▶ ジェネヴァント サイエンシズ ゲーエムベーハーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-27
(54)【発明の名称】脂質ナノ粒子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220620BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220620BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220620BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220620BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20220620BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220620BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20220620BHJP
A61K 47/18 20060101ALI20220620BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20220620BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20220620BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20220620BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220620BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20220620BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220620BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20220620BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12N15/09 100
C12N15/09 110
C12N15/63 Z
C12N15/113 Z
C12N15/88 Z
C12N15/12
A61K9/51
A61K47/18
A61K47/24
A61K47/28
A61K47/34
A61K48/00
A61P3/00
A61K31/7105
A61K31/711
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021562869
(86)(22)【出願日】2020-04-24
(85)【翻訳文提出日】2021-11-30
(86)【国際出願番号】 US2020029907
(87)【国際公開番号】W WO2020219941
(87)【国際公開日】2020-10-29
(31)【優先権主張番号】62/839,452
(32)【優先日】2019-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/867,098
(32)【優先日】2019-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521194024
【氏名又は名称】ジェネヴァント サイエンシズ ゲーエムベーハー
【氏名又は名称原語表記】ＧＥＮＥＶＡＮＴ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＧＭＢＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100139723
【弁理士】
【氏名又は名称】樋口 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100116540
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 香
(72)【発明者】
【氏名】ヘイズ，ジェイムズ
(72)【発明者】
【氏名】ジャッジ，アダム
(72)【発明者】
【氏名】ラム，キエウ モン
(72)【発明者】
【氏名】マーティン，アラン ディー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076AA95
4C076CC21
4C076DD51
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE23
4C084AA13
4C084MA05
4C084MA38
4C084NA14
4C084ZC21
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA38
4C086NA14
4C086ZC21
(57)【要約】
本発明は、脂質ナノ粒子、及びこの脂質ナノ粒子を含む製剤を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）核酸、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、前記粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）前記粒子中の総脂質の約２から約５ｍｏｌ％の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子であって、
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００から約１，０００ダルトンであり、
ただし、前記脂質アンカー部分がジアルキル部分である場合、２つのアルキル鎖の少なくとも１つがＣ１４未満である、前記脂質ナノ粒子。
【請求項2】
前記脂質アンカー部分が単一のＣ１０～Ｃ２４アルキル鎖である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項3】
前記脂質アンカー部分が単一のＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６またはＣ１８鎖である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項4】
前記脂質アンカー部分が単一のＣ１８鎖である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項5】
前記脂質アンカー部分が単一のＣ１６～Ｃ２４アルキル鎖である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項6】
前記脂質アンカー部分が単一のＣ１８～Ｃ２２アルキル鎖である、請求項５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項7】
前記脂質アンカー部分がステロールまたはステロール誘導体を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項8】
前記脂質アンカー部分がコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項9】
前記脂質アンカー部分が多環式構造を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項10】
前記脂質アンカー部分がジアルキル部分である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項11】
前記脂質アンカー部分が対称的ジアルキル部分である、請求項１０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項12】
前記脂質アンカー部分が非対称ジアルキル部分である、請求項１０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項13】
前記脂質アンカー部分が、Ｃ１０及びＣ１４アルキル鎖を有する非対称ジアルキル部分である、請求項１２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項14】
前記脂質アンカー部分が、２つのＣ８アルキル鎖を有するジアルキル部分である、請求項１１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項15】
前記脂質アンカー部分が、２つのＣ１０アルキル鎖を有するジアルキル部分である、請求項１１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項16】
前記脂質アンカー部分が、２つのＣ１２アルキル鎖を有するジアルキル部分である、請求項１１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項17】
前記脂質アンカー部分がトリアルキル部分である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項18】
前記脂質アンカー部分が、Ｃ１０以下の３つのアルキル鎖を有するトリアルキル部分である、請求項１７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項19】
前記脂質アンカー部分が対称的トリアルキル部分である、請求項１７または１８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項20】
前記脂質アンカー部分が非対称トリアルキル部分である、請求項１７または１８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項21】
前記脂質アンカー部分がテトラアルキル部分である、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項22】
前記脂質アンカー部分が、Ｃ８以下の３つのアルキル鎖を有するテトラアルキル部分である、請求項２１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項23】
前記脂質アンカー部分が対称的テトラアルキル部分である、請求項２１または２２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項24】
前記脂質アンカー部分が非対称テトラアルキル部分である、請求項２１または２２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項25】
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧ部分が約７５０ダルトンの平均分子量を有する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項26】
脂質ナノ粒子の凝集を阻害する前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートは、前記粒子中の総脂質の約２ｍｏｌ％の量で存在する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項27】
脂質ナノ粒子の凝集を阻害する前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートは、前記粒子中の総脂質の約３ｍｏｌ％の量で存在する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項28】
脂質ナノ粒子の凝集を阻害する前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートは、前記粒子中の総脂質の約４ｍｏｌ％の量で存在する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項29】
脂質ナノ粒子の凝集を阻害する前記ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートは、前記粒子中の総脂質の約５ｍｏｌ％の量で存在する、請求項１～２５のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項30】
（ａ）核酸、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、前記粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）前記粒子中の総脂質の約０．２から約０．５ｍｏｌ％の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子であって、
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧ部分の平均分子量は、約５，０００から約２０，０００ダルトンである、前記脂質ナノ粒子。
【請求項31】
前記脂質アンカー部分が単一のアルキル鎖である、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項32】
前記脂質アンカー部分がステロールまたはステロール誘導体を含む、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項33】
前記脂質アンカー部分がコレステロールまたはコレステロール誘導体を含む、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項34】
前記脂質アンカー部分が多環式構造を含む、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項35】
前記脂質アンカー部分がジアルキル部分である、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項36】
前記脂質アンカー部分が対称的ジアルキル部分である、請求項３５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項37】
前記脂質アンカー部分が非対称ジアルキル部分である、請求項３５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項38】
前記脂質アンカー部分が、Ｃ１４よりも長いアルキル鎖を有するジアルキル部分である、請求項３５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項39】
前記脂質アンカー部分が、Ｃ１４～Ｃ２２アルキル鎖を有するジアルキル部分である、請求項３５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項40】
前記脂質アンカー部分が、２つのＣ１４アルキル鎖を有するジアルキル部分である、請求項３６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項41】
前記脂質アンカー部分が、２つのＣ１６アルキル鎖を有するジアルキル部分である、請求項３６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項42】
前記脂質アンカー部分が、２つのＣ１８アルキル鎖を有するジアルキル部分である、請求項３６に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項43】
前記脂質アンカー部分がトリアルキル部分である、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項44】
前記脂質アンカー部分が、Ｃ８以上の３つのアルキル鎖を有するトリアルキル部分である、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項45】
前記脂質アンカー部分が対称的トリアルキル部分である、請求項４３または４４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項46】
前記脂質アンカー部分が非対称トリアルキル部分である、請求項４３または４４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項47】
前記脂質アンカー部分がテトラアルキル部分である、請求項３０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項48】
前記脂質アンカー部分が、Ｃ６以上の３つのアルキル鎖を有するテトラアルキル部分である、請求項４７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項49】
前記脂質アンカー部分が対称的テトラアルキル部分である、請求項４７または４８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項50】
前記脂質アンカー部分が非対称テトラアルキル部分である、請求項４７または４８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項51】
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧ部分が約５，０００から約１０，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項３０～５０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項52】
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧ部分が約８，０００から約１０，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項３０～５０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項53】
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧ部分が約５，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項３０～５０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項54】
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧ部分が約１０，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項３０～５０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項55】
前記核酸が少なくとも８０塩基の長さである、請求項１～５４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項56】
前記核酸が少なくとも１００塩基の長さである、請求項１～５４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項57】
前記核酸が少なくとも５００塩基の長さである、請求項１～５４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項58】
前記核酸は、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、ｃｅＤＮＡ（閉末端ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、遺伝子編集構築体、ＲＮＡ編集構築体、または塩基編集構築体である、請求項１～５４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項59】
前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１～５４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項60】
前記核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１～５４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項61】
前記核酸がｓｉＲＮＡではない、請求項１～５４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項62】
前記カチオン性脂質が式ＣＬ１の化合物またはその塩である、請求項１～６１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子：【化1】
【請求項63】
前記カチオン性脂質が式ＣＬ２の化合物またはその塩である、請求項１～６１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子：【化2】
【請求項64】
前記カチオン性脂質が式ＣＬ３の化合物またはその塩である、請求項１～６１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子：【化3】
【請求項65】
前記リン脂質がＤＳＰＣである、請求項１～６４のいずれか１項に記載の核酸－脂質粒子。
【請求項66】
前記脂質アンカー部分が少なくとも１つの飽和アルキル鎖を含む、請求項１～６５のいずれか１項に記載の核酸－脂質粒子。
【請求項67】
前記脂質アンカー部分が少なくとも１つの不飽和アルキル鎖を含む、請求項１～６６のいずれか１項に記載の核酸－脂質粒子。
【請求項68】
前記脂質アンカー部分が、少なくとも１つの二重結合を有する少なくとも１つのアルキル鎖を含む、請求項１～６７のいずれか１項に記載の核酸－脂質粒子。
【請求項69】
（ａ）ｍＲＮＡである核酸、（ｂ）カチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、非カチオン性脂質、及び
（ｄ）脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子であって、
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、一本鎖Ｃ１８アルキル部分である脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含む、前記脂質ナノ粒子。
【請求項70】
（ａ）ｍＲＮＡである核酸、（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、前記粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）前記粒子中の総脂質の約１から約２．５ｍｏｌ％（例えば、約１．６ｍоｌ％）の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子であって、
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、一本鎖Ｃ１４～Ｃ２２（例えば、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０またはＣ２２）アルキル部分である脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートの前記ＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００から約３，０００ダルトン（例えば、約２０００ダルトン）である、前記脂質ナノ粒子。
【請求項71】
請求項１～７０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項72】
静脈内投与用に製剤化される、請求項７１に記載の医薬組成物。
【請求項73】
核酸を細胞に送達するための方法であって、請求項１～７０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子に前記細胞を接触させることを含む、前記方法。
【請求項74】
機能性タンパク質の欠損を生じさせる遺伝的欠陥を特徴とする疾患を治療するための方法であって、請求項５９に記載の脂質ナノ粒子を前記疾患を有する対象に投与することを含み、ここで、前記ｍＲＮＡが、前記機能性タンパク質または前記機能性タンパク質と同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードする、前記方法。
【請求項75】
ポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患を治療するための方法であって、請求項５７に記載の脂質ナノ粒子を前記疾患を有する対象に投与することを含み、ここで、前記ｓｉＲＮＡが、前記過剰発現されたポリペプチドの発現を標的とする、前記方法。
【請求項76】
機能性タンパク質の欠損を生じさせる遺伝的欠陥を特徴とする疾患の治療的または予防的処置のための、請求項１～７０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項77】
ポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患の治療的または予防的処置のための、請求項１～７０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項78】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で使用するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを選択することを含む、ヒトへのＬＮＰの投与の免疫応答を低減するための方法であって、ここで、前記ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、前記脂質アンカー部分は、単一のアルキル鎖であり、前記ＬＮＰは、ｍＲＮＡペイロードを含む、前記方法。
【請求項79】
前記脂質アンカー部分が単一のＣ１０～Ｃ２４アルキル鎖である、請求項７８に記載の方法。
【請求項80】
前記脂質アンカー部分が単一のＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、またはＣ２２鎖である、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
前記脂質アンカー部分が単一のＣ８鎖である、請求項８０に記載の方法。
【請求項82】
前記ＬＮＰの最初の投与及び少なくとも１回のその後の前記ＬＮＰの投与でそれを必要とするヒトを治療することをさらに含む、請求項７８～８１のいずれか１項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年４月２６日に出願された米国特許出願第６２／８３９，４５２号及び２０１９年６月２６日に出願された米国特許出願第６２／８６７，０９８号に対する優先権の利益を主張するものである。
【背景技術】
【0002】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、通常であれば細胞不透過性である生物学的に活性な化合物、例えば、治療用核酸、タンパク質、及びペプチドのための効果的な薬物送達系である。例えば、インビトロで転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）などの大型核酸分子及びメッセンジャーＲＮＡまたは遺伝子と相互作用するより小さなポリヌクレオチドを含む、核酸ベースの薬物は、効果的であるためには適切な細胞区画へと送達されなければならない。例えば、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）（例えばｓｉＲＮＡを含む）などの二本鎖核酸には、それらを細胞に対して不浸透性にするそれらの物理化学的性質の問題がある。適切な区画に送達されると、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる高度に保存された調節機構を通じて遺伝子発現を遮断する。通常、ｓｉＲＮＡは、分子量が１２～１７ｋＤａの範囲で大型のサイズであり、最大５０の負電荷を有するそれらのリン酸骨格によって高度にアニオン性である。さらに、２本の相補的ＲＮＡ鎖が強固ならせんをもたらす。これらの特徴は、ｓｉＲＮＡの「薬物様」特性の乏しさの一因となっている。静脈内投与された場合、ｓｉＲＮＡは、わずか１０分の範囲の典型的な半減期で急速に身体から排出される。加えて、ｓｉＲＮＡは、血液及び他の体液または組織に存在するヌクレアーゼによって急速に分解され、インビトロ及びインビボで強力な免疫応答を刺激することが示されている。例えば、非特許文献１を参照されたい。ｍＲＮＡ分子は、不浸透性、脆弱性、及び免疫原性の同様の問題に苦しんでいる。国際特許出願公開番号ＷＯ２０１６／１１８６９７を参照されたい。
【0003】
脂質ナノ粒子製剤により、インビボでの核酸送達が改善された。例えば、そのような製剤により、インビボでの標的ノックダウンを行うのに必要なｓｉＲＮＡの用量が大幅に低減した。非特許文献２を参照されたい。通常、そのような脂質ナノ粒子薬物送達系は、カチオン性脂質と、ヘルパー脂質と、ポリエチレングリコールを含有する脂質とを含む多成分製剤である。正に荷電したカチオン性脂質がアニオン性核酸に結合し、その一方で他の成分が脂質ナノ粒子の安定的な自己集合を補助する。
【0004】
脂質ナノ粒子製剤の送達有効性の改善に向けた取り組みがなされている。多くのそのような取り組みは、より適切なカチオン性脂質を開発することに向けられている。例えば、非特許文献３～６を参照されたい。これらの取り組みにもかかわらず、投与後に高い薬効をもたらし、低用量の核酸の投与が可能となる製剤を含有する脂質ナノ粒子が、依然として求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９：８９－１０２，２００９
【非特許文献2】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４，２００６
【非特許文献3】Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６：５６１－５６９，２００８
【非特許文献4】Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０７：１８６４－１８６９，２０１０
【非特許文献5】Ｂａｉｇｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７，２００５
【非特許文献6】Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：１７２－１７６，２０１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
脂質ナノ粒子、及びその脂質ナノ粒子を含む医薬組成物が提供される。この脂質ナノ粒子及び医薬組成物は、核酸を患者（例えば、ヒト）または細胞に送達するのに特に有用である。
【0007】
核酸の送達に有用な脂質ナノ粒子製剤には、しばしばＰＥＧ－脂質コンジュゲートが使用される。このＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＬＮＰ製造中の粒子サイズを制御し、投与後のバイアル及び血液中の不要な凝集を防ぐのに役立つ。ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、血液中の不要なオプソニン作用を防ぐのにも役立つ。これらのＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、分子量が約２０００のＰＥＧポリマー成分を使用するのが非常に典型的である。コンジュゲートが２つのＣ１４鎖を含む脂質部分を使用すること、及びこれらのＰＥＧ－脂質コンジュゲートが０．５から２％のモル比（組成物中の他の脂質と比較して）で使用されることも典型的である。対照的に、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、２％から５％のモル比で分子量５００～１０００のＰＥＧ、及び０．２％から０．５％のモル比で５０００～２００００のＰＥＧポリマーサイズを有するＰＥＧ脂質を含むことができる。したがって、本明細書でより完全に説明するように、脂質ナノ粒子に有益な特性を提供するために、通常使用されるものとは異なる、異なる量で使用されるＰＥＧ－脂質コンジュゲート構造を使用する新しい製剤が開発された。
【0008】
したがって、一実施形態では、
（ａ）核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約２から約５ｍｏｌ％の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００から約１，０００ダルトンであり、
ただし、脂質アンカー部分がジアルキル部分である場合、２つのアルキル鎖の少なくとも１つがＣ１４未満である。
（ａ）核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約２から約５ｍｏｌ％の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００から約１，０００ダルトンであり、
ただし、脂質アンカー部分がジアルキル部分である場合、２つのアルキル鎖の少なくとも１つがＣ１４未満である。
【0009】
また、
（ａ）核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約０．２から約０．５ｍｏｌ％の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子も提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５，０００から約２０，０００ダルトンである。
（ａ）核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約０．２から約０．５ｍｏｌ％の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子も提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５，０００から約２０，０００ダルトンである。
【0010】
また、
（ａ）ｍＲＮＡである核酸、
（ｂ）カチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、非カチオン性脂質、及び
（ｄ）脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子も提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、一本鎖Ｃ１８アルキル部分である脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含む。
（ａ）ｍＲＮＡである核酸、
（ｂ）カチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、非カチオン性脂質、及び
（ｄ）脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子も提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、一本鎖Ｃ１８アルキル部分である脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含む。
【0011】
また、
（ａ）ｍＲＮＡである核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約１から約２．５ｍｏｌ％（例えば、約１．６ｍоｌ％）の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、一本鎖Ｃ１４～Ｃ２２（例えば、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０またはＣ２２）アルキル部分である脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００から約３，０００ダルトン（例えば、約２０００ダルトン）である。
（ａ）ｍＲＮＡである核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約１から約２．５ｍｏｌ％（例えば、約１．６ｍоｌ％）の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、一本鎖Ｃ１４～Ｃ２２（例えば、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０またはＣ２２）アルキル部分である脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００から約３，０００ダルトン（例えば、約２０００ダルトン）である。
【0012】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で使用するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを選択することを含む、ヒトへのＬＮＰの投与の免疫応答を低減するための方法も提供され、ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、脂質アンカー部分は、単一のアルキル鎖であり、ＬＮＰは、ｍＲＮＡペイロードを含む。
【0013】
本発明はまた、本発明の脂質ナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【0014】
本発明はまた、核酸を細胞に送達するための方法であって、本発明のナノ粒子に細胞を接触させることを含む方法を提供する。より一般的には、本発明は、核酸をインビボまたはインビトロで生体細胞に投与する方法を提供する。
【0015】
本発明はまた、機能性タンパク質の欠損を生じさせる遺伝的欠陥を特徴とする疾患を治療するための方法であって、本発明の脂質ナノ粒子をその疾患を有する対象に投与することを含み、ここで、核酸分子は機能性タンパク質または機能性タンパク質と同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡである方法を提供する。
【0016】
本発明はまた、ポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患を治療するための方法であって、本発明の脂質ナノ粒子をその疾患を有する対象に投与することを含み、ここで、核酸分子は過剰発現されたポリペプチドの発現を標的とするｓｉＲＮＡである方法を提供する。
【0017】
本発明はまた、機能性タンパク質の欠損を生じさせる遺伝的欠陥を特徴とする疾患の治療的または予防的処置のための本発明の脂質ナノ粒子を提供する。
【0018】
本発明はまた、ポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患の治療的または予防的処置のための本発明の脂質ナノ粒子を提供する。
【0019】
本発明はまた、動物における疾患または障害を治療するための方法であって、治療有効量の本発明の脂質ナノ粒子を動物に投与することを含む方法を提供する。
【0020】
本発明はまた、本発明の脂質ナノ粒子を作製するために有用である、本明細書に開示されるプロセス及び中間体を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0021】
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語は特に明記しない限り以下に帰する意味を有する。
本明細書で使用される場合、以下の用語は特に明記しない限り以下に帰する意味を有する。
【0022】
「約」という用語は、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％を意味する。
【0023】
「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」という用語は、干渉ＲＮＡが標的遺伝子または配列と同じ細胞内に存在する場合に、（例えば干渉ＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの分解を媒介することにより、またはその翻訳を阻害することにより）標的遺伝子または配列の発現を低減させるかまたは阻害することができる、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡもしくはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡなどの二重鎖ＲＮＡ）を指す。したがって、干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な一本鎖ＲＮＡ、または２本の相補鎖によって、もしくは１本の自己相補鎖によって形成された二本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的遺伝子もしくは配列に実質的もしくは完全な同一性を有してもよく、またはミスマッチ領域（すなわちミスマッチモチーフ）を含んでもよい。干渉ＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。
【0024】
干渉ＲＮＡには、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば、約１５～６０、１５～５０、または１５～４０（二重鎖）ヌクレオチド長、より典型的には約１５～３０、１５～２５または１９～２５（二重鎖）ヌクレオチド長、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３（二重鎖）ヌクレオチド長である干渉ＲＮＡが含まれる（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５ヌクレオチド長、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチド長であり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５塩基対長、好ましくは約１８～２２、１９～２０、または１９～２１塩基対長である）。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１～約４つのヌクレオチドまたは約２～約３つのヌクレオチドの３’オーバーハング及び５’リン酸末端を含み得る。ｓｉＲＮＡの例には、２つの別々の鎖分子からアセンブルした二本鎖ポリヌクレオチド分子（ここで、一方の鎖はセンス鎖であり、他方は相補的アンチセンス鎖である）；一本鎖分子からアセンブルした二本鎖ポリヌクレオチド分子（ここで、センス領域及びアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーにより連結している）；自己相補的センス領域及びアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する、二本鎖ポリヌクレオチド分子；ならびに２つ以上のループ構造ならびに自己相補的センス領域及びアンチセンス領域を有するステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子（ここで、この環状ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロでプロセシングされ活性二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を産生することができる）が含まれるが、これらに限定されない。
【0025】
好ましくは、ｓｉＲＮＡは化学合成される。ｓｉＲＮＡはまた、より長いｄｓＲＮＡ（例えば、約２５ヌクレオチド長を超えるｄｓＲＮＡ）をＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ ＩＩＩまたはダイサーにより切断することによって産生させることができる。これらの酵素は、ｄｓＲＮＡをプロセシングして生物学的に活性なｓｉＲＮＡにする（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：９９４２－９９４７（２００２）、Ｃａｌｅｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１４２３６（２００２）、Ｂｙｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｂｉｏｎ ＴｅｃｈＮｏｔｅｓ，１０（１）：４－６（２００３）、Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３１：９８１－９８７（２００３）、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２２６９－２２７１（２００１）、及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：８２（１９６８）を参照されたい）。好ましくは、ｄｓＲＮＡは、少なくとも５０ヌクレオチド長～約１００、２００、３００、４００または５００ヌクレオチド長である。ｄｓＲＮＡは、１０００、１５００、２０００、５０００ヌクレオチド長またはそれ以上の長さであり得る。ｄｓＲＮＡは、遺伝子転写物全体または遺伝子転写物の一部をコードし得る。特定の場合では、ｓｉＲＮＡは、プラスミドによってコードされ得る（例えば、ヘアピンループを有する二重鎖に自発的にフォールディングする配列として転写される）。
【0026】
本明細書で使用される場合、「ミスマッチモチーフ」または「ミスマッチ領域」という用語は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）配列の、その標的配列に対して１００％の相補性を有さない部分を指す。干渉ＲＮＡは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のミスマッチ領域を有し得る。ミスマッチ領域は、連続的であっても、または１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個もしくはそれ以上のヌクレオチドで分離されていてもよい。ミスマッチモチーフまたはミスマッチ領域は、１つのヌクレオチドを含んでもよく、または２つ、３つ、４つ、５つもしくはそれ以上のヌクレオチドを含んでもよい。
【0027】
