特表 2022-530466 ウィスコット・アルドリッチ症候群遺伝子ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、組成物、および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-29

(54)【発明の名称】ウィスコット・アルドリッチ症候群遺伝子ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、組成物、および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20220622BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20220622BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220622BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220622BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20220622BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20220622BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20220622BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20220622BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20220622BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220622BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20220622BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20220622BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20220622BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20220622BHJP

   C12N 5/078 20100101ALN20220622BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N9/16 A ZNA

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N15/867 Z

C12N15/864 100Z

A61P37/02

A61P17/00

A61P7/00

A61K48/00

A61K35/17 A

A61K35/15 A

C12N5/0783

C12N5/0789

C12N5/078

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021563323

(86)(22)【出願日】2020-04-24

(85)【翻訳文提出日】2021-12-21

(86)【国際出願番号】 US2020029771

(87)【国際公開番号】W WO2020219845

(87)【国際公開日】2020-10-29

(31)【優先権主張番号】62/837,996

(32)【優先日】2019-04-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521464503

【氏名又は名称】シアトル チルドレンズ ホスピタル ディー／ビー／エー シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ゲイ， ジョエル

(72)【発明者】

【氏名】カーン， イラム エフ．

(72)【発明者】

【氏名】マン， ジャスディープ

(72)【発明者】

【氏名】ローリングス， デイビッド ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ワン， ユーペン

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050LL05

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA31

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA511

4C084ZA512

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZB071

4C084ZB072

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB44

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA05

4C087NA14

4C087ZA51

4C087ZA89

4C087ZB07

(57)【要約】

本開示は、ヒトウィスコット・アルドリッチ症候群遺伝子を編集するための、改善されたゲノム編集組成物および方法を提供する。本開示は、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、またはＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）を含むが、これらに限定されない、ＷＡＳの少なくとも一つの症状の予防、治療、または回復のためのゲノム編集された細胞をさらに提供する。本明細書において企図される組成物は、ＷＡＳ遺伝子における欠損によって引き起こされる疾患、障害、および状態を有する対象に、可能性のある治癒的な解決を提供する。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子における標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含む、ポリペプチド。

【請求項2】

前記ＨＥバリアントが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

前記ポリペプチドが、前記ＨＥバリアントの生物学的に活性なフラグメントを含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

前記生物学的に活性なフラグメントが、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノを欠く、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記生物学的に活性なフラグメントが、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

前記生物学的に活性なフラグメントが、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠く、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項7】

前記生物学的に活性なフラグメントが、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠く、請求項３に記載のポリペプチド。

【請求項8】

前記生物学的に活性なフラグメントが、対応する野生型ＨＥと比較して、前記Ｃ末端アミノ酸を欠く、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

前記生物学的に活性なフラグメントが、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠く、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項10】

前記ＨＥバリアントが、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、およびＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項11】

前記ＨＥバリアントが、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、およびＩ－ＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項12】

前記ＨＥバリアントが、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントである、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項13】

前記ＨＥバリアントが、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、およびＩ－ＴｅｖＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項14】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置でのＤＮＡ認識境界面において１個または複数のアミノ酸置換を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項15】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項16】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントの２４、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７５、７６、７８、８０、８２、１０８、１１６、１３５、１３８、１４３、１５５、１５６、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、２０１、２０３、２０７、２０９、２２５、２２８、２３１、２３２、２３３、２３８、２４７、２５４、および２９１からなる群から選択されるアミノ酸位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項17】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｓ２４Ｆ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３５Ｖ、Ｓ３６Ｉ、Ｓ３６Ｖ、Ｓ３６Ｎ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｉ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｅ４２Ｇ、Ｇ４４Ｅ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｋ、Ｑ４６Ｇ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｓ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｆ１６８Ｈ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｎ１８４Ｆ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２０９Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｋ２２５Ｑ、Ｎ２２８Ｉ、Ｅ２３１Ｇ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｅ、Ｄ２４７Ｎ、Ｑ２５４ＲおよびＫ２９１Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項18】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、およびＱ２５４Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項19】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｅ、およびＱ２５４Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項20】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｖ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｓ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｑ、Ｅ２３１Ｇ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、およびＶ２３８Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項21】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｆ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｖ、Ｓ３６Ｎ、Ｖ３７Ｉ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｇ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２０９Ｒ、Ｋ２２５Ｑ、Ｆ２３２Ｓ、Ｖ２３８Ｒ、およびＱ２５４Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項22】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｈ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｑ２５４ＲおよびＫ２９１Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項23】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｆ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｅ、およびＱ２５４Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項24】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｇ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｎ２２８Ｉ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｎ、およびＱ２５４Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項25】

前記ＨＥバリアントが、配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、またはなおより好ましくは、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項26】

前記ＨＥバリアントが、配列番号６に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項27】

前記ＨＥバリアントが、配列番号７に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項28】

前記ＨＥバリアントが、配列番号８に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項29】

前記ＨＥバリアントが、配列番号９に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項30】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項31】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１１に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項32】

前記ＨＥバリアントが、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項33】

前記ＨＥバリアントが、前記ＷＡＳ遺伝子におけるポリヌクレオチド配列に結合する、請求項１～３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項34】

前記ＨＥバリアントが、配列番号２７に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する、請求項１～３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項35】

ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項36】

前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される、請求項３５に記載のポリペプチド。

【請求項37】

前記ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位～約

【請求項38】

５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項３５に記載のポリペプチド。

【請求項39】

前記ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、前記ＷＡＳ遺伝子におけるポリヌクレオチド配列に結合する、請求項３６または請求項３７に記載のポリペプチド。

【請求項40】

前記ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号２８に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する、請求項３６～３８のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項41】

前記ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーモチーフを含む、請求項３６に記載のポリペプチド。

【請求項42】

ペプチドリンカーおよびエンドプロセッシング酵素またはその生物学的に活性なフラグメントをさらに含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項43】

ウイルス自己切断２Ａペプチドおよびエンドプロセッシング酵素またはその生物学的に活性なフラグメントをさらに含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項44】

前記エンドプロセッシング酵素またはその生物学的に活性なフラグメントが、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項４１または請求項４２に記載のポリペプチド。

【請求項45】

前記エンドプロセッシング酵素が、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性なフラグメントを含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項46】

前記ポリペプチドが、配列番号２７または配列番号２９に記載されるポリヌクレオチド配列における前記ヒトＷＡＳ遺伝子を切断する、請求項１～４４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項47】

請求項１～４５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項48】

請求項１～４５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ｍＲＮＡ。

【請求項49】

請求項１～４５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ。

【請求項50】

請求項１～４５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項51】

請求項１～４５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、細胞。

【請求項52】

請求項１～４５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。

【請求項53】

請求項４９に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項54】

請求項１～４５のいずれか一項に記載のポリペプチドによって導入される１個または複数のゲノム改変を含む、細胞。

【請求項55】

前記細胞が造血細胞である、請求項５０～５３のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項56】

前記細胞が、造血幹細胞または前駆細胞である、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項57】

前記細胞が、ＣＤ３４^＋細胞である、請求項５０～５５のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項58】

前記細胞が、ＣＤ１３３^＋細胞である、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項59】

前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項60】

前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項５８に記載の細胞。

【請求項61】

前記細胞が、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、および／またはＣＤ８^＋細胞である、請求項５８または請求項５９に記載の細胞。

【請求項62】

前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項63】

前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項64】

請求項５０～６２のいずれか一項に記載の細胞を含む、組成物。

【請求項65】

請求項５０～６２のいずれか一項に記載の細胞および生理学的に許容可能な担体を含む、組成物。

【請求項66】

細胞においてＷＡＳ遺伝子を編集する方法であって、請求項１～４５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項４６～４８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項４９に記載のベクター；およびドナー修復鋳型を前記細胞に導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ＷＡＳ遺伝子における標的部位での二本鎖切断を生じ、前記ドナー修復鋳型が、前記二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位での相同組み換え修復（ＨＤＲ）によって前記ＷＡＳ遺伝子に取り込まれる、方法。

【請求項67】

前記ＷＡＳ遺伝子が、ＷＡＳ、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、またはＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）をもたらす１個または複数のアミノ酸変異または欠失を含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

前記細胞が、造血細胞である、請求項６５または請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

前記細胞が、造血幹細胞または前駆細胞である、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記細胞が、ＣＤ３４^＋細胞である、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記細胞が、ＣＤ１３３^＋細胞である、請求項６５～６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項６５または請求項６６に記載の方法。

【請求項73】

前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項７１に記載の細胞。

【請求項74】

前記細胞が、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、および／またはＣＤ８^＋細胞である、請求項７１または請求項７２に記載の細胞。

【請求項75】

前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項76】

前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項６５または請求項６６に記載の細胞。

【請求項77】

前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、請求項６５～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

５’－３’エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記細胞に導入される、請求項６５～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性なフラグメントをコードするポリヌクレオチドが、前記細胞に導入される、請求項６５～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記ドナー修復鋳型が、ＷＡＳ遺伝子配列５’の前記ＤＳＢに相同な５’相同アーム、ドナーポリヌクレオチド、およびＷＡＳ遺伝子配列３’の前記ＤＳＢに相同な３’相同アームを含む、請求項６５～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記ドナーポリヌクレオチドが、前記ＷＡＳ遺伝子における１個または複数のアミノ酸変異または欠失を修復するよう設計される、請求項７９に記載の方法。

【請求項82】

前記ドナーポリヌクレオチドが、ＷＡＳポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項83】

前記ドナーポリヌクレオチドが、ＷＡＳポリペプチドをコードするｃＤＮＡに動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む、請求項７９に記載の方法。

【請求項84】

前記５’および３’相同アームの長さが、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐから独立して選択される、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記５’および３’相同アームの長さが、約６００ｂｐ～約１５００ｂｐから独立して選択される、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記５’相同アームが、約１５００ｂｐであり、前記３’相同アームが、約１０００ｂｐである、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記５’相同アームが、約６００ｂｐであり、前記３’相同アームが、約６００ｂｐである、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

ウイルスベクターを使用して、前記ドナー修復鋳型を前記細胞に導入する、請求項６５～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

前記ウイルスベクターが、組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、請求項８７に記載の方法。

【請求項90】

前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２由来の１個または複数のＩＴＲを有する、請求項８８に記載の方法。

【請求項91】

前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、請求項８８または請求項８９に記載の方法。

【請求項92】

前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型を有する、請求項８８～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項８８に記載の方法。

【請求項94】

前記レンチウイルスが、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である、請求項９２に記載の方法。

【請求項95】

ＷＡＳ、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、もしくはＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）、またはそれと関連する状態の少なくとも一つの症状を治療する、予防する、または回復させる方法であって、ＨＳＰＣの集団を対象から回収すること、請求項６５～９３のいずれか一項に記載の方法によりＨＳＰＣの前記集団を編集すること、およびＨＳＰＣの前記編集された集団を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項96】

ＷＡＳ、免疫系障害、またはそれと関連する状態の少なくとも一つの症状を治療する、予防する、または回復させる方法であって、免疫エフェクター細胞の集団を対象から回収すること、請求項７１～７５のいずれか一項に記載の方法により免疫エフェクター細胞の前記集団を編集すること、および細胞の前記編集された集団を前記対象に投与することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１９年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／８３７，９９６号に基づく利益を主張し、参照によりその全体が取り込まれる。

【0002】

配列表に関する記述
本出願と関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に取り込まれる。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＢＬＢＤ＿１１７＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは約２５０ＫＢで、２０２０年４月１４日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

【0003】

本開示は、改善されたゲノム編集組成物に関する。より具体的には、本開示は、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子を編集するための、リプログラミングされたヌクレアーゼ、組成物、およびそれを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

関連技術の説明
ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）は、Ｘ連鎖性劣性遺伝障害であり、およそ１：１００，０００出生数の推定発生率を伴う。

【0005】

ＷＡＳは、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）をコードする遺伝子における変異によって引き起こされる。ＷＡＳは、一般的に、感染（その後、適応および自然免疫不全と関連する）、微量血小板減少症、ならびに湿疹に対する増大した感受性によって特徴付けられる。しかしながら、ＷＡＳ遺伝子変異に起因する広範な疾患重症度が存在する。ＷＡＳの重篤な形態は、細菌およびウイルス感染、重篤な湿疹自己免疫、および／または悪性腫瘍（癌）、特に、リンパ腫または白血病と関連する。より軽度の形態は、血小板減少症ならびにあまり重篤でない感染および湿疹、またはときに感染および湿疹が存在しないことによって特徴付けられる。これらのより軽度の形態は、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）およびＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）として言及される。

【0006】

ＷＡＳの一つの可能性のある治癒は、骨髄、末梢血または臍帯血からの造血幹細胞移植である。しかしながら、ＷＡＳ患者は、依然としてＴリンパ球およびＮＫ細胞機能が残存しているため、患者は、ドナー幹細胞が注入される前に、いくつかの「前処置」を受けるか、または化学療法薬および／もしくは全身照射を用いた処置を受けて、彼ら自身の免疫細胞を破壊しなければならない。ＨＬＡ型クロスマッチドナーが存在しない場合、ほとんどの患者は、ＧＶＨＤのリスクを減少するために、長期間免疫抑制剤の投与を受けている。

【0007】

遺伝子療法を使用して、ＷＡＳを有する少数の患者をうまく治療し、これにより、彼らの出血の問題および免疫不全を治した。残念なことに、少なくとも１人の患者が、遺伝子療法ウイルスのＤＮＡを患者の染色体の感受性領域に挿入する遺伝子療法ウイルスの結果として白血病を発症した。可能性のある、より安全な新しい遺伝子療法ウイルスを試験し、代替的な非ウイルス性遺伝子療法を開発するための研究が、現在進行中である。明らかに、遺伝子療法が、ＷＡＳにより広く適用可能になるまでに、解決されるべき多数の問題が残っている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本開示は、一般的に、一部、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびヒトウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子における標的部位を切断するｍｅｇａＴＡＬを含む組成物、ならびにそれを使用する方法に関する。

【0009】

様々な実施形態では、ポリペプチドは、ヒトＷＡＳ遺伝子における標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含む。

【0010】

ある特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである。

【0011】

特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＨＥバリアントの生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0012】

一部の実施形態では、生物学的に活性なフラグメントは、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠く。

【0013】

特定の実施形態では、生物学的に活性なフラグメントは、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠く。

【0014】

様々な実施形態では、生物学的に活性なフラグメントは、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠く。

【0015】

さらなる実施形態では、生物学的に活性なフラグメントは、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠く。

【0016】

特定の実施形態では、生物学的に活性なフラグメントは、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＣ末端アミノ酸を欠く。

【0017】

ある特定の実施形態では、生物学的に活性なフラグメントは、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠く。

【0018】

様々な実施形態では、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、およびＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。

【0019】

特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、およびＩ－ＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。

【0020】

様々な実施形態では、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントである。

【0021】

特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、およびＩ－ＴｅｖＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。

【0022】

一部の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置でのＤＮＡ認識境界面において１個または複数のアミノ酸置換を含む。

【0023】

さらなる実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置に少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。

【0024】

特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントの２４、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７５、７６、７８、８０、８２、１０８、１１６、１３５、１３８、１４３、１５５、１５６、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、２０１、２０３、２０７、２０９、２２５、２２８、２３１、２３２、２３３、２３８、２４７、２５４、および２９１からなる群から選択されるアミノ酸位置に１個または複数のアミノ酸置換を含む。

【0025】

特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｓ２４Ｆ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３５Ｖ、Ｓ３６Ｉ、Ｓ３６Ｖ、Ｓ３６Ｎ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｉ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｅ４２Ｇ、Ｇ４４Ｅ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｋ、Ｑ４６Ｇ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｓ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｆ１６８Ｈ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｎ１８４Ｆ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２０９Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｋ２２５Ｑ、Ｎ２２８Ｉ、Ｅ２３１Ｇ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｅ、Ｄ２４７Ｎ、Ｑ２５４ＲおよびＫ２９１Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む。

【0026】

さらなる実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、およびＱ２５４の少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む。

【0027】

様々な実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｅ、およびＱ２５４Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む。

【0028】

ある特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｖ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｓ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｑ、Ｅ２３１Ｇ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、およびＶ２３８Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む。

【0029】

様々な実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｆ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｖ、Ｓ３６Ｎ、Ｖ３７Ｉ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｇ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２０９Ｒ、Ｋ２２５Ｑ、Ｆ２３２Ｓ、Ｖ２３８Ｒ、およびＱ２５４Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む。

【0030】

一部の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｈ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｑ２５４ＲおよびＫ２９１Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む。

【0031】

さらなる実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｆ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｅ、およびＱ２５４Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む。

【0032】

特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１～５に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに関連して、以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｇ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｎ２２８Ｉ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｎ、およびＱ２５４Ｒ、およびＶ２３８Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む。

【0033】

さらなる実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、またはなおより好ましくは、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0034】

特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号６に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0035】

さらなる実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号７に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0036】

様々な実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号８に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0037】

特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号９に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0038】

一部の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0039】

特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１１に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0040】

様々な実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0041】

特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、ＷＡＳ遺伝子におけるポリヌクレオチド配列に結合する。

【0042】

一部の実施形態では、ＨＥバリアントは、配列番号２７に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する。

【0043】

さらなる実施形態では、本明細書において企図されるポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。

【0044】

ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される。

【0045】

特定の実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位～約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。

【0046】

さらなる実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ＷＡＳ遺伝子におけるポリヌクレオチド配列に結合する。

【0047】

一部の実施形態では、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号２８に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する。

【0048】

様々な実施形態では、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８個のジンクフィンガーモチーフを含む。

【0049】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるポリペプチドは、ペプチドリンカーおよびエンドプロセッシング酵素またはその生物学的に活性なフラグメントをさらに含む。

【0050】

さらなる実施形態では、本明細書において企図されるポリペプチドは、ウイルス自己切断２Ａペプチドおよびエンドプロセッシング酵素またはその生物学的に活性なフラグメントをさらに含む。

【0051】

一部の実施形態では、エンドプロセッシング酵素またはその生物学的に活性なフラグメントは、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。

【0052】

さらなる実施形態では、エンドプロセッシング酵素は、Ｔｒｅｘ２ またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0053】

様々な実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２７または配列番号２９に記載されるポリヌクレオチド配列においてヒトＷＡＳ遺伝子を切断する。

【0054】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書において企図されるポリペプチドをコードする。

【0055】

さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書において企図されるポリペプチドをコードする。

【0056】

特定の実施形態では、ｃＤＮＡは、本明細書において企図されるポリペプチドをコードする。

【0057】

様々な実施形態では、ベクターは、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0058】

一部の実施形態では、細胞は、本明細書において企図されるポリペプチドを含む。

【0059】

ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0060】

ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書において企図されるベクターを含む。

【0061】

様々な実施形態では、細胞は、本明細書において企図されるポリペプチドによって導入される１個または複数のゲノム改変を含む。

【0062】

特定の実施形態では、細胞は、造血細胞である。

【0063】

特定の実施形態では、細胞は、造血幹細胞または前駆細胞である。

【0064】

特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４^＋細胞である。

【0065】

さらなる実施形態では、細胞は、ＣＤ１３３^＋細胞である。

【0066】

特定の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。

【0067】

一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。

【0068】

特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、および／またはＣＤ８^＋細胞である。

【0069】

ある特定の実施形態では、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。

【0070】

特定の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。

【0071】

一部の実施形態では、組成物は、本明細書において企図されるポリペプチドによって導入される１個または複数のゲノム改変を含む細胞を含む。

【0072】

様々な実施形態では、組成物は、本明細書において企図される１個または複数のゲノム改変および生理学的に許容可能な担体を含む細胞を含む。

【0073】

ある特定の実施形態では、細胞においてＷＡＳ遺伝子を編集する方法は、本明細書において企図されるポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはベクター；およびドナー修復鋳型を細胞に導入することを含み、ポリペプチドの発現が、ＷＡＳ遺伝子における標的部位での二本鎖切断を生じ、ドナー修復鋳型が、二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位での相同組み換え修復（ＨＤＲ）によってＷＡＳ遺伝子に取り込まれる。

【0074】

一部の実施形態では、ＷＡＳ遺伝子は、ＷＡＳ、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、またはＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）をもたらす１個または複数のアミノ酸変異または欠失を含む。

【0075】

特定の実施形態では、細胞は、造血細胞である。

【0076】

さらなる実施形態では、細胞は、造血幹細胞または前駆細胞である。

【0077】

特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。

【0078】

様々な実施形態では、細胞は、ＣＤ１３３＋細胞である。

【0079】

特定の実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。

【0080】

一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。

【0081】

特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ３^＋、ＣＤ４^＋、および／またはＣＤ８^＋細胞である。

【0082】

ある特定の実施形態では、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。

【0083】

特定の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。

【0084】

ある特定の実施形態では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。

【0085】

様々な実施形態では、５’－３’エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、細胞に導入される。

【0086】

さらなる実施形態では、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性なフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、細胞に導入される。

【0087】

一部の実施形態では、ドナー修復鋳型は、ＷＡＳ遺伝子配列５’のＤＳＢに相同な５’相同アーム、ドナーポリヌクレオチド、およびＷＡＳ遺伝子配列３’のＤＳＢに相同な３’相同アームを含む。

【0088】

様々な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＷＡＳ遺伝子における１個または複数のアミノ酸変異または欠失を修復するよう設計される。

【0089】

特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＷＡＳポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む。

