特表 2022-530044 腫瘍ワクチン接種方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-27

(54)【発明の名称】腫瘍ワクチン接種方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/00 20060101AFI20220620BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220620BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220620BHJP

   A61P 15/08 20060101ALI20220620BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220620BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20220620BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20220620BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20220620BHJP

【ＦＩ】

A61K39/00 H

A61P35/00

A61P37/04

A61P43/00 121

A61K48/00

A61P25/00

A61P15/08

A61K9/08

A61K35/76

A61K35/15

C12N7/01 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021562977

(86)(22)【出願日】2020-04-24

(85)【翻訳文提出日】2021-11-29

(86)【国際出願番号】 IB2020053898

(87)【国際公開番号】W WO2020217226

(87)【国際公開日】2020-10-29

(31)【優先権主張番号】19170999.7

(32)【優先日】2019-04-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】PCT/NL2019/050451

(32)【優先日】2019-07-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL

(31)【優先権主張番号】62/961,554

(32)【優先日】2020-01-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521022691

【氏名又は名称】ディーシープライム・ベスローテン・フェンノートシャップ

【氏名又は名称原語表記】ＤＣＰＲＩＭＥ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】マンティング，エリック ハンス

(72)【発明者】

【氏名】シン，サトウィンダー カウア

(72)【発明者】

【氏名】ソマンダス，ヴィノッド

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA45

4C076AA11

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB14

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB31

4C076CC01

4C076CC17

4C076CC27

4C076FF02

4C076FF04

4C076FF12

4C084AA13

4C084MA02

4C084MA17

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC751

4C085AA03

4C085BA01

4C085BB11

4C085DD62

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4C085EE03

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG10

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB64

4C087BB65

4C087BC83

4C087MA02

4C087MA17

4C087MA63

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZA81

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZC75

(57)【要約】

第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程と、第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程とを含む、それを必要とする対象において腫瘍を処置するまたは腫瘍に対する免疫応答を生成する方法を提供する。第１の組成物および第２の組成物はそれぞれ、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍性抗原）または抗原性ポリペプチドをコード化する核酸を含む。また、本明細書に記載の方法で用いるための抗原性ポリペプチドおよび組成物も提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法であって、
腫瘍から遠位部位で該対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、該第１の組成物が、非腫瘍抗原または該非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む、ワクチン接種工程；および、
腫瘍部位で該対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、該第２の組成物が、非腫瘍抗原または該非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む、腫瘍マーキング工程
を含み、ここで、該ワクチン接種工程と該腫瘍マーキング工程との間の期間が、約１日から約６カ月である、方法。

【請求項2】

対象にブースター組成物を投与することをそれぞれ含む１回以上のブースター工程をさらに含み、ここで、該ブースター組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

１回以上のブースター工程が、該腫瘍マーキング工程の前に行われる、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

腫瘍マーキング工程が、第２の組成物を腫瘍内または腫瘍の近位に投与することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ワクチン接種工程が、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、胸骨内投与、皮内投与、経皮投与、経皮内投与、組織の間質腔への送達および非腫瘍組織への送達からなる群より選択される経路を介して第１の組成物を投与することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を皮内投与することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

第１の組成物が皮内注射用に調製されている、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

第１の組成物が、皮内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を筋肉内に投与することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

第１の組成物が筋肉内注射用に調製される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

第１の組成物が、筋肉内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む、請求項９または１０に記載の方法。

【請求項12】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を腫瘍が存在する臓器系とは異なる臓器系に投与することを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を腫瘍とは反対側の部位に投与することを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

ワクチン接種工程が、腫瘍マーキング工程の後に行われる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

腫瘍マーキング工程が、ワクチン接種工程の後に行われる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間が、ワクチン接種工程の結果として免疫応答を形成するのに十分である、請求項１４または１５に記載の方法。

【請求項17】

ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間が、約２日から約２１日である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

腫瘍が固形腫瘍である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

固形腫瘍が膠芽腫または卵巣癌である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

第１の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

樹状細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

成熟樹状細胞がＤＣＯｎｅに由来する、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

第２の組成物が、腫瘍内投与用に調製される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

第２の組成物が、腫瘍ターゲティング成分を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

腫瘍ターゲティング成分が腫瘍特異的ウイルスである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

腫瘍特異的ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

腫瘍特異的ウイルスが、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む、請求項２４または２５に記載の方法。

【請求項28】

腫瘍ターゲティング成分が腫瘍特異的ナノ粒子である、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

腫瘍特異的ナノ粒子が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

第２の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

樹状細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

成熟樹状細胞がＤＣＯｎｅに由来する、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

第１の組成物および第２の組成物がそれぞれ、１以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または希釈剤を含んでいてよい、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

対象が非腫瘍抗原に曝されていない対象である、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

対象が、以前に非腫瘍抗原に曝されたことがある、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

対象が、以前に非腫瘍抗原に対する免疫応答を形成している、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

対象がヒトである、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

対象が、家畜動物および／または動物医療に適した動物である、請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法であって、
腫瘍から遠位部位で該対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、該第１の組成物が、非腫瘍リコール抗原または該非腫瘍リコール抗原をコード化する核酸を含む、ワクチン接種工程；および、
腫瘍部位で該対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、該第２の組成物が、リコール抗原または該リコール抗原をコード化する核酸を含む、腫瘍マーキング工程
を含む、方法。

【請求項40】

腫瘍マーキング工程が、第２の組成物を腫瘍内または腫瘍の近位に投与することを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

ワクチン接種工程が、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、胸骨内投与、皮内投与、経皮投与、経皮内投与、組織の間質腔への送達および非腫瘍組織への送達からなる群より選択される経路を介して第１の組成物を投与することを含む、請求項３９または４０に記載の方法。

【請求項42】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を皮内投与することを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

第１の組成物が皮内注射用に調製されている、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

第１の組成物が、皮内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項45】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を筋肉内投与することを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項46】

第１の組成物が筋肉内注射用に調製される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

第１の組成物が、筋肉内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む、請求項４５または４６に記載の方法。

【請求項48】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を腫瘍が存在する臓器系とは異なる臓器系に投与することを含む、請求項３９から４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を腫瘍とは反対側の部位に投与することを含む、請求項３９から４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程が、時間的に分離されている、請求項３９から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

ワクチン接種工程が、腫瘍マーキング工程の後に行われる、請求項３９から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

腫瘍マーキング工程が、ワクチン接種工程の後に行われる、請求項３７から５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間が、ワクチン接種工程の結果として免疫応答を形成するのに十分である、請求項５０から５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間が、約２日から約２１日である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

腫瘍が固形腫瘍である、請求項３７から５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

固形腫瘍が膠芽腫または卵巣癌である、請求項３７から５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

第１の組成物が、リコール抗原またはリコール抗原をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む、請求項３７から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

樹状細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

成熟樹状細胞がＤＣＯｎｅに由来する、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

第２の組成物が、腫瘍内投与用に調製される、請求項３７から５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

第２の組成物が、腫瘍ターゲティング成分を含む、請求項３７から６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

腫瘍ターゲティング成分が腫瘍特異的ウイルスである、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

腫瘍特異的ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

腫瘍特異的ウイルスが、リコール抗原またはリコール抗原をコード化する核酸を含む、請求項６２または６３に記載の方法。

【請求項65】

腫瘍ターゲティング成分が腫瘍特異的ナノ粒子である、請求項６１に記載の方法。

【請求項66】

腫瘍特異的ナノ粒子が、リコール抗原またはリコール抗原をコード化する核酸を含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

第２の組成物が、リコール抗原またはリコール抗原をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む、請求項３７から６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

樹状細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

成熟樹状細胞がＤＣＯｎｅに由来する、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

第１の組成物および第２の組成物がそれぞれ、１以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または希釈剤を含んでいてよい、請求項３７から６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

対象が以前にリコール抗原に曝されていない対象である、請求項３７から７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

対象が、以前にリコール抗原に対する免疫応答を形成したことがある、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

対象がヒトである、請求項１から７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

対象が、家畜動物および／または動物医療に適した動物である、請求項１から７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法であって、
腫瘍から遠位部位で該対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、該第１の組成物が、ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体または該ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体をコード化する核酸を含む、ワクチン接種工程；および、
腫瘍部位で該対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、該第２の組成物が、ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体または該ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体をコード化する核酸を含む、腫瘍マーキング工程
を含む、方法。

【請求項76】

対象にブースター組成物を投与することをそれぞれ含む１回以上のブースター工程をさらに含み、ここで、該ブースター組成物が、ジフテリア毒素もしくはその無害化変異体、またはジフテリア毒素もしくはその無害化変異体をコード化する核酸を含む、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

１回以上のブースター工程が、腫瘍マーキング工程の前に行われる、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体がＣＲＭ１９７である、請求項７５から７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

腫瘍マーキング工程が、第２の組成物を腫瘍内または腫瘍の近位に投与することを含む、請求項７５から７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

ワクチン接種工程が、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、胸骨内投与、皮内投与、経皮投与、経皮内投与、組織の間質腔への送達および非腫瘍組織への送達からなる群より選択される経路を介して第１の組成物を投与することを含む、請求項７５から７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を皮内投与することを含む、請求項７５から８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

第１の組成物が皮内注射用に調製されている、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

第１の組成物が、皮内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む、請求項８１または８２に記載の方法。

【請求項84】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を筋肉内に投与することを含む、請求項７５から８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

第１の組成物が筋肉内注射用に調製される、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

第１の組成物が、筋肉内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む、請求項８４または８５に記載の方法。

【請求項87】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を腫瘍が存在する臓器系とは異なる臓器系に投与することを含む、請求項７５から８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

ワクチン接種工程が、第１の組成物を腫瘍とは反対側の部位に投与することを含む、請求項７５から８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

ワクチン接種工程が、腫瘍マーキング工程とは時間的に分離されている、請求項７５から８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

ワクチン接種工程が腫瘍マーキング工程の後に行われる、請求項７５から８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

腫瘍マーキング工程がワクチン接種工程の後に行われる、請求項７５から９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間が、ワクチン接種工程の結果として免疫応答を形成するのに十分である、請求項９０または９１に記載の方法。

【請求項93】

ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間が、約２日から約２１日である、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

腫瘍が固形腫瘍である、請求項７５から９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

固形腫瘍が、膠芽腫または卵巣癌である、請求項７５から９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

第１の組成物が、ＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む、請求項７５から９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

樹状細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

成熟樹状細胞がＤＣＯｎｅに由来する、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

第２の組成物が、腫瘍内投与用に調製される、請求項７５から９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

第２の組成物が、腫瘍ターゲティング成分を含む、請求項７５から９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

腫瘍ターゲティング成分が腫瘍特異的ウイルスである、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

腫瘍特異的ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

腫瘍特異的ウイルスが、ＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコード化する核酸を含む、請求項１０１または１０２に記載の方法。

【請求項104】

腫瘍ターゲティング成分が腫瘍特異的ナノ粒子である、請求項１００に記載の方法。

【請求項105】

腫瘍特異的ナノ粒子が、ＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコード化する核酸を含む、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

第２の組成物が、ＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む、請求項７５から１０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

樹状細胞が、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である、請求項１０６に記載の方法。

【請求項108】

成熟樹状細胞がＤＣＯｎｅに由来する、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

第１の組成物および第２の組成物はそれぞれ、１以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または希釈剤を含んでいてよい、請求項７５から１０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

対象がヒトである、請求項７５から１０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

対象が、家畜動物および／または動物医療に適した動物である、請求項７５から１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法であって、
該対象に腫瘍部位で非腫瘍抗原または該非腫瘍抗原をコード化する核酸を投与することを含み、ここで、該対象が、以前に該非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸をワクチン接種されたことがある、方法。

【請求項113】

対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法であって、
該対象に腫瘍部位でリコール抗原またはリコール抗原をコード化する核酸を投与することを含み、ここで、該対象が、以前に該リコール抗原または該リコール抗原をコード化する核酸をワクチン接種されたことがあり、かつ該抗原が非腫瘍抗原である、方法。

【請求項114】

対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法であって、
該対象に腫瘍部位でジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体または該ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体をコード化する核酸を投与することを含み、ここで、該対象が、以前に該ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体または該ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体をコード化する核酸をワクチン接種されたことがある、方法。

【請求項115】

ジフテリア毒素またはその無害化変異体がＣＲＭ１９７である、請求項１１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１９年４月２５日出願の“Pharmaceutical Combination”と題する欧州特許出願第１９１７０９９９．７号、２０１９年７月１６日出願の“Pharmaceutical Combination”と題する国際ＰＣＴ出願ＰＣＴ/ＮＬ１９/５０４５１号、および２０２０年１月１５日出願の“Methods of Tumor Vaccination”と題する米国仮特許出願第６２/９６１，５５４号基づく優先権を主張する。これらの各出願の開示内容全体を引用により本明細書中に包含させる。

【0002】

電子的に提出された配列表の引用
電子的に提出された配列表の内容は、ASCIIテキストファイル（名称：DCP9-004PC_SL_ST25；サイズ：７，８４６バイト；および、作成日：２０２０年４月２４日）は、その内容全体が引用により本明細書中に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

背景
伝統的に、そして現在もなお、腫瘍治療用ワクチンの焦点は、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって開始され、それによってＴ細胞の活性化および腫瘍に対する免疫応答を形成(mount)する腫瘍抗原でのワクチン接種にある。

【0004】

このようなワクチン接種戦略の目標は、天然レパートリーから腫瘍特異的Ｔ細胞の集団を増殖させることであるが、腫瘍抗原の提示を通じて腫瘍関連の休眠またはアネルギーを逆転させ、それらの抗原に対する中枢性免疫寛容を破壊し、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞のレパートリーの鈍化を克服することである。

【0005】

腫瘍特異的エピトープに対するＴ細胞を優先的に刺激する治療用腫瘍ワクチンを設計することの難しさは、腫瘍抗原の発現を減少させるために、あるいはＴ細胞および免疫系の他の細胞にとって阻害的な環境（腫瘍微小環境またはＴＭＥ）を作り出すことによって、腫瘍が免疫制御を回避する傾向にあることにある。このようにして、腫瘍抗原を認識するＴ細胞レパートリーが不活性化され、不活性化または枯渇したＴ細胞集団をもたらす。

【0006】

現在のワクチン接種アプローチは、腫瘍によって特定の時期に発現される腫瘍抗原に依存する。このことは、腫瘍に対する自然選択圧が一般的に腫瘍に細胞死を生じさせるほど強くないため、これらのワクチン接種アプローチが腫瘍細胞の免疫回避性によって回避されていることを意味する。さらに、自己抗原ではない腫瘍特異的抗原を用いることは依然として困難であり、該自己抗原は一般的に免疫系によって寛容化を有するか、あるいは弱いＴ細胞介在性免疫応答を提供する。治療用腫瘍ワクチンの分野における現在の研究の焦点は、特に腫瘍ネオ抗原の同定にある。これらのネオ抗原はワクチン接種後にＴ細胞を十分に刺激し得るが、それらは一般的に患者特異的であるという内在的な欠点を有しており、従って、患者集団に広く適用される腫瘍ワクチンとしては適していない。また、それらは安定して発現されておらず、時間の経過とともに変化する可能性があり、正しいワクチン製剤を作製することはさらに困難である。上記から明らかなように、現在の腫瘍ワクチン接種アプローチは、腫瘍抗原によるワクチン接種に基づいており、所定の時点での腫瘍の抗原性状態に向けられており、したがって、腫瘍の抗原性状態を積極的に改変しない。

【0007】

従って、腫瘍によって発現される腫瘍抗原に依存せず、ワクチン接種時に最適なＴ細胞応答を提供する抗原を組み込んだ、改良された治療用腫瘍ワクチンおよび／またはワクチン接種戦略の必要がある。かかる改良された治療用腫瘍ワクチンおよび／またはワクチン接種戦略は、ヒトへの使用および家畜動物への使用の両方に適用可能であり得る。

【発明の概要】

【0008】

概要
本発明は、“腫瘍抗原に依存しないワクチン接種”とも呼ばれる新規のワクチン接種戦略を提供する。腫瘍抗原に依存しないワクチン接種アプローチを設計することにより、免疫応答は、対象（例えば、ヒト対象）において免疫原性を有し、かつ外来（例えば、非ヒト）由来の抗原に対して起こる。そのような免疫原は、例えば、天然レパートリーからのＴ細胞を活性化することによって、または腫瘍に対する免疫応答ではなく、ある場合には、感染症に対する一般的なワクチン接種の結果として腫瘍が確立する前に生じた免疫応答である、以前の免疫応答の間に生じたメモリーＴ細胞および／またはメモリーＢ細胞を再活性化することによって、既存の免疫を活用することによって、強力な免疫応答を提供する。この原理は、上記の腫瘍抗原に基づくワクチン接種の制限を克服し、患者集団全体に適用可能である。加えて、腫瘍抗原に依存しないワクチン接種は、標的となり得る腫瘍抗原が少ない動物医療において価値があると考えられ、様々な動物種に適用可能なコスト効率の高い免疫療法への高い必要性がある。

【0009】

第一面において、ワクチン接種戦略は、免疫原として対象（例えば、ヒト対象）に対して外来性または外因性の抗原を含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン組成物）の投与（例えば、ワクチン接種工程）を含む。ある態様において、抗原は、免疫原性が高く、感染症に対する一般的なワクチン接種を介した場合を除いて、対象(例えば、ヒト対象）の免疫系が遭遇しないか、または殆ど遭遇しない抗原であり得る。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、非ヒト抗原を用いて行われる。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、非腫瘍抗原を用いて行われる。

【0010】

第二の面において、ワクチン接種戦略は、ワクチン接種に関連する第一の面で採用されたのと同じ抗原を用いて、腫瘍細胞またはその直接もしくは即時の環境（例えば、腫瘍部位または腫瘍微小環境（ＴＭＥ））を積極的にマーキングすること(例えば、腫瘍マーキング工程）を含む。ある例示的態様において、腫瘍またはその直接環境（例えば、腫瘍部位または腫瘍微小環境（ＴＭＥ））は、非腫瘍抗原(例えば、非ヒト抗原、非腫瘍抗原）の提示によって操作される。ある例示的態様において、腫瘍のマーキングに先立って、そのような免疫応答はすでに誘発されているか、または形成されている。

【0011】

ある例示的態様において、例えば、天然レパートリーからＴ細胞を活性化することによって、または目的の腫瘍に特異的な抗原ではない抗原に対する既存の免疫を利用する（tapping into）ことによって、対象（例えば、ヒト対象）において免疫原性があり、外来（例えば、非ヒト）由来であり、かつ強い免疫応答を提供すると予期される任意の抗原を用いて、（ｉ）該抗原に対して所望の免疫応答を獲得するように該抗原に対してワクチンを接種する、および（ｉｉ）腫瘍部位または腫瘍微小環境での対応する抗原の提示を可能にすることにより、そのような免疫応答の標的として腫瘍をマーキングする。免疫原性組成物を投与する工程は、腫瘍マーキングの前または後に実施することができる。ある例示的態様において、１回以上のワクチン接種工程が、腫瘍マーキング工程に先立って実施される。

【0012】

従って、ある面において、腫瘍から遠位部位で該対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、該第１の組成物が、非腫瘍抗原または該非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む、ワクチン接種工程；および、腫瘍部位で該対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、該第２の組成物が、非腫瘍抗原または該非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む、腫瘍マーキング工程、を含み、ここで、該ワクチン接種工程と該腫瘍マーキング工程との間の期間が、約１日から約６カ月である、対象において腫瘍に対する免疫応答を生成する方法を提供する。

【0013】

ある例示的態様において、該方法は、対象にブースター組成物を投与することをそれぞれ含む１回以上のブースター工程をさらに含み、ここで、該ブースター組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む。ある例示的態様において、１回以上のブースター工程は、腫瘍マーキング工程の前に行われる。

【0014】

ある例示的態様において、腫瘍マーキング工程は、第２の組成物を腫瘍内または腫瘍の近位に投与することを含む。

【0015】

ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、筋肉内投与、皮下投与（subcutaneous）、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、胸骨内投与、皮内投与（intradermal）、経皮投与（transcutaneous）、経皮内投与（transdermal）、組織の間質腔への送達および非腫瘍組織への送達からなる群より選択される経路を介して第１の組成物を投与することを含む。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を皮内投与することを含む。ある例示的態様において、第１の組成物は皮内注射用に調製されている。ある例示的態様において、第１の組成物は、皮内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を筋肉内に投与することを含む。ある例示的態様において、第１の組成物は筋肉内注射用に調製される。ある例示的態様において、第１の組成物は、筋肉内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む。

【0016】

ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を腫瘍が存在する臓器系とは異なる臓器系に投与することを含む。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を腫瘍とは反対側の部位に投与することを含む。

