特表 2022-530678 短縮センス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-30

(54)【発明の名称】短縮センス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20220623BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20220623BHJP

   A61K 31/7115 20060101ALI20220623BHJP

   A61K 31/7125 20060101ALI20220623BHJP

   A61K 31/712 20060101ALI20220623BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220623BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220623BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z

A61K31/713

A61K31/7115

A61K31/7125

A61K31/712

A61P43/00 105

A61P43/00 111

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021564975

(86)(22)【出願日】2020-04-29

(85)【翻訳文提出日】2021-11-02

(86)【国際出願番号】 US2020030398

(87)【国際公開番号】W WO2020226960

(87)【国際公開日】2020-11-12

(31)【優先権主張番号】62/842,908

(32)【優先日】2019-05-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521359667

【氏名又は名称】ディセルナ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100183379

【弁理士】

【氏名又は名称】藤代 昌彦

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン ボブ デール

(72)【発明者】

【氏名】ワン ウェイミン

(72)【発明者】

【氏名】ナゼフ ネイム

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB211

4C084ZC411

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZB21

4C086ZC41

(57)【要約】

本明細書では、ステムループ構造をもつ短縮センス鎖、及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子が提供される。標的遺伝子発現を低減するための方法及び組成物、ならびに対象となる疾患を治療するための方法及び組成物も提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１５～４３ヌクレオチドを含み、且つ第１の領域（Ｒ１）及び第２の領域（Ｒ２）を有するセンス鎖と、
１８～３５ヌクレオチドならびに５’及び３’末端を含むアンチセンス鎖であって、前記３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記センス鎖と別個の鎖である前記アンチセンス鎖と、
前記センス鎖の前記第１の領域及び前記アンチセンス鎖によって形成される第１の二重鎖（Ｄ１）であって、長さが８～２９塩基対である前記第１の二重鎖と
を含み、
前記センス鎖の前記第２の領域が、第１の小領域（Ｓ１）、第２の小領域（Ｓ２）、及び前記第１及び第２の小領域を結合する一本鎖ループを含み、前記第１及び第２の小領域が第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、
前記第２の二重鎖は、長さが６塩基対であり、且つＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含まないか、または、長さが１～５塩基対であり、且つ少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む、
二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項2】

ａ）前記センス鎖が１５～３０ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が２０ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが１０～１４塩基対であるか、
ｂ）前記センス鎖が１６～３１ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が２１ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが１１～１５塩基対であるか、
ｃ）前記センス鎖が１７～３２ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が２２ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが１２～１６塩基対であるか、
ｄ）前記センス鎖が１８～３３ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が２３ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが１３～１７塩基対であるか、
ｅ）前記センス鎖が１９～３４ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が２４ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが１４～１８塩基対であるか、
ｆ）前記センス鎖が２０～３５ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が２５ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが１５～１９塩基対であるか、
ｇ）前記センス鎖が２１～３６ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が２６ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが１６～２０塩基対であるか、
ｈ）前記センス鎖が２２～３７ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が２７ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが１７～２１塩基対であるか、
ｉ）前記センス鎖が２３～３８ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が２８ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが１８～２２塩基対であるか、
ｊ）前記センス鎖が２４～３９ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が２９ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが１９～２３塩基対であるか、
ｋ）前記センス鎖が２５～４０ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が３０ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが２０～２４塩基対であるか、
ｌ）前記センス鎖が２６～４１ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が３１ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが２１～２５塩基対であるか、
ｍ）前記センス鎖が２７～４２ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が３２ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが２２～２６塩基対であるか、または
ｎ）前記センス鎖が２８～４３ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が３３ヌクレオチド、及び前記３’末端に前記６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、前記第１の二重鎖の長さが２３～２７塩基対である、
請求項１に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項3】

前記アンチセンス鎖が２０～２４、２１～２３、または２２ヌクレオチドを有する、請求項１または２に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項4】

前記アンチセンス鎖の前記３’末端が７～９ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項5】

前記第１の二重鎖の長さが１２～１６塩基対である、請求項１～４のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項6】

前記ループがテトラループまたはトリループである、請求項１～５のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項7】

前記アンチセンス鎖中の少なくとも１つのヌクレオチドが２’－Ｆで修飾され、前記アンチセンス鎖中の前記２’－Ｆで修飾された前記少なくとも１つのヌクレオチドが、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している、請求項１～６のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項8】

前記アンチセンス鎖のヌクレオチド１４が２’－Ｆで修飾され、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合によって前記アンチセンス鎖のヌクレオチド１３及び１５に結合し、及び／または前記アンチセンス鎖のヌクレオチド２が２’－Ｆで修飾され、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合によって前記アンチセンス鎖のヌクレオチド１及び３に結合している、請求項１～７のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項9】

前記アンチセンス鎖が、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合に隣接する２’－Ｆで修飾された少なくとも２つのヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項10】

前記リン含有ヌクレオチド間結合がホスホロチオアート結合である、請求項７～９のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項11】

前記センス鎖の領域１が少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項12】

前記センス鎖のヌクレオチド１がＴ_mを上昇させるヌクレオチドである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項13】

前記センス鎖の領域１が最大３つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項14】

前記アンチセンス鎖のヌクレオチド６と塩基対を形成する前記センス鎖の領域１中のヌクレオチドがＴ_mを上昇させるヌクレオチドであり、且つ／または前記アンチセンス鎖のヌクレオチド５と塩基対を形成する前記センス鎖の領域１中のヌクレオチドがＴ_mを上昇させるヌクレオチドである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項15】

前記アンチセンス鎖のヌクレオチド１～４と塩基対を形成する前記センス鎖の領域１中のヌクレオチドのいずれもがＴ_mを上昇させるヌクレオチドではない、請求項１～１４のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項16】

前記第２の二重鎖の長さが１～３塩基対であり、前記第２の二重鎖が少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項17】

前記第２の二重鎖が２～１０個のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、且つ前記第２の二重鎖の長さが１～５塩基対であるか、または前記第２の二本鎖が２～６個のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、且つ前記第２の二本鎖の長さが１～３塩基対である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項18】

前記センス鎖の長さが１６～３３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の長さが２１～２３ヌクレオチドであり、前記第１の二重鎖の長さが１２～１７塩基対であり、前記第２の二重鎖の長さが１～３塩基対であり、前記第２の二重鎖が少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項19】

前記センス鎖の前記第１の領域の長さが１２～１６ヌクレオチドであり、前記センス鎖の前記第２の領域の長さが５～１０ヌクレオチドであり、
前記センス鎖の前記第１の領域と前記アンチセンスによって形成される前記第１の二重鎖の長さが１２～１６塩基対であり、
前記センス鎖の前記第２の領域の前記第１及び第２の核酸によって形成される前記第２の二重鎖の長さが、３塩基対、２塩基対、または１塩基対であり、前記第２の二重鎖が少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、
前記アンチセンス鎖は、長さが２２ヌクレオチドであり、その３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項20】

