特表 2022-530241 ＣＤＫ阻害剤と組み合わせたＲＡＮＫ経路阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-28

(54)【発明の名称】ＣＤＫ阻害剤と組み合わせたＲＡＮＫ経路阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20220621BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220621BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220621BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20220621BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20220621BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220621BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20220621BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20220621BHJP

   A61K 31/4196 20060101ALI20220621BHJP

   A61K 31/565 20060101ALI20220621BHJP

   A61K 31/138 20060101ALI20220621BHJP

   C07D 471/04 20060101ALN20220621BHJP

   C07D 487/04 20060101ALN20220621BHJP

   C07D 401/14 20060101ALN20220621BHJP

   C07D 498/18 20060101ALN20220621BHJP

   C07D 249/08 20060101ALN20220621BHJP

   C07J 31/00 20060101ALN20220621BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220621BHJP

   C07K 16/24 20060101ALN20220621BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20220621BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220621BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20220621BHJP

【ＦＩ】

A61K45/06

A61P43/00 121

A61K39/395 D

A61K31/519

A61K31/506

A61P35/00

A61P35/04

A61K31/436

A61K31/4196

A61K31/565

A61K31/138

A61K39/395 N

C07D471/04 118Z

C07D487/04 140

C07D401/14

C07D498/18

C07D249/08 534

C07J31/00

C12N15/13 ZNA

C07K16/24

C07K16/28

C12N15/12

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021564120

(86)(22)【出願日】2020-04-24

(85)【翻訳文提出日】2021-10-26

(86)【国際出願番号】 PT2020050017

(87)【国際公開番号】W WO2020222668

(87)【国際公開日】2020-11-05

(31)【優先権主張番号】115483

(32)【優先日】2019-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT

(31)【優先権主張番号】62/840,810

(32)【優先日】2019-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521468947

【氏名又は名称】インスチトゥート デ メディシーナ モリクラール ジョアン ロボ アントゥネス

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ダ コスタ， ルイス アントニオ マルケス

(72)【発明者】

【氏名】デ アンジョ カシミロ， サンドラ クリスティナ カラ

【テーマコード（参考）】

4C050

4C063

4C065

4C072

4C084

4C085

4C086

4C091

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C050AA01

4C050BB04

4C050CC08

4C050EE03

4C050FF03

4C050GG04

4C050HH04

4C063AA03

4C063BB09

4C063CC29

4C063DD12

4C063EE01

4C065AA04

4C065BB10

4C065CC01

4C065DD03

4C065EE02

4C065HH02

4C065HH04

4C065HH09

4C065JJ04

4C065KK01

4C065LL07

4C065PP04

4C065PP12

4C065PP15

4C072AA03

4C072BB03

4C072CC01

4C072CC12

4C072DD07

4C072EE09

4C072FF15

4C072GG07

4C072HH01

4C072UU01

4C084AA20

4C084AA24

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZB26

4C084ZC75

4C085AA13

4C085AA14

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC46

4C086BC50

4C086BC60

4C086CB05

4C086CB09

4C086CB22

4C086DA09

4C086GA02

4C086GA07

4C086GA08

4C086GA12

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZC75

4C091AA01

4C091BB03

4C091BB04

4C091BB07

4C091CC01

4C091DD01

4C091EE04

4C091FF03

4C091FF06

4C091GG01

4C091HH01

4C091JJ01

4C091KK01

4C091LL01

4C091MM03

4C091NN01

4C091PA02

4C091PA09

4C091QQ01

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA23

4C206MA02

4C206MA03

4C206MA04

4C206MA14

4C206MA17

4C206NA05

4C206ZB26

4C206ZC75

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045FA74

(57)【要約】

ｉ）ＲＡＮＫ経路阻害剤をｉｉ）ＣＤＫ阻害剤と組み合わせて含む医薬組成物及び関連する方法が本明細書で提供される。ＣＤＫ阻害剤による治療に対する癌細胞の反応性又は感受性を増加又は回復させる方法と、ＣＤＫ阻害剤による治療に対する耐性又は低減された感受性を有する対象を治療する方法とが本明細書で提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）ＲＡＮＫ経路阻害剤をｉｉ）ＣＤＫ阻害剤と組み合わせて含む医薬組成物。

【請求項2】

前記ＲＡＮＫ経路阻害剤は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）との間の結合相互作用を阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記ＲＡＮＫ経路阻害剤は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、そのＲＡＮＫＬ結合断片又はＲＡＮＫ若しくはＲＡＮＫＬに結合する抗原結合タンパク質を含む、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記抗原結合タンパク質は、抗ＲＡＮＫ抗体又は抗ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超えるものを含むＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は単鎖Ｆｖである、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記抗原結合タンパク質は、ＲＡＮＫＬに結合する、請求項３～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記抗原結合タンパク質は、
ａ．配列番号８の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、
ｂ．配列番号９の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、
ｃ．配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、
ｄ．配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、
ｅ．配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、
ｆ．配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、又は
ｇ．（ａ）～（ｆ）の任意の２つ以上の組み合わせ
を含む、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記抗原結合タンパク質は、
（Ａ）軽鎖可変ドメインであって、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｉｉ）配列番号１９を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｉｉｉ）配列番号１９からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン、又は
（Ｂ）重鎖可変ドメインであって、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸或いは配列番号２に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む重鎖可変ドメイン、
（ｉｉ）配列番号２０を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
（ｉｉｉ）配列番号２０からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
からなる群から選択される重鎖可変ドメイン、又は
（Ｃ）（Ａ）の軽鎖可変ドメイン及び（Ｂ）の重鎖可変ドメイン
を含む、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記変異体配列は、前記配列番号に対して少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％又は少なくとも若しくは約９５％の配列同一性を有する、請求項７又は８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記抗原結合タンパク質は、任意選択的にカッパ軽鎖を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４抗体である、請求項３～９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項３～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項３～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記抗原結合タンパク質は、
（Ａ）軽鎖であって、
（ｉ）配列番号３又は配列番号１３のアミノ酸配列或いは配列番号３又は１３に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む軽鎖、
（ｉｉ）配列番号２１又は２３を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｉｉｉ）配列番号２１又は２３からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖
からなる群から選択される軽鎖、又は
（Ｂ）重鎖であって、
（ｉ）配列番号４又は配列番号１４のアミノ酸配列或いは配列番号４又は１４に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む重鎖、
（ｉｉ）配列番号２２又は２４を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖、
（ｉｉｉ）配列番号２２又は２４からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖
からなる群から選択される重鎖、又は
（Ｃ）（Ａ）の軽鎖及び（Ｂ）の重鎖
を含む、請求項３～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号５、６、７、８、９及び１０のアミノ酸配列を含む、請求項３～１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列及び配列番号２８のアミノ酸配列を更に含む、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項３～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列及び配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項３～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤、任意選択的にセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）３Ａ阻害剤又は両方である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質のリン酸化を阻害する、請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、構造Ｉ又は構造ＩＩ：

【化8】

の構造を含む、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、構造Ｉ又は構造ＩＩの構造を含み、且つＡ－Ｂの構造を更に含み、ここで、Ａは、二環式構造を含み、及びＢは、単環式構造を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

Ａ－Ｂは、構造ＩＩＩ、又は構造ＩＶ、又は構造Ｖ：

【化9】

の構造を含む、請求項２２に記載の医薬組成物。

【請求項24】

構造ＩＩＩ又はＩＶのＢは、シクロペンタンである、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

構造ＶのＢは、ピリミジンを含む、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項26】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、

【化10】

の構造又はその薬学的に許容される塩を含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項27】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、

【化11】

の構造又はその薬学的に許容される塩を含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項28】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、

【化12】

の構造又はその薬学的に許容される塩を含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項29】

前記ＣＤＫ阻害剤は、前記ＲＡＮＫ経路阻害剤とは別にパッケージ化される、請求項１～２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項30】

ホルモン療法剤を更に含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項31】

アロマターゼ阻害剤、ＥＲ標的剤、ラパマイシン若しくはラパマイシン類似体、抗ＨＥＲ２薬剤又はＰＩ３Ｋ阻害剤を更に含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項32】

前記アロマターゼ阻害剤は、レトロゾール、アナストロゾール又はエキセメスタンである、請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項33】

前記ラパマイシン類似体は、エベロリムス、テムシロリムス、リダホロリムス、ゾタロリムス及び３２－デオキソ－ラパマイシンである、請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項34】

前記ＥＲ標的剤は、フルベストラント又はタモキシフェンである、請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項35】

前記抗ＨＥＲ２薬剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、Ｔ－ＤＭ１又はネラチニブである、請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項36】

前記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、タセリシブ、アルペリシブ又はブパルリシブである、請求項３１に記載の医薬組成物。

【請求項37】

（Ａ）ＣＤＫ阻害剤による治療に対する癌細胞の反応性又は感受性を増加又は回復させること、（Ｂ）癌を患う対象を治療することであって、任意選択的に、前記癌は、ＣＤＫ阻害剤による治療に対して低減された反応性を示すか、又は前記対象は、ＣＤＫ阻害剤で治療されるか若しくは治療されている、治療すること、（Ｃ）対象における転移癌の発生又は発症を遅延させること、（Ｄ）対象における腫瘍成長若しくは腫瘍量を低減させるか、又は腫瘍退縮を増加させることであって、任意選択的に、前記対象は、ＣＤＫ阻害剤で治療されるか又は治療されている、低減又は増加させること、（Ｅ）癌を患う対象において、無進行生存期間、全生存又は米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態が悪化するまでの時間を増加させることであって、任意選択的に、前記癌は、ＣＤＫ阻害剤に対して耐性であるか、又は低減された感受性を示す、増加させること、（Ｆ）対象における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルを低減させること、或いは（Ｇ）これらの任意の組み合わせを行う、請求項１～３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項38】

ＣＤＫ阻害剤による治療に対する癌細胞の反応性又は感受性を増加又は回復させること、対象における癌を治療すること、癌を患う対象における転移癌の発生又は発症を遅延させること、対象における腫瘍成長若しくは腫瘍量を低減させるか、又は腫瘍退縮を増加させること、ＣＤＫ阻害剤に対して耐性であるか、又は低減された感受性を有する腫瘍又は癌細胞を有する対象において、無進行生存期間、全生存又は米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態が悪化するまでの時間を増加させること、及び／又は対象における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルを低減させることに使用するための、請求項１～３７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項39】

ＣＤＫ阻害剤による治療に対する癌細胞の反応性又は感受性を増加又は回復させる方法であって、ＣＤＫ阻害剤で治療されるか又は治療されている対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む方法。

【請求項40】

ＣＤＫ阻害剤による治療に対する癌細胞の反応性又は感受性を増加又は回復させる方法であって、任意選択的にＣＤＫ阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む方法。

【請求項41】

ＣＤＫ阻害剤で治療されるか又は治療されている対象において癌を治療する方法であって、任意選択的に前記ＣＤＫ阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項42】

ＣＤＫ阻害剤による治療に対して低減された反応性を有する癌を患う対象を治療する方法であって、任意選択的に前記ＣＤＫ阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項43】

癌を患う対象を治療する方法であって、（ｉ）前記癌の細胞は、ＲＡＮＫ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６若しくはサイクリンＤの１つ以上を過剰発現させるか、（ｉｉ）前記対象は、増加したレベルの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を有するか、又は（ｉｉｉ）これらの組み合わせであり、前記方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項44】

癌を患う対象における転移癌の発生又は発症を遅延させる方法であって、前記対象は、ＣＤＫ阻害剤で治療されるか又は治療されており、前記方法は、前記対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む、方法。

【請求項45】

癌を患う対象における転移癌の発生又は発症を遅延させる方法であって、任意選択的にＣＤＫ阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項46】

ＣＤＫ阻害剤で治療されるか又は治療されている対象における腫瘍成長若しくは腫瘍量を低減させるか、又は腫瘍退縮を増加させる方法であって、前記対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む方法。

【請求項47】

対象における腫瘍成長若しくは腫瘍量を低減させるか、又は腫瘍退縮を増加させる方法であって、任意選択的にＣＤＫ阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項48】

ＣＤＫ阻害剤に対して耐性であるか、又は低減された感受性を有する腫瘍又は癌細胞を有する対象において、無進行生存期間、全生存又は米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態が悪化するまでの時間を増加させる方法であって、任意選択的にＣＤＫ阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項49】

対象における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルを低減させる方法であって、任意選択的にＣＤＫ阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項50】

前記ＲＡＮＫ経路阻害剤及び前記ＣＤＫ阻害剤は、別々に投与される、請求項３８に記載の使用のための医薬組成物又は請求項３９～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記ＲＡＮＫ経路阻害剤及び前記ＣＤＫ阻害剤は、同時に前記対象に投与される、請求項３８に記載の使用のための医薬組成物又は請求項３９～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記ＲＡＮＫ経路阻害剤は、皮下注射を介して前記対象に投与される、請求項３８に記載の使用のための医薬組成物又は請求項３９～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記ＣＤＫ阻害剤は、前記対象に経口投与される、請求項３８に記載の使用のための医薬組成物又は請求項３９～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記ＲＡＮＫ経路阻害剤は、２～６週間毎に１回、任意選択的に４週間毎に１回、前記対象に投与される、請求項３８に記載の使用のための医薬組成物又は請求項３９～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記ＲＡＮＫ経路阻害剤は、２～８ヵ月毎に１回、任意選択的に６ヵ月毎に１回、前記対象に投与される、請求項３９～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ＣＤＫ阻害剤は、前記対象に１日１回投与される、請求項３９～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記対象は、癌を有し、及び前記癌は、ＲＡＮＫ又はＲＡＮＫ－Ｌを発現する細胞を含む、請求項３９～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記対象は、転移癌、切除不可能な腫瘍又はこれらの組み合わせを有する癌を有する、請求項３９～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記対象は、乳癌を有する、請求項３９～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記乳癌は、トリプルネガティブ乳癌である、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記乳癌は、ホルモン受容体（ＨＲ）陽性、ＨＥＲ２陰性である、請求項５９又は６０に記載の方法。

【請求項62】

前記乳癌は、進行性乳癌及び／又は転移性乳癌である、請求項５９又は６０に記載の方法。

【請求項63】

前記対象は、ＣＤＫ阻害剤による治療に対する耐性又は低減された感受性を示すか又は示している、請求項３９～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記ＲＡＮＫ経路阻害剤は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）との間の結合相互作用を阻害する、請求項３９～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記ＲＡＮＫ経路阻害剤は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、そのＲＡＮＫＬ結合断片又はＲＡＮＫ若しくはＲＡＮＫＬに結合する抗原結合タンパク質を含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項66】

前記抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記抗原結合タンパク質は、抗ＲＡＮＫ抗体又は抗ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超えるものを含むＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は単鎖Ｆｖである、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

前記抗原結合タンパク質は、ＲＡＮＫＬに結合する、請求項６５又は６６に記載の方法。

【請求項69】

前記抗原結合タンパク質は、
ａ．配列番号８の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、
ｂ．配列番号９の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、
ｃ．配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、
ｄ．配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、
ｅ．配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、
ｆ．配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、又は
ｇ．（ａ）～（ｆ）の任意の２つ以上の組み合わせ
を含む、請求項６７に記載の方法。

【請求項70】

前記抗原結合タンパク質は、
（Ａ）軽鎖可変ドメインであって、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｉｉ）配列番号１９を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｉｉｉ）配列番号１９からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン、又は
（Ｂ）重鎖可変ドメインであって、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸或いは配列番号２に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む重鎖可変ドメイン、
（ｉｉ）配列番号２０を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
（ｉｉｉ）配列番号２０からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
からなる群から選択される重鎖可変ドメイン、又は
（Ｃ）（Ａ）の軽鎖可変ドメイン及び（Ｂ）の重鎖可変ドメイン
を含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項71】

前記変異体配列は、前記配列番号に対して少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％又は少なくとも若しくは約９５％の配列同一性を有する、請求項６９又は７０に記載の方法。

【請求項72】

前記抗原結合タンパク質は、任意選択的にカッパ軽鎖を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４抗体である、請求項６５～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項６５～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項６５～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記抗原結合タンパク質は、
（Ａ）軽鎖であって、
（ｉ）配列番号３又は配列番号１３のアミノ酸配列或いは配列番号３又は１３に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む軽鎖、
（ｉｉ）配列番号２１又は２３を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｉｉｉ）配列番号２１又は２３からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖
からなる群から選択される軽鎖、又は
（Ｂ）重鎖であって、
（ｉ）配列番号４又は配列番号１４のアミノ酸配列或いは配列番号４又は１４に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む重鎖、
（ｉｉ）配列番号２２又は２４を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖、
（ｉｉｉ）配列番号２２又は２４からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖
からなる群から選択される重鎖、又は
（Ｃ）（Ａ）の軽鎖及び（Ｂ）の重鎖
を含む、請求項６５～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号５、６、７、８、９及び１０のアミノ酸配列を含む、請求項６５～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項６５～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列及び配列番号２８のアミノ酸配列を更に含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項79】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項６５～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記抗原結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列及び配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項81】

前記ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤、任意選択的にセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）３Ａ阻害剤又は両方である、請求項３９～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質のリン酸化を阻害する、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、構造Ｉ又は構造ＩＩ：

【化13】

の構造を含む、請求項８１又は８２に記載の方法。

【請求項84】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、構造Ｉ又は構造ＩＩの構造を含み、且つＡ－Ｂの構造を更に含み、ここで、Ａは、二環式構造を含み、及びＢは、単環式構造を含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

Ａ－Ｂは、構造ＩＩＩ、又は構造ＩＶ、又は構造Ｖ：

【化14】

の構造を含む、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

構造ＩＩＩ又はＩＶのＢは、シクロペンタンである、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

構造ＶのＢは、ピリミジンを含む、請求項８５に記載の方法。

【請求項88】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、

【化15】

の構造又はその薬学的に許容される塩を含む、請求項３９～８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、

【化16】

の構造又はその薬学的に許容される塩を含む、請求項３９～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記ＣＤＫ４／６阻害剤は、

【化17】

の構造又はその薬学的に許容される塩を含む、請求項３９～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記ＣＤＫ阻害剤は、前記ＲＡＮＫ経路阻害剤とは別にパッケージ化される、請求項３９～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記対象にホルモン療法剤を投与することを更に含む、請求項３９～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

アロマターゼ阻害剤、ＥＲ標的剤、ラパマイシン若しくはラパマイシン類似体、抗ＨＥＲ２薬剤又はＰＩ３Ｋ阻害剤を投与することを更に含む、請求項９１に記載の方法。

【請求項94】

前記アロマターゼ阻害剤は、レトロゾール、アナストロゾール又はエキセメスタンである、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

前記ラパマイシン類似体は、エベロリムス、テムシロリムス、リダホロリムス、ゾタロリムス及び３２－デオキソ－ラパマイシンである、請求項９３に記載の方法。

【請求項96】

前記ＥＲ標的剤は、フルベストラント又はタモキシフェンである、請求項９３に記載の方法。

【請求項97】

前記抗ＨＥＲ２薬剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、Ｔ－ＤＭ１又はネラチニブである、請求項９３に記載の方法。

【請求項98】

前記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、タセリシブ、アルペリシブ又はブパルリシブである、請求項９３に記載の方法。

【請求項99】

請求項３９～９８のいずれか一項に記載の方法で使用するための、請求項１～３８又は５０～５４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年４月３０日出願の米国仮特許出願第６２／８４０，８１０号明細書及び２０１９年４月３０日出願のポルトガル国特許出願第１１５４８３号明細書に対する優先権を主張する。

【0002】

電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出されたコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれ、以下のように識別される：２０２０年４月２２日作成の１３０，２１４バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル、ファイル名「５３９７８Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」。

【背景技術】

【0003】

乳癌は、全世界の全悪性腫瘍の約２５％を占め、米国では女性における最も頻度の高い癌である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｒｅｓ ２０１９．Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１９；及びＧｈｏｎｃｈｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｉａｎ Ｐａｃ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ １７：４３－４６（２０１６））。本年度のみでも、２６５，０００件超の浸潤性乳癌の新規症例及び４０，０００件超のこの疾患による死亡例が発生することが推定される（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｒｅｓ ２０１９．Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１９）。

【0004】

そのエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）の状態に基づき、乳癌は、３つのサブタイプの１つに分類される：ホルモン受容体（ＨＲ）陽性、ＨＥＲ２陽性及びトリプルネガティブサブタイプ。これらのサブタイプのうち、ＨＲ陽性乳癌が大部分を占める（Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １２：５４１－５５２（２０１５））。ホルモン療法（「内分泌療法」とも称される）は、ＨＲ陽性乳癌の主要療法と見なされており、これとしては、ロイプロリド、ゴセレリン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、タモキシフェン、トレミフェン及びフルベストラントなどの薬剤による治療が挙げられる。このようなホルモン療法によって達成された長期の成功があるものの、多数の患者は、最終的にホルモン療法に対する耐性を獲得し（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９６：２１０－２１８（２００４））、他の癌治療を必要とする。
乳癌患者治療のためのサイクリン依存性キナーゼ４及び６（ＣＤＫ４／６）阻害剤の出現は、ホルモン療法に対する耐性を示す癌症例が増えてきていることから生じた。ＣＤＫ４／６阻害剤は、細胞周期のＧ１相からＳ相への移行中にサイクリンＤと結合するキナーゼであるＣＤＫ４及びＣＤＫ６の作用を阻害することにより、癌細胞の成長を妨げるように機能するため、こうした薬剤は、有望な薬物の部類を示した。ＣＤＫ４／６阻害剤を対象とする研究により、ＣＤＫ４／６阻害剤で治療した患者の無進行生存期間（ＰＦＳ）の増加が実証されており、これらの治療の治療有効性は、文書によって十分に立証されている。Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１８（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｉｊｃ．３２０２０）及びこの文献で引用される参考文献を参照されたい。その結果、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、乳癌の治療に対する３種類のＣＤＫ４／６阻害剤、すなわちパルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブの使用を認可した。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｆｉｇｕｒｅｓ ２０１９

【非特許文献2】Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１９

【非特許文献3】Ｇｈｏｎｃｈｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｓｉａｎ Ｐａｃ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ １７：４３－４６（２０１６）

【非特許文献4】Ｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ １２：５４１－５５２（２０１５）

【非特許文献5】Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９６：２１０－２１８（２００４）

【非特許文献6】Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ２０１８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

乳癌患者は、過去及び現在も続けて、ＣＤＫ４／６阻害剤で成功裏に治療されているが、全ての患者がこれらの薬剤に好反応を示すわけではなく、腫瘍がＣＤＫ４／６阻害剤に好反応を示した大半の患者は、最終的にこれらの薬剤に対する耐性を形成する。上記のＰａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１８を参照されたい。このため、当技術分野において、ＣＤＫ４／６阻害剤などのＣＤＫ阻害剤に対する耐性を備える患者を含む乳癌患者を治療可能である、新規な医薬組成物に対する必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本明細書では、核因子カッパβの受容体活性化因子（ＲＡＮＫ）の発現レベルがＣＤＫ阻害剤に対する癌細胞の感受性と相関していることと、ＲＡＮＫ経路を阻害することにより、こうした癌細胞をこれらのＣＤＫ阻害剤に対して感受性にすることとを実証するデータが初めて提示される。したがって、本開示は、ｉ）ＲＡＮＫ経路阻害剤をｉｉ）ＣＤＫ阻害剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。例示的な実施形態では、医薬組成物は、ｉ）ＲＡＮＫ経路阻害剤をｉｉ）ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて含む。

【0008】

本開示は、ＣＤＫ阻害剤による治療に対する癌細胞の反応性又は感受性を増加又は回復させる方法であって、任意選択的に、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤である、方法も提供する。例示的な実施形態では、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。

【0009】

更に、対象における癌を治療する方法が本明細書で提供される。例示的な実施形態では、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。

【0010】

癌を患う対象を治療する方法が本明細書で提供される。例示的な態様では、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。任意選択的に、癌は、ＣＤＫ阻害剤による治療に対して低減された反応性を有する。例示的な態様では、（ｉ）癌の細胞は、ＲＡＮＫ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６若しくはサイクリンＤの１つ以上を過剰発現させるか、（ｉｉ）対象は、増加したレベルの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を有するか、又は（ｉｉｉ）これらの組み合わせであり、及び方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。

【0011】

癌を患う対象における転移癌の発生又は発症を遅延させる方法が本明細書で提供される。例示的な実施形態では、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。

【0012】

対象における腫瘍成長若しくは腫瘍量を低減させるか、又は腫瘍退縮を増加させる方法も本明細書で提供される。例示的な実施形態では、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。

【0013】

本開示は、癌を患う対象において、無進行生存期間（ＰＦＳ）、全生存（ＯＳ）又は米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態が悪化するまでの時間を増加させる方法を更に提供する。例示的な実施形態では、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。任意選択的に、癌は、ＣＤＫ阻害剤に対して耐性であるか、又は低減された感受性を有する。

【0014】

対象における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルを低減させる方法が本明細書で更に提供される。例示的な実施形態では、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。

【0015】

上記に関して、例示的態様の癌は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）に対して耐性であるか、又は低減された感受性を示す。例示的な実施形態では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）との間の結合相互作用を阻害する。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、そのＲＡＮＫＬ結合断片又はＲＡＮＫ若しくはＲＡＮＫＬに結合する抗原結合タンパク質を含む。任意選択的に、抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体又は抗ＲＡＮＫ抗体若しくは抗ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくはそれを超えるものを含むＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は単鎖Ｆｖを含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＲＡＮＫＬに結合する。場合により、抗原結合タンパク質は、デノスマブと呼ばれる抗体の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超えるものを含む。様々な場合、抗原結合タンパク質は、配列番号５、６、７、８、９及び１０のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含み、且つ配列番号１６のアミノ酸配列及び配列番号２８のアミノ酸配列を更に含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列及び配列番号４のアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）は、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）３Ａ阻害剤又は両方である。様々な態様では、ＣＤＫ阻害剤は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質のリン酸化を阻害する。いくつかの態様では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤である。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、構造Ｉ又は構造ＩＩ：

【化1】

の構造を含む。

【0016】

様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、構造Ｉ又は構造ＩＩの構造を含み、且つＡ－Ｂの構造を更に含み、ここで、Ａは、二環式構造を含み、及びＢは、単環式構造を含む。例示的な態様では、Ａ－Ｂは、構造ＩＩＩ、又は構造ＩＶ、又は構造Ｖ：

【化2】

の構造を含む。

【0017】

例示的な態様では、構造ＩＩＩ又はＩＶのＢは、シクロペンタンである。例示的な態様では、構造ＶのＢは、ピリミジンを含む。様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、パルボシクリブ、リボシクリブ若しくはアベマシクリブの構造又はその薬学的に許容される塩を含む。

【0018】

様々な場合、医薬組成物は、追加の活性成分、例えば化学療法剤を含む。任意選択的に、医薬組成物は、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール又はエキセメスタン）、ＥＲ標的剤（例えば、フルベストラント又はタモキシフェン）、ラパマイシン、ラパマイシン類似体（例えば、エベロリムス、テムシロリムス、リダホロリムス、ゾタロリムス及び３２－デオキソ－ラパマイシン）、抗ＨＥＲ２薬剤（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、Ｔ－ＤＭ１又はネラチニブ）又はＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、タセリシブ、アルペリシブ又はブパルリシブ）を含む。

【0019】

本明細書に開示される医薬組成物及び方法の更なる実施形態及び態様を下記で提供する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1-1】ＲＡＮＫをコードするレンチウイルスによって形質導入された細胞がＲＡＮＫを安定的に過剰発現することを示すデータを提供する。図１Ａは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した、管腔ＢＣ細胞株（ＭＣＦ－７及びＴ４７Ｄ）及びこれらの誘導されたＲＡＮＫ ＯＥ（過剰発現）クローン中の相対的ＲＡＮＫ ｍＲＮＡ発現のグラフである。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、対照として比較のために並行して試験した。Ｃｔ値は、１８Ｓ遺伝子に対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。図１Ｂは、フローサイトメトリによって評価したＲＡＮＫタンパク質レベルのグラフである。

