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特表2022-530232活性成分として単離されたミトコンドリアを含む、筋炎を予防又は治療するための医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-28
(54)【発明の名称】活性成分として単離されたミトコンドリアを含む、筋炎を予防又は治療するための医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/12 20150101AFI20220621BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220621BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20220621BHJP
【ＦＩ】
A61K35/12
A61P29/00
A61P21/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021563663
(86)(22)【出願日】2020-04-29
(85)【翻訳文提出日】2021-12-22
(86)【国際出願番号】 KR2020005769
(87)【国際公開番号】W WO2020222566
(87)【国際公開日】2020-11-05
(31)【優先権主張番号】10-2019-0050527
(32)【優先日】2019-04-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521466954
【氏名又は名称】パエアン バイオテクノロジー インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＥＡＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ハン， キュボム
(72)【発明者】
【氏名】キム， チュン‐ヒュン
(72)【発明者】
【氏名】ユ， シン‐ヘ
(72)【発明者】
【氏名】リー， ソ‐ユン
(72)【発明者】
【氏名】リム， サン‐ミン
(72)【発明者】
【氏名】ジュン， ハンスン
(72)【発明者】
【氏名】ナ， クァンミン
(72)【発明者】
【氏名】ハン， ユン ミ
(72)【発明者】
【氏名】ソン， ジュン ヤン
(72)【発明者】
【氏名】リー， ユン ヤン
(72)【発明者】
【氏名】キム， ジョン ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ソン， ヨン ウク
(72)【発明者】
【氏名】ペン， ジン チュル
(72)【発明者】
【氏名】リー， ユン サン
(72)【発明者】
【氏名】ファン， ド ウォン
【テーマコード（参考）】
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB45
4C087BB47
4C087BB64
4C087NA14
4C087ZA94
(57)【要約】
本発明は、筋炎を予防又は治療するための医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、ミトコンドリアを有効成分として含む、筋炎を予防又は治療するための医薬組成物に関する。外来性ミトコンドリアを有効成分として含む本発明の医薬組成物を筋炎に罹患した対象に投与すると、対象の筋細胞に浸潤した炎症細胞を減少させることができる。さらに、本発明の医薬組成物は、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－６、炎症性サイトカインの発現を効果的に阻害する。したがって、本発明による医薬組成物は、筋炎を予防又は治療するために有用に使用することができる。
【選択図】 図２０
【選択図】 図２０
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ミトコンドリアを有効成分として含む、筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項2】
ミトコンドリアが細胞又は組織から単離される、請求項１に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項3】
ミトコンドリアがインビトロで培養された細胞から単離される、請求項２に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項4】
細胞が、体細胞、生殖細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項２に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項5】
体細胞が、筋細胞、肝細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板、又は粘膜細胞及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項４に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項6】
生殖細胞が、精子、卵子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項４に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項7】
幹細胞が、間葉系幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、輪部幹細胞、組織由来の幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項４に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項8】
間葉系幹細胞が、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、胎盤、滑液、精巣、骨膜、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つから得られる、請求項７に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項9】
ミトコンドリアが、医薬組成物に対して、０．１μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬの濃度で含まれる、請求項１に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項10】
ミトコンドリアが、医薬組成物に対して、１×１０５～５×１０８ミトコンドリア／ｍＬの含有量で含まれる、請求項１に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、筋炎を予防又は治療するための方法。
【請求項12】
筋炎を予防又は治療するための、単離されたミトコンドリアの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ミトコンドリアを有効成分として含む、筋炎を予防又は治療するための医薬組成物に関する。
【0002】
［背景技術］
筋炎は、筋肉に炎症が起こり、筋線維が損傷する、筋肉痛をもたらし、筋肉が収縮する能力が低下する疾患である。筋炎は、皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎に分けられ、とりわけ多発性筋炎及び皮膚筋炎は、体幹に近い四肢の筋力低下、筋酵素レベルの上昇、炎症性サイトカインの発現上昇、筋電図の異常、筋生検の異常等の症状が現れる炎症性筋疾患である。
筋炎は、筋肉に炎症が起こり、筋線維が損傷する、筋肉痛をもたらし、筋肉が収縮する能力が低下する疾患である。筋炎は、皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎に分けられ、とりわけ多発性筋炎及び皮膚筋炎は、体幹に近い四肢の筋力低下、筋酵素レベルの上昇、炎症性サイトカインの発現上昇、筋電図の異常、筋生検の異常等の症状が現れる炎症性筋疾患である。
【0003】
さらに、多発性筋炎及び皮膚筋炎による筋力低下は、主に数週間から数ヶ月かけて徐々に進行するものの、ごくまれに急速に進行する。重度の筋力低下を治療しなければ、筋肉の喪失につながる。多発性筋炎を患っている患者の約１５％から３０％は、悪性腫瘍を伴い、皮膚筋炎が高齢者に発生すると、共に癌を発症することが報告されている。
【0004】
ステロイド、免疫抑制剤、又は免疫調節剤は、多発性筋炎及び皮膚筋炎の治療に使用される。ステロイドは早期治療に最もよく使用される薬であり、ステロイド治療への反応及び副作用に依存して免疫抑制剤を使用するかどうかが決定される。筋炎患者の約７５％は、ステロイドに加えて追加の免疫抑制剤が処方される。最近、免疫調節剤として、静脈内投与のための免疫グロブリンが、皮膚筋炎の筋力や筋生検で見られる兆候を改善する効果があることが示されており、皮膚筋炎に使用されている。しかし、免疫抑制剤及び免疫調節剤には、免疫系に直接関与するため副作用があり、薬の効果が長期間持続せず、６～８週間ごとに薬の注射を繰り返す必要があるという短所がある。
【0005】
さらに、最近、筋炎誘導マウスモデルが開発され、筋炎治療薬の開発に使用されている。特には、２００７年に組換え骨格筋ファストタイプＣタンパク質を単回投与することで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに多発性筋炎を誘導することができ、筋炎の疾患特異的治療法の研究を試みる可能性が示唆された（Ｓｕｇｉｈａｒａ Ｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２００７、５６（４）：１３０４～１４）。筋炎誘導マウスモデルは、多発性筋炎の筋肉組織において発現が増加するケモカインであるＣＸＣＬ１０（Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０）に対する筋炎治療における免疫抑制剤の効果を評価するために使用されている（Ｋｉｍら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１４、１６：Ｒ１２６）。
【0006】
一方、ミトコンドリアは、細胞内エネルギー源であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の合成及び調節に関わる真核細胞の細胞小器官である。ミトコンドリアは、例えば、細胞内シグナル伝達、細胞分化、細胞死、並びに細胞周期及び細胞増殖の制御などの様々な生体内代謝経路に関連している。
【0007】
［発明の詳細な説明］
［技術課題］
筋炎の治療についての研究が行われているものの、開発された薬剤は副作用を生じ、定期的な注射が必要であるという問題があり、これまで革新的な治療法が開発されていなかった。したがって、安全で効果的な筋炎の治療薬の継続的な研究開発が必要である。
［技術課題］
筋炎の治療についての研究が行われているものの、開発された薬剤は副作用を生じ、定期的な注射が必要であるという問題があり、これまで革新的な治療法が開発されていなかった。したがって、安全で効果的な筋炎の治療薬の継続的な研究開発が必要である。
【0008】
したがって、本発明の目的は、筋炎を治療するための医薬組成物及びそれを使用して筋炎を治療するための方法を提供することである。
【0009】
［課題の解決手段］
上記の問題を解決するための、本発明の一態様は、ミトコンドリアを有効成分として含む、筋炎を予防又は治療するための医薬組成物を提供することである。
上記の問題を解決するための、本発明の一態様は、ミトコンドリアを有効成分として含む、筋炎を予防又は治療するための医薬組成物を提供することである。
【0010】