核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）などの核酸の「有効量」または「治療有効量」とは、所望の効果、例えば、干渉ＲＮＡの非存在下で検出された正常発現レベルと比較した標的配列の発現の阻害、または生体内で発現しそこで望ましい生物学的効果を生じさせるタンパク質の量のｍＲＮＡ特異的発現を生じさせるのに十分な量である。標的遺伝子または標的配列の発現阻害は、干渉ＲＮＡを用いて得られた値が対照の約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または０％となる場合に達成される。他の実施形態では、発現タンパク質は、体内の細胞タイプに通常発現するタンパク質の活性形態であり、治療有効量のｍＲＮＡは、健常個体のその細胞タイプで通常発現するタンパク質の量の少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％）のコードされたタンパク質の量を産生させる量である。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するのに適したアッセイには、例えば、当業者に公知の技術、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、及び当業者に公知の表現型アッセイを使用する、タンパク質またはＲＮＡレベルの検査が含まれる。
【0028】
干渉ＲＮＡによる免疫応答を「低下させる」、「低下させること」、「低減させる」、または「低減させること」とは、所与の干渉ＲＮＡ（例えば、修飾干渉ＲＮＡ）に対する免疫応答の検出可能な低下を意味することが意図される。修飾干渉ＲＮＡによる免疫応答の低下量は、非修飾干渉ＲＮＡの存在下での免疫応答のレベルと比較して測定することができる。検出可能な低下は、非修飾干渉ＲＮＡの存在下で検出された免疫応答よりも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上に低くなり得る。干渉ＲＮＡに対する免疫応答の低下は、通常、インビトロでのレスポンダー細胞によるサイトカイン生成（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＩＬ－６もしくはＩＬ－１２）の低下、または干渉ＲＮＡ投与後の哺乳動物対象の血清中のサイトカイン生成の低下により測定される。
【0029】
ｍＲＮＡによる免疫応答を「低下させる」、「低下させること」、「低減させる」、または「低減させること」とは、所与のｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）に対する免疫応答の検出可能な低下を意味することが意図される。修飾ｍＲＮＡによる免疫応答の低下量は、非修飾ｍＲＮＡの存在下での免疫応答のレベルと比較して測定することができる。検出可能な低下は、非修飾ｍＲＮＡの存在下で検出された免疫応答よりも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれ以上に低くなり得る。ｍＲＮＡに対する免疫応答の低下は、通常、インビトロでのレスポンダー細胞によるサイトカイン生成（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＴＮＦα、ＩＬ－６もしくはＩＬ－１２）の低下、またはｍＲＮＡ投与後の哺乳動物対象の血清中のサイトカイン生成の低下により測定される。
【0030】
本明細書で使用される場合、「レスポンダー細胞」という用語は、非修飾ｓｉＲＮＡなどの免疫刺激性干渉ＲＮＡと接触した場合に、検出可能な免疫応答を生じる細胞、好ましくは哺乳動物細胞を指す。例示的なレスポンダー細胞には、例えば、樹状細胞、マクロファージ、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、脾細胞などが含まれる。検出可能な免疫応答には、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＴＧＦ、及びこれらの組み合わせなどの、サイトカインまたは増殖因子の生成が含まれる。
【0031】
「実質的同一性」は、ストリンジェントな条件下で参照配列にハイブリダイズする配列、または参照配列の特定の領域にわたって特定の同一性パーセントを有する配列を指す。
【0032】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、核酸が、典型的には核酸の複合混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況では異なることになる。より長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨでの特定の配列の熱融点（ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５～１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨ及び核濃度（ｎｕｃｌｅｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）での）温度である（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍにおいてプローブの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
【0033】
例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下の通りであり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、６５℃の０．２×ＳＳＣ、及び０．１％ＳＤＳ中で洗浄。ＰＣＲの場合、低ストリンジェンシー増幅は通常約３６℃の温度であるが、アニーリング温度はプライマー長に応じて約３２℃～４８℃で変動し得る。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅の場合、通常約６２℃の温度であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、プライマー長及び特異性に応じて、約５０℃～約６５℃の範囲であり得る。高ストリンジェンシー増幅及び低ストリンジェンシー増幅の両方の典型的なサイクル条件には、９０℃～９５℃で３０秒～２分の変性段階、３０秒～２分続くアニーリング段階、及び約７２℃で１～２分間の伸長段階が含まれる。低ストリンジェンシー増幅反応及び高ストリンジェンシーの増幅反応のプロトコル及びガイドラインは、例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）に示されている。
【0034】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それでもなお、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮重を使用して核酸のコピーが生成される場合に生じる。そのような場合、核酸は通常、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」には、３７℃での４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液でのハイブリダイゼーション、及び４５℃の１×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。当業者は、代替的なハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件を利用して、類似のストリンジェンシー条件を得ることができることを容易に理解するであろう。ハイブリダイゼーションパラメータを決定するためのさらなるガイドラインは、多数の参照文献、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．に示されている。
【0035】
２つ以上の核酸との関連における「実質的に同一」または「実質的同一性」という用語は、比較ウィンドウにわたって、または以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、もしくは手動アラインメント及び目視検査により測定される指定領域にわたって、最大限一致するように比較及びアラインメントされるとき、同じであるかまたは同じであるヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、特定の領域にわたる少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性）を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。この定義はまた、文脈が示す場合、配列の相補体も同様に指す。好ましくは、実質的同一性は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０ヌクレオチド長の領域にわたり存在する。
【0036】
配列比較のために、通常、１つの配列が、試験配列と比較する参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定のプログラムパラメータを使用してもよく、または代替的パラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【0037】
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、ある配列を、同じ連続的位置数の参照配列と、２つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができる、約５～約６０、一般的には約１０～約４５、より一般的には約１５～約３０からなる群から選択されるいくつかの連続的位置のうちのいずれか１つの区分に対する参照を含む。比較のための配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、または手動アラインメント及び目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）により実施することができる。
【0038】
配列同一性パーセント及び配列類似性の決定に適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、それらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。核酸の配列同一性パーセントを決定するために、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０が本明細書に記載のパラメータとともに使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に利用可能である。
【0039】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小和確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると見なされる。
【0040】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有するポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、予め凝縮したＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体及び組み合わせの形態であり得る。ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、自己増幅ＲＮＡ、及びこれらの組み合わせの形態であり得る。核酸には、合成、天然、及び非天然であり参照核酸と類似した結合特性を有する、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは結合を含有する核酸が含まれる。そのような類似体の例には、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、及びペプチド－核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。明確に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有する、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。特に示さない限り、特定の核酸配列はまた、明示された配列に加えて、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって実現することができる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：５０８１（１９９１）、Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：２６０５－２６０８（１９８５）、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，８：９１－９８（１９９４））。「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介して互いに連結している。「塩基」には、プリン及びピリミジンが含まれ、それにはさらに、天然化合物であるアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類似体、ならびにプリン及びピリミジンの合成誘導体が含まれ、それらには、限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、及びハロゲン化アルキルなどの新たな反応性基を配置する修飾が非限定的に含まれる。
【0041】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドの生成に必要な、部分長または完全長のコード配列を含む核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。
【0042】
本明細書で使用される場合、「遺伝子産物」は、ＲＮＡ転写物またはポリペプチドなどの遺伝子の産物を指す。
【0043】
「脂質」という用語は、非限定的に脂肪酸のエステルを含み、水に不溶であるが多くの有機溶媒に可溶であることを特徴とする有機化合物の群を指す。それらは、通常、（１）脂肪及び油ならびにロウが含まれる「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質が含まれる「複合脂質」、ならびに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」の少なくとも３つのクラスに分類される。
【0044】
「アルキル」という用語は、それ自体でまたは別の置換基の一部として、別途指示のない限り、飽和または不飽和であり得る、表記される炭素原子の数（すなわち、Ｃ１－８は、１～８個の炭素を意味する）を有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどが挙げられる。「アルケニル」という用語は、１つ以上の二重結合を有する不飽和アルキルラジカルを指す。同様に、「アルキニル」という用語は、１つ以上の三重結合を有する不飽和アルキルラジカルを指す。そのような不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２－プロペニル、クロチル、２－イソペンテニル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、エチニル、１－及び３－プロピニル、３－ブチニル、ならびにより高次のホモログ及び異性体が挙げられる。
【0045】
本明細書で使用される場合、脂質ナノ粒子「ＬＮＰ」という用語は、脂質－核酸粒子または核酸－脂質粒子（例えば、安定核酸－脂質粒子）を指す。ＬＮＰは、脂質（例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び粒子の凝集を防ぐコンジュゲート脂質）と核酸から作製された粒子であって、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、自己増幅ＲＮＡ、またはプラスミド（干渉ＲＮＡもしくはｍＲＮＡが転写されるプラスミドを含む））が脂質内に封入されている粒子を表す。一実施形態では、核酸は脂質に少なくとも５０％封入されており、一実施形態では、核酸は脂質に少なくとも７５％封入されており、一実施形態では、核酸は脂質に少なくとも９０％封入されており、一実施形態では、核酸は脂質に完全に封入されている。ＬＮＰは通常、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び脂質コンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に循環寿命の延長を示すことができ、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に隔てられた部位）に蓄積することができ、これらの遠位部位でのトランスフェクトされた遺伝子の発現または標的遺伝子発現のサイレンシングを媒介できることから、全身適用に極めて有用である。
【0046】
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、典型的には、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、または約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒性である。さらに、核酸は、本発明の脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許出願公開第２００４０１４２０２５号及び同第２００７００４２０３１号に開示されており、これらの開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0047】
本明細書で使用される場合、「脂質封入された」とは、完全に封入されたか、部分的に封入されたかまたはその両方である核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を提供する脂質粒子を指し得る。一実施形態では、核酸は、（例えば、ＬＮＰまたは他の核酸－脂質粒子を形成するために）脂質粒子に完全に封入される。
【0048】
「カチオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨ（例えば、約７．０のｐＨ）などの選択されたｐＨで正味の正電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。驚くべきことに、複数の不飽和部位、例えば、少なくとも２つまたは３つの不飽和部位を有するアルキル鎖を含むカチオン性脂質が、膜流動性が増加した脂質粒子を形成するのに特に有用であることが見出された。本発明においても有用であるいくつかのカチオン性脂質及び関連する類似体は、米国特許公開第２００６００８３７８０号及び同第２００６０２４０５５４号；米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号、同第５，２８３，１８５号、同第５，７５３，６１３号、及び同第５，７８５，９９２号；並びにＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０３９０に記載されており、それらの開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。カチオン性脂質の非限定的な例は、本明細書に詳細に記載されている。場合によっては、カチオン性脂質は、プロトン化可能な第三級アミン（例えば、ｐＨ滴定可能）ヘッド基、Ｃ１８アルキル鎖、ヘッド基とアルキル鎖との間のエーテル結合、及び０～３個の二重結合を含む。そのような脂質には、例えば、ＤＳＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｅｎＤＭＡ、及びＤＯＤＭＡが含まれる。
【0049】
本明細書に記載の脂質ナノ粒子において、カチオン性脂質は、例えば、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ －Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、またはそれらの混合物のうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（「ＸＴＣ２」）、またはそれらの混合物である。
【0050】
ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（「ＸＴＣ２」）、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ、及びＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺなどのカチオン性脂質、並びに追加のカチオン性脂質の合成は、２００８年１０月９日に出願された米国仮出願第６１／１０４，２１２号に記載されており、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ、ＤＬｉｎ－ＤＡＣ、ＤＬｉｎ－ＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ、ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ、ＤＬｉｎ－ＭＰＺ、ＤＬｉｎＡＰ、ＤＯＡＰ、及びＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡなどのカチオン性脂質、並びに追加のカチオン性脂質の合成は、２００８年１２月３１日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０８／８８６７６号に記載されており、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＣＬｉｎＤＭＡなどのカチオン性脂質、並びに追加のカチオン性脂質の合成は、米国特許公開第２００６０２４０５５４号に記載されており、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0051】
様々なカチオン性脂質のいずれかを、単独で、または１つ以上の他のカチオン性脂質種もしくは非カチオン性脂質種と組み合わせて、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）に使用することができる。
【0052】
本発明において有用であるカチオン性脂質は、生理学的ｐＨで正味の正電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかであり得る。このような脂質は、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ －（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３β－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、及びそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。いくつかのこれらの脂質及び関連する類似体は、米国特許公開第２００６００８３７８０号及び同第２００６０２４０５５４号；米国特許第５，２０８，０３６号、同第５，２６４，６１８号、同第５，２７９，８３３号、同第５，２８３，１８５号、同第５，７５３，６１３号、及び同第５，７８５，９９２号；並びにＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／１０３９０に記載されており、それらの開示はそれぞれ、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、カチオン性脂質のいくつかの市販の製剤が利用可能であり、本発明で使用することができる。これらには、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（米国ニューヨーク州グランドアイランドのＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの、ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む市販のカチオン性リポソーム）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬからの、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む市販のカチオン性リポソーム）、及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（米国ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．からの、ＤＯＧＳを含む市販のカチオン性リポソーム）が含まれる。
【0053】
さらに、以下の構造を有する式Ｉのカチオン性脂質は、本発明において有用である。
式中、Ｒ１及びＲ２は独立して選択され、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は独立して選択され、約１０～約２０個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つは少なくとも２つの不飽和部位を含む。特定の例では、Ｒ３とＲ４は両方とも同じである。つまり、Ｒ３とＲ４は両方ともリノレイル（Ｃ１８）などである。他の特定の例では、Ｒ３とＲ４は異なる。つまり、Ｒ３はテトラデクトリエニル（Ｃ１４）であり、Ｒ４はリノレイル（Ｃ１８）である。一実施形態では、式Ｉのカチオン性脂質は対称的であり、すなわち、Ｒ３及びＲ４は両方とも同じである。別の実施形態では、Ｒ３及びＲ４の両方は、少なくとも２つの不飽和部位を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、及びイコサジエニルからなる群から独立して選択される。一実施形態では、Ｒ３及びＲ４は両方ともリノレイルである。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４は、少なくとも３つの不飽和部位を含み、しかも、例えば、ドデカトリエニル、テトラデクトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、及びイコサトリエニルから独立して選択される。特別な実施形態において、式Ｉのカチオン性脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）または１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）である。
【化1】
【0054】
さらに、以下の構造を有する式ＩＩのカチオン性脂質は、本発明において有用である。
式中、Ｒ１及びＲ２は独立して選択され、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は独立して選択され、約１０～約２０個の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ３及びＲ４の少なくとも１つは少なくとも２つの不飽和部位を含む。特定の例では、Ｒ３とＲ４は両方とも同じである。つまり、Ｒ３とＲ４は両方ともリノレイル（Ｃ１８）などである。他の特定の例では、Ｒ３とＲ４は異なる。つまり、Ｒ３はテトラデクトリエニル（Ｃ１４）であり、Ｒ４はリノレイル（Ｃ１８）である。一実施形態では、本発明のカチオン性脂質は対称的であり、すなわち、Ｒ３及びＲ４は両方とも同じである。別の実施形態では、Ｒ３及びＲ４の両方は、少なくとも２つの不飽和部位を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、及びイコサジエニルからなる群から独立して選択される。一実施形態では、Ｒ３及びＲ４は両方ともリノレイルである。いくつかの実施形態において、Ｒ３及びＲ４は、少なくとも３つの不飽和部位を含み、しかも、例えば、ドデカトリエニル、テトラデクトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、及びイコサトリエニルから独立して選択される。
【化2】
【0055】
さらに、以下の構造を有する式ＩＩＩのカチオン性脂質（またはその塩）は、本発明において有用である。
式中、Ｒ１とＲ２は、同じであるか異なっており、独立して置換されていてもよいＣ１２－Ｃ２４アルキル、置換されていてもよいＣ１２－Ｃ２４アルケニル、置換されていてもよいＣ１２－Ｃ２４アルキニル、または置換されていてもよいＣ１２－Ｃ２４アシルである；Ｒ３とＲ４は同じであるか異なっており、独立して置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルケニル、もしくは置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキニルであり、またはＲ３とＲ４が結合して、４～６個の炭素原子、及び窒素と酸素から選択された１つまたは２つのヘテロ原子からなる置換されていてもよい複素環を形成し得る；Ｒ５は存在しないか、水素またはＣ１－Ｃ６アルキルのいずれかであり、第４級アミンを提供する；ｍ、ｎ、及びｐは同じであるか異なっており、独立して０または１であり、ただし、ｍ、ｎ、及びｐは同時に０ではない；ｑは０、１、２、３、または４である；ＹとＺは同じであるか異なっており、独立してＯ、Ｓ、またはＮＨである。
【化3】
【0056】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、またはそれらの混合物である。いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＸＴＣ２）である。
【0057】
カチオン性脂質は典型的には、粒子中に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、または約５５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％を構成する。
【0058】
粒子の使用目的に応じて、成分の比率を変えることができ、特定の製剤の送達効率を、例えば、エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを使用して測定できることは、当業者には明らかであろう。
【0059】
特定の実施形態では、「カチオン性脂質」という用語は、式ＣＬ１の化合物またはその塩を指す。
【化4】
【0060】
特定の実施形態では、「カチオン性脂質」という用語は、式ＣＬ２の化合物またはその塩を指す。
【化5】
【0061】
特定の実施形態では、「カチオン性脂質」という用語は、式ＣＬ３の化合物またはその塩を指す。
【化6】
【0062】
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）に使用される非カチオン性脂質は、安定複合体を生成することができる任意の様々な中性非荷電性、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。
【0063】
非カチオン性脂質の非限定的な例には、リン脂質、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びこれらの混合物が含まれる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用することができる。これらの脂質中のアシル基は、典型的には、Ｃ１０～Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。
【0064】
非カチオン性脂質のさらなる例には、コレステロールなどのステロール、及びその誘導体、例えば、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、ならびにこれらの混合物が含まれる。
【0065】
いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えば、リン脂質不含の脂質粒子製剤を含むか、またはそれからなる。他の実施形態では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、１つ以上のリン脂質、例えば、コレステロール不含の脂質粒子製剤を含むか、またはそれからなる。さらなる実施形態では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）中に存在する非カチオン性脂質は、１つ以上のリン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含むか、またはそれからなる。
【0066】
本発明での使用に適した非カチオン性脂質の他の例には、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレエート、ヘキサデシルステアレート（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ ｓｔｅｒｅａｔｅ）、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン－ラウリルスルフェート、アルキル－アリールスルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリンなどのようなリン不含の脂質が含まれる。
【0067】
「疎水性脂質」という用語は、長鎖の飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに任意選択で１つ以上の芳香族基（複数可）、脂環式基（複数可）、または複素環式基（複数可）により置換されているそのような基を含むがこれらに限定されない、無極性基を有する化合物を指す。好適な例には、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、及び１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
【0068】
「膜融合性」という用語は、ＬＮＰなどの脂質粒子が細胞の膜と融合する能力を指す。膜は、形質膜または細胞小器官、例えばエンドソーム、核などを取り囲む膜のいずれかであり得る。
【0069】
本明細書で使用される場合、「水溶液」という用語は、水を全体的または部分的に含む組成物を指す。
【0070】
本明細書で使用される場合、「有機脂質溶液」という用語は、脂質を有する有機溶媒を全体的または部分的に含む組成物を指す。
【0071】
本明細書で使用される「遠位部位」とは、隣接する毛細血管床に限らず生体全体に広く分布する部位を含む、物理的に隔てられた部位を指す。
【0072】
ＬＮＰなどの脂質ナノ粒子に関連する「血清安定性」とは、遊離ＤＮＡまたはＲＮＡを著しく分解する血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に、粒子が著しく分解されないことを意味する。好適なアッセイには、例えば、標準的な血清アッセイ、ＤＮＡｓｅアッセイ、またはＲＮＡｓｅアッセイが含まれる。
【0073】
本明細書で使用される場合、「全身送達」とは、生体内での干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの核酸の広範な生体内分布をもたらす、脂質粒子の送達を指す。ある特定の薬剤の全身送達をもたらすことができる投与技術もあれば、そうではない投与技術もある。全身送達とは、有用な量、好ましくは治療量の薬剤が身体の大部分に曝露されることを意味する。広範な生体内分布を得るために、薬剤が投与部位から遠位の疾患部位に到達する前に、（初回通過器官（肝臓、肺など）または迅速な非特異的細胞結合などにより）迅速な分解またはクリアランスを受けないような血中寿命が一般に必要とされる。脂質粒子の全身送達は、例えば、静脈内、皮下、及び腹腔内を含む当該技術分野で公知の任意の手段によるものであり得る。好ましい実施形態では、脂質粒子の全身送達は、静脈内送達によるものである。
【0074】
本明細書で使用される場合、「局所送達」とは、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの核酸を生体内の標的部位に直接送達することを指す。例えば、薬剤は、腫瘍などの疾患部位、または炎症部位などの他の標的部位、または標的器官、例えば肝臓、心臓、膵臓、腎臓などに直接注射により局所送達することができる。
【0075】
「哺乳動物」という用語は、例えば、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ハムスター、モルモット、ウサギ、家畜などの任意の哺乳動物種を指す。
【0076】
「がん」という用語は、異常細胞の制御不能な増殖を特徴とする疾患クラスの任意のメンバーを指す。この用語には、悪性、良性、軟部組織または固形のいずれとして特徴付けられるかを問わないすべての公知のがん及び腫瘍状態、ならびに転移前及び転移後のがんを含むすべての病期及びグレードのがんが含まれる。異なるタイプのがんの例には、肺癌、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ）ｃａｎｃｅｒ）、食道癌；胆嚢癌、肝癌、膵癌、虫垂癌、乳癌、卵巣癌；子宮頸癌、前立腺癌、腎癌（例えば腎細胞癌）、中枢神経系の癌、神経膠芽腫、皮膚癌、リンパ腫、絨毛癌、頭頸部癌、骨原性肉腫、及び血液癌が含まれるが、これらに限定されない。特定のタイプの肝癌の非限定的な例には、肝細胞癌（ＨＣＣ）、続発性肝癌（例えば、他のいくつかの非肝癌細胞タイプの転移に起因するもの）、及び肝芽腫が含まれる。本明細書で使用される場合、「腫瘍」は、１つ以上のがん細胞を含む。
【0077】
特定の実施形態では、
（ａ）核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約２から約５ｍｏｌ％の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に結合したＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００から約１，０００ダルトンであり、
ただし、脂質アンカー部分がジアルキル部分である場合、２つのアルキル鎖の少なくとも１つがＣ１４未満である。
（ａ）核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約２から約５ｍｏｌ％の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に結合したＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００から約１，０００ダルトンであり、
ただし、脂質アンカー部分がジアルキル部分である場合、２つのアルキル鎖の少なくとも１つがＣ１４未満である。
【0078】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、単一のＣ１０～Ｃ２４アルキル鎖（例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、またはＣ２４）である。
【0079】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、単一のＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６またはＣ１８鎖である。
【0080】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、単一のＣ１８鎖である。
【0081】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、単一のＣ１６～Ｃ２４アルキル鎖である。
【0082】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、単一のＣ１８～Ｃ２２アルキル鎖である。
【0083】
特定の実施形態において、脂質アンカー部分は、ステロールもしくはステロール誘導体であるか、またはステロールもしくはステロール誘導体を含む。
【0084】
特定の実施形態において、脂質アンカー部分は、コレステロールもしくはコレステロール誘導体であるか、またはコレステロールもしくはコレステロール誘導体を含む。
【0085】
特定の実施形態において、脂質アンカー部分は、多環式構造であるか、または多環式構造を含む。
【0086】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、ジアルキル部分である。
【0087】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、対称的なジアルキル部分である。
【0088】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、非対称ジアルキル部分である。
【0089】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、Ｃ１０及びＣ１４アルキル鎖を有する非対称ジアルキル部分である。
【0090】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、２つのＣ８アルキル鎖を有するジアルキル部分である。
【0091】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、２つのＣ１０アルキル鎖を有するジアルキル部分である。
【0092】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、２つのＣ１２アルキル鎖を有するジアルキル部分である。
【0093】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、トリアルキル部分である。
【0094】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、Ｃ１０以下の３つのアルキル鎖を有するトリアルキル部分である。
【0095】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、対称的なトリアルキル部分である。
【0096】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、非対称トリアルキル部分である。
【0097】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、テトラアルキル部分である。
【0098】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、Ｃ８以下の３つのアルキル鎖を有するテトラアルキル部分である。
【0099】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、対称的なテトラアルキル部分である。
【0100】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、非対称テトラアルキル部分である。
【0101】
特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約７５０ダルトンである。
【0102】
特定の実施形態では、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートは、粒子中の総脂質の約２ｍｏｌ％の量で存在する。
【0103】
特定の実施形態では、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートは、粒子中の総脂質の約３ｍｏｌ％の量で存在する。
【0104】
特定の実施形態では、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートは、粒子中の総脂質の約４ｍｏｌ％の量で存在する。
【0105】
特定の実施形態では、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートは、粒子中の総脂質の約５ｍｏｌ％の量で存在する。
【0106】
特定の実施形態では、
（ａ）核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約０．２から約０．５ｍｏｌ％の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５，０００から約２０，０００ダルトンである。
（ａ）核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約０．２から約０．５ｍｏｌ％の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５，０００から約２０，０００ダルトンである。
【0107】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、単一のアルキル鎖である。
【0108】
特定の実施形態において、脂質アンカー部分は、ステロールもしくはステロール誘導体であるか、またはステロールもしくはステロール誘導体を含む。
【0109】
特定の実施形態において、脂質アンカー部分は、コレステロールもしくはコレステロール誘導体であるか、またはコレステロールもしくはコレステロール誘導体を含む。
【0110】
特定の実施形態において、脂質アンカー部分は、多環式構造であるか、または多環式構造を含む。
【0111】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、ジアルキル部分である。
【0112】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、対称的なジアルキル部分である。
【0113】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、非対称ジアルキル部分である。
【0114】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、Ｃ１４より長いアルキル鎖を有するジアルキル部分である。