前記センス鎖の前記第２の領域の長さが５または６ヌクレオチドであり、前記第２の二重鎖の長さが１塩基対である、請求項１９に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項21】

前記第２の二重鎖が少なくとも２つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項22】

前記テトラループが、ＵＮＣＧ、ＧＮＲＡ、ＣＵＵＧ、Ａ／ＵＧＮＮ、ＧＧＵＧ、ＲＮＹＡ、もしくはＡＧＮＮから選択されるＲＮＡテトラループ、またはｄ（ＧＮＡＢ）、ｄ（ＣＮＮＧ）、もしくはｄ（ＴＮＣＧ）から選択されるＤＮＡテトラループである、請求項１～２１のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項23】

前記テトラループが配列ＧＡＡＡを有する、請求項１～２２のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項24】

前記トリループが配列ＧＡＡを有する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項25】

前記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドが、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、Ｇクランプ及びその類似体、ヘキシトールヌクレオチド、及び修飾ヌクレオチドからなる群より選択され、前記修飾ヌクレオチドは、糖部分の２’炭素において２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅで修飾されていない、請求項１～２４のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項26】

前記修飾ヌクレオチドが、５－ブロモ－ウラシル、５－ヨード－ウラシル、５－プロピニル修飾ピリミジン、２－アミノアデニン、２－チオウリジン、５Ｍｅ－チオウリジン、またはシュードウリジンである、請求項１～２５のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項27】

前記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドが二環式ヌクレオチドである、請求項１～２６のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項28】

前記二環式ヌクレオチドが、フラノシルである第１の環と、前記フラノシルの２’炭素と４’炭素を連結して第２の環を形成する架橋とを含む、請求項２７に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項29】

前記フラノシルの２’炭素と４’炭素を連結する前記架橋が、
ａ）例えば、４’－ＣＨ₂－ＮＨ－Ｏ－２’（ＢＮＡ^NCとしても知られる）または４’－ＣＨ₂－Ｎ（ＣＨ₃）－Ｏ－２’（ＢＮＡ^NC［ＮＭｅ］としても知られる）を含む、４’－ＣＨ₂－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’及び４’－ＣＨ₂－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、ＲはＨ、Ｃ₁～Ｃ₁₂アルキル、または保護基である）と、
ｂ）４’－ＣＨ₂－２’、４’－（ＣＨ₂）₂－２’、４’－（ＣＨ₂）₃－２’、４’－（ＣＨ₂）－Ｏ－２’（ＬＮＡとしても知られる）、４’－（ＣＨ₂）－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ₂）₂－Ｏ－２’（ＥＮＡとしても知られる）、４’－ＣＨ（ＣＨ₃）－Ｏ－２’（ｃＥｔとしても知られる）、及び４’－ＣＨ（ＣＨ₂ＯＣＨ₃）－Ｏ－２’（ｃＭＯＥとしても知られる）、ならびにそれらの類似体と、
ｃ）４’－Ｃ（ＣＨ₃）（ＣＨ₃）－Ｏ－２’及びその類似体と、
ｄ）４’－ＣＨ₂－Ｎ（ＯＣＨ₃）－２’及びその類似体と、
ｅ）４’－ＣＨ₂－Ｏ－Ｎ（ＣＨ₃）－２’及びその類似体と、
ｆ）４’－ＣＨ₂－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ₃）－２’及びその類似体と、
ｇ）４’－ＣＨ₂－Ｃ（＝ＣＨ₂）－２’及びその類似体と
からなる群より選択される、請求項２８に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項30】

前記テトラループまたはトリループが、少なくとも１つのリガンドコンジュゲートヌクレオチドを含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項31】

前記テトラループが２つ、３つ、または４つのリガンドコンジュゲートヌクレオチドを含むか、または前記トリループが２つまたは３つのコンジュゲートヌクレオチドを含む、請求項３０に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項32】

前記リガンドがＧａｌＮＡｃである、請求項３０または３１に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項33】

前記ＧａｌＮＡｃが糖部分の２’位において前記ヌクレオチドにコンジュゲートしている、請求項３２に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項34】

前記センス鎖及び／または前記アンチセンス鎖の５’末端に５’－リン酸模倣物をさらに含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項35】

前記二本鎖核酸阻害剤分子が脂質ナノ粒子を用いて製剤化される、請求項１～３４のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項36】

前記脂質ナノ粒子がコア脂質及びエンベロープ脂質を含み、前記コア脂質が第１のカチオン性脂質及び第１のペグ化脂質を含み、前記エンベロープ脂質が、第２のカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、及び第２のペグ化脂質を含む、請求項３５に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項37】

前記第１のカチオン性脂質がＤＬ－０４８であり、前記第１のペグ化脂質がＤＳＧ－ＭＰＥＧであり、前記第２のカチオン性脂質がＤＬ－１０３であり、前記中性脂質がＤＳＰＣであり、前記ステロールがコレステロールであり、前記第２のペグ化脂質がＤＳＰＥ－ＭＰＥＧである、請求項３６に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。

【請求項38】

治療有効量の請求項１～３７のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子及び賦形剤を含む組成物。

【請求項39】

前記組成物が医薬組成物であり、前記賦形剤が薬学的に許容される賦形剤である、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

対象における標的遺伝子発現の低減方法であって、請求項１～３９のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子または組成物を、標的遺伝子発現の低減を必要とする対象に、前記標的遺伝子発現を低減するのに十分な量で投与することを含む、前記方法。

【請求項41】

前記標的遺伝子が、構造遺伝子、ハウスキーピング遺伝子、転写因子をコードする遺伝子、運動性因子をコードする遺伝子、細胞周期因子をコードする遺伝子、細胞周期阻害因子をコードする遺伝子、酵素をコードする遺伝子、成長因子をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、または腫瘍抑制因子をコードする遺伝子である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記投与することが、静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与を含む、請求項４０または４１に記載の方法。

【請求項43】

前記対象がヒトである、請求項４０～４２のいずれか1項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月３日出願の米国仮特許出願第６２／８４２，９０８号の優先権を主張する。この段落で参照する前記関連出願は、その全体が本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの高分子配列（ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びそれらの類似体）である。核酸阻害剤分子は、細胞内ＲＮＡレベルを調節するオリゴヌクレオチドであり、がん、ウイルス感染症、及び遺伝性障害の治療において早い時期から有望であることが実証されている。核酸阻害剤分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含む多様な一連の機序を介してＲＮＡ発現を調節することができる。