本発明の別の態様は、対象に医薬組成物を投与するステップを含む、筋炎を予防又は治療するための方法を提供することである。
【0011】
［発明の効果］
ミトコンドリアを有効成分とする本発明の医薬組成物を、筋炎に罹患している対象に投与すると、対象の筋細胞に浸潤する炎症細胞を減少させることができる。さらに、本発明の医薬組成物は、筋炎を発症している筋組織の炎症性サイトカインの発現を効果的に減少させることができる。したがって、筋炎を予防又は治療するために、本発明による医薬組成物を有用に使用することができる。
ミトコンドリアを有効成分とする本発明の医薬組成物を、筋炎に罹患している対象に投与すると、対象の筋細胞に浸潤する炎症細胞を減少させることができる。さらに、本発明の医薬組成物は、筋炎を発症している筋組織の炎症性サイトカインの発現を効果的に減少させることができる。したがって、筋炎を予防又は治療するために、本発明による医薬組成物を有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】臍帯由来の間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアにおけるＡＴＰの合成量の測定を示す図である。
【図2】臍帯由来の間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアにおける膜電位活性の測定値を示す図である。
【図3】臍帯由来の間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアにおける活性酸素種の測定を示す図である。
【図4】筋炎誘導マウスを用いたミトコンドリアの投与による筋炎治療の効果を確認するための一次動物実験計画の概略を示す図である。
【図5】筋線維に浸潤した炎症細胞を同定するために、陰性対照群、陽性対照群、及び外因性ミトコンドリアを投与した実験群のＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）で染色した大腿四頭筋とハムストリング筋の写真を示す図である。
【図6】陰性対照群、陽性対照群、及び外因性ミトコンドリアを投与した実験群において、大腿四頭筋をＨ＆Ｅで染色した後の、筋線維に浸潤した炎症細胞の数の測定及びスコアリングを示す図である。
【図7】正常群、陰性対照群、陽性対照群、及びミトコンドリアを投与した実験群における、マウスの血中のＩＬ－６の濃度を示す図である。
【図8】陰性対照群、陽性対照群、及び外因性ミトコンドリアを投与した実験群における、マウスのＰＥＴ／ＭＲＩの写真を示す図である。
【図9】筋炎誘導マウスモデルにおいて、ミトコンドリアの移植後にミトコンドリアの活性が上昇したことを示す図である。
【図10】筋炎誘導マウスを用いた外因性ミトコンドリアの投与による筋炎治療の効果を確認するための二次動物実験計画の概略を示す図である。
【図11】筋線維に浸潤した炎症細胞を同定するために、陰性対照群、陽性対照群、及び外因性ミトコンドリアを投与した実験群においてＨ＆Ｅで染色された大腿四頭筋の写真を示す図である。
【図12】筋線維に浸潤した炎症細胞を同定するために、陰性対照群、陽性対照群、及び外因性ミトコンドリアを投与した実験群においてＨ＆Ｅで染色されたハムストリング筋の写真を示す図である。
【図13】陰性対照群、陽性対照群、及び外因性ミトコンドリアを投与した実験群における、大腿四頭筋をＨ＆Ｅで染色した後に筋線維に浸潤した炎症細胞の数の測定とスコアリングを示す図である。
【図14】正常群、陰性対照群、陽性対照群、及び外因性ミトコンドリアを投与した実験群におけるマウスの血中のＩＬ－１βの濃度を示す図である。
【図15】正常群、陰性対照群、陽性対照群、及び外因性ミトコンドリアを投与した実験群におけるマウスの血中のＩＬ－６の濃度を示す図である。
【図16】正常群、陰性対照群、陽性対照群、及び外因性ミトコンドリアを投与した実験群におけるマウスの血中のＴＮＦ－αの濃度を示す図である。
【図17】正常群、陰性対照群、陽性対照群、及び外因性ミトコンドリアを投与した実験群におけるマウスの筋肉内のＩＬ－６のｍＲＮＡの発現量を示す図である。
【図18】筋炎誘導マウスを用いた外因性ミトコンドリアの投与による筋炎治療の効果を確認するための三次動物実験計画の概略を示す図である。
【図19】筋炎誘導マウスモデルにおいて、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）で染色された炎症細胞の数が、ミトコンドリアの移植後に減少したことを確認する図である。
【図20】筋炎誘導マウスモデルにおいて、スコアリングシステムによる組織学的スコアが、ミトコンドリアの移植後に減少したことを確認する図である。
【図21】筋炎誘導マウスモデルにおいて、炎症性サイトカインの数が、ミトコンドリアの移植後に減少したことを示す図である。
【図22】筋炎誘導マウスモデルにおいて、ミトコンドリアの活性が、ミトコンドリアの移植後に増加したことを示す図である。
【図23】筋炎誘導マウスモデルにおける、ミトコンドリア移植後のメタボローム分析による筋肉プロファイルヒートマップの分析の結果としての骨格筋の総代謝物の増加及び減少を示す図である。
【図24】筋炎誘導マウスモデルにおいて、ミトコンドリアを移植した後、メタボローム分析により、リンゴ酸及びアスパラギン酸の相対定量値比が有意に増加し、対照群のレベルに回復したことを確認する図である。
【図25】筋炎誘導マウスモデルにおいて、ミトコンドリアを移植した後、メタボローム分析により、リンゴ酸及びアスパラギン酸の相対定量値比が有意に増加し、対照群のレベルに回復したことを確認する図である。
【図26】筋炎誘導マウスモデルにおいて、ミトコンドリアを移植した後、メタボローム分析により、リンゴ酸及びアスパラギン酸の相対定量値比が有意に増加し、対照群のレベルに回復したことを確認する図である。
【図27】筋炎誘導マウスモデルにおいて、ミトコンドリアを移植した後、メタボローム分析により、リンゴ酸及びアスパラギン酸の相対定量値比が有意に増加し、対照群のレベルに回復したことを確認する図である。
【図28】臍帯由来の凍結保存間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアのＡＴＰ活性と、臍帯由来の培養間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアのＡＴＰ活性との比較を示す図である。
【図29】臍帯由来の凍結保存間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアの膜電位と、臍帯由来の培養間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアの膜電位との比較を示す図である。
【図30】臍帯由来の凍結保存間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリア及び臍帯由来の培養間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアにおける活性酸素種の測定を示す図である。
【図31】粒子カウンター（Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ４ｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した、１μｇ／ｍＬの濃度のミトコンドリアを含む溶液中のミトコンドリアの数の測定を示す図である。
【図32】粒子カウンターを使用した、２．５μｇ／ｍＬの濃度のミトコンドリアを含む溶液中のミトコンドリアの数の測定を示す図である。
【図33】粒子カウンターを使用した、５μｇ／ｍＬの濃度のミトコンドリアを含む溶液中のミトコンドリアの数の測定を示す図である。
【図34】ＬＰＳで活性化されたＲＡＷ２６４．７細胞における数種類の細胞に由来するミトコンドリアによるＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現を阻害する能力を確認する図である。
【図35】ＬＰＳで活性化されたＴＨＰ－１細胞における数種類の細胞に由来するミトコンドリアによるＩＬ－６のｍＲＮＡの発現を阻害する能力を観察する図である。
【図36】ＬＰＳで活性化されたＴＨＰ－１細胞中のいくつかの種類の細胞に由来するミトコンドリアによるＩＬ－６のタンパク質の発現を阻害する能力の観察を示す図である。
【図37】メタボローム分析で使用される筋肉の情報を示す図である。
【0013】
［発明を実施するための最良の形態］
以下に本発明を詳細に記載する。
以下に本発明を詳細に記載する。
【0014】
本発明の一態様は、ミトコンドリアを有効成分として含む、筋炎を予防又は治療するための医薬組成物を提供することである。
【0015】
本明細書で使用される場合、「筋炎」という用語は、筋肉に炎症が生じ、筋線維が損傷する疾患を指す。特には、筋炎は皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎に分かれ、その中でも多発性筋炎及び皮膚筋炎は炎症性筋疾患に属する。多発性筋炎又は皮膚筋炎の筋肉組織においては、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６などの炎症性サイトカイン又はケモカインの発現が増加している。ＣＸＣＬ１０、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α又はＩＬ－６を阻害する免疫抑制剤又は免疫調節剤が、筋炎の治療薬として開発されている。しかしながら、免疫抑制剤又は免疫調節剤の場合、免疫系に直接関与することで副作用が発生するという問題がある。
【0016】
さらに、筋炎誘導マウスモデルは、筋炎の治療薬の開発に使用できる。筋炎誘導マウスモデルは、Ｃタンパク質断片及び熱殺菌したマイコバクテリウム・ブティリカム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を含むＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）を皮内注射し、ＰＴ（百日咳毒素；ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ）を腹腔内注射することによって作製できる。この場合、ＣＤ８ Ｔ細胞は、薬剤の注射後７日から移動し、筋肉への浸潤が起きて炎症を引き起こす可能性がある。この場合、筋炎患者の筋肉で炎症及び炎症細胞が観察される組織は、大腿四頭筋及びハムストリング筋であるため、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織は筋炎誘導マウスにも使用される可能性がある。
【0017】
本明細書において特に記載がない限り、「有効成分」という用語は、単独で、又はそれ自体は活性を有さないアジュバント（担体）と組み合わせて活性を示す成分を指す。
【0018】
実験例に示すように、Ｃタンパク質誘導性筋炎マウスモデル（ＣＩＭ）の筋肉においてＣＥ－ＴＯＦＭＳを使用して、大腿四頭筋、白筋、及びヒラメ筋、赤筋、の両方の代謝プロファイルを解析した。筋炎誘導群では、リンゴ酸とアスパラギン酸の比率が低下し、上記に基づいて、ミトコンドリア損傷があることが確認された。実験の結果、いくつかの投与量での外因性ミトコンドリア注射の効力を確認するための試験により、ＣＩＭマウスモデルにおいて炎症が改善され、ミトコンドリア損傷が回復したことが確認された。
【0019】
ミトコンドリアは、哺乳動物から得られてもよく、ヒトから得られてもよい。特には、ミトコンドリアは、細胞又は組織から単離されてもよい。例えば、ミトコンドリアは、インビトロで培養された細胞から単離されてもよい。さらに、ミトコンドリアは、体細胞、生殖細胞、血液細胞、又は幹細胞から得ることができる。さらに、ミトコンドリアは血小板から得ることができる。ミトコンドリアは、ミトコンドリアの生物学的活性が正常である細胞から得られる正常なミトコンドリアであってもよい。さらに、ミトコンドリアは、インビトロで培養してもよい。