【0115】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、Ｃ１４～Ｃ２２アルキル鎖（例えば、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、またはＣ２２）を有するジアルキル部分である。
【0116】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、２つのＣ１４アルキル鎖を有するジアルキル部分である。
【0117】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、２つのＣ１６アルキル鎖を有するジアルキル部分である。
【0118】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、２つのＣ１８アルキル鎖を有するジアルキル部分である。
【0119】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、トリアルキル部分である。
【0120】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、Ｃ８以上の３つのアルキル鎖を有するトリアルキル部分である。
【0121】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、対称的なトリアルキル部分である。
【0122】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、非対称トリアルキル部分である。
【0123】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、テトラアルキル部分である。
【0124】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、Ｃ６以上の３つのアルキル鎖を有するテトラアルキル部分である。
【0125】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、対称的なテトラアルキル部分である。
【0126】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、非対称テトラアルキル部分である。
【0127】
特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５，０００から約１０，０００ダルトンである。
【0128】
特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約８，０００から約１０，０００ダルトンである。
【0129】
特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５，０００ダルトンである。
【0130】
特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約１０，０００ダルトンである。
【0131】
特定の実施形態では、核酸は、少なくとも８０塩基の長さである。
【0132】
特定の実施形態では、核酸は、少なくとも１００塩基の長さである。
【0133】
特定の実施形態では、核酸は、少なくとも５００塩基の長さである。
【0134】
特定の実施形態において、核酸は、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、ｃｅＤＮＡ（閉末端ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、遺伝子編集構築体、ＲＮＡ編集構築体、または塩基編集構築体である。
【0135】
特定の実施形態では、核酸は、ｍＲＮＡである。
【0136】
特定の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡである。
【0137】
特定の実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡではない。
【0138】
特定の実施形態では、カチオン性脂質は、式ＣＬ１の化合物またはその塩である。
【化7】
【0139】
特定の実施形態では、カチオン性脂質は、式ＣＬ２の化合物またはその塩である。
【化8】
【0140】
特定の実施形態では、カチオン性脂質は、式ＣＬ３の化合物またはその塩である。
【化9】
【0141】
特定の実施形態では、リン脂質はＤＳＰＣである。
【0142】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、少なくとも１つの飽和アルキル鎖を含む。
【0143】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、少なくとも１つの不飽和アルキル鎖を含む。
【0144】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、少なくとも１つの二重結合を有する少なくとも１つのアルキル鎖を含む。
【0145】
特定の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で使用するためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを選択することを含む、ヒトへのＬＮＰの投与の免疫応答を低減するための方法が提供され、ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、脂質アンカー部分は、単一のアルキル鎖であり、ＬＮＰは、ｍＲＮＡペイロードを含む。
【0146】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、単一のＣ１０～Ｃ２４アルキル鎖（例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、またはＣ２４）である。
【0147】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、単一のＣ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２、またはＣ２４鎖である。
【0148】
特定の実施形態では、脂質アンカー部分は、単一のＣ１８鎖である。
【0149】
特定の実施形態では、この方法は、それを必要とするヒトを、ＬＮＰの最初の投与及び少なくとも１回のその後のＬＮＰの投与で治療することをさらに含む。
【0150】
特定の実施形態では、
（ａ）ｍＲＮＡである核酸、
（ｂ）カチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、非カチオン性脂質、及び
（ｄ）脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、一本鎖Ｃ１８アルキル部分である脂質アンカー部分に結合したＰＥＧ部分を含む。
（ａ）ｍＲＮＡである核酸、
（ｂ）カチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、非カチオン性脂質、及び
（ｄ）脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、一本鎖Ｃ１８アルキル部分である脂質アンカー部分に結合したＰＥＧ部分を含む。
【0151】
特定の実施形態では、
（ａ）ｍＲＮＡである核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約１から約２．５ｍｏｌ％（例えば、約１．６ｍоｌ％）の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、一本鎖Ｃ１４～Ｃ２２（例えば、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、またはＣ２２、例えば、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、またはＣ２２）アルキル部分である脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００から約３，０００ダルトン（例えば、約２０００ダルトン）である。
（ａ）ｍＲＮＡである核酸、
（ｂ）粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量のカチオン性脂質、
（ｃ）リン脂質とコレステロールまたはその誘導体との混合物を含む、粒子中に存在する総脂質の約３０から約７０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、及び
（ｄ）粒子中の総脂質の約１から約２．５ｍｏｌ％（例えば、約１．６ｍоｌ％）の量の、脂質ナノ粒子の凝集を阻害するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質コンジュゲートを含む脂質ナノ粒子が提供され、
ここで、ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、一本鎖Ｃ１４～Ｃ２２（例えば、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、またはＣ２２、例えば、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、またはＣ２２）アルキル部分である脂質アンカー部分に連結されたＰＥＧ部分を含み、
ＰＥＧ－脂質コンジュゲートのＰＥＧ部分の平均分子量は、約５００から約３，０００ダルトン（例えば、約２０００ダルトン）である。
【0152】
特定の実施形態は、本明細書に記載の脂質ナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【0153】
特定の実施形態において、医薬組成物は、静脈内投与に製剤化される。
【0154】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるように、脂質ナノ粒子に細胞を接触させることを含む、核酸を細胞に送達するための方法が提供される。
【0155】
特定の実施形態は、機能性タンパク質の欠損を生じさせる遺伝的欠陥を特徴とする疾患を治療するための方法であって、本明細書に記載の脂質ナノ粒子をその疾患を有する対象に投与することを含み、ここで、脂質ナノ粒子は機能性タンパク質または機能性タンパク質と同じ生物学的活性を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、方法を提供する。
【0156】
特定の実施形態は、ポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患を治療するための方法であって、本明細書に記載の脂質ナノ粒子をその疾患を有する対象に投与することを含み、ここで、脂質ナノ粒子が、過剰発現されたポリペプチドの発現を標的とするｓｉＲＮＡを含む、方法を提供する。
【0157】
特定の実施形態は、機能性タンパク質の欠損を生じさせる遺伝的欠陥を特徴とする疾患の治療的または予防的処置のための本明細書に記載の脂質ナノ粒子を提供する。
【0158】
特定の実施形態は、ポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患の治療的または予防的処置のための、本明細書に記載の脂質ナノ粒子を提供する。
【0159】
特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子中の核酸が水溶液中で例えばヌクレアーゼまたはプロテアーゼによる酵素的分解に耐性であるように、脂質粒子の脂質部分内に完全に封入される。特定の他の実施形態では、脂質粒子は、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に無毒性である。
【0160】
特定の場合では、核酸は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはこれらの混合物などの干渉ＲＮＡ分子を含む。特定の他の場合では、核酸は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、またはこれらの混合物などの、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。特定の他の場合では、核酸は、１つ以上のｍＲＮＡ分子（例えば、カクテル）を含む。
【0161】
一実施形態において、核酸は、ｓｉＲＮＡを含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５～約６０ヌクレオチド長（例えば、約１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、もしくは１９～２５ヌクレオチド長、または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド長）の二本鎖領域を含む。本発明のｓｉＲＮＡ分子は、インビトロ及び／またはインビボで標的配列の発現をサイレンシングすることができる。
【0162】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖領域に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。特定の場合では、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域に約１％～約１００％（例えば、約１％、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）の修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、二本鎖領域のヌクレオチドの約２５％未満（例えば、約２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、もしくは５％未満）または約１％～約２５％（例えば、約１％～２５％、５％～２５％、１０％～２５％、１５％～２５％、２０％～２５％、もしくは１０％～２０％）は、修飾ヌクレオチドを含む。
【0163】
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’Ｆ）ヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、及びこれらの混合物を含むがこれらに限定されない、修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－アデノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチドなどの２’ＯＭｅヌクレオチド（例えば、２’ＯＭｅプリン及び／またはピリミジンヌクレオチド）、ならびにこれらの混合物を含む。特定の場合では、ｓｉＲＮＡは、２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチドを含まない。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ヘアピンループ構造を含む。
【0164】
ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ分子の二本鎖領域の一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に修飾ヌクレオチドを含み得る。好ましくは、ウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域の選択的位置で修飾される。ウリジンヌクレオチド修飾に関して、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖のウリジンヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上は、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチドなどの修飾ウリジンヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖のすべてのウリジンヌクレオチドは、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチドである。グアノシン修飾に関して、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖のグアノシンヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上は、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチドなどの修飾グアノシンヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖のすべてのグアノシンヌクレオチドは、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチドである。
【0165】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上の５’－ＧＵ－３’モチーフは、例えば、ミスマッチを導入して５’－ＧＵ－３’モチーフを除去することによって、及び／または２’ＯＭｅヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドを導入することによって、修飾され得る。５’－ＧＵ－３’モチーフは、ｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖に存在し得る。５’－ＧＵ－３’モチーフは、互いに隣接していても、またはその代わりに１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個もしくはそれ以上のヌクレオチドで分離されていてもよい。
【0166】
いくつかの好ましい実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫刺激性が低い。そのような実施形態では、免疫刺激特性が低減した修飾ｓｉＲＮＡ分子は、標的配列に対するＲＮＡｉ活性を好都合に保持している。別の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子の免疫刺激特性及び標的遺伝子発現をサイレンシングするその能力を、例えばｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域内などのｓｉＲＮＡ配列内に最小かつ選択的な２’ＯＭｅ修飾を導入することにより、バランスさせるかまたは最適化することができる。特定の場合では、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡよりも、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％、免疫刺激性が低い。修飾ｓｉＲＮＡ分子及び対応する非修飾ｓｉＲＮＡ分子の免疫刺激特性を、例えば、適切な脂質ベースの送達系（本明細書に開示されるＬＮＰ送達系など）を使用した、哺乳動物における全身投与または哺乳動物のレスポンダー細胞のトランスフェクションの約２時間～約１２時間後のＩＮＦ－α及び／またはＩＬ－６レベルを測定することによって決定できることは、当業者には容易に明らかであろう。
【0167】
特定の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対応する非修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０（すなわち、最大半量阻害濃度）の１０倍以下のＩＣ５０を有する（すなわち、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０の１０倍以下のＩＣ５０を有する）。他の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列のＩＣ５０の３倍以下のＩＣ５０を有する。さらに他の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０の２倍以下のＩＣ５０を有する。当業者に周知の方法を使用して、用量反応曲線を生成することができ、修飾ｓｉＲＮＡ及び対応する非修飾ｓｉＲＮＡのＩＣ５０値を容易に測定できることが当業者には容易に明らかであろう。
【0168】
さらに別の実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡ分子は、対応する非修飾ｓｉＲＮＡと比較して、標的配列の発現の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％をサイレンシングすることができる。
【0169】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、例えば、二本鎖領域のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖に、リン酸骨格修飾を含まない。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖に、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のリン酸骨格修飾を含む。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、リン酸骨格修飾を含まない。
【0170】
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖に、２’－デオキシヌクレオチドを含まない。なおさらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、二本鎖領域のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖に、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の２’－デオキシヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２’－デオキシヌクレオチドを含まない。
【0171】
特定の場合では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の二本鎖領域の３’末端のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドではない。特定の他の場合では、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の二本鎖領域の３’末端近傍のヌクレオチド（例えば、３’末端の１、２、３または４ヌクレオチド以内）は、修飾ヌクレオチドではない。
【0172】
本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子は、二本鎖領域の片側もしくは両側に１つ、２つ、３つ、４つもしくはそれ以上のヌクレオチドの３’オーバーハングを有していてもよく、または二本鎖領域の片側もしくは両側にオーバーハングを欠いていても（すなわち、平滑末端を有していても）よい。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、二本鎖領域の両側に２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する。特定の場合では、アンチセンス鎖上の３’オーバーハングは、標的配列に対して相補性を有し、センス鎖上の３’オーバーハングは、標的配列の相補鎖に対して相補性を有する。あるいは、３’オーバーハングは、標的配列またはその相補鎖に対して相補性を有さない。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングは、２’－デオキシ（２’Ｈ）ヌクレオチドなどの１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。特定の好ましい実施形態では、３’オーバーハングは、デオキシチミジン（ｄＴ）及び／またはウリジンヌクレオチドを含む。他の実施形態では、二本鎖領域の片側または両側の３’オーバーハング中のヌクレオチドのうちの１つ以上は、修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は前述されており、２’ＯＭｅヌクレオチド、２’－デオキシ－２’Ｆヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－２－ＭＯＥヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、及びこれらの混合物が含まれる。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖上に存在する３’オーバーハング中の１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のヌクレオチドは、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－アデノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチドなどの２’ＯＭｅヌクレオチド（例えば、２’ＯＭｅプリン及び／またはピリミジンヌクレオチド）、ならびにこれらの混合物を含む。
【0173】
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現をサイレンシングする非修飾及び／または修飾ｓｉＲＮＡ配列の少なくとも１つまたはそれらのカクテル（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれ以上）を含み得る。ｓｉＲＮＡのカクテルは、１つ以上の標的遺伝子の同じ領域もしくはドメイン（例えば、「ホットスポット」）及び／または異なる領域もしくはドメインを対象とする配列を含み得る。特定の場合では、１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれ以上）の標的遺伝子発現をサイレンシングする修飾ｓｉＲＮＡが、カクテル中に存在する。特定の他の場合では、１つ以上（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれ以上）の標的遺伝子発現をサイレンシングする非修飾ｓｉＲＮＡ配列が、カクテル中に存在する。
【0174】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、標的配列またはその一部に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である配列を含むか、またはそれからなる。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、標的配列またはその一部に１００％相補的である配列を含むか、またはそれからなる。さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、標的配列またはその一部に特異的にハイブリダイズする配列を含むか、またはそれからなる。
【0175】
さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、標的配列またはその一部に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含むか、またはそれからなる。追加の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、標的配列またはその一部に１００％同一である配列を含むか、またはそれからなる。
【0176】
コレステロール誘導体の例には、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテルの合成は、本明細書に記載されている。
【0177】
本明細書で使用される場合、ＤＳＰＣは、ジステアロイルホスファチジルコリンを意味する。
【0178】
本発明の脂質粒子において、核酸は、粒子の脂質部分内に完全に封入され得、このことにより、核酸を酵素分解から保護することができる。好ましい実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡなどの核酸を含むＬＮＰは、粒子の脂質部分内に完全に封入されており、このことにより、核酸をヌクレアーゼ分解から保護する。特定の場合では、ＬＮＰ中の核酸は、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、または６０分間粒子をヌクレアーゼに曝露させた後に、実質的に分解されない。特定の他の場合では、ＬＮＰ中の核酸は、血清中で粒子を３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分間または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間インキュベートした後に実質的に分解されない。他の実施形態では、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍＲＮＡなどの核酸）は、粒子の脂質部分と複合体を形成している。本発明の製剤の利点の１つは、脂質粒子組成物が、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に無毒性であることである。
【0179】
「完全に封入された」という用語は、脂質粒子中の核酸が、遊離のＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を著しく分解し得る血清またはヌクレアーゼもしくはプロテアーゼアッセイへの曝露後に著しく分解されないことを示す。完全に封入された系では、遊離核酸の１００％を通常分解する処理において、好ましくは粒子中の核酸の約２５％未満が分解され、より好ましくは粒子中の核酸の約１０％未満、最も好ましくは約５％未満が分解される。核酸治療剤との関連において、完全な封入は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより判定することができる。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチド及び一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを定量化するための超高感度蛍光核酸染色剤である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）。「完全に封入された」とはまた、脂質粒子が血清安定性であること、すなわち、インビボ投与時にそれらがその構成成分に迅速に分解されないことも示す。
【0180】
別の態様では、本発明は、複数の脂質粒子を含む脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）組成物を提供する。好ましい実施形態では、核酸（例えば、核酸）は、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の約３０％～約１００％、約４０％～約１００％、約５０％～約１００％、約６０％～約１００％、約７０％～約１００％、約８０％～約１００％、約９０％～約１００％、約３０％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％、約８０％～約９５％、約８５％～約９５％、約９０％～約９５％、約３０％～約９０％、約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、または少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％（あるいは任意のその端数またはその中の範囲）がその中に封入された核酸を有するように、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の脂質部分内に完全に封入される。
【0181】
典型的には、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、約１～約１００の脂質：活性剤（例えば、脂質：核酸）比（質量／質量比）を有する。場合によっては、脂質：活性剤（例えば、脂質：核酸）比（質量／質量比）は、約１～約５０、約２～約２５、約３～約２０、約４～約１５、または約５～約１０の範囲である。
【0182】
典型的には、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍの平均直径を有する。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、約４０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１２０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約１２０ｎｍ未満、約１１０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、もしくは約８０ｎｍ未満（あるいは任意のその端数またはその中の範囲）の平均直径を有する。
【0183】
本発明はまた、本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【0184】
さらなる態様では、本発明は、１つ以上の活性剤または治療剤（例えば、核酸）を細胞に導入するための方法であって、本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）に細胞を接触させることを含む方法を提供する。一実施形態では、細胞は哺乳動物中に存在し、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、本発明は、１つ以上の活性剤または治療剤（例えば、核酸）をインビボ送達するための方法であって、本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を哺乳動物対象に投与することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、投与様式には、経口、鼻腔内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、病巣内、気管内、皮下、及び皮内が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、哺乳動物対象はヒトである。
【0185】
一実施形態では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の総注射用量の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、または２５％が、注射の約８、１２、２４、３６、または４８時間後の血漿中に存在する。他の実施形態では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の総注射用量の約２０％超、３０％超、４０％超、及び約６０％、７０％または８０％までもが、注射の約８、１２、２４、３６、または４８時間後に血漿中に存在する。特定の場合では、複数の粒子の約１０％超が、投与の約１時間後に哺乳動物の血漿中に存在する。特定の他の場合では、脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）の存在は、粒子の投与の少なくとも約１時間後に検出可能である。特定の実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡなどの核酸の存在は、投与の約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２または９６時間後に細胞内で検出可能である（例えば、肺、肝臓、腫瘍、または炎症部位）。他の実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの核酸による標的配列の発現の下方制御は、投与の約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２または９６時間後に検出可能である。さらに他の実施形態では、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの核酸による標的配列の発現の下方制御は、腫瘍細胞内で、または炎症部位の細胞内で優先的に生じる。さらなる実施形態では、投与部位から近位もしくは遠位の部位の細胞内または肺、肝臓、もしくは腫瘍の細胞内の干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの核酸の存在または作用は、投与の約１２、２４、４８、７２、もしくは９６時間後、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２６、もしくは２８日後に検出可能である。他の実施形態では、ｍＲＮＡまたは自己増幅ＲＮＡなどの核酸による標的配列の発現の上方制御は、投与の約８、１２、２４、３６、４８、６０、７２または９６時間後に検出可能である。さらに他の実施形態では、ｍＲＮＡまたは自己増幅ＲＮＡなどの核酸による標的配列の発現の上方制御は、腫瘍細胞内で、または炎症部位の細胞内で優先的に生じる。さらなる実施形態では、投与部位から近位もしくは遠位の部位の細胞内または肺、肝臓、もしくは腫瘍の細胞内のｍＲＮＡまたは自己増幅ＲＮＡなどの核酸の存在または作用は、投与の約１２、２４、４８、７２、もしくは９６時間後、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２０、２２、２４、２６、もしくは２８日後に検出可能である。追加の実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、非経口投与または腹腔内投与される。実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、筋肉内投与される。
【0186】
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、干渉ＲＮＡ配列（例えばｓｉＲＮＡ）を含む１つ以上の核酸の治療的送達のための方法に有用である。特に、１つ以上の標的核酸配列または目的遺伝子の転写及び／または翻訳を下方制御またはサイレンシングすることによって、哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類またはヒト、チンパンジー、もしくはサルなどの霊長類）における疾患または障害を治療するためのインビトロ法及びインビボ法を提供することは、本発明の１つの目的である。非限定的な例として、本発明の方法は、哺乳動物対象の肝臓及び／または腫瘍への干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）のインビボ送達に有用である。特定の実施形態では、疾患または障害は、遺伝子の発現及び／または過剰発現と関連しており、遺伝子の発現または過剰発現は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）によって低減される。特定の他の実施形態では、治療有効量の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を、哺乳動物に投与することができる。場合によっては、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をＬＮＰに製剤化して、この粒子を、そのような治療を必要とする患者に投与する。他の場合では、細胞を患者から取り出し、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）をインビトロで（例えば、本明細書に記載のＬＮＰを使用して）送達し、その細胞を患者に再注入する。
【0187】
追加の態様では、本発明は、標的遺伝子の発現をサイレンシングする非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）分子を含む脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）、及びそのような粒子を使用して標的遺伝子の発現をサイレンシングする方法を提供する。
【0188】
一実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、約１０～約２５（塩基対形成）ヌクレオチド長の二本鎖（二重鎖）領域を含み、ａｉＲＮＡ分子は５’及び３’オーバーハングを含むアンチセンス鎖を含み、ａｉＲＮＡ分子は標的遺伝子発現をサイレンシングすることができる。
【0189】
一実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、約１２～２０、１２～１９、１２～１８、１３～１７、または１４～１７（塩基対形成）ヌクレオチド長、より典型的には、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０（塩基対形成）ヌクレオチド長の二本鎖（二重鎖）領域を含む。特定の他の場合では、アンチセンス鎖上の５’及び３’オーバーハングは標的ＲＮＡ配列に相補的である配列を含み、任意選択で、非標的配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖上の５’及び３’オーバーハングの各々は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上のヌクレオチドを含むか、またはそれらからなる。
【0190】
他の実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチド、２’Ｆヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、及びこれらの混合物からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチドを含む。非限定的な例として、２’ＯＭｅヌクレオチドは、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、及びこれらの混合物からなる群から選択され得る。
【0191】
関連する態様では、本発明は、標的遺伝子の発現をサイレンシングするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を含む脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）、及びそのような組成物を使用して標的遺伝子発現をサイレンシングする方法を提供する。
【0192】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、約１５～約６０ヌクレオチド長で構成され、ｍｉＲＮＡ分子は標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。
【0193】
特定の場合では、ｍｉＲＮＡ分子は、約１５～５０、１５～４０、または１５～３０ヌクレオチド長、より典型的には約１５～２５または１９～２５ヌクレオチド長、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチド長で構成される。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、目的ＲＮＡ配列を標的とする成熟ｍｉＲＮＡ分子である。
【0194】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチド、２’Ｆヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、及びこれらの混合物からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチドを含む。非限定的な例として、２’ＯＭｅヌクレオチドは、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、及びこれらの混合物からなる群から選択され得る。
【0195】
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、１つ以上のｍＲＮＡ分子の治療的送達のための方法に有用である。特に、１つ以上の標的タンパク質の発現を介して哺乳動物（例えば、マウスなどのげっ歯類またはヒト、チンパンジー、もしくはサルなどの霊長類）における疾患または障害を治療するためのインビトロ法及びインビボ法を提供することは、本発明の１つの目的である。非限定的な例として、本発明の方法は、哺乳動物対象への１つ以上のｍＲＮＡ分子のインビボ送達に有用である。特定の他の実施形態では、治療有効量の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を、哺乳動物に投与することができる。場合によっては、１つ以上のｍＲＮＡ分子をＬＮＰに製剤化して、この粒子を、そのような治療を必要とする患者に投与する。他の場合では、細胞を患者から取り出し、１つ以上のｍＲＮＡ分子をインビトロで（例えば、本明細書に記載のＬＮＰを使用して）送達し、その細胞を患者に再注入する。
【0196】
他の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、２’ＯＭｅヌクレオチド、２’Ｆヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－ＭＯＥヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、及びこれらの混合物からなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む。関連する態様では、本発明は、標的遺伝子の発現をサイレンシングするマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子を含む脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）、及びそのような組成物を使用して標的遺伝子発現をサイレンシングする方法を提供する。
【0197】
