ホーム > 特許ランキング > オーロラ オンコロジー
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-06-29
(54)【発明の名称】拡張性組織の治療のための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/65 20170101AFI20220622BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220622BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220622BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20220622BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20220622BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220622BHJP
C07K 14/195 20060101ALI20220622BHJP
C07K 14/485 20060101ALI20220622BHJP
【ＦＩ】
A61K47/65
A61P35/00 ZNA
A61K38/16
A61K47/02
A61K47/26
C07K19/00
C07K14/195
C07K14/485
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2021561043
(86)(22)【出願日】2020-04-22
(85)【翻訳文提出日】2021-10-13
(86)【国際出願番号】 US2020029396
(87)【国際公開番号】W WO2020219599
(87)【国際公開日】2020-10-29
(31)【優先権主張番号】62/837,533
(32)【優先日】2019-04-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521450285
【氏名又は名称】オーロラ オンコロジー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ジネン， ショーン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076BB11
4C076CC27
4C076DD23
4C076DD67
4C076FF11
4C076FF61
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA41
4C084BA44
4C084DA33
4C084DB53
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA20
4H045DA83
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書では、例えば膀胱、子宮、腹膜、網、または眼などの拡張性組織における癌を治療するための組成物および方法が提供される。有用な組成物は、本明細書に記載されるＤＴ－ＥＧＦ融合タンパク質を含む。一部の実施形態では、構造Ａ－Ｘ－Ｙ－Ｚのジフテリア毒素－上皮成長因子（ＤＴ－ＥＧＦ）融合タンパク質を含む医薬組成物であって、式中、Ａは、ジフテリア毒素配列の前面への０～５アミノ酸残基のＮ末端付加であり、Ｘは、触媒活性を維持するジフテリア毒素断片または変異断片であり；Ｙは、Ｘのカルボキシ末端をＺのアミノ末端に接続する、長さ０～２０ａａのアミノ酸配列であり、Ｚは、上皮成長因子受容体に対する結合親和性を維持または改善する、その配列の上皮成長因子配列または変異体である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組成物であって、ａ．構造Ａ－Ｘ－Ｙ－Ｚのジフテリア毒素－上皮成長因子（ＤＴ－ＥＧＦ）融合タンパク質を含み、式中：
ｂ．Ａは、前記ジフテリア毒素配列の前面への０～５のアミノ酸残基のＮ末端付加であり；
ｃ．Ｘは、触媒活性を維持するジフテリア毒素断片または変異断片であり；
ｄ．Ｙは、Ｘのカルボキシ末端をＺのアミノ末端に接続する、長さ０～２０ａａのアミノ酸配列であり；ならびに
ｅ．Ｚは、上皮成長因子受容体に対する結合親和性を維持する、上皮成長因子またはその変異体である、組成物。
【請求項2】
前記組成物が、少なくとも約７．０、少なくとも約７．４、または少なくとも約８のｐＨを有する製剤中に存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記組成物が、少なくとも約１０ｍＭのグルコース、少なくとも約５０ｍＭのグルコース、または少なくとも約１００ｍＭのグルコースを含む製剤中に存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
製剤中の前記組成物が、最小限の量のＭｇＣｌ２、または約２０ｍＭ未満のＭｇＣｌ２、または約１０ｍＭ未満のＭｇＣｌ２、または約２ｍＭ未満のＭｇＣｌ２を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記組成物が、ｐＨ８．０で１０ｍＭのＰＯ４および１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて製剤化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
Ａが単一のアラニンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
Ｘが（グリコシル化部位が除去された）gaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd
wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet
rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf （配列番号１）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
Ｘが、gaddvvdss ksfvmenfss yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd
wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet
rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespnktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf（配列番号２）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
Ｘが、免疫反応も回避しながら触媒活性を維持する修飾配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
Ｙが、ａ． ｈａ、
ｂ． ｐｗ、
ｃ． ａａ、
ｄ． ｌｐ、または
ｅ． ｇｇである、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
Ｙが、ａ．リソソームプロテアーゼまたは細胞内プロテアーゼによって標的化されるように設計された０～２０のアミノ酸短配列
ｂ．Ｘ配列とＺ配列の負のまたは阻害性の相互作用を最小化するよう設計された、０～２０のアミノ酸短配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
Ｚが野生型ヒトＥＧＦ配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項13】
Ｚが、ａ．wnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号３）または
ｂ．ＥＧＦ受容体に対する親和性を増加させる任意の変異体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項14】
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd
gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn
rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe
lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv
aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号６）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項15】
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn
rvrrsvgsslscinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe
lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsdsecp lshdgyclhd gvcmyieald kyacncvvgy igercqyrdl kwwelr (A-dmDT390-EGF) （配列番号5）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項16】
標的薬物治療に対する細胞表面標的の曝露を最大化する注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
【請求項17】
細胞表面標的の標的薬物治療への曝露を最大化する製剤および一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
【請求項18】
細胞表面標的の標的薬物治療への曝露を最大化する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
【請求項19】
細胞表面標的の標的薬物治療への結合および曝露を阻害する成分を除去する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
【請求項20】
標的への薬剤の改善された結合の他の機序により標的薬物治療の治療有効性を最大化する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
【請求項21】
標的への薬剤の改善された結合の他の機序により標的薬物治療の治療有効性を最大化する製剤および投与後治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
【請求項22】
前記癌が膀胱内に存在する、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記癌が胸膜内に存在する、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記癌が子宮内に存在する、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記癌が腹膜内に存在する、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記癌が網内に存在する、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記癌が眼内に存在する、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記標的薬物治療が、ジフテリア毒素の上皮細胞増殖因子へのタンパク質－毒素融合物である、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記標的薬物治療が、シュードモナス外毒素ＡのＥｐＣＡＭへのタンパク質－毒素融合物である、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記標的薬物治療が、ＯＮＴＡＫであるタンパク質－毒素融合物である、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
請求項１６～３０のいずれか一項に記載の方法で使用するための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項32】
請求項１６～３０のいずれか一項に記載の方法で使用するための医薬品の製造における使用のための、請求項１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項33】
配列番号５または配列番号６を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１９年４月２３日に出願された“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｔｅｎｔａｂｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ”と題された米国仮特許出願第６２／８３７，５３３号の利益を主張するものである。