【0020】
さらに、ミトコンドリアは、自家、同種、又は異種の対象から得られてもよい。特には、自家ミトコンドリアとは、同じ対象の組織又は細胞から得られるミトコンドリアを指す。さらに、同種ミトコンドリアとは、対象と同じ種に属し、対立遺伝子の遺伝子型が異なる対象から得られたミトコンドリアを指す。さらに、異種ミトコンドリアとは、対象とは異なる種に属する対象から得られたミトコンドリアを指す。
【0021】
特には、体細胞は、筋細胞、肝細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板、又は粘膜細胞であってもよい。さらに、生殖細胞は、減数分裂及び有糸分裂を起こす細胞であってもよく、精子又は卵子であってもよい。さらに、幹細胞は、間葉系幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、輪部幹細胞、及び組織由来の幹細胞からなる群から選択される任意のものであってもよい。この場合、間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、及び胎盤からなる群から選択される任意のものであってもよい。
【0022】
一方、ミトコンドリアが特定の細胞から単離される場合、ミトコンドリアは、例えば、特定の緩衝液を使用するか、又は電位差及び磁場を使用するなど、様々な既知の方法によって単離することができる。
【0023】
ミトコンドリアの単離は、ミトコンドリアの活性を維持するという点で、細胞を粉砕及び遠心分離することによって得ることができる。一実施形態では、細胞を培養し、細胞を含む医薬組成物の第１の遠心分離を行ってペレットを生成するステップ、ペレットを緩衝液に再懸濁してホモジナイズするステップ、ホモジナイズした溶液の第２の遠心分離を行って上清を生成するステップ、及び上清の第３の遠心分離を行ってミトコンドリアを精製するステップによって実行することができる。この場合、細胞活性を維持するという点で、第２の遠心分離を行う時間は、第１の遠心分離及び第３の遠心分離を行う時間よりも短く調整することが好ましく、第１の遠心分離から第３の遠心分離まで速度が上昇してもよい。
【0024】
特には、第１から第３の遠心分離は、０℃から１０℃、好ましくは３℃から５℃の温度で行ってもよい。さらに、遠心分離を行う時間は、１分から５０分であってもよく、遠心分離の回数及びサンプルの含有量などに応じて適切に調整することができる。
【0025】
さらに、第１の遠心分離は、１００×ｇ～１，０００×ｇ、又は２００×ｇ～７００×ｇ、又は３００×ｇ～４５０×ｇの速度で行うことができる。さらに、第２の遠心分離は、１×ｇ～２０００×ｇ、又は２５×ｇ～１８００×ｇ、又は５００×ｇ～１６００×ｇの速度で行うことができる。さらに、３回目の遠心分離は、１００×ｇ～２００００×ｇ、又は５００×ｇ～１８０００×ｇ、又は８００×ｇ～１５０００×ｇで行うことができる。
【0026】
単離されたミトコンドリアは、タンパク質を定量することで定量できる。特には、単離されたミトコンドリアは、ＢＣＡ（ビシンコニン酸アッセイ）分析で定量できる。この場合、医薬組成物中のミトコンドリアは、０．１μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ～７５０μｇ／ｍＬ、又は２５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬの濃度で含まれている可能性がある。本発明の一例では、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの濃度で使用された。
【0027】
さらに、単離されたミトコンドリアの数は、粒子カウンター（Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ４ｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）によって測定してもよく、ミトコンドリアの数は、Ｊａｍｅｓ Ｄ． ＭｃＣｕｌｌｙによって執筆された論文（Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１４；（９１）：５１６８２）を参照して、下記の表１のようにしてもよい。
【0028】
［表１］
【表1】
【0029】
本発明の実施例９に示すように、粒子カウンターを用いて１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、及び５μｇ／ｍＬの濃度のミトコンドリアの数を測定した結果、１．９６×１０６±０．９８×１０６、５．９７×１０６±０．１９×１０６、１．０１×１０７±０．３２×１０７と測定された。上記の表１と比較して、１０μｇ／ｍＬの濃度のミトコンドリアの数は２．１６×１０７±０．０８×１０７であると確認され、これは５μｇ／ｍＬの濃度のミトコンドリアの数に２を掛けて得られる２．０２×１０７±０．６４×１０７に類似している。この場合、医薬組成物中のミトコンドリアは、１×１０５ミトコンドリア／ｍＬから５×１０９ミトコンドリア／ｍＬの含有量で含まれ得る。特には、医薬組成物中のミトコンドリアは、１×１０５ミトコンドリア／ｍＬ～５×１０９ミトコンドリア／ｍＬ、２×１０５ミトコンドリア／ｍＬ～２×１０９ミトコンドリア／ｍＬ、５×１０５ミトコンドリア／ｍＬ～１×１０９ミトコンドリア／ｍＬ、１×１０６ミトコンドリア／ｍＬ～５×１０８ミトコンドリア／ｍＬ、２×１０６ミトコンドリア／ｍＬ～２×１０８ミトコンドリア／ｍＬ、５×１０６ミトコンドリア／ｍＬ～１×１０８ミトコンドリア／ｍＬ、又は１×１０７ミトコンドリア／ｍＬ～５×１０７ミトコンドリア／ｍＬの含有量で含まれ得る。医薬組成物には、上記の範囲の濃度及び含有量のミトコンドリアが含まれている可能性があるため、投与時のミトコンドリアの投与量は簡単に調整でき、患者の筋炎症状の改善度をさらに上昇させることができる。
【0030】
特に、医薬組成物に含まれるミトコンドリアの治療有効量は、投与される対象の体重に基づいた１回の投与量として、３×１０５ミトコンドリア／ｋｇ～１．５×１０１０ミトコンドリア／ｋｇであり得る。特には、医薬組成物に含まれるミトコンドリアの治療有効量は、投与対象の体重に基づいた１回の投与量として、３×１０５ミトコンドリア／ｋｇ～１．５×１０１０ミトコンドリア／ｋｇ、６×１０５ミトコンドリア／ｋｇ～６×１０９ミトコンドリア／ｋｇ、１．５×１０６ミトコンドリア／ｋｇ～３×１０９ミトコンドリア／ｋｇ、３×１０６ミトコンドリア／ｋｇ～１．５×１０９ミトコンドリア／ｋｇ、６×１０６ミトコンドリア／ｋｇ～６×１０８ミトコンドリア／ｋｇ、１．５×１０７ミトコンドリア／ｋｇ～３×１０８ミトコンドリア／ｋｇ又は３×１０７ミトコンドリア／ｋｇ～１．５×１０８ミトコンドリア／ｋｇであり得る。すなわち、ミトコンドリアを含む医薬組成物は、筋炎の対象の体重に基づいて投与される上記のミトコンドリア投与量の範囲で投与されることが、細胞活性の点から最も好ましい。
【0031】
さらに、医薬組成物は、１～１０回、３～８回、又は５～６回投与することができ、好ましくは５回投与することができる。この場合、投与間隔は１～７日又は２～５日、好ましくは３日であり得る。
【0032】
さらに、本発明による医薬組成物は、筋炎にかかりやすいか、又はそのような疾患又は障害に罹患しているヒト又は他の哺乳動物に投与することができる。さらに、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、又は皮下に投与することができる注射液であってよく、好ましくは注射可能な調製物であってよい。
【0033】
したがって、本発明による医薬組成物は、処方された注射液の流通に従った製品安定性を確保するために、注射に使用できる酸性水溶液又はリン酸塩などの緩衝液を用いてｐＨを調整することにより、物理的又は化学的に非常に安定な注射液として製造することができる。
【0034】
特には、本発明の医薬組成物は、注射用水を含んでもよい。注射用水は、固体注射液を溶解するか、又は水溶性注射液を希釈するために作られた蒸留水を指す。
【0035】
さらに、本発明の医薬組成物は、安定剤又は可溶化剤を含んでもよい。例えば、安定剤は、ピロ亜硫酸、クエン酸、又はエチレンジアミン四酢酸であってもよく、可溶化剤は、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、又は水酸化カリウムであってもよい。
【0036】
本発明の別の態様では、本発明は、上記のような医薬組成物を対象に投与するステップを含む、筋炎を予防又は治療するための方法を提供する。ここで、対象は哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトであってもよい。
【0037】
この場合、投与は、静脈内、筋肉内、又は皮内投与であってもよい。したがって、本発明による医薬組成物は、筋炎に罹患した対象の静脈に正常な活性を持つ外因性ミトコンドリアを供給することができ、したがって、それはミトコンドリア機能が低下した細胞の活性を上昇させるため、又はミトコンドリア機能が異常な細胞を再生するために、有用であり得、筋炎の予防又は治療に使用することができる。
【0038】
本発明の別の態様において、本発明は、筋炎を予防又は治療するための単離されたミトコンドリアの使用を提供する。ミトコンドリア及び筋炎の詳細は、上に記載したとおりである。
【0039】
［発明を実施するための形態］
以下に、本発明の理解を助けるため、好ましい例を提示する。しかしながら、以下の例は、本発明をより理解しやすくするためのものであり、本発明の内容は、以下の例に限定されない。
以下に、本発明の理解を助けるため、好ましい例を提示する。しかしながら、以下の例は、本発明をより理解しやすくするためのものであり、本発明の内容は、以下の例に限定されない。
【0040】
Ｉ．ミトコンドリアを含む組成物の調製
調製例１．ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアを含む組成物の調製Ｉ
ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬアンピシリンを含むアルファ－ＭＥＭ（アルファ最小必須培地；Ａｌｐｈａ－Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地に接種し、７２時間培養した。培養終了後、ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、Ｇｉｂｃｏ）を用い、洗浄を２回行った。洗浄した細胞を０．２５％（ｖ／ｖ）トリプシン－ＥＤＴＡ（ＴＥ、Ｇｉｂｃｏ）で処理し、細胞を得た。
調製例１．ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアを含む組成物の調製Ｉ
ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬアンピシリンを含むアルファ－ＭＥＭ（アルファ最小必須培地；Ａｌｐｈａ－Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地に接種し、７２時間培養した。培養終了後、ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、Ｇｉｂｃｏ）を用い、洗浄を２回行った。洗浄した細胞を０．２５％（ｖ／ｖ）トリプシン－ＥＤＴＡ（ＴＥ、Ｇｉｂｃｏ）で処理し、細胞を得た。
【0041】
ミトコンドリアを単離するために、得られた細胞を、血球計算盤を使用して１×１０７細胞／ｍＬの濃度で回収した。細胞株を３５０×ｇの速度で４℃の温度、１０分間、第１の遠心分離に供した。この時に、得られたペレットを回収し、緩衝液に再懸濁し、１０～１５分間のホモジナイズに供した。その後、ペレットを含む組成物を、１１００×ｇの速度で、３分間、４℃の温度で第２の遠心分離に供し、上清を取得した。上清を１２，０００×ｇの速度、１５分間、４℃の温度で第３の遠心分離に供し、ミトコンドリアを細胞株から単離した。このようにして得られたミトコンドリアを、ＰＢＳと混合し、次いでシリンジに充填した。