【0003】

ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が、当該ｄｓＲＮＡに相補的な配列を有する標的遺伝子発現を阻害する、ほとんどの真核生物に見られる保存された経路である。一般的なＲＮＡｉ経路において、より長いｄｓＲＮＡはダイサー酵素によって低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）と呼ばれるより短いＲＮＡ二重鎖に切断される。上記ｓｉＲＮＡは、ダイサー、トランス活性化応答ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、及びアルゴノート２（「Ａｇｏ２」）と結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ」）と呼ばれることもある複合体を形成することが明らかになっている。Ａｇｏ２は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖とも呼ばれる）を使用して標的ｍＲＮＡ切断の配列特異性を誘導し、標的ｍＲＮＡを切断する、エンドヌクレアーゼである。

【0004】

様々な二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子構造が長年にわたって開発されてきた。例えば、ＲＮＡｉ阻害剤分子に関する初期の研究では、天然のｓｉＲＮＡを模倣する二本鎖核酸分子であって、各鎖のサイズが１９～２５ヌクレオチドであり、１～５ヌクレオチドである少なくとも１つの３’オーバーハングを有する上記二本鎖核酸分子に焦点が当てられていた（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号）。その後、より長い二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子であって、インビボでダイサー酵素によってプロセシングされて活性ＲＮＡｉ阻害剤分子となる、上記二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子が開発された（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号を参照のこと）。その後の研究により、伸長二本鎖核酸阻害剤分子であって、少なくとも一方の鎖の少なくとも一端が、上記分子の二本鎖標的指向性領域を超えて伸長し、上記鎖の一方が、熱力学的に安定化させるテトラループ構造を含む構造を含む、上記分子が開発された（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号、米国特許第８，９２７，７０５号、ＷＯ２０１０／０３３２２５、及びＷＯ２０１６／１００４０１を参照されたく、これらのそれぞれは、本記述をもって、その全体が援用される）。

【0005】

特定の例において、化学的に修飾したヌクレオチドを核酸阻害剤分子中に導入し、インビボ投与後に置かれる条件などの特定の条件下で所望される場合がある特性を導入してきた。かかる化学的に修飾されたヌクレオチドとしては、例えば、上記オリゴヌクレオチドの構造を分解するもしくは活性に干渉するヌクレアーゼまたは他の酵素に対して安定化するように、細胞による上記オリゴヌクレオチドの取り込みを増加させるように、あるいは上記オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するように設計された上記ヌクレオチドが挙げられる。

【0006】

しかしながら、新たな二本鎖核酸阻害剤分子構造を開発する、及び／またはかかる核酸阻害剤分子に所望の特性を付与するために化学的に修飾したヌクレオチドを組み込むという願望については、上記構造及び／または化学的に修飾したヌクレオチドが上記核酸阻害剤分子の活性に与える可能性があるいずれかの悪影響を最小限に抑制する（例えば、標的遺伝子ノックダウンの効力または持続時間の何らかの低下を最小限に抑制する）という競合する願望とのバランスをとらなければならない。

【発明の概要】

【0007】

本出願は、ステムループ構造をもつセンス鎖、及び別個のアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子であって、上記センス鎖の長さがその５’末端において短縮されており、その結果、上記アンチセンス鎖の３’末端により長い一本鎖オーバーハングが生じる、上記二本鎖核酸阻害剤分子に関する。本二本鎖核酸阻害剤分子は、１）センス鎖（Ｓ）の第１の領域（Ｒ１）とアンチセンス鎖（ＡＳ）との間の第１の二重鎖（Ｄ１）；２）上記ステムループ構造のステムに相当するセンス鎖の第２の領域（Ｒ２）における第２の二重鎖（Ｄ２）；３）Ｒ２の第１の小領域（Ｓ１）及び第２の小領域（Ｓ２）を連結するループを含む。図１Ａ～Ｄを参照されたい。さらに、上記ステムループ構造は一般的に、テトラループまたはトリループを含み、センス鎖の５’または３’末端に位置する。驚くべきことに、センス鎖の５’末端を、本二本鎖核酸阻害剤分子の効力を低下させることなく、実質的に短縮させることができることが見出された。例えば、例１～４を参照されたい。

【0008】

さらに、米国仮出願第６２／６５７，４２８号及び第６２／７７８，７５９号において既に示されているように、テトラループまたはトリループを含む二本鎖核酸阻害剤分子のステム二重鎖（Ｄ２）中にＴ_mを上昇させるヌクレオチド（例えば、二環式ヌクレオチド）を導入することにより、部分的に、インビボ標的ｍＲＮＡノックダウンの持続時間の延長によって証明されているように、本二本鎖核酸阻害剤分子の安定性が向上する可能性がある。本明細書では、本明細書に開示の二本鎖核酸阻害剤分子の短縮センス鎖の第１の領域（Ｒ１）中に、例えばヌクレオチド１、７、８、９、または１０の１つ以上に、追加のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを組み込むことによって、上記短縮センス鎖核酸阻害剤分子の安定性が向上する可能性があることがさらに開示される。例えば、例２及び３を参照されたい。

【0009】

一態様は、
１５～４３ヌクレオチドを含み、且つ第１の領域（Ｒ１）及び第２の領域（Ｒ２）を有するセンス鎖と、
１８～３５ヌクレオチドならびに５’及び３’末端を含むアンチセンス鎖であって、上記３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、上記センス鎖と別個の鎖である上記アンチセンス鎖と、
センス鎖の第１の領域及びアンチセンス鎖によって形成される第１の二重鎖（Ｄ１）であって、長さが８～２９塩基対である上記第１の二重鎖と
を含み、
センス鎖の第２の領域が、第１の小領域（Ｓ１）、第２の小領域（Ｓ２）、及び第１の小領域と第２の小領域を結合する一本鎖ループを含み、第１及び第２の小領域が第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、
第２の二重鎖は、長さが６塩基対であり、且つＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含まないか、または、長さが１～５塩基対であり、且つ少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む、
二本鎖核酸阻害剤分子に関する。

【0010】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は１５～３０ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２０ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは１０～１４塩基対である。

【0011】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は１６～３１ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２１ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは１１～１５塩基対である。

【0012】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は１７～３２ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２２ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは１２～１６塩基対である。

【0013】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は１８～３３ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２３ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは１３～１７塩基対である。

【0014】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は１９～３４ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２４ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは１４～１８塩基対である。

【0015】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は２０～３５ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２５ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは１５～１９塩基対である。

【0016】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は２１～３６ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２６ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは１６～２０塩基対である。

