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特表2022-530086プロテアーゼ活性化受容体媒介シグナル伝達経路の活性を用いた細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞の選別方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-27
(54)【発明の名称】プロテアーゼ活性化受容体媒介シグナル伝達経路の活性を用いた細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞の選別方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0735 20100101AFI20220620BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220620BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20220620BHJP
C07K 14/745 20060101ALN20220620BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0735
C12Q1/02
C12N5/0775
C07K14/745
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021563128
(86)(22)【出願日】2020-04-28
(85)【翻訳文提出日】2021-10-22
(86)【国際出願番号】 KR2020005599
(87)【国際公開番号】W WO2020222503
(87)【国際公開日】2020-11-05
(31)【優先権主張番号】10-2019-0049898
(32)【優先日】2019-04-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2020-0050893
(32)【優先日】2020-04-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】512250119
【氏名又は名称】サムスン ライフ パブリック ウェルフェア ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100154922
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 允辰
(72)【発明者】
【氏名】ユン・シル・チャン
(72)【発明者】
【氏名】ウォン・ソン・パク
(72)【発明者】
【氏名】ドン・キュン・スン
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ79
4B063QR48
4B063QR77
4B063QS33
4B065AA90X
4B065AC20
4B065CA24
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA65
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性を測定する段階を含む細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞の選別方法と、当該方法によって選別された幹細胞、および細胞外小胞の生成誘導剤のスクリーニング方法に関する。本発明によれば、幹細胞にトロンビンを前処理すると、ＰＡＲ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）媒介シグナル伝達経路を通じて前記幹細胞で細胞外小胞の生成および前記小胞内タンパク質のレベルが顕著に増加するところ、幹細胞にトロンビンを処理し、ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定することによって、細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞を効率的に選別することができ、このような方法によって選別された幹細胞は関連研究および臨床分野において有用に活用されうる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階を含む、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の高効率生成能を有する幹細胞の選別方法。
【請求項2】
前記ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性レベルの測定段階は、下記の段階を含むことを特徴とする請求項１に記載の選別方法：（ａ）幹細胞の培養後、トロンビンを処理する段階；
（ｂ）前記トロンビンが処理された幹細胞でＲａｂ－５（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ－５）、ＥＥＡ－１（Ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ａｎｔｉｇｅｎ－１）、ｐ－ＥＲＫ１／２（Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ １／２）およびｐ－ＡＫＴ（Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ）からなる群から選択される１種以上の発現レベルを測定する段階；および
（ｃ）前記発現レベルが増加した幹細胞を細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞として選別する段階。
【請求項3】
前記ＰＡＲが、ＰＡＲ１またはＰＡＲ３であることを特徴とする請求項１に記載の選別方法。
【請求項4】
前記細胞外小胞の高効率生成能は、細胞外小胞の生産量または細胞外小胞内タンパク質のレベルが増進されるものであることを特徴とする請求項１に記載の選別方法。
【請求項5】
前記タンパク質が、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）、アンジオジェニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）およびアンジオポエチン－１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１）からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項４に記載の選別方法。
【請求項6】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または成体幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の選別方法。
【請求項7】
前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系ストローマ細胞、ヒト組織由来間葉系幹細胞、および多分化能幹細胞からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項６に記載の選別方法。
【請求項8】
前記間葉系幹細胞が、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、皮膚、羊膜および胎盤からなる群から選択される１種以上の組織に由来するものであることを特徴とする請求項７に記載の選別方法。
【請求項9】
前記トロンビンが１～１０Ｕ／ｍＬで処理されることを特徴とする請求項２に記載の選別方法。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の選別方法によって選別された、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の高効率生成能を有する幹細胞。
【請求項11】
下記の段階を含む、幹細胞の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）生成増進誘導剤のスクリーニング方法：（ａ）幹細胞に候補物質を処理する段階；
（ｂ）プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階；および
（ｃ）前記ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性を増加させる物質を細胞外小胞の生成増進誘導剤として選定する段階。
【請求項12】
前記ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性レベル測定は、Ｒａｂ－５（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ－５）、ＥＥＡ－１（Ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ａｎｔｉｇｅｎ－１）、ｐ－ＥＲＫ１／２（Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ １／２）およびｐ－ＡＫＴ（Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ）からなる群から選択される１種以上の発現レベルを測定するものであることを特徴とする請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項13】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または成体幹細胞であることを特徴とする請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項14】