【図1-2】ＲＡＮＫシグナル伝達経路の活性化を示すデータを提供する。低血清培地中で２４時間後、ＭＣＦ－７及びＴ４７Ｄ細胞又はこれらのＲＡＮＫ過剰発現対応物であるＭＣＦ－７^ＯＥ及びＴ４７Ｄ^ＯＥを１μｇ／ｍＬの可溶性ＲＡＮＫリガンド（ｓＲＡＮＫＬ）で０、５、１０、２０、４０若しくは６０分間（上パネル）又は０、５、１０若しくは２５分間（下パネル）刺激した。細胞溶解物を、指定のタンパク質（ＩκＢα；ＮＫ－κＢ ｐ６５；ＥＲＫ１／２；ＡＫＴ）に対して又はそのリン酸化バージョン（ｐ－ＩκＢα（Ｓｅｒ３２）；ｐ－ＮＫ－κＢ ｐ６５（Ｓｅｒ５３６）；ｐ－ＥＲＫ１／２；ｐ－ＡＫＴ）に対して特異的な抗体を用いてウェスタンブロットした。β－アクチンを負荷対照として用いた。

【図2】（図２Ａ－２Ｂ）ＲＡＮＫ ＯＥ細胞（ＭＣＦ－７^ＯＥ及びＴ４７Ｄ^ＯＥ）の表現型特性を、ＲＡＮＫを過剰発現しないこれらの親対応物と比較して示す、ウェスタンブロットからのデータを提供する。図２Ａは、上皮マーカーβ－カテニンのタンパク質発現の減少並びにＮ－カドヘリン、ビメンチン、Ｓｎａｉｌ及びＳｌｕｇなどの間葉マーカー発現の増加を実証する。図２Ｂは、幹細胞マーカー：ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２のタンパク質発現の増加を実証する。β－アクチンを負荷対照として用いた。 （図２Ｃ）ＲＡＮＫ ＯＥ細胞（ＭＣＦ－７^ＯＥ及びＴ４７Ｄ^ＯＥ）における、その親対応物と比較した球体形成能力（ＳＦＣ）の指標としての、播種された１細胞当たりの球体％のグラフを提供する。接着細胞を非接着性条件下で培養し、７日後に（＞５０μｍの乳房球体の数／播種細胞数）×１００としてＳＦＣ（％）を測定した。

【図3】ＲＡＮＫ過剰発現がフルベストラントに対する感受性を低下させることを示すデータを提供する。細胞を９６ウェルプレートに播種し、７日間フルベストラントに曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果は、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。図３は、フルベストラント濃度の関数としてのＲＦＵ（対照からの％）のグラフである。

【図4】ＲＡＮＫの過剰発現がＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブ）に対する感受性を低下させることと、更にオステオプロテゲリン（ＯＰＧ－Ｆｃ）によるＲＡＮＫ経路遮断が療法に対する感受性を回復させたこととを実証する一連のグラフである。細胞を９６ウェルプレートに播種し、異なる薬剤に７日間曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果は、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。図４の左側の３つのグラフは、ＭＣＦ－７細胞、ＭＣＦ－７^ＯＥ細胞又はパルボシクリブ（上）、リボシクリブ（中）又はアベマシクリブ（下）で処理されたＯＰＧ－Ｆｃで処理されたＭＣＦ－７^ＯＥ細胞のグラフである。図４の右側の３つのグラフは、パルボシクリブ（上）、リボシクリブ（中）又はアベマシクリブ（下）で処理されたＯＰＧ－Ｆｃで処理されたＴ４７Ｄ細胞、Ｔ４７Ｄ^ＯＥ細胞又はＴ４７Ｄ^ＯＥ細胞のグラフである。

【図5】ＲＡＮＫの過剰発現が、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ及びリボシクリブの単体又はフルベストラント若しくはエベロリムスとの組み合わせに対する感受性を低下させることと、更にオステオプロテゲリン（本実施例では完全長ＯＰＧ（ｆｌＯＰＧ）を用いた）が療法に対する感受性を回復させたこととを実証する一連のグラフである。細胞を９６ウェルプレートに播種し、異なる薬剤に７日間曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果は、１アッセイ当たり４つの複製を有する３つの独立したアッセイの平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。図５の上部の４つのグラフは、ＭＣＦ－７細胞、ＭＣＦ－７^ＯＥ細胞又はパルボシクリブ及びフルベストラント（左端）、パルボシクリブ及びエベロリムス（左から２番目）、リボシクリブ及びフルベストラント（左から３番目）若しくはリボシクリブ及びエベロリムス（右端）のいずれかで処理されたＯＰＧで処理されたＭＣＦ－７^ＯＥ細胞のグラフである。図５の下部の４つのグラフは、Ｔ４７Ｄ細胞、Ｔ４７Ｄ^ＯＥ細胞又はパルボシクリブ及びフルベストラント（左端）、パルボシクリブ及びエベロリムス（左から２番目）、リボシクリブ及びフルベストラント（左から３番目）若しくはリボシクリブ及びエベロリムス（右端）のいずれかで処理されたＯＰＧで処理されたＴ４７Ｄ^ＯＥ細胞のグラフである。

【図6】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＴＮＢＣ細胞が、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ及びリボシクリブに対して耐性があることと、ＲＡＮＫ ＫＤ（ノックダウン）が療法に対する感受性を増加させたこととを実証するデータを提供する。図６Ａは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した、対照又はＲＡＮＫ ｓｈＲＮＡでトランスフェクションしたトリプルネガティブＢＣ細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における相対的ＲＡＮＫ ｍＲＮＡ発現のグラフである。Ｃｔ値は、１８Ｓ遺伝子に対して正規化した。図６Ｂは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＴＮＢＣ細胞が、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ（左グラフ）及びリボシクリブ（右グラフ）に対して耐性があることと、ＲＡＮＫ ＫＤが療法に対する感受性を増加させたこととを実証するデータを提供する。細胞を９６ウェルプレートに播種し、７日間パルボシクリブ（左グラフ）又はリボシクリブ（右グラフ）に曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果は、１アッセイ当たり４つの複製を有する３つの独立したアッセイの平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図7】ＯＰＧ－ＦｃによるＲＡＮＫ経路の阻害が、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブに対するＴＮＢＣ細胞株の感受性を増加させることを実証する一連のグラフである。ＴＮＢＣ細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（グラフの左カラム）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（グラフの中央カラム）又はＭＤＡ－ＭＢ－４３６（グラフの右カラム））を９６ウェルプレートに播種し、ＯＰＧ－Ｆｃを用いて又は用いずに、７日間パルボシクリブ（上部行）、リボシクリブ（中央行）又はアベマシクリブ（下部行）に曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果は、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図8】ＣＤＫ４／６阻害剤に応答したサイクリンＤ１／ＣＤＫ４／ＣＤＫ２の上方制御を実証するウェスタンブロットであり、ここで、ＣＤＫ４の上方制御は、ＯＰＧ－Ｆｃを用いたＲＡＮＫ経路遮断によって抑止され、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞の感受性を回復させる。タンパク質発現は、ウェスタンブロットによって評価した。細胞（ＭＣＦ－７又はＭＣＦ－７^ＯＥ）を６ウェルプレートに播種し、パルボシクリブ又はＯＰＧ－Ｆｃを含むパルボシクリブに７２時間（図８Ａ）若しくはＯＰＧ－Ｆｃを含むパルボシクリブに７日間（図８Ｂ）曝露した。β－アクチンを負荷対照として用いて、サイクリンＤ１及びＣＤＫ４の発現の正規化されたレベルを示す（図８Ｃ）。

【図9】ＲＡＮＫ ＯＥ腫瘍がインビボで低下した増殖速度を有することを実証するデータを提供する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの第２胸郭の乳腺脂肪体にＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（親）、ＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）又はＭＣＦ－７ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋及びＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋ＲＦＰ＋細胞（１：１）（ミックス）を植菌した（ｎ＝５／群）。腫瘍植菌後、腫瘍を生物発光によって実験終了まで毎週画像化した（１２週間）。図９Ａは、実験終了時に取られた生物発光の一連の代表的画像である。図９Ｂは、指定された細胞を植菌した後の時間（週）に対してプロットされた全フラックス（ｐ／ｓ）のグラフである。図９Ｃは、指定された細胞を植菌したマウス中の腫瘍のＫｉ６７陽性染色細胞％（免疫比）のグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ又は対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図10】外因性ｓＲＡＮＫＬがＭＣＦ－７^ＯＥ異種移植片成長に影響を及ぼさないことを実証する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの第２胸郭の乳腺脂肪体にＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）細胞を植菌した（ｎ＝３～４／群）。マウスを、４８時間ごとの０．５ｍｇのヒトｓＲＡＮＫＬ（ｓ．ｃ．）又はビヒクル（ＰＢＳ）で処理した。腫瘍植菌後、腫瘍を生物発光によって実験終了まで毎週画像化した（８週間）。図１０Ａは、実験終了時に測定された全フラックス（ｐ／ｓ）のグラフである。図１０Ｂは、ｓＲＡＮＫＬを用いて（＋）又は用いずに（－）処理したマウスから得たＭＣＦ－７ ＯＥ細胞由来腫瘍の、犠牲時点における腫瘍重量のグラフである。図１０Ｃは、ｓＲＡＮＫＬを用いて（＋）又は用いずに（－）処理したマウスから得たＭＣＦ－７ ＯＥ細胞由来腫瘍からのＫｉ６７陽性染色細胞のグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ又は対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図11-1】ＲＡＮＫの過剰発現が循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルを増加させることを実証するデータを提供する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの尾静脈中にＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（親）又はＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）細胞を植菌した（ｎ＝３／群）。腫瘍植菌から２時間後及び実験終了まで毎週、腫瘍を生物発光によって画像化した。図１１Ａは、植菌後（ｐ．ｉ．）２時間、２週間ｐ．ｉ．、４週間ｐ．ｉ．、６週間ｐ．ｉ．又は８週間ｐ．ｉ．における、ＭＣＦ－７親又はＭＣＦ－７ ＯＥ細胞を植菌されたマウスの生物発光の一連の代表的画像である。図１１Ｂは、ＭＣＦ－７又はＭＣＦ－７ ＯＥ細胞由来の腫瘍の全フラックス（ｐ／ｓ）のグラフである。図１１Ｃは、エクスビボ生物発光及び剖検時観察によって評価したマクロ転移の数の表である。図１１Ｄは、骨病変上の全フラックス（ｐ／ｓ）のグラフであり、図１１Ｅは、肺病変上の全フラックス（ｐ／ｓ）のグラフである。図１１Ｆは、フローサイトメトリによって定量化したＣＴＣ細胞（ＧＦＰ＋細胞）のグラフである。ここでは、犠牲時に心穿刺によって血液を回収し、ＣＴＣをフローサイトメトリによって定量化した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用して実施した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ又は対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図11-2】同上。

【図12】管腔ＲＡＮＫ ＯＥ腫瘍がインビボでパルボシクリブ及びフルベストラントに対して耐性があることを実証するデータを提供する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの第２胸郭の乳腺脂肪体にＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（親）、ＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）又はＭＣＦ－７ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋及びＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋ＲＦＰ＋細胞（１：１）（ミックス）を植菌した（ｎ＝３～４／群）。腫瘍植菌後、腫瘍を生物発光によって実験終了まで毎週画像化した。植菌後１２週間で、マウスを腫瘍サイズに基づいたグループに無作為抽出し、２５ｍｇ／Ｋｇ／日のパルボシクリブ（ｐ．ｏ．）（経口強制飼養により）及び１ｍｇ／日のフルベストラント（ｓ．ｃ．）又はビヒクル（０．１Ｍの乳酸ナトリウム（Ｎａ Ｌａｃｔａｔｅ）及び９５％コーン油、５％ＤＭＳＯ）で処理した。図１２Ａは、親、ＲＡＮＫ ＯＥ又はミックス細胞を植菌したマウスの腫瘍の全フラックス（ｐ／ｓ）のグラフである。図１２Ｂは、剖検時に測定した腫瘍重量のグラフである。図１２Ｃは、Ｋｉ６７陽性染色細胞％のグラフである。図１２Ｄは、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定した腫瘍中の相対的サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）ｍＲＮＡ発現のグラフである。Ｃｔ値は、１８Ｓ遺伝子に対して正規化した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ又は対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図13-1】ＲＡＮＫ経路遮断がインビボでＴＮＢＣ異種移植片をパルボシクリブに対して感受性にすることを実証するデータを提供する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの第４腹部の乳腺脂肪体の両側にＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋細胞を植菌した（ｎ＝２／群）。植菌後７週間で、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為抽出し、１週間に２回の１０ｍｇ／ＫｇのＯＰＧ－Ｆｃ（ｉ．ｐ．）、２５ｍｇ／Ｋｇ／日のパルボシクリブ（ｐ．ｏ．）又は組み合わせで治療した。図１３Ａは、実験設計の概略図である。図１３Ｂは、剖検時に測定した腫瘍重量のグラフである。図１３Ｃは、Ｋｉ－６７又はホスホｐＲｂで染色した細胞の画像であり、図１３Ｄは、Ｋｉ６７又はホスホｐＲｂに対して陽性染色された細胞のグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図13-2】同上。

【図13-3】同上。

【図13-4】同上。

【図14】ＲＡＮＫ経路遮断と組み合わせて、ＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）に対するトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ；図１４Ａ）又はエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳癌（図１４Ｂ）の感受性を試験するための進行中のインビボモデルの概略図である。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの第４腹部の乳腺脂肪体の両側にＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋、ＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（親）又はＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）を植菌した（ｎ＝５／群）。腫瘍植菌後、腫瘍を生物発光によって実験終了まで毎週画像化する。腫瘍が約１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為抽出し、実験プロトコルに従って治療する。

【図15】骨再形成、乳腺発達、乳癌発症及び適応免疫におけるＲＡＮＫの役割並びにＲＡＮＫがＥＲ＋ＲＡＮＫ＋乳癌に関与する方法を示す背景図である。

【図16】本研究で従われる方法論を示す。図１６Ａは、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の構成及びＴＣＧＡ内のエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳癌（ＢＣ）又はエストロゲン受容体陰性（ＥＲ－）ＢＣの症例の数を説明する画像である。ＴＣＧＡのＥＲ＋／ＨＥＲ２－陰性ＢＣ症例の数も示される。図１６Ｂは、ＲＡＮＫ過剰発現（ＲＡＮＫ ＯＥ）細胞を作製するために、レンチウイルスベクターにパッケージ化されたＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）ｃＤＮＡと接触するＥＲ＋ＨＥＲ２－ＢＣ細胞の図である。相対的ＲＡＮＫ ｍＲＮＡ発現の測定値は、右側のＭＣＦ－７過剰発現細胞（ＭＣＦ－７^ＯＥ）、Ｔ４７Ｄ過剰発現細胞（Ｔ４７Ｄ^ＯＥ）、これらの親の非形質導入対応物（ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ）及びトリプルネガティブ乳癌細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のグラフに示される。図１６Ｃは、図１６Ｂに記載のＲＡＮＫ ＯＥ細胞又は親細胞を注射され、続いてマウスを撮像された同所移植マウスモデル（上）又は実験的転移モデル（下）の図である。

【図17-1】本コホート中において、高いＲＡＮＫ発現は、５年全生存（ＯＳ）の低下に関連したことと、ＥＲ陰性乳房腫瘍におけるＲＡＮＫ発現がより高くても、全ＥＲ＋乳癌の約５％は、上位２５のＥＲ－陰性腫瘍と同一のＲＡＮＫ発現を有する（７５％Ｑ）こととを裏付けるデータを提供する。図１７Ａは、最適カットオフ（Ｃｕｔ－ｏｆｆ Ｆｉｎｄｅｒソフトウェア）及びログランク検定を用いてプロットした生存曲線を用いて、ＲＡＮＫ発現に基づき二分された、ＴＣＧＡからの女性ＢＣ患者のグラフである。図１７Ｂは、ＥＲ－陰性ＢＣ腫瘍とＥＲ陽性ＢＣ腫瘍とを比較し、且つＥＲ陰性腫瘍の７５Ｑ内で比較した中央ＲＡＮＫ発現のグラフである。結果は、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図17-2】同上。

【図18-1】ＭＣＦ－７^ＯＥ、Ｔ４７Ｄ^ＯＥ及び親非形質導入対応物（ＭＣＦ－７、Ｔ４７Ｄ）の球体／播種細胞％（左カラム）及び球状体面積（中央カラム）を実証するグラフである。右カラムでは、グラフは、４種の細胞タイプのそれぞれに対して可溶性ＲＡＮＫＬ（ｓＲＡＮＫＬ）で刺激したときの面積（９６時間対０時間の倍率変化）を示す。

【図18-2】化学療法抵抗性、ＥＭＴ並びにＲＡＮＫ低発現細胞及びＲＡＮＫ高発現細胞の幹細胞性と関連した、示される遺伝子の発現のグラフである。

【図19】ＥＲ陽性乳癌中のＲＡＮＫ発現とＥＲ陽性腫瘍中のＲＡＮＫ発現との関連性が腫瘍進行に影響を及ぼし得ることを示す図である。

【図20】ＲＡＮＫ ＯＥ細胞が特定のＣＤＫ４阻害剤に対して耐性であることを裏付けるデータを提供する。細胞を９６ウェルプレートに播種し、異なる薬剤、すなわち３－ＡＴＡ（図２０Ａ）又はＣｄｋ４阻害剤ＩＩＩ（図２０Ｂ）に７日間曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果は、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図21】ＲＡＮＫ ＯＥ細胞が、ｐａｎ－ＣＤＫ阻害剤であるセリシクリブに対して耐性があり、セリシクリブが、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブに対して耐性を返さないことを裏付けるデータを提供する。細胞を９６ウェルプレートに播種し、異なる薬剤に７日間曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果は、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図22-1】本研究に含まれる細胞株中のＲＡＮＫ発現を裏付けるデータを提供する。（図２２Ａ）親及びＲＡＮＫ ＯＥ細胞株中のＲＡＮＫのＲＴ－ｑＰＣＲ、（図２２Ｂ）親及びＲＡＮＫ ＯＥ細胞株中のＲＡＮＫのフローサイトメトリ。

【図22-2】同上。

【図23】ＯＰＧ－ＦｃによるＲＡＮＫ経路の阻害が、ｐＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＢＲＣＡ１及びＥＧＦＲの変異状況とは無関係に、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブに対するＴＮＢＣ細胞株の感受性を増加させることを裏付けるデータを提供する。細胞を９６ウェルプレートに播種し、異なる薬剤に７日間曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果は、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図24-1】ＯＰＧ－ＦｃによるＲＡＮＫ経路の阻害が、ｐＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＢＲＣＡ１及びＥＧＦＲの変異状況とは無関係に、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブに対するＴＮＢＣ細胞株の感受性を増加させることを裏付けるデータを提供する。細胞を６ウェルプレートに播種し、異なる薬剤に６日間曝露し、薬剤を含まない培地で６日間回復させた。細胞をクリスタルバイオレットで染色し（図２４Ｂ）、１％ＳＤＳで溶解し、５７０ｎＭで培地の吸光度を測定した（図２４Ａ）。結果は、３つの複製の平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図24-2】同上。

【図25】ＯＰＧ－Ｆｃが細胞増殖に直接の影響を及ぼさないことを裏付けるデータを提供する。細胞を９６ウェルプレートに播種し、７日間ＯＰＧ－Ｆｃに曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果は、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、一方向ＡＮＯＶＡを用いて計算し、ｐ＞０．０５であれば非有意と見なした。

【図26】ＲＡＮＫＬによって誘発されるＲＡＮＫ経路活性化をＯＰＧ－Ｆｃが中和することを裏付けるデータを提供する。タンパク質発現は、ウェスタンブロットによって評価した。細胞を６ウェルプレートに播種し、２４時間血清飢餓状態に置き、示される時点の間、１μｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬに曝露した（図２６Ａ）。ＲＡＮＫＬ中和（図２６Ｂ）のために、ＲＡＮＫＬを３７℃の血清枯渇培地±１００ｎｇ／ｍｌのＯＰＧ－Ｆｃ又は２．５μｇ／ｍｌのＭＡＢ６２６中で６０分間予インキュベートし、６０分後にタンパク質を解析した。β－アクチンを負荷対照として使用し、ＦｉＪｉを用いてバンド強度を定量化した。

【図27】ＲＡＮＫ経路遮断と組み合わせて、ＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）に対するＴＮＢＣの感受性を試験するためのインビボモデルの概略を提供する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの脇腹の両側から皮下植菌した（ｎ＝５／群）。腫瘍をキャリパーで測定する。腫瘍が約１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為抽出し、実験プロトコルに従って治療する。

【図28-1】ＲＡＮＫ経路遮断がインビボでＴＮＢＣ異種移植片をパルボシクリブに対して感受性にすることを裏付けるデータを提供する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの脇腹の両側からＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を皮下植菌した（ｎ＝４～５／群）。植菌後６週間で、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為抽出し、ＯＰＧ－Ｆｃの１０ｍｇ／Ｋｇ（ｉ．ｐ．）３回／週；パルボシクリブ３０ｍｇ／Ｋｇ／日（ｐ．ｏ．）又は組み合わせで処理した。図２８Ａ及び２８Ｂは、２日ごとにキャリパーで測定し、式：Ｔ_ｖｏｌ＝１／２（長さ×幅^２）を用いて計算した腫瘍体積のグラフである。図２８Ｃは、剖検時の腫瘍重量のグラフである。図２８Ｄは、剖検後の臓器の組織病理学的評価後に転移を有するマウス数のグラフである。図２８Ｅは、剖検時に回収された血清中で定量化された破骨細胞特異性ＴＲＡｃＰ ５ｂのグラフである。図２８Ｆは、Ｋｉ６７（左）及びｐ－ｐＲｂ（免疫比）（右）の定量化を示す一対のグラフである。図２８Ｇは、マウスの体重のグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【図28-2】同上。

【図28-3】同上。

【図29】ＲＡＮＫ経路遮断と組み合わせて、ＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）及び内分泌療法（フルベストラント）に対する管腔ＲＡＮＫ ＯＥの感受性を試験するためのインビボモデルの概略を提供する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの脇腹の両側から皮下植菌した（ｎ＝５／群）。腫瘍をキャリパーで測定する。腫瘍が約１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為抽出し、実験プロトコルに従って治療する。

【図30】ＲＡＮＫ経路遮断と組み合わせて、ＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）に対するＴＮＢＣの感受性を試験するためのインビボモデルの概略を提供する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの脇腹の両側から皮下植菌した（ｎ＝５／群）。腫瘍をキャリパーで測定する。腫瘍が約１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為抽出し、実験プロトコルに従って治療する。

【発明を実施するための形態】

【0021】

医薬組成物
本開示は、ｉ）ＲＡＮＫ経路阻害剤をｉｉ）ＣＤＫ阻害剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。例示的な態様では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤である。したがって、本開示は、ｉ）ＲＡＮＫ経路阻害剤をｉｉ）ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。本開示は、ｉ）ＲＡＮＫ経路阻害剤、及びｉｉ）ＣＤＫ４阻害剤若しくはＣＤＫ６阻害剤又はＣＤＫ４阻害剤及びＣＤＫ６阻害剤の両方を含む医薬組成物も提供する。

【0022】

例示的な態様では、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤）は、ＲＡＮＫ経路阻害剤と共にパッケージ化される。例示的な態様では、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤）は、ＲＡＮＫ経路阻害剤と共に製剤化され、その結果、本製剤は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤）及びＲＡＮＫ経路阻害剤の両方を含み、本製剤を投与すると２つの成分が同時に投与される。例示的な態様では、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤）は、ＲＡＮＫ経路阻害剤とは別にパッケージ化される。例示的な態様では、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤）は、ＲＡＮＫ経路阻害剤とは別に製剤化され、その結果、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤）は、ＲＡＮＫ経路阻害剤とは別に投与され得、任意選択的に、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤）は、ＲＡＮＫ経路阻害剤の投与前に投与されるか、又はＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤）は、ＲＡＮＫ経路阻害剤の投与後に投与される。

【0023】

ＲＡＮＫ経路阻害剤
本明細書で使用するとき、用語「ＲＡＮＫ経路阻害剤」とは、ＲＡＮＫＬがＲＡＮＫに結合すると続いて生じるシグナル伝達を低減又は阻害する任意の化合物又は分子を指す。ＲＡＮＫ経路については、Ｂｏｙｃｅ ａｎｄ Ｘｉｎｇ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：９８－１０４（２００７）及びＤａｒｎａｙ ｅｔ ａｌ．，ＴＲＡＦｓ ｉｎ ＲＡＮＫ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｉｎ：Ｍａｄａｍｅ Ｃｕｒｉｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ［インターネット］．Ａｕｓｔｉｎ（ＴＸ）：Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；２０００－２０１３。入手先：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ６２２２／並びにＫｏｈｌｉ ａｎｄ Ｋｏｈｌｉ，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １５（３）：１７５－１８１（２０１１）で精査されており、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＫＬがＲＡＮＫに結合することで、ＮＦκＢ、ＪＮＫ、ｐ３８及び／又はＭＡＰＫシグナル経路の活性化がもたらされる。ＦＥＯ、ＯＦＥ、ＯＤＦＲ、ＯＳＴＳ、ＰＤＢ２、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＣＤ２６５、ＯＰＴＢ７、ＴＲＡＮＣＥＲ及びＬＯＨ１８ＣＲ１としても知られるＲＡＮＫは、破骨細胞及びその前駆体の表面で発現する膜貫通受容体タンパク質である。ＲＡＮＫは、乳腺細胞及び癌細胞によっても発現する（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４０：６９２－６９６（２００６）；Ｃａｓｉｍｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｃｅ ８（５）：ｅ６３１５３（２０１３），ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６３１５３；及びＩｎｆａｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３８：１２（２０１９）。ＲＡＮＫ経路は、乳癌細胞及び前立腺癌細胞の遊走及び侵襲も媒介する（上記のＣａｓｉｍｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＲＡＮＫは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーのメンバーであり、このファミリーの他のメンバーと同様に、４つの細胞外システイン豊富な疑似反復ドメイン（ＣＲＤ）を有する。ＲＡＮＫをコードする遺伝子は、ヒト染色体１８（アームｑ２１．３３）で見出され、ＲＡＮＫのアミノ酸配列は、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のウェブサイトで受託番号ＮＰ＿００３８３０．１（アイソフォーム１前駆体）、ＮＰ＿００１２５７８７８．１（アイソフォーム２前駆体）、ＮＰ＿００１２５７８７９．１（アイソフォーム３前駆体）、ＮＰ＿００１２５７８８０．１（アイソフォーム４前駆体）及びＮＰ＿００１２６５１９７．１（アイソフォーム５前駆体）として見出され得る。ＲＡＮＫのアミノ酸配列は、配列番号２９として本明細書に記載され、対応するｍＲＮＡ配列は、配列番号３０として提供される。ＯＤＦ、ＯＰＧＬ、ｓＯｄｆ、ＣＤ２５４、ＯＰＴＢ２、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＬＧ６Ｂ、ＴＲＡＮＣＥ及びｈＲＡＮＫＬ２としても知られるＲＡＮＫＬは、ＴＮＦサイトカインファミリーのメンバーであり、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）及びＲＡＮＫのリガンドである。ＲＡＮＫＬは、間質細胞及び骨芽細胞並びに乳腺細胞によって発現される。ＲＡＮＫＬは、ＲＡＮＫを発現するヒト上皮癌細胞及びメラノーマ細胞の遊走をトリガする（上記のＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＲＡＮＫＬをコードする遺伝子は、ヒト染色体１３（アームｑ１４．１１）で見出され、ＲＡＮＫのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩウェブサイトで受託番号ＮＰ＿００３６９２．１（アイソフォーム１）及びＮＰ＿１４３０２６．１（アイソフォーム２）として見出され得る。ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列は、配列番号３１として本明細書に記載され、対応するｍＲＮＡ配列は、配列番号３２として提供される。ＲＡＮＫＬがＲＡＮＫに結合すると、ＲＡＮＫの細胞質ドメインは、ＲＡＮＫの３つの細胞質モチーフの１つを介して、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６を含むＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）ファミリーのメンバーと相互作用し、ＮＦκＢ及びＭＡＰＫシグナル伝達経路を活性化する（Ｊｕｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２９０（３９）：２３７３８－２３７５０（２０１５））。ＲＡＮＫＬがＲＡＮＫに結合すると、ＴＡＢ２を動員するＴＲＡＦ６のポリユビキチン化がもたらされ、これが続いてＴＡＫ１の活性化をもたらす。ＴＡＫ１は、下流キナーゼを活性化させ、これがＮＦκＢ、ＪＮＫ及びｐ３８の活性化をもたらして遺伝子の転写を駆動して、破骨細胞の分化をもたらす。ＲＡＮＫＬの結合はまた、ＴＲＡＦ６を介したＳｒｃキナーゼ経路の活性化をもたらし、これが破骨細胞の活性化をもたらす。ＴＲＡＦ６は、シグナル伝達も活性化して、ＮＦＡＴ１ｃの核への転座をもたらし、ここで、ＴＲＡＦ６は、ＮＦκＢ及びＡＰ１と協働する。上記のＤａｒｎａｙ ｅｔ ａｌ．。