【0042】
調製例２．ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアを含む組成物の調製ＩＩ
ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬアンピシリンを含むアルファ－ＭＥＭ（アルファ最小必須培地、Ｇｉｂｃｏ）培地に接種し、７２時間培養した。細胞の培養が完了した後、ＤＰＢＳを用いて２回洗浄した。その後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで処理することにより、細胞を得た。細胞の濃度を１×１０７細胞／ｍＬになるように、細胞を再懸濁した後、細胞は、３５０×ｇの速度で、１０分間、４℃の温度で第１の遠心分離に供した。
ヒト臍帯由来の間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬアンピシリンを含むアルファ－ＭＥＭ（アルファ最小必須培地、Ｇｉｂｃｏ）培地に接種し、７２時間培養した。細胞の培養が完了した後、ＤＰＢＳを用いて２回洗浄した。その後、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで処理することにより、細胞を得た。細胞の濃度を１×１０７細胞／ｍＬになるように、細胞を再懸濁した後、細胞は、３５０×ｇの速度で、１０分間、４℃の温度で第１の遠心分離に供した。
【0043】
洗浄した細胞をミトコンドリア単離液で再浮遊させた後、１ｍｌシリンジを用いて破砕した。その後、破砕した細胞を含む溶液を１５００×ｇで、５分間、４℃で遠心分離して不純物を除去し、ミトコンドリアを含む上清を回収した。回収した上清を２００００×ｇで、５分間、４℃で遠心分離して、沈殿したミトコンドリアを回収し、単離したミトコンドリアをＴｒｉｓ緩衝液に浮遊させ、ＢＣＡ法でタンパク質を定量した後、実験に使用した。
【0044】
調製例３．ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアを含む組成物の調製
ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬアンピシリンを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地に接種し、７２時間培養した。
ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬアンピシリンを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地に接種し、７２時間培養した。
【0045】
細胞の培養が完了した後、ミトコンドリアを回収し、調製例２に記載の方法のように定量し、次いで実験に使用した。
【0046】
調製例４．ヒト線維芽細胞から単離されたミトコンドリアを含む組成物の調製
ヒト線維芽細胞（ＣＣＤ－８ＬＵ、ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬアンピシリンを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地に接種し、７２時間培養した。
ヒト線維芽細胞（ＣＣＤ－８ＬＵ、ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び１００Ｕ／ｍＬアンピシリンを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地に接種し、７２時間培養した。
【0047】
細胞の培養が完了した後、ミトコンドリアを回収し、調製例２に記載の方法のように定量し、次いで実験に使用した。
【0048】
調製例５．ヒト人工多能性幹細胞から単離されたミトコンドリアを含む組成物の調製
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、１０μｇ／ｍｌのビトロネクチン（幹細胞０７１８０）でコートされた細胞培養容器内のＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）（幹細胞０５９９０）培地で培養され、使用された。
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、１０μｇ／ｍｌのビトロネクチン（幹細胞０７１８０）でコートされた細胞培養容器内のＴｅＳＲ（商標）－Ｅ８（商標）（幹細胞０５９９０）培地で培養され、使用された。
【0049】
細胞の培養が完了した後、ミトコンドリアを回収し、調製例２に記載の方法のように定量し、次いで実験に使用した。
【0050】
調製例６．血小板ミトコンドリアから単離されたミトコンドリアを含む組成物の調製
ミトコンドリアを血小板から単離するために、ブタ全血を５００×ｇで、３分間、周囲温度で遠心分離し、その後、多血小板血漿（ＰＲＰ）を含む上清を回収した。回収した上清を１，５００×ｇ、５分間遠心分離して、上清を除去し、血小板を含む沈殿物を回収した。ＰＢＳを使用して、濃縮した血小板沈殿物を再浮遊させた後、１５００×ｇで５分間遠心分離し、洗浄した。洗浄した血小板をミトコンドリア単離溶液で再浮遊させ、１ｍｌシリンジを使用して破砕した。その後、破砕した血小板を含む溶液を１，５００×ｇで、５分間、４℃で遠心分離して不純物を除去し、ミトコンドリアを含む上清を回収した。回収した上清を２００００×ｇで、５分間、４℃で遠心分離して沈殿したミトコンドリアを回収し、単離したミトコンドリアをＴｒｉｓ緩衝液中に浮遊させ、タンパク質を定量した後、実験に使用した。
ミトコンドリアを血小板から単離するために、ブタ全血を５００×ｇで、３分間、周囲温度で遠心分離し、その後、多血小板血漿（ＰＲＰ）を含む上清を回収した。回収した上清を１，５００×ｇ、５分間遠心分離して、上清を除去し、血小板を含む沈殿物を回収した。ＰＢＳを使用して、濃縮した血小板沈殿物を再浮遊させた後、１５００×ｇで５分間遠心分離し、洗浄した。洗浄した血小板をミトコンドリア単離溶液で再浮遊させ、１ｍｌシリンジを使用して破砕した。その後、破砕した血小板を含む溶液を１，５００×ｇで、５分間、４℃で遠心分離して不純物を除去し、ミトコンドリアを含む上清を回収した。回収した上清を２００００×ｇで、５分間、４℃で遠心分離して沈殿したミトコンドリアを回収し、単離したミトコンドリアをＴｒｉｓ緩衝液中に浮遊させ、タンパク質を定量した後、実験に使用した。
【0051】
調製例７．ラットの骨格筋由来の筋芽細胞から単離されたミトコンドリアを含む組成物の調製
ラットの骨格筋に由来する筋芽細胞株であるＬ６細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１４５８）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ－高グルコース（ダルベッコ改変イーグル培地－高グルコース、Ｇｉｂｃｏ）培地に接種し、７２時間培養した。
ラットの骨格筋に由来する筋芽細胞株であるＬ６細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１４５８）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ－高グルコース（ダルベッコ改変イーグル培地－高グルコース、Ｇｉｂｃｏ）培地に接種し、７２時間培養した。
【0052】
細胞の培養が完了した後、ミトコンドリアを回収し、調製例２に記載の方法のように定量し、次いで実験に使用した。
【0053】
ＩＩ．ミトコンドリアの特性の確認
実施例１．ミトコンドリアＡＴＰ合成の確認
調製例１で単離したミトコンドリアが正常にＡＴＰを合成するかどうかを確認するため、単離したミトコンドリアのミトコンドリアタンパク質濃度を、ＢＣＡ（ビシンコニン酸アッセイ）分析により定量し、５μｇのミトコンドリアを調製した。その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者のマニュアルに従って使用して、ＡＴＰの量を定量した。
実施例１．ミトコンドリアＡＴＰ合成の確認
調製例１で単離したミトコンドリアが正常にＡＴＰを合成するかどうかを確認するため、単離したミトコンドリアのミトコンドリアタンパク質濃度を、ＢＣＡ（ビシンコニン酸アッセイ）分析により定量し、５μｇのミトコンドリアを調製した。その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者のマニュアルに従って使用して、ＡＴＰの量を定量した。
【0054】
特には、実験群として、５μｇの調製したミトコンドリアを１００μＬのＰＢＳ中に混合し、次いで、９６ウェルプレートに分注した。さらに、対照群として、ミトコンドリアを含まない１００μＬのＰＢＳを、９６－ウェルプレートに分注した。その後、各ウェルをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光キットに含まれる１００μＬの試験溶液で処理し、その後、スターラーで２分間反応させ、十分に混合した。その後、周囲温度で１０分間反応させ、その後、ルミネセンスマイクロプレートリーダーを使用して５６０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【0055】
その結果、ミトコンドリアを含む実験群のＡＴＰの量は対照群のＡＴＰの量の約３倍以上であることが確認された（図１）。上記から、調製例１で単離されたミトコンドリアが、正常にＡＴＰを合成していることが確認された。
【0056】
実施例２．ミトコンドリアの膜電位の測定
調製例１で単離したミトコンドリアの膜電位を測定するために、単離したミトコンドリアのミトコンドリアタンパク質濃度をＢＣＡで定量し、５μｇのミトコンドリアを調製した。ミトコンドリアの膜電位は、ＪＣ－１（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号１７４３１５９）色素を使用して測定した。
調製例１で単離したミトコンドリアの膜電位を測定するために、単離したミトコンドリアのミトコンドリアタンパク質濃度をＢＣＡで定量し、５μｇのミトコンドリアを調製した。ミトコンドリアの膜電位は、ＪＣ－１（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号１７４３１５９）色素を使用して測定した。
【0057】
特には、実験群として、５μｇの調製したミトコンドリアを５０μＬのＰＢＳに混合し、９６ウェルプレートに分注した。さらに、対照群として、ミトコンドリアを含まない５０μＬのＰＢＳを９６ウェルプレートに分注した。さらに、追加の実験グループとして、５μｇのミトコンドリアを５０μＬのＣＣＣＰ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡＳ ５５５－６０－２）に混合し、室温で１０分間反応させた後、９６ウェルプレートに分注した。この場合、ＣＣＣＰはミトコンドリアのイオントランスポーターであり、ミトコンドリアの膜電位を脱分極させ、それによってミトコンドリアの機能を阻害する。
【0058】
その後、各ウェルを濃度が２μＭになるようにＪＣ－１色素で処理し、反応させた後、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を測定した。このとき、ＪＣ－１色素は、低濃度ではモノマーとして存在して緑色の蛍光を示し、高濃度では、ＪＣ－１色素が凝集して赤色の蛍光を示す（モノマー：Ｅｘ ４８５／Ｅｍ ５３０、Ｊ－凝集体：Ｅｘ ５３５ｎｍ／Ｅｍ ５９０ｎｍ）。ミトコンドリアの膜電位は、赤色蛍光の吸光度に対する緑色蛍光の吸光度の比を計算することによって分析した。
【0059】
その結果、ミトコンドリアを含む実験群は高い膜電位活性を示した。他方、ミトコンドリアをＣＣＣＰで処理した追加の実験群は、低い膜電位活性を示した（図２）。上記から、調製例１で単離されたミトコンドリアは、正常な膜電位活性を示すことが確認された。