【0090】

さらなる実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＷＡＳポリペプチドをコードするｃＤＮＡに動作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。

【0091】

特定の実施形態では、５’および３’相同アームの長さは、約１００ｂｐ～約２５００ｂｐから独立して選択される。

【0092】

特定の実施形態では、５’および３’相同アームの長さは、約６００ｂｐ～約１５００ｂｐから独立して選択される。

【0093】

一部の実施形態では、５’相同アームは、約１５００ｂｐであり、３’相同アームは、約１０００ｂｐである。

【0094】

ある特定の実施形態では、５’相同アームは、約６００ｂｐであり、３’相同アームは、約６００ｂｐである。

【0095】

さらなる実施形態では、ウイルスベクターを使用して、ドナー修復鋳型を細胞に導入する。

【0096】

ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、組み換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである。

【0097】

様々な実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来の１個または複数のＩＴＲを有する。

【0098】

さらなる実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する。

【0099】

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型を有する。

【0100】

一部の実施形態では、レトロウイルスは、レンチウイルスである。

【0101】

ある特定の実施形態では、レンチウイルスは、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である。

【0102】

特定の実施形態では、ＷＡＳ、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、もしくはＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）、またはそれと関連する状態の少なくとも一つの症状を治療する、予防する、または回復させる方法は、ＨＳＰＣの集団を対象から回収すること、ＨＳＰＣの集団を編集すること、およびＨＳＰＣの編集された集団を対象に投与することを含む。

【0103】

特定の実施形態では、免疫系障害、またはそれと関連する状態の少なくとも一つの症状を治療する、予防する、または回復させる方法は、免疫エフェクター細胞の集団を対象から回収すること、免疫エフェクター細胞の集団を編集すること、および細胞の編集された集団を対象に投与することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0104】

【図1A】図１Ａは、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬおよびＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ認識部位（配列番号４７）の模式図を示す。

【図1B】図１Ｂは、ヒトウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子のイントロン２におけるＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ認識部位の位置を示す。エクソン２の下流の認識部位３０塩基対（ｂｐ）および翻訳開始コドンの下流の１６２ｂｐ。

【図2-1】図２Ａは、酵母表面提示アッセイにおけるＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩバリアントの結合活性を示す。 図２Ｂは、ｐＨ８下での酵母表面提示アッセイにおけるＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩバリアントの切断活性を示す。

【図2-2】図２Ｃおよび図２Ｄは、リプログラミングされたＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントが、ＷＡＳ標的部位に結合し、切断することを示す。Ｉ－ＯｎｕＩバリアントライブラリー由来のリプログラミングされたＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントを、ＷＡＳ標的部位に結合し、切断するそれらの能力について試験するために、六つのバリアント（ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントＶ６、Ｖ１２、Ｖ１８、Ｖ３５、Ｖ３７、およびＶ５５）を、酵母表面提示アッセイにおいてそれらの結合および切断活性について比較した。図２Ｃは、約５００～約２８００ＭＦＩの範囲にある、ＭＦＩによって測定した、ＷＡＳ標的部位オリゴヌクレオチドに対する結合活性を示す。図２Ｄは、ｐＨ７．０でのＣａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋比によって測定した、全てのバリアントが示した、ＷＡＳ標的部位オリゴヌクレオチドの切断活性を示し、これは、ヒトＷＡＳ遺伝子の効率的標的化を示している。

【図2-3】同上。

【図3-1】図３Ａは、イタリック体の１１、１２、１３、１４、または１５のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン標的部位（配列番号４７）を有するｍｅｇａＴＡＬ認識部位を示す。 図３Ｂは、変動するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを有するｍｅｇａＴＡＬとして再配列したＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩバリアントが、ＴＬＲアッセイにおいて同等の発現レベル（％ＢＦＰ発現）を有することを示す。 図３Ｃは、１２個の反復可変残基（ＲＶＤ）を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを有するＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ｍｅｇａＴＡＬが、１１、１３、１４、または１５個のＲＶＤを有するｍｅｇａＴＡＬより高い切断活性（％ｍＣｈｅｒｒｙとして表す）を有することを示す。

【図3-2】図３Ｄは、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ｍｅｇａＴＡＬ（Ｖ６、Ｖ１２、Ｖ１８、Ｖ３５、Ｖ３７、またはＶ５５）が、ＴＲＥＸ２（Ｔｘ２）発現の存在または不存在下で同等の発現レベル（％ＢＦＰ発現）を有することを示す。図３Ｅは、ＴＲＥＸ２ともに発現したＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ｍｅｇａＴＡＬ（Ｖ６、Ｖ１２、Ｖ１８、Ｖ３５、Ｖ３７、またはＶ５５）が、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ認識部位の切断（％ｍＣｈｅｒｒｙ発現）を増大させることを示す。

【図3-3】図３Ｆは、ｍＲＮＡ遺伝子導入による、ヒト初代Ｔ細胞におけるＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ｍｅｇａＴＡＬ（Ｖ６、Ｖ１２、Ｖ１８、Ｖ３５、Ｖ３７、または１２ＲＶＤを有するＶ５５）の切断効率（ＮＨＥＪ％）を示す。提示したデータは、標準誤差を有する健康な対照男性ドナー三名からの三つの独立した実験の平均である。

【図4-1】図４Ａは、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ Ｖ６、Ｖ１２、Ｖ１８、Ｖ３５、Ｖ３７、およびＶ５５ならびにＡＡＶ ＧＦＰ発現ドナー修復鋳型を遺伝子導入したヒト初代Ｔ細胞においてＨＤＲを誘導する一般的な実験アプローチを示す。図４Ｂは、ＷＡＳ遺伝子座でのＨＤＲストラテジーの模式図を示す。

【図4-2】図４Ｃは、遺伝子導入の２日後および１５日後のＣＤ４^＋Ｔ細胞の生存率を示す。提示したデータは、一つの独立した実験からのものである。図４Ｄは、遺伝子導入の２日後および１５日後のＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現を示す。提示したデータは、一つの独立した実験からのものである。

【図5-1】図５Ａは、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ Ｖ６、Ｖ１２、Ｖ１８、Ｖ３５、Ｖ３７、およびＶ５５ならびに異なる量のＡＡＶ ＧＦＰ発現ドナー修復鋳型を遺伝子導入したヒト初代ＣＤ３４^＋細胞においてＨＤＲを誘導する一般的な実験アプローチを示す。図５Ｂは、遺伝子導入の１日後および５日後のＣＤ３４^＋細胞の生存率を示す。提示したデータは、二つの独立した実験の平均である。

【図5-2】図５Ｃは、遺伝子導入の１日後および５日後のＣＤ３４^＋細胞におけるＧＦＰ発現を示す。提示したデータは、二つの独立した実験の平均である。

【図6-1】図６Ａは、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ Ｖ３５およびＡＡＶ ＧＦＰ発現ドナー修復鋳型を遺伝子導入した初代ＣＤ３４^＋細胞の生存率のフローサイトメトリープロットを示す。 図６Ｂは、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ Ｖ３５およびＡＡＶ ＧＦＰ発現ドナー修復鋳型を遺伝子導入したＧＦＰ発現初代ＣＤ３４^＋細胞のフローサイトメトリープロットを示す。

【図6-2】図６Ｃは、遺伝子導入の１日後および５日後のＣＤ３４^＋細胞の生存率を示す。示したデータは、標準誤差を有する健康な対照男性ドナー二名からの四つの独立した実験の平均である。 図６Ｄは、遺伝子導入の１日後および５日後のＣＤ３４^＋細胞におけるＧＦＰ発現を示す。ＧＦＰ陰性（非ＨＤＲ）細胞のＮＨＥＪ率を、ＣＲＩＳＰＲ編集推論（ＩＣＥ）解析によって示し、処置条件の下に列挙した。示したデータは、標準誤差を有する健康な対照男性ドナー二名からの四つの独立した実験の平均である。

【図6-3】図６Ｅは、フローサイトメーターにおいてＧＦＰ発現によって測定したＨＤＲ率と比較した、デジタル液滴ＰＣＲによって測定したＨＤＲ率を示す。示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した試料からのＧＦＰおよびｄｄＰＣＲによって測定したＨＤＲの平均比である。 図６Ｆは、ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡとｒＡＡＶ６ドナーの両方で処理した試料において計算した、ＮＨＥＪ率に対するＨＤＲ率の比を示す。

【図6-4】

【図7-1】図７Ａは、同じ細胞モデルにおける代替のデザイナーヌクレアーゼの活性の直接比較を可能にする、合わせたＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ（ＭＴ）、ＷＡＳ ＴＡＬＥＮ（ＴＡ；配列番号４１）およびＷＡＳ ｇＲＮＡ（ＲＮＰ；配列番号４２）認識部位を含有するＴＬＲレポーター細胞株において使用したＨＤＲストラテジーの模式図を示す。 図７Ｂは、遺伝子導入（ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ Ｖ３５ ｍＲＮＡ、ＷＡＳ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡまたはＴｒｅｘ２を有するか、もしくは有さないＷＡＳ ＲＮＰ）の４日後のレポーター細胞の生存率を示す。提示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した実験の平均である。 図７Ｃは、遺伝子導入（ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ Ｖ３５ ｍＲＮＡ、ＷＡＳ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡまたはＴｒｅｘ２を有するか、もしくは有さないＷＡＳ ＲＮＰ）の４日後のレポーター細胞のＮＨＥＪ率（ＣＲＩＳＰＲ編集推論（ＩＣＥ）解析によって示す）を示す。提示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した実験の平均である。

【図7-2】図７Ｄは、酵素（ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ Ｖ３５ ｍＲＮＡ、ＷＡＳ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡまたはＷＡＳ ＲＮＰ）とｒＡＡＶ６ドナーの両方で処置した４日目でのレポーター細胞におけるＧＦＰ発現を示す。提示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した実験の平均である。 図７Ｅは、酵素（ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬＶ３５ ｍＲＮＡ、ＷＡＳ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡまたはＷＡＳ ＲＮＰ）とｒＡＡＶ６ドナーの両方で処理した試料において計算した、ＮＨＥＪ率（ＩＣＥ解析によって測定した）に対するＨＤＲ率（ＧＦＰ発現によって測定した）の相対比を比較する。提示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した実験の平均である。 図７Ｆは、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ Ｖ３５およびｒＡＡＶ６ドナーまたはＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ Ｖ３５、Ｔｒｅｘ２（ＴＸ２）およびｒＡＡＶ６ドナーで処理したレポーター細胞におけるＧＦＰ発現を示す。提示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した実験の平均である。

【発明を実施するための形態】

【0105】

配列識別子の簡単な説明
配列番号１は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥのアミノ酸配列である。
配列番号３は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥの生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号４は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥの生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号５は、野生型Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥの生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号６～１２は、ヒトＷＡＳ遺伝子における標的部位に結合し、切断するようリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
配列番号１３～１９は、ヒトＷＡＳ遺伝子における標的部位に結合し、切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
配列番号２０～２６は、ヒトＷＡＳ遺伝子における標的部位に結合し、切断するｍｅｇａＴＡＬ－ＴＲＥＸ２融合物のアミノ酸配列である。
配列番号２７は、ヒトＷＡＳ遺伝子のイントロン２におけるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアント標的部位である。
配列番号２８は、ヒトＷＡＳ遺伝子のイントロン２におけるＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン標的部位である。
配列番号２９は、ヒトＷＡＳ遺伝子のイントロン２におけるｍｅｇａＴＡＬ標的部位である。
配列番号３０～３６は、ヒトＷＡＳ遺伝子のイントロン２における標的部位を切断するｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号３７は、ＴＲＥＸ２タンパク質をコードするｍＲＮＡ配列である。
配列番号３８は、ＴＲＥＸ２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、典型的なＡＡＶドナー修復鋳型のポリヌクレオチド配列である。
配列番号４０は、ヒトウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４１は、ヒトＷＡＳ遺伝子のイントロン２におけるＷＡＳ ＴＡＬＥＮ標的部位である。
配列番号４２は、ヒトＷＡＳ遺伝子のエクソン１におけるＷＡＳ ＲＮＰ ｇＲＮＡ標的部位である。
配列番号４３は、典型的なＡＡＶドナー修復鋳型のポリヌクレオチド配列である。
配列番号４４は、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ ＴＡＬＥＮおよびＷＡＳ ＲＮＰ 標的部位と合わせた典型的なレポーターベクターのポリヌクレオチド配列である。
配列番号４５は、コドン最適化ＷＡＳ ｃＤＮＡ配列を有する典型的なＡＡＶドナー修復鋳型のポリヌクレオチド配列である。
配列番号４６は、野生型ＷＡＳ ｃＤＮＡ配列を有する典型的なＡＡＶドナー修復鋳型のポリヌクレオチド配列である。
配列番号４７は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン標的部位を有するｍｅｇａＴＡＬ認識部位である。
前述の配列において、Ｘは、存在するなら、任意のアミノ酸またはアミノ酸の不存在を指す。

【0106】

Ａ．概要
本開示は、一般的に、一部、改善されたゲノム編集組成物およびその使用方法に関する。いかなる特定の理論によって束縛されるものではないが、本明細書において企図されるゲノム編集組成物を使用して、細胞におけるウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）タンパク質の量を増大させて、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、もしくはＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）、またはそれと関連する状態を含むが、これらに限定されない、ＷＡＳと関連する症状を治療する、予防する、または改善する。したがって、本明細書において企図される組成物は、ＷＡＳ遺伝子における欠損によって引き起こされる疾患、障害、および状態を有する対象に、可能性のある治癒的な解決を提供する。いかなる特定の理論によって束縛されるものではないが、ＷＡＳ、ＸＬＴ、ＸＬＮ、免疫系障害、血小板減少症、または湿疹を導く１個または複数の変異および／または欠失を有するＷＡＳ遺伝子に、機能的ＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）をコードするポリヌクレオチドを導入する遺伝子編集アプローチが、ＷＡＳｐによって引き起こされる免疫学的および機能的欠損を救出し、可能性のある治癒的療法をもたらすことが企図される。

【0107】

様々な実施形態では、ＷＡＳｐ機能を増大させるか、または回復させるための、ゲノム編集ストラテジー、組成物、遺伝子改変された細胞、例えば、造血幹細胞もしくは前駆細胞、または免疫エフェクター細胞、およびその使用方法が、企図される。いかなる特定の理論によって束縛されるものではないが、ＷＡＳｐの機能的コピーをコードするポリヌクレオチドを導入するための、ＷＡＳ遺伝子のゲノム編集が、企図される。一実施形態では、ＷＡＳ遺伝子の編集は、それが、造血幹細胞または前駆細胞（ＨＳＰＣ）において内因性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にあるように、ＷＡＳｐの機能的コピーをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。ＨＳＰＣの子孫における機能的ＷＡＳｐ産生の回復は、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、ＸＬＴ、ＸＬＮ、またはそれと関連する状態を有する対象と関連する一つまたは複数の症状を有効に治療する、予防する、および／または改善する。一実施形態では、ＷＡＳ遺伝子の編集は、それが、免疫エフェクター細胞において内因性プロモーターおよびエンハンサーの制御下にあるように、ＷＡＳｐの機能的コピーをコードするポリヌクレオチドを導入することを含む。免疫エフェクター細胞の子孫における機能的ＷＡＳｐ産生の回復は、免疫系障害を有する対象と関連する一つまたは複数の症状を有効に治療する、予防する、および／または改善する。

【0108】

様々な実施形態で企図されるゲノム編集方法は、ＷＡＳ遺伝子における転写因子結合部位に結合し、切断するよう設計されたヌクレアーゼバリアントを含む。特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントを使用して、標的ポリヌクレオチド配列において二本鎖切断を導入し、ポリヌクレオチド鋳型、例えば、ドナー修復鋳型の存在下で、相同組み換え修復（ＨＤＲ）、すなわち、ＷＡＳ遺伝子へのドナー修復鋳型の相同組み換えをもたらし得る。ある特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントはまた、細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構またはドナー修復鋳型の存在下での相同組み換えを使用して修復され得る一本鎖ＤＮＡ切断を生じる、ニッカーゼとして設計することができる。相同組み換えは、二本鎖ＤＮＡ切断を修復するための鋳型として相同なＤＮＡを必要とし、標的部位に隣接する領域に対する相同性を生じる配列が、両側で隣接する標的部位での、治療遺伝子、例えば、ＷＡＳをコードする発現カセットまたはポリヌクレオチドを含むドナーＤＮＡの導入によって特定される無限の多様な改変を生じるよう活用することができる。

【0109】

一つの好ましい実施形態では、本明細書において企図されるゲノム編集組成物は、ヒトＷＡＳ遺伝子を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬを含む。

【0110】

ＤＮＡ切断が、ＷＡＳ遺伝子の第二のイントロンおよびＷＡＳｐの機能的コピーをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復鋳型、すなわち、ドナー修復鋳型において生成される、様々な実施形態では、ＤＳＢは、ＤＮＡ切断部位での相同組み換えによって、鋳型の配列を用いて修復される。好ましい実施形態では、修復鋳型は、ポリヌクレオチドおよびＷＡＳｐの発現が、内因性ＷＡＳプロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下にある部位において挿入されるよう設計されたＷＡＳｐの機能的コピーをコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0111】

一つの好ましい実施形態では、本明細書において企図されるゲノム編集組成物は、ＨＤＲ効率を増大させるためのヌクレアーゼバリアントおよび１個または複数のエンドプロセッシング酵素を含む。

【0112】

一つの好ましい実施形態では、本明細書において企図されるゲノム編集組成物は、ヒトＷＡＳ遺伝子を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、機能的ＷＡＳｐをコードするドナー修復鋳型、およびエンドプロセッシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２を含む。

【0113】

様々な実施形態では、ゲノム編集された細胞が、企図される。ゲノム編集された細胞は、機能的ＷＡＳｐを含み、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、ＸＬＴ、ＸＬＮ、またはそれと関連する状態を含むが、これらに限定されない、ＷＡＳの少なくとも一つの症状を治療する、予防するか、または改善する。

【0114】

したがって、本明細書において企図される方法および組成物は、ＷＡＳおよびそれと関連する状態の治療のための既存の遺伝子編集ストラテジーと比較して、飛躍的な改善を表す。

【0115】

組み換え（すなわち、操作された）ＤＮＡ、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成技術、免疫アッセイ、組織培養、形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）、酵素反応、精製ならびに関連する技術および方法は、本明細書を通して引用され、考察される、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学および免疫学における様々な一般的かつより具体的な参考文献に記載される通り、一般的に行われ得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ ＵＳＡ，１９８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ ２００１ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ）；Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｊｕｌｉｅ Ｌｏｇａｎ，Ｋｉｒｓｔｉｎ Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｎｉｃｋ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００９，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｇｕｔｈｒｉｅ ａｎｄ Ｆｉｎｋ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，Ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｊａｎｉｔｚ，２００８ Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｐａｒｋ，Ｅｄ．，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１０ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄＣＣ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｏｉｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの雑誌における研究論文を参照のこと。

【0116】

Ｂ．定義
本開示をより詳細に記載する前に、本明細書において使用される特定の用語の定義を提供することは、その理解に有用であり得る。

【0117】

別途定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または均等な任意の方法および材料を、特定の実施形態の実施または試験において使用することができるが、組成物、方法および物質の好ましい実施形態が、本明細書において記載される。本開示の目的のために、以下の用語が以下に定義される。追加の定義は、本開示全体を通じて記載される。

【0118】

冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、冠詞の文法的対象の一つ～一つより多く（すなわち、～少なくとも一つ、または～一つより多く）を指すために使用される。例として、「構成要素」は、一つの構成要素または一つ以上の構成要素を意味する。

【0119】

二者択一（例えば、「または」）の使用は、二者択一の一方、両方、またはその任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。

【0120】

用語「および／または」は、二者択一の一方または両方を意味すると理解されるべきである。

【0121】

本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％と同等に変動する数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、用語「約」または「およそ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの約±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。

【0122】

一実施形態では、範囲、例えば、１～５、約１～５、または約１～約５は、範囲によって包含されるそれぞれの数値を指す。例えば、一つの非限定的かつ単に例示的な実施形態では、範囲「１～５」は、表現１、２、３、４、５；または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０；または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０と均等である。

【0123】

本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上である数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、「実質的に同じ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さとほぼ同じである、効果、例えば、生理学的効果を生じる参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを意味する。

【0124】

本明細書全体を通して、文脈が別段必要としない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、指定された工程もしくは構成要素または工程もしくは構成要素の群を含むことを暗示するが、任意の他の工程もしくは構成要素または工程もしくは構成要素の群の排除を暗示するものではないことは理解される。「からなる」とは、「からなる」という語句に続くものを含み、かつそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された構成要素が、必要とされるか、または必須であること、および他の構成要素が存在し得ないことを示す。「本質的にからなる」とは、語句の後に列挙される任意の構成要素を含むこと、および列挙される要素について本開示において特定される活性または作用と干渉しないか、または関与しない他の構成要素に限定されることを意味する。したがって、「本質的にからなる」という語句は、列挙される構成要素が要求されるか、または必須であるが、列挙される構成要素の活性または作用に実質的に影響を与える他の構成要素が存在しないことを示す。

【0125】

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」またはその組み合わせは、実施形態と関連して記載される特定の特性、構造または特徴が、少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な場所における前述の語句の出現は、必ずしも、すべて同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、特定の特性、構造、または特徴は、一つまたは複数の実施形態において任意の適切な様式で組み合わせられてもよい。また、一つの実施形態における特性の正の列挙は、特定の実施形態における特性を除外するための基礎としての役割を果たすことも理解される。