したがって、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、これらが循環中に安定しており、血管外部位へのアクセスをもたらす薬力学的挙動に必要とされるサイズであり、標的細胞集団に到達することができることから、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、及び／またはｍｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ、あるいはｍＲＮＡ）などの活性剤または治療剤の対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）への投与に使用するために好都合であり適している。
【0198】
本発明の文脈において、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然の塩基、糖及び糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、同様に機能する非天然モノマーまたはその一部を含むポリマーまたはオリゴマーを含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの向上、免疫原性の低減、及びヌクレアーゼ存在下での安定性の増加などの特性故に、天然型よりも好ましいことが多い。
【0199】
オリゴヌクレオチドは一般に、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドに分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、デオキシリボースと称される５炭糖からなり、この糖の５’炭素及び３’炭素でリン酸に共有結合して、交互の非分枝ポリマーを形成する。リボオリゴヌクレオチドは、５炭糖がリボースである類似の繰り返し構造からなる。
【0200】
本発明による脂質－核酸粒子中に存在する核酸は、公知の任意の形態の核酸を含む。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例は本明細書に記載されており、例えば、構造遺伝子、制御及び終止領域を含む遺伝子、ならびにウイルスＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡなどの自己複製系が含まれる。二本鎖ＲＮＡの例は本明細書に記載されており、例えば、ｓｉＲＮＡ、ならびにａｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡなどの他のＲＮＡｉ剤が含まれる。一本鎖核酸には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、成熟ｍｉＲＮＡ、及び三重鎖形成性オリゴヌクレオチドが含まれる。
【0201】
核酸は、一般に核酸の特定の形態に応じて、様々な長さのものであり得る。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子は、約１，０００～約１００，０００ヌクレオチド残基長であり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０～約１００ヌクレオチド長の範囲であり得る。関連する様々な実施形態では、一本鎖、二本鎖、及び三本鎖のいずれかのオリゴヌクレオチドは、約１０～約６０ヌクレオチド長、約１５～約６０ヌクレオチド長、約２０～約５０ヌクレオチド長、約１５～約３０ヌクレオチド長、または約２０～約３０ヌクレオチド長の長さの範囲であり得る。
【0202】
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするか、またはそれに相補的である。本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとの間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な程度の相補性を示す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列に対して１００％相補的である必要はないことを理解されたい。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドの標的配列への結合が標的配列の正常機能を妨害して標的配列からの有用性または発現の喪失を引き起こす場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望まれる条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合には生理学的条件下で、またはインビトロアッセイの場合にはそのアッセイが行われる条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある。したがって、オリゴヌクレオチドは、それが標的とするかまたはそれが特異的にハイブリダイズする遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域と比較して、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の塩基置換を含み得る。
【0203】
ｓｉＲＮＡ
本発明の脂質ナノ粒子のｓｉＲＮＡ成分は、目的の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。ｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖は、通常、約１５～約６０ヌクレオチド長、好ましくは、約１５～約３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾ｓｉＲＮＡは、一般に、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫刺激性が低く、かつ目的の標的遺伝子に対するＲＮＡｉ活性を保持している。いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅプリンヌクレオチドまたは２’ＯＭｅピリミジンヌクレオチド、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－アデノシンヌクレオチド、及び／または２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチドを含有する。好ましい実施形態では、ウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドのうちの１つ以上は、修飾されている。修飾ヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に存在し得る。ｓｉＲＮＡ配列は、オーバーハング（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５：１８８（２００１）またはＮｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７：３０９（２００１）に記載されている３’もしくは５’オーバーハング）を有していてもよく、またはオーバーハングを欠いていてもよい（すなわち、平滑末端を有する）。
本発明の脂質ナノ粒子のｓｉＲＮＡ成分は、目的の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。ｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖は、通常、約１５～約６０ヌクレオチド長、好ましくは、約１５～約３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾ｓｉＲＮＡは、一般に、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫刺激性が低く、かつ目的の標的遺伝子に対するＲＮＡｉ活性を保持している。いくつかの実施形態では、修飾ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの２’ＯＭｅプリンヌクレオチドまたは２’ＯＭｅピリミジンヌクレオチド、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－アデノシンヌクレオチド、及び／または２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチドを含有する。好ましい実施形態では、ウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドのうちの１つ以上は、修飾されている。修飾ヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの一方の鎖（すなわち、センスもしくはアンチセンス）または両方の鎖に存在し得る。ｓｉＲＮＡ配列は、オーバーハング（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５：１８８（２００１）またはＮｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７：３０９（２００１）に記載されている３’もしくは５’オーバーハング）を有していてもよく、またはオーバーハングを欠いていてもよい（すなわち、平滑末端を有する）。
【0204】
修飾ｓｉＲＮＡは、一般に、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域に約１％～約１００％（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％）の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域内のヌクレオチドのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれ以上は、修飾ヌクレオチドを含む。
【0205】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域内のヌクレオチドの約２５％未満（例えば、約２５％未満、約２４％未満、約２３％未満、約２２％未満、約２１％未満、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満）は、修飾ヌクレオチドを含む。
【0206】
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域内のヌクレオチドの約１％～約２５％（例えば、約１％～２５％、２％～２５％、３％～２５％、４％～２５％、５％～２５％、６％～２５％、７％～２５％、８％～２５％、９％～２５％、１０％～２５％、１１％～２５％、１２％～２５％、１３％～２５％、１４％～２５％、１５％～２５％、１６％～２５％、１７％～２５％、１８％～２５％、１９％～２５％、２０％～２５％、２１％～２５％、２２％～２５％、２３％～２５％、２４％～２５％など）または約１％～約２０％（例えば、約１％～２０％、２％～２０％、３％～２０％、４％～２０％、５％～２０％、６％～２０％、７％～２０％、８％～２０％、９％～２０％、１０％～２０％、１１％～２０％、１２％～２０％、１３％～２０％、１４％～２０％、１５％～２０％、１６％～２０％、１７％～２０％、１８％～２０％、１９％～２０％、１％～１９％、２％～１９％、３％～１９％、４％～１９％、５％～１９％、６％～１９％、７％～１９％、８％～１９％、９％～１９％、１０％～１９％、１１％～１９％、１２％～１９％、１３％～１９％、１４％～１９％、１５％～１９％、１６％～１９％、１７％～１９％、１８％～１９％、１％～１８％、２％～１８％、３％～１８％、４％～１８％、５％～１８％、６％～１８％、７％～１８％、８％～１８％、９％～１８％、１０％～１８％、１１％～１８％、１２％～１８％、１３％～１８％、１４％～１８％、１５％～１８％、１６％～１８％、１７％～１８％、１％～１７％、２％～１７％、３％～１７％、４％～１７％、５％～１７％、６％～１７％、７％～１７％、８％～１７％、９％～１７％、１０％～１７％、１１％～１７％、１２％～１７％、１３％～１７％、１４％～１７％、１５％～１７％、１６％～１７％、１％～１６％、２％～１６％、３％～１６％、４％～１６％、５％～１６％、６％～１６％、７％～１６％、８％～１６％、９％～１６％、１０％～１６％、１１％～１６％、１２％～１６％、１３％～１６％、１４％～１６％、１５％～１６％、１％～１５％、２％～１５％、３％～１５％、４％～１５％、５％～１５％、６％～１５％、７％～１５％、８％～１５％、９％～１５％、１０％～１５％、１１％～１５％、１２％～１５％、１３％～１５％、１４％～１５％など）は、修飾ヌクレオチドを含む。
【0207】
さらなる実施形態では、例えば、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖がウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドにおいて選択的に修飾される場合、生じる修飾ｓｉＲＮＡは、約３０％未満の修飾ヌクレオチド（例えば、約３０％未満、約２９％未満、約２８％未満、約２７％未満、約２６％未満、約２５％未満、約２４％未満、約２３％未満、約２２％未満、約２１％未満、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、もしくは約１％未満の修飾ヌクレオチド）、または約１％～約３０％の修飾ヌクレオチド（例えば、約１％～３０％、２％～３０％、３％～３０％、４％～３０％、５％～３０％、６％～３０％、７％～３０％、８％～３０％、９％～３０％、１０％～３０％、１１％～３０％、１２％～３０％、１３％～３０％、１４％～３０％、１５％～３０％、１６％～３０％、１７％～３０％、１８％～３０％、１９％～３０％、２０％～３０％、２１％～３０％、２２％～３０％、２３％～３０％、２４％～３０％、２５％～３０％、２６％～３０％、２７％～３０％、２８％～３０％、もしくは２９％～３０％の修飾ヌクレオチド）を含み得る。
【0208】
ｓｉＲＮＡ配列の選択
好適なｓｉＲＮＡ配列は、当該技術分野で公知の任意の手段を使用して同定することができる。通常、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４－４９８（２００１）及びＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７－６８８８（２００１）に記載されている方法を、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（３）：３２６－３３０（２００４）に記載の合理的設計規則と組み合わせる。
好適なｓｉＲＮＡ配列は、当該技術分野で公知の任意の手段を使用して同定することができる。通常、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４－４９８（２００１）及びＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７－６８８８（２００１）に記載されている方法を、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２２（３）：３２６－３３０（２００４）に記載の合理的設計規則と組み合わせる。
【0209】
一般に、目的の標的遺伝子からの転写物のＡＵＧ開始コドンのヌクレオチド配列３’を、ジヌクレオチド配列（例えば、ＡＡ、ＮＡ、ＣＣ、ＧＧ、またはＵＵ（Ｎ＝Ｃ、ＧもしくはＵ））についてスキャンする（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７－６８８８（２００１）を参照されたい）。ジヌクレオチド配列のすぐ３’側のヌクレオチドを、潜在的なｓｉＲＮＡ配列（すなわち、標的配列またはセンス鎖配列）として同定する。通常、ジヌクレオチド配列のすぐ３’側の１９個、２１個、２３個、２５個、２７個、２９個、３１個、３３個、３５個、またはそれ以上のヌクレオチドを、潜在的なｓｉＲＮＡ配列として同定する。いくつかの実施形態では、ジヌクレオチド配列はＡＡまたはＮＡ配列であり、ＡＡまたはＮＡジヌクレオチドのすぐ３’側の１９個のヌクレオチドを潜在的なｓｉＲＮＡ配列として同定する。ｓｉＲＮＡ配列を、一般に、標的遺伝子の長さに沿って異なる位置で間隔を空けて配置する。ｓｉＲＮＡ配列のサイレンシング効率をさらに高めるために、潜在的なｓｉＲＮＡ配列を分析して、例えば標的細胞または生物における、他のコード配列との相同領域を含まない部位を同定することができる。例えば、約２１塩基対の好適なｓｉＲＮＡ配列は、通常、標的細胞または生物におけるコード配列に対して相同である１６～１７を超える連続塩基対を有さない。ｓｉＲＮＡ配列をＲＮＡ ＰｏｌＩＩＩプロモーターから発現させる場合、４つを超えて連続するＡまたはＴを欠くｓｉＲＮＡ配列を選択する。
【0210】
潜在的なｓｉＲＮＡ配列を同定した後、相補配列（すなわち、アンチセンス鎖配列）を設計することができる。潜在的なｓｉＲＮＡ配列はまた、当該技術分野で公知の様々な基準を使用して分析することができる。例えば、それらのサイレンシング効率を高めるために、合理的設計アルゴリズムによってｓｉＲＮＡ配列を分析し、以下の特徴、すなわち、（１）約２５％～約６０％Ｇ／ＣであるＧ／Ｃ含有量、（２）センス鎖の１５～１９位に少なくとも３つのＡ／Ｕ、（３）内部リピートなし、（４）センス鎖の１９位がＡ、（５）センス鎖の３位がＡ、（６）センス鎖の１０位がＵ、（７）センス鎖の１９位がＧ／Ｃではない、及び（８）センス鎖の１３位がＧではない、の１つ以上を有する配列を同定することができる。これらの各特性の適切な値を割り当て、ｓｉＲＮＡの選択に有用なアルゴリズムを組み込んだｓｉＲＮＡ設計ツールは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚ０９４．ｕｓｔ．ｈｋ／ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡに見出すことができる。当業者は、前述の特徴のうちの１つ以上を有する配列を、潜在的なｓｉＲＮＡ配列としてさらなる分析及び試験のために選択することができることを理解するであろう。
【0211】
さらに、以下の基準、すなわち、（１）連続して４つ以上並んだ同じ塩基を含む配列、（２）Ｇのホモポリマーを含む配列（すなわち、これらのポリマーの構造的特性に起因する起こり得る非特異的作用を低減させるため）、（３）三重塩基モチーフ（例えば、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＡＡＡ、またはＴＴＴ）を含む配列、（４）連続して７つ以上並んだＧ／Ｃを含む配列、及び（５）候補内に４つ以上の塩基のダイレクトリピートを含み内部フォールドバック構造をもたらす配列、の１つ以上を有する潜在的なｓｉＲＮＡ配列は、多くの場合ｓｉＲＮＡとしては除外される。しかしながら、当業者は、前述の特徴のうちの１つ以上を有する配列を、潜在的なｓｉＲＮＡ配列としてさらなる分析及び試験のために依然として選択することができることを理解するであろう。
【0212】
いくつかの実施形態では、潜在的なｓｉＲＮＡ配列を、例えば、Ｋｈｖｏｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：２０９－２１６（２００３）、及びＳｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：１９９－２０８（２００３）に記載されているように、ｓｉＲＮＡ二重鎖非対称に基づいてさらに分析することができる。他の実施形態では、潜在的なｓｉＲＮＡ配列を、例えば、Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１８：３０３－３１０（２００４）に記載されているように、標的部位での二次構造に基づいてさらに分析することができる。例えば、標的部位での二次構造を、Ｍｆｏｌｄアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｍｆｏｌｄ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉで入手可能）を使用してモデル化し、塩基対合の形態で二次構造が少なくステムループが存在する、標的部位での到達性に有利なｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。
【0213】
潜在的なｓｉＲＮＡ配列を同定した後、例えば、インビトロサイトカインアッセイまたはインビボ動物モデルを使用して、任意の免疫刺激特性の存在について配列を分析することができる。ｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖内のモチーフ、例えばＧＵリッチモチーフ（例えば、５’－ＧＵ－３’、５’－ＵＧＵ－３’、５’－ＧＵＧＵ－３’、５’－ＵＧＵＧＵ－３’など）もまた、配列が免疫刺激性であり得るか否かの指標を提供し得る。ｓｉＲＮＡ分子が免疫刺激性であることが判明すると、次に、本明細書に記載の通りに、免疫刺激性を低下させるようにｓｉＲＮＡ分子を修飾することができる。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡが免疫刺激性ｓｉＲＮＡまたは非免疫刺激性ｓｉＲＮＡのいずれであるかを判定するために、検出可能な免疫応答を細胞が生じるような条件下で、ｓｉＲＮＡ配列を哺乳動物のレスポンダー細胞と接触させることができる。哺乳動物のレスポンダー細胞は、ナイーブ哺乳動物（すなわち、これまでｓｉＲＮＡ配列の遺伝子産物と接触したことのない哺乳動物）に由来し得る。哺乳動物のレスポンダー細胞は、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、マクロファージなどであり得る。検出可能な免疫応答は、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、及びこれらの組み合わせなどの、サイトカインまたは増殖因子の生成を含み得る。次に、免疫刺激性であると同定されたｓｉＲＮＡ分子を、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖のヌクレオチドのうちの少なくとも１つを修飾ヌクレオチドで置換することにより修飾して、その免疫刺激特性を低下させることができる。例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖の二本鎖領域内のヌクレオチドの約３０％未満（例えば、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満）を、２’ＯＭｅヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドで置換することができる。次に、修飾ｓｉＲＮＡを前述の通りに哺乳動物のレスポンダー細胞と接触させて、その免疫刺激特性が低減または抑制されていることを確認することができる。
【0214】
免疫応答を検出するための好適なインビトロアッセイには、Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．の二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法（米国特許第４，３７６，１１０号）；モノクローナル－ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Ｗｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｋｉｒｋｈａｍ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，ｅｄｓ．，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（１９７０））；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．の「ウエスタンブロット」法（米国特許第４，４５２，９０１号）；標識リガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：４９８０－４９８３（１９８０））；例えば、Ｒａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：５１５４－５１６０（１９８２）により記載されている酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学法（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９：４７７（１９８０））；及び活性の中和（Ｂｏｗｅｎ－Ｐｏｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：２３９６－２４００（１９８４））が含まれるが、これらに限定されない。前述のイムノアッセイに加えて、米国特許第３，８１７，８２７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、及び同第４，０９８，８７６号に記載されているものを含む、他の多数のイムノアッセイが利用可能である。これらの参照文献の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0215】
免疫応答を検出するためのインビボモデルの非限定的な例には、例えば、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３：４９４－５０５（２００６）に記載されているインビボマウスサイトカイン誘導アッセイが含まれる。特定の実施形態では、以下の通り実施することができるアッセイ：（１）ｓｉＲＮＡを、標準的な静脈内注射により外側尾静脈に投与することができる、（２）血液を、投与の約６時間後に心臓穿刺により採取して、サイトカイン分析用の血漿として処理することができる、及び（３）サイトカインを、サンドイッチＥＬＩＳＡキットを製造業者の指示に従って使用して定量化することができる（例えば、マウス及びヒトＩＦＮ－α（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、ヒトＩＬ－６及びＴＮＦ－α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ならびにマウスＩＬ－６、ＴＮＦ－α、及びＩＦＮ－γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））。
【0216】
サイトカイン及び増殖因子に特異的に結合するモノクローナル抗体は、複数の供給源から市販されており、当該技術分野で公知の方法を使用して作製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照されたい）。モノクローナル抗体の作製は以前に記載されており、当該技術分野で公知の任意の手段により行うことができる（Ｂｕｈｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１，ｐｐ．７７－７８（１９９１））。いくつかの方法では、モノクローナル抗体は、検出を容易にするために（例えば、分光学的、光化学的、生化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物で）標識される。
【0217】
ｓｉＲＮＡ分子の作製
ｓｉＲＮＡは、例えば、１つ以上の単離された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖として、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）として、またはＤＮＡプラスミド中の転写カセットから転写されたｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡとして、を含むいくつかの形態で提供され得る。ｓｉＲＮＡ配列は、オーバーハング（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５：１８８（２００１）またはＮｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７：３０９（２００１）に記載されている３’もしくは５’オーバーハング）を有していてもよく、またはオーバーハングを（すなわち、平滑末端を有するように）欠いていてもよい。
ｓｉＲＮＡは、例えば、１つ以上の単離された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖として、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）として、またはＤＮＡプラスミド中の転写カセットから転写されたｓｉＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡとして、を含むいくつかの形態で提供され得る。ｓｉＲＮＡ配列は、オーバーハング（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５：１８８（２００１）またはＮｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７：３０９（２００１）に記載されている３’もしくは５’オーバーハング）を有していてもよく、またはオーバーハングを（すなわち、平滑末端を有するように）欠いていてもよい。
【0218】
ＲＮＡ集団を使用して長い前駆体ＲＮＡを得ることができ、または選択した標的配列に対して実質的もしくは完全な同一性を有する長い前駆体ＲＮＡを使用してｓｉＲＮＡを作製することができる。ＲＮＡは、当業者に周知の方法に従って細胞または組織から単離し、合成し、及び／またはクローン化することができる。ＲＮＡは、（細胞もしくは組織から得られる、ｃＤＮＡから転写される、サブトラクトされる、選択されるなどの）混合集団であり得、または単一の標的配列を表し得る。ＲＮＡは、天然（例えば、組織または細胞試料から単離される）であり得るか、インビトロで（例えば、Ｔ７もしくはＳＰ６ポリメラーゼ及びＰＣＲ産物またはクローン化ｃＤＮＡを使用して）合成され得るか、あるいは化学合成され得る。
【0219】
長いｄｓＲＮＡを形成するために、合成ＲＮＡの場合、相補体もインビトロで転写しハイブリダイズしてｄｓＲＮＡを形成する。天然ＲＮＡ集団を使用する場合、例えば、ＲＮＡ集団に対応するｃＤＮＡを転写することによって、またはＲＮＡポリメラーゼを使用することによって、（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅＩＩＩまたはダイサーによる消化用のｄｓＲＮＡを形成するために）ＲＮＡ相補体もまた、提供される。次に、前駆体ＲＮＡをハイブリダイズさせて、消化用の二本鎖ＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡは、対象に直接投与することも、または投与前にインビトロで消化することもできる。
【0220】
ＲＮＡの単離、ＲＮＡの合成、核酸のハイブリダイズ、ｃＤＮＡライブラリーの作成及びスクリーニング、ならびにＰＣＲの実施のための方法は、ＰＣＲ法（米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照されたい）と同様に、当該技術分野において周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３－２６９（１９８３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上掲、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，上掲を参照されたい）。発現ライブラリーもまた、当業者に周知である。本発明における一般的な使用方法を開示するさらなる基本的な文書には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が含まれる。これらの参照文献の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0221】
好ましくは、ｓｉＲＮＡは化学合成される。本発明のｓｉＲＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドは、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９：７８４５（１９８７）、Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：５４３３（１９９０）、Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３：２６７７－２６８４（１９９５）、及びＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４：５９（１９９７）に記載されているものなどの当該技術分野で公知の任意の様々な技術を使用して合成することができる。オリゴヌクレオチドの合成は、５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホラミダイトなどの一般的な核酸保護基及びカップリング基を使用する。非限定的な例として、スモールスケールの合成は、０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ合成装置で実施することができる。あるいは、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）の９６ウェルプレート合成装置で実施することができる。しかしながら、より大きなまたはより小さなスケールの合成もまた、本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチド合成に適した試薬、ＲＮＡ脱保護の方法、及びＲＮＡ精製の方法は、当業者に公知である。
【0222】
ｓｉＲＮＡ分子はまた、タンデム合成技術を介して合成することもでき、ここで、両方の鎖を、切断可能なリンカーによって分離した単一の連続するオリゴヌクレオチド断片または鎖として合成し、これらはその後切断されて別個の断片または鎖をもたらし、これらがハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであり得る。ｓｉＲＮＡのタンデム合成は、マルチウェル／マルチプレート合成プラットフォーム、及びバッチ反応器、合成カラムなどを用いるラージスケール合成プラットフォームの両方に容易に適応させることができる。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子を、一方のオリゴヌクレオチドがｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み他方がアンチセンス鎖を含む、２つの別個のオリゴヌクレオチドからアセンブルすることができる。例えば、各鎖を別々に合成し、合成及び／または脱保護の後にハイブリダイゼーションまたはライゲーションによって互いに連結させることができる。特定の他の場合では、ｓｉＲＮＡ分子を単一の連続するオリゴヌクレオチド断片として合成することができ、ここで、自己相補的センス領域とアンチセンス領域がハイブリダイズして、ヘアピン二次構造を有するｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。
【0223】
ｓｉＲＮＡ配列の修飾
特定の態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、２本の鎖と、二本鎖領域に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドとを有する二重鎖を含み、ここで、各鎖は、約１５～約６０ヌクレオチド長である。有利なことに、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫刺激性が低いが、標的配列の発現をサイレンシングする能力を保持している。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子に導入される化学修飾の程度は、ｓｉＲＮＡの免疫刺激特性の低減または抑制と、ＲＮＡｉ活性の保持との間のバランスをとる。非限定的な例として、目的遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子発現をサイレンシングするその能力を保持しながらｓｉＲＮＡによって生じる免疫応答を排除するように、ｓｉＲＮＡ二重鎖内の選択的なウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドにおいて最小限に修飾され得る（例えば、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満修飾される）。
特定の態様では、ｓｉＲＮＡ分子は、２本の鎖と、二本鎖領域に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドとを有する二重鎖を含み、ここで、各鎖は、約１５～約６０ヌクレオチド長である。有利なことに、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫刺激性が低いが、標的配列の発現をサイレンシングする能力を保持している。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子に導入される化学修飾の程度は、ｓｉＲＮＡの免疫刺激特性の低減または抑制と、ＲＮＡｉ活性の保持との間のバランスをとる。非限定的な例として、目的遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子発現をサイレンシングするその能力を保持しながらｓｉＲＮＡによって生じる免疫応答を排除するように、ｓｉＲＮＡ二重鎖内の選択的なウリジン及び／またはグアノシンヌクレオチドにおいて最小限に修飾され得る（例えば、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満修飾される）。
【0224】
本発明での使用に適した修飾ヌクレオチドの例には、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’Ｆ）、２’－デオキシ、５－Ｃ－メチル、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、４’－チオ、２’－アミノ、または２’－Ｃ－アリル基を有するリボヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｅｄ．（１９８４）に記載されているものなどのノーザンコンフォメーション（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を有する修飾ヌクレオチドもまた、ｓｉＲＮＡ分子における使用に適している。そのような修飾ヌクレオチドには、ロックド核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－（Ｄ－リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’－メチル－チオ－エチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’Ｆ）ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－クロロ（２’Ｃｌ）ヌクレオチド、及び２’－アジドヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。特定の場合では、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子は、１つ以上のＧ－クランプヌクレオチドを含む。Ｇ－クランプヌクレオチドは、修飾シトシン類似体であって、その修飾が、二重鎖内の相補的なグアニンヌクレオチドのワトソン－クリック面及びフーグスティーン面の両方に水素結合する能力を付与する類似体を指す（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０：８５３１－８５３２（１９９８）を参照されたい）。さらに、ヌクレオチド塩基類似体、例えば、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチルなど、他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびにニトロアゾール誘導体、例えば、３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、及び６－ニトロインドールを有するヌクレオチド（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２４３７－２４４７（２００１）を参照されたい）を、ｓｉＲＮＡ分子に組み込むことができる。
【0225】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、１つ以上の化学修飾、例えば、末端キャップ部分、リン酸骨格修飾などをさらに含み得る。末端キャップ部分の例には、逆位デオキシ脱塩基残基、グリセリル修飾、４’，５’－メチレンヌクレオチド、１－（β－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、α－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、スレオ－ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’－セコヌクレオチド、非環式３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５－ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－逆位ヌクレオチド部分、３’－３’－逆位脱塩基部分、３’－２’－逆位ヌクレオチド部分、３’－２’－逆位脱塩基部分、５’－５’－逆位ヌクレオチド部分、５’－５’－逆位脱塩基部分、３’－５’－逆位デオキシ脱塩基部分、５’－アミノ－アルキルホスフェート、１，３－ジアミノ－２－プロピルホスフェート、３－アミノプロピルホスフェート、６－アミノヘキシルホスフェート、１，２－アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，４－ブタンジオールホスフェート、３’－ホスホロアミデート、５’－ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、５’－アミノ、３’－ホスホロチオエート、５’－ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及び架橋もしくは非架橋メチルホスホネートまたは５’－メルカプト部分が含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第５，９９８，２０３号、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９：１９２５（１９９３）を参照されたい）。リン酸骨格修飾（すなわち、修飾されたヌクレオチド間結合をもたらす）の非限定的な例には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、及びアルキルシリル置換が含まれる（例えば、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１－４１７（１９９５）、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４－３９（１９９４）を参照されたい）。このような化学修飾は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の５’末端及び／または３’末端で生じ得る。これらの参照文献の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0226】
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、約１つ～約４つ（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）の２’－デオキシリボヌクレオチド及び／または修飾及び非修飾ヌクレオチドの任意の組み合わせを有する３’末端オーバーハングをさらに含み得る。ｓｉＲＮＡ分子に導入することができる修飾ヌクレオチド及び化学修飾のタイプのさらなる例は、例えば、英国特許第ＧＢ２，３９７，８１８Ｂ号ならびに米国特許出願公開第２００４０１９２６２６号、同第２００５０２８２１８８号、及び同第２００７０１３５３７２号に記載されており、これらの開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0227】
本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子は、任意選択で、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖に１つ以上の非ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、「非ヌクレオチド」という用語は、糖及び／またはリン酸置換を含む１つ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸鎖に組み込むことができ、残りの塩基がそれらの活性を示すことを可能にする、任意の基または化合物を指す。この基または化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはチミンなどの一般的に認識されているヌクレオチド塩基を含まず、したがって、１’位に塩基を欠いているという点で脱塩基性である。
【0228】
