特表 2022-529784 分子を細胞内送達するためのペプチドおよびナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-24

(54)【発明の名称】分子を細胞内送達するためのペプチドおよびナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20220617BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220617BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20220617BHJP

   A61K 47/60 20170101ALI20220617BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20220617BHJP

   A61K 47/61 20170101ALI20220617BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20220617BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20220617BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220617BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220617BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20220617BHJP

   C12N 7/00 20060101ALN20220617BHJP

   C07K 7/06 20060101ALN20220617BHJP

   C07K 5/062 20060101ALN20220617BHJP

   C07K 5/065 20060101ALN20220617BHJP

   C07K 5/083 20060101ALN20220617BHJP

   C07K 5/087 20060101ALN20220617BHJP

   C07K 5/103 20060101ALN20220617BHJP

   C07K 5/107 20060101ALN20220617BHJP

【ＦＩ】

C07K7/08 ZNA

C07K14/00

A61P11/00

A61P1/16

A61P1/00

A61P13/12

A61P25/00

A61P9/00

A61P21/00

A61P37/00

A61P35/00

A61P37/02

A61P29/00

A61P43/00 105

A61P31/12

A61P27/02

A61P3/10

A61P7/00

A61P3/00

A61P3/06

A61K48/00

A61K38/02

A61K35/76

A61K31/7088

A61K31/7105

A61K31/713

A61K31/711

A61K39/395 C

A61K39/395 L

A61K47/64

A61K47/60

A61K47/69

A61K47/61

A61K9/14

A61K9/51

A61K47/42

A61K9/10

A61K47/26

A61K47/02

C12N15/113 Z

C12N15/11 Z

C07K16/00

C12N7/00

C07K7/06

C07K5/062

C07K5/065

C07K5/083

C07K5/087

C07K5/103

C07K5/107

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021562003

(86)(22)【出願日】2020-04-16

(85)【翻訳文提出日】2021-12-17

(86)【国際出願番号】 US2020028572

(87)【国際公開番号】W WO2020214846

(87)【国際公開日】2020-10-22

(31)【優先権主張番号】1904115

(32)【優先日】2019-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514289920

【氏名又は名称】アーディジェン， エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】デサイ， ニール ピー．

(72)【発明者】

【氏名】ディビタ， ジル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA30

4B065CA44

4C076AA22

4C076AA30

4C076AA64

4C076AA65

4C076AA94

4C076BB13

4C076BB15

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4C076CC07

4C076CC10

4C076CC11

4C076CC15

4C076CC16

4C076CC17

4C076CC21

4C076CC26

4C076CC27

4C076CC29

4C076CC35

4C076CC41

4C076DD23

4C076DD23D

4C076DD26

4C076DD26Z

4C076DD67

4C076EE23

4C076EE30

4C076EE41

4C076EE41H

4C076EE41N

4C076EE59

4C076EE59N

4C076FF01

4C076FF11

4C076FF34

4C076GG41

4C076GG43

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA03

4C084CA18

4C084MA05

4C084MA23

4C084MA38

4C084MA43

4C084MA66

4C084NA11

4C084NA13

4C084ZA011

4C084ZA012

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZA361

4C084ZA362

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4C084ZA512

4C084ZA591

4C084ZA592

4C084ZA661

4C084ZA662

4C084ZA751

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4C084ZA812

4C084ZA941

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4C084ZB071

4C084ZB072

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB211

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4C084ZB261

4C084ZB262

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4C085CC22

4C085CC23

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4C085GG02

4C085GG03

4C086AA01

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4C086MA04

4C086MA05

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4C086MA38

4C086MA43

4C086MA66

4C086NA11

4C086NA13

4C086ZA01

4C086ZA02

4C086ZA33

4C086ZA36

4C086ZA51

4C086ZA59

4C086ZA66

4C086ZA75

4C086ZA81

4C086ZA94

4C086ZB07

4C086ZB11

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZB33

4C086ZC21

4C086ZC23

4C086ZC25

4C087AA01

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4C087BC83

4C087CA09

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4C087MA38

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4C087NA11

4C087NA13

4C087ZA01

4C087ZA02

4C087ZA33

4C087ZA36

4C087ZA51

4C087ZA59

4C087ZA66

4C087ZA75

4C087ZA81

4C087ZA94

4C087ZB07

4C087ZB11

4C087ZB21

4C087ZB26

4C087ZB33

4C087ZC21

4C087ZC33

4C087ZC35

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA01

4H045BA17

4H045BA18

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本出願は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む第１のペプチド、細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド、およびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体を対象とする。第２のペプチドは、第２のＣＰＰと連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドは、ＰＥＧ部分を有さない。本出願はまた、ＣＰＰおよびカーゴ分子を含み、ＣＰＰがレトロインベルソペプチドである、カーゴ送達複合体を対象とする。本出願はまた、ＣＰＰおよびカーゴ分子を含み、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含む、カーゴ送達複合体を対象とする。カーゴ送達複合体を作成し使用する方法もまた、開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、前記第２のペプチドが、前記第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、前記第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さない、カーゴ送達複合体。

【請求項2】

前記第１の細胞透過性ペプチドおよび前記第２の細胞透過性ペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項3】

前記第１の細胞透過性ペプチドおよび前記第２の細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、請求項１または２に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項4】

前記第１の細胞透過性ペプチドおよび／または前記第２の細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである、請求項１から３までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項5】

前記ＶＥＰＥＰ－３ペプチドが、配列番号１～１４、７５、および７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項6】

前記第１の細胞透過性ペプチドおよび／または前記第２の細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである、請求項１から５までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項7】

前記ＶＥＰＥＰ－６ペプチドが、配列番号１５～４０および７７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項8】

前記第１の細胞透過性ペプチドおよび／または前記第２の細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである、請求項１から７までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項9】

前記ＶＥＰＥＰ－９ペプチドが、配列番号４１～５２および７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項10】

前記第１の細胞透過性ペプチドおよび／または前記第２の細胞透過性ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである、請求項１から９までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項11】

前記ＡＤＧＮ－１００ペプチドが、配列番号５３～７０、７９および８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項12】

前記第１の細胞透過性ペプチドと前記第２の細胞透過性ペプチドが同じである、請求項１から１１までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項13】

前記カーゴ分子が、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項14】

前記カーゴ分子が、核酸である、請求項１３に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項15】

前記核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される、請求項１４に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項16】

前記核酸が、ｍＲＮＡを含む、請求項１５に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項17】

前記核酸が、ＲＮＡｉを含む、請求項１５または１６に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項18】

前記核酸が、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、前記ｍＲＮＡが、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、前記ＲＮＡｉが、ＲＮＡを標的とするものであり、前記ＲＮＡの発現が、前記疾患または状態に関連付けられる、請求項１６または１７に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項19】

前記細胞透過性ペプチドの前記核酸に対するモル比が、約１：１から約１００：１の間である、請求項１４から１８までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項20】

前記カーゴ送達複合体の平均直径が、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間である、請求項１４から１９までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項21】

前記第１の細胞透過性ペプチドの前記第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１である、請求項１から２０までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項22】

前記ＰＥＧ部分が、直鎖状ＰＥＧである、請求項１から２１までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項23】

前記ＰＥＧ部分が、分枝ＰＥＧである、請求項１から２１までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項24】

前記ＰＥＧ部分の分子量が、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである、請求項１から２３までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項25】

前記ＰＥＧ部分が、約１～１０個のエチレングリコール単位からなる、請求項１から２４までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項26】

前記ＰＥＧ部分が、前記第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている、請求項１から２５までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項27】

前記ＰＥＧ部分が、前記第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている、請求項１から２５までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項28】

前記第１のペプチドおよび／または第２のペプチドが、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖、および標的化配列からなる群から選択される１つまたは複数の部分をさらに含み、前記１つまたは複数の部分が前記第１の細胞透過性ペプチドもしくは前記第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端、または前記ＰＥＧ部分と共有結合により連結している、請求項１から２７までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項29】

前記１つまたは複数の部分が、前記第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端、前記第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端または前記ＰＥＧ部分とリンカーを介して共有結合により連結している、請求項２８に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項30】

前記１つまたは複数の部分が、標的化配列を含む、請求項２８に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項31】

前記標的化配列が、ＧＹ、ＹＶ、ＶＳ、ＳＫ、ＧＹＶ、ＹＶＳ、ＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＶＳＫ、ＹＩ、ＩＧ、ＧＳ、ＳＲ、ＹＩＧ、ＩＧＳ、ＧＳＲ、ＹＩＧＳ、およびＩＧＳＲからなる群から選択される、請求項３０に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項32】

前記標的化配列が、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される、請求項３１に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項33】

前記標的化配列が、前記第１の細胞透過性ペプチドまたは前記第２の細胞透過性ペプチドとリンカーを介して共有結合により連結している、請求項３０から３２までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項34】

前記１つまたは複数の部分が、アセチル基および／またはステアリル基を含む、請求項２８から３３までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項35】

前記第１のペプチドおよび／または第２のペプチドが、システアミド、システイン、チオール、アミド、必要に応じて置換されているニトリロ三酢酸、カルボキシル、必要に応じて置換されている直鎖状または分枝Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、第一級または第二級アミン、オシド誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、多糖および標的化配列からなる群から選択される１つまたは複数の部分をさらに含み、前記１つまたは複数の部分が、前記第１の細胞透過性ペプチドのＣ末端、前記第２の細胞透過性ペプチドのＣ末端または前記ＰＥＧ部分と共有結合により連結している、請求項１から３４までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項36】

前記１つまたは複数の部分が、前記第１の細胞透過性ペプチドのＣ末端、前記第２の細胞透過性ペプチドのＣ末端または前記ＰＥＧ部分とリンカーを介して共有結合により連結している、請求項３５に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項37】

前記第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドである、請求項１から３６までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項38】

細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、前記細胞透過性ペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択され、前記細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドである、カーゴ送達複合体。

【請求項39】

前記レトロインベルソペプチドが、配列番号８５または８６の配列を含む、請求項３７または３８に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項40】

ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、前記ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含む、カーゴ送達複合体。

【請求項41】

前記細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、請求項４０に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項42】

前記標的化配列が、前記細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している、請求項４０または４１に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項43】

前記ペプチドが、前記標的化配列のＮ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、前記１つまたは複数の部分が、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される、請求項４２に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項44】

前記カーゴ分子が、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体およびタンパク質複合体からなる群から選択される、請求項３８から４３までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項45】

前記カーゴ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸を含む、請求項４４に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項46】

前記カーゴ分子が、ｍＲＮＡを含む、請求項４５に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項47】

前記カーゴ分子が、ＲＮＡｉを含む、請求項４５または４６に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項48】

前記カーゴ分子が、ウイルスを含まない、請求項３８から４７までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体。

【請求項49】

請求項１から４８までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体を含むコアを含むナノ粒子。

【請求項50】

前記コアが、末梢細胞透過性ペプチドを含む殻でコーティングされている、請求項４９に記載のナノ粒子。

【請求項51】

前記末梢細胞透過性ペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される、請求項５０に記載のナノ粒子。

【請求項52】

請求項１から４８までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体または請求項４９から５１までのいずれか一項に記載のナノ粒子、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項53】

請求項１から３７までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体を調製する方法であって、ａ）前記第１のペプチドと前記第２のペプチドを組み合わせ、それにより、ペプチド混合物を形成するステップと、ｂ）前記ペプチド混合物を前記カーゴと組み合わせ、それにより、前記カーゴ送達複合体を形成するステップとを含む方法。

【請求項54】

請求項３８から４８までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体を調製する方法であって、前記ペプチドを前記カーゴ分子と組み合わせ、それにより、前記カーゴ送達複合体を形成するステップを含む方法。

【請求項55】

前記ペプチドまたは前記ペプチド混合物と前記カーゴ分子をそれぞれ約１：１から約１００：１までのモル比で組み合わせる、請求項５３または５４に記載の方法。

【請求項56】

前記カーゴ分子を含む第１の溶液を前記ペプチドまたはペプチド混合物を含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成するステップを含み、前記第３の溶液が、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むまたはそれを含むように調整され、前記第３の溶液をインキュベートして前記カーゴ送達複合体を形成させる、請求項５３から５５までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記第１の溶液が、滅菌水中の前記カーゴを含み、かつ／または前記第２の溶液が、滅菌水中の前記ペプチドまたはペプチド混合物を含む、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記第３の溶液を、インキュベートして前記カーゴ送達複合体を形成した後にｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むように調整する、請求項５６または５７に記載の方法。

【請求項59】

前記カーゴ送達複合体をポアサイズの膜を通して濾過する濾過プロセスをさらに含む、請求項５３から５８までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記ポアの直径が少なくとも約０．１μｍである、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

１つまたは複数のカーゴを細胞内に送達する方法であって、前記細胞を請求項１から４８までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体または請求項４９から５１までのいずれか一項に記載のナノ粒子と接触させるステップを含み、前記カーゴ送達複合体が、１つまたは複数のカーゴを含む、方法。

【請求項62】

１つまたは複数のカーゴを個体の組織または器官内に送達する方法であって、前記個体に請求項１から４８までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体、請求項４９から５１までのいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項５２に記載の医薬組成物を有効量で投与するステップを含み、前記組織または器官が、肝臓、肺、腎臓、脳、腸、脾臓、心臓、筋肉、およびリンパ節からなる群から選択される、方法。

【請求項63】

個体における疾患または状態を処置する方法であって、前記個体に請求項１から４８までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体、請求項４９から５１までのいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項５２に記載の医薬組成物を有効量で投与するステップを含む方法。

【請求項64】

前記疾患または状態が、肝臓、肺、腎臓、脳、腸、脾臓、心臓、筋肉、およびリンパ節からなる群から選択される器官または組織における病的細胞に関連するものである、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記疾患または状態が、がん、糖尿病、自己免疫疾患、血液病、心疾患、血管疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼の疾患、肝疾患、肺疾患、筋疾患、タンパク質欠乏性疾患、リソソーム蓄積症、神経疾患、腎疾患、老化および変性疾患、ならびにコレステロールレベルの異常を特徴とする疾患からなる群から選択される、請求項６３または６４に記載の方法。

【請求項66】

前記カーゴ送達複合体を静脈内または筋肉内に投与する、請求項６２から６５までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記個体がヒトである、請求項６２から６６までのいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

請求項１から４８までのいずれか一項に記載のカーゴ送達複合体、請求項４９から５１までのいずれか一項に記載のナノ粒子、または請求項５２に記載の医薬組成物を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、その内容全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる２０１９年４月１７日出願の仏国特許出願番号ＦＲ１９０４１１５号の優先権利益を主張するものである。

【0002】

本発明は、カーゴ分子を細胞内に送達するために有用なペプチドを含有する複合体／ナノ粒子に関する。

【背景技術】

【0003】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許、特許出願および公開特許出願の開示は、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
小分子は診療所において多くの場合に使用される主要な薬物のままであるが、それらの治療的影響は、例えば、標的に到達する能力が不十分であること、特異性を欠くこと、高用量が必要であり、それにより毒性および主要な副作用が導かれることなど、限界に達している。我々は、過去１０年間にわたって、小分子および遺伝子に基づく治療の限界を免れるために、標的に対して高い特異性を示すがリピンスキーの法則には従わないタンパク質、ペプチドおよび核酸などのより大きな治療用分子の発見の劇的な加速を目の当たりにした。これらの分子の医薬としての効力は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性が低いこと、および細胞への取り込みが少ないことによって制限されたままである。したがって、「送達」が治療に関するパズルの中心的なピースになっており、送達戦略を検証するための新しいマイルストーンが確立されている：（ａ）毒性がないこと、（ｂ）低用量でのｉｎ ｖｉｖｏにおける効率、（ｃ）治療への適用のための取り扱いが容易であること、（ｄ）迅速なエンドソーム放出、および（ｅ）標的に到達できること。遺伝子および細胞治療に関してウイルスによる送達戦略に大きな期待が寄せられているが、それらの臨床的適用に関しては、副作用および毒性作用に悩まされている（Ibraheem et al. (2014) Int J Pharm 459, 70-83）。研究は、ウイルスによらない戦略の開発に主に焦点が当てられ、脂質、ポリカチオンナノ粒子およびペプチドに基づく製剤を含めた種々の方法が提唱されているが、これらの技術のうちｉｎ ｖｉｖｏにおいて効率的であり、臨床まで達したものはほんのわずかである（Yin et al. (2014)Nat Rev Genet 15, 541-555）。したがって、ｍＲＮＡまたはＲＮＡｉを標的細胞の内部に効率的に送達するための改善された方法が必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ibraheem et al. (2014) Int J Pharm 459, 70-83

【非特許文献2】Yin et al. (2014)Nat Rev Genet 15, 541-555

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

本出願は、カーゴ分子を細胞内送達するために有用なカーゴ送達複合体およびナノ粒子を提供する。一部の実施形態では、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体は、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含み、第２のペプチドは、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドは、ＰＥＧ部分を有さない。一部の実施形態では、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体は、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含み、細胞透過性ペプチドは、レトロインベルソペプチドである。一部の実施形態では、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体は、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含み、ペプチドは、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドまたは第２の細胞透過性ペプチドなどの細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。

【0006】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは同じである。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸である。一部の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉを含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間である。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比は、約５０対１である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、分枝（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、第１のペプチドおよび／または第２のペプチドは、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖、および標的化配列からなる群から選択される１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、第１の細胞透過性ペプチドもしくは第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端、またはＰＥＧ部分と共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、標的化配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、ＧＹ、ＹＶ、ＶＳ、ＳＫ、ＧＹＶ、ＹＶＳ、ＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＶＳＫ、ＹＩ、ＩＧ、ＧＳ、ＳＲ、ＹＩＧ、ＩＧＳ、ＧＳＲ、ＹＩＧＳ、およびＩＧＳＲからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化配列は、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化配列は、第１の細胞透過性ペプチドまたは第２の細胞透過性ペプチドとリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、第１のペプチドおよび／または第２のペプチドは、システアミド、システイン、チオール、アミド、必要に応じて置換されているニトリロ三酢酸、カルボキシル、必要に応じて置換されている直鎖状または分枝（ｒａｍｉｆｉｅｄ）Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、第一級または第二級アミン、オシド誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、多糖および標的化配列からなる群から選択される１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、第１の細胞透過性ペプチドのＣ末端、第２の細胞透過性ペプチドのＣ末端またはＰＥＧ部分と共有結合により連結している。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、レトロインベルソペプチドである。

【0007】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択され、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドである、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、レトロインベルソペプチドは、配列番号８５または８６の配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。

【0008】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択され、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。

【0009】

本出願は、上記のカーゴ送達複合体を含むコアを含むナノ粒子も提供する。一部の実施形態では、コアは、末梢細胞透過性ペプチドを含む殻でコーティングされている。一部の実施形態では、末梢細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。

【0010】

本出願は、上記のカーゴ送達複合体またはナノ粒子のいずれか１つおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。

【0011】

本出願は、上記のカーゴ送達複合体を調製する方法であって、ａ）第１のペプチドと第２のペプチドを組み合わせ、それにより、ペプチド混合物を形成するステップと、ｂ）ペプチド混合物をカーゴと組み合わせ、それにより、カーゴ送達複合体を形成するステップとを含む方法も提供する。

【0012】

本出願は、上記のカーゴ送達複合体を調製する方法であって、ペプチドをカーゴ分子と組み合わせ、それにより、カーゴ送達複合体を形成するステップを含む方法も提供する。

【0013】

上記のカーゴ送達複合体を調製する方法のいずれかによる一部の実施形態では、ペプチドまたはペプチド混合物およびカーゴ分子を、それぞれ約１：１から約１００：１までのモル比で組み合わせる。一部の実施形態では、方法は、カーゴ分子を含む第１の溶液をペプチドまたはペプチド混合物を含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成するステップを含み、ここで、第３の溶液は、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むまたはそれを含むように調整され、第３の溶液をインキュベートしてカーゴ送達複合体を形成させる。一部の実施形態では、第１の溶液は滅菌水中のカーゴを含み、かつ／または第２の溶液は滅菌水中のペプチドまたはペプチド混合物を含む。一部の実施形態では、第３の溶液を、インキュベートしてカーゴ送達複合体を形成した後にｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むように調整する。一部の実施形態では、方法は、カーゴ送達複合体をポアサイズの膜を通して濾過する濾過プロセスをさらに含む。一部の実施形態では、ポアの直径は少なくとも約０．１μｍである。

【0014】

本出願は、１つまたは複数のカーゴを細胞内に送達する方法であって、細胞に上記のカーゴ送達複合体またはナノ粒子を接触させるステップを含み、カーゴ送達複合体が、１つまたは複数のカーゴを含む、方法も提供する。

【0015】

本出願は、１つまたは複数のカーゴを個体の組織または器官内に送達する方法であって、個体に上記のカーゴ送達複合体、ナノ粒子、または医薬組成物を有効量で投与するステップを含み、組織または器官が、肝臓、肺、腎臓、脳、腸、脾臓、心臓、筋肉、およびリンパ節からなる群から選択される、方法も提供する。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体を静脈内に投与する。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。

【0016】

本出願は、個体における疾患または状態を処置する方法であって、個体に上記のカーゴ送達複合体、ナノ粒子、または医薬組成物を有効量で投与するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、疾患または状態は、肝臓、肺、腎臓、脳、腸、脾臓、心臓、筋肉、およびリンパ節からなる群から選択される器官または組織における病的細胞に関連するものである。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、糖尿病、自己免疫疾患、血液病、心疾患、血管疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼の疾患、肝疾患、肺疾患、筋疾患、タンパク質欠乏性疾患、リソソーム蓄積症、神経疾患、腎疾患（ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、老化および変性疾患、ならびにコレステロールレベルの異常を特徴とする疾患からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体を静脈内に投与する。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。

【0017】

本出願は、上記のカーゴ送達複合体、ナノ粒子、または医薬組成物を含むキットも提供する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】図１Ａ～１Ｃは、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体を用いて処理した２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。４８ウェルプレートで培養した２９３Ｔ細胞に、ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子をトランスフェクトした。０．２５μｇのｍＲＮＡを含有する、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ５、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ６およびＡＤＧＮ－ペプチド／ＡＤＧＮ－１００ＰＥＧ１０％ナノ粒子を滅菌水中に形成し、５％スクロースを含有する滅菌水中に希釈し、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体をトランスフェクション前に２５％血清またはヘパラン硫酸のいずれかの存在下で３時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現をトランスフェクションの７２時間後にモニタリングし、結果をＲＬＵ（発光）：タンパク質１ｍｇとして報告した。

【図1B】図１Ａ～１Ｃは、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体を用いて処理した２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。４８ウェルプレートで培養した２９３Ｔ細胞に、ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子をトランスフェクトした。０．２５μｇのｍＲＮＡを含有する、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ５、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ６およびＡＤＧＮ－ペプチド／ＡＤＧＮ－１００ＰＥＧ１０％ナノ粒子を滅菌水中に形成し、５％スクロースを含有する滅菌水中に希釈し、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体をトランスフェクション前に２５％血清またはヘパラン硫酸のいずれかの存在下で３時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現をトランスフェクションの７２時間後にモニタリングし、結果をＲＬＵ（発光）：タンパク質１ｍｇとして報告した。

【図1C】図１Ａ～１Ｃは、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体を用いて処理した２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。４８ウェルプレートで培養した２９３Ｔ細胞に、ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子をトランスフェクトした。０．２５μｇのｍＲＮＡを含有する、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ５、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ６およびＡＤＧＮ－ペプチド／ＡＤＧＮ－１００ＰＥＧ１０％ナノ粒子を滅菌水中に形成し、５％スクロースを含有する滅菌水中に希釈し、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体をトランスフェクション前に２５％血清またはヘパラン硫酸のいずれかの存在下で３時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現をトランスフェクションの７２時間後にモニタリングし、結果をＲＬＵ（発光）：タンパク質１ｍｇとして報告した。

【0019】

【図2A】図２Ａ～２Ｃは、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４プラスミドＤＮＡ複合体を用いて処理した２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。４８ウェルプレートで培養した２９３Ｔ細胞に、ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子をトランスフェクトした。０．１７μｇのｐＧＬ４プラスミドＤＮＡを含有する、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ５、およびＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ６を滅菌水中に形成し、５％スクロースを含有する滅菌水中に希釈した。ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子を、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いた濾過前（図２Ａ）および濾過後（図２Ｂ）に評価した。図２Ｃ、ペグ化ＡＤＧＮ－１００のトランスフェクション効率に対する影響。ｐＧＬ４ ｌｕｃプラスミド（０．１５μｇ）を、５～５０％のＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１００溶液と、またはＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと結び付けた。ＡＤＧＮ／ｐＧＬ４プラスミドＤＮＡ複合体をトランスフェクション前に２５％血清またはヘパラン硫酸のいずれかの存在下で３時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現をトランスフェクションの７２時間後にモニタリングし、結果をＲＬＵ（発光）：タンパク質１ｍｇとして報告した。

【図2B】図２Ａ～２Ｃは、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４プラスミドＤＮＡ複合体を用いて処理した２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。４８ウェルプレートで培養した２９３Ｔ細胞に、ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子をトランスフェクトした。０．１７μｇのｐＧＬ４プラスミドＤＮＡを含有する、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ５、およびＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ６を滅菌水中に形成し、５％スクロースを含有する滅菌水中に希釈した。ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子を、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いた濾過前（図２Ａ）および濾過後（図２Ｂ）に評価した。図２Ｃ、ペグ化ＡＤＧＮ－１００のトランスフェクション効率に対する影響。ｐＧＬ４ ｌｕｃプラスミド（０．１５μｇ）を、５～５０％のＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１００溶液と、またはＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと結び付けた。ＡＤＧＮ／ｐＧＬ４プラスミドＤＮＡ複合体をトランスフェクション前に２５％血清またはヘパラン硫酸のいずれかの存在下で３時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現をトランスフェクションの７２時間後にモニタリングし、結果をＲＬＵ（発光）：タンパク質１ｍｇとして報告した。

【図2C】図２Ａ～２Ｃは、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４プラスミドＤＮＡ複合体を用いて処理した２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。４８ウェルプレートで培養した２９３Ｔ細胞に、ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子をトランスフェクトした。０．１７μｇのｐＧＬ４プラスミドＤＮＡを含有する、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ５、およびＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ６を滅菌水中に形成し、５％スクロースを含有する滅菌水中に希釈した。ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子を、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いた濾過前（図２Ａ）および濾過後（図２Ｂ）に評価した。図２Ｃ、ペグ化ＡＤＧＮ－１００のトランスフェクション効率に対する影響。ｐＧＬ４ ｌｕｃプラスミド（０．１５μｇ）を、５～５０％のＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１００溶液と、またはＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと結び付けた。ＡＤＧＮ／ｐＧＬ４プラスミドＤＮＡ複合体をトランスフェクション前に２５％血清またはヘパラン硫酸のいずれかの存在下で３時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現をトランスフェクションの７２時間後にモニタリングし、結果をＲＬＵ（発光）：タンパク質１ｍｇとして報告した。

【0020】

【図3A】図３Ａ～３Ｃは、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を用いて処理したＡ３７５／Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。４８ウェルプレートで培養したＡ３７５／Ｌｕｃ細胞に、ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子をトランスフェクトした。１０ｎＭまたは２５ｎＭのｓｉＲＮＡを含有する、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ５、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ６およびＡＤＧＮ－ペプチド／ＡＤＧＮ－１００ＰＥＧ１０％ナノ粒子を滅菌水中に形成し、５％スクロースを含有する滅菌水中に希釈し、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過した。図３Ｃ、ペグ化ＡＤＧＮ－１００のトランスフェクション効率に対する影響。ｓｉＲＮＡ Ｌｕｃ（１０ｎＭおよび２５ｎＭ）を、５～５０％のＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１００溶液と、またはＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと結び付けた。ＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ複合体をトランスフェクション前に２５％血清の存在下で３時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現をトランスフェクションの４８時間後にモニタリングし、結果をＲＬＵ（発光）：タンパク質１ｍｇとして報告した。

【図3B】図３Ａ～３Ｃは、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を用いて処理したＡ３７５／Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。４８ウェルプレートで培養したＡ３７５／Ｌｕｃ細胞に、ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子をトランスフェクトした。１０ｎＭまたは２５ｎＭのｓｉＲＮＡを含有する、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ５、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ６およびＡＤＧＮ－ペプチド／ＡＤＧＮ－１００ＰＥＧ１０％ナノ粒子を滅菌水中に形成し、５％スクロースを含有する滅菌水中に希釈し、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過した。図３Ｃ、ペグ化ＡＤＧＮ－１００のトランスフェクション効率に対する影響。ｓｉＲＮＡ Ｌｕｃ（１０ｎＭおよび２５ｎＭ）を、５～５０％のＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１００溶液と、またはＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと結び付けた。ＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ複合体をトランスフェクション前に２５％血清の存在下で３時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現をトランスフェクションの４８時間後にモニタリングし、結果をＲＬＵ（発光）：タンパク質１ｍｇとして報告した。