【0126】

用語「エクスビボ」は、一般的に、生物の外部の人工環境で、好ましくは、最小限の変化の天然の状態で、生きた組織内または上で行われる実験または測定などの、生物の外部で怒る活動を指す。特定の実施形態では、「エクスビボ」の手法は、生物から採取され、実験室装置において、通常、滅菌条件下で、典型的には、数時間または最大約２４時間、ただし状況に応じて最大４８時間または７２時間を含む時間培養されるか、または調節される生きた細胞または組織を含む。ある特定の実施形態では、このような組織または細胞は、収集され、凍結され、その後、エクスビボ処理のため解凍され得る。生きた細胞または組織を使用して数日より長い間続く組織培養実験または手法は、典型的には、「インビトロ」であるとみなされるが、ある特定の実施形態では、この用語は、エクスビボと互換的に使用され得る。

【0127】

用語「インビボ」は、一般的に、生物内で起こる活動を指す。一実施形態では、細胞ゲノムは、インビボで操作され、編集され、または改変される。

【0128】

「増強する」または「促進する」または「増大させる」または「拡大する」または「強める」は、一般的に、ビークルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より大きな応答（すなわち、生理学的応答）を生じる、誘発する、または引き起こす、本明細書において企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。測定可能な応答は、とりわけ、当技術分野における見解および本明細書の記載から明らかなＨＤＲおよび／またはＷＡＳＰ発現の増大を含み得る。「増大した」または「増強した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビークルまたは対照によって産生される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０回以上（例えば、５００、１０００回）（例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など１を超えるすべての整数および小数点を含む）である増大を含み得る。

【0129】

「減少する」または「低下する」または「少なくする」または「低減する」または「弱める」または「切除する」または「阻害する」または「そぐ」は、一般的に、ビークルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より小さな応答（すなわち、生理学的応答）を生じる、誘発する、または引き起こす、本明細書において企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の能力を指す。測定可能な応答は、ＷＡＳまたはそれと関連する状態、例えば、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、ＸＬＴ、もしくはＸＬＮと関連する一つまたは複数の症状における減少を含み得る。「減少」または「低減した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビークルまたは対照によって産生される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０回以上（例えば、５００、１０００回）（例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など１を超えるすべての整数および小数点を含む）である減少を含み得る。

【0130】

「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」とは、一般的に、ビークルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、本明細書において企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、実質的に類似または同等の生理学的応答（すなわち、下流の効果）を生じる、誘発する、または引き起こす能力を指す。同等の応答は、参照の応答と有意に異なっていないか、または測定可能なほど異なっていないものである。

【0131】

本明細書において使用される場合、「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的な結合」または「特異的に標的化する」という用語は、バックグラウンド結合よりも高い結合親和性での、一方の分子の別の分子への結合、例えば、ＤＮＡへのポリペプチド結合のＤＮＡ結合ドメインを記載する。結合ドメインは、例えば、約１０^５Ｍ^－１以上の親和性またはＫ_ａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的部位に結合するか、または標的部位と会合する場合、それは、標的部位に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、約１０^６Ｍ^－１、１０^７Ｍ^－１、１０^８Ｍ^－１、１０^９Ｍ^－１、１０^１０Ｍ^－１、１０^１１Ｍ^－１、１０^１２Ｍ^－１、または１０^１３Ｍ^－１．以上のＫ_ａで標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１、少なくとも１０^１２Ｍ^－１、少なくとも１０^１３Ｍ^－１以上のＫ_ａを有する結合ドメインを指す。

【0132】

あるいは、親和性は、Ｍの単位（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ、またはそれ未満）での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）として定義されてもよい。特定の実施形態で企図されるＤＮＡ標的部位に対する一つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼバリアントの親和性は、従来技術、例えば、酵母細胞表面提示、または結合会合、もしくは標識されたリガンドを使用した置換アッセイを使用して容易に決定することができる。

【0133】

一実施形態では、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合の約２倍、バックグラウンド結合の約５倍、バックグラウンド結合の約１０倍、バックグラウンド結合の約２０倍、バックグラウンド結合の約５０倍、バックグラウンド結合の約１００倍、またはバックグラウンド結合の約１０００倍以上大きい。

【0134】

用語「選択的に結合する」または「選択的に結合した」または「選択的に結合している」または「選択的に標的化する」は、複数のオフターゲット分子の存在下で標的分子への一つの分子の優先的結合（オンターゲット結合）を記載する。特定の実施形態では、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬが、オフターゲットＤＮＡ標的結合部位に結合するよりも、約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、または１０００倍以上頻繁に、オンターゲットＤＮＡ結合部位に選択的に結合する。

【0135】

「オンターゲット」は、標的部位配列を指す。

【0136】

「オフターゲット」は、標的部位配列と類似するが、同一ではない配列を指す。

【0137】

「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が、結合および／または切断する核酸の部分を定義する染色体または染色体外核酸配列であり、ただし、結合および／または切断に十分な条件が存在する。標的部位または標的配列の一つの鎖のみを参照するポリヌクレオチド配列または配列番号に言及するとき、ヌクレアーゼバリアントによって結合され、および／または切断される標的部位または標的配列が、二本鎖であり、参照配列およびその相補配列を含むことは、理解される。好ましい実施形態では、標的部位は、ヒトＷＡＳ遺伝子における配列である。

【0138】

「組み換え」は、相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組み換えによるドナー捕獲を含むが、これらに限定されない、二つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報の交換プロセスを指す。本開示の目的のため、「相同組み換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組み換え修復（ＨＤＲ）機構を介した細胞における二本鎖切断の修復の間に起こる、このような交換の特定の形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子を鋳型として使用して、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）を修復し、それは、ドナーから標的への遺伝子情報の伝達を導くので、「非クロスオーバー遺伝子変換」または「狭い区域の遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる特定の理論によって束縛されるものではないが、このような伝達は、破壊された標的とドナーの間で形成するヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／またはドナーが、標的の部分となる遺伝子情報を再合成するために使用される「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを含み得る。このような特定のＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが、標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の変化をもたらす。

【0139】

「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、これらに限定されない、様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能である。二本鎖切断は、二つの別個の一本鎖切断現象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態では、本明細書において企図される、ポリペプチドおよびヌクレアーゼバリアント、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬなどが、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のため使用される。エンドヌクレアーゼ切断認識部位は、いずれかのＤＮＡ鎖上にあり得る。

【0140】

「外因性」分子は、細胞に通常存在しないが、一つまたは複数の遺伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞に導入される分子である。例示的な外因性分子としては、小有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記分子の任意の改変された誘導体、または上記分子の一つまたは複数を含む任意の複合体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞への外因性分子の導入方法は、当業者に公知であり、脂質介在性伝達（すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含む、リポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン介在性伝達、およびウイルスベクター介在性伝達が挙げられるが、これらに限定されない。

【0141】

「内因性」分子は、特定の環境条件下で、特定の発生段階において、特定の細胞に通常存在する分子である。追加の内因性分子には、タンパク質が含まれ得る。

【0142】

「遺伝子」は、このような制御配列が、コード配列および／または転写された配列に隣接しているかどうかにかかわらず、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域を指す。遺伝子には、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答エレメント、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳制御配列、複製開始点、基質付着部位、ならびに座位調節領域が挙げられるが、これらに限定されない。

【0143】

「遺伝子発現」とは、遺伝子に含有される情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡもしくは任意の他のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質の直接転写産物であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって改変されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって改変されるタンパク質を含む。

【0144】

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」は、細胞中の総遺伝物質へのＤＮＡまたはＲＮＡの形態の余分な遺伝物質の染色体または染色体外付加を指す。遺伝子改変は、細胞のゲノム中の特定の部位を標的としても、または標的としなくてもよい。一実施形態では、遺伝子改変は、部位特異的である。一実施形態では、遺伝子改変は、部位特異的でない。

【0145】

本明細書で使用される場合、用語「ゲノム編集」は、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復させる、修正する、破壊する、および／または改変する、細胞のゲノムにおける標的部位での遺伝物質の置換、欠失、および／または導入を指す。特定の実施形態で企図されるゲノム編集は、一つまたは複数のヌクレアーゼバリアントを細胞内に導入して、好ましくは、ドナー修復鋳型の存在下で、細胞のゲノムにおける標的部位で、または標的部位の近位でＤＮＡ損傷を生じることを含む。

【0146】

本明細書で使用される場合、用語「遺伝子療法」は、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復させる、修正する、もしくは改変する、または治療ポリペプチドを発現させる目的のための、細胞における総遺伝物質への余分な遺伝物質の導入を指す。特定の実施形態では、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復させる、修正する、破壊する、もしくは改変する、または治療ポリペプチドを発現させる目的のための、ゲノム編集による細胞ゲノムへの遺伝物質の導入は、遺伝子療法とみなされる。

【0147】

Ｃ．ヌクレアーゼバリアント
ＷＡＳ遺伝子における標的部位をゲノム編集するのに適している、本明細書における特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、一つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインおよび一つまたは複数のＤＮＡ切断ドメイン（例えば、一つまたは複数のエンドヌクレアーゼドメインおよび／またはエキソヌクレアーゼドメイン）、ならびに任意選択的に、本明細書に企図される一つまたは複数のリンカーを含む。用語「リプログラミングされたヌクレアーゼ」、「操作されたヌクレアーゼ」、または「ヌクレアーゼバリアント」は、互換的に使用され、一つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインおよび一つまたは複数のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、ヌクレアーゼは、ＷＡＳ遺伝子における二本鎖ＤＮＡ標的配列、好ましくは、ヒトＷＡＳ遺伝子の第二のイントロンにおける標的配列、より好ましくは、配列番号２７に記載されるヒトＷＡＳ遺伝子の第二のイントロンにおける標的配列に結合し、切断するように親または天然に存在するヌクレアーゼから設計され、および／または改変されている。ヌクレアーゼバリアントは、天然に存在するヌクレアーゼから、または以前のヌクレアーゼバリアントから設計され、および／または改変されてもよい。特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、一つまたは複数の追加の機能的ドメイン、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すエンドプロセッシング酵素のエンドプロセッシング酵素ドメインをさらに含んでもよい。

【0148】

ＷＡＳ遺伝子における標的配列に結合し、切断するヌクレアーゼバリアントの例には、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント（メガヌクレアーゼバリアント）およびｍｅｇａＴＡＬが挙げられるが、これらに限定されない。

【0149】

１．ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアント
様々な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、ＷＡＳ遺伝子における二本鎖切断（ＤＳＢ）を、好ましくは、ヒトＷＡＳ遺伝子の第二のイントロンにおける標的配列、より好ましくは、配列番号２７に記載されるヒトＷＡＳ遺伝子の第二のイントロンにおける標的配列を導入するようにリプログラミングされている。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は、互換的に使用され、１２～４５塩基対の切断部位を認識する天然に存在するヌクレアーゼを指し、一般に、配列ならびに構造モチーフ：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓ ｂｏｘ、およびＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫに基づき、五つのファミリーにグループ化される。

【0150】

「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「参照メガヌクレアーゼ」は、野生型ホーミングエンドヌクレアーゼまたは天然で見られるホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態では、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、基礎活性を増大させるよう改変されている野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。

【0151】

「操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「リプログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント」、「操作されたメガヌクレアーゼ」、「リプログラミングされたメガヌクレアーゼ」、または「メガヌクレアーゼバリアント」は、一つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインおよび一つまたは複数のＤＮＡ切断ドメインを含むホーミングエンドヌクレアーゼを指し、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＷＡＳ遺伝子におけるＤＮＡ標的配列に結合し、切断するように、親または天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼから設計され、および／または改変されている。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼから、または別のホーミングエンドヌクレアーゼバリアントから、設計され、および／または改変されてもよい。特定の実施形態で企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、一つまたは複数の追加の機能的ドメイン、例えば、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すエンドプロセッシング酵素のエンドプロセッシング酵素ドメインをさらに含んでもよい。

【0152】

ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントは、天然で存在せず、組み換えＤＮＡテクノロジーによって、またはランダム変異誘発によって得ることができる。ＨＥバリアントは、天然に存在するＨＥまたはＨＥバリアントにおいて、１個または複数のアミノ酸変更を行うこと、例えば、一つまたは複数のアミノ酸を変異誘発すること、置換させること、付加すること、または欠損させることによって得られ得る。特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識境界面に対する１個または複数のアミノ酸変更を含む。

【0153】

特定の実施形態で企図されるＨＥバリアントは、一つまたは複数のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼもしくは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すエンドプロセッシング酵素のエンドプロセッシング酵素ドメインをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、ＨＥバリアントは、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すエンドプロセッシング酵素を用いて、ＨＳＰＣ細胞または免疫エフェクター細胞に導入される。ＨＥバリアントおよび３’プロセッシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、あるいは例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離されるポリシストロニックコンストラクトにおいて、一緒に導入されてもよい。

【0154】

「ＤＮＡ認識境界面」は、核酸標的塩基と相互作用するＨＥアミノ酸残基ならびに隣接するその残基を指す。それぞれのＨＥについて、ＤＮＡ認識境界面は、側鎖と側鎖および側鎖とＤＮＡコンストラクトの広範なネットワークを含み、そのほとんどは、特定の核酸配列配列を認識するため必然的に固有である。したがって、特定の核酸配列に対応するＤＮＡ認識境界面のアミノ酸配列は、大きく変動し、任意の天然またはＨＥバリアントの特性である。非限定的な例として、特定の実施形態で企図されるＨＥバリアントは、天然のＨＥ（または以前に生成されたＨＥバリアント）のＤＮＡ認識境界面に局在化した一つまたは複数のアミノ酸残基が変動する、ＨＥバリアントのライブラリーを構築することによって誘導されてもよい。ライブラリーは、切断アッセイを使用して、それぞれ予測されるＷＡＳ標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングされてもよい（例えば、Ｊａｒｊｏｕｒ ｅｔ ａｌ．、２００９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（２０）：６８７１－６８８０を参照のこと）。

【0155】

ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、ホーミングエンドヌクレアーゼの最もよく研究されたファミリーであり、主に、古細菌において、ならびに緑藻類および真菌類における細胞小器官ＤＮＡにおいてコードされ、最も高い全体的なＤＮＡ認識特異性を示す。ＬＨＥは、タンパク質鎖当たり一つまたは二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ触媒モチーフを含み、それぞれ、ホモダイマーまたは単鎖モノマーとして機能する。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質の構造研究により、αββαββαにより特徴付けられ、このフォールドの第一のヘリックスに属するＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを伴う、高度に保存されたコア構造が同定された（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）。ＬＨＥの非常に効率的かつ特異的な切断は、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼをもたらすためのタンパク質スキャフォールドを表す。しかしながら、非天然または非基準の標的部位に結合し、切断するためのＬＨＥの操作は、標的部位における塩基対位置の最大三分の二で、そのＤＮＡ接触点および切断特異性を変更するための、適当なＬＨＥスキャフォールドの選択、標的遺伝子座の調査、推定標的部位の選択、およびＬＨＥの広範な変更を必要とする。

【0156】

一実施形態では、リプログラミングされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントが設計され得るＬＨＥとしては、Ｉ－ＣｒｅＩおよびＩ－ＳｃｅＩが挙げられるが、これらに限定されない。

【0157】

リプログラミングされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントが設計され得るＬＨＥの例としては、Ｉ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、およびＩ－Ｖｄｉ１４１Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。

【0158】

一実施形態では、リプログラミングされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＣｐａＭＩバリアント、Ｉ－ＨｊｅＭＩバリアント、Ｉ－ＯｎｕＩバリアント、Ｉ－ＰａｎＭＩバリアント、およびＩ－ＳｍａＭＩバリアントからなる群から選択される。

【0159】

一実施形態では、リプログラミングされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントである。例えば、配列番号６～１２を参照のこと。

【0160】

一実施形態では、ＷＡＳ遺伝子を標的化するリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥまたはＩ－ＯｎｕＩバリアントは、天然のＩ－ＯｎｕＩまたはその生物学的に活性なフラグメント（配列番号１～５）から生成された。好ましい実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子を標的化するリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥまたはＩ－ＯｎｕＩバリアントは、既存のＩ－ＯｎｕＩバリアントから生成された。一実施形態では、リプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、配列番号２７に記載されるヒトＷＡＳ遺伝子標的部位に対して生成された。

【0161】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥまたはＩ－ＯｎｕＩバリアントは、ＤＮＡ認識境界面において１個または複数のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子を結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｉ－ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１ Ａｕｇ ９；１０８（３２）：１３０７７－１３０８２）もしくは配列番号６～１２に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアント、またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識境界面と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。

【0162】

一実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子を結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｉ－ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１ Ａｕｇ ９；１０８（３２）：１３０７７－１３０８２）もしくは配列番号６～１２に記載されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアント、またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識境界面と少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、より好ましくは、少なくとも９９％の配列同一性を含む。

【0163】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号１～１２のいずれか一つに記載されるＩ－ＯｎｕＩ、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識境界面における１個または複数のアミノ酸置換または改変を含む。

【0164】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）、配列番号６～１２に記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識境界面、特に、位置２４～５０、６８～８２、１８０～２０３および２２３～２４０に位置するサブドメインにおいて１個または複数のアミノ酸置換または改変を含む。

【0165】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２に記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置でのＤＮＡ認識境界面において１個または複数のアミノ酸置換または改変を含む。

【0166】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２に記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置において１個または複数のアミノ酸置換または改変を含む。

【0167】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２に記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントのＤＮＡ認識境界面、特に、位置２４～５０、６８～８２、１８０～２０３および２２３～２４０に位置するサブドメインにおいて５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個以上のアミノ酸置換または改変を含む。

【0168】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２に記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置でのＤＮＡ認識境界面において５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個以上のアミノ酸置換または改変を含む。

【0169】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２に記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７８、８０、８２、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置において５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個以上のアミノ酸置換または改変を含む。

【0170】

一実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ配列全体におけるすべてに位置する追加の位置において１個または複数のアミノ酸置換または修飾を含む。置換され、および／または修飾され得る残基は、核酸標的と接触するか、または核酸骨格と、またはヌクレオチド塩基と、直接または水分子を介して相互作用するアミノ酸を含むが、これらに限定されない。

【0171】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断する本明細書において企図されるＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２に記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの位置：２４、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７５、７６、７８、８０、８２、１０８、１１６、１３５、１３８、１４３、１５５、１５６、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、２０１、２０３、２０７、２０９、２２５、２２８、２３１、２３２、２３３、２３８、２４７、２５４、および２９１からなる位置群から選択される少なくとも一つの位置において１個または複数の置換および／または修飾、好ましくは、少なくとも５個、好ましくは、少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２０個、より好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３０個、なおより好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個を含む。

【0172】

さらなる実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）、もしくは配列番号６～１２に記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｓ２４Ｆ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３５Ｖ、Ｓ３６Ｉ、Ｓ３６Ｖ、Ｓ３６Ｎ、Ｖ３７Ａ、Ｖ３７Ｉ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｅ４２Ｇ、Ｇ４４Ｅ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｋ、Ｑ４６Ｇ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｓ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｆ１６８Ｈ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｎ１８４Ｆ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２０９Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｋ２２５Ｑ、Ｎ２２８Ｉ、Ｅ２３１Ｇ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｅ、Ｄ２４７Ｎ、Ｑ２５４ＲおよびＫ２９１Ｒの少なくとも５個、少なくとも１５個、好ましくは、少なくとも２５個、より好ましくは、少なくとも３５個、またはなおより好ましくは、少なくとも４０個以上を含む。

【0173】

ある特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、およびＱ２５４Ｒを含む。

【0174】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｅ、およびＱ２５４Ｒを含む。

【0175】

一部の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｖ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｔ８２Ｓ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｑ、Ｅ２３１Ｇ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、およびＶ２３８Ｒを含む。

【0176】

ある特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｆ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｖ、Ｓ３６Ｎ、Ｖ３７Ｉ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｇ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２０９Ｒ、Ｋ２２５Ｑ、Ｆ２３２Ｓ、Ｖ２３８Ｒ、およびＱ２５４Ｒを含む。

【0177】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｋ１５６Ｉ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｈ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｑ２５４ＲおよびＫ２９１Ｒを含む。

【0178】

さらなる実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｙ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｆ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｅ、およびＱ２５４Ｒを含む。

【0179】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、Ｉ－ＯｎｕＩ（配列番号１～５）もしくは配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるＩ－ＯｎｕＩバリアント、その生物学的に活性なフラグメント、および／またはそのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｓ２４Ｔ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｒ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｉ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｒ、Ｓ４０Ｅ、Ｅ４２Ｇ、Ｇ４４Ｅ、Ｑ４６Ｋ、Ｔ４８Ｓ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｎ、Ｎ７５Ｒ、Ａ７６Ｙ、Ｓ７８Ｔ、Ｋ８０Ｒ、Ｋ１０８Ｍ、Ｖ１１６Ｌ、Ｋ１３５Ｒ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５５Ｇ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｈ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｉ、Ｉ１８６Ｎ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｔ、Ｋ１９１Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｈ、Ｑ１９５Ｔ、Ｑ１９７Ｒ、Ｓ２０１Ｇ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｋ２２５Ｌ、Ｎ２２８Ｉ、Ｆ２３２Ｓ、Ｓ２３３Ｒ、Ｖ２３８Ｒ、Ｄ２４７Ｎ、およびＱ２５４Ｒを含む。