前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系ストローマ細胞、ヒト組織由来間葉系幹細胞、および多分化能幹細胞からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項15】
前記間葉系幹細胞が、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、皮膚、羊膜および胎盤からなる群から選択される１種以上の組織に由来するものであることを特徴とする請求項１４に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性を測定する段階を含む細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞の選別方法と、当該方法によって選別された幹細胞、および細胞外小胞の生成誘導剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＥＶｓ）は、４０～１５０ｎｍの直径を有し、様々な細胞から分泌される分泌膜小胞である。細胞外小胞は、起源細胞に存在するものと類似した多くの種類のタンパク質、脂質およびＲＮＡを含有し、内部に含まれた様々な因子の伝達を通じて細胞間コミュニケーションのための重要なメッセンジャーとして認識されてきた。最近の研究によれば、心血管系疾患、肺損傷、急性腎障害、胎児の低酸素性虚血性脳障害、皮膚傷治療および低酸素血症による肺高血圧症のような様々な疾患において間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）の治療効能が、間葉系幹細胞由来の細胞外小胞を通したｍＲＮＡｓ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびタンパク質の伝達によって主に媒介されると報告されてきた（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０１２，１２６，２６０１－２６１１．）。間葉系幹細胞自体を移植する治療法に比べて間葉系幹細胞由来の細胞外小胞を用いた療法の主なメリットは、細胞外小胞が細胞自体を用いた治療の限界点を克服できるということである。また、間葉系幹細胞と比較して、細胞外小胞は、生物学的機能の消失なしで保管が可能で、「ｏｆｆ ｔｈｅ ｓｈｅｌｆ」医薬品として使用するのにさらに適している。しかしながら、このような細胞外小胞の長所にもかかわらず、間葉系幹細胞から少量のみが分泌され、結果的に、低い治療効能は、細胞外小胞の臨床適用のために克服すべき問題と指摘される。
【0003】
このような観点から、本発明者らは、以前の研究を通じて間葉系幹細胞にトロンビンを前処理した結果、細胞外小胞の生合成および内部物質の濃度が増加する効果を確認した。しかしながら、トロンビン処理がいかなる分子的機序を通じて上記のような効果を誘導するかについては明確に糾明されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明者らは、間葉系幹細胞においてトロンビン処理がいかなる経路を通じて細胞外小胞の生成能を向上させるかを糾明するために研究を重ねた結果、トロンビン処理が、ＰＡＲ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）媒介シグナル伝達経路を通じて上記のような効果を誘導することを具体的に確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【0005】
これより、本発明は、幹細胞内プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性化レベルを測定する段階を含む、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の高効率生成能を有する幹細胞の選別方法を提供することを目的とする。
【0006】
また、本発明は、前記方法によって選別された、細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞を提供することを他の目的とする。
【0007】
また、本発明は、幹細胞の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）生成増進誘導剤のスクリーニング方法を提供することをさらに他の目的とする。
（ａ）幹細胞に候補物質を処理する段階；
（ｂ）プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階；および
（ｃ）前記ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性を増加させる物質を細胞外小胞の生成増進誘導剤として選定する段階。
（ａ）幹細胞に候補物質を処理する段階；
（ｂ）プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階；および
（ｃ）前記ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性を増加させる物質を細胞外小胞の生成増進誘導剤として選定する段階。
【0008】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から当業者が明確に理解できる。
【課題を解決するための手段】
【0009】
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階を含む、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の高効率生成能を有する幹細胞の選別方法を提供する。
【0010】
また、本発明は、前記方法を通じて選別された、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の高効率生成能を有する幹細胞を提供する。
【0011】
前記ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階は、下記の段階を含んでいてもよい。
（ａ）幹細胞の培養後、トロンビンを処理する段階；
（ｂ）前記トロンビンが処理された幹細胞でＲａｂ－５（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ－５）、ＥＥＡ－１（Ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ａｎｔｉｇｅｎ－１）、ｐ－ＥＲＫ１／２（Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ １／２）およびｐ－ＡＫＴ（Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ）からなる群から選択される１種以上の発現レベルを測定する段階；および
（ｃ）前記発現レベルが増加した幹細胞を細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞として選別する段階。
（ａ）幹細胞の培養後、トロンビンを処理する段階；
（ｂ）前記トロンビンが処理された幹細胞でＲａｂ－５（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ－５）、ＥＥＡ－１（Ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ａｎｔｉｇｅｎ－１）、ｐ－ＥＲＫ１／２（Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ １／２）およびｐ－ＡＫＴ（Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ）からなる群から選択される１種以上の発現レベルを測定する段階；および
（ｃ）前記発現レベルが増加した幹細胞を細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞として選別する段階。
【0012】
本発明の他の具現例として、前記ＰＡＲが、ＰＡＲ１またはＰＡＲ３であってもよい。
【0013】
本発明のさらに他の具現例として、前記細胞外小胞の高効率生成能は、細胞外小胞の生産量または細胞外小胞内タンパク質の含有量が増進されるものであってもよい。
【0014】
本発明のさらに他の具現例として、前記タンパク質が、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）、アンジオジェニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）およびアンジオポエチン－１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１）からなる群から選択される１種以上であってもよい。
【0015】
本発明のさらに他の具現例として、前記幹細胞が、胚性幹細胞または成体幹細胞であってもよい。
【0016】
本発明のさらに他の具現例として、前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系ストローマ細胞、ヒト組織由来間葉系幹細胞、および多分化能幹細胞からなる群から選択される１種以上であってもよい。
【0017】
本発明のさらに他の具現例として、前記間葉系幹細胞が、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、皮膚、羊膜および胎盤からなる群から選択される１種以上の組織に由来したものであってもよい。
【0018】
本発明のさらに他の具現例として、前記トロンビンが１～１０Ｕ／ｍＬで処理されるものであってもよい。
