特表 2022-529824 ＲＡＳ変異体癌を治療するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-24

(54)【発明の名称】ＲＡＳ変異体癌を治療するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/435 20060101AFI20220617BHJP

   A61K 31/7135 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20220617BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220617BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220617BHJP

   C07K 16/32 20060101ALN20220617BHJP

【ＦＩ】

A61K31/435

A61K31/7135 ZNA

A61K45/00

A61K48/00

A61P43/00 111

A61P35/00

A61K31/711

A61K31/7105

A61K31/519

A61K39/395 D

A61K39/395 P

C12N15/113 110Z

C07K16/32

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021562908

(86)(22)【出願日】2020-04-23

(85)【翻訳文提出日】2021-12-10

(86)【国際出願番号】 US2020029513

(87)【国際公開番号】W WO2020219668

(87)【国際公開日】2020-10-29

(31)【優先権主張番号】62/838,065

(32)【優先日】2019-04-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500213834

【氏名又は名称】メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター

(71)【出願人】

【識別番号】521460952

【氏名又は名称】アルゲン バイオテクノロジーズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100111501

【弁理士】

【氏名又は名称】滝澤 敏雄

(72)【発明者】

【氏名】フアン チュン－ハオ

(72)【発明者】

【氏名】ナイト スペンサー チャールズ

(72)【発明者】

【氏名】ロウ スコット

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084AA17

4C084AA19

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC201

4C084ZC202

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB22

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC16

4C086CB05

4C086EA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA56

4C086MA58

4C086MA59

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC20

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、一般的に、ＲＡＳ変異体癌の治療のための組成物および方法に関する。特に、本テクノロジーは、治療有効量の１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤を、ＲＡＳ変異体癌（例えば、ＲＡＳ変異体膵癌）と診断された、またはそのリスクがある対象に投与することに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

オーラノフィン、ピペルロングミン、Ｄ９、ＴＲｉ－１、ＴＲｉ－２、ミリセチン、ＰＭＸ４６４、ＰＸ１２、ブレベトキシン－２、マニュマイシンＡ、エタセレン、オーロチオグルコース、プロトポルフィリンＩＸ、および抗ＴＸＮＲＤ１抗体からなる群から選択されるＴＸＮＲＤ１阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要としている対象においてＲＡＳ変異体癌を治療するための方法。

【請求項2】

ＴＸＮＲＤ１発現を阻害する阻害性核酸の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要としている対象においてＲＡＳ変異体癌を治療するための方法。

【請求項3】

阻害性核酸が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択される配列またはその任意の相補物を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

対象が治療前の癌細胞においてＲＡＳタンパク質の発現レベルの上昇を示している、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ＲＡＳ変異体癌が、肺癌、粘液性腺腫、膵癌、結腸直腸癌、皮膚癌、子宮内膜癌、精巣胚細胞性癌、または副腎癌である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

ＲＡＳ変異体癌が、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｅからなる群から選択されるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ変異を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

対象が、背中に向かって放射状に広がる上腹部における痛み、食欲不振または意図せぬ体重減少、鬱、初発糖尿病、血栓、疲労、皮膚および白目の黄染（黄疸）、腹部膨満、悪心、ならびに嘔吐の中から選択される１つまたは複数の徴候または症状を示す、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

対象が、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＳＭＡＤ４、ＭＬＬ３、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＳＦ３Ｂ１、ＥＰＣ１、ＡＲＩＤ２、ＡＴＭ、ＺＩＭ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＡＬＣＮ、ＳＬＣ１６Ａ４、ＭＡＧＥＡ６、ＲＯＢＯ２、ＫＤＭ６Ａ、ＰＲＥＸ２、ＥＲＢＢ２、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＣＤＫ６、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、またはＰＡＬＢ２における１つまたは複数の点変異を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

対象がヒトである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

ＴＸＮＲＤ１阻害剤が、経口的に、局所的に、鼻腔内に、全身性に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜で、または筋肉内に投与される、請求項１または３～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

阻害性核酸が、経口的に、局所的に、鼻腔内に、全身性に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜で、または筋肉内に投与される、請求項２～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

対象に１つまたは複数の追加の治療剤を別々に、逐次的に、または同時に投与することをさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

追加の治療剤が、パクリタキセル、ゲムシタビン、ＡＭＧ ５１０、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、およびイリノテカンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

ＴＸＮＲＤ１阻害剤または阻害性核酸が、６週間以上、毎日、投与される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

ＴＸＮＲＤ１阻害剤または阻害性核酸が、１２週間以上、毎日、投与される、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

ＲＡＳ変異体癌と診断された対象においてＴＸＮＲＤ１阻害剤の治療効力をモニターするための方法であって、
（ａ）前記対象が前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤を投与された後、前記対象から得られる検査試料においてＴＸＮＲＤ１タンパク質レベルを検出するステップ；および
（ｂ）前記検査試料におけるＴＸＮＲＤ１タンパク質レベルが、前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤の投与前に前記対象から得られた対照試料に観察されるレベルと比較して低下している場合、前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤が有効であると決定するステップ、
を含む、￥前記方法。

【請求項17】

ＴＸＮＲＤ１阻害剤が、オーラノフィン、ピペルロングミン、Ｄ９、ＴＲｉ－１、ＴＲｉ－２、ミリセチン、ＰＭＸ４６４、ＰＸ１２、ブレベトキシン－２、マニュマイシンＡ、エタセレン、オーロチオグルコース、プロトポルフィリンＩＸ、抗ＴＸＮＲＤ１抗体、またはＴＸＮＲＤ１発現を阻害する阻害性核酸である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

阻害性ＲＮＡが、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｓｇＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

治療有効量の少なくとも１つのＴＸＮＲＤ１阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要としている対象においてＲＡＳ変異体細胞増殖を阻害するための方法であって、前記少なくとも１つのＴＸＮＲＤ１阻害剤が、オーラノフィン、ピペルロングミン、Ｄ９、ＴＲｉ－１、ＴＲｉ－２、ミリセチン、ＰＭＸ４６４、ＰＸ１２、ブレベトキシン－２、マニュマイシンＡ、エタセレン、オーロチオグルコース、プロトポルフィリンＩＸ、抗ＴＸＮＲＤ１抗体、およびＴＸＮＲＤ１発現を阻害する阻害性核酸からなる群から選択され、前記対象が、ＲＡＳおよび／またはＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／または活性の増加により特徴づけられる疾患または状態を患っている、前記方法。

【請求項20】

阻害性核酸が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２、またはその任意の相補物からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

治療有効量のゲムシタビンを対象に投与することをさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

治療有効量のＫＲＡＳ^G12C阻害剤を対象に投与することをさらに含み、前記ＫＲＡＳ^G12C阻害剤がＡＭＧ ５１０であってもよい、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／８３８，０６５号の恩恵および優先権を主張し、その米国仮特許出願の全内容は参照により本明細書に組み入れられている。
本テクノロジーは、一般的に、それを必要としている対象においてＲＡＳ変異体癌を治療し、防止し、および／または寛解させるための組成物および方法に関する。特に、本テクノロジーは、治療有効量のＴＸＮＲＤ１阻害剤の投与によりＲＡＳ変異体膵癌を治療し、防止し、および／または寛解させるための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

本テクノロジーの背景の以下の説明は、単に本テクノロジーを理解することにおける助けとして提供され、本テクノロジーの先行技術を説明または構成すると認められるものではない。
全膵癌の約９０％は、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）であり、それは最も致死性の高い癌の１つである。ＰＤＡＣはたった７％の５年生存率を有する。詳細な遺伝学的プロファイルは、癌の間で著しい可変性を示唆している。例えば、ゲノムシーケンシングにより、ＰＤＡＣにおいて頻繁に変異している遺伝子には、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＳＭＡＤ４、ＭＬＬ３、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲＩＤ１ＡおよびＳＦ３Ｂ１、ＥＰＣ１およびＡＲＩＤ２、ＡＴＭ、ＺＩＭ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＡＬＣＮ、ＳＬＣ１６Ａ４、ＭＡＧＥＡ６、ＲＯＢＯ２、ＫＤＭ６Ａ、ＰＲＥＸ２、ＥＲＢＢ２、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＣＤＫ６、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２などが挙げられることが明らかにされている。可変性にも関わらず、ＫＲＡＳがＰＤＡＣ症例の９５％において変異していることは明らかである。例えば、Biankin et al., Nature 491(7424): 399-405 (2012)；Waddell et al., Nature 518(7540):495-501 (2015)；およびJones et al., Science 321(5897): 1801-1806 (2008)を参照。

【0003】

ＫＲＡＳタンパク質は、細胞シグナル伝達経路において重要な役割を果たすＧＴＰアーゼである。ＫＲＡＳタンパク質は、活性グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合型状態と不活性グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）結合型状態の間を循環する、二進法的オン・オフスイッチとして働くと考えられている。正常な静止細胞において、ＫＲＡＳは、ほとんど、ＧＤＰ結合型不活性状態で見出される。細胞表面受容体は、細胞外刺激に応答して活性ＫＲＡＳ－ＧＴＰの形成を一過性に促進する。ＰＤＡＣおよび他の型の癌におけるＫＲＡＳ変異は、典型的には、ＫＲＡＳタンパク質を恒常的なＧＴＰ結合型にするミスセンス変異であり、それは、結果として、癌成長を駆動させるシグナル伝達経路の過剰刺激を生じる。発癌性変異体ＫＲＡＳタンパク質は、多数の癌型において腫瘍進行を駆動させる。例えば、ＰＤＡＣの場合、変異体ＫＲＡＳタンパク質は、膵腺房細胞の導管細胞上皮内新生物への再プログラミングを制御する。ＫＲＡＳはまた、ＰＤＡＣおよび他の癌の成長および維持において必要とされる。例えば、Ying et al., Cell 149(3):656-70 (2012)参照。実際、ＰＤＡＣは、最も「ＫＲＡＳ依存性（ＫＲＡＳ－ａｄｄｉｃｔｅｄ）」型の癌の１つであると考えられている。
したがって、ＫＲＡＳは、ＰＤＡＣおよび他のＫＲＡＳ変異体癌に対する重要な治療標的であると考えられる。例えば、Waters and Der, Cold Spring Harb Perspect Med. 8(9): a031435 (2018)参照。

【発明の概要】

【0004】

一態様において、本開示は、オーラノフィン、ピペルロングミン、Ｄ９、ＴＲｉ－１、ＴＲｉ－２、ミリセチン、ＰＭＸ４６４、ＰＸ１２、ブレベトキシン－２、マニュマイシンＡ、エタセレン、オーロチオグルコース、プロトポルフィリンＩＸ、抗ＴＸＮＲＤ１抗体、およびその任意の誘導体からなる群から選択されるＴＸＮＲＤ１阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要としている対象においてＲＡＳ変異体癌を治療するための方法を提供する。ＴＸＮＲＤ１発現を阻害する阻害性核酸の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要としている対象においてＲＡＳ変異体癌を治療するための方法もまた本明細書に開示されている。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、ＴＣＴＡＡＴＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号１；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、
ＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＴＣＡ（配列番号２；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡ（配列番号３；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＧＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡ（配列番号４；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＡＴ（配列番号５；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＡ（配列番号６；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＣＡＡＣＡＴ（配列番号７；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴＡ（配列番号８；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＴＡＣＣＣＡＡ（配列番号９；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡ（配列番号１０；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、
ＴＴＴＡＧＴＣＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＣＧＴＣ（配列番号１１；マウスｓｈＴｘｎｒｄ１）、および
ＴＴＣＧＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴＧＡ（配列番号１２；マウスｓｈＴｘｎｒｄ１）、またはその任意の相補物からなる群から選択される配列を含む。ＲＡＳ変異体癌は、肺癌（例えば、肺腺癌）、粘液性腺腫、膵癌（例えば、ＰＤＡＣ）、結腸直腸癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、子宮内膜癌、精巣胚細胞性癌、または副腎癌であり得る。ある特定の実施形態において、ＲＡＳ変異体癌は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｅからなる群から選択されるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ変異を含む。追加としてまたは代替として、いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ変異は、ＤＮＡシーケンシングによって検出される。

【0005】

追加としてまたは代替として、本明細書に開示された方法のいくつかの実施形態において、対象は、治療前に、癌細胞におけるＲＡＳタンパク質（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）の発現レベルの上昇を示している。本明細書に開示された方法の実施形態のいずれかにおいて、対象は、背中に向かって放射状に広がる上腹部における痛み、食欲不振または意図せぬ体重減少、鬱、初発糖尿病、血栓、疲労、皮膚および白目の黄染（黄疸）、腹部膨満、悪心、ならびに嘔吐の中から選択される１つまたは複数の徴候または症状を示す。

【0006】

追加としてまたは代替として、本明細書に開示された方法のいくつかの実施形態において、対象は、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＳＭＡＤ４、ＭＬＬ３、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲＩＤ１Ａ、ＳＦ３Ｂ１、ＥＰＣ１、ＡＲＩＤ２、ＡＴＭ、ＺＩＭ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＡＬＣＮ、ＳＬＣ１６Ａ４、ＭＡＧＥＡ６、ＲＯＢＯ２、ＫＤＭ６Ａ、ＰＲＥＸ２、ＥＲＢＢ２、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＣＤＫ６、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、またはＰＡＬＢ２における１つまたは複数の点変異を含む。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。

【0007】

本明細書に開示された方法の実施形態のいずれかにおいて、ＴＸＮＲＤ１阻害剤またはＴＸＮＲＤ１発現を阻害する阻害性核酸が、経口的に、局所的に、鼻腔内に、全身性に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜で、または筋肉内に投与され得る。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤または阻害性核酸は、６週間以上、毎日、投与される。他の実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤または阻害性核酸は、１２週間以上、毎日、投与される。

【0008】

追加としてまたは代替として、いくつかの実施形態において、本方法は、対象に１つまたは複数の追加の治療剤を別々に、逐次的に、または同時に投与することをさらに含む。追加の治療剤の例には、パクリタキセル、ゲムシタビン、ＡＭＧ ５１０、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、およびイリノテカンが挙げられるが、それらに限定されない。

【0009】

別の態様において、本開示は、以下のステップを含む、ＲＡＳ変異体癌と診断された対象においてＴＸＮＲＤ１阻害剤の治療効力をモニターするための方法を提供する：（ａ）前記対象が前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤を投与された後、前記対象から得られる検査試料においてＴＸＮＲＤ１タンパク質レベルを検出するステップ；および（ｂ）前記検査試料におけるＴＸＮＲＤ１タンパク質レベルが、前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤の投与前に前記対象から得られた対照試料に観察されるレベルと比較して低下している場合、前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤が有効であると決定するステップ。ＴＸＮＲＤ１阻害剤の例には、オーラノフィン、ピペルロングミン、Ｄ９、ＴＲｉ－１、ＴＲｉ－２、ミリセチン、ＰＭＸ４６４、ＰＸ１２、ブレベトキシン－２、マニュマイシンＡ、エタセレン、オーロチオグルコース、プロトポルフィリンＩＸ、抗ＴＸＮＲＤ１抗体、ＴＸＮＲＤ１発現を阻害する阻害性核酸、またはその任意の誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態において、阻害性ＲＮＡはｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｓｇＲＮＡである。

【0010】

一態様において、本開示は、治療有効量の少なくとも１つのＴＸＮＲＤ１阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要としている対象においてＲＡＳ変異体細胞増殖を阻害するための方法であって、前記少なくとも１つのＴＸＮＲＤ１阻害剤が、オーラノフィン、ピペルロングミン、Ｄ９、ＴＲｉ－１、ＴＲｉ－２、ミリセチン、ＰＭＸ４６４、ＰＸ１２、ブレベトキシン－２、マニュマイシンＡ、エタセレン、オーロチオグルコース、プロトポルフィリンＩＸ、抗ＴＸＮＲＤ１抗体、ＴＸＮＲＤ１発現を阻害する阻害性核酸、およびその任意の誘導体からなる群から選択され、前記対象が、ＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）および／またはＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／または活性の増加により特徴づけられる疾患または状態を患っている、方法を提供する。いくつかの実施形態において、阻害性核酸は、
ＴＣＴＡＡＴＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号１；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＴＣＡ（配列番号２；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、
ＴＴＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡ（配列番号３；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＧＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡ（配列番号４；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＡＴ（配列番号５；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＡ（配列番号６；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＣＡＡＣＡＴ（配列番号７；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴＡ（配列番号８；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＴＡＣＣＣＡＡ（配列番号９；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡ（配列番号１０；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、
ＴＴＴＡＧＴＣＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＣＧＴＣ（配列番号１１；マウスｓｈＴｘｎｒｄ１）、および
ＴＴＣＧＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴＧＡ（配列番号１２；マウスｓｈＴｘｎｒｄ１）からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0011】

本明細書に開示された方法のありとあらゆる実施形態において、ＴＸＮＲＤ１および／またはＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）発現レベルは、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、ドットまたはスロットブロット、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、リアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲ、高速液体クラマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫電気泳動、免疫染色、免疫組織化学法、またはウェスタンブロッティングによって検出される。

【0012】

追加としてまたは代替として、本明細書に開示された方法のいくつかの実施形態において、方法は、治療有効量のゲムシタビンを対象に投与することをさらに含む。本明細書に開示された方法の前述の実施形態のいずれかにおいて、方法は、治療有効量のＫＲＡＳ^G12C阻害剤を対象に投与することをさらに含み、前記ＫＲＡＳ^G12C阻害剤がＡＭＧ ５１０であってもよい。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1A】ＫＲＡＳ変異体膵癌における治療標的の発見のために本開示で用いられたパイプラインを示す概略図である。パイプラインは、抑制が癌細胞を最大限かつ選択的にターゲットする新規な標的を同定するために、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓに基づいた干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）ライブラリでのＫＲＡＳ変異体膵癌細胞の低い感染多重度（ＭＯＩ）形質導入（例えば、Gilbert et al., Cell 154: 442-451 (2013)参照）、シングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）、ゲノムアラインメントおよびカウントマトリックスの作成（例えば、Tang et al., Nature Methods 6: 377-382 (2009)参照）、教師つき次元削減、ならびに機械学習アルゴリズムを含んだ。

【図1B】いくつかのＣＲＩＳＰＲ標的候補についてのｚ変換された治療スコアの散布図である。治療指数は、治療標的を同定するための陰性対照ベンチマークを集合的に確立した、機械学習アルゴリズムに基づいた２つの陰性ガイドＲＮＡにわたってスコアリングされた。

【図2A】機械学習アルゴリズムを用いる教師つき次元削減後の一次元に沿っての細胞型集団の分布を示す図である。以下の集団が示されている：１）癌細胞：非ターゲティングガイドＲＮＡ遺伝子がターゲットされる癌細胞（Ｎ＝１２０）、２）無効な標的：陰性対照遺伝子がターゲットされる癌細胞（Ｎ＝１２２）、３）ＴＸＮＲＤ１：ＴＸＮＲＤ１がターゲットされる癌細胞（Ｎ＝８７）、および４）健康な細胞：健康な導管細胞（Ｎ＝６００）。

【図2B】上位２０個の候補標的についてのｚ変換された治療スコアを示すヒートマップである。候補標的は、機械学習アルゴリズムからの４つの示された決定関数にわたっての平均ランクに基づいた降順で示されている。示されているように、ＴＸＮＲＤ１は最も高い平均ランクを示した。

【図2C】候補標的のパネルにわたる治療指数についての加重平均決定関数スコアを描くグラフである。ＴＸＮＲＤ１は、最も高くランキングされた標的として現れた。

【図3A】ｓｈＲＮＡ媒介性プールドネガティブ選択スクリーニングの交差分析の結果を示す図である。ｓｈＲＮＡ媒介性プールドネガティブ選択スクリーニングを、（１）ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｍｙｃ；ｓｈｐ５３マウス膵管腺癌（ｍＰＤＡＣ）細胞、および（２）Ｍｙｃ；ｐ５３^-/-マウス肝細胞癌（ｍＨＣＣ）細胞において実施した。その２つの細胞型からのｓｈＲＮＡ媒介性プールドネガティブ選択スクリーニングの結果を、比較のために交差分析した。

【図3B】図３Ａから得られた候補遺伝子の検証を示す棒グラフである。競合増殖アッセイを、ｍＰＤＡＣ細胞、ｍＨＣＣ細胞、および形質転換されていない不死化マウス胚線維芽細胞（ｉＭＥＦ）において実施した。これらの細胞に、誘導性ｓｈＲＮＡを有するＶｅｎｕｓ⁺ウイルスを形質導入した。以下の対照ｓｈＲＮＡを用いた：Ｒｅｎ．７１３（陰性対照としての役割を果たす非ターゲティングｓｈＲＮＡ）、Ｒｐａ３．５６１（全ての増殖細胞における成長阻害についての陽性対照）、Ｋｒａｓ．２４７（ｍＰＤＡＣ特異的成長阻害についての陽性対照）。Ｇ４１８選択されたＶｅｎｕｓ⁺細胞を非形質導入細胞と混合し、ｓｈＲＮＡを誘導するためにドキシサイクリンの存在下で培養した。Ｖｅｎｕｓ⁺およびｄｓＲｅｄ⁺（ｓｈＲＮＡ発現）細胞のパーセンテージを異なる時点（Ｔ０：０日目；Ｔ１２：１２日目）に決定した。変化は、発現したｓｈＲＮＡの成長阻害効果の読み出しとしての役割を果たした。

【図3C】ｍＰＤＡＣ、ｍＨＣＣ、およびｉＭＥＦ細胞におけるＴＸＮＲＤ１ノックダウンを示すイムノブロットを示す図である。

【図3D】膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１の薬理学的阻害の効果を示す図である。ｍＰＤＡＣ細胞を、増加性用量のオーラノフィンで７２時間処理した。生細胞数を測定し、ＤＭＳＯ処理細胞の生細胞数（１に設定した）に対して正規化することにより、相対的増殖を計算した。その後、相対的増殖をオーラノフィン濃度の関数としてプロットし、指数関数的曲線にフィッティングした。

【図3E】増加性用量のオーラノフィンとの培養における７２時間後の生細胞数の変化により測定された、ヒト膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１の薬理学的阻害の効果を示す図である。生細胞数を測定し、ＤＭＳＯ処理細胞の生細胞数（１に設定した）に対して正規化することにより、相対的増殖を計算した。その後、相対的増殖をオーラノフィン濃度の関数としてプロットし、指数関数的曲線にフィッティングした。Ｌ３．３、Ｃｏｌｏ３５７、およびＢＸＰＣ３は野生型ＫＲＡＳを有し、それらの細胞株の残りはＫＲＡＳ変異を含む。

【図4A】ヒト膵癌細胞株（ｎ＝１２）におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンのＩＣ₅₀値とＫＲＡＳ状態との相関を示す棒グラフである。

【図4B】ヒト膵癌細胞株（ｎ＝９）におけるオーラノフィンのＩＣ₅₀値とｐ５３状態との相関を示す棒グラフである。

【図4C】ヒト膵癌細胞株（ｎ＝９）におけるオーラノフィンのＩＣ₅₀値とＭｙｃ発現レベルとの相関を示す散布図である。

【図4D】膵癌細胞のピペルロングミン（別のＴＸＮＲＤ１阻害剤）による７２時間の処理により測定した、ＴＸＮＲＤ１の薬理学的阻害の効果を示す図である。異なるＫＲＡＳ変異（Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ）または野生型アレルを含む癌細胞をアッセイした。生細胞数を測定し、ＤＭＳＯ処理細胞の生細胞数（１に設定した）に対して正規化することにより、相対的増殖を計算した。その後、相対的増殖をオーラノフィン濃度の関数としてプロットし、指数関数的曲線にフィッティングした。

【図4E】ＴＣＧＡヒト膵癌腫瘍（ｎ＝１４９）におけるＴＸＮＲＤ１発現レベルとＫＲＡＳ発現レベルとの間の相関を示す散布図である。

【図4F】ｍＰＤＡＣ細胞におけるＴＸＮＲＤ１ノックダウンによる遺伝子シグネチャの変化の評価を示す図である。遺伝子セットエンリッチメント分析（ＧＳＥＡ）を用いて、ｓｈＲｅｎ（陰性対照としての役割を果たす非ターゲティングｓｈＲＮＡ）を含む細胞と比較した、ｍＰＤＡＣ細胞におけるＴＸＮＲＤ１ノックダウンによる、ＫＲＡＳ依存性の遺伝子シグネチャ（図４Ｆ）、膵癌（図４Ｇ）、およびアミノ酸輸送体／フェロトーシス（図４Ｈ）における変化を評価した。

【図4G】ｍＰＤＡＣ細胞におけるＴＸＮＲＤ１ノックダウンによる遺伝子シグネチャの変化の評価を示す図である。遺伝子セットエンリッチメント分析（ＧＳＥＡ）を用いて、ｓｈＲｅｎ（陰性対照としての役割を果たす非ターゲティングｓｈＲＮＡ）を含む細胞と比較した、ｍＰＤＡＣ細胞におけるＴＸＮＲＤ１ノックダウンによる、ＫＲＡＳ依存性の遺伝子シグネチャ（図４Ｆ）、膵癌（図４Ｇ）、およびアミノ酸輸送体／フェロトーシス（図４Ｈ）における変化を評価した。

【図4H】ｍＰＤＡＣ細胞におけるＴＸＮＲＤ１ノックダウンによる遺伝子シグネチャの変化の評価を示す図である。遺伝子セットエンリッチメント分析（ＧＳＥＡ）を用いて、ｓｈＲｅｎ（陰性対照としての役割を果たす非ターゲティングｓｈＲＮＡ）を含む細胞と比較した、ｍＰＤＡＣ細胞におけるＴＸＮＲＤ１ノックダウンによる、ＫＲＡＳ依存性の遺伝子シグネチャ（図４Ｆ）、膵癌（図４Ｇ）、およびアミノ酸輸送体／フェロトーシス（図４Ｈ）における変化を評価した。

【図5A】条件付きＲＮＡｉ実験の概略図である。Ｔｅｔ－ＯｎコンピテントマウスＰＤＡＣ細胞にＴＲＭＰＶ－Ｎｅｏ－ｍｉＲ－Ｅ ｓｈＲＮＡおよびルシフェラーゼ－ｈｙｇｒｏベクターを形質導入した。形質導入細胞をＧ４１８およびハイグロマイシン抵抗性について選択し、レシピエントマウスの膵臓へ移植した。生物発光画像化を用いて決定した疾患発症時点（典型的には、７日後に起こる）に、飲料水および固形飼料中のドキシサイクリン（ｄｏｘ）追加により、マウスのサブセットにおいてｓｈＲＮＡ発現を誘導した。

【図5B】対応するｓｈＲＮＡを誘導するためのドキシサイクリン有りまたは無しで処置された動物（ｎ＝４～５）における腫瘍質量を示す散布図である。

【図5C】７日間のｄｏｘ処理有りおよび無しで、示されたＴＲＭＰＶ－Ｎｅｏ－ｍｉＲ－Ｅ ｓｈＲＮＡを含むｍＰＤＡＣ細胞を正所性に移植された代表的なマウスの生物発光画像化を示す図である。ｄｏｘは疾患発症時点に投与した。０日目（Ｄ０）および７日目（Ｄ７）における生物発光画像が示されている。

【図5D】オーラノフィン処置により引き起こされるインビボでの腫瘍質量低下を示す棒グラフである。ＫＲａｓ^G12D；ｐ５３^-/-オルガノイドをレシピエントマウスに移植し、マウスをビヒクルのみまたはオーラノフィンで１週間、処置した（ｎ＝３～４）。腫瘍質量を測定し、プロットした。