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１９年４月２３日に出願された“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｔｅｎｔａｂｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ”と題された米国仮特許出願第６２／８３７，５３３号の利益を主張するものである。
【0002】
配列表
配列表の正式なコピーは、ファイル名“１００３７．００１ＷＯ１＿ＳＴ２５”、作成日２０２０年４月２２日、サイズ約１８．８キロバイトのＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に明細書と同時に提出される。本ＡＳＣＩＩフォーマット文書に含まれる配列表は、本明細書の一部を構成し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の正式なコピーは、ファイル名“１００３７．００１ＷＯ１＿ＳＴ２５”、作成日２０２０年４月２２日、サイズ約１８．８キロバイトのＡＳＣＩＩフォーマットの配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に明細書と同時に提出される。本ＡＳＣＩＩフォーマット文書に含まれる配列表は、本明細書の一部を構成し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0003】
本開示は、拡張性組織の治療、特に、拡張性組織における癌の治療のための新しい治療剤および方法に関する。
【背景技術】
【0004】
薬剤は、疾患細胞に対して特異性を有するか、または疾患細胞の要素を特異的に標的とするように設計される。機序にかかわらず、すべての薬剤は、それぞれの目的の標的細胞に結合、および／またはそれらの標的細胞によって摂取されなければならない。残念なことに、疾患治療の臨床環境において、すべての標的に結合する、または疾患細胞の全集団の均一な標的化を達成する薬剤は稀である。これは、不完全応答および疾患再発の一つの原因である。
【発明の概要】
【0005】
本明細書では、拡張性組織における癌を治療するための医薬組成物および方法が提供される。
【0006】
一部の実施形態では、構造Ａ－Ｘ－Ｙ－Ｚのジフテリア毒素－上皮成長因子（ＤＴ－ＥＧＦ）融合タンパク質を含む医薬組成物であって、式中、Ａは、ジフテリア毒素配列の前面への０～５アミノ酸残基のＮ末端付加であり、Ｘは、触媒活性を維持するジフテリア毒素断片または変異断片であり；Ｙは、Ｘのカルボキシ末端をＺのアミノ末端に接続する、長さ０～２０ａａのアミノ酸配列であり、Ｚは、上皮成長因子受容体に対する結合親和性を維持または改善する、その配列の上皮成長因子配列または変異体である。
【0007】
一部の態様では、組成物は、少なくとも約７．０のｐＨ、または少なくとも約７．４のｐＨ、または少なくとも約８．０のｐＨを有する。
【0008】
一部の実施形態では、組成物は、ｐＨ８．０で１０ｍＭのＰＯ４および１５０ｍＭのＮａＣｌで製剤化される。一部の態様では、組成物は、１００ｍＭのグルコースで製剤化される。
【0009】
一部の態様では、Ａは単一アラニンである。
【0010】
一部の態様では、Ｘは（グリコシル化部位が除去される）
gaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd
wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet
rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf（配列番号１）である。
gaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd
wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet
rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf（配列番号１）である。
【0011】
一部の態様では、Ｘは（野生型配列）
gaddvvdss ksfvmenfss yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd
wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet
rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespnktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf（配列番号２）である。
gaddvvdss ksfvmenfss yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd
wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet
rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespnktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf（配列番号２）である。
【0012】
一部の態様では、Ｘは、免疫応答を回避しながら触媒活性を維持する修飾配列である。
【0013】
一部の態様では、Ｙは、ｈａ、ｐｗ、ｌｐ、ａａ、またはｇｇである。
【0014】
一部の態様では、Ｙは、
ａ．リソソームプロテアーゼまたは細胞内プロテアーゼによって標的化されるように設計された０～２０のアミノ酸短配列
ｂ．Ｘ配列とＺ配列の負のまたは阻害性の相互作用を最小化するよう設計された、０～２０のアミノ酸短配列である。
ａ．リソソームプロテアーゼまたは細胞内プロテアーゼによって標的化されるように設計された０～２０のアミノ酸短配列
ｂ．Ｘ配列とＺ配列の負のまたは阻害性の相互作用を最小化するよう設計された、０～２０のアミノ酸短配列である。
【0015】
一部の態様では、Ｚは野生型ヒトＥＧＦ配列である。
【0016】
一部の態様では、Ｚは、ＥＧＦ受容体に対する親和性を増加させる変異体である。一部の態様では、Ｚは、
wnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号３）である。
wnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号３）である。
【0017】
一部の態様では、ＸＹＺは、
gaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk
ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd
gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn
rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe
lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv
aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号４）である。
gaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk
ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd
gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn
rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe
lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv
aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号４）である。
【0018】
一部の態様では、ＡＸＹＺは、
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk
ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn
rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe
lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsdsecp lshdgyclhd gvcmyieald kyacncvvgy igercqyrdl kwwelr（配列番号５）(A-dmDT390-EGF)である。
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk
ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn
rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe
lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsdsecp lshdgyclhd gvcmyieald kyacncvvgy igercqyrdl kwwelr（配列番号５）(A-dmDT390-EGF)である。
【0019】
一部の態様では、ＡＸＹＺは、
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk ydaagysvdn
enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp
faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi
rdktktkies lkehgpiknk msespa ktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya
awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald
Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号６）である。
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk ydaagysvdn
enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp
faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi
rdktktkies lkehgpiknk msespa ktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya
awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald
Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号６）である。
【0020】
上記の組成物は、以下に記載される方法において、および本明細書全体を通して使用することができる。一部の態様では、本明細書に開示される方法における使用のための医薬品の製造における使用のための医薬組成物が本明細書に提供される。一部の態様では、医薬組成物、すなわち、標的薬物治療は、配列番号５または配列番号６を含む。一部の態様では、標的薬物治療は、配列番号５である。一部の態様では、標的薬物治療は、配列番号６である。
【0021】
本明細書では、細胞表面標的の標的薬物治療への曝露を最大化する注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法が提供される。一部の態様では、標的薬物治療は、配列番号５である。一部の態様では、標的薬物治療は、配列番号６である。
【0022】
本明細書では、細胞表面標的の標的薬物治療への曝露を最大化する製剤および一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法が提供される。一部の態様では、標的薬物治療は、配列番号５である。一部の態様では、標的薬物治療は、配列番号６である。
【0023】
本明細書では、細胞表面標的の標的薬物治療への曝露を最大化する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法が提供される。一部の態様では、標的薬物治療は、配列番号５である。一部の態様では、標的薬物治療は、配列番号６である。
【0024】
本明細書では、細胞表面標的の標的薬物治療への結合および曝露を阻害する成分を除去する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法が提供される。一部の態様では、標的薬物治療は、配列番号５である。一部の態様では、標的薬物治療は、配列番号６である。
【0025】
本明細書では、標的への薬剤の改善された結合の他の機序により治療有効性を最大化する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法が提供される。投与前治療の一例は、図１に示されるようなものであって、例えば、１０ｍＭシトレート、ｐＨ６．０、３７℃、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む最大５００ｍＬの滅菌等張生理食塩水を注入し、１５分間保持し、その後、膀胱を空にし、５００ｍＬの滅菌等張生理食塩水で最大３回まで洗浄し排出させる。これは、グリコカリックスおよび他の結合阻害剤の分解および除去をもたらす。