【0017】

ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、腫瘍マーキング工程の後に行われる。ある例示的態様において、腫瘍マーキング工程は、ワクチン接種工程の後に行われる。ある例示的態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間は、ワクチン接種工程の結果として免疫応答を形成するのに十分である。ある例示的態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間は、約２日から約２１日である。

【0018】

ある例示的態様において、腫瘍は固形腫瘍である。ある例示的態様において、固形腫瘍は、膠芽腫または卵巣癌である。

【0019】

ある例示的態様において、第１の組成物は、腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む。ある例示的態様において、樹状細胞は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である。ある例示的態様において、成熟樹状細胞はＤＣＯｎｅに由来する。

【0020】

ある例示的態様において、第２の組成物は、腫瘍内投与用に調製される。ある例示的態様において、第２の組成物は、腫瘍ターゲティング成分を含む。ある例示的態様において、腫瘍ターゲティング成分は腫瘍特異的ウイルスである。ある例示的態様において、腫瘍特異的ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスである。ある例示的態様において、腫瘍特異的ウイルスは、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む。ある例示的態様において、腫瘍ターゲティング成分は腫瘍特異的ナノ粒子である。ある例示的態様において、腫瘍特異的ナノ粒子は、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む。

【0021】

ある例示的態様において、第２の組成物は、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む。ある例示的態様において、樹状細胞は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である。ある例示的態様において、成熟樹状細胞はＤＣＯｎｅに由来する。

【0022】

ある例示的態様において、第１の組成物および第２の組成物はそれぞれ、要すれば、１以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または希釈剤を含んでいてよい。

【0023】

ある例示的態様において、対象は、非腫瘍抗原に曝されていない（ナイーブな）対象である。ある例示的態様において、対象は、以前に非腫瘍抗原に曝されたことがある。ある例示的態様において、対象は、以前に非腫瘍抗原に対する免疫応答を形成している。

【0024】

ある例示的態様において、対象はヒトである。ある例示的態様において、対象は、家畜動物および／または動物医療に適した動物である。

【0025】

他の面において、腫瘍から遠位部位で該対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、該第１の組成物が、非腫瘍リコール抗原または該非腫瘍リコール抗原をコード化する核酸を含む、ワクチン接種工程；および、腫瘍部位で該対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、該第２の組成物が、リコール抗原または該リコール抗原をコード化する核酸を含む、腫瘍マーキング工程、を含む、対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法を提供する。

【0026】

ある例示的態様において、腫瘍マーキング工程は、第２の組成物を腫瘍内または腫瘍の近位に投与することを含む。

【0027】

ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、胸骨内投与、皮内投与、経皮投与、経皮内投与、組織の間質腔への送達および非腫瘍組織への送達からなる群より選択される経路を介して第１の組成物を投与することを含む。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を皮内投与することを含む。ある例示的態様において、第１の組成物は皮内注射用に調製されている。ある例示的態様において、第１の組成物は、皮内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を筋肉内投与することを含む。ある例示的態様において、第１の組成物は筋肉内注射用に調製されている。ある例示的態様において、第１の組成物は、筋肉内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む。

【0028】

ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を腫瘍が存在する臓器系とは異なる臓器系に投与することを含む。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を腫瘍とは反対側の部位に投与することを含む。

【0029】

ある例示的態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程は、時間的に分離されている。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、腫瘍マーキング工程の後に行われる。ある例示的態様において、腫瘍マーキング工程は、ワクチン接種工程の後に行われる。ある例示的態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間は、ワクチン接種工程の結果として免疫応答を形成するのに十分である。ある例示的態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間は、約２日から約２１日である。

【0030】

ある例示的態様において、腫瘍は固形腫瘍である。ある例示的態様において、固形腫瘍は、膠芽腫または卵巣癌である。

【0031】

ある例示的態様において、第１の組成物は、リコール抗原またはリコール抗原をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む。ある例示的態様において、樹状細胞は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である。ある例示的態様において、成熟樹状細胞はＤＣＯｎｅに由来する。

【0032】

ある例示的態様において、第２の組成物は腫瘍内投与用に調製される。ある例示的態様において、第２の組成物は腫瘍ターゲティング成分を含む。ある例示的態様において、腫瘍ターゲティング成分は腫瘍特異的ウイルスである。ある例示的態様において、腫瘍特異的ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスである。ある例示的態様において、腫瘍特異的ウイルスは、リコール抗原またはリコール抗原をコードする核酸を含む。ある例示的態様において、腫瘍ターゲティング成分は、腫瘍特異的ナノ粒子である。ある例示的態様において、腫瘍特異的ナノ粒子は、リコール抗原またはリコール抗原をコードする核酸を含む。

【0033】

ある例示的態様において、第２の組成物は、リコール抗原またはリコール抗原をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む。ある例示的態様において、樹状細胞は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である。ある例示的態様において、成熟樹状細胞はＤＣＯｎｅに由来する。

【0034】

ある例示的態様において、第１の組成物および第２の組成物はそれぞれ、要すれば、１以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または希釈剤を含んでいてよい。

【0035】

ある例示的態様において、対象は、以前にリコール抗原に曝されている。ある例示的態様において、対象は、以前にリコール抗原に対する免疫応答を形成していた。

【0036】

ある例示的態様において、対象はヒトである。ある例示的態様において、対象は、家畜動物および／または動物医療に適した動物である。

【0037】

他の面において、腫瘍から遠位部位で該対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、該第１の組成物が、ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体または該ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体をコード化する核酸を含む、ワクチン接種工程；および、腫瘍部位で該対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、該第２の組成物が、ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体または該ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体をコード化する核酸を含む、腫瘍マーキング工程、を含む、対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法を提供する。

【0038】

ある例示的態様において、該方法は、対象にブースター組成物を投与することをそれぞれ含む１回以上のブースター工程をさらに含み、ここで、該ブースター組成物は、ジフテリア毒素もしくはその無害化変異体、またはジフテリア毒素もしくはその無害化変異体をコード化する核酸を含む。ある例示的態様において、１回以上のブースター工程は腫瘍マーキング工程の前に行われる。

【0039】

ある例示的態様において、ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体はＣＲＭ１９７である。

【0040】

ある例示的態様において、腫瘍マーキング工程は、第２の組成物を腫瘍内または腫瘍の近位に投与することを含む。

【0041】

ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、胸骨内投与、皮内投与、経皮投与、経皮内投与、組織の間質腔への送達および非腫瘍組織への送達からなる群より選択される経路を介して第１の組成物を投与することを含む。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を皮内投与することを含む。ある例示的態様において、第１の組成物は皮内注射用に調製されている。ある例示的態様において、第１の組成物は、皮内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を筋肉内に投与することを含む。ある例示的態様において、第１の組成物は筋肉内注射用に調製される。ある例示的態様において、第１の組成物は、筋肉内注射に許容される希釈剤または溶媒を含む。

【0042】

ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を腫瘍が存在する臓器系とは異なる臓器系に投与することを含む。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を腫瘍とは反対側の部位に投与することを含む。

【0043】

ある例示的態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程とは、時間的に分離されている。ある例示的態様において、ワクチン接種工程は、腫瘍マーキング工程の後に行われる。ある例示的態様において、腫瘍マーキング工程は、ワクチン接種工程の後に行われる。ある例示的態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間は、ワクチン接種工程の結果として免疫応答を形成するのに十分である。ある例示的態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間は、約２日から約２１日である。

【0044】

ある例示的態様において、腫瘍は固形腫瘍である。ある例示的態様において、固形腫瘍は、膠芽腫または卵巣癌である。

【0045】

ある例示的態様において、第１の組成物は、ＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む。ある例示的態様において、樹状細胞は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である。ある例示的態様において、成熟樹状細胞はＤＣＯｎｅに由来する。

【0046】

ある例示的態様において、第２の組成物は腫瘍内投与用に調製される。ある例示的態様において、第２の組成物は腫瘍ターゲティング成分を含む。ある例示的態様において、腫瘍ターゲティング成分は腫瘍特異的ウイルスである。ある例示的態様において、腫瘍特異的ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスである。ある例示的態様において、腫瘍特異的ウイルスは、ＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコード化する核酸を含む。ある例示的態様において、腫瘍ターゲティング成分は腫瘍特異的ナノ粒子である。ある例示的態様において、腫瘍特異的ナノ粒子は、ＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコードする核酸を含む。

【0047】

ある例示的態様において、第２の組成物は、ＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む。ある例示的態様において、樹状細胞は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性の成熟樹状細胞である。ある例示的態様において、成熟樹状細胞はＤＣＯｎｅに由来する。

【0048】

ある例示的態様において、第１の組成物および第２の組成物はそれぞれ、要すれば、１以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または希釈剤を含んでいてよい。

【0049】

ある例示的態様において、対象はヒトである。ある例示的態様において、対象は、家畜動物および／または動物医療に適した動物である。

【0050】

他の面において、対象に腫瘍部位で非腫瘍抗原または該非腫瘍抗原をコード化する核酸を投与することを含み、ここで、該対象が、以前に該非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸をワクチン接種されたことがある、該対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法を提供する。

【0051】

他の面において、対象に腫瘍部位でリコール抗原またはリコール抗原をコード化する核酸を投与することを含み、ここで、該対象が、以前に該リコール抗原またはリコール抗原をコード化する核酸をワクチン接種されたことがあり、かつ該抗原が非腫瘍抗原である、該対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法を提供する。

【0052】

他の面において、対象に腫瘍部位でジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体または該ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体をコード化する核酸を投与することを含み、ここで、該対象が、以前に該ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体または該ジフテリア毒素もしくはその無毒化変異体をコード化する核酸をワクチン接種されたことがある、該対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法を提供する。

【0053】

ある例示的態様において、ジフテリア毒素またはその無害化変異体はＣＲＭ１９７である。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】図１Ａ－図１Ｂは、４時間後および２４時間後の、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞（ｎ＝３）によるサブユニットＫＬＨタンパク質の取り込み（図１Ａ）と、ＯＶ９０卵巣癌細胞（ｎ＝２）の標識化（図１Ｂ）を示す。細胞外結合サブユニットＫＬＨ－ＦＩＴＣをクエンチするために０．０８％のトリパンブルー（ＴＢ）を添加し、細胞内サブユニットＫＬＨ－ＦＩＴＣの割合を可視化した。

【図2】図２Ａ－図２Ｂは、４時間後および２４時間後の、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞（ｎ＝３）によるβ－ガラクトシダーゼタンパク質の取り込み（図２Ａ）と、ＯＶ９０卵巣癌細胞（ｎ＝２）の標識化（図２Ｂ）を示す。細胞外結合β－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣをクエンチするために０．０８％トリパンブルーを添加し、細胞内β－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣの割合を可視化した。

【図3】図３は、４時間後および２４時間後の、ＯＶ９０卵巣癌細胞（ｎ＝２）による タンパク質の取り込みを示す。細胞外結合ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８をクエンチするために０．０８％トリパンブルーを添加し、細胞内ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８の割合を可視化した。

【図4】図４Ａ－図４Ｂは、ヒト化Ｕ８７－ＭＧ膠芽腫モデルにおける腫瘍増殖阻害を示す。腫瘍サイズは、デジタルノギスを用いて１週間当たり３回測定した（図４Ａ）。注射したワクチン接種マウスにおける１８日目の腫瘍サイズを図４Ｂに示す。

【図5】図５Ａ－図５Ｂは、ヒト化Ａ３７５黒色腫モデルにおける腫瘍増殖阻害を示す。腫瘍サイズは、デジタルノギスを用いて１週間当たり３回測定した（図５Ａ）。注射したワクチン接種マウスの３０日目以降の腫瘍サイズを図５Ｂに示す。

【図6】図６Ａ－図６Ｄは、マウスの血清中の抗ＫＬＨ ＩｇＧレベル（図６Ｃ－６Ｄ）およびＩｇＭレベル（図６Ａ－６Ｂ）を経時的に示す。抗ＫＬＨ ＩｇＧ濃度および抗ＫＬＨ ＩｇＭ濃度（ＵＩ／ｍＬ）を、Ｄ０、Ｄ１４および屠殺時に採取したマウス血清を用いてＥＬＩＳＡにより測定した。１群あたりＮ＝５匹のマウスを用いた。グラフは各群の抗ＫＬＨ ＩｇＧおよびＩｇＭの個別データを示す（（図６Ａおよび図６Ｃ）は膠芽腫群、（図６Ｂおよび図６Ｄ）は黒色腫群である）。２元配置分散分析（Two-way ANOVA）とダネットの多重比較検定を用いた。＊ 対 ビークル群、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１。

【図7】図７Ａ－図７Ｄは、４時間後および２４時間後の、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞（ｎ＝２）によるＣＲＭ１９７タンパク質の取り込み（図７Ａ）と、ＤＣＯｎｅ前駆ＡＭＬ細胞（ｎ＝４）（図７Ｂ）、ＯＶ９０卵巣癌細胞（ｎ＝２）（図７Ｃ）、Ｕ８７ ＭＧ膠芽腫癌細胞（ｎ＝３）（図７Ｄ）の標識化を示す。細胞外結合ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８をクエンチするために０．０８％トリパンブルーを添加し、細胞内ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８の割合を可視化した。

【図8】図８Ａ－図８Ｂは、ヒト化ＯＶ９０ｌｕｃ卵巣癌マウスモデルにおける腫瘍増殖を示す。腫瘍の体積（ｍｍ３）を、楕円体近似式（ellipsoid formula） (ＬｘＷｘＨ)π／６で算出した（図８Ａ）。生物発光強度（photon／秒）が示されている（図８Ｂ）。

【図9】図９は、生物発光強度（動物あたりの総光子束（Optical））の経時変化を示すイメージングデータを示す。

【発明を実施するための形態】

【0055】

詳細な説明
本発明は、対象において腫瘍に対する免疫応答を生成する方法を提供する。この方法は、一般に、腫瘍から遠位部位で該対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程と、腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物が、同じ非腫瘍抗原（または同じ非腫瘍抗原をコードする核酸）を含む、腫瘍マーキング工程とを含む。

【0056】

本明細書で用いる用語“免疫応答”は、Ｔ細胞介在性および／またはＢ細胞介在性免疫応答を含む。Ｔ細胞の例示的な免疫機能は、例えば、サイトカイン産生および他の細胞における細胞毒性の誘導を含む。Ｂ細胞の機能には、抗体産生が含まれる。さらに、この用語はＴ細胞の活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答、例えば、抗体産生およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化が含まれる。免疫応答に関与する免疫細胞には、Ｂ細胞およびＴ細胞（ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞）などのリンパ球；抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、ランゲルハンス細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞およびケラチン生成細胞、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、オリゴデンドロサイトなどのノンプロフェッショナル抗原提示細胞）；ナチュラルキラー細胞；マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球などのミエロイド細胞が挙げられる。ある態様において、この用語は、Ｔ細胞介在免疫応答を意味する。免疫応答は、いくつかの態様において、Ｔ細胞依存性免疫応答であってもよい。当業者は、語句“腫瘍に対する免疫応答”はまた、（ｉ）該ポリペプチドを負荷した自己または同種異系の樹状細胞を含む樹状細胞、または（ｉｉ）該ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルス、の腫瘍内投与などの腫瘍内投与によって腫瘍微小環境に導入される非ヒト抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を含むことを理解している。

【0057】

本明細書で用いる用語“Ｔ細胞依存性免疫応答”は、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＴ細胞およびＢ細胞の両方の集団のいずれかが活性化され、Ｔ細胞がさらに、Ｔ細胞およびＢ細胞ならびに他の免疫細胞がそれらの機能を実行する際に補助する免疫応答を意味する。

【0058】

本明細書で用いる用語“腫瘍”は、異常に速く増殖している細胞塊、例えば組織への言及を含む。新生物細胞を含む増殖は、“腫瘍”としても知られる新生物であり、一般に、対象の体内に別個の組織塊を形成する。腫瘍は、正常組織との構造的組織および機能的協調性の部分的または完全な欠如を示すことがある。本明細書で用いる腫瘍は、造血腫瘍ならびに固形腫瘍を包含することを意図する。ある態様において、腫瘍は固形腫瘍である。本明細書で用いる用語“腫瘍”は、腫瘍微小環境または腫瘍部位、すなわち、腫瘍内の領域および腫瘍組織の直接外側の領域である。ある態様において、腫瘍微小環境または腫瘍部位は、腫瘍組織の境界内にある領域である。ある態様において、腫瘍微小環境または腫瘍部位は、腫瘍の腫瘍間質性部分（これは、本明細書中、新生細胞の血漿膜と新しく形成された新生血管の血管壁との間に介在するすべてのものとして定義される）を含む。本明細書で用いる、用語“腫瘍微小環境”または“腫瘍部位”とは、腫瘍のすぐ周囲の領域も含む、腫瘍が存在する対象内の位置を意味する。

【0059】

腫瘍は、良性（例えば、良性腫瘍）であるか、または悪性（例えば、悪性腫瘍もしくは癌）であってもよい。悪性腫瘍は、大きく分けて３つのタイプに分類することができ、上皮構造に由来するものを癌腫と呼び、筋肉、軟骨、脂肪または骨などの結合組織に由来するものを肉腫と呼び、そして免疫系の構成要素を含む造血構造（血液細胞の形成に関わる構造）に影響を及ぼすものを白血病およびリンパ腫と呼ぶ。他の腫瘍としては、神経線維腫症が挙げられるが、これに限定されない。ある例示的態様において、腫瘍は膠芽腫である。ある例示的態様において、腫瘍は、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌、明細胞性卵巣癌、子宮内膜症性卵巣癌、粘液性卵巣癌または混合上皮性卵巣癌にさらに細分化され得る上皮性卵巣癌）である。

【0060】

固形腫瘍は、良性または悪性であり得る組織の異常な塊である。特定の態様において、固形腫瘍は、それを形成する細胞の種類によって命名される（肉腫、癌腫およびリンパ腫など）。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例としては、脂肪肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、粘液肉腫およびその他の肉腫、中皮腫、滑膜腫、平滑筋肉腫、ユーイング腫瘍、大腸癌、横紋筋肉腫、膵臓癌、リンパ系悪性腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma)、腺癌、基底細胞癌、汗腺癌、扁平上皮癌、甲状腺髄様癌、褐色細胞腫脂腺癌、甲状腺乳頭癌、乳頭状腺癌、乳頭癌髄様癌、気管支癌、肝細胞癌(hepatoma)、腎細胞癌、胆管癌、ウィルムス腫瘍、絨毛癌、子宮頸癌、精上皮腫、精巣腫瘍、膀胱癌、黒色腫、ＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、例えば、脳幹神経膠腫および混合神経膠腫、膠芽腫（例えば、多形性膠芽腫）、胚芽腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、上衣腫、シュワン腫、ＣＮＳリンパ腫、聴神経腫瘍、松果体腫、血管芽腫、髄膜腫、乏突起膠腫、網膜芽腫、神経芽腫および脳転移）などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0061】

本明細書に記載の方法で治療可能な癌腫としては、扁平上皮癌（様々な組織）、基底細胞癌（皮膚癌の一種）、食道癌、移行上皮癌（膀胱の悪性新生物）を含む膀胱癌、肝細胞癌、結腸直腸癌、肺の小細胞癌および非小細胞癌を含む肺癌、結腸癌、甲状腺癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、副腎皮質癌、膵臓癌、汗腺癌、前立腺癌、乳頭癌、腺癌、脂腺癌、髄様癌、乳頭腺癌、非浸潤性乳管癌（ductal carcinoma in situ）または胆管癌、膀胱腺癌、腎細胞癌、絨毛癌、ウィルム腫瘍、精上皮腫、胎児性癌、子宮頸癌、精巣癌、鼻咽頭癌、骨肉腫、上皮性癌、子宮癌などが挙げられるが、これらに限定される。

【0062】

本明細書に記載の方法で治療可能な肉腫としては、筋肉肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫（osteogenic sarcoma）、脂肪肉腫、線維肉腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、内皮肉腫、骨肉腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫および他の軟部組織肉腫などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0063】

本明細書で用いる用語“対象”は、本明細書に記載の方法のレシピエント、すなわち、細胞性免疫応答を発現し得るレシピエントを意味し、それは哺乳動物である。特定の態様において、対象はヒトである。特定の態様において、対象は、家畜動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコなどである。特定の態様において、対象は、動物医療に適した動物、例えば、動物園の動物である。用語“患者”および“対象”は、互換的に用いられ得る。特定の態様において、対象は、腫瘍（例えば、固形腫瘍）を有するヒトであ。特定の態様において、対象は、腫瘍（例えば、固形腫瘍）を有する家畜動物である。特定の態様において、対象は、腫瘍（例えば、固形腫瘍）を有する動物医療に適した動物である。本明細書で用いる“動物医療に適した動物”とは、獣医師による処置に適した任意の動物であり、細胞性免疫応答を形成できる野生動物、家畜動物および動物園の動物を含むが、これに限定されない。