【0180】

特定の実施形態では、ヒトＷＡＳ遺伝子に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントに対して少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、またはなおより好ましくは、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0181】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0182】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号６に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0183】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号７に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0184】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号８に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0185】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号９に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0186】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0187】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号１１に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0188】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む。

【0189】

特定の実施形態では、配列番号２７に記載されるヌクレオチド配列に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントは、配列番号６～１２のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む。

【0190】

２．ＭｅｇａＴＡＬ
様々な実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むｍｅｇａＴＡＬは、ＷＡＳ遺伝子、好ましくはヒトＷＡＳ遺伝子の第二のイントロン中の標的配列、より好ましくは配列番号２９に記載されるヒトＷＡＳ遺伝子の第二のイントロン中の標的配列、二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するように再プログラムされる。「ｍｅｇａＴＡＬ」は、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよびＷＡＳ遺伝子におけるＤＮＡ標的配列に結合し、切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むポリペプチドを指し、任意選択で、一つまたは複数のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すエンドプロセッシング酵素のエンドプロセッシング酵素ドメインを含む。

【0191】

特定の実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を示すエンドプロセッシング酵素と共に、細胞に導入することができる。ｍｅｇａＴＡＬおよび３’プロセッシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、あるいは例えば、融合タンパク質として、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離されるポリシストロニックコンストラクトにおいて、一緒に導入されてもよい。

【0192】

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」は、植物トランスクリプトームを操作するように植物転写活性化因子を模倣する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥまたはＴＡＬエフェクター）のＤＮＡ結合部分である（例えば、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．、２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８－６５１を参照のこと）。特定の実施形態で企図されるＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、新規に操作されるか、または天然に存在するＴＡＬＥ、例えば、キサントモナス・カンペストリス病原型ヴェシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｇａｒｄｎｅｒｉ（キサントモナス・ガルドネリ）、キサントモナス・トランスルセンス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）、キサントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、キサントモナス・ペルフォランス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｐｅｒｆｏｒａｎｓ）、キサントモナス・アルファルファ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｌｆａｌｆａ）、キサントモナス・シトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ）、キサントモナス・エウヴェシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）、およびキサントモナス・オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のＡｖｒＢｓ３ならびにラルストニア・ソラナセラム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）由来のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７から操作される。ＤＮＡ結合ドメインをもたらし、設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例は、米国特許第９，０１７，９６７号、およびそこで引用される参考文献において開示されており、それらのすべては、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。

【0193】

特定の実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、その対応する標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの結合に関与する、一つまたは複数の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。単一の「反復単位」（「反復」とも呼ばれる）は、典型的には、３３～３５アミノ酸長である。それぞれのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位は、典型的には、反復の１２位および／または１３位において、反復可変二残基（ＲＶＤ）を構成する１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識のための天然（基準）コードは、１２位および１３位のＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合を導き、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように、決定されている。ある特定の実施形態では、非基準（非定型）ＲＶＤが企図される。

【0194】

特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおける使用に適した非基準ＲＶＤの例としては、グアニン（Ｇ）の認識のためＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮ；アデニン（Ａ）の認識のためＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識のためＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧ；シトシン（Ｃ）の認識のためＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧ；ＡまたはＧの認識のためＮＶ、ＨＮ；およびＡまたはＴまたはＧまたはＣの認識のためＨ^＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ^＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ^＊（ここで、（^＊）は、１３位のアミノ酸が存在しないことを意味する）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態で企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおける使用に適したＲＶＤのさらなる例としては、米国特許第８，６１４，０９２号において開示されたものが挙げられ、それは、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。

【0195】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３～３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５～１５個の反復単位、より好ましくは、７～１５個の反復単位、より好ましくは、９～１５個の反復単位、より好ましくは、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。

【0196】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３～３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイおよびＴＡＬＥ反復単位のセットのＣ末端に位置する２０のアミノ酸を含む、追加の単一の切断ＴＡＬＥ反復単位、すなわち、追加のＣ末端半分のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位（本明細書において以下のどこかで開示されるＣキャップのアミノ酸－２０～－１）を含む。したがって、特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３．５～３０．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５．５～１５．５個の反復単位、より好ましくは、７．５～１５．５個の反復単位、より好ましくは、９．５～１５．５個の反復単位、より好ましくは、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、または１５．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。

【0197】

特定の実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチド、一つまたは複数の ＴＡＬＥ反復ドメイン／単位、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチド、およびホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むＴＡＬエフェクター構造を含む。一部の実施形態では、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ反復、および／またはＣＴＤドメインは、同じ種由来である。他の実施形態では、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ反復、および／またはＣＴＤドメインの一つまたは複数は、異なる種由来である。

【0198】

本明細書で使用される場合、用語「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドは、天然に存在するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分またはフラグメントに隣接する配列を指す。ＮＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位が、ＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってもよい。特定の実施形態では、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に少なくとも１２０～少なくとも１４０以上のアミノ酸を含む（０は、ほとんどのＮ末端反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態では、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に少なくとも約１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または少なくとも１４０のアミノ酸を含む。一実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、キサントモナスＴＡＬＥタンパク質の少なくとも約アミノ酸＋１から＋１２２～少なくとも約＋１から＋１３７のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、ほとんどのＮ末端反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態では、ＮＴＤポリペプチドは、キサントモナスＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に少なくとも約１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７のアミノ酸を含む。一実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ラルストニアＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸＋１～＋１２１のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、ほとんどのＮ末端反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態では、ＮＴＤポリペプチドは、ラルストニアＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端に少なくとも約１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７のアミノ酸を含む。

【0199】

本明細書で使用される場合、用語「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドは、天然に存在するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分またはフラグメントに隣接する配列を指す。ＣＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン反復単位が、ＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってもよい。特定の実施形態では、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最終の全反復のＣ末端に少なくとも２０～少なくとも８５以上のアミノ酸を含む（最初の２０のアミノ酸は、最終Ｃ末端全反復単位のＣ末端の半反復単位である）。特定の実施形態では、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最終全反復のＣ末端に少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または少なくとも８５のアミノ酸を含む。一実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、キサントモナスＴＡＬＥタンパク質の少なくとも約アミノ酸－２０～－１のＣＴＤポリペプチドを含む（－２０は、最終Ｃ末端全反復単位のＣ末端の半反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態では、ＣＴＤポリペプチドは、キサントモナスＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最終全反復のＣ末端に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１のアミノ酸を含む。一実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ラルストニアＴＡＬＥタンパク質の少なくとも約アミノ酸－２０～－１のＣＴＤポリペプチドを含む（－２０は、最終Ｃ末端全反復単位のＣ末端の半反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態では、ＣＴＤポリペプチドは、ラルストニアＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインの最終全反復のＣ末端に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１のアミノ酸を含む。

【0200】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、任意選択で、本明細書において他で企図される一つまたは複数のリンカーポリペプチドを用いて互いに結合された、標的配列に結合するよう操作されたＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、標的配列に結合し、切断するようリプログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼ、ならびに任意選択で、ＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む。いかなる特定の理論によって束縛されるものではないが、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン、ならびに任意選択で、ＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドを含むｍｅｇａＴＡＬが、リンカーポリペプチドに融合され、それが、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントにさらに融合されることが、企図される。したがって、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントのＤＮＡ結合ドメインによって結合された標的配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド離れているＤＮＡ標的配列に結合する。このように、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ゲノム編集の特異性および効率を増大させる。

【0201】

一実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよび約４、５、または６ヌクレオチド、好ましくは、リプログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼの結合部位の上流の６ヌクレオチド内であるヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。

【0202】

一実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびホーミングエンドヌクレアーゼバリアント（配列番号２７）によって結合され、切断されるヌクレオチド配列の上流６ヌクレオチドである、配列番号２８に記載されるヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを含む。好ましい実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬ標的配列は、配列番号２９である。

【0203】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、１個または複数のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合反復単位ならびにＩ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、Ｉ－Ｖｄｉ１４１Ｉおよびそのバリアント、または好ましくは、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩおよびそのバリアント、またはより好ましくは、Ｉ－ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥから設計されるか、またはリプログラミングされたＬＨＥバリアントを含む。

【0204】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤ、１個または複数のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合反復単位、ＣＴＤ、ならびにＩ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、Ｉ－Ｖｄｉ１４１Ｉおよびそのバリアント、または好ましくは、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩおよびそのバリアント、またはより好ましくは、Ｉ－ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥバリアントを含む。

【0205】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤ、約９．５～約１５．５個のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合反復単位、ならびにＩ－ＡａｂＭＩ、Ｉ－ＡａｅＭＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＡｐａＭＩ、Ｉ－ＣａｐＩＩＩ、Ｉ－ＣａｐＩＶ、Ｉ－ＣｋａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ－ＣｐａＭＩＶ、Ｉ－ＣｐａＭＶ、Ｉ－ＣｐａＶ、Ｉ－ＣｒａＭＩ、Ｉ－ＥｊｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｅＭＩ、Ｉ－ＧｐｉＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ－ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＬｔｒＩＩ、Ｉ－ＬｔｒＩ、Ｉ－ＬｔｒＷＩ、Ｉ－ＭｐｅＭＩ、Ｉ－ＭｖｅＭＩ、Ｉ－ＮｃｒＩＩ、Ｉ－Ｎｃｒｌ、Ｉ－ＮｃｒＭＩ、Ｉ－ＯｈｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ－ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ－ＰｎｏＭＩ、Ｉ－ＳｃｕＭＩ、Ｉ－ＳｍａＭＩ、Ｉ－ＳｓｃＭＩ、Ｉ－Ｖｄｉ１４１Ｉおよびそのバリアント、または好ましくは、Ｉ－ＣｐａＭＩ、Ｉ－ＨｊｅＭＩ、Ｉ－ＯｎｕＩ、Ｉ－ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩおよびそのバリアント、またはより好ましくは、Ｉ－ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥバリアントを含む。

【0206】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、約１２２のアミノ酸～１３７のアミノ酸のＮＴＤ、約９．５、約１０．５、約１１．５、約１２．５、約１３．５、約１４．５、または約１５．５個の結合反復単位、約２０のアミノ酸～約８５のアミノ酸のＣＴＤ、およびＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントを含む。特定の実施形態では、ＮＴＤ、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣＴＤのいずれか一つ、二つ、またはすべては、任意の適当な組み合わせで、同じ種または異なる種から設計することができる。

【0207】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号１３～１９のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む。

【0208】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬ－Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は、配列番号２０～２６のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む。

【0209】

ある特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号３０～３６のいずれか一つに記載されるｍＲＮＡ配列によってコードされる。

【0210】

ある特定の実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび配列番号２９に記載されるヌクレオチド配列を結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントを含む。

【0211】

特定の実施形態では、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインならびに配列番号１３～１９のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列を含む配列番号２９に記載されるヌクレオチド配列に結合し、切断するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントを含む。

【0212】

３．エンドプロセッシング酵素
特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセッシング酵素を使用した細胞ゲノムの編集を含む。特定の実施形態では、単一ポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断ペプチド配列、例えば、２Ａ配列によって、またはＩＲＥＳ配列によって分離される、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセッシング酵素をコードする。特定の実施形態では、ゲノム編集組成物は、ヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドおよびエンドプロセッシング酵素をコードする別個のポリヌクレオチドを含む。

【0213】

用語「エンドプロセッシング酵素」は、ポリヌクレオチド鎖の露出した末端を修飾する酵素を指す。ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖ハイブリッド、ならびに合成ＤＮＡ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ以外の塩基を含有する）であってもよい。エンドプロセッシング酵素は、一つまたは複数のヌクレオチドを付加すること、一つまたは複数のヌクレオチドを除去すること、リン酸基を除去するか、もしくは修飾することおよび／またはヒドロキシル基を除去するか、もしくは修飾することによって、露出したポリヌクレオチド鎖末端を修飾し得る。エンドプロセッシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位において、またはせん断（例えば、微細ゲージ針、加熱、超音波処理、ミニビーズタンブリング、および噴霧）、電離放射線、紫外線照射、酸素ラジカル、化学加水分解剤および化学療法剤などの、他の化学的または機械的種ダウンによって生成される末端において末端を修飾してもよい。

【0214】

特定の実施形態では、特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬおよびＤＮＡエンドプロセッシング酵素を使用した細胞ゲノムの編集を含む。

【0215】

用語「ＤＮＡエンドプロセッシング酵素」は、ＤＮＡの露出した末端を修飾する酵素を指す。ＤＮＡエンドプロセッシング酵素は、平滑末端または付着末端（５’もしくは３’オーバーハングを有する末端）を修飾してもよい。ＤＮＡエンドプロセッシング酵素は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを修飾してもよい。ＤＮＡエンドプロセッシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位において、またはせん断（例えば、微細ゲージ針、加熱、超音波処理、ミニビーズタンブリング、および噴霧）、電離放射線、紫外線照射、酸素ラジカル、化学加水分解剤および化学療法剤などの、他の化学的または機械的種ダウンによって生成される末端において末端を修飾してもよい。ＤＮＡエンドプロセッシング酵素は、一つまたは複数のヌクレオチドを付加すること、一つまたは複数のヌクレオチドを除去すること、リン酸基を除去するか、もしくは修飾することおよび／またはヒドロキシル基を除去するか、もしくは修飾することによって、露出したＤＮＡ末端を修飾し得る。

【0216】

本明細書において企図される特定の実施形態での使用に適したＤＮＡエンドプロセッシング酵素の例としては、５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３’－５’エキソヌクレアーゼ、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、加水分解酵素および鋳型非依存性ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

【0217】

本明細書において企図される特定の実施形態での使用に適したＤＮＡエンドプロセッシング酵素の追加の例としては、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通型ドメインを有さないＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、Ｅｘｏ１、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７－エキソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルス統合タンパク質（ＩＮ）、ブルーム、南極ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌ ｍｕ、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４およびＵＬ－１２が挙げられるが、これらに限定されない。

【0218】

特定の実施形態では、本明細書において企図される細胞ゲノムを編集するためのゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬおよびエキソヌクレアーゼを含むポリペプチドを含む。用語「エキソヌクレアーゼ」は、３’または５’末端のいずれかにおいてホスホジエステル結合を破壊する加水分解反応を介して、ポリヌクレオチド鎖の末端のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。

【0219】

本明細書において企図される特定の実施形態での使用に適したエキソヌクレアーゼ例としては、ｈＥｘｏＩ、酵母ＥｘｏＩ、大腸菌ＥｘｏＩ、ｈＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ２、ラットＴＲＥＸ２、ｈＴＲＥＸ１、マウスＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、およびラットＴＲＥＸ１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0220】

特定の実施形態では、ＤＮＡエンドプロセッシング酵素は、３’または５’エキソヌクレアーゼ、好ましくは、Ｔｒｅｘ１またはＴｒｅｘ２、より好ましくは、Ｔｒｅｘ２、なおより好ましくは、ヒトまたはマウスＴｒｅｘ２である。

【0221】

Ｄ．標的部位
特定の実施形態で企図されるヌクレアーゼバリアントは、ＷＡＳ遺伝子における任意の適当な標的配列に結合する設計することができ、天然で生じるヌクレアーゼと比較して、新規の結合特異性を有することができる。特定の実施形態では、標的部位は、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーエレメントなどを含むが、これらに限定されない、遺伝子の制御領域である。特定の実施形態では、標的部位は、遺伝子またはスプライス部位のコード領域である。特定の実施形態では、ヌクレアーゼバリアントおよびドナー修復鋳型は、治療ポリヌクレオチドを挿入するよう設計することができる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼバリアントおよびドナー修復鋳型は、内因性ＷＡＳ遺伝子制御エレメントまたは発現調節配列の制御下で、治療ポリヌクレオチドを挿入するよう設計することができる。

【0222】

様々な実施形態では、ヌクレアーゼバリアントは、Ｘ染色体上に位置する、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子における標的配列を結合し、切断する。ＷＡＳ遺伝子は、Ａｒｐ２／３複合体とのその相互作用を介して、アクチンフィラメント認識を制御するＲｈｏ型ＧＴＰａｓｅについてのエフェクタータンパク質をコードする。ＷＡＳｐは、アクチンフィラメント認識および病原性細菌による感染の際のアクチン台の形成を仲介し、核におけるアクチン重合作用を促進し、これにより、損傷されたＤＮＡの遺伝子転写および修復を制御し、核のアクチン重合作用を促進することによって、ＤＮＡ損傷に応答した相同組み換え（ＨＲ）修復を促進し、これが、二本鎖切断（ＤＳＢ）の駆動能を導く。ＷＡＳはまた、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質（ＷＡＳｐ）、血小板減少症１（Ｘ連鎖性）（ＴＨＣ）、湿疹－血小板減少症－免疫不全症候群、重篤な先天性好中球減少症、Ｘ連鎖性（ＳＣＮＸ）、および免疫不全２（ＩＭＤ２）としても言及される。特定の実施形態で使用される例示的なＷＡＳおよびＷＡＳｐ参照配列番号としては、ＥＮＳＧ００００００１５２８５、ＥＮＳＰ０００００３６５８９１、ＥＮＳＰ０００００４１０５３７、ＥＮＳＴ０００００３７６７０１、ＸＰ＿０１６８８５２７５．１、ＸＰ＿０１１５４２２７９．１、ＮＭ＿０００３７７．２、ＮＰ＿０００３６８．１、ＸＭ＿０１７０２９７８６．１、ＸＭ＿０１１５４３９７７．２、ＸＰ＿０１６８８５２７５．１ ＸＰ＿０１１５４２２７９．１、Ｐ４２７６８、Ｑ９ＢＵ１１、Ｑ９ＵＮＪ９、Ａ０Ａ０２４ＱＹＸ８、ＮＣ＿００００２３．１１、ＮＧ＿００７８７７．１、ＢＩ９１００７２、ＣＦ５２９５６５、Ｕ１９９２７、およびＣＣＤＳ１４３０３．１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0223】

特定の実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＷＡＳ遺伝子における二本鎖切断（ＤＳＢ）、好ましくは、ヒトＷＡＳ遺伝子の第二のイントロンにおける標的配列、より好ましくは、配列番号２７に記載されるヒトＷＡＳ遺伝子の第二のイントロンにおける標的配列を導入する。特定の実施形態では、リプログラミングされたヌクレアーゼまたはｍｅｇａＴＡＬは、配列「ＴＴＴＣ」を切断することによって、配列番号２７に記載されるＷＡＳ遺伝子の第二のイントロンにおける標的部位において二本鎖切断を導入するＩ－ＯｎｕＩ ＬＨＥバリアントを含む。

【0224】

好ましい実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、二本鎖ＤＮＡを切断し、ＤＳＢを配列番号２７または２９に記載されるポリヌクレオチド配列に導入する。

【0225】

好ましい実施形態では、ＷＡＳ遺伝子は、ヒトＷＡＳ遺伝子である。

【0226】

Ｅ．ドナー修復鋳型
ヌクレアーゼバリアントを使用して、標的配列におけるＤＳＢを導入してもよく、ＤＳＢは、一つまたは複数のドナー修復鋳型の存在下で相同組み換え修復（ＨＤＲ）機構を通じて修復されてもよい。特定の実施形態では、ドナー修復鋳型を使用して、配列をゲノムに挿入する。特定の好ましい実施形態では、ドナー修復鋳型を使用して、治療ＷＡＳポリペプチドまたはそのフラグメント、例えば、配列番号４０をコードするポリヌクレオチド配列を挿入する。特定の好ましい実施形態では、ＷＡＳポリペプチドの発現が、内因性ＷＡＳプロモーターおよび／またはエンハンサーの調節下にあるように、ドナー修復鋳型を使用して、治療ＷＡＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を挿入する。

【0227】

様々な実施形態では、ドナー修復鋳型は、ドナー修復鋳型を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、ＩＤＬＶなど、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはワクシニアウイルスベクターを用いて細胞を形質導入することによって、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは前駆細胞、またはＣＤ３４^＋細胞に導入される。

【0228】

特定の実施形態では、ドナー修復鋳型は、ＤＳＢ部位に隣接する一つまたは複数の相同アームを含む。

【0229】

本明細書で使用される場合、用語「相同アーム」は、標的部位においてヌクレアーゼによって導入されるＤＮＡ切断に隣接するＤＮＡ配列と同一であるか、またはほぼ同一であるドナー修復鋳型における核酸配列を指す。一実施形態では、ドナー修復鋳型は、ＤＮＡ切断部位の５’のＤＮＡ配列に同一であるか、またはほぼ同一である核酸配列を含む５’相同アームを含む。一実施形態では、ドナー修復鋳型は、ＤＮＡ切断部位の３’のＤＮＡ配列に同一であるか、またはほぼ同一である核酸配列を含む３’相同アームを含む。好ましい実施形態では、ドナー修復鋳型は、５’相同アームおよび３’相同アームを含む。ドナー修復鋳型は、ＤＳＢ部位にすぐ隣接するゲノム配列に対する相同性、またはＤＳＢ部位由来の任意の数の塩基対内のゲノム配列に対する相同性を含み得る。一実施形態では、ドナー修復鋳型は、相同な配列の任意の介在する長さを含む、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１００００ｂｐ以上のゲノム配列に相同である核酸配列を含む。

【0230】

特定の実施形態で企図される相同アームの適当な長さの例は、独立して選択され、相同アームのすべての介在する長さを含む、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ、または約３０００ｂｐ以上の相同アームが挙げられるが、これらに限定されない。