【0024】

本明細書で使用するとき、用語「阻害する」及び「低減させる」並びにこれらに由来する語は、必ずしも１００％の又は完全な阻害若しくは抑止又は低減を意味するわけではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する阻害及び／又は低減の様々な程度が存在する。この点において、本開示のＲＡＮＫ経路阻害剤は、ＲＡＮＫ経路の活性を任意の量又はレベルまで低減又は阻害することができる。例示的な実施形態では、ＲＡＮＫ経路阻害剤によって提供される低減又は阻害は、少なくとも又は約１０％の低減又は阻害（例えば、少なくとも又は約２０％の低減又は阻害、少なくとも又は約３０％の低減又は阻害、少なくとも又は約４０％の低減又は阻害、少なくとも又は約５０％の低減又は阻害、少なくとも又は約６０％の低減又は阻害、少なくとも又は約７０％の低減又は阻害、少なくとも又は約８０％の低減又は阻害、少なくとも又は約９０％の低減又は阻害、少なくとも又は約９５％の低減又は阻害、少なくとも又は約９８％の低減又は阻害）である。

【0025】

例示的な実施形態では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）との間の結合相互作用を阻害する。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬとの間の結合相互作用の少なくとも又は約１０％（例えば、結合相互作用の少なくとも又は約２０％、結合相互作用の少なくとも又は約３０％、結合相互作用の少なくとも又は約４０％、結合相互作用の少なくとも又は約５０％、結合相互作用の少なくとも又は約６０％、結合相互作用の少なくとも又は約７０％、結合相互作用の少なくとも又は約８０％、結合相互作用の少なくとも又は約９０％、結合相互作用の少なくとも又は約９５％、結合相互作用の少なくとも又は約９８％）を阻害する。

【0026】

例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）又はそのＲＡＮＫＬ結合断片を含む。ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＲ１、ＯＣＩＦ及びＰＤＢ５としても知られるＯＰＧは、染色体８（アームｑ２４．１２）に位置する遺伝子によってコードされるタンパク質である。これは、破骨細胞形成を阻害するＲＡＮＫＬのデコイ受容体である。ＯＰＧの配列は、ＮＣＢＩウェブサイトで受託番号ＮＰ＿００２５３７．３（アミノ酸２２－４０１である成熟ペプチドである）として入手可能である。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、完全長のＯＰＧ分子（例えば、受託番号ＮＰ＿００２５３７．３のアミノ酸２２－４０１である成熟ＯＰＧペプチド）を含む。様々な場合、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、ＲＡＮＫＬ結合断片を含み、任意選択的に、ＲＡＮＫＬ結合断片は、ＯＰＧのシステイン豊富ドメインを４つのみ含む（Ｄ１～Ｄ４）。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、抗体（任意選択的にＩｇＧ１抗体）のＦｃドメインに融合した、ＲＡＮＫＬ結合断片（例えば、４つのみのＯＰＧのシステイン豊富ドメイン（Ｄ１～Ｄ４））を含む融合タンパク質である。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、Ｂｏｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ９７（３ Ｓｕｐｐｌ）：８８７－８９２（２００３）に記載され、ＡＭＧＮ－０００７と示される阻害剤と同様又は同一である。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、Ｇｅｎｗａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のカタログ番号ＧＱＢ－２１Ｄ１Ｅ９、ＡＢ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）のカタログ番号Ｐ７０１９Ｆ、Ｂｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）のＳＫＵ：ＰＲＯＴＯ００３００－１又はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の製品番号Ｏ９６３１として入手可能な阻害剤などのＯＰＧ－Ｆｃタンパク質である。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、ＩｇＧ１抗体のＦｃドメインに融合した、４つのみのＯＰＧのシステイン豊富ドメイン（Ｄ１～Ｄ４）を含む融合タンパク質である。

【0027】

例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、ＲＡＮＫ又はＲＡＮＫＬに結合する抗原結合タンパク質である。様々な態様における抗原結合タンパク質は、抗体、抗原結合抗体断片又は抗体タンパク質生成物である。本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、重鎖及び軽鎖を含み、且つ可変領域及び定常領域を含む、既知の免疫グロブリンフォーマットを有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアの「Ｙ型」構造であるＩｇＧであり得、各ペアは、１本の「軽」（一般的には分子量が約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（一般的には分子量が約５０～７０ｋＤａ）を有する。抗体は、可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧフォーマットでは、可変領域は、一般に、約１００～１１０又はそれを超えるアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体と実質的に異なる。定常領域は、抗体が免疫系の細胞及び分子を動員することを可能にする。可変領域は、各軽鎖及び重鎖のＮ末端領域からできているが、定常領域は、重鎖及び軽鎖のそれぞれのＣ末端部分からできている。（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４^ｔｈｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９））。

【0028】

抗体のＣＤＲの一般的な構造及び性質が当技術分野において記述されている。簡潔に述べると、抗体骨格において、ＣＤＲは、重鎖及び軽鎖可変領域内に埋め込まれ、それらは、抗原結合及び認識に大きく関与する領域を構成する。可変領域は、通常、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖ＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；ｓｅｅ ａｌｓｏ Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３）、それらは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１～４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と呼ばれている；上記のＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７も参照されたい）中にある。

【0029】

抗体は、当技術分野において公知の任意の定常領域を含み得る。ヒト軽鎖は、ヒト軽鎖カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられるが、これらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が挙げられるが、これらに限定されないサブクラスを有する。本開示の実施形態は、抗体のこうしたクラス又はアイソタイプの全てを含む。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型又はラムダ型軽鎖定常領域、例えばヒトカッパ型又はラムダ型軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型重鎖定常領域、例えばヒトアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型重鎖定常領域であり得る。したがって、例示的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つを含むアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭの抗体である。

【0030】

抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター及びヒトなどによって産生される天然抗体に実質的に類似する配列を含む。この点において、抗体は、哺乳動物抗体、例えばマウス抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体及びヒト抗体などと考えることができる。特定の態様では、抗体は、ヒト抗体である。特定の態様では、抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体である。「キメラ抗体」という用語は、２つ以上の異なる抗体由来のドメインを含有する抗体を指す。キメラ抗体は、例えば、１つの種由来の定常ドメイン及び第２の種由来の可変ドメインを含有することができるか、又はより一般的に少なくとも２つの種由来のアミノ酸配列のストレッチを含有することができる。キメラ抗体は、同じ種内の２つ以上の異なる抗体のドメインを含有することもできる。「ヒト化」という用語は、抗体に関して使用する場合、本来の源の抗体より真のヒト抗体に類似した構造及び免疫機能を有するように操作されている、非ヒト源由来の少なくともＣＤＲ領域を有する抗体を指す。例えば、ヒト化は、マウス抗体などの非ヒト抗体からヒト抗体へのＣＤＲの移植を含むことができる。ヒト化は、非ヒト配列をヒト配列に更に類似させるために選択アミノ酸置換も含むことができる。

【0031】

抗体は、例えば、パパイン及びペプシンなどの酵素により切断して断片にすることができる。パパインは、抗体を切断して、２つのＦａｂ断片及び単一のＦｃ断片を産生する。ペプシンは、抗体を切断して、Ｆ（ａｂ’）_２断片及びｐＦｃ’断片を産生する。本開示の例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、抗体の抗原結合断片である。本明細書で使用するとき、用語「抗原結合抗体断片」は、抗体の抗原に結合することができる抗体の一部分を指し、「抗原結合断片」又は「抗原結合部分」としても知られている。例示的な例では、抗原結合抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）_２断片である。

【0032】

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、抗体タンパク質生成物である。本明細書で使用するとき、用語「抗体タンパク質生成物」とは、様々な例では、抗体の構造に基づくが、天然には見出されない、いくつかの抗体代替物の任意の１つを指す。いくつかの態様では、抗体タンパク質生成物は、少なくとも約１２～１５０ｋＤａの範囲内の分子量を有する。特定の態様では、抗体タンパク質生成物は、更に高次の価数ではない場合、単量体（ｎ＝１）から二量体（ｎ＝２）、三量体（ｎ＝３）、四量体（ｎ＝４）までの価数（ｎ）範囲を有する。いくつかの態様では、抗体タンパク質生成物は、完全な抗体構造に基づくもの及び／又は完全な抗原結合能を保持する抗体断片を模倣するもの、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ／ＶＨ（後述）である。完全な抗原結合部位を保持する最小の抗原結合抗体断片は、専ら可変（Ｖ）領域からなるＦｖ断片である。可溶性で柔軟なアミノ酸ペプチドリンカーを使用して、Ｖ領域をｓｃＦｖ（単鎖断片可変）断片に連結させて、分子を安定化させるか、又は定常（Ｃ）ドメインをＶ領域に加えて、Ｆａｂ断片［断片、抗原結合性］を生成する。ｓｃＦｖ断片及びＦａｂ断片の両方は、宿主細胞、例えば原核生物宿主細胞中で容易に産生することができる。他の抗体タンパク質生成物には、ジスルフィド結合安定化ｓｃＦｖ（ｄｓ－ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）並びにオリゴマー化ドメインに連結されたｓｃＦｖからなる異なるフォーマットを含む、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ又はミニボディ（ミニＡｂ）のような二量体及び多量体抗体フォーマットが含まれる。最小の断片は、ラクダ類重鎖Ａｂ及び単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）のＶＨＨ／ＶＨである。新規な抗体フォーマットを作製するために最も頻繁に使用される構築ブロックは、約１５アミノ酸残基のペプチドリンカーによって連結された重鎖及び軽鎖（ＶＨ及びＶＬドメイン）由来のＶドメインを含む単鎖可変（Ｖ）－ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）である。ペプチボディ又はペプチド－Ｆｃ融合体は、更に別の抗体タンパク質生成物である。ペプチボディの構造は、Ｆｃドメインに移植された生物学的に活性なペプチドからなる。ペプチボディは、当技術分野において詳細に記述されている。例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４（５）：５８６－５９１（２０１２）を参照されたい。

【0033】

他の抗体タンパク質生成物としては、単鎖抗体（ＳＣＡ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び二重特異性抗体又は三重特異性抗体などが挙げられる。二重特異性抗体は、５つの主要なクラス：ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質及びＢｓＡｂコンジュゲートに分類することができる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２）Ｐａｒｔ Ａ：９７－１０６（２０１５）を参照されたい。

【0034】

例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ（登録商標））分子であり、これは人工の二重特異性モノクローナル抗体である。ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、異なる抗体の２つのｓｃＦｖを含む融合タンパク質である。１つは、ＣＤ３に結合し、もう１つは、標的抗原に結合する。ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、当技術分野で既知である。例えば、Ｈｕｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．．，Ｉｍｍｕｎｏ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９３（３）：２９０－２９６（２０１５）、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．．，ＭＡｂｓ ６（２）：３８１－９１（２０１４）、Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２（８）：ｅ０１８３３９０を参照されたい。

【0035】

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＲＡＮＫＬに結合する。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、非共有結合性且つ可逆性の様式でＲＡＮＫＬに結合する。例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質の結合強度は、ＲＡＮＫ及びＲＡＮＫＬの結合部位間の相互作用の強度の尺度である、その親和性の観点から説明することができる。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、ＲＡＮＫＬに対して親和性が高く、このため、親和性の低い抗原結合タンパク質より短時間でより多くのＲＡＮＫＬに結合することになる。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、ＲＡＮＫＬに対して親和性が低く、このため、親和性の高い抗原結合タンパク質より長時間でより少ないＲＡＮＫＬに結合することになる。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、平衡会合定数ＫＡが少なくとも１０^５Ｍ^－１、少なくとも１０^６Ｍ^－１、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１又は少なくとも１０^１０Ｍ^－１である。当業者であれば理解するように、ＫＡは、ｐＨ、温度及び緩衝液組成を含む因子による影響を受ける場合がある。

【0036】

例示的な実施形態では、ＲＡＮＫＬへの抗原結合タンパク質の結合強度は、その感受性の観点から説明することができる。Ｋ_Ｄは、平衡解離定数、抗原結合タンパク質とＲＡＮＫＬとの間のｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎの比である。Ｋ_ＤとＫＡとは、逆相関の関係にある。Ｋ_Ｄ値は、抗原結合タンパク質の濃度（特定の実験に必要な抗原結合タンパク質の量）と相関しているため、Ｋ_Ｄ値が低い（低い濃度が必要である）ほど、抗原結合タンパク質の親和性が高まる。例示的な態様では、ＲＡＮＫＬへの抗原結合タンパク質の結合強度は、Ｋ_Ｄの観点から説明することができる。例示的な態様では、抗原結合タンパク質のＫ_Ｄは、約１０^－１Ｍ、約１０^－２Ｍ、約１０^－３Ｍ、約１０^－４Ｍ、約１０^－５Ｍ、約１０^－６Ｍ又はそれ未満である。例示的な態様では、抗原結合タンパク質Ｋ_Ｄは、マイクロモル、ナノモル、ピコモル又はフェムトモルである。例示的な態様では、抗原結合タンパク質のＫ_Ｄは、約１０^－４～１０^－６Ｍ、又は約１０^－７～１０^－９Ｍ、又は約１０^－１０～１０^－１２Ｍ、又は約１０^－１３～１０^－１５Ｍの範囲内である。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、Ｋ_Ｄが約０．０４ｎＭ以上のヒトＲＡＮＫＬに結合する。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、Ｋ_Ｄが約０．０１ｎＭ～約２０ｎＭ、０．０２ｎＭ～２０ｎＭ、０．０５ｎＭ～２０ｎＭ、０．０５ｎＭ～１５ｎＭ、０．１ｎＭ～１５ｎＭ、０．１ｎＭ～１０ｎＭ、１ｎＭ～１０ｎＭ又は５ｎＭ～１０ｎＭのヒトＲＡＮＫＬに結合する。

【0037】

任意選択的に、抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体又はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２若しくは単鎖Ｆｖを含む。様々な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、抗ＲＡＮＫ抗体又は抗ＲＡＮＫＬ抗体の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超えるものを含む。

【0038】

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＲＡＮＫＬに結合する。場合により、抗原結合タンパク質は、デノスマブと呼ばれる抗体の重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超えるものを含む。デノスマブは、参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願第０３／００２７１３号パンフレット及び米国特許第７，３６４，７３６号明細書で説明及び特許請求されている。デノスマブは、配列番号８の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。デノスマブは、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）可変領域とを含む。ＬＣの成熟型は、配列番号１３に記載されており、ＨＣの成熟型は、配列番号１４に記載されている。シグナルペプチドを含む完全長ＬＣは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。シグナルペプチドを含む完全長ＨＣは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。様々な場合、抗原結合タンパク質は、配列番号５、６、７、８、９及び１０のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含み、且つ配列番号１６のアミノ酸配列及び配列番号２８のアミノ酸配列を更に含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列及び配列番号４のアミノ酸配列を含む。

【0039】

様々な態様では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号８の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、（ｂ）配列番号９の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、（ｃ）配列番号１０の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、（ｄ）配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、（ｅ）配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、（ｆ）配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列或いは１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有するその変異体配列、又は（ｇ）（ａ）～（ｆ）の任意の２つ以上の組み合わせを含む。任意選択的に、抗原結合タンパク質は、（Ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列或いは配列番号１に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む軽鎖可変ドメイン、（ｉｉ）配列番号１９を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、又は（ｉｉｉ）配列番号１９からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインからなる群から選択される軽鎖可変ドメイン、又は（Ｂ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸或いは配列番号２に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む重鎖可変ドメイン、（ｉｉ）配列番号２０を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、又は（ｉｉｉ）配列番号２０からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインからなる群から選択される重鎖可変ドメイン、又は（Ｃ）（Ａ）の軽鎖可変ドメイン及び（Ｂ）の重鎖可変ドメインを含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、任意選択的にカッパ軽鎖を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４抗体である。任意選択的に、抗原結合タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、（Ａ）軽鎖であって、（ｉ）配列番号３又は１３のアミノ酸配列或いは配列番号３若しくは１３に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む軽鎖、（ｉｉ）配列番号２１又は２３を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖、又は（ｉｉｉ）配列番号２１又は２３からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖からなる群から選択される軽鎖、又は（Ｂ）（ｉ）配列番号４又は配列番号１４のアミノ酸配列或いは配列番号４若しくは１４に対して１つ若しくは２つのみのアミノ酸が異なるか、又は少なくとも若しくは約７０％の配列同一性を有する変異体配列を含む重鎖、（ｉｉ）配列番号２２又は２４を含むポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖、若しくは（ｉｉｉ）配列番号２２又は２４からなるポリヌクレオチドの補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む重鎖からなる群から選択される重鎖、又は（Ｃ）（Ａ）の軽鎖及び（Ｂ）の重鎖を含む。様々な場合、抗原結合タンパク質は、配列番号５、６、７、８、９及び１０のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列を含み、且つ配列番号１６のアミノ酸配列及び配列番号２８のアミノ酸配列を更に含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む。上記の変異体配列に関して、いくつかの態様では、変異体配列は、１つ又は２つのアミノ酸のみが異なるか、或いは引用された配列（例えば、配列番号１～１０、１３又は１４）と少なくとも若しくは約７０％の配列同一性、引用された配列と少なくとも若しくは約７５％の配列同一性、引用された配列と少なくとも若しくは約８０％の配列同一性、引用された配列と少なくとも若しくは約８５％の配列同一性、引用された配列と少なくとも若しくは約９０％の配列同一性、引用された配列と少なくとも若しくは約９５％の配列同一性又は引用された配列と少なくとも若しくは約９８％の配列同一性を有する。

【0040】

例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、ＲＡＮＫＬとの結合に関してデノスマブと競合する完全ヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体又はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２若しくは単鎖Ｆｖを含む。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、デノスマブが結合するエピトープと結合する。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、更に低くない場合、デノスマブと同様であるか又は同じＫＤを有する。例示的な場合、ＲＡＮＫＬとの結合に関してデノスマブと競合する抗原結合タンパク質は、インビトロの競合的結合アッセイにおいて、ＲＡＮＫＬに結合するデノスマブの量を低減させる。例示的な態様では、ＲＡＮＫＬに結合したデノスマブの量は、少なくとも若しくは約２５％、少なくとも若しくは約３０％、少なくとも若しくは約３５％、少なくとも若しくは約４０％、少なくとも若しくは約４５％、少なくとも若しくは約５０％、少なくとも若しくは約５５％、少なくとも若しくは約６０％、少なくとも若しくは約６５％、少なくとも若しくは約７０％、少なくとも若しくは約７５％、少なくとも若しくは約８０％、少なくとも若しくは約８５％、少なくとも若しくは約９０％又はそれを超えて減少する。ＲＡＮＫＬに結合したデノスマブの減少した量を判定するために用いることのできる好適な競合的結合アッセイは、ＲＡＮＫＬへの結合に関してデノスマブと競合する抗原結合タンパク質でデノスマブをインキュベートし、続いてＲＡＮＫＬを添加する工程を含む。ＲＡＮＫＬに結合したデノスマブの量は、ＲＡＮＫＬへの結合に関して競合する抗原結合タンパク質を用いて及び用いずに測定する。他の結合アッセイ、例えば抗原又はそのエピトープへの結合に関して別の抗原結合タンパク質と競合する抗体の能力を試験する競合的結合アッセイ又は競合アッセイは、当技術分野において既知である。例えば、米国特許出願公開第２０１４０１７８９０５号明細書、Ｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４６：１６８－１７１（２０１７）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５２５：８９－９１（２０１７）；及びＧｏｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２９（２）：２５０－２５３（２０１７）を参照されたい。また、２つの抗体を比較する他の方法が当技術分野で知られており、これとしては、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が挙げられる。ＳＰＲを、抗体及び第２の抗体の結合定数を決定するために使用することができ、２つの結合定数が比較され得る。

【0041】

ＣＤＫ阻害剤
例示的な実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、ＲＡＮＫ経路阻害剤と組み合わせたＣＤＫ阻害剤を含む。本明細書で使用するとき、用語「ＣＤＫ阻害剤」とは、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）を標的化する任意の化合物又は分子を意味する。様々な場合、ＣＤＫは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４又はＣＤＫ６である。様々な態様におけるＣＤＫは、ＣＤＫ４若しくはＣＤＫ６又はこれらの組み合わせである。例示的な場合、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤又はＣＤＫ４阻害剤若しくはＣＤＫ６阻害剤である。ＣＤＫ阻害剤により提供される低減又は阻害は、１００％の又は完全な阻害若しくは抑止又は低減でなくてもよい。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する低減又は阻害の様々な程度が存在する。この点において、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６タンパク質を任意の量又はレベルまで阻害することができる。例示的な実施形態では、ＣＤＫ阻害剤によって提供される低減又は阻害は、少なくとも又は約１０％の低減又は阻害（例えば、少なくとも又は約２０％の低減又は阻害、少なくとも又は約３０％の低減又は阻害、少なくとも又は約４０％の低減又は阻害、少なくとも又は約５０％の低減又は阻害、少なくとも又は約６０％の低減又は阻害、少なくとも又は約７０％の低減又は阻害、少なくとも又は約８０％の低減又は阻害、少なくとも又は約９０％の低減又は阻害、少なくとも又は約９５％の低減又は阻害、少なくとも又は約９８％の低減又は阻害）である。

【0042】

好適なＣＤＫ阻害剤は、当技術分野で既知である。例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｇｉａｎｅｌｌａ－Ｂｏｒｒａｄｏｒｉ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ（２００５）１４（４）：４５７－４７７、並びに国際特許出願国際公開第２００３０７２０６２号パンフレット、同第２００２０９６８８８号パンフレット、同第２００３０９７０４８号パンフレット、同第２００４０９７０４８号パンフレット、同第２００４０６９１３７号パンフレット及び同第２００３０３３４９９号パンフレットを参照されたい。例示的な態様では、ＣＤＫ阻害剤は、アルボシジブ（フラボピリドール；Ａｖｅｎｔｉｓ－ＮＣＩとしても知られる）及びセリシクリブ（ＣＹＣ２０２、（Ｒ）－ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ、Ｃｙｃｌａｃｅｌとしても知られる）、ＵＣＮ－０１、インジスラム、ＢＭＳ－３８７０３２、ＯＮ０１９１０．Ｎａ、ＡＺＤ－５４３８、ＺＫ－ＣＤＫ、ＪＮＪ－７７０６６２１、ＧＰＣ－２８６１９９である。

【0043】

例示的な実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤である。本明細書で使用するとき、用語「ＣＤＫ４／６阻害剤」とは、サイクリン依存性キナーゼであるＣＤＫ４及びＣＤＫ６を標的化し、これらの酵素活性、例えばキナーゼ活性を低減又は阻害する任意の化合物又は分子を指す。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６に作用して、細胞周期停止を誘発する。細胞周期の進行中、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６は、成長抑制タンパク質である網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）をリン酸化のために標的化し、Ｒｂタンパク質は、リン酸化されると不活性化される。ＣＤＫ４及びＣＤＫ６がＣＤＫ４／６阻害剤によって阻害されていると、Ｒｂは、リン酸化されず（又はリン酸化が低減し）、その結果、Ｒｂは、その成長抑制機能を自由に実行することができる。例示的な実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ４５０）３Ａ阻害剤又は両方である。様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質のリン酸化を阻害する。様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、ＣＹＰ４５０３Ａの機能を阻害する。

【0044】

例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、構造：

【化3】

を含む。

【0045】

様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、構造Ｉ又は構造ＩＩの構造を含み、且つＡ－Ｂの構造を更に含み、ここで、Ａは、二環式構造を含み、及びＢは、単環式構造を含む。例示的な態様では、Ａ－Ｂは、構造ＩＩＩ、又は構造ＩＶ、又は構造Ｖ：

【化4】

の構造を含む。

【0046】

例示的な態様では、構造ＩＩＩ又はＩＶのＢは、シクロペンタンである。例示的な態様では、構造ＶのＢは、ピリミジンを含む。

【0047】

様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、

【化5】

の構造又はその薬学的に許容される塩を含む。

【0048】

様々な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、

【化6】

の構造又はその薬学的に許容される塩を含む。

【0049】

様々な場合、ＣＤＫ４／６阻害剤は、

【化7】

の構造又はその薬学的に許容される塩を含む。

【0050】

例示的な実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物のＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤である。したがって、例示的な態様では、医薬組成物は、ＲＡＮＫ経路阻害剤及びＣＤＫ４阻害剤を含む。本明細書で使用するとき、用語「ＣＤＫ４阻害剤」は、ＣＤＫ４の活性（例えば、キナーゼ活性）を低減又は阻害するが、ＣＤＫ６の活性を低減又は阻害しない任意の化合物又は分子を指す。いくつかの態様では、ＣＤＫ４阻害剤は、ＣＤＫ４をコードする核酸を標的化する分子である。代表的な場合、ＣＤＫ４阻害剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するアンチセンス分子である。ＲＮＡｉは、標的ｍＲＮＡが配列特異的な方法で分解される、植物及び動物における遺伝子調節の普遍的機構である（Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，４８５－４９０（２００１）；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，１２，２２５－２３２（２００２）、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６－８１１（１９９８）、Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０１，２５－３３（２０００））。天然のＲＮＡ分解プロセスは、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼダイサーによって開始され、長いｄｓＲＮＡ前駆体から、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、短干渉ＲＮＡとしても知られる）と称される２１～２５ヌクレオチド長の二本鎖断片への切断を促進する（Ｚａｍｏｒｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ．１０１，２５－３３（２０００）、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８－２００（２００１）、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３－２９６（２０００）、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３－３６６（２００１））。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識して切断する巨大タンパク質複合体に組み込まれる（Ｎｙｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９－３２１（２００１）。細胞中のｓｉＲＮＡの成熟におけるダイサーの必要条件は、様々な哺乳動物細胞中において、トランスフェクションされ且つ内因性の遺伝子の発現を阻害する合成２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖を導入することによって回避することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４－４９８（２００１））。例示的な態様では、ＣＤＫ４阻害剤は、ＲＮＡｉを媒介し、また様々な場合、これは、ＣＤＫ４タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）発現の阻害に特異的なｓｉＲＮＡ分子である。本明細書で使用するとき、用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを誘導又は媒介することが可能である、約１０～約５０ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ（又はＲＮＡ類似体）を指す。例示的な実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５～約３０ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）又は約２０～約２５ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）、例えば２１～２３ヌクレオチド（又はヌクレオチド類似体）を含む。ｓｉＲＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得、好ましくは二本鎖である。

【0051】

代替的な態様では、ＣＤＫ４阻害剤は、ＣＤＫ４タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）発現の阻害に特異的な短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。本明細書で使用するとき、用語「ｓｈＲＮＡ」は、約２０以上の塩基対からなる分子を指し、ここで、一本鎖ＲＮＡは、回文塩基配列を部分的に含有し、且つその中に二本鎖構造（すなわちヘアピン構造）を形成する。ｓｈＲＮＡは、折り畳まれてヘアピン構造になるｓｉＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ類似体）であり得る。ｓｈＲＮＡは、典型的には約４５～約６０ヌクレオチドを含み、これは、約２１のヌクレオチドアンチセンス及びヘアピンのセンス部分、約２～約６ヌクレオチド長の非ループ側上の任意選択的オーバーハング並びに例えば約３～１０ヌクレオチド長であり得るループ部分を含む。ｓｈＲＮＡは、化学的に合成することができる。代わりに、ｓｈＲＮＡは、逆方向のＤＮＡ配列のセンス鎖とアンチセンス鎖とを連結し、テンプレートとしてＤＮＡを用いてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡをインビトロ合成することによって生成することもできる。いかなる理論又は機序にも束縛されるものではないが、ｓｈＲＮＡが細胞に導入された後、ｓｈＲＮＡは、約２０塩基以上の長さ（例えば、典型的には２１、２２、２３塩基）に分解し、ＲＮＡｉを生じさせ、阻害作用をもたらすものと考えられる。したがって、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘発し、したがって本開示の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡは、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは、特に限定されていないが、好ましくは約１０以上のヌクレオチド、より好ましくは約２０以上のヌクレオチドである。本明細書では、３’突出末端は、好ましくは、ＤＮＡ、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長のＤＮＡ、更により好ましくは２～４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。