【図5E】オーラノフィン処置のヒト膵癌細胞株腫瘍質量へのインビボ効果を示す棒グラフである。ＭＩＡＰａＣａ－２（ＫＲＡＳ変異体）またはＣｏｌｏ３５７（ＫＲＡＳ野生型）オルガノイドをレシピエントマウスの膵臓へ移植した。マウスをビヒクルのみまたはオーラノフィンで２週間処置した（ｎ＝５）。腫瘍質量を測定し、プロットした。

【図6A】示された細胞株の列挙された遺伝子への生存依存性を示すヒートマップである。各列は、最も高い平均ランクを示した細胞株を表し、各行が遺伝子を表す。遺伝子依存性スコアを、全ての対応するｓｇＲＮＡ（図６Ａ）のｌｏｇ２ＦＣ（非疾患組織に対する存在量倍数変化）の平均をとることにより計算した。ゼロは示された細胞株の変化無しを表し、負の数は枯渇を表し、正の数は濃縮を表す。教師なしクラスター化を用いて、類似した表現型を有する遺伝子をクラスター化した。示されているように、複製遺伝子ＲＡＰ１またはＰＣＮＡをノックアウトまたはノックダウンすることは、結果として、ほとんど全部の細胞株への全般的な致死性を生じた。対照的に、ＴＸＮＲＤ１は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、およびＮＲＡＳについて類似した依存性を示すある特定の細胞株に条件的に必要とされる。

【図6B】示された細胞株の列挙された遺伝子への生存依存性を示すヒートマップである。各列は、最も高い平均ランクを示した細胞株を表し、各行が遺伝子を表す。遺伝子依存性スコアを、全ての対応するｓｈＲＮＡ（図６Ｂ）のｌｏｇ２ＦＣ（非疾患組織に対する存在量倍数変化）の平均をとることにより計算した。ゼロは、示された細胞株の、変化無しを表し、負の数は枯渇を表し、正の数は濃縮を表す。教師なしクラスター化を用いて、類似した表現型を有する遺伝子をクラスター化した。示されているように、複製遺伝子ＲＡＰ１またはＰＣＮＡをノックアウトまたはノックダウンすることは、結果としてほとんど全部の細胞株への全般的な致死性を生じた。対照的に、ＴＸＮＲＤ１は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、およびＮＲＡＳについて類似した依存性を示すある特定の細胞株に条件的に必要とされる。

【図7A】ＫＲＡＳ変異体膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンの抗増殖性効果、およびゲムシタビンと併用された場合の潜在的相乗阻害効果を示す図である。図７Ａは、オーラノフィン、ゲムシタビン、およびそれらの併用のＭＩＡＰａＣａ－２（ＫＲＡＳ^G12C）およびＰＳＮ１（ＫＲＡＳ^G12R）膵癌細胞株への用量依存性効果を示す。

【図7B】ＫＲＡＳ変異体膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンの抗増殖性効果、およびゲムシタビンと併用された場合の潜在的相乗阻害効果を示す図である。図７Ｂは、図７ＡからのＭＩＡＰａＣａ－２（ＫＲＡＳ^G12C）およびＰＳＮ１（ＫＲＡＳ^G12R）細胞におけるオーラノフィンおよびゲムシタビンの各濃度におけるパーセント成長阻害を示す。データは、３つの独立した実験（ｎ＝３）の平均として提示されている。図７Ｃは、ゲムシタビンと併用してオーラノフィンで処理されたＭＩＡＰａＣａ－２（ＫＲＡＳ^G12C）およびＰＳＮ１（ＫＲＡＳ^G12R）細胞の併用指数（ＣＩ）プロットを示す。

【図7C】ＫＲＡＳ変異体膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンの抗増殖性効果、およびゲムシタビンと併用された場合の潜在的相乗阻害効果を示す図である。図７Ｃは、ゲムシタビンと併用してオーラノフィンで処理されたＭＩＡＰａＣａ－２（ＫＲＡＳ^G12C）およびＰＳＮ１（ＫＲＡＳ^G12R）細胞の併用指数（ＣＩ）プロットを示す。図７Ｃにより、１未満のＣＩ値はオーラノフィンとゲムシタビンの間の相乗作用を示す。

【図7D】ＫＲＡＳ変異体膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンの抗増殖性効果、およびゲムシタビンと併用された場合の潜在的相乗阻害効果を示す図である。図７Ｄは、示された濃度における、ゲムシタビンと併用してオーラノフィンで処理されたＭＩＡＰａＣａ－２（ＫＲＡＳ^G12C）およびＰＳＮ１（ＫＲＡＳ^G12R）細胞についての併用指数（ＣＩ）スコアを示す。各ＣＩスコアは、少なくとも３つの独立した実験からのデータを表す。

【図8A】ＫＲＡＳ変異体膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンの抗増殖性効果、およびＫＲＡＳ^G12C阻害剤ＡＭＧ ５１０と併用された場合の潜在的相乗阻害効果を示す図である。図８Ａは、オーラノフィン、ＡＭＧ ５１０、およびそれらの併用のＭＩＡＰａＣａ－２（ＫＲＡＳ^G12C）およびＰＳＮ１（ＫＲＡＳ^G12R）膵癌細胞株への用量依存性効果を示す。

【図8B】ＫＲＡＳ変異体膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンの抗増殖性効果、およびＫＲＡＳ^G12C阻害剤ＡＭＧ ５１０と併用された場合の潜在的相乗阻害効果を示す図である。図８Ｂは、図８ＡからのＭＩＡＰａＣａ－２（ＫＲＡＳ^G12C）およびＰＳＮ１（ＫＲＡＳ^G12R）細胞におけるオーラノフィンおよびＡＭＧ ５１０の各濃度におけるパーセント成長阻害を示す。データは３つの独立した実験（ｎ＝３）の平均として提示されている。

【図8C】ＫＲＡＳ変異体膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンの抗増殖性効果、およびＫＲＡＳ^G12C阻害剤ＡＭＧ ５１０と併用された場合の潜在的相乗阻害効果を示す図である。図８Ｃは、１未満のＣＩ値を提示するＣＩプロットが、オーラノフィンとＡＭＧ ５１０の間の相乗作用を示すことを示している。

【図8D】ＫＲＡＳ変異体膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンの抗増殖性効果、およびＫＲＡＳ^G12C阻害剤ＡＭＧ ５１０と併用された場合の潜在的相乗阻害効果を示す図である。図８Ｄは、示された濃度における、ＡＭＧ ５１０と併用してオーラノフィンで処理されたＭＩＡＰａＣａ－２（ＫＲＡＳ^G12C）およびＰＳＮ１（ＫＲＡＳ^G12R）細胞についての併用指数（ＣＩ）スコアを示す。各ＣＩスコアは少なくとも３つの独立した実験からのデータを表す。

【図9】ＴＸＮＲＤ１ ｍＲＮＡ上方制御を有する膵臓腺癌を有する患者における全生存期間を示す図である。１７８人の患者を２つの群、ＴＸＮＲＤ１低とＴＸＮＲＤ１高／中へ分けた。高／中および低についての比率カットオフ（０～１００％）は、それぞれ、＞１５．８７％（Ｚスコア＞－１、ｎ＝１４５）および≦１５．８７％（Ｚスコア≦－１、ｎ＝３３）である。データ分析は入手可能なＴＣＧＡデータに基づいている。

【図10】１０ｍｇ／ｋｇオーラノフィン懸濁液の単一腹腔内注射用量後のＮＣＲ ｎｕ／ｎｕマウスにおける血漿および膵臓の金濃度を示す図である。２４時間にわたって収集された３つの連続的試料（２時間目、４時間目、２４時間目）（ｎ＝３）。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本方法のある特定の態様、モード、実施形態、バリエーション、および特徴は、本テクノロジーの実質的な理解を提供するために様々なレベルの詳細で下で記載されていることは認識されるべきである。

【0015】

本方法を実施することにおいて、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、微生物学、および組換えＤＮＡにおける多くの通常の技術が用いられる。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition；the series Ausubel et al., eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson et al., (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al., (1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition；Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；米国特許第４，６８３，１９５号；Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells； Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；and Herzenberg et al., eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunologyを参照されたい。

【0016】

本開示は、ＴＸＮＲＤ１が、ＲＡＳ変異体膵癌を治療するための治療標的であるという発見、および膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１の薬理学的阻害がＲＡＳ変異体膵癌を治療することにおいて有効であるという発見に一部基づいている。

【0017】

定義
他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、一般的に、当業者により一般に理解されているのと同じ意味をもつ。この明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、その内容が明らかに別なふうに指図することがない限り、複数の指示対象物を含む。例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞の組合せを含むなどである。一般的に、本明細書で用いられる命名法、ならびに下記の細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学および核酸化学、およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当技術分野においてよく知られかつ一般的に用いられるものである。
本明細書で用いられる場合、数に関しての用語「約」は、一般的に、他に言及がない限り、または文脈から別なふうに明らかであることがない限り、その数のどちらの方向にも（より大きいまたはより小さい）１％、５％、または１０％の範囲内にある数（そのような数が可能な値の０％未満または１００％を超える場合を除く）を含むと解釈される。

【0018】

本明細書で用いられる場合、対象への作用物質または薬物の「投与」は、化合物をそれの意図された機能を実施するように対象に導入または送達する任意の経路を含む。投与は、経口的に、鼻腔内に、非経口的に（静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、または皮下に）、または局所的に、など、任意の適切な経路によって行うことができる。投与は自己投与および別の者による投与を含む。

【0019】

本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、例としてかつ非限定的に、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、それらの組合せ、ならびに任意の脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ、およびマウスにおける免疫応答中に産生される類似した分子、加えて非哺乳動物種における、例えば、サメ免疫グロブリンを含む、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子を集合的に指す。本明細書で用いられる場合、「抗体」（無傷免疫グロブリンを含む）および「抗体結合断片」は、他の分子との結合を実質的に排除して、関心対象となる分子（または関心対象となる高度に類似した分子の群）と特異的に結合する（例えば、生物学的試料における他の分子についての結合定数より少なくとも１０³Ｍ^-1大きく、少なくとも１０⁴Ｍ^-1大きく、または少なくとも１０⁵Ｍ^-1大きい、関心対象となる分子についての結合定数を有する抗体および抗体断片）。用語「抗体」はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作型を含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.)；Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997もまた参照されたし。

【0020】

より具体的には、抗体は、抗原のエピトープを特異的に認識および結合する少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを指す。抗体は重鎖および軽鎖で構成され、それぞれが重鎖可変（Ｖ_H）領域および軽鎖可変（Ｖ_L）領域と名づけられた可変領域を有する。Ｖ_H領域およびＶ_L領域は一緒になって、その抗体により認識される抗原を結合することに関与している。典型的には、免疫グロブリンはジスルフィド結合により相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥがある。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（この領域は「ドメイン」としても知られている）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は共同して抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は定義されている（参照により本明細書に組み入れられている、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991参照）。Ｋａｂａｔデータベースは現在、オンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内で比較的保存されている。構成要素軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域、概してβ－シート立体構造の形をとり、ＣＤＲはβ－シート構造を接続するループを形成し、場合によってはβ－シート構造の一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用により正しい配向でＣＤＲを位置づけることを与える足場を形成するように働く。

【0021】

ＣＤＲは、主として抗原のエピトープと結合することに関与する。各鎖のＣＤＲは、典型的には、Ｎ末端から始まって連続的に番号付けされた、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれ、また典型的には、その特定のＣＤＲが位置する鎖によっても同定される。したがって、Ｖ_H ＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメイン内に位置し、一方、Ｖ_L ＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。ＴＸＮＲＤ１タンパク質を結合する抗体は特異的なＶ_H領域およびＶ_L領域配列、およびしたがって、特異的なＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原についての異なる結合部位）を有する抗体は異なるＣＤＲを有する。それは抗体によって異なるＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位置だけが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。本明細書で用いられる場合、「免疫グロブリン関連組成物」は、抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体などを含む）、加えて抗体断片を指す。抗体またはその抗原結合断片は抗原と特異的に結合する。

【0022】

本明細書で用いられる場合、用語「抗体関連ポリペプチド」は、可変領域を単独で、または以下のポリペプチド要素：抗体分子のヒンジ領域、ＣＨ₁、ＣＨ₂、およびＣＨ₃ドメインの全部もしくは一部と組み合わせて含み得る、一本鎖抗体を含む抗原結合抗体断片を意味する。可変領域、ならびにヒンジ領域、ＣＨ₁、ＣＨ₂、およびＣＨ₃ドメインの任意の組合せもまた本テクノロジーに含まれる。本方法において有用な抗体関連分子、例えば、非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）₂、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ならびにＶ_LまたはＶ_Hドメインのいずれかを含む断片。例には以下が挙げられる：（ｉ）Ｆａｂ断片、Ｖ_L、Ｖ_H、Ｃ_L、およびＣＨ₁ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）₂断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）Ｖ_HおよびＣＨ₁ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_LおよびＶ_HドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）Ｖ_HドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al.、Nature 341: 544-546、1989）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。そのようなものとして、「抗体断片」または「抗原結合断片」は、完全長抗体の一部分、一般的には、その抗原結合領域または可変領域を含み得る。抗体断片または抗原結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、およびＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。

【0023】

用語「抗原結合断片」は、抗原との結合に関与するポリペプチドの一部を有する免疫グロブリン構造全体の断片を指す。本テクノロジーに有用な抗体結合断片の例には、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）₂、ｓｃＦｖＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）₂が挙げられるが、それらに限定されない。

【0024】

本明細書で用いられる場合、用語「ダイアボディ」は、同じポリペプチド鎖（Ｖ_H Ｖ_L）において軽鎖可変ドメイン（Ｖ_L）と接続した重鎖可変ドメイン（Ｖ_H）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指す。同じ鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、それらのドメインが、別の鎖の相補性ドメインと対形成するように強制され、２つの抗原結合部位を生じる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に、より完全に記載されている。

【0025】

本明細書で用いられる場合、用語「一本鎖抗体」または「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」は、Ｆｖ断片の２つのドメイン、Ｖ_LおよびＶ_Hの抗体融合分子を指す。一本鎖抗体分子は、いくつかの個々の分子を有する重合体、例えば、二量体、三量体、または他の重合体を含み得る。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、Ｖ_LおよびＶ_Hは、別々の遺伝子によってコードされるが、Ｖ_LおよびＶ_H領域が対形成して一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている）を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらが生成されるのを可能にする合成リンカーにより、組換え方法を用いてそれらを連結することができる。Bird et al. (1988) Science 242:423-426およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883。そのような一本鎖抗体は、組換え技術または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断により調製することができる。

【0026】

上記で言及された抗体断片のいずれも、当業者に知られた通常の技術を用いて得られ、その断片は、無傷抗体と同じ方法で結合特異性および中和活性についてスクリーニングされる。
ポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸などのヌクレオチドの配列）に関して本明細書で用いられる場合、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成規則を指す。本明細書で用いられる場合の核酸配列の相補物は、一方の配列の５’末端が他方の３’末端と対形成するように核酸配列に関してアラインメントされた時、「逆平行会合」にあるオリゴヌクレオチドを指す。例えば、配列「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’」は、配列「３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５」と相補的である。天然に存在する核酸に一般的には見出されないある特定の塩基が、本明細書に記載された核酸に含まれてもよい。これらには、例えば、イノシン、７－デアザグアノシン、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。相補性は完全である必要はなく、安定な二重鎖が、不適正塩基対、縮重塩基、または不適合塩基を含有してもよい。核酸テクノロジー分野の業者は、例えばオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列、イオン強度、ならびに不適正塩基対の発生率を含むいくつかの変数を考慮して経験的に二重鎖安定性を決定することができる。相補性配列はまた、ＤＮＡ配列またはそれの相補性配列に相補的なＲＮＡ配列でもあり得、ｃＤＮＡでもあり得る。

【0027】

本明細書で用いられる場合、用語「コンセンサスＦＲ」は、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク（ＦＲ）抗体領域を意味する。抗体のＦＲ領域は抗原と接触しない。
本明細書で用いられる場合、「対照」は、比較を目的として、実験に用いられる代替試料である。対照は「陽性」または「陰性」であり得る。例えば、実験の目的が特定の型の疾患または状態についての治療に対する治療剤の効力の相関を決定することである場合、陽性対照（所望の治療効果を示すことが知られた化合物または組成物）および陰性対照（その治療を受けずまたはプラセボを受ける対象または試料）が典型的には用いられる。

【0028】

本明細書で用いられる場合、用語「有効量」は、所望の治療的および／または予防的効果を達成するのに十分な量、例えば、本明細書に記載された疾患もしくは状態または本明細書に記載された疾患もしくは状態に関連した１つもしくは複数の徴候もしくは症状の防止または減少を生じる量を指す。治療的または予防的適用の関連において、対象に投与される組成物の量は、組成、疾患の程度、型、および重症度、ならびに一般的健康状態、年齢、性別、体重、および薬物に対する許容度などの個体の特性に依存して異なる。当業者は、これらを始めとする因子に依存する適切な投薬量を決定することができる。本組成物はまた、１つまたは複数の追加の治療用化合物と組み合わせて投与することができる。本明細書に記載された方法において、治療用組成物は、ＲＡＳ変異体癌の１つまたは複数の徴候または症状を有する対象に投与され得る。本明細書で用いられる場合、組成物の「治療有効量」は、疾患または状態の生理学的効果が寛解または消失する組成物レベルを指す。治療有効量は、１回または複数回の投与で与えることができる。
本明細書で用いられる場合、「発現」は、以下の１つまたは複数を含む：遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写；成熟ｍＲＮＡを産生するための前駆体ｍＲＮＡのスプライシングおよび他のプロセシング；ｍＲＮＡ安定性；成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドン使用頻度およびｔＲＮＡ利用能を含む）；ならびに、適切な発現および機能に必要とされる場合には、翻訳産物のグリコシル化および／または他の修飾。

【0029】

本明細書で用いられる場合、用語「遺伝子」は、プロモーター、エクソン、イントロン、および発現を調節する他の非翻訳領域を含む、ＲＮＡ産物の制御される生合成のための全情報を含有するＤＮＡのセグメントを意味する。

【0030】

「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較を目的としてアラインメントされ得る各配列における位置を比較することにより決定することができる。比較される配列における位置が、同じ核酸塩基またはアミノ酸によって占められている場合、その分子はその位置において相同である。配列間の相同性の度合は、それらの配列によって共有される一致または相同位置の数の関数である。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列とある特定のパーセンテージ（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）の「配列同一性」を有するとは、アラインメントされた場合、塩基（またはアミノ酸）のそのパーセンテージが、その２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野において知られたソフトウェアプログラムを用いて決定することができる。いくつかの実施形態において、デフォルトパラメータがアラインメントに用いられる。１つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いてのＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメータを用いてのＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝無し；ストランド＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示＝５０個の配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに見出すことができる。生物学的等価のポリヌクレオチドは、特定されたパーセント相同性を有し、かつ同じまたは類似した生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。２つの配列は、お互いに４０％未満同一性または２５％未満同一性を共有する場合には、それぞれ「無関係」または「非相同性」と見なされる。

【0031】

本明細書で用いられる場合、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般的に「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、Ｖ_Lにおける約残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、および８９～９７（Ｌ３）の周辺、およびＶ_Hにおける約３１～３５Ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）の周辺（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）、および／または「超可変ループ」由来のそれらの残基（例えば、Ｖ_Lにおける残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、および９１～９６（Ｌ３）、ならびにＶ_Hにおける２６～３２（Ｈ１）、５２Ａ～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。

【0032】

本明細書で用いられる場合、用語「ハイブリダイズする」は、２つの実質的に相補的な核酸鎖（少なくとも１４～２５ヌクレオチドのひと続きにわたって少なくとも約６５％相補性、少なくとも約７５％または少なくとも約９０％相補性）が適切にストリンジェントな条件下でお互いにアニールして、相補性塩基対間の水素結合の形成を通して二重鎖またはヘテロ二重鎖を形成する過程を指す。核酸ハイブリダイゼーション技術は当技術分野においてよく知られている。例えば、Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.参照。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の度合、関与する条件のストリンジェンシー、および形成されるハイブリッドの熱融解温度（Ｔ_m）のような因子により影響される。少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が安定にハイブリダイズし、一方、より低い相補性を有するものはハイブリダイズしないようにハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを推定および調整する方法を当業者は理解している。ハイブリダイゼーション条件およびパラメータの例について、例えば、Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.；Ausubel, F. M. et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J.参照。いくつかの実施形態において、特異的なハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で起こる。標的核酸に特異的であるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えば、プローブまたはプライマー）は、適切な条件下で標的核酸と「ハイブリダイズする」。

【0033】

本明細書で用いられる場合、「オリゴヌクレオチド」は、限定された間隔で同一の単量体で主に構成されるバックボーン上に核酸塩基の配列を有する分子を指す。塩基は、そのオリゴヌクレオチドの塩基に相補的である塩基の配列を有する核酸と結合することができるようにバックボーン上に並べられる。最も一般的なオリゴヌクレオチドは、糖リン酸単位のバックボーンを有する。２’位にヒドロキシル基を有しないオリゴデオキシリボヌクレオチドと２’位にヒドロキシル基を有するオリゴリボヌクレオチドとが区別され得る。オリゴヌクレオチドはまた、ヒドロキシル基の水素が有機基、例えばアリル基で置き換えられている誘導体を含んでもよい。オリゴヌクレオチドの１個または複数の塩基はまた、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を増加させるためにホスホロチオエート結合（例えば、ヌクレオチド間の架橋に関与しないリン酸バックボーンにおける２つの酸素原子の１つが、イオウ原子によって置き換えられている）を含むように改変されてもよい。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは多くの因子に依存し、そして、その多くの因子が、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは任意の方法で作製され得、その方法には、例えば、化学合成、ＤＮＡ複製、プラスミドもしくはファージＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化、逆転写、ＰＣＲ、またはそれらの組合せが挙げられる。オリゴヌクレオチドは、例えば、メチル基、ビオチンもしくはジゴキシゲニン部分、蛍光タグの付加により、または放射性ヌクレオチドを用いることにより、修飾されてもよい。

【0034】

本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合した、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌化合物、等張性および吸収遅延化合物、およびその他同種類のものを含むように意図される。薬学的に許容される担体およびそれらの製剤は当業者に知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.）に記載されている。

【0035】

本明細書で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意のＲＮＡまたはＤＮＡを意味し、それは、非修飾型または修飾型のＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドには、非限定的に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ならびに一本鎖、または、より典型的には、二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドという用語はまた、１個または複数の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性のためにまたは他の理由のために改変されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。

【0036】

本明細書で用いられる場合、障害または状態の「防止」、「防止する」、または「防止すること」は、統計的試料において、治療されていない対照試料と比べて治療された試料において障害もしくは状態の発生率を低下させ、または治療されていない対照試料と比べて障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発症を遅延させる、１つまたは複数の化合物を指す。本明細書で用いられる場合、ＲＡＳ変異体癌を防止することは、ＲＡＳ変異体癌の症状の開始を防止しまたは遅延させることを含む。本明細書で用いられる場合、ＲＡＳ変異体癌の防止はまた、ＲＡＳ変異体癌の１つまたは複数の徴候または症状の再発を防止することも含む。

【0037】

本明細書で用いられる場合、用語「試料」は、対象から得られる臨床試料を指す。生物学的試料には、組織、細胞、細胞のタンパク質または膜抽出物、粘液、痰、骨髄、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、気管支洗浄液（ＢＷ）、および対象から単離された生体液（例えば、腹水または脳脊髄液（ＣＳＦ））、加えて、対象内に存在する組織、細胞、および体液（血液、血漿、唾液、尿、血清など）が挙げられ得る。

【0038】

本明細書で用いられる場合、用語「別々の」治療的使用は、異なる経路による、同じ時点または実質的に同じ時点における少なくとも２つの活性成分の投与を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「逐次的」治療的使用は、異なる時点における少なくとも２つの活性成分の投与を指し、投与経路は同一または異なる。より具体的には、逐次的使用は、その他の投与が開始する前の、活性成分の１つの全投与を指す。したがって、その他の活性成分を投与する前の数分間、数時間、または数日間にわたって、活性成分の１つを投与することが可能である。この場合、同時的治療はない。
本明細書で用いられる場合、用語「同時的」治療的使用は、同じ経路により、かつ同じ時点または実質的に同じ時点における少なくとも２つの活性成分の投与を指す。
本明細書で用いられる場合、用語「対象」、「個体」、または「患者」は、交換可能に用いられ、個々の生物体、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトを指す。ある特定の実施形態において、個体、患者、または対象はヒトである。
本明細書で用いられる場合、用語「標的配列」および「標的核酸配列」は、調節される（例えば、阻害され、または下方制御される）べき特定の核酸配列を指す。
本明細書で用いられる場合の用語「ＴＸＮＲＤ１阻害剤」は、ＴＸＮＲＤ１の遺伝子発現または生物学的活性を阻害する作用物質を指す。ＴＸＮＲＤ１生物学的活性の例には、酵素活性、基質結合活性、ホモまたはヘテロ二量体化活性、および細胞構造との結合が挙げられるが、それらに限定されない。チオレドキシンレダクターゼ１のいくつかの異なるアイソフォームが存在する。本開示のＴＸＮＲＤ１阻害剤は、少なくとも１つのアイソフォームの少なくとも１つの生物学的活性を阻害する。ＴＸＮＲＤ１阻害剤の例には、オーラノフィン、ピペルロングミン、Ｄ９、ＴＲｉ－１、ＴＲｉ－２、ミリセチン、ＰＭＸ４６４、ＰＸ１２、ブレベトキシン－２、マニュマイシンＡ、エタセレン、オーロチオグルコース、プロトポルフィリンＩＸ、ＴＸＮＲＤ１に対するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ、ＴＸＮＲＤ１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、抗ＴＸＮＲＤ１抗体、またはその任意の誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。

【0039】

本明細書で用いられる場合、「治療すること」、「治療する」、または「治療」は、ヒトなどの対象において、本明細書に記載された疾患または障害の治療を網羅し、以下を含む：（ｉ）疾患もしくは障害を阻害すること、すなわち、それの発生を抑止すること；（ｉｉ）疾患もしくは障害を軽減すること、すなわち、障害の退行を引き起こすこと；（ｉｉｉ）障害の進行を遅くすること；および／または（ｉｖ）疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状の進行を阻害し、軽減し、もしくは遅くすること。いくつかの実施形態において、治療は、疾患に関連した症状が、例えば、緩和され、低下し、治癒し、または寛解の状態に置かれることを意味する。

【0040】

記載されているような医学的疾患および状態の治療または防止の様々なモードが、「実質的な」を意味することを意図され、それは、全部だけでなく、全部に満たない治療または防止、および一部の生物学的または医学的関連結果が達成される場合も含むことは認識されるべきである。治療は、慢性疾患のための継続的な長期の治療、または急性状態の治療のための単回もしくは２、３回の投与の場合もある。

【0041】

本テクノロジーのＴＸＮＲＤ１阻害剤
ＴＸＮＲＤ１タンパク質（別名チオレドキシンレダクターゼ１、ＧＲＩＭ－１２、ＴＲ、ＴＲ１、ＴＲＸＲ１、またはＴＸＮＲとも言う）は、ピリジンヌクレオチドオキシドリダクターゼファミリーのメンバーであり、チオレドキシン（Ｔｒｘ）系の構成要素である。ＴＸＮＲＤ１はフラビン酵素であり、それは、チオレドキシン、加えて他の基質も還元し、酸化還元ホメオスタシスおよびセレン代謝において重要な役割を果たす。ＴＸＮＲＤ１タンパク質は、ＦＡＤを含有するホモ二量体として機能し、活性部位にセレノシステイン（Ｓｅｃ）を有する。
一態様において、本開示は、ＲＡＳ変異体癌を治療するための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は、ＴＸＮＲＤ１の遺伝子発現および／または活性レベルを低下させる。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は、酵素活性、基質結合活性、ホモまたはヘテロ二量体化活性、および細胞構造との結合からなる群から選択されるＴＸＮＲＤ１活性を低下させる。
一態様において、本開示は、非限定的に、オーラノフィン、ピペルロングミン、Ｄ９、ＴＲｉ－１、ＴＲｉ－２、ミリセチン、ＰＭＸ４６４、ＰＸ１２、ブレベトキシン－２、マニュマイシンＡ、エタセレン、オーロチオグルコース、およびプロトポルフィリンＩＸを含む薬理学的阻害剤を提供する。抗ＴＸＮＲＤ１抗体またはその任意の派生物もまた、本明細書に開示された方法に用いられ得る。