【0064】

本明細書で用いる用語“ポリペプチド”は、アミド結合（ペプチド結合）により直線的に連結されたアミノ酸モノマーから構成される分子を意味する。本明細書で用いるように、この用語は、本明細書で用いる用語“ペプチド”および“タンパク質”を相互互換的に包含し、該ポリペプチドの部分を含む。

【0065】

本明細書で用いる用語“核酸”は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含むＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにそれらの合成同族体を意味する。核酸は、組換えまたは合成核酸であり得る。

【0066】

本明細書に記載のポリペプチドに関連して用いる用語“抗原”または“抗原性”は、一般的に、Ｔ細胞受容体、抗体または特定の体液性および／または細胞性免疫の他の要素により特異的に認識される少なくとも１つのエピトープを含む生物学的分子を意味する。例えば、ポリペプチドのＭＨＣペプチド抗原複合体(complex)への細胞内プロセシングおよびその後の抗原提示に続いて、分子全体または分子の１以上の部分が認識され得る。本明細書で用いる用語“抗原性ポリペプチド”は、“ポリペプチド抗原”と互換的に用いられる。この用語は、該ポリペプチドの抗原性部分を含み、例えばポリペプチドの細胞内プロセシング後に、ＭＨＣペプチド抗原複合体として生成される。本明細書で用いる用語“抗原”または“抗原性”には、本明細書に記載のポリペプチドの少なくとも１つ、またはそれ以上の抗原性エピトープへの言及が含まれる。特定の態様において、“非腫瘍抗原”とは、本明細書中、腫瘍に由来しない抗原を意味する。例えば、特定の態様において、非腫瘍抗原は、外来抗原であってもよい。ある例示的態様において、非腫瘍抗原は、細菌毒素、例えば、ジフテリア毒素の非毒性変異体であってもよい。

【0067】

本明細書で用いる用語“抗原”または“抗原性”はまた、免疫原としてのポリペプチドでのワクチン接種後に、該ポリペプチドがＴ細胞受容体および／または抗体によって特異的に認識される能力を維持する限り、天然配列への欠失、付加および置換などの改変を含むポリペプチドを意味するためにも用いられ得る。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発、特定の合成手順、または遺伝子工学的アプローチによる意図的なものである場合もあれば、抗原を産生する宿主の突然変異のような偶発的なものである場合もある。合成抗原、例えばポリエピトープ、隣接エピトープおよび他の組換えまたは合成由来の抗原も包含される（Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777 2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242 3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402 408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998；それらの内容全体は引用により本明細書中に包含される）。特定の態様において、抗原性ポリペプチドは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のＣＤ４^＋ Ｔヘルパー細胞エピトープおよび／または少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個のＣＤ８^＋ 細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含む。

【0068】

本明細書で用いる用語“免疫原性組成物”は、免疫原に対する免疫応答を必要とする対象において、該免疫原に対する特定の免疫応答を誘導する物質を意味する。組成物は、アジュバント、および要すれば１以上の薬学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を含み得る。免疫原性組成物は、少なくとも２回、３回、４回または５回の免疫接種を時間間隔を空けて行うような、プライムブーストワクチン接種（prime-boost vaccination）において用いることができる。免疫原性組成物は、該免疫原を含む（同種異系の）樹状細胞であり得る。

【0069】

本明細書で用いる用語“免疫原”は、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドに対して特異的な免疫応答を誘発することができるポリペプチドなどの化合物を意味する。免疫原はまた、抗原、すなわち抗原性ポリペプチドである。対照的に、抗原は、必ずしも免疫原ではない。免疫原は、ワクチン接種に用いられ（ワクチン組成物などの免疫原性組成物において）、腫瘍内送達のために調製された抗原性ポリペプチドは、そうではなくて、対象において誘発されるべき免疫応答の標的として、または既に誘発されている免疫応答の標的として、腫瘍をマーキングするために使用される。本明細書で用いる用語“免疫原”はまた、本明細書に記載の非ヒト抗原性ポリペプチドをコードする核酸を意味するために用いられる。加えて、抗原性ポリペプチドを記載する態様はまた、本明細書に記載の免疫原にも適用される。

【0070】

抗原性ポリペプチドと関連して本明細書で用いる用語“非ヒト”は、細菌ポリペプチド、古細菌ドメイン（Archaea domain）の菌類のポリペプチド、真菌ポリペプチドおよびウイルスポリペプチドを含む、ヒト由来ではないポリペプチを含む。また、植物ポリペプチドおよび非ヒト哺乳動物ポリペプチド、例えば非ヒト哺乳動物、齧歯動物（例えば、マウスおよびラット）、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマおよびロバ、ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウなど）のポリペプチドも含まれる。また、カギアナカサガイ（Megathura crenulata）を含むカタツムリまたは他の軟体動物のポリペプチドも含まれる。この用語“非ヒト”はまた、合成ポリペプチド、すなわち、ヒトによって設計された人工的な配列を有するポリペプチドであって、天然には存在しないか、または天然で未だ同定されていないポリペプチドを包含する。加えて、この用語は、天然配列からのアミノ酸改変を含むヒトポリペプチドを含み、この改変はヒト対象において免疫原性を提供する。

【0071】

本明細書で用いる用語“腫瘍内”は、抗原性ポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸の腫瘍内への送達または輸送を意味する。本明細書に記載の抗原性ポリペプチドの腫瘍内送達または輸送の一例は、当技術分野で一般的に知られている投与経路である腫瘍内投与によるものである。腫瘍内投与のための別の経路として、抗原は、腫瘍に遺伝子配列を送達するために広く開発されている腫瘍特異的担体、例えば腫瘍溶解性ウイルスまたは遺伝子治療ベクターを介して腫瘍に送達されてもよい。そのようなビークルの使用は、複数の投与経路－腫瘍内投与に加えて－例えば、静脈内または腹腔内投与と、その後に腫瘍への該ポリペプチドをコードする核酸の送達をもたらすことを可能にする（Lundstrom, Diseases, 6(2):42 (2018); Alemany, Biomedicines, 2, p.36-49 (2014); Twumasi-Boateng et al., Nature Reviews Cancer 18, p.419-432 (2018)；それらの内容全体は引用により本明細書中に包含される）。

【0072】

本明細書で用いる語句“腫瘍内送達のために調製される”は、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは本明細書に記載の該ポリペプチドをコードする核酸が、腫瘍内送達に適合されている、および／または腫瘍内送達を可能にする形態であることを意味する。腫瘍内送達に用いられる調製物は、免疫系と腫瘍との間の相互作用に有益な効果を有するように構成され得る。例えば、自己由来または同種異系樹状細胞などの樹状細胞は、該ポリペプチドを負荷されてよく、そして腫瘍内投与時に、腫瘍に入るＴ細胞との直接的な相互作用を介して、および／または近隣（bystander）の抗原提示細胞を動員することによって間接的に、さらなる免疫刺激を提供することができる（Laurell et al., Journal for Immunotherapy of Cancer, 5:52 (2017); Wallgren et al., Scandinavian Journal of Immunology, 62, p.234-242 (2005)、それらの内容全体を引用により本明細書中に包含させる）。そのような調製物の別の例は、本明細書に記載のポリペプチドまたは核酸が、腫瘍細胞に感染し、（ｉ）腫瘍細胞内での該核酸の発現、および（ｉｉ）（その後の）該腫瘍細胞による該（発現された）ポリペプチドの細胞内プロセシングおよび抗原提示（ＭＨＣ）を可能にする、腫瘍溶解性ウイルス（または腫瘍細胞内で選択的に複製する任意の他のウイルス）のような腫瘍特異的ウイルスを含む腫瘍標的化ビークルのような腫瘍送達ビークル内に構成され得ることを特徴とする。当業者は、ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸を、体腔内送達のために調製するための他の方法および手段を十分に認識している。例えば、当業者は、腫瘍特異的ナノ粒子のような他の腫瘍標的送達ビークルを適用することができるか、または該ポリペプチドもしくは核酸を腫瘍内に送達するために、腫瘍内注射による腫瘍内投与を適用することができる。特定の態様において、本明細書に記載の腫瘍内送達のために調製されたポリペプチドまたは核酸は、腫瘍標的化ビークル中に構成される。

【0073】

本明細書で用いる用語“腫瘍外”とは、例えば、対象の体内で、腫瘍およびすぐ周囲の組織（例えば、腫瘍微小環境を構成し得る組織）から離れた（例えば、遠位の）場所を意味する。

【0074】

本明細書に記載の使用のための組成物は、対象の腫瘍に対して特異的に向けられた免疫応答を誘発する。当業者は、“特異的に向けられた”とは、腫瘍に対して特異的な免疫応答を意味することを理解する。特異性は、免疫応答の標的として非ヒト抗原性ポリペプチドで腫瘍をマーキングする工程と、該非ヒト抗原性ポリペプチドの抗原性部分（すなわち、標的）に対する免疫応答を誘発する工程によって導入される。したがって、特定の態様において、本明細書に記載の使用のための組成物は、該免疫応答の標的としてマークされた腫瘍に対する免疫応答を誘発するために使用するためのものである。特定の態様において、本明細書に記載の使用のための組成物は、該免疫応答の標的としてマークされた腫瘍に対する免疫応答を誘発するために使用するためのものである；ここで、該標的は、本明細書に記載の非ヒト抗原性ポリペプチドである。

【0075】

特定の態様において、本明細書に記載の腫瘍内送達のために調製された非ヒト抗原性ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸は、免疫応答の標的として腫瘍をマーキングする目的を果たす（腫瘍をマーキングするためのポリペプチド／核酸）。したがって、特定の態様において、該ポリペプチドまたは腫瘍内送達のために調製された該核酸は、腫瘍を、腫瘍内送達後の免疫応答の標的としてマーキングする。

【0076】

本明細書で用いる用語“ワクチン接種工程”とは、本明細書に記載の方法（ワクチン戦略）において、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍性抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、腫瘍から遠位部位で対象に投与する工程を意味する。特定の態様において、本明細書に記載の方法のワクチン接種工程では、組成物は、腫瘍が存在する部位ではない（例えば、腫瘍部位ではない）部位で投与される。特定の態様において、本明細書に記載の方法のワクチン接種工程において、組成物は、腫瘍外の部位に投与される。本明細書で用いる用語“ブースター工程”とは、本明細書に記載の方法（ワクチン接種戦略）の工程であって、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含むブースター組成物を、腫瘍から遠位部位で対象に投与される工程を意味する。特定の態様において、ブースター工程は、ワクチン接種工程の後に実行され、ここで、ワクチン接種工程は、抗原に対する免疫応答をもたらし、ブースター工程は、抗原に対する免疫応答を増強する。特定の態様において、ブースター工程は、例えば、抗原ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）に対する既存の免疫を有する対象において、増強された免疫応答をもたらす。特定の態様において、本明細書に記載の方法におけるワクチン接種工程は、例えば、対象が、非腫瘍リコール抗原に対する既存の免疫を有するとき、ブースターステム（booster stem）である。

【0077】

本明細書で用いる用語“マーキング”、“マーク”または“マークされた”は、本明細書に記載の、抗原性ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸の腫瘍内送達による腫瘍の抗原性状態の能動的な操作を意味する。これは、該腫瘍細胞による該ポリペプチドの細胞内送達ならびにその後のプロセシングおよび提示を介した腫瘍細胞の直接標識を提供するか、あるいは（ｉ）該腫瘍内の非腫瘍細胞による該ポリペプチドの細胞内送達ならびにその後のプロセシングおよび提示、または（ｉｉ）該腫瘍への該抗原性ポリペプチドの細胞外送達（すなわち、マーキング前の該腫瘍内に存在する細胞への細胞外送達）を介した、該抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む、または該抗原性ポリペプチドを負荷した樹状細胞を用いることによる、腫瘍の間接標識を提供する。

【0078】

本明細書で用いる用語“腫瘍マーキング工程”とは、本明細書に記載の方法（例えば、ワクチン戦略）における工程であって、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍性抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、腫瘍部位で対象に投与する工程を意味する。ある例示的態様において、腫瘍マーキング工程は、腫瘍細胞の細胞質への抗原の送達を促進する組成物、方法または技術の使用を含む。

【0079】

本明細書に記載の免疫原性組成物はまた、該非ヒト抗原性ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含むが、免疫原（免疫応答を誘発するためのポリペプチド／核酸）として、該非ヒト抗原性ポリペプチドで標識されている、または標識されるべき腫瘍に対する免疫応答を誘発する目的を果たす。したがって、特定の態様において、該免疫原は、該非ヒト抗原性ポリペプチドまたは核酸で標識されている、または標識されるべき腫瘍に対する免疫応答を誘発するために用いられ、これは、腫瘍内送達のために調製される。原理的に、何れかの抗原性ポリペプチドを腫瘍に導入して、新しい抗原性標的を生成することができる。特定の態様において、標的に対する免疫応答が本明細書に記載の免疫学的組成物の対象への投与後に誘発されるときに、何れかの抗原ポリペプチドを腫瘍に導入して、それぞれ、抗体および／またはＴ細胞受容体によって認識されるＢ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープである新たな抗原標的を生成することができる。

【0080】

当業者は、（ｉ）本明細書に記載の腫瘍内送達のために調製された非ヒト抗原性ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸（腫瘍をマーキングするためのポリペプチド／核酸）、および（ｉｉ）本明細書に記載の免疫原性組成物中の免疫原として構成される非ヒト抗原性ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸（免疫応答を誘発するためのポリペプチド／核酸）は、投与されたとき、その免疫原が、腫瘍のマーキング用ポリペプチドまたは核酸によって確立された１以上の（標的）エピトープに対して向けられる免疫応答を誘発するという点で一致することを理解する。

【0081】

したがって、例えば、（ｉ）および（ｉｉ）のポリペプチドは、腫瘍内のマーキング用ポリペプチドのＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープが、免疫原として用いられたポリペプチドによって誘発されるＴ細胞および／またはＢ細胞応答によって認識されるか、またはそれと反応性であるという点で、免疫学的に一致している。したがって、（ｉ）および（ｉｉ）のポリペプチドは、同じ非ヒト抗原性ポリペプチドに基づいており、要すれば、その同一の抗原性部分を、場合により、その少なくとも１つのＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを共有している（すなわち、免疫学的に一致している）ことが理解される。このようにして、誘発された免疫応答は、該免疫応答の標的としてマーキングされた腫瘍に特異的に向けられる。したがって、一方では免疫応答を誘発するために用いられる該ポリペプチドの剤形と、他方では腫瘍マーキングのために用いられる該ポリペプチドの剤形は、同じである必要はない。実際に、当業者は、ワクチン接種および腫瘍マーキングのために該ポリペプチドの異なる剤形を用いることが有益である可能性があることを理解している。

【0082】

本明細書で用いる用語“Ｔ細胞介在性免疫応答”は、Ｔ細胞が駆動する免疫応答を意味し、ここで、別の免疫応答またはさらなる免疫応答の誘発はＴ細胞の活性化に依存する。特定の態様において、免疫応答は、Ｔ細胞介在性免疫応答／Ｔ細胞依存性免疫応答である。当業者は、Ｔ細胞介在性免疫応答／Ｔ細胞依存性免疫応答を開始するための方法および手段、例えば、細菌－、真菌－、軟体動物－、カタツムリ－、昆虫－または植物由来の抗原を含むがこれらに限定されない多くの文献に記載されている好適な抗原の選択を介する方法および手段、または測定可能なＴ細胞応答が記載されている昆虫または植物由来の抗原、または化学的アジュバント、生物学的アジュバント、タンパク質、ウイルスワクチン、樹状細胞ワクチンもしくはワクチン組成物として投与可能な何れか他の組成物などの好適なアジュバントまたは担体を選択することによる方法および手段を十分に認識している（Bender et al., J. Exp. Med, 182:1663-1671 (1995); Bennett et al., Nature, 393:478-480 (1998); Kalinski and Moser, Nature、5:251-260 (2005); Pashine et al., Nature Medicine Supplement, 11:S63-S68 (2005)、これらの内容全体は引用により本明細書中に包含させる）。

【0083】

本明細書で用いる用語“腫瘍特異的ウイルス”は、腫瘍細胞において選択的に複製する能力を有する何れかのウイルスを含む。

【0084】

本明細書で用いる用語“腫瘍溶解性ウイルス”は、正常細胞と比較して腫瘍細胞を優先的に殺すウイルスを意味する。さらに、この用語は、ポリペプチドをコードする核酸構築物を担持するように設計され得るウイルスを意味し、この核酸構築物は、腫瘍細胞の感染後に該腫瘍細胞で発現される。

【0085】

本明細書で用いる用語“ナノ粒子”は、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドなどの目的の化合物を担持することができ、腫瘍標的化または腫瘍特異的な部位でそれらの表面上で機能化することができる組成物を意味する。腫瘍細胞を積極的に標的化するように設計され得るナノ粒子の例は、ミセルおよびリポソームである。

【0086】

本明細書で用いる用語“樹状細胞”は、抗原性ポリペプチドなどの抗原をその細胞内に取り込むことができ、該抗原またはその免疫原性部分をＭＨＣクラスＩ複合体もしくはＭＨＣクラスＩＩ複合体と共に提示することができる、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）を意味する。この用語には、成熟度に応じて、未成熟樹状細胞（“ｉｍＤＣ”）および成熟樹状細胞（“ｍＤＣ”）の両方が含まれる。特定の態様において、樹状細胞は、成熟樹状細胞である。特定の態様において、樹状細胞は、２０１２年１１月１５日にブダペスト条約の条件下でＤＳＭＺに寄託された受託番号ＤＳＭＺ ＡＣＣ３１８９の細胞株ＤＣＯｎｅの細胞から得られた成熟樹状細胞である。寄託されたＤＣＯｎｅ細胞株から成熟樹状細胞を得る工程は、例えばＥＰ２９３１８７８Ｂ１に記載されている。

【0087】

腫瘍部位からの距離などの測定可能な値に言及するとき、本明細書で用いる用語“約”または“およそ”とは、本明細書に記載の方法を実行するのに適切な、所定の値または範囲の±２０％または±１０％、±５％、±１％または±０．１％の変動を包含する。

【0088】

組成物および製剤
本明細書で提供される、第一面は、非腫瘍抗原（例えば、免疫原としての非ヒト抗原性ポリペプチド）を含むか、または非腫瘍抗原をコードする核酸（例えば、非ヒト抗原性ポリペプチドをコードする核酸）を含む第１の組成物（例えば、免疫原性組成物）を投与する（ワクチン接種）ことを含むワクチン接種工程に関する。特定の態様において、第１の組成物は、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む。特定の態様において、第１の組成物は、要すれば、１以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または希釈剤を含んでいてよい。

【0089】

本明細書で提供される、第２の面は、非腫瘍抗原（例えば、免疫原としての非ヒト抗原性ポリペプチド）を含む、または非腫瘍抗原をコードする核酸（例えば、非ヒト抗原性ポリペプチドをコードする核酸）を含む第２の組成物（例えば、免疫原性組成物）を投与する（ワクチン接種する）ことを含む腫瘍マーキング工程に関する。特定の態様において、第２の組成物は、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む。特定の態様において、第２の組成物は、要すれば、１以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または希釈剤を含む。

【0090】

特定の態様において、本明細書に記載の非腫瘍抗原（例えば、非ヒト抗原ポリペプチド）は、２つの目的に役立つ。第一の目的は免疫応答を生成することである。特定の態様において、免疫応答は、免疫原性組成物中に免疫原として挿入されることにより、抗原（例えば、非ヒト抗原性ポリペプチド）に対するＴ細胞介在性免疫応答である。第二の目的は、該免疫応答の標的として腫瘍をマーキングすることである。当業者であれば、腫瘍マーキングおよび免疫応答の負荷／生成が、負荷された免疫応答がこのようにマーキングされた腫瘍に対して向けられるという点で一致していることが必要であることを直ちに理解することができる。“マッチしている”とは、誘発される（されるべき）免疫応答が、腫瘍に積極的に導入された抗原性ポリペプチドに対して特異的に向けられていることを意味する。特定の態様において、腫瘍のマーキングおよび免疫応答の誘発において、同じかまたは対応する抗原性エピトープが用いられる。したがって、特定の態様において、本明細書に記載の第１の組成物（例えば、免疫原性組成物）の対象への投与後に、同じ抗原に基づく免疫応答の標的として、マーキングされるべき腫瘍（または既にマーキングされている腫瘍）に対して特異的に向けられた免疫応答が誘発される。

