特表 2022-530029 核酸ガイドヌクレアーゼ細胞ターゲティングスクリーニングのための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-27

(54)【発明の名称】核酸ガイドヌクレアーゼ細胞ターゲティングスクリーニングのための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20220620BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20220620BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220620BHJP

   C12Q 1/6837 20180101ALI20220620BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220620BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220620BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220620BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220620BHJP

   C40B 40/08 20060101ALI20220620BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20220620BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220620BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20220620BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20220620BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20220620BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220620BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20220620BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20220620BHJP

   C12N 5/0787 20100101ALN20220620BHJP

   C12N 5/0784 20100101ALN20220620BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALN20220620BHJP

【ＦＩ】

C12N15/63 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6837 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C40B40/08

C12Q1/02 ZNA

C12N15/11 Z

C07K19/00

C12N9/16 Z

C07K16/00

C12N15/113 Z

C12N5/0789

C12N5/0783

C12N5/0787

C12N5/0784

C12N5/0786

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021562949

(86)(22)【出願日】2020-04-24

(85)【翻訳文提出日】2021-11-29

(86)【国際出願番号】 US2020029864

(87)【国際公開番号】W WO2020219913

(87)【国際公開日】2020-10-29

(31)【優先権主張番号】62/838,053

(32)【優先日】2019-04-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521437747

【氏名又は名称】スポットライト セラピューティクス

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】タンベ アクシャイ

(72)【発明者】

【氏名】ジャヤラム ハリハラン

(72)【発明者】

【氏名】ストラット スティーブン

【テーマコード（参考）】

4B050

4B063

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050CC05

4B050KK13

4B050LL10

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA18

4B063QQ34

4B063QQ52

4B063QQ79

4B063QR08

4B063QR14

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX01

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA77X

4B065AA77Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

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4B065CA23

4B065CA24

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4H045AA10

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA89

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

核酸ガイドヌクレアーゼ細胞ターゲティングスクリーニングに関する方法及び組成物を提供する。本発明は、核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）に会合するときに、少なくとも当該核酸ガイドヌクレアーゼを、標的細胞の表面にターゲティングさせる、または、標的細胞によって、すなわち、細胞ターゲティング剤により標的とされた細胞によって内部移行させることを可能にする、細胞ターゲティングタンパク質を識別するための組成物及び方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞ターゲティング剤を識別する方法であって：
それぞれがＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び固有の識別ＲＮＡ（ｕｉＲＮＡ）を含む複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を提供することであって、前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質が、ＲＮＡガイドヌクレアーゼまたはその機能性フラグメント、及び試験タンパク質を含み；前記ｕｉＲＮＡが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び配列識別子を含む、提供すること；
前記ＲＮＰを標的細胞の集団と接触させること；
前記標的細胞の集団からＲＮＡを単離し、それにより、単離されたＲＮＡを得ること；ならびに
前記識別子配列の存在に関して、前記単離されたＲＮＡを試験することであって、前記識別子配列の存在が、前記試験タンパク質が細胞ターゲティング剤であることを示す、試験すること
を含む、前記方法。

【請求項2】

細胞ターゲティング剤を識別する方法であって：
ＲＮＡガイドヌクレアーゼまたはその機能性フラグメント、及び試験タンパク質を含む、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質をコードし、かつ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び配列識別子を含む固有の識別ＲＮＡ（ｕｉＲＮＡ）をコードするベクターを提供すること；
前記ベクターを、前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び前記ｕｉＲＮＡを発現するのに好適な宿主細胞に移入すること；
それぞれが前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び前記ｕｉＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）が形成されるように、前記宿主細胞において前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び前記ｕｉＲＮＡを発現すること；
前記ＲＮＰを前記宿主細胞から単離すること；
前記ＲＮＰを標的細胞の集団と接触させること；
前記標的細胞の集団からＲＮＡを単離すること；ならびに
前記識別子配列の存在に関して、前記単離されたＲＮＡを試験することであって、前記識別子配列の存在が、前記試験タンパク質が細胞ターゲティング剤であることを示す、試験すること
を含む、前記方法。

【請求項3】

前記核酸配列識別子をコードする前記ベクターの部分及び前記試験タンパク質をコードする前記ベクターの部分が、前記ベクターが前記宿主細胞に移入される前にシーケンシングされて、これにより、前記試験タンパク質を識別するためのリファレンスを提供する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記識別子配列の存在が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸マイクロアレイを使用して検出される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ベクターが、複数のベクター内にあり、前記複数のベクターは、宿主細胞当たりの平均ベクターが１以上となるような条件下で宿主細胞に移入される、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ベクターが、前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸配列に動作可能に連結された第１プロモーター、及び前記ｕｉＲＮＡをコードする核酸配列に動作可能に連結された第２プロモーターを含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質の発現レベル及び前記ｕｉＲＮＡの発現レベルが、ＲＮＰを得るよう制御され得るように、前記第１及び第２プロモーターがそれぞれ誘導性である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記第１及び／または第２プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記ベクターが、前記ベクターが移入された前記宿主細胞について選択する選択可能なマーカーを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ベクターが、細菌の複製起点を含む、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ベクターが、真核生物の複製起点を含む、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記細胞ターゲティング剤が、前記標的細胞のコンパートメントに内部移行する、または前記標的細胞の細胞表面に結合する、のいずれかである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記コンパートメントが、膜結合型細胞小器官または細胞質である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記膜結合型細胞小器官が、核、小胞体、ゴルジ装置、液胞、リソソーム、エンドソーム、またはミトコンドリアである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記単離されたＲＮＡが、ＲＮＡ単離の前に前記標的細胞から抽出される膜結合型細胞小器官から得られる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記単離されたＲＮＡが、ＲＮＡ単離の前に前記標的細胞から抽出される細胞質から得られる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記試験する工程が、前記単離されたＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生すること、及び前記ｃＤＮＡをシーケンシングして前記識別子配列の存在を決定することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記試験する工程が、前記単離されたＲＮＡをシーケンシングして前記識別子配列の存在を決定することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記試験タンパク質が、ペプチドである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記試験タンパク質が、抗原結合タンパク質である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記抗原結合タンパク質が、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）_２、イントラボディ、または抗体模倣体である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記抗体模倣体が、アドネクチン（すなわち、フィブロネクチン系結合分子）、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ナノクランプ、ユニボディ、またはヴァーサボディ、アプタマー、またはシクロチドである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記試験タンパク質が、リガンド、またはその部分である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼが、クラス２のＣａｓポリペプチドである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記クラス２のＣａｓポリペプチドが、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型Ｃａｓポリペプチドである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記ＩＩ型Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記標的細胞が、哺乳類細胞である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記哺乳類細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、眼の細胞、または線維芽細胞である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

細胞発現ベクターであって：
試験タンパク質の核酸を挿入するためにクローニング部位に動作可能に連結されたＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードし、それにより、前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び前記試験タンパク質を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質を形成する、核酸；ならびに
固有の識別ＲＮＡ（ｕｉＲＮＡ）をコードする核酸であって、前記ｕｉＲＮＡがガイドＲＮＡ及び配列識別子を含む、前記核酸
を含む、前記細胞発現ベクター。

【請求項33】

前記試験タンパク質を含む核酸をさらに含む、請求項３２に記載の細胞発現ベクター。

【請求項34】

プラスミドである、請求項３２または３３に記載の細胞発現ベクター。

【請求項35】

前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸配列に動作可能に連結された第１プロモーターを含み、かつ、前記ｕｉＲＮＡをコードする核酸配列に動作可能に連結された第２プロモーターを含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の細胞発現ベクター。

【請求項36】

前記第１及び第２プロモーターは、それぞれが、前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質の発現レベル及び前記ｕｉＲＮＡの発現レベルが制御され得るような誘導性の要素を含む、請求項３５に記載の細胞発現ベクター。

【請求項37】

前記第１及び／または第２プロモーターが、Ｔ７またはＴ５である、請求項３５または３６に記載の細胞発現ベクター。

【請求項38】

前記第１及び／または第２プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項３５に記載の細胞発現ベクター。

【請求項39】

選択可能なマーカーを含む、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の細胞発現ベクター。

【請求項40】

細菌の複製起点を含む、請求項３２～３９のいずれか一項に記載の細胞発現ベクター。

【請求項41】

真核生物の複製起点を含む、請求項３２～３９のいずれか一項に記載の細胞発現ベクター。

【請求項42】

前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼが、クラス２のＣａｓポリペプチドである、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の細胞発現ベクター。

【請求項43】

前記クラス２のＣａｓポリペプチドが、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型Ｃａｓポリペプチドである、請求項４２に記載の細胞発現ベクター。

【請求項44】

前記ＩＩ型Ｃａｓポリペプチドが、Ｃａｓ９である、請求項４３に記載の細胞発現ベクター。

【請求項45】

請求項３２～４４のいずれか一項に記載の細胞発現ベクターを含む、キット。

【請求項46】

前記試験タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記細胞発現ベクターのクローニング部位に挿入するための試薬をさらに含む、請求項４５に記載のキット。

【請求項47】

請求項３２～４４のいずれか一項に記載の細胞発現ベクターを含む、単離された細胞。

【請求項48】

真核細胞または細菌細胞である、請求項４７に記載の細胞。

【請求項49】

前記真核細胞が、哺乳類細胞、酵母細胞、または昆虫細胞である、請求項４８に記載の細胞。

【請求項50】

前記哺乳類細胞が、ＣＯＰ細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ－０細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＣ１２細胞、ＰＣ１２ｈ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ３細胞、ＣＯＳＴ細胞、ＣＶ１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＰＥＲ Ｃ６細胞、２倍体線維芽細胞由来の細胞、骨髄腫細胞、またはＨｅｐＧ２である、請求項４９に記載の細胞。

【請求項51】

前記酵母細胞が、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）または出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり、前記昆虫細胞が、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）である、請求項４９に記載の細胞。

【請求項52】

前記細菌細胞が、大腸菌細胞である、請求項４８に記載の細胞。

【請求項53】

前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び前記ｕｉＲＮＡを含む少なくとも１つのＲＮＰを作製するための方法であって、請求項３２～４４のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む細胞を、前記少なくとも１つのＲＮＰの発現及びアセンブリを可能にする条件下で細胞培養培地において培養することを含む、前記方法。

【請求項54】

前記少なくとも１つのＲＮＰが、前記細胞培養培地中に分泌され、方法が、前記細胞培養培地から前記少なくとも１つのＲＮＰを単離する工程をさらに含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項55】

請求項３２～４４のいずれか一項に記載の、複数の細胞発現ベクターを含む、細胞発現ベクターのライブラリ。

【請求項56】

前記細胞発現ベクターのそれぞれが、異なる配列識別子を含む、請求項５５に記載のライブラリ。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

発明の背景
ＣＲＩＳＰＲ会合ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９は、様々な細胞タイプ及び生物におけるゲノム工学のための多目的なツールとなっている（例えば、ＵＳ８，６９７，３５９（特許文献１）を参照されたい）。ガイドＲＮＡ、例えば、二重－ＲＮＡ複合体またはキメラ単一ガイドＲＮＡによってガイドされると、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、またはＲＮＡ）内に部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ＳＳＢ）を生じ得る。標的核酸の開裂が細胞（例えば、真核細胞）内で起こると、標的核酸における切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組み換え修復（ＨＤＲ）によって修復され得る。また、触媒不活性ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、単独で、または、転写アクチベーターもしくはリプレッサードメインと融合して、開裂することなく標的部位に結合することによって標的核酸内の部位で転写レベルを変更するのに使用され得る。しかし、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを特定の細胞または組織にターゲティングさせる能力は、依然として課題のままである。そのため、所望の細胞または組織をターゲティングする能力によってＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを識別するという、満たされていない要求が存在する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0002】

【特許文献1】ＵＳ８，６９７，３５９

【発明の概要】

【0003】

核酸ガイドヌクレアーゼを細胞にターゲティングさせ及び／または当該細胞もしくはそのコンパートメント（例えば、核）への当該核酸ガイドヌクレアーゼの内部移行を促進することが可能である細胞標的指向剤を識別するためのスクリーニングに関する方法及び組成物を本明細書において提供する。

【0004】

一態様において、細胞ターゲティング剤を識別する方法であって：それぞれがＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び固有の識別ＲＮＡ（ｕｉＲＮＡ）を含む複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を提供することであって、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質が、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ、またはその機能性フラグメント、及び試験タンパク質を含み、ｕｉＲＮＡが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び配列識別子を含む、提供すること；ＲＮＰを標的細胞の集団と接触させること；標的細胞の集団からＲＮＡを単離し、それにより、単離されたＲＮＡを得ること；ならびに、識別子配列の存在に関して、単離されたＲＮＡを試験することであって、識別子配列の存在が、試験タンパク質が細胞ターゲティング剤であることを示す、試験すること、を含む、上記方法を本明細書において提供する。

【0005】

別の態様において、細胞ターゲティング剤を識別する方法であって：ＲＮＡガイドヌクレアーゼ、またはその機能性フラグメント、及び試験タンパク質を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質をコードし、かつ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び配列識別子を含む固有の識別ＲＮＡ（ｕｉＲＮＡ）をコードするベクターを提供すること；上記ベクターを、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＲＮＡを発現するのに好適な宿主細胞に移入すること；それぞれがＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）が形成されるように、宿主細胞においてＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＲＮＡを発現すること；ＲＮＰを宿主細胞から単離すること；ＲＮＰを標的細胞の集団と接触させること；標的細胞の集団からＲＮＡを単離すること；ならびに、識別子配列の存在に関して、単離されたＲＮＡを試験することであって、識別子配列の存在が、試験タンパク質が細胞ターゲティング剤であることを示す、試験すること、を含む、上記方法を本明細書において提供する。

【0006】

いくつかの実施形態において、核酸配列識別子及び試験タンパク質をコードするベクターの部分は、ベクターが宿主細胞に移入される前にシーケンシングされて、これにより、試験タンパク質を識別するためのリファレンスを提供する。

【0007】

いくつかの実施形態において、識別子配列の存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸マイクロアレイを使用して検出される。

【0008】

いくつかの実施形態において、ベクターは、複数のベクター内にあり、複数のベクターは、宿主細胞当たりの平均ベクターが１以上となるような条件下で宿主細胞に移入される。いくつかの実施形態において、ベクターは、複数のベクター内にあり、複数のベクターは、宿主細胞当たりの平均ベクターが１未満となるような条件下で宿主細胞に移入される。

【0009】

いくつかの実施形態において、ベクターは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸配列に動作可能に連結された第１プロモーター、及びｕｉＲＮＡをコードする核酸配列に動作可能に連結された第２プロモーターを含む。ある特定の実施形態において、第１及び第２プロモーターは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質の発現レベル及びｕｉＲＮＡの発現レベルが、ＲＮＰを得るように制御され得るようにそれぞれ誘導性である。ある特定の実施形態において、第１及び／または第２プロモーターは、Ｔ７またはＴ５である。

【0010】

いくつかの実施形態において、第１及び／または第２プロモーターは、構成的プロモーターである。

【0011】

いくつかの実施形態において、ベクターは、そのベクターが移入された宿主細胞を選択するための選択可能なマーカーを含む。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、発現の際に、選択因子（例えば、薬物、例えば、抗生物質）への耐性を与える遺伝子である。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、発現の際に、識別可能な表現型を与える遺伝子である。例えば、選択可能なマーカーは、視覚的に、または、機械、例えば、フローサイトメトリーによって識別され得るベクターを持つ細胞において蛍光を与える蛍光マーカーであってよい。

【0012】

いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌の複製起点を含む。

【0013】

いくつかの実施形態において、ベクターは、真核生物の複製起点を含む。

【0014】

いくつかの実施形態において、細胞ターゲティング剤は、標的細胞のコンパートメントに内部移行する、または標的細胞の細胞表面に結合する、のいずれかである。ある特定の実施形態において、コンパートメントは、膜結合型細胞小器官または細胞質である。ある特定の実施形態において、膜結合型細胞小器官は、核、小胞体、ゴルジ装置、液胞、リソソーム、エンドソーム、またはミトコンドリアである。

【0015】

いくつかの実施形態において、単離されたＲＮＡは、ＲＮＡ単離の前に標的細胞から抽出される膜結合型細胞小器官から得られる。ある特定の実施形態において、膜結合型細胞小器官は、核、小胞体、ゴルジ装置、液胞、リソソーム、エンドソーム、またはミトコンドリアである。

【0016】

いくつかの実施形態において、単離されたＲＮＡは、ＲＮＡ単離の前に標的細胞から抽出される細胞質から得られる。

【0017】

いくつかの実施形態において、試験する工程は、単離されたＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生すること、及びｃＤＮＡをシーケンシングして識別子配列の存在を決定することを含む。いくつかの実施形態において、試験する工程は、単離されたＲＮＡをシーケンシングして識別子配列の存在を決定することを含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、試験タンパク質は、ペプチドである。

【0019】

いくつかの実施形態において、試験タンパク質は、抗原結合タンパク質である。

【0020】

いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）_２、イントラボディ、または抗体模倣体である。ある特定の実施形態において、抗体模倣体は、アドネクチン（すなわち、フィブロネクチン系結合分子）、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ナノクランプ、ユニボディ、またはヴァーサボディ、アプタマー、またはシクロチドである。

【0021】

いくつかの実施形態において、試験タンパク質は、リガンド、またはその部分である。

【0022】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核細胞である。

【0023】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞である。ある特定の実施形態において、細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。

【0024】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、クラス２のＣａｓポリペプチドである。ある特定の実施形態において、クラス２のＣａｓポリペプチドは、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型Ｃａｓポリペプチドである。ある特定の実施形態において、ＩＩ型Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９である。

【0025】

いくつかの実施形態において、標的細胞は、哺乳類細胞である。ある特定の実施形態において、哺乳類細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、好中球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、眼の細胞、または線維芽細胞である。

【0026】

別の態様において、細胞発現ベクターであって：試験タンパク質の核酸を挿入するためにクローニング部位に動作可能に連結されたＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードし、それにより、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び試験タンパク質を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質を形成する、核酸；ならびに、固有の識別ＲＮＡ（ｕｉＲＮＡ）をコードする核酸であって、当該ｕｉＲＮＡがガイドＲＮＡ及び配列識別子を含む、上記核酸；を含む、上記細胞発現ベクターを本明細書において提供する。

【0027】

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、試験タンパク質をコードする核酸をさらに含む。

【0028】

いくつかの実施形態において、発現ベクターは、プラスミドである。

【0029】

いくつかの実施形態において、細胞発現ベクターは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸配列に動作可能に連結された第１プロモーターを含み、ｕｉＲＮＡをコードする核酸配列に動作可能に連結された第２プロモーターを含む。ある特定の実施形態において、第１及び第２プロモーターは、それぞれが、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質の発現レベル及びｕｉＲＮＡの発現レベルが制御され得るような誘導性の要素を含む。ある特定の実施形態において、第１及び／または第２プロモーターは、Ｔ７またはＴ５である。

【0030】

いくつかの実施形態において、第１及び／または第２プロモーターは、構成的プロモーターである。

【0031】

いくつかの実施形態において、ベクターは、選択可能なマーカーを含む。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、発現の際に、選択因子（例えば、薬物、例えば、抗生物質）への耐性を与える遺伝子である。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、発現の際に、識別可能な表現型を与える遺伝子である。例えば、選択可能なマーカーは、視覚的に、または、機械、例えば、フローサイトメトリーによって識別され得るベクターを持つ細胞において蛍光を与える蛍光マーカーであってよい。

【0032】

いくつかの実施形態において、ベクターは、細菌の複製起点を含む。

【0033】

いくつかの実施形態において、ベクターは、真核生物の複製起点を含む。

【0034】

いくつかの実施形態において、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、クラス２のＣａｓポリペプチドである。ある特定の実施形態において、クラス２のＣａｓポリペプチドは、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型Ｃａｓポリペプチドである。ある特定の実施形態において、ＩＩ型Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９である。

【0035】

別の態様において、本発明の細胞発現ベクターのいずれかを含むキットを本明細書において提供する。

【0036】

いくつかの実施形態において、キットは、試験タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞発現ベクターのクローニング部位に挿入するための試薬をさらに含む。

【0037】

別の態様において、本発明の細胞発現ベクターのいずれかを含む単離された細胞を本明細書において提供する。ある特定の実施形態において、細胞は、真核細胞または細菌細胞である。いくつかの実施形態において、真核細胞は、哺乳類細胞、昆虫細胞、または酵母細胞である。ある特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ＣＯＰ細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ－０細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＣ１２細胞、ＰＣ１２ｈ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ３細胞、ＣＯＳＴ細胞、ＣＶ１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＰＥＲ Ｃ６細胞、２倍体線維芽細胞由来の細胞、骨髄腫細胞、またはＨｅｐＧ２である。ある特定の実施形態において、酵母細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）または出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。ある特定の実施形態において、細菌細胞は、大腸菌細胞である。ある特定の実施形態において、昆虫細胞は、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞である。

【0038】

別の態様において、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＲＮＡを含む少なくとも１つのＲＮＰを作製するための方法であって、本発明の発現ベクターのいずれかを含む細胞を、少なくとも１つのＲＮＰの発現及びアセンブリを可能にする条件下で細胞培養培地において培養することを含む、上記方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＰは、細胞培養培地に分泌され、方法は、細胞培養培地から少なくとも１つのＲＮＰを単離する工程をさらに含む。

【0039】

別の態様において、複数の本発明の細胞発現ベクターのいずれかを含む細胞発現ベクターのライブラリを、本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、細胞発現ベクターは、それぞれが、異なる配列識別子を含む。

【0040】

さらなる実施形態において、選択された試験因子の変異体のサブライブラリを作成する方法を本明細書において提供し、本明細書において記載されている方法を使用して、サブライブラリを標的細胞集団と接触させた後にサブライブラリを試験して所望の活性を有する変異体を識別する。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】Ｃａｓ９の内部移行を効果的に容易にし得る細胞透過性ペプチドに関する例示的な核酸ガイドヌクレアーゼ細胞ターゲティングスクリーニングにおける工程を概説するフローチャートをグラフにより示す。

【図2】それぞれが、試験ＣＰＰと会合する固有の識別ＲＮＡ（ｕｉＲＮＡ）をコードするＣＰＰ－Ｃａｓ９ベクターのライブラリを作成する高スループットクローニングプロセスの結果を示す。Ａは、ｕｉＲＮＡ及び６ｘＨｉｓ－ＣＰＰ^＊－Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳ（配列番号２２として開示されている「６ｘＨｉｓ」）（星印はＣＰＰが可変であることを示している）をコードする核酸のマップを示す。Ｂは、およそ５０００の大腸菌形質転換細胞の小さなライブラリからのコロニーを含む例示的な寒天プレートの写真を示す。Ｃは、核酸ラダー（レーン１）と比較した、ＰＣＲ増幅したＣＰＰ－Ｃａｓ９プラスミドライブラリ（約１２００ｂｐバンド；レーン２及び３）の２つの複製のゲル電気泳動分析の結果を示す。