【0042】

別の態様において、本開示は、ＴＸＮＲＤ１発現および／または活性レベルを阻害する阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）を提供する。そのような阻害性ＲＮＡの例には、
ＴＣＴＡＡＴＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号１；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、
ＴＡＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＡＴＧＧＴＣＡ（配列番号２；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡ（配列番号３；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＧＴＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＡ（配列番号４；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＡＴ（配列番号５；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＣＴＴＣＡＣＡ（配列番号６；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＣＡＡＣＡＴ（配列番号７；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＡＣＣＣＣＴＡ（配列番号８；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＴＡＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＴＡＣＣＣＡＡ（配列番号９；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＡＡ（配列番号１０；ヒトｓｈＴＸＮＲＤ１）、
ＴＴＴＡＧＴＣＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴＴＣＧＴＣ（配列番号１１；マウスｓｈＴｘｎｒｄ１）、および
ＴＴＣＧＴＣＡＣＴＧＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴＧＡ（配列番号１２；マウスｓｈＴｘｎｒｄ１）、またはその任意の相補物を含む配列を有するＲＮＡが挙げられる。

【0043】

本開示は、以下（すなわち、ＴＸＮＲＤ１ ｍＲＮＡアイソフォーム）のいずれか１つの一部分と相補的でありかつ特異的にハイブリダイズし、それによりＴＸＮＲＤ１発現を低下させまたは阻害する核酸配列を含むアンチセンス核酸を提供する；
ＮＭ＿１８２７２９．２ ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）チオレドキシンレダクターゼ１（ＴＸＮＲＤ１）、転写産物変種１、ｍＲＮＡ（配列番号１３）
1 agaccctcac gtgatgacaa cagctagcaa agttctgtag ctactgcctt agggcatagt
61 ctaatttctt cagtaaaaac acacttattc caaatttggt tccagaattg ccttaaattg
121 tttttgctct gttcttaggt tgggggcggc tatgagcagg cagaggatgt ggtgtcaccc
181 aattaggagc tctcagctta cgaggcaatt agcataggtt gccagggctg cacgaggagt
241 ggatttctgc tttgtcattc tgactctggc agttagcccg cccgctcggc gcagggcgtg
301 gcttctcgta gccattagga aacagcaacc ctttcacctc agttttcttc actccggcat
361 ttgcagcaga gcgaaaggtg gtcgagtcct gaaggagggc ctgatgtctt catcattctc
421 aaattcttag gacggtcggg ccctggaagg aacgctctcg gaattggccg cggaaaccga
481 tctgcccgtt gtgtttgtga aacagagaaa gataggcggc catggtccaa ccttgaaggc
541 ttatcaggag ggcagacttc aaaagctact aaaaatgaac ggccctgaag atcttcccaa
601 gtcctatgac tatgacctta tcatcattgg aggtggctca ggaggtctgg cagctgctaa
661 ggaggcagcc caatatggca agaaggtgat ggtcctggac tttgtcactc ccacccctct
721 tggaactaga tggggtctcg gaggaacatg tgtgaatgtg ggttgcatac ctaaaaaact
781 gatgcatcaa gcagctttgt taggacaagc cctgcaagac tctcgaaatt atggatggaa
841 agtcgaggag acagttaagc atgattggga cagaatgata gaagctgtac agaatcacat
901 tggctctttg aattggggct accgagtagc tctgcgggag aaaaaagtcg tctatgagaa
961 tgcttatggg caatttattg gtcctcacag gattaaggca acaaataata aaggcaaaga
1021 aaaaatttat tcagcagaga gatttctcat tgccactggt gaaagaccac gttacttggg
1081 catccctggt gacaaagaat actgcatcag cagtgatgat cttttctcct tgccttactg
1141 cccgggtaag accctggttg ttggagcatc ctatgtcgct ttggagtgcg ctggatttct
1201 tgctggtatt ggtttagacg tcactgttat ggttaggtcc attcttctta gaggatttga
1261 ccaggacatg gccaacaaaa ttggtgaaca catggaagaa catggcatca agtttataag
1321 acagttcgta ccaattaaag ttgaacaaat tgaagcaggg acaccaggcc gactcagagt
1381 agtagctcag tccaccaata gtgaggaaat cattgaagga gaatataata cggtgatgct
1441 ggcaatagga agagatgctt gcacaagaaa aattggctta gaaaccgtag gggtgaagat
1501 aaatgaaaag actggaaaaa tacctgtcac agatgaagaa cagaccaatg tgccttacat
1561 ctatgccatt ggcgatatat tggaggataa ggtggagctc accccagttg caatccaggc
1621 aggaagattg ctggctcaga ggctctatgc aggttccact gtcaagtgtg actatgaaaa
1681 tgttccaacc actgtattta ctcctttgga atatggtgct tgtggccttt ctgaggagaa
1741 agctgtggag aagtttgggg aagaaaatat tgaggtttac catagttact tttggccatt
1801 ggaatggacg attccgtcaa gagataacaa caaatgttat gcaaaaataa tctgtaatac
1861 taaagacaat gaacgtgttg tgggctttca cgtactgggt ccaaatgctg gagaagttac
1921 acaaggcttt gcagctgcgc tcaaatgtgg actgaccaaa aagcagctgg acagcacaat
1981 tggaatccac cctgtctgtg cagaggtatt cacaacattg tctgtgacca agcgctctgg
2041 ggcaagcatc ctccaggctg gctgctgagg ttaagcccca gtgtggatgc tgttgccaag
2101 actgcaaacc actggctcgt ttccgtgccc aaatccaagg cgaagttttc tagagggttc
2161 ttgggctctt ggcacctgcg tgtcctgtgc ttaccaccgc ccaaggcccc cttggatctc
2221 ttggatagga gttggtgaat agaaggcagg cagcatcaca ctggggtcac tgacagactt
2281 gaagctgaca tttggcaggg catcgaaggg atgcatccat gaagtcacca gtctcaagcc
2341 catgtggtag gcggtgatgg aacaactgtc aaatcagttt tagcatgacc tttccttgtg
2401 gattttctta ttctcgttgt caagttttct agggttgaat ttttttcttt tttctccatg
2461 gtgttaatga tattagagat gaaaaacgtt agcagttgat ttttgtccaa aagcaagtca
2521 tggctagagt atccatgcaa ggtgtcttgt tgcatggaag ggatagtttg gctcccttgg
2581 aggctatgta ggcttgtccc gggaaagaga actgtcctgc agctgaaatg gactgttctt
2641 tactgacctg ctcagcagtt tcttctctca tatattccca aaacaagtac atctgcgatc
2701 aactctagcc aaatttgccc ctgtgtgcta catgatggat gattattatt ttaaggtctg
2761 tttaggaagg gaaatggcta cttggccagc cattgcctgg catttggtag tatagtatga
2821 ttctcaccat tatttgtcat ggaggcagac atacaccaga aatgggggag aaacagtaca
2881 tatctttctg tctttagttt attgtgtgct ggtctaagca agctgagatc atttgcaatg
2941 gaaaacacgt aacttgttta aaagtttttc tggtagcttt agctttatgc taaaaaaaat
3001 aatgacattg ggtatctatt tctttctaag actacattag taggaaaata agtcttttca
3061 tgcttatgat ttagctgttt tgtggtaatt gctttttaaa ggaagttatt aatatcataa
3121 gttattatta atattttgaa cacaggtgga tgtgaaggat tttcatttaa aaaccaagtg
3181 gttttgactt tttctgttga atgaacaact gtgccttgtg gaatttttgc agaagtgttt
3241 atgctttgtt agcatttcaa cttgcattat tataaagagg tattaatgcc tcagttatgt
3301 gtttgtcaat gtactggctg aggattctat ctcagctgtc ttttctaact gtgtaggttg
3361 agttttgaac acgtgcttgt ggacatcagg cctcctgcca gcagttcttg aagcttcttt
3421 ttcattcctg ctactctacc tgtatttctc agttgcagca ctgagtggtc aaaatacatt
3481 tctgggccac ctcagggaac ccatgcatct gcctggcatt taggcagcag agcccctgac
3541 cgtcccccac agggctctgc ctcacgtcct catctcattt ggctgtgtaa agaaatggga
3601 aaagggaaaa ggagagagca attgaggcag ttgaccatat tcagttttat ttatttattt
3661 ttaatttgtt tttttctcca agtccaccag tctctgaaat tagaacagta ggcggtatga
3721 gataatcagg cctaatcatg ttgtgattct cttttcttag tggagtggaa tgttctatcc
3781 ccacaagaag gattatatct tatagacttg tcttgttcag attctgtatt tacccatttt
3841 attgaaacat atactaagtt ccatgtattt ttgttacaaa tcttctgaaa aaaaacaaaa
3901 caatgtgaaa cattaaaatt aaaaggcatt aataatatcc acgtgtgcct tcttactgaa
3961 aaaaaaaaa

【0044】

ＮＭ＿１８２７４２．２ ヒトチオレドキシンレダクターゼ１（ＴＸＮＲＤ１）、転写産物変種２、ｍＲＮＡ（配列番号１４）
1 agaccctcac gtgatgacaa cagctagcaa agttctgtag ctactgcctt agggcatagt
61 ctaatttctt cagtaaaaac acacttattc caaatttggt tccagaattg ccttaaattg
121 tttttgctct gttcttaggt tgggggcggc tatgagcagg cagaggatgt ggtgtcaccc
181 aattaggagc tctcagctta cgaggcaatt agcataggtt gccagggctg cacgaggagt
241 ggatttctgc tttgtcattc tgactctggc agttagcccg cccgctcggc gcagggcgtg
301 gcttctcgta gccattagga aacagcaacc ctttcacctc agttttcttc actccggcat
361 ttgcagcaga gcgaaaggtg gtcgagtcct gaaggagggc ctgatgtctt catcattctc
421 aaattcttgt aagctctgcg tcgggtgaaa ccagacaaag ccgcgagccc agggatggga
481 gcacgcgggg gacggcctgc cggcggggac gacagcattg cgcctgggtg cagcagtgtg
541 cgtctcgggg aagggaagat attttaaggc gtgtctgagc agacggggag gcttttccaa
601 acccaggcag cttcgtggcg tgtgcggttt cgacccggtc acacaaagct tcagcatgtc
661 atgtggctta tcaggagggc agacttcaaa agctactaaa aatgaacggc cctgaagatc
721 ttcccaagtc ctatgactat gaccttatca tcattggagg tggctcagga ggtctggcag
781 ctgctaagga ggcagcccaa tatggcaaga aggtgatggt cctggacttt gtcactccca
841 cccctcttgg aactagatgg ggtctcggag gaacatgtgt gaatgtgggt tgcataccta
901 aaaaactgat gcatcaagca gctttgttag gacaagccct gcaagactct cgaaattatg
961 gatggaaagt cgaggagaca gttaagcatg attgggacag aatgatagaa gctgtacaga
1021 atcacattgg ctctttgaat tggggctacc gagtagctct gcgggagaaa aaagtcgtct
1081 atgagaatgc ttatgggcaa tttattggtc ctcacaggat taaggcaaca aataataaag
1141 gcaaagaaaa aatttattca gcagagagat ttctcattgc cactggtgaa agaccacgtt
1201 acttgggcat ccctggtgac aaagaatact gcatcagcag tgatgatctt ttctccttgc
1261 cttactgccc gggtaagacc ctggttgttg gagcatccta tgtcgctttg gagtgcgctg
1321 gatttcttgc tggtattggt ttagacgtca ctgttatggt taggtccatt cttcttagag
1381 gatttgacca ggacatggcc aacaaaattg gtgaacacat ggaagaacat ggcatcaagt
1441 ttataagaca gttcgtacca attaaagttg aacaaattga agcagggaca ccaggccgac
1501 tcagagtagt agctcagtcc accaatagtg aggaaatcat tgaaggagaa tataatacgg
1561 tgatgctggc aataggaaga gatgcttgca caagaaaaat tggcttagaa accgtagggg
1621 tgaagataaa tgaaaagact ggaaaaatac ctgtcacaga tgaagaacag accaatgtgc
1681 cttacatcta tgccattggc gatatattgg aggataaggt ggagctcacc ccagttgcaa
1741 tccaggcagg aagattgctg gctcagaggc tctatgcagg ttccactgtc aagtgtgact
1801 atgaaaatgt tccaaccact gtatttactc ctttggaata tggtgcttgt ggcctttctg
1861 aggagaaagc tgtggagaag tttggggaag aaaatattga ggtttaccat agttactttt
1921 ggccattgga atggacgatt ccgtcaagag ataacaacaa atgttatgca aaaataatct
1981 gtaatactaa agacaatgaa cgtgttgtgg gctttcacgt actgggtcca aatgctggag
2041 aagttacaca aggctttgca gctgcgctca aatgtggact gaccaaaaag cagctggaca
2101 gcacaattgg aatccaccct gtctgtgcag aggtattcac aacattgtct gtgaccaagc
2161 gctctggggc aagcatcctc caggctggct gctgaggtta agccccagtg tggatgctgt
2221 tgccaagact gcaaaccact ggctcgtttc cgtgcccaaa tccaaggcga agttttctag
2281 agggttcttg ggctcttggc acctgcgtgt cctgtgctta ccaccgccca aggccccctt
2341 ggatctcttg gataggagtt ggtgaataga aggcaggcag catcacactg gggtcactga
2401 cagacttgaa gctgacattt ggcagggcat cgaagggatg catccatgaa gtcaccagtc
2461 tcaagcccat gtggtaggcg gtgatggaac aactgtcaaa tcagttttag catgaccttt
2521 ccttgtggat tttcttattc tcgttgtcaa gttttctagg gttgaatttt tttctttttt
2581 ctccatggtg ttaatgatat tagagatgaa aaacgttagc agttgatttt tgtccaaaag
2641 caagtcatgg ctagagtatc catgcaaggt gtcttgttgc atggaaggga tagtttggct
2701 cccttggagg ctatgtaggc ttgtcccggg aaagagaact gtcctgcagc tgaaatggac
2761 tgttctttac tgacctgctc agcagtttct tctctcatat attcccaaaa caagtacatc
2821 tgcgatcaac tctagccaaa tttgcccctg tgtgctacat gatggatgat tattatttta
2881 aggtctgttt aggaagggaa atggctactt ggccagccat tgcctggcat ttggtagtat
2941 agtatgattc tcaccattat ttgtcatgga ggcagacata caccagaaat gggggagaaa
3001 cagtacatat ctttctgtct ttagtttatt gtgtgctggt ctaagcaagc tgagatcatt
3061 tgcaatggaa aacacgtaac ttgtttaaaa gtttttctgg tagctttagc tttatgctaa
3121 aaaaaataat gacattgggt atctatttct ttctaagact acattagtag gaaaataagt
3181 cttttcatgc ttatgattta gctgttttgt ggtaattgct ttttaaagga agttattaat
3241 atcataagtt attattaata ttttgaacac aggtggatgt gaaggatttt catttaaaaa
3301 ccaagtggtt ttgacttttt ctgttgaatg aacaactgtg ccttgtggaa tttttgcaga
3361 agtgtttatg ctttgttagc atttcaactt gcattattat aaagaggtat taatgcctca
3421 gttatgtgtt tgtcaatgta ctggctgagg attctatctc agctgtcttt tctaactgtg
3481 taggttgagt tttgaacacg tgcttgtgga catcaggcct cctgccagca gttcttgaag
3541 cttctttttc attcctgcta ctctacctgt atttctcagt tgcagcactg agtggtcaaa
3601 atacatttct gggccacctc agggaaccca tgcatctgcc tggcatttag gcagcagagc
3661 ccctgaccgt cccccacagg gctctgcctc acgtcctcat ctcatttggc tgtgtaaaga
3721 aatgggaaaa gggaaaagga gagagcaatt gaggcagttg accatattca gttttattta
3781 tttattttta atttgttttt ttctccaagt ccaccagtct ctgaaattag aacagtaggc
3841 ggtatgagat aatcaggcct aatcatgttg tgattctctt ttcttagtgg agtggaatgt
3901 tctatcccca caagaaggat tatatcttat agacttgtct tgttcagatt ctgtatttac
3961 ccattttatt gaaacatata ctaagttcca tgtatttttg ttacaaatct tctgaaaaaa
4021 aacaaaacaa tgtgaaacat taaaattaaa aggcattaat aatatccacg tgtgccttct
4081 tactgaaaaa aaaaaa

【0045】

ヒトチオレドキシンレダクターゼ１（ＴＸＮＲＤ１）、転写産物変種３、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿１８２７４３．２（配列番号１５）
1 agaccctcac gtgatgacaa cagctagcaa agttctgtag ctactgcctt agggcatagt
61 ctaatttctt cagtaaaaac acacttattc caaatttggt tccagaattg ccttaaattg
121 tttttgctct gttcttaggt tgggggcggc tatgagcagg cagaggatgt ggtgtcaccc
181 aattaggagc tctcagctta cgaggcaatt agcataggtt gccagggctg cacgaggagt
241 ggatttctgc tttgtcattc tgactctggc agttagcccg cccgctcggc gcagggcgtg
301 gcttctcgta gccattagga aacagcaacc ctttcacctc agttttcttc actccggcat
361 ttgcagcaga gcgaaaggtg gtcgagtcct gaaggagggc ctgatgtctt catcattctc
421 aaattcttgc ttatcaggag ggcagacttc aaaagctact aaaaatgaac ggccctgaag
481 atcttcccaa gtcctatgac tatgacctta tcatcattgg aggtggctca ggaggtctgg
541 cagctgctaa ggaggcagcc caatatggca agaaggtgat ggtcctggac tttgtcactc
601 ccacccctct tggaactaga tggggtctcg gaggaacatg tgtgaatgtg ggttgcatac
661 ctaaaaaact gatgcatcaa gcagctttgt taggacaagc cctgcaagac tctcgaaatt
721 atggatggaa agtcgaggag acagttaagc atgattggga cagaatgata gaagctgtac
781 agaatcacat tggctctttg aattggggct accgagtagc tctgcgggag aaaaaagtcg
841 tctatgagaa tgcttatggg caatttattg gtcctcacag gattaaggca acaaataata
901 aaggcaaaga aaaaatttat tcagcagaga gatttctcat tgccactggt gaaagaccac
961 gttacttggg catccctggt gacaaagaat actgcatcag cagtgatgat cttttctcct
1021 tgccttactg cccgggtaag accctggttg ttggagcatc ctatgtcgct ttggagtgcg
1081 ctggatttct tgctggtatt ggtttagacg tcactgttat ggttaggtcc attcttctta
1141 gaggatttga ccaggacatg gccaacaaaa ttggtgaaca catggaagaa catggcatca
1201 agtttataag acagttcgta ccaattaaag ttgaacaaat tgaagcaggg acaccaggcc
1261 gactcagagt agtagctcag tccaccaata gtgaggaaat cattgaagga gaatataata
1321 cggtgatgct ggcaatagga agagatgctt gcacaagaaa aattggctta gaaaccgtag
1381 gggtgaagat aaatgaaaag actggaaaaa tacctgtcac agatgaagaa cagaccaatg
1441 tgccttacat ctatgccatt ggcgatatat tggaggataa ggtggagctc accccagttg
1501 caatccaggc aggaagattg ctggctcaga ggctctatgc aggttccact gtcaagtgtg
1561 actatgaaaa tgttccaacc actgtattta ctcctttgga atatggtgct tgtggccttt
1621 ctgaggagaa agctgtggag aagtttgggg aagaaaatat tgaggtttac catagttact
1681 tttggccatt ggaatggacg attccgtcaa gagataacaa caaatgttat gcaaaaataa
1741 tctgtaatac taaagacaat gaacgtgttg tgggctttca cgtactgggt ccaaatgctg
1801 gagaagttac acaaggcttt gcagctgcgc tcaaatgtgg actgaccaaa aagcagctgg
1861 acagcacaat tggaatccac cctgtctgtg cagaggtatt cacaacattg tctgtgacca
1921 agcgctctgg ggcaagcatc ctccaggctg gctgctgagg ttaagcccca gtgtggatgc
1981 tgttgccaag actgcaaacc actggctcgt ttccgtgccc aaatccaagg cgaagttttc
2041 tagagggttc ttgggctctt ggcacctgcg tgtcctgtgc ttaccaccgc ccaaggcccc
2101 cttggatctc ttggatagga gttggtgaat agaaggcagg cagcatcaca ctggggtcac
2161 tgacagactt gaagctgaca tttggcaggg catcgaaggg atgcatccat gaagtcacca
2221 gtctcaagcc catgtggtag gcggtgatgg aacaactgtc aaatcagttt tagcatgacc
2281 tttccttgtg gattttctta ttctcgttgt caagttttct agggttgaat ttttttcttt
2341 tttctccatg gtgttaatga tattagagat gaaaaacgtt agcagttgat ttttgtccaa
2401 aagcaagtca tggctagagt atccatgcaa ggtgtcttgt tgcatggaag ggatagtttg
2461 gctcccttgg aggctatgta ggcttgtccc gggaaagaga actgtcctgc agctgaaatg
2521 gactgttctt tactgacctg ctcagcagtt tcttctctca tatattccca aaacaagtac
2581 atctgcgatc aactctagcc aaatttgccc ctgtgtgcta catgatggat gattattatt
2641 ttaaggtctg tttaggaagg gaaatggcta cttggccagc cattgcctgg catttggtag
2701 tatagtatga ttctcaccat tatttgtcat ggaggcagac atacaccaga aatgggggag
2761 aaacagtaca tatctttctg tctttagttt attgtgtgct ggtctaagca agctgagatc
2821 atttgcaatg gaaaacacgt aacttgttta aaagtttttc tggtagcttt agctttatgc
2881 taaaaaaaat aatgacattg ggtatctatt tctttctaag actacattag taggaaaata
2941 agtcttttca tgcttatgat ttagctgttt tgtggtaatt gctttttaaa ggaagttatt
3001 aatatcataa gttattatta atattttgaa cacaggtgga tgtgaaggat tttcatttaa
3061 aaaccaagtg gttttgactt tttctgttga atgaacaact gtgccttgtg gaatttttgc
3121 agaagtgttt atgctttgtt agcatttcaa cttgcattat tataaagagg tattaatgcc
3181 tcagttatgt gtttgtcaat gtactggctg aggattctat ctcagctgtc ttttctaact
3241 gtgtaggttg agttttgaac acgtgcttgt ggacatcagg cctcctgcca gcagttcttg
3301 aagcttcttt ttcattcctg ctactctacc tgtatttctc agttgcagca ctgagtggtc
3361 aaaatacatt tctgggccac ctcagggaac ccatgcatct gcctggcatt taggcagcag
3421 agcccctgac cgtcccccac agggctctgc ctcacgtcct catctcattt ggctgtgtaa
3481 agaaatggga aaagggaaaa ggagagagca attgaggcag ttgaccatat tcagttttat
3541 ttatttattt ttaatttgtt tttttctcca agtccaccag tctctgaaat tagaacagta
3601 ggcggtatga gataatcagg cctaatcatg ttgtgattct cttttcttag tggagtggaa
3661 tgttctatcc ccacaagaag gattatatct tatagacttg tcttgttcag attctgtatt
3721 tacccatttt attgaaacat atactaagtt ccatgtattt ttgttacaaa tcttctgaaa
3781 aaaaacaaaa caatgtgaaa cattaaaatt aaaaggcatt aataatatcc acgtgtgcct
3841 tcttactgaa aaaaaaaaa