【図3C】図３Ａ～３Ｃは、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を用いて処理したＡ３７５／Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示すグラフである。４８ウェルプレートで培養したＡ３７５／Ｌｕｃ細胞に、ＡＤＧＮ－ペプチドナノ粒子をトランスフェクトした。１０ｎＭまたは２５ｎＭのｓｉＲＮＡを含有する、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ５、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ６およびＡＤＧＮ－ペプチド／ＡＤＧＮ－１００ＰＥＧ１０％ナノ粒子を滅菌水中に形成し、５％スクロースを含有する滅菌水中に希釈し、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過した。図３Ｃ、ペグ化ＡＤＧＮ－１００のトランスフェクション効率に対する影響。ｓｉＲＮＡ Ｌｕｃ（１０ｎＭおよび２５ｎＭ）を、５～５０％のＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１００溶液と、またはＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと結び付けた。ＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ複合体をトランスフェクション前に２５％血清の存在下で３時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現をトランスフェクションの４８時間後にモニタリングし、結果をＲＬＵ（発光）：タンパク質１ｍｇとして報告した。

【0021】

【図4A】図４Ａ～４Ｄは、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示す図である。５μｇのｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／ｌｕｃ ｍＲＮＡ粒子を滅菌水中に形成し、次いで、５％スクロース中に希釈した。マウスにＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体１００μｌをＩＶ注射した。ｍＲＮＡ ＬＵＣ発現を１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に生物発光イメージングによってモニタリングした。図４Ｂは、対照群および処置群における２４時間の時点での生物発光イメージングを示す。肝臓（Ｃ）および肺（Ｄ）におけるルシフェラーゼシグナルの半定量的データを製造者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。次いで、結果を０日目に対する値として表した。

【図4B-C】図４Ａ～４Ｄは、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示す図である。５μｇのｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／ｌｕｃ ｍＲＮＡ粒子を滅菌水中に形成し、次いで、５％スクロース中に希釈した。マウスにＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体１００μｌをＩＶ注射した。ｍＲＮＡ ＬＵＣ発現を１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に生物発光イメージングによってモニタリングした。図４Ｂは、対照群および処置群における２４時間の時点での生物発光イメージングを示す。肝臓（Ｃ）および肺（Ｄ）におけるルシフェラーゼシグナルの半定量的データを製造者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。次いで、結果を０日目に対する値として表した。

【図4D】図４Ａ～４Ｄは、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示す図である。５μｇのｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／ｌｕｃ ｍＲＮＡ粒子を滅菌水中に形成し、次いで、５％スクロース中に希釈した。マウスにＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体１００μｌをＩＶ注射した。ｍＲＮＡ ＬＵＣ発現を１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に生物発光イメージングによってモニタリングした。図４Ｂは、対照群および処置群における２４時間の時点での生物発光イメージングを示す。肝臓（Ｃ）および肺（Ｄ）におけるルシフェラーゼシグナルの半定量的データを製造者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た。次いで、結果を０日目に対する値として表した。

【0022】

【図5A】図５Ａ～５Ｂは、マウスにおける筋肉内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示す図である。２．５μｇのｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／ｌｕｃ ｍＲＮＡ粒子を滅菌水中に形成し、次いで、５％スクロース中に希釈した。マウスにＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体２５μｌをＩＶ注射した。ｍＲＮＡ ＬＵＣ発現を１２時間後、２４時間後および４８時間後に生物発光イメージングによってモニタリングした（Ａ）。図５Ｂは、対照群および処置群における２４時間の時点での生物発光イメージングを示す。

【図5B】図５Ａ～５Ｂは、マウスにおける筋肉内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示す図である。２．５μｇのｍＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／ｌｕｃ ｍＲＮＡ粒子を滅菌水中に形成し、次いで、５％スクロース中に希釈した。マウスにＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体２５μｌをＩＶ注射した。ｍＲＮＡ ＬＵＣ発現を１２時間後、２４時間後および４８時間後に生物発光イメージングによってモニタリングした（Ａ）。図５Ｂは、対照群および処置群における２４時間の時点での生物発光イメージングを示す。

【0023】

【図6A】図６Ａ～６Ｃは、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＬ４のｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示す図である。５μｇのプラスミドＤＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４粒子を滅菌水中に形成し、次いで、５％スクロース中に希釈した。マウスにＡＤＧＮ－ペプチド／プラスミド複合体１００μｌをＩＶ注射した。ｐＧＬ４ルシフェラーゼ発現を１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に生物発光イメージングによってモニタリングした。図６Ｂは、対照群および処置群における２４時間の時点での生物発光イメージングを示す。図６Ｃは、製造者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た、肝臓におけるルシフェラーゼシグナルの半定量的データを示す。次いで、結果を０日目に対する値として表した。

【図6B】図６Ａ～６Ｃは、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＬ４のｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示す図である。５μｇのプラスミドＤＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４粒子を滅菌水中に形成し、次いで、５％スクロース中に希釈した。マウスにＡＤＧＮ－ペプチド／プラスミド複合体１００μｌをＩＶ注射した。ｐＧＬ４ルシフェラーゼ発現を１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に生物発光イメージングによってモニタリングした。図６Ｂは、対照群および処置群における２４時間の時点での生物発光イメージングを示す。図６Ｃは、製造者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た、肝臓におけるルシフェラーゼシグナルの半定量的データを示す。次いで、結果を０日目に対する値として表した。

【図6C】図６Ａ～６Ｃは、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＬ４のｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示す図である。５μｇのプラスミドＤＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４粒子を滅菌水中に形成し、次いで、５％スクロース中に希釈した。マウスにＡＤＧＮ－ペプチド／プラスミド複合体１００μｌをＩＶ注射した。ｐＧＬ４ルシフェラーゼ発現を１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に生物発光イメージングによってモニタリングした。図６Ｂは、対照群および処置群における２４時間の時点での生物発光イメージングを示す。図６Ｃは、製造者のソフトウェア（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して得た、肝臓におけるルシフェラーゼシグナルの半定量的データを示す。次いで、結果を０日目に対する値として表した。

【0024】

【図7A】図７Ａ～７Ｂは、マウスにおける筋肉内投与によるルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＬ４のｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示す図である。２．５μｇのプラスミドＤＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４ ｌｕｃ粒子を滅菌水中に形成し、次いで、５％スクロース中に希釈した。マウスにＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４複合体２５μｌをＩＶ注射した。ルシフェラーゼ発現を１２時間後、２４時間後および４８時間後に生物発光イメージングによってモニタリングした（Ａ）。図７Ｂは、対照群および処置群における２４時間の時点での生物発光イメージングを示す。

【図7B】図７Ａ～７Ｂは、マウスにおける筋肉内投与によるルシフェラーゼ発現プラスミドｐＧＬ４のｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示す図である。２．５μｇのプラスミドＤＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４ ｌｕｃ粒子を滅菌水中に形成し、次いで、５％スクロース中に希釈した。マウスにＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４複合体２５μｌをＩＶ注射した。ルシフェラーゼ発現を１２時間後、２４時間後および４８時間後に生物発光イメージングによってモニタリングした（Ａ）。図７Ｂは、対照群および処置群における２４時間の時点での生物発光イメージングを示す。

【0025】

【図8】図８は、ＤＬＳ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）で測定した、濾過を伴わない場合または濾過を伴う場合の、ＡＤＧＮ－１００ペプチドバリアント／ｍＲＮＡ複合体の粒子サイズおよび凝集のレベルを示す表である。

【0026】

【図9】図９は、ＤＬＳ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）で測定した、濾過を伴わない場合または濾過を伴う場合の、ＡＤＧＮ－１０６ペプチドバリアント／ｍＲＮＡ複合体の粒子サイズおよび凝集のレベルを示す表である。

【0027】

【図10】図１０は、ＤＬＳ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）で測定した、濾過を伴わない場合または濾過を伴う場合の、ＡＤＧＮペプチドバリアント／ＤＮＡプラスミド複合体の粒子サイズおよび凝集のレベルを示す表である。

【0028】

【図11A】図１１Ａ～１１Ｃは、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示すグラフである。

【図11B】図１１Ａ～１１Ｃは、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示すグラフである。

【図11C】図１１Ａ～１１Ｃは、マウスにおける静脈内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達についてのＡＤＧＮ－ペプチドバリアントの効力を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本出願は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）および１つまたは複数のｍＲＮＡを含む複合体およびナノ粒子であって、ＣＰＰが、１つまたは複数のｍＲＮＡ（例えば、治療用製品、例えば腫瘍抑制因子をコードするｍＲＮＡなど）を細胞内に送達するために適したものである、複合体およびナノ粒子を提供する。複合体およびナノ粒子は、複数のｍＲＮＡを含み得る。ｍＲＮＡは、例えば、治療用タンパク質（例えば、腫瘍抑制因子、免疫調節物質など）をコードするｍＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、複合体およびナノ粒子を、疾患組織、例えば腫瘍などの標的組織に優先的に局在化させる。一部の実施形態では、複合体およびナノ粒子は、内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉなどのＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患に関連する内因性遺伝子、例えば癌遺伝子を標的とするものである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とするものである。

【0030】

したがって、本出願は、一態様では、新規のカーゴ送達複合体およびナノ粒子を提供し、それらを下により詳細に記載する。

【0031】

別の態様では、細胞透過性ペプチドを使用してｍＲＮＡを細胞内に送達する方法が提供される。別の態様では、ｍＲＮＡおよび細胞透過性ペプチドを含む複合体またはナノ粒子を局所的な組織、器官または細胞内に送達する方法が提供される。別の態様では、ｍＲＮＡおよび細胞透過性ペプチドを含む本明細書に記載の複合体またはナノ粒子を対象に投与することによって疾患または障害を処置する方法が提供される。

【0032】

細胞透過性ペプチドおよび１つまたは複数のｍＲＮＡを含む（例えば、複合体およびナノ粒子の形態で）医薬組成物および疾患を処置するためのその使用も提供される。
定義

【0033】

本明細書で使用される場合、「レトロインベルソペプチド」という用語は、逆向きの配列のＤ－アミノ酸で構成され、伸長させた場合、その親分子と同様の側鎖トポロジーが想定されるが、アミドペプチド結合が反転しているペプチドである。

【0034】

本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当技術分野で当業者によって理解される用語であり、生物体、株、遺伝子または特徴の、突然変異体またはバリアント形態とは区別される、天然に存在する典型的な形態を意味する。

【0035】

「バリアント」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在するものから逸脱するパターンを有する質を示すものと解釈されるべきである。

【0036】

「天然に存在しない」または「工学的に作製された」という用語は、互換的に使用され、人間の手の関与を示す。この用語は、核酸分子またはポリペプチドについて言及する場合、その核酸分子またはポリペプチドが、自然界で天然に付随し、天然に見いだされる少なくとも１つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。

【0037】

「相補性」は、核酸の、別の核酸配列と従来のワトソン・クリック塩基対合または他の従来のものではない型のいずれかで水素結合（複数可）を形成する能力を指す。パーセント相補性は、核酸分子内の、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン・クリック塩基対合）を形成することができる残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％／、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列の連続した残基の全てが第２の核酸配列内の同じ数の連続した残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用される場合、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、もしくはそれよりも多くのヌクレオチドの領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指す、または２つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを指す。

【0038】

本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から転写されるプロセス（例えば、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ転写物に）および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされるポリペプチドは、集合的に、「遺伝子産物」と称され得る。ポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡから引き出す場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0039】

「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、本明細書では、互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、マウス、サル、ヒト、農場動物、競技動物、および愛玩動物が挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏで得られたまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの後代も包含される。

【0040】

「治療剤」、「治療能のある薬剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｐａｂｌｅ ａｇｅｎｔ）」または「処置剤」という用語は、互換的に使用され、対象に投与されるといくらかの有益な効果を付与する分子または化合物を指す。有益な効果としては、診断決定の実施可能性；疾患、症状、障害、または病的状態の好転；疾患、症状、障害または状態発症の低減または防止；および一般に、疾患、症状、障害または病的状態を打ち消すことが挙げられる。

【0041】

本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、これだけに限定されないが、治療的利益を含めた有益なまたは所望の結果を得るための手法を指す。治療的利益は、処置下にある１つまたは複数の疾患、状態、または症状に対するあらゆる治療に関連性のある改善または効果を意味する。

【0042】

「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分である薬剤の量を指す。治療有効量は、処置を受けている対象および疾患状態、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などのうちの１つまたは複数に応じて変動し得、当業者が容易に決定することができる。この用語は、本明細書に記載のイメージング方法のいずれか１つによって検出するための画像がもたらされる用量にも当てはまる。特定の用量は、選択される特定の薬剤、従う投薬レジメン、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、イメージングが行われる組織、および運ばれる物理的送達系のうちの１つまたは複数に応じて変動し得る。

【0043】

本明細書で使用される場合、単数形「１個の（ａ）」、「１個の（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段の指定のない限り、複数の参照対象を含む。

【0044】

「約」値またはパラメータへの言及は、本明細書では、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。

【0045】

本発明の組成物および方法は、本明細書に記載の発明の必須の要素および限定、ならびに、本明細書に記載のまたは他の点で有用な任意の追加的なまたは必要に応じた成分、構成成分、または限定を含み得る、それからなり得る、またはそれから本質的になり得る。

【0046】

特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。
複合体およびナノ粒子
複合体

【0047】

一部の態様では、１つまたは複数のカーゴ分子を細胞内に送達するための細胞透過性ペプチドを含むカーゴ送達複合体が提供される。
ペプチド混合物を含むカーゴ送達複合体

【0048】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸である。一部の実施形態では、核酸は、ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドのカーゴ分子（例えば、核酸など）に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0049】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）である、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰペプチド（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２またはＰＥＰ－３ペプチドなど）、またはＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＡＤＧＮ－１００、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－４、ＶＥＰＥＰ－５、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドなど）である。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0050】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドから選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸である。一部の実施形態では、核酸は、ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドのカーゴ分子（例えば、核酸など）に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0051】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、カーゴ分子が、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸である／核酸を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、配列番号７１～７４および８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは同じである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは異なる。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0052】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0053】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0054】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0055】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0056】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、配列番号７１～７４および８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0057】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、カーゴ分子が、核酸であるまたは核酸を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、核酸は、ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、配列番号７１～７４および８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは同じである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは異なる。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0058】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、カーゴ分子が、ウイルスであるまたはウイルスを含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、配列番号７１～７４および８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは同じである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは異なる。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0059】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、カーゴ分子が、ポリペプチドであるまたはポリペプチドを含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、配列番号７１～７４および８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは同じである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは異なる。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0060】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、カーゴ分子が、タンパク質／核酸複合体であるまたはタンパク質／核酸複合体を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、配列番号７１～７４および８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは同じである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは異なる。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0061】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、カーゴ分子が、ウイルス様粒子であるまたはウイルス様粒子を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、配列番号７１～７４および８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは同じである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは異なる。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0062】

一部の実施形態では、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチド；ｂ）第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチド；およびｃ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さず、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比が、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）であり、カーゴ分子が、タンパク質複合体であるまたはタンパク質複合体を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、配列番号７１～７４および８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは同じである。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドと第２の細胞透過性ペプチドは異なる。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約５０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0063】

一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、分枝ＰＥＧである。

【0064】

一部の実施形態では、第１のペプチドおよび／または第２のペプチドは、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖、および標的化配列からなる群から選択される１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、第１の細胞透過性ペプチドもしくは第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端、またはＰＥＧ部分と共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、第１の細胞透過性ペプチドのＮ末端、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＰＥＧ部分とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、標的化配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、第１の細胞透過性ペプチドまたは第２の細胞透過性ペプチドとリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、第１の細胞透過性ペプチドまたは第２の細胞透過性ペプチドとリンカーを伴わずに共有結合により連結している。

【0065】

一部の実施形態では、第１のペプチドおよび／または第２のペプチドは、システアミド、システイン、チオール、アミド、必要に応じて置換されているニトリロ三酢酸、カルボキシル、必要に応じて置換されている直鎖状または分枝（ｒａｍｉｆｉｅｄ）Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、第一級または第二級アミン、オシド誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、多糖および標的化配列からなる群から選択される１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、第１の細胞透過性ペプチドのＣ末端、第２の細胞透過性ペプチドのＣ末端またはＰＥＧ部分と共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、第１の細胞透過性ペプチドのＣ末端、第２の細胞透過性ペプチドのＣ末端またはＰＥＧ部分とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、標的化配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、第１の細胞透過性ペプチドまたは第２の細胞透過性ペプチドとリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、第１の細胞透過性ペプチドまたは第２の細胞透過性ペプチドとリンカーを伴わずに共有結合により連結している。

【0066】

一部の実施形態では、標的化配列は、ＧＹ、ＹＶ、ＶＳ、ＳＫ、ＧＹＶ、ＹＶＳ、ＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＶＳＫ、ＹＩ、ＩＧ、ＧＳ、ＳＲ、ＹＩＧ、ＩＧＳ、ＧＳＲ、ＹＩＧＳ、およびＩＧＳＲからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化配列は、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される。

【0067】

一部の実施形態では、本明細書に記載のリンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。

【0068】

一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドおよび／または第２の細胞透過性ペプチドは、レトロインベルソペプチドである。一部の実施形態では、レトロインベルソペプチドは、配列番号８５または８６の配列を含む。

【0069】

一部の実施形態では、第１のペプチドおよび／または第２のペプチドは、配列番号１～１１２の配列を含む。
レトロインベルソ細胞透過性ペプチドを含むカーゴ送達複合体

【0070】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドである、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＰＥＰペプチド（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２またはＰＥＰ－３ペプチドなど）、またはＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＡＤＧＮ－１００、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－４、ＶＥＰＥＰ－５、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドなど）である。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0071】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択され、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドである、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドのカーゴ分子（例えば、核酸など）に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。

【0072】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドであり、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドのカーゴ分子（例えば、核酸など）に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。

【0073】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドであり、細胞透過性ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドであり、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドであり、細胞透過性ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。

【0074】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドであり、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドであり、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドであり、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸である、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、カーゴは、ＤＮＡプラスミドを含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。

【0075】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドであり、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドであり、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドであり、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。

【0076】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドであり、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドであり、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドであり、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。

【0077】

一部の実施形態では、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、細胞透過性ペプチドおよびカーゴ分子を含み、細胞透過性ペプチドが、配列番号８５または８６の配列を含むレトロインベルソペプチドであり、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、複合体が提供される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）を含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドのカーゴ分子（例えば、核酸など）に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。

【0078】

一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。

【0079】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖、および標的化配列からなる群から選択される１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、標的化配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドとリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドとリンカーを伴わずに共有結合により連結している。

【0080】

一部の実施形態では、ペプチドは、システアミド、システイン、チオール、アミド、必要に応じて置換されているニトリロ三酢酸、カルボキシル、必要に応じて置換されている直鎖状または分枝（ｒａｍｉｆｉｅｄ）Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、第一級または第二級アミン、オシド誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、多糖および標的化配列からなる群から選択される１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、細胞透過性ペプチドのＣ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、細胞透過性ペプチドのＣ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、標的化配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドとリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、第２の細胞透過性ペプチドとリンカーを伴わずに共有結合により連結している。

【0081】

一部の実施形態では、標的化配列は、ＧＹ、ＹＶ、ＶＳ、ＳＫ、ＧＹＶ、ＹＶＳ、ＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＶＳＫ、ＹＩ、ＩＧ、ＧＳ、ＳＲ、ＹＩＧ、ＩＧＳ、ＧＳＲ、ＹＩＧＳ、およびＩＧＳＲからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化配列は、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される。

【0082】

一部の実施形態では、本明細書に記載のリンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。
シグナル伝達配列（すなわち、標的化部分）を有する細胞透過性ペプチドを含むカーゴ送達複合体

【0083】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。

【0084】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、カーゴ分子が、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドのカーゴ分子に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。

【0085】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、カーゴ分子が、核酸である、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、核酸は、ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉを含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡプラスミドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。

【0086】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドであり、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＡＤＧＮ－１００ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸である、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、核酸は、ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉを含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡプラスミドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。

【0087】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドであり、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸である、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、核酸は、ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉを含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡプラスミドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。

【0088】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドであり、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸である、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉを含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡプラスミドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。

【0089】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドであり、カーゴ分子が、ウイルスを含まない、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される標的化配列をさらに含み、細胞透過性ペプチドが、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドであり、カーゴ分子が、核酸である、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、ｉＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなど）、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉを含むまたはそれをさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡプラスミドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１の間など）である。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。

【0090】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＹＩＧＳＲの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0091】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＹＩＧＳＲの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結しており、リンカーが、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシンを含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、リンカーは、２つ、３つまたは４つのグリシンからなる。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0092】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結しており、リンカーが、少なくとも約２つ、３つ、または４つのグリシンを含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、リンカーは、２つ、３つまたは４つのグリシンからなる。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0093】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＹＩＧＳＲの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結しており、リンカーが、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）部分を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、メチレン基（すなわち、ＣＨ２）をさらに含む。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、少なくとも約２個のＣＨ２を含む。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、２個のＣＨ２を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0094】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結しており、リンカーが、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）部分を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、メチレン基（すなわち、ＣＨ２）をさらに含む。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、少なくとも約２個のＣＨ２を含む。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、２個のＣＨ２を有する。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0095】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＹＩＧＳＲの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結しており、リンカーが、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）部分を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、メチレン基（すなわち、ＣＨ２）をさらに含む。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個または６個など）のＣＨ２を含む。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、ＣＨ２を約１～１０個（例えば、約４～８個、約５～７個、または６個など）含む。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0096】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結しており、リンカーが、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）部分を含む、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、メチレン基（すなわち、ＣＨ２）をさらに含む。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、少なくとも１個（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個または６個など）のＣＨ２を含む。一部の実施形態では、Ａｖａ部分は、ＣＨ２を約１～１０個（例えば、約４～８個、約５～７個、または６個など）含む。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0097】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳまたはＹＩＧＳＲの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端にＰＥＧリンカー部分を含むリンカーを介して共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、標的化配列は、ＹＩＧＳＲを含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、標的化配列は、ＧＹＶＳを含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分の分子量は、約０．０５ｋＤａ～約０．５ｋＤａ（例えば、約０．０５～０．１ｋＤａ、０．０５～０．４ｋＤａ、０．１～０．３ｋＤａ、０．０５～０．２５ｋＤａ、０．２５～０．５ｋＤａなど）である。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含まない。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0098】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＧＹＶＳまたはＹＩＧＳＲの配列を含む標的化配列をさらに含み、ペプチドが、配列番号８８、８９、９４～９９、１０１～１１２からなる群から選択される配列を含む、カーゴ送達複合体が提供される。

【0099】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＳＹＴＳＳＴＭの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカー部分を介して連結している。一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１１５、１２８、１３１、および１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0100】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＣＫＴＲＲＶＰの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカー部分を介して連結している。一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１３４または１３７に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0101】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＴＨＲＰＰＮＷＳＰＶの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカー部分を介して連結している。一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１３３または１３８に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0102】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＤＨＮＧの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカー部分を介して連結している。一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１２２または１２３に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0103】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＣＡＲＰＡＲの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカー部分を介して連結している。一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１２１または１３９に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0104】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＡＳＳＬＮＩＡの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカー部分を介して連結している。一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１１３に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0105】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＬＳＳＲＬＤＡの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカー部分を介して連結している。一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１１４に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0106】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＫＳＹＤＴＹの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカー部分を介して連結している。一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１１６または１１９に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0107】

一部の実施形態では、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含む、カーゴ分子を細胞内送達するためのカーゴ送達複合体であって、ペプチドが、ＣＫＲＡＶの配列を含む標的化配列をさらに含み、標的化配列が、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している、カーゴ送達複合体が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結したアセチル基をさらに含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカー部分を介して連結している。一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１１７に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される核酸である。

【0108】

一部の実施形態では、カーゴ送達複合体の平均直径は、約２０ｎｍから約１０００ｎｍの間（例えば、約２０～約５００ｎｍ、約５０～約４００ｎｍ、約６０～約３００ｎｍ、約８０～約２００ｎｍ、または約１００～約１６０ｎｍなど）である。

【0109】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、および多糖からなる群から選択される１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、細胞透過性ペプチドのＮ末端に第２のリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ステアリル基を含む、またはそれからなる。

【0110】

一部の実施形態では、ペプチドは、システアミド、システイン、チオール、アミド、必要に応じて置換されているニトリロ三酢酸、カルボキシル、必要に応じて置換されている直鎖状または分枝（ｒａｍｉｆｉｅｄ）Ｃ_１～Ｃ_６アルキル、第一級または第二級アミン、オシド誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体、および多糖からなる群から選択される１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、細胞透過性ペプチドのＣ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、細胞透過性ペプチドのＣ末端に第２のリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ステアリル基を含む、またはそれからなる。

【0111】

一部の実施形態では、ペプチドは、レトロインベルソペプチドである。一部の実施形態では、レトロインベルソペプチドは、配列番号８５または８６の配列を含む。

【0112】

一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１１２の配列を含む。

【0113】

一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞透過性ペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子と複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子のうちの少なくとも１つと非共有結合により複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子のそれぞれと非共有結合により複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子のうちの少なくとも１つと共有結合により複合体を形成する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、１つまたは複数のカーゴ分子のそれぞれと共有結合により複合体を形成する。
細胞透過性ペプチド

【0114】

細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、ウイルスによらない戦略の有望なものの１つである。ＣＰＰの定義は進化し続けているが、タンパク質またはキメラ配列に由来する３０アミノ酸未満の短いペプチドと一般に説明される。ＣＰＰは、通常、両親媒性であり、正味の正電荷を有する（Langel U (2007) Handbook of Cell-Penetrating Peptides (CRC Taylor & Francis, Boca Raton)；Heitz et al. (2009) Br J Pharmacol 157, 195-206）。ＣＰＰは、種々の生体分子の細胞膜を横断して細胞質内への移動を誘発するため、およびそれらの細胞内経路設定を改善し、それにより、標的との相互作用を容易にするために、生体膜を透過させることができるものである。ＣＰＰは、２つの主要なクラスに細分することができ、第１のクラスはカーゴとの化学的連結を必要とするものであり、第２のクラスは、安定な非共有結合性の複合体の形成を伴うものである。どちらの戦略のＣＰＰも、カーゴの大きなパネル（プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質、ペプチド、リポソーム、ナノ粒子．．．）の多種多様な細胞型およびｉｎ ｖｉｖｏモデルへの送達に有利であることが報告されている（Langel U (2007) Handbook of Cell-Penetrating Peptides (CRC Taylor & Francis, Boca Raton)；Heitz et al. (2009) Br J Pharmacol 157, 195-206；Mickan et al. (2014) Curr Pharm Biotechnol 15, 200-209；Shukla et al. (2014) Mol Pharm 11, 3395-3408）。