他の実施形態では、ｓｉＲＮＡの化学修飾は、コンジュゲートをｓｉＲＮＡ分子に結合させることを含む。コンジュゲートは、例えば、生分解性リンカーなどの共有結合を介して、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端及び／または３’末端に結合させることができる。コンジュゲートはまた、例えば、カルバメート基または他の連結基を介して、ｓｉＲＮＡに結合させることができる（例えば、米国特許出願公開第２００５００７４７７１号、同第２００５００４３２１９号、及び同第２００５０１５８７２７号を参照されたい）。特定の場合では、コンジュゲートは、細胞へのｓｉＲＮＡの送達を容易にする分子である。ｓｉＲＮＡへの結合に適したコンジュゲート分子の例には、コレステロールなどのステロイド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのグリコール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、脂肪酸、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、葉酸塩（例えば、葉酸、葉酸塩類似体及びこれらの誘導体）、糖類（例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコース、マンノース、フルクトース、フコースなど）、リン脂質、ペプチド、細胞取り込みを媒介することが可能な細胞受容体のリガンド、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない（例えば、米国特許出願公開第２００３０１３０１８６号、同第２００４０１１０２９６号、及び同第２００４０２４９１７８号、米国特許第６，７５３，４２３号を参照されたい）。他の例には、米国特許出願公開第２００５０１１９４７０号及び同第２００５０１０７３２５号に記載されている、親油性部分、ビタミン、ポリマー、ペプチド、タンパク質、核酸、低分子、オリゴ糖、炭水化物クラスター、インターカレーター、副溝結合剤、切断剤、及び架橋剤コンジュゲート分子が含まれる。さらに他の例には、米国特許出願公開第２００５０１５３３３７号に記載されている、２’－Ｏ－アルキルアミン、２’－β－アルコキシアルキルアミン、ポリアミン、Ｃ５－カチオン性修飾ピリミジン、カチオン性ペプチド、グアニジウム基、アミジニニウム（ａｍｉｄｉｎｉｎｉｕｍ）基、カチオン性アミノ酸コンジュゲート分子が含まれる。追加の例には、米国特許出願公開第２００４０１６７０９０号に記載されている、疎水性基、膜活性化合物、細胞透過性化合物、細胞標的化シグナル、相互作用修飾因子、及び立体安定剤コンジュゲート分子が含まれる。さらなる例には、米国特許出願公開第２００５０２３９７３９号に記載されているコンジュゲート分子が含まれる。使用するコンジュゲートのタイプ及びｓｉＲＮＡ分子とのコンジュゲーションの程度を、ＲＮＡｉ活性を保持しながら改善されたｓｉＲＮＡの薬物動態プロファイル、バイオアベイラビリティ、及び／または安定性について、評価することができる。したがって、当業者は、様々な周知のインビトロ細胞培養物またはインビボ動物モデルのいずれかを使用して、種々のコンジュゲートが結合しているｓｉＲＮＡ分子をスクリーニングし、改善された特性及び完全なＲＮＡｉ活性を有するものを同定することができる。前述の特許文書の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0229】
標的遺伝子
特定の実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子の核酸成分（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、目的遺伝子の翻訳（すなわち、発現）を下方制御またはサイレンシングすることができる。目的遺伝子には、ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性疾患及び障害（例えば、肝疾患及び肝障害）に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞形質転換（例えば、がん）に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症応答及び自己免疫応答に関連するものなどの免疫調節遺伝子、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性障害に関連する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、目的遺伝子は、肝細胞で発現される。
特定の実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子の核酸成分（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、目的遺伝子の翻訳（すなわち、発現）を下方制御またはサイレンシングすることができる。目的遺伝子には、ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性疾患及び障害（例えば、肝疾患及び肝障害）に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞形質転換（例えば、がん）に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症応答及び自己免疫応答に関連するものなどの免疫調節遺伝子、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性障害に関連する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、目的遺伝子は、肝細胞で発現される。
【0230】
ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子には、細胞内で結合し、細胞内に侵入し、細胞内で複製するためにウイルスによって発現される遺伝子が含まれる。特に対象となるものは、慢性ウイルス疾患に関連するウイルス配列である。特に対象となるウイルス配列には、エボラウイルス及びマールブルグウイルスなどのフィロウイルス（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ．，１９３：１６５０－１６５７（２００６）を参照されたい）、ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、及びサビアウイルスなどのアレナウイルス（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ：ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｋｎｉｐｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（２００１））、インフルエンザＡ、Ｂ、及びＣウイルスなどのインフルエンザウイルス（例えば、Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．，３６：３０５－３３２（２００２）、及びＮｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，８３：２６３５－２６６２（２００２）を参照されたい）、肝炎ウイルス（例えば、Ｈａｍａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５４３：５１（２００３）、Ｙｏｋｏｔａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．，４：６０２（２００３）、Ｓｃｈｌｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３７：７６４（２００３）、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：２７８３（２００３）、Ｋａｐａｄｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：２０１４（２００３）、及びＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｋｎｉｐｅ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（２００１）を参照されたい）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（Ｂａｎｅｒｊｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，８：６２（２００３）、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：７１７４（２００３）、Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，ＪＡＭＡ，２８９：１４９４（２００３）、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１８３（２００３））、ヘルペスウイルス（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：３３０１（２００３））、ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７：６０６６（２００３）、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：６０４１（２００２））の配列が含まれる。
【0231】
サイレンシングすることができる例示的なフィロウイルス核酸配列には、構造タンパク質（例えば、ＶＰ３０、ＶＰ３５、核タンパク質（ＮＰ）、ポリメラーゼタンパク質（Ｌ－ｐｏｌ））、及び膜結合タンパク質（例えば、ＶＰ４０、糖タンパク質（ＧＰ）、ＶＰ２４）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。エボラウイルスの完全なゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２５４９、ＡＹ７６９３６２、ＮＣ＿００６４３２、ＮＣ＿００４１６１、ＡＹ７２９６５４、ＡＹ３５４４５８、ＡＹ１４２９６０、ＡＢ０５０９３６、ＡＦ５２２８７４、ＡＦ４９９１０１、ＡＦ２７２００１、及びＡＦ０８６８３３に記載されている。エボラウイルスＶＰ２４の配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ７７３８５及びＡＹ０５８８９７に記載されている。エボラウイルスＬ－ｐｏｌの配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６７１１０に記載されている。エボラウイルスＶＰ４０の配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ０５８８９６に記載されている。エボラウイルスＮＰの配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ０５８８９５に記載されている。エボラウイルスＧＰの配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ０５８８９８、Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，２９：２１５－２４０（１９９３）、Ｗｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：１２０３－１２１０（１９９３）、Ｖｏｌｃｈｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３０５：１８１－１８４（１９９２）、及び米国特許第６，７１３，０６９号に記載されている。さらなるエボラウイルス配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１１３６５及びＸ６１２７４に記載されている。マールブルグウイルスの完全なゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１６０８、ＡＹ４３０３６５、ＡＹ４３０３６６、及びＡＹ３５８０２５に記載されている。マールブルグウイルスＧＰの配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００５７３４、ＡＦ００５７３３、及びＡＦ００５７３２に記載されている。マールブルグウイルスＶＰ３５の配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００５７３１及びＡＦ００５７３０に記載されている。さらなるマールブルグウイルス配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ６４４０６、Ｚ２９３３７、ＡＦ００５７３５、及びＺ１２１３２に記載されている。エボラウイルス及びマールブルグウイルスの核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００７０１３５３７０号に記載されているものが含まれ、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0232】
サイレンシングすることができる例示的なインフルエンザウイルス核酸配列には、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）、非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）、ＲＮＡポリメラーゼ（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ならびにヘマグルチニン（ＨＡ）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。インフルエンザＡのＮＰ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４５２２、ＡＹ８１８１３８、ＡＢ１６６８６３、ＡＢ１８８８１７、ＡＢ１８９０４６、ＡＢ１８９０５４、ＡＢ１８９０６２、ＡＹ６４６１６９、ＡＹ６４６１７７、ＡＹ６５１４８６、ＡＹ６５１４９３、ＡＹ６５１４９４、ＡＹ６５１４９５、ＡＹ６５１４９６、ＡＹ６５１４９７、ＡＹ６５１４９８、ＡＹ６５１４９９、ＡＹ６５１５００、ＡＹ６５１５０１、ＡＹ６５１５０２、ＡＹ６５１５０３、ＡＹ６５１５０４、ＡＹ６５１５０５、ＡＹ６５１５０６、ＡＹ６５１５０７、ＡＹ６５１５０９、ＡＹ６５１５２８、ＡＹ７７０９９６、ＡＹ７９０３０８、ＡＹ８１８１３８、及びＡＹ８１８１４０に記載されている。インフルエンザＡのＰＡ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ８１８１３２、ＡＹ７９０２８０、ＡＹ６４６１７１、ＡＹ８１８１３２、ＡＹ８１８１３３、ＡＹ６４６１７９、ＡＹ８１８１３４、ＡＹ５５１９３４、ＡＹ６５１６１３、ＡＹ６５１６１０、ＡＹ６５１６２０、ＡＹ６５１６１７、ＡＹ６５１６００、ＡＹ６５１６１１、ＡＹ６５１６０６、ＡＹ６５１６１８、ＡＹ６５１６０８、ＡＹ６５１６０７、ＡＹ６５１６０５、ＡＹ６５１６０９、ＡＹ６５１６１５、ＡＹ６５１６１６、ＡＹ６５１６４０、ＡＹ６５１６１４、ＡＹ６５１６１２、ＡＹ６５１６２１、ＡＹ６５１６１９、ＡＹ７７０９９５、及びＡＹ７２４７８６に記載されている。インフルエンザウイルスの核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００７０２１８１２２号に記載されているものが含まれ、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0233】
サイレンシングすることができる例示的な肝炎ウイルスの核酸配列には、転写及び翻訳に関与する核酸配列（例えば、Ｅｎ１、Ｅｎ２、Ｘ、Ｐ）、ならびに構造タンパク質（例えば、Ｃタンパク質及びＣ関連タンパク質を含むコアタンパク質、Ｓ、Ｍ、及び／またはＬタンパク質を含むカプシド及びエンベロープタンパク質、またはそれらの断片）をコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない（例えば、ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，上掲を参照されたい）。サイレンシングすることができる例示的なＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の核酸配列には、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、ポリタンパク質翻訳開始コドン領域、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列、及び／またはコアタンパク質、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質、ｐ７タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ３プロテアーゼ／ヘリカーゼ、ＮＳ４Ａタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、ＮＳ５Ａタンパク質、及び／またはＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。ＨＣＶのゲノム配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００４１０２（ＨＣＶ遺伝子型１ａ）、ＡＪ２３８７９９（ＨＣＶ遺伝子型１ｂ）、ＮＣ＿００９８２３（ＨＣＶ遺伝子型２）、ＮＣ＿００９８２４（ＨＣＶ遺伝子型３）、ＮＣ＿００９８２５（ＨＣＶ遺伝子型４）、ＮＣ＿００９８２６（ＨＣＶ遺伝子型５）、及びＮＣ＿００９８２７（ＨＣＶ遺伝子型６）に記載されている。Ａ型肝炎のウイルス核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４８９に記載されており、Ｂ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３９７７に記載されており、Ｄ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１６５３に記載されており、Ｅ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４３４に記載されており、Ｇ型肝炎ウイルスの核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１７１０に記載されている。ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、ウイルス状態を治療するために使用される従来の薬剤の投与と組み合わせて好都合に使用することができる。肝炎ウイルス核酸配列を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００６０２８１１７５号、同第２００５００５８９８２号、及び同第２００７０１４９４７０号、米国特許第７，３４８，３１４号、ならびに２００９年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／１６２，１２７号に記載されているものが含まれ、これらの開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0234】
代謝性疾患及び障害（例えば、肝臓が標的である障害、ならびに肝疾患及び肝障害）に関連する遺伝子には、例えば、脂質異常症において発現する遺伝子（例えば、ＬＸＲα及びＬＸＲβなどの肝臓Ｘ受容体（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７１２１）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５１２３）、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、部位－１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素－Ａレダクターゼ（ＨＭＧ補酵素－Ａレダクターゼ）、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００３８４）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣ３）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００４０及びＮＧ＿００８９４９ ＲＥＧＩＯＮ：５００１．８１６４）、及びアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００４１及びＮＧ＿００７０８４ ＲＥＧＩＯＮ：５００１．８６１２））、ならびに糖尿病（例えば、グルコース６－ホスファターゼ）が含まれる（例えば、Ｆｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８１：６８７（１９９５）、Ｓｅｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，９：７２（１９９５）、Ｚａｖａｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：７９０９（１９９７）、Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８５：１０３７－１０４６（１９９６）、Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１２７７８－１２７８５（１９９７）、Ｗｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１０３３－１０４５（１９９５）、Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：３１３７－３１４０（１９９７）、Ｊａｎｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８３：７２８－７３１（１９９６）、及びＰｅｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９３：６９３－７０４（１９９８）を参照されたい）。当業者は、代謝性疾患及び障害（例えば、肝臓が標的である障害、ならびに肝疾患及び肝障害）に関連する遺伝子には、肝臓自体で発現する遺伝子ならびに他の器官及び組織で発現する遺伝子が含まれることを理解するであろう。代謝性疾患及び障害に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、その疾患または障害を治療するために使用される従来の薬剤の投与と組み合わせて好都合に使用することができる。ＡｐｏＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００６０１３４１８９号に記載されているものが含まれ、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。ＡｐｏＣ３遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、２００９年１月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／１４７，２３５号に記載されているものが含まれ、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0235】
腫瘍形成及び細胞形質転換（例えば、がんまたは他の新生物形成）に関連する遺伝子配列の例には、Ｅｇ５（ＫＳＰ、ＫＩＦ１１；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４５２３）などの有糸分裂キネシン；ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ－１）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５０３０、Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，５：４２９－４４０（２００４））などのセリン／スレオニンキナーゼ；ＷＥＥ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３３９０及びＮＭ＿００１１４３９７６）などのチロシンキナーゼ；ＸＩＡＰ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１６７）などのアポトーシス阻害因子；ＣＳＮ１、ＣＳＮ２、ＣＳＮ３、ＣＳＮ４、ＣＳＮ５（ＪＡＢ１；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００６８３７）、ＣＳＮ６、ＣＳＮ７Ａ、ＣＳＮ７Ｂ及びＣＳＮ８などのＣＯＰ９シグナロソームサブユニット；ＣＯＰ１（ＲＦＷＤ２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２２４５７及びＮＭ＿００１００１７４０）などのユビキチンリガーゼ；ならびにＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１５２７）、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９などのヒストンデアセチラーゼなどが含まれる。Ｅｇ５及びＸＩＡＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、２００７年５月２９日に出願された米国特許出願第１１／８０７，８７２号に記載されているものが含まれ、この開示はすべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。ＰＬＫ－１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、米国特許出願公開第２００５０１０７３１６号及び同第２００７０２６５４３８号、ならびに２００８年１２月２３日に出願された米国特許出願第１２／３４３，３４２号に記載されているものが含まれ、これらの開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。ＣＳＮ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、２００８年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／０４５，２５１号に記載されているものが含まれ、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0236】
腫瘍形成及び細胞形質転換に関連する遺伝子配列のさらなる例には、転座配列、例えば、ＭＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ－ＡＢＬ（Ｗｉｌｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：５７１６（２００２）、Ｓｃｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：１５６６（２００３））、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＥＷＳ－ＦＬＩ１、ＴＬＳ－ＦＵＳ、ＰＡＸ３－ＦＫＨＲ、ＢＣＬ－２、ＡＭＬ１－ＥＴＯ、及びＡＭＬ１－ＭＴＧ８（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：３１５７（２００３））；過剰発現配列、例えば、多剤耐性遺伝子（Ｎｉｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５４５：１４４（２００３）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：１５１５（２００３））、サイクリン（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：３５９３（２００３）、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１６：２９２３（２００２））、ベータ－カテニン（Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９：１２９１（２００３））、テロメラーゼ遺伝子（Ｋｏｓｃｉｏｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２：２０９（２００３））、ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、ＢＣＬ－２、増殖因子受容体（例えば、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５２２８、ＮＭ＿２０１２８２、ＮＭ＿２０１２８３、及びＮＭ＿２０１２８４、またＮａｇｙ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２８５：３９－４９（２００３）も参照されたい）、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ－２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４４８及びＮＭ＿００１００５８６２）、ＥｒｂＢ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１９８２及びＮＭ＿００１００５９１５）、ならびにＥｒｂＢ４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５２３５及びＮＭ＿００１０４２５９９））；ならびにＲＡＳ（Ｔｕｓｃｈｌ ａｎｄ Ｂｏｒｋｈａｒｄｔ，Ｍｏｌ．Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ，２：１５８（２００２）に概説されている）などの突然変異配列が含まれる。ＥＧＦＲ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例には、２００７年５月２９日に出願された米国特許出願第１１／８０７，８７２号に記載されているものが含まれ、この開示はすべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0237】
ＤＮＡ修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法剤の投与と組み合わせて使用される（Ｃｏｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：１５５０（２００３））。腫瘍遊走に関連するタンパク質をコードする遺伝子はまた、目的標的配列、例えば、インテグリン、セレクチン、及びメタロプロテイナーゼである。前述の例は排他的なものではない。当業者は、腫瘍形成もしくは細胞形質転換、腫瘍増殖、または腫瘍遊走を促進するかまたは推進する、いかなる全体的または部分的な遺伝子配列も、鋳型配列として含まれ得ることを理解するであろう。
【0238】
血管新生遺伝子は、新たな血管の形成を促進することができる。特に対象となるのは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．，９：２１０（２００３））またはＶＥＧＦＲである。ＶＥＧＦＲを標的とするｓｉＲＮＡ配列は、例えば、ＧＢ２３９６８６４、米国特許出願公開第２００４０１４２８９５号、及びＣＡ２４５６４４４に記載されており、これらの開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0239】
抗血管新生遺伝子は、新血管新生を阻害することができる。これらの遺伝子は、血管新生が疾患の病理学的発生における役割を担うがんの治療に特に有用である。抗血管新生遺伝子の例には、限定されないが、エンドスタチン（例えば、米国特許第６，１７４，８６１号を参照されたい）、アンジオスタチン（例えば、米国特許第５，６３９，７２５号を参照されたい）、及びＶＥＧＦＲ２（例えば、Ｄｅｃａｕｓｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１８８：３６９－３７７（１９９９）を参照されたい）が含まれ、これらの開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0240】
免疫調節遺伝子は、１つ以上の免疫応答を調節する遺伝子である。免疫調節遺伝子の例には、増殖因子（例えば、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦなど）、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：６９１（２００３））、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２０など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γなど）及びＴＮＦなどのサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。Ｆａｓ及びＦａｓリガンド遺伝子もまた、目的の免疫調節標的配列である（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：３４７（２００３））。造血細胞及びリンパ系細胞において二次シグナル伝達分子をコードする遺伝子、例えば、ブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）（Ｈｅｉｎｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，５２７：２７４（２００２））などのＴｅｃファミリーキナーゼもまた、本発明に含まれる。
【0241】
細胞受容体リガンドには、細胞表面受容体（例えば、インスリン受容体、ＥＰＯ受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、チロシンキナーゼ活性を有する受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体など）に結合して、その受容体が関与する生理学的経路（例えば、グルコースレベルの調節、血球発生、有糸分裂生起など）を調節（例えば、阻害、活性化など）することができるリガンドが含まれる。細胞受容体リガンドの例には、サイトカイン、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、グルカゴン、Ｇタンパク質共役型受容体リガンドなどが含まれるが、これらに限定されない。トリヌクレオチドリピート（例えば、ＣＡＧリピート）の伸長をコードする鋳型は、球脊髄性筋萎縮症及びハンチントン病（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：１７５（２００２））などのトリヌクレオチドリピートの伸長に起因する神経変性障害における病原性配列のサイレンシングに使用される。
【0242】
遺伝子の発現を下方制御またはサイレンシングするために核酸によって（例えば、ｓｉＲＮＡによって）標的化され得る他の特定の標的遺伝子には、大動脈平滑筋アルファ２アクチン（ＡＣＴＡ２）、アルコール脱水素酵素１Ａ（ＡＤＨ１Ａ）、アルコール脱水素酵素４（ＡＤＨ４）、アルコール脱水素酵素６（ＡＤＨ６）、アファミン（Ａｆａｍｉｎ）（ＡＦＭ）、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）、セリン－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）、アルファ－２－ＨＳ－糖タンパク質（ＡＨＳＧ）、アルド－ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ４（ＡＫＲ１Ｃ４）、血清アルブミン（ＡＬＢ）、アルファ－１－ミクログロブリン／ビクニン前駆体（ＡＭＢＰ）、アンジオポエチン関連タンパク質３（ＡＮＧＰＴＬ３）、血清アミロイドＰ成分（ＡＰＣＳ）、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ（ＡＰＯＡ２）、アポリポタンパク質Ｂ－１００（ＡＰＯＢ）、アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＶ（ＡＰＯＣ４）、アポリポタンパク質Ｆ（ＡＰＯＦ）、ベータ－２－糖タンパク質１（ＡＰＯＨ）、アクアポリン－９（ＡＱＰ９）、胆汁酸－ＣｏＡ：アミノ酸Ｎ－アシルトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、Ｃ４ｂ結合タンパク質ベータ鎖（Ｃ４ＢＰＢ）、ＬＩＮＣ０１５５４（Ｃ５ｏｒｆ２７）によりコードされる性質不明の推定タンパク質、補体第３因子（Ｃ３）、補数第５因子（Ｃ５）、補体成分Ｃ６（Ｃ６）、補体成分Ｃ８アルファ鎖（Ｃ８Ａ）、補体成分Ｃ８ベータ鎖（Ｃ８Ｂ）、補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８Ｇ）、補体成分Ｃ９（Ｃ９）、カルモジュリン結合転写活性化因子１（ＣＡＭＴＡ１）、ＣＤ３８（ＣＤ３８）、補体因子Ｂ（ＣＦＢ）、補体因子Ｈ関連タンパク質１（ＣＦＨＲ１）、補体因子Ｈ関連タンパク質２（ＣＦＨＲ２）、補体因子Ｈ関連タンパク質３（ＣＦＨＲ３）、カンナビノイド受容体１（ＣＮＲ１）、セルロプラスミン（ＣＰ）、カルボキシペプチダーゼＢ２（ＣＰＢ２）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン２（ＣＸＣＬ２）、シトクロムＰ４５０ １Ａ２（ＣＹＰ１Ａ２）、シトクロムＰ４５０ ２Ａ６（ＣＹＰ２Ａ６）、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ８（ＣＹＰ２Ｃ８）、シトクロムＰ４５０ ２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）、シトクロムＰ４５０ファミリー２サブファミリーＤメンバー６（ＣＹＰ２Ｄ６）、シトクロムＰ４５０ ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）、フィロキノンオメガ－ヒドロキシラーゼＣＹＰ４Ｆ２（ＣＹＰ４Ｆ２）、７－アルファ－ヒドロキシコレスト－４－エン－３－オン１２－アルファ－ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ８Ｂ１）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、凝固第１２因子（Ｆ１２）、凝固第ＩＩ因子（トロンビン）（Ｆ２）、凝固第ＩＸ因子（Ｆ９）、フィブリノーゲンアルファ鎖（ＦＧＡ）、フィブリノーゲンベータ鎖（ＦＧＢ）、フィブリノーゲンガンマ鎖（ＦＧＧ）、フィブリノーゲン様１（ＦＧＬ１）、フラビン含有モノオキシゲナーゼ３（ＦＭＯ３）、フラビン含有モノオキシゲナーゼ５（ＦＭＯ５）、グループスペシフィックコンポーネント（ビタミンＤ結合タンパク質）（ＧＣ）、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）、グリシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＧＮＭＴ）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、ヘプシジン抗菌ペプチド（ＨＡＭＰ）、ヒドロキシ酸オキシダーゼ（グリコール酸オキシダーゼ）１（ＨＡＯ１）、ＨＧＦ活性化因子（ＨＧＦＡＣ）、ハプトグロビン関連タンパク質；ハプトグロビン（ＨＰＲ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧ）、ヒドロキシステロイド（１１－ベータ）デヒドロゲナーゼ１（ＨＳＤ１１Ｂ１）、ヒドロキシステロイド（１７－ベータ）デヒドロゲナーゼ１３（ＨＳＤ１７Ｂ１３）、インターアルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ１（ＩＴＩＨ１）、インターアルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ２（ＩＴＩＨ２）、インターアルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ３（ＩＴＩＨ３）、インターアルファ－トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）、プレカリクレイン（ＫＬＫＢ１）、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（ＬＤＨＡ）、肝臓発現抗菌ペプチド２（ＬＥＡＰ２）、白血球細胞由来ケモタキシン２（ＬＥＣＴ２）、リポタンパク質（ａ）（ＬＰＡ）、マンナン結合レクチンセリンペプチダーゼ２（ＭＡＳＰ２）、Ｓ－アデノシルメチオニン合成酵素アイソフォーム１型（ＭＡＴ１Ａ）、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ４（ＮＯＸ４）、ポリ［ＡＤＰ－リボース］ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）、パラオキソナーゼ１（ＰＯＮ１）、パラオキソナーゼ３（ＰＯＮ３）、ビタミンＫ依存性プロテインＣ（ＰＲＯＣ）、レチノールデヒドロゲナーゼ１６（ＲＤＨ１６）、構成的血清アミロイドＡ４（ＳＡＡ４）、セリンデヒドラターゼ（ＳＤＳ）、セルピンファミリーＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１），セルピンＡ１１（ＳＥＲＰＩＮＡ１１），カリスタチン（ＳＥＲＰＩＮＡ４）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＳＥＲＰＩＮＡ６）、アンチトロンビンＩＩＩ（ＳＥＲＰＩＮＣ１）、ヘパリン補因子２（ＳＥＲＰＩＮＤ１）、セルピンファミリーＨメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＨ１），溶質キャリアファミリー５メンバー２（ＳＬＣ５Ａ２）、ナトリウム／胆汁酸共輸送体（ＳＬＣ１０Ａ１）、溶質キャリアファミリー１３メンバー５（ＳＬＣ１３Ａ５）、溶質キャリアファミリー２２メンバー１（ＳＬＣ２２Ａ１）、溶質キャリアファミリー２５メンバー４７（ＳＬＣ２５Ａ４７）、溶質キャリアファミリー２促進性グルコース輸送体メンバー２（ＳＬＣ２Ａ２）、ナトリウム共役型中性アミノ酸輸送体４（ＳＬＣ３８Ａ４）、溶質キャリア有機アニオン輸送体ファミリーメンバー１Ｂ１（ＳＬＣＯ１Ｂ１）、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１（ＳＭＰＤ１）、胆汁酸塩スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ２Ａ１）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ２）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ２ファミリーポリペプチドＢ１０（ＵＧＴ２Ｂ１０）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ２ファミリーポリペプチドＢ１５（ＵＧＴ２Ｂ１５）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ２ファミリーポリペプチドＢ４（ＵＧＴ２Ｂ４）、及びビトロネクチン（ＶＴＮ）が含まれるが、これらに限定されない。
【0243】
治療目的で前述の遺伝子のいずれかの発現をサイレンシングするその有用性に加えて、本明細書に記載の特定の核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）はまた、研究及び開発用途、ならびに診断的、予防的、予後診断的、臨床的、及び他の健康管理用途においても有用である。非限定的な例として、特定の核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を、目的遺伝子が治療標的である可能性があるか否かを試験することを目的とした標的検証試験において使用することができる。特定の核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）はまた、潜在的な治療標的としての遺伝子を見出すことを目的とした標的同定試験にも使用することができる。
【0244】
ＣＲＩＳＰＲ
標的化ゲノム編集は、ニッチ技術から多くの生物学研究者が使用する方法へと進化した。この進化は、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）技術の出現により大いに促進された（例えば、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（２０１４）を含むＳａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４），３４７－３５５、国際公開第ＷＯ２０１６／１９７１３２号及び同第２０１６／１９７１３３号を参照されたい）。したがって、本明細書で提供されるのは、ＨＢＶなどの疾患を治療するためにＣＲＩＳＰＲ技術と組み合わせて使用することができる改善物（例えば、脂質ナノ粒子及びその製剤）である。ＣＲＩＳＰＲを使用するための標的に関して、ＣＲＩＳＰＲ技術で利用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、特異的に同定された配列、例えば、標的遺伝子（例えばＨＢＶゲノムの標的遺伝子）を標的とするように設計することができる。そのような標的配列の例は、国際公開第ＷＯ２０１６／１９７１３２号に示されている。さらに、国際公開第ＷＯ２０１３／１５１６６５号（例えば、表６を参照されたい。この文書は、表６及び付随する配列表を特に含めて、具体的に参照により組み込まれる）は、ｍＲＮＡ発現コンストラクトに関連して特許請求された約３５，０００のｍＲＮＡ配列を記載している。本発明の特定の実施形態は、これらの配列のいずれかの発現を標的とするためにＣＲＩＳＰＲ技術を利用する。本発明の特定の実施形態はまた、本明細書で論じられる標的遺伝子の発現を標的とするためにＣＲＩＳＰＲ技術を利用することができる。
標的化ゲノム編集は、ニッチ技術から多くの生物学研究者が使用する方法へと進化した。この進化は、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）技術の出現により大いに促進された（例えば、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（２０１４）を含むＳａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４），３４７－３５５、国際公開第ＷＯ２０１６／１９７１３２号及び同第２０１６／１９７１３３号を参照されたい）。したがって、本明細書で提供されるのは、ＨＢＶなどの疾患を治療するためにＣＲＩＳＰＲ技術と組み合わせて使用することができる改善物（例えば、脂質ナノ粒子及びその製剤）である。ＣＲＩＳＰＲを使用するための標的に関して、ＣＲＩＳＰＲ技術で利用されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、特異的に同定された配列、例えば、標的遺伝子（例えばＨＢＶゲノムの標的遺伝子）を標的とするように設計することができる。そのような標的配列の例は、国際公開第ＷＯ２０１６／１９７１３２号に示されている。さらに、国際公開第ＷＯ２０１３／１５１６６５号（例えば、表６を参照されたい。この文書は、表６及び付随する配列表を特に含めて、具体的に参照により組み込まれる）は、ｍＲＮＡ発現コンストラクトに関連して特許請求された約３５，０００のｍＲＮＡ配列を記載している。本発明の特定の実施形態は、これらの配列のいずれかの発現を標的とするためにＣＲＩＳＰＲ技術を利用する。本発明の特定の実施形態はまた、本明細書で論じられる標的遺伝子の発現を標的とするためにＣＲＩＳＰＲ技術を利用することができる。