【0060】
実施例３．ミトコンドリアの活性酸素種の測定
調製例１で単離したミトコンドリアの損傷を確認するために、単離したミトコンドリアのミトコンドリアタンパク質濃度をＢＣＡにより定量し、５μｇのミトコンドリアを調製した。ミトコンドリア内のミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）は、ＭｉｔｏＳＯＸレッドインジケーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｍ３６００８）色素を用いて測定した。
調製例１で単離したミトコンドリアの損傷を確認するために、単離したミトコンドリアのミトコンドリアタンパク質濃度をＢＣＡにより定量し、５μｇのミトコンドリアを調製した。ミトコンドリア内のミトコンドリア活性酸素種（ＲＯＳ）は、ＭｉｔｏＳＯＸレッドインジケーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｍ３６００８）色素を用いて測定した。
【0061】
特には、実験群として、調製したミトコンドリア５μｇを５０μＬのＰＢＳに混合し、９６ウェルプレートに分注した。さらに、対照群として、ミトコンドリアを含まない５０μＬのＰＢＳを９６ウェルプレートに分注した。その後、ＭｉｔｏＳＯＸレッドインジケーター色素を５０μＬのＰＢＳに、濃度が１０μＭになるように混合した後、各ウェルを混合物で処理し、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベーター中に２０分間反応させた。反応終了後、蛍光マイクロプレートリーダー（Ｅｘ ５１０ｎｍ／Ｅｍ ５８０ｎｍ）を用いて吸光度を測定した。その結果、ミトコンドリア内のミトコンドリア活性酸素種が、対照群と実験群の両方で低いことが確認された（図３）。上記から、調製例１で単離されたミトコンドリアの損傷がないことが確認された。
【0062】
ＩＩＩ．インビボでの筋炎の治療に対するミトコンドリアの効果の確認
実施例４．筋炎誘導マウスモデルにおける外因性ミトコンドリアの投与による筋炎の治療に対する効果の確認：一次実験
実施例４．１．筋炎誘導マウスモデルの構築及びミトコンドリアの投与（ｎ＝３）
２００μｇのＣタンパク質断片と１００μｇの熱殺菌したマイコバクテリウム・ブティリカムを含むＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）を、Ｃ５７ＢＬ／６雌８週齢マウスに皮内注射し、２μｇのＰＴ（百日咳毒素）を皮内注射した。
実施例４．筋炎誘導マウスモデルにおける外因性ミトコンドリアの投与による筋炎の治療に対する効果の確認：一次実験
実施例４．１．筋炎誘導マウスモデルの構築及びミトコンドリアの投与（ｎ＝３）
２００μｇのＣタンパク質断片と１００μｇの熱殺菌したマイコバクテリウム・ブティリカムを含むＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）を、Ｃ５７ＢＬ／６雌８週齢マウスに皮内注射し、２μｇのＰＴ（百日咳毒素）を皮内注射した。
【0063】
筋炎誘導後１日目又は７日目に調製例１（５μｇ）で単離されたミトコンドリアの静脈内単回投与を行った群を実験群とした。さらに、１００μＬのＰＢＳの腹腔内投与を行った群を陰性対照群として設定し、筋炎誘導後１日目～１４日目まで連日投与量０．８ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンの腹腔内投与を行った群を陽性対照群として設定した（図４）。
【0064】
実施例４．２．炎症が浸潤した筋線維の確認
実施例４．１の各群のマウスを１４日目に犠牲にし、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織を採取し、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）で染色した後、炎症細胞の浸潤を光学顕微鏡で観察した。
実施例４．１の各群のマウスを１４日目に犠牲にし、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織を採取し、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）で染色した後、炎症細胞の浸潤を光学顕微鏡で観察した。
【0065】
その結果、陽性対照群及び実験群においては、筋線維に浸潤した炎症細胞の数が、陰性対照群に比べて減少していることが確認された（図５）。さらに、１４日目に各群のマウスを犠牲にし、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織を採取してＨ＆Ｅで染色した後、スコアリングシステムを使用して、炎症細胞が浸潤した筋線維の数を評価した。スコアリングシステムのスコア測定法は、以下の表２に示されている。この場合、大腿四頭筋及びハムストリング筋の左右の筋肉の平均値を比較した。
【0066】
［表２］
【表2】
【0067】
結果として、陽性対照群及び実験群においては、炎症が浸潤した筋線維のスコアが、陰性対照群に比べて減少した（図６）。
【0068】
実施例４．３．血中のサイトカイン濃度の確認
１４日目の正常マウス及び実施例４．１の各群のマウスの血液中のＩＬ－６の濃度を確認するために、各群のマウスの血液から血清を単離し、次いで、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を製造業者のマニュアルに従って使用して、血液中のＩＬ－６を測定した。
１４日目の正常マウス及び実施例４．１の各群のマウスの血液中のＩＬ－６の濃度を確認するために、各群のマウスの血液から血清を単離し、次いで、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を製造業者のマニュアルに従って使用して、血液中のＩＬ－６を測定した。
【0069】
その結果、対照群では血中のＩＬ－６濃度が増加し、陽性対照群と実験群では血中のＩＬ－６濃度が減少していることが確認された（図７）。
【0070】
実施例４．４．ＰＥＴ／ＭＲＩ分析による炎症反応の確認
まず、実施例４．１の各群のマウスの組織におけるグルコース摂取効率を増加させるために、画像化の８時間前から食物を与えなかった。８時間後、２００ｕｃｉ１８Ｆ－ＦＤＧ（サイクロトロン室、核医学部、ソウル国立大学病院）をマウスの静脈から注射し、１時間後にＰＥＴ／ＭＲ画像を撮影した。
まず、実施例４．１の各群のマウスの組織におけるグルコース摂取効率を増加させるために、画像化の８時間前から食物を与えなかった。８時間後、２００ｕｃｉ１８Ｆ－ＦＤＧ（サイクロトロン室、核医学部、ソウル国立大学病院）をマウスの静脈から注射し、１時間後にＰＥＴ／ＭＲ画像を撮影した。
【0071】
その結果、陰性対照群のマウスの脚に強い放射性核種シグナルが観察された。１８Ｆ－ＦＤＧ放射性医薬品は、多くの場合、炎症細胞であるマクロファージに選択的に摂取される。したがって、核医学イメージング技術により、炎症反応を容易に監視でき得る（図８）。
【0072】
実施例４．５．ミトコンドリアの酸化的リン酸化複合体の発現の変化の確認
陰性対照群（ＣＩＭ）の大腿四頭筋における酸化的リン酸化複合体ＩＩの発現は、対照群と比較して減少し、実験群（ＣＩＭ＋Ｍｉｔｏ ７日目）の発現は、陽性対照群（ＤＥＸＡ）と比較して増加した。陰性対照群（ＣＩＭ）の足底筋におけるＴＯＭ２０の発現は、対照群と比較して減少し、実験群（ＣＩＭ＋Ｍｉｔｏ １日目、ＣＩＭ＋Ｍｉｔｏ ７日目）の発現は、陽性対照群（ＤＥＸＡ）と比較して増加した（図９）。
陰性対照群（ＣＩＭ）の大腿四頭筋における酸化的リン酸化複合体ＩＩの発現は、対照群と比較して減少し、実験群（ＣＩＭ＋Ｍｉｔｏ ７日目）の発現は、陽性対照群（ＤＥＸＡ）と比較して増加した。陰性対照群（ＣＩＭ）の足底筋におけるＴＯＭ２０の発現は、対照群と比較して減少し、実験群（ＣＩＭ＋Ｍｉｔｏ １日目、ＣＩＭ＋Ｍｉｔｏ ７日目）の発現は、陽性対照群（ＤＥＸＡ）と比較して増加した（図９）。
【0073】
上記実施例４．２～４．５の実験結果を考慮し、ミトコンドリア投与の時点を筋炎誘導後７日目に設定して二次実験を行った。
【0074】
実施例５．筋炎誘導マウスモデルにおける外因性ミトコンドリアの投与による筋炎の治療に対する効果の確認：二次実験
実施例５．１．筋炎誘導マウスモデルの構築及びミトコンドリアの投与（ｎ＝１０）
２００μｇのＣタンパク質断片及び１００μｇの熱殺菌したマイコバクテリウム・ブティリカムを含むＣＦＡをＣ５７ＢＬ／６雌８週齢マウスに皮内注射し、２μｇのＰＴを腹腔内注射した。
実施例５．１．筋炎誘導マウスモデルの構築及びミトコンドリアの投与（ｎ＝１０）
２００μｇのＣタンパク質断片及び１００μｇの熱殺菌したマイコバクテリウム・ブティリカムを含むＣＦＡをＣ５７ＢＬ／６雌８週齢マウスに皮内注射し、２μｇのＰＴを腹腔内注射した。
【0075】
筋炎誘導後７日目に調製例１（５μｇ）で単離されたミトコンドリアの静脈内単回投与を行った群を実験群とした。さらに、１００μＬのＰＢＳの腹腔内投与を行った群を陰性対照群と設定し、筋炎誘導後７日目から１４日目まで連日投与量０．８ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを腹腔内投与した群を陽性対照群とした（図１０）。
【0076】
実施例５．２．炎症が浸潤した筋線維の確認
実施例５．１の各群のマウスを１４日目に犠牲にし、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織を採取してＨ＆Ｅで染色した後、光学顕微鏡を用いて炎症細胞の浸潤を観察した。その結果、陽性対照群及び実験群では、筋線維に浸潤した炎症細胞の数が、陰性対照群と比較して減少していることが確認された（図１１及び１２）。
実施例５．１の各群のマウスを１４日目に犠牲にし、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織を採取してＨ＆Ｅで染色した後、光学顕微鏡を用いて炎症細胞の浸潤を観察した。その結果、陽性対照群及び実験群では、筋線維に浸潤した炎症細胞の数が、陰性対照群と比較して減少していることが確認された（図１１及び１２）。
【0077】
さらに、１４日目に各グループのマウスを犠牲にし、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織を採取してＨ＆Ｅで染色し、スコアリングシステムを使用して、炎症細胞が浸潤した筋線維の数を評価した。スコアリングシステムのスコア測定方法は、実施例４．２と同じように行った。この場合、大腿四頭筋及びハムストリング筋の左右の筋肉の平均値が比較された。その結果、陽性対照群及び実験群での炎症が浸潤した筋線維のスコアは、陰性対照群と比較して有意に減少した（図１３）。
【0078】
実施例５．３．血中のサイトカイン濃度の確認
正常マウス及び実施例５．１の各群のマウスの１４日目の血中のＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－αの濃度を確認するために、各群のマウスの血液から血清を単離し、その後、製造業者のマニュアルに従って、ＩＬ－１β ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、米国）、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット、及びＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、米国）をそれぞれ使用して、血中のＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－αの濃度を測定した。