【0091】

言い換えれば、マーキングのための第２の組成物中の抗原性ポリペプチドおよび第１の組成物中の免疫原とは、対象への第１の組成物の投与後に誘発される免疫応答が、同じかまたは少なくとも免疫原的に同じ抗原性ポリペプチドの腫瘍内送達後に、該抗原性ポリペプチドでマーキングされた腫瘍に対して向けられるという点で一致している。これは、本明細書に記載の免疫原性組成物の投与後に誘発される免疫応答が、腫瘍がマーキングされるべき（またはマーキングされる）少なくとも１つのＴ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープに特異的に向けられることを意味する。特定の態様において、該免疫原性組成物中の非ヒト抗原性ポリペプチドは、本明細書に記載の腫瘍のマーキングに用いられるポリペプチドに対応するポリペプチドである。

【0092】

特定の態様において、本明細書に記載の第１の組成物（例えば、免疫原性組成物）の投与後に誘発される免疫応答は、Ｔ細胞介在性免疫応答またはＴ細胞依存性免疫応答である。免疫細胞群を活性化する適当な免疫原および／またはアジュバントを同定することは、当業者の能力の範囲内である。当業者が適当な抗原を選択するのを助ける参考文献は、例えば、Bender et al., J. Exp. Med, 182:1663-1671 (1995); Bennett et al., Nature, 393:478-480 (1998); Kalinski and Moser, Nature, 5:251-260 (2005); Van Tenderloo et al., PNAS, 107:31, p. 13824-13829 (2010); Anguille et al., Blood, 12;130(15):1713-1721 (2017); Tacken et al., Blood, 106:4, p.1278-1285 (2005); Vigneron et al, Cancer Immunity, 13:15 (2013); および、Cheever et al, Clin Cancer Res;15:5323-5337 (2009)であり、それら全ての内容全体は引用により本明細書中に包含させる。当業者は、免疫原性組成物に関連して記載された抗原性ポリペプチドが、腫瘍内送達面にも関連しており、逆もまた同様であることを直ちに理解する。好適な抗原の例としては、ウイルス、細菌、真菌由来のタンパク質；アレルゲン、毒素および毒物、または鶏卵オバルブミンおよびジャイアントキーホールリンペット（Megathura crenulata）由来のキーホールリンペットヘモシアニンなどの様々な供給源のモデル抗原が挙げられる。特定の態様において、好適な抗原は、バクテリア由来のものである。特定の態様において、好適な抗原は、ジフテリア毒素である。特定の態様において、好適な抗原は、ジフテリア毒素の非毒性変異体である。特定の態様において、好適な抗原はＣＲＭ１９７である。他の好適な抗原性ポリペプチドは、対象の先行ワクチン接種において用いられたポリペプチドであり、例えば、本明細書中以下に、より詳細に記載されるリコール（recall）抗原などである。そのようなワクチン接種で用いられる一般的なワクチンは、異なる抗原性ポリペプチドを含んでもよく、これは、アジュバントの有無にかかわらず、異なる微生物（リコール）抗原を構成するという点で多価であり得る。

【0093】

本明細書で用いる用語“リコール抗原”は、以前に（例えば、対象に腫瘍が生じる前、または腫瘍マーキング工程の前に）対象が遭遇した抗原（例えば、抗原性ポリペプチド）を意味する。リコール抗原とは、対象が以前に遭遇したことがあり、対象に既存のメモリーリンパ球が存在する抗原である。特定の態様において、リコール抗原とは、例えば、以前の感染または予防接種の結果として、対象に既存のメモリーリンパ球が存在する抗原（例えば、抗原性ポリペプチド）を意味する。特定の態様において、リコール抗原は、ワクチン接種を介して対象が以前に遭遇した抗原ポリペプチドを意味する。特定の態様において、リコール抗原は、該対象に既存の免疫が存在する抗原性ポリペプチドである。

【0094】

当業者は、本明細書に記載の免疫原組成物に含まれる免疫原としての非ヒト抗原ポリペプチドに対する免疫応答の形成を行うために、常套的に適用できる複数の方法および手段を有する。

【0095】

免疫応答を細胞免疫に向けるアジュバントの選択において当業者を補助する参考文献は、例えば、Pashine et al., Nature Medicine Supplement, 11:S63-S68 (2005)およびAwate et al., Frontiers in Immunology, 4:114, p.1-10 (2013)であり、その内容全体は引用により本明細書宙に包含させる。そのようなアジュバントの例としては、アルミニウム金属塩、水中油型エマルジョン、リポソーム、トール様受容体アゴニストまたはそれらの組み合わせが挙げられる。他のアジュバントとしては、リポソーム、ビロソーム（virosome）、ＭＦ５９、モンタニド、ＩＳＣＯＭ、ＱＳ-２１、アルミニウム、ＡＳ０４、ポリＩ：Ｃ、ＭＰＬ、ＧＬＡ、イミキモド、ＣｐＧ ＯＤＮ、キチン、キトサン、β－グルカンまたはそれらの組み合わせが挙げられる（Temizoz et al. Int Immunol. 2016 Jul; 28(7): 329－338、その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）。

【0096】

特定の態様において、本明細書に記載の方法に使用するための組成物（例えば、非腫瘍抗原を含む第１の組成物および非腫瘍抗原を含む第２の組成物）は、要すれば、非腫瘍抗原を含む樹状細胞；Ｔ細胞免疫応答誘発性アジュバント；非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含むＴ細胞免疫応答誘発性ウイルスまたはウイルス様粒子；あるいは、それらの組合せを含んでいてよい。

【0097】

一般的に、本明細書に記載の方法で使用するための組成物に関する態様が、例えば、（ｉ）本明細書に記載の方法に用いるための非腫瘍抗原（例えば、非ヒト抗原性ポリペプチド）またはそれをコードする核酸、（ｉｉ）本明細書に記載の方法に用いるための免疫原性組成物、（ｉｉｉ）免疫応答を誘発するための方法、（ｉｖ）処置方法、および適当な場合には本明細書に記載の方法に用いるための他の面にも適用されることが明示的に想定されている。

【0098】

特定の態様において、本明細書に記載の方法は、第１の組成物および第２の組成物の使用を採用する。特定の態様において、第１の組成物は、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍性抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の態様において、第１の組成物は、抗原性ポリペプチドを含む。特定の態様において、第１の組成物は、抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の態様において、第１の組成物は、非腫瘍性抗原を含む。特定の態様において、第１の組成物は、非腫瘍性抗原をコードする核酸を含む。

【0099】

特定の態様において、第２の組成物は、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む（すなわち、第２の組成物は、第１の組成物と同じ抗原性ポリペプチド、または少なくとも免疫学的に第１の組成物と同じ抗原性ポリペプチド、あるいは該抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む）。特定の態様において、第２の組成物は、抗原性ポリペプチドを含む。特定の態様において、第２の組成物は、抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の態様において、第２の組成物は、非腫瘍性抗原を含む。特定の態様において、第２の組成物は、非腫瘍性抗原をコードする核酸を含む。

【0100】

特定の態様において、第１の組成物および／または第２の組成物は、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む樹状細胞を含み得る。特定の態様において、第１の組成物は、抗原性ポリペプチドまたは抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む樹状細胞を含む。特定の態様において、第２の組成物は、抗原性ポリペプチドまたは抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む樹状細胞を含む。特定の態様において、第１の組成物は、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む樹状細胞を含む。特定の態様において、第２の組成物は、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコード化する核酸を含む樹状細胞を含む。

【0101】

特定の態様において、樹状細胞は、かかる細胞が本明細書に記載の抗原性ポリペプチドを負荷される場合に、樹状細胞ワクチンとして用いられる。特定の態様において、組成物（例えば、第１の組成物または第２の組成物）は、前駆細胞株から分化した成熟樹状細胞を含む。特定の態様において、組成物（例えば、第１の組成物または第２の組成物）は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性およびＣＤ８３陽性である成熟樹状細胞を含む。特定の態様において、樹状細胞は、２０１２年１１月１５日にＤＳＭＺに寄託された受託番号ＤＳＭＺ ＡＣＣ３１８９の細胞株ＤＣＯｎｅの細胞である。例えば、その開示内容全体が引用により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／００６０５８を参照のこと。例えば、特定の態様において、第１の組成物および／または第２の組成物はそれぞれ、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍性抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞株ＤＣＯｎｅの樹状細胞を含む。樹状細胞の添加戦略(loading strategy)については、本明細書に記載する。当業者は、樹状細胞を免疫原性組成物の形態でどのように効果的に使用することができるかについて十分な指針を有しており、これは例えば、ＥＰ２９３１８７８ Ｂ１、ＷＯ２０１４／００６０５８ Ａ１、ＷＯ２００９／０１９３２０およびSaxena and Bhardwaj, Trends in Cancer, 4:2, p.119-137 (2018)を含む複数の文献に記載されており、これらの内容全体は引用により本明細書に組み込まれる。

【0102】

特定の態様において、薬学的に有効量の組成物が投与される。本明細書で用いる、例えば第１の組成物または第２の組成物の“有効量”または“薬学的に有効量”とは、免疫応答を達成するのに必要な用量および期間で、有効な量を意味する。例えば、有効量は、要すれば樹状細胞に含まれる抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍性抗原）に対する免疫応答を誘導するのに十分な量である。有効量は、本明細書に記載の抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）でマーキング（mark）された腫瘍に対する免疫応答を誘導するのに十分な量である。

【0103】

本明細書に記載の第１の組成物および／または第２の組成物は、当業者に知られている何らかのアジュバントを含んでいてもよい。投与経路に関わらず、当業者に知られているアジュバントは、本発明の組成物内に包含される抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）の免疫原性を改善／増強するために採用され得る。アジュバントは、抗原（例えば、非腫瘍性抗原を含む組成物）の免疫原性を高めるが、必ずしもそれ自体が免疫原性である必要はない。

【0104】

アジュバントは、当業者によって、例えば、ワクチンに対する免疫応答を改善するために用いられてきた。アジュバントには、内因性のものと外因性のものがある。内因性アジュバントは、ワクチンとして用いられる死滅または弱毒化した細菌に由来するものである。外因性アジュバントは、抗原に非共有結合した免疫調節物質であり、免疫反応を高めるように製剤されている。

【0105】

特定の態様において、第１の組成物および／または第２の組成物は、Ｔ細胞免疫応答誘発アジュバントを含んでいてもよい。本明細書中アジュバントまたはウイルスまたはウイルス様粒子に関連して用いる用語“Ｔ細胞免疫応答誘発”とは、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋ Ｔ細胞免疫応答を増強するか、あるいはＣＤ４^＋および／もしくはＣＤ８^＋ Ｔ細胞活性化に向ける免疫応答を駆動することを意味する。当業者は、例えばリポソーム、ビロソーム、ＭＦ５９、モンタニド、ＩＳＣＯＭ、ＱＳ－２１、アルミニウム、ＡＳ０４、ポリＩ：Ｃ、ＭＰＬ、ＧＬＡ、イミキモド、ＣｐＧ ＯＤＮ、キチン、キトサン、β－グルカンまたはそれらの組み合わせなどの、この目的のために用いられ得るアジュバントをよく知っている（Temizoz et al. Int Immunol. 2016 Jul; 28(7): 329－338、その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）。

【0106】

特定の態様において、特に非経腸投与のためにアジュバントを用いることができる。かかるアジュバントとしては、例えば、アルミニウム化合物（リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなど）が挙げられる。抗原は、標準的なプロトコールに従って、アルミニウム化合物で沈殿させたり、アルミニウム化合物に吸着させたりすることができる。非経腸投与のための他のアジュバント、ならびに腫瘍内または腫瘍周囲の投与のためのアジュバントは、当業者に知られている。

【0107】

本明細書に記載の第１の組成物および／または第２の組成物は、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む、ウイルス、例えば、Ｔ細胞免疫応答誘発ウイルスまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み得る。本明細書に記載の組成物中に、または本明細書に記載の組成物として用いられ得るウイルスまたはＶＬＰを設計および製造することは常套的な実験の範囲内である。このようなウイルス、とりわけＴ細胞免疫応答誘発ウイルスまたはＶＬＰは、ワクチン接種の目的で詳しく記載されている。これは、例えば、Frietze et al., Curr Opin Virol., 18: 44－49 (2016); Koup and Douek, Cold Spring Harb Perspect Med, 2011;1:a007252に記載されており、これらの開示内容全体は引用により本明細書中に包含される。Ｔ細胞免疫応答誘発ウイルスまたはＶＬＰの例としては、例えば、牛痘（ワクシニア）ウイルスまたはその誘導体、例えば改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスおよびヒトパピローマウイルスに基づくＶＬＰ、Ｂ型肝炎ウイルスもしくは異なる腫瘍抗原を提示するように設計されたＶＬＰが挙げられる。特定の態様において、本明細書に記載の組成物（例えば、腫瘍マーキング工程で用いられる第２の組成物）は、腫瘍溶解性ウイルスを含んでいてもよい。腫瘍溶解性であることが臨床的に試験されたウイルスとしては、アデノウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルスおよびワクシニアが挙げられるが、これらに限定されない。

【0108】

本明細書で用いる用語“医薬組成物”または“医薬製剤”とは、対象に投与したときの毒性に関して、そこに含まれる有効成分の生物学的活性を有効にする（例えば、そこに含まれる抗原性ポリペプチドを免疫原性にする）ことを可能にするような形態であり、許容できない毒性のある成分をさらに含まない製剤を意味する。“薬学的に許容される担体”とは、医薬製剤および／または組成物に含まれる成分のうち、有効成分以外のもので、対象に対して毒性のないものを意味する。薬学的に許容される担体には、安定化剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤などが含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、担体の選択は、特定の投与方法によって部分的に決定される。従って、様々な適切な製剤および組成物が存在する。例えば、腫瘍内投与、筋肉内投与および他の投与経路に適する様々な製剤および組成物が当技術分野で知られている。

【0109】

特定の態様において、医薬組成物は、防腐剤を含み得る。適切な防腐剤は、例えば、プロピルパラベン、メチルパラベン、塩化ベンザルコニウムおよび安息香酸ナトリウムが挙げられ得売る。特定の態様において、２種以上の防腐剤の混合物が用いられる。防腐剤またはその混合物は、一般的には、全組成物の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。

【0110】

担体については、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)にさらに記載されている。薬学的に許容される担体は、一般的に、用いられた投与量および濃度で本明細書に記載の方法に従って組成物を投与された対象に対して非毒性であり、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：クエン酸、リン酸およびその他の有機酸などの緩衝剤；メチオニンおよびアスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；ゼラチン、免疫グロブリンまたは血清アルブミン等のタンパク質；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；塩化ヘキサメトニウム；３－ペンタノール；シクロヘキサノール；および、ｍ－クレゾールなど）；グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、グリシン、アルギニン、リシンなどのアミノ酸；デキストリン、グルコース、マンノースなどの単糖類、二糖類およびその他の炭水化物；スクロース、トレハロース、ソルビトールまたはマンニトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤、ならびに／またはＥＤＴＡなどのキレート剤。

【0111】

特定の態様において、緩衝剤が組成物中に含まれる。適切な緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、リン酸カリウム、リン酸、および様々な他の酸および塩が挙げられる。特定の態様において、２種以上の緩衝剤の混合物が用いられる。緩衝剤またはその混合物は、一般的には、組成物全量に対して約０．００１重量％～約４重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製する方法は、当業者に知られている。例えば、Remingtonの、The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams ＆ Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)を参照のこと。

【0112】

特定の態様において、本明細書に記載の組成物および製剤は、水溶液を含み得る。また、製剤または組成物は、本明細書に記載の方法を用いて処置される特定の適応症、疾患または病状（例えば、腫瘍タイプ）に有用な複数の有効成分を含んでいてもよい。かかる有効成分は、好適には、意図した目的に有効な量で組み合わせて存在する。

【0113】

製剤および組成物には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、肺投与、経皮投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、頬投与、舌下投与または坐薬による投与のためのものが含まれる。製剤および組成物は、当業者に知られている様々な投与経路の何れか１つのためのものを含む。特定の態様において、組成物は非経腸的に投与される。本明細書で用いる用語“非経腸”とは、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、膣投与および腹腔内投与を含む。

【0114】

特定の態様において、組成物および製剤は、無菌液体製剤、例えば、懸濁液、エマルジョン、分散液、粘性組成物または等張水溶液として提供され、これらは、いくつかの態様において、選択されたｐＨに緩衝されてもよい。特定の態様において、組成物および製剤は、ゲル、他の粘性組成物および固体組成物として提供される。粘性組成物は、特定の組織との接触時間を長くするために、適切な粘度範囲内で配合することができる。液体または粘性の組成物は、担体を含むことができ、これは、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、水、ポリオール（例えば、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、グリセロール）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。

【0115】

滅菌された注射剤は、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤または賦形剤と混合して、組成物に溶媒を組み込むことによって調製することができる。組成物には、所望の投与経路および製剤に応じて、ゲル化剤や粘度向上剤、ｐＨ緩衝剤、湿潤剤、分散剤または乳化剤（メチルセルロースなど）、香料、着色料および／または防腐剤などの補助物質を配合することができる。適切な製剤を調製するために、当業者が入手可能な標準的なテキストを参考にすることもできる。

【0116】

また、組成物の無菌性および安定性を高めるために、キレート剤、抗菌防腐剤、緩衝剤および抗酸化剤などの様々な添加剤を加えることができる。組成物は、クロロブタノール、パラベン、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤により、微生物の作用を受けずに無菌状態を保つことができる。吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを用いることで、注射剤の吸収を延長させることができる。

【0117】

当業者は、本明細書に記載の抗原に対する免疫応答を形成する他の適切な免疫原性組成物を知っている。例えば、本明細書に記載の免疫原と、免疫原に結合した担体タンパク質とを含むサブユニットワクチンを使用するという選択肢もある。

【0118】

抗原性ポリペプチドおよび核酸
特定の態様において、本明細書に記載の方法で用いる組成物は、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍性抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の態様において、抗原性ポリペプチドが腫瘍内投与用の組成物中にある場合、抗原性ポリペプチドは、腫瘍を標的としているか、または腫瘍内投与用に調製されているか、あるいは抗原性ポリペプチドをコードする核酸は、腫瘍を標的としているか、または腫瘍内投与用に調製されているかのいずれかである。当業者であれば、腫瘍抗原に依存しないワクチン接種という新たな概念は、腫瘍のマーキングに関しても、既に記載のようにマーキングされた腫瘍に対して免疫応答を形成するワクチン接種に関しても、当技術分野で知られている複数の方法および手段で実現できることを理解できる。

【0119】

本明細書に記載の医学的方法において、本明細書に記載の非ヒト抗原性ポリペプチドを用いることにより、免疫応答の標的としての腫瘍のマーキングまたは標識が、インビトロまたはエクスビボではなく、インビボで起こる。

【0120】

より具体的には、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは核酸は、当技術分野で一般的によく知られている種々の方法で、腫瘍内送達のために調製することができる。例えば、調製は、例えばポリペプチドまたは核酸を含む腫瘍標的化組成物を調製することによって、該ポリペプチドまたは核酸の腫瘍標的化を伴っていてもよい。腫瘍標的化組成物は、腫瘍特異的となるような方法でポリペプチドまたは核酸を含む。特定の態様において、腫瘍標的化されたポリペプチドまたは核酸を対象に投与すると、非腫瘍組織と比較して腫瘍組織に対する特異性に基づいて腫瘍内送達が効果的に行われることである。腫瘍特異性はまた、腫瘍内送達を提供するために腫瘍への標的化を可能にし得ることを示す。

【0121】

特定の態様において、腫瘍内送達のために調製されたポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸は、以下のうち１以上を用いて腫瘍を標的化する：例えば、該ポリペプチドをコードする核酸を含む、腫瘍溶解性ウイルスを含む、腫瘍特異的ウイルス；該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含む腫瘍特異的ナノ粒子。特定の態様において、該ポリペプチドまたは核酸は、該ポリペプチドまたは核酸に融合した腫瘍標的化抗体、ペプチド、小分子または核酸アプタマーを用いて腫瘍標的化される。