【0046】

ヒトチオレドキシンレダクターゼ１（ＴＸＮＲＤ１）、転写産物変種４、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００３３３０．３（配列番号１６）
1 agaccctcac gtgatgacaa cagctagcaa agttctgtag ctactgcctt agggcatagt
61 ctaatttctt cagtaaaaac acacttattc caaatttggt tccagaattg ccttaaattg
121 tttttgctct gttcttaggt tgggggcggc tatgagcagg cagaggatgt ggtgtcaccc
181 aattaggagc tctcagctta cgaggcaatt agcataggtt gccagggctg cacgaggagt
241 ggatttctgc tttgtcattc tgactctggc agttagcccg cccgctcggc gcagggcgtg
301 gcttctcgta gccattagga aacagcaacc ctttcacctc agttttcttc actccggcat
361 ttgcagcaga gcgaaaggtg gtcgagtcct gaaggagggc ctgatgtctt catcattctc
421 aaattcttgt aagctctgcg tcgggtgaaa ccagacaaag ccgcgagccc agggatggga
481 gcacgcgggg gacggcctgc cggcggggac gacagcattg cgcctgggtg cagcagtgtg
541 cgtctcgggg aagggaagat attttaaggc gtgtctgagc agacggggag gcttttccaa
601 acccaggcag cttcgtggcg tgtgcggttt cgacccggtc acacaaagct tcagcatgtc
661 atgtgaggac ggtcgggccc tggaaggaac gctctcggaa ttggccgcgg aaaccgatct
721 gcccgttgtg tttgtgaaac agagaaagat aggcggccat ggtccaacct tgaaggctta
781 tcaggagggc agacttcaaa agctactaaa aatgaacggc cctgaagatc ttcccaagtc
841 ctatgactat gaccttatca tcattggagg tggctcagga ggtctggcag ctgctaagga
901 ggcagcccaa tatggcaaga aggtgatggt cctggacttt gtcactccca cccctcttgg
961 aactagatgg ggtctcggag gaacatgtgt gaatgtgggt tgcataccta aaaaactgat
1021 gcatcaagca gctttgttag gacaagccct gcaagactct cgaaattatg gatggaaagt
1081 cgaggagaca gttaagcatg attgggacag aatgatagaa gctgtacaga atcacattgg
1141 ctctttgaat tggggctacc gagtagctct gcgggagaaa aaagtcgtct atgagaatgc
1201 ttatgggcaa tttattggtc ctcacaggat taaggcaaca aataataaag gcaaagaaaa
1261 aatttattca gcagagagat ttctcattgc cactggtgaa agaccacgtt acttgggcat
1321 ccctggtgac aaagaatact gcatcagcag tgatgatctt ttctccttgc cttactgccc
1381 gggtaagacc ctggttgttg gagcatccta tgtcgctttg gagtgcgctg gatttcttgc
1441 tggtattggt ttagacgtca ctgttatggt taggtccatt cttcttagag gatttgacca
1501 ggacatggcc aacaaaattg gtgaacacat ggaagaacat ggcatcaagt ttataagaca
1561 gttcgtacca attaaagttg aacaaattga agcagggaca ccaggccgac tcagagtagt
1621 agctcagtcc accaatagtg aggaaatcat tgaaggagaa tataatacgg tgatgctggc
1681 aataggaaga gatgcttgca caagaaaaat tggcttagaa accgtagggg tgaagataaa
1741 tgaaaagact ggaaaaatac ctgtcacaga tgaagaacag accaatgtgc cttacatcta
1801 tgccattggc gatatattgg aggataaggt ggagctcacc ccagttgcaa tccaggcagg
1861 aagattgctg gctcagaggc tctatgcagg ttccactgtc aagtgtgact atgaaaatgt
1921 tccaaccact gtatttactc ctttggaata tggtgcttgt ggcctttctg aggagaaagc
1981 tgtggagaag tttggggaag aaaatattga ggtttaccat agttactttt ggccattgga
2041 atggacgatt ccgtcaagag ataacaacaa atgttatgca aaaataatct gtaatactaa
2101 agacaatgaa cgtgttgtgg gctttcacgt actgggtcca aatgctggag aagttacaca
2161 aggctttgca gctgcgctca aatgtggact gaccaaaaag cagctggaca gcacaattgg
2221 aatccaccct gtctgtgcag aggtattcac aacattgtct gtgaccaagc gctctggggc
2281 aagcatcctc caggctggct gctgaggtta agccccagtg tggatgctgt tgccaagact
2341 gcaaaccact ggctcgtttc cgtgcccaaa tccaaggcga agttttctag agggttcttg
2401 ggctcttggc acctgcgtgt cctgtgctta ccaccgccca aggccccctt ggatctcttg
2461 gataggagtt ggtgaataga aggcaggcag catcacactg gggtcactga cagacttgaa
2521 gctgacattt ggcagggcat cgaagggatg catccatgaa gtcaccagtc tcaagcccat
2581 gtggtaggcg gtgatggaac aactgtcaaa tcagttttag catgaccttt ccttgtggat
2641 tttcttattc tcgttgtcaa gttttctagg gttgaatttt tttctttttt ctccatggtg
2701 ttaatgatat tagagatgaa aaacgttagc agttgatttt tgtccaaaag caagtcatgg
2761 ctagagtatc catgcaaggt gtcttgttgc atggaaggga tagtttggct cccttggagg
2821 ctatgtaggc ttgtcccggg aaagagaact gtcctgcagc tgaaatggac tgttctttac
2881 tgacctgctc agcagtttct tctctcatat attcccaaaa caagtacatc tgcgatcaac
2941 tctagccaaa tttgcccctg tgtgctacat gatggatgat tattatttta aggtctgttt
3001 aggaagggaa atggctactt ggccagccat tgcctggcat ttggtagtat agtatgattc
3061 tcaccattat ttgtcatgga ggcagacata caccagaaat gggggagaaa cagtacatat
3121 ctttctgtct ttagtttatt gtgtgctggt ctaagcaagc tgagatcatt tgcaatggaa
3181 aacacgtaac ttgtttaaaa gtttttctgg tagctttagc tttatgctaa aaaaaataat
3241 gacattgggt atctatttct ttctaagact acattagtag gaaaataagt cttttcatgc
3301 ttatgattta gctgttttgt ggtaattgct ttttaaagga agttattaat atcataagtt
3361 attattaata ttttgaacac aggtggatgt gaaggatttt catttaaaaa ccaagtggtt
3421 ttgacttttt ctgttgaatg aacaactgtg ccttgtggaa tttttgcaga agtgtttatg
3481 ctttgttagc atttcaactt gcattattat aaagaggtat taatgcctca gttatgtgtt
3541 tgtcaatgta ctggctgagg attctatctc agctgtcttt tctaactgtg taggttgagt
3601 tttgaacacg tgcttgtgga catcaggcct cctgccagca gttcttgaag cttctttttc
3661 attcctgcta ctctacctgt atttctcagt tgcagcactg agtggtcaaa atacatttct
3721 gggccacctc agggaaccca tgcatctgcc tggcatttag gcagcagagc ccctgaccgt
3781 cccccacagg gctctgcctc acgtcctcat ctcatttggc tgtgtaaaga aatgggaaaa
3841 gggaaaagga gagagcaatt gaggcagttg accatattca gttttattta tttattttta
3901 atttgttttt ttctccaagt ccaccagtct ctgaaattag aacagtaggc ggtatgagat
3961 aatcaggcct aatcatgttg tgattctctt ttcttagtgg agtggaatgt tctatcccca
4021 caagaaggat tatatcttat agacttgtct tgttcagatt ctgtatttac ccattttatt
4081 gaaacatata ctaagttcca tgtatttttg ttacaaatct tctgaaaaaa aacaaaacaa
4141 tgtgaaacat taaaattaaa aggcattaat aatatccacg tgtgccttct tactgaaaaa
4201 aaaaaa

【0047】

ヒトチオレドキシンレダクターゼ１（ＴＸＮＲＤ１）、転写産物変種５、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１２６１４４５．１（配列番号１７）
1 agaccctcac gtgatgacaa cagctagcaa agttctgtag ctactgcctt agggcatagt
61 ctaatttctt cagtaaaaac acacttattc caaatttggt tccagaattg ccttaaattg
121 tttttgctct gttcttaggt tgggggcggc tatgagcagg cagaggatgt ggtgtcaccc
181 aattaggagc tctcagctta cgaggcaatt agcataggtt gccagggctg cacgaggagt
241 ggatttctgc tttgtcattc tgactctggc agttagcccg cccgctcggc gcagggcgtg
301 gcttctcgta gccattagga aacagcaacc ctttcacctc agttttcttc actccggcat
361 ttgcagcaga gcgaaaggtg gtcgagtcct gaaggagggc ctgatgtctt catcattctc
421 aaattcttgt aagctctgcg tcgggtgaaa ccagacaaag ccgcgagccc agggatggga
481 gcacgcgggg gacggcctgc cggcggggac gacagcattg cgcctgggtg cagcagtgtg
541 cgtctcgggg aagggaagat attttaaggc gtgtctgagc agacggggag gcttttccaa
601 acccaggcag cttcgtggcg tgtgcggttt cgacccggtc acacaaagct tcagcatgtc
661 atgtggtagg tgaggccggc gcctgtaggc tggcggtttc cttcctcttg gtctttgtag
721 agacagtttg cagaacagcg gagaaaatgg aggacggtcg ggccctggaa ggaacgctct
781 cggaattggc cgcggaaacc gatctgcccg ttgtgtttgt gaaacagaga aagataggcg
841 gccatggtcc aaccttgaag gcttatcagg agggcagact tcaaaagcta ctaaaaatga
901 acggccctga agatcttccc aagtcctatg actatgacct tatcatcatt ggaggtggct
961 caggaggtct ggcagctgct aaggaggcag cccaatatgg caagaaggtg atggtcctgg
1021 actttgtcac tcccacccct cttggaacta gatggggtct cggaggaaca tgtgtgaatg
1081 tgggttgcat acctaaaaaa ctgatgcatc aagcagcttt gttaggacaa gccctgcaag
1141 actctcgaaa ttatggatgg aaagtcgagg agacagttaa gcatgattgg gacagaatga
1201 tagaagctgt acagaatcac attggctctt tgaattgggg ctaccgagta gctctgcggg
1261 agaaaaaagt cgtctatgag aatgcttatg ggcaatttat tggtcctcac aggattaagg
1321 caacaaataa taaaggcaaa gaaaaaattt attcagcaga gagatttctc attgccactg
1381 gtgaaagacc acgttacttg ggcatccctg gtgacaaaga atactgcatc agcagtgatg
1441 atcttttctc cttgccttac tgcccgggta agaccctggt tgttggagca tcctatgtcg
1501 ctttggagtg cgctggattt cttgctggta ttggtttaga cgtcactgtt atggttaggt
1561 ccattcttct tagaggattt gaccaggaca tggccaacaa aattggtgaa cacatggaag
1621 aacatggcat caagtttata agacagttcg taccaattaa agttgaacaa attgaagcag
1681 ggacaccagg ccgactcaga gtagtagctc agtccaccaa tagtgaggaa atcattgaag
1741 gagaatataa tacggtgatg ctggcaatag gaagagatgc ttgcacaaga aaaattggct
1801 tagaaaccgt aggggtgaag ataaatgaaa agactggaaa aatacctgtc acagatgaag
1861 aacagaccaa tgtgccttac atctatgcca ttggcgatat attggaggat aaggtggagc
1921 tcaccccagt tgcaatccag gcaggaagat tgctggctca gaggctctat gcaggttcca
1981 ctgtcaagtg tgactatgaa aatgttccaa ccactgtatt tactcctttg gaatatggtg
2041 cttgtggcct ttctgaggag aaagctgtgg agaagtttgg ggaagaaaat attgaggttt
2101 accatagtta cttttggcca ttggaatgga cgattccgtc aagagataac aacaaatgtt
2161 atgcaaaaat aatctgtaat actaaagaca atgaacgtgt tgtgggcttt cacgtactgg
2221 gtccaaatgc tggagaagtt acacaaggct ttgcagctgc gctcaaatgt ggactgacca
2281 aaaagcagct ggacagcaca attggaatcc accctgtctg tgcagaggta ttcacaacat
2341 tgtctgtgac caagcgctct ggggcaagca tcctccaggc tggctgctga ggttaagccc
2401 cagtgtggat gctgttgcca agactgcaaa ccactggctc gtttccgtgc ccaaatccaa
2461 ggcgaagttt tctagagggt tcttgggctc ttggcacctg cgtgtcctgt gcttaccacc
2521 gcccaaggcc cccttggatc tcttggatag gagttggtga atagaaggca ggcagcatca
2581 cactggggtc actgacagac ttgaagctga catttggcag ggcatcgaag ggatgcatcc
2641 atgaagtcac cagtctcaag cccatgtggt aggcggtgat ggaacaactg tcaaatcagt
2701 tttagcatga cctttccttg tggattttct tattctcgtt gtcaagtttt ctagggttga
2761 atttttttct tttttctcca tggtgttaat gatattagag atgaaaaacg ttagcagttg
2821 atttttgtcc aaaagcaagt catggctaga gtatccatgc aaggtgtctt gttgcatgga
2881 agggatagtt tggctccctt ggaggctatg taggcttgtc ccgggaaaga gaactgtcct
2941 gcagctgaaa tggactgttc tttactgacc tgctcagcag tttcttctct catatattcc
3001 caaaacaagt acatctgcga tcaactctag ccaaatttgc ccctgtgtgc tacatgatgg
3061 atgattatta ttttaaggtc tgtttaggaa gggaaatggc tacttggcca gccattgcct
3121 ggcatttggt agtatagtat gattctcacc attatttgtc atggaggcag acatacacca
3181 gaaatggggg agaaacagta catatctttc tgtctttagt ttattgtgtg ctggtctaag
3241 caagctgaga tcatttgcaa tggaaaacac gtaacttgtt taaaagtttt tctggtagct
3301 ttagctttat gctaaaaaaa ataatgacat tgggtatcta tttctttcta agactacatt
3361 agtaggaaaa taagtctttt catgcttatg atttagctgt tttgtggtaa ttgcttttta
3421 aaggaagtta ttaatatcat aagttattat taatattttg aacacaggtg gatgtgaagg
3481 attttcattt aaaaaccaag tggttttgac tttttctgtt gaatgaacaa ctgtgccttg
3541 tggaattttt gcagaagtgt ttatgctttg ttagcatttc aacttgcatt attataaaga
3601 ggtattaatg cctcagttat gtgtttgtca atgtactggc tgaggattct atctcagctg
3661 tcttttctaa ctgtgtaggt tgagttttga acacgtgctt gtggacatca ggcctcctgc
3721 cagcagttct tgaagcttct ttttcattcc tgctactcta cctgtatttc tcagttgcag
3781 cactgagtgg tcaaaataca tttctgggcc acctcaggga acccatgcat ctgcctggca
3841 tttaggcagc agagcccctg accgtccccc acagggctct gcctcacgtc ctcatctcat
3901 ttggctgtgt aaagaaatgg gaaaagggaa aaggagagag caattgaggc agttgaccat
3961 attcagtttt atttatttat ttttaatttg tttttttctc caagtccacc agtctctgaa
4021 attagaacag taggcggtat gagataatca ggcctaatca tgttgtgatt ctcttttctt
4081 agtggagtgg aatgttctat ccccacaaga aggattatat cttatagact tgtcttgttc
4141 agattctgta tttacccatt ttattgaaac atatactaag ttccatgtat ttttgttaca
4201 aatcttctga aaaaaaacaa aacaatgtga aacattaaaa ttaaaaggca ttaataatat
4261 ccacgtgtgc cttcttactg aaaaaaaaaa a

【0048】

ヒトチオレドキシンレダクターゼ１（ＴＸＮＲＤ１）、転写産物変種６、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１２６１４４６．１（配列番号１８）
1 agaccctcac gtgatgacaa cagctagcaa agttctgtag ctactgcctt agggcatagt
61 ctaatttctt cagtaaaaac acacttattc caaatttggt tccagaattg ccttaaattg
121 tttttgctct gttcttaggt tgggggcggc tatgagcagg cagaggatgt ggtgtcaccc
181 aattaggagc tctcagctta cgaggcaatt agcataggtt gccagggctg cacgaggagt
241 ggatttctgc tttgtcattc tgactctggc agttagcccg cccgctcggc gcagggcgtg
301 gcttctcgta gccattagga aacagcaacc ctttcacctc agttttcttc actccggcat
361 ttgcagcaga gcgaaaggtg gtcgagtcct gaaggagggc ctgatgtctt catcattctc
421 aaattcttag gacggtcggg ccctggaagg aacgctctcg gaattggccg cggaaaccga
481 tctgcccgtt gtgtttgtga aacagagaaa gataggcggc catggtccaa ccttgaagga
541 ggcagcccaa tatggcaaga aggtgatggt cctggacttt gtcactccca cccctcttgg
601 aactagatgg ggtctcggag gaacatgtgt gaatgtgggt tgcataccta aaaaactgat
661 gcatcaagca gctttgttag gacaagccct gcaagactct cgaaattatg gatggaaagt
721 cgaggagaca gttaagcatg attgggacag aatgatagaa gctgtacaga atcacattgg
781 ctctttgaat tggggctacc gagtagctct gcgggagaaa aaagtcgtct atgagaatgc
841 ttatgggcaa tttattggtc ctcacaggat taaggcaaca aataataaag gcaaagaaaa
901 aatttattca gcagagagat ttctcattgc cactggtgaa agaccacgtt acttgggcat
961 ccctggtgac aaagaatact gcatcagcag tgatgatctt ttctccttgc cttactgccc
1021 gggtaagacc ctggttgttg gagcatccta tgtcgctttg gagtgcgctg gatttcttgc
1081 tggtattggt ttagacgtca ctgttatggt taggtccatt cttcttagag gatttgacca
1141 ggacatggcc aacaaaattg gtgaacacat ggaagaacat ggcatcaagt ttataagaca
1201 gttcgtacca attaaagttg aacaaattga agcagggaca ccaggccgac tcagagtagt
1261 agctcagtcc accaatagtg aggaaatcat tgaaggagaa tataatacgg tgatgctggc
1321 aataggaaga gatgcttgca caagaaaaat tggcttagaa accgtagggg tgaagataaa
1381 tgaaaagact ggaaaaatac ctgtcacaga tgaagaacag accaatgtgc cttacatcta
1441 tgccattggc gatatattgg aggataaggt ggagctcacc ccagttgcaa tccaggcagg
1501 aagattgctg gctcagaggc tctatgcagg ttccactgtc aagtgtgact atgaaaatgt
1561 tccaaccact gtatttactc ctttggaata tggtgcttgt ggcctttctg aggagaaagc
1621 tgtggagaag tttggggaag aaaatattga ggtttaccat agttactttt ggccattgga
1681 atggacgatt ccgtcaagag ataacaacaa atgttatgca aaaataatct gtaatactaa
1741 agacaatgaa cgtgttgtgg gctttcacgt actgggtcca aatgctggag aagttacaca
1801 aggctttgca gctgcgctca aatgtggact gaccaaaaag cagctggaca gcacaattgg
1861 aatccaccct gtctgtgcag aggtattcac aacattgtct gtgaccaagc gctctggggc
1921 aagcatcctc caggctggct gctgaggtta agccccagtg tggatgctgt tgccaagact
1981 gcaaaccact ggctcgtttc cgtgcccaaa tccaaggcga agttttctag agggttcttg
2041 ggctcttggc acctgcgtgt cctgtgctta ccaccgccca aggccccctt ggatctcttg
2101 gataggagtt ggtgaataga aggcaggcag catcacactg gggtcactga cagacttgaa
2161 gctgacattt ggcagggcat cgaagggatg catccatgaa gtcaccagtc tcaagcccat
2221 gtggtaggcg gtgatggaac aactgtcaaa tcagttttag catgaccttt ccttgtggat
2281 tttcttattc tcgttgtcaa gttttctagg gttgaatttt tttctttttt ctccatggtg
2341 ttaatgatat tagagatgaa aaacgttagc agttgatttt tgtccaaaag caagtcatgg
2401 ctagagtatc catgcaaggt gtcttgttgc atggaaggga tagtttggct cccttggagg
2461 ctatgtaggc ttgtcccggg aaagagaact gtcctgcagc tgaaatggac tgttctttac
2521 tgacctgctc agcagtttct tctctcatat attcccaaaa caagtacatc tgcgatcaac
2581 tctagccaaa tttgcccctg tgtgctacat gatggatgat tattatttta aggtctgttt
2641 aggaagggaa atggctactt ggccagccat tgcctggcat ttggtagtat agtatgattc
2701 tcaccattat ttgtcatgga ggcagacata caccagaaat gggggagaaa cagtacatat
2761 ctttctgtct ttagtttatt gtgtgctggt ctaagcaagc tgagatcatt tgcaatggaa
2821 aacacgtaac ttgtttaaaa gtttttctgg tagctttagc tttatgctaa aaaaaataat
2881 gacattgggt atctatttct ttctaagact acattagtag gaaaataagt cttttcatgc
2941 ttatgattta gctgttttgt ggtaattgct ttttaaagga agttattaat atcataagtt
3001 attattaata ttttgaacac aggtggatgt gaaggatttt catttaaaaa ccaagtggtt
3061 ttgacttttt ctgttgaatg aacaactgtg ccttgtggaa tttttgcaga agtgtttatg
3121 ctttgttagc atttcaactt gcattattat aaagaggtat taatgcctca gttatgtgtt
3181 tgtcaatgta ctggctgagg attctatctc agctgtcttt tctaactgtg taggttgagt
3241 tttgaacacg tgcttgtgga catcaggcct cctgccagca gttcttgaag cttctttttc
3301 attcctgcta ctctacctgt atttctcagt tgcagcactg agtggtcaaa atacatttct
3361 gggccacctc agggaaccca tgcatctgcc tggcatttag gcagcagagc ccctgaccgt
3421 cccccacagg gctctgcctc acgtcctcat ctcatttggc tgtgtaaaga aatgggaaaa
3481 gggaaaagga gagagcaatt gaggcagttg accatattca gttttattta tttattttta
3541 atttgttttt ttctccaagt ccaccagtct ctgaaattag aacagtaggc ggtatgagat
3601 aatcaggcct aatcatgttg tgattctctt ttcttagtgg agtggaatgt tctatcccca
3661 caagaaggat tatatcttat agacttgtct tgttcagatt ctgtatttac ccattttatt
3721 gaaacatata ctaagttcca tgtatttttg ttacaaatct tctgaaaaaa aacaaaacaa
3781 tgtgaaacat taaaattaaa aggcattaat aatatccacg tgtgccttct tactgaaaaa
3841 aaaaaa

【0049】

ヒトチオレドキシンレダクターゼ１（ＴＸＮＲＤ１）、転写産物変種７、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０９３７７１．３（配列番号１９）
1 agttcccaca gggccttgtg cgacatgggc tgcgccgagg gcaaggcagt ggcggcggcc
61 gccccaacgg agctgcagac gaaaggcaag aacggcgatg gccgccgtag gtcagctaaa
121 gatcatcacc ctggtaaaac tttgccagag aacccagcag gattcaccag cacggccact
181 gcagactcca gagccctgct tcaggcctat atagatggtc actctgtggt catcttcagt
241 aggtccacat gcacacgctg tactgaggta aagaagttat ttaaatctct gtgtgttcct
301 tattttgtgc ttgaacttga tcaaacagag gacggtcggg ccctggaagg aacgctctcg
361 gaattggccg cggaaaccga tctgcccgtt gtgtttgtga aacagagaaa gataggcggc
421 catggtccaa ccttgaaggc ttatcaggag ggcagacttc aaaagctact aaaaatgaac
481 ggccctgaag atcttcccaa gtcctatgac tatgacctta tcatcattgg aggtggctca
541 ggaggtctgg cagctgctaa ggaggcagcc caatatggca agaaggtgat ggtcctggac
601 tttgtcactc ccacccctct tggaactaga tggggtctcg gaggaacatg tgtgaatgtg
661 ggttgcatac ctaaaaaact gatgcatcaa gcagctttgt taggacaagc cctgcaagac
721 tctcgaaatt atggatggaa agtcgaggag acagttaagc atgattggga cagaatgata
781 gaagctgtac agaatcacat tggctctttg aattggggct accgagtagc tctgcgggag
841 aaaaaagtcg tctatgagaa tgcttatggg caatttattg gtcctcacag gattaaggca
901 acaaataata aaggcaaaga aaaaatttat tcagcagaga gatttctcat tgccactggt
961 gaaagaccac gttacttggg catccctggt gacaaagaat actgcatcag cagtgatgat
1021 cttttctcct tgccttactg cccgggtaag accctggttg ttggagcatc ctatgtcgct
1081 ttggagtgcg ctggatttct tgctggtatt ggtttagacg tcactgttat ggttaggtcc
1141 attcttctta gaggatttga ccaggacatg gccaacaaaa ttggtgaaca catggaagaa
1201 catggcatca agtttataag acagttcgta ccaattaaag ttgaacaaat tgaagcaggg
1261 acaccaggcc gactcagagt agtagctcag tccaccaata gtgaggaaat cattgaagga
1321 gaatataata cggtgatgct ggcaatagga agagatgctt gcacaagaaa aattggctta
1381 gaaaccgtag gggtgaagat aaatgaaaag actggaaaaa tacctgtcac agatgaagaa
1441 cagaccaatg tgccttacat ctatgccatt ggcgatatat tggaggataa ggtggagctc
1501 accccagttg caatccaggc aggaagattg ctggctcaga ggctctatgc aggttccact
1561 gtcaagtgtg actatgaaaa tgttccaacc actgtattta ctcctttgga atatggtgct
1621 tgtggccttt ctgaggagaa agctgtggag aagtttgggg aagaaaatat tgaggtttac
1681 catagttact tttggccatt ggaatggacg attccgtcaa gagataacaa caaatgttat
1741 gcaaaaataa tctgtaatac taaagacaat gaacgtgttg tgggctttca cgtactgggt
1801 ccaaatgctg gagaagttac acaaggcttt gcagctgcgc tcaaatgtgg actgaccaaa
1861 aagcagctgg acagcacaat tggaatccac cctgtctgtg cagaggtatt cacaacattg
1921 tctgtgacca agcgctctgg ggcaagcatc ctccaggctg gctgctgagg ttaagcccca
1981 gtgtggatgc tgttgccaag actgcaaacc actggctcgt ttccgtgccc aaatccaagg
2041 cgaagttttc tagagggttc ttgggctctt ggcacctgcg tgtcctgtgc ttaccaccgc
2101 ccaaggcccc cttggatctc ttggatagga gttggtgaat agaaggcagg cagcatcaca
2161 ctggggtcac tgacagactt gaagctgaca tttggcaggg catcgaaggg atgcatccat
2221 gaagtcacca gtctcaagcc catgtggtag gcggtgatgg aacaactgtc aaatcagttt
2281 tagcatgacc tttccttgtg gattttctta ttctcgttgt caagttttct agggttgaat
2341 ttttttcttt tttctccatg gtgttaatga tattagagat gaaaaacgtt agcagttgat
2401 ttttgtccaa aagcaagtca tggctagagt atccatgcaa ggtgtcttgt tgcatggaag
2461 ggatagtttg gctcccttgg aggctatgta ggcttgtccc gggaaagaga actgtcctgc
2521 agctgaaatg gactgttctt tactgacctg ctcagcagtt tcttctctca tatattccca
2581 aaacaagtac atctgcgatc aactctagcc aaatttgccc ctgtgtgcta catgatggat
2641 gattattatt ttaaggtctg tttaggaagg gaaatggcta cttggccagc cattgcctgg
2701 catttggtag tatagtatga ttctcaccat tatttgtcat ggaggcagac atacaccaga
2761 aatgggggag aaacagtaca tatctttctg tctttagttt attgtgtgct ggtctaagca
2821 agctgagatc atttgcaatg gaaaacacgt aacttgttta aaagtttttc tggtagcttt
2881 agctttatgc taaaaaaaat aatgacattg ggtatctatt tctttctaag actacattag
2941 taggaaaata agtcttttca tgcttatgat ttagctgttt tgtggtaatt gctttttaaa
3001 ggaagttatt aatatcataa gttattatta atattttgaa cacaggtgga tgtgaaggat
3061 tttcatttaa aaaccaagtg gttttgactt tttctgttga atgaacaact gtgccttgtg
3121 gaatttttgc agaagtgttt atgctttgtt agcatttcaa cttgcattat tataaagagg
3181 tattaatgcc tcagttatgt gtttgtcaat gtactggctg aggattctat ctcagctgtc
3241 ttttctaact gtgtaggttg agttttgaac acgtgcttgt ggacatcagg cctcctgcca
3301 gcagttcttg aagcttcttt ttcattcctg ctactctacc tgtatttctc agttgcagca
3361 ctgagtggtc aaaatacatt tctgggccac ctcagggaac ccatgcatct gcctggcatt
3421 taggcagcag agcccctgac cgtcccccac agggctctgc ctcacgtcct catctcattt
3481 ggctgtgtaa agaaatggga aaagggaaaa ggagagagca attgaggcag ttgaccatat
3541 tcagttttat ttatttattt ttaatttgtt tttttctcca agtccaccag tctctgaaat
3601 tagaacagta ggcggtatga gataatcagg cctaatcatg ttgtgattct cttttcttag
3661 tggagtggaa tgttctatcc ccacaagaag gattatatct tatagacttg tcttgttcag
3721 attctgtatt tacccatttt attgaaacat atactaagtt ccatgtattt ttgttacaaa
3781 tcttctgaaa aaaaacaaaa caatgtgaaa cattaaaatt aaaaggcatt aataatatcc
3841 acgtgtgcct tcttactgaa