【0017】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は２２～３７ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２７ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは１７～２１塩基対である。

【0018】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は２３～３８ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２８ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは１８～２２塩基対である。

【0019】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は２４～３９ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２９ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは１９～２３塩基対である。

【0020】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は２５～４０ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む３０ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは２０～２４塩基対である。

【0021】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は２６～４１ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む３１ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは２１～２５塩基対である。

【0022】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は２７～４２ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む３２ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは２２～２６塩基対である。

【0023】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖は２８～４３ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖は、上記３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む３３ヌクレオチドを有し、第１の二重鎖の長さは２３～２７塩基対である。

【0024】

特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖は、２０～２４、２１～２３、または２２ヌクレオチドを有する。特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖は、その３’末端に７～９ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。

【0025】

特定の実施形態において、第１の二重鎖（Ｄ１）の長さは１２～１６塩基対である。

【0026】

特定の実施形態において、上記ループはテトラループまたはトリループである。

【0027】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、
２１～３２ヌクレオチドを含み、且つ第１の領域（Ｒ１）及び第２の領域（Ｒ２）を有するセンス鎖と、
２２ヌクレオチドならびに５’及び３’末端を含むアンチセンス鎖であって、上記３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有し、上記センス鎖と別個の鎖である上記アンチセンス鎖と、
上記センス鎖の第１の領域及び上記アンチセンス鎖によって形成される第１の二重鎖（Ｄ１）であって、長さが１２～１６塩基対である上記第１の二重鎖と
を含み、
上記センス鎖の第２の領域は、第１の小領域（Ｓ１）、第２の小領域（Ｓ２）、及び第１の小領域と第２の小領域を結合する一本鎖トリループまたはテトラループを含み、第１及び第２の小領域は第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、
第２の二重鎖は、長さが６塩基対であり、且つＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含まないか、または、長さが３～５塩基対であり、且つ少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。

【0028】

特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖中の少なくとも１つのヌクレオチドは２’－Ｆで修飾され、両側がホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している。特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖は、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合に隣接する２’－Ｆで修飾された少なくとも２つのヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖のヌクレオチド１４は２’－Ｆで修飾され、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合によって上記アンチセンス鎖のヌクレオチド１３及び１５に結合している。特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖のヌクレオチド２は２’－Ｆで修飾され、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合によって上記アンチセンス鎖のヌクレオチド１及び３に結合している。特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖のヌクレオチド２及び１４は２’－Ｆで修飾され、両側がホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している。特定の実施形態において、上記リン含有ヌクレオチド間結合はホスホロチオアート結合である。

【0029】

特定の実施形態において、上記センス鎖の領域１は少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチド１は二環式ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の領域１は最大３つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。

【0030】

特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖のヌクレオチド６と塩基対を形成する上記センス鎖の領域１中のヌクレオチドはＴ_mを上昇させるヌクレオチドであり、且つ／またはアンチセンス鎖のヌクレオチド５と塩基対を形成するセンス鎖の領域１中のヌクレオチドはＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド１～４と塩基対を形成するセンス鎖の領域１中のヌクレオチドのいずれもがＴ_mを上昇させるヌクレオチドではない。

【0031】

特定の実施形態において、第２の二重鎖は、長さが１～３塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第２の二重鎖は２～１０個のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、且つ第２の二重鎖の長さは１～５塩基対であるか、または第２の二本鎖は２～６個のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、且つ第２の二重鎖の長さは１～３塩基対である。

【0032】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖の長さは１６～３３ヌクレオチドであり、上記アンチセンス鎖の長さは２１～２３ヌクレオチドであり、第１の二重鎖の長さは１２～１７塩基対であり、第２の二重鎖は、長さが１～３塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。

【0033】

二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記センス鎖の第１の領域の長さは１２～１６ヌクレオチドであり、センス鎖の第２の領域は、長さが５～１０ヌクレオチドであり、トリループまたはテトラループを含み、
センス鎖の第１の領域とアンチセンスによって形成される第１の二重鎖の長さは１２～１６塩基対であり、
センス鎖の第２の領域の第１及び第２の小領域によって形成される第２の二重鎖は、長さが、３塩基対、２塩基対、または１塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、
上記アンチセンス鎖の長さは、３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２２ヌクレオチドである。

【0034】

特定の実施形態において、上記センス鎖の第２の領域の長さは５または６ヌクレオチドであり、第２の二重鎖（Ｄ２）は、長さが１塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第２の二重鎖（Ｄ２）は、少なくとも２つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。

【0035】

特定の実施形態において、上記ループはテトラループであり、上記テトラループは、ＵＮＣＧ、ＧＮＲＡ、ＣＵＵＧ、Ａ／ＵＧＮＮ、ＧＧＵＧ、ＲＮＹＡ、ＡＧＮＮから選択されるＲＮＡテトラループ、またはｄ（ＧＮＡＢ）、ｄ（ＣＮＮＧ）、もしくはｄ（ＴＮＣＧ）から選択されるＤＮＡテトラループである。特定の実施形態において、上記テトラループは配列ＧＡＡＡを有する。

【0036】

特定の実施形態において、上記ループはトリループである。特定の実施形態において、上記トリループは配列ＧＡＡを有する。

【0037】

本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、Ｇクランプ及びその類似体、ヘキシトールヌクレオチド、及び修飾ヌクレオチドからなる群より選択され、上記修飾ヌクレオチドは、糖部分の２’炭素において２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅで修飾されていない。特定の実施形態において、上記修飾ヌクレオチドは、５－ブロモ－ウラシル、５－ヨード－ウラシル、５－プロピニル修飾ピリミジン、２－アミノアデニン、２－チオウリジン、５Ｍｅ－チオウリジン、またはシュードウリジンである。

【0038】

特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、フラノシルである第１の環と、上記フラノシルの２’炭素と４’炭素を連結して第２の環を形成する架橋とを含む。