【0122】

本明細書に記載のポリペプチドまたは核酸を腫瘍標的化する（対象への投与時に腫瘍内送達を達成するための）別の方法は、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスを調製することを含み、このウイルスは、該核酸を腫瘍細胞内で発現させるように設計されている。腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞を特異的に標的化するために使用され得ることは、当技術分野において広く記載されており、例えば、Lawler et al., JAMA Oncol. 1;3(6):841-849 (2017); Howells et al., Front Oncol. 7:195 (2017)に記載されている（それらの内容全体は引用により本明細書中に包含される）。さらに、例えばＷＯ２０１４１３８３１４ Ａ１（その内容全体は引用により本明細書中に包含される）に例示されているように、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞と結合するように改変することができる。腫瘍溶解性ウイルスが、ポリペプチドをコードする核酸構築物を腫瘍細胞に送達するために用いられ得て、該ウイルスは、該ポリペプチドを腫瘍細胞にて発現するように改変されることも当技術分野でよく知られている（Hutzler et al., Scientific Reports, 7: 16892 (2017); Grossardt et al., Human Gene Therapy, 24:644－654 (2013); Andtbacka et al., Journal of Clinical Oncology, 22:25, p.2780-2788 (2015)；それらの内容全体は引用により本明細書中に包含される）。該ポリペプチドのその後の細胞内プロセシングおよび該腫瘍細胞による抗原提示は、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドでマーキングされた腫瘍を提供する。言い換えれば、特定の態様において、腫瘍内送達後に本明細書に記載の抗原性ポリペプチドは、本明細書に記載の該核酸が腫瘍の細胞内で発現された際に、該腫瘍細胞のＭＨＣ系によって提示され、それによって免疫応答の標的として該腫瘍をマーキングする。

【0123】

腫瘍標的化に用いられ得る腫瘍溶解性ウイルスの例は、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、コクサッキーウイルス、マラバウイルス（Maraba virus）、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルスである（Lal and Rajala, Cancer Gene Therapy, DOI 10.1038/s41417-018-0018-1 (2018); Haddad, Frontiers in Immunology, 7:96 (2017); Bommareddy et al., Nature Reviews Immunology (2018)；それらの内容全体は引用により本明細書中に包含される）。

【0124】

腫瘍溶解性ウイルスのような腫瘍特異的ウイルスは、非経腸投与に適した医薬製剤に調製され得る。このような製剤は一般に、例えば水性または油性の溶液、分散液、乳化剤および／または懸濁液などの担体を含む。非経腸投与は、特定の態様において、注射器、針またはカテーテルを用いる身体組織または体液への注射または点滴を含む。特定の態様において、担体は、水溶液、特定の態様において、蒸留滅菌水、生理食塩水、緩衝生理食塩水または他の薬学的に許容される注射用賦形剤である。非経腸投与様式の例としては、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与および腫瘍内投与が挙げられ、これらは当業者にはよく知られている。特定の態様において、腫瘍溶解性ウイルスなどの腫瘍特異的ウイルスの投与様式は、静脈内投与または腫瘍内投与である（Marelli et al., Frontiers in Immunology, 866 (2018)；その内容全体は引用により本明細書中に包含される）。

【0125】

腫瘍溶解性ウイルスなどの腫瘍特異的ウイルスが投与されるべき用量は、薬学的に有効な用量、すなわち、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは核酸を腫瘍に送達するのに十分な用量である。腫瘍特異的ウイルスの投与レジメンを決定することは、常套的に行われている。

【0126】

本明細書に記載のポリペプチドまたは核酸を腫瘍標的化する（対象への投与時に腫瘍内送達を効果的に行うための）別の方法は、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは核酸を含む腫瘍特異的ナノ粒子を調製することを含み、後者は、送達後に腫瘍細胞内で該核酸を発現させるように設計されている。癌療法の分野では、例えば目的のポリペプチドを担持させた、または例えばそれと組み合わせたナノキャリアを含むナノ粒子が、特異的／選択的に腫瘍細胞を標的化（ホーミング）し、その後、例えばポリペプチドなどの薬剤を該腫瘍細胞に送達することに関連して広く記載されていることはよく知られている。ナノ粒子またはナノキャリアの腫瘍標的化のための方法および手段は一般に知られており、とりわけ、Olusanya et al., Molecules 23:907 (2018); Din et al., Int J Nanomedicine, 12:7291-7309 (2017); Alibakhshi et al., J Control Release, 268:323-334 (2017); および、US 2013/0330399 A1（それらの内容全体は引用により本明細書中に包含される）に記載されている。特定の態様において、抗原（例えば、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍性抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸）の腫瘍細胞の細胞質への送達を強化するために、ナノ粒子の使用、リポソームの使用、および光化学的プロセス（例えば、光化学的内在化）が用いられ得るが、これらに限定されない腫瘍特異的な送達方法が用いられ得る。

【0127】

光化学的内在化とは、光と光増感剤を用いて、膜不透過性の分子を標的細胞の細胞質内に導入する方法であるが、必ずしも標的細胞の破壊や死をもたらすものではない、送達方法を意味する。この方法では、内在化または移行すべき分子を光増感剤と組み合わせて細胞に適用する。適当な波長の光を細胞に照射すると、光増感剤が活性化され、細胞内区画膜（compartment membrane）が破壊され、その後、分子が細胞質に放出される。光化学的内在化では、光増感剤と光の相互作用を利用して細胞に影響を与え、分子の細胞内への取り込みを向上させることができる。 光化学的内在化、および様々な光増感剤は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０７４３２、ＷＯ００／５４７０８、ＷＯ０１／１８６３６、ＷＯ０２／４４３９６、ＷＯ０２／４４３９５およびＷＯ０３／０２０３０９、米国特許第６，６８０，３０１号、同第５，８７６，９８９号に記載されており、これらの開示内容全体は、引用により本明細書中に組み込まれる。特定の態様において、光化学的内在化を用いて、抗原を腫瘍細胞の細胞質内に送達する。特定の態様において、光化学的内在化は、腫瘍細胞の細胞質への抗原の送達を強化するために用いられる。

【0128】

ナノ粒子またはその主要部分としてのナノキャリアは、高分子ナノ粒子、ミセル、リポソーム、ナノゲルまたはカーボンナノチューブであり得る。このような粒子または担体（キャリア）は、目的の化合物（ポリペプチドなど）を担持し、そのような粒子または担体を、例えば腫瘍細胞の表面上に発現した腫瘍抗原に特異的な抗体または抗体フラグメントで修飾することにより、腫瘍を積極的に標的化することができる（上記の参考文献も参照のこと）。ナノ粒子の腫瘍標的化部位は、原則として、ペプチド、オリゴペプチドもしくはポリペプチド、タンパク質、ホルモン、ビタミン、酵素、腫瘍抗原のリガンドまたは腫瘍抗原に特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントなど、腫瘍細胞上に発現する分子に対して親和性を示す何らかの生物学的または化学的構造であり得る。特定の態様において、腫瘍標的化ナノ粒子の投与ならびにその後の腫瘍細胞への移行および結合の後、受容体介在性エンドサイトーシス（内在化）により、腫瘍細胞によるナノキャリアの取り込みを可能にし、それにより、例えば目的のポリペプチドの細胞内送達を提供し、これは、細胞内でプロセシングされ、その後、腫瘍細胞によってＭＨＣ複合体中の抗原として提示され得る。

【0129】

あるいは、腫瘍標的化ナノ粒子の投与およびその後の腫瘍への移行および貪食細胞または線維芽細胞などの免疫細胞を含む腫瘍内の非腫瘍細胞への結合後、受容体介在性エンドサイトーシス（内在化）により、該細胞によるナノキャリアの取り込みを可能にし、それにより、例えば腫瘍中で目的のポリペプチドの細胞内送達を提供し、それは細胞内でプロセシングされ、その後、該腫瘍内の該細胞によってＭＨＣ複合体中の抗原として提示され得る。本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは核酸の腫瘍内送達のために用い得る腫瘍特異的（または腫瘍標的化された）ナノ粒子の具体例は、例えば、ポリ（プロピレン）サルファイド（ＰＰＳ）ナノ粒子、金ナノ粒子、ＰＬＧＡナノ粒子、人工エキソソーム、ミセルまたはデンドリマーである。

【0130】

特定の態様において、本明細書に記載の腫瘍特異的ナノ粒子は、非経腸投与に適した医薬製剤に調製される。このような製剤は、一般的に、例えば、水性または油性溶液、分散液、乳剤および／または懸濁液のような担体を含む。非経腸投与は、ある場合には、注射器、針またはカテーテルを用いる身体組織または体液への注射または点滴を含む。特定の態様において、担体は、水溶液であり、ある場合には、担体は、蒸留滅菌水、生理食塩水、緩衝生理食塩水または他の薬学的に許容される注射用賦形剤である。非経腸投与様式の例としては、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与および腫瘍内投与が挙げられ、これらは当業者にはよく知られている。特定の態様において、腫瘍特異的ナノ粒子の投与様式は、静脈内投与または腫瘍内投与である。

【0131】

投与される腫瘍特異的ナノ粒子の用量は、薬学的に有効な用量、すなわち、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは核酸を腫瘍に送達するのに十分な用量である。当業者であれば、腫瘍特異的ナノ粒子の投与レジメンを決定することは常套的に行われる。

【0132】

本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは核酸が腫瘍標的化されていない態様において、それらは、腫瘍内注射を可能にする形態であることにより腫瘍内送達のために調製される。当業者は、本明細書に記載の腫瘍標的化組成物もまた、腫瘍内に投与され得ることを直ちに理解する。当業者は、腫瘍内注射に適合され、例えば水性または油性溶液、分散液、乳剤および／または懸濁液のような担体を含んでいてもよい、医薬製剤を認識している。本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは核酸が腫瘍標的化されていない場合、抗原性ポリペプチドおよび／または核酸は、樹状細胞中に含まれるか、または抗原性ポリペプチドは水性懸濁液もしくは溶液中にある。同様に、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは核酸が腫瘍標的化されていない態様において、抗原性ポリペプチドおよび／または核酸は、ウイルス中に含まれ得る。従って、抗原性ポリペプチドによる腫瘍のマーキングは、腫瘍細胞で起こり得るが、必ずしも腫瘍細胞自体による細胞内プロセシングおよび抗原提示を必要としないことが、本明細書中明示的に想定されている。例えば、そのような細胞内プロセシングはまた、貪食細胞などの免疫細胞－マクロファージが一例として挙げられる－または線維芽細胞を含む、腫瘍内の他の細胞タイプによって影響を受ける可能性がある。樹状細胞が腫瘍のマーキングに用いられるとき、腫瘍のマーキングは、樹状細胞が腫瘍内に注射される樹状細胞自体のＭＨＣ系を介した抗原プロセシングによって行われ得る。また、樹状細胞、特に同種異系樹状細胞は、ＮＫ細胞を含む内因性免疫細胞および腫瘍内の免疫応答を強制するクロスプライミング（cross-prime）樹状細胞を引き寄せ得ることも知られている（Laurell et al. 2017, J for Immunother. Of Cancer 5: 52、その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）。

【0133】

理論はともかく、以前は‘手つかずの’免疫細胞を腫瘍に動員するか、または腫瘍マーキングの前に腫瘍に対して指向されていなかった既存の免疫を用いることにより、免疫寛容が破壊され、すなわち、腫瘍の腫瘍抗原に対して指向された免疫細胞がさらに動員される。

【0134】

腫瘍マーキングに関して、当業者は、抗原性ポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードするｍＲＮＡなどの核酸を樹状細胞に負荷することに関連する方法および手段をよく知っている。例えば、Van Nuffel et al., ISBT Science Series, 8, 161－164 (2013); ＷＯ２０１４／００６０５８ Ａ１；ＷＯ２００９／０３４１７２ Ａ１(それらの開示内容全体は引用により本明細書中に包含させる）を参照のこと。さらに、当業者は、樹状細胞を腫瘍内に注射するための方法および手段をよく知っている。例えば、US 2004/0057935 A1; Cripe et al., Molecular Therapy, 23: 3, p. 602－608 (2015); Hirooka et al., Oncotarget, 9:2, p.2838-2847 (2018); Triozzi et al., Cancer, 89:12, p.2646-2654 (2000); Laurell et al., Journal for ImmunoTherapy of Cancer, 5:52 (2017)(それらの内容全体は引用により本明細書中に包含させる）を参照のこと。特定の態様において、腫瘍内送達のために調製された該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする該核酸は、腫瘍内投与のためのものであり、樹状細胞の形態である。特定の態様において、樹状細胞は、本明細書に記載の細胞株ＤＣＯｎｅの細胞から得られた（成熟）樹状細胞であって、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする該核酸を含む。当業者は、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む樹状細胞の腫瘍内投与に適した投与レジメンを常套的に決定することができる。本明細書に記載の抗原性ポリペプチドを含む水性懸濁液または溶液も同様である。

【0135】

腫瘍のマーキングは、腫瘍が本明細書に記載の抗原性ポリペプチドでマーキングされている限り、複数の異なる方法および手段を介して実施できることは明らかである。例えば、腫瘍マーキングは、腫瘍細胞または腫瘍内の他の細胞型による抗原性ポリペプチドの細胞内プロセシングによってのみ実施される必要はない。腫瘍内送達のために調製された抗原性ポリペプチドは、腫瘍細胞外であり、したがって、該腫瘍内の細胞によって内在化されないことも可能である。腫瘍内の細胞外抗原性ポリペプチドの存在は、本明細書に記載のワクチン接種工程によるマーキングの前に活性化された免疫細胞を引き付け得る。特定の態様において、このようなワクチン接種工程およびその後の免疫の生成は、腫瘍のマーキングに先立って行われる。

【0136】

さらに、腫瘍内送達のために調製されたポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸は、特定の態様において、免疫応答に対する感受性を高めるように、ある場合において、少なくとも部分的に免疫寛容な腫瘍環境を免疫感受性の腫瘍環境に変換するように、またはＴＭＥにおけるＴ細胞の（最適な）機能性を促進するように、腫瘍、特定の態様において、腫瘍部位またはＴＭＥを調節する、ケモカインおよび／またはサイトカインなどの免疫調節化合物を伴う。そのような免疫調節化合物は、ある場合において、ポリペプチドの形態で、またはそのようなポリペプチドをコードする核酸として、本明細書に記載の腫瘍特異的ウイルス、腫瘍特異的ナノ粒子、樹状細胞または水性懸濁液もしくは溶液中に含まれる。特定の態様において、そのような免疫調節化合物の例は、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＣＲ５、ＸＣＬ１、ＣＣＬ２０およびＣＣＬ２１である（Mohan et al., Immunobiology, 223:477－485 (2018); He et al., Journal of Experimental & Clinical Cancer Research、29:37 (2010); Nguyen-Hoai et al., Cancer Gene Therapy, 19: 69－76 (2012)；それらの内容全体は引用により本明細書中に包含される）。したがって、本発明の方法における使用のために、腫瘍内送達のために調製された該抗原性ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸は、少なくとも部分的に免疫寛容な腫瘍（腫瘍部位またはＴＭＥ）を免疫感受性の腫瘍部位もしくはＴＭＥに変換し、および／または腫瘍部位もしくはＴＭＥにおけるＴ細胞の機能性を促進する、免疫調節化合物（例えば、免疫調節ポリペプチドまたは該免疫調節ポリペプチドをコードする核酸）も含む組成物である。特定の態様において、免疫調節化合物は、免疫調節ポリペプチドまたは該免疫調節ポリペプチドをコードする核酸である。特定の態様において、免疫調節ポリペプチドは、ＧＭ-ＣＳＦ、ＣＣＲ５、ＸＣＬ１またはＣＣＬ２０、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、ＣＣＲ５、ＸＣＬ１またはＣＣＬ２０であるか、またはそれらをコードする核酸である。特定の態様において、そのような免疫調節化合物は、腫瘍部位またはＴＭＥにおけるＴ細胞機能を促進する。

【0137】

本明細書で用いる用語“免疫寛容性ＴＭＥ”または“免疫寛容性腫瘍部位”は、腫瘍内の環境が抗腫瘍免疫応答に対する寛容性または非感受性を提供する、よく確立された現象を意味する。特定の態様において、腫瘍部位またはＴＭＥは、腫瘍の外側の環境中、例えば、健康な細胞または健康な組織内またはその近くの環境中の標的に対して向けられた免疫応答と比較して、該ＴＭＥ内の腫瘍に対して向けられた免疫応答により寛容性であるか、またはより非感受性である場合、免疫寛容である。

【0138】

本明細書で用いる用語“免疫感受性ＴＭＥ”または“腫瘍感受性腫瘍部位”は、腫瘍が抗腫瘍免疫応答に対して感受性または影響を受けやすい状況を意味する。

【0139】

本発明の方法における使用のための抗原性ポリペプチドに関して、該ポリペプチドが腫瘍抗原ではないことは、本発明の一態様である。本明細書で用いる用語“腫瘍抗原”は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍ネオ抗原を含む腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）の両方を含む。腫瘍関連抗原は、正常細胞上で観察されるよりも大量に腫瘍細胞の表面上に発現される抗原、または胎児発育中に正常細胞上で発現される抗原である。腫瘍特異的抗原とは、腫瘍細胞に固有の抗原であり、正常細胞に発現しない抗原である。腫瘍抗原という用語には、すでに同定されているＴＡＡまたはＴＳＡと、未だ同定されていないＴＡＡまたはＴＳＡとが含まれる。

【0140】

ヒト対象に免疫原性である限り、何れかの抗原性ポリペプチドを用いることができる。これには、ヒト由来および非ヒト由来の抗原性ポリペプチドの両方が含まれる。したがって、抗原性ポリペプチドは、ヒト対象において免疫原性であるヒト由来または非ヒト由来の抗原性ポリペプチドであり得る。特定の態様において、抗原性ポリペプチドは、非ヒト由来である。それにもかかわらず、用語“非ヒト抗原性ポリペプチド”に言及する面および／または態様において、その面または態様は、“ヒト抗原性ポリペプチド”に言及するように修正することができるか、または用語“ヒト抗原性ポリペプチド”をかかる面および／または態様に追加することができることを、明示的に想定している。ヒト対象において免疫原性であるヒト抗原性ポリペプチドは、例えば、胚ポリペプチド、卵巣ポリペプチドまたは精巣ポリペプチドである。これは、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＷＴ－１およびＭＡＧＥ抗原に適用される（例えば、Cheever et al, Clin Cancer Res;15:5323-5337 (2009); Vigneron et al, Cancer Immunity, 13:15 (2013)を参照のこと。その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）。

【0141】

一面において、本明細書に記載されている方法の面における免疫原およびマーカーとして採用される非ヒト抗原性ポリペプチドが、腫瘍に対する免疫反応の一部として対象が以前に遭遇したものではないものである方法が提供される。このように、特定の態様において、抗原性ポリペプチドは非腫瘍抗原である。特定の態様において、抗原性ポリペプチドは、対象の免疫系によって以前に遭遇しておらず、したがって対象が免疫学的にナイーブである抗原であり得るか、または対象により以前に遭遇した抗原性ポリペプチドであるが、腫瘍に対する免疫応答の一部としてではなく、ある場合において保護免疫（メモリーＴ細胞および／またはＢ細胞）が存在する抗原性ポリペプチドであり得る。後者は、導入するのに時間がかかるが、その代わり、既存の免疫に入り込むか、または再活性化して、本明細書に記載の方法の原則的メカニズムに従って腫瘍に誘導する、新規な（デノボ）免疫応答を導入する必要がないため、非常に有益であり得る。従って、１つの態様において、本明細書に記載の非ヒト抗原性ポリペプチドは、潜在的なワクチン接種を意図したヒト集団の大部分によって（免疫系によって）遭遇することは殆どないか、または免疫が予め存在する（対象に存在する）抗原性ポリペプチドであり、ここで、該免疫は腫瘍に対して向けられていない。後者の形態の免疫は、例えば、Ａ型および／またはＢ型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、インフルエンザ菌ｂ型（Haemophilus influenzae type b）、ポリオ（ポリオ性骨髄炎）、麻疹、おたふくかぜ、風疹、水痘、ヒトパピローマウイルス、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）（肺炎）、ナイセリア髄膜炎菌（Neisseria meningitides）（髄膜炎）またはロタウイルス（rotavirus）（ロタウイルス感染症）などの肝炎に対するワクチン接種を含む、人生の早い段階での感染症に対する以前のワクチン接種によって提供され得る。本明細書に記載の方法により用いるための非ヒト抗原ポリペプチドとして本明細書で明示的に想定されるのは、Ａ型および／またはＢ型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、インフルエンザ菌Ｂ型、ポリオ、麻疹、おたふくかぜ、風疹、水痘、ヒトパピローマウイルス、肺炎球菌（肺炎）、ナイセリア髄膜炎菌またはロタウイルスを含む肝炎の１以上の免疫原性ポリペプチドである。特定の態様において、本明細書に記載の非ヒト抗原ポリペプチドは、該対象の以前のワクチン接種に用いられた微生物ポリペプチドである。特定の態様において、以前のワクチン接種は感染症に対するものであった。特定の態様において、以前のワクチン接種はＡ型肝炎および／またはＢ型肝炎；ジフテリア；破傷風；百日咳；インフルエンザ；インフルエンザ菌ｂ型；ポリオ；麻疹；おたふくかぜ；風疹；水痘；ヒトパピローマウイルス、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、ナイセリア髄膜炎菌またはロタウイルスに対するものであった。当業者は、以前のワクチン接種で用いられたポリペプチドが、（ｉ）サブユニットワクチン、（ｉｉ）不活化または弱毒化微生物、（ｉｉｉ）トキソイドワクチン（すなわち、不活化毒素を含むワクチン）の一部など、種々の形態で投与され得ることを理解している。