【0115】

タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）の概念は、最初に、いくつかのタンパク質、主に転写因子を細胞内におよび１つの細胞から別の細胞にシャトル輸送することができるという観察に基づいて提唱された（総説についてはLangel U (2007) Handbook of Cell-Penetrating Peptides (CRC Taylor & Francis、Boca Raton)；Heitz et al. (2009) Br J Pharmacol 157, 195-206を参照されたい）。最初の観察は１９８８年にＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏによってなされた。彼らは、ＨＩＶ－１の転写トランス活性化（Ｔａｔ）タンパク質が細胞に進入し、核内に場所を移すことができることを示した。１９９１年に、ＰｒｏｃｈｉａｎｔｚのグループがＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインを用いて同じ結論に達し、このドメインが神経細胞によって内部移行することを実証した。これらの研究は、１９９４年の最初のタンパク質導入ドメイン：ペネトラチンと名付けられた、アンテナペディアのホメオドメインの第３のへリックスに由来する１６ｍｅｒペプチドの発見の原点になった。１９９７年には、Ｌｅｂｌｅｕのグループにより、細胞内取り込みに必要なＴａｔの最小配列が同定され、Ｄｏｗｄｙのグループにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＴＤの適用に関する最初の概念実証が小さなペプチドおよび大きなタンパク質の送達に関して報告された（Gump JM, and Dowdy SF (2007) Trends Mol Med 13, 443-448.）。歴史的に、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の概念は１９９８年にＬａｎｇｅｌのグループによって導入され、最初のキメラペプチド担体であるトランスポータンが設計され、これは、スズメバチ毒液ペプチドであるマストパランと連結した神経ペプチドであるガラニンのＮ末端断片に由来するものであった。トランスポータンは元々、培養細胞およびｉｎ ｖｉｖｏの両方におけるＰＮＡ（ペプチド核酸）の送達を改善するためのものとして報告された（Langel U (2007) Handbook of Cell-Penetrating Peptides (CRC Taylor & Francis, Boca Raton)）。１９９７年に、ＨｅｉｔｚおよびＤｉｖｉｔａのグループにより、カーゴの安定であるが非共有結合性の複合体の形成にＣＰＰを伴う新しい戦略が提唱された（Morris et al. (1997) Nucleic Acids Res 25, 2730-2736）。この戦略は、まず、２つのドメイン：親水性（極性）ドメインおよび疎水性（無極性）ドメインからなる短いペプチド担体（ＭＰＧ）に基づくものであった。核酸の送達のためにＭＰＧが設計された。次いで、タンパク質およびペプチドの非共有結合性送達のために、第一次の両親媒性ペプチドＰｅｐ－１が提唱された（Morris et al. (2001)Nat Biotechnol 19, 1173-1176）。次いで、ＷｅｎｄｅｒのグループおよびＦｕｔａｋｉのグループにより、小さな分子および大きな分子を細胞内におよびｉｎ ｖｉｖｏで駆動するためにはポリアルギニン配列（Ａｒｇ８）が十分であることが実証された（Nakase et al. (2004)Mol Ther 10, 1011-1022；Rothbard et al. (2004)J Am Chem Soc 126, 9506-9507）。その後ずっと、天然配列または天然でない配列に由来する多くのＣＰＰが同定されており、その一覧は増え続けている。ペプチドは、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２タンパク質から、カルシトニンから、抗菌薬または毒素ペプチドから、細胞周期の調節に関与するタンパク質から、ならびにポリプロリンリッチペプチドから引き出されている（Heitz et al. (2009)Br J Pharmacol 157, 195-206）。つい最近、第二次の両親媒性ＣＰＰに基づく新しい非共有結合性戦略が記載されている。ＣＡＤＹおよびＶＥＰＥＰ－ファミリーなどのこれらのペプチドは、分子の異なる側面にある親水性残基および疎水性残基を用いてヘリックス形状に自己組織化することができる。ＷＯ２０１４／０５３８７９にはＶＥＰＥＰ－３ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８１にはＶＥＰＥＰ－４ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８２にはＶＥＰＥＰ－５ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１２／１３７１５０にはＶＥＰＥＰ－６ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８０にはＶＥＰＥＰ－９ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１６／１０２６８７にはＡＤＧＮ－１００ペプチドが開示されており、ＵＳ２０１０／００９９６２６にはＣＡＤＹペプチドが開示されており、米国特許第７，５１４，５３０号にはＭＰＧペプチドが開示されている；その開示は、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0116】

本発明のカーゴ送達複合体またはナノ粒子内の細胞透過性ペプチドは、種々のカーゴと安定な複合体およびナノ粒子を形成することができるものである。本明細書に記載の任意のカーゴ送達複合体またはナノ粒子の任意の細胞透過性ペプチドは、この節に記載されている任意の細胞透過性ペプチド配列を含み得る、またはそれからなり得る。

【0117】

一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子は、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＭＰＧ、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド（本明細書ではＡＤＧＮ－１０３ペプチドと互換的に使用される）、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド（本明細書ではＡＤＧＮ－１０４ペプチドと互換的に使用される）、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド（本明細書ではＡＤＧＮ－１０５ペプチドと互換的に使用される）、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド（本明細書ではＡＤＧＮ－１０６ペプチドと互換的に使用される）、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド（本明細書ではＡＤＧＮ－１０９ペプチドと互換的に使用される）、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される細胞透過性ペプチドを含む。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、カーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在するカーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、カーゴ分子と結び付いている。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法によるものである。ＷＯ２０１４／０５３８７９にはＶＥＰＥＰ－３ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８１にはＶＥＰＥＰ－４ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８２にはＶＥＰＥＰ－５ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１２／１３７１５０にはＶＥＰＥＰ－６ペプチドが開示されており、ＷＯ２０１４／０５３８８０にはＶＥＰＥＰ－９ペプチドが開示されており、 ＷＯ２０１６／１０２６８７にはＡＤＧＮ－１００ペプチドが開示されており、ＵＳ２０１０／００９９６２６にはＣＡＤＹペプチドが開示されており、米国特許第７，５１４，５３０号にはＭＰＧペプチドが開示されている；その開示は、これにはよりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＥＰＥＰ－３ペプチド

【0118】

一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_３Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２Ｘ_１３（配列番号１）を含むＶＥＰＥＰ－３細胞透過性ペプチドを含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_２は、Ｋ、ＲまたはＬであり（互いに独立に）、Ｘ_３は、ＦまたはＷであり（互いに独立に）、Ｘ_４は、Ｆ、ＷまたはＹであり（互いに独立に）、Ｘ_５は、Ｅ、ＲまたはＳであり、Ｘ_６は、Ｒ、ＴまたはＳであり、Ｘ_７は、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ_８は、存在しないか、ＦまたはＷであり、Ｘ_９は、ＰまたはＲであり、Ｘ_１０は、ＲまたはＬであり、Ｘ_１１は、Ｋ、ＷまたはＲであり、Ｘ_１２は、ＲまたはＦであり、Ｘ_１３は、ＲまたはＫである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２ＷＸ_４ＥＸ_２ＷＸ_４Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_３ＰＲＸ_１１ＲＸ_１３（配列番号２）を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_２は、Ｋ、ＲまたはＬであり、Ｘ_３は、ＦまたはＷであり、Ｘ_４は、Ｆ、ＷまたはＹであり、Ｘ_５は、Ｅ、ＲまたはＳであり、Ｘ_６は、Ｒ、ＴまたはＳであり、Ｘ_７は、Ｅ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ_８は、存在しないか、ＦまたはＷであり、Ｘ_９は、ＰまたはＲであり、Ｘ_１０は、ＲまたはＬであり、Ｘ_１１は、Ｋ、ＷまたはＲであり、Ｘ_１２は、ＲまたはＦであり、Ｘ_１３は、ＲまたはＫである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１ＫＷＦＥＲＷＦＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号３）、Ｘ_１ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ（配列番号４）、Ｘ_１ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＫ（配列番号５）、Ｘ_１ＲＷＷＥＫＷＷＴＲＷＰＲＫＲＫ（配列番号６）、またはＸ_１ＲＷＹＥＫＷＹＴＥＦＰＲＲＲＲ（配列番号７）を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ここで、細胞透過性ペプチドは、１０位のアミノ酸の非天然アミノ酸による置換え、２位のアミノ酸と３位のアミノ酸の間への非天然アミノ酸の付加、および２つの非天然アミノ酸の間の炭化水素連結の付加によって改変されている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１ＫＸ_１４ＷＷＥＲＷＷＲＸ_１４ＷＰＲＫＲＫ（配列番号８）を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_１４は、非天然アミノ酸であり、また、２つの非天然アミノ酸の間に炭化水素連結が存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＷＸ_５Ｘ_１０Ｘ_３ＷＸ_６Ｘ_７ＷＸ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＷＸ_１２Ｒ（配列番号９）を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_２は、Ｋ、ＲまたはＬであり、Ｘ_３は、ＦまたはＷであり、Ｘ_５は、ＲまたはＳであり、Ｘ_６は、ＲまたはＳであり、Ｘ_７は、ＲまたはＳであり、Ｘ_８は、ＦまたはＷであり、Ｘ_９は、ＲまたはＰであり、Ｘ_１０は、ＬまたはＲであり、Ｘ_１２は、ＲまたはＦである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１ＲＷＷＲＬＷＷＲＳＷＦＲＬＷＲＲ（配列番号１０）、Ｘ_１ＬＷＷＲＲＷＷＳＲＷＷＰＲＷＲＲ（配列番号１１）、Ｘ_１ＬＷＷＳＲＷＷＲＳＷＦＲＬＷＦＲ（配列番号１２）、またはＸ_１ＫＦＷＳＲＦＷＲＳＷＦＲＬＷＲＲ（配列番号１３）を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１および９～１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ここで、細胞透過性ペプチドは、５位および１２位のアミノ酸の非天然アミノ酸による置換え、および２つの非天然アミノ酸の間の炭化水素連結の付加によって改変されている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１ＲＷＷＸ_１４ＬＷＷＲＳＷＸ_１４ＲＬＷＲＲ（配列番号１４）を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータアラニンまたはセリンであり、Ｘ_１４は、非天然アミノ酸であり、また、２つの非天然アミノ酸の間に炭化水素連結が存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号７５または配列番号７６に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、カーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア内のカーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、カーゴと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－３ペプチドは標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法によるものである。
ＶＥＰＥＰ－６ペプチド

【0119】

一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子は、ＶＥＰＥＰ－６細胞透過性ペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ｘ_１ＬＸ_２ＲＡＬＷＸ_９ＬＸ_３Ｘ_９Ｘ_４ＬＷＸ_９ＬＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８（配列番号１５）、Ｘ_１ＬＸ_２ＬＡＲＷＸ_９ＬＸ_３Ｘ_９Ｘ_４ＬＷＸ_９ＬＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８（配列番号１６）およびＸ_１ＬＸ_２ＡＲＬＷＸ_９ＬＸ_３Ｘ_９Ｘ_４ＬＷＸ_９ＬＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８（配列番号１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_２は、ＦまたはＷであり、Ｘ_３は、Ｌ、Ｗ、ＣまたはＩであり、Ｘ_４は、Ｓ、Ａ、ＮまたはＴであり、Ｘ_５は、ＬまたはＷであり、Ｘ_６は、ＷまたはＲであり、Ｘ_７は、ＫまたはＲであり、Ｘ_８は、Ａであるかまたは存在せず、Ｘ_９は、ＲまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１ＬＸ_２ＲＡＬＷＲＬＸ_３ＲＸ_４ＬＷＲＬＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８（配列番号１８）を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_２は、ＦまたはＷであり、Ｘ_３は、Ｌ、Ｗ、ＣまたはＩであり、Ｘ_４は、Ｓ、Ａ、ＮまたはＴであり、Ｘ_５は、ＬまたはＷであり、Ｘ_６は、ＷまたはＲであり、Ｘ_７は、ＫまたはＲであり、Ｘ_８は、Ａであるかまたは存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１ＬＸ_２ＲＡＬＷＲＬＸ_３ＲＸ_４ＬＷＲＬＸ_５Ｘ_６ＫＸ_７（配列番号１９）を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_２は、ＦまたはＷであり、Ｘ_３は、ＬまたはＷであり、Ｘ_４は、Ｓ、ＡまたはＮであり、Ｘ_５は、ＬまたはＷであり、Ｘ_６は、ＷまたはＲであり、Ｘ_７は、Ａであるかまたは存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ｘ_１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＲＸ_２ＬＷＲＬＬＷＸ_３（配列番号２０）、Ｘ_１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＸ_２ＬＷＲＬＬＷＸ_３Ａ（配列番号２１）、Ｘ_１ＬＷＲＡＬＷＲＬＸ_４ＲＸ_２ＬＷＲＬＷＲＸ_３Ａ（配列番号２２）、Ｘ_１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＸ_２ＬＷＲＬＷＲＸ_３Ａ（配列番号２３）、Ｘ_１ＬＷＲＡＬＷＲＬＸ_５ＲＡＬＷＲＬＬＷＸ_３Ａ（配列番号２４）、およびＸ_１ＬＷＲＡＬＷＲＬＸ_４ＲＮＬＷＲＬＬＷＸ_３Ａ（配列番号２５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_２は、ＳまたはＴであり、Ｘ_３は、ＫまたはＲであり、Ｘ_４は、Ｌ、ＣまたはＩであり、Ｘ_５は、ＬまたはＩである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ａｃ－Ｘ_１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号２６）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－システアミド（配列番号２７）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＷＲＫＡ－システアミド（配列番号２８）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＷＲＫＡ－システアミド（配列番号２９）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＡＬＷＲＬＬＷＫＡ－システアミド（配列番号３０）、およびＡｃ－Ｘ_１ＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＮＬＷＲＬＬＷＫＡ－システアミド（配列番号３１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号１５～３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、８位および１２位の２つの残基間に炭化水素連結をさらに含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、Ａｃ－Ｘ_１ＬＦＲＡＬＷＲ_ＳＬＬＲＳ_ＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３２）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＦＬＡＲＷＲ_ＳＬＬＲＳ_ＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３３）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＦＲＡＬＷＳ_ＳＬＬＲＳ_ＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３４）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＦＬＡＲＷＳ_ＳＬＬＲＳ_ＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３５）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＲ_ＳＳＬＷＳ_ＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３６）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＦＬＡＲＷＲＬＬＲ_ＳＳＬＷＳ_ＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３７）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＦＲＡＬＷＲＬＬＳ_ＳＳＬＷＳ_ＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３８）、Ａｃ－Ｘ_１ＬＦＬＡＲＷＲＬＬＳ_ＳＳＬＷＳ_ＳＬＬＷＫ－システアミド（配列番号３９）、およびＡｃ－Ｘ_１ＬＦＡＲ_ＳＬＷＲＬＬＲＳ_ＳＬＷＲＬＬＷＫ－システアミド（配列番号４０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、また、後に下付きの「Ｓ」が続く残基は、前記炭化水素連結によって連結されている残基である。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号９２または９３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、配列番号９４～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、カーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア内のカーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、カーゴと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－６ペプチドは標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法によるものである。
ＶＥＰＥＰ－９ペプチド

【0120】

一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＷＷＸ_４Ｘ_５ＷＡＸ_６Ｘ_３Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１Ｘ_１２ＷＸ_１３Ｒ（配列番号４１）を含むＶＥＰＥＰ－９細胞透過性ペプチドを含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_２は、Ｌであるかまたは存在せず、Ｘ_３は、Ｒであるかまたは存在せず、Ｘ_４は、Ｌ、ＲまたはＧであり、Ｘ_５は、Ｒ、ＷまたはＳであり、Ｘ_６は、Ｓ、ＰまたはＴであり、Ｘ_７は、ＷまたはＰであり、Ｘ_８は、Ｆ、ＡまたはＲであり、Ｘ_９は、Ｓ、Ｌ、ＰまたはＲであり、Ｘ_１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ_１１は、Ｗまたは存在せず、Ｘ_１２は、Ａであるか、Ｒであるか、または存在せず、Ｘ_１３は、ＷまたはＦであり、Ｘ_３が存在しない場合、Ｘ_２、Ｘ_１１およびＸ_１２も存在しない。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２ＲＷＷＬＲＷＡＸ_６ＲＷＸ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＷＸ_１２ＷＸ_１３Ｒ（配列番号４２）を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_２は、Ｌであるかまたは存在せず、Ｘ_６は、ＳまたはＰであり、Ｘ_８は、ＦまたはＡであり、Ｘ_９は、Ｓ、ＬまたはＰであり、Ｘ_１０は、ＲまたはＳであり、Ｘ_１２は、ＡまたはＲであり、Ｘ_１３は、ＷまたはＦである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ_１ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ（配列番号４３）、Ｘ_１ＬＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＳＲＷＡＷＦＲ（配列番号４４）、Ｘ_１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号４５）、Ｘ_１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＬＳＷＲＷＷＲ（配列番号４６）、Ｘ_１ＲＷＷＬＲＷＡＰＲＷＦＰＳＷＲＷＷＲ（配列番号４７）、およびＸ_１ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＡＰＳＷＲＷＷＲ（配列番号４８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ_１ＷＷＸ_４Ｘ_５ＷＡＸ_６Ｘ_７Ｘ_８ＲＸ_１０ＷＷＲ（配列番号４９）のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳであり、Ｘ_４は、ＲまたはＧであり、Ｘ_５は、ＷまたはＳであり、Ｘ_６は、Ｓ、ＴまたはＰであり、Ｘ_７は、ＷまたはＰであり、Ｘ_８は、ＡまたはＲであり、Ｘ_１０は、ＳまたはＲである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、Ｘ_１ＷＷＲＷＷＡＳＷＡＲＳＷＷＲ（配列番号５０）、Ｘ_１ＷＷＧＳＷＡＴＰＲＲＲＷＷＲ（配列番号５１）、およびＸ_１ＷＷＲＷＷＡＰＷＡＲＳＷＷＲ（配列番号５２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ_１は、ベータ－ＡまたはＳである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号７８に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、配列番号１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、カーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア内のカーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、カーゴと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－９ペプチドは標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法によるものである。
ＡＤＧＮ－１００ペプチド

【0121】

一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列Ｘ_１ＫＷＲＳＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＲＷＲＬＷＲＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＳＲ（配列番号５３）を含むＡＤＧＮ－１００細胞透過性ペプチドを含み、ここで、Ｘ_１は、任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ_２～_８は、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列Ｘ_１ＫＷＲＳＸ_２Ｘ_３Ｘ_４ＲＷＲＬＷＲＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８ＳＲ（配列番号５４）を含み、ここで、Ｘ_１は、βＡであるか、Ｓであるか、または存在せず、Ｘ_２は、ＡまたはＶであり、Ｘ_３は、ＧまたはＬであり、Ｘ_４は、ＷまたはＹであり、Ｘ_５は、ＶまたはＳであり、Ｘ_６は、Ｒ、Ｖ、またはＡであり、Ｘ_７は、ＳまたはＬであり、Ｘ_８は、ＷまたはＹである。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列ＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号５５）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号５６）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号５７）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号５８）を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、炭化水素連結によって連結した３個または６個の残基によって分離された２つの残基を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、アミノ酸配列ＫＷＲＳ_ＳＡＧＷＲ_ＳＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号５９）、ＫＷＲ_ＳＳＡＧＷＲＷＲ_ＳＬＷＲＶＲＳＷＳＲ（配列番号６０）、ＫＷＲＳＡＧＷＲ_ＳＷＲＬＷＲＶＲ_ＳＳＷＳＲ（配列番号６１）、ＫＷＲＳ_ＳＡＬＹＲ_ＳＷＲＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号６２）、ＫＷＲ_ＳＳＡＬＹＲＷＲ_ＳＬＷＲＳＲＳＷＳＲ（配列番号６３）、ＫＷＲＳＡＬＹＲ_ＳＷＲＬＷＲＳＲ_ＳＳＷＳＲ（配列番号６４）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲ_ＳＬＷＲＳ_ＳＲＳＷＳＲ（配列番号６５）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳ_ＳＲＳＷＳ_ＳＲ（配列番号６６）、ＫＷＲ_ＳＳＡＬＹＲＷＲ_ＳＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号６７）、ＫＷＲＳ_ＳＡＬＹＲ_ＳＷＲＬＷＲＳＡＬＹＳＲ（配列番号６８）、ＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲ_ＳＬＷＲＳ_ＳＡＬＹＳＲ（配列番号６９）、またはＫＷＲＳＡＬＹＲＷＲＬＷＲＳ_ＳＡＬＹＳ_ＳＲ（配列番号７０）を含み、ここで、下付き文字「Ｓ」で印づけられた残基は、炭化水素連結によって連結している。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号７９または８０に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号８６に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、配列番号８７～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、カーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア内のカーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、カーゴと結び付いている。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＧＮ－１００ペプチドは標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法によるものである。
ＶＥＰＥＰ－４ペプチド

【0122】

一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列ＸＷＸＲＬＸＸＸＸＸＸ（配列番号１４０）を含むＶＥＰＥＰ－４細胞透過性ペプチドを含み、ここで、１位のＸは、ベータ－ＡまたはＳである；３位、９位および１０位のＸは、互いに独立に、ＷまたはＦである；６位のＸは、８位のＸがＳの場合にはＲであり、６位のＸは、８位のＸがＲの場合にはＳである；７位のＸは、Ｌであるかまたは存在しない；１１位のＸは、Ｒであるかまたは存在せず、および７位のＸは、１１位のＸが存在しない場合には、Ｌである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、配列番号１４１～１４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、カーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子のコア内のカーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、カーゴと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－４ペプチドは標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法によるものである。
ＶＥＰＥＰ－５ペプチド

【0123】

一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、アミノ酸配列ＲＸＷＸＲＬＷＸＲＬＲ（配列番号１４５）を含むＶＥＰＥＰ－５細胞透過性ペプチドを含み、２位のＸは、ＲまたはＳであり、４位および８位のＸは、互いに独立に、ＷまたはＦである。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、配列番号１４６～１５１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、カーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子のコア内のカーゴ送達複合体内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子のコア内に存在し、カーゴと結び付いている。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子の中間層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは、ナノ粒子の表層内に存在する。一部の実施形態では、ＶＥＰＥＰ－５ペプチドは標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法によるものである。

【0124】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＰＰ（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、ＣＰＰのＮ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ＣＰＰのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基、ステアリル基、脂肪酸、コレステロール、ポリ－エチレングリコール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖、および標的化分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、アセチル基および／またはステアリル基である。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に連結したアセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に連結したアセチル基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に連結したステアリル基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基および／またはステアリル基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に共有結合により連結したアセチル基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＮ末端に共有結合により連結したステアリル基を含む。

【0125】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＰＰ（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、ＣＰＰのＣ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ＣＰＰのＣ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、システアミド基、システイン、チオール、アミド、ニトリロ三酢酸、カルボキシル基、直鎖状または分枝（ｒａｍｉｆｉｅｄ）Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、一級または二級アミン、オシド誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリ－エチレングリコール、核局在化シグナル、核外移行シグナル、抗体またはその抗体断片、ペプチド、多糖、および標的化分子からなる群から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、システアミド基である。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＣ末端に連結したシステアミド基を含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、そのＣ末端に共有結合により連結したシステアミド基を含む。

【0126】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＰＰ（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、ステープル留めされている。「ステープル留め」とは、本明細書で使用される場合、ペプチド内の２つの残基間の化学的連結を指す。一部の実施形態では、ＣＰＰはステープル留めされており、ペプチドの２つのアミノ酸間に化学的連結を含む。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸は、３個または６個のアミノ酸によって分離されている。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸は、３個のアミノ酸によって分離されている。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸は、６個のアミノ酸によって分離されている。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸のそれぞれは、ＲまたはＳである。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸のそれぞれは、Ｒである。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸のそれぞれは、Ｓである。一部の実施形態では、化学的連結によって連結した２つのアミノ酸の一方はＲであり、他方はＳである。一部の実施形態では、化学的連結は、炭化水素連結である。

【0127】

一部の実施形態では、ＣＰＰは、Ｌ－アミノ酸を含むＬ－ペプチドである。一部の実施形態では、ＣＰＰは、レトロインベルソペプチド（例えば、逆向きの配列のＤ－アミノ酸で構成され、伸長させた場合、その親分子と同様の側鎖トポロジーが想定されるが、アミドペプチド結合が反転しているペプチド）である。

【0128】

一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＰＰ（例えば、ＰＥＰ－１、ＰＥＰ－２、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチド）は、１つまたは複数の部分をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ＣＰＰのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、第１の部分がＣＰＰのＮ末端にコンジュゲートしており、第２の部分がＣＰＰのＣ末端にコンジュゲートしている。

【0129】

一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、標的化分子を含む。一部の実施形態では、標的化分子は、ＣＰＰのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、第１の標的化分子がＣＰＰのＮ末端にコンジュゲートしており、第２の標的化分子がＣＰＰのＣ末端にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、標的化分子は、少なくとも約３個、４個、または５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、標的化分子は、約８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、または４個以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、標的化分子は、約３個、４個、または５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、標的化分子は、ＧＹ、ＹＶ、ＶＳ、ＳＫ、ＧＹＶ、ＹＶＳ、ＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＶＳＫ、ＹＩ、ＩＧ、ＧＳ、ＳＲ、ＹＩＧ、ＩＧＳ、ＧＳＲ、ＹＩＧＳ、ＩＧＳＲからなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、配列（例えば、標的化配列）は、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される。

【0130】

一部の実施形態では、配列（例えば、標的化配列）は、配列番号１５２～１６２からなる群から選択される。

【0131】

一部の実施形態では、標的化分子は、ＣＰＰとリンカーを介してコンジュゲートしている。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２個、３個、または４個のグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。

【0132】

一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＴ）を含む。一部の実施形態では、ポリマーは、ＣＰＰのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、第１のポリマーがＣＰＰのＮ末端とコンジュゲートしており、第２のポリマーがＣＰＰのＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ポリマーは、ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ以下、１０ｋＤａ以下、１５ｋＤａ以下、２０ｋＤａ以下、３０ｋＤａ以下、または４０ｋＤａ以下である。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、少なくとも約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａ、または約３０ｋＤａ～約４０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または４０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約１０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも約１個、２個、または３個のエチレングリコール単位を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約３個以下、２個以下、または１個以下のエチレングリコール単位を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１個、２個、または３個のエチレングリコール単位を含む。
標的化部分

【0133】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、ＣＰＰのＮ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、標的化部分は、ＣＰＰのＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、第１の標的化部分がＣＰＰのＮ末端とコンジュゲートしており、第２の標的化部分がＣＰＰのＣ末端とコンジュゲートしている。

【0134】

一部の実施形態では、標的化部分は、１つまたは複数の器官を標的とする標的化ペプチドを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の器官は、筋肉、心臓、脳、脾臓、リンパ節、肝臓、肺、および腎臓からなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、脳を標的とするものである。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、筋肉を標的とするものである。一部の実施形態では、標的化ペプチドは、心臓を標的とするものである。

【0135】

一部の実施形態では、標的化部分は、少なくとも約３個、４個、または５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、約８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、または４個以下のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、約３個、４個、または５個のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、ＧＹ、ＹＶ、ＶＳ、ＳＫ、ＧＹＶ、ＹＶＳ、ＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＶＳＫ、ＹＩ、ＩＧ、ＧＳ、ＳＲ、ＹＩＧ、ＩＧＳ、ＧＳＲ、ＹＩＧＳ、ＩＧＳＲからなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、配列（例えば、標的化配列）は、ＧＹＶＳＫ、ＧＹＶＳ、ＹＩＧＳ、およびＹＩＧＳＲからなる群から選択される。

【0136】

一部の実施形態では、標的化部分は、配列番号１５２～１６２からなる群から選択される標的化配列を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＳＹＴＳＳＴＭ（配列番号１５２）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＣＫＴＲＲＶＰ（配列番号１５３）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＴＨＲＰＰＮＷＳＰＶ（配列番号１５４）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＤＨＮＧ（配列番号１５５）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＣＡＲＰＡＲ（配列番号１５６）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＡＳＳＬＮＩＡ（配列番号１５９）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＬＳＳＲＬＤＡ（配列番号１６０）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＫＳＹＤＴＹ（配列番号１６１）を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、標的化配列ＣＫＲＡＶ（配列番号１６２）を含む。

【0137】

一部の実施形態では、標的化部分は、ＣＰＰと、本明細書に記載のリンカー部分のいずれか１つなどのリンカー部分を介してコンジュゲートしている。
リンカー部分

【0138】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、リンカー部分を含む。

【0139】

一部の実施形態では、リンカー部分は、ポリグリシンリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、β－アラニンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも約２個、３個、または４個のグリシン、必要に応じて連続したグリシンを含む。一部の実施形態では、リンカーは、セリンをさらに含む。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳまたはＳＧＧＧＧ配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン－β－アラニンモチーフを含む。

【0140】

一部の実施形態では、１つまたは複数の部分は、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリシン、ＰＥＴ）を含む。一部の実施形態では、ポリマーは、ＣＰＰのＮ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ポリマーは、ＣＰＰのＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、第１のポリマーがＣＰＰのＮ末端とコンジュゲートしており、第２のポリマーがＣＰＰのＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ポリマーは、ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ以下、１０ｋＤａ以下、１５ｋＤａ以下、２０ｋＤａ以下、３０ｋＤａ以下、または４０ｋＤａ以下である。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、少なくとも約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、または４０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａ、約１０ｋＤａ～約１５ｋＤａ、約１５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａ、または約３０ｋＤａ～約４０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または４０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約５ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は、約１０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧは、少なくとも約１個、２個、または３個のエチレングリコール単位を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１０個以下、９個以下、８個以下または７個以下のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１個、２個、または３個のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１個～８個、または約２個～７個のエチレングリコール単位からなる。

【0141】

一部の実施形態では、リンカー部分は、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカー部分は、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）を含む。一部の実施形態では、リンカー部分は、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）を含む。一部の実施形態では、リンカー部分は、Ａｈｘ（アミノカプロン酸）を含む。
炭水化物部分