【図3】ＣＰＰ－Ｃａｓ９プラスミドライブラリのシーケンシングに関する結果を示す。Ａは、２つのライブラリ複製間のプラスミド－ｓｅｑ固有の分子識別子（ＵＭＩ）カウントを比較した結果をグラフにより示す。Ｂは、ｘ軸における存在度によって及びｙ軸に示されている相対存在度（百万当たりのカウント）を用いて選別されるライブラリにおいて表される各ＣＰＰ－Ｃａｓ９－融合物に関するライブラリカバレッジ分布をグラフにより示す。

【図4A】プラスミド不均一性を評価する研究の結果を示す。２つのライブラリ複製に関してのＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物当たりのプラスミドＵＭＩの数をグラフにより示し、大腸菌におけるライブラリバイアスまたはクローニングバイアスを示唆している（例えば、コピー数または成長率）。

【図4B】プラスミド不均一性を評価する研究の結果を示す。ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物当たりのｓｇＲＮＡバーコード（すなわち、ｕｉＲＮＡ）の数をグラフにより示し、ライブラリアセンブリバイアスを示唆している。

【図4C】プラスミド不均一性を評価する研究の結果を示す。ｓｇＲＮＡバーコード（すなわち、ｕｉＲＮＡ）当たりのＵＭＩの数をグラフにより示し、シーケンシングバイアスを示唆している。

【図5A】ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物間で形成されバーコード化されたＲＮＰ、または、大腸菌におけるプラスミドライブラリにおいてプラスミドから発現されたＧＦＰ ｓｇＲＮＡのライブラリの共精製に関する結果を示す。それぞれ示されたＲＮＰ精製工程から収集したサンプルにおけるタンパク質（例えば、Ｃａｓ９、１５０ｋＤａバンド）のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析（クーマシー染色）の画像を示す。

【図5B】ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物間で形成されバーコード化されたＲＮＰ、または、大腸菌におけるプラスミドライブラリにおいてプラスミドから発現されたＧＦＰ ｓｇＲＮＡのライブラリの共精製に関する結果を示す。それぞれ示されたＲＮＰ精製工程から収集したサンプルにおける核酸のゲル電気泳動分析（２％アガロース；ＳｙＢｒ ｓａｆｅ染料）の画像を示す。

【図5C】ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物間で形成されバーコード化されたＲＮＰ、または、大腸菌におけるプラスミドライブラリにおいてプラスミドから発現されたＧＦＰ ｓｇＲＮＡのライブラリの共精製に関する結果を示す。Ｓ２００カラムにおける精製されたＲＮＰのサイズ排除分析からのクロマトグラムをグラフにより示す。

【図5D】ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物間で形成されバーコード化されたＲＮＰ、または、大腸菌におけるプラスミドライブラリにおいてプラスミドから発現されたＧＦＰ ｓｇＲＮＡのライブラリの共精製に関する結果を示す。精製されたＲＮＰから抽出されたバルクＲＮＡのゲル電気泳動分析（２％アガロース、ＳｙＢｒ Ｓａｆｅ染料）の画像を示す。Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ｓｇＲＮＡを陽性対照として示す。

【図6】ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリと共精製したＲＮＡの逆転写から得られた産物のゲル電気泳動分析（２％アガロースゲル、ＳｙＢｒ Ｓａｆｅ染料）の画像を示し、バーコード化されたまたはＧＦＰ ｓｇＲＮＡ産物、鋳型なしの陰性対照、及びＳｙｎｔｈｅｇｏ ｓｇＲＮＡ陽性対照を示す。

【図7】ＤＮＡ開裂アッセイからのサンプルのゲル電気泳動分析（２％アガロースゲル、ＳｙＢｒ Ｓａｆｅ染料）の画像を示し、標的ｓｇＲＮＡ（ＧＦＰ）及び非標的ｓｇＲＮＡ（バーコード）を有するＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリをｄｓＲＮＡによってインキュベートした。非開裂及び開裂ｄｓＲＮＡに相当するバンドを示す。ＲＮＰなしの対照条件からのｄｓＲＮＡも示す。

【図8】ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリによる共精製されたＲＮＡのＲＮＡ－ｓｅｑ分析からの結果をグラフにより示し、複製間のＲＮＡ－ｓｅｑ ＵＭＩカウント（Ａ）、及びプラスミド対ＲＮＰの存在度についてのサンプルの相互関係（Ｂ）を比較している。

【図9】１時間または５時間のいずれかでＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリと共インキュベートしたヒトまたはマウスＴ細胞から単離した核ＲＮＡのゲル電気泳動分析の画像を示す。ｇＲＮＡを上方のバンドによって表す。ＲＮＰ単独または陰性対照（緩衝剤と（しかし、Ｃａｓ９ ＲＮＰなし）５時間共インキュベートしたＴ細胞またはヒトＴ細胞）からのＲＮＡも評価した。

【図10】１時間（Ａ）または５時間（Ｂ）、精製されたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリによってインキュベートした刺激ヒトＴ細胞から単離したＲＮＡに関する複製間のＲＮＡ－ｓｅｑ ＵＭＩカウントを比較したＲＮＡ－ｓｅｑ結果をグラフにより示す。

【図11A】１時間（Ａ）または５時間（Ｂ及びＣ）のいずれかでＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリと共インキュベートした、ヒト刺激Ｔ細胞において異なって発現され内部移行されたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを分析した結果をグラフにより示す。グラフは、ヒト刺激Ｔ細胞から得られる核抽出物（ＡＴＳｅｑ－０１Ｃ）においてシーケンシングされたＲＮＡの変化倍率を、出発物質（共インキュベーション前にプールされたＲＮＰ；ＡＴＳｅｑ－０１Ａ）においてシーケンシングされかつ合計ＲＮＰ存在度（ＡＴＳｅｑ－０１Ａ；ｙ軸）に対してプロットされるＲＮＡの変化倍率に対して比較する。Ｃは、ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリとの５時間の共インキュベーション後に、ヒト刺激Ｔ細胞において高い存在度及び高い核内部移行を有するＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを表す重要なデータ点（星印を参照されたい）をハイライトしている。ハイライトしたデータ点に会合するＣＰＰを表１にまとめる。

【図11B】１時間（Ａ）または５時間（Ｂ及びＣ）のいずれかでＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリと共インキュベートした、ヒト刺激Ｔ細胞において異なって発現され内部移行されたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを分析した結果をグラフにより示す。グラフは、ヒト刺激Ｔ細胞から得られる核抽出物（ＡＴＳｅｑ－０１Ｃ）においてシーケンシングされたＲＮＡの変化倍率を、出発物質（共インキュベーション前にプールされたＲＮＰ；ＡＴＳｅｑ－０１Ａ）においてシーケンシングされかつ合計ＲＮＰ存在度（ＡＴＳｅｑ－０１Ａ；ｙ軸）に対してプロットされるＲＮＡの変化倍率に対して比較する。Ｃは、ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリとの５時間の共インキュベーション後に、ヒト刺激Ｔ細胞において高い存在度及び高い核内部移行を有するＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを表す重要なデータ点（星印を参照されたい）をハイライトしている。ハイライトしたデータ点に会合するＣＰＰを表１にまとめる。

【図11C】１時間（Ａ）または５時間（Ｂ及びＣ）のいずれかでＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリと共インキュベートした、ヒト刺激Ｔ細胞において異なって発現され内部移行されたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを分析した結果をグラフにより示す。グラフは、ヒト刺激Ｔ細胞から得られる核抽出物（ＡＴＳｅｑ－０１Ｃ）においてシーケンシングされたＲＮＡの変化倍率を、出発物質（共インキュベーション前にプールされたＲＮＰ；ＡＴＳｅｑ－０１Ａ）においてシーケンシングされかつ合計ＲＮＰ存在度（ＡＴＳｅｑ－０１Ａ；ｙ軸）に対してプロットされるＲＮＡの変化倍率に対して比較する。Ｃは、ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリとの５時間の共インキュベーション後に、ヒト刺激Ｔ細胞において高い存在度及び高い核内部移行を有するＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを表す重要なデータ点（星印を参照されたい）をハイライトしている。ハイライトしたデータ点に会合するＣＰＰを表１にまとめる。

【図12A】線維芽細胞におけるＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ内部移行に関してのスクリーニングの結果をグラフにより示す。線維芽細胞を、精製されたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのプールされたライブラリと、３７℃で１時間共インキュベートし、その後、細胞を洗浄し、核及び細胞質ゾルに分画し、ＲＮＡ－ｓｅｑによってさらに分析した。Ａは、入力対照、非分画細胞、細胞質画分、及び核画分からのｕｉＲＮＡカウントにおける主な構成要素の分析の結果をグラフにより示す。これらの結果を、使用した共インキュベーションプロトコル（低ＲＮＰ濃度対高ＲＮＰ濃度プロトコル）に基づいてさらに分析した。Ｂは、Ｐ値（ｙ軸）に対して火山プロットにおいてプロットした、入力対照におけるＲＮＡに対する核抽出物におけるＲＮＡの変化倍率（ｘ軸）をグラフにより示す。プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰとの共インキュベーション後の線維芽細胞における核局在化を表すＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡをグラフの右上部分に示す（Ｂの囲まれた部分及びＣにおける星印状のヒットを参照されたい）。Ｃは、線維芽細胞において核内部移行が富化したＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを表すＢの頂部の８つのデータ点をハイライトしている（星印状のデータ点を参照されたい）。Ｄは、スクリーニングにおいて識別されたＣＰＰのハイドロパシー（ｙ軸）及び残基当たりの正味電荷（ｘ軸）をグラフにより示す。各ドットは、Ｂ及びＣにおけるペプチドを表しており、ドットのサイズが、Ｐ値（Ｌｏｇ１０）を示しており、陰影部分は変化倍率（Ｌｏｇ１０）を示している。グラフの右下部分におけるデータは、疎水性度が低い高電荷のＣＰＰを示している。Ｂ及びＤにおける丸状のデータ点は、同じＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰに関するデータに相当する（例えば、各図における丸状のデータ点１は、同じＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰに関するデータに相当する）。丸状のデータ点１は、高電荷のＣＰＰヒットに相当し、丸状のデータ点２は、非極性ＣＰＰヒットに相当する。

【図12B】線維芽細胞におけるＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ内部移行に関してのスクリーニングの結果をグラフにより示す。線維芽細胞を、精製されたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのプールされたライブラリと、３７℃で１時間共インキュベートし、その後、細胞を洗浄し、核及び細胞質ゾルに分画し、ＲＮＡ－ｓｅｑによってさらに分析した。Ａは、入力対照、非分画細胞、細胞質画分、及び核画分からのｕｉＲＮＡカウントにおける主な構成要素の分析の結果をグラフにより示す。これらの結果を、使用した共インキュベーションプロトコル（低ＲＮＰ濃度対高ＲＮＰ濃度プロトコル）に基づいてさらに分析した。Ｂは、Ｐ値（ｙ軸）に対して火山プロットにおいてプロットした、入力対照におけるＲＮＡに対する核抽出物におけるＲＮＡの変化倍率（ｘ軸）をグラフにより示す。プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰとの共インキュベーション後の線維芽細胞における核局在化を表すＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡをグラフの右上部分に示す（Ｂの囲まれた部分及びＣにおける星印状のヒットを参照されたい）。Ｃは、線維芽細胞において核内部移行が富化したＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを表すＢの頂部の８つのデータ点をハイライトしている（星印状のデータ点を参照されたい）。Ｄは、スクリーニングにおいて識別されたＣＰＰのハイドロパシー（ｙ軸）及び残基当たりの正味電荷（ｘ軸）をグラフにより示す。各ドットは、Ｂ及びＣにおけるペプチドを表しており、ドットのサイズが、Ｐ値（Ｌｏｇ１０）を示しており、陰影部分は変化倍率（Ｌｏｇ１０）を示している。グラフの右下部分におけるデータは、疎水性度が低い高電荷のＣＰＰを示している。Ｂ及びＤにおける丸状のデータ点は、同じＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰに関するデータに相当する（例えば、各図における丸状のデータ点１は、同じＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰに関するデータに相当する）。丸状のデータ点１は、高電荷のＣＰＰヒットに相当し、丸状のデータ点２は、非極性ＣＰＰヒットに相当する。

【図12C】線維芽細胞におけるＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ内部移行に関してのスクリーニングの結果をグラフにより示す。線維芽細胞を、精製されたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのプールされたライブラリと、３７℃で１時間共インキュベートし、その後、細胞を洗浄し、核及び細胞質ゾルに分画し、ＲＮＡ－ｓｅｑによってさらに分析した。Ａは、入力対照、非分画細胞、細胞質画分、及び核画分からのｕｉＲＮＡカウントにおける主な構成要素の分析の結果をグラフにより示す。これらの結果を、使用した共インキュベーションプロトコル（低ＲＮＰ濃度対高ＲＮＰ濃度プロトコル）に基づいてさらに分析した。Ｂは、Ｐ値（ｙ軸）に対して火山プロットにおいてプロットした、入力対照におけるＲＮＡに対する核抽出物におけるＲＮＡの変化倍率（ｘ軸）をグラフにより示す。プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰとの共インキュベーション後の線維芽細胞における核局在化を表すＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡをグラフの右上部分に示す（Ｂの囲まれた部分及びＣにおける星印状のヒットを参照されたい）。Ｃは、線維芽細胞において核内部移行が富化したＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを表すＢの頂部の８つのデータ点をハイライトしている（星印状のデータ点を参照されたい）。Ｄは、スクリーニングにおいて識別されたＣＰＰのハイドロパシー（ｙ軸）及び残基当たりの正味電荷（ｘ軸）をグラフにより示す。各ドットは、Ｂ及びＣにおけるペプチドを表しており、ドットのサイズが、Ｐ値（Ｌｏｇ１０）を示しており、陰影部分は変化倍率（Ｌｏｇ１０）を示している。グラフの右下部分におけるデータは、疎水性度が低い高電荷のＣＰＰを示している。Ｂ及びＤにおける丸状のデータ点は、同じＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰに関するデータに相当する（例えば、各図における丸状のデータ点１は、同じＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰに関するデータに相当する）。丸状のデータ点１は、高電荷のＣＰＰヒットに相当し、丸状のデータ点２は、非極性ＣＰＰヒットに相当する。

【図12D】線維芽細胞におけるＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ内部移行に関してのスクリーニングの結果をグラフにより示す。線維芽細胞を、精製されたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのプールされたライブラリと、３７℃で１時間共インキュベートし、その後、細胞を洗浄し、核及び細胞質ゾルに分画し、ＲＮＡ－ｓｅｑによってさらに分析した。Ａは、入力対照、非分画細胞、細胞質画分、及び核画分からのｕｉＲＮＡカウントにおける主な構成要素の分析の結果をグラフにより示す。これらの結果を、使用した共インキュベーションプロトコル（低ＲＮＰ濃度対高ＲＮＰ濃度プロトコル）に基づいてさらに分析した。Ｂは、Ｐ値（ｙ軸）に対して火山プロットにおいてプロットした、入力対照におけるＲＮＡに対する核抽出物におけるＲＮＡの変化倍率（ｘ軸）をグラフにより示す。プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰとの共インキュベーション後の線維芽細胞における核局在化を表すＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡをグラフの右上部分に示す（Ｂの囲まれた部分及びＣにおける星印状のヒットを参照されたい）。Ｃは、線維芽細胞において核内部移行が富化したＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを表すＢの頂部の８つのデータ点をハイライトしている（星印状のデータ点を参照されたい）。Ｄは、スクリーニングにおいて識別されたＣＰＰのハイドロパシー（ｙ軸）及び残基当たりの正味電荷（ｘ軸）をグラフにより示す。各ドットは、Ｂ及びＣにおけるペプチドを表しており、ドットのサイズが、Ｐ値（Ｌｏｇ１０）を示しており、陰影部分は変化倍率（Ｌｏｇ１０）を示している。グラフの右下部分におけるデータは、疎水性度が低い高電荷のＣＰＰを示している。Ｂ及びＤにおける丸状のデータ点は、同じＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰに関するデータに相当する（例えば、各図における丸状のデータ点１は、同じＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰに関するデータに相当する）。丸状のデータ点１は、高電荷のＣＰＰヒットに相当し、丸状のデータ点２は、非極性ＣＰＰヒットに相当する。

【発明を実施するための形態】

【0042】

発明の詳細な説明
本発明は、ポリペプチドを編集する核酸ガイド遺伝子、例えば、Ｃａｓ９、を、細胞にターゲティングさせるための細胞ターゲティング剤に関するスクリーニングのための組成物及び方法に関する。

【0043】

Ｉ．定義
用語「核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質」は、核酸配列を認識する核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼまたはＤＮＡガイドヌクレアーゼ）にコンジュゲートした試験因子を含む分子の複合体を指す。核酸ガイドヌクレアーゼの例は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９である。

【0044】

本明細書において使用されているとき、「核酸ガイドヌクレアーゼ」は、修飾するポリペプチド自身または会合する分子（例えば、ＲＮＡ）により特定の配列（複数可）の認識を介して特定の核酸配列または一連の同様のポリヌクレオチド鎖配列に標的とされるタンパク質を指し、ここで、ポリペプチドは、ポリヌクレオチド鎖を修飾し得る。

【0045】

本明細書において使用されているとき、用語「核酸」は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または他のＤＮＡもしくはＲＮＡを含めた、ヌクレオチドを含む分子を指す。一実施形態において、核酸は、細胞に存在し、細胞分裂を介して細胞の子孫に伝達され得る。いくつかの場合において、核酸は、染色体内の細胞のゲノムにおいて見出される遺伝子（例えば、内在性遺伝子）である。他の場合において、核酸は、細胞にトランスフェクトされた哺乳類発現ベクターである。例えば、トランスフェクション方法を使用して細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡはまた、組み込まれるＤＮＡが子孫細胞に伝達されることが意図されていないときでも、本明細書において使用されているときの「核酸」の範囲内であるとされる。

【0046】

本明細書において使用されているとき、用語「核酸を修飾する」は、部位特異的な修飾ポリペプチドによって標的とされる核酸に対しての任意の修飾を指す。かかる修飾の例として、限定されないが、参照配列（例えば、野生型またはネイティブ配列）に対して核酸配列においてアミノ酸残基のいずれかの挿入、欠失、または置換を含む、アミノ酸配列についての任意の変化を含む。かかるアミノ酸変化は、例えば、遺伝子の発現の変化（例えば、発現の増加もしくは減少）または核酸配列の置き換えにつながり得る。核酸の修飾は、二本鎖開裂、一本鎖開裂、または標的部位への本明細書に開示されているいずれかのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの結合をさらに含み得る。ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼの結合は、核酸の発現を阻害し得、または、標的部位を含む核酸への動作可能な連結において任意の核酸の発現を増加させ得る。

【0047】

本明細書において使用されているとき、用語「固有の識別核酸」（ｕｉＮＡ）は、核酸ガイドヌクレアーゼに安定に会合することが可能であるガイド核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、及び、核酸の集団から核酸を区別するために使用され得る固有の配列識別子（例えば、バーコード）を含む核酸配列を指す。いくつかの実施形態において、ｕｉＮＡは、ポリヌクレオチド（例えば、試験タンパク質もしくはＣＰＰ－試験タンパク質融合物をコードするポリヌクレオチド）に動作可能に連結され得、または、ポリペプチドと安定に会合して核タンパク質（例えば、ＲＮＰもしくはＤＮＰ）を形成し得る。したがって、ｕｉＮＡにおける識別子は、ｕｉＮＡに動作可能に連結されたポリヌクレオチド、または、ｕｉＮＡに安定に会合された核タンパク質を識別するのに使用され得る。配列識別子は、ガイド核酸のいずれの箇所に位置していても、ガイド核酸に隣接していてもよい（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡにあっても、もしくはこれに隣接していても、または、単一のガイドＲＮＡにおけるｃｒＲＮＡ／ｔｒＲＮＡ間のテトラループにあってもよい）。いくつかの場合において、固有の識別子は、ランダム化されたガイド核酸である。かかる実施形態において、ランダム化されたガイド配列は、標的配列とハイブリダイズすることが可能でないが核酸ガイドヌクレアーゼと依然として安定して会合し得るものであってよい。他の実施形態において、ガイド核酸は、相補的核酸配列とハイブリダイズする能力を保持する。

【0048】

用語「細胞ターゲティング剤」は、核酸ガイドヌクレアーゼと会合しているとき、少なくとも、核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を、標的細胞の表面にターゲティングさせる、または、標的細胞、すなわち、細胞ターゲティング剤により標的とされる細胞によって内部移行させることができるタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、細胞ターゲティング剤は、細胞膜において示される細胞外標的分子（例えば、細胞外タンパク質またはグリカン）に特異的に結合するものであってよい。かかる場合において、細胞ターゲティング剤は、少なくとも核酸ガイドヌクレアーゼが標的細胞、すなわち、細胞ターゲティング剤によって結合される細胞外分子を発現する細胞によって内部移行されるように核酸ガイドヌクレアーゼに会合され得る。いくつかの実施形態において、細胞ターゲティング剤は、細胞における膜結合型細胞小器官、例えば、核への核酸ガイドヌクレアーゼの内部移行を促進する。

【0049】

用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書において互換可能に使用されているとき、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。用語「ポリペプチド」は、ネイティブまたは人工タンパク質、タンパク質フラグメント、及びタンパク質配列のポリペプチドアナログを包含する。

【0050】

「試験タンパク質」は、本明細書に記載されている方法によって細胞ターゲティングに関して評価され得る任意のタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、試験タンパク質は、核酸ガイドヌクレアーゼにコンジュゲートされ得るタンパク質である。核酸ガイドヌクレアーゼと会合し得る細胞ターゲティング剤を識別することに加えて、本明細書における方法は、所望の細胞ターゲティング特性を有する、核酸ガイドヌクレアーゼの変異体（例えば、ガイド核酸に結合する能力が保持されている、突然変異した核酸ガイドヌクレアーゼ）を、さらなる剤を用いてまたは用いることなく識別するのにさらに有用である。かかる場合において、核酸ガイドヌクレアーゼは、試験タンパク質であるとされる。

【0051】

本明細書において使用されているとき、用語「標的細胞」は、核酸の部位特異的な修飾が（例えば、遺伝子組み換え細胞を産生するために）望まれる核酸配列を含む、細胞または細胞の集団、例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）を指す。いくつかの場合において、標的細胞は、その細胞膜において、ＴＡＧＥ剤の細胞外細胞膜結合部位によって特異的に結合される細胞外分子（例えば、細胞外タンパク質、例えば、レセプターもしくはリガンド、またはグリカン）を示す。

【0052】

本明細書において使用されているとき、用語「遺伝子組み換え細胞」は、ＤＮＡ配列が、部位特異的な修飾ポリペプチド（例えば、核酸ガイドヌクレアーゼ）によって意図的に修飾されている、細胞またはその祖先を指す。用語「コンジュゲーション部位」は、本明細書において使用されているとき、２つの以上の分子、例えば、試験タンパク質及び核酸ガイドヌクレアーゼをコンジュゲートすることが可能である部位を指す。用語「コンジュゲーション」は、本明細書において使用されているとき、分子（例えば、試験タンパク質用）と第２分子（例えば、核酸ガイドヌクレアーゼ）との間で形成される物理的または化学的複合体化を指す。化学的複合体化は、具体的には、第１分子（例えば、試験タンパク質）の官能基と第２分子（例えば、核酸ガイドヌクレアーゼ）の官能基との間で形成される結合または化学的部位を構成する。かかる結合として、限定されないが、共有結合的連結及び非共有結合的結合が挙げられる一方で、かかる化学的部位として、限定されないが、エステル、カーボネート、イミン、リン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド連結、及びオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。一実施形態において、コンジュゲーションは、物理的会合または非共有結合的複合体化を介して達成される。