【0019】
また、本発明は、下記の段階を含む、幹細胞の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）生成増進誘導剤のスクリーニング方法を提供する。
（ａ）幹細胞に候補物質を処理する段階；
（ｂ）プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階；および
（ｃ）前記ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性を増加させる物質を細胞外小胞の生成増進誘導剤として選定する段階。
（ａ）幹細胞に候補物質を処理する段階；
（ｂ）プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階；および
（ｃ）前記ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性を増加させる物質を細胞外小胞の生成増進誘導剤として選定する段階。
【発明の効果】
【0020】
本発明によれば、幹細胞にトロンビンを前処理すると、ＰＡＲ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）媒介シグナル伝達経路を通じて前記幹細胞で細胞外小胞の生成および前記小胞内タンパク質のレベルが顕著に増加するところ、幹細胞にトロンビンを処理し、ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定することによって、細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞を効率的に選別することができ、このような方法によって選別された幹細胞は、関連研究および臨床分野において有用に活用されうる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1a】間葉系幹細胞にトロンビンを処理しないか（ｎａｉｖｅ）、濃度別に処理（１、２、４Ｕ／ｍＬ）した群において細胞外小胞の生産レベルを分析した結果である。
【図1b】間葉系幹細胞にトロンビンを処理しないか（ｎａｉｖｅ）、濃度別に処理（１、２、４Ｕ／ｍＬ）した群において細胞外小胞の内部に含まれたタンパク質（ＶＥＧＦ、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１およびＨＧＦ）のレベルを分析した結果である。
【図1c】間葉系幹細胞内初期エンドソームをＧＦＰで標識してトロンビン処理の有無による初期エンドソームの差異を分析した蛍光イメージおよびその定量結果である。
【図1d】トロンビンが処理されない間葉系幹細胞（ｎａｉｖｅ）およびトロンビンを前処理した間葉系幹細胞（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）からそれぞれ分離した細胞外小胞を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）および透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した結果である。
【図1f】図１ｄと同じ群から分離した各細胞外小胞でエキソソーム特異的マーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１、ミトコンドリアマーカーであるシトクロムｃ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ）、核マーカーであるフィブリラリン（Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ）およびゴルジ体マーカーであるＧＭ１３０の発現の有無を免疫ブロッティング分析を通じて確認した結果である。
【図2a】トロンビンが処理されない間葉系幹細胞およびトロンビンを前処理した間葉系幹細胞でＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４の発現レベルを測定した結果およびＰＡＲ１とＰＡＲ３の定量結果である。
【図2b】間葉系幹細胞にトロンビンを処理しない群（ｎａｉｖｅ）、ＰＡＲ３特異的ｓｉＲＮＡを処理した群（ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡ）および対照群ｓｉＲＮＡを処理した群（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｉＲＮＡ）においてそれぞれＰＡＲ１およびＰＡＲ３発現レベルを測定した結果およびこれを定量した結果である。
【図3a】間葉系幹細胞でトロンビン処理の有無によるエンドソームマーカー（Ｒａｂ－５、ＥＥＡ－１）の発現レベルを測定して示した結果である。
【図3b】間葉系幹細胞でトロンビン処理の有無によるＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、およびそのリン酸化形態であるｐＥＲＫ１／２、ｐＡＫＴタンパク質の発現レベルを測定して示した結果である。
【図4a】それぞれ、間葉系幹細胞にトロンビンを処理しない群（ｎａｉｖｅ）、トロンビンを前処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、トロンビンを前処理した後、ＰＡＲ１特異的抑制剤であるＳＣＨ７９７９７を処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ＋ＳＣＨ７９７９７）、トロンビンを前処理した後、ＰＡＲ３特異的ｓｉＲＮＡを処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ＋ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡ）およびトロンビンを前処理した後、ＳＣＨ７９７９７とＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを全部処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ＋ＳＣＨ７９７９７＋ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡ）においてエンドソームマーカー（Ｒａｂ－５、ＥＥＡ－１）の発現レベルを分析した結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0022】
本発明者らは、間葉系幹細胞においてトロンビン処理がいかなる経路を通じて細胞外小胞の生成能を向上させるかを糾明するために研究を重ねた結果、トロンビン処理が、ＰＡＲ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）媒介シグナル伝達経路を通じて上記のような効果を誘導することを具体的に確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【0023】
以下、本発明を詳しく説明する。
【0024】
本発明は、プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階を含む、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の高効率生成能を有する幹細胞の選別方法を提供する。
【0025】
また、本発明は、前記方法によって選別された、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）の高効率生成能を有する幹細胞を提供する。
【0026】
本発明において、前記ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階は、（ａ）幹細胞の培養後、トロンビンを処理する段階と、（ｂ）前記トロンビンが処理された幹細胞でＲａｂ－５（Ｒａｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒａｂ－５）、ＥＥＡ－１（Ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ａｎｔｉｇｅｎ－１）、ｐ－ＥＲＫ１／２（Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅｓ １／２）およびｐ－ＡＫＴ（Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ）からなる群から選択される１種以上の発現レベルを測定する段階と、（ｃ）前記発現レベルが増加した幹細胞を細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞として選別する段階と、を含んでいてもよい。
【0027】
本発明において使用される用語、「プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）」は、細胞外ドメインの一部切断によって活性化する関連Ｇタンパク質共役受容体のサブファミリーであり、血小板、内皮細胞、筋細胞およびニューロンで高度で発現すると知られている。ＰＡＲは、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４の４種類の類型があり、これを活性化させることができる主な酵素によって分類される。内皮細胞においてＰＡＲは、血管緊張度および透過性の調節に関与し、血管平滑筋では、収縮、増殖および肥大を媒介する。内皮細胞のＰＡＲは、ＶＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－１およびＥ－ｓｅｌｅｃｔｉｎのような内皮接着分子に対するポジティブシグナルを提供し、また、炎症反応にも寄与すると知られていて、最近では、筋肉の成長と骨細胞の分化および増殖に関連していることが報告されている。本発明では、ＰＡＲは、幹細胞において細胞外小胞の高効率生成能を媒介し、好ましくは、ＰＡＲ１またはＰＡＲ３媒介シグナル伝達経路が関与し、より好ましくは、ＰＡＲ１がＰＡＲ３よりも幹細胞の細胞外小胞の高効率生成能にさらに大きい影響を及ぼすことを具体的な実施例を通じて確認した。