【0142】

一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、炭水化物部分をさらに含む。一部の実施形態では、炭水化物部分は、ＧａｌＮＡｃである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１０６ペプチドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、炭水化物部分により細胞透過性ペプチド内のアラニンが修飾されている。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号１２４または１２９に記載される。
第１の細胞透過性ペプチドおよび第２の細胞透過性ペプチド

【0143】

一部の実施形態では、第２のペプチドは、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドは、ＰＥＧ部分を有さない。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比は、約５０対１である（例えば、約２５対約２、約２０対約３、約１５対約４、約１２対約４、約１２対約５、または約１０対約５など）。

【0144】

一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、直鎖状ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、分枝ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分の分子量は、約５ｋＤａ～約１０ｋＤａである。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、約１～１０個のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＣ末端とコンジュゲートしている。
カーゴ分子

【0145】

一部の実施形態では、上記の複合体またはナノ粒子のカーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0146】

一部の実施形態では、上記の複合体またはナノ粒子のカーゴ分子は、核酸である。一部の実施形態では、カーゴ分子は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、一本鎖または二本鎖オリゴおよびポリヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどを含めた様々な形態のＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンタゴミル、リボザイム、アプタマー、プラスミドＤＮＡなど、ならびに、これらのうちの１つまたは複数の適切な組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよびその類似体からなる群から選択される。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡｉを含む。一部の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡおよびＲＮＡｉを含み、ｍＲＮＡは、疾患または状態を処置するための治療用タンパク質をコードするものであり、ＲＮＡｉは、ＲＮＡを標的とするものであり、当該ＲＮＡの発現は、疾患または状態に関連付けられる。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドの核酸に対するモル比は、約１：１から約１００：１の間である。

【0147】

一部の実施形態では、カーゴ分子は、例えば、酵素または抗体、または小分子などのタンパク質である。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸とタンパク質または小分子の組合せを含む複数のカーゴ分子を含む。一部の実施形態では、組合せは、互いに共有結合により付着した核酸とタンパク質または小分子を含む。一部の実施形態では、組合せは、互いに共有結合により付着していない核酸とタンパク質または小分子を含む。

【0148】

「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／もしくはそれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み入れることができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有する、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、予め凝縮させたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、または誘導体およびこれらの群の組合せの形態であり得る。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、およびこれらの組合せの形態であり得る。核酸は、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、およびジップ核酸（ＺＮＡ）を含めた、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または連結を含有する核酸を含み、これらは、合成核酸、天然に存在する核酸、および天然に存在しない核酸であり得、また、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体の例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。特に限定がない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指定のない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮退コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補配列ならびに明確に示されている配列も暗黙のうちに包含する。具体的には、縮退コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる（Batzer e al., Nucleic Acid Res., 19: 5081 (1991)；Ohtsuka et a ., j . Biol. Chern., 260: 2605-2608 (1985)；Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8: 91-98 (1994)）。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を通じて連結している。「塩基」は、プリンおよびピリミジンを含み、これらは、天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類似体、ならびにプリンおよびピリミジンの合成誘導体をさらに含み、これらとしては、これだけに限定されないが、例えば、これだけに限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラーゼ、およびハロゲン化アルキルなどの新しい反応性基が置かれる改変が挙げられる。「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、一般に、必ずではないが一般に約２００ヌクレオチド未満の長さの、短い、一般に合成されたものであるポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、オリゴヌクレオチドに同等かつ完全に適用可能である。

【0149】

一部の実施形態では、核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、核酸は、二本鎖オリゴヌクレオチドである。本明細書に記載の核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンタゴミルの場合では必ずではないが２００ヌクレオチドまで、またはプラスミドＤＮＡの場合では１０００キロ塩基までの様々な長さのいずれかであり得る。

【0150】

一部の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどの干渉ＲＮＡである。「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」という用語は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子または配列と同じ細胞内に存在する場合に、標的遺伝子または配列の発現を低減または阻害することができる（例えば、干渉ＲＮＡ配列と相補的なｍＲＮＡの分解を媒介することまたは干渉ＲＮＡ配列と相補的なｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって）一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、もしくはプレｍｉＲＮＡなどの二重鎖ＲＮＡ）を指し、したがって、干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列と、または２つの相補鎖によってもしくは単一の自己相補鎖によって形成された二本鎖ＲＮＡと相補的な一本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子または配列に対して実質的または完全な同一性を有し得る、またはミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を有し得る。干渉ＲＮＡの配列は、全長の標的遺伝子、またはその部分配列に対応し得る。干渉ＲＮＡは、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば、約１５～６０、１５～５０、または５～４０（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、より一般には約１５～３０、１５～２５、または１９～２５（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３（二重鎖）ヌクレオチドの長さ（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチドの長さであり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１５～６０、１５～５０、１５～４０、５～３０、５～２５、または１９～２５塩基対の長さ、好ましくは約８～２２、９～２０、または１９～２１塩基対の長さである）の干渉ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１～約４ヌクレオチドまたは約２～約３ヌクレオチドの３’突出および５’リン酸末端を含み得る。ｓｉＲＮＡの例としては、限定することなく、一方の鎖がセンス鎖であり、他方の鎖が相補的なアンチセンス鎖である２つの別々の鎖分子からアセンブルされた二本鎖ポリヌクレオチド分子；センス領域とアンチセンス領域が核酸に基づくリンカーまたは核酸に基づくものではないリンカーによって連結した一本鎖分子からアセンブルされた二本鎖ポリヌクレオチド分子；自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子；および２つまたはそれよりも多くのループ構造および自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を有するステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子であって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで処理して活性な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる、環状ポリヌクレオチドが挙げられる。ｓｉＲＮＡは化学的に合成されたものであることが好ましい。ｓｉＲＮＡは、長いｄｓＲＮＡ（例えば、約２５ヌクレオチドの長さよりも長いｄｓＲＮＡ）をＥ ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ ＩＩＩまたはＤｉｃｅｒで切断することによって生成することもできる。これらの酵素により、ｄｓＲＮＡが加工されて生物活性のあるｓｉＲＮＡになる（例えば、Yang et al., Proc Natl. Acad. Set. USA, 99: 9942-9947 (2002)；Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 14236 (2002)；Byrom et al., Ambion TeehNotes, 10 (1):4-6(2003)；Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 3 1:981-987 (2003)；Knight et al., Science, 293: 2269-2271 (2001)；およびRobertson et al., J. Biol. Chem., 243: 82 (1968)を参照されたい）。ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド～約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの長さであることが好ましい。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチドの長さと同じくらいの長さ、またはそれよりも長いものであり得る。ｄｓＲＮＡは、遺伝子転写物全体または部分的な遺伝子転写物をコードするものであり得る。ある特定の場合では、ｓｉＲＮＡをプラスミドにコードさせる（例えば、ヘアピンループを有する二重鎖に自動的にフォールディングされる配列として転写する）ことができる。低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ ｏｒ ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができるタイトなヘアピンターンを構成するＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によって切断されてｓｉＲＮＡになり、次いでこれがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、それと結合するｓｉＲＮＡとマッチするｍＲＮＡに結合し、それを切断する。干渉ＲＮＡの適切な長さは、約５～約２００ヌクレオチド、または１０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、対応する標的遺伝子と実質的に相補的である（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きく同一である、など）。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡを、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み入れることによって改変する。

【0151】

一部の実施形態では、核酸は、二本鎖アンチセンスＲＮＡである。干渉ＲＮＡの適切な長さは、約５～約２００ヌクレオチド、または１０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、対応する標的遺伝子と実質的に相補的である（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きく同一である、など）。一部の実施形態では、アンチセンスＲＮＡを、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み入れることによって改変する。

【0152】

一部の実施形態では、核酸は、干渉ＲＮＡ、例えば、がんなどの疾患に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子を特異的に標的とするｓｉＲＮＡなどである。一部の実施形態では、疾患は、固形腫瘍または血液悪性腫瘍などのがんであり、干渉ＲＮＡは、がんに関与するタンパク質、例えば、がんの増悪の調節に関与するタンパク質などをコードするｍＲＮＡを標的とするものである。

【0153】

一部の実施形態では、核酸は、干渉ＲＮＡ、例えば、免疫応答の負の調節に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子を特異的に標的とするｓｉＲＮＡなどである。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを標的とするものである。一部の実施形態では、負の共刺激分子として、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、およびＣＴＬＡ－４が挙げられる。

【0154】

一部の実施形態では、核酸は、ｍｉＲＮＡである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略される）は、真核細胞において見いだされる短いリボ核酸（ＲＮＡ）分子である。マイクロＲＮＡ分子は、他のＲＮＡと比較して非常にわずかなヌクレオチド（平均２２個）を有する。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補配列に結合する転写後調節因子であり、通常、翻訳抑止または標的分解および遺伝子サイレンシングをもたらす。ヒトゲノムは、１０００種を超えるｍｉＲＮＡをコードし得、これらは哺乳動物の遺伝子の約６０％を標的とし得、多くのヒト細胞型において豊富である。ｍｉＲＮＡの適切な長さは、約５～約２００ヌクレオチド、または０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対である。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、対応する標的遺伝子と実質的に相補的である（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きく同一である、など）。一部の実施形態では、アンチセンスＲＮＡを、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み入れることによって改変する。

【0155】

一部の実施形態では、核酸は、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ（例えば、ＤＮＡ断片、例えば、長さが最大約１０００ｂｐのＤＮＡ断片）である。さらに、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡは、高度にメチル化されたものであっても低度にメチル化されたものであってもよい。一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡは、１つまたは複数の遺伝子をコードし、前記１つまたは複数の遺伝子の発現に必要な調節エレメントを含有し得る。一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡは、選択マーカーをコードする１つまたは複数の遺伝子を含み得、それにより、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ断片を妥当な宿主細胞内で維持することが可能になる。

【0156】

一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡは、標的抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするＤＮＡ配列を含む。ＣＡＲは、例えば、開示全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許第８，８２２，６４７号、米国特許出願公開第２０１５／００５１２６６号、ＷＯ２０１４／１２７２６１、およびＷＯ２０１４０９９６７１に記載されている。一部の実施形態では、標的抗原は、がん細胞に抗原特異的に関連する（例えば、がん細胞によって発現されるなど）。例えば、一部の実施形態では、プラスミドＤＮＡは、がんに関連する抗原に特異的に結合する細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、がんに関連する抗原は、固形腫瘍に関連するものである。一部の実施形態では、がんに関連する抗原は、Ｂ細胞悪性腫瘍または白血病などの血液悪性腫瘍に関連するものである。

【0157】

一部の実施形態では、カーゴ分子は、ウイルスを含む。一部の実施形態では、ウイルスは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ポックスウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、およびヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）を含めた組換えウイルスである。一部の実施形態では、組換えウイルスは、細胞ゲノムに挿入するための導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、治療用導入遺伝子である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、治療用タンパク質などのタンパク質をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、内因性遺伝子、例えば、疾患に関連する内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉなどの阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＡＲをコードする。一部の実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡｉをコードする第１の導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する内因性遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡｉである。一部の実施形態では、治療用ＲＮＡｉは、疾患に関連する形態の内因性遺伝子（例えば、突然変異タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常な発現をもたらす遺伝子）を標的とする。一部の実施形態では、ウイルスは、タンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、疾患または状態の処置に有用な治療用タンパク質である。一部の実施形態では、第２の導入遺伝子は、治療用形態の内因性遺伝子である（例えば、第２の導入遺伝子は、内因性遺伝子によってコードされる野生型または機能性形態の突然変異タンパク質をコードする、または第２の導入遺伝子により、内因性遺伝子によってコードされるタンパク質の正常な発現がもたらされる）。一部の実施形態では、第１の導入遺伝子および第２の導入遺伝子を含むウイルスが提供される。

【0158】

一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡ（例えば、ＰＴＥＮ）およびｓｉＲＮＡ（例えば、癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とするｓｉＲＮＡなど）の両方を含む。

【0159】

一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡ（例えば、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡなど）およびガイドＲＮＡ（例えば、突然変異した癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ）を標的とするガイドＲＮＡなど）の両方を含む。
ゲノム編集系

【0160】

一部の実施形態では、カーゴは、ゲノム編集系分子を含む。

【0161】

一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子のゲノム編集系分子（例えば、ＲＧＥＮ）は、タンパク質またはポリペプチドである。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＲＧＥＮ（例えば、Ｃａｓ９）を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、約１０ｋＤａから約２００ｋＤａの間（例えば、おおよそで、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、および２００ｋＤａのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、複数のタンパク質またはポリペプチドを含み、複数のタンパク質またはポリペプチドのそれぞれが、約１０ｋＤａから約２００ｋＤａの間（例えば、おおよそで、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１６０ｋＤａ、１７０ｋＤａ、１８０ｋＤａ、１９０ｋＤａ、および２００ｋＤａのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。

【0162】

一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子のゲノム編集系分子（例えば、ｇＲＮＡ）は、核酸である。一部の実施形態では、核酸は、約２０ｎｔから約２０ｋｂの間（例えば、おおよそで、０．０２ｋｂ、０．０３ｋｂ、０．０４ｋｂ、０．０５ｋｂ、０．０６ｋｂ、０．０７ｋｂ、０．０８ｋｂ、０．０９ｋｂ、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂ、７．５ｋｂ、８ｋｂ、８．５ｋｂ、９ｋｂ、９．５ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、および２０ｋｂのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ｇＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、約２０ｎｔから約２００ｎｔの間（例えば、おおよそで、２０ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、６０ｎｔ、７０ｎｔ、８０ｎｔ、９０ｎｔ、１００ｎｔ、１１０ｎｔ、１２０ｎｔ、１３０ｎｔ、１４０ｎｔ、１５０ｎｔ、１６０ｎｔ、１７０ｎｔ、１８０ｎｔ、１９０ｎｔ、および２００ｎｔのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、核酸は、ゲノム編集系分子をコードするＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノム編集系分子を発現させるための発現カセットを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、約１ｋｂから約２０ｋｂの間（例えば、おおよそで、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、および２０ｋｂのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）。一部の実施形態では、核酸は、ゲノム編集系分子をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約１００ｎｔから約１０ｋｂの間（例えば、おおよそで、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂ、７．５ｋｂ、８ｋｂ、８．５ｋｂ、９ｋｂ、９．５ｋｂ、および１０ｋｂのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、本明細書に記載の核酸のいずれかなどの複数の核酸を含む。例えば、一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ｇＲＮＡおよびゲノム編集系分子をコードする核酸（例えば、ゲノム編集系分子をコードするＤＮＡプラスミドまたはｍＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ゲノム編集複合体またはナノ粒子は、複数のゲノム編集系分子をコードする核酸（例えば、複数のゲノム編集系分子をコードする１つまたは複数のＤＮＡプラスミド、または複数のゲノム編集系分子をコードする複数のｍＲＮＡ）を含む。

【0163】

一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子のゲノム編集系分子（例えば、ＲＧＥＮまたはｇＲＮＡ）を、ゲノム編集系分子をコードする核酸で置き換える。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム編集複合体またはナノ粒子は、ＲＧＥＮをコードする核酸および／またはｇＲＮＡをコードする核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、ゲノム編集系分子をコードするＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、ゲノム編集系分子を発現させるための発現カセットを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡプラスミドは、約１ｋｂから約２０ｋｂの間（例えば、おおよそで、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、および２０ｋｂのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、核酸は、ゲノム編集系分子をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約１００ｎｔから約１０ｋｂの間（例えば、おおよそで、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、５．５ｋｂ、６ｋｂ、６．５ｋｂ、７ｋｂ、７．５ｋｂ、８ｋｂ、８．５ｋｂ、９ｋｂ、９．５ｋｂ、および１０ｋｂのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。

【0164】

一部の実施形態では、カーゴは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知）、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、そのホモログ、またはその改変バージョン、例えば、誘導性、不活化、または分割Ｃａｓタンパク質などが挙げられる（例えば、Dominguez et al. (2015). Nature Reviews Molecular Cell Biology；Polstein, L. R., & Gersbach, C. A. (2015). Nature chemical biology, 11(3) : 198-200；Dow et al. (2015). Nature biotechnology, 33(4) : 390-394；Zetsche et al. (2015). Nature biotechnology, 33(2) : 139-142；Kleinstiver et al. (2015). Nature. 523:481-485；Bikard et al. (2013). Nucleic acids research, 41(15) : 7429-7437；Qi et al. (2013). Cell, 152(5) : 1173-1183を参照されたい）。これらの酵素は、当業者に公知である；例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｑ９９ＺＷ２の下に見いだすことができ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列はＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｕ２ＵＭＱ６の下に見いだすことができる。一部の実施形態では、例えばＣａｓ９など、改変されていないＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９であり、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＣａｓ９であり得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１であり、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１であり得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素により、標的配列内および／または標的配列の相補物内などの標的配列の場所における一方または両方の鎖の切断が方向付けられる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素により、標的配列の最初のヌクレオチドまたは最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれよりも多くの塩基対以内での一方または両方の鎖の切断が方向付けられる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、対応する野生型酵素に対して突然変異したものであり、その結果、突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一方の鎖または両方の鎖を切断する能力を欠く。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン内のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）により、Ｃａｓ９が、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換される。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例としては、限定することなく、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼを、ガイド配列、例えば、それぞれＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖を標的とする２つのガイド配列と組み合わせて使用することができる。この組合せにより、両方の鎖にニックを入れ、ＮＨＥＪの誘導に使用することが可能になる。

【0165】

さらなる例として、Ｃａｓ９の２つまたはそれよりも多くの触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、およびＲｕｖＣ ＩＩＩ）を突然変異させて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠く突然変異Ｃａｓ９を作製することができる。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、またはＮ８６３Ａ突然変異のうちの１つまたは複数と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠くＣａｓ９酵素を作製する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異した酵素のＤＮＡ切断活性が、その突然変異していない形態に対して約２５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、０．１％未満、０．０１％未満である、またはそれよりも低い場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に欠くとみなされる。他の突然変異も有用でありうる；Ｃａｓ９または他のＣＲＩＳＰＲ酵素がＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ以外の種に由来するものである場合、対応するアミノ酸の突然変異を行って同様の効果を実現することができる。

【0166】

一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）は、Ｎ末端Ｃａｓタンパク質断片、Ｃａｓ（Ｎ）、およびＣ末端Ｃａｓタンパク質断片、Ｃａｓ（Ｃ）を含む分割Ｃａｓタンパク質であり、ここで、Ｃａｓ（Ｎ）は第１の二量体形成ドメインと融合しており、Ｃａｓ（Ｃ）は第２の二量体形成ドメインと融合しており、また、第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメインにより、Ｃａｓ（Ｎ）とＣａｓ（Ｃ）の二量体形成が容易になって、機能的なＣａｓヌクレアーゼ活性を有する複合体が形成される。一部の実施形態では、第１の二量体形成ドメインと第２の二量体形成ドメインの二量体形成は、二量体形成剤に対して感受性である。例えば、一部の実施形態では、第１の二量体形成ドメインおよび第２の二量体形成ドメインは、ＦＫ５０６結合性タンパク質１２（ＦＫＢＰ）およびラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）のＦＫＢＰラパマイシン結合性（ＦＲＢ）ドメインを含み、二量体形成剤はラパマイシンである。

【0167】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列を、真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化する。真核細胞は、これだけに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長類を含めた哺乳動物などの特定の生物体のものまたは特定の生物体に由来するものであり得る。一般に、コドン最適化は、目的の宿主細胞における発現を増強するために、核酸配列を、ネイティブな配列の少なくとも１個のコドン（例えば、約１個または約１個よりも多く、約２個または約２個よりも多く、約３個または約３個よりも多く、約４個または約４個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、約１５個または約１５個よりも多く、約２０個または約２０個よりも多く、約２５個または約２５個よりも多く、約５０個または約５０個よりも多く、またはそれよりも多くのコドン）を、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって改変する一方で、ネイティブなアミノ酸配列を維持するプロセスを指す。種々の種が特定のアミノ酸に関してある特定のコドンへの特定の偏りを示す。コドンバイアス（生物体間のコドン使用の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、今度は翻訳の効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞において選択されるｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映するものである。したがって、所与の生物体における最適な遺伝子発現のために、遺伝子をコドン最適化に基づいて調整することができる。コドン使用表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表をいくつかのやり方で適合させることができる。Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）も利用可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列における１つまたは複数のコドン（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、またはそれよりも多く、または全てのコドン）が特定のアミノ酸に関して最も頻繁に使用されるコドンに対応する。

【0168】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約１個または約１個よりも多く、約２個または約２個よりも多く、約３個または約３個よりも多く、約４個または約４個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約６個または約６個よりも多く、約７個または約７個よりも多く、約８個または約８個よりも多く、約９個または約９個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、またはそれよりも多くのＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端またはその付近に約１個または約１個よりも多く、約２個または約２個よりも多く、約３個または約３個よりも多く、約４個または約４個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約６個または約６個よりも多く、約７個または約７個よりも多く、約８個または約８個よりも多く、約９個または約９個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、またはそれよりも多くのＮＬＳを含むか、カルボキシ末端またはその付近に約１個または約１個よりも多く、約２個または約２個よりも多く、約３個または約３個よりも多く、約４個または約４個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約６個または約６個よりも多く、約７個または約７個よりも多く、約８個または約８個よりも多く、約９個または約９個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、またはそれよりも多くのＮＬＳを含むか、またはこれらの組合せを含む（例えば、アミノ末端に１つまたは複数のＮＬＳを含み、カルボキシ末端に１つまたは複数のＮＬＳを含む）。１つよりも多くのＮＬＳが存在する場合、それぞれを他のＮＬＳとは独立に選択することができ、したがって、単一のＮＬＳが１つよりも多くのコピー内に存在する可能性もあり、かつ／または、１つまたは複数のコピー内の１つまたは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在する可能性もある。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、最大で６個のＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近くのアミノ酸がポリペプチド鎖に沿ってＮ末端またはＣ末端から約１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、４０アミノ酸、５０アミノ酸、またはそれよりも多くのアミノ酸以内にある場合、Ｎ末端またはＣ末端の付近にあるとみなされる。一般には、ＮＬＳは、タンパク質表面に露出した正に荷電したリシンまたはアルギニンの１つまたは複数の短い配列からなるが、他の型のＮＬＳも公知である。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ－抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二連ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファ由来のＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ－ａｂ１ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。

【0169】

一般に、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列に対して、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を方向付けるために十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントした場合、約５０％または約５０％よりも大きい、約６０％または約６０％よりも大きい、約７５％または約７５％よりも大きい、約８０％または約８０％よりも大きい、約８５％または約８５％よりも大きい、約９０％または約９０％よりも大きい、約９５％または約９５％よりも大きい、約９７．５％または約９７．５％よりも大きい、約９９％または約９９％よりも大きい、またはそれよりも大きい。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５個または約５個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、約１１個または約１１個よりも多く、約１２個または約１２個よりも多く、約１３個または約１３個よりも多く、約１４個または約１４個よりも多く、約１５個または約１５個よりも多く、約１６個または約１６個よりも多く、約１７個または約１７個よりも多く、約１８個または約１８個よりも多く、約１９個または約１９個よりも多く、約２０個または約２０個よりも多く、約２１個または約２１個よりも多く、約２２個または約２２個よりも多く、約２３個または約２３個よりも多く、約２４個または約２４個よりも多く、約２５個または約２５個よりも多く、約２６個または約２６個よりも多く、約２７個または約２７個よりも多く、約２８個または約２８個よりも多く、約２９個または約２９個よりも多く、約３０個または約３０個よりも多く、約３５個または約３５個よりも多く、約４０個または約４０個よりも多く、約４５個または約４５個よりも多く、約５０個または約５０個よりも多く、約７５個または約７５個よりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５個未満、５０個未満、４５個未満、４０個未満、３５個未満、３０個未満、２５個未満、２０個未満、１５個未満、１２個未満、またはそれ未満のヌクレオチドの長さである。ガイド配列の、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を方向付ける能力は、任意の適切なアッセイによって評価することができる。例えば、試験されるガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を、対応する標的配列を有する宿主細胞に供給し、その後、標的配列内の優先的な切断を、例えば本明細書に記載の調査またはアッセイによってなどで評価する。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験管中で、標的配列に、試験されるガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、標的配列における結合または切断速度を試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応で比較することによって評価することができる。他のアッセイが可能であり、当業者には想起されよう。

【0170】

ガイド配列は、任意の標的配列を標的とするように選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列としては、標的ゲノムに特有の配列が挙げられる。一部の実施形態では、ガイド配列を、ガイド配列内の二次構造の程度が低下するように選択する。二次構造は、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定することができる。いくつかのプログラムは、最小のギブス自由エネルギーの算出に基づく。１つのそのようなアルゴリズムの例は、Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)に記載されている通り、ｍＦｏｌｄである。フォールディングアルゴリズムの別の例は、ウイーン大学のInstitute for Theoretical Chemistryにおいて、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用して開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、A. R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24; and P A Carr and G M Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62を参照されたい）。さらに別のアルゴリズムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／８３６，０８０号に見いだすことができる。

【0171】

一般に、以下のうちの１つまたは複数を促進するために、ｔｒａｃｒメイト配列はｔｒａｃｒ配列に対して十分な相補性を有する任意の配列を含む：（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞におけるｔｒａｃｒメイト配列に挟まれたガイド配列の削除；および（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列とハイブリダイズしたｔｒａｃｒメイト配列を含む。一般に、相補性の程度は、ｔｒａｃｒメイト配列とｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントを参照し、２つの配列のうちの短い方の長さに沿ったものである。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、また、最適なアラインメントにより、ｔｒａｃｒ配列またはｔｒａｃｒメイト配列のいずれか内での自己相補性などの二次構造をさらに説明することができる。一部の実施形態では、最適にアラインメントした場合の２つのうちの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列の相補性の程度は、約２５％または約２５％より大きい、約３０％または約３０％より大きい、約４０％または約４０％より大きい、約５０％または約５０％より大きい、約６０％または約６０％より大きい、約７０％または約７０％より大きい、約８０％または約８０％より大きい、約９０％または約９０％より大きい、約９５％または約９５％より大きい、約９７．５％または約９７．５％より大きい、約９９％または約９９％より大きい、またはそれよりも大きい。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５個または約５個よりも多く、約６個または約６個よりも多く、約７個または約７個よりも多く、約８個または約８個よりも多く、約９個または約９個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、約１１個または約１１個よりも多く、約１２個または約１２個よりも多く、約１３個または約１３個よりも多く、約１４個または約１４個よりも多く、約１５個または約１５個よりも多く、約１６個または約１６個よりも多く、約１７個または約１７個よりも多く、約１８個または約１８個よりも多く、約１９個または約１９個よりも多く、約２０個または約２０個よりも多く、約２５個または約２５個よりも多く、約３０個または約３０個よりも多く、約４０個または約４０個よりも多く、約５０個または約５０個よりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列およびｔｒａｃｒメイト配列は単一のＲＮＡ（本明細書では「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と称される）内に含有され、したがって、ｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒメイト配列のハイブリダイゼーションにより、ヘアピンなどの二次構造が生じる。ヘアピン構造への使用に好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチドの長さであり、配列ＧＡＡＡを有することが最も好ましい。しかし、より長いまたはより短いループ配列を代替配列として使用することもできる。配列は、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）および追加的なヌクレオチド（例えば、ＣまたはＧ）を含むことが好ましい。ループ形成配列の例としては、ＣＡＡＡおよびＡＡＡＧが挙げられる。本発明のある実施形態では、ｓｇＲＮＡは、少なくとも２つまたはそれよりも多くのヘアピンを有する。好ましい実施形態では、ｓｇＲＮＡは、２つ、３つ、４つまたは５つのヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態では、ｓｇＲＮＡは、最大で５つのヘアピンを有する。一部の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、転写終結配列をさらに含み、これはポリＴ配列、例えば、６Ｔヌクレオチドであることが好ましい。