【0142】

特定の態様において、本明細書に記載の非ヒト抗原性ポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０８６１７（最終更新日：１９８８年８月１日－v1）で同定されたＶＰ３を含む、Ａ型肝炎ウイルス由来のＶＰ３；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０４９５８（最終更新日：２００７年１月２３日 - v2）で同定された破傷風トキシンを含む、Clostridium tetani由来の破傷風トキシン；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０４９７７（最終更新日：１９８７年８月１３日 - v1）で同定された百日咳毒素を含む、Bordetella pertussis由来の百日咳毒素； タンパク質 1987年8月13日-v1；ＵｎｉｐｒｏｔＫｂ受託番号Ｒ４Ｒ７Ｑ５（最終更新日：２０１３年７月２４日 - v1）で同定されたプロテインＤを含む、Haemophilus influenzae由来のプロテインＤ；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０３３００（最終更新日：２００７年１月２３日 - v3）で同定されたＶｐ１キャプシドタンパク質を含む、ポリオウイルス由来のＶｐ１キャプシドタンパク質；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ０８３６２（最終更新日：１９８８年８月１日 - v1)で同定されたヘマグルチニンを含む、麻疹ウイルス由来のヘマグルチニン；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｑ７７ＩＳ８（最終更新日：２００４年７月５日 - v1)で同定された核タンパク質を含む、ムンプスウイルス由来の核タンパク質；ＵｎｉｐｒｏｔＫｂ受託番号Ｐ０８５６３（最終更新日：２００６年５月３０日 - v2)で同定された糖タンパク質Ｅ１またはＥ２を含む、風疹ウイルス由来の糖タンパク質Ｅ１またはＥ２；ＵｎｉｐｒｏｔＫｂ受託番号Ｐ０９３１０（最終更新日：１９８９年７月１日-ｖ１）で同定された即時初期(immediate early)６２（ＩＥ６２）タンパク質を含む、水痘帯状疱疹ウイルス由来のＩＥ６２タンパク質；ＵｎｉｐｒｏｔＫｂ受託番号Ｐ０３１２６（最終更新日：１９８６年７月２１日-v1）、Ｐ０３１２９（最終更新日：１９８６年７月２１日-v1）、Ｐ０６４６３（最終更新日：１９８８年１月１日-v1）またはＰ０６７８８（最終更新日：１９９０年４月１日-v2）で同定されたＥ６またはＥ７タンパク質を含む、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８由来のＥ６またはＥ７タンパク質；Ｓｐｒ９６/２０２１、ＰＶ７（７価）および／またはＰＶ１３（１３価）、ある場合において肺炎球菌に由来するか、または肺炎球菌に基づく；ＵｎｉｐｒｏｔＫｂ受託番号Ｑ７ＷＹＺ０（最終更新日：２００３年１０月１日 - v1）で同定されたナイセリアヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ）、ＵｎｉｐｒｏｔＫｂ受託番号Ｂ２ＣＱ００（最終更新日：２００８年５月２０日 - v1）で同定された第Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）またはＵｎｉｐｒｏｔＫｂ受託番号Ｑ９Ｋ１０５（最終更新日：２０００年１０月１日-v1）で同定されたナイセリアアドへシンＡ（ｎａｄＡ）を含む、Neisseria meningitides由来のＮＨＢＡ、ｆＨｂｐまたはｎａｄＡ；ＵｎｉｐｒｏｔＫｂ受託番号Ｐ１２４７３（最終更新日：２００９年３月２４日 - v2）で同定されたＶＰ８またはＵｎｉｐｒｏｔＫｂ受託番号Ｐ０４５０９（最終更新日：２０００年５月３０日-v2）で同定されたＶＰ６を含む、ロタウイルス由来のＶＰ８またはＶＰ６；ならびに、ＣＲＭ－１９７と呼ばれるその無害化変種を含む、コリネバクテリウムジフテリア由来のジフテリア毒素によって形成される群より選択されるポリペプチドである。以前のワクチン接種で用いられたポリペプチドに言及する場合、該用語には、無害化された免疫原性変異体またはその一部も含まれることに留意されたい。特定の態様において、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドは、リコール抗原である。特定の態様において、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドは、微生物リコール抗原である。

【0143】

特定の態様において、選択された抗原性ポリペプチドは、免疫原としてのそのような抗原性ポリペプチドによるワクチン接種およびそのような抗原性ポリペプチドによる腫瘍マーキングが、該既存免疫を利用する（すなわち、該腫瘍に対する免疫応答を誘導するために、メモリーＴ細胞および／またはＢ細胞を活性化する）ように、対象における既存の免疫（例えば、メモリーＴ細胞および／またはＢ細胞の形態のメモリー免疫）と適合される。当業者は、抗原性ポリペプチドに対する免疫が存在するかどうかを容易に確立することができる。特定の態様において、既存の免疫は腫瘍の形成前に生成された。特定の態様において、既存の免疫は、対象の人生の早い時期、例えば、０～２０歳の間の時期、１～１２歳の間の時期、または１～６歳の間の時期に生成された。特定の態様において、既存の免疫は、約０－１歳、約０－２歳、約０－３歳、約１－３歳、約２－４歳、約３－５歳、約４－６歳、約５－７歳、約６－８歳、約７－９歳、約８－１０歳、約９－１１歳、約１０－１２歳、約１１－１３歳、約１２－１４歳、約１３－１５歳、約１４－１６歳、約１５－１７歳、約１４－１６歳、約１５－１７歳、約１６－１８歳、約１７－１９歳、約１８－２０歳の間の時期、１歳前の時点、２歳前の時点、３歳前の時点、４歳前の時点、５歳前の時点、６歳前の時点、７歳前の時点、８歳前の時点、９歳前の時点、１０歳前の時点、１１歳前の時点、１２歳前の時点、１３歳前の時点、１４歳前の時点、１５歳前の時点、１６歳前の時点、１７歳前の時点、１８歳前の時点、１９歳前の時点、２０歳前の時点、２５歳前の時点、３０歳前の時点、３５歳前の時点、４０歳前の時点、４５歳前の時点、５０歳前の時点、６０歳前の時点、７０歳前の時点、８０歳前の時点、９０歳前の時点、１００歳前の時点、または対象の生涯のうちのある時点で生成された。

【0144】

既存の免疫を活用するために、特定の態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物を用いた少なくとも１回の免疫により、休眠免疫細胞を再活性化する。

【0145】

特定の態様において、本明細書に記載の方法の一面に用いられる抗原性ポリペプチドは、腫瘍に対する免疫応答の一部として対象が以前に遭遇しておらず、（ｉ）免疫応答の一部としてヒト対象が遭遇していない（または殆ど遭遇していない）か、または（ｉｉ）免疫応答の一部として遭遇しているが、腫瘍に対する免疫応答ではなく、ここで、保護免疫が対象に存在する。

【0146】

特定の態様において、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドは、癌患者、例えば腫瘍に罹患している患者において免疫応答を形成する。特定の態様において、抗原性ポリペプチドは、本明細書に記載の方法を用いた潜在的なワクチン接種を意図した患者の少なくとも９０％において免疫応答を誘導する。例えば、抗原性ポリペプチドは、本明細書に記載の方法を用いて、潜在的にワクチン接種を意図した患者の少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％に免疫応答を誘導する。このようにして癌患者に誘導された免疫応答は、患者の免疫系が以前にこの免疫原に遭遇していないという事実のために、新規な（de novo）応答であり得る。

【0147】

ある例示的態様において、抗原性ポリペプチドは、微生物ポリペプチドなどの非哺乳動物ポリペプチド、または合成ポリペプチドである。ある例示的態様において、抗原性ポリペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を含む緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼおよびジフテリア毒素で形成される群より選択される。

【0148】

本明細書で用いる用語“微生物ポリペプチド”は、細菌、古細菌、原生生物、真菌、単細胞植物およびウイルスを含む微生物のポリペプチドを意味する。

【0149】

特定の態様において、抗原性ポリペプチド（例えば、非ヒト抗原性ポリペプチド）は、細菌ポリペプチド、古細菌ドメイン（Archaea domain）の生物に由来するポリペプチド、真菌ポリペプチドまたはウイルスポリペプチドである。特定の態様において、抗原性ポリペプチドは、植物ポリペプチドである。また、非ヒト霊長動物、げっ歯類（例えば、マウスおよびラットなど）、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ロバなどの非ヒト哺乳動物のポリペプチド、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウなど）のポリペプチドも想定される。また、抗原性ポリペプチドは、カタツムリなどの軟体動物のポリペプチドであってもよく、例えばMegathura属またはMegathura crenulata属のポリペプチドであってもよい。

【0150】

特定の態様において、非哺乳動物抗原性ポリペプチドは、ヒト対象に投与したとき、哺乳動物ポリペプチドよりも免疫原性が高いため、哺乳動物ポリペプチドではない抗原性ポリペプチドが本明細書に記載の方法に用いるものとして見いだされる。好適な非哺乳動物抗原性ポリペプチドの例としては、例えば、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を含む緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼおよびβ－ガラクトシダーゼが挙げられる。

【0151】

抗原性ポリペプチドの一例は、Megathura crenulataのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。ＫＬＨは、ＫＬＨ1（アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ５３ＩＰ９に提供される。最終更新日：２０１４年２月１９日 - v2）またはＫＬＨ２（アミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ１ＭＶＡ１に提供される。最終更新日：２００６年５月３０日 - v1）のいずれかであり得る。ＫＬＨは、免疫原性の高い抗原の一例であり、普遍的な免疫原およびワクチン担体として広く用いられてきた。

【0152】

抗原性ポリペプチドの別の例は、ジフテリア毒素であり、この用語は、交差反応物質（ＣＲＭ）－１９７などのその無害化された変異体を含む。特定の態様において、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）は、ＣＲＭ１９７である。特定の態様において、ジフテリア毒素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。特定の態様において、ジフテリア毒素の無害化変異体は、アミノ酸残基位置５２のグリシン（Ｇ）がグルタミン酸（Ｅ）で置換されていることを除いて、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するＣＲＭ－１９７である。この用語はまた、少なくとも１００、少なくとも２００または少なくとも３００の連続的なアミノ酸残基長を有する配列番号１あるいは配列番号１の一部と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するジフテリア毒素の変異体を含む。特定の態様において、連続的なアミノ酸長は、配列番号１の位置１～３８５によって示されるアミノ酸領域内にあるか、またはアミノ酸領域である。あるいは、そのような変異体は、１～５０、１～２０、または１～１０のアミノ酸残基が欠失、挿入または置換されていることを除いて、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。そのような変異体は、本明細書に記載の抗原性および／または免疫原性を示す。

【0153】

用語“％配列同一性”は、本明細書中、最大％の配列同一性を達成するために配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入後、目的のアミノ酸配列中のアミノ酸と同一であるアミノ酸の％として定義される。アライメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野でよく知られている。配列同一性は、目的のアミノ酸配列の実質的に全長、ある場合には全長（完全長）にわたって計算される。当業者は、あるアミノ酸配列における連続したアミノ酸残基が、別のアミノ酸配列における連続したアミノ酸残基と比較されることを理解する。

【0154】

特定の態様において、ジフテリア毒素が抗原性ポリペプチドの腫瘍内送達のために用いられる本明細書に記載の方法において、腫瘍は、ＨＢ－ＥＧＦ受容体を発現する腫瘍である。特定の態様において、ＨＢ－ＥＧＦ受容体を発現する腫瘍は、卵巣腫瘍；肺腫瘍；膀胱腫瘍；胃腫瘍；膵臓腫瘍；乳房腫瘍；肝臓腫瘍（例えば、肝細胞癌）；脳腫瘍（例えば、膠芽腫）；星細胞腫；脳幹神経膠腫；混合神経膠腫；乏突起膠腫；視神経膠腫；およびその他の脳に由来する腫瘍（例えば、退形成性星細胞腫、線維性星細胞腫、毛細血管性星細胞腫）；神経芽腫；ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；組織球性リンパ腫または未分化大細胞リンパ腫；ならびに、白血病（例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬまたはＡＬＬ）からなる群より選択される。特定の態様において、ＨＢ－ＥＧＦ受容体を発現する腫瘍は、卵巣癌；肺癌；膀胱癌；胃癌；膵臓癌；乳癌；肝細胞癌；脳腫瘍（例えば、膠芽腫）；神経芽腫；ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；組織球性リンパ腫または未分化大細胞リンパ腫；ならびに、白血病（例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬまたはＡＬＬ）からなる群より選択される悪性腫瘍である。

【0155】

また、本明細書では、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドをコードする核酸が提供される。特定の態様において、本明細書に記載の方法で用いるためのＣＲＭ１９７をコードする核酸が提供される。

【0156】

本明細書に記載のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列は、当技術分野で一般的に利用可能な方法および手段によって生成することができる。例えば、当業者は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を生成する方法、ならびに一般的に知られている組換えＤＮＡ技術を用いて該ＤＮＡ配列を有する核酸分子を製造および単離する方法を理解し得る。特定の態様において、核酸分子の配列は、宿主細胞中での発現のためにコドン最適化される。このようにして、特定の宿主細部で高レベルの発現に有利なコドンが用いられる。特定の態様において、核酸分子は、当業者に知られている組換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクターに挿入される。発現ベクターは、宿主細胞において本明細書に記載の融合タンパク質の発現を指向する。特定の態様において、これらの発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの一部として、宿主細胞中で複製可能である。さらに、特定の態様において、発現ベクターは、（ｉ）ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターなどの強力なプロモーター／エンハンサー、（ｉｉ）リボソーム結合部位および開始コドンなどの最適な翻訳開始配列、および／またはＫＯＺＡＫコンセンサス配列、および（ｉｉｉ）タンパク質が真核細胞で発現されるときのポリ（Ａ）シグナルを含む転写終結配列、を含む。好適な発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスなどのプラスミドおよびウイルスベクターを含む。当業者は、用いられる発現ベクターが、組換えタンパク質の発現に用いられる宿主細胞に依存することを理解し得る。特定の態様において、発現ベクターは、細菌細胞を含む原核細胞における、または、酵母細胞および哺乳動物細胞などの真核宿主細胞における核酸の発現に適している。好適な例は、哺乳動物発現ベクターｐＣＭＶ４である。

【0157】

別法として、核酸分子を宿主細胞のゲノムに挿入することができる。特定の態様において、挿入は、宿主細胞における本明細書に記載の核酸分子の発現を確実にする遺伝子座または遺伝子領域内にある。

【0158】

好適な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、サル細胞およびヒト細胞などの原核細胞および真核細胞が挙げられる。適当な真核生物宿主細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ハムスター細胞株ＣＨＯおよびＢＨＫ－２１；マウス宿主細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳＯおよびＣ１２７；シミアン宿主細胞ＣＯＳおよびＶｅｒｏ；ならびに、ヒト宿主細胞ＨｅＬａ、ＰＥＲ.Ｃ６、Ｕ－９３７およびＨｅｐ Ｇ２が挙げられるが、これらに限定されない。適切な細胞は、ＡＴＣＣおよびLife Technologiesなどの公的な供給源から入手可能である。多くのトランスフェクション技術が当技術分野で知られており、例えば、Graham et al., 1973. Virology 52: 456; Green et al., 2012. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, CSHL Press; Davis et al., “Basic Methods in Molecular Biology”, 1986, Elsevier; and Chu et al., 1981. Gene 13: 197（それらの内容全体は引用により本明細書中に包含させる）を参照のこと。当業者は、これらの文献に記載の技術を用いて、１以上の外因性核酸分子を好適な宿主細胞に導入し得る。本明細書に記載の融合タンパク質を産生するための宿主細胞の例は、ＨＥＫ２９３細胞である。

【0159】

本明細書に記載の抗原性ポリペプチドはまた、合成ポリペプチド、例えばヒト対象への投与時に強い細胞免疫応答を誘発するように設計されたポリペプチドであり得る。

【0160】

抗原性ポリペプチドが免疫原として投与するためのものであるとき、免疫応答の誘発を増強するように、さらにポリペプチドまたは複合パートナーを含んでいてもよい。従って、該免疫原は、該抗原性ポリペプチドおよび例えば担体タンパク質を含む融合ポリペプチドであり得る。

【0161】

投与方法
本発明は、対象における腫瘍（例えば、固形腫瘍）を処置するための方法を提供する。また、対象における腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法も提供する。そのような方法は、第１の組成物を遠位部に投与することを含むワクチン接種工程と、第２の組成物を腫瘍内または腫瘍周囲に投与することを含む腫瘍マーキング工程とを含む。このような方法は、第１の組成物を腫瘍から遠位部位で対象に投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程と、第２の組成物を腫瘍部位で対象に投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、腫瘍マーキング工程とを含む。第１の組成物および第２の組成物は、本明細書の他の箇所に記載されている。

【0162】

特定の態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を腫瘍から離れた部位に投与することを含む。特定の態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を腫瘍から遠位の部位に投与することを含む。特定の態様において、本明細書に記載のワクチン接種工程における免疫原性組成物（例えば、第１の組成物）の遠位部投与（distal administration）は、非経腸経路を介したものであり、これには、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与（intradermal）、節内投与（intranodal）、リンパ内投与および筋肉内投与が含まれ、これらはすべて当業者によく知られている。特定の態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物（例えば、第１の組成物）の遠位部投与は、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、胸骨内注射、皮内注射、経皮注射（transcutaneous injection、transdermal injection）および組織の間質腔への送達からなる群より選択される投与方法によって送達される。

【0163】

特定の態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を投与することを含み、この投与は、腫瘍内投与ではなく、腫瘍外投与であり、ある場合には、筋肉内投与、皮内投与（intradermal）、静脈内投与、節内投与またはリンパ内投与、皮内投与、静脈内、またはこれらの組合せである。特定の態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を、腫瘍から遠位部位で筋肉内投与することを含む。

【0164】

特定の態様において、ワクチン接種工程は、第１の組成物を、腫瘍（例えば、腫瘍の端部または腫瘍の中心部）から少なくとも約０．１ｍｍ、少なくとも約０．２ｍｍ、少なくとも約０．３ｍｍ、少なくとも約０．４ｍｍ、少なくとも約０．５ｍｍ、少なくとも約０．６ｍｍ、少なくとも約０．７ｍｍ、少なくとも約０．８ｍｍ、少なくとも約０．９ｍｍ、少なくとも約１ｍｍ、少なくとも約２ｍｍ、少なくとも約３ｍｍ、少なくとも約４ｍｍ、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約６ｍｍ、少なくとも約７ｍｍ、少なくとも約８ｍｍ、少なくとも約９ｍｍ、少なくとも約１０ｍｍ、少なくとも約１５ｍｍ、少なくとも約２０ｍｍ、少なくとも約２５ｍｍ、少なくとも約３０ｍｍ、少なくとも約３５ｍｍ、少なくとも約２０ｍｍ、少なくとも約２５ｍｍ、少なくとも約２５ｍｍ、少なくとも約３０ｍｍ、少なくとも約３５ｍｍ、少なくとも約４０ｍｍ、少なくとも約４５ｍｍ、少なくとも約５０ｍｍ、少なくとも約６０ｍｍ、少なくとも約７０ｍｍ、少なくとも約８０ｍｍ、少なくとも約９０ｍｍ、少なくとも約１０ｃｍ、少なくとも約２０ｃｍ、少なくとも約３０ｃｍ、少なくとも約４０ｃｍ、少なくとも約５０ｃｍ、５０ｃｍ以上離れた部位に遠位投与することを含む。特定の態様において、ワクチン接種工程は、腫瘍から遠位部位で対象に第１の組成物を投与することを含み、ここで、腫瘍から遠位部位は、腫瘍（例えば、腫瘍の端部または腫瘍の中心部）から少なくとも約０．１ｍｍ、少なくとも約０．２ｍｍ、少なくとも約０．３ｍｍ、少なくとも約０．４ｍｍ、少なくとも約０．５ｍｍ、少なくとも約０．６ｍｍ、少なくとも約０．７ｍｍ、少なくとも約０．８ｍｍ、少なくとも約０．９ｍｍ、少なくとも約１ｍｍ、少なくとも約２ｍｍ、少なくとも約３ｍｍ、少なくとも約４ｍｍ、少なくとも約５ｍｍ、少なくとも約６ｍｍ、少なくとも約７ｍｍ、少なくとも約８ｍｍ、少なくとも約９ｍｍ、少なくとも約１０ｍｍ、少なくとも約１５ｍｍ、少なくとも約２０ｍｍ、少なくとも約２５ｍｍ、少なくとも約３０ｍｍ、少なくとも約３５ｍｍ、少なくとも約４０ｍｍ、少なくとも約４５ｍｍ、少なくとも約５０ｍｍ、少なくとも約６０ｍｍ、少なくとも約７０ｍｍ、少なくとも約８０ｍｍ、少なくとも約９０ｍｍ、少なくとも約１０ｃｍ、少なくとも約２０ｃｍ、少なくとも約３０ｃｍ、少なくとも約４０ｃｍ、少なくとも約５０ｃｍ、５０ｃｍ以上離れた部位である。