【0028】
本発明は、具体的な実施例においてＰＡＲ媒介シグナル伝達経路が幹細胞の細胞外小胞の高効率生成能に重要な影響を及ぼすことを確認した。
【0029】
本発明の一実施例では、トロンビンの前処理が、幹細胞で細胞外小胞の生成、細胞外小胞内タンパク質のレベルおよびその特性に及ぼす影響を様々な実験を通じて分析した。その結果、トロンビンが処理されない場合と比較して、トロンビン処理濃度に比例して細胞外小胞の生産量は５倍以上、細胞外小胞内部タンパク質の含有量レベルは２倍以上増加した。また、トロンビン処理は、幹細胞内初期エンドソームのレベルを顕著に増加させることを確認した（実施例２参照）。
【0030】
本発明の他の実施例では、間葉系幹細胞が、トロンビンの処理有無に関係なく、ＰＡＲ１およびＰＡＲ３受容体を発現することを確認した（実施例３参照）。
【0031】
本発明のさらに他の実施例では、トロンビンが前処理された間葉系幹細胞で初期エンドソームマーカー（Ｒａｂ－５およびＥＥＡ１）の発現レベルが有意に増加し、ＥＲＫ１／２、ＡＫＴのリン酸化が増加したことを確認した（実施例４参照）。
【0032】
本発明のさらに他の実施例では、ＰＡＲシグナル伝達経路が、トロンビン処理によって誘導された細胞外小胞の生産と内部タンパク質含有量の増加およびエンドソームマーカーとＥＲＫ１／２、ＡＫＴのリン酸化増加を媒介するか否かを確認するために、ＰＡＲ１特異的抑制剤およびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡをそれぞれまたは共に細胞に処理して分析した結果、ＰＡＲ１とＰＡＲ３媒介シグナル伝達経路が前記効果を誘導することに関与しており、特にＰＡＲ３よりもＰＡＲ１がさらに重要な影響を及ぼすことを確認した（実施例５参照）。
【0033】
前記段階（ｂ）で発現レベルを測定する方法は、当該技術分野においてタンパク質の発現レベルを測定できる公知の方法を当業者が適宜選択して用いることができ、具体的にウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；ＲＩＡ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、オクタロニー（ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）、補体固定分析法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）およびタンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）からなる群から選択される１種以上の方法を通じて測定できるが、これらに制限されるものではない。
【0034】
本発明において使用される用語、「細胞外小胞の高効率生成能」は、好ましくは幹細胞から細胞外小胞の生成量が増加することおよび／または前記幹細胞から生産された細胞外小胞内タンパク質のレベルが増加することを意味する。
【0035】
前記細胞外小胞内タンパク質は、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）、アンジオジェニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）およびアンジオポエチン－１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１）からなる群から選択される１種以上であってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0036】
本発明において「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、未分化細胞であり、自己複製能を有し、かつ、２つ以上の異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞をいう。
【0037】
本発明の幹細胞は、自己由来または同種由来の幹細胞であってもよく、ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む任意の類型の動物由来であってもよく、前記幹細胞が成体に由来したものであっても、胚性に由来したものであってもよく、これらに限定されない。本発明の幹細胞は、胚性幹細胞または成体幹細胞を含み、好ましくは、成体幹細胞である。前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系ストローマ細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞、多分化能幹細胞であってもよく、好ましくは、間葉系幹細胞であるが、これらに限定されない。
【0038】
前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、皮膚、羊膜または胎盤などに由来した間葉系幹細胞であってもよく、好ましくは、臍帯血由来であってもよいが、これらに限定されない。
【0039】
前記幹細胞の培養は、当該技術分野において公知となった方法によって当業者が適切に選択して用いることができる。本発明では、具体的に臍帯血由来間葉系幹細胞をα－ＭＥＭ培地で培養したが、これに制限されるものではない。
【0040】
前記トロンビンの処理方法は、具体的に限定されないが、好ましくは、培地に添加し、前記培地で幹細胞を２～１０時間、好ましくは、４～８時間、より好ましくは、５～７時間、最も好ましくは、６時間培養することによって行われ得る。トロンビンは、前記培地内に１～１０Ｕ／ｍｌの濃度で含まれ得、好ましくは、１～５Ｕ／ｍｌの濃度、より好ましくは、２～４Ｕ／ｍＬで含まれ得る。
【0041】
本発明の他の様態として、本発明は、（ａ）幹細胞に候補物質を処理する段階と、（ｂ）プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する段階と、（ｃ）前記ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性を増加させる物質を細胞外小胞の生成増進誘導剤として選定する段階と、を含む、幹細胞の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）生成増進誘導剤のスクリーニング方法を提供する。
【0042】
本発明において、前記候補物質は、化合物、微生物培養液または抽出物、天然物抽出物、核酸、およびペプチドからなる群から選択されるものであってもよく、前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、およびモルホリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）からなる群から選択されるものであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【0043】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【0044】
［実施例］
実施例１．実験準備および実験方法
１－１．間葉系幹細胞の培養および前処理
ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）は、Ｍｅｄｉｐｏｓｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（ソウル、韓国）から購入して本研究に用いた。前記細胞は、事前の同意を得た単一供与者から分離したものであり、６継代で優れた製造工程を厳格に遵守して製造された。前記間葉系幹細胞は、ＣＤ１０５（９９．６％）およびＣＤ７３（９６．３％）を発現し、ＣＤ３４（０．１％）、ＣＤ４５（０．２％）またはＣＤ１４（０．１％）を発現しないことを確認し、また、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＡＢ（９６．８％）に対して陽性であり、ＨＬＡ－ＤＲ（０．１％）に対しては陽性でないことを確認した。
実施例１．実験準備および実験方法
１－１．間葉系幹細胞の培養および前処理
ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）は、Ｍｅｄｉｐｏｓｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（ソウル、韓国）から購入して本研究に用いた。前記細胞は、事前の同意を得た単一供与者から分離したものであり、６継代で優れた製造工程を厳格に遵守して製造された。前記間葉系幹細胞は、ＣＤ１０５（９９．６％）およびＣＤ７３（９６．３％）を発現し、ＣＤ３４（０．１％）、ＣＤ４５（０．２％）またはＣＤ１４（０．１％）を発現しないことを確認し、また、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＡＢ（９６．８％）に対して陽性であり、ＨＬＡ－ＤＲ（０．１％）に対しては陽性でないことを確認した。
【0045】