【0172】

一部の実施形態では、ドナー核酸も提供される。一部の実施形態では、ドナー核酸は、例えばＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてのＣＲＩＳＰＲ酵素によってニックを入れられるまたは切断される標的配列内またはその付近での相同組換えの鋳型として機能するように設計される。ドナー核酸は、例えば、約１０個または約１０個よりも多く、約１５個または約１５個よりも多く、約２０個または約２０個よりも多く、約２５個または約２５個よりも多く、約５０個または約５０個よりも多く、約７５個または約７５個よりも多く、約１００個または約１００個よりも多く、約１５０個または約１５０個よりも多く、約２００個または約２００個よりも多く、約５００個または約５００個よりも多く、約１０００個または約１０００個よりも多く、またはそれよりも多くのヌクレオチドの長さなどの任意の適切な長さのものであってよい。一部の実施形態では、ドナー核酸は、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部と相補的な配列を含む。一部の実施形態では、ドナー核酸と標的配列を含むポリヌクレオチドを最適にアラインメントした場合、ドナー核酸は、標的配列の１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、約１個または約１個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、約１５個または約１５個よりも多く、約２０個または約２０個よりも多く、約２５個または約２５個よりも多く、約３０個または約３０個よりも多く、約３５個または約３５個よりも多く、約４０個または約４０個よりも多く、約４５個または約４５個よりも多く、約５０個または約５０個よりも多く、約６０個または約６０個よりも多く、約７０個または約７０個よりも多く、約８０個または約８０個よりも多く、約９０個または約９０個よりも多く、約１００個または約１００個よりも多くまたはそれよりも多くのヌクレオチド）と重複する。一部の実施形態では、ドナー核酸と標的配列を含むポリヌクレオチドを最適にアラインメントした場合、相補性の領域内のドナー核酸の最も近くのヌクレオチドは、標的配列から約１ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、２５ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、７５ヌクレオチド以内、１００ヌクレオチド以内、２００ヌクレオチド以内、３００ヌクレオチド以内、４００ヌクレオチド以内、５００ヌクレオチド以内、１０００ヌクレオチド以内、５０００ヌクレオチド以内、１００００ヌクレオチド以内、またはそれよりも多くのヌクレオチド以内である。

【0173】

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つまたは複数の異種タンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１個または約１個よりも多く、約２個または約２個よりも多く、約３個または約３個よりも多く、約４個または約４個よりも多く、約５個または約５個よりも多く、約６個または約６個よりも多く、約７個または約７個よりも多く、約８個または約８個よりも多く、約９個または約９個よりも多く、約１０個または約１０個よりも多く、またはそれよりも多くのドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加的なタンパク質配列、および必要に応じて任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素と融合することができるタンパク質ドメインの例としては、限定することなく、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および以下の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑止活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性および核酸結合活性のうちの１つまたは複数を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、これだけに限定されないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含めた自己蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、これだけに限定されないが、マルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ－タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合性ドメイン（ＤＢＤ）融合、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合性ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含めた、ＤＮＡ分子に結合するまたは他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配列と融合することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加的なドメインは、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１００５９５０２に記載されている。一部の実施形態では、タグが付されたＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の場所を同定する。

【0174】

一部の実施形態では、カーゴは、触媒として機能しないヌクレアーゼ（例えば、触媒として機能しないＣａｓ９エンドヌクレアーゼなど）および逆転写酵素（例えば、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素のペンタ突然変異体など）を含む融合タンパク質を含む。例えば、Anzalone & Liu et al., Nature. 2019 Dec; 576 (7785): 149-157を参照されたい。一部の実施形態では、カーゴは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0175】

一部の実施形態では、カーゴは、触媒として機能しないヌクレアーゼ（例えば、触媒として機能しないＣａｓ９エンドヌクレアーゼなど）および核酸塩基デアミナーゼ酵素を含む融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、核酸塩基デアミナーゼ酵素は、ＡＰＯＢＥＣ１シチジンデアミナーゼである。一部の実施形態では、核酸塩基デアミナーゼ酵素は、シチジンデアミナーゼＣＤＡ１である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤をさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）である。一部の実施形態では、カーゴは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
ｍＲＮＡ

【0176】

一部の実施形態では、カーゴは、ｍＲＮＡを含む。例示的なｍＲＮＡは、これだけに限定されないが、生物学的製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質もしくはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌型タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質もしくは細胞骨格タンパク質、細胞内膜に結合したタンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連するタンパク質、標的化部分または治療適応は同定されていないにもかかわらず研究および発見の分野で有用性があるヒトゲノムによってコードされるタンパク質を含めた、いくつかの標的カテゴリーのいずれかから選択される目的のポリペプチドをコードする。

【0177】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードする領域およびそのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，０６１，０５９号および同第９，２２１，８９１号に記載されているｍＲＮＡのいずれかによる連結したヌクレオシドの領域を含む。

【0178】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、参照ポリペプチドのポリペプチドバリアントをコードする。一部の実施形態では、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドと同じまたは同様の活性を有し得る。あるいは、バリアントは、参照ポリペプチドと比べて変更された活性（例えば、増大または低減）を有し得る。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、本明細書に記載されており、当業者に公知の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが１００％未満の配列同一性を有する。

【0179】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、生物学的製剤をコードする。本明細書で使用される場合、「生物学的製剤」は、本明細書に提示される方法によって作製され、重篤なまたは生命を脅かす疾患または医学的状態を処置する、治癒させる、軽減する、予防する、または診断するために使用することができる、ポリペプチドに基づく分子である。本発明による生物学的製剤としては、これだけに限定されないが、とりわけ、アレルゲンエキス（例えば、アレルギー注射およびテスト用）、血液成分、遺伝子治療用製品、移植に使用されるヒト組織または細胞製品、ワクチン、モノクローナル抗体、サイトカイン、増殖因子、酵素、血栓溶解薬、および免疫調節物質が挙げられる。一部の実施形態では、生物学的製剤は、現在販売されているものまたは開発中のものである。

【0180】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、抗体またはその断片（例えば、抗原結合性断片など）をコードするものである。一部の実施形態では、抗体またはその断片は、現在販売されているものまたは開発中のものである。

【0181】

「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、および単鎖分子）、ならびに抗体断片を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書では「抗体」と互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、微量で存在し得る、可能性のある天然に存在する突然変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である集団から得た抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象とする。

【0182】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、ワクチンをコードする。本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、特定の疾患または感染因子に対する免疫を改善する生物学的製剤調製物である。一部の実施形態では、ワクチンは、現在販売されているものまたは開発中のものである。

【0183】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされるワクチンを利用して、これだけに限定されないが、心血管、ＣＮＳ、皮膚、内分泌、腫瘍、免疫、呼吸器、および感染予防などの多くの治療領域の状態または疾患を処置する。

【0184】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、治療用タンパク質をコードするものである。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、現在販売されているものまたは開発中のものである。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、（ａ）欠乏しているもしくは異常なタンパク質を置き換えるため；（ｂ）既存の経路を強化するため；（ｃ）新規の機能もしくは活性を提供するため；または（ｄ）分子もしくは生物体に干渉するために有用である。一部の実施形態では、治療用タンパク質としては、これだけに限定することなく、抗体に基づく薬物、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固薬、血液因子、骨形成タンパク質、工学的に作製されたタンパク質足場、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、および血栓溶解薬が挙げられる。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、（ａ）標的に非共有結合により結合することによって作用する、例えば、ｍＡｂである；（ｂ）共有結合に影響を及ぼすことによって作用する、例えば、酵素である；または（ｃ）特異的な相互作用なしで活性を発揮することによって作用する、例えば、血清アルブミンである。一部の実施形態では、治療用タンパク質は、組換えタンパク質である。

【0185】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされる治療用タンパク質を利用して、これだけに限定されないが、血液、心血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚、内分泌、遺伝子、尿生殖器、胃腸、筋骨格、腫瘍、および免疫、呼吸器、知覚および感染予防などの多くの治療領域の状態または疾患を処置する。一部の実施形態では、治療用タンパク質として、これだけに限定することなく、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ）、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ；ＣＤ１３４Ｌ）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、インターロイキン２３（ＩＬ２３）、インターロイキン３６γ（ＩＬ３６γ）、およびＣｏＡムターゼが挙げられる。

【0186】

一部の実施形態では、治療用タンパク質は、欠乏しているまたは異常なタンパク質に置き換わるものである。一部の実施形態では、治療用タンパク質として、これだけに限定することなく、アルファ１抗トリプシン、フラタキシン、インスリン、成長ホルモン（ソマトトロピン）、増殖因子、ホルモン、ジストロフィン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、β－グルコセレブロシダーゼ、アルグルコシダーゼ－α、α－１－イズロニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガルスルファーゼ、ヒトα－ガラクトシダーゼＡ、α－１－プロテイナーゼ阻害剤、ラクターゼ、膵臓酵素（リパーゼ、アミラーゼ、およびプロテアーゼを含む）、アデノシンデアミナーゼ、ならびにアルブミンが挙げられ、これらの組換え型も含まれる。

【0187】

一部の実施形態では、治療用タンパク質は、新規の機能または活性を提供するものである。一部の実施形態では、治療用タンパク質として、これだけに限定することなく、ボツリヌス毒素Ａ型、ボツリヌス毒素Ｂ型、コラゲナーゼ、ヒトデオキシ－リボヌクレアーゼＩ、ドルナーゼ－α、ヒアルロニダーゼ、パパイン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ラスブリカーゼ、レピルジン、ビバリルジン、ストレプトキナーゼ、およびアニソイレート化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ）が挙げられる。

【0188】

一部の実施形態では、治療用タンパク質は、分子または生物体に干渉するものである。一部の実施形態では、治療用タンパク質として、これだけに限定することなく、抗ＶＥＧＦＡ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２／Ｎｅｕ抗体、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧ１の改変されたＦｃ部分の融合タンパク質、インターロイキン１（ＩＬ１）受容体アンタゴニスト、抗ＴＮＦα抗体、ＣＤ２結合性タンパク質、抗ＣＤ１１ａ抗体、α４β１およびα４β７インテグリンのα４－サブユニットに対する抗体、抗補体タンパク質Ｃ５抗体、抗胸腺細胞グロブリン、キメラ（ヒト／マウス）ＩｇＧ１、ＣＤ２５のアルファ鎖に結合するヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂ、抗ＣＤ３抗体、抗ＩｇＥ抗体、呼吸器合胞体ウイルスのＦタンパク質のＡ抗原部位に結合するヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂ、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０／ｇｐ４１結合性ペプチド、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａインテグリン受容体に結合するキメラ（ヒト／マウス）ｍＡｂ ７Ｅ３のＦａｂ断片、ならびに毒液毒素に結合し、それを中和するＩｇＧのＦａｂ断片が挙げられる。

【0189】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質をコードし、当該タンパク質は、腫瘍抑制遺伝子に対応する。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）である。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＢＲＣＡ１である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＢＲＣＡ２である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＴＳＣ１である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子は、ＴＳＣ２である。一部の実施形態では、対応する腫瘍抑制遺伝子として、これだけに限定することなく、網膜芽細胞腫ＲＢ（またはＲＢ１）、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰ７３、ＣＤＫＮ２Ａ（ＩＮＫ４Ａ）、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＤＬＤ／ＮＰ１、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＦＲＰ１、ＴＣＦ２１、ＴＩＧ１、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＷＴ１、ＷＴ２、ＮＦ１、ＮＦ２Ｎ、ＶＨＬ、ＫＬＦ４、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、ＡＰＣ、ＭＡＤＲ２、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、パッチド（ｐａｔｃｈｅｄ）、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＡＬＢ２、ＳＴ１４、またはＶＨＬが挙げられる。

【0190】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮをコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮは、ヒトＰＴＥＮ配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおける受託番号ＢＣ００５８２１、ＪＦ２６８６９０、Ｕ９２４３６、ＣＲ４５０３０６、ＡＫ０２４９８６、ＡＫ３１３５８１、Ｕ９６１８０、およびＵ９３０５１およびＮＭ＿０００３１４の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0191】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ｐ５３は、ヒトＴＰ５３配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおける受託番号ＡＦ０５２１８０、ＮＭ＿０００５４６、ＡＹ４２９６８４、ＢＴ０１９６２２、ＡＫ２２３０２６、ＤＱ１８６６５２、ＤＱ１８６６５１、ＤＱ１８６６５０、ＤＱ１８６６４９、ＤＱ１８６６４８、ＤＱ２６３７０４、ＤＱ２８６９６４、ＤＱ１９１３１７、ＤＱ４０１７０４、ＡＦ３０７８５１、ＡＭ０７６９７２、ＡＭ０７６９７１、ＡＭ０７６９７０、ＤＱ４８５１５２、ＢＣ００３５９６、ＤＱ６４８８８７、ＤＱ６４８８８６、ＤＱ６４８８８５、ＤＱ６４８８８４、ＡＫ２２５８３８、Ｍ１４６９４、Ｍ１４６９５、ＥＦ１０１８６９、ＥＦ１０１８６８、ＥＦ１０１８６７、Ｘ０１４０５、ＡＫ３１２５６８、ＮＭ＿００１１２６１１７、ＮＭ＿００１１２６１１６、ＮＭ＿００１１２６１１５、ＮＭ＿００１１２６１１４、ＮＭ＿００１１２６１１３、ＮＭ＿００１１２６１１２、ＦＪ２０７４２０、Ｘ６００２０、Ｘ６００１９、Ｘ６００１８、Ｘ６００１７、Ｘ６００１６、Ｘ６００１５、Ｘ６００１４、Ｘ６００１３、Ｘ６００１１、Ｘ６００１２、Ｘ６００１０、Ｘ０２４６９、Ｓ６６６６６、ＡＢ０８２９２３、ＮＭ＿００１１２６１１８、ＪＮ９００４９２、ＮＭ＿００１２７６６９９、ＮＭ＿００１２７６６９８、ＮＭ＿００１２７６６９７、ＮＭ＿００１２７６７６１、ＮＭ＿００１２７６７６０、ＮＭ＿００１２７６６９６、およびＮＭ＿００１２７６６９５の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0192】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ１は、ヒトＢＲＣＡ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおける受託番号ＮＭ＿００７２９４、ＮＭ＿００７２９７、ＮＭ＿００７２９８、ＮＭ＿００７３０４、ＮＭ＿００７２９９、ＮＭ＿００７３００、ＢＣ０４６１４２、ＢＣ０６２４２９、ＢＣ０７２４１８、ＡＹ３５４５３９、ＡＹ７５１４９０、ＢＣ０８５６１５、ＢＣ１０６７４６、ＢＣ１０６７４５、ＢＣ１１４５１１、ＢＣ１１５０３７、Ｕ１４６８０、ＡＫ２９３７６２、Ｕ６８０４１、ＢＣ０３０９６９、ＢＣ０１２５７７、ＡＫ３１６２００、ＤＱ３６３７５１、ＤＱ３３３３８７、ＤＱ３３３３８６、Ｙ０８８６４、ＪＮ６８６４９０、ＡＢ６２１８２５、ＢＣ０３８９４７、Ｕ６４８０５、およびＡＦ００５０６８の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0193】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ２をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＢＲＣＡ２は、ヒトＢＲＣＡ２配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおける受託番号ＢＣ０４７５６８、ＮＭ＿００００５９、ＤＱ８９７６４８、ＢＣ０２６１６０の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0194】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ１をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ１は、ヒトＴＳＣ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおける受託番号ＢＣ０４７７７２、ＮＭ＿０００３６８、ＢＣ０７００３２、ＡＢ１９０９１０、ＢＣ１０８６６８、ＢＣ１２１０００、ＮＭ＿００１１６２４２７、ＮＭ＿００１１６２４２６、Ｄ８７６８３、およびＡＦ０１３１６８の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0195】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ２をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＴＳＣ２は、ヒトＴＳＣ２配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおける受託番号ＢＣ０４６９２９、ＢＸ６４７８１６、ＡＫ１２５０９６、ＮＭ＿０００５４８、ＡＢ２１００００、ＮＭ＿００１０７７１８３、ＢＣ１５０３００、ＢＣ０２５３６４、ＮＭ＿００１１１４３８２、ＡＫ０９４１５２、ＡＫ２９９３４３、ＡＫ２９５７２８、ＡＫ２９５６７２、ＡＫ２９４５４８、およびＸ７５６２１の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0196】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、腫瘍抑制タンパク質網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）をコードする。一部の実施形態では、腫瘍抑制タンパク質ＲＢ１は、ヒトＲＢ１配列によってコードされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにおける受託番号ＮＭ＿０００３２１、ＡＹ４２９５６８、ＡＢ２０８７８８、Ｍ１９７０１、ＡＫ２９１２５８、Ｌ４１８７０、ＡＫ３０７７３０、ＡＫ３０７１２５、ＡＫ３００２８４、ＡＫ２９９１７９、Ｍ３３６４７、Ｍ１５４００、Ｍ２８４１９、ＢＣ０３９０６０、ＢＣ０４０５４０、およびＡＦ０４３２２４の配列からなる群から選択される配列を含む。

【0197】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、タンパク質をコードし、当該タンパク質は、欠乏すると疾患または障害が生じるものである。一部の実施形態では、タンパク質は、フラタキシンである。一部の実施形態では、タンパク質は、アルファ１抗トリプシンである。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子である。一部の実施形態では、タンパク質は、第ＩＸ因子である。

【0198】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、タンパク質をコードし、当該タンパク質が個体において発現されることにより、個体における当該タンパク質に対する免疫応答がモジュレートされる。一部の実施形態では、タンパク質は、抗原である。一部の実施形態では、抗原は、疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原）であり、当該抗原が個体において発現されると、個体における当該抗原に対する免疫応答の増大がもたらされる。一部の実施形態では、抗原は自己抗原であり、当該抗原が個体において発現すると、個体における当該抗原に対する免疫応答の低下がもたらされる。

【0199】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、抗体またはその抗原結合性断片をコードする。一部の実施形態では、抗体は、治療用抗体である。一部の実施形態では、抗体は、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）などの二重特異性抗体である。一部の実施形態では、抗体は、腫瘍関連抗原などの疾患関連抗原に特異的に結合する。

【0200】

一部の実施形態では、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるカーゴ送達複合体に含有されるｍＲＮＡは、レポーターｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、Ｌｕｃ ｍＲＮＡ、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｃｙａｎｉｎｅ ５ Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、ＣｌｅａｎＣａｐ Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）、またはＣｌｅａｎＣａｐ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ、ＣｌｅａｎＣａｐ β－ｇａｌ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）およびＣｌｅａｎＣａｐ ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）から選択されるｍＲＮＡを含む。
ＲＮＡｉ

【0201】

一部の実施形態では、カーゴ分子は、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉとして、これだけに限定することなく、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、マイクロＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、内因性遺伝子を標的とするものである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とするものである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患に関連する遺伝子、例えば、癌遺伝子などのがんに関連する遺伝子を標的とするものである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、癌遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、癌遺伝子は、スムーズンド（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）である。一部の実施形態では、癌遺伝子は、ｒａｓＫである。一部の実施形態では、癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。

【0202】

一部の実施形態では、カーゴ分子は、ｍＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のｍＲＮＡのうちのいずれか１つなど）およびＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡなど）の両方を含む。

【0203】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、癌遺伝子を標的とするものであり、癌遺伝子は、ＫＲＡＳである。一部の実施形態では、個体は、ＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４または６１に対する突然変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｑ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。

【0204】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの突然変異形態を標的とするものである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの突然変異形態を特異的に標的とし、ＫＲＡＳの野生型形態は標的としないものである。一部の実施形態では、突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４または６１に対する突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｑ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。

【0205】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳの複数の突然変異形態を標的とするものである。一部の実施形態では、複数の突然変異形態は、ＫＲＡＳの複数の異常を含み、ＫＲＡＳの複数の異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４および／または６１に対する少なくとも２つまたはそれよりも多くの突然変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの複数の異常は、ＫＲＡＳのコドン１２および６１に対する少なくとも２つまたはそれよりも多くの突然変異を含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、およびＱ６１Ｋからなる群から選択される。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＧ１２Ｄを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＣおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。一部の実施形態では、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋを含む。

【0206】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、第１のＲＮＡｉ（例えば、第１のｓｉＲＮＡ）および第２のＲＮＡｉ（例えば、第２のｓｉＲＮＡ）を含む複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含み、第１のＲＮＡｉは、第１のＫＲＡＳの突然変異形態を標的とするものであり、第２のＲＮＡｉは、第２のＫＲＡＳの突然変異形態を標的とするものである。一部の実施形態では、第１のＲＮＡｉおよび／または第２のＲＮＡｉは、ＫＲＡＳの野生型形態を標的としない。一部の実施形態では、第１の突然変異形態および／または第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４および／または６１に対する突然変異を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異形態および／または第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳのコドン１２または６１に対する突然変異を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異形態は、コドン１２に対する突然変異を含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の突然変異形態は、コドン６１に対する突然変異を含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異形態および／または第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の突然変異形態および／または第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の突然変異形態および／または第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の突然変異形態および／または第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の突然変異形態および／または第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２ＶおよびＧ１３Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、第１の突然変異形態および／または第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳの異常を含み、ＫＲＡＳの異常は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋから選択される。一部の実施形態では、第１の突然変異形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを含むＫＲＡＳの異常を含む。

【0207】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、第１のＲＮＡｉ（例えば、第１のｓｉＲＮＡ）、第２のＲＮＡｉ（例えば、第２のｓｉＲＮＡ）、および第３のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む複数のＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第１のＲＮＡｉは第１のＫＲＡＳの突然変異形態を標的とするものであり、第２のＲＮＡｉは第２のＫＲＡＳの突然変異形態を標的とするものであり、第３のＲＮＡｉは第３のＫＲＡＳの突然変異形態を標的とするものである。一部の実施形態では、第１のＫＲＡＳ突然変異形態、第２のＫＲＡＳ突然変異形態および第３のＫＲＡＳ突然変異形態は、それぞれが、ＫＲＡＳのコドン１２、１３、１７、３４および／または６１に対する突然変異を含むＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１のＫＲＡＳ突然変異形態、第２のＫＲＡＳ突然変異形態および第３のＫＲＡＳ突然変異形態は、それぞれが、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｐ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１のＫＲＡＳ突然変異形態、第２のＫＲＡＳ突然変異形態および第３のＫＲＡＳ突然変異形態は、それぞれが、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｆ、Ｇ１２Ｌ、Ｇ１２Ｎ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｇ１３Ｐ、Ｓ１７Ｇ、Ｐ３４Ｓ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、およびＱ６１Ｈからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１のＫＲＡＳ突然変異形態、第２のＫＲＡＳ突然変異形態および第３のＫＲＡＳ突然変異形態は、それぞれが、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎ、Ａ１４６Ｐ、Ａ１４６ＴおよびＡ１４６Ｖからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１のＫＲＡＳ突然変異形態、第２のＫＲＡＳ突然変異形態および第３のＫＲＡＳ突然変異形態は、それぞれが、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｒからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１のＫＲＡＳ突然変異形態、第２のＫＲＡＳ突然変異形態および第３のＫＲＡＳ突然変異形態は、それぞれが、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３ＤおよびＱ６１Ｋからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１のＫＲＡＳ突然変異形態、第２のＫＲＡＳ突然変異形態および第３のＫＲＡＳ突然変異形態は、それぞれが、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２ＤおよびＱ６１Ｋからなる群から選択されるＫＲＡＳの異常を含む。一部の実施形態では、第１の突然変異形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃを含むＫＲＡＳの異常を含み、第２の突然変異形態は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄを含むＫＲＡＳの異常を含み、第３の突然変異形態は、ＫＲＡＳ Ｑ６１Ｋを含むＫＲＡＳの異常を含む。

【0208】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＵＧＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）、５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３（アンチセンス）、５’－ＧＡＡＧＵＧＣＡＵＡＣＡＣＣＧＡＧＡＣＴＴ－３’（センス）、５’－ＧＵＣＵＣＧＧＵＧＵＡＧＣＡＣＵＵＣＴＴ－３’（アンチセンス）、５’－ＧＵＵＧＧＡＧＣＵＧＵＵＧＧＣＧＵＡＧＴＴ－３’（センス）および／または５’－ＣＵＡＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＵＣＣＡＡＣＴＴ－３’（アンチセンス）の配列を含むＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、配列番号１７９、１８０、１８２～１８５の配列から選択される核酸配列を含むＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓを標的とする配列、例えば、Acunzo, M. et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2017 May 23; 114 (21): E4203-E4212に開示されているｓｉＲＮＡ配列などを含むＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）は、それぞれが本出願に完全に組み込まれるＷＯ２０１４０１３９９５、ＪＰ２０１３２１２０５２、ＷＯ２０１４１１８８１７、ＷＯ２０１２１２９３５２、ＷＯ２０１７１７９６６０、ＪＰ２０１３５４４５０５、ＵＳ８００８４７４、ＵＳ７７４５６１１、ＵＳ７５７６１９７、ＵＳ７５０７８１１に開示されている、ＫＲＡＳを標的とするＲＮＡｉ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含む。

【0209】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉとして、これだけに限定することなく、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡが挙げられる。「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」という用語は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子または配列と同じ細胞内に存在する場合に、標的遺伝子または配列の発現を低減または阻害することができる（例えば、干渉ＲＮＡ配列と相補的なｍＲＮＡの分解を媒介することまたは干渉ＲＮＡ配列と相補的なｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって）一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、またはプレｍｉＲＮＡなどの二重鎖ＲＮＡ）を指し、したがって、干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列と相補的である、または２つの相補鎖によってもしくは単一の自己相補鎖によって形成された二本鎖ＲＮＡと相補的である一本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子または配列に対して実質的または完全な同一性を有し得る、またはミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を有し得る。干渉ＲＮＡの配列は、全長の標的遺伝子、またはその部分配列に対応し得る。干渉ＲＮＡは、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば、約１５～６０、１５～５０、または５～４０（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、より一般には約１５～３０、１５～２５、または１９～２５（二重鎖）ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３（二重鎖）ヌクレオチドの長さの干渉ＲＮＡを含む（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチドの長さであり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１５～６０、１５～５０、１５～４０、５～３０、５～２５、または１９～２５塩基対の長さ、好ましくは約８～２２、９～２０、または１９～２１塩基対の長さである）。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１～約４ヌクレオチドまたは約２～約３ヌクレオチドの３’突出および５’リン酸末端を含み得る。ｓｉＲＮＡの例としては、限定することなく、一方の鎖がセンス鎖であり、他方の鎖が相補的なアンチセンス鎖である２つの別々の鎖分子からアセンブルされた二本鎖ポリヌクレオチド分子；センス領域とアンチセンス領域が核酸に基づくリンカーまたは核酸に基づくものではないリンカーによって連結した一本鎖分子からアセンブルされた二本鎖ポリヌクレオチド分子；自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子；および２つまたはそれよりも多くのループ構造および自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域を有するステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子であって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで処理して活性な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成することができる、環状ポリヌクレオチドの分子が挙げられる。ｓｉＲＮＡは化学的に合成されたものであることが好ましい。ｓｉＲＮＡは、長いｄｓＲＮＡ（例えば、おおよそで、２５ヌクレオチドの長さよりも長いｄｓＲＮＡ）をＥ ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ ＩＩＩまたはＤｉｃｅｒで切断することによって生成することもできる。これらの酵素により、ｄｓＲＮＡが加工されて生物活性のあるｓｉＲＮＡになる（例えば、Yang et al., Proc Natl. Acad. Set. USA, 99: 9942-9947 (2002)；Calegari et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 14236 (2002)；Byrom et al., Ambion TeehNotes, 10 (1):4-6 (2003)；Kawasaki et al., Nucleic Acids Res., 3 1:981-987 (2003)；Knight et al., Science, 293: 2269-2271 (2001)；およびRobertson et al., J. Biol. Chem., 243:82 (1968)を参照されたい）。ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド～約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドの長さであることが好ましい。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチドの長さと同じくらいの長さ、またはそれよりも長いものであり得る。ｄｓＲＮＡは、遺伝子転写物全体または部分的な遺伝子転写物をコードするものであり得る。ある特定の場合では、ｓｉＲＮＡをプラスミドにコードさせる（例えば、ヘアピンループを有する二重鎖に自動的にフォールディングされる配列として転写する）ことができる。低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ ｏｒ ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができるタイトなヘアピンターンを構成するＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によって切断されてｓｉＲＮＡになり、次いでこれがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、それと結合するｓｉＲＮＡとマッチするｍＲＮＡに結合し、それを切断する。ＲＮＡｉの適切な長さとしては、限定することなく、約５～約２００ヌクレオチド、または１０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対が挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、対応する標的遺伝子と実質的に相補的である（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きく同一である、など）。一部の実施形態では、ＲＮＡｉを、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み入れることによって改変する。

【0210】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡｉである。ＲＮＡｉの適切な長さとしては、限定することなく、約５～約２００ヌクレオチド、または１０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対が挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、対応する標的遺伝子と実質的に相補的である（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きく同一である、など）。一部の実施形態では、ＲＮＡｉを、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み入れることによって改変する。

【0211】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、がんなどの疾患に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子を特異的に標的とするものである。一部の実施形態では、疾患は、固形腫瘍または血液悪性腫瘍などのがんであり、干渉ＲＮＡは、がんに関与するタンパク質、例えば、がんの増悪の調節に関与するタンパク質などをコードするｍＲＮＡを標的とするものである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、がんに関与する癌遺伝子を標的とするものである。