【0052】

例示的な態様では、ＣＤＫ４阻害剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。本明細書で使用するとき、用語「マイクロＲＮＡ」とは、塩基がｍＲＮＡ分子と対合して、翻訳抑制又は標的分解を介して遺伝子発現をサイレンシングする、小さい（例えば、１５～２２ヌクレオチドの）非コードＲＮＡ分子を指す。マイクロＲＮＡ及びその治療可能性は、当技術分野で説明されている。例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ， ＭｉｃｒｏＲＮＡ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，２０１１、Ｂａｄｅｒ ａｎｄ Ｌａｍｍｅｒｓ，“Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ” Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ ５２－５５（Ｍａｒｃｈ ２０１１）を参照されたい。

【0053】

例示的な実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物のＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ６阻害剤である。したがって、例示的な態様では、医薬組成物は、ＲＡＮＫ経路阻害剤及びＣＤＫ６阻害剤を含む。本明細書で使用するとき、用語「ＣＤＫ６阻害剤」は、ＣＤＫ６の活性（例えば、キナーゼ活性）を低減又は阻害するが、ＣＤＫ４の活性を低減又は阻害しない任意の化合物又は分子を指す。いくつかの態様では、ＣＤＫ６阻害剤は、ＣＤＫ６をコードする核酸を標的化する分子である。代表的な場合、ＣＤＫ６阻害剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介するアンチセンス分子である。例示的な態様では、ＣＤＫ６阻害剤は、ＲＮＡｉを媒介し、また様々な場合、これは、ＣＤＫ６タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）発現の阻害に特異的なｓｉＲＮＡ分子である。代替的な態様では、ＣＤＫ６阻害剤は、代替的にはＣＤＫ６タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）発現の阻害に特異的な短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。例示的な態様では、ＣＤＫ６阻害剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。

【0054】

追加的活性成分
様々な場合、医薬組成物は、２種類以上のＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又は２種類以上のＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤）を含む。例えば、医薬組成物は、ＯＰＧ、ＯＰＧ－Ｆｃ及びデノスマブの少なくとも２つ並びにパルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブの少なくとも２つを含む。様々な場合、医薬組成物は、ＲＡＮＫ経路阻害剤以外及びＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤）以外の追加の活性成分を含む。例示的な場合、医薬組成物は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）及び化学療法剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を含む。

【0055】

本明細書に開示される医薬組成物に含めるのに好適な化学療法剤は、当技術分野で既知であり、これとしては、米国特許第６，６３０，１２４号明細書に記載されるように、白金配位化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生物質、抗有糸分裂アルカロイド及びジフルオロヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0056】

いくつかの実施形態では、化学療法剤は、白金配位化合物である。用語「白金配位化合物」は、白金がイオン形態で提供される、任意の腫瘍細胞成長阻害性の化合物を指す。いくつかの実施形態では、白金配位化合物は、ｃｉｓ－ジアミンジアコ白金（ＩＩ）－イオン；クロロ（ジエチレントリアミン）－白金（ＩＩ）塩化物；ジクロロ（エチレンジアミン）－白金（ＩＩ）、ジアミン（１，１－シクロブタンジカルボキシラト）白金（ＩＩ）（カルボプラチン）；スピロプラチン；イプロプラチン；ジアミン（２－エチルマロナト）－白金（ＩＩ）；エチレンジアミンマロナト白金（ＩＩ）；アクア（１，２－ジアミノジクロヘキサン）－スルファト白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）マロナト白金（ＩＩ）；（４－カロキシフタラト）（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）－（イソシトラト）白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）ｃｉｓ（ピルバト）白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）オキサラト白金（ＩＩ）；オルマプラチン；及びテトラプラチンである。

【0057】

いくつかの実施形態では、シスプラチンは、本発明の組成物及び方法に使用される白金配位化合物である。シスプラチンは、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ－Ｓｑｕｉｂｂ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからＰＬＡＴＩＮＯＬ（商標）の名称で市販されており、水、滅菌生理食塩水又は他の適切なビヒクルで構成するための粉末として入手可能である。本発明において使用するのに適切な他の白金配位化合物は、既知であり、市販品を入手可能であり、且つ／又は既知の技術によって調製することができる。シスプラチン又はｃｉｓ－ジクロロジアミン白金ＩＩは、種々のヒト固形悪性腫瘍の治療において化学療法剤として長年使用され、奏効してきた。最近では、他のジアミノ－白金錯体も種々のヒト固形悪性腫瘍の治療において化学療法剤として有効性を示している。そのようなジアミノ－白金錯体としては、以下に限定されないが、スピロ白金及びカルボ白金が挙げられる。シスプラチン及び他のジアミノ－白金錯体は、ヒトにおける化学療法剤として広く使用されてきたが、それらは、高投与量レベルで送達されなければならず、このため、腎障害などの毒性問題を招き得る。

【0058】

いくつかの実施形態では、化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼは、真核細胞のＤＮＡトポロジーを変更することができる酵素である。トポイソメラーゼは、細胞機能及び細胞増殖に不可欠である。一般に、真核細胞中には、２つの種類のトポイソメラーゼ、Ｉ型及びＩＩ型が存在する。トポイソメラーゼＩは、およそ１００，０００分子量の単量体酵素である。この酵素は、ＤＮＡに結合し、一過性の一本鎖切断を導入し、二重らせんをほどき（又は二重らせんがほどけるのを可能にし）、次いで切断部を再接合した後にＤＮＡ鎖から分離する。種々のトポイソメラーゼ阻害剤は、卵巣癌、乳癌、食道癌又は非小細胞肺癌に罹患しているヒトの治療に臨床有効性を示している。

【0059】

いくつかの態様では、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン又はカンプトテシン類似体である。カンプトテシンは、中国原産のカレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｃｕｍｉｎａｔａ）の木及びインド原産のクサミズキ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ ｆｏｅｔｉｄａ）の木によって産生される水不溶性の細胞毒性アルカロイドである。カンプトテシンは、多くの腫瘍細胞の成長を阻害する。カンプトテシン類似体クラスの化合物は、典型的には、ＤＮＡトポイソメラーゼＩの特異的阻害剤である。カンプトテシン類似体クラスの化合物としては、トポテカン、イリノテカン及び９－アミノ－カンプトテシンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

追加的な実施形態では、化学療法剤は、１９９１年４月２日発行の米国特許第５，００４，７５８号明細書及び欧州特許第０３２１１２２号明細書として１９８９年６月２１日に公開された欧州特許出願第８８３１１３６６．４号明細書、１９８６年８月５日発行の米国特許第４，６０４，４６３号明細書及び１９８５年４月１７日公開の欧州特許出願公開第０１３７１４５号明細書、１９８４年９月２５日発行の米国特許第４，４７３，６９２号明細書及び１９８３年３月１６日公開の欧州特許出願公開第００７４２５６号明細書、１９８５年１０月８日発行の米国特許第４，５４５，８８０号明細書及び１９８３年３月１６日公開の欧州特許出願公開第００７４２５６号明細書、１９８３年９月１４日公開の欧州特許出願公開第００８８６４２号明細書、Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９，２３５８－２３６３（１９８６）、Ｎｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．１４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｋｙｏｔｏ，１９８５，Ｔｏｋｙｏ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｓｅｃｔｉｏｎ １，ｐ．２８－３０で特許請求又は記載される、腫瘍細胞成長を阻害する任意のカンプトテシン類似体、特にＣＰＴ－１１と呼ばれる化合物である。ＣＰＴ－１１は、４－（ピペリジノ）－ピペリジン側鎖が１０－ヒドロキシ－７－エチルカンプトテシンのＣ－１０位でカルバメート結合によって連結しているカンプトテシン類似体である。ＣＰＴ－１１は、現在、ヒト臨床試験が行われており、イリノテカンとも呼ばれる；Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２３，５５４（１９８０）；Ｗａｎｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０，１７７４（１９８７）、１９８２年８月３日発行の米国特許第４，３４２，７７６号明細書、１９９０年９月１３日出願の米国特許出願第５８１，９１６号明細書及び１９９１年３月２０日公開の欧州特許出願公開第４１８０９９号明細書、１９８５年４月２３日発行の米国特許第４，５１３，１３８号明細書及び１９８３年３月２３日公開の欧州特許出願公開第００７４７７０号明細書、１９８３年８月１６日発行の米国特許第４，３９９，２７６号明細書及び１９８２年７月２８日公開の欧州特許出願公開第００５６６９２号明細書（各開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）。上記のカンプトテシン類似体クラスの化合物は、全て市販品を入手可能であり、且つ／又は上記の参考文献に記載されている技術を含む既知の技術によって調製することができる。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポテカン、イリノテカン及び９－アミノカンプトテシンからなる群から選択され得る。

【0061】

カンプトテシン類似体クラスの多種の化合物（それらの薬学的に許容される塩、水和物及び溶媒和物を含む）の調製及びそのようなカンプトテシン類似体クラスの化合物と、不活性で薬学的に許容される担体又は希釈剤とを含む経口及び非経口の医薬組成物の調製は、１９９１年４月２日に発行された米国特許第５，００４，７５８号明細書及び欧州特許第０３２１１２２号明細書として１９８９年６月２１日に公開された欧州特許出願第８８３１１３６６．４号明細書に詳細に記載されており、それらの教示は、参照により本明細書に援用される。

【0062】

なお更に他の実施形態では、化学療法剤は、複合抗生物質である。適切な抗生物質としては、ドキソルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン及びストレプトゾシンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0063】

いくつかの実施形態では、化学療法剤は、抗有糸分裂アルカロイドである。一般に、抗有糸分裂アルカロイドは、カタランツス・ロゼウス（Ｃａｎｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）から抽出することができ、抗癌化学療法剤として有効であることが分かっている。多くの半合成誘導体が化学的にも薬理学的にも研究されてきた（Ｏ．Ｖａｎ Ｔｅｌｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，１６９９－１７１６（１９９２）を参照されたい）。本発明の抗有糸分裂アルカロイドとしては、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセル（ＰＴＸ；タキソール（登録商標））及びビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。最後の２つの抗有糸分裂アルカロイドは、それぞれＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ及びＰｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている（米国特許第５，６２０，９８５号明細書を参照されたい）。本発明の例示的な態様では、抗有糸分裂アルカロイドは、ビノレルビンである。

【0064】

本発明の他の実施形態では、化学療法剤は、ジフルオロヌクレオシドである。２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロヌクレオシドは、抗ウイルス活性を有するとして当技術分野において公知である。そのような化合物は、米国特許第４，５２６，９８８号明細書及び同第４，８０８６１４号明細書に開示され、且つ教示されている。欧州特許出願公開第１８４，３６５号明細書は、これらの同じジフルオロヌクレオシドが腫瘍崩壊活性を有することを開示している。特定の態様では、本発明の組成物及び方法に使用される２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロヌクレオシドは、２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロシチジン塩酸塩、別名ゲムシタビン塩酸塩である。ゲムシタビンは、市販されているか、又は米国特許第４，５２６，９８８号明細書、同第４，８０８，６１４号明細書及び同第５，２２３，６０８号明細書に開示され、且つ教示されている多段階プロセスで合成することができ、これらの教示は、参照により本明細書に援用される。

【0065】

例示的な態様では、化学療法剤は、ホルモン療法剤である。例示的な態様では、医薬組成物は、ＣＤＫ阻害剤と組み合わせたＲＡＮＫ経路阻害剤を含み、且つホルモン療法剤を更に含む。例示的な場合、ホルモン療法剤は、例えば、レトロゾール、タモキシフェン、バゼドキシフェン、エキセメスタン、ロイプロリド、ゴセレリン、フルベストラント、アナストロゾール又はトレミフェンである。例示的な態様では、ホルモン療法剤は、黄体形成ホルモン（ＬＨ）ブロッカー、例えばゴサレリン（ｇｏｓａｒｅｌｉｎ）又はＬＨ放出ホルモン（ＲＨ）アゴニストである。例示的な態様では、ホルモン療法剤は、ＥＲ標的剤（例えば、フルベストラント又はタモキシフェン）、ラパマイシン、ラパマイシン類似体（例えば、エベロリムス、テムシロリムス、リダホロリムス、ゾタロリムス及び３２－デオキソ－ラパマイシン）、抗ＨＥＲ２薬剤（例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、Ｔ－ＤＭ１又はネラチニブ）又はＰＩ３Ｋ阻害剤（例えば、タセリシブ、アルペリシブ又はブパルリシブ）である。

【0066】

例示的な態様では、医薬組成物は、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせたＲＡＮＫ経路阻害剤を含み、またＫｎｕｄｓｅｎ ａｎｄ Ｗｉｔｋｉｅｗｉｃｚ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ ３（１）：３９－５５（２０１７）に記載されるように、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせた任意の追加の活性成分を更に含む。本参考文献の表３は、臨床治験における多くの薬剤の組み合わせを記載しており、その少なくとも１つの活性成分がＣＤＫ４／６阻害剤である。例示的な態様では、医薬組成物は、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせたＲＡＮＫ経路阻害剤を含み、且つＡＺＤ－２０１４、ＢＹＬ７１９、ＢＫＭ１２０、エベロリムス、ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｔ－ＤＭ１、パクリタキセル、ＴＡＣＥ、放射線療法、ドセタキセル、Ｎａｂ、カルボプラチン、シスプラチン、５ＦＵ、オキサリプラチン、セツキシマブ、トラスツズマブ、ＭＥＫ１６２、アンドロゲン遮断、エンザルタミド、イブルチニブ、セリチニブ、ＭＥＫ阻害剤、トラメチニブ、ＨＤＭ２０１及び／又はＭＴＯＲ阻害剤の任意の１つ以上を更に含む。

【0067】

例示的な態様では、医薬組成物は、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせたＲＡＮＫ経路阻害剤を含み、また米国食品医薬品局（ＦＤＡ）又は欧州医薬品庁（ＥＭＥＡ）、カナダ保健省、オーストラリア保健省薬品・医薬品行政局（ＴＧＡ）、中国国家食品薬品監督管理局、日本国厚生労働省（ＭＨＬＷ）など、他の医薬品規制当局により認可された、ＣＤＫ４／６阻害剤の添付文書上に列挙される活性成分を更に含む。したがって、いくつかの態様では、医薬組成物は、ＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ、リボシクリブ、アベマシクリブ）と組み合わせたＲＡＮＫ経路阻害剤を含み、またフルベストラント又はアロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール、アナストロゾール又はエキセメスタン）を更に含む。様々な場合、医薬組成物は、フルベストラント若しくはパルボシクリブ及びフルベストラント若しくはリボシクリブ及びフルベストラント又はパルボシクリブ及びアロマターゼ阻害剤若しくはリボシクリブ及びアロマターゼ阻害剤と組み合わせたアベマシクリブを含む。

【0068】

薬学的に許容される塩
例示的な態様では、本明細書に開示される医薬組成物は、活性成分としてのＲＡＮＫ経路阻害剤及びＣＤＫ４／６阻害剤又はその薬学的に許容される塩を含む。こうした塩は、活性成分の最終的な単離及び精製中にその場で調製することができるか、又は遊離塩基官能基を好適な酸と反応させることによって個別に調製することができる。薬学的に許容される酸付加塩を形成するために用いられ得る酸の例としては、例えば、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸並びに有機酸、例えばシュウ酸、マレイン酸、コハク酸及びクエン酸が挙げられる。

【0069】

代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩及びウンデカン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。

【0070】

塩基付加塩も、活性剤の最終の単離及び精製中或いはカルボン酸含有部分を薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩若しくは重炭酸塩などの好適な塩基又はアンモニア若しくは有機第一級、第二級若しくは第三級アミンと反応させることにより、その場で調製することができる。薬学的に許容される塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及びアルミニウム塩などのアルカリ金属又はアルカリ土類金属をベースとしたカチオン並びにとりわけアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアンモニウム、ジメチルアンモニウム、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、ジエチルアンモニウム及びエチルアンモニウムを含む非毒性第四級アンモニア及びアミンカチオンが挙げられるが、これらに限定されない。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンとしては、例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジンなどが挙げられる。

【0071】

更に、塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピル及びブチルクロリド、ブロミド及びヨージドなどの低級ハロゲン化アルキル；デシル、ラウリル、ミリスチル及びステアリルクロリド、ブロミド及びヨージドなどの長鎖ハロゲン化物；ベンジル及びフェネチルブロミドなどのハロゲン化アリールアルキル並びに他のものなどの活性剤で四級化することができる。これにより、水又は油に溶性又は分散性の生成物が得られる。

【0072】

薬学的に許容される担体
例示的な実施形態では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と共に製剤化される。例示的な実施形態では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と共に製剤化される。投与経路、使用が意図される特定の活性剤（ＲＡＮＫ経路阻害剤又はＣＤＫ４／６阻害剤）及び他の要因に応じて、ＲＡＮＫ経路阻害剤又はＣＤＫ４／６阻害剤は、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル噴霧剤、気体排除剤、アルカリ化剤、抗ケーキング剤、抗凝固剤、抗菌保存剤、抗酸化剤、防腐剤、塩基、結合剤、緩衝化剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗浄剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、色素、皮膚軟化剤、乳化剤、エマルション安定化剤、充填剤、薄膜形成剤、風味増強剤、香味剤、流動促進剤、ゲル化剤、造粒剤、湿潤剤、潤滑剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏剤、油性ビヒクル、有機塩基、錠剤基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、保存剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶剤、安定剤、坐剤基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性剤、粘度増強剤、吸水剤、水混和性共溶媒、硬水軟化剤又は湿潤剤を含む１つ以上の追加の薬学的に許容される成分と混合され得る。

【0073】

例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、皮下注射用に製剤化される。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、ソルビトール、酢酸塩、ポリソルベート２０、注射用の水及び水酸化ナトリウムでｐＨ５．２に製剤化される。任意選択的に、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、４．７％のソルビトール、１７ｍＭの酢酸塩、０．０１％のポリソルベート２０、注射用の水及び水酸化ナトリウムでｐＨ５．２に製剤化される。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、デノスマブであり、医薬組成物は、任意選択的に、４．７％のソルビトール、１７ｍＭの酢酸塩、０．０１％のポリソルベート２０、注射用の水及び水酸化ナトリウムでｐＨ５．２に製剤化された６０ｍｇのデノスマブを含む。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、デノスマブであり、医薬組成物は、任意選択的に、４．６％のソルビトール、１８ｍＭの酢酸塩、０．０１％のポリソルベート２０、注射用の水及び水酸化ナトリウムでｐＨ５．２に製剤化された１２０ｍｇのデノスマブを含む。例示的な態様では、医薬組成物は、Ｐｒｏｌｉａ（登録商標）若しくはＸｇｅｖａ（登録商標）又はこれらのバイオシミラーを含む。

【0074】

例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、経口投与用に製剤化される。様々な場合、ＣＤＫ４／６阻害剤は、カプセル剤に製剤化される。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、微結晶セルロース、ラクトース一水和物、デンプングリコール酸ナトリウム、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム及び硬ゼラチンカプセルシェルで製剤化される。淡オレンジ色、淡オレンジ色／カラメル色及びカラメル色の不透明カプセル剤シェルは、ゼラチン、赤酸化鉄、黄酸化鉄及び二酸化チタンを含有し、印刷用インクは、セラック、二酸化チタン、水酸化アンモニウム、プロピレングリコール及びシメチコンを含有する。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、パルボシクリブであり、任意選択的に、１２５ｍｇ、１００ｍｇ又は７５ｍｇのパルボシクリブは、微結晶セルロース、ラクトース一水和物、デンプングリコール酸ナトリウム、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム及び硬ゼラチンカプセルシェルで製剤化される。淡オレンジ色、淡オレンジ色／カラメル色及びカラメル色の不透明カプセル剤シェルは、ゼラチン、べんがら、鉄黄及び二酸化チタンを含有し、印刷用インクは、セラック、二酸化チタン、水酸化アンモニウム、プロピレングリコール及びシメチコンを含有する。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、Ｉｂｒａｎｃｅ（登録商標）又はそのジェネリック版である。

【0075】

例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、経口投与用に製剤化される。様々な場合、ＣＤＫ４／６阻害剤は、錠剤に製剤化される。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、コロイド状二酸化ケイ素、クロスポビドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸マグネシウム及び微結晶性セルロースで製剤化される。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、リボシクリブであり、任意選択的に、２００ｍｇのリボシクリブは、コロイド状二酸化ケイ素、クロスポビドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸マグネシウム及び微結晶性セルロースで製剤化される。任意選択的に、錠剤は、フィルムコーティングを含み、フィルムコーティングは、任意選択的に、非活性成分として四酸化三鉄、べんがら、レシチン（大豆）、ポリビニルアルコール（部分的に加水分解した）、タルク、二酸化チタン及びキサンタンガムを含む。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、Ｋｉｓｑａｌｉ（登録商標）又はそのジェネリック版である。

【0076】

例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、経口投与用に製剤化される。様々な場合、ＣＤＫ４／６阻害剤は、錠剤に製剤化される。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、微結晶セルロース１０２、微結晶セルロース１０１、ラクトース一水和物、クロスカルメロースナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、二酸化ケイ素で製剤化される。例示的な態様では、錠剤は、混色成分、ポリビニルアルコール、二酸化チタン、ポリエチレングリコール、タルク、鉄黄及びべんがらを含む。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、Ｖｅｒｚｅｎｉｏ（登録商標）又はそのジェネリック版である。

【0077】

例示的な態様では、医薬組成物は、追加の活性成分を含み、その活性成分は、フルベストラントである。例示的な態様では、フルベストラントは、注射、任意選択的に筋肉注射用に製剤化される。様々な場合、フルベストラントは、共溶媒としての１０ｗ／ｖ％のアルコール（ＵＳＰ）、１０ｗ／ｖ％のベンジルアルコール（ＮＦ）及び１５ｗ／ｖ％の安息香酸ベンジル（ＵＳＰ）で製剤化され、共溶媒及び放出速度調整剤としてのヒマシ油（ＵＳＰ）で１００ｗ／ｖ％にされる。例示的な態様では、５００ｍｇのフルベストラントは、共溶媒としての１０ｗ／ｖ％のアルコール（ＵＳＰ）、１０ｗ／ｖ％のベンジルアルコール（ＮＦ）及び１５ｗ／ｖ％の安息香酸ベンジル（ＵＳＰ）で製剤化され、共溶媒及び放出速度調整剤としてのヒマシ油（ＵＳＰ）で１００ｗ／ｖ％にされる。例示的な態様では、医薬組成物は、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標）又はそのジェネリック版を含む。

【0078】

例示的な態様では、医薬組成物は、追加の活性成分を含み、その活性成分は、エベロリムスである。例示的な態様では、エベロリムスは、経口投与用に、任意選択的に錠剤として製剤化される。様々な場合、エベロリムス、任意選択的に２．５ｍｇ、５ｍｇ又は１０ｍｇのエベロリムスは、非活性成分としてのブチル化ヒドロキシトルエン、ステアリン酸マグネシウム、ラクトース一水和物、ヒプロメロース、クロスポビドン及び無水ラクトースで製剤化される。例示的な態様では、医薬組成物は、Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）又はそのジェネリック版を含む。

【0079】

キット
本開示は、本明細書に開示される医薬組成物のいずれか１つを含むキットを更に提供する。例示的実施形態におけるキットは、ＲＡＮＫ経路阻害剤及びＣＤＫ阻害剤を含む。例示的実施形態におけるキットは、ＲＡＮＫ経路阻害剤及びＣＤＫ４／６阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ６阻害剤を含む。ＲＡＮＫ経路阻害剤は、例えば、ＯＰＧ、ＯＰＧ－Ｆｃ、デノスマブなど、本明細書に記載されるもののいずれかであり得る。ＣＤＫ４／６阻害剤は、例えばアベマシクリブ、パルボシクリブ、リボシクリブなど、本明細書に記載されるもののいずれかであり得る。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、皮下注射用に製剤化される。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、ソルビトール、酢酸塩、ポリソルベート２０、注射用の水及び水酸化ナトリウムでｐＨ５．２に製剤化される。任意選択的に、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、４．７％のソルビトール、１７ｍＭの酢酸塩、０．０１％のポリソルベート２０、注射用の水及び水酸化ナトリウムでｐＨ５．２に製剤化される。代わりに、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、４．６％のソルビトール、１８ｍＭの酢酸塩、０．０１％のポリソルベート２０、注射用の水及び水酸化ナトリウムでｐＨ５．２に製剤化される。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、使い捨てバイアル又は使い捨ての予充填シリンジとして提供される。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、経口投与、任意選択的に錠剤又はカプセル剤用に製剤化される。例示的な場合、ＣＤＫ４／６阻害剤は、微結晶セルロース、ラクトース一水和物、デンプングリコール酸ナトリウム、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム及び硬ゼラチンカプセルシェルで製剤化される。淡オレンジ色、淡オレンジ色／カラメル色及びカラメル色の不透明カプセル剤シェルは、ゼラチン、べんがら、鉄黄及び二酸化チタンを含有し、印刷用インクは、セラック、二酸化チタン、水酸化アンモニウム、プロピレングリコール及びシメチコンを含有する。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、Ｉｂｒａｎｃｅ（登録商標）又はそのジェネリック版である。例示的な場合、ＣＤＫ４／６阻害剤は、コロイド状二酸化ケイ素、クロスポビドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ステアリン酸マグネシウム及び微結晶性セルロースで製剤化される。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、Ｋｉｓｑａｌｉ（登録商標）又はそのジェネリック版である。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、微結晶セルロース１０２、微結晶セルロース１０１、ラクトース一水和物、クロスカルメロースナトリウム、フマル酸ステアリルナトリウム、二酸化ケイ素で製剤化される。例示的な態様では、ＣＤＫ４／６阻害剤は、Ｖｅｒｚｅｎｉｏ（登録商標）又はそのジェネリック版である。

【0080】

反応性、感受性及び耐性
いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本明細書に開示される医薬組成物は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤に対する癌又は腫瘍（本明細書では病変とも称される）の反応性を向上させるのに有用である。したがって、本開示は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤による治療に対する癌細胞又は腫瘍細胞の反応性を増加させる方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。

【0081】

本明細書で使用する場合、用語「反応性」は、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）又は他の同様の基準に従う、薬剤／化合物（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）又は他の治療（例えば、放射線療法）に対する癌細胞又は腫瘍の治療反応又は反応性の程度を指す。ＲＥＣＩＳＴは、米国国立癌研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）、カナダ国立癌研究所臨床試験グループ（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎａｄａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ Ｇｒｏｕｐ）及びヨーロッパ癌研究治療学会（ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）によって共同で作成された、腫瘍及び／又は癌細胞の進行、安定化又は反応性を評価するための一連の判定基準である。ＲＥＣＩＳＴによれば、薬剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）での治療後に比較するためのベースラインを提供するために、特定の腫瘍が、評価（例えば臨床治験）の開始時に測定される。腫瘍の反応アセスメント及び評価基準は、Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４５：２２８－２４７（２００９）及びＬｉｔｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３７（１３）：１１０２－１１１０（２０１９）ＤＯＩ：１０．１２００／ＪＣＯ．１８．０１１００で公開されている。要約すると、上記のＥｉｓｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９のセクション４．３は、標的病変に対する客観的腫瘍反応を判定するために用いられる反応基準を以下のように教示している。

【0082】

【表3】

【0083】

理想的な事例では、薬剤又は他の治療の結果、ＣＲ又はＰＲがもたらされる。いくつかの態様では、ＳＤ又はＰＤの反応は、薬物が癌に対する効果的な治療ではないことと、腫瘍が治療に対して反応しなくなったこととを示すために用いられる。

【0084】

本開示の方法によって提供される、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤に対する腫瘍又は癌細胞の反応性の増加は、対照と比較して少なくとも又は約１％～約１０％の増加（例えば、少なくとも又は約１％の増加、少なくとも又は約２％の増加、少なくとも又は約３％の増加、少なくとも又は約４％の増加、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約６％の増加、少なくとも又は約７％の増加、少なくとも又は約８％の増加、少なくとも又は約９％の増加、少なくとも又は約９．５％の増加、少なくとも又は約９．８％の増加、少なくとも又は約１０％の増加）であり得る。本開示の方法によって提供される、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤に対する腫瘍細胞又は癌細胞の反応性の増加は、対照と比較して、少なくとも又は約１０％～約９５％超の増加（例えば、少なくとも又は約１０％の増加、少なくとも又は約２０％の増加、少なくとも又は約３０％の増加、少なくとも又は約４０％の増加、少なくとも又は約５０％の増加、少なくとも又は約６０％の増加、少なくとも又は約７０％の増加、少なくとも又は約８０％の増加、少なくとも又は約９０％の増加、少なくとも又は約９５％の増加、少なくとも又は約９８％の増加、少なくとも又は約１００％の増加）であり得る。例示的な態様では、対照は、本明細書に開示される医薬組成物で治療されていない癌若しくは腫瘍又は対象若しくは対象の集団であるか、或いは対象は、プラセボで治療されている。