【0053】

本明細書において使用されているとき、用語「リガンド」は、細胞上または内の別の分子に特異的に結合することが可能である分子、例えば、１つ以上の細胞表面レセプター、を指し、例えば、タンパク質、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、成長因子、細胞接着分子、または栄養素を含む。核酸ガイドヌクレアーゼは、共有結合的または非共有結合的連結を通して１つ以上のリガンドに会合され得る。本明細書において有用なリガンド、またはリガンドによって結合される標的、及びリガンドのさらなる記載の例は、概して、Ｂｒｙａｎｔ ＆ Ｓｔｏｗ（２００５）。Ｔｒａｆｆｉｃ，６（１０），９４７－９５３；Ｏｌｓｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ，８３（１），１６３－１８２；ａｎｄ Ｐｌａｎｑｕｅ，Ｎ．（２００６）．Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４（１），７に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0054】

本明細書において使用されているとき、用語「特異的に結合する」は、サンプルに存在する抗原を認識してこれに結合する抗原結合ポリペプチドを指すが、この抗原結合ポリペプチドは、サンプルにおける他の分子を実質的に認識せず、またはこれに結合しない。一実施形態において、抗原に特異的に結合する抗原結合ポリペプチドは、表面プラズモン共鳴、または、本明細書においてさらに記載されているものを含めた、当該分野において公知の他のアプローチ（例えば、フィルタ結合アッセイ、蛍光偏光、等温滴定カロリメトリー）によって求められるＫｄが少なくとも約１×１０^－４、１×１０^－５、１×１０^－６Ｍ、１×１０^－７Ｍ、１×１０^－８Ｍ、１×１０^－９Ｍ、１×１０^－１０Ｍ、１×１０^－１１Ｍ、１×１０^－１２Ｍ以上である抗原に結合する。一実施形態において、抗原結合ポリペプチドが、表面プラズモン共鳴によって求められる親和性が非特異的抗原に関するその親和性よりも少なくとも２倍大きい抗原に結合していると、抗原結合ポリペプチドは、抗原に特異的に結合している。

【0055】

用語「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）は、コンジュゲート分子の細胞取り込みを容易にし得る、概して約５～６０のアミノ酸残基長さのペプチド、特に、１つ以上の部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、核酸ガイドヌクレアーゼ）を指す。ＣＰＰはまた、ある特定の実施形態において、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜（例えば、核膜）、ベシクル膜、または細胞壁の１つ以上を横断しての／通しての分子コンジュゲートの移動または横断を容易にすることができるとしても特徴付けられ得る。本明細書におけるＣＰＰは、ある特定の実施形態において、カチオン性であっても、両親媒性であっても、疎水性であってもよい。本明細書において有用なＣＰＰ、及び、ＣＰＰのさらなる記載の例は、概して、Ｂｏｒｒｅｌｌｉ，Ａｎｔｏｎｅｌｌａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２３．２（２０１８）：２９５；Ｍｉｌｌｅｔｔｉ，Ｆｒａｎｃｅｓｃａ．Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏｄａｙ １７．１５－１６（２０１２）：８５０－８６０に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、実験的に立証されたＣＰＰのデータベース（ＣＰＰｓｉｔｅ、Ｇａｕｔａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１２）が存在する。ＣＰＰは、任意の公知のＣＰＰ、例えば、ＣＰＰｓｉｔｅデータベースに示されているＣＰＰであってよい。

【0056】

用語「抗原結合タンパク質」は、本明細書において使用されているとき、特定の標的抗原に結合するタンパク質、例えば、細胞外細胞－膜結合タンパク質（例えば、細胞表面タンパク質）を指す。抗原結合ポリペプチドの例として、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、及び抗体模倣体が挙げられる。ある特定の実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、抗原結合ペプチドである。

【0057】

用語「抗体」は、本明細書において広義で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、ナノボディ、モノボディ、及び抗体フラグメントを含めた様々な抗体構造を包含する。

【0058】

用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、ならびにこれらのマルチマー（例えば、ＩｇＭ）を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖（ＨＣ）は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）及び重鎖定常領域（またはドメイン）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖（ＬＣ）は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、１－Ｒ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４においてアミノ末端からカルボキシ末端まで配置されている３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されており、免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってよい。ＶＨ及びＶＬ領域は、超可変性の領域、より保存される領域と共に散在している、いわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）、いわゆるフレームワーク領域（ＦＲ）にさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置されている３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成されている。

【0059】

本明細書において使用されているとき、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重及び軽鎖両方のポリペプチドの可変領域内に見出される不連続な抗原結合部位を指す。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９－６６１６（１９７７）及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）により、ならびに、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７） ａｎｄ ｂｙ ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）により説明されており、定義は、互いに比較されたとき、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含んでいる。上記に列挙されている参照文献のそれぞれによって定義されているＣＤＲを包含するアミノ酸残基が比較のために記載されている。好ましくは、用語「ＣＤＲ」は、配列の比較に基づいて、Ｋａｂａｔによって定義されているＣＤＲである。

【0060】

用語「Ｆｃドメイン」は、無傷抗体のパパイン分解によって発生し得る、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。Ｆｃドメインは、ネイティブ配列Ｆｃドメインまたは変異体Ｆｃドメインであってよい。免疫グロブリンのＦｃドメインは、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを概して含み、ＣＨ４ドメインを任意選択的に含む。抗体エフェクター機能を変更するための、Ｆｃ部におけるアミノ酸残基の置き換えは、当該分野において公知である（Ｗｉｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃドメインは、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、ならびに抗体及び抗原－抗体複合体の半減期／クリアランス率を媒介する。ある特定の実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基は、結合タンパク質のエフェクター機能が変更されるようにＦｃドメイン含有結合タンパク質のＦｃドメインにおいて変更される（例えば、欠失され、挿入され、または置き換えられる）。

【0061】

「無傷」、または「全長」抗体は、本明細書において使用されているとき、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む抗体を指す。一実施形態において、無傷抗体は、無傷ＩｇＧ抗体である。

【0062】

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において使用されているとき、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、例えば、自然発生の変異体を含有するまたはモノクローナル抗体調製物の作製の際に生じる、可能性のある変異体抗体を除いて、同じエピトープと同一であり及び／またはこれに結合しており、かかる変異体は、概して少量で存在する。異なる決定因子（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定因子を対象とする。そのため、修飾因子「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるとして抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法によって抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組み換え型ＤＮＡ法、ファージ提示法、ならびに、ヒト免疫グロブリン座の全体または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めた様々な技術によって作製されてよく、かかる方法、及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

【0063】

用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用されているとき、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。さらに、抗体が定常領域を含むとき、定常領域もまた、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムもしくは部位特異的突然変異生成によってまたはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入される変異体）によってコードされないアミノ酸残基を含んでいてよい。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用されているとき、別の哺乳類種、例えば、マウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列においてグラフト化されている抗体を含むことは意図されない。

【0064】

用語「ヒト化抗体」は、１の哺乳類種、例えば、マウスの生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列にグラフト化されている抗体を指す。さらなるフレームワーク領域修飾は、ヒトフレームワーク配列内でなされてよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を経た抗体を指す。

【0065】

用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が一方の種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことが意図される。

【0066】

抗体の「抗体フラグメント」、「抗原結合フラグメント」または「抗原結合部分」は、無傷抗体の部分を含み、無傷抗体が結合する抗原に結合する無傷抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントとして、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成される多重特異的抗体が挙げられる。

【0067】

「多重特異的抗原結合ポリペプチド」または「多重特異的抗体」は、１を超える抗原またはエピトープを標的とするものである。「二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）」、「二重特異的（ｄｕａｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「二元機能」抗原結合ポリペプチドまたは抗体は、それぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合ポリペプチドまたは抗体である。二重特異的抗原結合ポリペプチド及び抗体は、多重特異的抗原結合ポリペプチドまたは多重特異的抗体の例であり、限定されないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含めた様々な方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５－３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７－１５５３，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ．２０１７．ＭＡＢＳ．９（２）：１８２－２１２を参照されたい。二重特異的抗原結合ポリペプチドまたは抗体の２つの結合部位は、例えば、同じまたは異なるタンパク質標的に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。

【0068】

用語「抗体模倣体」または「抗体模擬体」は、抗体に構造的に関連しないが、抗原に特異的に結合することが可能である分子を指す。抗体模倣体の例として、限定されないが、アドネクチン（すなわち、フィブロネクチン系結合分子）、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎｓ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ナノクランプ、ナノボディ、ユニボディ、ヴァーサボディ、アプタマー、シクロチド及びペプチド分子が挙げられ、これらの全てが、常套の抗体結合を模擬する一方で、異なるメカニズムを介して発生されて機能する結合構造を用いている。

【0069】

本明細書に記載されているアミノ酸配列は、核酸変更が化学的に同様のアミノ酸の置換を結果として生じさせるコード配列において単一のアミノ酸または少量のアミノ酸を変更、付加または削除する核酸の置換、欠失または付加を含めた、「保存変異体」を含んでいてよい。保存アミノ酸置換は、第１アミノ酸を、第１アミノ酸のものと同様である化学的及び／または物理的特性（例えば、電荷、構造、極性、疎水性／親水性）を有する第２アミノ酸によって置き換えることを指す。同類置換は、１つのアミノ酸を以下の群内の別のものによって置き換えることを含む：リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）及びヒスチジン（Ｈ）；アスパラギン酸塩（Ｄ）及びグルタミン酸塩（Ｅ）；アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）；Ｎ、Ｑ、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、及びチロシン（Ｙ）；Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、及びＥ；Ｄ、Ｅ、Ｎ、及びＱ；アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）、及びグリシン（Ｇ）；Ｆ、Ｗ、及びＹ；Ｈ、Ｆ、Ｗ、及びＹ；Ｃ、Ｓ及びＴ；Ｃ及びＡ；Ｓ及びＴ；Ｃ及びＳ；Ｓ、Ｔ、及びＹ；Ｖ、Ｉ、及びＬ；Ｖ、Ｉ、及びＴ。他の保存アミノ酸置換もまた、当該のアミノ酸の事情に応じて、有効であると認識される。例えば、いくつかの場合において、メチオニン（Ｍ）は、リシン（Ｋ）と置き換わり得る。また、保存の変動によって異なる配列は、概して均質である。

【0070】

用語「単離された」は、他の細胞物質を実質的に含まない、例えば、核タンパク質、タンパク質、または核酸であってよい化合物を指す。

【0071】

本明細書において使用されているとき、用語「動作可能に連結された」は、互いに機能的関係に配置されているポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を指す。例えば、調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）は、調節配列がポリヌクレオチドの転写または翻訳を制御するまたはその調節に寄与するとき、ポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡまたは核酸ガイドヌクレアーゼをコードする）に「動作可能に連結されている」。同様に、２つのポリペプチドコードヌクレオチド配列は、これらが、連続的であり、かつ、転写及び翻訳の後に「融合タンパク質」を産生するように同じリーディングフレームを発現することが可能であるとき、動作可能に連結されている。

【0072】

さらなる定義を以下のセクションにおいて説明する。

【0073】

本発明の様々な態様を以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明する。

【0074】

ＩＩ．細胞ターゲティング剤を識別する方法
核酸ガイドヌクレアーゼと会合しているとき、少なくとも、核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を、標的細胞の表面にターゲティングさせる、または、標的細胞、すなわち、細胞ターゲティング剤によって標的とされる細胞によって内部移行させることができる細胞ターゲティング剤を識別する方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、細胞ターゲティング剤は、細胞膜において示される細胞外標的分子（例えば、細胞外タンパク質またはグリカン）に特異的に結合するものであってよい。かかる場合において、細胞ターゲティング剤は、少なくとも核酸ガイドヌクレアーゼが標的細胞、すなわち、細胞ターゲティング剤によって結合される細胞外分子を発現する細胞によって内部移行されるように核酸ガイドヌクレアーゼに会合され得る。

【0075】

核酸ガイドヌクレアーゼと会合し得る細胞ターゲティング剤を識別することに加えて、本明細書における方法は、所望の細胞ターゲティング特性を有する、核酸ガイドヌクレアーゼの変異体（例えば、ガイド核酸に結合する能力が保持されている、突然変異した核酸ガイドヌクレアーゼ）を、さらなる剤を用いてまたは用いることなく識別するのにさらに有用である。かかる場合において、核酸ガイドヌクレアーゼは、試験タンパク質であるとされる。

【0076】

いくつかの実施形態において、方法は、（１）核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡ）もしくはＤＮＡガイドヌクレアーゼ）、またはその機能性フラグメント、及び試験タンパク質を含むＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質をコードし、（２）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）及び配列識別子を含む固有の識別核酸（ｕｉＮＡ）（例えば、ｕｉＲＮＡまたはｕｉＤＮＡ）をコードするベクターを提供することを含む。ベクター（セクションＩＩＩ）、核酸ガイドヌクレアーゼ（セクションＩＶ）、及び試験タンパク質の例を本明細書においてさらに詳細に説明する。いくつかの実施形態において、方法は、核酸配列識別子をコードするベクターの部分をシーケンシングすることをさらに含み、試験タンパク質がシーケンシングされることにより、試験タンパク質と識別子配列との間の会合を確立させる。この会合は、例えば、方法のより後の行程において、識別子配列の存在に基づいて試験タンパク質を識別するためのリファレンスまたは指標を提供するのに使用され得る。

【0077】

代替的には、方法は、ｕｉＮＡ及び核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質、またはこれらの構成要素をコードする２つ以上のベクターを提供することを含んでいてよい。２つのベクターが使用される場合において、例えば、第１ベクターは、ｕｉＮＡ及び試験因子をコードし得、第２ベクターは、試験因子にコンジュゲートすることが可能であるコンジュゲート性部位を含む核酸ガイドヌクレアーゼをコードし得る。２つのベクターを同じ宿主細胞に移入する際、コンジュゲート性部位を含む、第２ベクターから発現される核酸ガイドヌクレアーゼ、及び、第１ベクターから発現される試験因子が、安定に会合して核酸ガイドヌクレアーゼ融合物を形成することができる。核酸ガイドヌクレアーゼ融合物は、ｕｉＮＡにさらに会合して核タンパク質を形成することができる。

【0078】

いくつかの実施形態において、方法は、ベクターを、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡを発現するのに好適な宿主細胞に移入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、複数のベクター内にあり、複数のベクターは、宿主細胞当たりの平均ベクターが１以上となるような条件下で宿主細胞に移入される。いくつかの実施形態において、ベクターは、複数のベクター内にあり、複数のベクターは、宿主細胞当たりの平均ベクターが１未満となるような条件下で宿主細胞に移入される。核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡは、宿主細胞においてベクターから発現され得、その結果、核タンパク質（ＮＰ：例えば、ＤＮＰまたはＲＮＰ）が形成されることとなり、ここで、核タンパク質は、ベクターにおいてコードされる核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸配列に動作可能に連結された第１プロモーターを含み、ｕｉＮＡをコードする核酸配列に動作可能に連結された第２プロモーターを含む。ある特定の実施形態において、第１及び第２プロモーターは、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質の発現レベル及びｕｉＮＡの発現レベルが核タンパク質を得るように制御され得るようにそれぞれ誘導性である（例えば、Ｔ７またはＴ５）。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２プロモーターは、構成的プロモーターである。

【0079】

いくつかの実施形態において、核タンパク質は、例えば、ｇＮＡ及び核酸ガイドヌクレアーゼ融合物が共精製後に安定して会合したままとなるように、宿主細胞から次いで精製される。精製された核タンパク質は、任意選択的に一緒にプールされ、プールされた核タンパク質ライブラリとしてさらに評価され得、または、核タンパク質は、個々に評価され得る。核タンパク質は、核タンパク質を標的細胞と共に含有すること（例えば、共インキュベートすること）により細胞ターゲティング能力について次いで評価され得る。

【0080】

したがって、別の態様において、方法は、それぞれが核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び固有の識別核酸（ｕｉＮＡ）を含む複数の核タンパク質（例えば、ＲＮＰまたはＤＮＰ）を提供すること、ならびに、上記に概説されているように、核タンパク質を標的細胞と共に含有する工程によって進行することを含み得る。いくつかのかかる実施形態において、リファレンスまたは指標はまた、例えば、方法における後の工程において、識別子配列の存在に基づいて試験タンパク質を識別するために提供されてもよい。代替的には、リファレンスは、核タンパク質ポリペプチドにおける試験タンパク質及びｕｉＮＡの識別を確立させるために様々な方法によって確立されてよい。

【0081】

核タンパク質を標的細胞と共に含有させた後、標的細胞内の核酸が、内部移行したｕｉＮＡを識別するために評価され得る。いくつかの実施形態において、方法は、核酸を標的細胞、またはその画分（例えば、細胞質画分もしくは膜結合型細胞小器官画分（例えば、核、小胞体、ゴルジ装置、液胞、リソソーム、エンドソーム、もしくはミトコンドリア）から単離することを含む。単離の際、単離された核酸は、（例えば、シーケンシングによって）識別子配列の存在に関して試験され得る。識別子配列の存在は、会合した試験タンパク質が細胞ターゲティング剤であることを示唆している。例えば、細胞ターゲティング剤としての試験因子の識別は、核タンパク質においてｕｉＮＡと試験タンパク質との間の会合を確立する予め確立されたリファレンスまたは指標であってよい。

【0082】

所望の特性を有する試験因子の識別または選択の後、選択された試験因子の変異体を試験及び識別するためにさらなる一連のスクリーニングが実施され得る。試験因子の変異体を含むサブライブラリが作成され、次いで本明細書に記載されているようにスクリーニングされ得る。サブライブラリは、それぞれが試験因子（例えば、試験細胞ターゲティング剤）を含む、単一の選択された試験因子または第１選択ラウンドにおいてスクリーニングされた試験因子の数よりも少ない数の試験因子に由来する、ヌクレオチドのライブラリを指す。サブライブラリを作成するのに使用される試験因子の変異体は、タンパク質変異体を作り出す当該分野において公知のいずれの手段によって作り出されても選択されてもよい。サブライブラリの製造及び試験は、本明細書において概説されている方法によって実施され得る。サブライブラリが標的細胞と接触した後、サブライブラリ内の個々の変異体が所望の活性を有するために選択され得る。特定の実施形態において、識別された変異体の所望の活性とは、標的細胞のコンパートメントに核酸ガイドヌクレアーゼをターゲティングさせることまたは標的細胞の細胞表面に結合することができるということであり得る。

【0083】

本発明の方法のさらなる実施形態を本明細書においてさらに詳細に説明する。

【0084】

試験タンパク質
試験タンパク質は、核酸ガイドヌクレアーゼにコンジュゲートされ得、また、本明細書に記載されている方法によって細胞ターゲティングに関して評価され得るいずれのタンパク質であってもよい。例えば、いくつかの実施形態において、試験タンパク質は、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。いくつかの実施形態において、試験タンパク質は、リガンド、またはその部分である。他の実施形態において、抗原結合タンパク質。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ナノボディ、ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）_２、イントラボディ、または抗体模倣体である。ある特定の実施形態において、抗体模倣体は、アドネクチン（すなわち、フィブロネクチン系結合分子）、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、クニッツドメインペプチド、モノボディ、ナノクランプ、ユニボディ、またはヴァーサボディ、アプタマー、またはシクロチドである。

【0085】

試験タンパク質は、天然、組み換え型、または合成であってよい。いくつかの実施形態において、試験タンパク質は、試験タンパク質のライブラリから選択される１つである。いくつかの実施形態において、試験タンパク質は、ランダム変異タンパク質のライブラリから選択され得る。したがって、いくつかの実施形態において、試験タンパク質を（例えば、ランダムな突然変異生成を通して）突然変異させること、及び、突然変異したタンパク質のライブラリを作成することを含み得る。突然変異した試験タンパク質は、次いで、本明細書に記載されているように、細胞ターゲティング剤として評価され得る。

【0086】

いくつかの実施形態において、試験タンパク質は、タンパク質もしくはペプチドデータベース（例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ、ＴｒＥＭＢＬ、ＳＢＡＳＥ、ＰＦＡＭ、ＣＰＰｓｉｔｅ、もしくは当該分野において公知であるもの）において見出されるタンパク質もしくはペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体である。試験タンパク質は、当該分野において公知の核酸配列、例えば、核酸データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＴＩＧＲ、ＣＰＰｓｉｔｅ、もしくは当該分野において公知であるもの）において見出される核酸配列に（例えば、転写及び／もしくは翻訳によって）由来し得るタンパク質もしくはペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であってよい。

【0087】

固有の識別核酸
本明細書に記載されている固有の識別核酸（ｕｉＮＡ）は、核酸ガイドヌクレアーゼに安定に会合することが可能であるガイド核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、及び、核酸の集団から核酸を区別するために使用され得る固有の配列識別子（例えば、バーコード）を含む。ｕｉＮＡは、ポリヌクレオチド（例えば、試験タンパク質もしくはＣＰＰ－試験タンパク質融合物をコードするポリヌクレオチド）に動作可能に連結され得、または、ポリペプチドと安定に会合して核タンパク質（例えば、ＲＮＰもしくはＤＮＰ）を形成し得る。したがって、ｕｉＮＡにおける識別子はまた、ｕｉＮＡに動作可能に連結されたポリヌクレオチド、または、ｕｉＮＡに安定に会合された核タンパク質を識別するのにも使用され得る。

【0088】

ガイド核酸に加えて、ｕｉＮＡは、固有の配列識別子またはバーコードを含む。配列識別子は、ガイド核酸を固有に識別するいずれの核酸配列であってもよく、バルク合成ポリヌクレオチドバーコード、ランダム合成バーコード配列、マイクロアレイベースのバーコード合成、ネイティブヌクレオチド、Ｎ－マー、ランダムＮ－マー、擬ランダムＮ－マー、またはこれらの組み合わせによる部分的補完を含めた様々な異なるフォーマットから生じてよい。いくつかの実施形態において、配列識別子は、非自然発生の配列であってよい。配列識別子は、例えば、１０未満、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８８、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、または２００を超えるヌクレオチドを含み得る。さらに、配列識別子は、ガイド核酸のいずれの箇所に位置していても、ガイド核酸に隣接していてもよい（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡにあっても、もしくはこれに隣接していても、または、単一のガイドＲＮＡにおけるｃｒＲＮＡ／ｔｒＲＮＡ間のテトラループにあってもよい）。いくつかの場合において、固有の識別子は、ランダム化されたガイド核酸である。かかる実施形態において、ランダム化されたガイド配列は、標的配列とハイブリダイズすることが可能でないが核酸ガイドヌクレアーゼと依然として安定して会合し得るものであってよい。他の実施形態において、ガイド核酸は、相補的核酸配列とハイブリダイズする能力を保持する。