【0212】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、免疫応答の負の調節に関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子を特異的に標的とするものである。一部の実施形態では、干渉ＲＮＡは、負の共刺激分子をコードするｍＲＮＡを標的とするものである。一部の実施形態では、負の共刺激分子として、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＬＡＧ－３、およびＣＴＬＡ－４が挙げられる。

【0213】

一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、ｍｉＲＮＡである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略される）は、真核細胞において見いだされる短いリボ核酸（ＲＮＡ）分子である。マイクロＲＮＡ分子は、他のＲＮＡと比較して非常にわずかなヌクレオチド（平均２２個）を有する。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補配列に結合する転写後調節因子であり、通常、翻訳抑止または標的分解および遺伝子サイレンシングをもたらす。ヒトゲノムは、１０００種を超えるｍｉＲＮＡをコードし得、これらは、哺乳動物遺伝子の約６０％を標的とし得、多くのヒト細胞型において豊富である。ｍｉＲＮＡの適切な長さとしては、限定することなく、約５～約２００ヌクレオチド、または約０～５０ヌクレオチドもしくは塩基対または１５～３０ヌクレオチドもしくは塩基対が挙げられる。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、対応する標的遺伝子と実質的に相補的である（例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはより大きく同一である、など）。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡを、例えば天然に存在しないヌクレオチドを組み入れることによって改変する。
ウイルス

【0214】

本明細書に記載の複合体および／またはナノ粒子のいずれかに従った一部の実施形態では、ウイルスは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ポックスウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、およびヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）を含めた組換えウイルスである。一部の実施形態では、組換えウイルスは、細胞ゲノムに挿入するための導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、導入遺伝子は、治療用導入遺伝子である。一部の実施形態では、導入遺伝子は、治療用タンパク質などのタンパク質をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、内因性遺伝子、例えば、疾患に関連する内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉなどの阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をコードする。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＡＲをコードする。一部の実施形態では、ウイルスは、ＲＮＡｉをコードする第１の導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する内因性遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡｉである。一部の実施形態では、治療用ＲＮＡｉは、疾患に関連する形態の内因性遺伝子（例えば、突然変異タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常な発現をもたらす遺伝子）を標的とする。一部の実施形態では、ウイルスは、タンパク質をコードする第２の導入遺伝子を含む。一部の実施形態では、タンパク質は、疾患または状態の処置に有用な治療用タンパク質である。一部の実施形態では、第２の導入遺伝子は、治療用形態の内因性遺伝子である（例えば、第２の導入遺伝子は、内因性遺伝子によってコードされる野生型または機能性形態の突然変異タンパク質をコードする、または第２の導入遺伝子により、内因性遺伝子によってコードされるタンパク質の正常な発現がもたらされる）。一部の実施形態では、第１の導入遺伝子および第２の導入遺伝子を含むウイルスが提供される。

【0215】

本明細書に記載の複合体および／またはナノ粒子のいずれかに従った一部の実施形態では、ウイルスは、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、改変アデノウイルス、改変レンチウイルス、改変レトロウイルス、改変単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、改変ポックスウイルス、改変エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、改変ワクシニアウイルス、および改変ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）を含めた、改変ウイルスである。本明細書に記載の複合体および／またはナノ粒子のいずれかに従った一部の実施形態では、ウイルスは、不活化アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、不活化アデノウイルス、不活化レンチウイルス、不活化レトロウイルス、不活化単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、不活化ポックスウイルス、不活化エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、不活化ワクシニアウイルス、および不活化ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）を含めた、不活化ウイルスである。本明細書に記載の複合体および／またはナノ粒子のいずれかに従った一部の実施形態では、ウイルスは、複製欠損性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、複製欠損性アデノウイルス、複製欠損性レンチウイルス、複製欠損性レトロウイルス、複製欠損性単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、複製欠損性ポックスウイルス、複製欠損性エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、複製欠損性ワクシニアウイルス、および複製欠損性ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）を含めた、複製欠損性ウイルスである。本明細書に記載の複合体および／またはナノ粒子のいずれかに従った一部の実施形態では、ウイルスは、標的細胞においてのみ複製することができる。
ナノ粒子

【0216】

一部の実施形態では、本明細書に記載の任意の１つまたは複数のカーゴ送達複合体を含むコアを含むカーゴ分子を細胞内送達するためのナノ粒子が提供される。

【0217】

一部の実施形態では、本明細書に記載の１つまたは複数のカーゴ送達複合体を含むコアを含むカーゴ分子を細胞内送達するためのナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、ナノ粒子コアは、複数のカーゴ送達複合体を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子コアは、所定の比で存在する複数のカーゴ送達複合体を含む。一部の実施形態では、所定の比は、下により詳細に記載されている方法のいずれかにおけるナノ粒子の最も有効な使用が可能になるように選択される。一部の実施形態では、ナノ粒子コアは、１つもしくは複数の追加的な細胞透過性ペプチドおよび／または１つもしくは複数の追加的なカーゴをさらに含む。

【0218】

一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体を含むコアを含むカーゴ分子を細胞内送達するためのナノ粒子であって、カーゴ送達複合体内の少なくとも１つの細胞透過性ペプチドがカーゴと結び付いている、ナノ粒子が提供される。一部の実施形態では、結び付きは非共有結合によるものである。一部の実施形態では、結び付きは、共有結合によるものである。

【0219】

一部の実施形態では、ナノ粒子は、末梢細胞透過性ペプチド（すなわち、ＣＰＰ）で構成される表層（例えば、殻）をさらに含み、殻によってコアがコーティングされている。一部の実施形態では、末梢ＣＰＰは、コア内のＣＰＰと同じである。一部の実施形態では、末梢ＣＰＰは、コア内のＣＰＰのいずれとも異なる。一部の実施形態では、末梢ＣＰＰとしては、これだけに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－４、ＶＥＰＥＰ－５、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドなど）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、およびＰｅｐ－２ペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、末梢ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。一部の実施形態では、末梢細胞透過性ペプチドは、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、表層内の末梢細胞透過性ペプチドの少なくとも一部が標的化部分と連結している。一部の実施形態では、連結は、共有結合によるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、化学的カップリングによるものである。一部の実施形態では、共有結合による連結は、遺伝学的方法によるものである。一部の実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子のコアと表層の間の中間層をさらに含む。一部の実施形態では、中間層は、中間ＣＰＰを含む。一部の実施形態では、中間ＣＰＰは、コア内のＣＰＰと同じである。一部の実施形態では、中間ＣＰＰは、コア内のＣＰＰのいずれとも異なる。一部の実施形態では、中間ＣＰＰとしては、これだけに限定されないが、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＶＥＰＥＰペプチド（例えば、ＶＥＰＥＰ－３、ＶＥＰＥＰ－６、またはＶＥＰＥＰ－９ペプチドなど）、ＡＤＧＮ－１００ペプチド、Ｐｅｐ－１ペプチド、およびＰｅｐ－２ペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、中間ＣＰＰは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドである。

【0220】

本明細書に記載のナノ粒子のいずれかに従った一部の実施形態では、ナノ粒子の平均サイズ（直径）は、例えば、約５０ｎｍから約８００ｎｍまで、約７５ｎｍから約６００ｎｍまで、約１００ｎｍから約６００ｎｍまで、および約２００ｎｍから約４００ｎｍまでを含めた、約２０ｎｍから約１０００ｎｍまでである。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均サイズ（直径）は、約１０００ナノメートル（ｎｍ）以下、例えば、約９００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、または１００ｎｍ以下のいずれかである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約２００ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約１５０ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約１００ｎｍ以下である。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約２０ｎｍ～約４００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約３０ｎｍ～約４００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約４０ｎｍ～約３００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約５０ｎｍ～約２００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約６０ｎｍ～約１５０ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子の標準または平均直径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子は、滅菌濾過可能である。

【0221】

一部の実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、約－３０ｍＶから約６０ｍＶまで（例えば、おおよそで、－３０ｍＶ、－２５ｍＶ、－２０ｍＶ、－１５ｍＶ、－１０ｍＶ、－５ｍＶ、０ｍＶ、５ｍＶ、１０ｍＶ、１５ｍＶ、２０ｍＶ、２５ｍＶ、３０ｍＶ、３５ｍＶ、４０ｍＶ、４５ｍＶ、５０ｍＶ、５５ｍＶ、および６０ｍＶのいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、例えば、約－２５ｍＶから約２５ｍＶまで、約－２０ｍＶから約２０ｍＶまで、約－１５ｍＶから約１５ｍＶまで、約－１０ｍＶから約１０ｍＶまで、および約－５ｍＶから約１０ｍＶまでを含めた、約－３０ｍＶから約３０ｍＶまでである。一部の実施形態では、ナノ粒子の多分散指数（ＰＩ）は、約０．０５から約０．６まで（例えば、おおよそで、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、および０．６のいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）。一部の実施形態では、ナノ粒子は、実質的に無毒性である。
組成物

【0222】

一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提供される。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子ならびに薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を含む医薬組成物である。一部の実施形態では、組成物中の複合体またはナノ粒子の濃度は、例えば、約１０ｎＭから約５０ｍＭまで、約２５ｎＭから約２５ｍＭまで、約５０ｎＭから約１０ｍＭまで、約１００ｎＭから約１ｍＭまで、約５００ｎＭから約７５０μＭまで、約７５０ｎＭから約５００μＭまで、約１μＭから約２５０μＭまで、約１０μＭから約２００μＭまで、および約５０μＭから約１５０μＭまでを含めた、約１ｎＭから約１００ｍＭまでである。一部の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥されたものである。

【0223】

「薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは他の脊椎動物宿主への投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むものとする。一般には、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、連邦政府の規制当局、州政府、もしくは他の規制当局によって認可された、または米国薬局方もしくはヒトならびに非ヒト哺乳動物を含めた動物における使用に関して他の一般に認められている薬局方に収載されている希釈剤、賦形剤、および／または担体である。希釈剤、賦形剤、および／または「担体」という用語は、医薬組成物を共に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような医薬希釈剤、賦形剤、および／または担体は、滅菌された液体、例えば、水、および石油起源、動物起源、野菜起源または合成起源のものを含めた油などであり得る。水、生理食塩溶液および水性ブドウ糖およびグリセロール溶液を特に注射液用の液体希釈剤、賦形剤、および／または担体として使用することができる。適切な医薬希釈剤および／または賦形剤としては、凍結乾燥助剤を含め、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、イネ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望であれば、組成物は、微量の湿潤剤、増量剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、持続放出製剤などの形態をとり得る。適切な医薬希釈剤、賦形剤、および／または担体の例は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martinに記載されている。製剤は、投与形式に適するものであるべきである。妥当な希釈剤、賦形剤、および／または担体は当業者には明らかになり、また、主に投与経路に依存する。

【0224】

一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子を含む組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体をさらに含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、組成物中のカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集のレベルおよび／または組成物中のカーゴ送達複合体またはナノ粒子によって媒介される細胞内送達の効率に影響を及ぼす。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体によって媒介される凝集および／または送達効率に対する影響の程度および／または方向は、組成物中の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体の相対量に依存する。

【0225】

例えば、一部の実施形態では、組成物中に薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体（例えば、塩、糖、化学緩衝剤、緩衝液、細胞培養培地、または担体タンパク質など）が１つまたは複数の濃度で存在することは、カーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、カーゴ送達複合体もしくはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２００％（例えば、多くとも、おおよそで、１９０％、１８０％、１７０％、１６０％、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくそれに寄与する。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、カーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２００％（例えば、多くとも、おおよそで、１９０％、１８０％、１７０％、１６０％、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１００％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、これだけに限定することなく、ＮａＣｌを含めた、塩である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、これだけに限定することなく、スクロース、グルコース、およびマンニトールを含めた、糖である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、これだけに限定することなく、ＨＥＰＥＳを含めた、化学緩衝剤である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、これだけに限定することなく、ＰＢＳを含めた、緩衝液である。一部の実施形態では、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および／または担体は、これだけに限定することなく、ＤＭＥＭを含めた、細胞培養培地である。粒子サイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）によるものなどの、粒子サイズを測定するための当技術分野で公知の任意の手段を使用して決定することができる。例えば、一部の実施形態では、ＤＬＳによって測定されたＺ－平均がカーゴ送達複合体またはナノ粒子のＤＬＳによって測定されたＺ－平均よりも１０％大きい凝集体は、カーゴ送達複合体またはナノ粒子よりも１０％大きい。

【0226】

一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、カーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１００％（例えば、多くとも、おおよそで、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約７５％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、塩（例えば、ＮａＣｌ）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物中の塩の濃度は、約１００ｍＭ以下（例えば、おおよそで、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、または１ｍＭ以下のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。

【0227】

一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、カーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２５％（例えば、多くとも、おおよそで、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約７５％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、糖（例えば、スクロース、グルコース、またはマンニトール）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物中の糖の濃度は、約２０％以下（例えば、おおよそで、１８％以下、１６％以下、１４％以下、１２％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、または１％以下のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、糖は、スクロースである。一部の実施形態では、糖は、グルコースである。一部の実施形態では、糖は、マンニトールである。

【0228】

一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、カーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％（例えば、多くとも、おおよそで、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約７．５％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約３％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、化学緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳまたはリン酸）を、カーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集の形成を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない濃度で含む。一部の実施形態では、化学緩衝剤は、ＨＥＰＥＳである。一部の実施形態では、ＨＥＰＥＳを、ＨＥＰＥＳを含む緩衝液の形態で組成物に添加する。一部の実施形態では、ＨＥＰＥＳを含む溶液のｐＨは、約５から約９の間（例えば、おおよそで、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、および９のいずれかなどであり、これらの値の間のあらゆる範囲も含む）である。一部の実施形態では、組成物は、ＨＥＰＥＳを、約７５ｍＭ以下（例えば、おおよそで、７０ｍＭ以下、６５ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、５５ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３５ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１０ｍＭ以下またはそれ未満のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）の濃度で含む。一部の実施形態では、化学緩衝剤は、リン酸である。一部の実施形態では、リン酸を、リン酸を含む緩衝液の形態で組成物に添加する。一部の実施形態では、組成物は、ＰＢＳを含まない。

【0229】

一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）をカーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２００％（例えば、多くとも、おおよそで、１９０％、１８０％、１７０％、１６０％、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）をカーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）をカーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１００％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）をカーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）をカーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２５％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞培養培地（例えば、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ）をカーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、細胞培養培地は、ＤＭＥＭである。一部の実施形態では、組成物は、ＤＭＥＭを約７０％以下（例えば、おおよそで、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、またはそれ未満のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）の濃度で含む。

【0230】

一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、カーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集を促進せず、かつ／もしくはそれに寄与しない、または、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２００％（例えば、多くとも、おおよそで、１９０％、１８０％、１７０％、１６０％、１５０％、１４０％、１３０％、１２０％、１１０％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは１％のいずれかなどであり、これらの値のいずれかの間のあらゆる範囲も含む）だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体もしくはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１５０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１００％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約５０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約２５％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、組成物は、担体タンパク質（例えば、アルブミン）を、カーゴ送達複合体またはナノ粒子のサイズよりも多くとも約１０％だけ大きいサイズを有するカーゴ送達複合体またはナノ粒子の凝集体の形成を促進するおよび／もしくはそれに寄与する濃度で含む。一部の実施形態では、担体タンパク質は、アルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。

【0231】

一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物を、静脈内投与、腫瘍内投与、動脈内投与、局部投与、眼内投与、点眼投与、門脈内投与、頭蓋内投与、脳内投与、脳室内投与、髄腔内投与、小胞内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、気管内投与、肺への投与、腔内投与、または経口投与用に製剤化する。

【0232】

例示的な投薬頻度としては、これだけに限定されないが、３日に１回以下が挙げられる。
調製方法

【0233】

一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子を調製する方法が提供される。

【0234】

一部の実施形態では、上記の通り第１のペプチドおよび第２のペプチドを含むカーゴ送達複合体を調製する方法であって、ａ）第１のペプチドと第２のペプチドを組み合わせ、それにより、ペプチド混合物を形成するステップと、ｂ）ペプチド混合物をカーゴと組み合わせ、それにより、カーゴ送達複合体を形成するステップとを含む方法が提供される。

【0235】

一部の実施形態では、上記の通りペプチドおよびカーゴ分子を含むカーゴ送達複合体を調製する方法であって、ペプチドをカーゴ分子と組み合わせ、それにより、カーゴ送達複合体を形成するステップを含む方法が提供される。

【0236】

一部の実施形態では、ペプチドまたはペプチド混合物とカーゴ分子をそれぞれ約１：１から約１００：１まで（例えば、およそ約１：１から約５０：１、または約２０：１までの間など）のモル比で組み合わせる。

【0237】

一部の実施形態では、方法は、カーゴ分子を含む第１の溶液をペプチドまたはペプチド混合物を含む第２の溶液と混合して第３の溶液を形成するステップを含み、ここで、第３の溶液は、ｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むまたはそれを含むように調整され、第３の溶液をインキュベートしてカーゴ送達複合体を形成させる。一部の実施形態では、第１の溶液は、滅菌水中のカーゴを含み、かつ／または、第２の溶液は、滅菌水中のペプチドまたはペプチド混合物を含む。一部の実施形態では、第３の溶液を、インキュベートしてカーゴ送達複合体を形成した後にｉ）約０～５％のスクロース、ｉｉ）約０～５％のグルコース、ｉｉｉ）約０～５０％のＤＭＥＭ、ｉｖ）約０～８０ｍＭのＮａＣｌ、またはｖ）約０～２０％のＰＢＳを含むように調整する。

【0238】

一部の実施形態では、方法は、カーゴ送達複合体をポアサイズの膜を通して濾過する濾過プロセスをさらに含む。一部の実施形態では、ポアの直径は、少なくとも約０．１μｍ（例えば、少なくとも約０．１μｍ、０．１５μｍ、０．２μｍ、０．２５μｍ、０．３μｍ、０．３５μｍ、０．４μｍ、０．４５μｍ、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１．０μｍ、１．１μｍまたは１．２μｍなど）である。一部の実施形態では、ポアの直径は、約１．２μｍ以下、１．０μｍ以下、０．８μｍ以下、０．６μｍ以下、０．５μｍ以下、０．４５μｍ以下、０．４μｍ以下、０．３５μｍ以下、０．３μｍ以下、または０．２５μｍ以下である。一部の実施形態では、ポートの直径は、約０．１μｍ～約１．２μｍ（例えば、約０．１～約０．８μｍ、約０．２～約０．５μｍなど）である。

【0239】

一部の実施形態では、本出願のカーゴ分子送達複合体またはナノ粒子を含む安定な組成物に関して、複合体またはナノ粒子の平均直径は約１０％よりも大きくは変化せず、また、多分散指数は約１０％よりも大きくは変化しない。

【0240】

本明細書に記載の細胞透過性ペプチドを含むペプチドのいずれかの調製方法も提供される。
使用方法

【0241】

本出願はまた、１つまたは複数のカーゴを細胞内に送達する方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、細胞にカーゴ送達複合体またはナノ粒子を接触させるステップを含み、ここで、カーゴ送達複合体は、１つまたは複数のカーゴを含む。

【0242】

一部の実施形態では、１つまたは複数のカーゴを細胞内に送達する方法であって、細胞に本明細書に記載のカーゴ送達複合体を接触させるステップを含み、カーゴ送達複合体が、１つまたは複数のカーゴを含む方法が提供される。一部の実施形態では、細胞は、がん細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は抗原（例えば、腫瘍抗原など）を発現し、カーゴ送達複合体内のカーゴ分子は当該抗原に特異的に結合するまたはそれを標的とするものである。

【0243】

本出願はまた、１つまたは複数のカーゴを個体の組織または器官内に送達する方法であって、個体に、本明細書に記載のカーゴ送達複合体、ナノ粒子、または医薬組成物を有効量で投与するステップを含み、組織または器官が、肝臓、肺、腎臓、脳、腸、脾臓、心臓、筋肉、およびリンパ節からなる群から選択される、方法も提供する。

【0244】

一部の実施形態では、１つまたは複数のカーゴ分子を個体の組織または器官内に送達する方法であって、個体に、本明細書に記載のカーゴ送達複合体を有効量で投与するステップを含み、組織または器官が、肝臓、肺、腎臓、脳、腸、脾臓、心臓、筋肉、およびリンパ節からなる群から選択される、方法が提供される。一部の実施形態では、組織または器官は、肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓およびリンパ節からなる群から選択される。

【0245】

一部の実施形態では、個体の組織または器官における１つまたは複数のカーゴ分子の保持を促進する方法であって、個体に、本明細書に記載のカーゴ送達複合体を有効量で投与するステップを含み、組織または器官が、肝臓、肺、腎臓、脳、腸、脾臓、心臓、筋肉、およびリンパ節からなる群から選択される、方法が提供される。一部の実施形態では、組織または器官は、肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓およびリンパ節からなる群から選択される。

【0246】

一部の実施形態では、個体における１つまたは複数のカーゴ分子の安定性を促進する方法であって、個体に、本明細書に記載のカーゴ送達複合体を有効量で投与するステップを含む方法が提供される。

【0247】

一部の実施形態では、個体の組織または器官における１つまたは複数のカーゴ分子の保持を促進する方法であって、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチドと第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチドを組み合わせ、それにより、ペプチド混合物を形成するステップであって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さない、ステップと、ｂ）ペプチド混合物とカーゴ分子を組み合わせ、それにより、カーゴ送達複合体を形成するステップと、ｃ）カーゴ送達複合体を個体に投与するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、組織または器官は、肝臓、肺、腎臓、脳、腸、脾臓、心臓、筋肉、およびリンパ節からなる群から選択される。一部の実施形態では、組織または器官は、肝臓、肺、腎臓、脳、脾臓およびリンパ節からなる群から選択される。一部の実施形態では、個体における１つまたは複数のカーゴ分子の安定性を促進する方法であって、ａ）第１の細胞透過性ペプチドを含む第１のペプチドと第２の細胞透過性ペプチドを含む第２のペプチドを組み合わせ、それにより、ペプチド混合物を形成するステップであって、第２のペプチドが、第２の細胞透過性ペプチドと共有結合により連結したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、第１のペプチドが、ＰＥＧ部分を有さない、ステップと、ｂ）ペプチド混合物とカーゴ分子を組み合わせ、それにより、カーゴ送達複合体を形成するステップと、ｃ）カーゴ送達複合体を個体に投与するステップとを含む方法が提供される。一部の実施形態では、第１の細胞透過性ペプチドの第２の細胞透過性ペプチドに対する比は、約２０：１～約１：１（例えば、約１５：１～約２：１、約１０：１～約４：１など）である。ペプチド（例えば、細胞透過性ペプチドまたは細胞透過性ペプチドを含むペプチド）、カーゴ、およびＰＥＧ部分の例としては、本明細書に記載のものが挙げられる。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチドのＮ末端またはＣ末端とコンジュゲートしている。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分は、第２の細胞透過性ペプチド内の部位とコンジュゲートしている。

【0248】

本出願は、個体の器官／組織内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体に上記のカーゴ送達複合体を投与するステップを含む方法も提供する。

【0249】

一部の実施形態では、個体の器官／組織内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与するステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子を含み、ペプチドが、配列番号１５２～１６２からなる群から選択される標的化配列をさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、器官または組織は、腫瘍組織、腎臓、膵臓、筋肉、心臓、脳、肝臓、腎臓、リンパ節、肺または脾臓である。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＰＴＤに基づくペプチド、両親媒性ペプチド、ポリアルギニンに基づくペプチド、ＭＰＧペプチド、ＣＡＤＹペプチド、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、またはＰＥＰ－３ペプチドである。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＣＡＤＹ、ＰＥＰ－１ペプチド、ＰＥＰ－２ペプチド、ＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－４ペプチド、ＶＥＰＥＰ－５ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、およびＡＤＧＮ－１００ペプチドからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0250】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、心臓または筋肉）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、ＰＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ）を含み、ペプチドが、標的化配列ＬＳＳＲＬＤＡをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１１４に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0251】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、脳または肝臓）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ）を含み、ペプチドが、標的化配列ＳＹＴＳＳＴＭをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１１５、１２８、１３１、または１３２に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0252】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、脳またはリンパ節）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ／ペプチド）を含み、ペプチドが、標的化配列ＫＳＹＤＴＹをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１１６または１１９に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0253】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、心臓または肺）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ）を含み、ペプチドが、標的化配列ＣＡＲＰＡＲをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１２１または１３９に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0254】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、脳または肺）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ）を含み、ペプチドが、標的化配列ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＤＨＮＧをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１２２または１２３に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0255】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、肺、腎臓、肝臓、腫瘍、膵臓）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内または筋肉内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ分子）を含み、ペプチドが、標的化配列ＹＩＧＳＲをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号８８、９４、９６、９８、１０１、１０３、１０５～１１２、１２５、１２６、１３０、および１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0256】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、肺、腎臓、肝臓、脾臓、脳、腫瘍、膵臓）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内または筋肉内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ分子）を含み、ペプチドが、標的化配列ＧＹＶＳをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号８９、９５、９７、９９、１０２、１０４、１２７、および１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0257】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、心臓）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、オリゴヌクレオチド）を含み、ペプチドが、標的化配列ＣＫＲＡＶをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１１７に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0258】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、脳）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内または筋肉内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ分子）を含み、ペプチドが、標的化配列ＴＨＲＰＰＮＷＳＰＶをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１３３または１３８に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0259】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、筋肉、心臓）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内または筋肉内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ分子）を含み、ペプチドが、標的化配列ＣＫＴＲＲＶＰをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１３４または１３７に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0260】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、筋肉）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内または筋肉内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチドおよびｂ）カーゴ分子（例えば、ペプチド、タンパク質、ＰＮＡ）を含み、ペプチドが、標的化配列ＡＳＳＬＮＩＡをさらに含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、ＶＥＰＥＰ－３ペプチド、ＶＥＰＥＰ－６ペプチド、ＶＥＰＥＰ－９ペプチド、またはＡＤＧＮ－１００ペプチドを含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１～１４、７５、７６、および１１３～１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１５～４０、７７、８５、９２～１００、１０５、１０７～１０９、および１２９～１３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号４１～５２、７８、および１１６～１２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号５３～７０、７９、８０、８６～９１、１０１～１０４、１０６、１１０～１１２、および１２１～１２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１１３に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端と共有結合により連結している。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを介して共有結合により連結している。一部の実施形態では、リンカーは、ベータアラニン、システイン、システアミド橋、ポリグリシン（例えば、Ｇ２またはＧ４など）、ＰＥＧリンカー部分、Ａｕｎ（１１－アミノ－ウンデカン酸）、Ａｖａ（５－アミノペンタン酸）、およびＡｈｘ（アミノカプロン酸）からなる群から選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー部分を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧリンカー部分は、約１～１０個（例えば、約１～８個、２～７個、１～５個、または６～１０個など）のエチレングリコール単位からなる。一部の実施形態では、標的化配列は、細胞透過性ペプチドのＮ末端とリンカーを伴わずに共有結合により連結している。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端と連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0261】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、膵臓、腎臓）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）配列番号７５に記載されているアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチドを含むペプチド、およびｂ）カーゴ分子（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、ウイルスまたはウイルス様粒子）を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0262】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、脳、肝臓、肺、腎臓）内にカーゴ分子を送達する方法、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に、筋肉内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）配列番号７８に記載されているアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチドを含むペプチド、およびｂ）カーゴ分子（例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、プラスミドＤＮＡ、ウイルスまたはウイルス様粒子）を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0263】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、肝臓、肺、腎臓、脳）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）配列番号１１８に記載されているアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチドを含むペプチド、およびｂ）カーゴ分子（例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、プラスミドＤＮＡ、ウイルスまたはウイルス様粒子）を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0264】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、肝臓、肺、腎臓、膵臓）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に、筋肉内に、皮下に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）配列番号７９または８０に記載されているアミノ酸配列を含む細胞透過性ペプチドを含むペプチド、およびｂ）カーゴ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ、ペプチド、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ分子、ｍＲＮＡ）を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0265】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に、筋肉内に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチド、およびｂ）カーゴ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を含み、細胞透過性ペプチドが、レトロインベルソペプチドである、方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号８５または８６に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。

【0266】

一部の実施形態では、個体の器官または組織（例えば、肝臓）内にカーゴ分子を送達する方法であって、個体にカーゴ送達複合体を投与する（例えば、静脈内に、皮下に）ステップを含み、カーゴ送達複合体が、ａ）細胞透過性ペプチドを含むペプチド、およびｂ）カーゴ分子（例えば、プラスミドＤＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ分子、ｍＲＮＡ）を含み、細胞透過性ペプチドが、炭水化物部分（例えば、ＧａｌＮＡｃなど）を含む、方法が提供される。一部の実施形態では、細胞透過性ペプチドは、ＡＤＧＮ－１００ペプチドまたはＶＥＰＥＰ－６ペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号１２４または１２９に記載されているアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、標的化配列のＮ末端に連結した１つまたは複数の部分をさらに含み、１つまたは複数の部分は、アセチル基およびステアリル基からなる群から選択される。一部の実施形態では、カーゴ分子は、核酸、ウイルス、ポリペプチド、タンパク質／核酸複合体、ウイルス様粒子、およびタンパク質複合体からなる群から選択される。
疾患および状態