【0231】

適当な相同アーム長のさらなる例としては、約１００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ～約１５００ｂｐ、または約１０００ｂｐ～約１５００ｂｐの相同アームが挙げられるが、これらに限定されない。

【0232】

特定の実施形態では、５’および３’相同アームの長さは、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐから独立して選択される。一実施形態では、５’相同アームは、約１５００ｂｐであり、３’相同アームは、約１０００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約２００ｂｐ～約６００ｂｐであり、３’相同アームは、約２００ｂｐ～約６００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約２００ｂｐであり、３’相同アームは、約２００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約３００ｂｐであり、３’相同アームは、約３００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約４００ｂｐであり、３’相同アームは、約４００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約５００ｂｐであり、３’相同アームは、約５００ｂｐである。一実施形態では、５’相同アームは、約６００ｂｐであり、３’相同アームは、約６００ｂｐである。

【0233】

Ｆ．ポリペプチド
ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および融合ポリペプチドを含むが、これらに限定されない、様々なポリペプチドが、本明細書において企図される。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～２６に記載されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチドフラグメント」、「ペプチド」および「タンパク質」は、対照的に既定されない限り、従来の意味に従い、すなわち、アミノ酸の配列として、互換的に使用される。一実施形態では、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、様々な周知の組み換え技術および／または合成技術のいずれかを使用して調製することができる。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、これらは、全長タンパク質配列、全長タンパク質のフラグメント、または融合タンパク質を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然に存在するのと、天然に存在しないのの両方の、当該技術分野で公知の他の修飾を含み得る。

【0234】

本明細書において使用される、「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」、または「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境から、および細胞の他の成分との関連からのペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロ合成、単離、および／または精製を指し、すなわち、それは、インビボ物質と有意に関連しない。

【0235】

特定の実施形態で企図されるポリペプチドの例としては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセッシングヌクレアーゼ、融合ポリペプチドおよびそのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。

【0236】

ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１個または複数のアミノ酸置換、欠失、付加および／または挿入において、天然に存在するポリペプチドと異なっていてもよい。このようなバリアントは、天然に存在してもよいか、または例えば、上記のポリペプチド配列の一つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって、合成的に生成されてもよい。例えば、特定の実施形態では、ポリペプチドに１個または複数の置換、欠失、付加および／または挿入を導入することによって、ヒトＷＡＳ遺伝子における標的部位に結合し、切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬなどの生物学的特性を改善することが望ましくてもよい。特定の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書において企図される参照配列のいずれかに対して少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、バリアントは、参照配列の少なくとも一つの生物学的活性を維持する。

【0237】

ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチドフラグメント」を含む。生物学的に活性なポリペプチドフラグメントの例としては、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなどが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「生物学的に活性なフラグメント」または「最小の生物学的に活性なフラグメント」は、天然に存在するポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％を保持するポリペプチドフラグメントを指す。好ましい実施形態では、生物学的活性は、標的配列に対する結合親和性および／または切断活性である。ある特定の実施形態では、ポリペプチドフラグメントは、少なくとも５～約１７００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態では、フラグメントは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００以上のアミノ酸長であることは、理解される。特定の実施形態では、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性なフラグメントを含む。特定の実施形態では、本明細書において記載されるポリペプチドは、「Ｘ」として示される一つまたは複数のアミノ酸を含んでもよい。「Ｘ」は、アミノ酸配列番号に存在する場合、任意のアミノ酸を指す。一つまたは複数の「Ｘ」残基は、本明細書において企図される特定の配列番号に記載されるアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端に存在してもよい。「Ｘ」アミノ酸が存在しない場合、配列番号に記載される残りのアミノ酸配列は、生物学的に活性なフラグメントとみなされ得る。

【0238】

特定の実施形態では、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、例えば、配列番号６～１２またはｍｅｇａＴＡＬ（配列番号１３～１９）の生物学的に活性なフラグメントを含む。生物学的に活性なフラグメントは、Ｎ末端切断および／またはＣ末端切断を含んでもよい。特定の実施形態では、生物学的に活性なフラグメントは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、５、６、７、または８つのＮ末端アミノ酸の欠失、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４つのＮ末端アミノ酸の欠失を欠くか、または含む。特定の実施形態では、生物学的に活性なフラグメントは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、または５つのＣ末端アミノ酸の欠失、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの２つのＣ末端アミノ酸の欠失を欠くか、または含む。特定の好ましい実施形態では、生物学的に活性なフラグメントは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４つのＮ末端アミノ酸および２つのＣ末端アミノ酸の欠失を欠くか、または含む。

【0239】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失；および／または以下の１、２、３、４、もしくは５つのＣ末端アミノ酸：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖの欠失を含む。

【0240】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失または置換；および／あるいは以下の１、２、３、４、もしくは５つのＣ末端アミノ酸：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖの欠失または置換を含む。

【0241】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失；および／または以下の１つまたは２つのＣ末端アミノ酸：Ｆ、Ｖの欠失を含む。

【0242】

特定の実施形態では、Ｉ－ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失または置換；および／あるいは以下の１つまたは２つのＣ末端アミノ酸：Ｆ、Ｖの欠失または置換を含む。

【0243】

上述の通り、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断、および挿入を含む様々な方法で変更され得る。このような操作方法は、当該技術分野で一般的に知られている。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異により調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列変更の方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２），Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７－３８２），米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）およびそこで引用される参考文献を参照のこと。対象となるタンパク質の生物活性に影響を与えない適当なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見られ得る。

【0244】

ある特定の実施形態では、バリアントは、一つまたは複数の保存的置換を含有する。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者が、実質的に変化させるべきポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標特性を予測するように、アミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸に置換されているものである。修飾は、特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において成されてもよく、ポリペプチドは、少なくともおよそ有するポリペプチドを含み、所望の特徴を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を依然として得る。均等な、または改善されてさえいる、バリアントポリペプチドを生成するために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更させることが望ましいとき、当業者は、例えば、例えば、表１に従い、コードＤＮＡ配列のコドンの一つまたは複数を変更させることができる。

【表1】

【0245】

アミノ酸残基が、生物学的活性を無効にすることなく、置換され得る、挿入され得る、または欠損され得る、決定のガイダンスが、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃベクター、またはベクターＮＴＩソフトウエアなどの、当該技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用して見ることができる。好ましくは、本明細書において開示されるタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変更は、保存的アミノ酸変更、すなわち、同様に荷電した、または荷電していないアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変更は、それらの側鎖において関連する、アミノ酸のファミリーの一つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は、四つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸に、一般的に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、ときに、芳香族アミノ酸としてまとめて分類される。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適当な保存的置換は、当業者に公知であり、一般的に、得られた分子の生物学的活性を変更することなく、成され得る。当業者は、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照のこと）。

【0246】

二つ以上のポリペプチドの発現が望ましい、一実施形態では、それをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書において他で開示されるＩＲＥＳ配列によって分けることができる。

【0247】

特定の実施形態で企図されるポリペプチドは、融合ポリペプチド、例えば、配列番号１２～２６を含む。特定の実施形態では、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。

【0248】

別の実施形態では、二つ以上のポリペプチドは、本明細書において他で開示される一つまたは複数の自己切断ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。

【0249】

一実施形態では、本明細書において企図される融合タンパク質は、一つまたは複数のＤＮＡ結合ドメインおよび一つまたは複数のヌクレアーゼ、および一つまたは複数のリンカーおよび／または自己切断ポリペプチドを含む。

【0250】

一実施形態では、本明細書において企図される融合タンパク質は、ヌクレアーゼバリアント；リンカーまたは自己切断ペプチド；ならびに５’－３’エキソヌクレアーゼ、５’－３’アルカリエキソヌクレアーゼ、および３’－５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）を含むが、これらに限定されないエンドプロセッシング酵素を含む。

【0251】

融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなど、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、およびＨＡ）、ポリペプチドリンカー、およびポリペプチド切断シグナルを含むが、これらに限定されない、一つまたは複数のポリペプチドドメインまたはセグメントを含み得る。融合ポリペプチドは、Ｃ末端がＣ末端に、Ｎ末端がＮ末端に、またはＮ末端がＣ末端にも結合し得るが、それらは、典型的には、Ｃ末端がＮ末端に結合する。特定の実施形態では、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存される限り、保存的に修飾されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列、および種間相同体を含み得る。融合ポリペプチドは、化学合成方法によって、または二つの部分間の化学結合によって生成されてもよく、または一般的に、他の標準的な技術を使用して調製されてもよい。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書において他で開示される適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに動作可能に連結される。

【0252】

融合ポリペプチドは、任意選択的で、ポリペプチド内の一つまたは複数のポリペプチドまたはドメインを連結するために使用することができるリンカーを含んでもよい。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮できるように、それぞれのポリペプチドが、その適切な二次構造および三次構造に折り畳まれるのを確実にするのに十分な距離で、任意の二つ以上のポリペプチド成分を分離するために利用され得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該技術分野における標準的な技術を使用して、融合ポリペプチドに組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の要因に基づいて選択され得る：（１）可動性の伸長された立体構造を取り入れるそれらの能力；（２）それらが、第一および第二のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を取り入れることができないこと；および（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基、およびＳｅｒ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の中性に近いアミノ酸も、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして有用に利用され得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６，１９８５；Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８－８２６２，１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号において開示されるものが挙げられる。特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防止するために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含有するとき、リンカー配列は、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的には、組み換え融合タンパク質の一部として合成される、可動性アミノ酸部分配列である。リンカーポリペプチドは、間のすべての整数値を含む、１～２００アミノ酸長、１～１００アミノ酸長、または１～５０アミノ酸長であり得る。

【0253】

例示的なリンカーには、以下のアミノ酸配列：グリシンポリマー（Ｇ）_ｎ；グリシン－セリンポリマー（Ｇ_１－５Ｓ_１－５）_ｎ（式中、ｎは少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）；グリシン－アラニンポリマー；アラニン－セリンポリマー；ＧＧＧ（配列番号４８）；ＤＧＧＧＳ（配列番号４９）；ＴＧＥＫＰ（配列番号５０）（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ５５２５－５５３０（１９９７）を参照のこと）；ＧＧＲＲ（配列番号５１）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９５、上記）；（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４または５）（配列番号５２）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３，１１５６－１１６０（１９９６．））；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号５３）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６－１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号５４）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号５５）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号５６）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号５７）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）_２ＥＲＰ（配列番号５８）が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、可動性リンカーは、ＤＮＡ結合部位とペプチド自体の両方をモデル化することができるコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６－２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ ９１：１１０９９－１１１０３（１９９４））を使用して、またはファージディスプレイ方法によって合理的に設計することができる。

【0254】

融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインのそれぞれの間、または内因性オープンリーディングフレームとドナー修復鋳型によってコードされるポリペプチドの間のポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。加えて、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に配置することができる。例示的なポリペプチド切断シグナルには、タンパク質分解酵素切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）、および自己切断ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６－２６を参照のこと）。

【0255】

適切なタンパク質分解酵素切断部位および自己切断ペプチドは、当業者に公知である（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９－７２２；Ｓｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９－５９４を参照のこと）。例示的なタンパク質分解酵素切断部位としては、ポティウイルスＮＩａタンパク質分解酵素（例えば、タバコエッチウイルスタンパク質分解酵素）、ポティウイルスＨＣタンパク質分解酵素、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）タンパク質分解酵素、ビオウイルスＮＩａタンパク質分解酵素、ビオウイルスＲＮＡ－２－コードタンパク質分解酵素、アフトウイルスＬタンパク質分解酵素、エンテロウイルス２Ａタンパク質分解酵素、ライノウイルス２Ａタンパク質分解酵素、ピコルナ３Ｃタンパク質分解酵素、コモウイルス２４Ｋタンパク質分解酵素、ネポウイルス２４Ｋタンパク質分解酵素、ＲＴＳＶ（イネツングロ球形ウイルス）３Ｃ様タンパク質分解酵素、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様タンパク質分解酵素、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子およびエンテロキナーゼの切断部位が挙げられるが、これらに限定されない。その高い切断ストリンジェンシーにより、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）タンパク質分解酵素切断部位が好ましく、一実施形態では、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号５９）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号６０）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号６１）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧの間またはＱとＳの間で生じる）が好ましい。

【0256】

ある特定の実施形態では、己切断ポリペプチド部位は、２Ａもしくは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７－１０４１）。特定の実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。

【0257】

一実施形態では、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａペプチド、ゾーシーアシグナウイルス（ＴａＶ）２Ａペプチド、豚テシオウイルス－１（ＰＴＶ－１）２Ａペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。

【0258】

２Ａ部位の例は、表２に提供される。

【0259】

表２：例示的な２Ａ部位は、以下の配列を含む：

【表2】

【0260】

Ｇ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態では、本明細書において企図される一つまたは複数のホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセッシング酵素、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり、組み換え、合成、または単離のいずれかであってもよい。ポリヌクレオチドには、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレ－ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅したＤＮＡ、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、および組み換えＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、または修飾された形態のいずれかのタイプのヌクレオチドである、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００以上のヌクレオチド長、ならびにすべての中間の長さの、多量形態のヌクレオチドを指す。この文脈における「中間の長さ」は、６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など；１５１、１５２、１５３など；２０１、２０２、２０３などの、引用された値の間の任意の長さを意味することは、容易に理解されるだろう。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。

【0261】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「コドン最適化」は、ポリペプチドの発現、安定性および／または活性を増大させるためにポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおけるコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響する要因としては、（ｉ）二つ以上の生物または遺伝子間のコドンバイアスの変動、もしくは合成的に構築されたバイアス表、（ｉｉ）生物、遺伝子、もしくは遺伝子セット内のコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）前後を含むコドンの系統的変動、（ｉｖ）それらのデコードｔＲＮＡによるコドンの変動、（ｖ）全体的または三重項の一つの位置のいずれかにおける、ＧＣ％によるコドンの変動、（ｖｉ）参照配列、例えば、天然に存在する配列に対する類似性の程度の変動、（ｖｉｉ）コドン頻度カットオフの変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計が基づくべき、ＤＮＡ配列の機能についての従前の知識、および／または（ｘ）それぞれのアミノ酸についてのコドンセットの系統的変動、および／または（ｘｉ）仮の翻訳開始部位の単離除去の一つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。

【0262】

本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、リン酸化糖とＮ－グリコシド結合した複素環窒素塩基を指す。ヌクレオチドは、天然の塩基、および非常に様々な当該技術分野で認識される修飾された塩基を含むことが理解される。このような塩基は、ヌクレオチド糖部分の１’位に一般的に位置付けられる。ヌクレオチドは、一般的に、塩基、糖およびリン酸基を含む。リボ核酸（ＲＮＡ）では、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）では、糖はデオキシリボース、すなわち、リボースに存在するヒドロキシル基を欠く糖である。例示的な天然の窒素塩基としては、プリン、アデノシン（Ａ）およびグアニジン（Ｇ）、ならびにピリミジン、シチジン（Ｃ）およびチミジン（Ｔ）（またはＲＮＡの文脈では、ウラシル（Ｕ））が挙げられる。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合する。ヌクレオチドは、通常、一リン酸、二リン酸、または三リン酸塩である。ヌクレオチドは、糖部分、リン酸塩部分、および／または塩基部分で修飾されていないか、または修飾され得る（ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、修飾されたヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、および非標準ヌクレオチドとして互換的に称される；例えば、国際公開第９２／０７０６５号および国際公開第９３／１５１８７号を参照のこと）。修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３－２１９６）により要約されている。

【0263】

ヌクレオチドはまた、ヌクレオシドのリン酸エステルとみなされてもよく、エステル化は、糖のＣ－５に結合したヒドロキシル基上で生じる。本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオシド」は、糖とのＮ－グルコシド結合における複素環窒素塩基を指す。ヌクレオシドは、天然の塩基を含み、また周知の修飾された塩基を含むことは、当該技術分野で認識されている。このような塩基は、ヌクレオシド糖部分の１’位に一般的に位置付けられる。ヌクレオシドは、一般的に、塩基および糖基を含む。ヌクレオシドは、糖部分、および／または塩基部分で修飾されていないか、または修飾され得る（ヌクレオシド類似体、ヌクレオシド誘導体、修飾されたヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、もしくは非標準ヌクレオシドとして互換的に称される）。また上述した通り、修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，２１８３－２１９６）により要約されている。

【0264】

ポリヌクレオチドの例としては、配列番号１～２６をコードするポリヌクレオチドおよび配列番号３０～３６に記載されるポリヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。

【0265】

様々な例示的な実施形態では、本明細書において企図されるポリヌクレオチドとしては、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド、ｍｅｇａＴＡＬｓ、エンドプロセッシング酵素、融合ポリペプチド、ならびに本明細書において企図されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ウイルスベクター、およびトランスファープラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0266】

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などは、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または本明細書において以下で定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも一つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドを包含する。したがって、用語「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」は、一つまたは複数のヌクレオチドが、付加もしくは欠失されているか、または修飾されているか、または異なるヌクレオチドで置換されているポリヌクレオチドを含む。この点に関して、変異、付加、欠失、および置換を含むある特定の変更が、参照ポリヌクレオチドに成され得、これによって、変更されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは、当該技術分野で十分に理解される。ポリヌクレオチドバリアントはまた、生物学的に活性なポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0267】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「ストリンジェントな条件」下でハイブリダイズさせることは、互いに少なくとも６０％同一のヌクレオチド配列が、ハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを記載する。一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列に対して相補的なプローブの５０％が、平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）である。標的配列は、一般的に、Ｔｍで過剰に存在するため、プローブの５０％が、平衡で占有される。

【0268】

本明細書において使用される場合、列挙「配列同一性」、または例えば、「５０％同一の配列」を含むことは、配列が、比較のウィンドウにわたってヌクレオチド対ヌクレオチド基盤またはアミノ酸対アミノ酸基盤で同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって二つの最適に整列させた配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が、両方の配列で生じて、一致した位置の数を生じる、位置の数を決定すること、一致した位置の数を、比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）における位置の総数で割ること、および結果を１００倍して、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算され得る。本明細書において記載される参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、典型的には、ポリペプチドバリアントは、参照ポリペプチドの少なくとも一つの生物活性を維持する。

【0269】

二つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関連性を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基長を含む、少なくとも１２モノマー単位だが、多くの場合、１５～１８モノマーであり、多くの場合、少なくとも２５モノマー単位である。二つのポリヌクレオチドは、それぞれ、（１）二つのポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）二つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含み得るので、二つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を同定し、比較するための「比較ウィンドウ」にわたる二つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、少なくとも６つの連続する位置、通常、約５０～約１００、より通常、約１００～約１５０の概念セグメントを指し、配列は、二つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の基準配列と比較される。比較ウィンドウは、二つの配列の最適なアライメントのための、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ） のコンピュータ制御システム実装によって、または選択された様々な方法のいずれかによって生じる、精査および最善のアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたる最大パーセンテージの相同性をもたらす）によって行われ得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを参照されてもよい。配列解析の詳細な考察は、Ｕｎｉｔ １９．３ ｏｆ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５に記載されている。

【0270】

本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に生じる状態のそれと隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、フラグメントに通常隣接している配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指す。特定の実施形態では、「単離されたポリヌクレオチド」は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または天然では存在せず、人の手により作製された他のポリヌクレオチドを指す。

【0271】

様々な実施形態では、ポリヌクレオチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、およびエンドプロセッシング酵素を含むが、これらに限定されない、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ、一つまたは複数のヌクレオチドおよび／または修飾されたヌクレオチド、ならびにポリ（Ａ）テールを含む。

【0272】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるｍＲＮＡは、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護し、ｍＲＮＡを安定化させ、翻訳を促進するためにポリ（Ａ）テールを含む。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。

【0273】

特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは少なくとも約５００以上のアデニンヌクレオチドまたは任意の中間にある数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さは、少なくとも約１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、または２７５以上のアデニンヌクレオチドである。

【0274】

特定の実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さは、約１０～約５００アデニンヌクレオチド、約５０～約５００アデニンヌクレオチド、約１００～約５００アデニンヌクレオチド、約１５０～約５００アデニンヌクレオチド、約２００～約５００アデニンヌクレオチド、約２５０～約５００アデニンヌクレオチド、約３００～約５００アデニンヌクレオチド、約５０～約４５０アデニンヌクレオチド、約５０～約４００アデニンヌクレオチド、約５０～約３５０アデニンヌクレオチド、約１００～約５００アデニンヌクレオチド、約１００～約４５０アデニンヌクレオチド、約１００～約４００アデニンヌクレオチド、約１００～約３５０アデニンヌクレオチド、約１００～約３００アデニンヌクレオチド、約１５０～約５００アデニンヌクレオチド、約１５０～約４５０アデニンヌクレオチド、約１５０～約４００アデニンヌクレオチド、約１５０～約３５０アデニンヌクレオチド、約１５０～約３００アデニンヌクレオチド、約１５０～約２５０アデニンヌクレオチド、約１５０～約２００アデニンヌクレオチド、約２００～約５００アデニンヌクレオチド、約２００～約４５０アデニンヌクレオチド、約２００～約４００アデニンヌクレオチド、約２００～約３５０アデニンヌクレオチド、約２００～約３００アデニンヌクレオチド、約２５０～約５００アデニンヌクレオチド、約２５０～約４５０アデニンヌクレオチド、約２５０～約４００アデニンヌクレオチド、約２５０～約３５０アデニンヌクレオチド、もしくは約２５０～約３００アデニンヌクレオチドまたは任意の中間にある範囲のアデニンヌクレオチドである。