【0026】
本明細書ではまた、標的への薬剤の改善された結合の他の機序により治療有効性を最大化する製剤および投与後治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法が提供される。投与後治療の一例は、最大５００ｍＬを注入することと、ｐＨ４．５および４０℃で０．２５％酢酸の溶液を最大１時間保持することと、その後、膀胱を空にすることと、最大５００ｍＬの滅菌等張生理食塩水を用いて３回洗浄および排出することと、が含まれる。これにより、酸および熱によって誘発されるシャペロンタンパク質の増加によって促進されるエンドソームからの薬剤放出が可能になり、細胞質の薬剤濃度および活性が増加する。
【0027】
癌は、膀胱、胸膜、子宮、腹膜、眼、または網に存在し得る。一部の態様では、癌は膀胱に存在する。
【0028】
一部の態様では、医薬組成物は、ジフテリア毒素の上皮細胞増殖因子へのタンパク質－毒素融合物、シュードモナス外毒素ＡのＥｐＣＡＭへのタンパク質－毒素融合物、またはＩＬ－２のデニロイキン・ディフティトックスまたはＯＮＴＡＫとして知られるジフテリア毒素とのタンパク質－毒素融合物である。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【発明を実施するための形態】
【0034】
本明細書において、ジフテリア・トキシン（ＤＴ）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の自然発生アミノ酸配列および改変アミノ酸配列、ならびにそれらに結合するアミノ酸配列から構成される融合タンパク質の新規組成物が提供される。ＤＴ－ＥＧＦ融合タンパク質は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を過剰発現する細胞によって引き起こされる癌および疾患を治療するための潜在的な治療剤として開発されてきた。本明細書に開示される方法および組成物は、任意のＤＴ－ＥＧＦ融合タンパク質に適用されて、免疫不活性化を最小化または除去し、それぞれの薬剤部分の活性を増強することによってその有効性を向上させることができる：リボソーム不活性化を促進し、エンドソーム放出を促進するＤＴの触媒活性、ＥＧＦの受容体結合および細胞取込み、ならびにＤＴおよびＥＧＦ活性の独立性を最大化するアミノ酸配列連結能力。リンカーは、標的細胞内で一度、ＥＧＦ部分からのＤＴの放出を可能にする細胞内プロテアーゼに対する感受性を提供するアミノ酸配列を含み得る。本明細書に開示される方法および組成物は、ＤＴ－ＥＧＦの免疫不活性化を回避すること、疾患細胞上の標的受容体への特異的結合を強化すること、標的取込みおよび細胞内放出を強化すること、ＤＴ部分の細胞内毒性を強化すること、およびＤＴのＥＧＦ部分の機能への干渉を最小化する（およびその逆）、新規の方法を提供する。
【0035】
ＤＴ－ＥＧＦなどの融合タンパク質薬剤、および活性に対する受動的拡散に依存しない任意の薬剤の有効性をさらに拡大するために、本明細書では、膀胱、胸膜、子宮、腹膜、網、または眼などの拡張性組織への注入または注射が投与経路である、拡張性組織の疾患を治療するための新規の方法が提供される。拡張性組織は、少なくとも５分間、所定の体積の流体を保持することができ、移行上皮を含有し得る、または含有し得ない、任意の組織である。本方法は、標的細胞の形質膜を横断する能動的なまたは促進された輸送を必要とする、および／または標的細胞の形質膜上の生物学的標的にドッキング、および／または化学的に改変、および／または結合する任意の治療に適用され得る。例としては、限定されるものではないが、小分子（促進された取り込み機序を使用する）、生物製剤、すなわち融合タンパク質、免疫毒素、抗体、遺伝子療法、および腫瘍溶解性ウイルスまたはワクチンが挙げられる。この方法は、標的細胞に入るために受動的拡散を使用する薬剤には有用ではない。この方法は、投与前、投与、および投与後製剤、条件、および組織コンディショニングを通して、治療を可能とするか、または既存治療の有効性を強化する。投与前および投与製剤および条件は、薬物標的結合相互作用を最大化する。方法は、組織を機械的に伸張させるための標的器官の拡張を含み、それによって、細胞膜上の標的の標的治療への曝露を最大化する。投与後製剤および条件は、例えば細胞内取込み、エンドソームもしくはリソソームからの薬剤放出、または有効性を強化するシャペロン機能などの結合後事象を促進する。
【0036】
本方法は、（ｉ）その標的への薬剤の最大結合、（ｉｉ）最大結合特異性および標的細胞による薬剤取込み、（ｉｉｉ）細胞質または他の細胞小器官への細胞の取込みおよび放出を含む結合後事象、（ｉｖ）結合飽和に近づけるために必要な最小時間（ｉｖ）有効性を最大化するための最適な時間と条件（ｖ）最小限の非特異的オフターゲット薬剤取込み、および（ｖｉ）その後の副作用と望ましくない毒性の最小化、を可能とするような様式で使用される、ＥＧＦ受容体、腫瘍抗原またはバイオマーカーなど、標的細胞の表面上に曝露された定義された受容体構造と相互作用するべきＤＴ－ＥＧＦ融合タンパク質およびその他の薬剤の使用に関連する。これは、拡張性器官の組織に関与する疾患を治療する手段、特に、ＥＧＦＲおよび／または関連するＥＧＦＲ受容体ファミリー発現に関連する疾患を治療するためのＤＴ－ＥＧＦ薬剤を利用する手段を提供する。
【0037】
ＤＴ－ＥＧＦは、二十年１－１１以上にわたって潜在的な抗癌療法として開発が検討されてきた。構築され、試験された少数のＤＴ－ＥＧＦ融合タンパク質において、天然型ＤＴ配列は、その結合ドメインを、天然型ＥＧＦ配列と、リンカーとして作用する０～５の介在アミノ酸と置換した。ＤＴ毒性に対するＥＧＦドメインのリンカーの影響は評価されていない。しかしながら、リンカーおよびＤＴ配列のＥＧＦ配列のＮ末端への付加は、その結合を最大で１／３０に減少させ、その後シグナル伝達を減少させたと報告されている。
【0038】
ＥＧＦ－ＥＧＦＲ相互作用は、十分に研究されてきた。精製されたシステムでは、ＥＧＦ配列中の多数の変異体が、結合ＥＧＦＲの有意な減少を示した一方、他の変異体は、結合の増加および／または会合速度の増加１２を示した。上述のように、ＤＴ配列の付加は、ＥＧＦ部分による受容体結合に負の影響を与えた。
【0039】
ＤＴ－ＥＧＦ構築物のＤＴ由来毒性はインビトロおよびインビボで実証されているが、ＤＴ誘導毒性に対するリンカーおよびＥＧＦ部分の影響の大きさは不明である。
【0040】
一部の態様では、ＥＧＦ部分の放出を可能にするリソソームおよびまたは細胞内プロテアーゼに感受性であるリンカー配列は、ＤＴ部分の毒性を増加させ、それによってＤＴ－ＥＧＦ薬剤構築物の有効性を増加させる。
【0041】
多くの人々がジフテリアのワクチン接種を受けており、そのため、ＤＴ－ＥＧＦ構築物の有効性を低下させることができる様々なレベルの不活化抗体を有する。ＤＴ免疫原性１３を減少させると報告されている配列に突然変異を組み込むことにより、ＤＴ－ＥＧＦ有効性の改善を達成し得る。
【0042】
本明細書において、上述の三つの要素の組み合わせ、（ｉ）結合を改善するためのＥＧＦ変異体、（ｉｉ）ＤＴ、ＥＧＦ相互抑制（例えば、連結がＥＧＦＲに対するＥＧＦ部分の親和性の１／２０の減少を引き起こす場合など）を最小化するため、またはＤＴの細胞内放出（例えば、標的細胞内に入るとＤＴ部分を放出する切断可能なリンカー）を可能にするためのリンカー配列、および（ｉｉｉ）ＤＴ部分を脱免疫化する変異、が提供される。
【0043】
単一のアミノ酸残基置換を含む軽微な変化は、予測不可能な方法で活性に深刻な効果を有し得る；したがって、ＤＴ－ＥＧＦ構築物活性および有効性を改善するための上述の方法は、合理的な予測を可能にするが、最終的には実証的検証を必要とする。いくつかの変異がＥＧＦ部分において試みられ、大部分がＥＧＦＲ結合の改善を呈さなかった。
【0044】
以下の配列は、インビボ活性に適しているが、ＥＧＦのＥＧＦＲ結合親和性に対する公知の１／３０の減少を伴うアミノ酸の配列によって結合された本質的に野生型ＤＴ配列およびＥＧＦ配列を含有する標準とみなされる：タンパク質１のアミノ酸配列（Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ）、上皮細胞増殖因子との切断ジフテリア毒素の融合物。
【0045】
配列の情報は、以下を含む：１、追加的なアラニン残基；２～３９１、ｄｍＤＴ３９０；１９、Ｓ→Ａ（Ｎ－グリコシル化部位の除去のための変異）；２３６、Ｎ→Ａ（Ｎ－グリコシル化部位の除去のための変異）；３９２～３９３、ＮｃｏＩ部位のためのアミノ酸配列；３９４～４４６：ＥＧＦ
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk ydaagysvdn
enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp
faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi
rdktktkies lkehgpiknk msespa ktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya
awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsdsecp lshdgyclhd gvcmyieald
kyacncvvgy igercqyrdl kwwelr（配列番号５）
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk ydaagysvdn
enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp
faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi
rdktktkies lkehgpiknk msespa ktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya
awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsdsecp lshdgyclhd gvcmyieald
kyacncvvgy igercqyrdl kwwelr（配列番号５）
【0046】
非常に多くの場合、薬剤は、レスポンダーによく見られる再発を有する患者のごく一部にのみ利益をもたらす。本発明は、既存の薬剤有効性を強化するか、または新規の候補薬剤において最適な有効性を可能にする方法を通して、レスポンダーの割合を増加させ、再発頻度を低下させることを狙いとする。
【0047】
薬剤は、疾患細胞に対して特異性を有するか、または疾患細胞の要素を特異的に標的とするように設計される。機序にかかわらず、すべての薬剤は、それぞれの目的の標的細胞に結合、および／またはそれらの標的細胞によって摂取されなければならない。残念なことに、疾患治療の臨床環境において、すべての標的に結合する、または疾患細胞の全集団の均一な標的化を達成する薬剤は稀である。これは、不完全応答および疾患再発の一つの原因である。一態様では、最大標的結合を達成するために標的組織の良性拡張を含む投与前および投与条件の使用が、治療利益を向上させる。別の態様では、薬剤結合後事象を強化するように設計された条件下での製剤の投与後注入は、薬剤活性および有効性を改善する。
【0048】
器官または組織、すなわち「拡張性組織」内で一定時間にわたって体積を保持する可能性は現在、疾患を治療するために使用されている。しかしながら、薬剤取込みを増加させるための、膀胱などの器官または組織の意図的な拡張について報告または提案されていない。膀胱癌に対する膀胱内治療は、使用される現行アプローチの例として提示され、本発明によって可能となる差異と利益を対照させる；この概念は、任意の拡張性組織にも拡張され得る。健康な成人は、通常、２５０～５００ｍＬまで充填されたときに膀胱を空にする；しかし、膀胱は損傷なく最大１０００ｍＬを保持し得る。膀胱の形状および内部表面積は、充填中、および空状態から拡張状態（２５０ｍＬ～１０００ｍＬ）への移行中に明らかに大幅に変化する。膀胱の内部を覆う尿路上皮は、その完全性を維持しながら、圧縮された構造から拡張された構造へと移行することができるため、その名称が付けられた移行上皮である。尿路上皮の移行上皮細胞の層は、膀胱が充填されると極端な形状変化を起こし、最終的に表在内層細胞は伸張すると不規則な扁平上皮に見え、最大表面積を露出する―図１を参照。これは、本開示が、薬剤と細胞表面構造との必要な相互作用を可能にするために利用する機序であり、これは驚くべきことに、かつ予想外に薬剤活性を最大化する。
【0049】
膀胱癌に対する現在の治療および臨床試験中の治療では、２０～７５ｍＬの体積が、空の膀胱に膀胱内送達され、その後膀胱内に２時間保持される。これは、小分子治療剤（例えば、ゲムシタビン、アパジコン）、生物製剤タンパク質（例えば、ＶＢ４－８４５）、または核酸ベースの遺伝子治療剤（例えば、ＢＣ８１９）、または腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ＣＧ０７００、ｒＡｄ－ＩＦＮ）に当てはまる。
【0050】