【0267】

本出願はまた、個体における疾患または状態を処置する方法であって、個体に本明細書に記載のカーゴ送達複合体、ナノ粒子、または医薬組成物を有効量で投与するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、疾患または状態は、肝臓、肺、腎臓、脳、腸、脾臓、心臓、筋肉、およびリンパ節からなる群から選択される器官または組織における病的細胞に関連するものである。一部の実施形態では、疾患または状態は、がん、糖尿病、自己免疫疾患、血液病、心疾患、血管疾患、炎症性疾患、線維性疾患、ウイルス感染性疾患、遺伝性疾患、眼の疾患、肝疾患、肺疾患、筋疾患、タンパク質欠乏性疾患、リソソーム蓄積症、神経疾患、腎疾患（ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ）、老化および変性疾患、ならびにコレステロールレベルの異常を特徴とする疾患からなる群から選択される。

【0268】

本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置される疾患は、がんである。一部の実施形態では、がんは、固形腫瘍であり、医薬組成物は、これだけに限定されないが、増殖因子およびサイトカイン、細胞表面受容体、シグナル伝達分子およびキナーゼ、転写因子および他の転写モジュレーター、タンパク質発現および修飾の調節因子、腫瘍抑制因子、ならびにアポトーシスおよび転移の調節因子を含めたタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むカーゴ送達複合体またはナノ粒子を含む。

【0269】

一部の実施形態では、固形腫瘍としては、これだけに限定されないが、肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、カポジ肉腫、軟部肉腫、子宮サクロノーマ滑膜腫（ｕｔｅｒｉｎｅ ｓａｃｒｏｎｏｍａｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏枝神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫などが挙げられる。

【0270】

一部の実施形態では、本発明によるカーゴ送達複合体またはナノ粒子を、これだけに限定されないが、以下ののうちの１つまたは複数を含めた種々の疾患、障害、および／または状態のいずれかを処置するために使用することができる：自己免疫障害（例えば、糖尿病、ループス、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ）；炎症性障害（例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患）；感染性疾患（例えば、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＲＳＶ、チクングニアウイルス、ジカウイルス、インフルエンザウイルス）、細菌感染症、真菌感染症、敗血症）；神経性障害（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病；自閉症；デュシェンヌ型筋ジストロフィー）；心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓症、凝固障害、黄斑変性症などの血管新生障害）；増殖性障害（例えば、がん、良性の新生物）；呼吸器疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患）；消化性障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍）；筋骨格障害（例えば、線維筋痛症、関節炎）；内分泌、代謝、および栄養障害（例えば、糖尿病、骨粗鬆症）；泌尿器障害（例えば、腎疾患（ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ））；心理学的障害（例えば、うつ病、統合失調症）；皮膚障害（例えば、創傷、湿疹）；血液およびリンパ障害（例えば、貧血、血友病）；など。

【0271】

一部の実施形態では、本明細書に記載のカーゴ送達複合体またはナノ粒子を、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、表皮水疱症、筋萎縮性側索硬化症、およびグルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症を含めた、機能障害性または異所性タンパク質活性を特徴とする疾患を処置するために使用することができる。例えば、本発明は、対象におけるそのような状態または疾患を、ｍＲＮＡを含有する核酸または細胞に基づく治療薬を含むカーゴ送達複合体を投与することによって処置するための方法であって、ｍＲＮＡが、対象の細胞内に存在する異所性タンパク質活性に拮抗するまたは他のやり方でそれを克服するタンパク質をコードするものである、方法を提供する。機能障害性タンパク質の特定の例は、ＣＦＴＲタンパク質の機能障害性タンパク質バリアントを生じさせる、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス突然変異バリアントであり、これにより、嚢胞性線維症が引き起こされる。

【0272】

タンパク質活性の喪失（または実質的に減弱し、その結果、適当な（正常なまたは生理的タンパク質機能が生じないこと）を特徴とする疾患としては、嚢胞性線維症、ニーマン・ピックＣ型、β重症型サラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ハンター症候群、および血友病Ａが挙げられる。そのようなタンパク質は存在しない場合がある、または基本的に非機能性である。本発明は、対象におけるそのような状態または疾患を、ｍＲＮＡを含有する核酸または細胞に基づく治療薬を含むカーゴ送達複合体を投与することによって処置するための方法であって、ｍＲＮＡが、対象の標的細胞から喪失しているタンパク質活性に置き換わるタンパク質をコードするものである、方法を提供する。機能障害性タンパク質の特定の例は、ＣＦＴＲタンパク質の非機能性タンパク質バリアントを生じさせる嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のナンセンス突然変異バリアントであり、これにより、嚢胞性線維症が引き起こされる。

【0273】

本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、処置される疾患は、がんであり、がんは、固形腫瘍であり、医薬組成物は、腫瘍の発生および／または増悪に関与するタンパク質をコードする１つまたは複数のｍＲＮＡを含むカーゴ送達複合体またはナノ粒子を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡがコードする腫瘍の発生および／または増悪に関与するタンパク質としては、これだけに限定されないが、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、インターフェロン－ガンマ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ７－１、カスパーゼ－９、ｐ５３、ＭＵＣ－１、ＭＤＲ－１、ＨＬＡ－Ｂ７／ベータ２－ミクログロブリン、Ｈｅｒ２、Ｈｓｐ２７、チミジンキナーゼ、およびＭＤＡ－７が挙げられ、これらの突然変異体も含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、治療用タンパク質などのタンパク質をコードするものである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＣＡＲをコードするものである。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、複数のタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、単一のタンパク質をコードする複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、第１のタンパク質および第２のタンパク質をコードする単一のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、内因性遺伝子、例えば、疾患に関連する内因性遺伝子を標的とするＲＮＡｉなどのｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、外因性遺伝子を標的とするものである。一部の実施形態では、ＲＮＡｉは、疾患または状態に関与する内因性遺伝子を標的とする治療用ＲＮＡｉであり、タンパク質は、疾患または状態の処置に有用な治療用タンパク質である。一部の実施形態では、複合体またはナノ粒子は、治療用ｍＲＮＡおよび治療用ＲＮＡｉを含み、治療用ＲＮＡｉは、疾患に関連する形態の内因性遺伝子（例えば、突然変異タンパク質をコードする遺伝子、またはタンパク質の異常な発現をもたらす遺伝子）を標的とするものであり、治療用ｍＲＮＡは、治療形態の内因性遺伝子に対応する（例えば、第２の導入遺伝子は野生型または機能性形態の突然変異タンパク質をコードする、または第２の導入遺伝子によりタンパク質の正常な発現がもたらされる）。

【0274】

本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、医薬組成物を個体に静脈内、腫瘍内、動脈内、局部、眼内、点眼用の、門脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、髄腔内、小胞内、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、気管内、肺、腔内、気管内滴下注入、噴霧、または経口投与のいずれかによって投与する。

【0275】

本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、個体は、哺乳動物である。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
キット

【0276】

本明細書に記載の方法のための有用なキット、試薬、および製造品も本発明で提供される。そのようなキットは、本明細書に記載のカーゴ送達複合体、ナノ粒子、または医薬組成物を含有し得る。

【0277】

本明細書に記載のキットは、本主題の方法を実施するためのキットの構成成分の使用に関する指示（例えば、本明細書に記載の医薬組成物の作製および／または医薬組成物の使用に関する指示）をさらに含み得る。本主題の方法の実施に関する指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は、紙またはプラスチックなどの基板に印刷されている場合がある。そのように、指示は、キット中に添付文書として、キットの容器のラベルに、またはその構成成分として（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに付随して）などで存在し得る。一部の実施形態では、指示は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する電子ストレージデータファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示は、キット中には存在しないが、離れた供給源から、例えばインターネットを経由して指示を入手するための手段が提供される。この実施形態の例は、指示を表示することができ、かつ／または指示をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示と同様に、指示を入手するためのこの手段も適切な基板に記録される。

【0278】

キットの種々の構成成分は別々の容器内に入っていてよく、容器は、単一の囲い、例えば箱内に含有されていてよい。

【実施例】

【0279】

本発明の範囲および主旨の中でいくつかの実施形態が可能であることが当業者には理解されよう。ここで、以下の非限定的な実施例を参照することによって本発明をより詳細に記載する。以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであるが、当然、どのようにも本発明の範囲を限定するものではないと解釈されるべきである。
（実施例１）
ｉｎ ｖｉｖｏにおける適用のためのＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ／プラスミド－ＤＮＡ／ｓｉＲＮＡナノ粒子の最適化
材料

【0280】

ｍＲＮＡ：ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５ｍｏＵ）をＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ）から入手した。

【0281】

プラスミド：ＣＭＶプロモーターの下でルシフェラーゼを発現するｐＧＬ４レポーターベクターをＰｒｏｍｅｇａから入手した。

【0282】

ｓｉＲＮＡ ｌｕｃ：ルシフェラーゼＬｕｃ２を標的とするｓｉＲＮＡ、５’ＣＵＵ－ＡＣＧ－ＣＵＧ－ＡＧＵ－ＡＣＵ－ＵＣＧ－ＡＴＴ－３’（センス鎖）および５’－ＵＣＧ－ＡＡＧ－ＵＡＣ－ＵＣＡ－ＧＣＧ－ＵＡＡ－ＧＴＴ－３’（アンチセンス鎖）をＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃから入手した。

【0283】

ＡＤＧＮペプチド：以下のペプチドを使用した：
ＡＤＧＮ－１０６：βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ
ＡＤＧＮ－１０６－ＲＩ：ａｋｗｌｌｒｗｌｓｒｗｌｒｗｌａｒｗｌｒ
ＡＤＧＮ－１０６－ＰＥＧ７：Ａｃ－（ＰＥＧ）７－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－ＰＥＧ２：Ａｃ－（ＰＥＧ）２－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ－１：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－（Ｇ）４－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６ ｈｙｄｒｏ－２：Ａｃ－ＧＹＶＳ－（Ｇ）４－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ－３：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｖａ（ＣＨ２）_２－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６ ｈｙｄｒｏ－４：Ａｃ－ＧＹＶＳ－Ａｖａ（ＣＨ２）_２－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ－５：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｕｎ（ＣＨ２）_６－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６ ｈｙｄｒｏ－６：Ａｃ－ＧＹＶＳ－Ａｕｎ（ＣＨ２）_６－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ－８：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｈｘ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６ ステアリル：ステアリル－βＡ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００：βＡＫＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷ ＲＶＲＳＷＳＲ
ＡＤＧＮ－１００－ＲＩ：ｒｓｗｓｒｖｒｗｌｒｗｒｗｇａｓｒｗｋ
ＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧ７：Ａｃ－（ＰＥＧ）７－βＡ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧ２：Ａｃ－（ＰＥＧ）２－βＡ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ－１：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－（Ｇ）４－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００ ｈｙｄｒｏ－２：Ａｃ－ＧＹＶＳ－（Ｇ）４－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ－３：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｖａ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００ ｈｙｄｒｏ－４ ：Ａｃ－ＧＹＶＳ－Ａｖａ －ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ－５：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｕｎ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００ ｈｙｄｒｏ－６：Ａｃ－ＧＹＶＳ－Ａｕｎ －ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ－８：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｈｘ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００ ステアリル：ステアリル－βＡ－ＫＷＲＳＡＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０３Ｃ：Ａｃ－ＡＳＳＬＮＩＡ－Ａｖａ－ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０４ Ａｃ－ＬＳＳＲＬＤＡ－Ａｖａ－ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ
ＡＤＧＮ－１０５ Ａｃ－ＳＹＴＳＳＴＭ－Ａｖａ－ＫＷＷＥＲＷＷＲＥＷＰＲＫＲＲ
ＡＤＧＮ－１０６ＴＢ：Ａｃ－ＳＹＴＳＳＴＭ－Ａｖａ－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０９：Ａｃ－ＫＳＹＤＴＹ－Ａｖａ－ＡＬＲＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０９Ｄ：Ａｃ－ＫＳＹＤＴＹＡＡＥＴＲ－ＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ －ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０９ｂ：Ａｃ－ＣＫＲＡＶ－ＲＷＷＬＲＷＡＳＲＷＦＳＲＷＡＷＷＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０１：Ａｃ－ＣＡＲＰＡＲ－ＷＲＳＡＧＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０２：Ａｃ－ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＤＨＮＧ－ＷＲＳＡＬＲＷＲＬＷＲＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１００ＧＡＬＮＡＣ：Ａｃ－ＫＷＲＳＡ（ＧａｌＮａｃ）ＬＷＲＷＲＬＷＲＶＲＳＷＳＲ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６ＧＡＬＮＡＣ：ＡＣ－ＡＬＷＲＡ（ＧａｌＮａｃ）ＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６ＴＣ：Ａｃ－ＴＨＲＰＰＮＷＳＰＶＷＰ－ＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＲＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６ＴＤ：Ａｃ－ＣＫＴＲＲＶＰ－ＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２

【0284】

Ａｈｘリンカーを用いて得られたものではペプチド調製物の収量が約２０倍であることが認められた。

【0285】

細胞株：２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－３２１６（商標））およびＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８０６５（商標））細胞をＡＴＣＣから入手した。ＳＫＯＶ－３／Ｌｕｃ細胞およびＡ３７５／Ｌｕｃ細胞をｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
方法

【0286】

ｍＲＮＡとの複合体の形成。２４ウェルプレート中で培養した２～５×１０^６個の細胞または集密度が約７０～８０％の細胞のトランスフェクションに以下のプロトコールを使用した。ＡＤＧＮペプチド／ｍＲＮＡ粒子を、（０．２５μｇ）ｍＲＮＡを使用し、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡのモル比２０：１で調製した。Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（０．２５μｇ）を室温で滅菌水（ＧＩＢＣＯ）２０μｌ中に希釈した。最終的なペプチド溶液５μｌを添加して総体積２０μｌを得た。滅菌水を用いて体積を５０μｌに調整し、ボルテックスを用いて低スピードで１分間穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、５％スクロースを含有する滅菌水を添加することによって体積を１００μｌにし、溶液をボルテックスを用いて低スピードで１分間穏やかに混合し、３７℃で５分間インキュベートし、次いで、細胞のトランスフェクションに進んだ。

【0287】

最適化されたｍＲＮＡとの複合体の形成。ＡＤＧＮペプチド／ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ粒子をＡＤＧＮ－ペプチド／核酸のモル比２：１（２×）で調製した。ＡＤＧＮ／ＣＡＳ９ｍＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ複合体を、０．２μｇのｍＲＮＡ：０．１５μｇのｓｇＲＮＡおよび５％グルコースまたはＤＭＥＭ（９６ウェルプレートに関する例）を用いてモル比１：２（２×）で調製した。予め混合したＣＡＳ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ（５μｇ／１５μｇ）を室温でガラスバイアル（１～４ｍｌ）中、滅菌水中に調製した。ＡＤＧＮ－ペプチド溶液を４００ｒｐｍでの磁気撹拌下で滴下して（毎秒１滴）、１：２の比を得た。次いで、溶液を室温または３７℃で３０分間インキュベートした。トランスフェクションの直前に、１５０μｌのグルコースまたはＤＭＥＭを添加した。次いで、溶液を４００ｒｐｍでの磁気撹拌下で１分間混合し、次いで、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、溶液を細胞のトランスフェクションまたはＩＶ投与のために準備した。ＩＶ投与の前に、複合体をスクロース５％溶液中に希釈した。

【0288】

プラスミドＤＮＡとの複合体の形成。２４ウェルプレート中で培養した２～５×１０^６個の細胞または集密度が約７０～８０％の細胞のトランスフェクションのために以下のプロトコールを使用した。（０．２μｇ）を使用して、ＡＤＧＮペプチド／プラスミドＤＮＡ ｐＧＬ４粒子をＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４のモル比２０：１で調製した。ＰＧＬ４プラスミド（０．１５μｇ）を室温で滅菌水（ＧＩＢＣＯ）２０μｌ中に希釈した。最終的なペプチド溶液１０μｌを添加して総体積２０μｌを得た。滅菌水を用いて体積を５０μｌに調整し、ボルテックスを用いて低スピードで１分間穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、５％スクロースを含有する滅菌水を添加することによって体積を１００μｌにし、溶液をボルテックスを用いて低スピードで１分間穏やかに混合し、３７℃で５分間インキュベートし、次いで、細胞のトランスフェクションに進んだ。

【0289】

ｓｉＲＮＡとの複合体の形成。２４ウェルプレート中で培養した２～５×１０^６個の細胞または集密度が約７０～８０％の細胞のトランスフェクションのために以下のプロトコールを使用した。２０ｎＭのｓｉＲＮＡを使用してＡＤＧＮペプチド／ｓｉＲＮＡ Ｌｕｃ粒子をＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４のモル比２０：１で調製した。ｓｉＲＮＡ二重鎖（１０ｎＭおよび２５ｎＭ）を室温で滅菌水（ＧＩＢＣＯ）２０μｌ中に希釈した。最終的なペプチド溶液（５５μＭ）１．５μｌまたは３μｌを添加して総体積２０μｌを得た。滅菌水を用いて体積を５０μｌに調整し、ボルテックスを用いて低スピードで１分間穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、５％スクロースを含有する滅菌水を添加することによって体積を１００μｌにし、溶液をボルテックスを用いて低スピードで１分間穏やかに混合し、３７℃で５分間インキュベートし、次いで、細胞のトランスフェクションに進んだ。

【0290】

トランスフェクションプロトコール。２４ウェルプレートフォーマットについてのプロトコールを報告する。細胞を、２ｍＭのグルタミン、１％抗生物質（ストレプトマイシン、１０，０００μｇ／ｍＬ、ペニシリン、１０，０００ＩＵ／ｍＬ）および１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ_２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養した。トランスフェクションの前日に細胞１５０，０００個を播種した２４ウェルプレートを５０～６０％集密まで成長させ、トランスフェクション時に約７０％集密になっているように設定した。トランスフェクトする前に、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した。次いで、細胞を、０．２５μｇのｍＲＮＡ、０．１５μｇのプラスミドＤＮＡまたは１０～２５ｎＭのｓｉＲＮＡを含有するＡＤＧＮ－ペプチド／カーゴ複合体溶液０．１ｍｌで覆い、穏やかに混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。新鮮なＤＭＥＭ０．２ｍＬを添加し、細胞を３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、ＡＤＧＮ－ペプチド／カーゴ複合体の覆いを取り除かずに最終的なＦＣＳ濃度１０％に達するように、１５％ＦＣＳを含有する完全ＤＭＥＭ １ｍＬを添加した。トランスフェクション後に細胞をインキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）に戻し、７２時間置いた。
結果

【0291】

この試験の目的は、いずれのＡＤＧＮ製剤が、ｉｎ ｖｉｖｏ全身ＩＶおよび局部またはＩＭ送達のための優れたｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡを有するＡＤＧＮ－ナノ粒子をもたらすことができるものであるかを評価することであった。ステアリル、異なるＰＥＧ長でのＰＥＧ化、シグナル伝達配列およびレトロインベルソ変換を含めたＡＤＧＮペプチドのいくつかの異なる修飾を評価した。レトロインベルソペプチド－ペプチドは、天然に存在するＬ－アイソフォームの逆配列のＤ－アミノ酸からなり、それらにより、構造的特色は維持する一方で、タンパク質分解に対して安定なペプチド類似体がもたらされるかどうかを調査するためのものである。ＡＤＧＮ－ペプチド／カーゴ製剤はｉｎ ｖｉｔｒｏでは特徴付けられており、ｍＲＮＡ、プラスミドＤＮＡおよびｓｉＲＮＡ送達するためのそれらの効力を培養細胞に対して、およびｉｎ ｖｉｖｏにおいて評価した。
（実施例２）
ＡＤＧＮ－ペプチドバリアント／ｍＲＮＡ複合体の特徴付けおよび安定性。

【0292】

種々のＡＤＧＮ－ペプチドの、ｍＲＮＡと安定なナノ粒子を形成する能力を分析した。粒子サイズおよび凝集のレベルをＤＬＳ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）で測定した。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の平均サイズおよび多分散を２５℃で測定当たり３分間にわたって決定した。大きな粒子を除去するために、複合体を形成したＡＤＧＮ／ｍＲＮＡを、ＰＥＳまたはＰＶＤＦのいずれかの０．４５μｍフィルターを使用して濾過した。データが図８および図９に３回の別々の実験の平均として示されている。

【0293】

図８に報告されている通り、全てのＡＤＧＮ－１００ペプチドがｍＲＮＡと安定なナノ粒子を形成し、平均サイズは１００～１６０ｎｍにわたった。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体溶液は、平均サイズが４００ｎｍよりも大きいナノ粒子を、ほんのわずか、５％～１３％含有した。ＡＤＧＮ－１００のレトロインベルソ修飾ではｍＲＮＡと安定な複合体を形成するペプチドの能力は改変されなかった。ＡＤＧＮ－１００ Ｒｅｔｒｏ ｉｎｖｅｒｓｏ、ＡＤＧＮ－１００ Ｈｙｄｒｏ５およびＡＤＧＮ－１００ Ｈｙｄｒｏ６ペプチドを用いると凝集体が４％未満である高度に均一なナノ粒子が得られる。

【0294】

図９に報告されている通り、全てのＡＤＧＮ－１０６ペプチドがｍＲＮＡと安定なナノ粒子を形成し、平均サイズは１１０～１６０ｎｍにわたった。ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体溶液は、平均サイズが４００ｎｍよりも大きいナノ粒子を、ほんのわずか、５％～１３％含有した。ＡＤＧＮ－１０６のレトロインベルソ修飾ではｍＲＮＡと安定な複合体を形成するペプチドの能力は改変されなかった。ＡＤＧＮ－１０６ Ｒｅｔｒｏ ｉｎｖｅｒｓｏおよびＡＤＧＮ－１００ Ｈｙｄｒｏ６ペプチドを用いると凝集体が３％未満である高度に均一なナノ粒子が得られる。

【0295】

ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６ペプチドバリアントのどちらに関しても、０．４５μｍフィルターで濾過することによって大きな粒子および凝集体が効率的に除去され、ＰＥＳフィルターでは約１５～２０％、およびＰＶＤＦフィルターでは約３０％の材料の消失がもたらされる。したがって、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いた濾過ステップをさらなる調査のために追加する。
（実施例３）
ＡＤＧＮ－ペプチドバリアント／ＤＮＡプラスミド複合体の特徴付けおよび安定性。

【0296】

種々のＡＤＧＮ－ペプチドの、５．６ＫｐＢのルシフェラーゼ発現プラスミドであるＤＮＡ ｐＧＬ４と安定なナノ粒子を形成する能力を分析した。粒子サイズおよび凝集のレベルをＤＬＳ ＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｌｔｄ）で測定した。ＡＤＧＮ／プラスミドＤＮＡ複合体の平均サイズおよび多分散を２５℃で測定当たり３分間にわたって決定した。大きな粒子を除去するために、複合体を形成したＡＤＧＮ／プラスミドＤＮＡを、ＰＥＳまたはＰＶＤＦのいずれかの０．４５μｍフィルターを使用して濾過した。データが図１０に３回の別々の実験の平均として示されている。

【0297】

図１０に報告されている通り、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ＨＹＤＲＯ２ＡおよびＡＤＧＮ－１００ＨＹＤＲＯ３以外の全てのＡＤＧＮペプチドが、ＰＧＬ４と１００～１５０ｎｍの範囲内の安定なナノ粒子を形成した。安定なＡＤＧＮ／プラスミドＤＮＡ複合体溶液は、平均サイズが４００ｎｍよりも大きいナノ粒子を、ほんのわずか、５％～２０％含有した。０．４５μｍフィルターで濾過することによって大きな粒子および凝集体が効率的に除去され、ＰＥＳフィルターでは約１５～３０％、およびＰＶＤＦフィルターでは約４０％の材料の消失がもたらされる。したがって、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いた濾過ステップをさらなる調査のために追加する。ＡＤＧＮ－１００のレトロインベルソ修飾ではプラスミドＤＮＡと安定な複合体を形成するペプチドの能力は改変されなかった。ＡＤＧＮ－１０６のレトロインベルソ修飾ではプラスミドと安定な粒子を形成するＡＤＧＮ－１０６の効力は改善されなかった。ＡＤＧＮ－１００ Ｒｅｔｒｏ ｉｎｖｅｒｓｏ、ＡＤＧＮ－１００ Ｈｙｄｒｏ５およびＡＤＧＮ－１００ Ｈｙｄｒｏ６ペプチドを用いると凝集体が４％未満である高度に均一なナノ粒子が得られる。
（実施例４）
ＡＤＧＮ－ペプチドバリアントにより、２９３Ｔ細胞におけるカーゴ送達が改善される

【0298】

ＡＤＧＮ－ペプチドを、２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼｍＲＮＡの細胞送達について評価した。０．２５μｇのｍＲＮＡの単回投与を評価した。滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（０．２５μｇ）をＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ５およびＡＤＧＮ－Ｈｙｄｒｏ６と混合した。ＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体を、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過した。高血清および細胞培養条件下でのＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の安定性を評価するために、複合体をトランスフェクション前に２５％血清またはヘパラン硫酸のいずれかの存在下で３時間インキュベートし、次いで、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ発現を７２時間モニタリングした。

【0299】

図１Ａおよび１Ｂに報告されている通り、濾過はＡＤＧＮ粒子の効率に影響を及ぼさなかった。血清またはヘパラン硫酸処理の非存在下では、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６ペプチドの両方について高レベルのルシフェラーゼ発現が得られ、ＡＤＧＮ－１０６がＡＤＧＮ－１００よりも２倍強力であった。ルシフェラーゼ発現は、ＡＤＧＮペプチドと連結したステアリル、Ｈｙｄｒｏ５およびＨｙｄｒｏ６モチーフの存在による有意な影響は受けない。対照的に、Ｈｙｄｒｏ１およびＨｙｄｒｏ２モチーフが存在するとＡＤＧＮペプチドの効率が２０～５０％低下した。レトロインベルソ修飾によりＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６の効率は改変されなかった。

【0300】

血清またはヘパラン硫酸の存在によりＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体の安定性が低下し、これは、ルシフェラーゼ発現の有意な減少と相関する。ＡＤＧＮ－１０６の効率は血清の存在下では７１％低下し、ヘパラン硫酸の存在下では５０％低下し、ＡＤＧＮ－１００の効率は、血清中では９０％低下し、へパラン中では５０％低下する。ステアリルまたはＨｙｄｒｏ－１、Ｈｙｄｒｏ－５およびＨｙｄｒｏ－６モチーフの存在により、ＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ粒子が安定化し、ルシフェラーゼ発現の低下は血清中では３０～４０％、およびヘパラン硫酸中では１０～２０％だけであった。レトロインベルソ修飾の導入により、特に血清の存在下およびヘパラン硫酸の存在下でのＡＤＧＮ－ｍＲＮＡ複合体が強力に安定化した。ＡＤＧＮ－１００ ＲＩに媒介されるルシフェラーゼ発現は血清の存在下では４０％低下し、ヘパラン硫酸を用いると１６％低下する。ＡＤＧＮ－１０６ＲＩに媒介されるルシフェラーゼ発現は血清の存在下では２６％低下し、ヘパラン硫酸を用いると１３％低下する。

【0301】

Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（０．２５μｇ）を、１０％または２０％のＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１００またはＡＤＧＮ－１０６溶液と、および１０％または２０％のＡＤＧＮ－１０６－ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１０６と結び付けた。ＡＤＧＮ－１００またはＡＤＧＮ－１０６と１０％または２０％のペグ化ＡＤＧＮ－１００またはペグ化ＡＤＧＮ－１０６と組み合わせることにより、複合体が有意に安定化された。血清処理後のトランスフェクション効率の低下は、ＡＤＧＮ－１００ ＰＥＧ １０％および２０％を使用するとそれぞれ２０％または１７％だけである。

【0302】

リンカー配列の影響を評価するために、ＹＩＧＳＲ標的化配列を、種々のリンカーモチーフを使用してＡＤＧＮ－１０６と連結した。
ＡＤＧＮ－１０６：Ａｃ－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－ＨＹＰＥＧ２：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－（ＰＥＧ）２－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－ＨＹＰＥＧ４：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－（ＰＥＧ）４－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－ＨＹＰＥＧ７：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－（ＰＥＧ）７－βＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ－１：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－（Ｇ）４－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ－７：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－（Ｇ）２－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ－３：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｖａ（ＣＨ２）_２－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ－５：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｕｎ（ＣＨ２）_６－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２
ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ－８：Ａｃ－ＹＩＧＳＲ－Ａｈｘ－ＡＬＷＲＡＬＷＲＬＷＲＳＬＷＲＬＬＷＫＡ－ＮＨ２