正常マウス及び実施例５．１の各群のマウスの１４日目の血中のＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－αの濃度を確認するために、各群のマウスの血液から血清を単離し、その後、製造業者のマニュアルに従って、ＩＬ－１β ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、米国）、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット、及びＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＮ、米国）をそれぞれ使用して、血中のＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びＴＮＦ－αの濃度を測定した。
【0079】
その結果、陽性対照群において、血中のＩＬ－６濃度が陰性対照群と比較して増加しているのに対し、実験群においては、血中のＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αの濃度が陰性対照群と比較して減少していた（図１４、１５、及び１６）。
【0080】
実施例５．４． ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現の変化の確認
ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現レベルは、正常マウス及び実施例５．１の各群のマウスの筋肉から１４日目にＲＴ－ｑＰＣＲにより単離されたｍＲＮＡにおいて確認された。特には、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて筋肉から全ＲＮＡを単離し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、米国）及び７，５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｑＰＣＲを行った。実験結果はβ－アクチンｍＲＮＡの量に対して正規化された。この場合における、使用プライマーを以下の表３に示す。
ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現レベルは、正常マウス及び実施例５．１の各群のマウスの筋肉から１４日目にＲＴ－ｑＰＣＲにより単離されたｍＲＮＡにおいて確認された。特には、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて筋肉から全ＲＮＡを単離し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、米国）及び７，５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｑＰＣＲを行った。実験結果はβ－アクチンｍＲＮＡの量に対して正規化された。この場合における、使用プライマーを以下の表３に示す。
【0081】
［表３］
【表3】
【0082】
その結果、実験群ではＩＬ－６のｍＲＮＡの発現が減少していることが確認された。他方、陽性対照群ではＩＬ－６のｍＲＮＡの発現が減少していないことが確認され、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現を減少させる効果に関して、実験群は、陽性対照群よりも効果的であった（図１７）。
【0083】
実施例５．５．メタボローム分析によるミトコンドリア機能の変化の確認
筋炎動物モデル（ＣＩＭ）を誘導した後、対照群、陰性対照群（ＣＩＭ）、陽性対照群（ＤＥＸＡ）、及び５μｇのミトコンドリアを移植した群の大腿四頭筋及びヒラメ筋において、陽イオン及び陰イオンモードのＣＥ－ＴＯＦＭＳに基づくメタボローム分析で、ミトコンドリア機能を測定した。ＣＥ－ＭＳ分析の分析品質を向上させることによる測定のために、サンプルを図３７に示すように希釈した。
筋炎動物モデル（ＣＩＭ）を誘導した後、対照群、陰性対照群（ＣＩＭ）、陽性対照群（ＤＥＸＡ）、及び５μｇのミトコンドリアを移植した群の大腿四頭筋及びヒラメ筋において、陽イオン及び陰イオンモードのＣＥ－ＴＯＦＭＳに基づくメタボローム分析で、ミトコンドリア機能を測定した。ＣＥ－ＭＳ分析の分析品質を向上させることによる測定のために、サンプルを図３７に示すように希釈した。
【0084】
筋肉のプロファイルヒートマップの分析からわかるように、対照群と比較して、陰性対照群（ＣＩＭ）の骨格筋の代謝物プロファイルに有意な影響を及ぼしたことが示された（図２３）。陽性対照群（ＤＥＸＡ）と比較して、ミトコンドリア移植群の代謝物プロファイルが、対照群の代謝物プロファイルと同様に回復したことを確認した。リンゴ酸－アスパラギン酸シャトル（時には短く、リンゴ酸シャトル、リンゴ酸アスパラギン酸シャトル欠損）は、糖分解プロセス間に生成された電子をミトコンドリアの半透過性内膜を横切って移動させ、真核生物の酸化的リン酸化を行う生化学的システムである。
【0085】
筋炎モデルにおいて見られるミトコンドリア機能障害は、リンゴ酸－アスパラギン酸シャトルと関連しており、リンゴ酸及びアスパラギン酸の相対定量値の比が減少することにより確認された。リンゴ酸とアスパラギン酸の相対定量値の比率は、ミトコンドリア移植後、陰性対照群（ＣＩＭ）及び陽性対照群（ＤＥＸＡ）と比較して有意に増加し、対照群と同様のレベルにまで回復したことが確認された（図２４～２７）。
【0086】
結論として、ＣＩＭマウスモデルにおいて、５μｇのミトコンドリアの移植の治療効果が確認された。
【0087】
実施例６．筋炎誘導マウスモデルにおける外因性ミトコンドリアの投与による筋炎の治療に対する効果の確認：三次実験
実施例６．１．実験方法（ｎ＝５）
２００μｇのＣタンパク質断片及び１００μｇの熱殺菌したマイコバクテリウム・ブティリカムを含むＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）をＣ５７ＢＬ／６雌８週齢マウスに皮内注射し、２μｇのＰＴ（百日咳毒素）を腹腔内注射した。
実施例６．１．実験方法（ｎ＝５）
２００μｇのＣタンパク質断片及び１００μｇの熱殺菌したマイコバクテリウム・ブティリカムを含むＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）をＣ５７ＢＬ／６雌８週齢マウスに皮内注射し、２μｇのＰＴ（百日咳毒素）を腹腔内注射した。
【0088】
筋炎誘導後７日目に、調製例１で単離したミトコンドリアを０．２μｇ、１μｇ、又は５μｇの投与量で単回静脈内投与した群を実験群とした。さらに、１００μＬのＰＢＳの腹腔内投与を行った群を陰性対照群とし、筋炎誘導後７日目から１４日目まで、デキサメタゾン（ＤＥＸＡ）を連日投与量０．８ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した群を陽性対照群とした（図１８）。炎症評価法として、Ｈ＆Ｅ染色後の筋炎を組織学的重症度に応じてスコアを１から６に分けて評価した。
【0089】
筋肉から単離されたｍＲＮＡにおける炎症性サイトカインの発現レベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより観察した。ミトコンドリアの移植後、ミトコンドリア酸化的リン酸化複合体（ＯＸＰＨＯＳ複合体）の発現のウエスタンブロット分析によってミトコンドリアの活性レベルを評価した。動物試験群の情報を以下の表４に示す。
【0090】
［表４］
【表4】
【0091】
実施例６．２．炎症が浸潤した筋線維の確認
各群のマウス（表４）を１４日目に犠牲にし、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織を採取してＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）で染色した後、光学顕微鏡で炎症細胞の浸潤を観察した。その結果、陽性対照群と実験群では、陰性対照群に比べて筋線維に浸潤した炎症細胞の数が減少していることが確認された（図１９）。さらに、各群のマウスを１４日目に犠牲にし、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織を採取してＨ＆Ｅで染色した後、炎症細胞が浸潤した筋線維の数を、４スコアリングシステムを使用して評価した。スコアリングシステムのスコア測定方法を以下の表５に示す。この場合、大腿四頭筋及びハムストリング筋の左右の筋肉の平均値を比較した。
各群のマウス（表４）を１４日目に犠牲にし、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織を採取してＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）で染色した後、光学顕微鏡で炎症細胞の浸潤を観察した。その結果、陽性対照群と実験群では、陰性対照群に比べて筋線維に浸潤した炎症細胞の数が減少していることが確認された（図１９）。さらに、各群のマウスを１４日目に犠牲にし、大腿四頭筋及びハムストリング筋の組織を採取してＨ＆Ｅで染色した後、炎症細胞が浸潤した筋線維の数を、４スコアリングシステムを使用して評価した。スコアリングシステムのスコア測定方法を以下の表５に示す。この場合、大腿四頭筋及びハムストリング筋の左右の筋肉の平均値を比較した。
【0092】
［表５］
【表5】
【0093】
その結果、陽性対照群及び５μｇのミトコンドリアを移植した群では、陰性対照群と比較して、筋線維に浸潤した炎症細胞の数が有意に減少していることが確認された（図２０）。
【0094】
実施例６．３． ＩＬ－６及びＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現の変化の確認
炎症性サイトカインであるＩＬ－６及びＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現レベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲにより、対照群、陰性対照群（ＣＩＭ）、陽性対照群（ＤＥＸＡ）、実験群（ミトコンドリア移植群）の各群のマウスの筋肉から単離されたｍＲＮＡで確認された。特には、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して筋肉から全ＲＮＡを単離し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、米国）及び７，５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＰＣＲを行った。実験結果は、β－アクチンｍＲＮＡの量に対して正規化した。この場合、ＲＴ－ｑＰＣＲで使用したプライマーを以下の表６に示す。
炎症性サイトカインであるＩＬ－６及びＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現レベルは、ＲＴ－ｑＰＣＲにより、対照群、陰性対照群（ＣＩＭ）、陽性対照群（ＤＥＸＡ）、実験群（ミトコンドリア移植群）の各群のマウスの筋肉から単離されたｍＲＮＡで確認された。特には、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して筋肉から全ＲＮＡを単離し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、米国）及び７，５００ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＰＣＲを行った。実験結果は、β－アクチンｍＲＮＡの量に対して正規化した。この場合、ＲＴ－ｑＰＣＲで使用したプライマーを以下の表６に示す。
【0095】
［表６］
【表6】
【0096】
その結果、ＩＬ－６のｍＲＮＡの発現が、ミトコンドリア移植群の筋肉で減少する傾向が確認された。さらに、ＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現が、５μｇのミトコンドリアを移植した群において有意に減少していることが確認された。一方、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現が、陽性対照群（ＤＥＸＡ）の筋肉では減少しておらず、ミトコンドリア移植群は、ＩＬ－６及びＴＮＦ－αのｍＲＮＡの発現を減少させる効果に関して、陽性対照群（ＤＥＸＡ）よりも効果的であったことが確認された（図２１）。