膀胱内容物の投与前洗浄は、膀胱内膜つまり尿路上皮上の標的に結合する薬剤の能力を改善し得る。潜在的な治療用腫瘍溶解性ウイルスの取込みの改善を示す一つの既存アプローチは、グリコカリックスの破壊または除去である。グリコカリックスは、尿路上皮細胞層と膀胱の内容物との間の糖タンパク質層である。尿路上皮のウイルス感染は、グリコカリックスを除去または破壊するよう設計された弱い洗剤溶液で膀胱を洗浄することによって増加させ得る１４。この一例は、膀胱癌を治療するために現在臨床試験中である、ｒＡＤ－ＩＦＮウイルスを用いた注入治療前に使用された前洗浄である。ＣＧ０７００－ｒＡＤ－ＩＮＦ治療の前に使用された前洗浄条件は、異なる取り込み機序を有する他の薬剤に対して有益であり得るが、異なる前洗浄製剤および条件は、それらの異なる薬剤の結合および取込みを改善する。ノイラミニダーゼを用いた治療によるグリコカリックスの破壊は、ＨＬＡ／抗ＨＬＡ介在性細胞付着を促進することが、異なるシステムで実証されている：二次元結合定数の３．６倍の増加が報告された１５。前洗浄の目的は、薬剤の結合および取込みを妨げるグリコカリックスのような要因を除去すると同時に、有害であり得る尿路上皮への損傷または変化を最小化することである；これら二つの間のバランスは、経験的決定を必要とし、本明細書に提供される前洗浄は驚くほど効果的である。
【0051】
極めて小さな範囲（２０～７５ｍＬ）の薬液体積が、一般的に膀胱に注入される；体積の関数としての有効性の臨床的研究は提示されていない。マウスにおける研究では、膀胱尿路上皮における５０～１００ｕＬの注入容量のウイルス取込みに差異は報告されていない。（マウスにおける顕著な膀胱拡張に必要な＞１５０μＬを両体積ともかなり下回ることは確認されなかった）。薬剤または他の結合相互作用に対する結合部位のアクセス性向上について、拡張はこれまで提案されていない。本開示は、拡張によって標的組織の表面積を最大化することにより、細胞への薬剤侵入のための最大数の標的部位へのアクセスを可能にすることを提供する。さらに、膀胱拡張の場合、追加的かつ驚くべき利益は、尿管からの流量の低下の誘導、およびそれに続く膀胱に注入された結合緩衝液／溶液の変化の最小化である。
【0052】
尿の成分：水、尿素、クレアチニン、タンパク質、ホルモン、無機塩、および約５．５～７の範囲のｐＨを有する他の有機化合物は、疾患細胞と、それらを殺すまたは改変するよう設計された治療薬との間の結合相互作用に負の影響を与える。
【0053】
一部の態様では、注入のための投与溶液の利用が提供され、その結果、結合条件は、結合部位の飽和に近づけるのに十分な時間にわたって最大化され、維持される。
【0054】
利用される注入の要素は、時間、体積、温度、ｐＨ、粘度、誘電率、イオン強度、一価イオン、二価イオン、体積排除剤として作用する賦形剤、洗剤、カオトロピック剤、安定剤を含む。治療時間中、添加または尿によって引き起こされる希釈の程度を監視および評価するために使用される着色剤。
【0055】
理想的な結合に必要な最良の条件および時間と最適な投与溶液は、事前に決定することができない。精製されたシステム、細胞ベースの試験、またはインビボモデルを用いて、最適な製剤および条件を実証的に決定する必要があることは、システムの複雑さの関数である。ＥＧＦＲへのＥＧＦ結合について報告された最適な条件は、リガンドタンパク質またはその受容体配列のわずかな変化でさえも、予測できない方法で、著しくかつ明らかに結合を変化させることを示した（Ｃｏｃｈｒａｎ ｅｔ ａｌ．８，８６５，８６４Ｂ２）。配列における比較的小さな変化は、結合オンレートおよびオフレートならびに親和性において著しくかつ明らかな差異を有する。ＤＴ３８９ＥＧＦ融合毒素１６で使用されるジフテリア毒素などの長い配列のＮ末端付加は、ＥＧＦＲへの結合に影響を及ぼし得る。本質的に、対象の全ての生物学的相互作用（例えば、リガンド－受容体、タンパク質－タンパク質相互作用、小分子－輸送タンパク質、および様々な化合物の膜透過輸送）は、ほとんどあらゆるタイプのｐＨ、温度、濃度、粘度、誘電率、イオン強度、および溶質濃度に対して複雑な依存性を有する。これは、配列または環境の任意の所与の変化に対する最適な結合条件を、経験的に決定する必要があることを示す。
【0056】
抗体または毒素配列の付着などの大きな変化は、受容体に対するリガンドの親和性を示すための以下の条件についての要件の未知の変化を惹起する：温度、リガンド濃度、一価および二価の濃度、カオトロピック賦形剤濃度、前洗浄の必要性、ｐＨ、粘度および結合時間。
【0057】
ＤＴ３９８ＥＧＦの膀胱癌細胞殺傷能力の報告は、２４時間の薬剤曝露が２時間の薬剤パルスよりも多くの細胞死を引き起こしたことを示した１７。しかしながら、必要とされる最小または最適時間は、細胞培養では調査されず、したがって、インビボ設定で試験されたパラメータではなかった。上述のように、現在の腫瘍療法の慣例は、注入された薬物製剤の２時間の保持である。所与の製剤中および臨床現場での特定の条件下での結合に必要な時間は予測できないが、経験的な最適化を開始するための境界を設定し得る。精製されたＥＧＦ／ＥＧＦＲ系における結合速度を測定する報告は、分時間規模での完全な結合を示し、一方で上の細胞系は、数時間から数日を必要とし得ることを示唆する。したがって、最適な有効性をもたらすために、１０分～４８時間の間の時点が本明細書で企図される。２時間を超える時間が必要な場合は、連続洗浄を使用する。膀胱を出入する流量、および膀胱体積は、一定の薬剤濃度（実用的な範囲内および所定の治療閾値を超える）および製剤条件が、当業者によって使用される現在の臨床手順を使用して、必要とされる時間に対して最適であり続けることができるように維持され得る。
【0058】
上の考察は、結合事象自体の有効性に影響を与え、改善された有効性を可能にするパラメータを強調した。標的器官および標的細胞に対する投与前、投与、および投与後の条件もまた、多くの治療の有効性または毒性低下に影響を与える。報告１８は、リソソームの酸性化がジフテリア毒素の細胞質への放出に重要であることを実証している；細胞培地の酸性化が毒性を増大させる一方、酸性化の遮断は毒性を低減または防止する。したがって、ｐＨは、単に結合という以上に重要である。報告１９はまた、熱ショックタンパク質がエンドソームから細胞質へのジフテリア毒素の転位を補助する重要なシャペロンタンパク質であることも示している。したがって、温度、および増加するシャペロンタンパク質活性を誘導するためのその使用は、結合とは関係のない機序を通して毒性を増大させるために使用され得る。したがって、投与前、投与中または投与後の時間にわたる標的器官および／または細胞による変化した温度およびｐＨへの曝露は、タンパク質－毒素融合物療法および他の療法による活性に有意な効果を有し得る。
【0059】
本明細書において、ＤＴ－ＥＧＦ融合タンパク質を、それを必要とする対象に投与することによって、その細胞表面上にＥＦＧ受容体の過剰発現を有する疾患を治療するための組成物および方法が提供される。一態様では、本開示の方法は、アミノ酸を変化させることによってＤＴの配列によって引き起こされる免疫応答を低下させ得るが、これはＤＴ誘発性毒性に顕著な影響を与えないような方法である。別の態様では、本開示の方法は、ＥＧＦ受容体に対するＤＴ－ＥＧＦ構築物のＥＧＦ部分の親和性を増大させ得る。別の態様では、本開示の方法は、ＤＴ部分とＥＧＦ部分との間にアミノ酸配列を挿入して、たとえばＥＧＦＲ結合の減少またはＤＴ誘導性毒性の減少などの任意の拮抗を最小化するか、または標的細胞内に入るとＤＴ－ＥＧＦ構築物からのＤＴの放出を可能にし得る。
【0060】
一実施形態では、本方法は、天然型ＤＴ配列と、ＥＧＦ受容体の会合速度または親和性を高めることが報告されている変異のいずれかで修飾されたＥＧＦへの０～２０アミノ酸の短配列で置換された結合ドメインを組み合わせる。
例示的な一実施形態は、タンパク質のアミノ酸配列（Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ－Ｋｄ＋）、強化された結合上皮細胞増殖因子変異体との切断ジフテリア毒素の融合物を含む。
例示的な一実施形態は、タンパク質のアミノ酸配列（Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ－Ｋｄ＋）、強化された結合上皮細胞増殖因子変異体との切断ジフテリア毒素の融合物を含む。
【0061】
以下のＡＸＹＺ配列に対する変異は、大文字で示される。
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk ydaagysvdn
enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp
faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi
rdktktkies lkehgpiknk msespa ktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya
awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald
Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号６）
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk ydaagysvdn
enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp
faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi
rdktktkies lkehgpiknk msespa ktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya
awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald
Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号６）
【0062】
一部の態様では、Ｚは、ＥＧＦＲ結合特性を改善する修飾を有するＥＧＦである。例えば、Ｚは：
wnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号３）であり得る。
wnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号３）であり得る。
【0063】
一実施形態では、本方法は、ＤＴ配列の免疫認識を低下させる組込みまたは報告された配列改変を、天然型アミノ酸配列を保持するＥＧＦへの０～２０アミノ酸の短配列で置換された結合ドメインと組み合わせる。
【0064】
一実施形態では、本方法は、ＤＴ配列の免疫認識を低減する組込みまたは報告された配列改変と、ＥＧＦ受容体の会合速度または親和性を高めることが報告されている変異のいずれかで修飾されたＥＧＦへの０～２０アミノ酸の短配列で置換された結合ドメインを組み合わせる。
【0065】
一実施形態では、本方法は、天然型ＤＴ配列と、ＥＧＦ受容体の会合速度または親和性を高めることが報告されている変異のいずれかで修飾されたＥＧＦへの、リソソームプロテアーゼまたは細胞内プロテアーゼによって標的化されるように設計された０～２０アミノ酸の短配列で置換された結合ドメインを組み合わせる。
【0066】
一実施形態では、本方法は、ＤＴ配列の免疫認識を低下させる組込みまたは報告された配列改変を、天然型アミノ酸配列を保持するＥＧＦへの、リソソームプロテアーゼまたは細胞内プロテアーゼによって標的化されるように設計された０～２０アミノ酸の短配列で置換された結合ドメインと組み合わせる。
【0067】
一実施形態では、本方法は、ＤＴ配列の免疫認識を低減する組込みまたは報告された配列改変と、ＥＧＦ受容体の会合速度または親和性を高めることが報告されている変異のいずれかで修飾されたＥＧＦへの、リソソームプロテアーゼまたは細胞内プロテアーゼによって標的化されるように設計された０～２０アミノ酸の短配列で置換された結合ドメインを組み合わせる。
【0068】
一態様では、本明細書は、対象における拡張性器官の疾患を治療する方法を提供し、本方法は、本明細書に開示される製剤を含む医薬組成物を対象の拡張性器官または組織に投与すること、薬剤標的相互作用および全体的な有効性を改善させるように設計された投与レジメンを使用することを含む。開示された方法は、その標的に対する薬剤の結合および親和性を増加および改善する、ならびに／または二次的機序によって有効性を改善する、製剤および一連の条件を用いて、拡張性器官を前処置し得る。開示された方法は、その標的に対する薬剤の結合および親和性を増加および改善する、ならびに／または二次的機序によって有効性を改善する、薬物製剤および一連の条件を用いて、拡張性器官を治療し得る。開示された方法は、その標的に対する薬剤の結合および親和性を増加および改善する、ならびに／または二次的機序によって有効性を改善する、製剤および一連の条件を用いて、拡張性器官を後処置し得る。本開示の方法は、投与前、投与、および投与後製剤および条件を使用し、条件は、体積、温度、ｐＨ、粘度、誘電率、イオン強度、一価イオン、二価イオン、体積排除剤として作用する賦形剤、洗剤、カオトロピック剤、安定剤を含み得る。
【0069】
一態様では、本明細書において、対象における拡張性器官の疾患を治療する方法を提供する。