【0085】

例示的な態様では、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤に対する反応性の増加は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）で過去に治療され、且つＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）に対して反応性であったが、時間の経過と共にＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）に対する反応性を喪失した、腫瘍又は癌細胞に対して達成される。例示的な態様では、腫瘍又は癌細胞は、第１の期間、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）で治療され、第１の期間の間、腫瘍又は癌細胞は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）での治療に対して反応性であったが、第１の期間の後に起きる第２の期間の間、腫瘍又は癌細胞は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）での治療に対する反応性が低下した。当業者であれば認識されるように、こうした腫瘍又は癌細胞は、治療に対する感受性を失ったもの及び／又は治療に対して耐性となったものであると理解される。例示的な実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）に対する腫瘍又は癌細胞の反応性を、第１の期間に観察された反応性のレベルまで増加させる。こうした場合、方法は、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）に対する腫瘍（又は病変）又は癌細胞の反応性を回復させるということが理解される。用語「回復させる」とは、過去の状態（例えば、治療に対する反応性の状態）に復元するか又は戻すことを意味する。したがって、本明細書では、ＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）による治療に対する腫瘍又は癌細胞の反応性を回復させる方法が提供される。

【0086】

本開示は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤による治療に対する癌細胞又は腫瘍の感受性を増加又は回復させる方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。本明細書で使用するとき、「感受性」とは、腫瘍が薬剤／化合物、例えばＣＤＫ阻害剤（例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤）に反応する方法を指す。例示的な態様では、「感受性」とは、「治療に対して反応性である」ことを意味し、「感受性」及び「反応性」の概念は、薬剤／化合物治療に対して反応性の腫瘍又は癌細胞が、その薬剤に対して感受性であると言われる点において正の関連を示す。例示的な場合における「感受性」は、Ｐｅｌｉｋａｎ，Ｅｄｗａｒｄ，Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｔｅｒｍｓ ａｎｄ Ｓｙｍｂｏｌｓ ｕｓｅｄ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ａｔ Ｂｏｓｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）に従って、特定の薬物用量に対して定性的に通常の方法で反応するための、他の能力と比較した集団、個体又は組織の能力として定義され。効果をもたらすのに必要な用量が少ないほど、反応系は、より感受性が高い。「感受性」は、用量効果曲線と横座標値又はこれに平行な線との交点を基準にして定量的に測定又は説明することができ、こうした点は、所与の効果の程度をもたらすのにまさに必要な用量に対応する。これと同様に、測定系の「感受性」は、所与の出力（効果）の程度をもたらすのに必要な最低入力（最小量）として定義される。例示的な態様では、「感受性」は、「耐性」とは反対であり、「耐性」の概念は、「感受性」と負の関連を示す。例えば、薬剤の治療に対して耐性のある腫瘍は、その薬物に感受性でも反応性でもなく、その薬物は、その腫瘍又は癌細胞に関して有効な治療ではない。本開示の方法によって提供される感受性の増加は、対照と比較して少なくとも又は約１％～約１０％の増加（例えば、少なくとも又は約１％の増加、少なくとも又は約２％の増加、少なくとも又は約３％の増加、少なくとも又は約４％の増加、少なくとも又は約５％の増加、少なくとも又は約６％の増加、少なくとも又は約７％の増加、少なくとも又は約８％の増加、少なくとも又は約９％の増加、少なくとも又は約９．５％の増加、少なくとも又は約９．８％の増加、少なくとも又は約１０％の増加）であり得る。本開示の方法によって提供される感受性の増加は、対照と比較して少なくとも又は約１０％～約９５％超の増加（例えば、少なくとも又は約１０％の増加、少なくとも又は約２０％の増加、少なくとも又は約３０％の増加、少なくとも又は約４０％の増加、少なくとも又は約５０％の増加、少なくとも又は約６０％の増加、少なくとも又は約７０％の増加、少なくとも又は約８０％の増加、少なくとも又は約９０％の増加、少なくとも又は約９５％の増加、少なくとも又は約９８％の増加、少なくとも又は約１００％の増加）であり得る。例示的な態様では、対照は、本明細書に開示される医薬組成物で治療されていない癌若しくは腫瘍又は対象若しくは対象の集団であるか、或いは対象又は対象の集団は、プラセボで治療されている。

【0087】

本明細書では、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤による治療に対する癌細胞又は腫瘍細胞の耐性を低減させる方法も提供される。例示的な実施形態では、方法は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。本開示の方法によって提供される、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤に対する腫瘍細胞又は癌細胞の耐性の低減は、対照と比較して、少なくとも又は約１％～約１０％の低減（例えば、少なくとも又は約１％の低減、少なくとも又は約２％の低減、少なくとも又は約３％の低減、少なくとも又は約４％の低減、少なくとも又は約５％の低減、少なくとも又は約６％の低減、少なくとも又は約７％の低減、少なくとも又は約８％の低減、少なくとも又は約９％の低減、少なくとも又は約９．５％の低減、少なくとも又は約９．８％の低減、少なくとも又は約１０％の低減）であり得る。本開示の方法によって提供される、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤に対する腫瘍細胞又は癌細胞の耐性の低減は、対照と比較して、少なくとも又は約１０％～９５％超の低減（例えば、少なくとも又は約１０％の低減、少なくとも又は約２０％の低減、少なくとも又は約３０％の低減、少なくとも又は約４０％の低減、少なくとも又は約５０％の低減、少なくとも又は約６０％の低減、少なくとも又は約７０％の低減、少なくとも又は約８０％の低減、少なくとも又は約９０％の低減、少なくとも又は約９５％の低減、少なくとも又は約９８％の低減、少なくとも又は約１００％の低減）であり得る。例示的な態様では、対照は、本明細書に開示される医薬組成物で治療されていない癌若しくは腫瘍又は対象若しくは対象の集団であるか、或いは対象又は対象の集団は、プラセボで治療されている。

【0088】

治療
更に、対象における癌を治療する方法が本明細書で提供される。例示的な実施形態では、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。

【0089】

本明細書で使用する場合、「治療する」という用語及びそれに関連する表現は、必ずしも１００％の又は完全な治療を意味するわけではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する処置には様々な程度がある。この点に関して、本開示の癌を治療する方法は、任意の量又は任意のレベルの治療を提供することができる。更に、本開示の方法によって提供される治療は、治療される癌の１つ以上の状態若しくは症状又は徴候の治療を含む場合がある。また、本開示の方法によって提供される治療は、癌の進行を緩徐化することを包含する場合がある。例えば、本方法は、癌に対するＴ細胞活性若しくは免疫応答を増強すること、腫瘍若しくは癌の成長若しくは腫瘍量を低減すること、腫瘍細胞の転移を低減すること、腫瘍若しくは癌細胞の細胞死を増加させること又は腫瘍退縮を増加させることなどにより、癌を治療することができる。上記に従い、対象における腫瘍成長若しくは腫瘍量を低減させるか、又は腫瘍退縮を増加させる方法が本明細書で提供される。例示的な実施形態では、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤で治療されるか又は治療されており、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。

【0090】

様々な態様では、本方法は、癌の発症又は再発を、少なくとも１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１５日、３０日、２カ月、３カ月、４カ月、６カ月、１年、２年、３年、４年又はそれを超えて遅延させるために治療する。様々な態様では、本方法は、対象の生存を延長するために治療する。例示的な態様では、本開示の方法は、転移癌の発生又は発症を遅延させることにより治療する。様々な場合、本方法は、新規転移癌の発生又は発症を遅延させることにより治療する。したがって、癌を患う対象における転移癌の発生又は発症を遅延させる方法が本明細書で提供される。例示的な実施形態では、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。

【0091】

例示的な場合、提供される治療は、臨床治験の観点から説明されるか、又は臨床治験から得られたデータによって裏付けされ得、治験のエンドポイントは、無進行生存期間（ＰＦＳ）、全生存（ＯＳ）又は米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態が悪化するまでの時間である。様々な態様では、本開示は、癌を患う対象における、ＰＦＳ、ＯＳ又はＥＣＯＧ一般状態が悪化するまでの時間を増加する方法を提供する。例示的な実施形態では、癌は、ＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤に対して耐性を有するか、又は感受性が低減されており、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。本明細書で使用するとき、用語「無進行生存期間」又は「ＰＦＳ」は、治療された患者が癌の悪化なしに経験する時間（悪化を測定するために用いられているどのような指標によっても）を意味する。用語「全生存」は、患者が治療後にどの程度の期間生存したかを意味する。ＥＣＯＧ一般状態は、患者の疾患を評価し（例えば、どのように疾患が進行／退行するか、どのように疾患が患者の日常的生活能力に影響を及ぼすか）、適切な治療及び予後を決定するために医師及び研究者によって用いられるスケールに基づくグレード又はスコアである。ＥＣＯＧ一般状態は、以下の基準に従って決定される。

【0092】

【表4】

【0093】

例示的な態様では、提供される治療は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルを低減させることによるものであり得る。したがって、本開示は、対象におけるＣＴＣのレベルを低減させる方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、任意選択的にＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。

【0094】

投与の経路及びタイミング
本明細書に開示される医薬組成物又は本明細書に開示される方法のＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ４／６阻害剤は、任意の好適な投与経路を介して対象に投与され得る。例えば、活性剤は、非経口、経鼻、経口、経肺、局所、経腟又は経直腸投与を介して対象に投与され得る。投与経路に関する以下の記載は、単に例示的な実施形態を説明するために提供され、決して範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0095】

例示的な態様では、本明細書に開示される医薬組成物又は本明細書に開示される方法のＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤、例えばＣＤＫ阻害剤は、非経口投与用に製剤化される。「非経口」という用語は、消化管を介するのではなく、皮下、筋肉内、脊髄内又は静脈内などの他の何らかの経路を介することを意味する。非経口投与に適切な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び対象のレシピエントの血液と製剤とを等張にする溶質を含有し得る、水性及び非水性の、等張滅菌注射用溶液並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存剤を含み得る、水性及び非水性の、滅菌懸濁液が挙げられる。活性剤（ＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤）は、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、エタノール又はヘキサデシルアルコールなどのアルコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－メタノールなどのケタール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド又は石鹸若しくは洗浄剤など、薬学的に許容される界面活性剤を添加した又は添加しないアセチル化脂肪酸グリセリド、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはカルボキシメチルセルロースなどの懸濁化剤又は乳化剤及び他の医薬補助剤を含む、滅菌液体又は液体混合物など、医薬担体中の生理学的に許容される希釈剤とともに投与することができる。非経口製剤に使用することができる油としては、石油、動物油、植物油又は合成油が挙げられる。油の具体的な例としては、ピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン及び鉱物油が挙げられる。非経口製剤に使用するための適切な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。例示的な態様では、非経口投与用製剤としては石鹸が挙げられる。非経口製剤に使用するための適切な石鹸としては、脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム塩及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、適切な洗浄剤としては、（ａ）カチオン性洗浄剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物及びアルキルピリジニウムハロゲン化物など、（ｂ）アニオン性洗浄剤、例えば、アルキル、アリール及びオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル及びモノグリセリド硫酸塩及びスルホコハク酸塩など、（ｃ）非イオン性洗浄剤、例えば、脂肪酸アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーなど、（ｄ）両性洗浄剤、例えば、アルキル－β－アミノプロピオネート及び２－アルキル－イミダゾリン第四級アンモニウム塩など、並びに（ｅ）これらの混合物が挙げられる。例示的な場合、非経口製剤中に保存剤及び緩衝剤が存在する。注射部位での刺激を最小化又は除去するために、このような組成物は、約１２～約１７の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１種以上の非イオン性界面活性剤を含有し得る。このような製剤中の界面活性剤の量は、通常、約５重量％～約１５重量％の範囲である。適切な界面活性剤としては、モノオレイン酸ソルビタンなどのポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される疎水性塩基を有するエチレンオキシドの高分子量付加物が挙げられる。いくつかの態様では、非経口製剤は、アンプル及びバイアル、シリンジなど、単位用量又は複数回用量の密封容器に入れて提供され、使用の直前に注射用の滅菌液体賦形剤、例えば水を添加することのみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管することができる。いくつかの態様では、即時調合される注射用溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌散剤、顆粒剤及び錠剤から調製される。

【0096】

例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤は、注射用に製剤化される。注射用製剤は、本開示によるものとする。注射用組成物用に有効な医薬担体の要件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ２３８－２５０（１９８２）及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６）を参照されたい）。

【0097】

任意選択的に、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、皮下注射を介して対象に投与される。

【0098】

様々な場合、ＣＤＫ阻害剤は、対象に経口投与される。経口投与に好適な製剤は、（ａ）水、生理食塩水又はオレンジジュースなどの希釈液中に溶解される有効量の本開示の類似体などの溶液；（ｂ）それぞれ固体又は顆粒として所定量の活性成分を含有するカプセル剤、サシェ剤、錠剤、ロゼンジ剤及びトローチ剤；（ｃ）散剤；（ｄ）適切な液体中の懸濁液；並びに（ｅ）好適な乳剤からなり得る。液体製剤としては、薬学的に許容される界面活性剤の添加を伴うか又は伴わない水並びにアルコール、例えばエタノール、ベンジルアルコール及びポリエチレンアルコールなどの希釈剤が挙げられ得る。カプセル剤の形態は、例えば、界面活性剤、潤滑剤並びにラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びトウモロコシデンプンなどの不活性充填剤を含有する一般的な硬質シェル又は軟質シェルのゼラチン型のものであり得る。錠剤の形態としては、ラクトース、スクロース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝化剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、香味料並びに他の薬理学的に適合する賦形剤の１つ以上を挙げることができる。ロゼンジ剤の形態は、香料、通常、スクロース及びアカシア又はトラガント中の本開示の類似体並びに当技術分野で知られる賦形剤を更に含有する、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア、乳剤、ゲルなどの不活性基剤中の本開示の類似体を含むパステル剤を含み得る。

【0099】

ＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤に関して、それぞれ例えば毎日（１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回）、１週間に３回、１週間に２回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、毎週、隔週、３週間に１回、毎月又は隔月を含む任意のレジメンに従って投与され得る。本明細書に開示される方法の例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤及びＣＤＫ阻害剤の両方が投与される場合、ＲＡＮＫ経路阻害剤及びＣＤＫ阻害剤は、別々に投与される。例示的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、２～６週間毎に１回（２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、５週間毎に１回、６週間毎に１回）対象に投与される。任意選択的に、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、４週間毎に１回対象に投与される。任意選択的に、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、２～８ヵ月毎に１回（２ヶ月毎に１回、３ヶ月毎に１回、４ヶ月毎に１回、５ヶ月毎に１回、６ヶ月毎に１回、７ヶ月毎に１回、８ヶ月毎に１回）対象に投与される。様々な場合、ＣＤＫ阻害剤は、１日１回対象に投与される。任意選択的に、ＲＡＮＫ経路阻害剤は、注射、任意選択的に筋肉注射又は皮下注射を介して対象に投与される。様々な場合、ＣＤＫ阻害剤は、対象に経口投与される。

【0100】

代替的な態様では、ＲＡＮＫ経路阻害剤及びＣＤＫ阻害剤は、同時に対象に投与される。例示的な態様では、組成物は、オパイン製剤上で個別の製剤として投与され得る。

【0101】

投与量
活性剤（ＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤）は、本明細書で説明されるような、ＣＤＫ阻害剤による治療に対する癌細胞又は腫瘍の反応性を増加又は回復させ、転移癌の発生又は発症を遅延させ、腫瘍成長若しくは腫瘍量を低減させるか、又は腫瘍退縮を増加させ、無進行生存期間、全生存又は米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態が悪化するまでの時間を増加させ、且つ対象における循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のレベルを低減させる方法において有用であると考えられ、したがって１種以上の疾患、例えば癌を治療又は予防する方法において有用であると考えられる。本開示の目的のため、投与される活性剤（ＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤）の量又は用量は、例えば、妥当な期間にわたり、対象又は動物において、治療的又は予防的反応を生じさせるのに十分であるべきである。例えば、活性剤（ＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤）の用量は、投与の時点から約１～約４日間又は約１～約４週間以上、例えば約５～約２０週間以上の期間中に、本明細書で説明される癌を治療するのに十分であるべきである。特定の実施形態では、その期間は、更に長くなる可能性がある。用量は、特定の活性剤の有効性及び動物（例えば、ヒト）の状態並びに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。

【0102】

投与される用量を決定するための多くのアッセイが当技術分野において公知である。本明細書の目的のため、腫瘍重量を比較することを含むアッセイ、腫瘍量を表す全フラックス射出又は各組が異なる用量を与えられる哺乳動物の組の間で１体の哺乳動物に所与の用量の活性剤を投与した際の増殖指数を提供するＫｉ６７陽性細胞の割合（例えば相対的割合）若しくはｐ－ｐＲｂ－陽性細胞の割合を、臨床治験において哺乳動物に投与すべき開始用量を決定するために用いることができる。腫瘍重量、全フラックス又はＫｉ６７陽性細胞の割合（例えば相対的割合）若しくはｐ－ｐＲｂ－陽性細胞の割合を測定する方法は、当技術分野で既知であり、且つ本明細書で説明される。

【0103】

活性剤（ＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤）の用量は、特定の活性剤の投与に伴い得る任意の有害な副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。通常、主治医は、年齢、体重、全身の健康状態、食事、性別、投与される活性剤、投与経路及び治療される状態の重症度などの種々の要因を考慮して、個々の各患者を処置する活性剤の投与量を決定する。一例としてであり、本開示を限定することを意図しないが、本開示の活性剤の用量は、治療対象の体重１キロ当たり約０．０００１～約１ｇ／日、体重１キロ当たり約０．０００１～約０．００１ｇ／日又は体重１キロ当たり約０．０１～約１ｇ／日であり得る。

【0104】

制御放出性製剤
いくつかの実施形態では、活性剤が投与される身体に放出される様式が体内での時間及び位置に関して制御されるように、本明細書に記載される活性剤（ＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤）は、デポー形態に改変され得る（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号明細書を参照されたい）。活性剤（ＲＡＮＫ経路阻害剤及び／又はＣＤＫ阻害剤）のデポー形態は、例えば、活性剤及びポリマーなどの多孔性又は非多孔性材料を含むインプラント可能な組成物であり得、活性剤は、材料によって封入されるか若しくは材料全体に拡散され、且つ／又は非多孔性材料の分解によって拡散される。次に、デポーは、対象の体内の所望の位置にインプラントされ、活性剤が所定の速度でインプラントから放出される。

【0105】

特定の態様における活性剤を含む医薬組成物は、任意のタイプのインビボ放出プロファイルを有するように改変される。いくつかの態様では、医薬組成物は、即時放出、制御放出、持続放出、長期放出、遅延放出又は二段階放出製剤である。制御放出のためのペプチドを製剤化する方法は、当技術分野において知られている。例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ ３７４：４６－５２（２００９）並びに国際公開第２００８／１３０１５８号パンフレット、国際公開第２００４／０３３０３６号パンフレット、国際公開第２０００／０３２２１８号パンフレット及び国際公開第１９９９／０４０９４２号パンフレットを参照されたい。

【0106】

本組成物は、更に、例えば、ミセル若しくはリポソーム又は他の被包形態を含むことができるか、或いは長期の貯蔵及び／又は送達効果を提供するために長期放出形態で投与することができる。

【0107】

対象
本開示の例示的な実施形態では、対象は、マウス及びハムスターなどの齧歯目の哺乳動物及びウサギなどのウサギ目の哺乳動物、ネコ科動物（ネコ）及びイヌ科動物（イヌ）などの食肉目の哺乳動物、ウシ亜科動物（ウシ）及びイノシシ科動物（ブタ）などの偶蹄目の哺乳動物又はウマ科の動物（ウマ）を含む奇蹄目の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない哺乳動物である。いくつかの態様では、哺乳動物は、霊長目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄ）目若しくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄ）目（長尾小型のサル（ｍｏｎｋｅｙ））又は真猿亜目（ヒト及び短尾大型のサル（ａｐｅ））の哺乳動物である。いくつかの態様では、哺乳動物は、ヒトである。任意選択的に、ヒトは、１８歳以上の雌である。いくつかの態様では、ヒトは、雌である。様々な場合、対象は、閉経前／閉経期又は閉経後の女性である。

【0108】

例示的な態様では、対象は、癌又は腫瘍を有する。癌は、いくつかの態様では、急性リンパ球性癌（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨癌、脳癌、乳癌、肛門、肛門管又は肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢又は胸膜の癌、鼻、鼻腔又は中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌、大腸癌、食道癌、子宮頸癌、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、大網及び腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎癌（例えば腎細胞腫（ＲＣＣ））、小腸癌、軟組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌並びに膀胱癌からなる群から選択されるものである。特定の実施形態では、癌は、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌及び食道癌、膵臓、消化管癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌及び結腸直腸癌、肝細胞癌、グリア芽腫、膀胱癌、肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、細気管支肺胞上皮癌からなる群から選択される。特定の実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）頭頸部癌、腎癌、トリプルネガティブ乳癌又は胃癌である。例示的な態様では、対象は、腫瘍（例えば固形腫瘍、血液悪性腫瘍又はリンパ性悪性腫瘍）を有し、医薬組成物は、対象中の腫瘍を治療するのに有効な量で対象に投与される。他の例示的な態様では、腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部癌、腎癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、前立腺癌、胃癌、リンパ腫又は白血病であり、医薬組成物は、対象中の腫瘍を治療するのに有効な量で対象に投与される。

【0109】

例示的な態様では、対象は、転移癌、切除不可能な腫瘍又はこれらの組み合わせを含む癌を有する。様々な態様では、癌又は腫瘍は、ＣＤＫ阻害剤による治療に対する耐性又は低減された感受性を示すか又は既に示した。例示的な態様では、対象は、乳癌、任意選択的に管腔乳癌又はトリプルネガティブ乳癌を有する。様々な場合、乳癌は、ホルモン受容体（ＨＲ）陽性及び／又はＨＥＲ２陰性である。様々な態様では、乳癌は、進行性乳癌及び／又は転移性乳癌である。様々な態様では、対象は、内分泌療法を受けた後に進行したＨＲ＋／ＨＥＲ２－進行性又は転移性乳癌を有する。いくつかの態様では、対象は、過去に癌が拡散／転移した後に内分泌療法及び化学療法で治療された、ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）／ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２－）進行性又は転移性乳癌の患者である。様々な場合、対象は、閉経後の女性において過去にホルモン療法（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（化学名：アナストロゾール）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（化学名：エキセメスタン）及びＦｅｍａｒａ（化学名：レトロゾール）で治療されたことがないＨＲ＋／ＨＥＲ２－進行性又は転移性乳癌を有する。様々な場合、対象は、閉経後の女性においてホルモン療法で治療された後に成長したＨＲ＋／ＨＥＲ２－進行性又は転移性乳癌を有する。特定の態様では、対象は、初回内分泌療法としてのＨＲ＋ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性の進行性又は転移性乳癌を患う閉経前／閉経期又は閉経後の女性である。任意選択的に、対象は、初回内分泌療法として又は内分泌療法中の疾患進行後、ＨＲ＋、ＨＥＲ２－の進行性又は転移性乳癌を患う閉経後の女性である。例示的な態様では、ホルモン受容体は、エストロゲン受容体（ＥＲ）である。様々な態様では、対象は、内分泌療法を受けた後に進行したＥＲ＋／ＨＥＲ２－進行性又は転移性乳癌を有する。いくつかの態様では、対象は、過去に癌が拡散／転移した後に内分泌療法及び化学療法で治療された、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）／ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２－）進行性又は転移性乳癌の患者である。

【0110】

例示的な態様では、対象は、上記のＫｎｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｔｋｉｅｗｉｃｚ，２０１７に記載される癌又は腫瘍を有する。例示的な態様では、対象は、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、髄芽細胞腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、滑膜肉腫、ラブドイド腫瘍、ＭＰＮＳＴ、胃癌、膵神経内分泌癌、膵管腺癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、神経膠腫、黒色腫、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、腎癌、大腸癌、食道癌又は前立腺癌を有する。

【0111】

様々な場合、癌は、ＲＡＮＫ又はＲＡＮＫ－Ｌを発現する細胞を含む。様々な場合、癌は、ＲＡＮＫ又はＲＡＮＫ－Ｌを過剰発現する細胞を含む。例示的な実施形態では、癌の細胞は、ＲＡＮＫ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６又はサイクリンＤの１つ以上を過剰発現させる。例示的な態様では、対象は、増加したレベルの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を有する。例示的な態様では、癌の細胞は、ＲＡＮＫ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６若しくはサイクリンＤの１つ以上を過剰発現させ、且つ／又は対象は、増加したレベルのＣＴＣを有する。例示的な場合、方法は、任意選択的にＣＤＫ阻害剤と組み合わせてＲＡＮＫ経路阻害剤を対象に投与することを含む。例示的な実施形態では、対象は、ＣＤＫ阻害剤で治療されるか又は治療されており、及び（ｉ）癌の細胞は、ＲＡＮＫ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６若しくはサイクリンＤの１つ以上を過剰発現させるか、（ｉｉ）対象は、増加したレベルの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を有するか、又は（ｉｉｉ）これらの組み合わせであり、及び方法は、対象にＲＡＮＫ経路阻害剤を投与することを含む。いくつかの態様では、対象は、内分泌療法で治療されている。いくつかの態様では、対象は、内分泌療法中に疾患の進行を示した。様々な態様では、対象は、過去に癌が拡散／転移した後に内分泌療法及び化学療法で治療されている。いくつかの態様では、対象は、内分泌療法を受けた後に進行した進行性又は転移性乳癌を有する。

【0112】

例示的な態様では、癌又は腫瘍細胞は、上記のＫｎｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｔｋｉｅｗｉｃｚ，２０１７に記載されるように内因性耐性の１つ以上のマーカーが陽性である。例示的な態様では、癌又は腫瘍は、ＲＢの喪失、ｐ１６ＩＮＫ４の高い発現、サイクリンＥの過剰発現若しくはサイクリンＥ１／Ｅ２の増幅、Ｅ２Ｆ過剰発現若しくはＥ２Ｆ３増幅、サイクリンＤ１の増幅若しくは転座、ＣＤＫ４の増幅又はＣＤＫＮ２Ａの喪失を示す。例示的な態様では、癌又は腫瘍細胞は、上記のＫｎｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｗｉｔｋｉｅｗｉｃｚ，２０１７に記載されるように耐性及び感受性の１つ以上の推定マーカーが陽性である。

【0113】

以下の実施例は、本発明を単に例示するために与えるものであり、その範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0114】

実施例１
別段の定めがある場合を除き、本実施例は、本明細書に記載される研究に用いられる材料及び方法を記載する。

【0115】

細胞培養
全ての細胞株を最初にＡＴＣＣから入手した。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋及びＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（本明細書ではＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ－７によって指定される）は、Ｓｅｒｇｉｏ Ｄｉａｓ Ｌａｂ（ＩＭＭ）によって提供され、ＧＦＰ－ルシフェラーゼレンチウイルス粒子によるレンチウイルス形質導入及び純粋ＧＦＰ＋細胞集団の細胞選別によって親細胞から誘導された。ＭＤＡ－ＭＢ－４３６及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、Ｓｅｒｇｉｏ Ｄｉａｓ Ｌａｂ（ＩＭＭ）によって提供された。Ｔ４７Ｄ細胞は、ＩＮＳＥＲＭのＰｈｉｌｉｐｐｅ Ｃｌｅｚａｒｄｉｎによって提供された。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＭＣＦ－７及びＴ４７Ｄ細胞を、０．０１ｍｇ／ｍＬのインスリン（Ｇｉｂｃｏ）を追加的に補充した同じ培地で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２に保持した。

【0116】

ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）の過剰発現
レンチウイルス形質導入のために、ＭＣＦ－７及びＴ４７Ｄ細胞を６ウェルプレートに２×１０^５細胞／ウェルの密度で播種した。播種から２４時間後、培地を、異なる感染多重度（ＭＯＩ）でＲＡＮＫレンチウイルス過剰発現粒子（ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）過剰発現プラスミドｐＲｅｃｅｉｖｅｒ－Ｌｖ１２１（ＥＸ－Ｏ０００７－Ｌｖ１２１）、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）を含有する新鮮培地と交換した。細胞を、０．５μｇ／ｍＬ（ＭＣＦ－７）又は１．５μｇ／ｍｌ（Ｔ４７Ｄ）ピューロマイシン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で選択し、これは形質導入から３日後に開始した。ＲＡＮＫ過剰発現（ＲＡＮＫ ＯＥ）をＲＴ－ｑＰＣＲによって確認した。