【0245】
ａｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡと同様に、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を動員し、アンチセンス鎖の５’末端に対するヌクレオチド１０と１１の間で標的配列の配列特異的切断を媒介することによって、哺乳動物細胞における種々の遺伝子の効果的なサイレンシングをもたらすことができる（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６：１３７９－１３８２（２００８））。通常、ａｉＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する短いＲＮＡ二重鎖を含み、この二重鎖は、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端にオーバーハングを含有する。ａｉＲＮＡは一般に、センス鎖が、相補的アンチセンス鎖と比較して両末端で短いため、非対称である。いくつかの態様では、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子に使用されるものと類似の条件下で、設計、合成、及びアニーリングすることができる。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列を選択するための前述の方法を使用して、選択及び作製することができる。
ｓｉＲＮＡと同様に、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を動員し、アンチセンス鎖の５’末端に対するヌクレオチド１０と１１の間で標的配列の配列特異的切断を媒介することによって、哺乳動物細胞における種々の遺伝子の効果的なサイレンシングをもたらすことができる（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６：１３７９－１３８２（２００８））。通常、ａｉＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する短いＲＮＡ二重鎖を含み、この二重鎖は、アンチセンス鎖の３’末端及び５’末端にオーバーハングを含有する。ａｉＲＮＡは一般に、センス鎖が、相補的アンチセンス鎖と比較して両末端で短いため、非対称である。いくつかの態様では、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子に使用されるものと類似の条件下で、設計、合成、及びアニーリングすることができる。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列を選択するための前述の方法を使用して、選択及び作製することができる。
【0246】
別の実施形態では、種々の長さ（例えば、約１０～２５、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１３～１７、または１４～１７塩基対、より典型的には１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または塩基対）のａｉＲＮＡ二重鎖を、目的のｍＲＮＡを標的とするためにアンチセンス鎖の３’末端及び５’末端にオーバーハングを含めて設計することができる。特定の場合では、ａｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、約１０～２５、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１３～１７、または１４～１７ヌクレオチド長、より典型的には、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である。特定の他の場合では、ａｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、約１５～６０、１５～５０、または１５～４０ヌクレオチド長、より典型的には約１５～３０、１５～２５または１９～２５ヌクレオチド長、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチド長である。
【0247】
いくつかの実施形態では、５’アンチセンスオーバーハングは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の非標的ヌクレオチド（例えば、「ＡＡ」、「ＵＵ」、「ｄＴｄＴ」など）を含有する。他の実施形態では、３’アンチセンスオーバーハングは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の非標的ヌクレオチド（例えば、「ＡＡ」、「ＵＵ」、「ｄＴｄＴ」など）を含有する。特定の態様では、本明細書に記載のａｉＲＮＡ分子は、例えば、二本鎖（二重鎖）領域に、及び／またはアンチセンスオーバーハングに、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列について前述した修飾ヌクレオチドのうちの１つ以上を含み得る。好ましい実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチドなどの２’ＯＭｅヌクレオチド、またはこれらの混合物を含む。
【0248】
特定の実施形態では、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖に対応するアンチセンス鎖、例えば、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ分子のうちの１つを含み得る。他の実施形態では、ａｉＲＮＡ分子を使用して前述の標的遺伝子のいずれか、例えば、ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性疾患及び障害に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞形質転換に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症応答及び自己免疫応答に関連するものなどの免疫調節遺伝子、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性障害に関連する遺伝子などの発現をサイレンシングすることができる。
【0249】
ｍｉＲＮＡ
一般に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を制御する約２１～２３ヌクレオチドの長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは遺伝子によってコードされ、その遺伝子のＤＮＡからｍｉＲＮＡが転写されるが、ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されず（非コードＲＮＡ）、代わりに、各一次転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）が、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと称される短いステムループ構造にプロセシングされ、最終的に機能的な成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に部分的に相補的であるかまたは完全に相補的であるかのいずれかであり、それらの主要な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。ｍｉＲＮＡ分子の同定は、例えば、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５３－８５８、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５８－８６２、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８６２－８６４に記載されている。
一般に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を制御する約２１～２３ヌクレオチドの長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは遺伝子によってコードされ、その遺伝子のＤＮＡからｍｉＲＮＡが転写されるが、ｍｉＲＮＡはタンパク質に翻訳されず（非コードＲＮＡ）、代わりに、各一次転写物（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）が、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと称される短いステムループ構造にプロセシングされ、最終的に機能的な成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に部分的に相補的であるかまたは完全に相補的であるかのいずれかであり、それらの主要な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。ｍｉＲＮＡ分子の同定は、例えば、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５３－８５８、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５８－８６２、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８６２－８６４に記載されている。
【0250】
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、プロセシングされた成熟ｍｉＲＮＡ分子よりもはるかに長い。ｍｉＲＮＡは、まず、キャップ及びポリＡテールを有する一次転写産物またはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして転写され、細胞核において、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとして知られる約７０ヌクレオチドの短いステムループ構造にプロセシングされる。このプロセシングは、動物において、ヌクレアーゼドローシャ及び二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質パーシャ（Ｐａｓｈａ）からなるマイクロプロセッサー複合体として知られるタンパク質複合体によって行われる（Ｄｅｎｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３２：２３１－２３５（２００４））。次に、これらのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、エンドヌクレアーゼダイサーとの相互作用により細胞質内で成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされ、このことはまた、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成を開始させる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３－３６６（２００１）。ＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが、ｍｉＲＮＡを生じさせるための鋳型として機能し得る。
【0251】
ダイサーがｐｒｅ－ｍｉＲＮＡステムループを切断すると、２つの相補的な短いＲＮＡ分子が形成されるが、その１つのみがＲＩＳＣ複合体に組み込まれる。この鎖は、ガイド鎖として知られており、５’末端の安定性に基づいて、ＲＩＳＣ複合体中の触媒的に活性なＲＮａｓｅであるアルゴノートタンパク質によって選択される（Ｐｒｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１６：５３０－５３５（２００６））。アンチガイドまたはパッセンジャー鎖として知られる残りの鎖は、ＲＩＳＣ複合体基質として分解される（Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２３：６３１－６４０（２００５））。活性ＲＩＳＣ複合体に組み込まれた後、ｍｉＲＮＡは、それらの相補的ｍＲＮＡ分子と塩基対合し、標的ｍＲＮＡの分解及び／または翻訳のサイレンシングを誘導する。
【0252】
哺乳動物のｍｉＲＮＡ分子は通常、標的ｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲ内の部位に相補的である。特定の場合では、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡへのアニーリングは、タンパク質の翻訳機序を遮断することによりタンパク質の翻訳を阻害する。特定の他の場合では、ｍｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡへのアニーリングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と類似のプロセスを通じて、標的ｍＲＮＡの切断及び分解を促進する。ｍｉＲＮＡはまた、標的化ｍＲＮＡに対応するゲノム部位のメチル化を標的とし得る。一般に、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＰと総称されるタンパク質の補体と関連して機能する。
【0253】
特定の態様では、本明細書に記載のｍｉＲＮＡ分子は、約１５～１００、１５～９０、１５～８０、１５～７５、１５～７０、１５～６０、１５～５０、または１５～４０ヌクレオチド長、より典型的には約１５～３０、１５～２５または１９～２５ヌクレオチド長、好ましくは約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチド長である。特定の他の態様では、ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列について前述した修飾ヌクレオチドのうちの１つ以上を含み得る。好ましい実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子は、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチドなどの２’ＯＭｅヌクレオチド、またはこれらの混合物を含む。
【0254】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ分子を使用して前述の標的遺伝子のいずれか、例えば、ウイルスの感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性疾患及び障害に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞形質転換に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症応答及び自己免疫応答に関連するものなどの免疫調節遺伝子、リガンド受容体遺伝子、ならびに神経変性障害に関連する遺伝子などの発現をサイレンシングすることができる。
【0255】
他の実施形態では、目的のｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡの活性を遮断する１つ以上の薬剤は、本発明の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を使用して投与される。遮断剤の例には、立体遮断オリゴヌクレオチド、ロックされた核酸オリゴヌクレオチド、及びモルフォリノオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。このような遮断剤は、ｍｉＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ結合部位に直接結合し得る。
【0256】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態では、核酸は、目的の標的遺伝子または配列を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」という用語は、標的とするポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンスヌクレオチドは、選択された配列に相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖である。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ鎖の翻訳を、そのＲＮＡに結合することによって阻止する。アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、特定の相補的（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的とすることができる。結合が生じると、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、酵素ＲＮａｓｅ Ｈによって分解され得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０～約６０個のヌクレオチド、より好ましくは約１５～約３０個のヌクレオチドを含む。この用語はまた、所望の標的遺伝子に厳密に相補的ではない可能性のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、本発明は、非標的特異的活性がアンチセンスに見られる場合、または標的配列との１つ以上のミスマッチを含有するアンチセンス配列が特定の使用に最も好ましい場合に、利用可能である。
一実施形態では、核酸は、目的の標的遺伝子または配列を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」という用語は、標的とするポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンスヌクレオチドは、選択された配列に相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖である。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ鎖の翻訳を、そのＲＮＡに結合することによって阻止する。アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、特定の相補的（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的とすることができる。結合が生じると、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、酵素ＲＮａｓｅ Ｈによって分解され得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０～約６０個のヌクレオチド、より好ましくは約１５～約３０個のヌクレオチドを含む。この用語はまた、所望の標的遺伝子に厳密に相補的ではない可能性のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、本発明は、非標的特異的活性がアンチセンスに見られる場合、または標的配列との１つ以上のミスマッチを含有するアンチセンス配列が特定の使用に最も好ましい場合に、利用可能である。
【0257】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の有効でありかつ標的化された阻害因子であることが示されており、したがって、標的とする遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害するために使用することができる。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクツロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）及びムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、それらのそれぞれのｍＲＮＡ配列を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号及び同第５，７５９，８２９号を参照されたい）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＩＣＡＭ－１、Ｅ－セレクチン、ＳＴＫ－１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体、及びヒトＥＧＦで示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１５４４－６（１９８８）、Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．，１：２２５－３２（１９８９）、Ｐｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１５；５７：３１０－２０（１９９８）、ならびに米国特許第５，８０１，１５４号、同第５，７８９，５７３号、同第５，７１８，７０９号、及び同第５，６１０，２８８号を参照されたい）。さらに、様々な異常細胞増殖、例えばがんを阻害し、それを治療するために使用することができるアンチセンスコンストラクトも記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号、同第５，５９１，３１７号、及び同第５，７８３，６８３号を参照されたい）。これらの参照文献の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0258】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成する方法は当該技術分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するように容易に適合させることができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択された標的配列の分析、ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、及び相対的安定性の判定に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞内で標的ｍＲＮＡへの特異的結合を低減させるかまたは阻止する、それらの二量体、ヘアピン、または他の二次構造の形成の相対的不能性に基づいて選択することができる。ｍＲＮＡの極めて好ましい標的領域には、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその近傍の領域、及びｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的な配列が含まれる。これらの二次構造分析及び標的部位選択の考察は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）及び／またはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－４０２（１９９７））を使用して実施することができる。
【0259】
リボザイム
本発明の別の実施形態によれば、脂質ナノ粒子はリボザイムと会合している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ－タンパク質複合体である（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４：８７８８－９２（１９８７）、及びＦｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４９：２１１－２０（１９８７）を参照されたい）。例えば、多くのリボザイムは、高度な特異性でリン酸エステル転移反応を促進させ、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質内のいくつかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断する（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２７：４８７－９６（１９８１）、Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１６：５８５－６１０（１９９０）、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ－Ｈｕｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：１７３－６（１９９２）を参照されたい）。この特異性は、基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に特異的な塩基対相互作用を介して結合するという要件に起因している。
本発明の別の実施形態によれば、脂質ナノ粒子はリボザイムと会合している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ－タンパク質複合体である（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４：８７８８－９２（１９８７）、及びＦｏｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４９：２１１－２０（１９８７）を参照されたい）。例えば、多くのリボザイムは、高度な特異性でリン酸エステル転移反応を促進させ、多くの場合、オリゴヌクレオチド基質内のいくつかのリン酸エステルのうちの１つのみを切断する（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２７：４８７－９６（１９８１）、Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１６：５８５－６１０（１９９０）、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ－Ｈｕｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５７：１７３－６（１９９２）を参照されたい）。この特異性は、基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に特異的な塩基対相互作用を介して結合するという要件に起因している。
【0260】
現在、天然の酵素ＲＮＡ分子の少なくとも６つの基本的な種類が知られている。それぞれが、生理学的条件下でＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解をトランスで触媒することができる（したがって、他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般に、酵素的核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に密接に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。したがって、酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次に相補的塩基対合を介してそれに結合し、正しい部位に結合すると、標的ＲＮＡを切断するように酵素的に作用する。そのような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされたタンパク質の合成を指示するその能力を消失させる。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合してそれを切断した後、その酵素的核酸は、そのＲＮＡから放出されて別の標的を探し、そして新しい標的に繰り返し結合し、それを切断することができる。
【0261】
酵素的核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎δウイルス、Ｉ群イントロンもしくはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と会合）またはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡモチーフで形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの具体的な例は、例えば、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：４５５９－６５（１９９２）に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、例えば、ＥＰ０３６０２５７、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８：４９２９－３３（１９８９）、Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：２９９－３０４（１９９０）、及び米国特許第５，６３１，３５９号に記載されている。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、例えば、Ｐｅｒｒｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１：１１８４３－５２（１９９２）に記載されている。ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、例えば、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ－Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３５：８４９－５７（１９８３）に記載されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフの例は、例えば、Ｓａｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６１：６８５－９６（１９９０）、Ｓａｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８８２６－３０（１９９１）、Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：２７９５－９（１９９３）に記載されている。Ｉ群イントロンの例は、例えば、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。本発明に従って使用される酵素的核酸分子の重要な特徴は、それらが標的遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡ領域のうちの１つ以上に相補的な特異的基質結合部位を有すること、及びそれらが、その基質結合部位内またはその周囲に、ＲＮＡ切断活性を分子に付与するヌクレオチド配列を有することである。したがって、リボザイムコンストラクトは、必ずしも本明細書において言及される特定のモチーフに限定されない。これらの参照文献の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0262】
任意のポリヌクレオチド配列を標的とするリボザイムの生成方法は、当該技術分野で公知である。リボザイムを、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／２３５６９号及び同第ＷＯ９４／０２５９５号に記載されているように設計し、それらに記載されているようにインビトロ及び／またはインビボで試験するために合成することができる。これらのＰＣＴ公開の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0263】
リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変化させることによって、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を阻止する修飾（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０７０６５号、同第ＷＯ９３／１５１８７号、同第ＷＯ９１／０３１６２号、及び同第ＷＯ９４／１３６８８号、ＥＰ９２１１０２９８．４号、ならびに米国特許第５，３３４，７１１号を参照されたい。これらは、酵素ＲＮＡ分子の糖部分に行うことができる種々の化学修飾について記載しており、これらの開示は、それぞれ、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる）、細胞内でのそれらの有効性を高める修飾、ならびにＲＮＡ合成時間の短縮及び化学的要件の低減のためのステムＩＩ塩基の除去、を有するリボザイムを化学合成することによって、最適化することができる。
【0264】
免疫刺激性オリゴヌクレオチド
本発明の脂質粒子に会合する核酸は、ヒトなどの哺乳動物であり得る対象に投与されたときに免疫応答を誘導することができる免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ；一本鎖または二本鎖）を含む、免疫刺激性であり得る。ＩＳＳには、例えば、ヘアピン二次構造をもたらす特定の回文構造（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：４０７２－６（１９９２）を参照されたい）、またはＣｐＧモチーフ、及び他の公知のＩＳＳの特徴（例えば、多重Ｇドメイン；ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１１２６６号を参照されたく、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる）が含まれる。
本発明の脂質粒子に会合する核酸は、ヒトなどの哺乳動物であり得る対象に投与されたときに免疫応答を誘導することができる免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ；一本鎖または二本鎖）を含む、免疫刺激性であり得る。ＩＳＳには、例えば、ヘアピン二次構造をもたらす特定の回文構造（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：４０７２－６（１９９２）を参照されたい）、またはＣｐＧモチーフ、及び他の公知のＩＳＳの特徴（例えば、多重Ｇドメイン；ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１１２６６号を参照されたく、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる）が含まれる。
【0265】
免疫刺激性核酸は、それらが、免疫応答を誘発するために、標的配列に特異的に結合してその発現を低減させる必要がない場合、非配列特異的と見なされる。したがって、特定の免疫刺激性核酸は、天然の遺伝子またはｍＲＮＡの領域に対応する配列を含み得るが、それらは依然として非配列特異的免疫刺激性核酸と見なされ得る。
【0266】
一実施形態では、免疫刺激性核酸またはオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドまたはＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていなくても、またはメチル化されていてもよい。別の実施形態では、免疫刺激性核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。一実施形態では、核酸は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含み、このＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンは、メチル化されている。代替的実施形態では、核酸は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、このＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１つのシトシンは、メチル化されている。さらなる実施形態では、配列内に存在するＣｐＧジヌクレオチド中の各シトシンは、メチル化されている。別の実施形態では、核酸は、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、このＣｐＧジヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、メチル化シトシンを含む。本発明の組成物及び方法における使用に適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドの例は、２００８年１２月３１日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／８８６７６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０６９３６９号、及び同第ＷＯ０１／１５７２６号、米国特許第６，４０６，７０５号、ならびにＲａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．，２９８：１１８５－９２（２００１）に記載されており、これらの開示はそれぞれ、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法に使用されるオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（「ＰＯ」）骨格もしくはホスホロチオエート（「ＰＳ」）骨格、及び／またはＣｐＧモチーフ内の少なくとも１つのメチル化シトシン残基を有する。
【0267】
ｍＲＮＡ
本発明の特定の実施形態は、生体細胞（例えば、人体内の細胞）内で１つ以上のｍＲＮＡ分子を発現させるために使用することができる組成物及び方法を提供する。このｍＲＮＡ分子は、生体細胞内で発現する１つ以上のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、罹患生物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）内で発現し、このポリペプチドの発現は、疾患の１つ以上の症状を改善する。本発明の組成物及び方法は、人体内の機能的ポリペプチドの欠如またはレベルの低減によって引き起こされるヒトの疾患の治療に特に有用である。したがって、特定の実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のｍＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子のカクテル）などの１つ以上の核酸分子を含み得る。
本発明の特定の実施形態は、生体細胞（例えば、人体内の細胞）内で１つ以上のｍＲＮＡ分子を発現させるために使用することができる組成物及び方法を提供する。このｍＲＮＡ分子は、生体細胞内で発現する１つ以上のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、罹患生物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）内で発現し、このポリペプチドの発現は、疾患の１つ以上の症状を改善する。本発明の組成物及び方法は、人体内の機能的ポリペプチドの欠如またはレベルの低減によって引き起こされるヒトの疾患の治療に特に有用である。したがって、特定の実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のｍＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ分子のカクテル）などの１つ以上の核酸分子を含み得る。
【0268】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（複数可）は、核酸－脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）に完全に封入される。ｍＲＮＡカクテルを含む製剤に関して、カクテル中に存在する異なるタイプのｍＲＮＡ種（例えば、異なる配列を有するｍＲＮＡ）は、同じ粒子に共封入されていてもよく、またはカクテル中に存在する各タイプのｍＲＮＡ種は、別個の粒子に封入されていてもよい。ｍＲＮＡカクテルを、２種以上の個々のｍＲＮＡ（それぞれユニークな配列を有する）の混合物を使用して、同一の、類似の、または異なる濃度またはモル比で、本明細書に記載の粒子中に製剤化することができる。一実施形態では、ｍＲＮＡのカクテル（異なる配列を有する複数のｍＲＮＡに対応する）を各ｍＲＮＡ種の同一の、類似の、または異なる濃度またはモル比を使用して製剤化し、異なるタイプのｍＲＮＡを同じ粒子に共封入する。別の実施形態では、カクテル中に存在する各タイプのｍＲＮＡ種を、同一の、類似の、または異なるｍＲＮＡ濃度またはモル比で異なる粒子に封入し、このように形成した粒子（それぞれ異なるｍＲＮＡペイロードを含有する）を別々に（例えば、治療レジメンに従って異なる時点で）投与するか、または（例えば、薬学的に許容可能な担体とともに）単一単位用量として組み合わせて、一緒に投与する。本明細書に記載の粒子は、血清安定性であり、ヌクレアーゼ分解に対して耐性であり、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に無毒性である。
【0269】
ｍＲＮＡに対する修飾
本発明の実施において使用されるｍＲＮＡは、１つ、２つ、または２つより多いヌクレオシド修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、対応する非修飾ｍＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡが導入される細胞において分解の低減を示す。
本発明の実施において使用されるｍＲＮＡは、１つ、２つ、または２つより多いヌクレオシド修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、対応する非修飾ｍＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡが導入される細胞において分解の低減を示す。
【0270】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドには、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンが含まれる。
【0271】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドには、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンが含まれる。
【0272】
他の実施形態では、修飾ヌクレオシドには、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデニン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンが含まれる。
【0273】
特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シチジン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジンまたは５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シュードウリジンである。α－チオ置換されたリン酸部分は、非天然ホスホロチオエート骨格結合を介してＲＮＡポリマーに安定性を付与するために提供される。ホスホロチオエートＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が増加し、次いで細胞環境における半減期が長くなる。ホスホロチオエート結合核酸は、細胞の自然免疫分子の比較的弱い結合／活性化を通じて、自然免疫応答を低減させることも予期される。
【0274】
特定の実施形態では、例えば、タンパク質産生の正確なタイミングが望まれる場合、細胞に導入された修飾核酸を細胞内で分解することが望ましい。したがって、本発明は、細胞内で指示された方法で作用することができる分解ドメインを含有する修飾核酸を提供する。
【0275】
他の実施形態では、修飾ヌクレオシドには、イノシン、１－メチル－イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンが含まれる。
【0276】
修飾核酸の任意成分
さらなる実施形態では、修飾核酸は、いくつかの実施形態において有益であり得る、他の任意成分を含み得る。これらの任意成分には、非翻訳領域、コザック配列、イントロンヌクレオチド配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、キャップ、及びポリＡテールが含まれるが、これらに限定されない。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲを提供することができ、これらのいずれかまたは両方は独立して１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含み得る。このような実施形態では、ヌクレオシド修飾はまた、翻訳可能領域にも存在し得る。コザック配列を含有する核酸も提供される。