【0165】

特定の態様において、ワクチン接種工程は、腫瘍が存在する臓器系とは異なる臓器系の部位に第１の組成物を遠位投与することを含む。特定の態様において、ワクチン接種工程は、腫瘍が存在する臓器系とは異なる臓器系に第１の組成物を投与することを含む。例えば、腫瘍が卵巣または卵巣内に存在する場合（例えば、上皮性卵巣癌）、ワクチン接種工程は、卵巣ではない臓器系の部位、例えば、肝臓、腎臓などに第１の組成物を遠位投与することを含む。本明細書で用いる用語“臓器”または“臓器系”とは、同様の機能を有する組織群を意味する。臓器系の例としては、筋肉系、消化器系（例えば、胃、小腸、大腸、肝臓、膵臓など）、呼吸器系（例えば、肺）、泌尿器系（例えば、腎臓、膀胱など）、生殖器系（例えば、男性生殖器および女性生殖器、卵巣、胎盤、前立腺など）、内分泌系、循環器系、神経系（例えば、中枢神経系および末梢神経系など）ならびに腸管系（例えば、皮膚、皮下組織など）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0166】

特定の態様において、ワクチン接種工程は、腫瘍部位に対向する部位に第１の組成物を遠位投与することを含む。特定の態様において、ワクチン接種は、腫瘍（腫瘍が存在する部位）に対向する部位で第１の組成物を投与することを含む。例えば、腫瘍が卵巣または卵巣内に存在する場合、ワクチン接種工程は、対側の卵巣または卵巣内に第１の組成物を遠位投与することを含む。例えば、腫瘍が左卵巣に存在する場合、ワクチン接種工程は、第１の組成物を右卵巣に遠位的に投与することを含む。例えば、腫瘍が卵巣または卵巣内に存在する場合、ワクチン接種工程は、第１の組成物を対側の卵巣に投与することを含む。例えば、腫瘍が左卵巣に存在する場合、ワクチン接種ステップは、第1の組成物を右卵巣に投与することを含む。

【0167】

特定の態様において、本明細書に記載の方法は、１回以上のワクチン接種工程を含む。特定の態様において、第２のワクチン接種工程、第３のワクチン接種工程、第４のワクチン接種工程、第５のワクチン接種工程、第６のワクチン接種工程、第７のワクチン接種工程、またはそれ以上のワクチン接種工程が行われる。当業者は、任意の、後続のワクチン接種工程が実行される場合、該後続のワクチン接種工程は、本明細書に記載のワクチン接種工程の態様のいずれかを組み込むことが想定されることを認識し得る。

【0168】

特定の態様において、腫瘍マーキング工程は、第２の組成物を腫瘍内または腫瘍周囲に投与することを含む。特定の態様において、腫瘍マーキング工程は、腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む。特定の態様において、腫瘍マーキング工程は、第２の組成物を腫瘍内または腫瘍の近位部に投与することを含む。従って、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドを、本明細書に記載のように腫瘍内送達用に調製した使用が提供される。

【0169】

また、腫瘍に罹患している対象に対して免疫応答を誘発する方法であって、腫瘍に罹患している対象に、腫瘍内送達用に調製された、薬学的に有効量の抗原性ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を投与する工程；および、該対象者に、該ポリペプチドを免疫原として、または該免疫原をコードする核酸、および要すれば１以上の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤および／または希釈剤を含む、薬学的に有効量の免疫原性組成物を投与する工程、を含む方法を提供する。特定の態様において、（i）腫瘍内送達のために調製されたポリペプチド／核酸、（ii）免疫原性組成物、および（iii）本明細書に記載の医療用途、を提供する。

【0170】

かかる方法は、腫瘍内送達のために調製された、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸の腫瘍内送達後に、該ポリペプチドからＭＨＣペプチド抗原複合体を産生させる工程をさらに含んでいてもよい。

【0171】

特定の態様において、本明細書に記載の方法による第１の組成物および第２の組成物の投与により、抗原性ポリペプチド またはＭＨＣペプチド抗原複合体に対するＴ細胞介在性免疫応答が誘発される。

【0172】

本発明はまた、必要とする対象において腫瘍を処置する方法であって、(1）抗原性ポリペプチドまたは該抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む第１の組成物を遠位部に投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、該投与が腫瘍部位の遠位部で行われるワクチン接種工程；および（2）抗原性ポリペプチドまたは該抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む第２の組成物を腫瘍内または腫瘍周囲に投与することを含む腫瘍マーキング工程、を含む方法も提供する。従って、特定の態様において、本発明は、必要とする対象における腫瘍を処置する方法であって、(1）非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む第１の組成物を遠位部に投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、該投与が腫瘍部位の遠位部で行われるワクチン接種工程；および（2）非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む第２の組成物を腫瘍内または腫瘍周囲に投与することを含む腫瘍マーキング工程、を含む方法を提供する。本発明はまた、必要とする対象における腫瘍を処置する方法であって、(1）腫瘍から遠位部位で対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程；および（2）腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、腫瘍マーキング工程、を含む方法も提供する。従って、特定の態様において、本発明は、必要とする対象における腫瘍を処置するための方法であって、(1）腫瘍から遠位部位で対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程；および（2）腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、腫瘍マーキング工程、を含む方法を提供する。

【0173】

本発明はまた、必要としている対象において腫瘍に対する免疫応答を生成する方法であって、(1）抗原ポリペプチドまたは該抗原ポリペプチドをコードする核酸を含む第１の組成物を遠位部に投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、該投与が腫瘍部位の遠位部で行われるワクチン接種工程；および（2）抗原ポリペプチドまたは該抗原ポリペプチドをコードする核酸を含む第２の組成物を腫瘍内または腫瘍周囲に投与することを含む腫瘍マーキング工程、を含む方法も提供する。従って、特定の態様において、本発明は、必要とする対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法であって、(1）非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む第１の組成物を遠位部に投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、該投与が腫瘍部位の遠位部で行われるワクチン接種工程と、（2）非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む第２の組成物を腫瘍内または腫瘍周囲に投与することを含む腫瘍マーキング工程とを含む方法を提供する。本発明はまた、必要とする対象において腫瘍に対する免疫応答を生成するための方法であって、(1）腫瘍から遠位部位で対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程；および（2）腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、腫瘍マーキング工程、を含む方法も提供する。従って、特定の態様において、本発明は、必要とする対象において腫瘍に対する免疫応答を生成する方法であって、(1）腫瘍から遠位部位で対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程；および、（2）腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、腫瘍マーキング工程、を含む方法を提供する。

【0174】

本発明はまた、必要としている対象において、腫瘍に対する免疫応答を誘発または誘導する方法であって、(1）抗原性ポリペプチドまたは抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む第１の組成物を遠位部に投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、投与が腫瘍部位の遠位部で行われるワクチン接種工程；および（2）抗原性ポリペプチドまたは抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む第２の組成物を腫瘍内または腫瘍周囲に投与することを含む腫瘍マーキング工程、を含む方法も提供する。従って、特定の態様において、本明細書は、必要とする対象において腫瘍に対する免疫応答を誘発または誘導する方法であって、(1）非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む第１の組成物を遠位部に投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、投与が腫瘍部位の遠位部で行われる、ワクチン接種工程と、（2）非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む第２の組成物を腫瘍内または腫瘍周囲に投与することを含む腫瘍マーキング工程とを含む方法を提供する。本発明はまた、必要とする対象において腫瘍に対する免疫応答を誘発または誘導する方法であって、(1）腫瘍から遠位部位で対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程；および、（2）腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、腫瘍マーキング工程、を含む方法も提供する。従って、特定の態様において、本発明はまた、必要とする対象において腫瘍に対する免疫応答を誘発または誘導する方法であって、(1）腫瘍から遠位部位で対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程；および、（2）腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物が、非腫瘍抗原または非腫瘍抗原をコードする核酸を含む、腫瘍マーキング工程、を含む方法を提供する。

【0175】

特定の態様において、本明細書に記載の方法の抗原ポリペプチドは、ＣＲＭ１９７である。従って、本発明はまた、必要な対象における腫瘍を処置する方法であって、(1）腫瘍から遠位部位で対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物がＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程と、（2）腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物がＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコードする核酸を含む、腫瘍マーキング工程とを含む方法も提供する。本発明はまた、必要としている対象において腫瘍に対する免疫応答を生成する方法であって、(1）腫瘍から遠位部位で対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物がＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程；および、（2）腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物がＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコードする核酸を含む、腫瘍マーキング工程を含む方法も提供する。本発明はまた、必要としている対象者において腫瘍に対する免疫応答を誘発または誘導する方法であって、(1）腫瘍から遠位部位で対象に第１の組成物を投与することを含むワクチン接種工程であって、ここで、第１の組成物がＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコードする核酸を含む、ワクチン接種工程；および、（2）腫瘍部位で対象に第２の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、ここで、第２の組成物がＣＲＭ１９７またはＣＲＭ１９７をコードする核酸を含む、腫瘍マーキング工程、を含む方法も提供する。

【0176】

特定の態様において、ワクチン接種工程および腫瘍マーキング工程は時間的に分離されている。従って、特定の態様において、ワクチン接種工程は、腫瘍マーキング工程の前に実行される。特定の態様において、腫瘍マーキング工程は、ワクチン接種工程の後に実行される。特定の態様において、腫瘍マーキング工程が実行される前に、ワクチン接種工程の後に一定の時間が経過している。特定の態様において、ワクチン接種工程後に経過した時間は、投与された第１の組成物内に包含された抗原ポリペプチドに対して対象が免疫応答を起こすのに十分な時間である。特定の態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の時間は、ワクチン接種工程の結果として免疫応答が形成されるのに十分である。

【0177】

例えば、ワクチン接種工程の結果、一次免疫応答が形成され得る。一次免疫応答の場合、一次免疫応答の形成には約７日から約２１日かかり得る。別の例において、例えば、対象が既存の免疫を有している抗原ポリペプチドに反応して、ワクチン接種工程の結果として、二次免疫応答を形成し得る。二次免疫応答の場合、二次免疫応答の形成には約２日から約３日かかり得る。従って、特定の態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間は、約１日から約２１日、約１日から約２２日、約１日から約２３日、約１日から約２４日、約１日から約３週間、約１日から約４週間で、約１日から約５週間、約１日から約１０週間、約１日から約１５週間、約１日から約２０週間、約１日から約２５週間、約１日から約３０週間、約１日から約３５週間、約１日から約４０週間、約１日から約４５週間、約１日から約５０週間、約１日から約１年、約１日から約２年、約１日から約３年、約１日から約４年、約１日から約５年、約１日から約１０年、約１日から約１５年、約１日から約２０年、約１日から約２５年、約１日から約３０年、約１日から約３０年以上、およびそれらの間の任意の期間である。特定の態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程との間の期間は、約１日から約１ヶ月、１４日から約２ヶ月、１ヶ月から約３ヶ月、２ヶ月から約５ヶ月、４ヶ月から約６ヶ月、５ヶ月から約７ヶ月、６ヶ月から約８ヶ月、７ヶ月から約９ヶ月、８ヶ月から約１０ヶ月、９ヶ月から約１１ヶ月、１０ヶ月から約１２ヶ月、１１ヶ月から約１３ヶ月、１２ヶ月から約１４ヶ月、１３ヶ月から約１５ヶ月、１４ヶ月から約１６ヶ月、１５ヶ月から約１７ヶ月、１６ヶ月から約１８ヶ月、１７ヶ月から約１９ヶ月、１８ヶ月から約２０ヶ月、１９ヶ月から約２１ヶ月、２０ヶ月から約２２ヶ月、２１ヶ月から約２３ヶ月、２２ヶ月から約２４ヶ月、３ヶ月から約１年、６ヶ月から約１年、１年から約２年、１．５年から約３年、２年から約３．５年、２．５年から約４年、３年から約４．５年、３．５年から約５年、４年から約５．５年、４．５年から約６年、５年から約６．５年、５．５年から約７年、６年から約７．５年、６．５年から約８年、７年から約８．５年、７．５年から約９年、８年から約９．５年、８．５年から約１０年、およびそれらの間の任意の期間である。

【0178】

特定の態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程の間の期間は、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約２０週間、約３０週間、約４０週間、約５０週間、約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約１０年、約１５年、約２０年、約２５年、約３０年、またはそれ以上、およびそれらの間の任意の期間である。特定の態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程の間の期間は、約２日から約２１日である。特定の態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程の間の期間は、約２日から約３日である。特定の態様において、ワクチン接種工程と腫瘍マーキング工程の間の期間は、約７日から約２１日である。

【0179】

本明細書で言及される文献の内容は、それぞれ引用により本明細書中に包含される。

【0180】

明確化かつ簡潔な説明の目的で、本明細書中、特徴を同じかまたは別個の面およびその態様の一部として記載する。例えば、ポリペプチドに関する態様はまた、そのようなポリペプチドをコードする核酸にも適用されてよく、逆もまた同様である。同じことが、例えば、使用のための製品、使用および方法形式で定義された医学的用途に関連する態様にも適用される。本発明をその具体的な態様を参照して説明してきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えたり、等価物を代用したりすることができることを、当業者は理解すべきである。本明細書に記載の方法の他の適切な変更および適応は、本明細書に記載の態様の範囲から逸脱することなく、適切な等価物を用いて行うことができることが、当業者には容易に明らかであり得る。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程または複数工程には、本発明の目的、精神および範囲に適応させるために、多くの変更を行うことができる。このような変更はすべて、添付の特許請求の範囲内であることが意図されている。ここまで特定の態様を詳細に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより、同じことがより明確に理解され得る。これらの実施例は、説明のためにのみ含まれており、限定することを意図していない。

【0181】

配列表
配列番号１：ジフテリア毒素
GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

配列番号２：ジフテリア毒素の受容体結合ドメイン(配列番号１のアミノ酸385－535)
KTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

配列番号３：ジフテリア毒素の受容体結合ドメイン(配列番号１のアミノ酸387－535)
QPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

【実施例】

【0182】

実施例
材料および方法
ＤＣＯｎｅ成熟樹状細胞（ｍＤＣ）の作製
ＤＣＯｎｅ前駆細胞（２０１２年１１月１５日に受託番号ＤＳＭＺ ＡＣＣ３１８９でＤＳＭＺに寄託された細胞）を、ＷＯ２００９０１９３２０ Ａ２（その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）に記載の方法により分化および成熟化させた。細胞を計数し、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞の表現型分析をフローサイトメトリー（FACSVerse; BDBiosciences）を用いて行った。

【0183】

卵巣癌細胞の培養
ＯＶ９０卵巣癌細胞を、１５％ ＦＢＳおよび２％ Ｐ／Ｓを含む媒体１９９／MCDB105培地（１：１）中、３７℃にて５％ ＣＯ_２でインキュベーター中で培養した。ＯＶ９０細胞はＡＴＣＣから得た。

【0184】

ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによる外来抗原の取り込み
ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによる取り込みを、成熟中の４時間および２４時間、終濃度１０μｇ／ｍＬの３つの異なる外来抗原について評価した。７５０，０００細胞を、各条件の６ウェルプエートに播種した。用いる抗原は、ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８、サブユニットＫＬＨ－ＦＩＴＣおよびβ－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣであった。ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８はFina Biosolutionsから購入した。サブユニットＫＬＨはStellar Biotechnologies Incから購入した。β－ガラクトシダーゼをRocheから購入した。サブユニットＫＬＨおよびβ－ガラクトシダーゼを、製造者プロトコールによりフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識キットを用いて、試験室内で蛍光色素ＦＩＴＣに結合させた。外来抗原の取り込みをフローサイトメトリーにより評価した。０．０８％トリパンブルーを用いて、外部に結合したタンパク質をクエンチし、内在化したタンパク質のみを可視化した。

【0185】

外来抗原による腫瘍細胞の標識
ＯＶ９０卵巣癌細胞の標識を、４時間および２４時間、終濃度１０μｇ／ｍＬの３つの異なる外来タンパク質について評価した。１００，０００細胞を、各条件の９６ウェルプエートに播種した。用いたタンパク質は、ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８、サブユニットＫＬＨ－ＦＩＴＣおよびβ－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣであった。インビトロでの腫瘍細胞の標識は、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞について上記のようにフローサイトメトリーにより評価した。

【0186】

ヒト化Ｕ８７－ＭＧ神経膠芽腫マウスモデル
４週齢の免疫不全メスＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ免疫不全マウス株（ＮＣＧ；Taconic）に、骨髄機能廃絶化学療法（chemical myeloablative treatment）の２日後、５ｅ４臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞（French Blood Bank）を静脈内（ＩＶ）注射で移植した。ヒト化マウスを、ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ３／ＩＬ４ 流体ブーストおよびＦｌｔ３Ｌ組換えタンパク質で樹状細胞集団を増強させた。７日後、腫瘍生着のためにマウス右脇腹に１ｅ^６ Ｕ８７－ＭＧ膠芽腫細胞／マウス（Sigma Aldrich）を皮下注射した。腫瘍生着の１５日後、マウスを無作為化し、１群当たり５匹のマウスを含む異なるワクチン接種群に分けた。全てのマウスは、腹腔内（ｉ.ｐ.）ワクチン接種１回および腫瘍をマーキングするため腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射１回を受けた。

【0187】

マウスは、以下のスケジュールで、腹腔内（ｉ.ｐ.）投与当たり１００μｇ ＫＬＨまたは１００μｌ ＰＢＳのｉ.ｐ投与を受け、２００，０００ ＫＬＨを添加したＤＣＯｎｅ ｍＤＣｓまたは５０μｌ中、１００μｇ ＫＬＨをｉ.ｔ．注射した：
群１（ＰＢＳ／ＫＬＨ）は、ＰＢＳワクチン接種の腹腔内（ｉ.ｐ.）投与１回（無作為化の１日後）、およびＫＬＨによる腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射１回（無作為化の８日後）を受けた。
群２（ＫＬＨ／ＫＬＨ）は、ＫＬＨワクチン接種のｉ.ｐ.投与１回（無作為化の１日後）、およびＫＬＨによるｉ．ｔ．注射１回（無作為化の８日後）を受けた。
群３（ＰＢＳ／ＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ）は、ＰＢＳワクチン接種のｉ.ｐ.投与１回（無作為化の１日後）、およびＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ によるｉ．ｔ．注射１回（無作為化の８日後）を受けた。
群４（ＫＬＨ／ＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ）は、ＫＬＨワクチン接種のｉ.ｐ.投与１回（無作為化の１日後）、およびＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ によるｉ．ｔ．注射１回（無作為化の８日後）を受けた。

【0188】

サブユニットＫＬＨは、Stellar Biotechnologies Incから購入した。腫瘍増殖の減少および免疫応答の誘導を測定した。

【0189】

ヒト化Ａ３７５黒色腫モデルマウス
上記のようにＣＤ３４^＋幹細胞でヒト化し、およびサイトカインで流体ブーストを行った後、腫瘍生着のために、マウスの右脇腹に２ｅ^６ Ａ３７５黒色腫細胞／マウス（Sigma Aldrich）を皮下接種した。腫瘍生着の１５日後、マウスを無作為化し、１群当たり５匹のマウスを含む異なるワクチン接種群に分けた。マウスは、腹腔内（ｉ.ｐ.）ワクチン接種２回および腫瘍をマーキングするため腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射１回を受けた。