【0039】

特定の実施形態において、上記フラノシルの２’炭素と４’炭素を連結する上記架橋は、
ａ）例えば、４’－ＣＨ₂－ＮＨ－Ｏ－２’（ＢＮＡ^NCとしても知られる）または４’－ＣＨ₂－Ｎ（ＣＨ₃）－Ｏ－２’（ＢＮＡ^NC［ＮＭｅ］としても知られる）を含む、４’－ＣＨ₂－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’及び４’－ＣＨ₂－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、ＲはＨ、Ｃ₁～Ｃ₁₂アルキル、または保護基である）と、
ｂ）４’－ＣＨ₂－２’、４’－（ＣＨ₂）₂－２’、４’－（ＣＨ₂）₃－２’、４’－（ＣＨ₂）－Ｏ－２’（ＬＮＡとしても知られる）、４’－（ＣＨ₂）－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ₂）₂－Ｏ－２’（ＥＮＡとしても知られる）、４’－ＣＨ（ＣＨ₃）－Ｏ－２’（ｃＥｔとしても知られる）、及び４’－ＣＨ（ＣＨ₂ＯＣＨ₃）－Ｏ－２’（ｃＭＯＥとしても知られる）、ならびにそれらの類似体と、
ｃ）４’－Ｃ（ＣＨ₃）（ＣＨ₃）－Ｏ－２’及びその類似体と、
ｄ）４’－ＣＨ₂－Ｎ（ＯＣＨ₃）－２’及びその類似体と、
ｅ）４’－ＣＨ₂－Ｏ－Ｎ（ＣＨ₃）－２’及びその類似体と、
ｆ）４’－ＣＨ₂－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ₃）－２’及びその類似体と、
ｇ）４’－ＣＨ₂－Ｃ（＝ＣＨ₂）－２’及びその類似体と
からなる群より選択される。

【0040】

特定の実施形態において、上記テトラループまたはトリループは、少なくとも１つのリガンドコンジュゲートヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、上記テトラループが、２つ、３つ、もしくは４つのリガンドコンジュゲートヌクレオチドを含むか、または上記トリループが２つもしくは３つのコンジュゲートヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、上記リガンドはＧａｌＮＡｃである。特定の実施形態において、上記ＧａｌＮＡｃは糖部分の２’位において上記ヌクレオチドにコンジュゲートしている。

【0041】

特定の実施形態において、上記二本鎖核酸阻害剤は、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端に５’－リン酸模倣物をさらに含む。

【0042】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は脂質ナノ粒子と共に製剤化される。特定の実施形態において、上記脂質ナノ粒子はコア脂質及びエンベロープ脂質を含み、上記コア脂質は第１のカチオン性脂質及び第１のペグ化脂質を含み、上記エンベロープ脂質は、第２のカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、及び第２のペグ化脂質を含む。特定の実施形態において、第１のカチオン性脂質はＤＬ－０４８であり、第１のペグ化脂質はＤＳＧ－ＭＰＥＧであり、第２のカチオン性脂質はＤＬ－１０３であり、上記中性脂質はＤＳＰＣであり、上記ステロールはコレステロールであり、第２のペグ化脂質はＤＳＰＥ－ＭＰＥＧである。

【0043】

別の態様は、治療有効量の、本明細書に記載の短縮センス鎖二本鎖核酸阻害剤分子及び賦形剤を含む組成物に関する。特定の実施形態において、上記組成物は医薬組成物であり、上記賦形剤は薬学的に許容される賦形剤である。

【0044】

別の態様は、対象における標的遺伝子発現の低減方法であって、本二本鎖核酸阻害剤分子または組成物を、それを必要とする対象に、上記標的遺伝子発現を低減するのに十分な量で投与することを含む、上記方法に関する。特定の実施形態において、上記標的遺伝子は、構造遺伝子、ハウスキーピング遺伝子、転写因子をコードする遺伝子、運動性因子をコードする遺伝子、細胞周期因子をコードする遺伝子、細胞周期阻害因子をコードする遺伝子、酵素をコードする遺伝子、成長因子をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、または腫瘍抑制因子をコードする遺伝子である。特定の実施形態において、投与ステップは、静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与を含む。特定の実施形態において、上記対象はヒトである。

【0045】

本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、特定の実施形態を示し、書面による説明と共に、本明細書に開示の組成物及び方法の特定の原理を説明する役割を果たす。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1A】アンチセンス鎖（「ＡＳ」）及びセンス鎖（「Ｓ」）を有する例示的な二本鎖核酸阻害剤分子であって、上記センス鎖がステムループ構造を含み、上記ループがトリループである上記二本鎖核酸阻害剤分子の概略図である。この図に示すように、上記ＡＳ鎖及びＳ鎖は別個の鎖であり、それぞれが５’端及び３’端を有する。

【図1B】図１Ａと同様の例示的な概略図である。この図では、センス鎖は、アンチセンス鎖（ＡＳ）と二重鎖を形成する第１の領域（Ｒ１）と、第１の小領域（Ｓ１）と第２の小領域（Ｓ２）を結合するループ（Ｌ）を含む第２の領域（Ｒ２）とにさらに分割され、Ｓ１とＳ２とは互いに十分に相補的であり、その結果、本明細書で「ステム」または「ステム二重鎖」とも呼ばれる二重鎖を形成する。

【図1C】図１Ａ及び１Ｂと同様の例示的な概略図であり、本核酸阻害剤分子における第１の二重鎖（Ｄ１）及び第２の二重鎖（Ｄ２）を示している。第１の二重鎖（Ｄ１）は、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）とアンチセンス鎖（ＡＳ）との間に形成される。第二の二重鎖（Ｄ２）または「ステム」は、センス鎖の第二領域（Ｒ２）の第一の小領域（Ｓ１）と第二の小領域（Ｓ２）との間に形成される。

【図1D】第２の二重鎖（Ｄ２）が図１Ｃに示す第２の二重鎖よりも短く、６個のＴ_mを上昇させるヌクレオチド（斜線の円）を含む、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の概略図である。

【図2A】例１で議論する目的の遺伝子配列を標的とし、且つ短縮センス鎖を含まない、例示的な対照二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１」）の構造を示す概略図である。構築物１のセンス鎖は２９ヌクレオチドを含む。構築物１のアンチセンス鎖の３’末端は、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図2B】例１で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２」）の構造を示す概略図である。構築物２のセンス鎖は２５ヌクレオチドを含む。構築物２のアンチセンス鎖の３’末端は、６ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図2C】例１で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物３」）の構造を示す概略図である。構築物３のセンス鎖は２４ヌクレオチドを含む。構築物３のアンチセンス鎖の３’末端は７ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図2D】例１で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物４」）の構造を示す概略図である。構築物４のセンス鎖は２３ヌクレオチドを含む。構築物４のアンチセンス鎖の３’末端は８ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図2E】例１で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物５」）の構造を示す概略図である。構築物５のセンス鎖は２２ヌクレオチドを含む。構築物５のアンチセンス鎖の３’末端は９ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図2F】例１で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物６」）の構造を示す概略図である。構築物６のセンス鎖は２１ヌクレオチドを含む。構築物６のアンチセンス鎖の３’末端は１０ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図2G】例１で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物７」）の構造を示す概略図である。構築物７のセンス鎖は２０ヌクレオチドを含む。構築物７のアンチセンス鎖の３’末端は１１ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図2H】例１で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物８」）の構造を示す概略図である。構築物８のセンス鎖は１９ヌクレオチドを含む。構築物８のアンチセンス鎖の３’末端は１２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図3】例１に記載するように構築物１（図２Ａを参照）及び構築物２～８（図２Ｂ～Ｈを参照）をＣＤ－１マウスに投与した４日後に残留する標的遺伝子ｍＲＮＡの割合を示す図である。アンチセンス鎖中にそれぞれ６及び７ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを有する構築物２ならびに構築物３は、アンチセンス鎖中に２ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを有する構築物１と比較して、遺伝子ノックダウンの効力を維持していた。アンチセンス鎖中にそれぞれ８及び９ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを有する構築物４ならびに５は、対照のＰＢＳと比較して、標的ｍＲＮＡの発現を低減した。アンチセンス鎖中にそれぞれ１０、１１、及び１２ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを含む構築物６～８は、標的ｍＲＮＡの発現を有意に低減しなかった。