【0050】

マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）チオレドキシンレダクターゼ１（Ｔｘｎｒｄ１）、転写産物変種１、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０４２５１３．１（配列番号２０）
1 agtttgcttc cgtcaggcct cgcgtccacg cgggaggtgc gggacgccga caccgcgggg
61 cgagaagagc tggtggtttc accttccttg ttcatagggc ggcggggcct tgcagcggcg
121 cgggcgagcg gaaaggccgc gggaggcggc gagccagcgg aaggtgcgac cggcggaggg
181 cggccatggt ccagccctga agccgaacaa aaaaggccaa cttcaaaagc tgccaacaat
241 gaatggctcc aaagatcccc ctgggtccta tgacttcgac ctgatcatca ttggaggagg
301 ctcaggagga ctggcagcag ctaaggaggc agccaaattt gacaagaaag tgctggtctt
361 ggattttgtc acaccgactc ctcttgggac cagatggggt ctcggaggaa cgtgtgtgaa
421 tgtgggttgc atacctaaga agctgatgca ccaggcagct ttgctcggac aagctctgaa
481 agactcgcgc aactatggct ggaaagtcga agacacagtg aagcatgact gggagaaaat
541 gacggaatct gtgcagagtc acatcggctc gctgaactgg ggctaccgcg tagctctccg
601 ggagaaaaag gtcgtctatg agaatgctta cgggaggttc attggtcctc acaggattgt
661 ggcgacaaat aacaaaggta aagaaaaaat ctattcagca gagcggttcc tcatcgccac
721 aggtgagagg ccccgctacc tgggcatccc tggagacaaa gagtactgca tcagcagtga
781 tgatcttttc tccttgcctt actgcccggg gaagacccta gtagttggtg catcctatgt
841 cgccttggaa tgtgcaggat ttctggctgg tatcggctta gacgtcactg taatggtgcg
901 gtccattctc cttagaggat ttgaccaaga catggccaac aaaatcggtg aacacatgga
961 agaacatggt atcaagttta taaggcagtt cgtcccaacg aaaattgaac agatcgaagc
1021 aggaacacca ggccgactca gggtgactgc tcaatccaca aacagcgagg agaccataga
1081 gggcgaattt aacacagtgt tgctggcggt aggaagagat tcttgtacga gaactattgg
1141 cttagagacc gtgggcgtga agataaacga aaaaaccgga aagatacccg tcacggatga
1201 agagcagacc aatgtgcctt acatctacgc catcggtgac atcctggagg ggaagctaga
1261 gctgactccc gtagccatcc aggcggggag attgctggct cagaggctgt atggaggctc
1321 caatgtcaaa tgtgactatg acaatgtccc aacgactgta tttactcctt tggaatatgg
1381 ctgttgtggc ctctctgaag aaaaagccgt agagaaattt ggggaagaaa atattgaagt
1441 ttaccatagt ttcttttggc cattggaatg gacagtccca tcccgggata acaacaaatg
1501 ttatgcaaaa ataatctgca accttaaaga cgatgaacgt gtcgtgggct tccacgtgct
1561 gggtccaaac gctggagagg tgacgcaggg ctttgcggct gcgctcaagt gtgggctgac
1621 taagcagcag ctggacagca ccatcggcat ccacccggtc tgtgcagaga tattcacaac
1681 gttgtcagtg acgaagcgct ctgggggaga catcctccag tctggctgct gaggttaagc
1741 cccagtgtgg atgctgttgc caagactaca gaccattgcc ttgcttcctt gcccacgccc
1801 aggtgaagtt caggaaggct cttgggtcct aggcgccaat tcaaggtgct gtcctaaggc
1861 caccgggtcc ctgggatctt gtgggtagga ggtggcaggt cgaaggaggc tgcagcatcg
1921 cactggggtc accatgacag actcagactg acatctggca gagcatcaca ggcatgcgtc
1981 catgaagtca ctggcctcaa gcccaagtgg tgggcagtga cagaagagct gccgggtctg
2041 ttgagctcaa ccttttcctg tagattgtct tagtctcact ttcaagctgt ctaatgtcaa
2101 ttctgttttt cttttttcct ccatggggtt aatgatacta gagataggga atattagcaa
2161 tcagtttttg tcatggctgg tccatctgca acagtcttta ctgtgtggaa gtgggtgaga
2221 tggcttatga gagccaaacc aatttatccc cagaaagacg aattaccctg tgactaaaat
2281 acactgtctg cttttactaa ctggtgtagc attgtctcct ttaataagtc ttgtgtccaa
2341 aacgagaaaa accattggcc acttttgcaa gtttcctgca gtgtgcttag caagggaggt
2401 ggcgacttgg ctaatctact tgaactgcat cgcatggctc ttgggtagct tagagcatcg
2461 cagggtagag gcagaccagc agtgagtgtc tctcctggta caattattgt ctggttctca
2521 gtggaaaacg cttaatttgc tttaaacttg gtgtttttgt gaggtggatt tagtcttaag
2581 ctgtgtccca taagaactac attcacaggc aagtggctct tcctccacac agcctataca
2641 tcttctgagg taattacttt cataaggaag ctgttcataa cgtaagttat tattattatt
2701 gaacacaggt ggatgtgaag gatttttcat tgaaaaacca aatggttttt ctttttttct
2761 gttcagtgag cccacaggaa ctctgtcagg acagccagta ctctgccggc atggctgctg
2821 gggcgtttac ggtgtagttt agctcctagg ttacatgacc gtgaacatgc tggctgagga
2881 ctacacaaac caggtttccc accatacacg gcctggccct gcagcttctt ttcttgccct
2941 cccctttgcc tgtccccacc tgcagtactg agtggcgttt cacagtaccc ttctgggcca
3001 cctcagggaa gggatttgcc tggtgtccag ccagcagcac ccaccctgcc ccacgaggct
3061 ccctcacacc tgcccccccg tccttgtgtt gaagacagtg ggaagaggag aaaggaccag
3121 ggaaaccaag ggagttgact gttcagtttt atttatttat tttttaagtt tttttttcct
3181 ttcaagtctg ccagtctctg agatcagaac aacagacagt gtagggtaac taatcatgtg
3241 attctcttag tggaatgaaa tgttctaccc ccacaagaag gagtatacgt cattgttcat
3301 attctgtaat cgcacaatgt attgtaatgc aaattccaat tccatgtatt tttattacaa
3361 tttttctgga aaaaaatgtg aaccaataaa agatgttgat gcacacgcgt gccttct

【0051】

マウスチオレドキシンレダクターゼ１（Ｔｘｎｒｄ１）、転写産物変種３、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０４２５１４．１（配列番号２１）
1 gtggctacga ggctggtgtt tttagccgcc atgcagagct tttctgagtt ctgggggtcc
61 tggagtcttg ctggcccggc tgcttaaggg tcggagtcca ctggcgagag tgacccaggg
121 cgcgtggcgt cccggaagcc ccgcccggag gaaggctcac tgccgctctg ctttgtgcca
181 cagagggcgg cggggccttg cagcggcgcg ggcgagcgga aaggccgcgg gaggcggcga
241 gccagcggaa ggtgcgaccg gcggagggcg gccatggtcc agccctgaag ccgaacaaaa
301 aaggccaact tcaaaagctg ccaacaatga atggctccaa agatccccct gggtcctatg
361 acttcgacct gatcatcatt ggaggaggct caggaggact ggcagcagct aaggaggcag
421 ccaaatttga caagaaagtg ctggtcttgg attttgtcac accgactcct cttgggacca
481 gatggggtct cggaggaacg tgtgtgaatg tgggttgcat acctaagaag ctgatgcacc
541 aggcagcttt gctcggacaa gctctgaaag actcgcgcaa ctatggctgg aaagtcgaag
601 acacagtgaa gcatgactgg gagaaaatga cggaatctgt gcagagtcac atcggctcgc
661 tgaactgggg ctaccgcgta gctctccggg agaaaaaggt cgtctatgag aatgcttacg
721 ggaggttcat tggtcctcac aggattgtgg cgacaaataa caaaggtaaa gaaaaaatct
781 attcagcaga gcggttcctc atcgccacag gtgagaggcc ccgctacctg ggcatccctg
841 gagacaaaga gtactgcatc agcagtgatg atcttttctc cttgccttac tgcccgggga
901 agaccctagt agttggtgca tcctatgtcg ccttggaatg tgcaggattt ctggctggta
961 tcggcttaga cgtcactgta atggtgcggt ccattctcct tagaggattt gaccaagaca
1021 tggccaacaa aatcggtgaa cacatggaag aacatggtat caagtttata aggcagttcg
1081 tcccaacgaa aattgaacag atcgaagcag gaacaccagg ccgactcagg gtgactgctc
1141 aatccacaaa cagcgaggag accatagagg gcgaatttaa cacagtgttg ctggcggtag
1201 gaagagattc ttgtacgaga actattggct tagagaccgt gggcgtgaag ataaacgaaa
1261 aaaccggaaa gatacccgtc acggatgaag agcagaccaa tgtgccttac atctacgcca
1321 tcggtgacat cctggagggg aagctagagc tgactcccgt agccatccag gcggggagat
1381 tgctggctca gaggctgtat ggaggctcca atgtcaaatg tgactatgac aatgtcccaa
1441 cgactgtatt tactcctttg gaatatggct gttgtggcct ctctgaagaa aaagccgtag
1501 agaaatttgg ggaagaaaat attgaagttt accatagttt cttttggcca ttggaatgga
1561 cagtcccatc ccgggataac aacaaatgtt atgcaaaaat aatctgcaac cttaaagacg
1621 atgaacgtgt cgtgggcttc cacgtgctgg gtccaaacgc tggagaggtg acgcagggct
1681 ttgcggctgc gctcaagtgt gggctgacta agcagcagct ggacagcacc atcggcatcc
1741 acccggtctg tgcagagata ttcacaacgt tgtcagtgac gaagcgctct gggggagaca
1801 tcctccagtc tggctgctga ggttaagccc cagtgtggat gctgttgcca agactacaga
1861 ccattgcctt gcttccttgc ccacgcccag gtgaagttca ggaaggctct tgggtcctag
1921 gcgccaattc aaggtgctgt cctaaggcca ccgggtccct gggatcttgt gggtaggagg
1981 tggcaggtcg aaggaggctg cagcatcgca ctggggtcac catgacagac tcagactgac
2041 atctggcaga gcatcacagg catgcgtcca tgaagtcact ggcctcaagc ccaagtggtg
2101 ggcagtgaca gaagagctgc cgggtctgtt gagctcaacc ttttcctgta gattgtctta
2161 gtctcacttt caagctgtct aatgtcaatt ctgtttttct tttttcctcc atggggttaa
2221 tgatactaga gatagggaat attagcaatc agtttttgtc atggctggtc catctgcaac
2281 agtctttact gtgtggaagt gggtgagatg gcttatgaga gccaaaccaa tttatcccca
2341 gaaagacgaa ttaccctgtg actaaaatac actgtctgct tttactaact ggtgtagcat
2401 tgtctccttt aataagtctt gtgtccaaaa cgagaaaaac cattggccac ttttgcaagt
2461 ttcctgcagt gtgcttagca agggaggtgg cgacttggct aatctacttg aactgcatcg
2521 catggctctt gggtagctta gagcatcgca gggtagaggc agaccagcag tgagtgtctc
2581 tcctggtaca attattgtct ggttctcagt ggaaaacgct taatttgctt taaacttggt
2641 gtttttgtga ggtggattta gtcttaagct gtgtcccata agaactacat tcacaggcaa
2701 gtggctcttc ctccacacag cctatacatc ttctgaggta attactttca taaggaagct
2761 gttcataacg taagttatta ttattattga acacaggtgg atgtgaagga tttttcattg
2821 aaaaaccaaa tggtttttct ttttttctgt tcagtgagcc cacaggaact ctgtcaggac
2881 agccagtact ctgccggcat ggctgctggg gcgtttacgg tgtagtttag ctcctaggtt
2941 acatgaccgt gaacatgctg gctgaggact acacaaacca ggtttcccac catacacggc
3001 ctggccctgc agcttctttt cttgccctcc cctttgcctg tccccacctg cagtactgag
3061 tggcgtttca cagtaccctt ctgggccacc tcagggaagg gatttgcctg gtgtccagcc
3121 agcagcaccc accctgcccc acgaggctcc ctcacacctg cccccccgtc cttgtgttga
3181 agacagtggg aagaggagaa aggaccaggg aaaccaaggg agttgactgt tcagttttat
3241 ttatttattt tttaagtttt tttttccttt caagtctgcc agtctctgag atcagaacaa
3301 cagacagtgt agggtaacta atcatgtgat tctcttagtg gaatgaaatg ttctaccccc
3361 acaagaagga gtatacgtca ttgttcatat tctgtaatcg cacaatgtat tgtaatgcaa
3421 attccaattc catgtatttt tattacaatt tttctggaaa aaaatgtgaa ccaataaaag
3481 atgttgatgc acacgcgtgc cttct

【0052】

マウスチオレドキシンレダクターゼ１（Ｔｘｎｒｄ１）、転写産物変種２、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１５７６２．２（配列番号２２）
1 agtttgcttc cgtcaggcct cgcgtccacg cgggaggtgc gggacgccga caccgcgggg
61 cgagaagagc tggtggtttc accttccttg ttcatccgaa caaaaaaggc caacttcaaa
121 agctgccaac aatgaatggc tccaaagatc cccctgggtc ctatgacttc gacctgatca
181 tcattggagg aggctcagga ggactggcag cagctaagga ggcagccaaa tttgacaaga
241 aagtgctggt cttggatttt gtcacaccga ctcctcttgg gaccagatgg ggtctcggag
301 gaacgtgtgt gaatgtgggt tgcataccta agaagctgat gcaccaggca gctttgctcg
361 gacaagctct gaaagactcg cgcaactatg gctggaaagt cgaagacaca gtgaagcatg
421 actgggagaa aatgacggaa tctgtgcaga gtcacatcgg ctcgctgaac tggggctacc
481 gcgtagctct ccgggagaaa aaggtcgtct atgagaatgc ttacgggagg ttcattggtc
541 ctcacaggat tgtggcgaca aataacaaag gtaaagaaaa aatctattca gcagagcggt
601 tcctcatcgc cacaggtgag aggccccgct acctgggcat ccctggagac aaagagtact
661 gcatcagcag tgatgatctt ttctccttgc cttactgccc ggggaagacc ctagtagttg
721 gtgcatccta tgtcgccttg gaatgtgcag gatttctggc tggtatcggc ttagacgtca
781 ctgtaatggt gcggtccatt ctccttagag gatttgacca agacatggcc aacaaaatcg
841 gtgaacacat ggaagaacat ggtatcaagt ttataaggca gttcgtccca acgaaaattg
901 aacagatcga agcaggaaca ccaggccgac tcagggtgac tgctcaatcc acaaacagcg
961 aggagaccat agagggcgaa tttaacacag tgttgctggc ggtaggaaga gattcttgta
1021 cgagaactat tggcttagag accgtgggcg tgaagataaa cgaaaaaacc ggaaagatac
1081 ccgtcacgga tgaagagcag accaatgtgc cttacatcta cgccatcggt gacatcctgg
1141 aggggaagct agagctgact cccgtagcca tccaggcggg gagattgctg gctcagaggc
1201 tgtatggagg ctccaatgtc aaatgtgact atgacaatgt cccaacgact gtatttactc
1261 ctttggaata tggctgttgt ggcctctctg aagaaaaagc cgtagagaaa tttggggaag
1321 aaaatattga agtttaccat agtttctttt ggccattgga atggacagtc ccatcccggg
1381 ataacaacaa atgttatgca aaaataatct gcaaccttaa agacgatgaa cgtgtcgtgg
1441 gcttccacgt gctgggtcca aacgctggag aggtgacgca gggctttgcg gctgcgctca
1501 agtgtgggct gactaagcag cagctggaca gcaccatcgg catccacccg gtctgtgcag
1561 agatattcac aacgttgtca gtgacgaagc gctctggggg agacatcctc cagtctggct
1621 gctgaggtta agccccagtg tggatgctgt tgccaagact acagaccatt gccttgcttc
1681 cttgcccacg cccaggtgaa gttcaggaag gctcttgggt cctaggcgcc aattcaaggt
1741 gctgtcctaa ggccaccggg tccctgggat cttgtgggta ggaggtggca ggtcgaagga
1801 ggctgcagca tcgcactggg gtcaccatga cagactcaga ctgacatctg gcagagcatc
1861 acaggcatgc gtccatgaag tcactggcct caagcccaag tggtgggcag tgacagaaga
1921 gctgccgggt ctgttgagct caaccttttc ctgtagattg tcttagtctc actttcaagc
1981 tgtctaatgt caattctgtt tttctttttt cctccatggg gttaatgata ctagagatag
2041 ggaatattag caatcagttt ttgtcatggc tggtccatct gcaacagtct ttactgtgtg
2101 gaagtgggtg agatggctta tgagagccaa accaatttat ccccagaaag acgaattacc
2161 ctgtgactaa aatacactgt ctgcttttac taactggtgt agcattgtct cctttaataa
2221 gtcttgtgtc caaaacgaga aaaaccattg gccacttttg caagtttcct gcagtgtgct
2281 tagcaaggga ggtggcgact tggctaatct acttgaactg catcgcatgg ctcttgggta
2341 gcttagagca tcgcagggta gaggcagacc agcagtgagt gtctctcctg gtacaattat
2401 tgtctggttc tcagtggaaa acgcttaatt tgctttaaac ttggtgtttt tgtgaggtgg
2461 atttagtctt aagctgtgtc ccataagaac tacattcaca ggcaagtggc tcttcctcca
2521 cacagcctat acatcttctg aggtaattac tttcataagg aagctgttca taacgtaagt
2581 tattattatt attgaacaca ggtggatgtg aaggattttt cattgaaaaa ccaaatggtt
2641 tttctttttt tctgttcagt gagcccacag gaactctgtc aggacagcca gtactctgcc
2701 ggcatggctg ctggggcgtt tacggtgtag tttagctcct aggttacatg accgtgaaca
2761 tgctggctga ggactacaca aaccaggttt cccaccatac acggcctggc cctgcagctt
2821 cttttcttgc cctccccttt gcctgtcccc acctgcagta ctgagtggcg tttcacagta
2881 cccttctggg ccacctcagg gaagggattt gcctggtgtc cagccagcag cacccaccct
2941 gccccacgag gctccctcac acctgccccc ccgtccttgt gttgaagaca gtgggaagag
3001 gagaaaggac cagggaaacc aagggagttg actgttcagt tttatttatt tattttttaa
3061 gttttttttt cctttcaagt ctgccagtct ctgagatcag aacaacagac agtgtagggt
3121 aactaatcat gtgattctct tagtggaatg aaatgttcta cccccacaag aaggagtata
3181 cgtcattgtt catattctgt aatcgcacaa tgtattgtaa tgcaaattcc aattccatgt
3241 atttttatta caatttttct ggaaaaaaat gtgaaccaat aaaagatgtt gatgcacacg
3301 cgtgccttct

【0053】

マウスチオレドキシンレダクターゼ１（Ｔｘｎｒｄ１）、転写産物変種４、ｍＲＮＡ
ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０４２５２３．１（配列番号２３）
1 caggctccac cagtgcttct gcagacctca gagcctggcg gctggcctca taaacagccg
61 tgcggtggac actctactaa gtgccctgca ttgaaggaga agccctggtc accatgccag
121 ttgatgactg ctggctgtac ttcccagctt ctcgaggtag aacctttgtg cagactgtct
181 gggtggcacc cacttgcccc aactgttgct ggtttccagg ttttctccct ccagtccccc
241 ggccaccaca tgtgccccgt gtgctgctga ggggccctcg tggggctgtg cttcctgctt
301 cacgtccctc caagacactc ccctcctcat cccagacgcc ctgtcctact gacccctgta
361 tctgccctcc accctccaca cctgatagta ggcaggaaaa aaatacgcaa tctgagctgc
421 cgaacaaaaa aggccaactt caaaagctgc caacaatgaa tggctccaaa gatccccctg
481 ggtcctatga cttcgacctg atcatcattg gaggaggctc aggaggactg gcagcagcta
541 aggaggcagc caaatttgac aagaaagtgc tggtcttgga ttttgtcaca ccgactcctc
601 ttgggaccag atggggtctc ggaggaacgt gtgtgaatgt gggttgcata cctaagaagc
661 tgatgcacca ggcagctttg ctcggacaag ctctgaaaga ctcgcgcaac tatggctgga
721 aagtcgaaga cacagtgaag catgactggg agaaaatgac ggaatctgtg cagagtcaca
781 tcggctcgct gaactggggc taccgcgtag ctctccggga gaaaaaggtc gtctatgaga
841 atgcttacgg gaggttcatt ggtcctcaca ggattgtggc gacaaataac aaaggtaaag
901 aaaaaatcta ttcagcagag cggttcctca tcgccacagg tgagaggccc cgctacctgg
961 gcatccctgg agacaaagag tactgcatca gcagtgatga tcttttctcc ttgccttact
1021 gcccggggaa gaccctagta gttggtgcat cctatgtcgc cttggaatgt gcaggatttc
1081 tggctggtat cggcttagac gtcactgtaa tggtgcggtc cattctcctt agaggatttg
1141 accaagacat ggccaacaaa atcggtgaac acatggaaga acatggtatc aagtttataa
1201 ggcagttcgt cccaacgaaa attgaacaga tcgaagcagg aacaccaggc cgactcaggg
1261 tgactgctca atccacaaac agcgaggaga ccatagaggg cgaatttaac acagtgttgc
1321 tggcggtagg aagagattct tgtacgagaa ctattggctt agagaccgtg ggcgtgaaga
1381 taaacgaaaa aaccggaaag atacccgtca cggatgaaga gcagaccaat gtgccttaca
1441 tctacgccat cggtgacatc ctggagggga agctagagct gactcccgta gccatccagg
1501 cggggagatt gctggctcag aggctgtatg gaggctccaa tgtcaaatgt gactatgaca
1561 atgtcccaac gactgtattt actcctttgg aatatggctg ttgtggcctc tctgaagaaa
1621 aagccgtaga gaaatttggg gaagaaaata ttgaagttta ccatagtttc ttttggccat
1681 tggaatggac agtcccatcc cgggataaca acaaatgtta tgcaaaaata atctgcaacc
1741 ttaaagacga tgaacgtgtc gtgggcttcc acgtgctggg tccaaacgct ggagaggtga
1801 cgcagggctt tgcggctgcg ctcaagtgtg ggctgactaa gcagcagctg gacagcacca
1861 tcggcatcca cccggtctgt gcagagatat tcacaacgtt gtcagtgacg aagcgctctg
1921 ggggagacat cctccagtct ggctgctgag gttaagcccc agtgtggatg ctgttgccaa
1981 gactacagac cattgccttg cttccttgcc cacgcccagg tgaagttcag gaaggctctt
2041 gggtcctagg cgccaattca aggtgctgtc ctaaggccac cgggtccctg ggatcttgtg
2101 ggtaggaggt ggcaggtcga aggaggctgc agcatcgcac tggggtcacc atgacagact
2161 cagactgaca tctggcagag catcacaggc atgcgtccat gaagtcactg gcctcaagcc
2221 caagtggtgg gcagtgacag aagagctgcc gggtctgttg agctcaacct tttcctgtag
2281 attgtcttag tctcactttc aagctgtcta atgtcaattc tgtttttctt ttttcctcca
2341 tggggttaat gatactagag atagggaata ttagcaatca gtttttgtca tggctggtcc
2401 atctgcaaca gtctttactg tgtggaagtg ggtgagatgg cttatgagag ccaaaccaat
2461 ttatccccag aaagacgaat taccctgtga ctaaaataca ctgtctgctt ttactaactg
2521 gtgtagcatt gtctccttta ataagtcttg tgtccaaaac gagaaaaacc attggccact
2581 tttgcaagtt tcctgcagtg tgcttagcaa gggaggtggc gacttggcta atctacttga
2641 actgcatcgc atggctcttg ggtagcttag agcatcgcag ggtagaggca gaccagcagt
2701 gagtgtctct cctggtacaa ttattgtctg gttctcagtg gaaaacgctt aatttgcttt
2761 aaacttggtg tttttgtgag gtggatttag tcttaagctg tgtcccataa gaactacatt
2821 cacaggcaag tggctcttcc tccacacagc ctatacatct tctgaggtaa ttactttcat
2881 aaggaagctg ttcataacgt aagttattat tattattgaa cacaggtgga tgtgaaggat
2941 ttttcattga aaaaccaaat ggtttttctt tttttctgtt cagtgagccc acaggaactc
3001 tgtcaggaca gccagtactc tgccggcatg gctgctgggg cgtttacggt gtagtttagc
3061 tcctaggtta catgaccgtg aacatgctgg ctgaggacta cacaaaccag gtttcccacc
3121 atacacggcc tggccctgca gcttcttttc ttgccctccc ctttgcctgt ccccacctgc
3181 agtactgagt ggcgtttcac agtacccttc tgggccacct cagggaaggg atttgcctgg
3241 tgtccagcca gcagcaccca ccctgcccca cgaggctccc tcacacctgc ccccccgtcc
3301 ttgtgttgaa gacagtggga agaggagaaa ggaccaggga aaccaaggga gttgactgtt
3361 cagttttatt tatttatttt ttaagttttt ttttcctttc aagtctgcca gtctctgaga
3421 tcagaacaac agacagtgta gggtaactaa tcatgtgatt ctcttagtgg aatgaaatgt
3481 tctaccccca caagaaggag tatacgtcat tgttcatatt ctgtaatcgc acaatgtatt
3541 gtaatgcaaa ttccaattcc atgtattttt attacaattt ttctggaaaa aaatgtgaac
3601 caataaaaga tgttgatgca cacgcgtgcc ttct

【0054】

アンチセンス核酸は、アンチセンスＲＮＡまたはアンチセンスＤＮＡであり得る。既知のＴＸＮＲＤ１遺伝子配列に基づいたアンチセンス核酸は、当技術分野において知られた方法を用いて容に設計および操作することができる。いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸は、配列番号１～１２のいずれか１つまたはその相補物の核酸配列を含む。

【0055】

アンチセンス核酸は、センス核酸鎖と相補的な分子、例えば、二本鎖ＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）分子のコード鎖と相補的またはｍＲＮＡ配列と相補的である分子である。したがって、アンチセンス核酸はセンス核酸と水素結合を形成することができる。アンチセンス核酸は、ＴＸＮＲＤ１コード鎖全体またはその一部分、例えば、タンパク質コード領域（またはオープンリーディングフレーム）の全部または部分と相補的であり得る。いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸は、ＴＸＮＲＤ１ ｍＲＮＡのコード領域の一部分のみと相補的であるオリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＴＸＮＲＤ１コード鎖の非コード領域と相補的であり得る。いくつかの実施形態において、非コード領域は、コード領域に隣接し、かつアミノ酸へ翻訳されない５’および３’非翻訳領域を指す。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＸＮＲＤ１の翻訳開始部位を囲む領域と相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であり得る。

【0056】

アンチセンス核酸は、当技術分野において知られた手順を用いる化学合成および酵素ライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはその分子の生物学的安定性を増加させるために、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるために設計された修飾ヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いて化学合成することができる。アンチセンス核酸を作製するために用いることができる修飾ヌクレオチドの例には、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ホドウラシル（ｈｏｄｏｕｒａｃｉｌ）、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（５－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｏｕｒｉｄｉｎｅ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン（ｍｅｔｎｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトシン、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル（ｔｈｌｏｕｒａｃｉｌ）、４－チオウラシル（ｔｈｉｏｕｒａｃｉｌ）、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向で（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡが関心対象となる標的核酸に対してアンチセンス配向である）サブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に産生することができる。

【0057】

アンチセンス核酸分子は、対象に投与され、またはインサイチューで生成され、対象となるタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡとハイブリダイズもしくは結合し、それにより、例えば転写および／もしくは翻訳を阻害することにより、そのタンパク質の発現を阻害し得る。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成し得るワトソン・クリック塩基対形成を介して、またはＤＮＡ二重鎖と結合するアンチセンス核酸分子の場合、その二重ヘリックスの主溝における特異的な相互作用を通して起こり得る。

【0058】

いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、例えば、アンチセンス核酸分子を細胞表面受容体または抗原と結合するペプチドまたは抗体に連結することにより、選択された細胞表面に発現した受容体または抗原と特異的に結合するように改変される。いくつかの実施形態において、アンチセンス核酸分子はα－アノマー核酸分子である。α－アノマー核酸分子は通常のβ－ユニットとは違って、ストランドがお互いに平行している相補性ＲＮＡとの特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Gaultier et al., Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641(1987)）。アンチセンス核酸分子はまた、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15:6131-6148 (1987)）またはキメラＲＮＡ－ＤＮＡアナログ（Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330 (1987)）を含むことができる。