【0117】

ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）ノックダウン
レンチウイルス形質導入のために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋細胞を２４ウェルプレートに４×１０^４細胞／ウェルの密度で播種した。播種から２４時間後、培地を、８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ）及びＲＡＮＫ ｓｈＲＮＡ（ｈ）レンチウイルス粒子（１５～２０μｌ／ウェル；ｓｃ－４２９６０－Ｖ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）又は対照ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子（１５～２０μｌ／ウェル；ｓｃ－１０８０８０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含有する新鮮培地と交換した。細胞を、０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）で選択し、これは形質導入から３日後に開始した。ＲＡＮＫ過剰発現ＫＤをＲＴ－ｑＰＣＲによって確認した。

【0118】

ＲＴ－ｑＰＣＲ
ｍＲＮＡ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ解析のために、ＮＺＹ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｎｚｙｔｅｃｈ）を製造業者の指示書に従って用いて細胞を８０～９０％コンフルエントまで成長させ、全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｃｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で定量化した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ～１μｇ）を、３７℃で、ＲＱ１ ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で製造業者の指示書に従って３０分間処理した。ＤＮアーゼＩで処理したＲＮＡを、ＮＺＹ Ｍ－ＭｕＬＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｎｚｙｔｅｃｈ）及びＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマーを製造業者の指示書に従って用いて逆転写させた。

【0119】

ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（製造業者の指示書に従う）並びにヒトＲＡＮＫ（ＰＰＨ０１１０２Ｃ、ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＧＡＰＤＨ（ＰＰＨ００１５０Ｆ、ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）用の特異的プライマーを用いて、ｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲによって増幅した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを用いて遺伝子発現を正規化し、相対的ｍＲＮＡ発現を、２－ΔΔＣｔ法を用いて計算した。

【0120】

ウェスタンブロット
ＲＡＮＫＬで刺激した際のＲＡＮＫ経路の活性化をウェスタンブロットによって解析した。この目的のため、４×１０^５個の細胞を６ウェルプレートに２４時間播種し、低血清培地（０．１％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で更に２４時間血清飢餓状態に置いた。培地を、１μｇ／ｍＬのヒトＲＡＮＫＬ（Ａｍｇｅｎ）を含有する新鮮な低血清培地と交換し、合計細胞溶解物を異なる時点で得た。合計細胞溶解物を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液を製造業者の指示書に従って用いて調製した。合計タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｉｃｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、製造業者の指示書に従って調製した定量化した。１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分解し、続いてｉＢｌｏｔ（登録商標）２ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って使用して、ニトロセルロース膜に転写した。

【0121】

β－アクチンの場合、ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ＰＢＳＴ）中５％の脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）中において又は他の抗体の場合、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）中において膜を室温（ＲＴ）で１時間ブロックした。４℃で終夜、膜を下記の特異的抗体でインキュベートした：マウス抗βアクチン抗体（Ａｂ６２７６；Ａｂｃａｍ）、ＮＦｋＢ ｐ６５に対するポリクローナルウサギ（ａｂ１６５０２，Ａｂｃａｍ）、ウサギモノクローナル抗体抗ＮＦ－ｋＢ ｐ６５（Ｄ１４Ｅ１２）（＃８２４２，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗ホスホ－ＮＦ－ｋＢ ｐ６５（Ｓｅｒ５３６）（９３Ｈ１）（＃３０３３，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウスモノクローナル抗体抗ＩｋＢα（Ｌ３５Ａ５）（＃４８１４，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗ホスホ－ＩｋＢα（Ｓｅｒ３２）（１４Ｄ４）（＃２８５９，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗ビメンチン（Ｄ２１Ｈ３）（＃５４７１，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗Ｎ－カドヘリン（Ｄ４Ｒ１Ｈ）（＃１３１１６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗β－カテニン（Ｄ１０Ａ８）（＃８４８０，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗Ｓｎａｉｌ（Ｃ１５Ｄ３）（＃３８７９，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗Ｓｌｕｇ（Ｃ１９Ｇ７）（＃９５８５，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗Ｅ－カドヘリン（２４Ｅ１０）（＃３１９５，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウスモノクローナル抗体抗Ｎａｎｏｇ（ｈＮａｎｏｇ．２）（１４５７６８－８０，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、マウスモノクローナル抗体抗Ｓｏｘ２（２４５６１０）（ＭＡＢ２０１８，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスモノクローナル抗体抗ＯＣＴ４（７Ｆ９．２）（ＭＡＢ４４１９，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギモノクローナル抗体抗ホスホ－Ｒｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１）（Ｄ２０Ｂ１２）（＃８５１６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗サイクリンＤ１（９２Ｇ２）（＃２９７８，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗サイクリンＥ（ＨＥ１２）（０５－３６３，Ｓｉｇｍａ）、ウサギモノクローナル抗体抗ＣＤＫ２（７８Ｂ２）（＃２５４６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗ＣＤＫ４（Ｄ９Ｇ３Ｅ）（＃１２７９０，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナル抗体抗ＣＤＫ６（ＤＣＳ８３）（＃３１３６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。ＰＢＳＴで洗浄した後、ＲＴで、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ）特異性二次抗体：抗マウスＨＲＰ ＩｇＧ及び抗ウサギＨＲＰ ＩｇＧ（１：５０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で２時間膜をインキュベートした。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＥＣＬ ＨＲＰ化学発光基質試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（製造者の使用説明書に従う）及びＣｕｒｉｘ６０プロセッサ（ＡＧＦＡ）又はＡｍｅｒｓｈａｍ（商標）Ｉｍａｇｅｒ６８０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で現像したＸ線フィルム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて、タンパク質を検出した。正規化したタンパク質発現を、ＦＩＪＩソフトウェア及びバンドデンシトメトリー解析を用いて計算した。

【0122】

フローサイトメトリ
ＲＡＮＫ発現解析のために、トリプシン処理した細胞を洗浄し、４℃の暗所でヒトＲＡＮＫ（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．）に対する特異的なマウス抗体を用いて３０分間インキュベートし、続いて洗浄し、４℃の暗所でｃｙ５ＩｇＭとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体（１：１００；Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて３０分間標識化した。染色後、標識化細胞を１２０ｇで遠心分離し、洗浄し、０．１％ＦＢＳを含む１×ＰＢＳに再懸濁し、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）上で取得した。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。

【0123】

腫瘍球体（ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）形成アッセイ
接着性の非コンフルエント細胞を採取し、３Ｄ Ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）中で洗浄し、超低接着６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）中の同じ培地中に、１０，０００細胞／ｍｌの密度で３重に播種した。７日後、１ウェル当たり直径＞５０μｍの全ての腫瘍球体を測定することにより、腫瘍球体の平均サイズを計算した。乳房球体の数（＞５０μｍ／播種細胞数）×１００として球体形成能力（ＳＦＣ）（％）を測定した。

【0124】

生存度アッセイ
細胞を、パクリタキセル（Ｙ００００６９８，Ｓｉｇｍａ）、ドキソルビシン塩酸塩（Ｄ２９７５０００，Ｓｉｇｍａ）、パルボシクリブ（ＰＤ ０３３２９９１イセチオン酸塩，ＰＺ０１９９，Ｓｉｇｍａ）、リボシクリブ（ＬＥＥ０１１コハク酸塩，ＳＣ－４８８１７４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、アベマシクリブメシル酸塩（ＬＹ２８３５２１９，Ｓ７１５８，Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、フルベストラント（Ｓ１１９１，Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、エベロリムス（＃７３１２２，ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、完全長ヒトＯＰＧ（ＳＲＰ３１３２，Ｓｉｇｍａ）及びＯＰＧ－Ｆｃ（Ａｍｇｅｎ）と共に又はこれなしに、９６ウェルプレート（２～５×１０^４細胞／ｍＬ）に播種した。培地を２日ごとに交換した。７日後、１：１０Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに添加し、インキュベーションから２時間後にＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）内で蛍光を測定した（励起：５６０ｎｍ；発光：５９０ｎｍ）。

【0125】

動物モデル
全ての動物実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｂｏｄｙの審査を受けて承認され、国立団体Ｄｉｒｅｃｃａｏ Ｇｅｒａｌ ｄｅ Ａｌｉｍｅｎｔａｃａｏ ｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ（ＤＧＡＶ）により認可を受けた。動物を伴う全ての研究では、マウスは、３Ｒの原則を適用した承認済み組織、国家及び国際ガイドラインに従って処理され、安楽死させられた。

【0126】

同所性異種移植片モデル
同所性ＭＣＦ－７異種移植片モデルのために、４週齢のＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に、乳癌細胞注入の６日前（第６日）に１７β－エストラジオール皮下ペレット（６０日放出、０．３６ｍｇ／ペレット、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）を補給した。ペレットは、中程度のイソフルラン麻酔下でマウスの肩甲骨中央領域にトロカールを用いて挿入した。

【0127】

成長の対数期に細胞を採取し、５０％フェノールフリーマトリゲル溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に２×１０^５細胞／ｍｌ（ＭＣＦ－７異種移植片）又は１．０×１０^６細胞／ｍｌ（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片）で再懸濁した。マウスの乳首基部に皮下注射することにより、１００μＬの細胞懸濁液を第２胸郭の脂肪体に直接に片側注射した。

【0128】

腫瘍成長を、週１回発光解析により監視した。マウスに１００μｌ／１０ｇ体重（ＢＷ）のＸｅｎｏＬｉｇｈｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ－Ｋ＋Ｓａｌｔ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を注射し、４分後、これらを７５ｍｇ／Ｋｇ ＢＷのケタミン＋１ｍｇ／Ｋｇ ＢＷのメデトミジンで麻酔した。約６分後、発光をＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ中でＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ３．０ソフトウェア（露光３０秒間；視野Ｄ１２．５ｃｍ；対象高さ：１．５ｃｍ）を用いて解析し、マウスを１ｍｇ／Ｋｇ ＢＷのアチパメゾールで回復させた。

【0129】

ＭＣＦ－７薬物感受性実験のために、マウスを生物発光によって測定した腫瘍サイズに基づいて無作為化し、パルボシクリブ２５ｍｇ／Ｋｇ／日（ｐ．ｏ．）（ＰＤ ０３３２９９１イセチオネート，ＰＺ０１９９，Ｓｉｇｍａ）及びフルベストラント１ｍｇ／日（ｓ．ｃ．）（Ｓ１１９１，Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）又はビヒクル（０．１Ｍの乳酸ナトリウム（Ｌ７９００，Ｓｉｇｍａ）並びに９５％コーン油（Ｃ８２６７，Ｓｇｍａ）、５％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ））で治療した。

【0130】

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１薬物感受性実験のために、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスを生物発光によって測定した腫瘍サイズに基づいて無作為化し（ｎ＝２／群）、パルボシクリブ２５ｍｇ／Ｋｇ／日（ｐ．ｏ．）；ＯＰＧ－Ｆｃ １０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）、週２回；又はパルボシクリブ＋ＯＰＧ－Ｆｃ１０ｍｇ／Ｋｇで治療した。

【0131】

マウスに０．２５ｍｇ／Ｋｇ ＢＷのペントバルビタールナトリウム（Ｅｕｔａｓｉｌ）を投与することで犠牲にした。剖検時、原発腫瘍を採取して、パラフィン包埋又はスナップショットフリージング（ｓｎａｐｓｈｏｔ ｆｒｅｅｚｉｎｇ）のために２つの断片に切断した。臓器を採取してパラフィン包埋した。

【0132】

実験的転移モデル
ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの尾静脈中に、２．５×１０^６細胞／ｍｌで、ＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（親）又はＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）細胞を植菌した（ｎ＝３／群）。腫瘍植菌から２時間後及び実験終了まで毎週、腫瘍を生物発光によって画像化した。

【0133】

ＣＴＣ解析のために、犠牲前に、心穿刺により、５μｌのＥＤＴＡ、０．５Ｍ（ｐＨ８．０）を含む１．５ｍＬの遠心管に静脈血を回収した。ＲＴで、１×ＲＢＣ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ Ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｅｓ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって１３分間インキュベートすることによって赤血球を溶解した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａ ２フローサイトメーター中で試料のＧＦＰ発現を解析した。

【0134】

免疫組織化学
Ｋｉ６７及びｐ－ｐＲｂ（Ｓｅｒ８０７／１１）を検出するために、ＦＦＰＥ試料からの５μｍの組織切片を免疫組織化学（ＩＨＣ）によって染色した。ＰＴ Ｌｉｎｋ Ｐｒｅ－Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ（Ｄａｋｏ）内で、抗原賦活化溶液ｐＨ９．０を用いて、９４℃で２０分間脱パラフィン及び抗原賦活化を実施した。ＲＴで１０分間Ｐｒｅｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ）で内因性ペルオキシダーゼをブロックし、ＲＴで２０分間Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ）でインキュベートすることにより全タンパク質をブロックした。スライドを、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ）中、ウサギ抗ヒトＫｉ６７一次抗体（１：１００，ＭＩＢ－１，Ｄａｋｏ）又はウサギモノクローナル抗体抗ホスホ－Ｒｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１）（Ｄ２０Ｂ１２）（１：４００，＃８５１６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で３０分間インキュベートした。スライドを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ウサギ／マウス（Ｄａｋｏ）で製造業者の指示書に従ってインキュベートし、続いてＤＡＢ（Ｄａｋｏ）で５分間インキュベートした。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、Ｑｕｉｃｋ－Ｄ封入剤（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ）で封入し、明視野顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＩＣＣ５０ ＨＤカメラを備えるＬｅｉｃａＤＭ７５０）で可視化した。全核領域（ヘマトキシリン染色核領域）にわたるＤＡＢ染色核領域の割合を計算することによって免疫比を得た（５野、４００×、ＩｍａｇｅＪソフトウェア）。

【0135】

統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いてデータを解析した。各実験で実施された複製の回数は示されている。一方向ＡＮＯＶＡ又は対応のないｔ検定（インビトロ実験）；双方向ＡＮＯＶＡ（腫瘍量及びマウスＢＷ）によって統計を実施した。結果は平均±ＳＥＭとして示され、ｐ値＜０．０５は有意であると見なされた。生存解析はカプラン・マイヤー法及びログランク検定並びにＣｕｔｏｆｆ ｆｉｎｄｅｒソフトウェアを使用した（Ｂｕｄｃｚｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１２），ＰＬｏＳ ＯＮＥ７（１２）：ｅ５１８６２．）。

【0136】

実施例２
本実施例は、ＲＡＮＫ過剰発現癌細胞の生成及び特性評価を示す。ＬＢＣ細胞は、通常低レベルのＲＡＮＫを発現する。これに関連して、ＲＡＮＫ発現レベルの効果を試験するため、親細胞株を用い、レンチウイルス形質導入によってＲＡＮＫ過剰発現（ＯＥ）細胞を生成した。要約すると、ＭＣＦ－７及びＴ４７Ｄ細胞のそれぞれをマルチウェルプレートに播種し、続いてＲＡＮＫレンチウイルス過剰発現粒子を含有する新鮮培地に曝露した。細胞をピューロマイシン二塩酸塩で選択し、これは形質導入後３日で開始した。ＲＡＮＫの過剰発現をＲＴ－ｑＰＣＲ（図１Ａ）及びフローサイトメトリ（図１Ｂ）によって確認した。図１Ａに示すように、ＭＣＦ－７ ＯＥ細胞及びＴ４７Ｄ ＯＥ細胞の両方が、その親対応物と比較してＲＡＮＫ発現の増加を示した。また、図１Ｂに示すように、Ｔ４７Ｄ ＯＥ細胞は、フローサイトメトリによって決定して、親対応物と比較してより高いＲＡＮＫ発現を実証した。

【0137】

次に、ＭＣＦ－７ ＯＥ細胞及びＴ４７Ｄ ＯＥ細胞を可溶性ＲＡＮＫリガンド（ｓＲＡＮＫＬ）で刺激し、続いてＩｋＢα、ＮＦｋＢ、ＥＲＫ及びＡＫＴをウェスタンブロットリン酸化によって解析することによってＲＡＮＫ ＯＥ細胞の下流シグナル伝達を試験した。この目的のためにＩｋＢαの分解も決定した。図１Ｃに示すように、刺激されたＭＣＦ－７ ＯＥ細胞及びＴ４７Ｄ ＯＥ細胞は、ＲＡＮＫ経路活性の増加を示した。

【0138】

上皮マーカー（β－カテニン及びＥ－カドヘリンを含む）、間葉マーカー（Ｎ－カドヘリン、ビメンチン、Ｓｎａｉｌ及びＳｌｕｇを含む）及び幹細胞マーカー（ＳＯＸ２、Ｏｃｔ４及びＮＡＮＯＧを含む）の発現レベルを解析することにより、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞の表現型を試験した。図２Ａに示すように、ＭＣＦ－７ ＯＥ細胞は、β－カテニンの発現の減少及び間葉マーカーの発現の増加を実証した。図２Ｂは、ＭＣＦ－７ ＯＥ細胞及びＴ４７Ｄ ＯＥ細胞並びにこれらの親対応物の幹細胞マーカー発現レベルを示す。図２Ｂに示すように、ＯＥ細胞は、幹細胞マーカーＳＯＸ２、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧを過剰発現し、それにより、幹細胞様の特徴を実証する。

【0139】

ＲＡＮＫ ＯＥ細胞の球体形成能力（ＳＦＣ）を解析することによってＲＡＮＫ ＯＥ細胞表現型も特性評価した。要約すると、接着性の非コンフルエント細胞を採取し、洗浄し、超低接着マルチウェルに播種し、１ウェル当たり直径＞５０μｍの全ての腫瘍球体を測定することにより、腫瘍球体の平均サイズを計算した。（＞５０μｍの乳房球体の数／播種細胞数）×１００として球体形成能力（ＳＦＣ）（％）を測定した。このアッセイからのデータを図２Ｃのグラフにプロットする。ここに示されるように、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞（ＭＣＦ－７ ＯＥ及びＴ４７Ｄ ＯＥ細胞の両方）のＳＦＣ％は、低レベルでＲＡＮＫを発現するこれらの親対応物よりも高かった。

【0140】

本実施例は、ＲＡＮＫ ＯＥ ＬＢＣ細胞の生成及びその親対応物と比較したこれらの細胞の表現型の差異を実証した。

【0141】

実施例３
本実施例は、ＲＡＮＫ過剰発現が、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性の減少と相関していることと、ＲＡＮＫ経路遮断が、管腔乳癌（ＬＢＣ）及びトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞をＣＤＫ４／６阻害剤に対して感受性にすることとを実証する。

【0142】

実施例２に示されるように、ＲＡＮＫ ＯＥ ＬＢＣ細胞は変化した表現型を示した。次に、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞もその親対応物と異なるかどうかを、ＬＢＣの治療に一般に用いられる標的化療法に対するこれらの反応によって試験した。具体的には、ホルモン療法に対するＲＡＮＫ ＯＥ細胞の反応性を試験した。要約すると、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞を、マルチウェルプレートに播種し、フルベストラントに７日間曝露した。細胞生存度をＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって評価し、結果を図３に示す。この図に示すように、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞は、フルベストラントに対する感受性の低減を示した。

【0143】

類似の薬物感受性アッセイを用いて、ＣＤＫ４／６阻害剤に対するＲＡＮＫ ＯＥ細胞の感受性を試験した。しかしながら、このアッセイでは、これに関連してＲＡＮＫ経路遮断の効果を試験するために、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞を、単体の又はＲＡＮＫ経路の阻害剤と組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤に曝露した。要約すると、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞をマルチウェルプレートに播種し、単体の又はＯＰＧ－Ｆｃと組み合わせた、パルボシクリブ、リボシクリブ又はアベマシクリブに７日間曝露した。オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は、ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）の生理学的に可溶性のデコイ受容体であり、ＯＰＧ－Ｆｃは、ＩｇＧ１抗体のＦｃドメインと融合したＯＰＧの４つのシステイン豊富ドメイン（Ｄ１～Ｄ４）のみを含む融合タンパク質である。細胞生存度をＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって評価し、結果を図４に示す。図４に示すように、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞は、試験されたＣＤＫ４／６阻害剤のそれぞれに対する感受性の低減を実証した（赤い線）。興味深いことに、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞が、ＲＡＮＫ経路の阻害剤（ＯＰＧ－Ｆｃ）と組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤に曝露されると、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性は、低レベルでＲＡＮＫを発現する親対応物細胞によって実証されたものと同様のレベルに回復する。これらの結果は、ＲＡＮＫ経路の阻害剤と組み合わせてＣＤＫ４／６阻害剤を使用することにより、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性は、回復され得ることを示唆する。

【0144】

実施例４
本実施例は、高いＲＡＮＫ発現レベルはＣＤＫ４／６併用療法に対する耐性と相関することと、ＲＡＮＫ経路の阻害によってＣＤＫ４／６併用療法に対する感受性が回復することとを実証する。

【0145】

上記のデータは、高いＲＡＮＫ発現レベルは、療法に対する耐性と関連することを示し、ＲＡＮＫ経路の阻害により、化学治療に対する感受性が回復又は誘発されることを示唆する。これらの概念は、ＣＤＫ４／６阻害剤併用療法に対するＲＡＮＫ ＯＥ細胞の感受性を、単体で又はＲＡＮＫ経路の阻害剤との更なる組み合わせで試験することによって更に裏付けられる。この研究では、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ及びリボシクリブを、フルベストラント又はエベロリムスと組み合わせてＲＡＮＫ ＯＥ細胞に曝露した。この併用療法を、続いて、単体で又はＲＡＮＫ経路の阻害剤であるＯＰＧと組み合わせて試験した。ＯＰＧ－Ｆｃを利用する前述の実施例とは対照的に、このアッセイでは、完全長ＯＰＧタンパク質を用いた。このアッセイは、本質的には上記の実施例１～３で説明されるとおりに実施し、結果は図５に示す。

【0146】

図５に示すように、親対応物（黒棒線）と比較して増加した細胞生存度によって示されるとおり、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞は、ＣＤＫ４／６阻害剤併用療法（パルボシクリブ＋フルベストラント；パルボシクリブ＋エベロリムス；リボシクリブ＋フルベストラント；リボシクリブ＋エベロリムス（赤棒線））に対する感受性の低減を示した。ＣＤＫ４／６阻害剤併用療法を、ＲＡＮＫ経路の阻害剤（ＯＰＧ）と更に組み合わせると、ＣＤＫ４／６阻害剤併用療法に対する感受性は、親対応物のレベルまで回復した。

【0147】

実施例５
本実施例は、ＲＡＮＫ経路は、ＣＤＫ４／６阻害剤に対するトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の内因性耐性に寄与することと、ＲＡＮＫのノックダウン発現によるＲＡＮＫ経路の阻害により、ＣＤＫ４／６阻害剤療法に対する感受性が回復することとを実証する。

【0148】

実施例２～４に記載される研究では、ＲＡＮＫを安定して過剰発現するように改変された管腔乳癌細胞を用いて、ＲＡＮＫ発現レベルとＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性との関係を実証した。トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、ＣＤＫ４／６阻害剤療法に対する耐性を過去に示している（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９．Ｆｉｎｎ Ｒ ｅｔ ａｌ ＳＡＢＣＳ ２００８，Ｆｉｎｎ ＲＳ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９；１１（５）：Ｒ７７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．２１４７／ＢＣＴＴ．Ｓ４６７２５ ａ ｒｅｖｉｅｗ）。こうして、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＴＮＢＣ細胞によって示されるＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性を、ＲＡＮＫノックダウン（ＫＤ）クローンのそれと比較した。

【0149】

最初に、感受性アッセイで使用するためにＲＡＮＫ ＫＤクローンを生成した。要約すると、ＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋細胞をマルチウェルプレートに播種し、続いて、ＲＡＮＫ ｓｈＲＮＡ（ｈ）レンチウイルス粒子又は対照ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子を含む新鮮培地に曝露した。ピューロマイシン二塩酸塩を用いて形質導入細胞を選択し、これは形質導入後３日で開始した。ＲＡＮＫ ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子に曝露された細胞によるＲＡＮＫ発現のノックダウンをＲＴ－ｑＰＣＲによって確認し、これらの細胞のＲＡＮＫ発現のレベルを、対照ｓｈＲＮＡレンチウイルス粒子で形質導入した細胞によるＲＡＮＫ発現と比較した（図６Ａ）。ＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性は、ＴＮＢＣ ＲＡＮＫ ＫＤ細胞（ＭＤＡ－２３１ ｓｈＲＡＮＫ）、非形質導入ＴＮＢＣ細胞（ＭＤＡ－２３１）又は対照レンチウイルス粒子で形質導入した（ＭＤＡ－２３１ｓｈ対照）細胞を用いた点を除いて、本質的に前述の実施例で記載したとおりに試験し、アッセイの結果を図６Ｂに示す。図６Ｂに示すように、ＭＤＡ－２３１細胞及びＭＤＡ－２３１ ｓｈ対照細胞の両方は、ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ及びリボシクリブに対する耐性を実証した。興味深いことに、ＴＮＢＣ ＲＡＮＫ ＫＤ細胞は、ＲＡＮＫ発現細胞（ＭＤＡ－２３１細胞及びＭＤＡ－２３１ ｓｈ対照細胞）と比較して、これらのＣＤＫ４／６阻害剤の両方に対して回復した感受性を実証した。

【0150】

実施例６
本実施例は、ＲＡＮＫ経路は、ＣＤＫ４／６阻害剤に対するトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）の内因性耐性に寄与することと、ＲＡＮＫ経路の阻害によってＣＤＫ４／６阻害剤療法に対する感受性が回復することとを実証する。

【0151】

ＣＤＫ４／６阻害剤であるパルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブに対する感受性は、ＬＢＣ細胞の代わりにＴＮＢＣ細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）を用いた点を除いて、本質的に前述の実施例に記載されるとおりに試験した。ＴＮＢＣ細胞を、単体の又はＲＡＮＫ経路阻害剤であるＯＰＧ－Ｆｃと組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤に曝露した。結果を図７に示す。

【0152】

図７に示すように、ＴＮＢＣ細胞は、試験されたＣＤＫ４／６阻害剤のそれぞれに対する耐性を実証した。興味深いことに、細胞がＲＡＮＫ経路阻害剤（ＯＰＧ－Ｆｃ）と組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤に曝露されると、ＯＰＧ－Ｆｃを含まないＣＤＫ４／６阻害剤で治療された細胞と比較して低減した細胞生存度によって示されるように、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性は回復した。

【0153】

ＲＡＮＫ経路遮断も、ＴＮＢＣ細胞をＣＤＫ４／６阻害剤に対して感受性にすることができる。３つのＴＮＢＣ細胞株及び３つの利用可能なＣＤＫ４／６阻害剤のパネルを用いて、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ－Ｆｃ）が療法に対する感受性を回復したために、ＲＡＮＫ経路がパルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブに対する耐性を媒介することが実証される（図７）。

【0154】

実施例７
本実施例は、ＲＡＮＫ経路の遮断が、サイクリン／ＣＤＫ複合体に伴われるタンパク質の上方制御された発現を抑止することを実証する。

【0155】

ＲＡＮＫ ＯＥ細胞がＣＤＫ４／６阻害剤に対して低感受性である理由を理解するために、サイクリン／ＣＤＫ複合体に伴われるタンパク質の発現を解析した。要約すると、パルボシクリブに０時間、２４時間又は７２時間曝露したＲＡＮＫ ＯＥ（ＭＤＦ－７ ＯＥ）細胞の細胞溶解物をウェスタンブロットすることによってサイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＥ及びＣＤＫ２の発現を解析して、親対応物細胞（低レベルのＲＡＮＫを発現する；ＭＣＦ－７細胞）の対応する発現レベルと比較した。ＲＡＮＫ ＯＥ細胞は、親対応物細胞と比較してサイクリンＤ１、ＣＤＫ４、サイクリンＥ及びＣＤＫ２の発現の増加を実証し、ＣＤＫ４／６阻害剤に曝露されるとサイクリンＤ１、ＣＤＫ４及びＣＤＫ２は増加した。