【図4A】例２で議論する目的の遺伝子配列を標的とし、短縮センス鎖を含まない、例示的な対照二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１」）の構造を示す概略図である。構築物１のセンス鎖は２９ヌクレオチドを含む。構築物１のアンチセンス鎖の３’末端は２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図4B】例２で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物９」）の構造を示す概略図である。構築物９のセンス鎖は、ヌクレオチド１のＬＮＡを含む、２５ヌクレオチドを含む。構築物９のアンチセンス鎖の３’末端は６ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図4C】例２で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１０」）の構造を示す概略図である。構築物１０のセンス鎖は、ヌクレオチド１のＬＮＡを含む、２４ヌクレオチドを含む。構築物１０のアンチセンス鎖の３’末端は７ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図4D】例２で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１１」）の構造を示す概略図である。構築物１１のセンス鎖は、ヌクレオチド１のＬＮＡを含む、２３ヌクレオチドを含む。構築物１１のアンチセンス鎖の３’末端は８ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図4E】例２で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１２」）の構造を示す概略図である。構築物１２のセンス鎖は、ヌクレオチド１のＬＮＡを含む、２２ヌクレオチドを含む。構築物１２のアンチセンス鎖の３’末端は９ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図4F】例２で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１３」）の構造を示す概略図である。構築物１３のセンス鎖は、ヌクレオチド１のＬＮＡを含む、２１ヌクレオチドを含む。構築物１３のアンチセンス鎖の３’末端は１０ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図4G】例２で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１４」）の構造を示す概略図である。構築物１４のセンス鎖は、ヌクレオチド１のＬＮＡを含む、２０ヌクレオチドを含む。構築物１４のアンチセンス鎖の３’末端は１１ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図4H】例２で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１５」）の構造を示す概略図である。構築物１５のセンス鎖は、ヌクレオチド１のＬＮＡを含む、１９ヌクレオチドを含む。構築物１５のアンチセンス鎖の３’末端は１２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図5】例２に記載するように構築物１（図４Ａを参照）及び構築物９～１５（図４Ｂ～Ｈを参照）をＣＤ－１マウスに投与した４日後に残留する標的遺伝子ｍＲＮＡの割合を示す図である。センス鎖の５’末端にＬＮＡを有し、アンチセンス鎖中にそれぞれ６～９ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを有する構築物９～１２は、構築物１と比較して、遺伝子ノックダウンの効力を維持していた。センス鎖の５’末端にＬＮＡを、且つアンチセンス鎖中に１０ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを有する構築物１３は、対照のＰＢＳと比較して、標的ｍＲＮＡの発現を低減した。センス鎖の５’末端にＬＮＡを、且つアンチセンス鎖中にそれぞれ１１及び１２ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを含む構築物１４ならびに１５は、標的ｍＲＮＡの発現を有意に低減しなかった。

【図6A】例３で議論する目的の遺伝子配列を標的とし、短縮センス鎖を含まない、例示的な対照二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１」）の構造を示す概略図である。構築物１のセンス鎖は２９ヌクレオチドを含む。構築物１のアンチセンス鎖の３’末端は２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図6B】例３で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物４」）の構造を示す概略図である。構築物４のセンス鎖は２３ヌクレオチドを含む。構築物４のアンチセンス鎖の３’末端は８ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図6C】例３で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１６」）の構造を示す概略図である。構築物１６のセンス鎖は、ヌクレオチド１及び９のＬＮＡを含む、２３ヌクレオチドを含む。構築物１６のアンチセンス鎖の３’末端は８ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図6D】例３で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物５」）の構造を示す概略図である。構築物５のセンス鎖は２２ヌクレオチドを含む。構築物５のアンチセンス鎖の３’末端は９ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図6E】例３で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１７」）の構造を示す概略図である。構築物１７のセンス鎖は、ヌクレオチド１及び８のＬＮＡを含む、２２ヌクレオチドを含む。構築物１７のアンチセンス鎖の３’末端は９ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図6F】例３で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物６」）の構造を示す概略図である。構築物６のセンス鎖は２１ヌクレオチドを含む。構築物６のアンチセンス鎖の３’末端は１０ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図6G】例３で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１８」）の構造を示す概略図である。構築物１８のセンス鎖は、ヌクレオチド１及び７のＬＮＡを含む、２１ヌクレオチドを含む。構築物１８のアンチセンス鎖の３’末端は１０ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図7】例３に記載するように構築物１（図６Ａを参照）ならびに構築物４～６及び１６～１８（図６Ｂ～Ｇを参照）をＣＤ－１マウスに投与した４日後に、残留する標的遺伝子ｍＲＮＡの割合を示す図である。センス鎖のヌクレオチド１ならびにヌクレオチド９、８、及び７にそれぞれＬＮＡを有すると同時に、アンチセンス鎖中にそれぞれ８、９、及び１０ヌクレオチドの３’末端オーバーハングを有する構築物１６、１７、ならびに１８は、標的遺伝子発現を５０％超低減した。構築物１６～１８の遺伝子ノックダウンの効力は、センス鎖の第１の領域にＬＮＡをもたない構築物４～６と比較して低下した。

【図8】例２及び３に記載するように構築物１（図２Ａを参照）ならびに構築物１１～１３（図４Ｄ～Ｆを参照）及び１６～１８（図６Ｃ、６Ｅ、及び６Ｇを参照）をＣＤ－１マウスに投与した４日後に、残留する標的遺伝子ｍＲＮＡの割合を示す図である。センス鎖のヌクレオチド１ならびにヌクレオチド９、８、及び７にそれぞれＬＮＡを有すると同時に、アンチセンス鎖の３’末端にそれぞれ８、９、及び１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する構築物１６、１７、ならびに１８は、センス鎖のヌクレオチド１に単一のＬＮＡを有する構築物１１～１３と比較して、遺伝子ノックダウンの効力を維持した。構築物１８（アンチセンス鎖の３’末端に１０ヌクレオチドのオーバーハング）は、センス鎖のヌクレオチド７に追加のＬＮＡをもつこと以外は構築物１３と同一であるが、構築物１３と比較して標的遺伝子発現を低減した。