方法は、対象の器官に、薬物－標的相互作用および全体的な有効性を改善するように実証された製剤を含む医薬組成物を投与することを含む（図２～５）。方法は、薬物のその標的への結合および親和性を増加および改善し、ならびに／または有効性を改善するように示された一連の条件のいずれかを使用し得る。図２～５は、以下の条件が、（配列番号１の）Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦまたは（配列番号２の）Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ－Ｋｄ＋とＥＧＦＲの結合を可能にすることを実証する：
ＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％界面活性剤Ｐ２０）
ＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）
１５０～５００ｍＭ ＮａＣｌ
０～２０ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０～５００ｍＭ ＮａＰＯ４
０～２００ｍＭ グルコース
ＲＭＰＩ（全成分）
０－１ｍＭＥＤＴＡ
ｐＨ６～８。
方法は、対象の器官に、薬物－標的相互作用および全体的な有効性を改善するように実証された製剤を含む医薬組成物を投与することを含む（図２～５）。方法は、薬物のその標的への結合および親和性を増加および改善し、ならびに／または有効性を改善するように示された一連の条件のいずれかを使用し得る。図２～５は、以下の条件が、（配列番号１の）Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦまたは（配列番号２の）Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ－Ｋｄ＋とＥＧＦＲの結合を可能にすることを実証する：
ＨＢＳ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、および０．０５％界面活性剤Ｐ２０）
ＰＢＳ（１０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）
１５０～５００ｍＭ ＮａＣｌ
０～２０ｍＭ ＭｇＣｌ２
１０～５００ｍＭ ＮａＰＯ４
０～２００ｍＭ グルコース
ＲＭＰＩ（全成分）
０－１ｍＭＥＤＴＡ
ｐＨ６～８。
【0070】
当業者であれば、ｐＨ７．４がｐＨ６と比較してそれほど顕著に改善されることを予想していなかったであろう（特に尿が通常ｐＨ６未満を呈すると仮定すると）。また、驚くべきことに、ＭｇＣｌ２などの二価の非存在下、または最小量の二価、例えば、約２０ｍＭ未満、または約１０ｍＭ未満、または約２ｍＭ未満の二価での結合の改善があった。そして最後に、グルコースの増加を伴う結合の改善は、当業者には予期されないであろう。
【0071】
本明細書で最初に実証されたのは、例えば少なくとも約ｐＨ７．０、約７．２、約７．４、約７．６、約７．８、約８．０など、ｐＨ７．４以上が改善された結合を提供する（図３）、および図４から、ＮａＣｌなどの一価イオンは、例えば約５ｍＭ～約１５ｍＭ、または約８ｍＭ～約１２ｍＭ、または約５ｍＭ、または約６ｍＭ、または約７ｍＭ、または約８ｍＭ、または約９ｍＭ、または約１０ｍＭ、または約１１ｍＭ、または約１２ｍＭ、または約１３ｍＭ、または約１４ｍＭ、または約１５ｍＭなど、約１０ｍＭで発見された試験された条件の最適値を示し、一方で、ＮａＰＯ４などの緩衝剤のイオン強度は、例えば約１４５ｍＭ、約１４８ｍＭ、約１５２ｍＭ、約１５４ｍＭ、約１４０～約１６０ｍＭ、または約１４５ｍＭ～約１５５ｍＭ、または約１５０ｍＭ～約１６０ｍＭ、または約１４０ｍＭ～約１５０ｍＭなど、約１５０ｍＭで発見された試験された条件の最適値で有効であり、例えばＭｇＣｌ２などの二価イオンは、それらが不在である場合に最も効果的である。二価イオンの非存在は、ビスホスホネートまたはＥＤＴＡ（ＳＰＲ実験の薬液中で最大３５ｕＭまで存在したように）などのキレート化剤を使用することによって達成し得る。約１０ｍＭ～約１５０ｍＭのグルコース、または約２０ｍＭ～約１２０ｍＭのグルコース、または少なくとも約１０ｍＭのグルコース、少なくとも約５０ｍＭのグルコース、または少なくとも約１００ｍＭのグルコースの存在は、例えば、図５に示す試験条件下での結合を改善する。
【0072】
一実施形態では、方法は、１０ｍＭ ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含む注入製剤で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【0073】
一実施形態では、方法は、１０ｍＭ ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、５０～２００ｍＭ グルコースを含む注入製剤で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【0074】
一実施形態では、方法は、１０ｍＭ ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、０．５～２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む注入製剤で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【0075】
一実施形態では、方法は、１０ｍＭ ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ゾレンドロネート（または任意のビスホスホネート）を含む注入製剤で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【0076】
一態様では、本明細書では、治療時間中に添加または尿によって引き起こされる希釈の程度を監視および評価し、条件を最適範囲内に維持するために使用される着色剤を提供する方法が提供される。
【0077】
一態様では、本明細書において、製剤および条件の開発における有効性を改善するための戦略の要素として、または製剤および／または条件自体の要素として、公知または公開された結合条件を使用する方法が提供される。
【0078】
一態様では、本明細書において、製剤および条件の開発における有効性を改善するための戦略の要素として、または製剤および／または条件自体の要素として、結合条件の細胞ベースの分析および／またはインビボ評価を使用する方法が提供される。
【0079】
一態様では、本明細書において、製剤および条件の開発における有効性を改善するための戦略の要素として、または製剤および／または条件自体の要素として、投与前、投与、および投与後条件の細胞ベースの分析および／またはインビボ評価を使用する方法が提供される。
【0080】
一実施形態では、方法は、そのＥＧＦＲ標的に対するジフテリア－ＥＧＦ、またはそのＥｐＣＡＭ標的に対するｅｐＣＡＭ－毒素Ａなどの融合タンパク質毒素に対する細胞表面標的の曝露を最大化する、注入容量（７５ｍＬ～１５００ｍＬ）で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【0081】
一実施形態では、方法は、融合タンパク質毒素薬剤による細胞表面標的への結合を改善するように設計された薬剤製剤の希釈を最小化する注入容量（７５ｍＬ～１５００ｍＬ）で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【0082】
一実施形態では、方法は、そのＥＧＦＲ標的に対するジフテリア－ＥＧＦ、またはそのＥｐＣＡＭ標的に対するｅｐＣＡＭ－毒素Ａなどの融合タンパク質－毒素薬剤による細胞表面標的への結合を最大化する、注入製剤および条件で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【0083】
一実施形態では、方法は、グリコカリックスまたは他の結合の阻害物質の破壊または除去により、そのＥＧＦＲ標的に対するジフテリア－ＥＧＦ、またはそのＥｐＣＡＭ標的に対するｅｐＣＡＭ－毒素Ａなどの融合タンパク質－毒素薬剤による細胞表面標的への結合を最大化する条件下で、投与前注入製剤で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【0084】
一実施形態では、方法は、そのＥＧＦＲ標的に対するジフテリア－ＥＧＦ、またはそのＥｐＣＡＭ標的に対するｅｐＣＡＭ－毒素Ａなどの融合タンパク質－毒素薬剤による細胞表面標的への結合を最大化する、および／または有効性を改善させる二次的機序（結合強化以外の）を促進させる条件下で、投与前注入製剤で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【0085】
一実施形態では、方法は、そのＥＧＦＲ標的に対するジフテリア－ＥＧＦ、またはそのＥｐＣＡＭ標的に対するｅｐＣＡＭ－毒素Ａなどの融合タンパク質－毒素薬剤による細胞表面標的への結合を最大化する、および／または有効性を改善させる二次的機序（結合強化ではない）を促進させる条件下で、投与後注入製剤で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【0086】
一実施形態では、方法は、そのＥＧＦＲ標的に対するジフテリア－ＥＧＦ、またはそのＥｐＣＡＭ標的に対するｅｐＣＡＭ－毒素Ａなどの融合タンパク質－毒素薬剤による細胞表面標的への結合を最大化する、および／または有効性を改善させる二次的機序（結合強化ではない）を促進させる注入保持時間で、投与前および／または投与および／または投与後注入製剤で膀胱癌を有する対象を治療することを含む。
【実施例】
【0087】
以下の実施例は、当業者に、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために提示されており、発明者がその発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（量、温度など）に関して正確さを確保するための努力がなされてきたが、実験誤差と偏差を考慮する必要がある場合がある。特に明記されていない限り、質量は重量部、分子量は平均分子量、温度は摂氏温度、室温は約２５℃、圧力は大気圧またはそれに近い温度である。
【0088】
実施例１
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、二つのＤＴＥＧＦ融合毒素のＥＧＦへの結合測定値および分析値が決定された。データは、３００（ｓ）の会合相および９００（ｓ）の解離相を使用して収集された。動態速度係数は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００バイオセンサーを用いて実施された結合分析実験から回収された。３００ｎＭ～１．２３ｎＭの範囲の六つの濃度の検体を、捕捉されたｒｈｕ ＥＧＦＲ（Ｆｃ）に対して二回繰返し分析した。会合および分離相のデータは、会合速度係数（ｋａ）、解離速度係数（ｋｄ）、およびＲｍａｘ値を決定するための、１：１の結合モデルについてのグローバルフィッティングを行った。結果は、１：１の結合モデル±標準偏差に対するグローバルフィッティングとして報告される。図２を参照。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、二つのＤＴＥＧＦ融合毒素のＥＧＦへの結合測定値および分析値が決定された。データは、３００（ｓ）の会合相および９００（ｓ）の解離相を使用して収集された。動態速度係数は、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００バイオセンサーを用いて実施された結合分析実験から回収された。３００ｎＭ～１．２３ｎＭの範囲の六つの濃度の検体を、捕捉されたｒｈｕ ＥＧＦＲ（Ｆｃ）に対して二回繰返し分析した。会合および分離相のデータは、会合速度係数（ｋａ）、解離速度係数（ｋｄ）、およびＲｍａｘ値を決定するための、１：１の結合モデルについてのグローバルフィッティングを行った。結果は、１：１の結合モデル±標準偏差に対するグローバルフィッティングとして報告される。図２を参照。
【0089】
実施例２
緩衝液条件をスクリーニングするためのＳＰＲアッセイ－Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦおよびＡ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ－Ｋｄ＋／ｒｈｕＥＧＦＲ相互作用のＮａＣｌ、ｐＨ、緩衝液強度、および二価カチオン。約２７５ＲＵでのｒｈｕＥＧＦＲ捕捉。各分析物の３００ｎＭ濃度を単回注射した。１ＨＢＳ Ｐ １０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ ７．４；２ＰＢＳ Ｐ １０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４。図３を参照。
緩衝液条件をスクリーニングするためのＳＰＲアッセイ－Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦおよびＡ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ－Ｋｄ＋／ｒｈｕＥＧＦＲ相互作用のＮａＣｌ、ｐＨ、緩衝液強度、および二価カチオン。約２７５ＲＵでのｒｈｕＥＧＦＲ捕捉。各分析物の３００ｎＭ濃度を単回注射した。１ＨＢＳ Ｐ １０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ ７．４；２ＰＢＳ Ｐ １０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ 界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４。図３を参照。