さらなる実施形態では、修飾核酸は、いくつかの実施形態において有益であり得る、他の任意成分を含み得る。これらの任意成分には、非翻訳領域、コザック配列、イントロンヌクレオチド配列、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、キャップ、及びポリＡテールが含まれるが、これらに限定されない。例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／または３’ＵＴＲを提供することができ、これらのいずれかまたは両方は独立して１つ以上の異なるヌクレオシド修飾を含み得る。このような実施形態では、ヌクレオシド修飾はまた、翻訳可能領域にも存在し得る。コザック配列を含有する核酸も提供される。
【0277】
さらに、核酸から切り取ることができる１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含有する核酸が提供される。
【0278】
非翻訳領域（ＵＴＲ）
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが翻訳はされない。５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり開始コドンまで続くが、開始コドンは含まない。一方、３’ＵＴＲは終止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳に関してＵＴＲが果たす調節的役割についてのエビデンスが増えつつある。分子の安定性を増加させるために、ＵＴＲの調節機能を本発明で使用されるｍＲＮＡに組み込むことができる。特定の機能を組み込んで、望ましくない器官部位に誤って誘導された場合に、転写物の下方制御を確実に制御することもできる。
遺伝子の非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが翻訳はされない。５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり開始コドンまで続くが、開始コドンは含まない。一方、３’ＵＴＲは終止コドンの直後から始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子の安定性及び翻訳に関してＵＴＲが果たす調節的役割についてのエビデンスが増えつつある。分子の安定性を増加させるために、ＵＴＲの調節機能を本発明で使用されるｍＲＮＡに組み込むことができる。特定の機能を組み込んで、望ましくない器官部位に誤って誘導された場合に、転写物の下方制御を確実に制御することもできる。
【0279】
５’キャッピング
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を通じて細胞内のｍＲＮＡの安定性及び翻訳能力に関与して、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシングの際に５’近位イントロンの除去を補助する。
ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡの安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、これは、ＣＢＰとポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を通じて細胞内のｍＲＮＡの安定性及び翻訳能力に関与して、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシングの際に５’近位イントロンの除去を補助する。
【0280】
内因性ｍＲＮＡ分子は５’末端がキャッピングされ、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端の転写されたセンスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を生じ得る。次に、この５’－グアニル酸キャップはメチル化され、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生じ得る。ｍＲＮＡの５’末端及び／または末端前の転写されたヌクレオチドのリボース糖もまた、任意選択で２’－Ｏ－メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’－キャップ除去は、分解のために、ｍＲＮＡ分子などの核酸分子を標的にし得る。
【0281】
ＩＲＥＳ配列
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有するｍＲＮＡもまた、本発明の実施に有用である。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として機能する場合もあれば、ｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして機能する場合もある。複数の機能的なリボソーム結合部位を含有するｍＲＮＡは、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（「マルチシストロン性ｍＲＮＡ」）。ｍＲＮＡがＩＲＥＳとともに提供される場合、さらに任意選択で、第２の翻訳可能領域が提供される。本発明に従って使用できるＩＲＥＳ配列の例には、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（Ｓ１Ｖ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含有するｍＲＮＡもまた、本発明の実施に有用である。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として機能する場合もあれば、ｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして機能する場合もある。複数の機能的なリボソーム結合部位を含有するｍＲＮＡは、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（「マルチシストロン性ｍＲＮＡ」）。ｍＲＮＡがＩＲＥＳとともに提供される場合、さらに任意選択で、第２の翻訳可能領域が提供される。本発明に従って使用できるＩＲＥＳ配列の例には、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、ペストウイルス（ｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（Ｓ１Ｖ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが含まれるが、これらに限定されない。
【0282】
ポリＡテール
ＲＮＡプロセシング中に、安定性を増加させるために、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）がｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後に、転写物の３’末端が切断され、３’ヒドロキシルが遊離し得る。次に、ポリＡポリメラーゼがＲＮＡにアデニンヌクレオチドの鎖を付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスでは、１００～２５０残基長であり得るポリＡテールが付加される。
ＲＮＡプロセシング中に、安定性を増加させるために、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリＡテール）がｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後に、転写物の３’末端が切断され、３’ヒドロキシルが遊離し得る。次に、ポリＡポリメラーゼがＲＮＡにアデニンヌクレオチドの鎖を付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスでは、１００～２５０残基長であり得るポリＡテールが付加される。
【0283】
一般に、ポリＡテールの長さは３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリＡテールは、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１２０以上、１４０以上、１６０以上、１８０以上、２００以上、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、４５０以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、１０００以上、１１００以上、１２００以上、１３００以上、１４００以上、１５００以上、１６００以上、１７００以上、１８００以上、１９００以上、２，０００以上、２，５００以上、及び３，０００以上のヌクレオチド）。
【0284】
この状況において、ポリＡテールは、修飾ｍＲＮＡよりも長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くなり得る。ポリＡテールはまた、それが属する修飾核酸の部分として設計され得る。この状況において、ポリＡテールは、修飾ｍＲＮＡの全長または修飾ｍＲＮＡの全長からポリＡテールを引いたものの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、またはそれ以上であり得る。
【0285】
ｍＲＮＡ分子の作製
ＲＮＡの単離、ＲＮＡの合成、核酸のハイブリダイズ、ｃＤＮＡライブラリーの作成及びスクリーニング、ならびにＰＣＲの実施のための方法は、ＰＣＲ法（米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照されたい）と同様に、当該技術分野において周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３－２６９（１９８３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）を参照されたい）。発現ライブラリーもまた、当業者に周知である。本発明における一般的な使用方法を開示するさらなる基本的な文書には、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が含まれる。これらの参照文献の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
ＲＮＡの単離、ＲＮＡの合成、核酸のハイブリダイズ、ｃＤＮＡライブラリーの作成及びスクリーニング、ならびにＰＣＲの実施のための方法は、ＰＣＲ法（米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９０）を参照されたい）と同様に、当該技術分野において周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｇｅｎｅ，２５：２６３－２６９（１９８３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）を参照されたい）。発現ライブラリーもまた、当業者に周知である。本発明における一般的な使用方法を開示するさらなる基本的な文書には、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）が含まれる。これらの参照文献の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0286】
コードされるポリペプチド
本明細書に記載の脂質ナノ粒子のｍＲＮＡ成分を使用して、目的ポリペプチドを発現させることができる。ヒトにおける特定の疾患は、機能性タンパク質の、そのタンパク質が通常存在しかつ活性である細胞タイプにおける欠如または障害によって引き起こされる。機能性タンパク質は、例えば、コード化遺伝子の転写不活性に起因して、またはタンパク質を完全にもしくは部分的に非機能的にする突然変異がコード化遺伝子に存在していることに起因して、完全にまたは部分的に欠如する可能性がある。タンパク質の完全または部分的な不活性化によって引き起こされるヒトの疾患の例には、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）及び副腎白質ジストロフィー（Ｘ－ＡＬＤ）が含まれる。Ｘ－ＳＣＩＤは、免疫系内のＢ細胞及びＴ細胞の発生及び成熟に関与するいくつかのインターロイキンの受容体の成分である、共通ガンマ鎖タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の突然変異によって引き起こされる。Ｘ－ＡＬＤは、ＡＢＣＤ１と呼ばれるペルオキシソーム膜輸送体タンパク質遺伝子の１つ以上の突然変異によって引き起こされる。Ｘ－ＡＬＤに罹患している個体は、全身の組織に極めて高レベルの長鎖脂肪酸を有し、これが、精神障害または死に至るおそれのある様々な症状を引き起こす。
本明細書に記載の脂質ナノ粒子のｍＲＮＡ成分を使用して、目的ポリペプチドを発現させることができる。ヒトにおける特定の疾患は、機能性タンパク質の、そのタンパク質が通常存在しかつ活性である細胞タイプにおける欠如または障害によって引き起こされる。機能性タンパク質は、例えば、コード化遺伝子の転写不活性に起因して、またはタンパク質を完全にもしくは部分的に非機能的にする突然変異がコード化遺伝子に存在していることに起因して、完全にまたは部分的に欠如する可能性がある。タンパク質の完全または部分的な不活性化によって引き起こされるヒトの疾患の例には、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）及び副腎白質ジストロフィー（Ｘ－ＡＬＤ）が含まれる。Ｘ－ＳＣＩＤは、免疫系内のＢ細胞及びＴ細胞の発生及び成熟に関与するいくつかのインターロイキンの受容体の成分である、共通ガンマ鎖タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の突然変異によって引き起こされる。Ｘ－ＡＬＤは、ＡＢＣＤ１と呼ばれるペルオキシソーム膜輸送体タンパク質遺伝子の１つ以上の突然変異によって引き起こされる。Ｘ－ＡＬＤに罹患している個体は、全身の組織に極めて高レベルの長鎖脂肪酸を有し、これが、精神障害または死に至るおそれのある様々な症状を引き起こす。
【0287】
機能性タンパク質の、そのタンパク質が通常存在しかつ活性である細胞タイプにおける欠如または障害によって引き起こされるいくつかの疾患を治療するために、遺伝子療法を用いる試みがなされてきた。遺伝子療法は、通常、罹患タンパク質の機能的形態をコードする遺伝子を含むベクターの罹患者への導入、及び疾患を治療するための機能的タンパク質の発現を伴う。これまでのところ、遺伝子療法における成功は限られている。さらに、ＬＮＰを使用してｍＲＮＡを送達する特定の態様が、例えば、国際公開第ＷＯ２０１８／００６０５２号及び同第２０１５／０１１６３３号で説明されてきた。
【0288】
このため、機能性タンパク質の完全または部分的な欠如によって引き起こされる疾患に罹患しているヒト内でタンパク質の機能的形態を発現するための改善が引き続き必要とされており、かつ、例えば、療法に対する免疫応答の誘発をより低減させることができる方法及び組成物を介した核酸（例えば、ｍＲＮＡ）送達の改善が必要とされている。本発明の特定の実施形態は、この文脈において有用である。したがって、特定の実施形態では、ポリペプチドの発現は、疾患または障害の１つ以上の症状を改善する。本発明の特定の組成物及び方法は、人体内の機能的ポリペプチドの欠如またはレベルの低減によって引き起こされるヒトの疾患の治療に有用であり得る。他の実施形態では、本発明の特定の組成物及び方法は、例えば、がんを治療するためのワクチン抗原の発現に有用であり得る。
【0289】
自己増幅ＲＮＡ
特定の実施形態では、核酸は、１つ以上の自己増幅ＲＮＡ分子である。自己増幅ＲＮＡ（ｓａ－ＲＮＡ）はまた、自己複製ＲＮＡ、複製可能ＲＮＡ、レプリコン、またはＲｅｐＲＮＡと称されることもある。自己増幅ｍＲＮＡと称されるＲｅｐＲＮＡは、プラス鎖ウイルスに由来する場合、少なくとも１つの構造遺伝子を欠くウイルスゲノムから生成され、ＲｅｐＲＮＡは、感染性の子孫ウイルスを生成することなく、翻訳及び複製（したがって「自己増幅」）することができる。特定の実施形態では、ＲｅｐＲＮＡ技術を使用して、所望の目的抗原をコードする遺伝子カセットを挿入することができる。例えば、アルファウイルスゲノムは２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に分割されており、第１のＯＲＦはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）のタンパク質をコードし、第２のＯＲＦは構造タンパク質をコードする。ｓａ－ＲＮＡワクチンコンストラクトでは、ウイルス構造タンパク質をコードするＯＲＦを任意の選択した抗原に置き換えることができるが、一方、ウイルスレプリカーゼは依然としてワクチンの不可欠な部分であり、免疫化後のＲＮＡの細胞内増幅を促進する。
特定の実施形態では、核酸は、１つ以上の自己増幅ＲＮＡ分子である。自己増幅ＲＮＡ（ｓａ－ＲＮＡ）はまた、自己複製ＲＮＡ、複製可能ＲＮＡ、レプリコン、またはＲｅｐＲＮＡと称されることもある。自己増幅ｍＲＮＡと称されるＲｅｐＲＮＡは、プラス鎖ウイルスに由来する場合、少なくとも１つの構造遺伝子を欠くウイルスゲノムから生成され、ＲｅｐＲＮＡは、感染性の子孫ウイルスを生成することなく、翻訳及び複製（したがって「自己増幅」）することができる。特定の実施形態では、ＲｅｐＲＮＡ技術を使用して、所望の目的抗原をコードする遺伝子カセットを挿入することができる。例えば、アルファウイルスゲノムは２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に分割されており、第１のＯＲＦはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）のタンパク質をコードし、第２のＯＲＦは構造タンパク質をコードする。ｓａ－ＲＮＡワクチンコンストラクトでは、ウイルス構造タンパク質をコードするＯＲＦを任意の選択した抗原に置き換えることができるが、一方、ウイルスレプリカーゼは依然としてワクチンの不可欠な部分であり、免疫化後のＲＮＡの細胞内増幅を促進する。
【0290】
脂質粒子の調製
特定の実施形態では、本発明は、連続混合方法、例えば、第１のリザーバに核酸を含む水溶液を供給すること、第２のリザーバに有機脂質溶液を供給すること、及び核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を封入するリポソームを実質的に瞬時に生成するように有機脂質溶液が水溶液と混合するように、水溶液を有機脂質溶液と混合することを含むプロセスにより生成されるＬＮＰを提供する。このプロセス及びこのプロセスを実施するための装置は、米国特許出願公開第２００４０１４２０２５号に詳細に記載されており、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
特定の実施形態では、本発明は、連続混合方法、例えば、第１のリザーバに核酸を含む水溶液を供給すること、第２のリザーバに有機脂質溶液を供給すること、及び核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）を封入するリポソームを実質的に瞬時に生成するように有機脂質溶液が水溶液と混合するように、水溶液を有機脂質溶液と混合することを含むプロセスにより生成されるＬＮＰを提供する。このプロセス及びこのプロセスを実施するための装置は、米国特許出願公開第２００４０１４２０２５号に詳細に記載されており、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0291】
脂質及び緩衝溶液を混合チャンバ内などの混合環境に連続的に導入する操作により、緩衝溶液による脂質溶液の連続希釈が生じ、これにより、混合すると実質的に瞬時にリポソームが生成される。本明細書で使用される場合、「脂質溶液を緩衝溶液で連続的に希釈する」という語句（及び変形）は、一般に、脂質溶液が水和プロセスにおいて小胞の生成をもたらすのに十分な力で十分に迅速に希釈されることを意味する。核酸を含む水溶液を有機脂質溶液と混合することにより、有機脂質溶液は、緩衝溶液（すなわち水溶液）の存在下で連続的な段階希釈を受けて、脂質ナノ粒子を生成する。
【0292】
連続混合法を使用して形成されたＬＮＰは、通常、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、または約７０ｎｍ～約９０ｎｍのサイズを有する。このように形成された粒子は凝集せず、均一な粒子径を得るために任意選択でサイジングされる。
【0293】
別の実施形態では、本発明は、リポソーム溶液を形成すること、及び制御された量の希釈緩衝液が入っている収集容器にリポソーム溶液を直ちに直接導入することを含む、直接希釈プロセスにより生成されるＬＮＰを提供する。好ましい態様では、収集容器は、希釈を促進するために収集容器の内容物を撹拌するように構成された１つ以上の構成要素を含む。一態様では、収集容器中に存在する希釈緩衝液の量は、その中に導入されるリポソーム溶液の体積に実質的に等しい。非限定的な例として、４５％エタノール中のリポソーム溶液は、等体積の希釈緩衝液が入っている収集容器中に導入される場合、有利なことに、より小さな粒子をもたらすであろう。
【0294】
さらに別の実施形態では、本発明は、希釈緩衝液が入っている第３のリザーバを第２の混合領域に流体連結する、直接希釈プロセスにより生成されるＬＮＰを提供する。本実施形態では、第１の混合領域中で形成されたリポソーム溶液が、第２の混合領域中で希釈緩衝液と直ちに直接混合される。好ましい態様では、第２の混合領域は、リポソーム溶液及び希釈緩衝液の流れが、１８０°対向する流れとして合流するように配置されたＴ－コネクタを含むが、より浅い角度、例えば約２７°～約１８０°をもたらすコネクタを使用することができる。ポンプ機構は、第２の混合領域に制御可能な緩衝液流を送達する。一態様では、第２の混合領域に供給される希釈緩衝液の流速は、第１の混合領域からそこに導入されるリポソーム溶液の流速と実質的に等しくなるように制御される。この実施形態は、有利なことに、第２の混合領域中でリポソーム溶液と混合している希釈緩衝液の流れ、したがってまた、第２の混合プロセス全体にわたる緩衝液中のリポソーム溶液の濃度の、さらなる制御を可能にする。このような希釈緩衝液の流速の制御により、有利なことに、低減された濃度での小粒子径の形成が可能となる。
【0295】
これらのプロセス及びこれらの直接希釈プロセスを実施するための装置は、米国特許出願公開第２００７００４２０３１号に詳細に記載されており、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0296】
直接希釈プロセスを使用して形成されたＬＮＰは、通常、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、または約７０ｎｍ～約９０ｎｍのサイズを有する。このように形成された粒子は凝集せず、均一な粒子径を得るために任意選択でサイジングされる。
【0297】
必要であれば、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）を、リポソームをサイジングするために利用可能な任意の方法によりサイジングすることができる。サイジングは、所望のサイズ範囲及び比較的狭い粒子径分布を得るために実施することができる。
【0298】
所望のサイズに粒子をサイジングするためのいくつかの技術が利用可能である。リポソームのために使用され、本発明の粒子に等しく適用可能な１つのサイジング方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。槽内超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかにより粒子懸濁液を超音波処理することで、約５０ｎｍ未満のサイズの粒子までサイズを漸減させる。ホモジナイゼーションは、より大きな粒子をより小さな粒子に断片化するための剪断エネルギーに依存する、別の方法である。典型的なホモジナイゼーション手順では、選択された粒子径（典型的には約６０～約８０ｎｍ）が観察されるまで、標準的なエマルションホモジナイザーを通じて粒子を再循環させる。両方の方法において、従来のレーザー光粒子径識別またはＱＥＬＳにより、粒子径分布をモニタリングすることができる。
【0299】
細孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通した粒子の押出しもまた、比較的明確なサイズ分布へと粒子径を低減させるための有効な方法である。通常、所望の粒子径分布が得られるまで、懸濁液を膜を通して１回以上循環させる。粒子をより小さな孔の膜に順次通過させて押出し、サイズを徐々に低減させることができる。
【0300】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ中の核酸は、例えば、米国特許出願第０９／７４４，１０３号（この開示はすべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる）に記載されているように予め濃縮される。
【0301】
他の実施形態では、方法は、本発明の組成物を使用して細胞のリポフェクションを行うために有用な非脂質性ポリカチオンを添加することをさらに含む。好適な非脂質性ポリカチオンの例には、臭化ヘキサジメトリン（ＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）の商品名でＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡから販売されている）またはヘキサジメトリンの他の塩が含まれる。他の好適なポリカチオンには、例えば、ポリ－Ｌ－オルニチン、ポリ－Ｌ－アルギニン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ポリアリルアミン、及びポリエチレンイミンの塩が含まれる。これらの塩を添加するのは、好ましくは粒子が形成された後である。
【0302】
脂質粒子の投与
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、形成された後、核酸の細胞への導入に有用である。したがって、本発明はまた、核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）などの核酸を細胞に導入するための方法も提供する。この方法は、まず前述のように粒子を形成し、次に、核酸の細胞への送達が生じるのに十分な一定時間、その粒子を細胞に接触させることにより、インビトロまたはインビボで実施される。
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、形成された後、核酸の細胞への導入に有用である。したがって、本発明はまた、核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）などの核酸を細胞に導入するための方法も提供する。この方法は、まず前述のように粒子を形成し、次に、核酸の細胞への送達が生じるのに十分な一定時間、その粒子を細胞に接触させることにより、インビトロまたはインビボで実施される。
【0303】
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、それらと混合させるかまたは接触させるほぼすべての細胞タイプに吸着させることができる。粒子は、一旦吸着させると細胞の一部によりエンドサイトーシスされるか、脂質を細胞膜と交換するか、または細胞と融合するかのいずれかであり得る。粒子の核酸（例えば、核酸）部分の導入または組み込みは、これらの経路のいずれか１つを介して生じ得る。特に、融合が生じると、粒子膜は細胞膜に組み込まれ、粒子の内容物は細胞内液と混ざる。
【0304】
本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、単独で、または投与経路及び標準的な薬務に従って選択される薬学的に許容可能な担体（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝液）との混合物のいずれかで、投与することができる。一般に、緩衝生理食塩水（例えば１３５～１５０ｍＭ ＮａＣｌ）が薬学的に許容可能な担体として用いられるであろう。他の好適な担体には、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの安定性増強のための糖タンパク質を含む、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどが含まれる。さらなる好適な担体は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に記載されている。本明細書で使用される場合、「担体」には、あらゆるすべての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗細菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。「薬学的に許容可能」という語句は、ヒトに投与したときにアレルギー性または類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
【0305】
薬学的に許容可能な担体は、一般に、脂質粒子の形成後に添加される。したがって、粒子の形成後に、生理緩衝食塩水などの薬学的に許容可能な担体中に粒子を希釈することができる。
【0306】
医薬製剤中の粒子の濃度は大幅に、すなわち約０．０５重量％未満、通常は約２～５重量％または少なくとも約２～５重量％から、約１０～９０重量％もの高さまで変動し得、選択された特定の投与様式に従って、主として流体体積、粘度などにより選択されることになる。例えば、治療に伴う流体負荷を低下させるために、濃度を増加させることができる。これは、アテローム性動脈硬化症に関連するうっ血性心不全または重度の高血圧症を有する患者に特に望ましい場合がある。あるいは、投与部位の炎症を軽減するために、刺激性脂質から構成される粒子を低濃度に希釈してもよい。
【0307】
本発明の医薬組成物を、従来の周知の滅菌技術により滅菌してもよい。水溶液は、使用のためにパッケージ化してもよく、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥し、その凍結乾燥調製物を投与前に無菌水溶液と混合してもよい。組成物は、生理学的条件に近似させるために必要とされる、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤などの薬学的に許容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウムを含有してもよい。さらに、粒子懸濁液は、貯蔵時のフリーラジカル及び脂質過酸化による損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含んでもよい。アルファトコフェロールなどの親油性フリーラジカルクエンチャー及びフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異的キレート剤が好適である。
【0308】
インビボ投与
インビボ療法のための全身送達、例えば、循環などの身体系を介した遠位標的細胞への治療用核酸の送達は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／００７１９６号、同第ＷＯ０５／１２１３４８号、同第ＷＯ０５／１２０１５２号、及び同第ＷＯ０４／００２４５３号（これらの開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる）に記載されているものなどの核酸－脂質粒子を使用して実現されている。本発明はまた、血清中でヌクレアーゼ分解から核酸を保護し、非免疫原性でありサイズが小さく反復投薬に好適である、完全に封入された脂質粒子を提供する。
インビボ療法のための全身送達、例えば、循環などの身体系を介した遠位標的細胞への治療用核酸の送達は、ＰＣＴ公開第ＷＯ０５／００７１９６号、同第ＷＯ０５／１２１３４８号、同第ＷＯ０５／１２０１５２号、及び同第ＷＯ０４／００２４５３号（これらの開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる）に記載されているものなどの核酸－脂質粒子を使用して実現されている。本発明はまた、血清中でヌクレアーゼ分解から核酸を保護し、非免疫原性でありサイズが小さく反復投薬に好適である、完全に封入された脂質粒子を提供する。
【0309】
インビボ投与の場合、投与は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、注射、経口投与、吸入（例えば、鼻腔内または気管内）、経皮適用、または直腸投与によるものであり得る。投与は、単回用量または分割用量により行うことができる。医薬組成物は、非経口的、すなわち、関節内に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または筋肉内に投与することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射により静脈内または腹腔内投与される（例えば、米国特許第５，２８６，６３４号を参照されたい）。細胞内核酸送達はまた、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１：５１２（１９８３）、Ｍａｎｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）、Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，６：２３９（１９８９）、及びＢｅｈｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２６：２７４（１９９３）で論じられている。脂質ベースの治療薬を投与するさらなる他の方法は、例えば、米国特許第３，９９３，７５４号、同第４，１４５，４１０号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２２４，１７９号、同第４，５２２，８０３号、及び同第４，５８８，５７８号に記載されている。脂質粒子は、疾患部位での直接注射により、または疾患部位から遠位の部位での注射により投与することができる（例えば、Ｃｕｌｖｅｒ，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０－７１（１９９４）を参照されたい）。前述の参照文献の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0310】
本発明の組成物は、吸入（例えば、鼻腔内または気管内）を介して投与するために、単独で、または他の適切な成分と組み合わせてのいずれかで、エアロゾル製剤に作製することができる（すなわち、それらを「噴霧する」ことができる）（Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．，２９８：２７８（１９８９）を参照されたい）。エアロゾル製剤を、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴射剤中に入れることができる。
【0311】
特定の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、及び／または他のエアロゾル送達ビヒクルにより送達することができる。核酸組成物を経鼻エアロゾルスプレーにより肺に直接送達するための方法は、例えば米国特許第５，７５６，３５３号及び同第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂及びリゾホスファチジル－グリセロール化合物を使用した薬物送達（米国特許第５，７２５，８７１号）もまた、薬学的分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載されている。前述の特許の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0312】
例えば、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路などによる非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張無菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液が含まれる。本発明の実施において、組成物は、好ましくは例えば、静脈内注入によって、経口で、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に投与される。
【0313】
一般に、静脈内投与する場合、脂質粒子製剤を適切な医薬担体を用いて製剤化する。多くの薬学的に許容可能な担体を、本発明の組成物及び方法に用いることができる。本発明における使用に適した製剤は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に見出される。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなどを使用することができ、それらの水性担体は、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの安定性増強のための糖タンパク質を含み得る。一般に、薬学的に許容可能な担体として緩衝生理食塩水（１３５～１５０ｍＭ ＮａＣｌ）が用いられるが、他の適切な担体でも十分であろう。これらの組成物は、濾過などの従来のリポソーム滅菌技術により滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近似させるために必要とされる、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤などの薬学的に許容可能な補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどを含有してもよい。これらの組成物を、前述の技術を使用して滅菌してもよく、またはその代わりに、滅菌条件下で生成してもよい。得られた水溶液は、使用のためにパッケージ化してもよく、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥し、その凍結乾燥調製物を投与前に無菌水溶液と混合してもよい。
【0314】
ある特定の用途では、本明細書に開示される脂質粒子は、経口投与により個体に送達することができる。粒子を賦形剤に組み込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、ロゼンジ、エリキシル剤、洗口剤、懸濁液、口腔スプレー剤、シロップ剤、オブラートなどの形態で使用することができる（例えば、米国特許第５，６４１，５１５号、同第５，５８０，５７９号、及び同第５，７９２，４５１を参照されたい。これらの開示はすべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる）。これらの経口剤形はまた、以下、すなわち結合剤、ゼラチン；賦形剤、滑沢剤、及び／または香味剤を含有し得る。単位剤形がカプセルの場合、その剤形は、前述の物質に加えて液体担体を含有してもよい。様々な他の物質が、コーティング剤として、またはその他の方法で投薬単位の物理的形態を変更するために、存在してもよい。当然ながら、任意の単位剤形の調製に使用される任意の物質は、薬学的に純粋であり、用いられる量で実質的に無毒性であるべきである。
【0315】
通常、これらの経口製剤は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い脂質粒子を含有し得るが、粒子のパーセンテージは当然ながら変動してもよく、好都合には製剤の総重量または総体積の約１％もしくは２％～約６０％もしくは７０％またはそれより多くてもよい。必然的に、治療的に有用な各組成物中の粒子の量は、好適な投薬量が化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方式で調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、生成物の有効期間、及び他の薬理学的考慮事項などの要因が、そのような医薬製剤を調製する当業者によって企図され、したがって、様々な投薬量及び治療レジメンが望ましい場合がある。
【0316】
経口投与に適した製剤は以下、すなわち、（ａ）液体溶液、例えば、水、食塩水、またはＰＥＧ４００などの希釈剤中に懸濁した、核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）などの有効量のパッケージ化された治療剤、（ｂ）所定量の核酸（例えば干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）などの治療剤を液体、固体、顆粒、またはゼラチンとしてそれぞれ含有する、カプセル剤、サシェ、または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、及び（ｄ）好適なエマルションから構成され得る。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、色素、崩壊剤、ならびに薬学的に適合可能な担体のうちの１つ以上を含み得る。ロゼンジ形態は、香料、例えば、スクロース中の核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）などの治療剤、ならびに治療剤に加えて当該技術分野で公知の担体を含有するゼラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアラビアゴムエマルション、ゲルなどの不活性基剤中に治療剤を含む香錠を含み得る。
【0317】
それらの別の使用例では、脂質粒子を広範な局所剤形に組み込むことができる。例えば、ＬＮＰなどの核酸－脂質粒子を含有する懸濁液は、ゲル、油、エマルション、局所クリーム、ペースト、軟膏、ローション、泡、ムースなどとして製剤化及び投与することができる。
【0318】
本発明の脂質粒子の医薬調製物を調製する場合、空の粒子または核酸などの治療剤が外表面と会合した粒子を低減または除去するために精製された、多量の粒子を使用することが好ましい。
【0319】
本発明の方法は、様々な宿主において実施することができる。好ましい宿主には、霊長類（例えば、ヒト及びチンパンジーならびに他の非ヒト霊長類）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類（例えば、ラット及びマウス）、ウサギ、ならびにブタなどの哺乳動物種が含まれる。
【0320】
投与される粒子の量は、治療剤（例えば、核酸）対脂質の比、使用される特定の治療剤（例えば、核酸）、治療される疾患または障害、患者の年齢、体重、及び状態、ならびに臨床医の判断に依存するが、一般に、約０．０１～約５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１～約５ｍｇ／ｋｇ体重、または投与（例えば、注射）１回あたり約１０８～１０１０粒子であろう。
【0321】
インビトロ投与
インビトロ用途の場合、核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）などの治療剤の送達は、植物起源であるか動物起源であるか、脊椎動物であるか無脊椎動物であるか、及びいずれの組織またはタイプであるかを問わず、培養で増殖させた任意の細胞に対して行うことができる。好ましい実施形態では、細胞は、動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
インビトロ用途の場合、核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）などの治療剤の送達は、植物起源であるか動物起源であるか、脊椎動物であるか無脊椎動物であるか、及びいずれの組織またはタイプであるかを問わず、培養で増殖させた任意の細胞に対して行うことができる。好ましい実施形態では、細胞は、動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
【0322】
インビトロで実施する場合、細胞と脂質粒子との間の接触は、生物学的に適合可能な培地中で行われる。粒子の濃度は、特定の用途に応じて広く変動するが、一般的には約１μｍｏｌ～約１０ｍｍｏｌである。脂質粒子を用いた細胞の処置は、一般に、生理学的温度（約３７℃）で、約１～４８時間、好ましくは約２～４時間の期間にわたって実施される。
【0323】
好ましい実施形態の一群では、脂質粒子懸濁液を、約１０３～約１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは約２×１０４細胞／ｍｌの細胞密度を有する、６０～８０％コンフルエントでプレーティングした細胞に添加する。細胞に添加される懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１～０．２μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１μｇ／ｍｌである。
【0324】
エンドソーム放出パラメータ（Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ）（ＥＲＰ）アッセイを使用して、本発明のＬＮＰまたは他の脂質粒子の送達効率を最適化することができる。ＥＲＰアッセイは、米国特許出願公開第２００３００７７８２９号に詳細に記載されており、この開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。より詳細には、ＥＲＰアッセイの目的は、ＬＮＰの様々なカチオン性脂質及びヘルパー脂質成分の作用を、エンドソーム膜の結合／取り込みまたはエンドソーム膜との融合／その不安定化に対するそれらの相対的作用に基づいて判別することである。このアッセイにより、ＬＮＰまたは他の脂質粒子の各成分が送達効率にどのように影響を及ぼすかを定量的に判定し、それにより、ＬＮＰまたは他の脂質粒子を最適化することが可能となる。通常、ＥＲＰアッセイは、レポータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など）の発現を測定する。場合によっては、発現プラスミドに対して最適化されたＬＮＰ製剤はまた、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡを封入するのに適している。他の場合では、ＥＲＰアッセイを、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の存在下または非存在下で標的配列の転写または翻訳の下方制御を測定するために適合させることができる。他の場合では、ＥＲＰアッセイを、ｍＲＮＡの存在下または非存在下で標的タンパク質の発現を測定するために適合させることができる。様々なＬＮＰまたは他の脂質粒子の各々についてのＥＲＰを比較することにより、最適化された系、例えば、細胞内に最も多く取り込まれるＬＮＰまたは他の脂質粒子を容易に決定することができる。