【0097】
実施例６．４．ミトコンドリアの酸化的リン酸化複合体の発現の変化の確認
対照群、陰性対照群（ＣＩＭ）、陽性対照群（ＤＥＸＡ）、実験群（ミトコンドリア移植群）の各群のマウスの筋肉から単離されたタンパク質における酸化的リン酸化複合体の発現の変化は、ウエスタンブロッティングにより確認された（全ＯＸＰＨＯＳマウスＷＢ抗体カクテル、ａｂｃａｍ）。酸化的リン酸化複合体Ｉ及びＩＩの発現が、対照群と比較して陰性対照群（ＣＩＭ）で減少しており、酸化的リン酸化複合体Ｉ及びＩＩの発現が、陽性対照群（ＤＥＸＡ）と比較して、実験群（ミトコンドリア移植群）で全ての投与量において増加していることが確認された（図２２）。
対照群、陰性対照群（ＣＩＭ）、陽性対照群（ＤＥＸＡ）、実験群（ミトコンドリア移植群）の各群のマウスの筋肉から単離されたタンパク質における酸化的リン酸化複合体の発現の変化は、ウエスタンブロッティングにより確認された（全ＯＸＰＨＯＳマウスＷＢ抗体カクテル、ａｂｃａｍ）。酸化的リン酸化複合体Ｉ及びＩＩの発現が、対照群と比較して陰性対照群（ＣＩＭ）で減少しており、酸化的リン酸化複合体Ｉ及びＩＩの発現が、陽性対照群（ＤＥＸＡ）と比較して、実験群（ミトコンドリア移植群）で全ての投与量において増加していることが確認された（図２２）。
【0098】
結論として、５μｇのミトコンドリアの移植の治療効果及び投与量依存性が、ＣＩＭマウスモデルにおいて確認された。
【0099】
ＩＶ．ミトコンドリアを含む組成物の毒性及び物理的特性の確認
実施例７．毒性実験
ミトコンドリア投与に際して毒性が示されることを確認するため、調製例１で調製したミトコンドリアをＩＣＲマウスに１回静脈内投与した後、剖検等により体重の変化や臓器の変化を確認した。１２匹の雄及び雌の７週齢のＩＣＲマウスを以下の表７に示すように４つのグループに分け、実験を行った。
実施例７．毒性実験
ミトコンドリア投与に際して毒性が示されることを確認するため、調製例１で調製したミトコンドリアをＩＣＲマウスに１回静脈内投与した後、剖検等により体重の変化や臓器の変化を確認した。１２匹の雄及び雌の７週齢のＩＣＲマウスを以下の表７に示すように４つのグループに分け、実験を行った。
【0100】
［表７］
【表7】
【0101】
上記の表７に示すように、Ｇ１グループには賦形剤を投与した。Ｇ２からＧ４グループには、２５μｇ、５０μｇ、又は１００μｇのミトコンドリアをそれぞれ投与した。このとき、Ｇ４グループには、ミトコンドリアを近似致死投与量（ＡＬＤ）以上の量で投与した。この時点で、投与部位を７０％アルコール綿で消毒し、その後、賦形剤又はミトコンドリアを１ｍＬ／ｍｉｎの速度で尾静脈から２６ゲージの注射針を備えたシリンジを用いて投与した。
【0102】
まず、全てのマウスで１日１回以上一般症状を観察し、飼育期間中の死亡を含む一般症状の種類及び程度を各対象について記録した。しかしながら、投与日においては、投与後１時間まで観察を続け、その後、１時間間隔で５時間観察を行った。瀕死の動物及び死亡した動物を計画した剖検動物に従って処置した。賦形剤又はミトコンドリアの投与開始日を１日目に設定した。
【0103】
一般症状を観察した結果、全試験期間中、全ての群で死亡動物は観察されず、ミトコンドリア投与後１日目に観察された異常症状は、その後の試験期間中に観察されなかったため、それはミトコンドリアによって引き起こされた一時的な変化と考えられる。さらに、投与前、投与後２日目、４日目、８日目、１５日目に、全てのマウス対象の体重を測定した。測定結果を以下の表８に示す。
【0104】
［表８］
【表8】
【0105】
表８に示すように、Ｇ１群からＧ４群において、体重に有意な変化は見られなかった。さらに、１５日目に全てのマウス対象を麻酔し、腹部を切り開いて全ての臓器を目視検査した。その結果、Ｇ１群からＧ４群においては臓器の変化は観察されなかった。
【0106】
以上の結果から、これらの試験条件下でＩＣＲマウスにおいて、ミトコンドリアの単回静脈内投与を行ったところ、１００μｇ／頭までのミトコンドリアの濃度で雄及び雌の両方ともに毒性を示さないことが確認された。
【0107】
実施例８．臍帯由来の凍結保存幹細胞から単離されたミトコンドリアと臍帯由来の培養幹細胞から単離されたミトコンドリアの特性の比較
臍帯由来の間葉系幹細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬアンピシリンを含むアルファ－ＭＥＭ培地に接種し、７２時間培養した。培養細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＴＥ）で処理して細胞を得た。血球計算器を用いて１×１０７細胞／ｍＬの濃度で得られた細胞を再懸濁し、凍結チューブに入れ、凍結保存容器に移し、その後、－８０℃で２４時間凍結し、液体窒素凍結保存バンクに保存した。臍帯由来の凍結保存幹細胞から単離したミトコンドリアは、上記の調製例１と同様の方法で単離し、ＡＴＰ活性、膜電位、及びミトコンドリア活性酸素種の特性に関して、調製例１で単離された培養細胞由来のミトコンドリアと比較した。
臍帯由来の間葉系幹細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬアンピシリンを含むアルファ－ＭＥＭ培地に接種し、７２時間培養した。培養細胞を０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（ＴＥ）で処理して細胞を得た。血球計算器を用いて１×１０７細胞／ｍＬの濃度で得られた細胞を再懸濁し、凍結チューブに入れ、凍結保存容器に移し、その後、－８０℃で２４時間凍結し、液体窒素凍結保存バンクに保存した。臍帯由来の凍結保存幹細胞から単離したミトコンドリアは、上記の調製例１と同様の方法で単離し、ＡＴＰ活性、膜電位、及びミトコンドリア活性酸素種の特性に関して、調製例１で単離された培養細胞由来のミトコンドリアと比較した。
【0108】
その結果、臍帯由来の凍結保存幹細胞から単離されたミトコンドリアと臍帯由来の培養幹細胞から単離されたミトコンドリアとの間のＡＴＰ合成能力を比較するために、基質（ＡＤＤＰ）が加えられ、ＡＴＰ活性が、基礎エネルギー代謝と比較して、両方の条件で同様の比率に回復したことを確認した。さらに、両方の条件において膜電位活性が類似しており、ミトコンドリアの活性酸素種の生成も類似していることが確認された（図２８～３０）。
【0109】
実施例９．粒子カウンターを使用したミトコンドリアの数の測定
調製例１で単離されたヒト臍帯由来の間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアの各溶液を、１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、及び５μｇ／ｍＬの濃度で調製し、次いで、ミトコンドリアの数を粒子カウンター（Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ４ｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により測定した。このとき、各濃度について２回測定し、下記の表９及び図３１～３３に測定結果を示す。
調製例１で単離されたヒト臍帯由来の間葉系幹細胞から単離されたミトコンドリアの各溶液を、１μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、及び５μｇ／ｍＬの濃度で調製し、次いで、ミトコンドリアの数を粒子カウンター（Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ４ｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により測定した。このとき、各濃度について２回測定し、下記の表９及び図３１～３３に測定結果を示す。
【0110】
［表９］
【表9】
【0111】
Ｖ．インビトロでのミトコンドリアによる抗炎症効果の確認
実施例１０． ＲＡＷ２６４．７細胞における、いくつかの種類の細胞に由来するミトコンドリアによる定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用した抗炎症活性の比較
実施例２、実施例３、実施例４、及び実施例７の方法により様々な細胞から得られたミトコンドリアによる抗炎症活性を比較し、分析するために、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用する細胞ベースの分析実験を行った。
実施例１０． ＲＡＷ２６４．７細胞における、いくつかの種類の細胞に由来するミトコンドリアによる定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用した抗炎症活性の比較
実施例２、実施例３、実施例４、及び実施例７の方法により様々な細胞から得られたミトコンドリアによる抗炎症活性を比較し、分析するために、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用する細胞ベースの分析実験を行った。
【0112】
マウス由来のマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。約３×１０５細胞／ウェルを６ウェルプレートに接種し、２４時間培養した後、ＦＢＳが除去されたＤＭＥＭ培地における欠乏状態を約２４時間の間、維持させた。
【0113】
２４時間後、１μｇ／ｍＬの濃度のサルモネラ由来リポ多糖（ＬＰＳ）で６時間処理し、マクロファージ細胞株に炎症反応を誘導した。６時間のリポ多糖処理後、細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、その後、各細胞から得られたミトコンドリアで処理し、さらに１８時間培養した。この場合、陰性対照群はリポ多糖とミトコンドリアで処理されていない群であり、陽性対照群は１μｇ／ｍＬの濃度のリポ多糖のみで処理した群である。さらに、実験群は１μｇ／ｍＬの濃度のリポ多糖で処理され、６時間後、３０μｇの量の骨髄由来の間葉系幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）、臍帯由来の間葉幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）、ラット筋芽細胞（Ｌ６筋芽細胞）、及びヒト肺由来の線維芽細胞（ＣＣＤ－８ＬＵ）から得られたミトコンドリアでそれぞれ処理された。
【0114】
１８時間のミトコンドリア処理後、培養液を除去し、ＰＢＳ緩衝液を細胞に加えて細胞を２回洗浄し、０．５ｍＬのＲＮＡ抽出物（Ｔｒｉｚｏｌ試薬、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を直接加え、その後、１０分間、周囲温度に放置した。次に、０．１ｍＬのクロロホルムを加えて１５秒間撹拌し、約１２０００×ｇで１０分間遠心分離した。
【0115】
分離した上澄み液を取得し、同量のイソプロピルアルコールを加え、その後、１２０００×ｇで１０分間遠心分離した。その後、液体を除去し、７５％エタノールを用いて１回洗浄し、周囲温度で乾燥させた。乾燥後、約５０μＬのＲＮＡａｓｅフリー精製蒸留水を加え、得られたＲＮＡの量と純度を、分光光度計を使用して測定した。
【0116】
得られたＲＮＡを使用してｃＤＮＡを合成するために、２μｇの精製全ＲＮＡをオリゴｄＴと７０℃で５分間結合反応させた後、１０Ｘ逆転写緩衝液、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、ＲＮＡｓｅ阻害剤、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）を加え、４２℃で６０分間ｃＤＮＡ合成反応を行った。