前記臍帯血由来間葉系幹細胞にトロンビンを前処理するために、まず、前記間葉系幹細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）が補充されたα－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）で標準培養の条件下に培養した。前記細胞が培養プレート面積の約９０％を占めるとき、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄して、汚染されたＦＢＳ由来エキソソームを除去した後、ヒト組換えトロンビン（１、２および４Ｕ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）が補充された新しい無血清α－ＭＥＭで６時間培養した。以後、培地を回収し、Ｌｕｎａ－ＦＬＴＭｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｇｏｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｎｙａｎｇ－ｓｉ，Ｋｏｒｅａ）を用いて１００ｍｍ培養皿当たり約２×１０６細胞を計数した。
【0046】
１－２．細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶｓ）の分離および定量化
前記実施例１－１の方法によってトロンビンが前処理された臍帯血由来間葉系幹細胞から分泌された細胞外小胞（以下、ＥＶｓという）を分離するために、下記過程によって実験を進めた。具体的に、上記で回収した培地を３０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して細胞残渣を除去した後、さらに４℃で１００，０００ｒｐｍで１２０分間遠心分離してＥＶｓを沈殿させた。以後、前記沈殿したペレットを２回洗浄し、滅菌されたＰＢＳに再懸濁した後、使用時まで－８０℃で保管した。
前記実施例１－１の方法によってトロンビンが前処理された臍帯血由来間葉系幹細胞から分泌された細胞外小胞（以下、ＥＶｓという）を分離するために、下記過程によって実験を進めた。具体的に、上記で回収した培地を３０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離して細胞残渣を除去した後、さらに４℃で１００，０００ｒｐｍで１２０分間遠心分離してＥＶｓを沈殿させた。以後、前記沈殿したペレットを２回洗浄し、滅菌されたＰＢＳに再懸濁した後、使用時まで－８０℃で保管した。
【0047】
ＥＶｓの分布は、速いビデオキャプチャーおよび粒子追跡ソフトウェアが装着されたＮａｎｏＳｉｇｈｔ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００；Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使ってブラウン運動（Ｂｒｏｗｎｉａｎ ｍｏｔｉｏｎ）速度を測定することによって分析した。収得したＥＶｓをＰＢＳ（５００μｌ、１ｍｇ／ｍＬ総タンパク質）に再懸濁させ、サイズおよび多分散性を測定した。また、単一細胞によるＥＶｓ生産量を定量化するために、上記で回収した培地を用いて製造社のプロトコルに基づいてＬＵＮＡ－ＦＬシステムを使って細胞を計数した。単一細胞により生成されたＥＶｓの数は、ＥＶｓの総個数を細胞数で割って計算した。
【0048】
１－３．透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）および走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察
ＥＶｓ（５μｌ）を２％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させ、２００メッシュのホルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）／炭素がコーティングされた電子顕微鏡グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）にローディングした後、１０分間培養した。次に、濾過した蒸留水で洗浄し、１分間水で２％ウラニルアセテート（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で染色した。以後、１２０ｋＶで作動するＴｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ Ｇ２透過電子顕微鏡（ＦＥＩ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて観察後、イメージを得た。
ＥＶｓ（５μｌ）を２％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させ、２００メッシュのホルムバール（ｆｏｒｍｖａｒ）／炭素がコーティングされた電子顕微鏡グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）にローディングした後、１０分間培養した。次に、濾過した蒸留水で洗浄し、１分間水で２％ウラニルアセテート（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で染色した。以後、１２０ｋＶで作動するＴｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ Ｇ２透過電子顕微鏡（ＦＥＩ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて観察後、イメージを得た。
【0049】
一方、分離したＥＶｓを走査電子顕微鏡で観察するために、ＥＶｓを２．５％グルタルアルデヒドで固定させ、ポリカーボネート膜上にローディングした。次に、前記膜をＰＢＳおよび水で１回洗浄した後、アセトンで脱水させた。次に、液体二酸化炭素を使って臨界点乾燥によりアセトンを除去した。サンプルをカーボンテープでアルミニウムスタブにマウントし、ＳＥＭスタブにマウントした。３～５ｎｍの白金でスパッタコーティングした後、走査電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｕｒｉｇａ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でサンプルを観察し、イメージを得た。
【0050】
１－４．ＰＡＲ１特異的抑制剤の処理およびＰＡＲ３ノックダウン
選択的ＰＡＲ１拮抗剤であるＳＣＨ７９７９７（Ｎ３－シクロプロピル－７－［［４－（１－メチルエチル）フェニル］メチル］－７Ｈ－ピロロ［３，２－ｆ］キナゾリン－１，３－ジアミンジヒドロクロリド）（Ｎ３－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－７－［［４－（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［３，２－ｆ］ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ－１，３－ｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）をＴｏｃｒｉｓ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）から得た。以後、前記物質を臍帯血由来間葉系幹細胞に処理するために、トロンビン処理１時間前に、前記ＳＣＨ７９７９７を培養培地に１μＭの濃度で添加した。
選択的ＰＡＲ１拮抗剤であるＳＣＨ７９７９７（Ｎ３－シクロプロピル－７－［［４－（１－メチルエチル）フェニル］メチル］－７Ｈ－ピロロ［３，２－ｆ］キナゾリン－１，３－ジアミンジヒドロクロリド）（Ｎ３－ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ－７－［［４－（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］－７Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［３，２－ｆ］ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ－１，３－ｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）をＴｏｃｒｉｓ（Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）から得た。以後、前記物質を臍帯血由来間葉系幹細胞に処理するために、トロンビン処理１時間前に、前記ＳＣＨ７９７９７を培養培地に１μＭの濃度で添加した。
【0051】
一方、ＰＡＲ３をノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）させるために、製造社のプロトコルに基づいてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ形質感染試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＲＡＲ３を標的するｓｉＲＮＡを間葉系幹細胞に形質感染させた。この際、陰性対照群としては、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｉＲＮＡを同じ方法および条件で処理した。対照群ｓｉＲＮＡおよびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。
【0052】
１－５．初期エンドソームの標識化