【0325】
脂質粒子の送達のための細胞
本発明の組成物及び方法は、多種多様な細胞タイプをインビボ及びインビトロで治療するために使用される。好適な細胞には、例えば、造血前駆（幹）細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、肝細胞、内皮細胞、骨格筋及び平滑筋細胞、骨芽細胞、神経細胞、静止リンパ球、最終分化細胞、周期が遅いまたは周期が停止した（ｎｏｎｃｙｃｌｉｎｇ）初代細胞、実質細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、骨細胞などが含まれる。一実施形態では、１つ以上の核酸分子（例えば、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡ）などの核酸は、例えば、肺癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肛門癌細胞、胆管癌細胞、小腸癌細胞、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ））細胞、食道癌細胞、胆嚢癌細胞、肝癌細胞、膵癌細胞、虫垂癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、腎癌細胞、中枢神経系の癌細胞、神経膠芽腫腫瘍細胞、皮膚癌細胞、リンパ腫細胞、絨毛癌腫瘍細胞、頭頸部癌細胞、骨原性肉腫腫瘍細胞、及び血液癌細胞などのがん細胞に送達される。
本発明の組成物及び方法は、多種多様な細胞タイプをインビボ及びインビトロで治療するために使用される。好適な細胞には、例えば、造血前駆（幹）細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、肝細胞、内皮細胞、骨格筋及び平滑筋細胞、骨芽細胞、神経細胞、静止リンパ球、最終分化細胞、周期が遅いまたは周期が停止した（ｎｏｎｃｙｃｌｉｎｇ）初代細胞、実質細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、骨細胞などが含まれる。一実施形態では、１つ以上の核酸分子（例えば、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡ）などの核酸は、例えば、肺癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、肛門癌細胞、胆管癌細胞、小腸癌細胞、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ（ｇａｓｔｒｉｃ））細胞、食道癌細胞、胆嚢癌細胞、肝癌細胞、膵癌細胞、虫垂癌細胞、乳癌細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、腎癌細胞、中枢神経系の癌細胞、神経膠芽腫腫瘍細胞、皮膚癌細胞、リンパ腫細胞、絨毛癌腫瘍細胞、頭頸部癌細胞、骨原性肉腫腫瘍細胞、及び血液癌細胞などのがん細胞に送達される。
【0326】
１つ以上の核酸分子（例えば、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）またはｍＲＮＡ）を封入しているＬＮＰなどの脂質粒子のインビボ送達は、任意の細胞タイプの細胞を標的とするのに適している。本方法及び組成物は、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、及びモルモット）、ウサギ、ブタ、ならびに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、及びヒト）などの哺乳動物を含む、多種多様な脊椎動物の細胞で用いることができる。
【0327】
必要とされ得る範囲内で、細胞の組織培養は当該技術分野において周知である。例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）、Ｋｕｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｏｗｄｅｎ，Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓ，Ｉｎｃ．（１９７７）及びこれらに引用された参照文献は、細胞培養への一般的な手引きを提供する。培養細胞系は、多くの場合単層細胞の形態であるが、細胞懸濁液も使用される。
【0328】
脂質粒子の検出
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、約１、２、３、４、５、６、７、８時間またはそれ以上の時点で、対象において検出可能である。他の実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、粒子の投与から約８、１２、２４、４８、６０、７２、もしくは９６時間後、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２２、２４、２５、もしくは２８日後に対象において検出可能である。粒子の存在は、対象由来の細胞、組織、または他の生体試料から検出することができる。粒子は、例えば、粒子の直接検出により、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）もしくはｍＲＮＡ配列などの治療用核酸の検出により、目的標的配列の検出により（すなわち目的配列の発現における変化を検出することにより）、またはこれらの組み合わせにより、検出することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、約１、２、３、４、５、６、７、８時間またはそれ以上の時点で、対象において検出可能である。他の実施形態では、本発明の脂質粒子（例えば、ＬＮＰ）は、粒子の投与から約８、１２、２４、４８、６０、７２、もしくは９６時間後、または約６、８、１０、１２、１４、１６、１８、１９、２２、２４、２５、もしくは２８日後に対象において検出可能である。粒子の存在は、対象由来の細胞、組織、または他の生体試料から検出することができる。粒子は、例えば、粒子の直接検出により、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）もしくはｍＲＮＡ配列などの治療用核酸の検出により、目的標的配列の検出により（すなわち目的配列の発現における変化を検出することにより）、またはこれらの組み合わせにより、検出することができる。
【0329】
粒子の検出
ＬＮＰなどの本発明の脂質粒子は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して検出することができる。例えば、当該技術分野で周知の方法を使用して、脂質粒子の成分に標識を直接または間接的にカップリングさせることができる。必要とされる感度、脂質粒子成分とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、ならびに利用可能な計測手段及び使い捨て設備（ｄｉｓｐｏｓａｌ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）に応じて標識を選択して、多種多様な標識を使用することができる。適切な標識には、蛍光色素（例えば、フルオレセインならびにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）などの誘導体；ローダミン及びテキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などの誘導体、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅ（商標）など）などの分光標識；３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなどの放射標識；西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素；コロイド状金または着色ガラスまたはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなどのプラスチックビーズなどの分光比色標識が含まれるが、これらに限定されない。標識は、当該技術分野で公知の任意の手段を使用して検出することができる。
ＬＮＰなどの本発明の脂質粒子は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して検出することができる。例えば、当該技術分野で周知の方法を使用して、脂質粒子の成分に標識を直接または間接的にカップリングさせることができる。必要とされる感度、脂質粒子成分とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、ならびに利用可能な計測手段及び使い捨て設備（ｄｉｓｐｏｓａｌ ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）に応じて標識を選択して、多種多様な標識を使用することができる。適切な標識には、蛍光色素（例えば、フルオレセインならびにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びＯｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（商標）などの誘導体；ローダミン及びテキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などの誘導体、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅ（商標）など）などの分光標識；３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなどの放射標識；西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素；コロイド状金または着色ガラスまたはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなどのプラスチックビーズなどの分光比色標識が含まれるが、これらに限定されない。標識は、当該技術分野で公知の任意の手段を使用して検出することができる。
【0330】
核酸の検出
核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）は、本明細書において当業者に周知の任意のいくつかの手段により検出及び定量される。核酸の検出は、サザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動、ＰＣＲ、放射標識、シンチレーション計数、及びアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の方法により行うことができる。分光光度法、Ｘ線撮影法、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及び高拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーなどのさらなる分析的な生化学的方法もまた、用いることができる。
核酸（例えば、干渉ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）は、本明細書において当業者に周知の任意のいくつかの手段により検出及び定量される。核酸の検出は、サザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動、ＰＣＲ、放射標識、シンチレーション計数、及びアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の方法により行うことができる。分光光度法、Ｘ線撮影法、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及び高拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーなどのさらなる分析的な生化学的方法もまた、用いることができる。
【0331】
核酸ハイブリダイゼーション形式の選択は、重要ではない。様々な核酸ハイブリダイゼーション形式が、当業者に公知である。例えば、一般的な形式には、サンドイッチアッセイ及び競合または置換アッセイが含まれる。ハイブリダイゼーション技術は、概して、例えば“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｅｄｓ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）に記載されている。
【0332】
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出される標的核酸を増加させる核酸増幅系の使用を通じて向上させることができる。分子プローブとして使用するための配列の増幅、または後続のサブクローニングのための核酸断片の作製に適したインビトロ増幅技術が、公知である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ－レプリカーゼ増幅、及び他のＲＮＡポリメラーゼ媒介性技術（例えば、ＮＡＳＢＡ（商標））を含む、そのようなインビトロ増幅法を介して当事者を導くのに十分な技術の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＳＨＯＲＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）、ならびに米国特許第４，６８３，２０２号、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）、Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔ．１，１９９０），Ｃ＆ＥＮ ３６；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３：８１（１９９１）、Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３（１９８９）、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０）、Ｌｏｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３５：１８２６（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２９１（１９９０）、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｅ，４：５６０（１９８９）；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０）、及びＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：５６３（１９９５）に見出される。インビトロで増幅した核酸をクローニングする改善された方法は、米国特許第５，４２６，０３９号に記載されている。当該技術分野で説明されている他の方法は、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ（商標）、Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）及びＱβ－レプリカーゼ系である。これらの系は、選択した配列が存在する場合のみＰＣＲまたはＬＣＲプライマーが伸長またはライゲートするように設計した場合、突然変異体を直接同定するために使用することができる。あるいは、選択した配列を、一般に、例えば非特異的ＰＣＲプライマーを使用して増幅することができ、その後、突然変異を示す特定の配列について、増幅された標的領域を探索することができる。前述の参照文献の開示は、すべての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【0333】
例えば、インビトロ増幅法におけるプローブとしての使用のための、遺伝子プローブとしての使用のための、または阻害物質成分としての核酸は、通常、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９ １８６２（１９８１）により記載されている固相ホスホラミダイトトリエステル法に従って、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２：６１５９（１９８４）に記載されている自動合成装置を使用して化学合成される。必要な場合、ポリヌクレオチドの精製は通常、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，２５５：１３７ １４９（１９８３）に記載されているアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかにより実施される。合成ポリヌクレオチドの配列は、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０）ｉｎ Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｌｄａｖｅ（ｅｄｓ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５：４９９の化学分解法を使用して検証することができる。
【0334】
転写レベルを測定するための代替的手段は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、概して、Ａｎｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：６４９（１９８７）に記載されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞を固体支持体、通常はスライドガラスに固定する。ＤＮＡを探索する場合、熱またはアルカリで細胞を変性させる。次に、細胞を中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させ、標識した特異的プローブをアニーリングさせる。プローブを、好ましくは放射性同位体または蛍光レポーターで標識する。
【実施例】
【0335】
本発明を、具体的な実施例によってより詳細に説明する。以下の実施例は例示目的のみに提供され、いかなる方法によっても本発明を限定することを意図するものではない。
【0336】
実施例１
核酸の送達に有用な脂質ナノ粒子製剤には、しばしばＰＥＧ－脂質コンジュゲートが使用される。このＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＬＮＰ製造中の粒子サイズを制御し、投与後のバイアル及び血液中の不要な凝集を防ぐのに役立つ。ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、血液中の不要なオプソニン作用を防ぐのにも役立つ。これらのＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、分子量が約２０００のＰＥＧポリマー成分を使用するのが非常に一般的である。コンジュゲートが２つのＣ１４鎖を含む脂質部分を使用すること、及びこれらのＰＥＧ－脂質コンジュゲートが０．５から２％のモル比（組成物中の他の脂質と比較して）で使用されることも典型的である。本明細書に記載のように、脂質ナノ粒子に有益な特性を提供するために、通常使用されるものとは異なる、異なる量で使用されるＰＥＧ－脂質コンジュゲート構造を使用する新しい製剤が開発された。
核酸の送達に有用な脂質ナノ粒子製剤には、しばしばＰＥＧ－脂質コンジュゲートが使用される。このＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＬＮＰ製造中の粒子サイズを制御し、投与後のバイアル及び血液中の不要な凝集を防ぐのに役立つ。ＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、血液中の不要なオプソニン作用を防ぐのにも役立つ。これらのＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、分子量が約２０００のＰＥＧポリマー成分を使用するのが非常に一般的である。コンジュゲートが２つのＣ１４鎖を含む脂質部分を使用すること、及びこれらのＰＥＧ－脂質コンジュゲートが０．５から２％のモル比（組成物中の他の脂質と比較して）で使用されることも典型的である。本明細書に記載のように、脂質ナノ粒子に有益な特性を提供するために、通常使用されるものとは異なる、異なる量で使用されるＰＥＧ－脂質コンジュゲート構造を使用する新しい製剤が開発された。
【0337】
したがって、ベンチマーク組成物よりもかなり優れた効力を示す新しいＬＮＰ組成物が同定された。ベンチマークは、最初に承認されたＲＮＡｉ製品であるパチシランで使用される脂質組成物であり、この組成物は、ゴールドスタンダードのベンチマークとして頻繁に使用される。パチシランは、遺伝性トランスチレチン介在性アミロイドーシスを有する人の多発性神経障害の治療薬である。これは、異常な形態のトランスサイレチンの産生を標的とするｓｉＲＮＡペイロードを含むＬＮＰ製品である。これは、ＦＤＡによって承認された最初の低分子干渉ＲＮＡベースの薬剤である。ベンチマーク比較組成物は、式ＣＬ２のカチオン性脂質、ＰＥＧ分子量２０００のＰＥＧ脂質、及び２ｘＣ１４脂質アンカーを使用する。このＰＥＧ－脂質は、製剤の１．５ ｍｏｌ％を構成する。対照的に、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、２％から５％のモル比で分子量５００～１０００のＰＥＧ、及び０．２％から０．５％のモル比で５０００～２００００のＰＥＧポリマーサイズを有するＰＥＧ脂質を含む。
【0338】
実験
脂質溶液には、ＰＥＧ結合脂質、イオン化脂質、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣなど）の４つの成分が含まれていた。本明細書に記載されている脂質の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）及びモル比を使用して、１００％エタノール中で総濃度約７ｍｇ／ｍＬを達成するように脂質原液を調製した。ｍＲＮＡ（ヒトエリスロポイエチン）を酢酸塩、ｐＨ５緩衝液、及びヌクレアーゼフリー水で希釈して、１００ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５で０．３６６ｍｇ／ｍＬ ｍＲＮＡの目標濃度を達成した。等量の脂質溶液と核酸溶液をＴコネクタを介して４００ｍＬ／分の流速でブレンドし、約４倍量のＰＢＳ、ｐＨ７．４で希釈した。配合物をＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析ユニット（ＭＷＣＯ １０，０００）に入れ、１０ｍＭトリス、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）緩衝液で一晩透析した。透析後、配合物をＶｉｖａＳｐｉｎコンセントレータユニット（ＭＷＣＯ １００，０００）を使用して約０．６ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２μｍシリンジフィルター（ＰＥＳメンブレン）に通して濾過した。核酸濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイによって決定した。
脂質溶液には、ＰＥＧ結合脂質、イオン化脂質、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣなど）の４つの成分が含まれていた。本明細書に記載されている脂質の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）及びモル比を使用して、１００％エタノール中で総濃度約７ｍｇ／ｍＬを達成するように脂質原液を調製した。ｍＲＮＡ（ヒトエリスロポイエチン）を酢酸塩、ｐＨ５緩衝液、及びヌクレアーゼフリー水で希釈して、１００ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５で０．３６６ｍｇ／ｍＬ ｍＲＮＡの目標濃度を達成した。等量の脂質溶液と核酸溶液をＴコネクタを介して４００ｍＬ／分の流速でブレンドし、約４倍量のＰＢＳ、ｐＨ７．４で希釈した。配合物をＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析ユニット（ＭＷＣＯ １０，０００）に入れ、１０ｍＭトリス、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）緩衝液で一晩透析した。透析後、配合物をＶｉｖａＳｐｉｎコンセントレータユニット（ＭＷＣＯ １００，０００）を使用して約０．６ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２μｍシリンジフィルター（ＰＥＳメンブレン）に通して濾過した。核酸濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイによって決定した。
【0339】
実験に記載された配合物に使用されたカチオン性脂質は、式ＣＬ１の化合物である。
【化10】
【0340】
ベンチマーク比較製剤に使用されたカチオン性脂質は、式ＣＬ２の化合物である。
【化11】
【0341】
これらのカチオン性脂質のそれぞれは、現在記載されている脂質ナノ粒子及びその製剤においても使用することができるカチオン性脂質の例である。
【0342】
一般に、ＬＮＰ製剤を雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（５～８週齢）に０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。注射の直前に、ＬＮＰ原液を必要な投与濃度に希釈した。ＥＰＯ ｍＲＮＡ－ＬＮＰを投与された動物の場合、投与後２～２４時間で採血した。最終時点で、動物を致死量のケタミン／キシラジンで安楽死させた。すべての血液サンプルをＫ２ＥＤＴＡに収集し、血漿に処理した後、分析まで－８０℃で凍結保存した。
【0343】
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）活性は、ヒトＥＰＯ ＥＬＩＳＡキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０１６３０またはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＥＰ００）を製造元の指示に従って使用して、血漿中でアッセイした。
【0344】
【表1】
【0345】
【表2】
【0346】
【表3】
【0347】
【表4】
【0348】
説明したように、ＬＮＰ組成物は通常、分子量２０００のＰＥＧポリマーと２ｘＣ１４脂質アンカー鎖を持つＰＥＧ脂質を含む。このようなＰＥＧ－脂質は、パチシランの場合と同様に、約０．５～２ｍｏｌ％の量で頻繁に使用される。本明細書に記載されているのは、異なる量で使用される異なるタイプのＰＥＧ－脂質を有する新しい組成物である。これらの新しい組成物は、通常使用されるよりも小さい（５００から１０００）または大きい（５０００から２００００）分子量のＰＥＧ－脂質コンジュゲートを採用している。より小さい分子量のＰＥＧポリマーを使用する場合、標準よりも多い量のＰＥＧ－脂質が使用された。より大きい分子量のＰＥＧポリマーを使用する場合、標準よりも少ない量のＰＥＧ－脂質が使用された。ほとんどの場合、これらの製剤は、パチシランで使用されているベンチマーク組成物よりもかなり強力であった。
【0349】
ＰＥＧ－脂質、及びＰＥＧ脂質を作製するための合成方法は、以下に記載されている。
【0350】
ＰＥＧ－脂質実験
【化12】
【0351】
スキーム１：ＰＥＧ脂質の一般的な合成
ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）中のジ－ｔ－ブチルジカルボナート（１４．２３ｇ、６５．２ｍｍｏｌ）の溶液を、ＣＨ３ＯＨ（４０ｍＬ）中の３－アミノ－１，２－プロパンジオール１（５．４ｇ、５９．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。撹拌（１８時間）後、反応混合物を濃縮乾固して２（１１．２５ｇ、９９％）を得て、それをさらに処理せずに使用した。Ｒｆ０．６（１０％ＣＨ３ＯＨ－ＣＨ２Ｃｌ２）ＫＭｎＯ４染色。
【化13】
【0352】
ジアルキルプロパンアミン－ＴＦＡ塩４の調製のための２段階プロトコル
ステップ１：
トルエン（２０ｍＬ）中の２（１ｇ、５．２３ｍｍｏｌ）、１－ブロモオクタン（３．０３ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びＴＢＡＨＳ（０．８９ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し（０℃）、ＮａＯＨ（１５ｍＬ、５０％ｗ／ｖ）で処理した。二相混合物を激しく撹拌した（１８時間、室温）。混合物を水で希釈し、ヘキサン（２ｘ）で抽出した後、これらの合わせた有機物をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗物質をクロマトグラフィーに供して、３ａ（１．２５ｇ、５７％）を淡黄色の油として得た。Ｒｆ０．４５ （１０％ＥｔＯＡｃ－ヘキサン）ＣｕＳＯ４染色。
ステップ１：
【化14】
【0353】
ステップ２：
ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の３ａ（１．２３ｇ、２．９６ｍｍｏｌ）の溶液をＴＦＡ（４．５６ｍＬ、５９．１８ｍｍｏｌ）で処理した。撹拌（２時間、室温）後、反応混合物を濃縮乾固して、ＴＦＡ塩として４ａ（１．２５ｇ、定量的）を得て、それをさらに処理せずに使用した。Ｒｆ０．４（１０％ＣＨ２Ｃｌ２－ＣＨ３ＯＨ）ＣｕＳＯ４染色。
【化15】
【0354】
２，３－ビス（デシルオキシ）プロパン－１－アミン－ＴＦＡ塩４ｂ
ジデシルオキシアミン４ｂを４ａと同じ方法でブロモデカン（３．４７ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）、２（１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＨＳ（０．８９ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）、そしてＴＦＡ（３．８２ｍＬ、４９．６ｍｍｏｌ）から調製して４ｂ（１．５ｇ、９３％）を無色の油として得た。
ジデシルオキシアミン４ｂを４ａと同じ方法でブロモデカン（３．４７ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）、２（１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＨＳ（０．８９ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）、そしてＴＦＡ（３．８２ｍＬ、４９．６ｍｍｏｌ）から調製して４ｂ（１．５ｇ、９３％）を無色の油として得た。
【0355】
２，３－ビス（ラウリルオキシ）プロパン－１－アミン－ＴＦＡ塩４ｃ
ジドデシルオキシアミン４ｃを４ａと同じ方法でブロモドデカン（３．９１ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）、２（１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＨＳ（０．８９ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）、そしてＴＦＡ（２．４４ｍＬ、３１．８３ｍｍｏｌ）から調製して４ｃ（０．４５ｇ、９３％）を無色の油として得た。
ジドデシルオキシアミン４ｃを４ａと同じ方法でブロモドデカン（３．９１ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）、２（１ｇ、５．３ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＨＳ（０．８９ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）、そしてＴＦＡ（２．４４ｍＬ、３１．８３ｍｍｏｌ）から調製して４ｃ（０．４５ｇ、９３％）を無色の油として得た。
【0356】
２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミン－ＴＦＡ塩４ｄ
ジテトラデシルオキシアミン４ｄを４ａと同じ方法でブロモテトラデカン（２１．７５ｇ、７８．４５ｍｍｏｌ）、２（５ｇ、２６．１５ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＨＳ（４．４４ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）、そしてＴＦＡ（１６．３ｍＬ、２１２ｍｍｏｌ）から調製し、４ｄ（８．３ｇ、定量的）を白色のワックス状固体として得た。
ジテトラデシルオキシアミン４ｄを４ａと同じ方法でブロモテトラデカン（２１．７５ｇ、７８．４５ｍｍｏｌ）、２（５ｇ、２６．１５ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＨＳ（４．４４ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）、そしてＴＦＡ（１６．３ｍＬ、２１２ｍｍｏｌ）から調製し、４ｄ（８．３ｇ、定量的）を白色のワックス状固体として得た。
【0357】
２，３－ビス（ヘキサデシルオキシ）プロパン－１－アミン－ＴＦＡ塩４ｅ
ジヘキサデシルオキシアミン４ｅを４ａと同じ方法でブロモヘキサデカン（４６．１ｇ、１５１ｍｍｏｌ）、２（９．６５ｇ、５０．４ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＨＳ（８．５６ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）、そしてＴＦＡ（３７．９ｍＬ、４９２ｍｍｏｌ）から調製し４ｅ（２１ｇ、定量的）を白色固体として得た。
ジヘキサデシルオキシアミン４ｅを４ａと同じ方法でブロモヘキサデカン（４６．１ｇ、１５１ｍｍｏｌ）、２（９．６５ｇ、５０．４ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＨＳ（８．５６ｇ、２５．２ｍｍｏｌ）、そしてＴＦＡ（３７．９ｍＬ、４９２ｍｍｏｌ）から調製し４ｅ（２１ｇ、定量的）を白色固体として得た。
【0358】
ＰＥＧ－スクシンイミジルカーボネート６の調製の一般的な手順
アセトニトリル（５０ｍＬ）中のメトキシＰＥＧ７５０－ＯＨ５ｂ（５ｇ、６．６７ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（１．８６ｍＬ、１３．３ｍｍｏｌ）の溶液をＤＳＣ（２．５６ｇ、１０ｍｍｏｌ）で処理した。撹拌（１８時間、室温）後、アセトニトリルを除去し、残留物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に取り、次にＮａＨＣＯ３（飽和水溶液）及びブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、濃縮して６ｂ（５．７ｇ、９５％）をさらに処理せずに使用されたワックス状の白色固体として得た。
【化16】
【0359】
【化17】
【0360】
【化18】
【0361】
【化19】
【0362】
【化20】
【0363】
【化21】
【0364】
【化22】
【0365】
【化23】
【0366】
スキーム２：トリＰＥＧ脂質の合成
ＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）中のメトキシＰＥＧ２０００－ＯＨ８（５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（１．３９ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を冷却し（０℃）、ＭｓＣｌ（０．３９ｍＬ、５ｍｍｏｌ）で滴下処理した。撹拌（２時間、室温）後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、次にＮａＨＣＯ３（飽和水溶液）及びブラインで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮して、メシル酸塩９（５．１ｇ、９９％）を白色固体として得た。
【化24】
【0367】
【化25】
【0368】
【化26】
【0369】
【化27】
【0370】
【化28】
【0371】
【化29】
【0372】
スキーム３：メトキシＰＥＧ１０００－ジラウリルグリセロール（ＤＬＧ）の合成
ＤＭＦ（１７５ｍＬ、０．１７１Ｍ、４３．７５体積）中のアリル－グリセロール１４（４ｇ、３．７４２ｍＬ、２９．９６４ｍｍｏｌ、１当量）の溶液をＮａＨ（４．７９４ｇ、１１９．８５６ｍｍｏｌ、４当量）で少量ずつ処理した。発泡がおさまったら、反応混合物を１－ブロモ－Ｎ－ドデカン（２３．０９７ｇ、２２．２０９ｍＬ、８９．８９２ｍｍｏｌ、３当量）で処理し、８５℃にした。撹拌（８５℃、１８時間）後、混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、ブラインで抽出（３Ｘ）し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗物質をクロマトグラフィーに供して、３－［２，３－ビス（ドデシルオキシ）プロポキシ］プロプ－１－エン１５（９．６４ｇ、２０．５６３ｍｍｏｌ、収率６８．６２５％）を無色の油として得た。Ｒｆ０．８（１０％ＥｔＯＡｃ－ヘキサン）ＣｕＳＯ４染色。
【化30】
【0373】
【化31】
【0374】
【化32】
【0375】
【化33】
【0376】
【化34】
【0377】
実施例２
核酸送達用の脂質ナノ粒子製剤には、しばしばＰＥＧ－脂質コンジュゲートが使用される。このＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＬＮＰ製造中の粒子サイズを制御し、投与後のバイアル及び血流中の不要な凝集を防ぐ。核酸ペイロードを有するＬＮＰは、それらが長期間血液中で循環する場合、免疫原性であり得る。例えば、体は表面の化学的性質を認識する抗体（例えば、ＰＥＧ脂質）を生成する可能性があり、これらの抗体はその後の投与量を迅速にクリアして、それらを無効にする可能性がある。疎水性アンカーとして２つのＣ１８脂質鎖を有するものなど、密接に関連するＰＥＧ－脂質を有するＬＮＰ組成物は、特に感受性が高い（Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１３，３２８－３３７（２００６））。広く採用されている解決策は、アンカーが小さいＰＥＧ脂質を使用することである。これにより、粒子からすばやく解離し、肝臓に急速に取り込まれ、ＬＮＰが免疫応答を引き起こす可能性が低くなる。最も一般的に使用されるアンカーは、分子量が約２０００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧポリマー成分（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ、ジミリスチルなど）に結合した２つのＣ１４アルキル鎖を持っている。このようなＰＥＧ脂質はｓｉＲＮＡペイロードに有効であり、投与後に抗ＰＥＧ抗体は観察されないが、ｍＲＮＡペイロードを使用すると、抗体反応がより容易に引き起こされることが発見された。抗体は、急速に解離するＣ１４ＰＥＧ－脂質を使用する組成物に対しても観察される。興味深いことに、本明細書に記載されるように、この問題は、単一のＣ１８鎖ＰＥＧ脂質（ステアリン酸塩）、または２つのＣ１２アルキル鎖（例えば、ＰＥＧ７５０－Ｃ－ＤＬＡ）を含むより小さいＰＥＧポリマーを使用することによって修正できることが発見された。ラットモデルで得られた結果を本明細書で論じ、ｍＲＮＡペイロードをカプセル化するＬＮＰに単一のアルキル鎖を有するＰＥＧ－脂質が免疫原性を低下させ、反復投与による効力の喪失を回避できることを実証する。
核酸送達用の脂質ナノ粒子製剤には、しばしばＰＥＧ－脂質コンジュゲートが使用される。このＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、ＬＮＰ製造中の粒子サイズを制御し、投与後のバイアル及び血流中の不要な凝集を防ぐ。核酸ペイロードを有するＬＮＰは、それらが長期間血液中で循環する場合、免疫原性であり得る。例えば、体は表面の化学的性質を認識する抗体（例えば、ＰＥＧ脂質）を生成する可能性があり、これらの抗体はその後の投与量を迅速にクリアして、それらを無効にする可能性がある。疎水性アンカーとして２つのＣ１８脂質鎖を有するものなど、密接に関連するＰＥＧ－脂質を有するＬＮＰ組成物は、特に感受性が高い（Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１３，３２８－３３７（２００６））。広く採用されている解決策は、アンカーが小さいＰＥＧ脂質を使用することである。これにより、粒子からすばやく解離し、肝臓に急速に取り込まれ、ＬＮＰが免疫応答を引き起こす可能性が低くなる。最も一般的に使用されるアンカーは、分子量が約２０００ｇ／ｍｏｌのＰＥＧポリマー成分（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＭＡ、ジミリスチルなど）に結合した２つのＣ１４アルキル鎖を持っている。このようなＰＥＧ脂質はｓｉＲＮＡペイロードに有効であり、投与後に抗ＰＥＧ抗体は観察されないが、ｍＲＮＡペイロードを使用すると、抗体反応がより容易に引き起こされることが発見された。抗体は、急速に解離するＣ１４ＰＥＧ－脂質を使用する組成物に対しても観察される。興味深いことに、本明細書に記載されるように、この問題は、単一のＣ１８鎖ＰＥＧ脂質（ステアリン酸塩）、または２つのＣ１２アルキル鎖（例えば、ＰＥＧ７５０－Ｃ－ＤＬＡ）を含むより小さいＰＥＧポリマーを使用することによって修正できることが発見された。ラットモデルで得られた結果を本明細書で論じ、ｍＲＮＡペイロードをカプセル化するＬＮＰに単一のアルキル鎖を有するＰＥＧ－脂質が免疫原性を低下させ、反復投与による効力の喪失を回避できることを実証する。
【0378】
実験
使用した脂質溶液には、ＰＥＧ結合脂質、イオン化脂質（ＣＬ１）、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣなど）の４つの成分が含まれていた。ＰＥＧ２０００組成物の場合、成分のモル比はそれぞれ１．６：５４．６：３２．８：１０．９であった。ＰＥＧ７５０組成物の場合、成分のモル比はそれぞれ３．０：５４．０：３２．４：１０．８であった。
使用した脂質溶液には、ＰＥＧ結合脂質、イオン化脂質（ＣＬ１）、コレステロール、及びリン脂質（ＤＳＰＣなど）の４つの成分が含まれていた。ＰＥＧ２０００組成物の場合、成分のモル比はそれぞれ１．６：５４．６：３２．８：１０．９であった。ＰＥＧ７５０組成物の場合、成分のモル比はそれぞれ３．０：５４．０：３２．４：１０．８であった。
【0379】
記載されている脂質の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）及びモル比を使用して、１００％エタノール中で総濃度７ｍｇ／ｍＬを達成するように脂質原液を調製した。ｍＲＮＡ（ヒトエリスロポイエチン）を酢酸塩、ｐＨ５緩衝液、及びヌクレアーゼフリー水で希釈して、１００ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５で０．３６６ｍｇ／ｍＬ ｍＲＮＡの目標濃度を達成した。等量の脂質溶液と核酸溶液をＴコネクタを介して４００ｍＬ／分の流速でブレンドし、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で希釈した。製剤を接線流限外濾過（ＭＷＣＯ５００，０００）に置き、最終保存緩衝液で約０．５ｍｇ／ｍＬに濃縮した後、０．２μｍシリンジフィルター（ＰＥＳメンブレン）で滅菌ろ過した。核酸濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイによって決定した。最終製剤を滅菌マイクロフュージチューブに分注し、使用するまで－８０℃で保存した。
【0380】
ＬＮＰ製剤を、０．２５ｍｇ／ｋｇでオスのＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット（７～８週齢、ｎ＝４）に週１回、４週間静脈内注射した（０、７、１４、２１日目に投与した）。）投与の各日及び注射の直前に、ＬＮＰ原液を解凍し、再ろ過し、ＰＢＳで必要な投与濃度に希釈した。分析のために、各投与日の投与前及び投与後６時間に血液を採取した。最終時点で、動物を致死量のケタミン／キシラジンで安楽死させた。すべての血液サンプルをＫ２ＥＤＴＡに収集し、血漿に処理した後、分析まで－８０℃で凍結保存した。血漿サンプルを、ＥＬＩＳＡによってＥＰＯ発現及び抗ＰＥＧ抗体について分析した。
【0381】
【表5】
【0382】
【表6】
【0383】
【表7】
【0384】
前述の説明は例示を意図したものであり、限定的なものではないことを理解されたい。前述の説明を読めば、当業者には、多くの実施形態が明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、前述の説明を参照して決定されるべきではなく、その代わりに、添付の特許請求の範囲を、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲とともに参照して決定されるべきである。特許出願、特許、ＰＣＴ公開、及びＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を含むすべての論文及び参照文献の開示は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【国際調査報告】