【0156】

ＲＡＮＫ ＯＥ細胞及び低レベルのＲＡＮＫを発現する対応する親細胞で同じアッセイを実施したが、但し、今回は、細胞を、単体の又は１０ｎｇ／ｍＬ若しくは１００ｎｇ／ｍＬのＯＰＧ－Ｆｃと組み合わせたパルボシクリブに７日間曝露した点が異なる。ＲＡＮＫ経路をＯＰＧ－Ｆｃで阻害すると、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞はＣＤＫ４の上方制御をそれ以上示さなかった。これらのデータは、サイクリン／ＣＤＫ複合体に伴われるＣＤＫ４の上方制御は、ＲＡＮＫ経路が阻害されると抑止されることを示唆する。

【0157】

実施例８
本実施例は、ＲＡＮＫを過剰発現するように改変された管腔ＢＣ細胞のインビボ成長の特性評価を実証する。

【0158】

癌細胞のインビボ成長に対するＲＡＮＫ発現の効果を決定するため、ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの第２胸郭の乳腺脂肪体に、（１）ＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（親）細胞、（２）ＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）細胞、又は（３）これらの組み合わせ（ＭＣＦ－７ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋及びＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥを１：１比）（ミックス）を植菌した。本研究では、各群は５匹のマウスを含んだ。腫瘍植菌後、植菌した癌細胞から形成された得られた腫瘍を生物発光によって研究完了まで毎週画像化した（１２週間）。植菌後１２週間における一連の腫瘍の代表的画像を図９Ａに示し、放射された光子／秒を表し、腫瘍量の定量化を可能にする全フラックスを図９Ｂに示し、増殖の指数を表すＫｉ６７陽性細胞の割合を図９Ｃに示す。これらの図に示すとおり、ＲＡＮＫを過剰発現する細胞から形成された腫瘍は、成長及び増殖速度の低減を示した。

【0159】

増殖速度の低減がＲＡＮＫＬの有効性に起因したものか否かを決定するため、ＮＳＧマウスに上記の親、ＲＡＮＫ ＯＥ又はミックス細胞の１つを植菌し、ヒト可溶性ＲＡＮＫＬ又はビヒクル対照で皮下治療した。図１０Ａ～１０Ｃに示すように、ｓＲＡＮＫＬの投与は腫瘍成長に影響を与えなかった。

【0160】

ＲＡＮＫを過剰発現する細胞がインビボでより侵襲性であったか否かを決定するために、実験的転移モデルを実施した。要約すると、ＮＳＧマウスの尾静脈に親又はＲＡＮＫ ＯＥ細胞を植菌した。各群は３匹のマウスを含んだ。植菌から２時間後、生物発光によって肺播種が確認され、腫瘍植菌後の毎週、実験終了まで、植菌癌細胞から形成された得られた腫瘍を画像化した。植菌後（ｐ．ｉ．）時間に対して指定された時点における一連の腫瘍の代表的画像を図１１Ａに示し、全フラックスを図１１Ｂに示し、マクロ転移（剖検時のエクスビボ生物発光によって評価される）を図１１Ｃに示し、骨病変上の全フラックス、肺上の全フラックス及び循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の数を、図１１Ｄ、図１１Ｅ及び図１１Ｆにそれぞれ示す。これらの図に示すように、低レベルのＲＡＮＫを発現する親細胞株と比較して、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞は、肺及び骨中では同等に転移性であるが、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞を植菌したマウスはＣＴＣ数の増加を示した。後者の観察は、より間葉性の表現型と一致し、攻撃的な潜在力を強化する。

【0161】

実施例９
本実施例は、ＲＡＮＫを過剰発現するように改変されたＬＢＣ細胞のホルモン療法と組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤に対するインビボ感受性を実証する。

【0162】

ＮＳＧマウスの第２胸郭の乳腺脂肪体に、（１）ＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（親）細胞、（２）ＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）細胞、又は（３）これらの組み合わせ（ＭＣＦ－７ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋及びＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥを１：１比）（ミックス）を植菌した。本研究では、各群は３～４匹のマウスを含んだ。腫瘍植菌後、植菌した癌細胞から形成された得られた腫瘍を生物発光によって研究完了まで毎週画像化した。植菌後１２週間で、マウスを腫瘍サイズに基づいて群に無作為化し、（Ａ）フルベストラントと組み合わせた、７日間の腫瘍退縮用量のパルボシクリブ（Ｖｉｊａｙａｒａｇｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８，ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ １５９１６（２０１７）；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５９１６に基づいて）、又は（Ｂ）ビヒクル対照で治療した。全フラックスを図１２Ａに示し、剖検時の腫瘍重量を図１２Ｂにグラフ化し、Ｋｉ６７陽性細胞の割合（増殖の指数を表す）を図１２Ｃに示し、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）の発現を図１２Ｄに示す。図１２Ａに示すように、併用治療（パルボシクリブ及びフルベストラント）は、ＭＣＦ－７異種移植片中で退縮を誘発することができたが、ＭＣＦ－７^ＯＥ又は混合異種移植片に対してはできなかった（図１２Ａ）。ＭＣＦ－７異種移植片に対する治療は、パルボシクリブ及びフルベストラントで治療しなかった腫瘍と比較しての、犠牲時の腫瘍重量の減少（図１２Ｂに示すとおり）、増殖指数の減少（図１２Ｃに示すとおり）及びＣＣＮＤ１発現の減少（図１２Ｄに示すとおり）によって確認された。これらのデータは、ＲＡＮＫを過剰発現する細胞から形成された腫瘍は、インビボでのパルボシクリブ及びフルベストラントとの併用療法に対する耐性を示したことを実証する。

【0163】

実施例１０
本実施例は、インビボでのＲＡＮＫ経路阻害が、乳癌細胞をＣＤＫ４／６阻害剤に対して感受性にするという概念実証を実証する。

【0164】

ＲＡＮＫ経路遮断（ＯＰＧ－Ｆｃ）と組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）に対するＴＮＢＣ異種移植片の感受性を試験するための予備研究を実施した。要約すると、ＮＳＧマウスの第４腹部の乳腺脂肪体の両側に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋細胞を植菌した（ｎ＝２／群）。植菌後７週間で、マウスを腫瘍サイズに基づいて群に無作為抽出し、続いて（Ａ）ＯＰＧ－Ｆｃ（１０ｍｇ／Ｋｇ、ｉ．ｐ．、１週間に２回）、（Ｂ）パルボシクリブ（２５ｍｇ／Ｋｇ／日、ｐ．ｏ．）、又は（Ｃ）これらの組み合わせで治療した。実験設計の概略を図１３Ａに示す。実験全体を通して体重を測定し、結果を図１３Ｂに示す。この図に示すように、体重は群間で変わりなかった。Ｋｉ６７陽性細胞及びｐ－ｐＲｂ陽性細胞の定量化によって測定した腫瘍の増殖指数を図１３Ｄに示す。図１３Ｃは、Ｋｉ６７染色又はｐ－ｐＲｂ染色細胞の一連の画像である。これらの図に示すように、パルボシクリブ及びＯＰＧ－Ｆｃで治療した腫瘍は、Ｋｉ６７及びｐ－ｐＲｂ発現の有意な低減を実証した。これらのデータは、ＲＡＮＫ経路遮断が、トリプルネガティブ腫瘍を、パルボシクリブなどのＣＤＫ４／６阻害剤による治療に対して感受性にすることを裏付けする。

【0165】

実施例１１
本実施例は、管腔乳癌及びトリプルネガティブ乳癌の両方における、ＲＡＮＫ経路遮断と組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤に対する感受性を試験するための２つの研究の設計を説明する。

【0166】

ＴＮＢＣに対する第１の研究では、ＮＳＧマウスの第４腹部の乳腺脂肪体の両側に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋細胞を植菌する（ｎ＝５／群）。腫瘍植菌後、腫瘍が約１００ｍｍ^３に達するまで生物発光によって毎週腫瘍を画像化する（例えば、約４週間）。腫瘍が約１００ｍｍ^３に達したら、マウスを腫瘍サイズに基づいて群に無作為化し、（１）プラセボ（０．１Ｍ乳酸ナトリウム、ｐ．ｏ．＋ＰＢＳ、ｉ．ｐ．）、（２）パルボシクリブ（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｐ．ｏ．）、（３）ＯＰＧ－Ｆｃ（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎週２回）、（４）ＯＰＧ－Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎週２回）、（５）（２）と（３）との組み合わせ又は（６）（２）と（４）との組み合わせで治療する。実験設計の概略を図１４Ａに示す。

【0167】

ＬＢＣに対する第２の研究では、ＮＳＧマウスに１７βエストラジオールペレットを２日間補充し、その後、（１）ＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（親）又は（２）ＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）を植菌する。腫瘍植菌後、腫瘍が約１００ｍｍ^３に達するまで生物発光によって毎週腫瘍を画像化する（例えば、約４週間）。腫瘍が約１００ｍｍ^３に達したら、マウスを腫瘍サイズに基づいて群に無作為化し、（１）プラセボ（０．１Ｍ乳酸ナトリウム、ｐ．ｏ．＋ＰＢＳ、ｉ．ｐ．）、（２）パルボシクリブ（２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｐ．ｏ．）、（３）ＯＰＧ－Ｆｃ（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎週２回）、（４）ＯＰＧ－Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、毎週２回）、（５）（２）と（３）との組み合わせ又は（６）（２）と（４）との組み合わせで治療する。実験設計の概略を図１４Ｂに示す。

【0168】

研究終了時に全生存（ＯＳ）、腫瘍量及び腫瘍退縮を測定する。

【0169】

これらの研究では、ＲＡＮＫ経路遮断と組み合わせたＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）に対するＴＮＢＣ（図１４Ａ）及びエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）乳癌（管腔ＢＣ）（図１４Ｂ）の感受性を試験する。ＣＤＫ４／６阻害剤とＲＡＮＫ経路遮断との組み合わせは、腫瘍退縮を増加させ、全生存を増加させることが予期される。

【0170】

実施例１２
本実施例は、トリプルネガティブ乳癌又は管腔乳癌を患うヒト対象を治療するためにデノスマブとＣＤＫ４／６阻害剤との組み合わせの安全性及び有効性を決定するための臨床治験の設計を説明する。

【0171】

１．トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）
ＴＮＢＣ試験に適格な患者の特性には、アントラサイクリン及びタキサンを含む進行性疾患向け化学療法レジメンを少なくとも２回且つ５回以下投与された、ＲＥＣＩＳＴ１．１に従って骨外性部位に測定可能な疾患を有する、切除不能又は転移性のトリプルネガティブ乳癌を患う１８歳以上が含まれる。患者は適切な骨髄、肝及び腎機能並びに０～２の米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態、のみならず３ヵ月以上の平均余命を有さなければならない。

【0172】

不的確な患者の特性（例えば重要除外基準）には、任意の治験薬の使用又は研究の４週間以内の治療、研究の３週間以内の化学療法又は放射線の使用、治療されて安定であるものを除く既知の脳転移及びデノスマブによる治療歴が含まれる。

【0173】

全ての患者は書面によるインフォームド・コンセントを提出しなければならず、研究の許可は中央倫理委員会から得る。全ての手順は、世界医師会（Ｗｏｒｌｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、ＷＭＡ）ヘルシンキ宣言改訂版（ＷＭＡ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｓｓｅｍｂｌｙ，Ｔｏｋｙｏ，２００４）、医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ（ＩＣＨ）ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｕｓｅ）、臨床試験実施基準（ｇｏｏｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）並びに現地の倫理的及び法的要件に合致する。

【0174】

本治験プロトコルの目的は、第２相臨床治験における、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせた、Ｑ４Ｗでの１２０ｍｇ標準用量のデノスマブの活性を評価することである。試験されるべき追加のレジメンには、最初の２ヶ月間で２週間毎に１２０ｍｇ、続いて１２０ｍｇ Ｑ４Ｗのレジメンが含まれる。治療は、疾患の進行、死、許容不可能な毒性、患者による同意の撤回又は臨床医による患者を中止させる決定に至るまで実施する。

【0175】

本研究の主要エンドポイントは、ＲＥＣＩＳＴ１．１に従って安定疾患（ＳＤ）、部分的奏功（ＰＲ）又は完全奏功（ＣＲ）を有する患者の総数によって定義される疾病管理率（ＤＣＲ）である。副次的エンドポイントは、以下を含む。

【0176】

【表5】

【0177】

本研究は、以下の治験設計の１つに従い実施する：単一アーム、サイモンの２段階設計：全ての患者は１２０ｍｇ、Ｑ４ＷのＣＤＫ４／６阻害剤及びデノスマブで治療される。ＥＭＢＲＡＣＥ試験の主治医選択治療（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ ｏｆ Ｃｈｏｉｃｅ、ＴＰＣ）アームの歴史的比較（Ｅｒｉｂｕｌｉｎ； Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌｕｍｅ ３７７，ＩＳＳＵＥ ９７６９，Ｐ９１４－９２３，Ｍａｒｃｈ １２，２０１１ ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１１）６００７０－６）；又は選択バイアス及び交絡を排除するためのＣＤＫ阻害剤＋デノスマブ１２０ｍｇ Ｑ４Ｗと主治医選択治療（ＴＰＣ）との間での２：１無作為化（ＥＭＢＲＡＣＥ試験からのデータは２０００年の最初の１０年間からのものである）；患者は、先行の化学療法レジメンの数（２又は＞２）及び肝臓／肺への転移（はい／いいえ）で層別化される。

【0178】

２．管腔乳癌（ＬＢＣ）
ＬＢＣ試験に適格な患者の特性には、過去にＣＤＫ４／６阻害剤又は内分泌療法（ＥＴ）を受けていない、ＲＥＣＩＳＴ１．１に従って測定可能な疾患を有する（骨外性部位に）、切除不可能又は転移性のエストロゲン受容体（ＥＲ）／プロゲステロン受容体（ＰＲ）のいずれかに陽性のｃ－ｅｒｂＢ２陰性乳癌を患う１８歳以上であることが含まれる。進行性疾患に対して１つの化学療法レジメンが許可される。閉経前の患者は、外科的又は化学的去勢を受けなくてはならない。

【0179】

患者は適切な骨髄、肝及び腎機能並びに０～２の米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）の一般状態、のみならず３ヵ月以上の平均余命を有さなければならない。

【0180】

不的確な患者の特性（例えば重要除外基準）には、任意の治験薬の使用又は研究の４週間以内の治療、研究の３週間以内の化学療法又は放射線の使用、治療されて安定であるものを除く既知の脳転移又はデノスマブによる治療歴が含まれる。

【0181】

全ての患者は書面によるインフォームド・コンセントを提出しなければならず、研究の許可は中央倫理委員会から得る。全ての手順は、世界医師会（Ｗｏｒｌｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、ＷＭＡ）ヘルシンキ宣言改訂版（ＷＭＡ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｓｓｅｍｂｌｙ，Ｔｏｋｙｏ，２００４）、医薬品規制調和国際会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ（ＩＣＨ）ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｕｓｅ）、臨床試験実施基準（ｇｏｏｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）並びに現地の倫理的及び法的要件に合致する。

【0182】

本治験プロトコルの目的は、第２相臨床治験における、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせた、Ｑ４Ｗでの１２０ｍｇ標準用量のデノスマブの活性を評価することである。試験されるべき追加のレジメンには、最初の２ヶ月間で２週間毎に１２０ｍｇ、続いて１２０ｍｇ Ｑ４Ｗのレジメンが含まれる。治療は、進行、死、許容不可能な毒性、臨床医の判断又は患者の同意の撤回まで行われる。

【0183】

本研究の主要エンドポイントは、ＲＥＣＩＳＴ１．１に従い安定疾患（ＳＤ）又は部分的奏功（ＰＲ）を有する患者の合計によって定義される、骨外性疾患（ＥＳＤ）における客観的奏功率（ＯＲＲ）である。副次的エンドポイントは、以下を含む。

【0184】

【表6】

【0185】

治験設計は以下の特徴を含む：（１）患者は、肺／肝臓転移の存在（はい／いいえ）、過去の化学療法及び内分泌療法の選択（ＮＳＡＩ／ＳＥＲＭ）に関して層別化される；（２）骨転移を有さない患者は、ＣＤＫ４／６阻害剤＋ＥＴとＣＤＫ４／６阻害剤＋ＥＴデノスマブ１２０ｍｇ Ｑ４Ｗとの間で２：１に無作為化される；（３）骨転移を有する患者は、ＣＤＫ４／６阻害剤＋ＥＴ＋ゾレドロン酸とＣＤＫ４／６阻害剤＋ＥＴデノスマブ１２０ｍｇ Ｑ４Ｗとの間で２：１に無作為化される。

【0186】

実施例１３
本実施例は、管腔乳癌及びトリプルネガティブ乳癌の両方において、ＲＡＮＫ経路遮断との組み合わせでＣＤＫ４又はＣＤＫ６を遮断する阻害剤に対する感受性を試験するように設計された実験を説明する。

【0187】

本実施例は、管腔乳癌及びトリプルネガティブ乳癌の両方において、ＲＡＮＫ経路遮断との組み合わせでＣＤＫ４を遮断する阻害剤に対する感受性を試験するように設計された実験を説明する。

【0188】

ＣＤＫ４阻害剤に対する感受性は、ＬＢＣ細胞（例えばＭＣＦ－７及びＴ４７Ｄ）及びＴＮＢＣ細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）を用いて、本質的に前述の実施例（実施例２～６）に記載されるとおりに試験される。ＬＢＣ及びＴＮＢＣ細胞をマルチウェルプレートに播種し、続いて単体の又はＲＡＮＫ経路阻害剤であるＯＰＧ－Ｆｃと組み合わせたＣＤＫ４阻害剤に曝露する。本アッセイに用いられるＣＤＫ４阻害剤としては、３－ＡＴＡ（３－アミノ－９－チオ（１０Ｈ）－アクリドン）及びＣＤＫ４阻害剤ＩＩＩ（５－（Ｎ－（４－メチルフェニル）アミノ）－２－メチル－４，７－ジオキソベンゾチアゾール、Ｒｙｕｖｉｄｉｎｅ）が挙げられる。細胞生存度は、本明細書に説明されるＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって評価する。

【0189】

インビボでのＴＮＢＣ又はＬＢＣ細胞のＣＤＫ４阻害剤に対する感受性を試験するために、ＮＳＧマウスの第４腹部の乳腺脂肪体の両側に、ＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（親）、ＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、本質的に本明細書で説明するとおりに植菌する。植菌から１２週間後、マウスを腫瘍サイズに基づいて群に無作為化し、（Ａ）ＣＤＫ４阻害剤、（Ｂ）ＯＰＧ、（Ｃ）（Ａ）と（Ｂ）との組み合わせ、又は（Ｄ）ビヒクル対照で治療する。植菌後、腫瘍を生物発光によって研究終了まで毎週画像化する。全フラックス並びにＫｉ６７陽性及びホスホＲｂ陽性細胞の定量化は、本明細書で説明するとおりに測定する。

【0190】

実施例１４
本実施例は、管腔乳癌及びトリプルネガティブ乳癌の両方の成長における、ＲＡＮＫ経路遮断との組み合わせでのＣＤＫ４又はＣＤＫ６発現の喪失又は減少を試験するように設計された実験を説明する。

【0191】

ある実験のセットでは、細胞を、ＣＤＫ４を標的とするｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスベクターを形質導入する。別の実験のセットでは、細胞を、ＣＤＫ６を標的とするｓｈＲＮＡを含むレンチウイルスベクターを形質導入する。どちらの場合も、対照ｓｈＲＮＡを用いる。

【0192】

ＣＤＫ４若しくはＣＤＫ６ノックダウン（対照と比較して発現が減少）若しくはノックアウト（対照と比較して発現が完全に喪失）又は対照ｓｈＲＮＡを含むＬＢＣ及びＴＮＢＣ細胞をマルチウェルプレートに播種し、続いてＲＡＮＫ経路阻害剤であるＯＰＧ－Ｆｃに曝露した。細胞生存度は、本明細書に説明されるＡｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって評価する。

【0193】

インビボでの管腔乳癌及びトリプルネガティブ乳癌の両方の成長における、ＲＡＮＫ経路遮断との組み合わせでの、ＣＤＫ４又はＣＤＫ６発現の喪失又は減少を試験するために、ＮＳＧマウスの第４腹部の乳腺脂肪体の両側に、ＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（親）、ＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（ＲＡＮＫ ＯＥ）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はこれらのＣＤＫ４、ＣＤＫ６、対照ｓｈＲＮＡノックダウン対応物を、本質的に本明細書で説明するとおりに植菌する。植菌から１２週間後、マウスを腫瘍サイズに基づいて群に無作為化し、（Ａ）ＯＰＧ又は（Ｂ）ビヒクル対照で治療する。植菌後、腫瘍を生物発光によって研究終了まで毎週画像化する。全フラックス並びにＫｉ６７陽性及びホスホＲｂ陽性細胞の定量化は、本明細書で説明するとおりに測定する。

【0194】

実施例１５
本実施例は、エストロゲン受容体陽性乳癌における上昇したＲＡＮＫ発現が幹細胞性の駆動因子であることを説明する。

【0195】

背景：骨再形成の重要な制御因子であるＮＦｋＢ（ＲＡＮＫ）－ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）経路の受容体活性化因子が、プロゲステロン誘導乳癌（ＢＣ）発症の主要な媒介物質であることが明らかになった。ＲＡＮＫ発現は、トリプルネガティブＢＣにおいて特に高く、攻撃性及び予後不良と関連してきた。本研究は、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性ＢＣにおける高いＲＡＮＫ発現の影響に取り組んだ。

【0196】

方法：ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）発現のインシリコ解析を、ＴＣＧＡ ＢＣコホートで実施した。ＲＡＮＫを過剰発現するＥＲ＋ＨＥＲ２－細胞株を、レンチウイルス形質導入によって得て、遺伝子の発現及び表現型の評価に標準アッセイを用いた。インビボの腫瘍成長を、同所性異種移植片中又は尾静脈植菌後に測定した。対応のないｔ検定を用いて２つ群の間で比較を実施した。生存解析は、カプラン・マイヤー法及びログランク検定を用いた。

【0197】

結果：ＲＡＮＫ発現はＥＲ－乳房腫瘍でより高く（ｐ＜０．００１）、５年全生存の低下と関連していた（ＨＲ＝２．１２（１．１６－３．８７）、ｐ＝０．０１２）。しかしながら、ＥＲ＋腫瘍の５％は、ＥＲ－７５％Ｑ範囲内でＲＡＮＫを発現することが判明した。ＲＡＮＫを過剰発現するＥＲ＋細胞株（ＭＣＦ－７ＯＥ及びＴ４７ＤＯＥ）を、下流経路の過剰活性化；間葉細胞及び幹細胞マーカーの上方制御；球体形成能力の向上によって特性評価した。インシリコでは、ＥＲ＋腫瘍中の高ＲＡＮＫ発現は、間葉性、幹細胞性と有意に相関した。インビボでは、ＭＣＦ－７ＯＥ異種移植片は、親のものと比較して一貫してより小さかった。しかしながら、尾静脈植菌は、ＭＣＦ－７及びＭＣＦ－７ＯＥ細胞が、肺及び骨格中で等しく転移性であったことを示し、ＭＣＦ－７ＯＥ細胞を内部に有する動物は、より多くの循環腫瘍細胞を有した。

【0198】

結論：本発明者らのデータは、初めて、ＥＲ＋ＢＣ中のＲＡＮＫ発現が無視できるものではなく、また特に転移性の環境では腫瘍進行に影響を及ぼし得ることを示す。

【0199】

実施例１６
本実施例は、高ＲＡＮＫ発現のエストロゲン受容体陽性乳癌の生物学的特徴を実証する。

【0200】

背景：ＲＡＮＫ－ＲＡＮＫＬ経路は、骨再形成の重要な制御因子である。過去１０年間において、ＲＡＮＫ－ＲＡＮＫＬ軸は、プロゲステロン誘導乳癌（ＢＣ）発症の主要な媒介物質であることが明らかになった。ＲＡＮＫ発現は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）において特に高く、攻撃性及び予後不良と関連してきた。管腔ＢＣにおけるＲＡＮＫ発現は過去に評価されたことがない。図１５を参照されたい。本研究の目的は、ＥＲ陽性（ＥＲ＋）乳癌における高いＲＡＮＫ発現の生物学的影響が何であるかを決定することであった。

【0201】

本研究の方法は、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）乳癌（ＢＣ）コホート上で実施されるＲＡＮＫ発現のインシリコ解析を含んだ。ＴＣＧＡ ＢＣコホートを用いて、ＲＡＮＫ及び更に対象の遺伝子の発現を定量化した。図１６Ａ。ＲＡＮＫを過剰発現するＥＲ＋ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２－）細胞株を、レンチウイルス形質導入によって得て、遺伝子の発現及び表現型の評価に標準アッセイを用いた。ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋及びＴ４７Ｄ細胞に、ＲＡＮＫレンチウイルス過剰発現粒子（ＥＸ－Ｏ０００７－Ｌｖ１２１，ＧｅｎｅＣｏｅｐｏｅｉａ）を形質導入し、ＲＡＮＫ過剰発現（ＲＡＮＫ ＯＥ）をＲＴ－ｑＰＣＲによって確認した。図１６Ｂ。インビボの腫瘍成長を、同所性異種移植片中又は尾静脈植菌後に測定した。全ての動物実験はＤＧＡＶの認可を受け、動物は、３Ｒの原則を適用した承認済み組織、国家及び国際ガイドラインに従って処理され、安楽死させられた。４週齢のＮＳＧマウスに、１７β－エストラジオール皮下ペレットを補充した。５０％フェノールフリーマトリゲル溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の２×１０^５細胞を、第２胸郭の脂肪体又は尾静脈に注射し、腫瘍成長を、発光解析により週１回監視した。図１６Ｃ。

【0202】

結果
実験の１セットでは、ＲＡＮＫ発現のインシリコ解析を、ＴＣＧＡ ＢＣコホート中で実施した。図１７Ａに示すように、ＴＣＧＡ（ｎ＝１０１５）からの女性ＢＣ患者を、最適カットオフ（Ｃｕｔ－ｏｆｆ Ｆｉｎｄｅｒソフトウェア）及びログランク検定を用いてプロットした生存曲線を用いて、ＲＡＮＫ発現に基づき二分した。図１７Ｂは、中央ＲＡＮＫ発現を、ＥＲ－腫瘍とＥＲ＋ＢＣ腫瘍との間で、且つＥＲ－腫瘍の７５Ｑ内で比較したことを示す。結果は平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。これらのデータは、ＲＡＮＫ発現がＥＲ乳房腫瘍中でより高く、高いＲＡＮＫ発現（ＲＡＮＫ－ｈｉｇｈ）が５年全生存（ＯＳ）の低下に関連し、５％のＥＲ＋ＢＣは、ＥＲ－７５％Ｑ範囲内でＲＡＮＫを発現することを示す。

【0203】

一連の実験では、ＮＳＧマウスの第２胸郭の乳腺脂肪体に、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－７ＯＥ又はＭＣＦ－７細胞とＭＣＦ－７ＯＥ細胞との１：１混合物を植菌した。図９Ａは、実験終了時に取られた、生物発光解析からの一連の代表的画像である。図９Ｂは全フラックス（ｐ／ｓ）のグラフであり、図９Ｃは、Ｋｉ６７の定量化のグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ又は対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。これらのデータは、ＭＣＦ－７ＯＥ異種移植片は、親のものと比較して一貫してより小さかったことを示す。

【0204】

接着細胞を非接着性条件下で培養し、乳房球体の数（＞５０μｍ／播種細胞数）×１００として球体形成能力（ＳＦＣ）（％）を測定し、７日後にＦｉＪｉソフトウェアを用いて球体を測定し、ｓＲＡＮＫＬあり及びなしで成長する乳房球体中で領域を比較した（図１８Ａ）。ＴＣＧＡ ＢＣコホートを用いて、ＲＡＮＫ及び更に対象の遺伝子の発現を定量化した（図１８Ｂ）。

【0205】

実験の１セットでは、ＮＳＧマウスの尾静脈にＭＣＦ－７又はＭＣＦ－７ＯＥ細胞を植菌した（ｎ＝３／群）。腫瘍植菌から２時間後及び実験終了まで毎週、腫瘍を生物発光によって画像化した。図１１Ａは、生物発光解析からの一連の代表的画像である。図１１Ｂは、全フラックス（ｐ／ｓ）のグラフである。図１１Ｄは、骨病変上の全フラックス（ｐ／ｓ）のグラフである。図１１Ｅは、肺病変上の全フラックス（ｐ／ｓ）のグラフである。図１１Ｆは、フローサイトメトリによって測定した、ＧＦＰ＋細胞（循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を表した）％のグラフである。この実験では、犠牲時に心穿刺によって血液を回収し、ＣＴＣ（ＧＦＰ＋細胞）をフローサイトメトリによって定量化した。データ解析は、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用して実施した。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ又は対応のないｔ検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。ここでは、尾静脈植菌は、ＭＣＦ－７及びＭＣＦ－７ＯＥ細胞が、肺及び骨格中で等しく転移性であったことを示した。ＭＣＦ－７ＯＥ異種移植片を有する動物は、より多くの循環腫瘍細胞を有した。