【0089】

ｕｉＮＡは、さらなる配列セグメントを含んでいてもよい。かかるさらなる配列セグメントは、機能的配列、例えば、プライマー配列、プライマーアニーリング部位配列、固定化配列、または後の処理に有用な他の認識もしくは結合配列、例えば、ｕｉＮＡオリゴヌクレオチドが付着するサンプルのシーケンシングに使用されるシーケンシングプライマーもしくはプライマー結合部位を含んでいてよい。

【0090】

ベクターまたは核タンパク質ライブラリ
いくつかの実施形態において、方法は、複数（例えば、ライブラリ）の発現ベクターを作製することを含み、方法が、各発現ベクターが、少なくとも１つの試験タンパク質に動作可能に連結された核酸ガイドヌクレアーゼまたはその機能性フラグメント、及び固有の識別核酸（ｕｉＲＮＡまたはｕｉＤＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含有するように、複数の試験タンパク質をコードする核酸を発現ベクターにクローニングすることを含んでおり、ｕｉＮＡは、ガイド核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）及び配列識別子を含む。いくつかの実施形態において、各ベクターは、単一の試験タンパク質を含む。他の実施形態において、各ベクターは、２つ以上の試験ポリペプチドを含む。例えば、いくつかの実施形態において、方法は、組み合わせのベクターライブラリを調製することを含み、各ベクターが、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上）の試験因子をコードして、その結果、核酸ガイドヌクレアーゼをコードする核酸が、２つのまたは試験因子に動作可能に連結されることとなる。

【0091】

いくつかの実施形態において、ライブラリは、オリゴクローナルライブラリである。例えば、プラスミドライブラリは、目的の特定の試験タンパク質をコードし得、同じ試験タンパク質をコードするプラスミドの複製を含み得る。この方法は、例えば、ｑＰＣＲ法を使用した分画を最適化するのに有用であり得る。

【0092】

いくつかの実施形態において、方法は、それぞれが、（１）核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼもしくはＤＮＡガイドヌクレアーゼ）、またはその機能性フラグメント、及び試験タンパク質を含む核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質をコードし、（２）ガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡ）及び配列識別子を含む固有の識別核酸（ｕｉＮＡ）（例えば、ｕｉＲＮＡまたはｕｉＤＮＡ）をコードする、複数（例えば、ライブラリ）のベクターを提供することを含む。

【0093】

いくつかの実施形態において、方法は、複数（例えば、ライブラリ）の核タンパク質（例えば、ＲＮＰまたはＤＮＰ）を作製することを含み、方法は、核酸ガイドヌクレアーゼまたはその機能性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを固有の識別核酸（ｕｉＲＮＡまたはｕｉＤＮＡ）と複合体化することを含んでおり、ｕｉＮＡは、ガイド核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）及び配列識別子を含む。いくつかの実施形態において、それぞれの核タンパク質が、単一の試験タンパク質を含む。他の実施形態において、それぞれの核タンパク質が、２つ以上の試験ポリペプチドを含む。

【0094】

別の態様において、方法は、それぞれが核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び固有の識別核酸（ｕｉＮＡ）を含む複数（例えば、ライブラリ）の核タンパク質（例えば、ＲＮＰまたはＤＮＰ）を提供すること、ならびに、上記に概説されているように、核タンパク質を標的細胞と共に含有する工程によって進行することを含んでいてよい。

【0095】

複数のベクターまたは核タンパク質は、ベクターまたは核タンパク質のライブラリであってよい。用語「ライブラリ」は、異種のポリペプチドまたは核酸の混合物を指す。ライブラリは、単一のポリペプチドまたは核酸配列を有するメンバーから構成される。ライブラリメンバー間の配列差、例えば、異なる試験因子またはｕｉＮＡ間の配列差は、ライブラリに存在する多様性の原因となる。ライブラリは、ポリペプチドまたは核酸の簡単な混合物の形態を取ってよく、または、核酸のライブラリ、例えば、本発明の発現ベクターによって形質転換された、生物もしくは細胞、例えば、細菌、ウイルス、動物もしくは植物細胞などの形態であってよい。好ましくは、それぞれ個々の生物または細胞は、ライブラリのうちの唯１つのメンバーを含む。

【0096】

ベクターは、目的の構成要素（例えば、試験タンパク質、核酸ガイドヌクレアーゼ、ｕｉＮＡ、または調節要素）をコードするＤＮＡからアセンブルされ得る。ＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡからの目的の配列の増幅を通して、または合成を通して、いずれの源から得られてもよい。目的の構成要素をコードするＤＮＡは、充分な量のＤＮＡを産生するために、かつ、発現ベクター（例えば、セクションＩＩＩに記載されているもの）へのインサートとして導入され得るような方法で（例えば、適切な制限部位の付加によって）ＤＮＡを修飾するために、公知の技術、例えば、適切に選択されたプライマーを使用するＰＣＲを使用して増幅及びクローニングされ得る。増幅及びクローニングされたＤＮＡは、試験タンパク質ならびに新規の試験タンパク質のより多くの多様性またはより広いレパートリーを生じさせるために、突然変異生成、例えば、ＰＣＲを使用してさらに多様化され得る。

【0097】

本明細書に記載されている任意のベクター構成要素（例えば、試験タンパク質、核酸ガイドヌクレアーゼ、ｕｉＮＡ、または調節要素）をコードする、クローニングされたポリヌクレオチドは、発現ベクター（例えば、プラスミド）、例えば、セクションＩＩＩに記載されているベクターに導入される。タンパク質または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの場合、ポリヌクレオチドは、タンパク質が適切な宿主細胞においてタンパク質として発現されるような方法でベクターに挿入される。

【0098】

いくつかの実施形態において、方法は、（例えば、プラスミド－ｓｅｑを介して）ベクターの１つ以上の部分をシーケンシングすることをさらに含む。例えば、方法は、核酸配列識別子及び／または試験タンパク質をコードするベクターの１つ以上の部分をシーケンシングし、それにより、試験タンパク質と識別子配列との間の会合を確立することをさらに含んでいてよい。この会合は、例えば、方法における後の工程において、識別子配列の存在に基づいて試験タンパク質を識別するためのリファレンスまたは指標を提供するのに使用され得る。例えば、シーケンシングは、自動サンガーシーケンシング（ＡＢＩ ３７３０ｘ１ゲノムアナライザー）、固体支持体におけるパイロシーケンシング（４５４シーケンシング、Ｒｏｃｈｅ）、可逆的終端による合成ごとのシーケンシング（ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ）、ライゲーションごとのシーケンシング（ＡＢＩ ＳＯＬｉＤ（登録商標））または事実上の終端による合成ごとのシーケンシング（ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（登録商標））を使用することによって実施され得る；Ｍｏｌｅｃｕｌｏシーケンシング（Ｖｏｓｋｏｂｏｙｎｉｋ ｅｔ ａｌ．ｅＬｉｆｅ ２０１３ ２：ｅ００５６９及び２０１２年９月１０日に出願された米国特許出願第１３／６０８，７７８号を参照されたい）；ＤＮＡナノボールシーケンシング；一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング；ナノポアＤＮＡシーケンシング；ハイブリダイゼーションによるシーケンシング；質量分析によるシーケンシング；及びマイクロ流体サンガーシーケンシング。当業者に公知の例示的な次世代のシーケンシング方法として、超並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）、ポロニーシーケンシング、パイロシーケンシング（４５４）、合成によるＩｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、ライゲーションによるＳＯＬｉＤシーケンシング、イオン半導体シーケンシング（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング）、ＤＮＡナノボールシーケンシング、鎖終端シーケンシング（サンガーシーケンシング）、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ一分子シーケンシング、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びナノポアシーケンシングが挙げられ、例えば、世界のウェブサイトｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍに記載されている。

【0099】

これらのベクターのライブラリは、ベクター（例えば、試験タンパク質、核酸ガイドヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ－試験タンパク質融合物、及び／またはｕｉＮＡ）においてコードされる１つ以上の構成要素の発現のために、真核生物または原核生物のものであり得る宿主細胞に次いで導入される。宿主細胞へのベクターの移入（例えば、感染、形質転換、またはトランスフェクションによる）は、公知の技術、例えば、エレクトロポレーション、原形質融合、またはリン酸カルシウム共沈を使用して実施され得る。方法が２つのベクターを必要とする場合、両方のライブラリが、同時または逐次的のいずれかで適切な宿主細胞に導入され得る。

【0100】

コンパートメント化された核タンパク質発現
いくつかの実施形態において、方法は、ベクターを、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡを発現するのに好適な宿主細胞に導入すること、ならびに宿主細胞において核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡを発現することをさらに含み、その結果、発現した核タンパク質（ＮＰ；ＲＮＰまたはＤＮＰ）が、それぞれ、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び対応するｕｉＮＡを含むこととなる。いくつかの実施形態において、ベクターは、複数のベクター内にあり、複数のベクターは、宿主細胞当たりの平均ベクターが１以上となるような条件下で宿主細胞に移入される。いくつかの実施形態において、ベクターは、複数のベクター内にあり、複数のベクターは、宿主細胞当たりの平均ベクターが１未満となるような条件下で宿主細胞に移入される。核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡは、宿主細胞においてベクターから発現され得、その結果、核タンパク質が形成されることとなり、ここで、発現した核タンパク質は、ベクターにおいてコードされる核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡを含む。

【0101】

用語「宿主細胞」は、タンパク質、タンパク質フラグメント、またはベクターからの目的のペプチドを発現し得る細胞を指す。例えば、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞、例えば、細菌細胞、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞であってよい。いくつかの実施形態において、真核細胞は、酵母細胞（例えば、出芽酵母細胞、ピキア・パストリスなど）、植物細胞、または哺乳類細胞であってよい。いくつかの場合において、細菌細胞は、大腸菌細胞である。

【0102】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、齧歯類（ラット、マウス、モルモットもしくはハムスター）由来の哺乳類培養細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０；またはヒト組織もしくはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、もしくは昆虫細胞である。この用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も包含する。ある特定の修飾は、変異または環境のいずれかの影響に起因して後世において起こり得るため、かかる子孫は、親細胞と同一でない場合があるが、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。ある特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ＣＯＰ細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ－０細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＣ１２細胞、ＰＣ１２ｈ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ３細胞、ＣＯＳＴ細胞、ＣＶ１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＰＥＲ Ｃ６細胞、２倍体線維芽細胞由来の細胞、骨髄腫細胞、またはＨｅｐＧ２である。

【0103】

ポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）を宿主細胞に導入する方法は当該分野において公知であり、宿主細胞の種類に基づいて典型的には選択される。かかる方法として、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、原形質融合、リポフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、直接微小注入、及びナノ粒子媒介送達が挙げられる。

【0104】

代替的には、方法は、ベクターを、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡを発現するのに好適な非細胞コンパートメント（例えば、エマルジョン液滴）に移入すること、ならびに非細胞コンパートメント（例えば、エマルジョン液滴）において核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡを発現することを含んでいてよく、その結果、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡをそれぞれ含むリボ核タンパク質（ＮＰ）が形成されることとなる。

【0105】

ある特定の実施形態において、非細胞コンパートメントは、液滴、例えば、エマルジョンにおける液滴及び／またはマイクロ流体液滴である。乳化は、サンプルまたはサンプルセットを、一連のコンパートメント、例えば、単一の細胞、あるいは、細胞サンプルの別々の部分、例えば、細胞不含抽出物または細胞不含転写及び／もしくは細胞不含翻訳混合物を有するコンパートメントに分離または隔離するために、本開示の方法において使用され得る。典型的には、本明細書に開示されている方法及び組成物と併せて使用されているとき、エマルジョンは、各液滴がベクターを含んで複数の液滴を含み、その結果、各液滴が、これを他の液滴から区別する、１つの試験因子及びｕｉＮＡをコードするベクターを含むこととなる。乳化は、エマルジョン液滴中の１つ以上の標的分子を、ｕｉＮＡをコードする１つのベクターによってコンパートメント化するために本開示の方法において使用され得る。エマルジョンにおける液滴は、当該分野において周知の方法によって選別及び／または単離され得る。例えば、蛍光シグナルを含むダブルエマルジョン液滴は、＞１０４液滴ｓ”１の速度で従来の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）機を使用して分析及び／または選別され得、単一の細胞によって、または、単一の遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳によって産生される酵素の活性を改良するために使用されてきた（Ａｈａｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ １２（１２）：１２８１－１２８９，２００５；Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２（１２）：１２９１－１３００，２００５）。しかし、エマルジョンは、定量分析を制限する、高度多分散系であり、予め形成された液滴に新しい試薬を添加することは困難である（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４（９）：３９５－４０２，２００６）。これらの制限は、しかし、ピコリットル体積の高度単分散液滴が、作製され（Ａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓ Ｌｅｔｔ ８２（３）：３６４－３６６，２００３）、融合され（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄｉｔ ４２（７）：７６７－７７２，２００３；Ｃｈａｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２６（１９）：３７０６－３７１５，２００５）、分裂され（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄｉｔ ４２（７）：７６７－７７２，２００３；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓ Ｒｅｖ Ｌｅｔｔ ９２（５）：０５４５０３，２００４）、インキュベートされ（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄｉｔ ４２（７）：７６７－７７２，２００３；Ｆｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ ９（１０）：１３４４－１３４８，２００９）、かつ、ｋＨｚ周波数で蛍光において選別されてトリガーされ（Ｂａｒｅｔ，ｅｔ ａｌ，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ ９（１３）：１８５０－１８５８，２００９）得る、液滴系マイクロ流体系に基づいたプロトコル（例えば、Ｔｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ ８（２）：１９８－２２０，２００８；Ｔｈｅｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ４９（３４）：５８４６－５８６８，２０１０；及びＧｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ ｏｎ ａ ｃｈｉｐ １２（１２）：２１４６，２０１２を参照されたい）、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｚｕｔｉｓ ｅｔ ａｌ．｛Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８（５）：８７０－８９１，２０１３）に記載されているものを使用することによって克服され得る。本明細書に開示されているように、エマルジョンは、標的分子、標的核酸及び起源特異的バーコードに加えて、様々な化合物、酵素、または試薬を含み得る。これらの添加物は、乳化の前にエマルジョン溶液に含まれていてよい。代替的には、添加物は、乳化後に個々の液滴に添加されてよい。

【0106】

エマルジョンは、当該分野において公知の様々な方法（例えば、ＵＳ２００６／００７８８８８Ａｌを参照されたい、段落［０１３９］－［０１４３］が参照により本明細書に組み込まれる）によって得られてよい。例示的なエマルジョンは、油中水エマルジョンである。いくつかの実施形態において、エマルジョンの連続相は、フッ素化油を含む。エマルジョンは、エマルジョンを安定化するために界面活性剤または乳化剤（例えば、洗浄剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、または両性界面活性剤）を含有し得る。他の油／界面活性剤混合物、例えば、シリコーン油もまた、特定の実施形態において使用されてもよい。エマルジョンは、取り扱いの容易さのために、ウェルまたは複数のウェル、例えば、プレートに含有され得る。いくつかの例において、１つ以上のベクター分子、標的核酸及び核酸バーコードがコンパートメント化されている。エマルジョンは、単分散系エマルジョンまたは多分散系エマルジョンであってよい。ある特定の実施形態において、液滴は、細胞系、例えば、細胞不含抽出物を含んでいてよい。本発明に関連するエマルジョンは、細胞不含転写または翻訳を達成するためにベクターに加えて様々な化合物、酵素、または試薬を含んでいてよい。これらの添加物は、乳化の前にエマルジョン溶液に含まれていてよい。代替的には、添加物は、乳化後に個々の液滴に添加されてよい。

【0107】

ＲＮＰの単離
いくつかの実施形態において、方法は、核タンパク質を、本明細書に記載されている発現ベクターを含む宿主細胞から単離することをさらに含み、それぞれの核タンパク質が、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び固有の識別核酸（ｕｉＮＡ）を含み、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質が、核酸ガイドヌクレアーゼ、またはその機能性フラグメント、及び試験タンパク質を含み；ｕｉＮＡがガイド核酸及び配列識別子を含む。宿主細胞から核タンパク質を単離するためにいずれの精製方法を使用することもできる。例示的な単離技術として、限定することなく、アフィニティー捕捉、免疫沈降、クロマトグラフィ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、金属結合クロマトグラフィ、免疫親和性クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、及び液体クロマトグラフィ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ））、電気泳動、捕捉オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、フェノール－クロロホルム抽出、ミニカラム精製、またはエタノールもしくはイソプロパノール沈殿が挙げられる。クロマトグラフィ法は、例えば、Ｈｅｄｈａｍｍａｒ ｅｔ ａｌ．（「Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｒｏｙａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）に詳細に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。かかる技術は、標識された核タンパク質、または核タンパク質と会合するｕｉＮＡもしくは試験タンパク質を認識する捕捉分子を利用することができる。

【0108】

試験配列識別子
核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び固有の識別核酸（ｕｉＮＡ）を含む単離された核タンパク質は、核タンパク質を標的細胞と共に含有すること（例えば、共インキュベートすること）により、細胞ターゲティング能力及び／または核内部移行能力について評価され得る。例えば、含有する工程は、細胞を核タンパク質と共にインキュベートすること、露光することまたは混合することを含んでいてよい。

【0109】

いくつかの実施形態において、標的細胞（複数可）は、真核細胞、例えば、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）である。ある特定の実施形態において、標的細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆幹細胞（ＨＰＳＣ）、天然キラー細胞、マクロファージ、ＤＣ細胞、非ＤＣ骨髄性細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞（例えば、活性化Ｔ細胞）、線維芽細胞または他の細胞である。ある特定の実施形態において、標的細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８Ｔ細胞である。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）またはエフェクターＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、腫瘍湿潤Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）または造血前駆細胞（ＨＰＳＣ）である。いくつかの実施形態において、マクロファージは、Ｍ０、Ｍ１、またはＭ２マクロファージである。いくつかの実施形態において、標的細胞は、異常細胞である。ある特定の実施形態において、標的細胞は、腫瘍細胞である。

【0110】

いくつかの実施形態において、単離された核タンパク質は、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡを含んでいて、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の標的細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＳＣ、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ（例えばＭ０、Ｍ１、またはＭ２マクロファージ）、ＤＣ、非ＤＣ骨髄性細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞（例えば、活性化Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、Ｔｒｅｇｓ、エフェクターＴ細胞、及び／または腫瘍湿潤Ｔ細胞）、線維芽細胞、眼細胞、小孔細胞、異常細胞（例えば、腫瘍細胞）、または他の細胞から選択される複数の標的細胞と接触させることによって細胞標的能及び／または核内部移行能に関して評価され得る。ある特定の実施形態において、単離された核タンパク質は、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及びｕｉＮＡを含んでいて、核タンパク質を、複数の標的細胞集団、例えば、Ｔ細胞の集団及びマクロファージの集団と接触させる、例えば共インキュベートすることによって細胞標的能及び／または核内部移行能に関して評価され得る。

【0111】

細胞は、細胞の生存に好適ないずれの条件または細胞培養培地にあってもよい。さらに、細胞は、表面に付着していても、細胞培養培地に懸濁していてもよい。核タンパク質を標的細胞と共に含有させた後、標的細胞内の核酸が、内部移行したｕｉＮＡを識別するために次いで評価され得る。

【0112】

いくつかの実施形態において、方法は、核酸を、標的細胞、またはその画分から単離することを含む。例えば、いくつかの実施形態において、単離された核酸は、核酸単離前に標的細胞から抽出される細胞質から得られる。代替的には、単離した核酸は、核酸単離前に標的細胞から抽出される膜結合型細胞小器官（例えば、核、小胞体、ゴルジ装置、液胞、リソソーム、エンドソーム、またはミトコンドリア）から得られる。例えば、いくつかの実施形態において、核が、標的細胞から抽出され、抽出された核内の核酸（例えば、ｕｉＮＡを含む）が単離されて、さらに分析される。ある特定の実施形態において、方法は、標的細胞を、標的細胞の核を含む第１画分及び標的細胞の細胞質ゾルを含む第２画分に分画することを含み、抽出された核及び抽出された細胞質ゾル内の核酸（例えば、ｕｉＮＡを含む）が単離されて、さらに分析される。

【0113】

いくつかの実施形態において、最初の核タンパク質プールにおけるｕｉＮＡ（標的細胞を核タンパク質と接触させる前の初期入力）が、比較基準としてさらに評価される。かかる場合において、入力対照と比較した、標的細胞、またはそのコンパートメント（例えば、標的細胞の核）におけるｕｉＮＡレベルの富化は、会合する試験タンパク質が細胞ターゲティング剤であることを示唆している。

【0114】

いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されているように、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質及び固有の識別核酸（ｕｉＮＡ）を含む核タンパク質と共に混合細胞集団を含有する（例えば、共インキュベーションを介して）ことを含む。ある特定の実施形態において、混合細胞集団は、細胞の第１細胞集団（すなわち、標的細胞）及び細胞の第２細胞集団（すなわち、標的細胞でない細胞）を含む。かかる場合において、方法は、第１細胞の集団及び第２細胞の集団の両方から核酸を単離することを含んでいてよい。いくつかの実施形態において、単離した核酸は、第１細胞の集団及び第２細胞の集団の両方における膜結合型細胞小器官から得られる。したがって、いくつかの実施形態において、核が第１及び第２細胞の集団の両方から抽出され、抽出された核内の核酸（例えば、ｕｉＮＡを含む）が単離されて、さらに分析される。いくつかの実施形態において、最初の核タンパク質プールにおけるｕｉＮＡ（第１及び第２細胞の集団を核タンパク質と接触させる前の初期入力）が、比較基準としてさらに評価される。いくつかの実施形態において、最初の核タンパク質プール（標的細胞を核タンパク質と接触させる前の初期入力）におけるｕｉＮＡが、比較基準としてさらに評価される。かかる場合において、入力対照及び第２細胞集団（例えば、標的細胞でない細胞）の両方と比較した、標的細胞、またはそのコンパートメント（例えば、標的細胞の核）におけるｕｉＮＡレベルの富化は、会合する試験タンパク質が細胞ターゲティング剤であることを示唆している。いくつかの実施形態において、複数の標的細胞集団、例えば、上記に記載されている２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の標的細胞集団が使用されてよい。例えば、Ｔ細胞の集団及びマクロファージの集団が標的細胞集団として使用され得、最初の核タンパク質プール（Ｔ細胞及びマクロファージを核タンパク質と接触させる前の初期入力）におけるｕｉＮＡが、比較基準としてさらに評価され得る。かかる場合において、入力対照と比較した、Ｔ細胞及びマクロファージ、またはそのコンパートメント（例えば、Ｔ細胞及びマクロファージの核）におけるｕｉＮＡレベルの富化は、会合した試験タンパク質が細胞ターゲティング剤であることを示唆し得る。代替の実施形態において、ヒトＨＳＣの集団及びマウスＨＳＣの集団が標的細胞集団として使用されよく、最初の核タンパク質プール（ヒトＨＳＣ及びマウスＨＳＣを核タンパク質と接触させる前の初期入力）におけるｕｉＮＡが、比較基準としてさらに評価され得る。かかる場合において、入力対照と比較した、ヒトＨＳＣ及びマウスＨＳＣ、またはそのコンパートメント（例えば、ヒトＨＳＣ及びマウスＨＳＣの核）におけるｕｉＮＡレベルの富化は、会合した試験タンパク質が細胞ターゲティング剤であることを示唆し得る。