【0303】

ＹＩＧＳＲ標的化配列を含有するＡＤＧＮ－１０６ペプチドを、２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼｍＲＮＡの細胞送達について評価した。０．２５μｇのｍＲＮＡの単回投与を評価した。滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（０．２５μｇ）をＡＤＧＮ－１０６およびＡＤＧＮ－１０６Ｈｙｄｒｏバリアントと混合した。ＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体を、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過した。ＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体をトランスフェクション前に２５％血清の存在下で３時間インキュベートし、次いで、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ発現を７２時間モニタリングした。

【0304】

図１Ｃに報告されている通り、血清処理の非存在下では、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１０６ Ｈｙｄｒｏ、ＡＤＧＮ－１０６ＨＹＰＥＧ２、ＡＤＧＮ－１０６－Ｈｙｄｒｏ１、ｈｙｄｒｏ３、ｈｙｄｒｏ５およびｈｙｄｒｏ８について高レベルのルシフェラーゼ発現が得られ、これにより、ベータＡｌａ、ＰＥＧ２、Ａｖａ、Ａｕｎ、Ａｈｘ、および（Ｇｌｙ）４などのリンカーの使用がトランスフェクション効率には影響しないことが示唆される。対照的に、ＰＥＧ４、ＰＥＧ７およびＧｌｙ－Ｇｌｙをリンカーとして使用すると、ルシフェラーゼ発現がそれぞれ３５％、７２％および２８％低下した。

【0305】

血清の存在下では、ＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ複合体の安定性が有意に低下し、これは、ルシフェラーゼ発現の有意な減少と相関する。ＡＤＧＮ－１０６およびＡＤＧＮ－１０６Ｈｙｄｒｏの効率は８０％低下する。ＰＥＧ２、Ａｖａ、Ａｈｘ、（Ｇｌｙ）４およびＡｕｎをリンカーとして使用することにより、粒子の安定性に対する血清の影響が低減した。最良の結果はＡｕｎ＞Ａｈｘ＞ＰＥＧ２＞Ａｖａ＞Ｇｌｙ_４リンカーで得られ、ルシフェラーゼ発現の減少はそれぞれ１５％、１７％、２１％、３２％および４０％であった。この結果から、リンカーの長さと性質の両方が重要であり、最良の結果は（ＣＨ２）_４モチーフで得られることが実証された。

【0306】

この結果から、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６により、２９３Ｔ細胞におけるｍＲＮＡの効率的な送達が促進されることが実証された。効率には影響を及ぼさずにナノ粒子調製物を清澄化するために濾過を使用することができる。結果から、ＡＤＧＮペプチドのレトロインベルソもしくはｈｙｄｒｏ－６修飾を使用すること、またはＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ粒子内で１０％～２０％のペグ化ＡＤＧＮペプチドを組み合わせることにより、複合体が高血清条件の存在下で強力に安定化されることが示された。
（実施例５）
ＡＤＧＮ－ペプチドバリアントにより、２９３Ｔ細胞におけるｐＧＬ４ ＤＮＡプラスミド送達が改善される

【0307】

ＡＤＧＮ－ペプチドを、ルシフェラーゼを発現するｐＧＬ４プラスミドＤＮＡの２９３Ｔ細胞における細胞送達について評価した。滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中Ｌｕｃ ｐＧＬ４プラスミド（０．１５μｇ）をＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ５およびＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ６と混合した。ＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体を、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過した。高血清および細胞培養条件下でのＡＤＧＮ／ｐＧＬ４プラスミド複合体の安定性を評価するために、複合体をトランスフェクション前に２５％血清またはヘパラン硫酸のいずれかの存在下で３時間インキュベートし、次いで、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ発現を７２時間モニタリングした。

【0308】

図２Ａおよび２Ｂに報告されている通り、濾過はＡＤＧＮ粒子の効率に影響を及ぼさない。血清またはヘパラン硫酸処理の非存在下では、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１００バリアントペプチドで高レベルのルシフェラーゼ発現が得られた。Ｈｙｄｒｏ１、２、３，４、５モチーフの存在により、ＡＤＧＮ－１００の効率が２０～４０％低下した。対照的に、ステアリル、レトロインベルソおよびＨｙｄｒｏ６修飾はＡＤＧＮ－１００の効率に影響を及ぼさない。図２ＡおよびＢに示されている通り、血清の非存在下または存在下でＡＤＧＮ－１０６およびＡＤＧＮ－１０６ＲＩを使用すると不十分なルシフェラーゼ発現がモニタリングされ、これは、ＡＤＧＮ－１０６／プラスミドＤＮＡ粒子のサイズが大きいことおよび安定性が乏しいこととかなり相関した。血清またはヘパラン硫酸の存在によりＡＤＧＮ／ｐＧＬ４プラスミド複合体の安定性が低下し、これは、ルシフェラーゼ発現の有意な減少と相関する。ＡＤＧＮ－１００の効率は血清の存在下では９０％低下し、ヘパラン硫酸の存在下では５０％低下する。ステアリルまたはＨｙｄｒｏ－１、Ｈｙｄｒｏ－５およびＨｙｄｒｏ－６モチーフの存在により、ＡＤＧＮ／ｐＧＬ４粒子が安定化し、ルシフェラーゼ発現の減少は血清中では３０～４０％、およびヘパラン硫酸中では１０～２０％だけである。対照的に、Ｈｙｄｒｏ－２、Ｈｙｄｒｏ－３およびｈｙｄｒｏ－４修飾により、血清の存在下およびへパラン処理でのトランスフェクションは有意には改善されない。レトロインベルソ修飾の導入により、ＡＤＧＮ－プラスミドＤＮＡ複合体が、特に血清の存在下でおよびヘパラン硫酸の存在下で強力に安定化した。ＡＤＧＮ－１００ＲＩに媒介されるルシフェラーゼ発現は血清の存在下では２５％減少し、ヘパラン硫酸を用いた場合は１０％未満の減少であった。

【0309】

ＡＤＧＮ－１００をペグ化ＡＤＧＮ－１００と組み合わせることのトランスフェクション効率に対する影響を評価した。ｐＧＬ４ ｌｕｃプラスミド（０．１５μｇ）を、５～５０％のＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１００溶液と、またはＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと結び付けた。図２Ｃに報告されている通り、ＡＤＧＮ－１００と１０％または２０％のペグ化ＡＤＧＮ－１００を組み合わせることにより、複合体が有意に安定化された。２５％血清の存在下でのトランスフェクション効率は２．３倍および２．４倍上昇する。対照的に、５０％および１００％のＡＤＧＮ－１００ ＰＥＧを使用するとルシフェラーゼ発現のレベルが５０％および８０％低下した。

【0310】

この結果から、ＡＤＧＮ－１００により、２９３Ｔ細胞におけるプラスミドＤＮＡの効率的な送達が促進されることが実証された。効率には影響を及ぼさずにナノ粒子調製物を清澄化するために濾過を使用することができる。結果から、ＡＤＧＮペプチドのステアリル化、レトロインベルソまたはＨｙｄｒｏ－６修飾を使用すること、またはＡＤＧＮ／プラスミド粒子内に１０％～２０％のペグ化ＡＤＧＮペプチドを組み合わせることにより、複合体が高血清条件の存在下で強力に安定化されることが示された。
（実施例６）
ＡＤＧＮ－ペプチドバリアントにより、Ａ３７５／Ｌｕｃ細胞におけるｓｉＲＮＡ送達が改善される

【0311】

ＡＤＧＮ－ペプチドを、Ａ３７５／Ｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖の細胞送達について評価した。滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中の、ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ（１０および２５ｎＭ）を、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ステアリル、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ１、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ２、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ４、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ３、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ５およびＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ６と混合した。ＡＤＧＮ－ペプチド／ｓｉＲＮＡ複合体を、０．４５μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過した。高血清条件下でのＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ複合体の安定性を評価するために、複合体を２５％血清の存在下で３時間インキュベートし、次いで、Ａ３７５／Ｌｕｃ細胞にトランスフェクトし、ルシフェラーゼ発現を４８時間モニタリングした。

【0312】

図３Ａおよび３Ｂに報告されている通り、血清処理の非存在下では、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６ペプチドの両方で高レベルのｓｉＲＮＡに媒介されるルシフェラーゼサイレンシングが得られた。ルシフェラーゼｉｘのレベルは１０ｎＭのｓｉＲＮＡを使用すると７８％低下し、２５ｎＭのｓｉＲＮＡを使用すると９３％低下した。Ｈｙｄｒｏ１、２、３、４、５モチーフの存在により、ＡＤＧＮ－１００またはＡＤＧＮ－１０６の効率が５０～９０％低下した。対照的に、ステアリル、レトロインベルソおよびＨｙｄｒｏ６修飾はＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６の効率に影響を及ぼさない。血清の存在により、ＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ複合体の安定性が低下し、これは、ｓｉＲＮＡに媒介されるルシフェラーゼサイレンシングの有意な減少と相関する。ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６の効率は、血清の存在下では９０％低下する。ステアリルおよびＨｙｄｒｏ－６モチーフの存在により、ＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ粒子が安定化され、血清中でのｓｉＲＮＡに媒介されるルシフェラーゼサイレンシングの減少は２０％だけである。レトロインベルソ修飾の導入により、ＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ複合体が強力に安定化した。図３Ａおよび３Ｂに報告されている通り、ＡＤＧＮ－１００ＲＩまたはＡＤＧＮ－１０６ＲＩを使用した場合、ｓｉＲＮＡに媒介されるルシフェラーゼサイレンシングは血清の存在の影響を受けず、ルシフェラーゼ発現レベルは１０ｎＭのｓｉＲＮＡでは７７％低下し、２５ｎＭのｓｉＲＮＡでは９５％低下する。

【0313】

ＡＤＧＮ－１００をペグ化ＡＤＧＮ－１００と組み合わせることの、ｓｉＲＮＡトランスフェクション効率に対する影響を評価した。ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡ（１０ｎＭおよび２５ｎＭ）を、５～５０％のＡＤＧＮ－１００－ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１００溶液と、またはＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと結び付けた。図３Ｃに報告されている通り、ＡＤＧＮ－１００と１０％または２０％のペグ化ＡＤＧＮ－１００を組み合わせることにより、複合体が有意に安定化された。ルシフェラーゼ発現は１０％および２０％のペグ化ＡＤＧＮ－１００を使用するとそれぞれ７５％および８１％減少する。対照的に、５０％および１００％のＡＤＧＮ－１００ ＰＥＧを使用するとトランスフェクション効率が５０％および８０％低下した。

【0314】

この結果から、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１０６により、Ａ３７５／Ｌｕｃ細胞におけるｓｉＲＮＡの効率的な送達が促進されることが実証された。結果から、ＡＤＧＮペプチドのステアリル化、レトロインベルソまたはＨｙｄｒｏ－６修飾を使用すること、またはＡＤＧＮ／ｓｉＲＮＡ粒子内に１０％～２０％のペグ化ＡＤＧＮペプチドを組み合わせることにより、複合体が高血清条件の存在下で強力に安定化されることが示された。
（実施例７）
ＡＤＧＮ－ペプチドバリアントによりｉｎ ｖｉｖｏにおけるカーゴ送達が改善される

【0315】

安定なＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡを、ルシフェラーゼｍＲＮＡの静脈内投与および筋肉内投与によるｉｎ ｖｉｖｏ送達について評価した。動物を、５ｍｏＵ修飾Ｌｕｃ ｍＲＮＡ ５μｇの単回投与で処置した。滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中の５ｍｏＵ修飾Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５μｇ）をＡＤＧＮペプチド（滅菌水）と混合し、各試料の体積を、５％スクロースを含有する滅菌水を用いて１００μｌに調整した。試料を、ボルテックスを用いて低スピードで１分間穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。試料を、投与前に０．４５μｍのＰＥＳフィルターで濾過した。ＩＶ投与に関しては、マウスに、ＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１００－ステアリル／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ１／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ２または１０％のＡＤＧＮ－１００ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体のいずれか１００μｌを静脈内（ＩＶ）注射した（群当たり動物３匹）。対照として、群３からのマウス（群当たり動物２匹）にネイキッド５ｍｏＵ修飾Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５μｇ）１００μｌをＩＶ注射した。ＩＭ投与に関しては、マウスに、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ／ｍＲＮＡまたは１０％もしくは２０％のＡＤＧＮ－１００ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ／ｍＲＮＡ複合体のいずれか２５μｌ（ｍＲＮＡ ５μｇ）をＩＶ注射した（群当たり動物２匹）。対照として、群３からのマウス（群当たり動物２匹）にネイキッド５ｍｏＵ修飾Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５μｇ）２５μｌをＩＶ注射した。

【0316】

ｍＲＮＡ Ｌｕｃ発現を生物発光によってモニタリングした。生物発光イメージングを１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に実施した。非侵襲的生物発光イメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のために、マウスに１５０μｇ／ｇのルシフェリンをｉ．ｐ．注射した。次いで、結果を０日目に対する値として表し、図４Ａ～４Ｄおよび図５に示した。

【0317】

図４Ａに示されている通り、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００およびＡＤＧＮ－１００ステアリルに媒介されるｉｎ ｖｉｖｏカーゴ送達およびｍＲＮＡ発現が主に肝臓において観察され、肺および腎臓においてより低いレベルで観察された。ＡＤＧＮ－１０６はＡＤＧＮ－１００ステアリルおよびＡＤＧＮ－１００よりもそれぞれ２倍および４倍効率的である。ＡＤＧＮ－１０６ＲＩ修飾により、ＡＤＧＮ－１０６の効率が全ての組織において２倍上昇した。対照的に、ＡＤＧＮ－１００ ｈｙｄｒｏ１またはＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ２を使用して得られたルシフェラーゼ発現は無視できるものであった。

【0318】

図４Ａおよび４Ｂに示されている通り、ＡＤＧＮ－１０６を１０％のＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと組み合わせることにより、種々の組織においてルシフェラーゼ発現が３～６倍改善された。さらに、ＡＤＧＮ１０６／ｍＲＮＡ複合体内に１０％のＡＤＧＮ－１００ＰＥＧが存在することにより、脳、リンパ節および脾臓におけるｍＲＮＡターゲティングが促進される。

【0319】

図４Ｃおよび４Ｄに示されている通り、肝臓および肺におけるルシフェラーゼ発現の動態が、１２時間後に開始して、４８時間の時点で最適な発現を有し、少なくとも７２時間安定なままである。

【0320】

図４Ｃおよび４Ｄに示されている通り、肝臓および肺におけるルシフェラーゼ発現の動態が、１２時間後に開始して、４８時間の時点で最適な発現を有し、少なくとも７２時間安定なままである。

【0321】

図５Ａおよび５Ｂに示されている通り、ＡＤＧＮ－１０６、ＡＤＧＮ１０６－Ｈｙｄｒｏ－６、ＡＤＧＮ－１０６ＲＩおよびＡＤＧＮ－１０６／ＡＤＧＮ－１００Ｐは、筋肉内（ＩＭ）投与後にルシフェラーゼ発現を媒介した。ＡＤＧＮ－１０６ＲＩおよびｈｙｄｒｏ－６修飾によりＡＤＧＮ－１０６の効率が６倍および４倍上昇した。ＡＤＧＮ－１０６を１０％または２０％のＡＤＧＮ－１００ ＰＥＧと組み合わせることにより、筋肉におけるルシフェラーゼ発現が８～１２倍改善される。対照的に、ＡＤＧＮ－１００を使用すると有意な発現は観察されず、ＡＤＧＮ－１００を１０％のＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと組み合わせることにより、ルシフェラーゼ発現がＡＤＧＮ－１０６と比較して３倍改善される。図５Ａに報告されている通り、ルシフェラーゼ発現の動態は、１２時間後に開始して、２４時間の時点で最適な発現を有し、少なくとも４８時間安定なままである。

【0322】

この結果から、ＡＤＧＮ－１０６では、ＡＤＧＮ－１００と比較して、ＩＶ投与後にｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡの有意に高い送達が促進されることが実証された。ＡＤＧＮ－１０６へのレトロインベルソ修飾の導入により、ｉｎ ｖｉｖｏにおける複合体の安定性およびカーゴ送達が増大した。この結果から、ＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ粒子内にペグ化ＡＤＧＮペプチドを組み合わせることにより、ＩＭ投与およびＩＶ投与のどちらに関しても複合体が強力に安定化されることが実証された。ペグ化ＡＤＧＮにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるルシフェラーゼ発現、および組織分布が有意に改善される。
（実施例８）
ＡＤＧＮ－ペプチドバリアントにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるプラスミドＤＮＡ送達が改善される

【0323】

安定なＡＤＧＮ－ペプチド／ｐＧＬ４．１１ ＤＮＡを、ルシフェラーゼｍＲＮＡの静脈内投与および筋肉内投与によるｉｎ ｖｉｖｏ送達について評価した。動物を、ｐＧＬ４．１１プラスミドＤＮＡのＩＶによる５μｇおよび筋肉内投与による２．５μｇの単回投与で処置した。

【0324】

滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中のｐＧＬ４．１１ ＤＮＡプラスミド（５μｇ）をＡＤＧＮペプチド（滅菌水）と混合し、各試料の体積を、５％スクロースを含有する滅菌水を用いて１００μｌに調整した。試料を、ボルテックスを用いて低スピードで１分間穏やかに混合し、室温で３０分間インキュベートした。試料を、投与前に０．４５μｍのＰＥＳフィルターで濾過した。ＩＶ投与に関しては、マウスに、ＡＤＧＮ－１０６／ｐＧＬ４、ＡＤＧＮ－１００／ｐＧＬ４、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ／ｐＧＬ４、ＡＤＧＮ－１００－ステアリル／ＰＧＬ４、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ１／ＰＧＬ４、ＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ２／ＰＧＬ４、ＡＤＧＮ１００ Ｈｙｄｒｏ６／ＰＧＬ４または１０％もしくは２０％のＡＤＧＮ－１００ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ／ＰＧＬ４複合体のいずれか１００μｌをＩＶ注射した（群当たり動物３匹）。対照として、群３からのマウス（群当たり動物２匹）にネイキッドｐＧＬ４プラスミド（５μｇ）１００μｌをＩＶ注射した。

【0325】

ＩＭ投与に関しては、マウスに、ＡＤＧＮ－１００／ＰＧＬ４、ＡＤＧＮ－１０６／ＰＧＬ４、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ／ＰＧＬ４、ＡＤＧＮ－１００ｈｙｄｒｏ１／ＰＧＬ４、ＡＤＧＮ－１００ｈｙｄｒｏ６／ＰＧＬ４、ＡＤＧＮ－１００ステアリル／ＰＧＬ４または１０％もしくは２０％のＡＤＧＮ－１００ＰＥＧを含有するＡＤＧＮ－１００／ＰＧＬ４複合体のいずれか２５μｌ（ｐＧＬ４プラスミド２．５μｇ）をＩＶ注射した（群当たり動物２匹）。対照として、群３からのマウス（群当たり動物２匹）にネイキッドＰＧＬ４プラスミド（２．５μｇ）２５μｌをＩＶ注射した。

【0326】

ルシフェラーゼ発現を生物発光によってモニタリングした。生物発光イメージングを１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に実施した。非侵襲的生物発光イメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のために、マウスに１５０μｇ／ｇのルシフェリンをｉ．ｐ．注射した。次いで、結果を０日目に対する値として表し、図６および図７に示した。

【0327】

図６Ａに示されている通り、ＩＶ注射後、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ６およびＡＤＧＮ－１００ステアリルに媒介されるｉｎ ｖｉｖｏプラスミド送達およびルシフェラーゼ発現が主に肝臓において観察され、肺および腎臓においてより低いレベルで観察された。対照的に、ＡＤＧＮ－１０６を用いた場合には発現は観察されなかったかまたは最小の発現が観察された。レトロインベルソ、ステアリル化およびＨｙｄｒｏ－６修飾により、ＡＤＧＮ－１００の効率が、全ての組織において、それぞれ４倍、２．７倍および３．４倍上昇した。対照的に、ＡＤＧＮ－１００ ｈｙｄｒｏ１またはＡＤＧＮ－１００Ｈｙｄｒｏ２を使用して得られたルシフェラーゼ発現は無視できるものであった。

【0328】

図６Ａおよび６Ｂに示されている通り、ＡＤＧＮ－１００を１０％のＡＤＧＮ－１００ＰＥＧと組み合わせることにより、ルシフェラーゼ発現が種々の組織において５～６倍改善された。図６Ｂに示されている通り、肝臓におけるルシフェラーゼ発現の動態は、１２時間後に開始して、４８時間の時点で最適な発現を有し、少なくとも７２時間安定なままである。

【0329】

図７Ａおよび７Ｂに示されている通り、ＡＤＧＮ－１００、ＡＤＧＮ－１００ＲＩ、ＡＤＧＮ－１００ ＨＹＤＲＯ６およびＡＤＧＮ－１００／ＡＤＧＮ－１００Ｐは、ＩＭ投与後にルシフェラーゼ発現を媒介した。ＡＤＧＮ－１００ＲＩ修飾によりＡＤＧＮ－１００の効率が６倍上昇した。ステアリルおよびＨｙｄｒｏ－６修飾によりＡＤＧＮ－１００の効率が３～４倍上昇した。ＡＤＧＮ－１００を１０％または２０％のＡＤＧＮ－１００ ＰＥＧと組み合わせることにより、筋肉におけるルシフェラーゼ発現が１０～１２倍改善される。対照的に、ＡＤＧＮ－１０６およびＨｙｄｒｏ－１またはｈｙｄｒｏ－２修飾を使用した場合に有意な発現は観察されなかった。図７Ａに報告されている通り、ルシフェラーゼ発現の動態は、１２時間後に開始して、２４時間の時点で最適な発現を有し、少なくとも４８時間安定なままである。

【0330】

この結果から、ＡＤＧＮ－１００により、ＡＤＧＮ－１０６と比較して、ＩＶ投与後にｉｎ ｖｉｖｏにおけるプラスミドＤＮＡの有意に高い送達が促進されることが実証された。レトロインベルソ、ステアリルまたはｈｙｄｒｏ－６修飾をＡＤＧＮ－１００に導入することにより、培養細胞およびｉｎ ｖｉｖｏにおけるプラスミドＤＮＡ送達に関して以前に観察された通り、複合体の安定性が増大した。この結果から、ＩＭ投与およびＩＶ投与のどちらに関しても、ＡＤＧＮ－１００／ｐＧＬ４プラスミド粒子内にペグ化ＡＤＧＮペプチドを組み合わせることにより複合体が強力に安定化されることが実証された。ペグ化ＡＤＧＮにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるルシフェラーゼ発現および組織分布が有意に改善される。
（実施例９）
ＡＤＧＮ－ペプチドバリアントによりｉｎ ｖｉｖｏにおけるカーゴ送達が改善される

【0331】

安定なＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡを、静脈内投与によるルシフェラーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達について評価した。動物を、５ｍｏＵ修飾Ｌｕｃ ｍＲＮＡ ５μｇの単回投与で処置した。滅菌水（ＧＩＢＣＯ）中の５ｍｏＵ修飾Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５μｇ）をＡＤＧＮペプチド（滅菌水）と混合し、各試料の体積を、５％スクロースを含有する滅菌水を用いて１００μｌに調整した。５ｍｏＵ修飾Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５μｇ）を室温でガラスバイアル（１～４ｍｌ）中、滅菌水中に調製した。ＡＤＧＮ－ペプチド溶液を４００ｒｐｍでの磁気撹拌下で滴下し（毎秒１滴）、室温で３０分間インキュベートした。ＩＶ投与の前に、ＡＤＧＮ－ペプチド／ｍＲＮＡ複合体をスクロース５％溶液中に希釈し、４００ｒｐｍでの磁気撹拌下で１分間にわたって混合した。試料を、投与前に０．４５μｍのＰＥＳフィルターで濾過した。

【0332】

ＩＶ投与に関しては、マウスに、ＡＤＧＮ－１０３Ｃ／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０４／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０５／ｍＲＮＡ ＡＤＧＮ－１０６ＴＢ／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０９／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０９Ｄ／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０９ｂ／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０１／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０２／ｍＲＮＡ：ＡＤＧＮ－１００ＧＡＬＮＡＣ／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０６ＧＡＬＮＡＣ／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０６ＴＣ／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０６ＴＤ／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０６／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１００／ｍＲＮＡ、ＡＤＧＮ－１０６ｈｙｄｒｏ８／ｍＲＮＡおよびＡＤＧＮ－１００－Ｈｙｄｒｏ８のいずれか１００μｌを静脈内（ＩＶ）注射した（群当たり動物３匹）。対照として、群３からのマウス（群当たり動物２匹）にネイキッド５ｍｏＵ修飾Ｌｕｃ ｍＲＮＡ（５μｇ）１００μｌをＩＶ注射した。

【0333】

ｍＲＮＡ Ｌｕｃ発現を生物発光によってモニタリングした。生物発光イメージングを１２時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に実施した。非侵襲的生物発光イメージング（ＩＶＩＳ Ｋｉｎｅｔｉｃ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）のために、マウスに１５０μｇ／ｇのルシフェリンをｉ．ｐ．注射した。次いで、結果を０日目に対する値として表し、図１１Ａ～１１Ｃに示した。

【0334】

図１１Ａおよび１１Ｂに示されている通り；ＡＤＧＮ－１００ＧＡＬＮＡＣおよびＡＤＧＮ－１０６ＧＡＬＮＡＣにより、肝臓におけるｍＲＮＡ蓄積が媒介され、ＡＤＧＮ－１０６またはＡＤＧＮ－１００と比較してｍＲＮＡ発現が１０～２０倍増大した。

【0335】

図１１Ａおよび１１Ｂに示されている通り、ＡＤＧＮ－１００ ｈｙｄｒｏ ８修飾により、肺および腎臓に対するＡＤＧＮ－１００の効率がそれぞれ２２倍および４倍上昇した。ＡＤＧＮ－１０６ Ｈｙｄｒｏ８修飾により、ＡＤＧＮ－１０６ペプチドの効率が肺および筋肉では５倍上昇し、肝臓では２倍上昇した。

【0336】

図１１Ａに示されている通り、ＡＤＧＮ－１０１修飾により、肺におけるルシフェラーゼ発現が６倍改善され、心臓および筋肉に対するｍＲＮＡの標的送達および発現が促進された。ＡＤＧＮ－１０２修飾により、肺におけるルシフェラーゼ発現が３倍改善され、脳に対するｍＲＮＡの標的送達および発現が促進された。

【0337】

図１１Ｂに示されている通り、ＡＤＧＮ－１０６修飾により、肺におけるルシフェラーゼ発現が２～３倍改善された。ＡＤＧＮ－１０６ＴＢおよびＡＤＧＮ－１０６ ＴＣ修飾により、脳に対するｍＲＮＡの標的送達および発現が促進された。ＡＤＧＮ－１０６ ＴＤ修飾により、心臓および筋肉に対するｍＲＮＡの標的送達および発現が促進された。

【0338】

図１１Ｃに示されている通り、ＡＤＧＮ－１０４、ＡＤＧＮ１０５、ＡＤＧＮ－１０９、ＡＤＧＮ－１０９Ｄ、ＡＤＧＮ－１０９Ｂは、静脈内投与後にルシフェラーゼ発現を媒介した。ＡＤＧＮ－１０４により、心臓および筋肉に対するｍＲＮＡの標的送達および発現が促進され、肝臓に対してもより低いレベルで促進された。ＡＤＧＮ－１０５により、脳に対するｍＲＮＡの標的送達および発現が促進され、肝臓、肺およびリンパ節に対してもより低いレベルで促進された。ＡＤＧＮ－１０９およびＡＤＧＮ－１０９Ｄにより、脳およびリンパ節に対するｍＲＮＡの標的送達および発現が促進され、肝臓および腎臓に対してもより低いレベルで促進された。ＡＤＧＮ－１０９Ｂにより、肺、心臓および筋肉に対するｍＲＮＡの標的送達および発現が促進された。対照的に、ＡＤＧＮ－１０３Ｃを使用して得られたルシフェラーゼ発現は無視できるものであった。
（実施例１０）

【0339】

表１に、マウスまたはラットモデルにおいて種々のカーゴ分子の１つまたは複数の標的化器官への送達（例えば、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、または皮下（ＳＱ）投与、または気管内滴下注入または噴霧（ＮＢ）によって）に関して成功が証明された細胞透過性ペプチドの要約を列挙する。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【表2-6】

【表2-7】

【表2-8】

【表2-9】

【表2-10】

【表2-11】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B-C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【配列表】

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【国際調査報告】