【0275】

ポリヌクレオチドの向きを記載する用語には、５’（通常、フリーのリン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常、フリーのヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’の向き、または３’から５’の向きに注釈付けされ得る。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについて、５’から３’の鎖は、その配列が、プレメッセンジャー（プレ－ｍＲＮＡ）の配列と同一であるため、「センス」鎖、「プラス」鎖、または「コード」鎖と指定される［ＤＮＡにおけるチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡにおけるウラシル（Ｕ）を除く］。ＤＮＡおよびｍＲＮＡについて、ＲＮＡポリメラーゼによって転写された鎖である相補的３’から５’鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖として指定される。本明細書で使用される場合、用語「逆向き」は、３’から５’の向きで書かれた５’から３’の配列、または５’から３’の向きで書かれた３’から５’の配列を指す。

【0276】

用語「相補的」および「相補性」は、塩基対形成規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ Ａ Ｇ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ ３’の相補鎖は、３’ Ｔ Ｃ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ ５’である。後者の配列は、多くの場合、５’末端を左に、３’末端を右に有する逆相補鎖、５’ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ ３’として書かれる。その逆相補鎖と等しい配列は、パリンドローム配列であると言われる。相補性は、核酸塩基の一部のみが、塩基対形成規則に従って一致する、「部分的」であり得る。または、核酸間に「完全な」または「総合的な」相補性が存在する。

【0277】

本明細書において使用される場合、用語「核酸カセット」または「発現カセット」は、ＲＮＡ、およびその後のポリペプチドを発現することができる、ベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態では、核酸カセットは、対象となる遺伝子（複数可）、例えば、対象となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。別の実施形態では、核酸カセットは、一つまたは複数の発現調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および対象となる遺伝子（複数可）、例えば、対象となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット中の核酸が、ＲＮＡに転写され、必要に応じて、タンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性に必要とされる適当な翻訳後就職を受け、適当な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって、生物学的活性に適当な区画に移動されるように、ベクター内で位置的かつ順次配向される。好ましくは、カセットは、ベクターへの挿入準備完了に適合したその３’および５’末端を有し、例えば、それは、それぞれの末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態では、核酸カセットは、遺伝的障害を治療する、予防する、または改善するために使用される治療遺伝子の配列を含有する。カセットは、除去され、プラスミドまたはウイルスベクターに単一ユニットとして挿入され得る。

【0278】

ポリヌクレオチドは、対象となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。本明細書で使用される場合、用語「対象となるポリヌクレオチド」は、本明細書において企図される、ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは阻害性ポリヌクレオチドの転写のための鋳型として働くポリヌクレオチドを指す。

【0279】

さらに、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書において企図される、ポリペプチド、またはそのバリアントのフラグメントをコードし得る多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者により理解される。これらのポリヌクレオチドの一部は、任意の天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を生じる。それにもかかわらず、コドン使用の違いに起因して変動するポリヌクレオチドは、特定の実施形態、例えば、ヒトおよび／または霊長類コドン選択に最適化されているポリヌクレオチドで、特に企図される。一実施形態では、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの、一つまたは複数の変異の結果として変更されている内因性ポリヌクレオチド配列である。

【0280】

ある実施形態では、対象となるポリヌクレオチドは、ドナー修復鋳型を含む。

【0281】

特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドは、それらの全体的な長さが、大きく変動し得るように、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書において他で開示される、プロモーターおよび／またはエンハンサーなど、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、転写後応答エレメント、ならびに自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの、他のＤＮＡ配列と組み合わせてもよい。したがって、特定の実施形態では、ほぼ任意の長さのポリヌクレオチドフラグメントが、利用されてもよく、全長は、好ましくは、意図される組み換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限されることが、企図される。

【0282】

ポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知かつ利用可能な様々な十分に確立された技術のいずれかを使用して、調製され、操作され、発現され、および／または送達され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適当なベクターに挿入することができる。所望のポリペプチドはまた、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞に送達することによっても発現され得る。

【0283】

ベクターの例としては、プラスミド、自律的に複製する配列、および転位性エレメント、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが挙げられるが、これらに限定されない。

【0284】

ベクターの追加の例としては、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

【0285】

ベクターとして有用なウイルスの例の例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0286】

発現ベクターの例としては、哺乳類細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳類細胞におけるレンチウイルス介在性遺伝子導入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書において開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳類細胞におけるポリペプチドの発現のため、このような発現ベクターにライゲーションされ得る。

【0287】

特定の実施形態では、ベクターは、エピソームベクターまたは染色体外で維持されるベクターである。本明細書で使用される場合、用語「エピソーム」は、宿主の染色体ＤＮＡに組み込むことなく、かつ分割宿主細胞からの段階的な喪失なく、複製することができるベクターを指し、当該ベクターが、染色体外またはエピソームで複製することを意味する。

【0288】

発現ベクターに存在する「発現調節配列」、「調節エレメント」、または「制御配列」は、ベクターの非翻訳領域である、複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、転写後制御エレメント、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域であり、これは、宿主の細胞タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を行う。このようなエレメントは、それらの強度および特異性において変動し得る。利用されるベクターシステムおよび宿主に依存して、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の適切な転写および翻訳エレメントが使用されてもよい。

【0289】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むが、これに限定されない、ベクターを含む。ベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、一つまたは複数の外因性、内因性、または異種調節配列を含んでもよい。「内因性調節配列」は、ゲノムにおける所定の遺伝子と天然に連結されているものである。「外因性調節配列」は、その遺伝子の転写が、連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示されるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）によって遺伝子に対して近位におかれるものである。「異種調節配列」は、遺伝子操作されている細胞とは異なる種由来の外因性配列である。「合成」調節配列は、一つのさらなる内因性および／もしくは外因性配列、ならびに／または特定の療法に最適なプロモーターおよび／またはエンハンサー活性をもたらすインビトロまたはインシリコで決定された配列のエレメントを含んでもよい。

【0290】

本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始し、転写する。特定の実施形態では、哺乳類細胞において作動するプロモーターは、転写が開始される部位のおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチな領域、および／またはＣＮＣＡＡＴ領域（式中、Ｎは、任意のヌクレオチドであってもよい）である、転写の開始から７０～８０塩基上流で見出される別の配列を含む。

【0291】

用語「エンハンサー」は、増強された転写をもたらすことができる配列を含有し、ある場合では、別の調節配列と関連するその向きにと関係なく機能し得るＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協働的または相加的に機能することができる。用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーター機能とエンハンサー機能の両方をもたらすことができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。

【0292】

用語「作動可能に連結された」は、記載される構成要素が、それらが意図される様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。一実施形態では、用語は、核酸発現調節配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第二のポリヌクレオチド配列、例えば、対象となるポリヌクレオチドとの間の機能的結合を指し、発現調節配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。

【0293】

本明細書で使用される場合、用語「構成的発現調節配列」は、作動可能に連結された配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現調節配列は、非常に様々な細胞および組織タイプでの発現を可能にする「偏在性」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサー、あるいはそれぞれ、限定された様々な細胞および組織タイプでの発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞タイプ特異的」、「細胞系統特異的」、もしくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであり得る。

【0294】

特定の実施形態での使用に適した例示的な偏在性発現調節配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルスサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、早期もしくは後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ） ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、短い伸長因子１－アルファ（ＥＦ１ａ－ショート）プロモーター、長い伸長因子１－アルファ（ＥＦ１ａ－ロング）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（β－ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７－１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、欠損した負の対照領域、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８－５５（１９９５））挙げられるが、これらに限定されない。

【0295】

特定の実施形態では、細胞、細胞タイプ、細胞系統または組織特異的発現調節配列を使用して、所望のポリヌクレオチド配列の細胞タイプ特異的、系統特異的、または組織特異的発現を達成する（例えば、細胞タイプ、細胞系統、または組織のサブセットのみにおいて、または発生の特定の段階中にポリペプチドをコードする特定の核酸を発現する）ことが望ましい。

【0296】

本明細書で使用される場合、「条件付発現」は、誘導性発現；抑圧可能な発現；特定の生理学的状態、生物学的状態、または疾患状態などを有する細胞または組織における発現を含むが、これらに限定されない、任意のタイプの条件付発現を指し得る。この定義は、細胞タイプまたは組織特異的発現を除外することを意図していない。ある特定の実施形態は、対象となるポリヌクレオチドの条件付発現をもたらし、例えば、発現は、細胞、組織、生物などを、ポリヌクレオチドを発現させる、または対象となるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現における増大もしくは減少を引き起こす処理または条件の対象にすることによって調節される。

【0297】

誘導性プロモーター／システムの例としては、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のためのプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター（対応するホルモンを用いた処理によって誘導可能）、メタロチオニンプロモーター（様々な重金属を用いた処理により誘導可能）、ＭＸ－１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン－制御可能なシステム（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クミン酸塩誘導性遺伝子スイッチ（国際公開第２００２／０８８３４６号）、テトラサイクリン依存性制御システムなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0298】

条件付発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによっても達成され得る。ある特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼにより仲介される組み換えのための少なくとも一つの（典型的には、二つの）部位を含む。本明細書で使用される場合、用語「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」は、切除もしくは組み込みタンパク質、酵素、補因子または野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９－７０７（１９９３）を参照のこと）、または変異体、誘導体（例えば、組み換えタンパク質配列もしくはそのフラグメントを含有する融合タンパク質）、フラグメント、およびそのバリアントであり得る、関連するタンパク質を含む。特定の実施形態での使用に適したリコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３ リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0299】

ポリヌクレオチドは、非常に様々な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための一つまたは複数の組み換え部位を含んでもよい。部位特異的リコンビナーゼの標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みに必要とされる任意の部位（複数可）に追加されることは、理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「組み換え配列」、「組み換え部位」、または「部位特異的組み換え部位」は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。

【0300】

特定の実施形態では、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、一つまたは複数のポリペプチドをコードする、一つまたは複数の対象となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複数のポリペプチドのそれぞれの効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、一つまたは複数のＩＲＥＳ配列または自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離され得る。

【0301】

本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧなどの開始コドンへの直接的な内部リボソーム侵入を促進し、これにより、遺伝子のキャップ非依存性翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７－８３）ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ １（１０）：９８５－１０００を参照のこと。当業者によって一般的に利用されるＩＲＥＳの例には、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものを含む。当技術分野で公知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例としては、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（ Ｈｕｅｚ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８－６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇならびに酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｄｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６６（３）：１６０２－９）から市販されている脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ならびにＶＥＧＦ ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８（１１）：６１７８－９０）などの、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０）ならびにウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ供給源から得られるＩＲＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、ピコルナウイルス科、ジシストロウイルス科およびフラビウイルス科種のウイルスゲノムにおいて、ならびにＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）において報告されている。

【0302】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、共通コザック配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「コザック配列」は、リボソームの小さいサブユニットへのｍＲＮＡの初期結合を大いに促進し、翻訳を増大させる短いヌクレオチド配列を指す。共通コザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号８４）（式中、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である）（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３－９２、およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５－４８）である。

【0303】

異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指示するエレメントは、異種遺伝子発現を増大させる。転写終結シグナルは、一般的に、ポリアデニル化シグナルの下流に見られる。特定の実施形態では、ベクターは、発現されるべきポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される場合、用語「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結とポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡテールをコード配列の３’末端に付加し、これにより、翻訳効率を増大させるのに寄与するｍＲＮＡ安定性を促進することができる。切断およびポリアデニル化は、ＲＮＡにおけるポリ（Ａ）配列によって指示される。哺乳類プレｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断－ポリアデニル化部位に隣接する二つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡヘキサマーは、Ｕ残基またはＧＵ残基が豊富な、より可変のエレメントの上流の２０～５０ヌクレオチドに位置する。新生転写物の切断は、これら二つのエレメントの間で生じ、結合して、５’切断産物に最大２５０個のアデノシンを付加する。特定の実施形態では、コアポリ（Ａ）配列は、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ－グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、そのバリアント、または当技術分野で公知の別の適当な異種もしくは内因性ポリＡ配列である。

【0304】

特定の実施形態では、一つまたは複数のホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセッシング酵素、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルスとウイルス方法の両方によって、造血細胞、例えば、ＣＤ３４^＋細胞、または免疫エフェクター細胞に導入されてもよい。特定の実施形態では、ヌクレアーゼおよび／またはドナー修復鋳型をコードする一つまたは複数のポリヌクレオチドの送達は、同じ方法によって、もしくは異なる方法によって、および／または同じベクターによって、もしくは異なるベクターによってもたらされてもよい。

【0305】

用語「ベクター」は、別の核酸分子を移行または輸送することができる核酸分子を指すために本明細書において使用される。移行される核酸を一般的に連結させて、例えば、ベクター核酸分子に挿入される。ベクターは、細胞において自律的複製を指示する配列を含んでもよく、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態では、非ウイルスベクターを使用して、本明細書において企図される一つまたは複数のポリヌクレオチドをＣＤ３４^＋細胞または免疫エフェクター細胞に送達する。

【0306】

非ウイルスベクターの例としては、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0307】

特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ－デキストラン仲介性移送、遺伝子銃、および熱ショックが挙げられるが、これらに限定されない。

【0308】

特定の実施形態で企図される特定の実施形態での使用に適したポリヌクレオチド送達システムの例としては、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．によって提供されているものが挙げられるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質が、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０－１８７；およびＢａｌａｚｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１－１２を参照のこと。抗体標的化送達、細菌由来送達、生きていないナノ細胞ベースの送達も、特定の実施形態では企図される。

【0309】

特定の実施形態で企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、典型的には、以下に記載される、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所適用によって、個々の患者に投与することによってインビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、動員された末梢血、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検など）または普遍的なドナー造血幹細胞などの細胞にエクスビボで送達され、その後、細胞を患者に再移植することができる。

【0310】

一実施形態では、ヌクレアーゼバリアントおよび／またはドナー修復鋳型を含むウイルスベクターは、インビボでの細胞の形質導入のため生物に直接投与される。あるいは、ネイキッドＤＮＡまたはｍＲＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、およびエレクトロポレーションを含むが、これらに限定されない、血液または組織細胞との究極的接触に分子を導入するため通常使用される経路のいずれかによる。そのような核酸を投与する適当な方法が利用可能であり、当業者に周知であるが、一つより多くの経路が、特定の組成物を投与するために使用でき、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりもより即時かつより有効な反応をもたらすことができる。

【0311】

本明細書において企図される特定の実施形態での使用に適したウイルスベクターシステムの例としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0312】

Ｈ．ゲノム編集された細胞
特定の実施形態で企図される方法によって製造されるゲノム編集された細胞は、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、もしくはＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）、またはそれと関連する状態を含むが、これらに限定されない、ＷＡＳの少なくとも一つの症状の治療、予防、および／または回復のための改善された細胞ベースの治療を提供する。いかなる特定の理論によって束縛されるものではないが、本明細書において企図される組成物および方法を使用して、内因性ＷＡＳｐ発現およびＷＡＳもしくはそれと関連する状態をほとんどもたらさないか、またはもたらさない１個または複数の変異および／または欠失を含むＷＡＳ遺伝子に、ＷＡＳｐの機能的コピーをコードするポリヌクレオチドを導入することができ、これにより、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、もしくはＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）を含むが、これらに限定されない、ＷＡＳまたはそれと関連する状態を治療し、一部の実施形態では、潜在的に治癒するために使用され得る、より頑強なゲノム編集された細胞組成物を提供することが、信じられている。

【0313】

特定の実施形態で企図されるゲノム編集された細胞は、自己／自己遺伝子（「自己」）または非自己（「非自己」、例えば、同種、同系もしくは異種）であってもよい。本明細書で使用される場合、「自己」は、同じ対象由来の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同種」は、比較中の細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「同系」は、比較中の細胞と遺伝子的に同一である異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用される場合、「異種」は、比較中の細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は、哺乳類対象から得られる。より好ましい実施形態では、細胞は、霊長類対象、任意選択で、非ヒト霊長類から得られる。最も好ましい実施形態では、細胞は、ヒト対象から得られる。

【0314】

「単離された細胞」は、天然に存在しない細胞、例えば、インビボ組織または器官から得られ、細胞外基質を実質的に含まない、天然に存在しない細胞、改変された細胞、操作された細胞などを指す。

【0315】

特定の実施形態では、細胞の集団は、編集すべき好ましい細胞タイプ（複数可）である一つまたは複数の特定の細胞タイプを含む。本明細書で使用される場合、用語「細胞の集団」は、本明細書において他で記載される、任意の数の同種もしくはヘテロ細胞タイプおよび／または同種もしくはヘテロ細胞タイプの組み合わせで構成される複数の細胞を指す。

【0316】

ゲノムが、本明細書において企図される組成物および方法を使用して編集され得る、細胞タイプの例としては、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、および分化した細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0317】

用語「幹細胞」は、（１）長期間の自己再生、または、元の細胞の少なくとも一つの同一コピーを生成する能力、（２）単一細胞レベルでの複数への分化、およびある場合では、一つのみの特定の細胞タイプへの分化、ならびに（３）インビボでの組織の機能的再生が可能な分化していない細胞である細胞を指す。幹細胞は、全能性、多能性、多分可能およびオリゴ／単能性として、その発生能により亜分類される。「自己再生」は、変更されていない娘細胞を生じ、特定の細胞タイプ（能力）を生じる固有の能力を有する細胞を意味する。自己再生は、二つの方法で達成することができる。非対称細胞分裂は、親細胞と同一の一つの娘細胞および親細胞とは異なり、前駆細胞または分化した細胞である一つの娘細胞を生じる。対称細胞分裂は、二つの同一の娘細胞を生じる。細胞の「増殖」または「拡大」は、対称的に分裂する細胞を指す。

【0318】

本明細書で使用される場合、用語「前駆体」または「前駆細胞」は、自己再生能力を有し、より成熟した細胞に分化する能力を有する細胞を指す。多くの前駆細胞は、単一系統に沿って分化するが、非常に広範な増殖能力を有し得る。

【0319】

特定の実施形態では、細胞は、初代細胞である。本明細書で使用される場合、用語「初代細胞」は、組織から単離され、インビトロまたはエクスビボでの成長のため確立された細胞を指すことが当該技術分野において知られている。対応する細胞は、もしあれば、非常に少ない集団の倍増を経験しており、それ故、連続する細胞株と比較して、それらがもたらされる組織の主要な機能的構成要素のより代表であり、したがって、インビボ状態のより代表的なモデルを表す。種々の組織から試料を得る方法、および初代細胞株を確立する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｗｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９７年）。本明細書において企図される方法において使用するための初代細胞は、臍帯血、胎盤血、動員された末梢血および骨髄からもたらされる。一実施形態では、初代細胞は、造血幹細胞または前駆細胞である。

【0320】

一実施形態では、ゲノム編集された細胞は、胚性幹細胞である。

【0321】

一実施形態では、ゲノム編集された細胞は、成人幹細胞または前駆細胞である。

【0322】

一実施形態では、ゲノム編集された細胞は、初代細胞である。

【0323】

特定の実施形態では、ゲノム編集された細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、例えば、Ｂ細胞前駆細胞、または造血細胞を含む細胞集団である。

【0324】

造血細胞を得るための例示的な供給源としては、臍帯血、骨髄または動員された末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。

【0325】

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生物の生涯にわたる成熟血液細胞のレパートリー全体を生じる能力がある、造血前駆細胞（ＨＰＣ）に傾倒して生じる。用語「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、骨髄系（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、ならびにリンパ系（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、ならびに当該技術分野で公知のもの（Ｓｅｅ Ｆｅｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６３５，３８７号；ＭｃＧｌａｖｅ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，４６０，９６４号；Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６７７，１３６号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，７５０，３９７号；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，７５９，７９３号；ＤｉＧｕｉｓｔｏ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６８１，５９９号；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，７１６，８２７号）を含む、生物の全ての血液細胞タイプを生じる多能性幹細胞を指す。致命的に照射された動物またはヒトに移植された場合、造血幹細胞および前駆細胞は、赤血球、好中球－マクロファージ、巨核球およびリンパ系造血細胞プールに再び繁殖することができる。

【0326】

本明細書において企図される方法および組成物での使用に適した造血幹細胞または前駆細胞の追加の例としては、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８^ＬｏＣＤ９０^＋ＣＤ４５^ＲＡ－である造血細胞、ＣＤ３４^＋、ＣＤ５９^＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０^＋、ＣＤ３８^Ｌｏ／－、Ｃ－キット／ＣＤ１１７^＋、およびＬｉｎ^（－）である造血細胞ならびにＣＤ１３３^＋である造血細胞が挙げられる。