【0115】

試験核タンパク質との接触の後に標的細胞から得られる核酸は、当該分野において公知のいずれの増幅方法に従ってさらなる分析のために増幅されてもよい。増幅の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、ここでは、サンプルを、サンプルにおける核酸鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で１対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる。プライマーは、好適な条件下で伸長され、鋳型から解離され、再アニーリングされ、伸長され、解離されて、核酸のコピー数を増幅することができる。このサイクルが繰り返され得る。増幅の産物は、電気泳動としてのかかる技術、制限エンドヌクレアーゼ開裂パターン、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションもしくはライゲーション、及び／または核酸シーケンシングによって特徴付けられ得る。

【0116】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅技術の他の例として、とりわけ、定量的リアルタイムＰＣＲ；逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）；リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）；リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ｒｔＲＴ－ＰＣＲ）；ネステッドＰＣＲ；ストランド置換増幅（米国特許第５，７４４，３１１号を参照されたい）；転写フリー等温増幅（米国特許第６，０３３，８８１号を参照されたい）、リガーゼ連鎖反応増幅（ＷＯ９０／０１０６９を参照されたい）；リガーゼ連鎖反応増幅（欧州特許公開公報第ＥＰ－Ａ－３２０ ３０８号を参照されたい）；ギャップ充填リガーゼ連鎖反応増幅（米国特許第５，４２７，９３０号を参照されたい）；結合リガーゼ検出及びＰＣＲ（米国特許第６，０２７，８８９号を参照されたい）；ならびにＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ転写フリー増幅（米国特許第６，０２５，１３４号を参照されたい）が挙げられる。ある特定の実施形態において、試験する工程は、単離されたＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生すること、及びｃＤＮＡをシーケンシングして識別子配列の存在を決定することを含む。いくつかの実施形態において、試験する工程は、単離されたＲＮＡをシーケンシングして識別子配列の存在を決定することを含む。

【0117】

核酸を増幅するための他の例示的な方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１ Ｐｔ １：２６３及びＣｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １ ：２４１；ならびに米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号を参照されたい）、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥ ＰＣＲ、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７－１０８０；ａｎｄ Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１ ：３６０－３６４を参照されたい）、自立配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１１７３）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、再帰的ＰＣＲ（Ｊａｆｆｅ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２６１９；及びＷｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：７７９０）、米国特許第６，３９１，５４４号、同第６，３６５，３７５号、同第６，２９４，３２３号、同第６，２６１，７９７号、同第６，１２４，０９０号及び同第５，６１２，１９９号に記載されている増幅方法、等温増幅（例えば、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、超分岐ローリングサークル増幅（ＨＲＣＡ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ＰＷＧＡ）、または当業者に周知の技術を使用するいずれか他の核酸増幅が挙げられる。

【0118】

得られた核酸（例えば、単離した核酸）は、当該分野において公知の任意のシーケンシングまたはマイクロアレイ方法を含めた様々な方法によって識別子配列の存在について試験され得る。いくつかの実施形態において、固有の識別核酸の識別性は、ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンシング（例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ）によって決定される。例えば、シーケンシングは、自動サンガーシーケンシング（ＡＢＩ ３７３０ｘ１ゲノムアナライザー）、固体支持体におけるパイロシーケンシング（４５４シーケンシング、Ｒｏｃｈｅ）、可逆的終端による合成ごとのシーケンシング（ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ）、ライゲーションごとのシーケンシング（ＡＢＩ ＳＯＬｉＤ（登録商標））または事実上の終端による合成ごとのシーケンシング（ＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（登録商標））を使用することによって実施され得る；Ｍｏｌｅｃｕｌｏシーケンシング（Ｖｏｓｋｏｂｏｙｎｉｋ ｅｔ ａｌ．ｅＬｉｆｅ ２０１３ ２：ｅ００５６９及び２０１２年９月１０日に出願された米国特許出願第１３／６０８，７７８号を参照されたい）；ＤＮＡナノボールシーケンシング；一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング；ナノポアＤＮＡシーケンシング；ハイブリダイゼーションによるシーケンシング；質量分析によるシーケンシング；及びマイクロ流体サンガーシーケンシング。当業者に公知の例示的な次世代のシーケンシング方法として、超並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）、ポロニーシーケンシング、パイロシーケンシング（４５４）、合成によるＩｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、ライゲーションによるＳＯＬｉＤシーケンシング、イオン半導体シーケンシング（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンシング）、ＤＮＡナノボールシーケンシング、鎖終端シーケンシング（サンガーシーケンシング）、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ一分子シーケンシング、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びナノポアシーケンシングが挙げられ、例えば、世界のウェブサイトｎａｎｏｐｏｒｅｔｅｃｈ．ｃｏｍに記載されている。いくつかの実施形態において、ｕｉＮＡは、鋳型－切り替え反応（例えば、ＳＭＡＲＴｓｅｑ由来のＭａｘｉｍａＨ－Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素による、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、ｓｓＲＮＡライゲーション（例えば、マイクロＲＮＡｓｅｑに由来するＴ４ ＲＮＡリガーゼＫ２２７Ｑによる）、ｓｓＤＮＡライゲーション（例えば、ＳＨＡＰＥ－ｓｅｑ由来のｃｒｉｃＬｉｇａｓｅ）、ホモポリマーテーリング（例えば、ＨＴＬ－ＰＣＲ由来の末端トランスフェラーゼ）、またはスプリンテッドライゲーション（例えば、ＳＲＳＬＹ－ｓｅｑ由来のＴ４ＤＮＡリガーゼ）を使用してシーケンシングされる。

【0119】

標的細胞における識別子配列の存在は、会合した試験タンパク質が細胞ターゲティング剤であることを示唆している。例えば、細胞ターゲティング剤としての試験因子の識別は、核タンパク質においてｕｉＮＡと試験タンパク質との間の会合を確立する予め確立されたリファレンスまたは指標であってよい。

【0120】

いくつかの実施形態において、本方法によって識別される細胞ターゲティング剤は、核酸ガイドヌクレアーゼを、標的細胞のコンパートメント内にターゲティングさせる、または標的細胞の細胞表面に結合させるタンパク質である。例えば、細胞ターゲティング剤コンパートメントは、膜結合型細胞小器官または細胞質である。ある特定の実施形態において、膜結合型細胞小器官は、核、小胞体、ゴルジ装置、液胞、リソソーム、エンドソーム、またはミトコンドリアである。特定の実施形態において、内部移行は、少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％の、内部移行したペプチドまたは組成物が、（例えば、１時間、２時間、３時間、４時間以上の間に）細胞の細胞質に局在化することを指す。

【0121】

ＩＩＩ．発現ベクター
別の態様において：試験タンパク質の核酸を挿入するためにクローニング部位に任意選択的に動作可能に連結された核酸ガイドヌクレアーゼをコードし、それにより、核酸ガイドヌクレアーゼ及び試験タンパク質を含む核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質を形成する、核酸；ならびに固有の識別核酸（ｕｉＮＡ）をコードする核酸；を含む細胞発現ベクターであって、ｕｉＮＡが、ガイド核酸及び配列識別子を含む、上記細胞発現ベクターを本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、試験タンパク質をコードする核酸をさらに含む。

【0122】

「発現ベクター」または「ベクター」は、本明細書において使用されているとき、細胞に遺伝物質を導入するのに使用され得るポリヌクレオチドビヒクルを指す。ベクターは、線状または環状であってよい。本明細書において発現ベクターとして有用なベクターとして、プラスミド、ウイルスベクター（ファージを含む）、及び統合可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同的組み換えによって宿主ゲノムに統合可能なフラグメント）が挙げられる。４つの主なベクタータイプは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミッド、及び人工染色体である。ベクターは、好適な宿主細胞においてベクターの複製を行うことが可能である複製配列（すなわち、複製起点）を含有し得る。典型的には、ベクターは、複製起点、マルチクローニング部位、及び／または選択可能なマーカーを含む。好適な宿主の形質転換の際、ベクターは、宿主ゲノムとは独立して複製及び機能してよく、または、宿主ゲノムに統合してよい。ベクター設計は、とりわけ、意図する用途及びベクターの宿主細胞に左右され、特定の用途及び宿主細胞のための本発明のベクターの設計は、当該分野における技能のレベルの範囲内である。

【0123】

発現ベクターの構築のための一般的な方法は、当該分野において公知である。大部分の宿主細胞のための発現ベクターは、市販されている。適切なベクター及びその構築、例えば、細菌細胞における細菌形質転換及び遺伝子発現のための細菌プラスミド、酵母及び他の真菌における細胞形質転換及び遺伝子発現のための酵母プラスミド、哺乳類細胞または哺乳類における哺乳類細胞形質転換及び遺伝子発現のための哺乳類ベクター、細胞形質転換及び遺伝子発現のためのウイルスベクター（レトロウイルス、レンチウイルス及びアデノウイルスベクターを含む）、ならびに、かかるポリヌクレオチドのクローニングを容易に可能にするための方法の選択を容易にするために設計された、いくつかの市販のソフトウェア製品がある。

【0124】

発現ベクターは、以下：転写の調節、転写後調節、及び翻訳の調節；の１つ以上に関与する調節配列を典型的には含む。発現ベクターは、細菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、及び植物細胞を含めた様々な生物に導入され得る。ベクターは、導入される宿主細胞または生物（複数可）に対応する機能的調節配列を典型的には含む。さらに、発現ベクターは、タンパク質タグ（例えば、ｐｏｌｙ－Ｈｉｓタグ、血球凝集素タグ、蛍光タンパク質タグ、生物発光タグ、核局在化タグ）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。かかるタンパク質タグのコード配列は、コード配列（例えば、核酸ガイドヌクレアーゼをコードする配列）に融合され得る。

【0125】

いくつかの態様において、ベクターの様々な構成要素（例えば、ガイドＮＡ、ｕｉＮＡ、核酸ガイドヌクレアーゼ、及び／または核酸ガイド融合タンパク質）の１つ以上をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結されている。例えば、動作可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、または構成的プロモーターであってよい。いくつかの実施形態において、細胞発現ベクターは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸配列に動作可能に連結された第１プロモーターを含み、ｕｉＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸配列に動作可能に連結された第２プロモーターを含む。ある特定の実施形態において、第１及び第２プロモーターは、それぞれ、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質の発現レベル及びｕｉＲＮＡの発現レベルまたはｇＲＮＡが制御され得るような誘導性の要素を含む。ある特定の実施形態において、第１及び／または第２プロモーターは、Ｔ７またはＴ５である。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２プロモーターは、構成的プロモーターである。

【0126】

ベクターは、原核または真核細胞における、記載されている方法の様々な構成要素の発現のために設計され得る。代替的には、転写は、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用するｉｎ ｖｉｔｒｏであってよい。他のＲＮＡポリメラーゼ及びプロモーター配列が使用され得る。

【0127】

ベクターは、原核生物に導入されて伝播され得る。原核生物ベクターは、当該分野において周知である。典型的には、原核生物ベクターは、標的宿主細胞に好適な複製起点（例えば、大腸菌由来のｏｒｉＣ、ｐＢＲ３２２由来のｐＵＣ、サルモネラ菌由来のｐＳＣ１０１）、１５Ａ起源（ｐ１５Ａ由来）または細菌人工染色体）を含む。ベクターは、選択可能なマーカーを含み得る。「選択可能なマーカー遺伝子」は、ベクターを持つ成功裏に形質転換された細胞が識別され得る表現型を発現の際に与える遺伝子を指す。選択可能なマーカー遺伝子は、本明細書において使用されているとき、細胞培養における選択因子への耐性を与え得及び／または目視検査の際に識別可能である表現型を与え得る。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、選択因子（例えば、薬物、例えば、抗生物質、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、及びカナマイシン）に対する耐性を発現の際に与える遺伝子である。Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）は、細菌、真菌（酵母を含む）、植物及び哺乳類細胞株における選択として使用され得る。したがって、ベクターは、多数の生物における選択作業のために、Ｚｅｏｃｉｎに対する薬物抵抗性を１つだけ保有するように設計され得る。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは、発現の際に、識別可能な表現型を与える遺伝子である。例えば、選択可能なマーカーは、視覚的に、または、機械、例えば、フローサイトメトリーによって識別され得るベクターを持つ細胞において蛍光を与える蛍光マーカーであってよい。

【0128】

有用なプロモーターは、原核生物におけるタンパク質発現について公知であり、例えば、Ｔ５、Ｔ７、ラムノース（誘導性）、アラビノース（誘導性）、及びＰｈｏＡ（誘導性）である。さらに、Ｔ７プロモーターは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼもコードするベクターにおいて広く使用される。原核生物ベクターはまた、様々な強度、及び分泌シグナルのリボソーム結合部位を含み得る（例えば、ｍａｌ、ｓｅｃ、ｔａｔ、ｏｍｐＣ、及びｐｅｌＢ）。また、ベクターは、ｇＲＮＡの発現のためのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み得る。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ転写終結配列も周知である（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅからの転写終結配列）。原核生物の安定な形質転換のための統合ベクターも当該分野において公知である（例えば、Ｈｅａｐ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｃｏｕｎｔｅｒ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１２） ４０：ｅ５９を参照されたい）。

【0129】

原核生物におけるタンパク質の発現は、多くの場合において、細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて、ベクターの発現される構成要素（例えば、ｕｉＮＡ及び核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質）の発現を対象とする構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。

【0130】

様々な構成要素の発現に好適な様々なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが原核生物において利用可能である（例えば、Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，「Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｅｎｏｍｅ ｖｉａ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ」，Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２０１５） ８１：２５０６－２５１４）；Ｅｓｔｒｅｍ，Ｓ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ：ｓｕｂｓｉｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＵＰ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ」，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５；１３（１６）：２１３４－４７を参照されたい）。

【0131】

いくつかの態様において、ベクターは、上記の方法の１つ以上の構成要素を含む酵母発現ベクターである。出芽酵母における発現のためのベクターの例として、限定されないが、以下：ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２、及びｐｉｃＺが挙げられる。酵母細胞における遺伝子発現のための方法は、当該分野において公知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐａｒｔ Ａ」，（２００４） Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｇｅｒａｌｄ Ｒ．Ｆｉｎｋ（ｅｄｓ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照されたい）。典型的には、酵母におけるタンパク質コード遺伝子の発現は、目的のコード領域に動作可能に連結されたプロモーター、及び転写ターミネーターを必要とする。様々な酵母プロモーターを使用して、酵母における遺伝子の発現のために発現カセットを構築することができる。プロモーターの例として、限定されないが、以下の酵母タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターが挙げられる：アルコール脱水素酵素１（ＡＤＨ１）またはアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ；ＴＤＨ３、またはトリオースリン酸脱水素酵素としても公知）、ガラクトース－１－リン酸ウリジル－トランスフェラーゼ（ＧＡＬ７）、ＵＤＰ－ガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、チトクロムｃｉ（ＣＹＣ１）、酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）及びグリセロール－３－リン酸脱水素酵素遺伝子（ＧＰＤ１）。ハイブリッドプロモーター、例えば、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨ、ＣＹＣ１／ＧＡＬ１０及びＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター（低い細胞グルコース濃度、例えば、約０．１パーセント～約０．２パーセントで誘発される）が使用されてもよい。Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅにおいて、好適なプロモーターとして、チアミン抑圧ｎｍｔｌプロモーター及びｐＴＬ２Ｍにおける構成的サイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。

【0132】

酵母ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、５Ｓ、Ｕ６またはＲＰＲ１遺伝子からのプロモーター）、ならびにポリメラーゼＩＩＩ終結配列は、当該分野において公知である（例えば、ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ；Ｈａｒｉｓｍｅｎｄｙ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，（２００３）「Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａｓｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ」，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．２２（１８）：４７３８－４７４７．を参照されたい）。

【0133】

プロモーターに加えて、エンハンサーとも呼ばれる、いくつかの上流活性化配列（ＵＡＳ）が、ポリペプチド発現を向上させるために使用されてよい。酵母における発現のための例示的な上流活性化配列として、これらのタンパク質をコードする遺伝子のＵＡＳが挙げられる：ＣＹＣ１、ＡＤＨ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、及びＡＤＨ２。酵母における発現のための例示的な転写終結配列として、α－因子、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、及びＰＧＫ遺伝子の終結配列が挙げられる。１つまたは複数の終結配列が使用され得る。

【0134】

好適なプロモーター、ターミネーター、及びコード領域は、大腸菌－酵母シャトルベクター中にクローニングされて酵母細胞に形質転換されてよい。これらのベクターは、酵母及び大腸菌株の両方で菌株伝播を可能にする。典型的には、ベクターは、選択可能なマーカー、及び、各宿主における自己複製または染色体統合を可能にする配列を含む。酵母において典型的に使用されるプラスミドの例は、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、及びｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）である。これらのプラスミドは、酵母の２ミクロン複製起点、大腸菌複製起点（例えば、ｐＭＢ１）、及び選択可能なマーカーを含有する。

【0135】

様々な構成要素は、昆虫または昆虫細胞においても発現され得る。かかる細胞における使用に好適な発現制御配列は、当該分野において周知である。いくつかの態様において、発現制御配列が構成的プロモーターを含むことが望ましい。好適な強力なプロモーター例として、限定されないが、以下が挙げられる：ｐｉＯについてのバキュロウイルスプロモーター、ポリへドリン（ｐｏｌｈ）、ｐ６．９、カプシド、ＵＡＳ（Ｇａｌ４結合部位を含有する）、Ａｃ５、カテプシン様遺伝子、Ｂ．ｍｏｒｉアクチン遺伝子プロモーター；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ｈｓｐ７０、アクチン、α－１－チューブリンまたはユビキチン遺伝子プロモーター、ＲＳＶまたはＭＭＴＶプロモーター、コピアプロモーター、ジプシープロモーター、及びサイトメガロウイルスＩＥ遺伝子プロモーター。使用され得る弱いプロモーターの例として、限定されないが、以下が挙げられる：ｉｅｌ、ｉｅ２、ｉｅＯ、ｅｔｌ、３９Ｋ（ａｋａ ｐｐ３１）、及びｇｐ６４遺伝子のためのバキュロウイルスプロモーター。弱いプロモーターからの遺伝子発現の量を増加させることが望ましいとき、エンハンサーエレメント、例えば、バキュロウイルスエンハンサーエレメント、ｈｒ５が、プロモーターと併せて使用されてよい。

【0136】

昆虫における、本明細書に開示されている構成要素のいくつかの発現のために、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーターが当該分野において公知である。昆虫におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの保存されている特徴も公知である（例えば、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｇ．，（２００７）「Ｉｎｓｅｃｔ ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｅｖｏｌｖｅ ｒａｐｉｄｌｙ ｙｅｔ ｒｅｔａｉｎ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７ Ｊａｎ；３５（１）：２１－３４を参照されたい）。

【0137】

別の態様において、様々な構成要素が、哺乳類細胞における使用のための哺乳類ベクターに組み込まれる。本発明のシステムと共に使用されるのに好適な多数の哺乳類ベクターが市販されている（例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ；ＮｅｏＢｉｏｌａｂ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ；Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡから）。

【0138】

哺乳類ウイルスに由来するベクターはまた、哺乳類細胞において本方法の様々な構成要素を発現するのに使用され得る。これらとして、ウイルス、例えば、アデノウイルス、パポバウイルス、ヘルペルウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、牛痘及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のベクターが挙げられる（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，（２０００）「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １６，Ｉｓｓｕｅ ２，ｐｐ １５１－１６０；Ｃｏｏｒａｙ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１２）「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：２９－５７を参照されたい）。構成要素に動作可能に連結された調節配列には、アクチベーター結合配列、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、リプレッサー結合配列、ステムループ構造、翻訳開始配列、翻訳リーダー配列、転写終結配列、翻訳終結配列、プライマー結合部位などが含まれ得る。一般的に使用されているプロモーターは、構成的哺乳類プロモーターＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１（マウスまたはヒト）、Ｕｂｃ、ＣＡＧ、ＣａＭＫＩＩａ、及びベータ－Ａｃｔ、ならびに当該分野において公知であるもの（Ｋｈａｎ，Ｋ．Ｈ．（２０１３）「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ３（２）、２５７－２６３）である。さらに、ＨＩ及びＵ６を含めた、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが使用され得る。

【0139】

ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓）及びＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）を含めて多数の哺乳類細胞株が遺伝子産物の発現のために利用されてきた。これらの細胞株は、標準的方法（例えば、リン酸カルシウムもしくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の使用、またはエレクトロポレーション）によってトランスフェクトされ得る。他の典型的な哺乳類細胞株として、限定されないが：ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ、５４９、ＨＴ１０８０、ＣＡＤ、Ｐ１９、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ９２９、Ｎ２ａ、ヒト胎児腎臓２９３細胞、ＭＣＦ－７、Ｙ７９、ＳＯ－Ｒｂ５０、ＨｅｐＧ２、ＤＵＫＸ－Ｘ１１、Ｊ５５８Ｌ、及びベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞が挙げられる。ある特定の実施形態において、哺乳類細胞は、ＣＯＰ細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ－０細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＣ１２細胞、ＰＣ１２ｈ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ３細胞、ＣＯＳＴ細胞、ＣＶ１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＰＥＲ Ｃ６細胞、２倍体線維芽細胞由来の細胞、骨髄腫細胞、またはＨｅｐＧ２である。

【0140】

ポリヌクレオチド（例えば、発現ベクター）を宿主細胞に導入する方法は、当該分野において公知であり、宿主細胞の種類に基づいて典型的には選択される。かかる方法として、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、原形質融合、リポフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、直接微小注入、及びナノ粒子媒介送達が挙げられる。

【0141】

ＩＶ．核酸ガイドヌクレアーゼ
本明細書において使用されているとき、「核酸ガイドヌクレアーゼ」は、ヌクレアーゼと会合するガイド核酸（すなわち、ガイドＲＮＡもしくはｇＲＮＡ、ガイドＤＮＡもしくはｇＤＮＡ、またはガイドＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）と標的配列との間の相補性（全部または部分）に基づいた特異的な標的配列を対象とするヌクレアーゼを指す。特定の実施形態において、核酸ガイドヌクレアーゼは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼである。ガイドＲＮＡと標的配列との間の結合は、ヌクレアーゼを標的配列の近傍に補充する働きをする。現在開示されている組成物及び方法に好適な核酸ガイドヌクレアーゼの非限定例として、原核生物（例えば、細菌、古細菌）またはその変異体からの、天然の、クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）に関連する（Ｃａｓ）ポリペプチドが挙げられる。原核生物において見出されるＣＲＩＳＰＲ配列は、侵入するウイルスからのポリヌクレオチドのフラグメントに由来する配列であり、後の感染の際に同様のウイルスを認識し、ウイルスポリヌクレオチドを開裂するＲＮＡガイドヌクレアーゼとして機能するＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドを介してウイルスポリヌクレオチドを開裂するのに使用される。本明細書において使用されているとき、「ＣＲＩＳＰＲ関連ポリペプチド」または「Ｃａｓポリペプチド」は、天然ＣＲＩＳＰＲ系内のＣＲＩＳＰＲ配列の近位の範囲内で見出される天然ポリペプチドを指す。ある特定のＣａｓポリペプチドは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼとして機能する。