【0059】

本開示はまた、配列番号１３～２３（ＴＸＮＲＤ１ ｍＲＮＡアイソフォーム）のいずれか１つの一部分と相補的でありかつ特異的にハイブリダイズし、それによりＴＸＮＲＤ１発現を低下させまたは阻害する核酸配列を含む、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も提供する。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、長さが約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９塩基対である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、植物、哺乳動物、卵母細胞、および初期胚などの多くの生物体において配列特異的転写後遺伝子サイレンシング（例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ））を誘導することができる。ＲＮＡｉはｍＲＮＡに干渉し、またはｍＲＮＡにより生成されたタンパク質コピーの数を有意に低下させる過程である。例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子は標的遺伝子のｍＲＮＡと相補し、かつハイブリダイズするように操作される。細胞内送達後、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に会合し、それは、その後、相補性標的ｍＲＮＡ（例えば、ＴＸＮＲＤ１ ｍＲＮＡ）を結合および分解する。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、配列番号１～１２のいずれか１つの核酸配列を含む。

【0060】

本開示はまた、配列番号１３～２３（ＴＸＮＲＤ１ ｍＲＮＡアイソフォーム）のいずれか１つの一部分と相補的でありかつ特異的にハイブリダイズし、それによりＴＸＮＲＤ１発現を低下させまたは阻害する核酸配列を含むリボザイム、も提供する。リボザイムは、ｍＲＮＡなどの相補性一本鎖核酸を切断する能力があるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。したがって、リボザイム（ハンマーヘッド型リボザイム（Haselhoff and Gerlach, Nature 334:585-591 (1988)に記載されている））は、ＴＸＮＲＤ１転写産物を触媒的に切断し、それによりＴＸＮＲＤ１の翻訳を阻害するために用いることができる。

【0061】

ＴＸＮＲＤ１コード核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されたＴＸＮＲＤ１核酸配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＴＸＮＲＤ１コードｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列と相補的である、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ－１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築することができる。例えば、米国特許第４，９８７，０７１号および米国特許第５，１１６，７４２号参照。あるいは、ＴＸＮＲＤ１ ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられた、Bartel and Szostak (1993) Science 261:1411-1418参照。

【0062】

本開示はまた、配列番号１３～２３（ＴＸＮＲＤ１ ｍＲＮＡアイソフォーム）のいずれか１つの一部分と相補的でありかつ特異的にハイブリダイズする核酸配列を含む合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を提供する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに用いられるガイドＲＮＡは、典型的には、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含む単一のガイドＲＮＡとして作製される。ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントはまた、別々のＲＮＡ分子として作製することもできる。ｃｒＲＮＡセグメントは、配列番号１３～２３（ＴＸＮＲＤ１ ｍＲＮＡアイソフォーム）のいずれか１つの一部分と結合するターゲティング配列、およびｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズするステム部分を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、ｃｒＲＮＡのステム配列と部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列、およびＣＲＩＳＰＲ酵素と結合するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、単一のガイドＲＮＡとして提供される。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、別々のＲＮＡとして提供される。ＣＲＩＳＰＲ酵素のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡとの組合せは、機能性ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを作り上げる。核酸をターゲットするための例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、例えば、ＷＯ２０１５／０８９４６５に記載されている。

【0063】

いくつかの実施形態において、合成ガイドＲＮＡは、以下の要素を含むとして表される単一ＲＮＡである：
５’－Ｘ１－Ｘ２－Ｙ－Ｚ－３’
式中、Ｘ１およびＸ２は、ｃｒＲＮＡセグメントを表し、式中、Ｘ１は配列番号１３～２３のいずれか１つの一部分と結合するターゲティング配列であり、Ｘ２はｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズするステム配列であり、Ｚは、Ｘ２と部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを表し、Ｙはリンカー配列を表す。いくつかの実施形態において、リンカー配列は２個以上のヌクレオチドを含み、ｃｒＲＮＡセグメントとｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを連結する。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ステム配列がｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズした時に形成されるヘアピン構造のループである。

【0064】

いくつかの実施形態において、合成ガイドＲＮＡは２つの別々のＲＮＡとして提供され、その場合、１つのＲＮＡがｃｒＲＮＡセグメント：５’－Ｘ１－Ｘ２－３’（式中、Ｘ１が配列番号１３～２３のいずれか１つの一部分と結合するターゲティング配列であり、Ｘ２がｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズするステム配列である）を表し、１つのＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントとは別個のＲＮＡでありかつｃｒＲＮＡのＸ２と部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメント、Ｚを表す。

【0065】

例示的なｃｒＲＮＡステム配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、例えば、参照により本明細書に組み入れられている、ＷＯ／２０１５／０８９４６５に提供されている。一般的に、ステム配列は、標的配列においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するためにｔｒａｃｒＲＮＡにおける相補性配列と十分な相補性を有する任意の配列を含み、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体がｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズしたステム配列を含む。一般的に、相補性の度合は、ステム配列とｔｒａｃｒＲＮＡにおける相補性配列の、その２つの配列の短い方の長さに沿っての最適なアラインメントに関するものである。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、さらに、ステム配列かまたはｔｒａｃｒＲＮＡにおける相補性配列かのいずれかの内における自己相補性などの二次構造を説明し得る。いくつかの実施形態において、ステム配列とｔｒａｃｒＲＮＡにおける相補性配列の間の、２つの配列の短い方の長さに沿っての最適にアライメントされた時の相補性の度合は、約２５％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９７．５％超、９９％超、またはそれを超える。いくつかの実施形態において、ステム配列は、長さが約５個超、６個超、７個超、８個超、９個超、１０個超、１１個超、１２個超、１３個超、１４個超、１５個超、１６個超、１７個超、１８個超、１９個超、２０個超、２５個超、３０個超、４０個超、５０個超のヌクレオチド、またはそれを超える。いくつかの実施形態において、ステム配列およびｔｒａｃｒＲＮＡにおける相補性配列は、単一のＲＮＡ内に含有され、その結果、その２つの配列間でのハイブリダイゼーションがヘアピンなどの二次構造を有する転写産物を産生する。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡはヘアピンを形成する追加の相補性配列を有する。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは、２つ、３つ、４つ、または５つのヘアピンを有する。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡは最大で５つのヘアピンを有する。

【0066】

ヘアピン構造において、最後の「Ｎ」の５’側でかつループの上流の配列の部分はｃｒＲＮＡステム配列に対応し、ループの３’側の配列の部分はｔｒａｃｒＲＮＡ配列に対応する。ガイド配列、ステム配列、およびｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的例は、以下の通りであり（５’から３’へ列挙されている）、「Ｎ」はガイド配列の塩基（例えば、本明細書に提供された修飾オリゴヌクレオチド）を表し、小文字の１番目のブロックはステム配列を表し、小文字の２番目のブロックはｔｒａｃｒＲＮＡ配列を表し、最後のポリＴ配列は転写終結配列を表す：
（ａ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａＧＡＡＡｔａａａｔｃｔｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａ ｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ（配列番号２４）；（ｂ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇ ａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ（配列番号２５）；（ｃ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇ ａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔＴＴＴＴＴＴ（配列番号２６）；（ｄ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔ ｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ（配列番号２７）；（ｅ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃ ｔｔｇａａａａａｇｔｇＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号２８）；および（ｆ）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＴＴ ＴＴＴＴＴＴ（配列番号２９）

【0067】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおけるターゲティング配列として用いられる適切なオリゴヌクレオチドの選択は、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ酵素、および標的核酸における標的配列の下流の対応するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在を含むいくつかの因子に依存する。ＰＡＭ配列は、標的核酸のＣＲＩＳＰＲ酵素による切断を方向づける。いくつかの実施形態において、適切なＰＡＭは、ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９酵素（または派生酵素）それぞれについて５’－ＮＲＧまたは５’－ＮＮＧＲＲである（ただし、Ｎは任意のヌクレオチドである）。一般的に、ＰＡＭ配列は標的核酸の効率的な切断を生じるために標的配列から約１ヌクレオチド～約１０ヌクレオチドの間に存在するべきである。したがって、ガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ酵素と複合体を形成する時、その複合体は、標的およびＰＡＭ配列の場所を見つけ、ＤＮＡ二重鎖を巻き戻し、ガイドＲＮＡが逆ストランド上の相補性配列とアニールする。これは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼに二本鎖切断を生じることを可能にさせる。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは配列番号１～１２のいずれか１つの核酸配列を含む。

【0068】

様々なＣＲＩＳＰＲ酵素が、本開示の開示されたガイドＲＮＡと共の使用に利用できる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤＮＡ切断を触媒する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＲＮＡ切断を触媒する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は任意のＣａｓ９タンパク質、例えば、任意の天然に存在する細菌Ｃａｓ９、加えて、任意のキメラ、変異体、ホモログ、またはオルソログである。Ｃａｓタンパク質の非限定的例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２とも言う）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変型変種が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位における標的核酸の両方の鎖を切断する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素はニッカーゼであり、標的核酸の１つの鎖のみを切断する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は追加の酵素活性を付されたｄＣａｓ９であり、関心対象となる遺伝子の発現を抑制または活性化する。

【0069】

医薬組成物
一態様において、本開示は、ＴＸＮＲＤ１阻害剤を含む医薬組成物を提供する。
本開示の医薬組成物は、薬学分野において知られた方法のいずれかにより調製され得る。単一剤形を作製するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置されることになっている宿主および特定の投与様式に依存して異なる。単一剤形を作製するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的に、治療効果を生じる化合物の量である。一般的に、活性化合物の量は、約０．１～９９パーセント、より典型的には約５～７０パーセント、より典型的には約１０～３０パーセントの範囲である。

【0070】

いくつかの実施形態において、本テクノロジーの医薬組成物は１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含有し、担体は、本明細書で用いられる場合、一般的に、活性物質が身体へ導入するのに有用な、液体もしくは固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、もしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸（ｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ））、または溶媒封入材料などの薬学的に許容される担体を指す。
本テクノロジーの医薬組成物に用いられ得る適切な水性および非水性担体の例には、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびその他の同種類のもの）、植物油（例えば、オリーブ油）、および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、およびそれらの適切な混合物が挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーディング材料の使用により、分散の場合では、必要とされる粒子サイズの維持により、および表面活性剤の使用により、維持することができる。

【0071】

いくつかの実施形態において、製剤は、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのそれの誘導体；トラガカント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；アルギン酸；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；発熱物質を含まない水；等張性生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝溶液；ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；保存剤；流動促進剤；増量剤；ならびに薬学的製剤に用いられる他の無毒適合性物質の１つまたは複数を含み得る。

【0072】

湿潤剤、乳化剤、潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、着色剤、遊離剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、保存剤、および抗酸化剤などの様々な補助剤もまた、本テクノロジーの医薬組成物に含むことができる。薬学的に許容される抗酸化剤のいくつかの例には以下が挙げられる：アスコルビン酸、塩酸システイン、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、およびその他同種類のものなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α－トコフェロール、およびその他同種類のものなどの油溶性抗酸化剤；ならびに、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、およびその他同種類のものなどの金属キレート剤。いくつかの実施形態において、薬学的製剤は、例えば、セルロース、リポソーム、脂質ナノ粒子、ミセル形成剤（例えば、胆汁酸）、ならびにポリマー担体、例えば、ポリエステルおよびポリ酸無水物から選択される賦形剤を含む。懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロオキシド（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｍｅｔａｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物を含有し得る。微生物の活性化合物への作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびその他同種類のものの包含により保証され得る。糖、塩化ナトリウム、およびその他同種類のものなどの等張剤を組成物へ含むことが望ましい場合もある。加えて、注射可能な医薬品形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる作用物質の包含により、もたらされ得る。

【0073】

治療方法
以下の議論は例としてのみ提示され、限定することを意図しない。

【0074】

本テクノロジーの一態様は、ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／または活性の増加により特徴づけられる疾患または状態を治療する方法を含む。追加としてまたは代替として、いくつかの実施形態において、本テクノロジーは、ＲＡＳ変異体癌を治療する方法を含む。ＲＡＳの３つの主要なアイソフォーム（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳ）は合わせてヒト癌の約２０％において、主に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）基質のｇ－リン酸近くの残基Ｇ１２、Ｇ１３、およびＱ６１における活性部位で、変異している（Marcus & Mattos, Clin Cancer Res 21(8): 1810-1818 (2015)参照）。ある特定の実施形態において、ＲＡＳ変異体癌は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｅからなる群から選択されるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ変異を含む。

【0075】

いくつかの実施形態において、本テクノロジーは、ＲＡＳ変異体膵癌を治療する方法を含む。一態様において、本開示は、それを必要としている対象においてＲＡＳ変異体癌の増殖を阻害するための方法であって、本明細書に開示された少なくとも１つのＴＸＮＲＤ１阻害剤の治療有効量を前記対象に投与することを含み、前記対象が、ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／または活性の増加により特徴づけられるＲＡＳ変異体癌を患っている、前記方法を提供する。

【0076】

いくつかの実施形態において、対象は、ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／または活性の増加により特徴づけられる疾患または状態を有すると診断され、前記疾患または状態を有するのではないかと疑われ、またはそのような疾患または状態のリスクを有する。追加としてまたは代替として、いくつかの実施形態において、対象は、ＲＡＳ変異体癌を有すると診断されている。ある特定の実施形態において、ＲＡＳ変異体癌は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｅからなる群から選択されるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ変異を含む。いくつかの実施形態において、対象は、肺癌（例えば、肺腺癌）、粘液性腺腫、膵癌（例えば、ＰＤＡＣ）、結腸直腸癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、子宮内膜癌、精巣胚細胞性癌、または副腎癌を有すると診断されている。いくつかの実施形態において、対象は膵癌を有すると診断されている。いくつかの実施形態において、対象はＲＡＳ変異体膵癌を有すると診断されている。

【0077】

治療的適用において、本明細書に開示されたＴＸＮＲＤ１阻害剤を含む組成物または薬物は、そのような疾患または状態を患っているのではないかと疑われ、またはすでに患っている対象（例えば、ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／もしくは活性の増加により特徴づけられる疾患もしくは状態と診断された対象、ならびに／またはＲＡＳ変異体癌と診断された対象、ならびに／または膵癌と診断された対象）に、前記疾患の発生におけるそれの合併症および中間病理学的表現型を含む、前記疾患の症状を治癒させ、または少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で投与される。

【0078】

ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／もしくは活性の増加により特徴づけられる疾患もしくは状態を患っている対象、ならびに／またはＲＡＳ変異体癌と診断された対象は、当技術分野において知られた診断または予後診断アッセイのいずれかまたは組合せにより同定することができる。
いくつかの実施形態において、対象は、ＫＲＡＳにおいて１つまたは複数の変異を示し得る。加えて、対象は、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＳＭＡＤ４、ＭＬＬ３、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲＩＤ１ＡおよびＳＦ３Ｂ１、ＥＰＣ１およびＡＲＩＤ２、ＡＴＭ、ＺＩＭ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＡＬＣＮ、ＳＬＣ１６Ａ４、ＭＡＧＥＡ６、ＲＯＢＯ２、ＫＤＭ６Ａ、ＰＲＥＸ２、ＥＲＢＢ２、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＣＤＫ６、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２などの少なくとも１つにおいて１つまたは複数の変異を示し得る。Biankin et al., Nature 491(7424): 399-405 (2012); and Waddell et al., Nature 518(7540):495-501 (2015)。追加としてまたは代替として、対象は、１２個の細胞シグナル伝達経路および過程のコアセットのうちの１つまたは複数において少なくとも１つの変異を示し得る。Jones et al., Science 321(5897): 1801-1806 (2008)。

【0079】

いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／もしくは活性の増加により特徴づけられる疾患もしくは状態を有する対象、ならびに／または、ＴＸＮＲＤ１阻害剤で治療される、ＲＡＳ変異体膵癌を患っている対象は、以下の症状の１つまたは複数の寛解または消失を示すだろう：背中に向かって放射状に広がる上腹部における痛み、食欲不振または意図せぬ体重減少、鬱、初発糖尿病、血栓、疲労、皮膚および白目の黄染（黄疸）、腹部膨満、悪心、ならびに嘔吐。
ある特定の実施形態において、ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／もしくはＴＸＮＲＤ１の活性レベルの増加により特徴づけられる疾患もしくは状態を有する対象、ならびに／または、ＴＸＮＲＤ１阻害剤で治療される、ＲＡＳ変異体癌を患っている対象、ならびに／または膵癌を患っている対象は、ＲＡＳ変異体癌を有する未治療の対象と比較して、ＲＡＳ変異体細胞増殖の低下および／または生存期間の増加を示すだろう。ある特定の実施形態において、ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／もしくはＴＸＮＲＤ１の活性レベルの増加により特徴づけられる疾患もしくは状態を有する対象、ならびに／または、ＴＸＮＲＤ１阻害剤で治療される、ＲＡＳ変異体癌を患っている対象ならびに／または膵癌を患っている対象は、ＲＡＳ変異体癌を有する未治療の対象と比較して、ＴＸＮＲＤ１および／もしくはＲＡＳ発現レベルの低下、ならびに／またはＴＸＮＲＤ１および／もしくはＲＡＳ活性レベルの低下を示すだろう。

【0080】

一態様において、本開示は、以下のステップを含む、ＲＡＳ変異体癌と診断された対象においてＴＸＮＲＤ１阻害剤の治療効力をモニターするための方法を提供する：（ａ）前記対象が前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤を投与された後、前記対象から得られた検査試料においてＴＸＮＲＤ１タンパク質レベルを検出するステップ；および（ｂ）前記検査試料におけるＴＸＮＲＤ１タンパク質レベルが、前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤の投与前に前記対象から得られた対照試料において観察されたレベルと比較して低下している場合、前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤が有効であると決定するステップ。ＴＸＮＲＤ１阻害剤は、オーラノフィン、ピペルロングミン、Ｄ９、ＴＲｉ－１、ＴＲｉ－２、ミリセチン、ＰＭＸ４６４、ＰＸ１２、ブレベトキシン－２、マニュマイシンＡ、エタセレン、オーロチオグルコース、プロトポルフィリンＩＸ、ＴＸＮＲＤ１に対する阻害性ＲＮＡ、抗ＴＸＮＲＤ１抗体、またはその任意の誘導体であり得る。検査試料は、対象内に存在する組織、細胞、または体液（血液、血漿、唾液、尿、血清など）であり得る。あるいは、ＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）および／またはＴＸＮＲＤ１発現レベルが、対象におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤の効力を決定するために用いられ得る（本明細書に記載された実施例６参照）。したがって、ある特定の実施形態において、本方法は、対象においてＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）および／またはＴＸＮＲＤ１発現レベルを検出するステップであって、治療前の前記対象において観察されるそれらと比べてのＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）および／またはＴＸＮＲＤ１発現レベルの減少が前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤の治療効力を示すステップをさらに含む。追加としてまたは代替として、ある特定の実施形態において、本方法は、対象においてＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）および／またはＴＸＮＲＤ１タンパク質の活性を検出するステップであって、治療前の前記対象において観察されるそれらと比べてのＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）および／またはＴＸＮＲＤ１活性の減少が前記ＴＸＮＲＤ１阻害剤の治療効力を示すステップをさらに含む。ある特定の実施形態において、ＲＡＳ変異体癌は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｅからなる群から選択されるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ変異を含む。ある特定の実施形態において、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ変異はＤＮＡシーケンシングによって検出される。

【0081】

本明細書に開示された方法のありとあらゆる実施形態において、ＴＸＮＲＤ１および／またはＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）発現レベルは、ＲＮＡ－ｓｅｑ、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、ドットまたはスロットブロット、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、リアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲ、高速液体クラマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫電気泳動、免疫染色、免疫組織化学法、またはウェスタンブロッティングによって検出される。

【0082】

予防方法
一態様において、本テクノロジーは、ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／または活性の増加により特徴づけられる疾患または状態の発症を防止しまたは遅延させるための方法を提供する。追加としてまたは代替として、いくつかの態様において、本テクノロジーは、ＲＡＳ変異体癌の発症を防止しまたは遅延させるための方法を提供する。ある特定の実施形態において、ＲＡＳ変異体癌は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｅからなる群から選択されるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ変異を含む。ＲＡＳ変異体癌は、肺癌（例えば、肺腺癌）、粘液性腺腫、膵癌（例えば、ＰＤＡＣ）、結腸直腸癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、子宮内膜癌、精巣胚細胞性癌、または副腎癌であり得る。

【0083】

ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／もしくは活性の増加により特徴づけられる疾患もしくは状態のリスクがあり、もしくはそれに罹りやすい対象、ならびに／またはＲＡＳ変異体癌のリスクがあり、もしくはそれに罹りやすい対象、ならびに／または膵癌のリスクがあり、もしくはそれに罹りやすい対象は、ＲＡＳ（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ）において１つまたは複数の変異を示す対象を含む。加えて、対象は、ＴＰ５３、ＣＤＫＮ２Ａ、ＳＭＡＤ４、ＭＬＬ３、ＴＧＦＢＲ２、ＡＲＩＤ１ＡおよびＳＦ３Ｂ１、ＥＰＣ１およびＡＲＩＤ２、ＡＴＭ、ＺＩＭ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＡＬＣＮ、ＳＬＣ１６Ａ４、ＭＡＧＥＡ６、ＲＯＢＯ２、ＫＤＭ６Ａ、ＰＲＥＸ２、ＥＲＢＢ２、ＭＥＴ、ＦＧＦＲ１、ＣＤＫ６、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２などの１つまたは複数において１つまたは複数の点変異を示し得る。Biankin et al., Nature 491(7424): 399-405 (2012);およびWaddell et al., Nature 518(7540):495-501 (2015)。追加としてまたは代替として、対象は、１２個の細胞シグナル伝達経路および過程のコアセットのうちの１つまたは複数において少なくとも１つの変異を示し得る。Jones et al., Science 321(5897): 1801-1806 (2008)。そのような対象は、例えば、当技術分野において知られた診断または予後診断アッセイのいずれかまたはそれらの組合せにより同定することができる。ある特定の実施形態において、ＲＡＳ変異体癌は、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１３Ｒ、Ｇ１３Ａ、Ｇ１３Ｖ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｐ、およびＱ６１Ｅからなる群から選択されるＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、またはＨＲＡＳ変異を含む。

【0084】

予防的適用において、本明細書に開示されたＴＸＮＲＤ１阻害剤を含む医薬組成物または薬物は、（ａ）ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／もしくは活性の増加により特徴づけられる疾患もしくは状態に罹りやすく、もしくはそうでなければ、そのリスクがある対象、ならびに／または（ｂ）ＲＡＳ変異体癌に罹りやすく、もしくはそうでなければ、それのリスクがある対象、ならびに／または膵癌に罹りやすく、もしくはそうでなければ、それのリスクがある対象に、前記疾患の生化学的、組織学的、および／または行動的症状、それの合併症、ならびに前記疾患の発生中に示される中間病理学的表現型を含む、前記疾患のリスクを除去しもしくは低下させ、またはその発症を遅延させるのに十分な量で投与される。予防的ＴＸＮＲＤ１阻害剤の投与は、疾患または障害が防止され、または、代替として、その進行が遅延するように、疾患または障害に特有な症状の顕在化の前に起こり得る。

【0085】

いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤での治療は、以下の症状の１つまたは複数の発症を防止しまたは遅延させるだろう：背中に向かって放射状に広がる上腹部における痛み、食欲不振または意図せぬ体重減少、鬱、初発糖尿病、血栓、疲労、皮膚および白目の黄染（黄疸）、腹部膨満、悪心、ならびに嘔吐。ある特定の実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤で治療される、（ａ）ＴＸＮＲＤ１の発現レベルの上昇および／もしくは活性の増加により特徴づけられる疾患もしくは状態を有する対象、ならびに／または（ｂ）ＲＡＳ変異体癌を有する対象、ならびに／または膵癌を有する対象は、健康な対照対象において観察されたそれらに似ているＴＸＮＲＤ１および／またはＲＡＳ発現レベルを示すだろう。

【0086】

治療的および／または予防的適用について、本明細書に開示されたＴＸＮＲＤ１阻害剤を含む組成物が対象に投与される。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は、１日に１回、２回、３回、４回、または５回、投与される。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は、１日に５回より多く投与される。追加としてまたは代替として、いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は毎日、１日おきに、２日おきに、３日おきに、４日おきに、または５日おきに投与される。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は毎週、隔週に、３週間ごとに、または毎月、投与される。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は１週間、２週間、３週間、４週間、または５週間、投与される。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は６週間以上、投与される。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は１２週間以上、投与される。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は１年未満、投与される。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は１年より長く投与される。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は対象の生涯を通じて投与される。

【0087】

本テクノロジーの方法のいくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は、１週間以上、毎日、投与される。本テクノロジーの方法のいくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は２週間以上、毎日、投与される。本テクノロジーの方法のいくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は３週間以上、毎日、投与される。本テクノロジーの方法のいくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は４週間以上、毎日、投与される。本テクノロジーの方法のいくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は６週間以上、毎日、投与される。本テクノロジーの方法のいくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は、１２週間以上、毎日、投与される。いくつかの実施形態において、ＴＸＮＲＤ１阻害剤は対象の生涯を通じて、毎日、投与される。

【0088】

ＴＸＮＲＤ１阻害剤の生物学的効果の決定
様々な実施形態において、特定のＴＸＮＲＤ１阻害剤の効果、およびそれの投与が治療に適応されるかどうかを決定するために適切なインビトロまたはインビボのアッセイが実施される。様々な実施形態において、インビトロアッセイは、所定のＴＸＮＲＤ１阻害剤が、ＲＡＳ変異体癌の徴候および／または症状を低下させまたは消失させることへの所望の効果を発揮するかどうかを決定するために、代表的な動物モデルを用いて実施することができる。治療に使用するための化合物は、ヒト対象における試験の前に適切な動物モデル系において試験することができ、その動物モデル系には、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、およびその他同種類のものが挙げられるが、それらに限定されない。同様に、インビボ試験について、当技術分野において知られた動物モデル系のいずれかが、ヒト対象への投与の前に用いることができる。いくつかの実施形態において、インビトロまたはインビボ試験は、本テクノロジーの１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤の生物学的機能に向けられる。
ＲＡＳ変異体癌および／または膵癌の動物モデルは、当技術分野において知られた技術を用いて作製され得る（本明細書に記載された実施例７参照）。そのようなモデルは、特定の遺伝子の破損および／または特定のタンパク質の活性の阻害から起こる状態の防止および治療におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤の生物学的効果を実証するために、ならびに所定の状況下で、本明細書に開示された１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤の治療有効量を含むものを決定するために用いられ得る。

【0089】

投与様式および有効投薬量
細胞、器官、または組織を、本明細書に開示された１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤と接触させるための、当技術分野において知られた任意の方法が用いられ得る。適切な方法には、インビトロ、エクスビボ、またはインビボの方法が挙げられる。インビボ方法は、典型的には、哺乳動物、適切にはヒトへの１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤の投与を含む。治療のためにインビボで用いられる場合、本明細書に記載された１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤は、対象に有効量（すなわち、所望の治療効果を生じる量）で投与される。用量および投与計画は、対象の疾患状態の程度、用いられる特定のＴＸＮＲＤ１阻害剤の特性、例えば、それの治療指数、および対象の病歴に依存する。

【0090】

有効量は、医師および臨床医によく知られた方法により前臨床試験および臨床試験中に決定され得る。本方法に有用な１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤の有効量は、それを必要としている哺乳動物へ、薬学的化合物を投与するためのいくつかの周知の方法のいずれかにより投与され得る。ＴＸＮＲＤ１阻害剤は全身性にまたは局所的に投与され得る。
本明細書に記載された１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤は、ＲＡＳ変異体癌の治療もしくは防止のための対象および／または膵癌の治療もしくは防止のための対象への、単独でまたは併用での投与のための医薬組成物へ組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、活性物質および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合した、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤、ならびにその他同種類のものを含む。補足的活性化合物も組成物へ組み込むことができる。