【0117】
ｃＤＮＡ合成反応が完了した後、７２℃で５分間加熱することにより逆転写酵素を失活させ、その後、ＲＮａｓｅ Ｈを加えて一本鎖ＲＮＡを除去し、最終的なｃＤＮＡを取得した。炎症反応の特徴的な遺伝子であるＴＮＦ－α遺伝子、ＩＬ－１β遺伝子、及びＩＬ－６遺伝子の発現変化は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって観察された。ＧＡＰＤＨ遺伝子は、発現の差異を較正するためにそれらの遺伝子と共に定量化された。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応で使用される遺伝子の塩基配列は、以下の表１０に記載されているとおりである。
【0118】
［表１０］
【表10】
【0119】
実験結果に示されるように、マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞をリポ多糖で処理すると、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６遺伝子の発現が増加することがわかった。さらに、骨髄由来の間葉系幹細胞、臍帯由来の間葉系幹細胞、ラット筋芽細胞、ヒト肺由来の線維芽細胞から得られたミトコンドリアで処理した場合、リポ多糖によって誘導されるＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、及びＩＬ－６遺伝子の発現が有意なレベルまで阻害されることが確認された。以上のことから、本発明で使用した細胞から得られたミトコンドリアは、著しく優れた抗炎症活性を示すことが確認された（図３４）。
【0120】
実施例１１．ヒト単核細胞（ＴＨＰ－１）中のいくつかの種類の細胞に由来するミトコンドリアによる抗炎症活性の比較
ヒト由来単核細胞であるＴＨＰ－１細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で培養した。４×１０５細胞／ウェルを２４ウェルプレートに接種し、１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で１５～１６時間培養した。
ヒト由来単核細胞であるＴＨＰ－１細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で培養した。４×１０５細胞／ウェルを２４ウェルプレートに接種し、１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で１５～１６時間培養した。
【0121】
細胞を２μｇ／ｍＬの濃度のサルモネラ由来リポ多糖（ＬＰＳ）で６時間処理し、ＴＨＰ－１細胞株に炎症反応を誘導した。６時間のリポ多糖処理後、各々の細胞から得られたミトコンドリアで細胞を処理し、２４時間さらに処理した。この場合、陰性対照群は、リポ多糖及びミトコンドリアで処理されていない群であり、陽性対照群は、２μｇの濃度のリポ多糖で処理された群である。さらに、実験群は２μｇ／ｍＬの濃度のリポ多糖で処理され、６時間後に、実施例２、実施例４、実施例５、及び実施例６の方法により得られた臍帯由来の間葉系幹細胞（ＵＣ－ＭＳＣ）、ヒト肺由来の線維芽細胞（ＣＣＤ－８ＬＵ）、ヒト人工多能性幹細胞（ＩＰＳ）、及びブタ血小板から得られたミトコンドリアを、それぞれ４０μｇの量で処理された。反応後の抗炎症活性を比較するために、細胞を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に使用し、培養液をＥＬＩＳＡに使用した。
【0122】
実施例１１．１定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を使用した抗炎症活性の比較
その後、培養液を除去し、ＰＢＳ緩衝液を細胞に加えて２回洗浄し、ＲＮＡ抽出物（Ｔｒｉｚｏｌ試薬、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）０．５ｍＬを直接加えた。周囲温度で１０分間静置した後、０．１ｍＬのクロロホルムを加え、１５秒間撹拌した後、１２０００×ｇで１０分間遠心分離した。分離した上清を取り、同量のイソプロピルアルコールを加え、１２０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を除去し、７５％エタノールで１回洗浄し、周囲温度で乾燥させた。
その後、培養液を除去し、ＰＢＳ緩衝液を細胞に加えて２回洗浄し、ＲＮＡ抽出物（Ｔｒｉｚｏｌ試薬、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）０．５ｍＬを直接加えた。周囲温度で１０分間静置した後、０．１ｍＬのクロロホルムを加え、１５秒間撹拌した後、１２０００×ｇで１０分間遠心分離した。分離した上清を取り、同量のイソプロピルアルコールを加え、１２０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上清を除去し、７５％エタノールで１回洗浄し、周囲温度で乾燥させた。
【0123】
５０μＬのＲＮＡａｓｅフリー精製蒸留水を加え、得られたＲＮＡの量及び純度を分光光度計で測定した。ｃＤＮＡを合成するために、２μｇの精製全ＲＮＡをオリゴｄＴとの５分間、７０℃の結合反応に供し、その後、１０Ｘ逆転写緩衝液、１０ｍＭ ｄＮＴＰ、ＲＮＡｓｅ阻害剤、及びＭ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）を加え、ｃＤＮＡ合成反応を４２℃で６０分間行った。反応後、７２℃で５分間加熱することにより逆転写酵素を失活させ、次いで、ＲＮａｓｅ Ｈを加え、一本鎖ＲＮＡを除去して、ｃＤＮＡを得た。
【0124】
以下の表１１に示すプライマーを使用して定量的ポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＲＴ－ＰＣＲ）を行い、炎症性サイトカインの発現が変化したか否かを決定した。この場合、補正遺伝子として１８Ｓを用いた定量で、発現の差を補正した。
【0125】
［表１１］
【表11】
【0126】
実験結果に示されるように、ヒト単核細胞であるＴＨＰ－１細胞をリポ多糖で処理した場合、ＩＬ－６遺伝子の発現が増加することがわかった。さらに、臍帯由来の間葉系幹細胞、ヒト肺由来の線維芽細胞、ヒト人工多能性幹細胞、及びブタ血小板から得られたミトコンドリアで処理した場合、リポ多糖で誘導されるＩＬ－６遺伝子の発現が、有意なレベルで阻害されることが確認された。以上のことから、様々な細胞から得られたミトコンドリアは、著しく優れた抗炎症活性を示すことが確認された（図３５、＊ Ｐ＜０．０５）。
【0127】
実施例１１．２．ＥＬＩＳＡ法を使用した抗炎症活性の比較
得られた上清でＴＨＰ－１細胞の炎症性サイトカインであるＩＬ－６の発現量を確認するために、ヒトＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造業者のマニュアルに従って実験を行った。
得られた上清でＴＨＰ－１細胞の炎症性サイトカインであるＩＬ－６の発現量を確認するために、ヒトＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造業者のマニュアルに従って実験を行った。
【0128】
１００μＬのコーティング溶液を９６ウェルプレートに入れ、周囲温度で一晩反応させ、３回洗浄し、次いで試薬希釈液と周囲温度で１時間反応させ、３回洗浄した。１０倍希釈した上清と標準溶液を周囲温度で２時間反応させ、次いで、３回洗浄した後、各ウェルを標識抗体（検出抗体）で処理した後、周囲温度で２時間反応させた。３回洗浄した後、ストレプトアビジン溶液（ストレプトアビジン－ＨＲＰ）を周囲温度で２０分間反応させ、次いで、３回洗浄した後、暗室内、周囲温度で２０分間カラー溶液（基質溶液）と反応させた後、反応停止溶液を加え、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【0129】
実験結果に示されるように、ヒト単核細胞であるＴＨＰ－１細胞をリポ多糖で処理した場合、ＩＬ－６タンパク質が増加することがわかった。さらに、臍帯由来の間葉系幹細胞、ヒト肺由来の線維芽細胞、ヒト人工多能性幹細胞、及びブタ血小板から得られたミトコンドリアで処理した場合、リポ多糖で誘導されるＩＬ－６タンパク質が、有意なレベルで阻害されることが確認され、このことは遺伝子発現の結果と一致していた。以上のことから、様々な細胞から得られたミトコンドリアは、著しく優れた抗炎症活性を示すことが確認された（図３６、＊Ｐ＜０．０５）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-12-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ミトコンドリアを有効成分として含む、筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項2】
ミトコンドリアが細胞又は組織から単離される、請求項１に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項3】
ミトコンドリアがインビトロで培養された細胞から単離される、請求項２に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項4】
細胞が、体細胞、生殖細胞、幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項２に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項5】
体細胞が、筋細胞、肝細胞、神経細胞、線維芽細胞、上皮細胞、脂肪細胞、骨細胞、白血球、リンパ球、血小板、又は粘膜細胞及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項４に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項6】
生殖細胞が、精子、卵子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項４に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項7】
幹細胞が、間葉系幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞、輪部幹細胞、組織由来の幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項４に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項8】
間葉系幹細胞が、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、胎盤、滑液、精巣、骨膜、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つから得られる、請求項７に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項9】
ミトコンドリアが、医薬組成物に対して、０．１μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬの濃度で含まれる、請求項１に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項10】
ミトコンドリアが、医薬組成物に対して、１×１０５～５×１０８ミトコンドリア／ｍＬの含有量で含まれる、請求項１に記載の筋炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、筋炎を予防又は治療するための方法。
【請求項12】
筋炎を予防又は治療するための医薬の製造のための、単離されたミトコンドリアの使用。
【国際調査報告】