【0327】

好ましい実施形態では、ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋である造血細胞。

【0328】

好ましい実施形態では、ＣＤ１３３^＋ＣＤ３４^＋である造血細胞。

【0329】

好ましい実施形態では、ＣＤ１３３^＋ＣＤ９０^＋ＣＤ３４^＋である造血細胞。

【0330】

造血階層を特徴付けるための様々な方法が存在する。一つの特徴決定方法は、ＳＬＡＭコードである。ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）ファミリーは、＞１０個の分子の群であり、その遺伝子は、主に染色体１（マウス）上の単一の遺伝子座に縦列に位置し、すべてが、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのサブセットに属し、元々Ｔ細胞刺激に関与すると考えられている。このファミリーには、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４などが含まれ、ＣＤ１５０は、創設メンバーであり、したがって、ｓｌａｍＦ１、すなわちＳＬＡＭファミリーメンバー１とも呼ばれる。造血階層に関する署名ＳＬＡＭコードは、造血幹細胞（ＨＳＣ）－ＣＤ１５０^＋ＣＤ４８^－ＣＤ２４４^－；多能性前駆細胞（ＭＰＰ）－ＣＤ１５０^－ＣＤ４８^－ＣＤ２４４^＋；系統限定前駆細胞（ＬＲＰ）－ＣＤ１５０^－ＣＤ４８^＋ＣＤ２４４^＋；共通の骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）－ｌｉｎ－ＳＣＡ－１－ｃ－キット^＋ＣＤ３４^＋ＣＤ１６／３２^ｍｉｄ；顆粒球－マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）－ｌｉｎ^－ＳＣＡ－１－ｃ－キット^＋ＣＤ３４^＋ＣＤ１６／３２^ｈｉ；および巨核球－赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）－ｌｉｎ^－ＳＣＡ－１－ｃ－キット^＋ＣＤ３４^－ＣＤ１６／３２^ｌｏｗである。

【0331】

特定の実施形態で企図される組成物および方法を用いて編集される好ましい標的細胞タイプとしては、造血細胞、好ましくは、ヒト造血細胞、より好ましくはヒト造血幹細胞および前駆細胞、なおより好ましくは、ＣＤ３４^＋ヒト造血幹細胞が挙げられる。本明細書において使用される場合、用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その細胞表面にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４」は、細胞接着因子としてしばしば作用する細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋は、造血幹細胞と前駆細胞の両方の細胞表面マーカーである。

【0332】

一実施形態では、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ１５０^＋ＣＤ４８^－ＣＤ２４４^－細胞である。

【0333】

一実施形態では、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ３４^＋ＣＤ１３３^＋細胞である。

【0334】

一実施形態では、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ１３３^＋細胞である。

【0335】

一実施形態では、ゲノム編集された造血細胞は、ＣＤ３４^＋細胞である。

【0336】

特定の実施形態では、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む造血細胞の集団は、欠陥のあるＷＡＳ遺伝子を含む。細胞は、内因性ＷＡＳｐ発現をほとんどもたらさないか、またはもたらさない、ＷＡＳ遺伝子における一つまたは複数の突然変異および／または欠失を含んでもよい。特定の実施形態では、欠陥のあるＷＡＳ遺伝子を含むＨＰＳＣは、機能的なＷＡＳｐを発現するように編集され、編集は、ＨＤＲによって修復されたＤＳＢである。

【0337】

特定の実施形態では、ゲノム編集された細胞は、ＣＤ３４^＋造血幹細胞または前駆細胞を含む。

【0338】

ゲノムが、本明細書において企図される組成物および方法を使用して編集され得る細胞タイプの他の例としては、免疫エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、およびＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0339】

様々な実施形態では、ゲノム編集された細胞は、本明細書において企図される組成物および方法によって編集されたＷＡＳ遺伝子を含む免疫エフェクター細胞を含む。「免疫エフェクター細胞」は、一つまたは複数のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態で企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４^＋Ｔ細胞）を含むが、これに限定されない、Ｔリンパ球である。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。

【0340】

用語「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、当該技術分野で認識され、胸腺細胞、調節性Ｔ細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４^＋Ｔ細胞）ＣＤ４^＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^－ＣＤ８^－Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。一実施形態では、Ｔ細胞は、免疫エフェクターＴ細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞はＮＫＴ細胞である。特定の実施形態での使用に適したＴ細胞の他の例示的な集団には、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。

【0341】

「強力なＴ細胞」および「若年Ｔ細胞」は、特定の実施形態で互換的に使用され、Ｔ細胞が、増殖能力を有し、かつ分化が同時に減少するＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態では、若年Ｔ細胞は、「ナイーブＴ細胞」の表現型を有する。特定の実施形態では、若年Ｔ細胞は、以下の生物学的マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの一つもしくは複数、またはすべてを含む。一実施形態では、若年Ｔ細胞は、以下の生物学的マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの一つもしくは複数、またはすべてを含む。一実施形態では、若年Ｔ細胞は、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ４、およびＬＡＧ３の発現を欠く。

【0342】

免疫エフェクター細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脊髄血液、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むが、これらに限定されない、多数の供給源から得られ得る。

【0343】

特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞を含む造血細胞の集団は、欠陥のあるＷＡＳ遺伝子を含む。細胞は、内因性ＷＡＳｐ発現をほとんどもたらさないか、またはもたらさない、ＷＡＳ遺伝子における一つまたは複数の突然変異および／または欠失を含んでもよい。特定の実施形態では、欠陥のあるＷＡＳ遺伝子を含む免疫エフェクター細胞は、機能的なＷＡＳｐを発現するように編集され、編集は、ＨＤＲによって修復されたＤＳＢである。

【0344】

特定の実施形態では、ゲノム編集された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、および／またはＮＫ細胞を含む。

【0345】

特定の実施形態では、細胞集団は、編集されてもよい。細胞の集団は、編集されるべき標的細胞タイプの約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％を含んでもよい。特定の実施形態では、ＣＤ３４^＋造血幹細胞または前駆細胞は、細胞の集団から単離されるか、または精製され、編集されてもよい。他の実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団は、編集されている免疫エフェクター細胞を含む。

【0346】

Ｉ．組成物および製剤
特定の実施形態で企図される組成物は、本明細書で企図される、一つまたは複数のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それを含むベクター、およびゲノム編集組成物およびゲノム編集された細胞組成物を含んでもよい。特定の実施形態で企図されるゲノム編集組成物および方法は、細胞または細胞の集団におけるヒトＷＡＳ遺伝子中の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態では、ゲノム編集組成物を使用して、造血細胞、例えば、造血幹細胞もしくは前駆細胞、ＣＤ３４^＋細胞、免疫エフェクター細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＮＫ細胞において、ＨＤＲによってＷＡＳ遺伝子を編集する。

【0347】

様々な実施形態では、本明細書において企図される組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意選択で、エンドプロセッシング酵素、例えば、３’－５’エキソヌクレアーゼ（Ｔｒｅｘ２）を含む。ヌクレアーゼバリアントは、上で開示されたポリヌクレオチド送達方法、例えば、エレクトロポレーション、脂質ナノ粒子などを介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。一実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ、および任意選択で、３’－５’エキソヌクレアーゼを含む組成物が、上で開示されたポリヌクレオチド送達方法を介して細胞内に導入される。

【0348】

特定の実施形態では、本明細書において企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、および任意選択で、ドナー修復鋳型を含む。特定の実施形態では、本明細書において企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、エンドプロセッシング酵素、および任意選択で、ドナー修復鋳型を含む。ヌクレアーゼバリアントおよび／またはエンドプロセッシング酵素は、上で開示されたポリヌクレオチド送達方法を介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。ドナー修復鋳型はまた、別個の組成物によって細胞に導入されてもよい。

【0349】

特定の実施形態では、本明細書において企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、および任意選択で、ドナー修復鋳型を含む。特定の実施形態では、本明細書において企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、３’－５’エキソヌクレアーゼ、および任意選択で、ドナー修復鋳型を含む。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および／または３’－５’エキソヌクレアーゼは、上で開示されたポリヌクレオチド送達方法を介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であってもよい。ドナー修復鋳型はまた、別個の組成物によって細胞に導入されてもよい。

【0350】

特定の実施形態では、細胞の集団は、造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ１３３^＋細胞、およびＣＤ３４^＋細胞を含むが、これらに限定されない遺伝子改変された造血細胞を含む。

【0351】

特定の実施形態では、細胞の集団は、免疫エフェクター細胞、Ｔ細胞、ＣＤ８^＋ＣＴＬ、ＴＩＬ、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞を含むが、これらに限定されない遺伝子改変された造血細胞を含む。

【0352】

組成物には、医薬組成物が含まれるが、これに限定されない。「医薬組成物」は、単独、または一つまたは複数の他の療法様式と組み合わせて、細胞または動物への投与のための医薬的に許容されるまたは生理学的に許容される溶液に製剤された組成物を指す。所望の場合、組成物は、同様に、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬剤、抗体、または他の様々な医薬的に活性な剤などの他の薬剤と組み合わせて投与されてもよいことも理解されるであろう。追加の薬剤が、組成物に悪影響を及ぼさないことを条件に、組成物に含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。

【0353】

語句「医薬的に許容される」は、妥当な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触した使用に適した、健全な医学的判断の範囲内にある化合物、物質、組成物、および／または投薬形態を指すように本明細書において利用される。

【0354】

「医薬的に許容される担体」という用語は、治療細胞が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビークルを指す。医薬担体の例は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などのような、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む、細胞培養培地、水および油であり得る。生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液も、液体担体として、特に、注射可能な溶液のため利用することができる。特定の実施形態における適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。任意の従来の媒体または薬剤が、有効成分と互換性がない場合を除き、治療組成物におけるその使用が企図される。追加の有効成分も、組成物に取り込むことができる。

【0355】

一実施形態では、医薬的に許容される担体を含む組成物は、対象への投与に適している。特定の実施形態では、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内投与もしくは動脈内投与）投与、腹腔内投与または筋肉内投与に適している。特定の実施形態では、医薬的に許容される担体を含む組成物は、脳室内投与、脊髄内投与、またはくも膜下腔内投与に適している。医薬的に許容される担体には、無菌の水溶液、細胞培養培地、または分散液が含まれる。医薬的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、形質導入された細胞と互換性がない場合を除き、医薬組成物におけるその使用が企図される。

【0356】

特定の実施形態では、本明細書において企図される組成物は、遺伝子修飾された造血幹細胞および／もしくは前駆細胞または機能的ＷＡＳｐをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む免疫エフェクター細胞ならびに医薬的に許容される担体を含む。

【0357】

特定の実施形態では、本明細書において企図される組成物は、遺伝子修飾された造血幹細胞および／もしくは前駆細胞または１個または複数の変異および／もしくは欠失を含むＷＡＳ遺伝子を含む免疫エフェクター細胞ならびに機能的ＷＡＳｐをコードする外因性ポリヌクレオチドならびに医薬的に許容される担体を含む。本明細書において企図される細胞ベースの組成物を含む組成物は、非経口投与方法によって投与することができる。

【0358】

医薬的に許容される担体は、治療されているヒト対象への投与に適しているように、十分に高い純度であり、十分に低い毒性でなければならない。それは、さらに、組成物の安定性を維持するか、または増大させるべきである。医薬的に許容される担体は、液体または固体であり得、組成物の他の構成成分と組み合わせたとき、所望のバルク、一貫性などを提供するために、計画された投与方法を念頭に置いて選択される。例えば、医薬的に許容される担体は、非限定的に、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたメイズスターチ、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）であり得る。本明細書において企図される組成物のための他の適切な医薬的に許容される担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0359】

このような担体溶液はまた、緩衝液、希釈剤および他の適切な添加剤を含有し得る。本明細書で使用される場合、用語「緩衝液」は、ｐＨの有意な変化なしに、その化学組成が、酸または塩基を中和する溶液または液体を指す。本明細書において企図される緩衝液の例としては、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル溶液、水中の５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）、正常／生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0360】

医薬的に許容される担体は、組成物のｐＨ約７を維持するのに十分な量で存在し得る。あるいは、組成物は、約６．８～約７．４の範囲、例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、および７．４のｐＨを有する。さらに別の実施形態では、組成物は、ｐＨ約７．４を有する。

【0361】

本明細書において企図される組成物は、無毒性の医薬的に許容される培地を含んでもよい。組成物は、懸濁液であってもよい。本明細書で使用される場合、用語「懸濁液」は、細胞が固体支持体に結合されていない非付着状態を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、撹拌されるか、またはかき混ぜられてもよく、培養ディッシュなどの支持体に付着していない。

【0362】

特定の実施形態では、本明細書において企図される組成物は、懸濁液において製剤化され、ここで、ゲノム編集された造血幹細胞および／または前駆細胞は、許容される液体培地、例えば、整理食塩水または血清を含まない培地内で、静脈内（ＩＶ）バックなどで分散される。許容される希釈剤としては、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム（生理食塩水）溶液、血清を含まない細胞培養培地、および例えば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地などの低温保存に適した培地が挙げられるが、これらに限定されない。

【0363】

ある特定の実施形態では、医薬的に許容される担体は、ヒトまたは動物起源の天然のタンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集された細胞、例えば、造血幹細胞および前駆細胞の集団を含む組成物の保存に適している。治療組成物は、ヒト患者に投与されることが意図されており、したがって、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、およびウシ胎児血清などの細胞培養成分を実質的に含まない。

【0364】

一部の実施形態では、組成物は、医薬的に許容される細胞培養培地において製剤化される。このような組成物は、ヒト対象への投与に適している。特定の実施形態では、医薬的に許容される細胞培養培地は、血清を含まない培地である。

【0365】

血清を含まない培地は、単純化され、より良好に定義された組成物、低減した程度の汚染物、可能性のある感染性物質源の除去、およびより低いコストを含む、血清含有培地よりもいくつかの利点を有する。様々な実施形態において、血清を含まない培地は、動物性のもを含まず、任意選択的に、タンパク質を含まない。任意選択的に、培地は、生物医薬的に許容される組み換えタンパク質を含有してもよい。「動物性のものを含まない」培地は、成分が、非動物供給源からもたらされる培地を指す。組み換えタンパク質は、動物性のものを含まない培地における天然の動物タンパク質を置き換え、栄養素は、合成、植物または微生物供給源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。

【0366】

特定の組成物において使用される血清を含まない培地の例としては、ＱＢＳＦ－６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ－ＶＩＶＯ １０が挙げられるが、これらに限定されない。

【0367】

好ましい実施形態では、ゲノム編集された造血幹細胞および／または前駆細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅにおいて製剤化される。

【0368】

様々な実施形態では、造血幹細胞および／または前駆細胞を含む組成物は、凍結保存培地において製剤化される。例えば、凍結保存剤を有する凍結保存培地を使用して、解凍後の高い細胞生存率の結果を維持してもよい。特定の組成物において使用される凍結保存培地体の例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。

【0369】

一実施形態では、組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ対ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む溶液において製剤化される。

【0370】

特定の実施形態では、組成物は、マイコプラズマ、エンドトキシン、および微生物汚染物を実質的に含まない。エンドトキシンに関して「実質的に含まない」とは、生物学についてＦＤＡが許可するよりも、細胞用量当たりのエンドトキシンが少ないことを意味し、これは、１日当たり５ＥＵ／体重１ｋｇの総エンドトキシンであり、平均７０ｋｇの個人について、細胞用量当たり３５０ＥＵである。特定の実施形態では、本明細書において企図されるレトロウイルスベクターを用いて形質導入された造血幹細胞または前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ～約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ、もしくは５．０ＥＵ／ｍＬを含有する。

【0371】

ある特定の実施形態では、一つまたは複数のリプログラミングされたヌクレアーゼをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡ、および任意選択で、エンドプロセッシング酵素を含むが、これらに限定されない、ポリヌクレオチドの送達に適した組成物および製剤が企図される。

【0372】

エクスビボ送達のための例示的な製剤はまた、リン酸カルシウム、エレクトロポレーション、熱ショックおよび様々なリポソーム製剤（すなわち、脂質仲介性遺伝子導入）などの、当該技術分野で公知の様々な遺伝子導入の使用を含み得る。以下でより詳細に記載される、リポソームは、水性流体の分画を包囲する脂質二重層である。ＤＮＡは、カチオン性リポソームの外部表面と（その電荷の力により）自発的に会合し、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用する。

【0373】

特定の実施形態では、医薬的に許容される担体溶液の製剤化は、当業者に周知であり、例えば、経腸および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、脳室内、脳内、頭蓋内、脊髄内、くも膜下腔内、ならびに髄内投与および製剤を含む、様々な治療レジメンにおいて本明細書において記載される特定の組成物を使用するのに適した投薬および治療レジメンの開発である。当業者は、本明細書において企図される特定の実施形態が、医薬技術分野において周知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅ Ｉ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ＩＩ．２２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載されるものなど、他の製剤を含んでもよいことを理解するであろう。

【0374】

Ｊ．ゲノム編集された細胞療法
特定の実施形態で企図される方法によって製造されるゲノム編集された細胞は、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、またはＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）を含むが、これらに限定されない、ＷＡＳまたはＷＡＳ遺伝子における変異によって引き起こされる状態の予防、治療、および回復における使用のための改善された薬物製品をもたらす。本明細書で使用される場合、用語「薬物製品」は、本明細書において企図される組成物および方法を使用して生成される遺伝子改変された細胞を指す。特定の実施形態では、薬物製品は、遺伝子改変された造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４^＋細胞を含む。遺伝子改変された造血幹細胞または前駆細胞は、造血細胞系統全体を生じる。特定の実施形態では、薬物製品は、遺伝子改変された免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を含む。

【0375】

特定の実施形態では、編集される細胞は、非機能的または破壊された、切除された、もしくは部分的に欠失したＷＡＳ遺伝子を含み、これにより、ＷＡＳｐ発現を低減するか、または取り除き、低いＷＡＳｐ発現または存在しないＷＡＳｐ発現と関連する状態を引き起こす。

【0376】

特定の実施形態では、ゲノム編集された細胞は、非機能的または破壊された、切除された、もしくは部分的に欠失したＷＡＳ遺伝子を含み、これにより、内因性ＷＡＳｐ発現を低減するか、または取り除き、免疫系障害、血小板減少症、湿疹、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、またはＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）を含むが、これらに限定されない、ＷＡＳの少なくとも一つの症状を治療する、予防する、または改善する機能的ＷＡＳｐをコードする、ＷＡＳ遺伝子に挿入された、ポリヌクレオチドをさらに含む。

【0377】

特定の実施形態では、ゲノム編集された造血幹細胞または前駆細胞は、ＷＡＳを有すると診断された対象、または有することが疑われる対象に対する治癒療法、予防療法、または回復療法を提供する。

【0378】

様々な実施形態では、ゲノム編集組成物は、インビボでの遺伝子療法を必要とする対象の細胞、組織、または器官、例えば、骨髄への直接注射によって投与される。様々な他の実施形態では、細胞は、本明細書において企図されるリプログラミングされたヌクレアーゼを用いてインビトロまたはエクスビボで編集され、任意選択で、エクスビボで拡大される。次いで、ゲノム編集された細胞は、療法を必要とする対象に投与される。

【0379】

本明細書において企図されるゲノム編集方法における使用に好ましい細胞としては、自己／自己の遺伝子（「自分自身」）細胞、好ましくは、造血細胞を含む。特定の実施形態では、造血幹細胞または前駆細胞、例えばＣＤ３４^＋細胞が好ましい。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞が好ましい。

【0380】

本明細書で使用される場合、用語「個体」および「対象」は、しばしば代替的に用いられ、リプログラミングされたヌクレアーゼ、ゲノム編集組成物、遺伝子療法ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および方法を用いて治療され得るＷＡＳの症状を示す、任意の動物を指す。適切な対象（例えば、患者）は、研究室動物（マウス、ラット、ウサギ、もしくはモルモットなど）、家畜、および飼育動物またはペット（ネコもしくはイヌなど）を含む。非ヒト霊長類、および好ましくは、ヒト対象が含まれる。典型的な対象には、ＷＡＳを有する、ＷＡＳを有すると診断されたか、またはＷＡＳを有するリスクがあるヒト患者が含まれる。

【0381】

本明細書において使用される場合、用語「患者」は、本明細書において他で企図される、リプログラミングされたヌクレアーゼ、ゲノム編集組成物、遺伝子療法ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および方法を用いて治療され得る、ＷＡＳまたはＷＡＳ遺伝子における変異によって引き起こされる状態と診断されている対象を指す。

【0382】

本明細書において使用される場合、「治療」または「治療すること」は、ＷＡＳまたはＷＡＳ遺伝子における変異によって引き起こされる状態の症状または病態に対する任意の有益または所望の効果を含み、一つまたは複数の測定可能なマーカーの最小の低減さえ含み得る。治療は、任意選択で、ＷＡＳの進行の遅延を含み得る。「治療」は、必ずしも、ＷＡＳ、またはそれらの関連する症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。

【0383】

本明細書で使用される場合、「予防する」および「予防」、「予防された」、「予防すること」などのような類似の語句は、ＷＡＳまたはＷＡＳ遺伝子における変異によって引き起こされる状態の出現または再発の可能性を妨げる、阻害する、または低減するためのアプローチを示す。これはまた、ＷＡＳの発症もしくは再発を遅らせること、またはＷＡＳの出現または再発を遅らせることも指す。本明細書で使用される場合、「予防」および類似の語句はまた、その発症または再発前のＷＡＳの強度、作用、症状および／または負荷の低減を含む。

【0384】

本明細書で使用される場合、語句「の少なくとも一つの症状を回復させる」は、ＷＡＳの一つまたは複数の症状を減少することを指す。特定の実施形態では、改善されるＷＡＳの一つまたは複数の症状としては、気管支炎（気道感染）、慢性下痢、結膜炎（目の感染）、中耳炎（中耳感染）、肺炎（肺感染）、副鼻腔炎（副鼻腔感染）、皮膚感染、上気道感染を含むが、これらに限定されない、一般的な感染；細菌、ウイルス、および他の微生物に起因した感染；ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎球菌（ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、およびブドウ球菌感染を含むが、これらに限定されない、細菌感染；湿疹；微量血小板減少症；Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）およびＸ連鎖性好中球減少症（ＸＬＮ）；ならびに白血病およびリンパ腫を含む癌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0385】

本明細書で使用される場合、用語「量」は、臨床結果を含む、有益もしくは所望の予防または治療結果を達成するのに十分なヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「有効な量」または「有効量」を指す。