【0142】

少なくとも２つの天然ＣＲＩＳＰＲ系のクラス、クラス１及びクラス２が存在する。概して、現在開示されている組成物及び方法の核酸ガイドヌクレアーゼは、クラス２ ＣＲＩＳＰＲ系が核酸ガイドヌクレアーゼ活性を有する単一のポリペプチドを含むことを考慮してクラス２のＣａｓポリペプチドまたはその変異体であるが、一方で、クラス１ ＣＲＩＳＰＲ系は、ヌクレアーゼ活性のためのタンパク質の複合体を必要とする。少なくとも３つの公知のタイプのクラス２ ＣＲＩＳＰＲ系、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型が存在し、これらの中に、複数のサブタイプが存在する（他の定義されていないまたは推定のサブタイプの中でも、サブＩＩ型－Ａ、ＩＩ－Ｂ、ＩＩ－Ｃ、Ｖ－Ａ、Ｖ－Ｂ、Ｖ－Ｃ、ＶＩ－Ａ、ＶＩ－Ｂ、及びＶＩ－Ｃ）。概して、ＩＩ型及びＶ型－Ｂ系は、活性のために、ｃｒＲＮＡに加えてｔｒａｃｒＲＮＡを必要とする。対照的に、Ｖ型－Ａ及びＶＩ型は、活性のために、ｃｒＲＮＡのみを必要とする。全ての公知のＩＩ型及びＶ型ＲＮＡガイドヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを標的とする一方で、全ての公知のＶＩ型ＲＮＡガイドヌクレアーゼは一本鎖ＲＮＡを標的とする。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、本明細書及び文献においてＣａｓ９と称される。いくつかの実施形態において、現在開示されている組成物及び方法の核酸ガイドヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓ９タンパク質またはその変異体である。ＲＮＡガイドヌクレアーゼとして機能するＶ型Ｃａｓポリペプチドは、標的配列のターゲティング及び開裂のためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。本明細書及び文献において、ＶＡ型ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１と称され；ＶＢ型ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１と称され；ＶＣ型ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ＣまたはＣ２Ｃ３と称され；ＶＩＡ型ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ２またはＣａｓ１３Ａ１と称され；ＶＩＢ型ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３Ｂと称され；ＶＩＣ型ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３Ａ２と称される。ある特定の実施形態において、現在開示されている組成物及び方法の核酸ガイドヌクレアーゼは、ＶＡ型Ｃｐｆ１タンパク質またはその変異体である。核酸ガイドヌクレアーゼとして機能する、自然発生のＣａｓポリペプチド及びその変異体は、当該分野において公知であり、限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅ Ｃａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１、または、それぞれの全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１７） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５（３）：１６９－１８２；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １３（１１）：７２２－７３６；及び米国特許第９７９０４９０号に記載されているものが挙げられる。クラス２ Ｖ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとして、Ｃａｓ１２及びＣａｓ１２のサブタイプ、例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｆ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、及びＣａｓ１２ｉが挙げられる。Ｃａｓ１３を含めたクラス２ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＲＮＡ標的配列を開裂するために使用され得る。

【0143】

現在開示されている組成物及び方法の核酸ガイドヌクレアーゼは、天然核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅ Ｃａｓ９）またはその変異体であってよい。変異体の核酸ガイドヌクレアーゼは、操作されていてよく、または、例えば、ヌクレアーゼドメインのうちの１つ以上の活性を変更する、核酸ガイドヌクレアーゼを、修飾特性を付与する非相同ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン、後成的修飾ドメイン、検出可能な標識）に融合する、ヌクレアーゼの安定性を修飾する、もしくはヌクレアーゼの特異性を修飾するアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を含む自然発生の変異体であってよい。

【0144】

いくつかの実施形態において、核酸ガイドヌクレアーゼは、細胞内微環境における、標的部位への特異性、及び／または安定性を改良するために１つ以上の変異体を含む。例えば、タンパク質がＣａｓ９（例えば、ＳｐＣａｓ９）または修飾Ｃａｓ９であるとき、Ｒｅｃ２ドメインのＮ１７５～Ｒ３０７（包含）のいずれかまたは全ての残基を欠失させることが有益であり得る。より小さい、またはより低分子量のバージョンのヌクレアーゼがより効果的であることが見出され得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、天然バージョンのヌクレアーゼと比較して少なくとも１つの置換を含む。例えば、タンパク質がＣａｓ９または修飾Ｃａｓ９であるとき、Ｃ８０またはＣ５７４（インデルによって修飾されたタンパク質においては、そのホモログ）を変異させることが有益であり得る。Ｃａｓ９において、望ましい置換は、Ｃ８０Ａ、Ｃ８０Ｌ、Ｃ８０Ｉ、Ｃ８０Ｖ、Ｃ８０Ｋ、Ｃ５７４Ｅ、Ｃ５７４Ｄ、Ｃ５７４Ｎ、Ｃ５７４Ｑ（任意の組み合わせにおいて）のいずれか、特にＣ８０Ａを含んでいてよい。置換は、ヌクレアーゼの細胞内タンパク質の結合を低減する及び／または標的部位特異性を増加させるために含まれていてよい。付加的または代替的には、置換は、組成物の標的外の毒性を低減するために含まれていてよい。

【0145】

核酸ガイドヌクレアーゼは、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ））との会合を通して特定の標的配列に向けられる。核酸ガイドヌクレアーゼは、非共有結合的相互作用を介してガイド核酸に結合し、それにより、複合体を形成する。ポリヌクレオチドターゲティング核酸は、標的配列の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むことによって複合体への標的特異性を付与する。複合体の核酸ガイドヌクレアーゼまたはこれに融合もしくは他の場合にはコンジュゲートしたドメインもしくは標識は、部位特異的活性を付与する。すなわち、核酸ガイドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドターゲティングガイド核酸のタンパク質結合セグメントとの会合のおかげで、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、染色体核酸における標的配列；染色体外核酸、例えば、エピソーム核酸、ミニサークルにおける標的配列；ミトコンドリア核酸における標的配列；葉緑体核酸における標的配列；プラスミドにおける標的配列）にガイドされる。

【0146】

そのため、ガイド核酸は、２つのセグメント、「ポリヌクレオチドターゲティングセグメント」及び「ポリペプチド結合セグメント」を含む。「セグメント」は、分子のセグメント／セクション／領域（例えば、ＲＮＡにおけるヌクレオチドの連続ストレッチ）を意味する。セグメントはまた、セグメントが１を超える分子の領域を含み得るような複合体の領域／セクションを指すこともできる。例えば、いくつかの場合において、ポリヌクレオチドターゲティング核酸のポリペプチド結合セグメント（後述されている）は、唯１つの核酸分子を含み、ポリペプチド結合セグメントは、そのため、かかる核酸分子の領域を含む。他の場合において、ＤＮＡターゲティング核酸のポリペプチド結合セグメント（後述されている）は、相補性の領域と併せてハイブリダイズされた２つの別個の分子を含む。

【0147】

ポリヌクレオチドターゲティングセグメント（または「ポリヌクレオチドターゲティング配列」もしくは「ガイド配列」）は、標的配列内の特定の配列に相補的（完全にまたは部分的に）であるヌクレオチド配列（例えば、標的ＤＮＡ配列の相補鎖）を含む。ポリペプチド結合セグメント（または「ポリペプチド結合配列」）は、核酸ガイドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ）と相互作用する。概して、核酸ガイドヌクレアーゼによる標的ＤＮＡの部位特異的開裂または修飾は、（ｉ）核酸及び標的ＤＮＡのポリヌクレオチドターゲティング配列間の塩基対形成相補性；ならびに（ｉｉ）標的ＤＮＡにおけるショートモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とも称される）の両方によって決定される箇所において起こる。

【0148】

プロトスペーサー隣接モチーフは、異なる長さのものであってよく、標的配列からの可変距離であってよいが、ＰＡＭは、概して、標的配列から約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０ヌクレオチドを含めた、標的配列から約１～約１０ヌクレオチド内である。ＰＡＭは、標的配列の５’または３’であってよい。概して、ＰＡＭは、約３～４ヌクレオチドのコンセンサス配列であるが、特定の実施形態においては、２、３、４、５、６、７、８、９以上の長さのヌクレオチドである。所与のＲＮＡガイドヌクレアーゼに好ましいＰＡＭ配列またはコンセンサス配列を識別する方法は、当該分野において公知であり、限定されないが、それぞれ、全体が参照により組み込まれる、Ｋａｒｖｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １６：２５３によって記載されているＰＡＭ枯渇アッセイ、またはＰａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１（９）：８３９－４３に開示されているアッセイが挙げられる。

【0149】

本明細書に記載されている固有の識別核酸（ｕｉＮＡ）は、ガイド核酸配列を含む。ポリヌクレオチドターゲティング配列（すなわち、ガイド配列）は、目的の標的配列と直接ハイブリッドを形成するヌクレオチド配列である。ガイド配列は、目的の標的配列と完全にまたは部分的に相補性であるように操作される。様々な実施形態において、ガイド配列は、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、またはこれを超えるヌクレオチドを含み得る。例えば、ガイド配列は、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０以上の長さのヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、約１０～約２６の長さのヌクレオチド、または約１２～約３０の長さのヌクレオチドである。特定の実施形態において、ガイド配列は、約３０の長さのヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適な整列アルゴリズムを使用して最適に整列されているとき、約または約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を超える、またはそれ以上である。特定の実施形態において、ガイド配列は、二次構造を含まず、これは、限定されないが、ｍＦｏｌｄ（例えば、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（１９８１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：１３３－１４８を参照されたい）及びＲＮＡｆｏｌｄ（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４を参照されたい）を含めた、当該分野において公知の任意の好適なポリヌクレオチドの折り畳みアルゴリズムを使用して予測され得る。

【0150】

いくつかの実施形態において、ガイド核酸は、２つの別個の核酸分子（「アクチベーター－核酸」及び「ターゲッター－核酸」、以下を参照されたい）を含み、本明細書において「二重分子ガイド核酸」、または「２分子ガイド核酸」と称される。他の実施形態において、対象のガイド核酸は、単一の核酸分子（単一のポリヌクレオチド）であり、本明細書において「単分子ガイド核酸」、「単一の－ガイド核酸」、または「ｓｇＮＡ」と称される。用語「ガイド核酸」または「ｇＮＡ」は、包含的であり、二重分子ガイド核酸及び単分子ガイド核酸（すなわち、ｓｇＮＡｓ）の両方を指している。ガイド核酸がＲＮＡであるこれらの実施形態において、ｇＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡまたは単一の－ガイドＲＮＡであってよい。同様に、ガイド核酸がＤＮＡであるこれらの実施形態において、ｇＤＮＡは、二重分子ガイドＤＮＡまたは単一の－ガイドＤＮＡであってよい。

【0151】

例示的な２分子ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッター－ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「ｔｒａｎｓ－アクチンＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーター－ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡ様分子（ターゲッター－ＲＮＡ）は、ガイドＲＮＡのポリヌクレオチドターゲティングセグメント（一本鎖）、及び、ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメントのｄｓＲＮＡデュプレックスの半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（「デュプレックス形成セグメント」）の両方を含み、本明細書においてＣＲＩＳＰＲリピート配列とも称される。

【0152】

用語「アクチベーター－核酸」または「アクチベーター－ＮＡ」は、二重分子ガイド核酸のｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を意味するように本明細書において使用されている。用語「ターゲッター－核酸」または「ターゲッター－ＮＡ」は、二重分子ガイド核酸のｃｒＲＮＡ様分子を意味するように本明細書において使用されている。用語「デュプレックス形成セグメント」は、対応するアクチベーター－ＮＡまたはターゲッター－ＮＡ分子のヌクレオチドのストレッチをハイブリダイズすることによってｄｓＲＮＡデュプレックスの形成に貢献するアクチベーター－ＮＡまたはターゲッター－ＮＡのヌクレオチドのストレッチを意味するように本明細書において使用されている。すなわち、アクチベーター－ＮＡは、対応するターゲッター－ＮＡのデュプレックス形成セグメントに相補的であるデュプレックス形成セグメントを含む。そのため、アクチベーター－ＮＡは、デュプレックス形成セグメントを含むが、ターゲッター－ＮＡは、デュプレックス形成セグメント及びガイド核酸のＤＮＡターゲティングセグメントの両方を含む。ゆえに、対象の二重分子ガイド核酸は、任意の対応するアクチベーター－ＮＡ及びターゲッター－ＮＡ対から構成され得る。

【0153】

アクチベーター－ＮＡは、アクチベーター－ＮＡ（ガイド核酸のポリペプチド結合セグメントの他の部分）にハイブリダイズするのに充分な相補性を有する領域を含むヌクレオチド配列を含むＣＲＩＳＰＲリピート配列を含む。様々な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、またはこれを超えるヌクレオチドを含み得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０以上の長さのヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列と、その対応するｔｒａｃｒ配列のアンチリピート領域との相補性の程度は、好適な整列アルゴリズムを使用して最適に整列されているとき、約または約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を超える、またはそれ以上である。

【0154】

対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（すなわち、アクチベーター－ＮＡ）は、ガイド核酸のポリペプチド結合セグメントの二本鎖デュプレックスの他の部分を形成するヌクレオチド（デュプレックス形成セグメント）のストレッチを含む。すなわち、ｃｒＲＮＡ様分子（すなわち、ＣＲＩＳＰＲリピート配列）のヌクレオチドのストレッチは、ガイド核酸のポリペプチド結合ドメインの二本鎖デュプレックスを形成するためのｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（すなわち、アンチリピート配列）のヌクレオチドのストレッチと相補的であり、これとハイブリダイズする。ｃｒＲＮＡ様分子は、一本鎖ＤＮＡターゲティングセグメントをさらに提供する。そのため、ｃｒＲＮＡ様及びｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（対応する対として）は、ハイブリダイズしてガイド核酸を形成する。所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＣＲＩＳＰＲ系、及びＲＮＡ分子が見出される種を特徴とする。対象の二重分子ガイドＲＮＡは、任意の対応するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ対を含み得る。

【0155】

トランス活性化様ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（本明細書において「アクチベーター－ＮＡ」とも称される）は、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズするのに充分な相補性を有する領域を含むヌクレオチド配列を含み、本明細書においてアンチリピート領域と称される。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は、二次構造（例えば、ステムループ）を有する領域をさらに含み、またはその対応するｃｒＲＮＡとハイブリダイズする際に二次構造を形成する。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列に完全にまたは部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ様分子の領域は、分子の５’端にあり、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子の３’端は二次構造を含む。二次構造のこの領域は、ネクサスヘアピンを含めたいくつかのヘアピン構造を概して含み、アンチリピート配列に隣接することが分かっている。ネクサスヘアピンは、多くの場合、ヘアピンステムのベースに保存ヌクレオチド配列を有し、モチーフＵＮＡＮＮＣが、ｔｒａｃｒＲＮＡにおける多くのネクサスヘアピンにおいて見出される。構造及び数が変動し得るが、ＧＣ－リッチＲｈｏ－依存性転写ターミネーターヘアピン、続いて３’端におけるＵのストリングを含み得る、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’端において末端ヘアピンが存在する場合が多い。例えば、Ｂｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６：３３３－３３９，Ｂｒｉｎｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ（２０１６） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｔｏｐ０９０９０２、及び米国特許出願公開公報第２０１７／０２７５６４８号を参照されたい、これらは、それぞれ、全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0156】

様々な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列に完全にまたは部分的に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ様分子のアンチリピート領域は、約８ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、またはこれを超えるヌクレオチドを含む。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ様アンチリピート配列とＣＲＩＳＰＲリピート配列との間の塩基対形成の領域は、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０以上の長さのヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とその対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様アンチリピート配列との間の相補性の程度は、好適な整列アルゴリズムを使用して最適に整列されているとき、約または約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％を超える、またはそれ以上である。

【0157】

様々な実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子全体は、約６０ヌクレオチド～約１４０超のヌクレオチドを含み得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０以上の長さのヌクレオチドであってよい。特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、及び約１００の長さのヌクレオチドを含めた約８０～約１００の長さのヌクレオチドである。

【0158】

対象の単分子ガイド核酸（すなわち、ｓｇＮＡ）は、互いに相補的であるヌクレオチド（ターゲッター－ＮＡ及びアクチベーター－ＮＡ）の２つのストレッチを含み、介在するヌクレオチド（「リンカー」または「リンカーヌクレオチド」）によって共有結合的に連結されており、ハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントの二本鎖核酸デュプレックスを形成することにより、ステムループ構造を結果として生じさせる。ターゲッター－ＮＡ及びアクチベーター－ＮＡは、ターゲッター－ＮＡの３’端及びアクチベーター－ＮＡの５’端を介して共有結合的に連結され得る。代替的には、ターゲッター－ＮＡ及びアクチベーター－ＮＡは、ターゲッター－ＮＡの５’端及びアクチベーター－ＮＡの３’端を介して共有結合的に連結され得る。

【0159】

単分子ＤＮＡターゲティング核酸のリンカーは、約３ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、リンカーは、限定されないが約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０以上のヌクレオチドを含めた、約３ヌクレオチド（ｎｔ）～約９０ｎｔ、約３ｎｔ～約８０ｎｔ、約３ｎｔ～約７０ｎｔ、約３ｎｔ～約６０ｎｔ、約３ｎｔ～約５０ｎｔ、約３ｎｔ～約４０ｎｔ、約３ｎｔ～約３０ｎｔ、約３ｎｔ～約２０ｎｔまたは約３ｎｔ～約１０ｎｔの長さを有し得る。いくつかの実施形態において、単分子ＤＮＡターゲティング核酸のリンカーは、４ｎｔである。

【0160】

例示的な単分子ＤＮＡターゲティング核酸は、ハイブリダイズして二本鎖デュプレックスを形成するヌクレオチドの２つの相補的ストレッチを、特定の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と併せて含む。

【0161】

適切な天然の同系ｃｒＲＮＡ対（及び、いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、発見されている核酸ガイドヌクレアーゼとして機能する大部分のＣａｓタンパク質について公知であり、または、核酸ガイドヌクレアーゼ活性を有する特定の天然Ｃａｓタンパク質について、Ｃａｓ核酸ガイドヌクレアーゼタンパク質のフランキング配列をシーケンシング及び分析して、公知のアンチリピート－コード配列またはその変異体に関して調査することによってｔｒａｃｒＲＮＡ－コード配列、及び、これによりｔｒａｃｒＲＮＡ配列を識別することにより、決定され得る。ｔｒａｃｒＲＮＡのアンチリピート領域は、ｄｓタンパク質結合デュプレックスの半分を含む。ｄｓタンパク質結合デュプレックスの半分を含む相補的リピート配列は、ＣＲＩＳＰＲリピートと呼ばれる。公知のＣＲＩＳＰＲ核酸ガイドヌクレアーゼによって利用されるＣＲＩＳＰＲリピート及びアンチリピート配列は、当該分野において公知であり、例えば、世界のウェブｃｒｉｓｐｒ．ｉ２ｂｃ．ｐａｒｉｓ－ｓａｃｌａｙ．ｆｒ／ｃｒｉｓｐｒ／におけるＣＲＩＳＰＲデータベースにおいて見出され得る。

【0162】

単一のガイド核酸または二重－ガイド核酸は、化学的にまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を介して合成され得る。核酸ガイドヌクレアーゼとガイド核酸との間の配列特異的結合を決定するためのアッセイは、当該分野において公知であり、限定されないが、発現した核酸ガイドヌクレアーゼと、検出可能な標識（例えば、ビオチン）によってタグ化され得、また、核タンパク質複合体が検出可能な標識を介して（例えば、ストレプトアビジンビーズによって）が捕捉されるプルダウン検出アッセイにおいて使用され得るガイド核酸との間のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを含む。ガイド核酸に関係しない配列または構造を有する対照ガイド核酸は、核酸への核酸ガイドヌクレアーゼの非特異的結合について陰性対照として使用され得る。

【0163】

ガイド核酸に加えて、ｕｉＮＡは、固有の配列識別子またはバーコードを含む。配列識別子は、ガイド核酸を固有に識別するいずれの核酸配列であってもよく、バルク合成ポリヌクレオチドバーコード、ランダム合成バーコード配列、マイクロアレイベースのバーコード合成、ネイティブヌクレオチド、Ｎ－マー、ランダムＮ－マー、擬ランダムＮ－マー、またはこれらの組み合わせによる部分的補完を含めた様々な異なるフォーマットから生じてよい。いくつかの実施形態において、配列識別子は、非自然発生の配列であってよい。配列識別子は、例えば、１０未満、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８８、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、または２００を超えるヌクレオチドを含み得る。さらに、配列識別子は、ガイド核酸のいずれの箇所に位置していても、ガイド核酸に隣接していてもよい（例えば、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡにあっても、もしくはこれに隣接していても、または、単一のガイドＲＮＡにおけるｃｒＲＮＡ／ｔｒＲＮＡ間のテトラループにあってもよい）。いくつかの場合において、固有の識別子は、ランダム化されたガイド核酸である。かかる実施形態において、ランダム化されたガイド配列は、標的配列とハイブリダイズすることが可能でないが核酸ガイドヌクレアーゼと依然として安定して会合し得るものであってよい。他の実施形態において、ガイド核酸は、相補的核酸配列とハイブリダイズする能力を保持する。

【0164】

ｕｉＮＡは、さらなる配列セグメントを含んでいてもよい。かかるさらなる配列セグメントは、機能的配列、例えば、プライマー配列、プライマーアニーリング部位配列、固定化配列、または後の処理に有用な他の認識もしくは結合配列、例えば、ｕｉＮＡオリゴヌクレオチドが付着するサンプルのシーケンシングに使用されるシーケンシングプライマーもしくはプライマー結合部位を含んでいてよい。

【0165】

ある特定の実施形態において、現在開示されている組成物及び方法の核酸ガイドヌクレアーゼは、ニッカーゼとして機能するヌクレアーゼ変異体を含み、ヌクレアーゼは、二本鎖核酸分子の一本鎖を開裂することのみが可能であるヌクレアーゼを結果として生じさせまたはヌクレアーゼ活性を完全に欠失している（すなわち、ヌクレアーゼ不活性型）野生型ヌクレアーゼと比較して変異を含む。

【0166】

ニッカーゼとして機能するヌクレアーゼ、例えば、核酸ガイドヌクレアーゼは、単一の機能のヌクレアーゼドメインを含むだけである。これらの実施形態のいくつかにおいて、さらなるヌクレアーゼドメインは、この特定のドメインのヌクレアーゼ活性が低減または排除されるように変異されている。

【0167】

他の実施形態において、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ）は、ヌクレアーゼ活性を完全に欠失しており、本明細書においてヌクレアーゼ不活性型と称される。これらの実施形態のいくつかにおいて、ヌクレアーゼ内の全てのヌクレアーゼドメインは、ポリペプチドの全てのヌクレアーゼ活性が排除されるように変異されている。核酸ガイドヌクレアーゼの１つ以上のヌクレアーゼドメインに変異を導入するために、それぞれ、全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開公報第２０１４／００６８７９７号及び米国特許第９，７９０，４９０号に記載されているものを含め、当該分野において公知のいずれの方法が使用されてもよい。