初期エンドソーム（Ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ）は、製造社の指示によってＣｅｌｌ Ｌｉｇｈｔ（登録商標）試薬－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＢａｃＭａｍ ２．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて標識した。簡略に、間葉系幹細胞を１２ウェルプレートにウェル当たり１．５×１０４の密度で分注し、細胞が付着した後に、ＢａｃＭａｍ ２．０試薬を細胞当たり４０個の粒子濃度（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｐｅｒ ｃｅｌｌ；ＰＰＣ）で添加した。次に、Ｒａｂ５ａ－ＧＦＰ発現を測定するために、Ｃｅｌｌ Ｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ－ＧＦＰ、ＢａｃＭａｍ ２．０を使って初期エンドソームを標識した。以後、ＧＦＰで標識されたエンドソームの数を推定するために、緑色免疫蛍光の光学密度をＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
初期エンドソーム（Ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ）は、製造社の指示によってＣｅｌｌ Ｌｉｇｈｔ（登録商標）試薬－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＢａｃＭａｍ ２．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて標識した。簡略に、間葉系幹細胞を１２ウェルプレートにウェル当たり１．５×１０４の密度で分注し、細胞が付着した後に、ＢａｃＭａｍ ２．０試薬を細胞当たり４０個の粒子濃度（ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｐｅｒ ｃｅｌｌ；ＰＰＣ）で添加した。次に、Ｒａｂ５ａ－ＧＦＰ発現を測定するために、Ｃｅｌｌ Ｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｅａｒｌｙ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ－ＧＦＰ、ＢａｃＭａｍ ２．０を使って初期エンドソームを標識した。以後、ＧＦＰで標識されたエンドソームの数を推定するために、緑色免疫蛍光の光学密度をＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
【0053】
１－６．Ｂｉｏｐｌｅｘアッセイ
ＥＶｓのサイトカインレベルをＥＬＩＳＡを用いて分析するために、下記方法で実験を進めた。具体的に、単離したＥＶｓの均質物をＥＬＩＳＡキットで０．１ｍＬの溶解緩衝液が含有されたウェルに添加した。以後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法を通じてＥＶｓ内タンパク質を定量化した後、１μｇのタンパク質をそれぞれのウェルにローディングした。次に、Ｈｕｍａｎ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｒｅｍｉｘ Ｋｉｔ Ａ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）であるＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅ（登録商標）ＭＡＰを用いてＥＶｓ内に存在するアンジオジェニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンジオポエチン－１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１）、ＶＥＧＦおよびＨＧＦレベルを定量化した。
ＥＶｓのサイトカインレベルをＥＬＩＳＡを用いて分析するために、下記方法で実験を進めた。具体的に、単離したＥＶｓの均質物をＥＬＩＳＡキットで０．１ｍＬの溶解緩衝液が含有されたウェルに添加した。以後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法を通じてＥＶｓ内タンパク質を定量化した後、１μｇのタンパク質をそれぞれのウェルにローディングした。次に、Ｈｕｍａｎ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｒｅｍｉｘ Ｋｉｔ Ａ（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）であるＦｌｕｏｒｏｋｉｎｅ（登録商標）ＭＡＰを用いてＥＶｓ内に存在するアンジオジェニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンジオポエチン－１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１）、ＶＥＧＦおよびＨＧＦレベルを定量化した。
【0054】
１－７．免疫ブロット分析
同じ体積のＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加して、臍帯血由来間葉系幹細胞およびＥＶｓを溶解させた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法で溶解物のタンパク質量を定量し、１０μｇのタンパク質が含まれたサンプルをβ－メルカプトエタノールが含有されたローディング緩衝液と混合した後、１０分間加熱し、１２％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いてタンパク質をサイズ別に分離した。次に、分離したタンパク質をニトロセルロースメンブレンに移した後、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０が含まれた１ｘ ＰＢＳ－Ｔで５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を製造し、前記メンブレンに処理して、室温でブロッキング過程を実施した後、１次抗体を処理し、室温で１時間培養した。培養後、１ｘ ＰＢＳ－Ｔでメンブレンを洗った後、抗マウスまたは抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼが接合された免疫グロブリンＧ（１：２０００）２次抗体とともに室温で１時間撹拌しつつ培養した。次に、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いてタンパク質バンドを検出し、Ｘ線フィルムでバンドイメージを得た。
同じ体積のＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加して、臍帯血由来間葉系幹細胞およびＥＶｓを溶解させた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ方法で溶解物のタンパク質量を定量し、１０μｇのタンパク質が含まれたサンプルをβ－メルカプトエタノールが含有されたローディング緩衝液と混合した後、１０分間加熱し、１２％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いてタンパク質をサイズ別に分離した。次に、分離したタンパク質をニトロセルロースメンブレンに移した後、０．５％Ｔｗｅｅｎ ２０が含まれた１ｘ ＰＢＳ－Ｔで５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を製造し、前記メンブレンに処理して、室温でブロッキング過程を実施した後、１次抗体を処理し、室温で１時間培養した。培養後、１ｘ ＰＢＳ－Ｔでメンブレンを洗った後、抗マウスまたは抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼが接合された免疫グロブリンＧ（１：２０００）２次抗体とともに室温で１時間撹拌しつつ培養した。次に、ＰＢＳ－Ｔで洗浄した後、ＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いてタンパク質バンドを検出し、Ｘ線フィルムでバンドイメージを得た。
【0055】
１－８．統計分析
すべての定量的結果は、３回反復実験結果から導き出した。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で示し、統計分析は、２個のグループの場合には、ｔ検定を用いて比較し、３個のグループに対しては、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を統計分析した。ｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意なものと見なした。
すべての定量的結果は、３回反復実験結果から導き出した。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で示し、統計分析は、２個のグループの場合には、ｔ検定を用いて比較し、３個のグループに対しては、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を統計分析した。ｐ値が０．０５未満の場合、統計的に有意なものと見なした。
【0056】
実施例２．トロンビン前処理がＥＶｓの合成、タンパク質レベルおよび特性に及ぼす影響の分析
本発明者らは、間葉系幹細胞に対するトロンビン前処理が、ＥＶｓ合成およびＥＶｓ内に存在するタンパク質レベル、およびＥＶｓ特性に及ぼす影響を分析するために、下記実験を進めた。
本発明者らは、間葉系幹細胞に対するトロンビン前処理が、ＥＶｓ合成およびＥＶｓ内に存在するタンパク質レベル、およびＥＶｓ特性に及ぼす影響を分析するために、下記実験を進めた。
【0057】
２－１．ＥＶｓ生産量およびタンパク質レベルの分析
まず、前記実施例１－１の方法によってトロンビンを１～４Ｕ／ｍＬで濃度を異ならせて間葉系幹細胞に処理し、実施例１－２の方法によってＥＶｓの量を分析した。その結果、図１ａに示されたように、トロンビン濃度に依存的にＥＶ生産量が増加し、特に２および４Ｕ／ｍＬの濃度でＥＶ生産量が大きく増加したことが示された。