【図9A】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物４」）の構造を示す概略図である。構築物４のセンス鎖は２３ヌクレオチドを含み、センス鎖の第１の領域中にＬＮＡは存在しない。構築物４のアンチセンス鎖の３’末端は８ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9B】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１６」）の構造を示す概略図である。構築物１６のセンス鎖は、ヌクレオチド１及び９のＬＮＡを含む、２３ヌクレオチドを含む。構築物１６のアンチセンス鎖の３’末端は８ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9C】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１９」）の構造を示す概略図である。構築物１９のセンス鎖は、ヌクレオチド１、９、及び１０のＬＮＡを含む、２３ヌクレオチドを含む。構築物１９のアンチセンス鎖の３’末端は８ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9D】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２２」）の構造を示す概略図である。構築物２２のセンス鎖は、ヌクレオチド１、９、１０、１２、及び１３のＬＮＡを含む、２３ヌクレオチドを含む。構築物２２のアンチセンス鎖の３’末端は８ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9E】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物５」）の構造を示す概略図である。構築物５のセンス鎖は２２ヌクレオチドを含み、センス鎖の第１の領域中にはいずれのＬＮＡも含まれない。構築物５のアンチセンス鎖の３’末端は９ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9F】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１７」）の構造を示す概略図である。構築物１７のセンス鎖は、ヌクレオチド１及び８のＬＮＡを含む、２２ヌクレオチドを含む。構築物１７のアンチセンス鎖の３’末端は９ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9G】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２０」）の構造を示す概略図である。構築物２０のセンス鎖は、ヌクレオチド１、８、及び9のＬＮＡを含む、２２ヌクレオチドを含む。構築物２０のアンチセンス鎖の３’末端は９ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9H】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２３」）の構造を示す概略図である。構築物２３のセンス鎖は、ヌクレオチド１、８、９、１１、及び１２のＬＮＡを含む、２２ヌクレオチドを含む。構築物２３のアンチセンス鎖の３’末端は９ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9I】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物６」）の構造を示す概略図である。構築物６のセンス鎖は２１ヌクレオチドを含む。構築物６のアンチセンス鎖の３’末端は１０ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9J】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物１８」）の構造を示す概略図である。構築物１８のセンス鎖は、ヌクレオチド１及び７のＬＮＡを含む、２１ヌクレオチドを含む。構築物１８のアンチセンス鎖の３’末端は１０ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9K】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２１」）の構造を示す概略図である。構築物２１のセンス鎖は、ヌクレオチド１、７、及び８のＬＮＡを含む、２１ヌクレオチドを含む。構築物２１のアンチセンス鎖の３’末端は１０ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図9L】例４で議論する目的の遺伝子配列を標的とする、例示的な二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２４」）の構造を示す概略図である。構築物２４のセンス鎖は、ヌクレオチド１、７、８、１０、及び１１のＬＮＡを含む、２１ヌクレオチドを含む。構築物２４のアンチセンス鎖の３’末端は１０ヌクレオチドのオーバーハングを含む。

【図10】例４に記載するように構築物１（図２Ａを参照）ならびに構築物４～６（図９Ａ、９Ｅ、及び９Ｉを参照）及び１６～２４（図９Ｂ～Ｄ、９Ｆ～Ｈ、及び９Ｊ～Ｌを参照）をＣＤ－１マウスに投与した４日後に、残留する標的遺伝子ｍＲＮＡの割合を示す図である。センス鎖の第１の領域に少なくとも１つのＬＮＡを有する構築物１６～２４は、構築物４～６と比較して遺伝子ノックダウンの向上を示し、構築物４～６はセンス鎖中にいずれのＬＮＡももっていない。センス鎖のヌクレオチド１、９、及び１０のＬＮＡを有する構築物１９は、全長センス鎖を有し、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングをもつ構築物１と同程度の効力があった。しかしながら、センス鎖の第１の領域中のヌクレオチド１、及びアンチセンス鎖のヌクレオチド２及び３と塩基対を形成するヌクレオチドを含む、４つのさらなる位置のＬＮＡを有する構築物２２～２４は、センス鎖の第１の領域中のヌクレオチド１、及び１つまたは２つのさらなる位置のＬＮＡを有する構築物１６～２１ほどには効力がなかった。

【図11】本二本鎖核酸阻害剤分子を製剤化するために使用することができる脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の非限定的な一実施形態を示す図である。上記ＬＮＰとしては、以下のコア脂質、すなわち、ＤＬ－０４８（カチオン性脂質）及びＤＳＧ－ｍＰＥＧ（ペグ化脂質）、ならびに以下のエンベロープ脂質、すなわち、ＤＬ－１０３（カチオン性脂質）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ｍＰＥＧ（ペグ化脂質）が挙げられる。

【発明を実施するための形態】

【0047】

用語の定義
本開示をより容易に理解するために、特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及びその他の用語のさらなる定義が本明細書中に記載されている場合もある。以下に記載される用語の定義が、援用される出願または特許における定義と矛盾する場合には、本出願に記載の定義を使用して当該用語の意味を理解する必要がある。

【0048】

本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈による明らかな別段の指示がない限り、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「１つの方法（ａ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、１つ以上の方法、及び／または本明細書に記載のタイプのステップ、及び／または本開示などを読んだ際に当業者であれば明らかになるであろうステップを含む。

【0049】

投与する：本明細書では、組成物を対象に「投与する」とは、該組成物を該対象に与える、塗布する、または接触させることを意味する。投与は、例えば、局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内、及び皮内を含む、多くの経路のいずれかによって実施することができる。

【0050】

アシル：本明細書では、用語「アシル」とは、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、及びアリールカルボニル部分をいう。

【0051】

アルコキシ：本明細書では、用語「アルコキシ」とは、酸素原子を介して分子の部分に結合したアルキル基をいう。

【0052】

アルケニル：本明細書では、用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有し、約２～約２０個の範囲の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基をいう。「置換アルケニル」とは、１つ以上の置換基をさらに有するアルケニル基をいう。本明細書では、「低級アルケニル」とは、２～約６個の炭素原子を有するアルケニル部分をいう。