【0091】

医薬組成物は、典型的には、それの意図された投与経路と適合性であるように製剤化される。投与経路の例には、非経口（静脈内、皮内、腹腔内、または皮下）、経口、吸入、経皮（局所的）、眼内、イオン泳動的、および経粘膜の投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下の適用に用いられる溶液または懸濁液は、以下のコンポーネントを含み得る：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などのバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度の調整のための作用物質。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与バイアル中に封入することができる。患者または治療する医師の便宜のために、投薬製剤は、治療コース（例えば、７日間の治療）のために全ての必要な器具（例えば、薬物のバイアル、希釈剤のバイアル、シリンジ、および針）を含有するキットで提供することができる。

【0092】

注射用に適した医薬組成物は、無菌の注射可能な溶液または分散体の即時調製のための無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散体および無菌粉末を含み得る。静脈内投与について、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、非経口投与のための組成物は無菌でなければならず、かつ容易にシリンジで利用できる程度まで流動性であるべきである。それは、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。

【0093】

本明細書に開示された１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤を有する医薬組成物は、担体を含み得、その担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、およびその他同種類のもの）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合では必要とされる粒子サイズの維持により、および表面活性剤の使用により、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメルサール（ｔｈｉｏｍｅｒａｓｏｌ）、およびその他同種類のものにより達成することができる。グルタチオンおよび他の抗酸化剤が、酸化を防ぐために含まれ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことは有利である。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組成物中に含むことにより、もたらされ得る。

【0094】

無菌注射用溶液は、上記で列挙された成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒中に必要とされる量で活性化合物を組み入れ、必要に応じて、その後、濾過滅菌を行うことにより調製することができる。一般的に、分散体は、活性化合物を無菌ビヒクル中へ組み入れることにより調製され、その無菌ビヒクルは基本的な分散媒、および上記で列挙されたものからの必要とされる他の成分を含有する。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の典型的な方法には真空乾燥および凍結乾燥が挙げられ、それらにより、それの前に滅菌濾過された溶液から、活性成分プラス任意の追加の望ましい成分の粉末を産生し得る。

【0095】

経口組成物は、一般的に、不活性な希釈剤または可食性担体を含む。経口治療的投与を目的として、活性化合物は、賦形剤と共に組み入れられ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形をとって用いられ得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のために流動性担体を用いて調製することができる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント材料が組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ、およびその他同種類のものは、以下の成分、または類似した性質の化合物のいずれかを含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅなどの潤滑剤；コロイド二酸化珪素などの流動促進剤；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバーなどの香味剤。

【0096】

吸入による投与について、化合物は、適切な噴霧剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器もしくはディスペンサ、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形をとって送達することができる。そのような方法は、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されたものを含む。
本明細書に記載されているような治療用化合物の全身性投与はまた、経粘膜または経皮手段によることができる。経粘膜または経皮投与について、透過するべきバリアに適した浸透剤が製剤に用いられる。そのような浸透剤は一般的に当技術分野において知られており、それには、例えば、経粘膜投与について、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は鼻腔用スプレーの使用を通して達成することができる。経皮投与について、活性化合物は、当技術分野において一般的に知られているような軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、膏薬（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームへ製剤化される。一実施形態において、経皮投与はイオン泳動により実施され得る。

【0097】

治療剤は、担体系に製剤化することができる。担体はコロイド系であり得る。コロイド系は、リポソーム、リン脂質二重層ビヒクル、または脂質ナノ粒子であり得る。一実施形態において、治療剤は、その剤の構造完全性を維持しながら、リポソーム内にカプセル化される。リポソームを調製するための様々な方法があることを当業者は認識しているだろう（Lichtenberg, et al., Methods Biochem. Anal., 33:337-462 (1988)；Anselem, et al., Liposome Technology, CRC Press (1993)参照）。リポソーム製剤は、クリアランスを遅延させ、かつ細胞取り込みを増加させることができる（Reddy, Ann. Pharmacother., 34(7-8):915-923 (2000)参照）。活性物質はまた、薬学的に許容される成分から調製された粒子へ装荷することができ、その成分には、可溶性、不溶性、透過性、不透過性、生分解性、または胃内滞留型ポリマーまたはリポソームが挙げられるが、それらに限定されない。そのような粒子には、ナノ粒子、生分解性ナノ粒子、微粒子、生分解性微粒子、ナノスフェア、生分解性ナノスフェア、マイクロスフェア、生分解性マイクロスフェア、カプセル、エマルジョン、リポソーム、ミセル、およびウイルスベクター系が挙げられるが、それらに限定されない。

【0098】

担体はまた、ポリマー、例えば、生分解性、生体適合性ポリマーマトリックスであり得る。一実施形態において、治療剤は、その剤の構造完全性を維持しながらポリマーマトリックス内に包埋することができる。ポリマーは、ポリペプチド、タンパク質、もしくは多糖などの天然、またはポリα－ヒドロキシ酸などの合成であり得る。例には、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチン、およびそれらの組合せで作られた担体が挙げられる。一実施形態において、ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）または乳酸／グリコール酸共ポリマー（ＰＧＬＡ）である。ポリマーマトリックスは、様々な形およびサイズで調製および単離することができ、それには、マイクロスフェアおよびナノスフェアが挙げられる。ポリマー製剤は、治療効果の長期持続をもたらすことができる（Reddy, Ann. Pharmacother., 34(7-8):915-923 (2000)参照）。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）についてのポリマー製剤は、臨床試験に用いられている（Kozarich and Rich, Chemical Biology, 2:548-552 (1998)参照）。

【0099】

ポリマーマイクロスフェア徐放性製剤の例は、国際公開第９９／１５１５４号（Ｔｒａｃｙら）、米国特許第５，６７４，５３４号および第５，７１６，６４４号（両方ともＺａｌｅら）、国際公開第９６／４００７３号（Ｚａｌｅら）、ならびに国際公開第００／３８６５１号（Ｓｈａｈら）に記載されている。米国特許第５，６７４，５３４号および第５，７１６，６４４号、ならびに国際公開第９６／４００７３号は、塩による凝集に対して安定化されているエリスロポイエチンの粒子を含有するポリマーマトリックスを記載する。

【0100】

いくつかの実施形態において、治療用化合物は、身体からの急速な排出から治療用化合物を保護する担体と共に調製され、そのような担体は、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤である。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。そのような製剤は、公知の技術を用いて調製することができる。材料もまた、商業的に、例えば、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から入手することができる。リポソーム懸濁液（細胞特異的抗原に対するモノクローナル抗体により特異的細胞を標的とするリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に知られた方法に従って調製することができる。
治療用化合物はまた、細胞内送達を増強するように製剤化することができる。例えば、リポソーム送達系は当技術分野において知られており、例えば、Chonn and Cullis, “Recent Advances in Liposome Drug Delivery Systems,” Current Opinion in Biotechnology 6:698-708 (1995)；Weiner, “Liposomes for Protein Delivery: Selecting Manufacture and Development Processes,” Immunomethods, 4(3):201-9 (1994); and Gregoriadis, “Engineering Liposomes for Drug Delivery: Progress and Problems,” Trends Biotechnol., 13(12):527-37 (1995)参照。Mizguchi, et al., Cancer Lett., 100:63-69 (1996)は、インビボとインビトロの両方における、タンパク質を細胞へ送達するための膜融合性リポソームの使用を記載する。

【0101】

任意の治療剤の投薬量、毒性、および治療効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が有利である。毒性副作用を示す化合物が用いられる場合があるが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小限にして副作用を低下させるために、罹患組織の部位へそのような化合物をターゲットする送達系を設計するように対処するべきである。

【0102】

細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を製剤化することにおいて用いることができる。そのような化合物の投薬量は、ほとんど毒性がなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であり得る。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。本方法に用いられる任意の化合物について、治療有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定された場合のＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように動物モデルに処方することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量を正確に決定するために用いることができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クラマトグラフィーにより測定され得る。

【0103】

典型的には、治療的または予防的効果を達成するのに十分な本明細書に開示された１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤の有効量は、１日あたり体重１キログラムにつき約０．０００００１ｍｇ～１日あたり体重１キログラムにつき約１０，０００ｍｇの範囲である。適切には、投薬量範囲は、１日あたり体重１キログラムにつき約０．０００１ｍｇ～１日あたり体重１キログラムにつき約１００ｍｇである。例えば、投薬量は、毎日、１日おきに、もしくは２日おきに１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または毎週、１週間おきに、もしくは２週間おきに１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。一実施形態において、治療用化合物の単回投薬量は、体重１ｋｇにつき０．００１～１０，０００マイクログラムの範囲である。一実施形態において、担体中の１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤濃度は、送達される１ミリリットルあたり０．２～２０００マイクログラムの範囲である。例示的な治療計画は、１日に１回または１週間に１回の投与を必要とする。治療的適用において、相対的に短い間隔で相対的に高い投薬量が、疾患の進行が低下もしくは終止するまで、または対象が疾患の症状の部分的もしくは完全な寛解を示すまで必要とされる場合がある。その後、患者は予防的計画を施され得る。

【0104】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤の治療有効量は、１０^-32～１０^-6モル濃度、例えば、およそ１０^-7モル濃度の標的組織における阻害剤の濃度として定義され得る。この濃度は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇの全身性用量、または体表面積による等価用量により送達され得る。投与のスケジュールは、標的組織における治療濃度を維持するように、例えば単回の連日または毎週投与によるだけでなく、持続的投与（例えば、非経口注入または経皮適用）を含めて最適化される。
ある特定の因子が、対象を効果的に治療するのに必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを当業者は認識しており、その因子には、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全般的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、本明細書に記載された治療用組成物の治療有効量での対象の治療は、単一の治療または一連の治療を含み得る。

【0105】

本方法に従って治療される哺乳動物は任意の哺乳動物であり得、例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、およびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどのペット動物；ラット、マウス、およびウサギなどの実験動物が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物はヒトである。

【0106】

併用治療
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されたＴＸＮＲＤ１阻害剤の１つまたは複数は、ＲＡＳ変異体癌または膵癌の防止または治療のために１つまたは複数の追加の治療と併用され得る。追加の治療剤には、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（アルブミン結合型パクリタキセル）、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、ＯＮＩＶＹＤＥ（登録商標）（イリノテカンリポソーム注射）、手術、放射線照射、またはそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示された１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤は、免疫治療剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、小胞体ストレス誘導剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、スルホン酸アルキル、白金剤、タキサン、ビンカ剤、抗エストロゲン薬、アロマターゼ阻害剤、卵巣抑制剤、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦ／ＥＧＦＲ阻害剤、ＲＡＳ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、細胞分裂阻害性アルカロイド、細胞傷害性抗生物質、内分泌／ホルモン剤、ビスホスホネート治療剤、フェンホルミン、および標的生物学的治療剤（例えば、米国特許第６３０６８３２号、ＷＯ２０１２００７１３７、ＷＯ２００５０００８８９、ＷＯ２０１００９６６０３などに記載された治療用ペプチド）からなる群から選択される少なくとも１つの追加の治療剤と共に別々に、逐次的に、または同時に投与され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの追加の治療剤は化学療法剤である。

【0107】

特定の化学療法剤には、シクロホスファミド、フルオロウラシル（または５－フルオロウラシルまたは５－ＦＵ）、メトトレキサート、エダトレキサート（１０－エチル－１０－デアザ－アミノプテリン）、チオテパ、カルボプラチン、シスプラチン、タキサン、パクリタキセル、タンパク質結合型パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、タモキシフェン、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、ゲムシタビン、イリノテカン、イキサベピロン、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｍｉｄｅ）、トポテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エリブリン、ムタマイシン（ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）、カペシタビン、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ロイプロリド、アバレリックス、ブセレリン（ｂｕｓｅｒｌｉｎ）、ゴセレリン、酢酸メゲストロール、リセドロネート、パミドロネート、イバンドロネート、アレンドロネート、デノスマブ、ゾレドロネート、トラスツズマブ、ｔｙｋｅｒｂ、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、クラドリビン、ミドスタウリン、ベバシズマブ、オキサリプラチン、メルファラン、エトポシド、メクロレタミン、ブレオマイシン、微小管毒、バンレイシ科アセトゲニン、クロラムブシル、イフォスファミド、ストレプトゾシン、カルムスチン、ロムスチン、ブスルファン、ダカルバジン、テモゾルミド、アルトレタミン、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、ペメトレキセド、エピルビシン、イダルビシン、ＳＮ－３８、ＡＲＣ、ＮＰＣ、カンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、９－アミノカンプトテシン、ルビフェン、ジャイマテカン、ジフロモテカン、ＢＮ８０９２７、ＤＸ－８９５１ｆ、ＭＡＧ－ＣＰＴ、アマサクリン（ａｍｓａｃｎｎｅ）、リン酸エトポシド、テニポシド、アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ）、デシタビン、バッカチンＩＩＩ、１０－デアセチルタキソール、７－キシロシル－１０－デアセチルタキソール、セファロマンニン、１０－デアセチル－７－エピタキソール、７－エピタキソール、１０－デアセチルバッカチンＩＩＩ、１０－デアセチルセファロマンニン、ストレプトゾトシン、ニムスチン、ラニムスチン、ベンダムスチン、ウラムスチン、エストラムスチン、マンノスルファン、カンプトテシン、エキサテカン、ルルトテカン、ラメラリンＤ９－アミノカンプトテシン、アムサクリン、エリプチシン、アウリントリカルボン酸、ＨＵ－３３１、またはそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。

【0108】

代謝拮抗剤の例には、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、６－メルカプトプリン（６－ＭＰ）、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、ペメトレキセド、およびそれらの混合物が挙げられる。

【0109】

タキサンの例には、バッカチンＩＩＩ、１０－デアセチルタキソール、７－キシロシル－１０－デアセチルタキソール、セファロマンニン、１０－デアセチル－７－エピタキソール、７－エピタキソール、１０－デアセチルバッカチンＩＩＩ、１０－デアセチルセファロマンニン、およびそれらの混合物が挙げられる。

【0110】

ＤＮＡアルキル化剤の例には、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ベンダムスチン、ウラムスチン、エストラムスチン、カルムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾトシン；ブスルファン、マンノスルファン、およびそれらの混合物が挙げられる。

【0111】

トポイソメラーゼＩ阻害剤の例には、ＳＮ－３８、ＡＲＣ、ＮＰＣ、カンプトテシン、トポテカン、９－ニトロカンプトテシン、エキサテカン、ルルトテカン、ラメラリンＤ９－アミノカンプトテシン、ルビフェン、ジャイマテカン、ジフロモテカン、ＢＮ８０９２７、ＤＸ－８９５１ｆ、ＭＡＧ－ＣＰＴ、およびそれらの混合物が挙げられる。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の例には、アムサクリン、エトポシド、硫酸エトポシド、テニポシド、ダウノルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、アウリントリカルボン酸、ドキソルビシン、およびＨＵ－３３１、ならびにそれらの組合せが挙げられる。

【0112】

免疫治療剤の例には、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１をターゲットする抗体）、イピリムマブ、９０Ｙ－クリバツズマブテトラキセタン、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、トラスツズマブ、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、ガニツマブ、デムシズマブ、セツキシマブ、ニモツズマブ、ダロツズマブ、シプロイセル－Ｔ、ＣＲＳ－２０７、およびＧＶＡＸが挙げられる。
ＲＡＳ阻害剤の例には、ＡＭＧ ５１０、ＭＲＴＸ８４９、ＡＲＳ－３２４８、ＢＩ １７０１９６３、ＡＲＳ－１６２０、ＡＲＳ－８５３、チオール反応性ＧＤＰアナログ、ＢＢＰ－４５４、ｍＲＮＡ－５６７１、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ阻害剤、およびその他同種類のものが挙げられる。
いずれの場合においても、複数の治療剤が、任意の順序で、またはさらに同時に、投与されてもよい。同時である場合には、複数の治療剤は、単一の一体化された形をとって、または複数の形をとって、提供され得る（ほんの一例として、単一の丸剤としてかまたは２つの別々の丸剤としてのいずれか）。治療剤の一方が複数回用量で与えられ得、または両方が複数回用量として与えられ得る。同時ではない場合には、複数回用量間のタイミングは０週間より長くから４週間未満まで変動し得る。加えて、併用方法、組成物、および製剤は、２つの作用物質だけの使用に限定されるべきではない。

【0113】

キット
本開示はまた、１つまたは複数のＴＸＮＲＤ１阻害剤を含む、ＲＡＳ変異体癌（例えば、ＲＡＳ変異体膵癌）の防止および／または治療のためのキットを提供する。任意で、本テクノロジーのキットの上記のコンポーネントが、適切な容器内にパッキングされ、ＲＡＳ変異体癌（例えば、ＲＡＳ変異体膵癌）の防止および／または治療用にラベルを貼られる。

【0114】

上記で言及されたコンポーネントは、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封されたアンプル、バイアル、ボトル、シリンジ、および試験管内に、水性の、好ましくは無菌の、溶液として、または再構成のための凍結乾燥した、好ましくは無菌の、製剤として、保存され得る。キットはさらに、医薬組成物をより大きい体積へ希釈するのに適した希釈剤を保持する第２の容器を含み得る。適切な希釈剤には、医薬組成物の薬学的に許容される賦形剤および生理食塩水が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、キットは、医薬組成物を希釈するための説明書、および／または希釈されるかどうかに関わらず、医薬組成物を投与するための説明書を含み得る。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって突き通し得るストッパーを有する、静注溶液バッグまたはバイアルであり得る）。キットはさらに、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む追加の容器を含み得る。それは、商業的およびユーザー的観点から望ましい他の材料をさらに含み得、それには、適切な宿主のうちの１つまたは複数のための他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、培地が挙げられる。キットは、任意で、例えば、そのような治療用または診断用製品の使用に関する、適応症、用法、投薬量、製造、投与、禁忌、および／または警告についての情報を含有する、治療用または診断用製品の市販パッケージに通例、含まれる使用説明書を含み得る。

【0115】

キットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤、または安定剤を含み得る。キットはまた、アッセイし、かつ試験試料と比較することができる対照試料または一連の対照試料を含有し得る。キットの各コンポーネントは、個々の容器内に封入することができ、その様々な容器の全部が、そのキットを用いて実施されるアッセイの結果を解釈するための使用説明書と共に、単一のパッケージ内にあり得る。本テクノロジーのキットは、キット容器上または中に書面を含有し得る。書面はキットに含有される試薬を使用する方法を記載する。ある特定の実施形態において、試薬の使用は本テクノロジーの方法に従い得る。

【実施例】

【0116】

本テクノロジーは、以下の実施例によりさらに例証されるが、実施例は、決して、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書における実施例は、本テクノロジーの利点を例証するために、および本テクノロジーの組成物およびシステムを調製または使用することに関して当業者をさらに助けるために提供される。実施例は、添付の特許請求の範囲により定義されているような本テクノロジーの範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。実施例は、上記の本テクノロジーのバリエーション、態様、または実施形態のいずれかを含みまたは組み入れることができる。上記のバリエーション、態様、または実施形態はまたさらに、それぞれ、本テクノロジーのいずれかまたは全部の他のバリエーション、態様、または実施形態のバリエーションを含みまたは組み入れ得る。以下の実施例は、ＴＸＮＲＤ１発現および／または活性を阻害する本テクノロジーの例証となる組成物の調製、特徴づけ、および使用を示している。

【0117】

（実施例１）
実験材料および方法
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑカウントデータの前処理。１０×シーケンシングにより作成された生のＨＧＮＣアラインメントされたＵＭＩカウントマトリックスを、下流分析パイプラインにおいて分析する前に、前処理およびスケーリングした。低存在量の遺伝子（例えば、平均カウント＜０．２５）および細胞の１０％未満におけるリードを有する遺伝子、加えて、全遺伝子の１０％未満についてのゼロでないリードを有する細胞を、カウントマトリックスから除去した。個々の細胞間のシーケンシング深度における矛盾を調整するために、次の分析において進める前に、場合によってはカウントマトリックスを正規化し、スケーリングした。正規化の方法は以下を含むが、それらに限定されない：１）全細胞にわたって深度中央値を一致させるために細胞レベルのカウント数を全体的にスケーリングすること（スカラー調整）、および２）個々の細胞についての固有のスケーリング因子を得るために連立一次方程式を解くこと。場合によっては、試料バッチ間効果を相互最近傍アルゴリズムによって補正した。

【0118】

教師つき次元削減。治療標的をコンピュータ的に同定するために、高次元カウントデータを、より低次元の潜在空間へマッピングした。潜在空間を、純粋な細胞型（例えば、膵臓腺癌、導管細胞、および腺房細胞）の収集物に対して、細胞型が縮退のための教師つきラベルとして働く教師つき次元削減によって構築した。このようにして、潜在空間は、癌細胞と初代細胞との分離可能性を最大限にした。場合によっては、必須遺伝子（例えば、ＲＮＡｉまたはＣＲＩＳＰＲによるＰＣＮＡまたはＭＣＭ６）でターゲットされる細胞もまた、「毒性」の領域を定義するために、潜在空間の構築に含めた。例えば遺伝子をノックダウンした場合に顕現化される毒性は、初代細胞においてアポトーシスを誘導した。モデル訓練後、ＣＲＩＳＰＲ標的候補に関して問い合わせられた細胞を、それらの転写の野生型発現プロファイルへのシフト（治療指数）を定量化するために、純粋な細胞型から構築された同じ潜在空間へマッピングした。

【0119】

教師つき次元削減のためにいくつかのアルゴリズムを用いた。場合によっては、潜在空間についての次元の最適な数を決定するために、Ｅｌｂｏｗ方法（Richards et al., J Shoulder Elbow Surg 8(4): 351-354 (1999)）を用いた。

【0120】

治療指数のスコアリング。プールされたＣＲＩＳＰＲｉライブラリにより問い合わせられた標的遺伝子を、癌細胞の転写プロファイルをシフトして野生型様発現状態へ戻すそれらの能力に関して定量化した（治療指数）。遺伝子を、機械学習アルゴリズムによってスコアリングした。簡単に述べれば、別々の１クラス機械学習アルゴリズムを異なる細胞型の潜在性発現プロファイルに関して訓練し、その細胞型には、１）膵管細胞；２）膵腺房細胞；３）膵臓腺癌；および４）毒性についてのモデルとして（ＣＲＩＳＰＲ／ＲＮＡｉにより）ターゲットされる必須遺伝子（例えば、ＰＣＮＡまたはＭＣＭ６）を有する膵臓腺癌が挙げられるが、それらに限定されない。その後、訓練された機械学習モデルのそれぞれを用いて、ＣＲＩＳＰＲｉライブラリでターゲットされたシングルセルの潜在性発現プロファイルに適用される決定関数のアウトプットに基づいた候補遺伝子をスコアリングした。場合によっては、決定関数推定についてのブートストラップ信頼区間を構築するために、細胞を繰り返し、復元サンプリングした。

【0121】

２－Ｄプールドネガティブ選択ＲＮＡｉスクリーニング。以前に記載されているように（Huang et al., Genes Dev. 28(16): 1800-1814 (2014)）、４４２個の薬物標的遺伝子に焦点を置いたカスタムｓｈＲＮＡライブラリ（２２４５個のｓｈＲＮＡ、遺伝子あたり５～６個）を設計および構築した。そのライブラリを、ＴＲＭＰＶ－Ｎｅｏベクターへクローニングし、Ｔｅｔ－Ｏｎマウス膵管腺癌（ｍＰＤＡＣ）細胞（Ｋｒａｓ^G12D；Ｍｙｃ；ｓｈｐ５３）へ形質導入した．Lito et al., Cancer Cell 25(5):697-710 (2014)。ライブラリの形質導入に用いられた条件は、主に単一のレトロウイルス組込みをもたらし、少なくとも１０００個の細胞の計算された数において各ｓｈＲＮＡを表現した。形質導入細胞を、１ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて５日間、選択した。各継代において、実験を通じてライブラリ表現を保存するために、２千万個より多い細胞を維持した。薬物選択後、Ｔ０試料を得て（レプリケートあたり２千万個の細胞）、Ｖｅｎｕｓ⁺細胞について選別した。１２日後（６継代、Ｔ１２）、２千万個のｓｈＲＮＡ発現（ｄｓＲｅｄ⁺ Ｖｅｎｕｓ⁺）細胞を各レプリケートについてＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別した。Ｔ０およびＴ１２試料からのゲノムＤＮＡを、ＰｈａｓｅＬｏｃｋチューブ（５ Ｐｒｉｍｅ）を用いるフェノール抽出の２ラウンド、続いてイソプロパノール沈澱により単離した。

【0122】

その後、ｍＰＤＡＣスクリーニングから得られた結果を、Ｍｙｃ；ｐ５３^-/-マウス肝細胞癌（ｍＨＣＣ）細胞から得られた結果（Huang et al., Genes Dev. 28(16): 1800-1814 (2014)）と比較し、２次元ＲＮＡｉスクリーニングプロットを構築した。例えば、図３Ａ参照。
プラスミド。条件付きＲＮＡｉ実験について、以前に記載されている（Zuber et al., Nat Biotechnol. 29(1):79-83 (2011)；Fellmann et al., Cell Rep 5(6): 1704-1713 (2013)）ｍｉＲ－ＥかまたはｍｉＲ－３０のいずれかのバックボーン由来のＴＲＭＰＶ－ＮｅｏベクターからｓｈＲＮＡを発現させた。ノックダウン効率または過剰発現をイムノブロッティングにより評価した。

【0123】

イムノブロッティング。細胞ペレットを、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．８、５％グリセロール、２％ＳＤＳ、５％２－メルカプトエタノール）中に溶解した。等量のタンパク質を、１２％ ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、ＰＶＤＦ膜へ９０Ｖ下で１２０分間転写した。同等の装荷を保証するために、β－アクチンの存在量をモニターした。画像をＡｌｐｈａＶｉｅｗソフトウェア（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いて分析した。イムノブロッティングを、ＴＸＮＲＤ１（ＴｒｘＲ１）（１：１０００、ｓｃ－２８３２１、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＫＲＡＳ（１：２００、ＷＨ０００３８４５Ｍ１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはβ－アクチン－ＨＲＰ（１：１００００、Ａ３８５４、Ｓｉｇｍａ）に対する抗体を用いて実施した。

【0124】

増殖アッセイ。ＴＲＭＰＶ－Ｎｅｏベクター（ｍｉＲ－３０またはｍｉＲ－Ｅバックボーンを有する）におけるｓｈＲＮＡを用いる競合増殖アッセイを、以前記載されているように（Huang et al., Genes Dev. 28(16): 1800-1814 (2014)）実施した。オーラノフィンまたはピペルロングミンによるインビトロ成長阻害についてのアッセイを、漸増濃度のオーラノフィンまたはピペルロングミンの存在下での７２時間の細胞のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて生細胞数をカウントすることにより実施した。７２時間目における生細胞数を０時間目における生細胞数で割ることにより増殖速度を計算した。ビヒクル処理細胞の増殖速度に対して正規化することにより相対的増殖速度を計算した。

【0125】

動物試験。この試験に記載された全ての実験手順は、プロトコール番号１１－０６－０１６および１１－０６－０１８においてＭｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＹ）における動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ））により承認された。マウスは、特定の病原体を除去した条件下で維持され、食物および水を自由に与えられた。
インビボの条件付きＲＮＡｉ実験。Ｔｅｔ－ＯｎマウスＰＤＡＣ細胞にルシフェラーゼ－ｈｙｇｒｏおよびＴＲＭＰＶ－Ｎｅｏ－ｍｉＲ－Ｅ ｓｈＲＮＡ構築物を形質導入した。１００万個のマウスＰＤＡＣ細胞を、雌ヌードレシピエントマウス（ＮＣＲ ｎｕ／ｎｕ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入）へ正所性に移植した。全身生物発光画像化について、マウスに５０ｍｇ／ｋｇ Ｄ－ルシフェリン（Ｇｏｌｄｂｉｏ）を腹腔内に注射し、１０分後、ＩＶＩＳスペクトルシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。マウス躯幹および四肢を網羅する標準化された関心対象の円領域に関して、定量化をＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。ｓｈＲＮＡ誘導について、動物を、飲料水（２％スクロースを含む２ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および食物（６２５ｍｇ／ｋｇ、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中のドキシサイクリンで処置した。