【0206】

結論（図１９）：これらのデータは、ＥＲ＋ＢＣにおけるＲＡＮＫ発現の関連性を初めて示す。ＥＲ＋腫瘍中のＲＡＮＫ発現は、腫瘍進行に影響を与え得る。

【0207】

実施例１７
本実施例は、ＲＡＮＫ ＯＥ ＥＲ＋ＨＥＲ２－乳癌細胞が、ＣＤＫ４阻害剤に対して耐性であることを実証する。

【0208】

実施例３は、ＲＡＮＫ ＯＥ ＥＲ＋ＨＥＲ２－細胞は、ＣＤＫ４／６阻害剤、すなわちパルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブに対して耐性があり、ＯＰＧ－ＦｃによるＲＡＮＫＬ遮断は、細胞をこれらの薬剤に対して感受性にすることができることを実証する。ＣＤＫ４／６阻害剤はＣＤＫ４及びＣＤＫ６に対して異なる親和性プロファイルを有し（Ｗｉｅｄｅｍｅｙｅｒ Ｗ．Ｒ．（２０１８）Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ Ｃｙｃｌｉｎ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｙａｒｄｅｎ Ｙ．，Ｅｌｋａｂｅｔｓ Ｍ．（ｅｄｓ）Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ Ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ １５．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｈａｍ）、耐性は特定のＣＤＫに関連し得るため、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞がＣＤＫ４及び／又はＣＤＫ６特異性阻害剤に対して等しく耐性であるかどうかを試験した（実施例１３）。

【0209】

この疑問に取り組むため、ＣＤＫ４阻害剤の存在下又は不在下での細胞成長を定量化した。要約すると、細胞を、９６ウェルプレートに播種して、２つの異なる薬剤、すなわちＣＤＫ４阻害剤である３－ＡＴＡ（図２０Ａ）又はＣＤＫ４阻害剤ＩＩＩ（図２０Ｂ）に７日間に曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果を図２０Ａ及び２０Ｂに示す。図２０Ａは、ＣＤＫ４阻害剤である３－ＡＴＡの存在下での細胞成長の定量化を提供し、図２０Ｂは、別のＣＤＫ４阻害剤であるＣＤＫ４阻害剤ＩＩＩの存在下での細胞成長の定量化を提供する。結果は、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値であり、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【0210】

図２０Ａ及び図２０Ｂに示すように、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞は、最大２．５μＭの両方のＣＤＫ４阻害剤に対して耐性であり、これらの細胞は、更により高い用量の３－ＡＴＡに対しても耐性であった。

【0211】

特異的なＣＤＫ６阻害剤は存在しないため、ＣＤＫ６ノックダウン又はノックアウトＲＡＮＫ ＯＥ細胞株は、特異的なＣＤＫ６標的化に対する感受性に対処するように作られている。細胞株は、ｓｈＲＮＡを用いて機能的に下方制御（例えばＣＤＫノックダウン）されるか、又はｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いてノックアウトされる。ＣＤＫ６ノックダウン細胞株の細胞成長の定量化は、野生型細胞株と比較される。

【0212】

実施例１８
本実施例は、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する耐性が他のＣＤＫの補償効果に起因するものではないことを実証する。

【0213】

ＣＤＫ４／６阻害剤に対する耐性が、パルボシクリブ耐性を誘起するとして前述されている他のＣＤＫ、すなわちＣＤＫ２の補償活性によって媒介されているか否かが問題とされた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ＭＨ，Ｗｉｌｌｅｋｅｓ Ｍ，ｖａｎ Ｒｏｏｎ Ｅ，ｅｔ ａｌ．ＭＬＬ ｆｕｓｉｏｎ－ｄｒｉｖｅｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＫ６ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ＭＬＬ－ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ ｉｎｆａｎｔ ＡＬＬ．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，Ｔｅｘ．）．２０１４；１３（５）：８３４－８４４．ＤＯＩ：１０．４１６１／ｃｃ．２７７５７）。この疑問に答えるために、ｐａｎ－ＣＤＫ阻害剤であるセリシクリブ（ロスコビチン又はＣＹＣ２０２としても知られる）の存在下での細胞成長を解析した。要約すると、細胞を９６ウェルプレートに播種し、異なる薬剤に７日間曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。

【0214】

結果を図２１に示し、これは、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値を表し、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。セリシクリブは、ＣＤＫ２／Ｅ、ＣＤＫ２／Ａ、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９の阻害剤である。これらのデータは、セリシクリブに対してＲＡＮＫ ＯＥ細胞が親（低ＲＡＮＫ細胞よりも感受性が低かったことを示す（図２１Ａ）。更に、パルボシクリブとセリシクリブとの組み合わせは、予期された通り親ＭＣＦ－７細胞中ではより効果的であった（図２１Ｂ）が、ＲＡＮＫ ＯＥ細胞中ではそうでなく、セリシクリブは、パルボシクリブ又はパルボシクリブ及びＯＰＦ－Ｆｃの効果を増強しなかった（図２１Ｂ）。これは、ＣＤＫ４／６阻害剤に対する耐性が他のＣＤＫ（すなわちＣＤＫ２／Ｅ、ＣＤＫ２／Ａ、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９）の補償活動によって媒介されないことを示唆する。

【0215】

実施例１９
本実施例は、ＯＰＧ－Ｆｃが、ｐＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ及びＢＲＣＡ１変異とは無関係にＴＮＢＣ細胞株をＣＤＫ４／６阻害剤に対して感受性にすることを実証する。

【0216】

３つのＴＮＢＣ細胞株のパネル（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８）を用いて、実施例６は、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ－Ｆｃ）が療法に対する感受性を回復したために、ＲＡＮＫ経路がパルボシクリブ、リボシクリブ及びアベマシクリブに対する耐性を媒介することを実証する。次に、ＣＤＫ４／６に対する耐性又はＯＰＧ－Ｆｃの効果のいずれかが、ｐＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ及びＢＲＣＡ１などのＴＮＢＣ中で頻繁に変異する遺伝子の変異状態に依存し得るかどうかが問題とされた。したがって、上記の解析を、３つの追加のＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－１５７、ＨＣＣ１９３７及びＢＴ－２０）を含むように拡大した（表１）。

【0217】

【表1】

【0218】

本研究に用いられた全細胞株中のＲＡＮＫの発現を、ＲＴ－ｑＰＣＲ（図２２Ａ）及びフローサイトメトリ（図２２Ｂ）によって評価した。Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）データベースから入手可能なＲＮＡｓｅｑデータを表２に示す。ＲＡＮＫ発現は、ＴＮＢＣ及び管腔細胞株の間では異種性であり、本研究に用いたＲＡＮＫ ＯＥ管腔細胞株は最高レベルのＲＡＮＫを発現する。細胞株の遺伝子発現及び研究室誘導変性を定量化するために用いられる異なる方法が、データ間の一部の差異に寄与する（例えばＴ４７Ｄ細胞株）。

【0219】

【表2】

【0220】

細胞を９６ウェルプレートに播種し、異なる薬剤に７日間曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果を図２３に示し、これは、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値を表し、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。これらのデータは、全ての細胞株で同じ効果が観察されたため、ＯＰＧ－Ｆｃは、ｐＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ及びＢＲＣＡ１変異並びにＥＧＦＲの増幅とは無関係にＴＮＢＣ細胞株をＣＤＫ４／６阻害剤に対して感受性にすることを示唆する（図２３）。これらの知見は、クローン原性アッセイによって確認された。要約すると、細胞を６ウェルプレートに播種し、異なる薬剤に６日間曝露し、薬剤を含まない培地で６日間回復させた。細胞をクリスタルバイオレットで染色し（図２４Ｂ）、１％ＳＤＳで溶解し、５７０ｎＭで培地の吸光度を測定した。結果を、図２４Ａに示し、細胞群体の画像を図２４Ｂに提供し、結果は３つの複製の平均値を表し、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、双方向ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【0221】

実施例２０
本実施例は、ＯＰＧ－Ｆｃ単体は、細胞株の増殖に対して全く影響を有さないことを実証する。

【0222】

細胞を９６ウェルプレートに播種し、７日間ＯＰＧ－Ｆｃに曝露した。培地を２日ごとに交換し、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅアッセイによって生存度を評価した。結果を図２５に示し、これは、１アッセイ当たり４つの複製を有する少なくとも３つの独立したアッセイの平均値を表し、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、一方向ＡＮＯＶＡを用いて計算し、ｐ＞０．０５であれば非有意と見なした。これは、ＯＰＧ－Ｆｃの添加とともに観察されたＣＤＫ４／６有効性の増加は、細胞増殖に対するＯＰＧ－Ｆｃ又はＲＡＮＫ経路の直接の効果に関連しないことを示唆する。

【0223】

更に、ＯＰＧ－ＦｃはＲＡＮＫＬを中和可能であることも確認された。タンパク質発現はウェスタンブロットによって評価した。細胞を、６ウェルプレートに播種し、２４時間血清飢餓状態に置き、示される時点の間、１μｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬに曝露した（図２６Ａ）。ＲＡＮＫＬ中和（図２６Ｂ）のために、ＲＡＮＫＬを３７℃の血清枯渇培地±１００ｎｇ／ｍｌのＯＰＧ－Ｆｃ又は２．５μｇ／ｍｌのＭＡＢ６２６中で６０分間予インキュベートし、６０分後にタンパク質を解析した。β－アクチンを負荷対照として使用し、ＦｉＪｉを用いてバンド強度を定量化した。ＲＡＮＫＬ刺激は、ＥＲＫ及びＡＫＴなどのＲＡＮＫ下流因子のリン酸化を駆動する（図２６Ａ）。ＯＰＧ－Ｆｃ又は抗ＲＡＮＫＬモノクローナル抗体ＭＡＢ６２６の存在下では、ＲＡＮＫＬ駆動ＲＡＮＫ経路の活性化は低減した（図２６Ｂ）。

【0224】

実施例２１
本実施例は、ＣＤＫ４／６阻害剤に対するＴＮＢＣ ＲＡＮＫ媒介耐性を実証し、ＯＰＧ－Ｆｃがインビボで腫瘍成長を低減させることを実証する。

【0225】

本明細書に提供されるデータは、ＥＲ＋ＨＥＲ２－ＲＡＮＫ ＯＥ細胞は、インビトロ及びインビボでの増殖速度は低下するが、侵襲性は増加することを特徴としたことを実証する（Ｇｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．２０２０（改訂））。同所移植モデルでは、ＭＣＦ－７ ＲＡＮＫ ＯＥ細胞は、インビボでパルボシクリブに対して耐性であると示された。パルボシクリブ及びＯＰＧ－Ｆｃで治療した腫瘍中のＫｉ６７及びｐ－ｐＲｂ発現の有意な低減によって示される、ＲＡＮＫ経路阻害（ＯＰＧ－Ｆｃ）がインビボでＴＮＢＣ細胞をＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）に対して感受性にすることを示す実験を実施した（実施例１０）。

【0226】

これらの知見に基づいて、ＴＮＢＣ異所性異種移植片モデル中で、ＲＡＮＫ経路遮断と組み合わせた、ＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ）に対するＴＮＢＣ ＢＣの感受性を試験した（図２７）。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの脇腹の両側から皮下植菌した（ｎ＝５／群）。腫瘍をキャリパーで測定する。腫瘍が約１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為抽出し、実験プロトコルに従って治療した。パルボシクリブに承認される１２５ｍｇ／日のヒト等価用量（ＨＥＤ）は、マウスでは２９．２５ｍｇ／Ｋｇ／日と等しいため、３０ｍｇ／Ｋｇ／日のパルボシクリブを２１日間連続で使用した（Ｎａｉｒ ａｎｄ Ｊａｃｏｂ，Ｊ Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍ．２０１６ Ｍａｒ；７（２）：２７－３１）。ＯＰＧ－Ｆｃを１０ｍｇ／Ｋｇ ３ｘ／週で用いた（ＨＥＤ２９１，６ｍｇ／１５日間）。

【0227】

ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの脇腹の両側からＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を皮下植菌した（ｎ＝４～５／群）。植菌後６週間で、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為抽出し、ＯＰＧ－Ｆｃの１０ｍｇ／Ｋｇ（ｉ．ｐ．）３回／週；パルボシクリブ３０ｍｇ／Ｋｇ／日（ｐ．ｏ．）又は組み合わせで処理した。腫瘍の容積をキャリパーで２日おきに測定し、式：Ｔ_ｖｏｌ＝１／２（長さ×幅^２）を用いて計算し、時間の関数としてプロットした腫瘍容積のグラフを図２８Ａ及び２８Ｂに提供する。マウスの各群の剖検時腫瘍重量を図２８Ｃのグラフに提供する。剖検後の臓器の組織病理学的評価後に転移を有するマウス数を図２８Ｄの表に提供する。破骨細胞特異性ＴＲＡｃＰ ５ｂを剖検時に回収された血清中で定量化し、ｓＴＲＡｃＰ ５Ｂのグラフを図２８Ｅに提供する。Ｋｉ６７及びｐ－ｐＲｂの定量化（免疫比）を、図２８Ｆの一対のグラフに提供する。時間の関数としてプロットされたマウスの体重のグラフを図２８に示す。データは、平均±ＳＥＭとして示される。ｐ値を、ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて計算した。

【0228】

ＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片は療法で退縮しなかったが、パルボシクリブによるＣＤＫ４／６阻害剤治療後に腫瘍成長の緩徐化を示し、これはＯＰＧ－Ｆｃによって改善された（図２８Ａ、Ｂ）。したがって、Ｋｉ６７及びｐ－ｐＲｂは、組み合わせで治療したマウス由来の腫瘍中で有意に低減した（図２８Ｆ）。血清ＴＲＡｃＰ ５ｂ定量化によって確認・評価してＯＰＧ－Ｆｃは破骨細胞活性を抑制した（図２８Ｅ）。

【0229】

実施例２２
本実施例は、ＲＡＮＫ経路阻害剤及びＣＤＫ４／６阻害剤を含む併用治療の効果を試験するための追加の研究を実証する。

【0230】

ＲＡＮＫ ＯＥ管腔乳癌細胞中でパルボシクリブ＋フルベストラントと比較してパルボシクリブ＋フルベストラント＋ＯＰＧ－Ｆｃの効果を試験するためのインビボモデルを製造する。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの脇腹の両側から皮下植菌する（ｎ＝５／群）。腫瘍をキャリパーで測定する。腫瘍が約１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為抽出し、実験プロトコルに従って治療する（図２９）。

【0231】

更に、試験を、ＴＮＢＣ細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－１５７及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８）中でパルボシクリブ単体と比較したパルボシクリブ＋ＯＰＧ－Ｆｃの効果に拡大するためのインビボモデルを製造する。これらの２つの細胞株を選択することにより、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１よりも高いパルボシクリブＩＣ５０を有する細胞及び異なるＲＡＮＫ発現を有する細胞並びにｐＲＢ欠乏細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）を試験することが意図される。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスの脇腹の両側から皮下植菌する（ｎ＝５／群）。腫瘍をキャリパーで測定する。腫瘍が約１００ｍｍ^３に達したとき、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為抽出し、図３０に示す実験プロトコルに従って治療する。

【0232】

これらの実験の最後に、耐性及びＯＰＧ－Ｆｃ効果の分子メカニズムを解明するために腫瘍をディープカバレッジＲＮＡ－ｓｅｑによって解析した。知見は、機能的に有効となる（例えば、細胞株、患者由来オルガノイド（ＰＤＯ）、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）及びＰＤＸ由来の安定細胞株中で）。

【0233】

実施例２３
本実施例は、実施例１７～２２で用いられた材料及び方法を説明する。

【0234】

細胞培養
ＢＴ－２０及びＭＤＡ－ＭＢ－１５７細胞をＡＴＣＣより購入した。ヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋及びＭＣＦ－７ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋（本明細書ではＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＣＦ－７によって指定される）は、Ｓｅｒｇｉｏ Ｄｉａｓ Ｌａｂ（ＩＭＭ）によって提供され、ＧＦＰ－ルシフェラーゼレンチウイルス粒子によるレンチウイルス形質導入及び純粋ＧＦＰ＋細胞集団の細胞選別によって親細胞から誘導された。Ｔ４７Ｄ細胞は、ＩＮＳＥＲＭのＰｈｉｌｉｐｐｅ Ｃｌｅｚａｒｄｉｎによって提供された。ＭＤＡ－ＭＢ－４６８及びＨＣＣ１９３７は、Ｆｕｎｄａｃａｏ ＣｈａｍｐａｌｉｍａｕｄのＲｉｔａ Ｆｉｏｒ Ｌａｂより提供された。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）中で、ＢＴ－２０を改変イーグル培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中及びＨＣＣ１９３７をＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で培養し、これらは、全て１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）（ＭＤＡ－ＭＢ－１５７に対して２０％）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、Ｇｉｂｃｏ）を補充した。ＭＣＦ－７及びＴ４７Ｄ細胞を、０．０１ｍｇ／ｍＬのインスリン（Ｇｉｂｃｏ）を追加的に補充した同じ培地で培養した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２に保持し、低い継代数で使用して、ｑＰＣＲによってマイコプラズマ汚染に関して試験した。

【0235】

ＲＴ－ｑＰＣＲ
ＮＺＹ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（＃ＭＢ１３４０２，Ｎｚｙｔｅｃｈ）を用いて、細胞の合計ＲＮＡを抽出した。ＤＮアーゼＩで処理したＲＮＡを、ＮＺＹ Ｍ－ＭｕＬＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（＃ＭＢ１７３０１，Ｎｚｙｔｅｃｈ）及びＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマーを用いて逆転写させ、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（＃４３６９０１６，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）並びにＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（＃Ｈｓ００９２１３７２＿ｍ１，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＧＡＰＤＨ（＃ＰＰＨ００１５０Ｆ，ＳＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）用の特異的プライマーを用いて、ｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲによって増幅した。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを用いて遺伝子発現を正規化し、相対的ｍＲＮＡ発現を、２－ΔＣｔ法を用いて計算した。

【0236】

フローサイトメトリ
ＲＡＮＫ発現解析のために、トリプシン処理した細胞を、マウスモノクローナル抗体抗ＲＡＮＫ（＃Ｍ３３１，Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．）でインキュベートし、１：１００でＣｙ５とコンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５－１７５－２０５，Ｄｉａｎｏｖａ）で標識化した。解析は、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０ソフトウェアを使用して行った。

【0237】

インシリコ解析
乳癌細胞中の正規化ＲＡＮＫ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）発現（ｌｏｇ２ ＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ））を、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃｃｌｅ）から導出した。

【0238】

ウェスタンブロット
ＲＡＮＫＬで刺激した際のＲＡＮＫ経路の活性化をウェスタンブロットによって解析した。この目的のため、４×１０^５個の細胞を６ウェルプレートに２４時間播種し、低血清培地（０．１％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中で更に２４時間血清飢餓状態に置いた）。培地を、１μｇ／ｍＬのヒトＲＡＮＫＬ（Ａｍｇｅｎ）を含有する新鮮な低血清培地と交換し、合計細胞溶解物を異なる時点で得た。ＲＡＮＫＬ中和のために、１００ｎｇ／ｍｌのＯＰＧ－Ｆｃ（ＰＬ－３３３２４，Ａｍｇｅｎ）又は２．５μｇ／ｍｌのＭＡＢ６２６（Ｒ＆Ｄ）を用いて、ＲＡＮＫＬを３７℃の低血清培地中で６０分間インキュベートした。合計細胞溶解物を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液を製造業者の指示書に従って用いて調製した。合計タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＳｉｃｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、製造業者の指示書に従って調製した定量化した。１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分解し、続いてｉＢｌｏｔ（登録商標）２ Ｇｅｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って使用して、ニトロセルロース膜に転写した。

【0239】

β－アクチンの場合、ＰＢＳ－０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ＰＢＳＴ）中５％の脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）中において又は他の抗体の場合、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）中において膜を室温（ＲＴ）で１時間ブロックした。４℃で終夜、膜を下記の特異的抗体でインキュベートした：ＲＴで、マウス抗βアクチン抗体（Ａｂ６２７６；Ａｂｃａｍ）、ウサギポリクローナル抗ホスホ－ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ－２０２／Ｔｙｒ－２０４）（＃ｓｃ－１６８２，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗ＥＲＫ１／２（ｃ－１４）（＃ｓｃ－１５４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗ホスホＡＫＴ１／２／３（Ｓｅｒ－４７３）（Ｄ９Ｅ）（＃ｓｃ－７９８５，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギポリクローナル抗ＡＫＴ１／２／３（Ｈ－１３６）（＃ｓｃ－８３１２，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ＰＢＳＴで洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（ＨＲＰ）特異性二次抗体：抗マウスＨＲＰ ＩｇＧ及び抗ウサギＨＲＰ ＩｇＧ（１：５０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）によって２時間で膜をインキュベートした。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＥＣＬ ＨＲＰ化学発光基質試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（製造者の使用説明書に従う）及びＣｕｒｉｘ６０プロセッサ（ＡＧＦＡ）又はＡｍｅｒｓｈａｍ（商標）Ｉｍａｇｅｒ６８０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で現像したＸ線フィルム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて、タンパク質を検出した。

【0240】

生存度アッセイ
細胞を、パルボシクリブ（ＰＤ ０３３２９９１イセチオネート，ＰＺ０１９９，Ｓｉｇｍａ）、リボシクリブ（ＬＥＥ０１１サクシネート，ＳＣ－４８８１７４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、アベマシクリブメシル酸塩（ＬＹ２８３５２１９，Ｓ７１５８，Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、３－ＡＴＡ（ｓｃ－２０２４１４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＣＤＫ４阻害剤ＩＩＩ（ｓｃ－２０２９８８，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、セリシクリブ（Ｓ１１５３，Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）及びＯＰＧ－Ｆｃ（ＰＬ－３３３２４，Ａｍｇｅｎ）と共に又はこれらを含まずに、９６ウェルプレート（２～５×１０^４細胞／ｍＬ）に播種した。培地を２日ごとに交換した。７日後、１：１０Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに添加し、インキュベーションから２時間後にＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）内で蛍光を測定した（励起：５６０ｎｍ；発光：５９０ｎｍ）。

【0241】

クローン原性アッセイ
コロニー形成アッセイのために、３，０００～５，０００細胞／ウェルを６ウェルプレートで平板培養し、試験薬物で６日間処理し、薬剤を含まない培地で更に６日間回復させた。細胞を２％ＰＦＡで１０分間固定し、１％クリスタルバイオレット溶液（Ｓｉｇｍａ）で染色した。染色を１％ＳＤＳに可溶化し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）内で吸光度を５７０ｎｍで測定した。

【0242】

動物モデル
全ての動物実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｂｏｄｙの審査を受けて承認され、Ｄｉｒｅｃｃａｏ Ｇｅｒａｌ ｄｅ Ａｌｉｍｅｎｔａｃａｏ ｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ（ＤＧＡＶ）により認可を受けた。動物を伴う全ての研究では、マウスは、３Ｒの原則を適用した承認済み組織、国家及び国際ガイドラインに従って処理され、安楽死させられた。

【0243】

異所性異種移植片モデル
異所性ＭＤＡ－ＭＢ－２３１異種移植片モデルのために、成長の対数期に細胞を採取し、５０％フェノールフリーマトリゲル溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中１．０×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁した。４週齢のＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の脇腹の両側に、１００μｌの細胞懸濁液を直接注射した。腫瘍成長を２日おきにキャリパーで監視し、腫瘍容積を、式Ｔｖｏｌ＝１／２（長さ×幅^２）を用いて計算した。腫瘍が１００ｍｍ^３に達したら、マウスを腫瘍サイズに基づいて無作為化し、パルボシクリブ３０ｍｇ／Ｋｇ／ｄ（ｐ．ｏ．）、ＯＰＧ－Ｆｃ１０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）３×／週、パルボシクリブ＋ＯＰＧ－Ｆｃ１０ｍｇ／Ｋｇ又はビヒクルで２１日間連続治療した。マウスに０．２５ｍｇ／Ｋｇ ＢＷのペントバルビタールナトリウム（Ｅｕｔａｓｉｌ）を投与することで犠牲にした。剖検時、原発腫瘍を採取して、パラフィン包埋又はスナップショットフリージング（ｓｎａｐｓｈｏｔ ｆｒｅｅｚｉｎｇ）のために２つの断片に切断した。臓器を採取してパラフィン包埋した。

【0244】

免疫組織化学
Ｋｉ６７及びｐ－ｐＲｂ（Ｓｅｒ８０７／１１）を検出するために、ＦＦＰＥ試料からの５μｍの組織切片を免疫組織化学（ＩＨＣ）によって染色した。ＰＴ Ｌｉｎｋ Ｐｒｅ－Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ（Ｄａｋｏ）内で、抗原賦活化溶液ｐＨ９．０を用いて、９４℃で２０分間脱パラフィン及び抗原賦活化を実施した。ＲＴで１０分間Ｐｒｅｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ）で内因性ペルオキシダーゼをブロックし、ＲＴで２０分間Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ）でインキュベートすることにより全タンパク質をブロックした。スライドを、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ）中、ウサギ抗ヒトＫｉ６７一次抗体（１：１００，ＭＩＢ－１，Ｄａｋｏ）又はウサギモノクローナル抗体抗ホスホ－Ｒｂ（Ｓｅｒ８０７／８１１）（Ｄ２０Ｂ１２）（１：４００，＃８５１６，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で３０分間インキュベートした。スライドを、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、ウサギ／マウス（Ｄａｋｏ）で製造業者の指示書に従ってインキュベートし、続いてＤＡＢ（Ｄａｋｏ）で５分間インキュベートした。スライドをヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、Ｑｕｉｃｋ－Ｄ封入剤（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ）で封入し、明視野顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＩＣＣ５０ ＨＤカメラを備えるＬｅｉｃａＤＭ７５０）で可視化した。全核領域（ヘマトキシリン染色核領域）にわたるＤＡＢ染色核領域の割合を微積分することによって免疫比を得た（５野、４００×、ＩｍａｇｅＪソフトウェア）。

【0245】

ｓＴＲＡｃＰ ５ｂ ＥＬＩＳＡ
ＭｏｕｓｅＴＲＡＰ（ＴＲＡｃＰ ５ｂ）ＥＬＩＳＡキット（ＩＤＳ）を製造者の使用説明書に従って使用して、ＴＲＡｃＰ ５ｂをマウス血清中で定量化した。

【0246】

統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを用いてデータを解析した。各実験で実施された複製の回数は示されている。一方向ＡＮＯＶＡ又は対応のないｔ検定（インビトロ実験）；双方向ＡＮＯＶＡ（腫瘍量及びマウスＢＷ）によって統計を実施した。結果は平均±ＳＥＭとして示され、ｐ値＜０．０５は有意であると見なされた。

【0247】

本明細書中に引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、あたかも各参考文献が参照により援用されるように個別且つ明確に示されているかのように、またあたかもその全体が本明細書に記載されているかのようであるのと同程度まで参照により本明細書に援用される。

【0248】

本発明の説明に関する（とりわけ以下の特許請求の範囲に関する）「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その」という用語並びに類似の指示対象の使用は、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。「含む」、「有する」、「包含する」及び「含有する」という用語は、特記しない限り、オープンエンドの用語（すなわち「含むが、限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。

【0249】

本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、単にその範囲及び各端点にある別個の値の各々を個々に指す簡略法の役割を果たすものに過ぎず、別個の値及び端点の各々は、それが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0250】

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明を更に明らかにするものであり、別段の主張がない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書のいかなる表現も、特許請求されていない要素を本発明の実施に不可欠のものとして示していると解釈されるべきではない。

【0251】

本明細書には、本発明の好ましい実施形態が記載されており、それは、本発明を実行するために本発明者らに知られている最良の形態を含む。それらの好ましい実施形態の変形形態は、先の記載を読むことで当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを期待し、また、本発明者らは、本明細書で具体的に記載されている形態以外で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用される法により認められる通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての変更形態及び均等物を含む。更に、上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、その全ての可能な変形形態において本発明に包含される。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図13-4】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22-1】

【図22-2】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28-1】

【図28-2】

【図28-3】

【図30】

【配列表】

2022530241000001.app

【国際調査報告】