【0090】
実施例３
１５分間にわたるＡ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ（ＢＯ５）およびＡ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ－Ｋｄ＋（ＢＯ１）処置は、膀胱癌細胞株ＨＴＢ９上で強力な細胞死滅を示す。図４を参照。
１５分間にわたるＡ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ（ＢＯ５）およびＡ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦ－Ｋｄ＋（ＢＯ１）処置は、膀胱癌細胞株ＨＴＢ９上で強力な細胞死滅を示す。図４を参照。
【0091】
実施例４
１日目に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０の９６ウェルプレートに播種したＨＴＢ９細胞を、２日間付着させた後、指示されたグルコース濃度の５ｎｇ／ｍＬ Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦで２時間処理した。処置を除去し、５０ｕｌの培地で二回洗浄し、次いで１００ｕｌの培地を加えて７２時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイで生存率を評価した。各条件を三回行った。図５を参照。
１日目に１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０の９６ウェルプレートに播種したＨＴＢ９細胞を、２日間付着させた後、指示されたグルコース濃度の５ｎｇ／ｍＬ Ａ－ｄｍＤＴ３９０－ＥＧＦで２時間処理した。処置を除去し、５０ｕｌの培地で二回洗浄し、次いで１００ｕｌの培地を加えて７２時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイで生存率を評価した。各条件を三回行った。図５を参照。
【0092】
参考文献：
1. Cohen KA, Liu TF, Cline JM, et al: Toxicology and pharmacokinetics of DT388IL3, a fusion toxin consisting of a truncated diphtheria toxin (DT388) linked to human interleukin 3 (IL3), in cynomolgus monkeys. Leuk Lymphoma 45:1647-56, 2004
2. Cohen KA, Liu TF, Cline JM, et al: Safety evaluation of DT388IL3, a diphtheria toxin/interleukin 3 fusion protein, in the cynomolgus monkey. Cancer Immunol Immunother 54:799-806, 2005
3. Horita H, Thorburn J, Frankel AE, et al: EGFR-targeted diphtheria toxin stimulates TRAIL killing of glioblastoma cells by depleting anti-apoptotic proteins. J Neurooncol 95:175-184, 2009
4. Liu TF, Cohen KA, Ramage JG, et al: A diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein is cytotoxic to human glioblastoma multiforme cells. Cancer Res 63:1834-7, 2003
5. Liu TF, Cohen KA, Willingham MC, et al: Combination fusion protein therapy of refractory brain tumors: demonstration of efficacy in cell culture. J Neurooncol 65:77-85, 2003
6. Liu TF, Hall PD, Cohen KA, et al: Interstitial diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein therapy produces regressions of subcutaneous human glioblastoma multiforme tumors in athymic nude mice. Clin Cancer Res 11:329-34, 2005
7. Liu TF, Tatter SB, Willingham MC, et al: Growth factor receptor expression varies among high-grade gliomas and normal brain: epidermal growth factor receptor has excellent properties for interstitial fusion protein therapy. Mol Cancer Ther 2:783-7, 2003
8. Liu TF, Urieto JO, Moore JE, et al: Diphtheria toxin fused to variant interleukin-3 provides enhanced binding to the interleukin-3 receptor and more potent leukemia cell cytotoxicity. Exp Hematol 32:277-81, 2004
9. Liu TF, Willingham MC, Tatter SB, et al: Diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein and Pseudomonas exotoxin-interleukin 13 fusion protein exert synergistic toxicity against human glioblastoma multiforme cells. Bioconjug Chem 14:1107-14, 2003
10. Mishra G, Liu TF, Frankel AE: Recombinant toxin DAB389EGF is cytotoxic to human pancreatic cancer cells. Expert Opin Biol Ther 3:1173-80, 2003
11. Yang X, Kessler E, Su LJ, et al: Diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein DAB389EGF for the treatment of bladder cancer. Clin Cancer Res 19:148-57, 2013
12. Lahti JL, Lui BH, Beck SE, et al: Engineered epidermal growth factor mutants with faster binding on-rates correlate with enhanced receptor activation. FEBS Lett 585:1135-9, 2011
13. Schmohl: Mutagenic Deimmunization of Diphtheria Toxin for use in Biological Drug Development. Toxins 7:4067-4082, 2015
14. Ramesh N, Memarzadeh B, Ge Y, et al: Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther 10:697-705, 2004
15. Saitakis M, Gizeli E: Quantification of the effect of glycocalyx condition on membrane receptor interactions using an acoustic wave sensor. Eur Biophys J 40:209-15, 2011
16. Liu TF, Cohen KA, Ramage JG, et al: A diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein is cytotoxic to human glioblastoma multiforme cells. Cancer Res 63:1834-7, 2003
17. Yang X, Kessler E, Su LJ, et al: Diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein DAB389EGF for the treatment of bladder cancer. Clin Cancer Res 19:148-57, 2013
18. Lemichez E, Bomsel M, Devilliers G, et al: Membrane translocation of diphtheria toxin fragment A exploits early to late endosome trafficking machinery. Mol Microbiol 23:445-57, 1997
19. Schuster M, Schnell L, Feigl P, et al: The Hsp90 machinery facilitates the transport of diphtheria toxin into human cells. Sci Rep 7:613, 2017
1. Cohen KA, Liu TF, Cline JM, et al: Toxicology and pharmacokinetics of DT388IL3, a fusion toxin consisting of a truncated diphtheria toxin (DT388) linked to human interleukin 3 (IL3), in cynomolgus monkeys. Leuk Lymphoma 45:1647-56, 2004
2. Cohen KA, Liu TF, Cline JM, et al: Safety evaluation of DT388IL3, a diphtheria toxin/interleukin 3 fusion protein, in the cynomolgus monkey. Cancer Immunol Immunother 54:799-806, 2005
3. Horita H, Thorburn J, Frankel AE, et al: EGFR-targeted diphtheria toxin stimulates TRAIL killing of glioblastoma cells by depleting anti-apoptotic proteins. J Neurooncol 95:175-184, 2009
4. Liu TF, Cohen KA, Ramage JG, et al: A diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein is cytotoxic to human glioblastoma multiforme cells. Cancer Res 63:1834-7, 2003
5. Liu TF, Cohen KA, Willingham MC, et al: Combination fusion protein therapy of refractory brain tumors: demonstration of efficacy in cell culture. J Neurooncol 65:77-85, 2003
6. Liu TF, Hall PD, Cohen KA, et al: Interstitial diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein therapy produces regressions of subcutaneous human glioblastoma multiforme tumors in athymic nude mice. Clin Cancer Res 11:329-34, 2005
7. Liu TF, Tatter SB, Willingham MC, et al: Growth factor receptor expression varies among high-grade gliomas and normal brain: epidermal growth factor receptor has excellent properties for interstitial fusion protein therapy. Mol Cancer Ther 2:783-7, 2003