まず、前記実施例１－１の方法によってトロンビンを１～４Ｕ／ｍＬで濃度を異ならせて間葉系幹細胞に処理し、実施例１－２の方法によってＥＶｓの量を分析した。その結果、図１ａに示されたように、トロンビン濃度に依存的にＥＶ生産量が増加し、特に２および４Ｕ／ｍＬの濃度でＥＶ生産量が大きく増加したことが示された。
【0058】
また、ＥＶｓ内タンパク質レベルを分析した結果、図１ｂに示されたように、トロンビンを処理しない間葉系幹細胞と比較して、２および４Ｕ／ｍＬのトロンビンを処理した群において血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ）、アンジオジェニン（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、アンジオポエチン－１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－１）および肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）のレベルが顕著に増加したことを確認した。ひいては、前記結果に基づいてヒトトロンビンの最適処理濃度を２Ｕ／ｍＬと選定し、後続実験を進めた。
【0059】
２－２．初期エンドソームの分析
本発明者らは、前記幹細胞内初期エンドソームをＣｅｌｌＬｉｇｈｔ Ｅａｒｌｙ Ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ－ＧＦＰキットを用いて緑色蛍光で標識して、トロンビンを処理しない間葉系幹細胞（Ｎａｉｖｅ）とトロンビンを前処理した間葉系幹細胞（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）を比較した。具体的に、蛍光イメージおよびその定量結果を通じて前記二つの細胞間のエンドソーム差異を比較した結果、図１ｃに示されたように、トロンビンを前処理した幹細胞で顕著に高いレベルの初期エンドソームが観察された。
本発明者らは、前記幹細胞内初期エンドソームをＣｅｌｌＬｉｇｈｔ Ｅａｒｌｙ Ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ－ＧＦＰキットを用いて緑色蛍光で標識して、トロンビンを処理しない間葉系幹細胞（Ｎａｉｖｅ）とトロンビンを前処理した間葉系幹細胞（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）を比較した。具体的に、蛍光イメージおよびその定量結果を通じて前記二つの細胞間のエンドソーム差異を比較した結果、図１ｃに示されたように、トロンビンを前処理した幹細胞で顕著に高いレベルの初期エンドソームが観察された。
【0060】
２－３．電子顕微鏡を通したＥＶｓ観察
また、トロンビン前処理によるＥＶｓ差異を比較するために、前記実施例１－３の方法によって走査電子顕微鏡および透過電子顕微鏡で分離したＥＶｓを観察した。その結果、図１ｄから分かるように、トロンビンを処理しない間葉系幹細胞と比較して、トロンビンを前処理した間葉系幹細胞でさらに多くのＥＶｓが観察された。
また、トロンビン前処理によるＥＶｓ差異を比較するために、前記実施例１－３の方法によって走査電子顕微鏡および透過電子顕微鏡で分離したＥＶｓを観察した。その結果、図１ｄから分かるように、トロンビンを処理しない間葉系幹細胞と比較して、トロンビンを前処理した間葉系幹細胞でさらに多くのＥＶｓが観察された。
【0061】
２－４．ＥＶｓの特性の確認
トロンビンが処理されない間葉系幹細胞およびトロンビンが前処理された間葉系幹細胞から分離したそれぞれのＥＶｓに対してサイズを測定した。その結果、図１ｅに示されたように、いずれも、１００ｎｍでピークを示し、前記各細胞から分離したＥＶｓのサイズが同一であることを確認した。しかしながら、分離したＥＶの数は、トロンビンが前処理された間葉系幹細胞において非常に高いことを確認できた。
トロンビンが処理されない間葉系幹細胞およびトロンビンが前処理された間葉系幹細胞から分離したそれぞれのＥＶｓに対してサイズを測定した。その結果、図１ｅに示されたように、いずれも、１００ｎｍでピークを示し、前記各細胞から分離したＥＶｓのサイズが同一であることを確認した。しかしながら、分離したＥＶの数は、トロンビンが前処理された間葉系幹細胞において非常に高いことを確認できた。
【0062】
また、前記二つの間葉系幹細胞から分離したＥＶｓに対して免疫ブロッティングを通じて様々なマーカーの発現レベルを分析した。その結果、図１ｆから分かるように、トロンビン処理の有無に関係なく、すべてのＥＶｓは、エキソソーム特異的マーカーであるＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１を全部発現し、ミトコンドリアマーカーであるシトクロム ｃ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ）、核マーカーであるフィブリラリン（Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｉｎ）およびゴルジ体マーカーであるＧＭ１３０は発現しないことを確認した。
【0063】
実施例３．間葉系幹細胞のＰＡＲｓ発現の確認
本発明者らは、前記実施例２の結果に基づいて、間葉系幹細胞がトロンビンに対する受容体を発現するか否かを調べてみるために、前記実施例１－７の方法によって免疫ブロッティング分析を行った。具体的に、トロンビンを処理しない間葉系幹細胞およびトロンビンが前処理された間葉系幹細胞それぞれに対してＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４タンパク質の発現レベルを分析した。その結果、図２ａに示されたように、間葉系幹細胞は、トロンビンの処理有無に関係なく、ＰＡＲ１およびＰＡＲ３を発現し、ＰＡＲ２およびＰＡＲ４は発現しないことが示された。これは、トロンビン前処理がＰＡＲ１およびＰＡＲ３を通じて間葉系幹細胞に影響を及ぼすことができることを示唆するのである。
本発明者らは、前記実施例２の結果に基づいて、間葉系幹細胞がトロンビンに対する受容体を発現するか否かを調べてみるために、前記実施例１－７の方法によって免疫ブロッティング分析を行った。具体的に、トロンビンを処理しない間葉系幹細胞およびトロンビンが前処理された間葉系幹細胞それぞれに対してＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４タンパク質の発現レベルを分析した。その結果、図２ａに示されたように、間葉系幹細胞は、トロンビンの処理有無に関係なく、ＰＡＲ１およびＰＡＲ３を発現し、ＰＡＲ２およびＰＡＲ４は発現しないことが示された。これは、トロンビン前処理がＰＡＲ１およびＰＡＲ３を通じて間葉系幹細胞に影響を及ぼすことができることを示唆するのである。
【0064】
ひいては、ＰＡＲ３に特異的なｓｉＲＮＡ（ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡ）がＰＡＲ３の発現を特異的に阻害するか否かを検証しようとした。このために、対照群ｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｓｉＲＮＡ）を前記間葉系幹細胞に形質感染させ、免疫ブロッティング分析を実施した。その結果、図２ｂから分かるように、ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを処理した場合には、ＰＡＲ１の発現レベルは変化せず、ＰＡＲ３の発現のみが特異的に阻害され、対照群ｓｉＲＮＡを処理した場合には、ＰＡＲ１およびＰＡＲ３は両方とも発現レベルに変化が現れないことを確認した。これを通じて、本実施例において利用したＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡは、ＰＡＲ３の発現のみを特異的に阻害することが分かった。
【0065】
実施例４．トロンビン前処理による初期エンドソームマーカーのタンパク質レベル、およびＥＲＫ１／２およびＡＫＴ経路のリン酸化増加の確認
本発明者らは、前記実施例２の結果に基づいて間葉系幹細胞でトロンビン前処理の有無による初期エンドソームマーカー（Ｒａｂ－５およびＥＥＡ－１）の発現レベルの変化を免疫ブロッティングで分析した。その結果、図３ａに示されたように、トロンビンが処理された場合、初期エンドソームマーカーであるＲａｂ－５およびＥＥＡ－１の発現レベルが有意に増加したことを確認した。
本発明者らは、前記実施例２の結果に基づいて間葉系幹細胞でトロンビン前処理の有無による初期エンドソームマーカー（Ｒａｂ－５およびＥＥＡ－１）の発現レベルの変化を免疫ブロッティングで分析した。その結果、図３ａに示されたように、トロンビンが処理された場合、初期エンドソームマーカーであるＲａｂ－５およびＥＥＡ－１の発現レベルが有意に増加したことを確認した。
【0066】
これに加えて、本発明による間葉系幹細胞においてトロンビン処理の有無によるＥＲＫ１／２およびＡＫＴシグナル伝達経路の活性化の有無を調査するために、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化レベルを分析した。その結果、図３ｂから分かるように、トロンビンが処理されない間葉系幹細胞と比較して、トロンビンが前処理された間葉系幹細胞においてｐＥＲＫ１／２およびｐＡＫＴタンパク質の発現が有意に増加したことを確認した。また、リン酸化しない形態のＥＲＫ１／２およびＡＫＴの場合には、統計的に有意しないが、トロンビン処理によって若干発現が増加する傾向を示した。
【0067】
実施例５．ＰＡＲ抑制によるＲａｂ－５およびＥＥＡ１発現、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴリン酸化およびＥＶ生産抑制の確認
５－１．Ｒａｂ－５およびＥＥＡ１発現、およびＥＲＫ１／２およびＡＫＴリン酸化抑制の確認