【0386】

「予防有効量」は、望ましい予防結果を達成するために十分なヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の量を指す。典型的には、しかし必ずしもそうではないが、予防用量は、疾患の早期段階前または早期段階において対象において使用されるので、予防有効量は、治療上有効量よりも少ない。

【0387】

ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「治療上有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を誘発する能力などの因子に応じて変動し得る。治療上有効量はまた、任意の毒性または有害な作用が、治療上有益な作用が凌ぐものである。用語「治療上有効量」は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効である量を含む。治療量が示されるとき、投与されるべき、特定の実施形態で企図される組成物の正確な量は、本明細書に照らし、患者（対象）の年齢、体重、症状の程度、および状態における個体差を考慮して、医師によって決定され得る。

【0388】

ゲノム編集された細胞は、骨髄切除療法を受けているか受けていない個体において、骨髄または脊髄血移植の一部として投与されてもよい。一実施形態では、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞は、化学切除または放射線切除骨髄療法を受けた個体への骨髄移植において投与される。

【0389】

一実施形態では、ゲノム編集された細胞の用量は、対象に静脈内送達される。好ましい実施形態では、ゲノム編集された造血幹細胞は、対象に静脈内投与される。他の好ましい実施形態では、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、対象に静脈内投与される。

【0390】

一つの例示的な実施形態では、対象にもたらされるゲノム編集された細胞の有効量は、すべての中間にある細胞用量を含む、少なくとも２×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０^６細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０^６細胞／ｋｇ、もしくは少なくとも１０×１０^６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇである。

【0391】

別の例示的な実施形態では、対象にもたらされるゲノム編集された細胞の有効量は、すべての中間にある細胞用量を含む、約２×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ、約６×１０^６細胞／ｋｇ、約７×１０^６細胞／ｋｇ、約８×１０^６細胞／ｋｇ、約９×１０^６細胞／ｋｇ、もしくは約１０×１０^６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇである。

【0392】

別の例示的な実施形態では、対象にもたらされるゲノム編集された細胞の有効量は、すべての中間にある細胞用量を含む、約２×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約３×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約４×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、約５×１０^６細胞／ｋｇ～約１０×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ×約６×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、２×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、３×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、４×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約６×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約７×１０^６細胞／ｋｇ、５×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇ、または６×１０^６細胞／ｋｇ～約８×１０^６細胞／ｋｇである。

【0393】

投薬量におけるいくらかの変動は、治療されている対象の状態に応じて必然的に生じる。投与の責任者は、いずれにしても、個々の対象に適切な用量を決定する。

【0394】

特定の実施形態では、内因性ＷＡＳｐ発現をほとんどもたらさないか、またはもたらさないＷＡＳ遺伝子における１個または複数の変異および／または欠失を有する対象に、治療上有効量の本明細書において企図されるゲノム編集された細胞を投与することを含む、ゲノム編集された細胞療法を使用して、ＷＡＳ、またはそれと関連する状態を治療する、予防する、または改善する。一実施形態では、ゲノム編集された細胞療法は、機能的内因性ＷＡＳｐ発現を欠くが、ＷＡＳｐの機能的コピーをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0395】

様々な実施形態では、対象は、対象におけるＷＡＳｐ発現を増大するのに有効な、機能的ＷＡＳｐをコードする外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム編集された細胞の量が投与される。特定の実施形態では、ＷＡＳ遺伝子における１個または複数の有害な変異または欠失を含むゲノム編集された細胞における外因性ポリヌクレオチドからのＷＡＳｐ発現の量は、内因性ＷＡＳｐ発現と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、もしくは少なくとも約１０００倍、またはそれ以上増大される。

【0396】

当業者は、適当な投与経路および本明細書において企図されるゲノム編集された細胞を含む組成物の有効量である正しい投薬量を決定するために、慣習的な方法を使用することができる。また、ある特定の療法において、本明細書において企図される医薬組成物の複数回の投与が、療法を果たすために必要とされ得ることを認識することは、当業者に知られている。

【0397】

ゲノム編集された造血幹細胞および前駆細胞療法を用いた治療に適している対象を治療するために使用される主要な方法の一つは、輸血である。したがって、本明細書において企図される組成物および方法の主な目標の一つは、輸血の回数を低減するか、または輸血の必要性を排除することである。

【0398】

特定の実施形態では、薬物製品は、１回投与される。

【0399】

ある特定の実施形態では、薬物製品は、１年、２年、５年、１０年、またはそれ以上の期間にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上投与される。

【0400】

本明細書において引用されるすべての刊行物、特許出願、および登録された特許は、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許出願、または登録された特許が、参照により取り込まれることを具体的かつ個々に示されたかのように、参照により本明細書に取り込まれる。

【0401】

前述の実施形態は、明確な理解の目的で、説明および例示によって幾分詳細に記載されたが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、ある特定の変更および修正がなされ得ることは、本明細書において企図される教示に照らして、当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、説明のみのため提供され、限定のため提供されるものではない。当業者は、本質的に類似する結果をもたらすよう変更または修正され得る様々な非臨界パラメータを容易に認識するであろう。

【実施例】

【0402】

実施例１
ヒトＷＡＳ遺伝子のイントロン２における標的部位へのＩ－ＯｎｕＩのリプログラミング
ＤＮＡ認識境界面における可変アミノ酸残基を含有するモジュラーライブラリーを構築することによって、ヒトウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子（図１Ａおよび１Ｂ）の第二のイントロンにおける標的部位に、Ｉ－ＯｎｕＩをリプログラミングした。バリアントを構築するために、縮重コドンを、オリゴヌクレオチドを使用してＩ－ＯｎｕＩ ＤＮＡ結合ドメインに組み込んだ。縮重コドンをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲ鋳型として使用して、酵母株Ｓ．セレビシアにおいてギャップ組み換えによってバリアントライブラリーを生成した。それぞれのバリアントライブラリーは、Ｎ末端またはＣ末端Ｉ－ＯｎｕＩ ＤＮＡ認識ドメインのいずれかに渡り、約１０^７～１０^８個の固有の形質転換体を含有した。得られた表面提示ライブラリーを、対応するドメインの半分の部位を含む標的部位に対する切断活性について、フローサイトメトリーによりスクリーニングした。

【0403】

Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインのリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＨＥを提示する酵母を精製し、プラスミドＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応を行い、リプログラミングされたドメインを増幅し、続いて、Ｓ．セレビシアに形質転換して、リプログラミングされたドメイン組み合わせのライブラリーを創出した。ＷＡＳ遺伝子に存在する完全な標的部位（配列番号２７）を認識する完全にリプログラムされたＩ－ＯｎｕＩバリアントを、このライブラリーから同定し、精製した。

【0404】

実施例２
ヒトＷＡＳ遺伝子のイントロン２を効率的に標的にする、リプログラムされたＩ－ＯｎｕＩホーミングエンドヌクレアーゼおよびｍｅｇａＴＡＬ
最初のスクリーニングにおいて同定した、ＷＡＳ遺伝子標的部位を標的とするリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＨＥ上でランダム変異誘発を行うことによって、二次Ｉ－ＯｎｕＩバリアントライブラリーを生成した。加えて、熱ショック後（４５℃で３０分間）、結合および切断条件下で表示ベースのフローソーティングを行い、熱安定性が向上したバリアントを単離しようとした。図２Ａおよび２Ｂ。

【0405】

二次Ｉ－ＯｎｕＩバリアントライブラリーからのＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアント（例えば、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントＶ６、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントＶ１２、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントＶ１８、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントＶ３５、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントＶ３７、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントＶ５５）の選択により、定量を用いて酵母表面提示システムにおいてＷＡＳ標的部位に結合し、切断する能力を示した。図２Ｃおよび２Ｄ。

【0406】

ＷＡＳ遺伝子におけるイントロン２を標的とするＩ－ＯｎｕＩ ＨＥの活性を、染色体に組み込んだ蛍光レポーターシステム（Ｃｅｒｔｏ ｅｔ．ａｌ．，２０１１）を使用して測定した。ＷＡＳ標的配列に結合し、切断する完全にリプログラミングされたＩ－ＯｎｕＩ ＨＥを、ＨＥをｍｅｇａＴＡＬとして再配列する哺乳類発現プラスミドにクローニングし、ＢＦＰに連結させ（発現を正規化するために）、次いで、蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードするアウトオブフレーム遺伝子の上流に、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ標的配列を含有するよう操作したＨＥＫ ２９３Ｔ線維芽細胞の細胞株に個々に遺伝子導入した。インビボで、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ部位は、ＷＡＳ遺伝子の第一エクソンの３０ｂｐ下流かつＡＴＧ翻訳開始コドン（図１Ｂ）の１６２ｂｐ下流に局在している。ｍｅｇａＴＡＬによる埋め込み標的部位の切断、および続く、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介したＤＮＡ修復によって引き起こされる、小さな挿入または欠失の続く蓄積は、蛍光レポーター遺伝子を「インフレーム」に戻す三つの修復された遺伝子座のおよそ一つをもたらす。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、染色体に組み込まれた標的配列におけるエンドヌクレアーゼ活性の読み取りである。

【0407】

ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ｍｅｇａＴＡＬに対する結合親和性を最適化するため、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ１１を、１１～１５個のＲＶＤを含有する一連のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに融合させた。図３Ａ。遺伝子導入したバリアントの発現レベルは、これらの５つのコンストラクトにわたって一貫していた。図３Ｂ。１２個のＲＶＤを有するＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ１１ ｍｅｇａＴＡＬ酵素は、ＴＬＲ細胞株において最も高い活性を示し（図３Ｃ）、したがって、１２個のＲＶＤ構造を、代替的なＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ酵素の試験のための標準として使用した。

【0408】

複数のリプログラミングされたＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ｍｅｇａＴＡＬ（例えば、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ６ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ１２ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ１８ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３７ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ５５ ｍｅｇａＴＡＬ）は、ＷＡＳ標的部位に結合し、切断する能力を示し（部位上のヌクレアーゼ切断活性と一致する細胞染色体状況において増大したｍＣｈｅｒｒｙ発現を示し）、それらの切断効率は、三つの初代修復エキソヌクレアーゼ２（Ｔｒｅｘ２；Ｔｘ２）の共発現によって有意に増大した。図３Ｄおよび３Ｅ。

【0409】

図３Ｆは、リプログラミングされたＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ＨＥバリアントが、ヒト初代細胞におけるＷＡＳ標的部位を切断することを示す。ヒト初代細胞におけるＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ ｍｅｇａＴＡＬの切断効率を比較するために、六つの選択したＩ－ＯｎｕＩ ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡコンストラクト（ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ６ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ１２ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ１８ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３７ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ５５ ｍｅｇａＴＡＬ）を、ヒト初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞に電気メッキした。ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ標的部位でのＮＨＥＪ率は、５日目のＣＲＩＳＰＲ編集推論（ＩＣＥ）解析（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって決定した。提示したデータは、標準誤差を有する３人の健康な対照の男性ドナーからの三つの独立した実験の平均であり、％ＮＨＥＪ率８～３０％を示す。

【0410】

実施例３
ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬは
ヒト初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞において相同組み換え修復（ＨＤＲ）を誘導する
六つの選択したＩ－ＯｎｕＩ ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡコンストラクト（ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ６ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ１２ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ１８ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３７ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ５５ ｍｅｇａＴＡＬ）をヒト初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞に電気メッキして、ドナー鋳型を有するｒＡＡＶ６を使用してＨＤＲを誘導するそれらの能力を比較した。図４Ａは、実験アプローチを説明する。細胞生存率（フローサイトメトリーフォワードおよび側方散乱ゲーティングに基づく）およびＨＤＲ（ＧＦＰ発現に基づく）のパーセンテージを、ｍＲＮＡ遺伝子導入およびＡＡＶ形質導入の２日後および１５日後にフローサイトメトリーによって測定した。図４Ｂは、ＧＦＰ発現ＡＡＶドナー鋳型の構造を示す。ＨＥ切断部位は、ドナー鋳型を切断不能にするために、ＡＡＶ ５’末端相同アームと３’末端相同アーム（それぞれのアームにおける部分配列）の間に位置する。図４Ｃは、２日目および１５日目のＣＤ４^＋Ｔ細胞の生存率を示し、図４Ｄは、ｍＲＮＡ遺伝子導入およびＡＡＶ形質導入の２日後および１５日後でのＧＦＰ発現を示す。ＧＦＰ陰性細胞のＮＨＥＪ率を、ＣＲＩＳＰＲ編集推論（ＩＣＥ）解析（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって決定し、それぞれ、ｍｅｇａＴＡＬ酵素の下に列挙した。評価したｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡコンストラクトの中で、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬは、初代ＣＤ４^＋Ｔ細胞における最高レベルのＮＨＥＪおよびＨＤＲを示した。示したデータは、健康な対照の男性ドナーからの一つの実験である。

【0411】

実施例４
ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬは、初代ヒトＣＤ３４^＋細胞においてＨＤＲを誘導する
六つの選択したＩ－ＯｎｕＩ ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡコンストラクト（ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ６ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ１２ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ１８ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３７ ｍｅｇａＴＡＬ、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ５５ ｍｅｇａＴＡＬ）をヒト初代ＣＤ３４^＋細胞に電気メッキして、ＤＮＡドナー鋳型を有するｒＡＡＶ６を使用してＨＤＲを誘導するそれらの能力を比較した。ｒＡＡＶ６コンストラクトは、図４において説明するドナーと同一であった。図５Ａは、一般的な実験アプローチを説明する。細胞を、ｍＲＮＡ１μｇを用いて遺伝子導入し、代替量（１～３％培養体積の範囲にある）のｒＡＡＶ６ドナーを用いて形質導入した。細胞生存率（フローサイトメトリーフォワードおよび側方散乱ゲーティングに基づく）およびＨＤＲ（ＧＦＰ発現に基づく）のパーセンテージを、ｍＲＮＡ遺伝子導入およびＡＡＶ形質導入の１日後および５日後にフローサイトメトリーによって測定した。図５Ｂは、１日目および５日目のＣＤ３４＋細胞の生存率を示し、図５Ｃは、ｍＲＮＡ遺伝子導入およびＡＡＶ形質導入の１日後および５日後でのＧＦＰ発現を示す。実施例３で行ったヒトＣＤ４^＋ Ｔ細胞実験と一致して、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬは、初代ヒトＣＤ３４^＋ ＨＳＣにおいてより高いＨＤＲ率を誘導することによって、他のバリアントよりも優れた性能を示した。示したデータは、単一のドナーを使用した二つの独立した実験を表すものである。

【0412】

実施例５
ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬは
初代ヒトＣＤ３４^＋細胞における高効率ＨＤＲを誘導する
実施例３および４の結果に基づき、動員したヒト初代ＣＤ３４^＋造血幹細胞および前駆細胞における追加試験のため、ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬを選択した。動員したヒト初代ＣＤ３４^＋細胞を、ｍＲＮＡ１μｇを用いて遺伝子導入し、２％培養体積のｒＡＡＶ６ドナーを用いて形質導入した。細胞生存率（フローサイトメトリーフォワードおよび側方散乱ゲーティングに基づく）およびＨＤＲ（ＧＦＰ発現に基づく）のパーセンテージを、それぞれ、図６Ａおよび図６Ｂ中の代表的パネルに示すフローサイトメトリーによって測定した。図６Ｃは、１日目および５日目のＣＤ３４^＋細胞の生存率を示し、図６Ｄは、ｍＲＮＡ遺伝子導入およびｒＡＡＶ形質導入の１日後および５日後でのＧＦＰ発現を示す。ｒＡＡＶ形質導入のみ（ｍｅｇａＴＡＬ共送達なし）を対照として使用して、非ＨＤＲ ＧＦＰバックグラウンドを測定した。示したデータは、標準誤差を有する健康な対照男性ドナー二名からの四つの独立した実験の平均である。

【0413】

ＧＦＰ陰性（非ＨＤＲ）細胞のＮＨＥＪ率を、ＣＲＩＳＰＲ編集推論（ＩＣＥ）解析（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって決定し、標準誤差を有する、それぞれ異なる条件下に列挙した。図６Ｄ。同じ試料のＨＤＲ率も、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって測定し、ＧＦＰ発現に基づき、フローサイトメーターによって測定したＨＤＲ率と比較した。図６Ｅ。二つの方法は、ＨＤＲの分子量と発現ＧＦＰタンパク質の間の強い相関を示す。示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した試料からのＧＦＰおよびｄｄＰＣＲによって測定したＨＤＲの平均比である。

【0414】

ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡとｒＡＡＶ６ドナーの両方を用いて処理した試料におけるＮＨＥＪ率に対するＨＤＲ率の比を計算した。図６Ｆ。これらの所見は、ＣＤ３４^＋細胞におけるＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬを使用した好ましいＨＤＲ：ＮＨＥＪ比を示す。示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した実験の平均である。

【0415】

ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ仲介性ＨＤＲを通じてＷＡＳ遺伝子座内の内因性プロモーターの制御下で機能的なＷＡＳ ｃＤＮＡを発現させるために、図６Ｇに示す通り、コドン最適化（配列番号４５）または野生型（配列番号４６）ｃＤＮＡ配列のいずれかを有するｍｅｇａＴＡＬ特異的ＷＡＳ ｃＤＮＡ ｒＡＡＶ６ベクターを構築した。配列番号４５は、配列番号４６（０．５６ｋｂの５’相同アーム）と比較して、わずかに長い５’相同アーム（０．６９ｋｂ）を含有し、エクソン１における配列とＷＴ ｃＤＮＡ配列との間の完全一致のため、より短い欠失（４１ｂｐ対１７２ｂｐ）を含有する。このより小さい欠失は、コドン最適化ＷＡＳ ｃＤＮＡ ＡＡＶを使用することより、配列番号４５を使用したより高いレベルのＨＤＲを可能にする。両方のＡＡＶドナーは、図５Ａに概説する実験アプローチを使用して、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＣにおいて試験している。ＨＤＲおよびＮＨＥＪ率を、それぞれ、ｄｄＰＣＲおよびＩＣＥ解析によって決定する。

【0416】

これらのデータは共に、操作したＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ試薬を使用してヒトＣＤ３４^＋造血幹細胞および前駆細胞におけるＷＡＳ遺伝子座の効率的な編集を示す。

【0417】

実施例６
ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬは、合わせた標的部位を有するレポーター細胞においてＷＡＳ ＴＡＬＥＮおよびＷＡＳ ＲＮＰよりも高いＨＤＲ：ＮＨＥＪ比を誘導する
ＷＡＳ Ｉ－ＯｎｕＩ Ｖ３５ ｍｅｇａＴＡＬ仲介性遺伝子編集を、ＳＣＲＡで開発された他の酵素（ＷＡＳ ＴＡＬＥＮおよびＷＡＳ ＲＮＰ）と比較するために、ＨＥＫ ２９３Ｔ線維芽細胞の細胞株を操作して、蛍光ＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子の真ん中に、合わせたＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ（ＭＴ）、ＷＡＳ ＴＡＬＥＮ（ＴＡ）およびＷＡＳ ＲＮＰ（ＲＮＰ）標的配列を含有させた。ｒＡＡＶ６形質導入によって送達させる切断ＧＦＰドナー鋳型の存在下で、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬ ｍＲＮＡ、ＷＡＳ ＴＡＬＥＮ ｍＲＮＡまたはＷＡＳ ＲＮＰ遺伝子導入によって誘導した二本鎖切断（ＤＳＢ）は、それぞれ、ＧＦＰ発現およびＣＲＩＳＰＲ編集推論（ＩＣＥ）解析（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ）によって決定する、ＨＤＲまたはＮＨＥＪのいずれかによって修復する（図７Ａ）。

【0418】

図７Ｂは、酵素遺伝子導入およびＡＡＶ形質導入の４日後の細胞の生存率を示す。示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した実験の平均である。図７Ｃは、処理後の対応する標的部位におけるＮＨＥＪ率を示す。ｒＡＡＶを伴う、または伴わないＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬで処理した試料のＮＨＥＪ率は、Ｔｒｅｘ２（ＴＸ２）タンパク質の共発現によって有意に増大し、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬによって誘導したＤＳＢの大部分を、ＮＨＥＪを引き起こすことなく正確な自己アニーリングによって修復することを示す。示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した実験の平均である。図７Ｄは、酵素およびｒＡＡＶ６で処理した細胞のＧＦＰ発現を示す。示したデータは、標準誤差を有する三つの独立した実験の平均である。三つの異なる酵素の相対的なＨＤＲ：ＮＨＥＪ比（ＷＡＳ ＲＮＰの比を１と設定する）を、図７Ｅに示し、これは、ＷＡＳ ｍｅｇａＴＡＬが、レポーター細胞において評価したのと同じ条件下で、ＷＡＳ ＴＡＬＥＮおよびＷＡＳ ＲＮＰよりも有意に高いＨＤＲ：ＮＨＥＪ比を誘導する可能性を有することを示している。図７Ｆは、図７Ｃに示す、ｍｅｇａＴＡＬとのＴｒｅｘ２と共発現後にＮＨＥＪ率の増大と対照的である知見である、ｍｅｇａＴＡＬとのＴｒｅｘ２の共発現が、ｒＡＡＶの存在下でＧＦＰ発現によって測定したＨＤＲ率を増大させないことを示す。

【0419】

一般的に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲において開示された特定の実施形態に限定するものとして解釈されるべきではないが、このような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共に、すべての可能な実施形態を含むものとして解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。

【図1A】

【図1B】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7-1】

【図7-2】

【配列表】

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【国際調査報告】