8. Liu TF, Urieto JO, Moore JE, et al: Diphtheria toxin fused to variant interleukin-3 provides enhanced binding to the interleukin-3 receptor and more potent leukemia cell cytotoxicity. Exp Hematol 32:277-81, 2004
9. Liu TF, Willingham MC, Tatter SB, et al: Diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein and Pseudomonas exotoxin-interleukin 13 fusion protein exert synergistic toxicity against human glioblastoma multiforme cells. Bioconjug Chem 14:1107-14, 2003
10. Mishra G, Liu TF, Frankel AE: Recombinant toxin DAB389EGF is cytotoxic to human pancreatic cancer cells. Expert Opin Biol Ther 3:1173-80, 2003
11. Yang X, Kessler E, Su LJ, et al: Diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein DAB389EGF for the treatment of bladder cancer. Clin Cancer Res 19:148-57, 2013
12. Lahti JL, Lui BH, Beck SE, et al: Engineered epidermal growth factor mutants with faster binding on-rates correlate with enhanced receptor activation. FEBS Lett 585:1135-9, 2011
13. Schmohl: Mutagenic Deimmunization of Diphtheria Toxin for use in Biological Drug Development. Toxins 7:4067-4082, 2015
14. Ramesh N, Memarzadeh B, Ge Y, et al: Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Mol Ther 10:697-705, 2004
15. Saitakis M, Gizeli E: Quantification of the effect of glycocalyx condition on membrane receptor interactions using an acoustic wave sensor. Eur Biophys J 40:209-15, 2011
16. Liu TF, Cohen KA, Ramage JG, et al: A diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein is cytotoxic to human glioblastoma multiforme cells. Cancer Res 63:1834-7, 2003
17. Yang X, Kessler E, Su LJ, et al: Diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein DAB389EGF for the treatment of bladder cancer. Clin Cancer Res 19:148-57, 2013
18. Lemichez E, Bomsel M, Devilliers G, et al: Membrane translocation of diphtheria toxin fragment A exploits early to late endosome trafficking machinery. Mol Microbiol 23:445-57, 1997
19. Schuster M, Schnell L, Feigl P, et al: The Hsp90 machinery facilitates the transport of diphtheria toxin into human cells. Sci Rep 7:613, 2017
【0093】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許が、参照により組み込まれることが明確にかつ個別に示唆された場合と同じ程度に、参照により援用される。この参照による援用の声明は、出願人により、個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、またはそのような引用が参照による援用の声明に直接隣接しなくても特定された特許の各々に関連することが意図されている。専用の参照による援用の声明を、存在する場合、明細書中に含めることは、一般的な参照による援用の声明をいかなる方法でも弱めるものではない。本明細書の参考文献の引用は、参考文献が先行技術に関係することを認めることを意図しておらず、またこれらの出版物または文書の内容または日付に関するいかなる承認も構成するものではない。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-10-26
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0001】
政府のライセンス権
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより与えられた１Ｒ４４ＣＡ２３２９６３－０１の下で政府の支援により為された。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
関連出願
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１９年４月２３日に出願された“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｔｅｎｔａｂｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ”と題された米国仮特許出願第６２／８３７，５３３号の利益を主張するものである。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより与えられた１Ｒ４４ＣＡ２３２９６３－０１の下で政府の支援により為された。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
関連出願
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１９年４月２３日に出願された“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｔｅｎｔａｂｌｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ”と題された米国仮特許出願第６２／８３７，５３３号の利益を主張するものである。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0093】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許が、参照により組み込まれることが明確にかつ個別に示唆された場合と同じ程度に、参照により援用される。この参照による援用の声明は、出願人により、個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、またはそのような引用が参照による援用の声明に直接隣接しなくても特定された特許の各々に関連することが意図されている。専用の参照による援用の声明を、存在する場合、明細書中に含めることは、一般的な参照による援用の声明をいかなる方法でも弱めるものではない。本明細書の参考文献の引用は、参考文献が先行技術に関係することを認めることを意図しておらず、またこれらの出版物または文書の内容または日付に関するいかなる承認も構成するものではない。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
組成物であって、
ａ．構造Ａ－Ｘ－Ｙ－Ｚのジフテリア毒素－上皮成長因子（ＤＴ－ＥＧＦ）融合タンパク質を含み、式中：
ｂ．Ａは、前記ジフテリア毒素配列の前面への０～５のアミノ酸残基のＮ末端付加であり；
ｃ．Ｘは、触媒活性を維持するジフテリア毒素断片または変異断片であり；
ｄ．Ｙは、Ｘのカルボキシ末端をＺのアミノ末端に接続する、長さ０～２０ａａのアミノ酸配列であり；ならびに
ｅ．Ｚは、上皮成長因子受容体に対する結合親和性を維持する、上皮成長因子またはその変異体である、組成物。
（項目２）
前記組成物が、少なくとも約７．０、少なくとも約７．４、または少なくとも約８のｐＨを有する製剤中に存在する、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物が、少なくとも約１０ｍＭのグルコース、少なくとも約５０ｍＭのグルコース、または少なくとも約１００ｍＭのグルコースを含む製剤中に存在する、項目１に記載の組成物。
（項目４）
製剤中の前記組成物が、最小限の量のＭｇＣｌ ２ 、または約２０ｍＭ未満のＭｇＣｌ ２ 、または約１０ｍＭ未満のＭｇＣｌ ２ 、または約２ｍＭ未満のＭｇＣｌ ２ を有する、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記組成物が、ｐＨ８．０で１０ｍＭのＰＯ ４ および１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて製剤化される、項目１に記載の組成物。
（項目６）
Ａが単一のアラニンである、項目１に記載の組成物。
（項目７）
Ｘが（グリコシル化部位が除去された）
gaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd
wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet
rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf （配列番号１）である、項目１に記載の組成物。
（項目８）
Ｘが、
gaddvvdss ksfvmenfss yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd
wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet
rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespnktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf（配列番号２）である、項目１に記載の組成物。
（項目９）
Ｘが、免疫反応も回避しながら触媒活性を維持する修飾配列である、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
Ｙが、
ａ． ｈａ、
ｂ． ｐｗ、
ｃ． ａａ、
ｄ． ｌｐ、または
ｅ． ｇｇである、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
Ｙが、
ａ．リソソームプロテアーゼまたは細胞内プロテアーゼによって標的化されるように設計された０～２０のアミノ酸短配列
ｂ．Ｘ配列とＺ配列の負のまたは阻害性の相互作用を最小化するよう設計された、０～２０のアミノ酸短配列である、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
Ｚが野生型ヒトＥＧＦ配列である、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
Ｚが、
ａ．wnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号３）または
ｂ．ＥＧＦ受容体に対する親和性を増加させる任意の変異体である、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk
ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd
gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn
rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe
lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv
aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号６）を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１５）
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk
ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn
rvrrsvgsslscinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe
lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsdsecp lshdgyclhd gvcmyieald kyacncvvgy igercqyrdl kwwelr (A-dmDT390-EGF) （配列番号5）を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
標的薬物治療に対する細胞表面標的の曝露を最大化する注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目１７）
細胞表面標的の標的薬物治療への曝露を最大化する製剤および一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目１８）
細胞表面標的の標的薬物治療への曝露を最大化する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目１９）
細胞表面標的の標的薬物治療への結合および曝露を阻害する成分を除去する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目２０）
標的への薬剤の改善された結合の他の機序により標的薬物治療の治療有効性を最大化する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目２１）
標的への薬剤の改善された結合の他の機序により標的薬物治療の治療有効性を最大化する製剤および投与後治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目２２）
前記癌が膀胱内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記癌が胸膜内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記癌が子宮内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記癌が腹膜内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記癌が網内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記癌が眼内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記標的薬物治療が、ジフテリア毒素の上皮細胞増殖因子へのタンパク質－毒素融合物である、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記標的薬物治療が、シュードモナス外毒素ＡのＥｐＣＡＭへのタンパク質－毒素融合物である、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記標的薬物治療が、ＯＮＴＡＫであるタンパク質－毒素融合物である、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
項目１６～３０のいずれか一項に記載の方法で使用するための、項目１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３２）
項目１６～３０のいずれか一項に記載の方法で使用するための医薬品の製造における使用のための、項目１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３３）
配列番号５または配列番号６を含む、項目３２に記載の医薬組成物。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
組成物であって、
ａ．構造Ａ－Ｘ－Ｙ－Ｚのジフテリア毒素－上皮成長因子（ＤＴ－ＥＧＦ）融合タンパク質を含み、式中：
ｂ．Ａは、前記ジフテリア毒素配列の前面への０～５のアミノ酸残基のＮ末端付加であり；
ｃ．Ｘは、触媒活性を維持するジフテリア毒素断片または変異断片であり；
ｄ．Ｙは、Ｘのカルボキシ末端をＺのアミノ末端に接続する、長さ０～２０ａａのアミノ酸配列であり；ならびに
ｅ．Ｚは、上皮成長因子受容体に対する結合親和性を維持する、上皮成長因子またはその変異体である、組成物。
（項目２）
前記組成物が、少なくとも約７．０、少なくとも約７．４、または少なくとも約８のｐＨを有する製剤中に存在する、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物が、少なくとも約１０ｍＭのグルコース、少なくとも約５０ｍＭのグルコース、または少なくとも約１００ｍＭのグルコースを含む製剤中に存在する、項目１に記載の組成物。
（項目４）
製剤中の前記組成物が、最小限の量のＭｇＣｌ ２ 、または約２０ｍＭ未満のＭｇＣｌ ２ 、または約１０ｍＭ未満のＭｇＣｌ ２ 、または約２ｍＭ未満のＭｇＣｌ ２ を有する、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記組成物が、ｐＨ８．０で１０ｍＭのＰＯ ４ および１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて製剤化される、項目１に記載の組成物。
（項目６）
Ａが単一のアラニンである、項目１に記載の組成物。
（項目７）
Ｘが（グリコシル化部位が除去された）
gaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd
wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet
rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge
lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf （配列番号１）である、項目１に記載の組成物。
（項目８）
Ｘが、
gaddvvdss ksfvmenfss yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd
wkgfystdnk ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet
rgkrgqdamy eymaqacagn rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespnktvs eekakqylee fhqtalehpe lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf（配列番号２）である、項目１に記載の組成物。
（項目９）
Ｘが、免疫反応も回避しながら触媒活性を維持する修飾配列である、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
Ｙが、
ａ． ｈａ、
ｂ． ｐｗ、
ｃ． ａａ、
ｄ． ｌｐ、または
ｅ． ｇｇである、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
Ｙが、
ａ．リソソームプロテアーゼまたは細胞内プロテアーゼによって標的化されるように設計された０～２０のアミノ酸短配列
ｂ．Ｘ配列とＺ配列の負のまたは阻害性の相互作用を最小化するよう設計された、０～２０のアミノ酸短配列である、項目１に記載の組成物。
（項目１２）
Ｚが野生型ヒトＥＧＦ配列である、項目１に記載の組成物。
（項目１３）
Ｚが、
ａ．wnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号３）または
ｂ．ＥＧＦ受容体に対する親和性を増加させる任意の変異体である、項目１に記載の組成物。
（項目１４）
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk
ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd
gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn
rvrrsvgssl scinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe
lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv
aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsYsecp PsYdgyclhd gvcRyieald Syacncvvgy Agercqyrdl RwwGRr（配列番号６）を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１５）
agaddvvdss ksfvmenfas yhgtkpgyvd siqkgiqkpk sgtqgnyddd wkgfystdnk
ydaagysvdn enplsgkagg vvkvtypglt kvlalkvdna etikkelgls lteplmeqvg teefikrfgd gasrvvlslp faegsssvey innweqakal sveleinfet rgkrgqdamy eymaqacagn
rvrrsvgsslscinldwdvi rdktktkies lkehgpiknk msespaktvs eekakqylee fhqtalehpe
lselktvtgt npvfaganya awavnvaqvi dsetadnlek ttaalsilpg igsvmgiadg avhhnteeiv aqsialsslm vaqaiplvge lvdigfaayn fvesiinlfq vvhnsynrpa yspghktqpf lpwnsdsecp lshdgyclhd gvcmyieald kyacncvvgy igercqyrdl kwwelr (A-dmDT390-EGF) （配列番号5）を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１６）
標的薬物治療に対する細胞表面標的の曝露を最大化する注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目１７）
細胞表面標的の標的薬物治療への曝露を最大化する製剤および一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目１８）
細胞表面標的の標的薬物治療への曝露を最大化する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目１９）
細胞表面標的の標的薬物治療への結合および曝露を阻害する成分を除去する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目２０）
標的への薬剤の改善された結合の他の機序により標的薬物治療の治療有効性を最大化する製剤および投与前治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目２１）
標的への薬剤の改善された結合の他の機序により標的薬物治療の治療有効性を最大化する製剤および投与後治療の一連の条件から成る注入容量で、拡張性器官における癌を治療する方法。
（項目２２）
前記癌が膀胱内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記癌が胸膜内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記癌が子宮内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記癌が腹膜内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記癌が網内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記癌が眼内に存在する、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記標的薬物治療が、ジフテリア毒素の上皮細胞増殖因子へのタンパク質－毒素融合物である、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記標的薬物治療が、シュードモナス外毒素ＡのＥｐＣＡＭへのタンパク質－毒素融合物である、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記標的薬物治療が、ＯＮＴＡＫであるタンパク質－毒素融合物である、項目１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
項目１６～３０のいずれか一項に記載の方法で使用するための、項目１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３２）
項目１６～３０のいずれか一項に記載の方法で使用するための医薬品の製造における使用のための、項目１～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目３３）
配列番号５または配列番号６を含む、項目３２に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】