【0168】

ニッカーゼ活性を有する核酸ガイドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ不活性型核酸ガイドヌクレアーゼを生じさせるために、ヌクレアーゼ活性を低減または排除するヌクレアーゼドメイン内のいずれの変異体が使用されてもよい。かかる変異体は、当該分野において公知であり、限定されないが、ＲｕｖＣドメイン内のＤ１０Ａ変異体、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅ Ｃａｓ９のＨＮＨドメイン内もしくはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅ Ｃａｓ９と最大の相同性で整列されたとき別の核酸ガイドヌクレアーゼ内の同様に位置（複数可）におけるＨ８４０Ａ変異体を含む。変異してニッカーゼまたはヌクレアーゼ不活性型タンパク質を生じさせ得るＳ．ｐｙｏｇｅｎｅ Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の位置として、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、及びＤ９８６が挙げられる。ニッカーゼまたはヌクレアーゼ不活性型タンパク質を生じ得る核酸ガイドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメイン内の他の変異体として、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１タンパク質の、または、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃｐｆ１タンパク質と最大の相同性で整列されたとき別の核酸ガイドヌクレアーゼ内の同様に位置（複数可）における、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｎ１２５７Ａ、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｅ１０２８Ａ、Ｄ１２２７Ａ、Ｄ１２５５Ａ、及びＮ１２５７Ａが挙げられる（全体が参照により組み込まれる、米国特許第９，７９０，４９０号）。

【0169】

ヌクレアーゼ不活性型ドメインを含む核酸ガイドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドを修飾することが可能であるドメインをさらに含み得る。ヌクレアーゼ不活性型ドメインに融合され得る修飾ドメインの非限定例として、限定されないが、転写活性化または抑制ドメイン、塩基編集ドメイン、及び後成的修飾ドメインが挙げられる。他の実施形態において、ヌクレアーゼ不活性型ドメインを含む核酸ガイドヌクレアーゼは、標的配列の存在の検出を助け得る検出可能な標識をさらに含む。

【0170】

ヌクレアーゼ不活性型ドメインに融合され得る後成的修飾ドメインは、ＤＮＡまたはヒストンタンパク質を共有結合的に修飾して、ＤＮＡ配列自体を変更することなくヒストン構造及び／または染色体構造を変更し、これにより遺伝子発現の変化（上方調節または下方調節）を引き起こす役割をし得る。核酸ガイドヌクレアーゼによって誘発され得る後成的修飾の非限定例として、ヒストン残基の以下の変更及びその逆反応：ｓｕｍｏ化、アルギニンまたはリシン残基のメチル化、リシン残基アセチル化またはユビキチン化、セリン及び／またはトレオニン残基のリン酸化；ならびにＤＮＡの以下の変更及びその逆反応：シトシン残基のメチル化またはヒドロキシメチル化が挙げられる。そのため、後成的修飾ドメインの非限定例として、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストン脱アセチル化ドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデメチラーゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメイン、及びＤＮＡデメチラーゼドメインが挙げられる。

【0171】

いくつかの実施形態において、核酸ガイドヌクレアーゼは、転写制御要素及び／または転写調節タンパク質、例えば、転写因子またはＲＮＡポリメラーゼとの相互作用を通して少なくとも１つの隣接遺伝子の転写を活性化する転写活性化ドメインを含む。好適な転写活性化ドメインは、当該分野において公知であり、限定されないが、ＶＰ１６活性化ドメインを含む。

【0172】

他の実施形態において、核酸ガイドヌクレアーゼは、転写制御要素及び／または転写調節タンパク質、例えば、転写因子またはＲＮＡポリメラーゼとも相互作用して、少なくとも１つの隣接遺伝子の転写を低減または終端させることもできる、転写リプレッサードメインを含む。好適な転写抑制ドメインは、当該分野において公知であり、限定されないが、ＩκＢ及びＫＲＡＢドメインを含む。

【0173】

さらに他の実施形態において、ヌクレアーゼ不活性型ドメインを含む核酸ガイドヌクレアーゼは、疾患関連配列である場合がある標的配列の存在の検出を助け得る検出可能な標識をさらに含む。検出可能な標識は、可視化または他の場合には観察することができる分子である。検出可能な標識は、融合タンパク質（例えば、蛍光タンパク質）としての核酸ガイドヌクレアーゼに融合され得、または視覚的にもしくは他の手段によって検出され得るヌクレアーゼポリペプチドにコンジュゲートした小分子であってよい。融合タンパク質として現在開示されている核酸ガイドヌクレアーゼに融合され得る検出可能な標識として、限定されないが、特定の抗体によって検出され得る蛍光タンパク質またはタンパク質ドメインを含めた、任意の検出可能なタンパク質ドメインが挙げられる。蛍光タンパク質の非限定例として、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）及び黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）が挙げられる。小分子の検出可能な標識の非限定例として、放射性標識、例えば、^３Ｈ及び^３５Ｓが挙げられる。

【0174】

核酸ガイドヌクレアーゼは、そのガイド核酸に結合した核酸ガイドヌクレアーゼを含む核タンパク質複合体として細胞に融合タンパク質（例えば、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ融合タンパク質）の部分として送達され得る。代替的には、核酸ガイドヌクレアーゼは、融合タンパク質として送達され、ガイド核酸は、別個に提供される。ある特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ分子として標的細胞に導入され得る。ガイドＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されても化学的に合成されてもよい。他の実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、細胞に導入される。これらの実施形態のいくつかにおいて、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、ネイティブプロモーターであっても、ガイドＲＮＡコードヌクレオチド配列と非相同であってもよい、プロモーター（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター）に動作可能に連結されている。特定の実施形態において、プロモーターに動作可能に連結されているガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドヌクレアーゼをコードする核酸配列は、ベクター、例えば、本明細書において詳細に記載されている発現ベクターにおいて送達され得る。

【0175】

ある特定の実施形態において、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質は、さらなるアミノ酸配列、例えば、少なくとも１つの核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。核局在配列は、細胞の核への核酸ガイドヌクレアーゼの輸送を向上させる。核に輸送されたタンパク質は、リシン及びアルギニン残基に概して最も良好に結合する、核孔複合体内のタンパク質、例えば、インポーチン／カリオフェリンタンパク質の１つ以上に結合する。核局在化のための最も良好に特徴付けられた経路は、インポーチン－αタンパク質に結合する短いペプチド配列を含む。これらの核局在化配列は、多くの場合、塩基性アミノ酸のストレッチを含み、２つのかかる結合部位がインポーチン－αに存在すると仮定して、少なくとも１０個のアミノ酸によって分離される２つの塩基性配列が、二分されたＮＬＳを構成し得る。核の輸送に関して二番目に良好に特徴付けられた経路は、それぞれインポーチン－β１に結合する、配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２３）及びＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲ（配列番号２４）を使用する、インポーチン－β１タンパク質、例えば、ＨＩＶ－ＴＡＴ及びＨＩＶ－ＲＥＶタンパク質に結合するタンパク質を含む。他の核局在化配列は、当該分野において公知である（例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００７） ２８２：５１０１－５１０５を参照されたい）。ＮＬＳは、核酸ガイドヌクレアーゼの天然ＮＬＳであっても、非相同ＮＬＳであってもよい。本明細書において使用されているとき、配列に関連して「非相同」は、外来種が起源である配列であり、または、同じ種からであるときには、意図的な人間の介在により組成及び／またはゲノム遺伝子座がそのネイティブ形態から実質的に修飾されている。核酸ガイドヌクレアーゼまたは核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質の核局在化を向上させるのに使用され得るＮＬＳ配列の非限定例として、ＳＶ４０ Ｌａｒｇｅ Ｔ－抗原及びｃ－ＭｙｃのＮＬＳが挙げられる。ある特定の実施形態において、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２５）を含む。

【0176】

核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質は、１を超えるＮＬＳを超える、例えば、２、３、４、５、６つ、またはそれを超えるＮＬＳ配列を含み得る。複数のＮＬＳは、それぞれ、配列において固有であり得、または、１を超える同じＮＬＳ配列が使用され得る。ＮＬＳは、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）端部、カルボキシ末端（Ｃ末端）端部、または融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方の端部にあり得る。ある特定の実施形態において、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質は、そのＮ末端端部に２つのＮＬＳ配列を含む。他の実施形態において、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質は、部位特異的ポリペプチドのＣ末端端部に２つのＮＬＳ配列を含む。さらに他の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、そのＮ末端端部に４つのＮＬＳ配列及びそのＣ末端端部に２つのＮＬＳ配列を含む。

【0177】

いくつかの実施形態において、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質は、エピトープタグを含み得る。例えば、エピトープタグは、ポリ－ヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ（配列番号２２）またはドデカヒスチジン（配列番号２６）、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグまたはＶ５タグであってよい。特定の実施形態において、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質は、５’～３’ヘキサヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ）（配列番号２２）、試験タンパク質（例えば、ＣＰＰ、またはその変異体）、Ｃａｓ９、及び２ｘＮＬＳを含む。

【0178】

ある特定の実施形態において、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質は、試験タンパク質、またはその変異体を含む。試験タンパク質は、本明細書に記載されている方法及び組成物を使用して試験される、いずれのタンパク質、またはその変異体であってもよい。

【0179】

いくつかの実施形態において、試験タンパク質は、細胞の原形質膜を通して、連結されたタンパク質またはペプチドの吸収を誘発する、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）である。概して、ＣＰＰは、それらの全体形状、及び、膜貫通孔に自己アセンブルする傾向、または、次いで内部移行を活性化する、膜の湾曲を誘発する負に帯電したリン脂質外膜と相互作用する、いくつかの正に帯電した残基を有すること傾向のいずれかに起因して、細胞に入ることを誘発する。例示的な透過性ペプチドとして、限定されないが、トランスポータン、ＰＥＰ１、ＭＰＧ、ｐ－ＶＥＣ、ＭＡＰ、ＣＡＤＹ、ｐｏｌｙＲ、ＨＩＶ－ＴＡＴ、ＨＩＶ－ＲＥＶ、ペネトラチン、Ｒ６Ｗ３、Ｐ２２Ｎ、ＤＰＶ３、ＤＰＶ６、Ｋ－ＦＧＦ、及びＣ１０５Ｙが挙げられ、それぞれ、全体が参照により本明細書に組み込まれる、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ａｎｄ Ｄｏｗｄｙ（２０１１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：８８８－８９３及びＦａｒｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４） Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ５７：７８－９４にレビューされている。

【0180】

ＮＬＳと併せてまたはその代替として、核酸ガイドヌクレアーゼ融合タンパク質は、さらなる非相同アミノ酸配列、例えば、本明細書のいずれかの箇所に記載されている検出可能な標識（例えば、蛍光タンパク質）、または精製タグを含んで、融合タンパク質を形成し得る。精製タグは、タンパク質または融合タンパク質を混合物（例えば、生物サンプル、培地）から単離するのに利用され得る任意の分子である。精製タグの非限定例として、ビオチン、ｍｙｃ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、及びグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。

【実施例】

【0181】

本発明は、以下の例を参照することにより、より完全に理解される。これらは、しかし、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。全ての文献及び特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0182】

実施例１－ＣＰＰ－Ｃａｓ９ライブラリの高スループットクローニング
実施例１～４は、Ｃａｓ９の内部移行を効果的に容易にする細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）のための異なる試験ＣＰＰを含むＣａｓ９－融合タンパク質のプールを迅速に評価するように設計されたスクリーニングに関する。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む複数の固有の識別ＲＮＡ（ｕｉＲＮＡ）及び３０００を超える異なる試験ＣＰＰをコードするポリヌクレオチドのライブラリを、Ｃａｓ９をコードするベクターライブラリにコンビナトリアルアセンブルした。ＣＰＰがＣａｓ９に動作可能に連結されるようにベクターをアセンブルした。ベクターをシーケンシングすることにより、各ベクターにおけるｕｉＲＮＡ及び試験ＣＰＰを識別し、これにより、後の工程においてｕｉＲＮＡの存在に基づいてＣＰＰ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質を識別するのに使用され得る会合したｕｉＲＮＡ及び試験ＣＰＰの対のリファレンスを提供した。

【0183】

プラスミドライブラリを大腸菌に形質転換し、ここで、ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物及びｕｉＲＮＡのコンパートメント化された発現は、ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ（すなわち、単一のライブラリベクターにおいて対であるとして先に確立されているｕｉＲＮＡ及びＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物を含む）の形成を可能にした。ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物を細菌細胞から単離して、ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのプールを生じさせた。プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰを、次いで、標的細胞による共インキュベーションによって細胞ターゲティングに関して評価した。共インキュベーション後、核分画を標的細胞において実施し、ＲＮＡを核抽出物から単離してシーケンシングした。単離した核ＲＮＡにおいて識別したｕｉＲＮＡを使用して、Ｃａｓ９の細胞取り込みを効果的に容易にする候補ＣＰＰを識別した。このスクリーニングの全体のワークフローをまとめるフローチャートを図１に示す。

【0184】

まず、ベクターライブラリをコンビナトリアルアセンブルするために、ＮＬＳ及びＣＰＰペプチドに関する既存のデータベースからコンピュータで識別されたおよそ３２００の固有の試験ＣＰＰのライブラリからランダムに選択された試験ＣＰＰに動作可能に連結されたｕｉＲＮＡカセット及びＣａｓ９ホモログを含むモジュールプラスミドを構築した。具体的な試験タンパク質は、目的の任意の試験タンパク質と容易に取り替えることができる。同様に、Ｃａｓ９ホモログは、目的の任意の他の核酸ガイドヌクレアーゼと容易に交換することができる。構築物のｓｇＲＮＡカセットは、Ｔ７プロモーター、ｓｇＲＮＡ（ランダムバーコードを有するまたは有さない）、３’ＨＤＶリボザイム、及び３’ＲＲＮＢターミネーターを含んだ。ＣＰＰコードヌクレオチドに連結されたｕｉＲＮＡをコードする核酸の例示的なマップを図２Ａに示す。プラスミドは、ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物の精製を助けるＨｉｓ６タグ（配列番号２２）、ＨＲＶ ３ｃプロテアーゼ部位、及びＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）をコードするポリヌクレオチドのＮ末端におけるＣＰＰの挿入のためのモジュール部位をさらにコードした。

【0185】

プラスミドの各構成要素をプラスミドアセンブリの前にＰＣＲ増幅によって調製した。ベクター骨格及びＣａｓ９（Ｃ８０Ａ）を、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。異なるＣＰＰをコードするオリゴヌクレオチドのプールを設計するために、ＣＰＰのライブラリからの各試験ＣＰＰをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで逆翻訳及びコドン最適化し、ＤＮＡヘアピンを除去し、プライマー結合部位を添加し、合成オリゴ類を各ＣＰＰにおいて順序づけた。ＣＰＰコードオリゴヌクレオチドプールを次いでＰＣＲ増幅し、発現ベクターに挿入した。ｇＢｌｏｃｋｓまたはｕｌｔｒａｍｅｒの合成ＤＮＡから調製したｕｉＲＮＡブロック（プロモーター、可変ｓｇＲＮＡ部分、ＨＤＶ、及びＲＲＮＢターミネーターを含む）をＰＣＲ増幅した。全てのＰＣＲ増幅をＱ５ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ）によって５０ｕｌの体積で実施し、３５サイクル行った。全てのＰＣＲ反応は、６０℃のアニーリング温度によって１μＭのプライマー濃度を有しており、プライマーを１５秒間アニーリングした。Ｃａｓ９ ＰＣＲ増幅（７２℃で３分）及びベクター骨格（７２℃で５分）を除いて全ての構築物について７２℃で１分間、伸長を実施した。ＰＣＲ増幅後、全ての産物をＺｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ及びＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅキットによって精製しゲル電気泳動によってアガロースゲルにおいて産物を可視化することによって検証した。

【0186】

次に、ＣＰＰコードオリゴヌクレオチドプール、ｕｉＲＮＡブロック、及びプロモーターカセットをオーバーラップ伸長ＰＣＲによってアセンブルした。２５０ｎｇの各インサートを５０μｌのＱ５ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ反応において混合した。反応を、次いで、標準の温度及び時間（６０℃のアニーリングを１５秒、７２℃で１分）に従って、プライマーを付加することなく熱サイクルに供し、次いでＺｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ及びＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅキットを使用して精製した。

【0187】

Ｃａｓ９（Ｃ８０Ａ）をコードするポリヌクレオチドカセットを、次いで、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングを可能にするＰＣＲプライマーを使用して増幅した。次に、発現ベクターを、２．５μｇのＣａｓ９（Ｃ８０）ＰＣＲ産物を２．５μｇのベクターＰＣＲ産物及び５００ｎｇのオーバーラップ伸長インサートと混合することによってアセンブルし、Ｓａｐ ＩのＩＩ型Ｓ制限酵素及びＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して標準Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅクローニングによってアセンブルした。アセンブルした構築したものを、製造のプロトコルに従って、クローニング大腸菌株（Ｔｏｐ１０またはＮｅｂＴｕｒｂｏ）に電気－形質転換した。およそ５０００の大腸菌 形質転換細胞のライブラリからのコロニーを含有する例示的な寒天プレートを図２Ｂに示す。プラスミドライブラリを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ－ｐｒｅｐキットを使用して形質転換細胞から採取した。単離したプラスミドライブラリ（２つの複製）のゲル電気泳動分析の結果を図２Ｃに提供する。プラスミドライブラリを実施例２に概説するようにさらに評価した。

【0188】

実施例２－ＣＰＰ－Ｃａｓ９ライブラリのｇＲＮＡ／ＣＰＰマッピング
実施例１に概説されているように調製した、ｕｉＲＮＡ及びＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物をコードするプラスミドライブラリを、次いで、以下のワークフローに従ってＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにおいて次世代シーケンシング（ＮＳＧ）用に調製した。

【0189】

ＰＣＲバイアスに関して制御する、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を、プラスミドライブラリの２－サイクルＰＣＲ増幅によって添加した。ＵＭＩプライマー（１μＭ）を５０μｌのＱ５ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘにおいてプライマープール（１０ｎｇプラスミド；約１０^－９分子）と混合した。混合物を、次いで、標準プロトコルに従って２サイクルにわたって熱サイクルに供した。１μＬ ＥｘｏＩを反応に添加して過剰のプライマーを分解した。ＥｘｏＩを、次いで、サンプルを８０℃でインキュベートすることによって熱不活化した。

【0190】

指数関数的ＰＣＲ増幅を実施して、標準的な製造者プロトコル（６５℃のアニーリング温度）を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングアダプタを付加した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、１５０サイクルキットによるＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑｕｅｎｃｅｒにおいてシーケンシングした。

【0191】

プールされたプラスミドデータをカスタムスクリプトによって分析した。読み取りを、ＵＭＩ、バーコード化されたｕｉＲＮＡ、及びＣａｓ９ ＣＰＰ融合に基づいて様々なフィールドに分割した。ＰＣＲバイアスを占めるＵＭＩをカウントして、二重ＵＭＩによる読み取りを廃棄した。

【0192】

ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物を、次いで、Ｂｏｗｔｉｅ２アライナーを使用してＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物をＣＰＰコードオリゴヌクレオチドに整列させることによって、特定のバーコード化されたｕｉＲＮＡに割り当てた。ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物を各ｕｉＲＮＡバーコードに関連付けるマップを、アライメント及びｕｉＲＮＡフィールドを解析することによって構築した。各ｕｉＲＮＡを各ベクターにおいて識別された特定のＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物にマッピングする表を作成した。

【0193】

複製間のプラスミド－ｓｅｑＵＭＩカウントを比較しているデータは、図３Ａに示されている通り、再現可能であった。ＣＰＰコードオリゴヌクレオチドの最初のプールにおける最初の３４００（約５８％カバレッジ）のうちの２０００の試験ＣＰＰをベクターライブラリにおいて観察した。図３Ｂは、各ランからのＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物に関するライブラリカバレッジ分布をグラフにより示し、異なるＣＰＰ－融合物の相対存在度がバイアスをかけられたことを示している。潜在的なプラスミド不均一性源を識別するために、Ｃａｓ９－ＣＰＰ融合物当たりのＵＭＩカウントの数、Ｃａｓ９－ＣＰＰ融合物当たりのガイドの数、及びｕｉＲＮＡ当たりのＵＭＩの数を評価した。

【0194】

図４Ａは、２つのライブラリ複製に関してのＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物当たりのプラスミドＵＭＩの数をグラフにより示し、大腸菌におけるライブラリバイアスまたはクローニングバイアスを示唆している（例えば、コピー数または成長率の差による）。大部分の変異体は変異体当たりほとんどＵＭＩを有していないが、少数の変異体は、多数のＵＭＩを有する。このことは、プラスミドプールにおいて過剰発現された少数の変異体（すなわち、異なるＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物）が存在することを示唆している。

【0195】

図４Ｂは、ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物当たりのｓｇＲＮＡバーコード（すなわち、ｕｉＲＮＡ）の数をグラフにより示し、ライブラリアセンブリバイアスを示唆している（例えば、ＰＣＲまたはオーバーラップアセンブリ工程の期間中）。大部分の変異体（すなわち、異なるＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物）は、少しの違ったｓｇＲＮＡバーコードを有するが、少しの変異体は、これに会合するいくつかの違ったｓｇＲＮＡバーコードを有する。このことは、図４Ａに示すバイアスの根本原因が、ランダム化されたｓｇＲＮＡバーコードがＣａｓ９ベクターにライゲーションされる前に起こったことを暗示している。これについての大まかな結論は、異なるＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物をコードする基礎のオリゴプールを初めに非対称にしたことである。

【0196】

図４Ｃは、ｓｇＲＮＡバーコード（すなわち、ｕｉＲＮＡ）当たりのＵＭＩの数をグラフにより示し、シーケンシングバイアスを示唆している。シーケンシングライブラリを、ＰＣＲバイアスを占めるのに使用される固有の分子識別子（ＵＭＩ）によって作成した。これらの結果は、ＰＣＲバイアスが有意でないこと（ｌｏｇスケールｙ軸に注意されたい）、これで占められていることを示した。このことは、図４Ａ及び図４Ｂの考察をより定量的にする。

【0197】

まとめると、これらの結果は、モジュール式の高スループットクローニングストラテジーが機能し、実施例３及び実施例４にさらに概説されているように、精製及び評価され得る異なるＣａｓ９－ＣＰＰ融合物のライブラリをコードするプラスミドライブラリの作成を可能にすることを示している。

【0198】

実施例３－ライブラリからの候補ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰの精製
次に、プラスミドライブラリを大腸菌に形質転換し、ここで、ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物及びｕｉＲＮＡのコンパートメント化された発現は、ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ（すなわち、単一のライブラリベクターにおいて対であるとして先に確立されているｕｉＲＮＡ及びＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物を含む）の形成を可能にした。ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物の発現をＴ５／ｌａｃ誘導性プロモーターによって駆動し、ｕｉＲＮＡ発現をＴ７プロモーターによって駆動した。ＢＬ２１ＤＥ細胞において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現もまたｌａｃ誘導性である。ゆえに、ＩＰＴＧの付加は、Ｃａｓ９及びｕｉＲＮＡの両方の同時の発現を結果として生じさせる。