本発明者らは、トロンビンがどのように初期エンドソームマーカーであるＲａｂ－５およびＥＥＡ－１の発現を誘導するかを調査するために、トロンビンが前処理された間葉系幹細胞にＰＡＲ１特異的拮抗剤であるＳＣＨ７９７９７を処理したり、ＰＡＲ３特異的ｓｉＲＮＡを形質感染させたり、または前記二つの物質を共に処理した後、Ｒａｂ－５およびＥＥＡ－１の発現レベルをそれぞれ分析した。その結果、図４ａに示されたように、それぞれ、ＳＣＨ７９７９７を処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ＋ＳＣＨ７９７９７）およびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ＋ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡ）が、いずれも、トロンビンのみを前処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）に比べて、Ｒａｂ－５およびＥＥＡ－１の発現レベルが有意に減少したことが示された。この際、ＳＣＨ７９７９７を処理した群が、ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを処理した群よりも発現レベルがさらに減少したことが示された。また、ＳＣＨ７９７９７およびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを共に処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ＋ＳＣＨ７９７９７＋ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡ）において各タンパク質の発現レベルが最も大きく減少したことを確認した。
５－１．Ｒａｂ－５およびＥＥＡ１発現、およびＥＲＫ１／２およびＡＫＴリン酸化抑制の確認
本発明者らは、トロンビンがどのように初期エンドソームマーカーであるＲａｂ－５およびＥＥＡ－１の発現を誘導するかを調査するために、トロンビンが前処理された間葉系幹細胞にＰＡＲ１特異的拮抗剤であるＳＣＨ７９７９７を処理したり、ＰＡＲ３特異的ｓｉＲＮＡを形質感染させたり、または前記二つの物質を共に処理した後、Ｒａｂ－５およびＥＥＡ－１の発現レベルをそれぞれ分析した。その結果、図４ａに示されたように、それぞれ、ＳＣＨ７９７９７を処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ＋ＳＣＨ７９７９７）およびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ＋ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡ）が、いずれも、トロンビンのみを前処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）に比べて、Ｒａｂ－５およびＥＥＡ－１の発現レベルが有意に減少したことが示された。この際、ＳＣＨ７９７９７を処理した群が、ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを処理した群よりも発現レベルがさらに減少したことが示された。また、ＳＣＨ７９７９７およびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを共に処理した群（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ＋ＳＣＨ７９７９７＋ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡ）において各タンパク質の発現レベルが最も大きく減少したことを確認した。
【0068】
これに加えて、トロンビンがＥＲＫ１／２およびＡＫＴ経路の活性化をどのように誘導するかを調査するために、トロンビンが前処理された間葉系幹細胞にＳＣＨ７９７９７および／またはＰＡＲ－３特異的ｓｉＲＮＡを処理した。その結果、図４ｂから分かるように、トロンビン前処理によるＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化の増加は、それぞれ、ＳＣＨ７９７９７およびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを処理した群において有意的に抑制され、ＰＡＲ－３特異的ｓｉＲＮＡを処理した場合よりも、ＳＣＨ７９７９７を処理した場合、さらに有意なレベルで抑制された。さらに前記二つの物質を共に処理した場合、最も大きく抑制されたことを確認した。このような結果は、トロンビン前処理によるＲａｂ－５、ＥＥＡ－１、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴの活性化にＰＡＲ－１シグナル伝達がさらに大きく関与しており、これに対して、ＰＡＲ－３シグナル伝達は部分的に関与していることを示唆するのである。
【0069】
５－２．ＥＶｓの生産およびＥＶｓ内部タンパク質レベル増加抑制の確認
間葉系幹細胞でＥＶｓの生産がＰＡＲにより調節されるか否かを確認するために、トロンビンが前処理された間葉系幹細胞にＰＡＲ１特異的拮抗剤ＳＣＨ７９７９７および／またはＰＡＲ３特異的ｓｉＲＮＡを形質感染させた。
間葉系幹細胞でＥＶｓの生産がＰＡＲにより調節されるか否かを確認するために、トロンビンが前処理された間葉系幹細胞にＰＡＲ１特異的拮抗剤ＳＣＨ７９７９７および／またはＰＡＲ３特異的ｓｉＲＮＡを形質感染させた。
【0070】
まず、各対照群および実験群において初期エンドソームを比較するために、トロンビンの前処理後、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ Ｅａｒｌｙ Ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ－ＧＦＰキットを使って緑色蛍光でエンドソームを標識した。以後、蛍光イメージおよびその定量結果を分析した結果、図５ａに示されたように、トロンビン処理による初期エンドソーム数の増加は、それぞれ、ＳＣＨ７９７９７およびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを処理した群において有意的に抑制された。また、ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡ形質感染によるものよりも、ＳＣＨ７９７９７処理によってさらに有意に抑制され、ＳＣＨ７９７９７およびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを共に処理した場合、最も高いレベルで抑制されたことを確認した。
【0071】
ひいては、上記と同じ群の臍帯血由来間葉系幹細胞の培養培地で細胞外小胞の数の増加程度を比較した。その結果、図５ｂおよび図５ｃに示されたように、トロンビン処理による細胞外小胞の数の増加は、それぞれ、ＳＣＨ７９７９７およびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを処理した群において有意的に抑制され、ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを形質感染させた場合よりも、ＳＣＨ７９７９７を処理した場合、さらに高いレベルで抑制され、前記二つの物質を共に処理した場合、最も高いレベルで抑制されたことを確認した。
【0072】
また、上記と同じ群においてＰＡＲ抑制剤の処理によるＥＶｓ内タンパク質のレベルの変化を分析した。具体的に、ＶＥＧＦ、アンジオジェニン、アンジオポエチン－１およびＨＧＦレベルをそれぞれ測定した結果、図５ｄから分かるように、それぞれ、ＳＣＨ７９７９７およびＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを処理した群において前記タンパク質のレベル増加が有意的に抑制され、ＰＡＲ３ ｓｉＲＮＡを形質感染させた場合よりも、ＳＣＨ７９７９７を処理した場合、さらに高いレベルで抑制され、前記二つの物質を共に処理した場合、最も高いレベルで抑制されたことを確認した。このような結果は、ＰＡＲ－１媒介シグナル伝達が、トロンビン前処理刺激によるＥＶ生産およびカーゴタンパク質のレベルの増加に強く関与し、ＰＡＲ３シグナル伝達は部分的に関与することを示唆するのである。
【0073】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【0074】
本発明によれば、幹細胞にトロンビンを処理し、プロテアーゼ活性化受容体（Ｐｒｏｔｅｓａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；ＰＡＲ）媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定することによって、細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞を効率的に選別できるところ、このような方法によって選別された幹細胞は、基礎研究および臨床分野において様々な用途に有用に活用されうる。また、幹細胞において特定物質の処理後、ＰＡＲ媒介シグナル伝達経路の活性レベルを測定する方法を通じて細胞外小胞の生成増進誘導剤をスクリーニングして新しい物質を発掘できるところ、前記発掘された物質を基礎研究および臨床分野に用いられる細胞外小胞の高効率生成能を有する幹細胞を製造するのに有用に用いることができる。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図1f】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【国際調査報告】