【0190】

マウスは、以下のスケジュールで、腹腔内（ｉ.ｐ.）投与当たり１００μｌ中、１００μｇ ＫＬＨまたは１００μｌ ＰＢＳのｉ.ｐ投与を受け、２００，０００ ＫＬＨを添加したＤＣＯｎｅ ｍＤＣｓまたは５０μｌ中、１００μｇ ＫＬＨをｉ.ｔ．注射した：
群１（ＰＢＳ／ＫＬＨ）は、ＰＢＳワクチン接種の腹腔内（ｉ.ｐ.）投与２回（無作為化の１日後および８日後）、およびＫＬＨによる腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射１回（無作為化の１５日後）を受けた。
群２（ＫＬＨ／ＫＬＨ）は、ＫＬＨワクチン接種のｉ.ｐ.投与２回（無作為化の１日後及び８日後）、およびＫＬＨによるｉ．ｔ．注射１回（無作為化の１５日後）を受けた。
群３（ＰＢＳ／ＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ）は、ＰＢＳワクチン接種のｉ.ｐ.投与２回（無作為化の１日後および８日後）、およびＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ によるｉ．ｔ．注射１回（無作為化の１５日後）を受けた。
群４（ＫＬＨ／ＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ）は、ＫＬＨワクチン接種のｉ.ｐ.投与２回（無作為化の１日後および８日後）、およびＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ によるｉ．ｔ．注射１回（無作為化の１５日後）を受けた。

【0191】

サブユニットＫＬＨをStellar Biotechnologies Incから購入した。腫瘍増殖の減少およびワクチン接種により誘発された免疫応答を測定した。

【0192】

実施例１．外来タンパク質の取り込み
ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによるサブユニットＫＬＨ－ＦＩＴＣの取り込み
ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞に、材料および方法セクションに記載の通り、４時間および２４時間、成熟プロセス中に蛍光色素結合サブユニットＫＬＨを負荷した。サブユニットＫＬＨの内在化を、フローサイトメトリーを用いて分析した。トリパンブルーは、細胞表面結合抗原をクエンチし、表面結合抗原と内在化抗原を区別するために用いた。４時間後のＤＣＯｎｅｍＤＣによるサブユニットＫＬＨ－ＦＩＴＣの観察された内在化は、５４．６±８．８％であり、トリパンブルーで４９．９±９．８％であり、２４時間後に８６．１±７．０％であり、トリパンブルーで８１．７±８．０％であって、これらはＤＣＯｎｅ ｍＤＣによる効果的な抗原取り込みを示している（図１Ａ）。

【0193】

サブユニットＫＬＨでのＯＶ９０腫瘍細胞の標識化
ＯＶ９０卵巣癌腫細胞を、材料および方法セクションに記載の通り、４時間および２４時間、サブユニットＫＬＨ－ＦＩＴＣと共に培養した。本発明者らは、表面結合サブユニットＫＬＨ－ＦＩＴＣシグナルをトリパンブルーで消光することで示されるように、４時間後に、ＯＶ９０細胞の１３．５±２．６％が標識され、細胞内抗原を有する細胞では７．５±１．０％であり、２４時間後には、ＯＶ９０細胞の１６．５±１１．５％が標識され、細胞内抗原を有する細胞では９．５±３．８％が標識された（図１Ｂ）。

【0194】

ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによるβ－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣの取り込み
ＤＣＯｎｅ ｍＤＣを、材料および方法セクションに記載のように、β－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣと共に４時間および２４時間インキュベートした。β－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣの取り込みを、細胞外で結合したβ－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣと内在化β－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣを区別するために、トリパンブルーの不存在下または存在下でフローサイトメトリーを用いて測定した。図２Ａは、トリパンブルーの消光がシグナルにほとんど影響を与えなかった（３４．５±１０．２％）ため、４時間のインキュベーション後、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣの３９．７±１０．７％がβ－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣを内在化していることを示し、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ中β－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣの細胞内局在が示唆された。ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによるβ－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣの内在化は、２４時間後に５７．６±１０．２％、トリパンブルーによる内在化は４９．９±１３．０％であり、細胞内β－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣの内在化が示唆された。

【0195】

β－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣによるＯＶ９０の標識化
卵巣癌細胞株ＯＶ－９０を、４時間後および２４時間後にβ－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣで標識したところ、それぞれ１１．３±８．９％（トリパンブルーで６．０±４．６％）および１０．４±４．２％（トリパンブルーで６．５±３．６％）であり、β－ガラクトシダーゼ－ＦＩＴＣの表面結合および細胞内存在の両方を示した（図２Ｂ）。

【0196】

ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによるＣＲＭ１９７の取り込み
成熟プロセス中、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣを、材料および方法セクションに記載のように、ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８と共に４時間および２４時間培養した。４時間および２４時間後、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによる抗原ＣＲＭ－１９７の取り込みを、上記のセクションで記載の通り、トリパンブルーの存在および不存在下でフローサイトメトリーを用いて分析した。本発明者らは、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣの９０．６±５．４％および９９．４±０．１％が、それぞれ４時間および２４時間後、効率的な内在化ＣＲＭ－１９７を有し、トリパンブルー消光は結果に影響しなかった（それぞれ８７．６±８．０％および９９．５±０．２％；図７Ａ）ことを観察した。

【0197】

ＣＲＭ１９７によるＯＶ９０腫瘍細胞の標識化
ＯＶ９０腫瘍細胞による４時間後のＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８の取り込みの割合は、８２．０±２．５％であり、２４時間後の標識は、９８．２±０．１％まで増加した（図３）。トリパンブルー消光は、シグナルに影響を与えず、これはＣＲＭ－１９７が主に、細胞内に存在することを示唆している（それぞれ４時間後および２４時間後に、トリパンブルーで７２．７±１１．９％および９７．６±１．４％）。

【0198】

ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによる外来タンパク質の取り込みのインビボデータは、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣが外来タンパク質の内在化に非常に効率的であることを示した。試験した全ての外来タンパク質、ＣＲＭ１９７、ＫＬＨおよびβ－ガラクトシダーゼは、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによって非常によく取り込まれる。従って、ＤＣＯｎｅ細胞は、ワクチン接種および／または外来タンパク質の腫瘍内送達のための担体として用いることができる。

【0199】

卵巣癌細胞による外来タンパク質の取り込みのデータは、卵巣癌細胞が、ＤＣＯｎｅ細胞と比べて、外来タンパク質の内在化においてより特異的であることを示した。文献に記載されているように（例えば Miyamoto et al. Cancer Sci, 97(5):341-7 (2006)；その内容全体は引用により本明細書中に包含される）、ジプテリア毒素／ＣＲＭ１９７に対する特異的なＨＢ－ＥＧＦ受容体の存在により、腫瘍細胞では受容体介在性エンドサイトーシスによりＣＲＭ１９７が非常に効率的に取り込まれるが（Moya et al. J Cell Biol, 101(2):548-59 (1985)；その内容全体は引用により本明細書中に包含される）、ＫＬＨおよびβ－ガラクトシダーゼの取り込みは低い。これらの知見は、腫瘍が外来タンパク質によってマークされ得ることを示している。これは、とりわけＣＲＭ１９７についての場合であり、したがって、ＣＲＭ１９７に結合した他の外来タンパク質を腫瘍マーキングのための担体として用い得る可能性がある。

【0200】

実施例２．ヒト化Ｕ８７－ＭＧ神経膠芽腫マウスモデルおよびヒト化Ａ３７５黒色腫マウスモデルにおける腫瘍増殖阻害
Ｕ８７－ＭＧマウスは、ＰＢＳまたはＫＬＨのいずれかのi.p.ワクチン接種１回およびＫＬＨまたはＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ ｍＤＣのいずれかで腫瘍をマークするためのi.t.注射１回を受けた。腫瘍増殖を、デジタルノギスを用いて週に３回モニターした（図４Ａ)。腫瘍体積（mm3）を、以下の式に従って計算した：体積＝（幅×長さ＾２）／２。本発明者らは、１８日目に、ＰＢＳを注射したマウスと比べて、ワクチン接種したマウスの腫瘍増殖が遅くなったことを観察し、ＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅのi.t.注射が最も強い効果を示した（図４Ｂ）。

【0201】

Ａ３７５黒色腫マウスは、ＰＢＳまたはＫＬＨのいずれかの２回のｉ.ｐ.ワクチン接種、およびＫＬＨまたはＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ ｍＤＣのいずれかで腫瘍をマークするための１回のｉ．ｔ．注射を受けた。腫瘍増殖を、デジタルノギスを用いて週に３回モニターした（図５Ａ）。腫瘍体積（mm3）は、以下の式に従って計算した：体積＝（幅×長さ＾２）／２。Ｕ８７－ＭＧマウスと同様に、我々は、ワクチン接種したマウス群が、ＰＢＳを注射した群と比較して腫瘍増殖が遅くなったことを観察した（図５Ｂ）。この効果は、ＫＬＨ／ＫＬＨを添加したＤＣＯｎｅで処理したマウスで最も強かった。

【0202】

ヒト化マウスにおけるこれらのインビボデータは、ワクチン接種に続いて腫瘍内注射（腫瘍マーキング）を行うと、特にＤＣＯｎｅ ｍＤＣを担体として用いて腫瘍マーキングを行ったときに、２つの別個の固形腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖が遅くなることを示している。統計的に有意ではなかったが、腫瘍増殖の遅延傾向は、２つの別個の固形腫瘍モデルにおいて一貫していた。

【0203】

実施例３．Ｔ細胞介在性ＫＬＨ特異的抗体産生
腫瘍内注射および／またはワクチン接種に起因するＫＬＨに対する可能性のある抗体反応をＥＬＩＳＡにより定量した（Ｄ０、Ｄ１４および屠殺）。Ｕ８７－ＭＧマウスおよびＡ３７５マウスの両マウスにおいて、処置群とＰＢＳ対照群との間で、抗ＫＬＨ ＩｇＭ濃度に関して経時的に有意差がないことが観察された（図６Ａ－図６Ｂ）。しかしながら、驚くべきことに、ＫＬＨ／ＫＬＨ添加ＤＣＯｎｅ群のマウスが、屠殺時にＰＢＳ対照群よりも有意に多くの抗ＫＬＨ ＩｇＭを産生していることが観察された（図６Ｃ－図６Ｄ）。このことは、Ｔ細胞依存性のＩｇＭからＩｇＧへのスイッチを示唆している（Geha et al., NEJM, 330:1008-1009 (1994)；その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）。

【0204】

実施例４．ＣＲＭ１９７ワクチン接種
材料および方法
ＤＣＯｎｅ成熟樹状細胞（ｍＤＣ）の生成
ＤＣＯｎｅ前駆細胞（２０１２年１１月１５日に受託番号ＤＳＭＺ ＡＣＣ３１８９でＤＳＭＺに寄託された細胞）を、ＰＣＴ公報ＷＯ２００９／０１９３２０（その内容全体は引用により本明細書中に包含させる）に記載の方法により分化および成熟化させた。細胞を計数し、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞の表現型分析をフローサイトメトリー（FACSVerse; BDBiosciences）を用いて行った。

【0205】

癌細胞の培養
ＤＣＯｎｅ ＡＭＬ前駆細胞を、１０％ ＦＢＳおよび２％ Ｐ／Ｓを含むＭＥＭα中、３７℃にて５％ ＣＯ_２でインキュベーター中で培養した。ＯＶ９０卵巣癌細胞を、１５％ＦＢＳおよび２％ Ｐ／Ｓを含むｍｅｄｉｕｍ１９９／ＭＣＤＢ１０５培地（１：１）中、３７℃にて５％ ＣＯ_２でインキュベーター中で培養した。ＯＶ９０細胞はＡＴＣＣから入手した。Ｕ８７ＭＧ膠芽腫細胞を、１０％ＦＢＳおよび２％Ｐ／Ｓを含むＥＭＥＭ培地中、３７℃にて５％ＣＯ_２で培養した。Ｕ８７ＭＧ細胞はＭｅｒｃｋ社から入手した。

【0206】

ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによる外来抗原ＣＲＭ１９７の取り込み
ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞による外来抗原の取り込みを、成熟中の４時間および２４時間、終濃度１０μｇ／ｍＬの外来抗原について評価した。７５０，０００細胞を、各条件の６ウェルプエートに播種した。用いる外来抗原は、ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８（Fina Biosolutions）であった。外来抗原の取り込みをフローサイトメトリーにより評価した。０．０８％トリパンブルーを用いて、外部に結合したタンパク質をクエンチし、内在化したタンパク質のみを可視化した。

【0207】

外来抗原ＣＲＭ１９７による腫瘍細胞の標識
ＤＣＯｎｅ前駆ＡＭＬ細胞、ＯＶ９０卵巣癌細胞、Ｕ８７ＭＧ膠芽腫癌細胞の標識を、４時間および２４時間、終濃度１０μｇ／ｍＬで評価した。１００，０００細胞を、各条件の９６ウェルプエートに播種した。用いた外来抗原は、ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８（Fina Biosolutions）であった。インビトロでの腫瘍細胞の標識は、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞について上記のようにフローサイトメトリーにより評価した。

【0208】

ヒト化ＯＶ９０ｌｕｃ卵巣癌マウスモデル
複数のＮＣＧに、５ｅ４臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆細胞を静脈内（ＩＶ）注射で移植した。腫瘍生着のために、マウスにルシフェラーゼを発現する５ｅ^６ ＯＶ９０ｌｕｃ卵巣癌を皮下注射した。腫瘍サイズでマウスを無作為化し、１群当たり５匹を含む異なるワクチン接種群に分けた。ワクチン接種開始時の平均腫瘍サイズは８０ｍｍ^３であった。すべてのマウスに腹腔内（i.p.）ワクチン接種を２回行い、腫瘍をマーキングするために腫瘍内（i.t.）注射を１回行った。

【0209】

マウスは、以下のスケジュールで、腹腔内（ｉ.ｐ.）投与当たり５０μｇ ＣＲＭ１９７またはＰＢＳのｉ.ｐ投与を受け、２５μｇ ＣＲＭ１９７をｉ.ｔ．注射した：
群１（ＰＢＳ／ＰＢＳ）は、ＰＢＳワクチン接種の腹腔内（ｉ.ｐ.）投与２回（無作為化後２週目および３週目）、およびＰＢＳの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射１回（無作為化後４週目）を受けた。
群２（ＰＢＳ／ＣＲＭ１９７）は、ＰＢＳワクチン接種の腹腔内（ｉ.ｐ.）投与２回（無作為化後２週目および３週目）、およびＣＲＭ１９７の腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射１回（無作為化後４週目）を受けた。
群３（ＣＲＭ１９７／ＰＢＳ）は、ＣＲＭ１９７ワクチン接種のｉ.ｐ.投与２回（無作為化後２週目および３週目）、およびＰＢＳのｉ．ｔ．注射１回（無作為化後４週目）を受けた。
群４（ＣＲＭ１９７／ＣＲＭ１９７）は、ＣＲＭ１９７ワクチン接種のｉ.ｐ.投与２回（無作為化後２週目および３週目）、およびＣＲＭ１９７のｉ．ｔ．注射１回（無作為化後４週目）を受けた。

【0210】

ＣＲＭ１９７は、Fina Biosolutions社から購入した。腫瘍の増殖抑制（キャリパー測定およびＢＬＩイメージング）および免疫応答の誘導を測定した。

【0211】

ＤＣＯｎｅ ｍＤＣによるＣＲＭ１９７の取り込み
成熟プロセス中、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞を、材料および方法セクションに記載のように、ＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８と共に４時間および２４時間培養した。４時間および２４時間後、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞による抗原ＣＲＭ－１９７の取り込みを、上記のセクションで記載の通り、トリパンブルーの存在および不存在下でフローサイトメトリーを用いて分析した。本発明者らは、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞の９０．６±５．４％および９９．４±０．１％が、それぞれ４時間および２４時間後、効率的な内在化ＣＲＭ－１９７を有したことを観察した。トリパンブルー消光はこれらの結果に影響しなかった（それぞれ８７．６±８．０％および９９．５±０．２％；図７Ａ）。

【0212】

ＣＲＭ１９７によるＤＣＯｎｅ前駆細胞の標識化
ＤＣＯｎｅ前駆細胞による４時間後のＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８の取り込みの割合は、９４．２±３．３％であり、２４時間後の標識は、９９．５±０．８％まで増加した。トリパンブルー消光は、シグナルに影響を与えず、これはＣＲＭ－１９７が主に、細胞内に存在することを示唆している（それぞれ４時間後および２４時間後に、トリパンブルーで９０．７±７．３％および９８．８±１．７％；図７Ｂ）。

【0213】

ＣＲＭ１９７によるＯＶ９０腫瘍細胞の標識化
ＯＶ９０腫瘍細胞による４時間後のＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８の取り込みの割合は、８２．０±２．５％であり、２４時間後の標識は、９８．２±０．１％まで増加した。トリパンブルー消光は、シグナルに影響を与えず、これはＣＲＭ－１９７が主に、細胞内に存在することを示唆している（それぞれ４時間後および２４時間後に、トリパンブルーで７２．７±１１．９％および９７．６±１．４％；図７Ｃ）。

【0214】

ＣＲＭ１９７によるＵ８７ＭＧ腫瘍細胞の標識化
Ｕ８７ＭＧ腫瘍細胞による４時間後のＣＲＭ１９７－Ａｌｅｘａ４８８の取り込みの割合は、９５．３±２．６％であり、２４時間後の標識は、９９．４±０．４％まで増加した。トリパンブルー消光は、シグナルに影響を与えず、これはＣＲＭ－１９７が主に、細胞内に存在することを示唆している（それぞれ４時間後および２４時間後に、トリパンブルーで９３．９±４．２％および９８．８±０．７％；図７Ｄ）。

【0215】

ヒト化ＯＶ９０ｌｕｃ卵巣癌モデルにおける腫瘍増殖
腫瘍増殖を、処置の開始から週１回のノギス測定（calliper measurement）と光学的イメージングによりモニターした。ＯＶ９０ｌｕｃマウスに、ＰＢＳまたはＣＲＭ１９７のいずれかを２回ｉ.ｐ.で接種し、ＰＢＳまたはＣＲＭ１９７のいずれかで腫瘍をマーキングするために１回ｉ．ｔ．で注射した。腫瘍増殖を、デジタルノギスを用いて１週間ごとにモニターした。腫瘍の体積（ｍｍ^３）を、楕円体近似式（ellipsoid formula） (ＬｘＷｘＨ)π／６で算出した。

【0216】

ＣＲＭ１９７を接種したマウスでは、ＰＢＳを注入したマウスと比較して、腫瘍体積に差は見られなかった（図８Ａ）。生物発光データによると、ＣＲＭ１９７をワクチン接種したマウスにＣＲＭ１９７をｉ．ｔ．で注射したところ、生物発光強度が有意に低下した（図８Ｂおよび図９）。これは、このＣＲＭ１９７ワクチン接種／ＣＲＭ１９７ ｉ．ｔ．群において、ＯＶ９０卵巣癌細胞の増殖が顕著に停止したことを示している。

【0217】

これらのヒト化マウスを用いたインビボデータは、ＣＲＭ１９７のワクチン接種後の腫瘍内注射（腫瘍マーキング）が、癌細胞の増殖停止をもたらすことを示している

【0218】

実施例５．インビボ細胞毒性ＣＲＭ１９７の概念実証
ヒト化腫瘍マウスモデルにおいて、ＣＲＭ１９７を腫瘍非依存性抗原としてプライム・ブースト戦略を試験するために用いる。本試験の目的は、ワクチン接種プロトコールの最適化、腫瘍を確実に退縮させるための最適なマウスモデルを用いた初期実験の繰り返し、腫瘍部位での免疫活性化のための免疫組織化学を用いた腫瘍の評価である。

【0219】

ワクチン接種戦略
腹腔内ワクチン接種：
（１週目、移植前、１週目、移植後）
I. 生理食塩水を用いたワクチン接種（６匹のマウス）。
II. 生理食塩水を用いたワクチン接種（６匹のマウス）。
III. ＣＲＭ１９７を用いたワクチン接種(６匹のマウス) 。
IV. ＣＲＭ１９７を用いたワクチン接種（６匹のマウス）。

腫瘍内注射：
(移植後３週目)
I. 生理食塩水を用いた腫瘍内ワクチン接種（６匹のマウス）。
II. ＣＲＭ１９７を用いた腫瘍内ワクチン接種（６匹のマウス）。
III. 生理食塩水を用いた腫瘍内ワクチン接種（６匹のマウス）。
IV. ＣＲＭ１９７を用いた腫瘍内ワクチン接種（６匹のマウス）。

【0220】

本試験を、Ｕ８７ＭＧ膠芽腫細胞株を用いたＨＢ－ＥＧＦ発現腫瘍を有するマウスで実施する。試験読み出しデータ（clinical readout）は、腫瘍の退縮／排除および生存率である。免疫細胞の腫瘍への浸潤を調べるため、腫瘍の免疫組織化学を評価する。血清分析を、抗ＣＲＭ抗体を検出するために行う。ワクチン接種量は、５０μｇのＣＲＭ１９７／マウスである。腫瘍内投与量は２５μｇ ＣＲＭ１９７／マウスである。

【0221】

【表1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】