【0126】

インビボの薬物治療実験。オーラノフィン治療試験について、１６ｍｇオーラノフィンをまず４ｍＬエタノール中に溶解し、その後、１２ｍＬ ＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈した。マウスに毎日、オーラノフィン（１０ｍｇ／ｋｇ）または類似した体積のビヒクルを腹腔内注射により与えた。病気の動物を犠牲にし、膵臓組織および腫瘍をさらなる分析に用いた。

【0127】

ＲＮＡシーケンシングおよび遺伝子セットエンリッチメント分析（ＧＳＥＡ）分析。ＲＮＡシーケンシングについて、対照ウミシイタケルシフェラーゼまたはＴＸＮＲＤ１をターゲットするｓｈＲＮＡを含むｍＰＤＡＣ細胞由来の全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ Ｃｏｌｕｍｎｓ ａｎｄ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリ構築およびシーケンシングを、ＭＳＫＣＣにおけるＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ（ＩＧＯ）Ｃｏｒｅにより用いられるプロトコールに従って実施した。レプリケート試料あたり５００～１０００万個のリードが獲得された。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Bolger et al., 2014）でアダプター配列を除去した後、ＲＮＡ－ｓｅｑリードを、ＳＴＡＲアラインメントツール（Dobin et al., 2013）を用いてＧＲＣｈ３７．７５（ｈｇ１９）に対してアラインメントした。ゲノムワイド転写産物カウンティングをＨＴＳｅｑにより実施して、ＦＰＫＭマトリックスを作成した（Anders et al., 2015 Bioinformatics）。遺伝子セットエンリッチメント分析（Subramanian et al., 2005）を、ＧＳＥＡ ｖ２．０７ソフトウェアを用いて実施した。

【0128】

統計。データは、特に断りのない限り、平均±標準偏差として提示されている。群間の統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定により計算された。補正は、Ｐｅａｒｓｏｎ検定により計算された。Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアは、ＩＣ₅₀値を計算するために用いられた。有意値はＰ＜０．０５（^*）、Ｐ＜０．０１（^**）、およびＰ＜０．００１（^***）である。場合によってはＶｏｌｃａｎｏプロットが作成された。

【0129】

遺伝子依存性の分析。全てのヒートマップについて用いられたヒト癌細胞株全ゲノムｓｇＲＮＡスクリーニングのデータは、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅｃｒｉｓｐｒ． ｄｋｆｚ．ｄｅ／からであった。Ｌｏｇ２ＦＣ（ｌｏｇ変換での存在量倍数変化）を用いて、各実験における各遺伝子についての遺伝子依存性スコアを計算した。遺伝子依存性スコアを、同じ遺伝子をターゲットする全ｓｇＲＮＡのＬｏｇ２ＦＣの平均をとることにより計算した。「Ｐｈｅａｔｍａｐ」Ｒパッケージを用いる教師なしクラスター化を用いて、可視化のために類似した表現型を有する遺伝子をクラスター化した。
オーラノフィンに対する感受性における倍数変化の決定および薬物相乗作用の定量分析。半有効原理および併用指数－アイソボログラム定理に基づいている、ＣｏｍｐｕＳｙｎソフトウェア（バージョン１．０）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｍｂｏｓｙｎ．ｃｏｍ）を用いて、薬物相乗作用を分析した。併用指数（ＣＩ）値ＣＩ＞１はアンタゴニズムを示す；ＣＩ＝０．７５～１．２５は、相加効果を示す；および＜１は相乗作用を示す。各ＧＩ（成長阻害）またはＣＩスコアは、少なくとも３つの独立した実験からのデータを表す。

【0130】

オーラノフィン薬物動態。９匹のＮＣＲ ｎｕ／ｎｕマウスにおいて、１０ｍｇ／ｋｇオーラノフィン懸濁液の単一用量の腹腔内注射による投与後、金の血漿および膵臓薬物動態を分析した。金濃度の決定についての血漿および膵臓試料を、オーラノフィンの投与後２時間目、４時間目、および２４時間目に取得した。収集された血漿および膵臓試料を、金濃度を定量化するために誘導結合型プラズマ質量分析（ＩＣＰＭＳ）方法を用いて分析した。

【0131】

（実施例２）
Ｋｒａｓ変異体膵癌における新規な標的のコンピュータによる発見および検証
図１Ａ～１Ｂは、ＲＡＳ変異体膵癌における治療標的のコンピュータによる発見についてのパイプラインを提供する。図１Ａに示されているように、Ｋｒａｓ変異体膵臓細胞株を、低い感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入されるＣＲＩＳＰＲｉライブラリを用いてスクリーニングした。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ機器（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）および酵素キット（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて、シングルセルのトランスクリプトームを単離し、ＤＮＡライブラリへ変換し、Ｈｉｓｅｑ４０００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてシーケンシングした。個々の細胞のシングルセルＲＮＡシーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）プロファイルを、それらのそれぞれのＣＲＩＳＰＲ標的へ、ペアエンドシーケンシングにより、およびバーコードを用いてマッチングした。ＦＡＳＴＱ形式における生リードを、全ゲノムに関してアラインメントし、各細胞についての適切なゲノム座標およびＨＧＮＣ遺伝子へマッピングし、Ｎ個の細胞×Ｍ個の遺伝子で構成されるカウント行列を生じた（図１Ａ参照）。このＮ×Ｍ行列をさらに、教師つき次元削減によってＮ×５０行列へ縮退した（図１Ａ参照）。純粋な細胞型（例えば、癌細胞、導管細胞、腺房細胞、または陰性対照としての役割を果たす非ターゲティング化ガイドＲＮＡを発現する癌細胞）を同定するように次元削減モデルを訓練し、その結果、より低次元の潜在空間が、健康な細胞と癌細胞をお互いから最大限に分離させた（図１Ａ～２Ａ参照）。ｍＲＮＡ発現パターンを陰性対照から離れて、かつ健康な細胞（導管細胞または腺房細胞）へ最大限に動かすＣＲＩＳＰＲ標的を発現する細胞をこのアルゴリズムを用いて同定し、そのようなＣＲＩＳＰＲ標的は前臨床開発において探求される最も有望な標的を構成した。

【0132】

図１Ａ～１Ｂに示されているように、機械学習アルゴリズムを用いて治療指数を定量化した。簡単に述べれば、異なる細胞集団を同定するように別々の機械学習モデルを訓練し、その細胞集団には、１）膵管細胞（治療指数についての陽性対照）；２）膵腺房細胞（治療指数についての陽性対照）；３）非標的ガイドＲＮＡを発現するＫｒａｓ変異体ＰＤＡＣ細胞（治療指数についての陰性対照）；および４）ターゲットされる必須遺伝子を発現するＫｒａｓ変異体ＰＤＡＣ細胞（毒性標的についての陽性対照）が挙げられる。図１Ａ～１Ｂに示されているように、その後、ＣＲＩＳＰＲｉ標的を発現するＫｒａｓ変異体ＰＤＡＣ細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータに訓練された機械学習モデルを適用して、膵腺房細胞と類似し、かつ治療指数についての陰性対照を発現するＫｒａｓ変異体ＰＤＡＣ細胞とは識別できるＲＮＡ－ｓｅｑプロファイルを示す細胞を検出した。そのような細胞により発現したＣＲＩＳＰＲｉ標的のアイデンティティを、ペアエンドシーケンシングおよびバーコードに基づいて同定した。前臨床開発において探求するために最大治療指数を有する標的を選択した。

【0133】

（実施例３）
ＫＲＡＳ変異体膵癌における治療標的としてのＴＸＮＲＤ１のコンピュータによる同定
図１Ｂに示されているように、ＣＲＩＳＰＲｉ標的を発現する個々のＫｒａｓ変異体ＰＤＡＣ細胞のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑプロファイルを、上記のように２つの非標的ガイドＲＮＡ、毒性標的、および健康な導管細胞株について訓練された機械学習アルゴリズムの決定関数を用いて分析した。決定関数のアウトプットをさらに様々な方法によって変換した。その方法として、対照集団と比べた効果量、Ｋ．Ｓ．統計値、ｚスコア、またはｐ値が挙げられるが、それらに限定されない。複数の機械学習アルゴリズムおよびレプリケートにわたるスコアをさらに様々な方法によって統合した。その方法として、平均、加重平均、ランク統合、加重ランク統合、Ｓｔｏｕｆｆｅｒ法（ｚスコア）、およびＦｉｓｃｈｅｒ法（ｐ値）が挙げられるが、それらに限定されない。

【0134】

図２Ａに示されているように、膵腺房細胞に類似したＲＮＡ－ｓｅｑプロファイルを示すようにＫｒａｓ変異体ＰＤＡＣ細胞を形質転換するＣＲＩＳＰＲｉ標的としてＴＸＮＲＤ１が同定された。細胞型集団の分布を、機械学習アルゴリズムを用いて、教師つき次元削減後の一次元に沿って分析し、プロットした。図２Ａに示されているように、ＴＸＮＲＤ１をターゲットするガイドＲＮＡを発現するＫｒａｓ変異体ＰＤＡＣ細胞（Ｎ＝８７）は、健康な導管細胞へのシフトを示した（Ｎ＝６００）。比較により、無効なＣＲＩＳＰＲｉ標的（非ターゲティングガイドＲＮＡ）を発現するＫｒａｓ変異体ＰＤＡＣ細胞（Ｎ＝１２２）は、大部分、癌細胞のプロファイルと重複した。図２Ｂに示されているように、機械学習アルゴリズムからの４つの決定関数にわたって平均されたＴＸＮＲＤ１のｚ変換された治療指数は、上位２０個の候補標的のうち最も高かった。同様に、図２Ｃに示されているように、ＴＸＮＲＤ１は、５０個を超える候補標的のパネルの中で治療指数についての最も高い加重平均決定関数スコアを示した。

【0135】

（実施例４）
２－Ｄ ＲＮＡｉスクリーニングアプローチによる治療標的としてのＴＸＮＲＤ１の同定
ＫＲＡＳ変異体ＰＤＡＣの維持に必須である薬物標的を選択的に同定するために、既知の薬物標的に方向づけられた低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のカスタムライブラリを、遺伝学的に定義されたマウスＨＣＣモデル（Ｋｒａｓ^G12D；Ｍｙｃ；ｓｈｐ５３）においてネガティブ選択についてスクリーニングした。結果を、マウスＨＣＣモデル（Ｍｙｃ；ｐ５３^-/-）からの以前のネガティブ選択結果（Huang et al., Genes Dev. 28(16): 1800-1814 (2014)）と交差分析した。図３Ａに示されているように、Ｔｘｎｒｄ１、Ａｃｐｐ、およびＡｍｔをターゲットするｓｈＲＮＡが、両方の細胞株において未変化のままであった陰性対照ｓｈＲＮＡと比較して、Ｋｒａｓ変異体ＰＤＡＣ細胞において選択的に枯渇していることが見出された。比較において、陽性対照ｓｈＲＮＡはマウスＨＣＣとマウスＨＣＣの両方において枯渇していた（図３Ａ参照）。

【0136】

ｍＰＤＡＣ、ｍＨＣＣ、およびｉＭＥＦにおいて定量化された特定のｓｉＲＮＡを発現する細胞の枯渇を検出するために、これらの細胞に、Ｔｘｎｒｄ１、Ａｃｐｐ、Ａｍｔ、および対照に対する誘導性ｓｈＲＮＡ：Ｒｅｎ．７１３（陰性対照としての役割を果たす非ターゲティングｓｈＲＮＡ）、Ｒｐａ３．５６１（全ての増殖細胞における成長阻害についての陽性対照）、Ｋｒａｓ．２４７（ｍＰＤＡＣ特異的成長阻害についての陽性対照）を有するウイルスを形質導入した。これらのｓｈＲＮＡを発現する細胞のパーセンテージを、ｓｈＲＮＡ誘導の０日目および１２日目に決定した。ｓｈＲＮＡを発現する細胞のパーセンテージの減少は、ｓｈＲＮＡの阻害効果を示した。図３Ｂに示されているように、（ウミシイタケルシフェラーゼに対する）非ターゲティング陰性対照であるｓｈＲＮＡ Ｒｅｎ．７１３は、いずれの細胞においても効果を生じず、陽性対照ｓｈＲＮＡ Ｒｐａ３．５６１は、試験された全ての細胞型において枯渇した。ｍＰＤＡＣ特異的陽性対照Ｋｒａｓ．２４７は、ｍＨＣＣおよびｉＭＥＦと比較してｍＰＤＡＣにおいて枯渇した。図３Ｂに示されているように、Ｔｘｎｒｄ１、Ａｃｐｐ、およびＡｍｔに対するｓｈＲＮＡは、陰性対照と比較して、Ｋｒａｓ変異体ＰＤＡＣ細胞（Ｋｒａｓ^G12D；Ｍｙｃ；ｓｈｐ５３）において阻害効果を示したが、ｍＨＣＣ細胞（Ｍｙｃ；ｐ５３^-/-）においても形質転換されていない不死化マウス胚線維芽細胞（ｉＭＥＦ）においても示さなかった。Ｔｘｎｒｄ１ ｓｈＲＮＡの効果は、ＡｃｐｐまたはＡｍｔをターゲットするｓｈＲＮＡより顕著であった。図３Ｂに示されたウェスタンブロットは、ｓｈＲＮＡが、それらがターゲットするタンパク質の量を低下させたことを示している。したがって、このアッセイもまた、Ｔｘｎｒｄ１を有望な標的として同定した。ＲＡＳ機能獲得変異（例えば、コドン１２、１３、または６１における）がＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳアイソフォームの中で１００％のアミノ酸配列同一性を共有する領域に起こると仮定すれば（Prior et al.、Cancer Research 72(10) (2012)参照）、ＴＸＮＲＤ１の阻害は、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳ変異と関連した癌を治療すると予測される。

【0137】

ＴＸＮＲＤ１依存性をさらに様々な細胞株において調べた。図６Ａ～６Ｂに示されているように、複製遺伝子ＲＡＰ１またはＰＣＮＡをノックアウトまたはノックダウンすることは、結果としてほとんど全部の細胞株への全般的な致死性を生じた。対照的に、ＴＸＮＲＤ１は、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、およびＮＲＡＳについて類似した依存性を示すある特定の細胞株に条件的に必要とされる。

【0138】

これらの結果は、本テクノロジーのＴＸＮＲＤ１阻害剤組成物が、それを必要としている対象においてＲＡＳ発現のレベルの上昇および／またはＴＸＮＲＤ１発現のレベルの上昇により特徴づけられる疾患または状態を治療するための方法に有用であることを実証している。

【0139】

（実施例５）
ＫＲＡＳ変異体ＰＤＡＣ成長は薬理学的ＴＸＮＲＤ１阻害に感受性がある
小分子薬物を用いた膵癌におけるＴＸＮＲＤ１の薬理学的阻害の効果を評価するために、ミリセチン、マニュマイシンＡ、プロトポルフィリンＩＸ、およびオーラノフィンによる阻害研究に取り組んだ。

【0140】

オーラノフィンは、ＴＸＮＲＤ１の酵素活性の阻害剤である（Gromer et al., J Biol Chem 273(32): 20096-20101参照）。ミリセチン、マニュマイシンＡ、およびプロトポルフィリンＩＸもまた、ＴＸＮＲＤ１の酵素活性の阻害剤である。ｍＰＤＡＣ細胞を、ＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンまたはＤＭＳＯで７２時間処理し、生存率を測定した。ＤＭＳＯ処理は、成長阻害の欠如を引き起こす陰性対照としての役割を果たした。ＤＭＳＯ処理細胞の生細胞数を１に設定した。ＤＭＳＯ処理細胞の生存率に対して正規化された、オーラノフィン処理細胞の生存率をオーラノフィン濃度の関数としてプロットし、指数関数的成長曲線にフィッティングした。ミリセチン、マニュマイシンＡ、およびプロトポルフィリンＩＸのそれぞれもまた、類似した処理に供した。
図３Ｄに示されているように、オーラノフィンはμＭ以下の濃度でｍＰＤＡＣ細胞の成長を阻害した。これらの結果は、本テクノロジーのＴＸＮＲＤ１阻害剤組成物が、それを必要としている対象において、ＲＡＳ変異、ＲＡＳ発現のレベルの上昇、および／またはＴＸＮＲＤ１発現のレベルの上昇により特徴づけられる疾患または状態を治療するための方法に有用であることを実証している。

【0141】

（実施例６）
ＫＲＡＳ状態がＴＸＮＲＤ１阻害に対する応答を予測する
上記で論じられたスクリーニングシステムおよび図１Ａ～３Ｂは、変異体Ｋｒａｓ、ｐ５３欠損、およびＭｙｃ過剰発現により駆動されたため、いずれかの遺伝子の変化がＴＸＮＲＤ１阻害に対する感受性を決定づけるのかどうか調べた。１２個の膵癌細胞株を、増加性濃度のオーラノフィンまたはＤＭＳＯで処理した。この実験に用いられる細胞株の中で、Ｌ３．３、Ｃｏｌｏ３５７、およびＢＸＰＣ３が野生型ＫＲＡＳを有する。細胞株ＰＡＮＣ０３２７、ＭＩＡＰａＣａ－２、ＰＡＮＣ０２１３、ＡＳＰＣ１、８８９８、ＣＦＰＡＣ－１、Ｌ３．６ｐｌ、ＰＡＮＣ１、およびＳＵ８６８６は、ＫＲＡＳ変異を含んだ。図３Ｅに示されているように細胞株間で変動があったが、ＫＲＡＳ変異体細胞は、一般的に、野生型ＫＲＡＳ細胞よりオーラノフィンに対してより感受性が高かった。

【0142】

野生型ＫＲＡＳ細胞の感受性とＫＲＡＳ変異体細胞の感受性の間で観察された差が、統計的に有意であるかどうかを理解するために、オーラノフィンによるＴＸＮＲＤ１阻害に対するヒトＰＤＡＣ細胞株の相対的感受性のＩＣ₅₀データを比較した。図４Ａに示されているように、ＴＸＮＲＤ１阻害に対する抗増殖性応答とＫＲＡＳ変異状態との間に有意な相関が見出された。対照的に、図４Ｂ～４Ｃに示されているように、ＴＸＮＲＤ１阻害に対する応答と、Ｐ５３変異状態またはＭＹＣ ｍＲＮＡ発現との間に有意な相関はなかった。ＫＲＡＳ変異（Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ）のオーラノフィン感受性への効果を理解するために、異なるＫＲＡＳ変異（Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ）を含むヒト膵癌細胞または野生型を、別のＴＸＮＲＤ１阻害剤ピペルロングミンで処理した。図４Ｄに示されているように、ＫＲＡＳ変異体細胞は、野生型ＫＲＡＳ細胞よりピペルロングミンに対してより感受性が高く、上記の所見をさらに強化した。
ＫＲＡＳの発現とＴＸＮＲＤ１の発現の間に相関があるかどうかを理解するために、両方のこれらの遺伝子の発現を、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＴＣＧＡ）からの１４９個のヒト膵癌腫瘍において定量化し、散布図として示した。図４Ｅに示されているように、ＴＸＮＲＤ１発現レベルとＫＲＡＳ発現レベルの間の相関が観察された（ｒ＝０．３６、ｐ＜０．０００１）。

【0143】

ＰＤＡＣ細胞におけるＴＸＮＲＤ１抑制の分子機構を理解するために、対照ウミシイタケまたはＴｘｎｒｄ１をターゲットするｓｈＲＮＡを含むｍＰＤＡＣ細胞のＲＮＡ－ｓｅｑ分析を実施した。図４Ｆ～４Ｇに示されているように、Ｃｄｋ９の抑制は、ＫＲＡＳ依存性（図４Ｆ）と膵癌シグネチャ（図４Ｇ）の両方の復帰変異を生じ、ＴＸＮＲＤ１がＫＲＡＳ発癌性シグナル伝達に必要とされるという所見をさらに確証した。興味深いことに、図４Ｈに示されているように、ＴＸＮＲＤ１の抑制は、ＳＬＣ７Ａ１１と呼ばれる遺伝子を含むアミノ酸輸送体およびフェロトーシスに関係した遺伝子シグネチャの下方制御を示した。

【0144】

これらの結果は、本テクノロジーのＴＸＮＲＤ１阻害剤組成物が、それを必要としている対象において、ＲＡＳ発現のレベルの上昇および／またはＴＸＮＲＤ１発現のレベルの上昇により特徴づけられる疾患または状態を治療するための方法に有用であることを実証している。

【0145】

（実施例７）
ＴＸＮＲＤ１はＫＲＡＳ変異体膵腫瘍の維持に必要とされる
インビボでのＴＸＮＲＤ１のＰＤＡＣ進行への関連性もまた調べた。樹立膵腫瘍においてＴｘｎｒｄ１を抑制するために、ｍＰＤＡＣ細胞に、ルシフェラーゼ、およびＴｘｎｒｄ１ ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを含有するｄｏｘ誘導性ＴＲＭＰＶ－Ｎｅｏ－ｍｉＲ－Ｅ構築物（ウミシイタケおよびＫｒａｓ）を形質導入し、レシピエントマウスの膵臓へ正所性注射により移植した（図５Ａ参照）。発光シグナルの検出時点で、対応するｓｈＲＮＡ発現を誘導するために動物をｄｏｘ無しまたは有りで処理した。図５Ｃに示されているように、生物発光画像化により、未処置群（ｄｏｘ無し）由来のマウスは７日目までに大きな膵腫瘍を示すことが明らかにされた。対照的に、Ｔｘｎｒｄ１またはＫｒａｓのノックダウンは腫瘍成長における同等の遅延をもたらした。したがって、Ｔｘｎｒｄ１のＲＮＡｉ媒介性抑制は、インビボでＫｒａｓ変異体ＰＤＡＣで抗腫瘍効果を誘発することにおいてＫｒａｓ阻害の効果に近似している。腫瘍質量を、対応するｓｈＲＮＡを誘導するためにドキシサイクリン有りまたは無しで処置された動物から定量化した（ｎ＝４～５）。図５Ｂに示されているように、未処置群（ｄｏｘ無し）由来のマウスからの腫瘍質量は、腫瘍成長における同等の遅延をもたらしたＴｘｎｒｄ１またはＫｒａｓのノックダウンを有するマウスと比較して、より大きい膵腫瘍を示した。Ｒｅｎ．７１３Ｅを発現する腫瘍の質量は、ドキシサイクリン処置によって影響されなかった（図５ＢのＲｅｎ．７１３列におけるレプリケートの２セットを比較する）。Ｔｘｎｒｄ１ ｓｈＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｓｈＲＮＡを発現する腫瘍の質量は、ドキシサイクリン処置により同程度で阻害された（図５ＢのＴｘｎｒｄ１．２０５７Ｅ、Ｔｘｎｒｄ１．１４７４Ｅ、およびＫＲａｓ．２４７の列における群間および群内のレプリケートの２セットを比較する）。

【0146】

これらの結果は、本テクノロジーのＴＸＮＲＤ１阻害剤組成物、例えば、ＴＸＮＲＤ１の発現を阻害する作用物質が、それを必要としている対象においてＲＡＳ変異体癌を治療するための方法に有用であることを実証している。

【0147】

薬理学的ＴＸＮＲＤ１阻害の成長阻害効果をまた、ＫＲａｓ^G12D；ｐ５３^-/-膵癌オルガノイド株をレシピエントマウスの膵臓へ移植することにより作製された追加のマウスＰＤＡＣモデルにおいて調べた。マウスを、陰性対照として働くビヒクルのみか、またはオーラノフィンかのいずれかで処置した。図５Ｄに示されているように、インビボＲＮＡｉ結果（図５Ａ～５Ｃ）と一致して、ＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンでの処置（１０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、１週間に５日）は、Ｋｒａｓ変異体腫瘍成長において遅延を引き起こした。加えて、図５Ｅに示されているように、薬理学的ＴＸＮＲＤ１阻害の成長阻害効果が、ＫＲＡＳ変異体ＰＤＡＣ細胞（ＭＩＡＰａＣａ－２：ＫＲＡＳ変異体）により作製されたヒト異種移植モデルにおいて見出されたが、ＫＲＡＳ野生型細胞（Ｃｏｌｏ３５７：ＫＲＡＳ野生型）においては見出されなかった。したがって、ＴＸＮＲＤ１は、インビボでのＫＲＡＳ変異体腫瘍および依存性の維持に必要とされる。図１０は、オーラノフィンが膵臓へ送達されることを示している。

【0148】

図９は、ＴＸＮＲＤ１ ｍＲＮＡ上方制御を示す膵臓腺癌（ＰＤＡＣ）を有する患者が、低レベルのＴＸＮＲＤ１を発現するＰＤＡＣ患者と比較して、全生存期間の低下を示すことを示している。
図７Ａ～７Ｄは、ＫＲＡＳ変異体膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンの抗増殖効果、およびゲムシタビンと併用された場合の潜在的相乗阻害効果を示している。図８Ａ～８Ｄは、ＫＲＡＳ変異体膵癌細胞におけるＴＸＮＲＤ１阻害剤オーラノフィンの抗増殖効果、およびＫＲＡＳ^G12C阻害剤ＡＭＧ ５１０と併用された場合の潜在的相乗阻害効果を示している。
これらの結果は、本テクノロジーのＴＸＮＲＤ１阻害剤組成物が、それを必要としている対象においてＲＡＳ変異体癌を治療するための方法に有用であることを実証している。

【0149】

等価物
本テクノロジーは、この出願に記載された特定の実施形態の観点から限定されるべきではなく、その実施形態は、本テクノロジーの個々の態様の単一の実例として意図される。この本テクノロジーの多くの改変およびバリエーションが当業者に明らかであるように、それの精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に列挙されたものに加えて、本テクノロジーの範囲内の機能的に等価の方法および装置が前述の説明から当業者に明らかであろう。そのような改変およびバリエーションは本テクノロジーの範囲内にあることを意図される。本テクノロジーが、当然ながら変わり得る、特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物系に限定されないことは理解されるべきである。本明細書に用いられる用語法は、特定の実施形態のみを記載するためであり、限定することを意図されないこともまた理解されるべきである。

【0150】

加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群を用いて記載される場合、当業者は、本開示がまた、それにより、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの部分群を用いて記載されることを認識しているだろう。
ありとあらゆる目的のために、特に書面での説明を提供することに関して、当業者により理解されているように、本明細書に開示された全ての範囲はまた、ありとあらゆる可能なその部分的範囲、および部分的範囲の組合せを包含する。いかなる列挙された範囲も、その同じ範囲が、少なくとも均等な２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などへ分解されることを十分に記載し、かつ可能にするものと容易に認識することができる。非限定的例として、本明細書で論じられた各範囲は、下部３分の１、中部３分の１、および上部３分の１などへ容易に分解され得る。また当業者により理解されているように、「までの」、「少なくとも」、「より高い」、「未満」、およびその他同種類のものなどの全ての言語は、列挙された数を含み、かつ上記で論じられているように、続いて、部分的範囲へ分解することができる範囲を指す。最後に、当業者により理解されているように、範囲は各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１～３個の細胞を有する群は、１個、２個、または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１～５個の細胞を有する群は、１個、２個、３個、４個、または５個の細胞を有する群を指すなどである。

【0151】

本明細書で言及または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらがこの明細書の明白な教示と矛盾しない程度で、全ての図および表を含む、全体として参照により組み入れられている。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9】

【図10】

【配列表】

2022529824000001.app

【国際調査報告】