【0199】

プラスミドライブラリによって形質転換された１Ｌの大腸菌を、ＯＤ１の光学密度に達するまで３７℃において２～５時間成長させた。ＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物発現及びｕｉＲＮＡ発現を１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって誘発した。温度を次いで１６℃に降下し、培養物を１６～２０時間にわたって一晩成長させた。大腸菌細胞をペレット化し、超音波処理によって溶解した。Ｈｉｓ６ｘ－ＣＰＰ－Ｃａｓ９（配列番号：２２として開示されている「Ｈｉｓ６ｘ」）ＲＮＰを、ニッケル樹脂を使用してアフィニティー精製し、イミダゾールによって樹脂から溶出した。アフィニティー精製した核タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図５Ａ）及びゲル電気泳動（図５Ｂ）によって立証した。ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰを、ＡＣＴＡ ＦＰＬＣ及びＳ２００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィによってさらに精製した（図５Ｃ）。バルクＲＮＡをＲＮＰからフェノール抽出し、ゲル電気泳動（２％アガロース、ＳｙＢｒ Ｓａｆｅ染料）によって分析したところ、図５Ｄに示すように、精製されたＲＮＰから抽出された共精製されたＲＮＡの存在が確認された。

【0200】

ＲＮＰと共精製されたＲＮＡの識別性を検証するために、共精製されたＲＮＡを鋳型切り替え逆転写によって増幅した。ガイド特異的逆転写プライマーを鋳型の５’端における鋳型切り替えによって使用した。これにより、第２プライマー結合配列を付加し、ＵＭＩを付加する。図６は、逆転写によって増幅されたＲＮＡサンプルのゲル電気泳動分析（２％アガロースゲル、ＳｙＢｒ Ｓａｆｅ染料）の画像を示す。結果は、ｕｉＲＮＡまたはＧＦＰ ｓｇＲＮＡがＲＮＰによって成功裏に共精製されたことを示す。

【0201】

次いで、ライブラリからの精製されたＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物を触媒活性に関して評価した。標的ｓｇＲＮＡ（ＧＦＰ）及び非標的ｓｇＲＮＡ（ｕｉＲＮＡ）を有する、０ｕＭ、１ｕＭ、２ｕＭ、または１０ｕＭのＣａｓ９ ＲＮＰをｄｓＤＮＡによって３７℃で３０分間インキュベートした。図７は、ＤＮＡ開裂アッセイからのサンプルのゲル電気泳動分析の画像を示す。非開裂及び開裂ｄｓＲＮＡに相当するバンドを示す。ＲＮＰなしの対照条件からのｄｓＲＮＡも示す。標的ＤＮＡ開裂を、ガイド依存性及びＲＮＰ濃度依存性の方法で観察した。ランダム化されたｇＲＮＡ（非ターゲティング）を含む精製されたＲＮＰ複合体が開裂活性を示さなかった一方で、ターゲティングされたｓｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体が開裂活性を保持した。ターゲティングされたｓｇＲＮＡに完全な開裂を示させたＲＮＰが１．２５ｕＭ ＲＮＰ及び０．２５ｕＭ ＤＮＡ基質において観察された。これらの結果は、共精製されたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰが、本明細書におけるプラスミドライブラリを使用して調製されて、触媒活性であることを示唆している。

【0202】

最後に、ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのプールと共精製されたＲＮＡをＲＮＡ－ｓｅｑによって分析した。図８Ａ及び８Ｂは、データが再現可能であることを示している、複製間のＲＮＡ－ｓｅｑ ＵＭＩカウントを比較した結果（図８Ａ）、及び、ＲＮＰ存在度がプラスミド存在度に追随することを示している、プラスミド対ＲＮＰ存在度のサンプル相互関係（図８Ｂ）をグラフにより示す。

【0203】

まとめると、この例は、プールＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのＲＮＰ精製が作動し、ＲＮＰがｓｇＲＮＡ（例えば、ｕｉＲＮＡ）と成功裏に共溶出し、同系ｄｓＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏでターゲティングさせ得る触媒活性なＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰを提供することを実証している。

【0204】

実施例４－候補ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰの、Ｔ細胞との共インキュベーション
プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰを、プールされたＲＮＰをヒトまたはマウスＴ細胞と共インキュベートすることによって細胞ターゲティングに関して評価した。共インキュベーション後、核分画を標的細胞において実施し、ＲＮＡを核抽出物から単離してシーケンシングした。単離した核ＲＮＡにおいて識別したｕｉＲＮＡを使用して、Ｃａｓ９の細胞取り込みを効果的に容易にする候補ＣＰＰを識別した。

【0205】

プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰをヒトＴ細胞（ＰＢＭＣ、刺激）またはマウスＴ細胞（脾臓、刺激）と共インキュベートした。２．５μｍのプールされたＣａｓ９ ＲＮＰをおよそ２００細胞／μｌ及び培地と混合した。サンプルをＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰＳによる１時間または５時間のインキュベーションの後に評価した（研究設計の概要に関する表１を参照されたい）。陰性対照サンプルを緩衝剤であるがＣａｓ９ ＲＮＰを含まないものと、５時間、共インキュベートした。細胞を直ちに溶解し、核及び細胞質を各時点で得られたサンプルから分画した。核及び細胞質画分を分離するために、細胞を３００ＲＣＦで５分間ペレット化した。上清を注意深く除去した。２００ｕｌ溶解緩衝剤（１０ｍＭ ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％ ＮＰ－４０）を再懸濁した細胞に添加し、氷上で５分間インキュベートした。サンプルを５００ＲＣＦで５分間４℃にて遠心分離した。細胞質画分に相当する上清を除去し、保存した。１ｍＬの核洗浄緩衝剤（１×ＰＢＳ、１％ ＢＳＡ）を添加し、先の工程を２回繰り返した。細胞着色剤を使用して集塊を除去した。最後に、核画分を核洗浄緩衝剤に再懸濁させた。

【0206】

（表１）研究設計

【0207】

図９において上方のバンドに示されているように、核ｇＲＮＡの明白な産物を、ＲＮＰを細胞によって１時間及び５時間インキュベートした後、ヒトＴ細胞の核画分において観察した。さらに、核画分においてバーコード化されたｇＲＮＡの量は、時間依存的に増加した（図９）。

【0208】

単離されたＲＮＡを次いで逆転写（ＲＴ）ＰＣＲによって増幅して、シーケンシング用のｃＤＮＡ産物を生じさせた。単離された核ｇＲＮＡから作成したｃＤＮＡライブラリをシーケンシングするために、ｃＤＮＡｓのライブラリを、ＮＥＢＮｅｘｔバーコード化プライマーを使用して増幅し、アガロースゲルによってサイズ選択し、ＵＭＩを含むプラスミドにライゲーションし、定量し（ＱｕＢｉｔ、フラグメントアナライザー）、混合し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングによってシーケンシングした。ＵＭＩカウントに基づいて、ＲＮＡ－ｓｅｑ複製間のＵＭＩカウントは、精製されたＲＮＰライブラリによって１時間（図１０Ａ）または５時間（図１０Ｂ）インキュベートした刺激ヒトＴ細胞から単離したＲＮＡのシーケンシングに関する運転間で一致した。

【0209】

次に、上記で概説されているように、ヒトＴ細胞から単離されたＲＮＡを分析して、差示的に内部移行したＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰを識別した。出発物質（共インキュベーション前にプールされたＲＮＰ；ＡＴＳｅｑ－０１Ａ）においてシーケンシングされたＲＮＡに対しての、ヒト刺激Ｔ細胞から核抽出物（ＡＴＳｅｑ－０１Ｃ）においてシーケンシングされたＲＮＡの変化倍率を、図１１Ｂ及び１１Ｃに示すように、合計ＲＮＰ存在度（ＡＴＳｅｑ－０１Ａ；ｙ軸）に対してプロットした。図１１Ｃは、ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのプールによる５時間の共インキュベーション後にヒト刺激Ｔ細胞において高い核内部移行を有するＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを表す重要なデータ点（星印状のデータ点）をハイライトしている。ハイライトしたデータ点に関連するＣＰＰを表２にまとめる。

【0210】

（表２）候補ＣＰＰ

【0211】

これらの結果は、本スクリーニング方法が、標的細胞におけるｕｉＲＮＡの存在に基づいてＣａｓ９の取り込みを容易にする（すなわち、Ｃａｓ９と複合体化されたとき）候補ＣＰＰを成功裏に識別し得ることを示している。

【0212】

実施例５－ｓｇＲＮＡ交換の測定
ｓｇＲＮＡがプラスミド構築及びＲＮＰ精製プロセスの際にＣＰＰ－Ｃａｓ９融合物間で交換されるか否かを評価するために、ｕｉＲＮＡ交換を測定する実験を実施する。２つのプラスミドを用意する。ＦＬＡＧアフィニティー－タグ化Ｃａｓ９タンパク質をコードする第１プラスミドを、公知のｓｇＲＮＡ（すなわち、ｓｇＲＮＡ－ＧＦＰ）と併せて用意する。非タグ化Ｃａｓ９をコードする第２プラスミドを、ランダム化されたｕｉＲＮＡと併せて用意する。これらのプラスミドを等しい比で一緒に混合する。プールされた細菌の形質転換を実施し、ＲＮＰを精製する。ＲＮＡ－ｓｅｑを、ＦＬＡＧアフィニティープルダウンの前後に実施する。ＲＮＰプールにおけるｕｉＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ－ＧＦＰの存在度及びＦＬＡＧ精製した物質におけるｕｉＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ－ＧＦＰの存在度を評価する。入力物質における、及び、ＦＬＡＧプルダウンにおける、ｓｇＲＮＡ－ＧＦＰ：ｕｉＲＮＡカウントの比を見ることにより、ｓｇＲＮＡ交換の頻度を決定する。低いｓｇＲＮＡ交換度であると、ＦＬＡＧプルダウン物質は公知のＧＦＰ ｓｇＲＮＡを主に含有する。対照的に、高い交換度が生じると、入力におけるｕｉＲＮＡカウントがＦＬＡＧプルダウン物質におけるものと相関している。

【0213】

実施例６－ライブラリ精製の最適化
実施例３に記載されているように、ＣＰＰ－Ｃａｓ９のライブラリを精製するために、ＲＮＰを、固定化した金属アフィニティークロマトグラフィを使用して（ＩＭＡＣ、例えば、Ｈｉｓタグについてアフィニティーでニッケル樹脂を使用して）、続いて、Ｓ２００カラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィを使用して大腸菌細胞溶解物から精製した。しかし、精製の際、ＤＮＡ混入が、精製されたＲＮＰにおいて存在した。さらに、ライブラリにおけるＣａｓ９ ＲＮＰが２つの主な種に区分化され、これは、タンパク質または核酸混入物質の存在を示唆している。これらの問題に対処するために、最適化されたＲＮＰ精製プロトコルを開発した。

【0214】

ＤＮＡ混入物質を除去するために、ＲＮＰのＤＮａｓｅ処理を評価した。３０℃で１時間のＲＮＰのＤＮａｓｅ処理により、ＤＮＡ混入が低減した純粋なＲＮＰを得た。したがって、ＤＮａｓｅ処理工程をＩＭＡＣ工程後に付加した。

【0215】

混入タンパク質及び核酸を除去するために、ＲＮＰ純度を、ＤＮａｓｅ Ｉ処理及びアニオン交換クロマトグラフィの両方の後に評価した。ＲＮＰをＩＭＡＣ工程の後及びアニオン交換クロマトグラフィを実施する前にＤＮａｓｅ Ｉで処理した。アニオン交換クロマトグラフィのために、ＲＮＰを５ｍＬ ＨｉＳｃｒｅｅｎ Ｑ ＨＰカラムに添加した。ＲＮＰの収率はアニオン交換クロマトグラフィ工程の付加によって低減したが、イオン交換により、大部分の混入タンパク質及び核酸が除去された。

【0216】

したがって、改良されたＲＮＰ精製プロトコルは、ＩＭＡＣ工程の後及びＳＥＣ工程の前にＤＮａｓｅ処理及びアニオン交換クロマトグラフィ工程を組み込むことにより、高純度ＲＮＰを得た。

【0217】

実施例７－細胞内分画の立証
細胞内分画プロトコルをさらに立証するために、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して品質管理実験を実施して、公知の細胞内でレポーター転写物を追跡して分画ワークフローを評価した。ＳＮＲＯＤ２２（核小体低分子ＲＮＡ）を核に局在化することが知られている対照ＲＮＡとして使用し、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを細胞質ゾルに局在化することが知られている対照ｍＲＮＡとして使用した。細胞を、ｑＰＣＲを使用してマーカー転写物の存在について評価した。各対照ＲＮＡの細胞内局在化パターンと一致して、核画分ではＳＮＯＲＤ２２が富化され、細胞質画分ではＧＡＰＤＨが富化された。

【0218】

次に、実験を実施して核内部移行及びゲノム編集の相互関係を評価した。Ｃａｓ９ ＲＮＰを、ＣＤ４７ターゲティングガイドＲＮＡを使用して生じさせた。Ｔ細胞を、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳもしくは４ｘＮＬＳ－Ｃａｓ９－２ｘＮＬＳを含むＲＮＰ、またはＲＮＰなしの対照と共インキュベートした。細胞を、次いで、（ｉ）ＣＤ４７枯渇（ゲノム編集の表現型の読み出し）を検出するＦＡＣＳまたは（ｉｉ）細胞から得られる核画分においてｓｇＲＮＡを検出するｑＰＣＲのいずれかを使用して評価した。ｓｇＲＮＡの核内部移行はＦＡＣＳによって検出されるようにゲノム編集と一致しており、これは、核内部移行がゲノム編集についてプロキシとして働き得ることを示唆している。

【0219】

実施例８－ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリ調製の最適化
本実施例において利用されるｕｉＲＮＡは、５’～３’までバーコードを含んで、ＲＮＡ－ｓｅｑを使用したｕｉＲＮＡを分析した。代替の方法を開発して、プライマーにシーケンシングハンドル及び第２ＰＣＲハンドルを与えて増幅を可能にした。実施例３に記載されているように、鋳型切り替え逆転写（例えば、ＳＭＡＲＴ－ｓｅｑから誘導されるように、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）は、ｕｉＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを作成し得る１つの方法である。鋳型切り替え逆転写による、例えば、ＳＭＡＲＴ－ｓｅｑを使用することによるｕｉＲＮＡ－ｓｅｑライブラリの作成はまた、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ９：１７１－１８１（２０１４）に記載されている。代替の方法として、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用するスプリンテッドライゲーションを使用して、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０：１０２３（２０１９））に記載されているように、ＳＲＳＬＹ－ｓｅｑ系を使用するｕｉＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを作成した。鋳型切り替えアプローチによって生じるライブラリをＳＲＳＬＹ－ｓｅｑアプローチと比較した。この比較は、ＳＲＳＬＹ－ｓｅｑが、鋳型切り替えプロトコルよりも高収率でｕｉＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを生じたことを示唆した。

【0220】

実施例９－線維芽細胞におけるＣＰＰ－Ｃａｓ９スクリーニング
実施例１～４において使用したものと同様の方法を使用して、スクリーニングを実施して、線維芽細胞へのＣａｓ９の内部移行を効果的に容易にするＣＰＰのための異なる試験細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含むＣａｓ９－融合タンパク質のプールを迅速に評価した。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む複数の固有の識別ＲＮＡ（ｕｉＲＮＡ）及び５８８５の異なる試験ＣＰＰをコードするポリヌクレオチドのライブラリを、Ｃａｓ９をコードするベクターライブラリにコンビナトリアルアセンブルした。ＣＰＰをＣＰＣ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＰＰｓｉｔｅ２、及びＮＬＳＤＢデータベースから得た。ＣＰＰは、ペプチド当たりおよそ１５～３４個のアミノ酸であり、短いペプチドのタンデムリピートを含んだ。ベクターをＣＰＰがＣａｓ９に動作可能に連結されるようにアセンブルした。ベクターをシーケンシングすることにより、各ベクターにおけるｕｉＲＮＡ及び試験ＣＰＰを識別し、これにより、後の工程においてｕｉＲＮＡの存在に基づいてＣＰＰ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質を識別するのに使用され得る会合したｕｉＲＮＡ及び試験ＣＰＰの対のリファレンスを提供した。

【0221】

ｕｉＲＮＡを含むＣＰＰ－ＲＮＰの発現及び単離の際、プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰのライブラリを、マウス線維芽細胞による共インキュベーション後に細胞内部移行を向上させたＲＮＰについてスクリーニングした。共インキュベーション後、核分画を標的細胞において実施し、ＲＮＡを核抽出物から単離してシーケンシングした。単離した核ＲＮＡにおいて識別したｕｉＲＮＡを使用して、線維芽細胞へのＣａｓ９の細胞取り込みを効果的に容易にする候補ＣＰＰを識別した。

【0222】

プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰを、実施例６に記載されているように、Ｄｎａｓｅ処理及びアニオン交換クロマトグラフィ工程を使用して精製した。プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰを、低ＲＮＰ濃度アプローチまたは高ＲＮＰ濃度アプローチのいずれかを介して線維芽細胞と共インキュベートした。低ＲＮＰ濃度アプローチにおいて、プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰを、およそ３００，０００細胞及び９０μｌの培地と、２ｕＭ ＲＮＰの最終濃度まで混合した。高ＲＮＰ濃度アプローチにおいて、プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰを、およそ３００，０００細胞及び３０μｌの培地と、５ｕＭ ＲＮＰの最終濃度まで混合した。両方のアプローチにおいて、線維芽細胞を、３７℃で６０分間、プールされたＲＮＰと共インキュベートし、その後、細胞を洗浄し、核及び細胞質ゾルに分画して、実施例４に記載されているように、ＲＮＡ－ｓｅｑによってさらに分析した。

【0223】

ＣＰＰ－ＲＮＰを発現及び単離する前に、各ＣＰＰ－ＲＮＰを発現するプラスミドをプラスミド－ｓｅｑによって評価してｕｉＲＮＡバーコード－ＣＰＰ会合をマッピングした。ＣＰＰ－ＲＮＰと共インキュベートした細胞の分画の後、鋳型切り替え逆転写法を使用して、核対細胞質ゾルで存在するｕｉＲＮＡをシーケンシングした。ＣＰＰ－Ｃａｓ９ライブラリと共インキュベートした非分画細胞を比較基準として評価した。ｕｉＲＮＡにおけるシーケンシングされたバーコード及び先に確立されたマップに基づいて、各細胞内画分にあるＣＰＰ－ＲＮＰを識別した。ｕｉＲＮＡ－ｓｅｑカウントにおけるＰＣＲバイアスを除去し（重複排除、デマルチプレックス工程）、核対細胞質ゾルで違った内部移行を有するｕｉＮＲＡを識別した。

【0224】

主な構成要素の分析を、入力対照（出発物質（共インキュベーション前にプールされたＲＮＰ）においてシーケンシングされる、例えばｇＲＮＡなどのＲＮＡ）、非分画細胞、細胞質画分、及び核画分からのｕｉＲＮＡカウントにおいて実施した。これらの結果を、使用した共インキュベーションプロトコル（低ＲＮＰ濃度対高ＲＮＰ濃度）に基づいてさらに分析した。図１２Ａに示されているように、ＲＮＡ－ｓｅｑデータを、ｕｉＲＮＡを単離した細胞内画分に基づいて集団化した。データは、共インキュベーションに使用した実験プロトコルに基づいて隔離しなかった。

【0225】

次に、線維芽細胞から単離したＲＮＡを、上記で概説されているように、分析して、線維芽細胞の核画分において富化されたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰを識別した。核画分において富化されたペプチドを、出発物質（共インキュベーション前にプールされたＲＮＰ、すなわち、入力対照）においてシーケンシングされたＲＮＡに対して０．５以上のｌｏｇ１０変化倍率を有する核においてｕｉＲＮＡに基づいて識別した。入力対照に対して核において存在度が統計的に有意に変化したペプチドを、－１０以下のＬｏｇ１０Ｐ－値を有するヒットに基づいて識別した。Ｐ－値は、Ｗａｌｄ試験、及び、多重仮説検定用に補正されたＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉを使用してコンピュータ計算した。核において富化され入力対照に対して統計的に有意に変化した存在度を示した合計９６のヒットを識別した。

【0226】

入力対照におけるＲＮＡに対する核抽出物におけるＲＮＡの変化倍率を、図１２Ｂに示されているように、Ｐ値（ｙ軸）に対しての火山プロットにおいてプロットした。プールされたＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰによる共インキュベーション後に線維芽細胞において核局在化を示すＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰに会合するＲＮＡをグラフの右上部分（図１２Ｂの囲まれた部分及び図１２Ｃにおける星印状のヒットを参照されたい）に示す。

【0227】

識別されたペプチドを化学的特性によってさらに区分化した（ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ核局在化に関連するＣＰＰが同様の化学的特性を有するときに決定する。図１２Ｄに示されているように、識別されたＣＰＰをハイドロパシー（ｙ軸）及び残基当たりの正味電荷（ｘ軸）に基づいて区分化した。各ドットは、図１２Ｂ及び１２Ｃにおけるペプチドを表しており、ドットのサイズが、Ｐ値（Ｌｏｇ１０）を示しており、陰影部分は変化倍率（Ｌｏｇ１０）を示している。グラフの右下部分におけるデータは、疎水性度が低い高電荷のＣＰＰを示している。富化した核局在化及びより高いＰ値に関連するＣＰＰは概して高電荷であり（例えば、残基当たりの正味電荷が＋０．４を超える）、低減した疎水度を有するが、ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰの富化した核局在化に関連するいくつかの非極性ペプチド（図１２Ｄにおける丸を付けたデータ点２を参照されたい）もまた識別した。

【0228】

図１２Ｃは、線維芽細胞において核内部移行が富化したＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰと会合するＲＮＡを表す頂部の８つのデータ点をハイライトしている（星印状のデータ点を参照されたい）。ハイライトしたデータ点に関連するＣＰＰを表３にまとめる。ある特定の場合において、いくつかのＣＰＰを同様の配列によって識別した。例えば、２つのＣＰＰを、アミノ酸モチーフＣＶＱＷＳＬＬＲＧＹＱＰＣ（配列番号：２０；表３におけるヒット番号１及び番号３を参照されたい）を含めたスクリーニングにおいて識別した。さらに、３つのＣＰＰを、アミノ酸モチーフＸＫＸＲＸ－ＧＳＧＳ（配列番号：２１）を含めたスクリーニングにおいて識別した。ここで、Ｘは、アミノ酸ＲまたはＫのいずれかである。大部分のヒットがポリカチオン性であった（例えば、Ｒ／Ｋリッチ）。ＴＡＴ細胞透過性ペプチドの１０個の変異体を、Ｓ４１ペプチドの２つの変異体と共にさらに識別した。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシンデルタ及びペネトラチンをスクリーニングにおいて識別した。

【0229】

（表３）線維芽細胞の核画分が富化されたｕｉＲＮＡ（ＣＰＰ－Ｃａｓ９ ＲＮＰの）と会合するＣＰＰ

【0230】

配列表

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【配列表】

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【国際調査報告】