【0053】

アルキル：本明細書では、用語「アルキル」とは、１～約２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基をいう。アルキルが本明細書に記載される場合は常に、「Ｃ₁～Ｃ₆アルキル」などの数値範囲は、アルキル基が、１つの炭素原子、２つの炭素原子、３つの炭素原子等のみを含み、最大で６個の炭素原子を含む場合があることを意味するが、用語「アルキル」は、炭素原子の数値範囲が指定されていない場合も含む。例えば、用語「アルキル」とは、Ｃ₁～Ｃ₁₀の下位範囲（例えば、Ｃ₁～Ｃ₆）を指す場合もある。「置換アルキル」とは、置換基を有するアルキル部分をいう。本明細書では、「低級アルキル」とは、１～約６個の炭素原子を有するアルキル部分をいう。

【0054】

アルキニル：本明細書では、用語「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有し、約２～約２０個の範囲の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基をいう「置換アルキニル」とは、１つ以上の置換基をさらに有するアルキニル基をいう。本明細書では、「低級アルキニル」とは、約２～約６個の炭素原子を有するアルキニル部分をいう。

【0055】

アンチセンス鎖：二本鎖核酸阻害剤分子は２本のオリゴヌクレオチド鎖、すなわち、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。上記アンチセンス鎖またはその領域は、標的核酸の対応する領域に、部分的に、実質的に、または完全に相補的である。さらに、本二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖またはその領域は、該二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖またはその領域に、部分的に、実質的に、または完全に相補的である。特定の実施形態において、アンチセンス鎖はまた、標的核酸配列に非相補的であるヌクレオチドを含んでいてもよい。上記非相補的ヌクレオチドは、上記相補的配列のいずれかの側にあってもよく、または上記相補的配列の両側にあってもよい。アンチセンス鎖もしくはその領域が、センス鎖もしくはその領域に部分的にまたは実質的に相補的である特定の実施形態において、上記非相補的ヌクレオチドは、相補性の１つ以上の領域（例えば、１つ以上のミスマッチ）の間に位置していてもよい。二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖はガイド鎖とも呼ばれる。上記アンチセンス鎖中のヌクレオチドの位置は、例えば、当該アンチセンス鎖中の各ヌクレオチドに対して、第１のヌクレオチドが「ヌクレオチド１」または「Ｇ１」として識別され、第２のヌクレオチドが「ヌクレオチド２」または「Ｇ２」として識別され、第３のヌクレオチドが「ヌクレオチド３」または「Ｇ３」として識別され、以後同様となるように、上記アンチセンス鎖の５’末端から開始してヌクレオチドを数えることによって識別することができる。

【0056】

おおよそ：本明細書では、対象となる１つ以上の値に適用される、用語「おおよそ」または「約」とは、記載された指示値に類似する値をいう。特定の実施形態において、用語「およそ」または「約」とは、別段の明示がない限り、または文脈から別段の意味が明確でない限り、記載された指示値の両方向に（より大きいまたはより小さい）、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満に入る範囲の値をいう（かかる数値が可能な値の１００％を超える場合を除く）。

【0057】

アリール：本明細書では、用語「アリール」とは、約５～約１９個の範囲の炭素原子を有する芳香族単環式または多環式基をいう。「置換アリール」とは、1つ以上の置換基をさらに有するアリール基をいう。

【0058】

二環式ヌクレオチド：本明細書では、用語「二環式ヌクレオチド」とは、二環式糖部分を含むヌクレオチドをいう。

【0059】

二環式糖部分：本明細書では、用語「二環式糖部分」とは、４～７員環（フラノシルを含む、但しこれに限定されない）であって、該４～７員環の２つの原子を連結して第２の環を形成し、その結果二環式構造を生じる架橋を含む修飾糖部分をいう。通常、上記４～７員環は糖である。いくつかの実施形態において、上記４～７員環はフラノシルである。特定の実施形態において、上記架橋は、上記フラノシルの２’炭素と４’炭素とを連結する。

【0060】

相補的な：本明細書では、用語「相補的な」とは、２つのヌクレオチド（例えば、２つの対合する核酸上の、または単一の核酸鎖の対合する領域上の）の間の構造上の関係であって、上記２つのヌクレオチドが互いに塩基対を形成することが可能である上記関係をいう。例えば、一方の核酸のプリンヌクレオチドであって、対合する核酸のピリミジンヌクレオチドに相補的な上記プリンヌクレオチドは、上記ピリミジンヌクレオチドと、互いに水素結合を形成することによって塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態において、相補的なヌクレオチドは、ワトソン・クリック様式で、または安定な二重鎖を形成することができるいずれかの他の様式で塩基対を形成することができる。「完全に相補的な」または１００％の相補性とは、第１のオリゴヌクレオチド鎖または第１のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントの各ヌクレオチドモノマーが、第２のオリゴヌクレオチド鎖または第２のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントの各ヌクレオチドモノマーと塩基対を形成することができる状況をいう。１００％未満の相補性とは、２つのオリゴヌクレオチド鎖（または２つのオリゴヌクレオチド鎖の２つのセグメント）のヌクレオチドモノマーの一部、但しすべてではない、が互いに塩基対を形成することができる状況をいう。「実質的な相補性」とは、互いの９０％以上の相補性を示す２つのオリゴヌクレオチド鎖（または２つのオリゴヌクレオチド鎖のセグメント）をいう。「十分に相補的な」とは、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の量を低減させるような、標的ｍＲＮＡと核酸阻害剤分子との間の相補性をいう。

【0061】

相補鎖：本明細書では、用語「相補鎖」とは、他の鎖に対して部分的に、実質的に、または完全に相補的である二本鎖核酸阻害剤分子の鎖をいう。

【0062】

シクロアルキル：本明細書では、用語「シクロアルキル」とは、３～１２個の炭素、例えば、３～８個の炭素、例えば３～６個の炭素を含む環状（すなわち、環含有）炭化水素基をいう。「置換シクロアルキ」とは、1つ以上の置換基をさらに有するシクロアルキル基をいう。

【0063】

デオキシリボフラノシル：本明細書では、用語「デオキシリボフラノシル」とは、以下、すなわち、

に示す、天然由来のＤＮＡ中に存在し、２’炭素に水素基を有するフラノシルをいう。

【0064】

デオキシリボヌクレオチド：本明細書では、用語「デオキシリボヌクレオチド」とは、当該糖部分の２’位に水素基を有する天然ヌクレオチド（本明細書で定義される）または修飾ヌクレオチド（本明細書で定義される）をいう。

【0065】

ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子：本明細書では、用語「ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子」とは、センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖核酸阻害剤分子であって、標的ｍＲＮＡの切断において、上記アンチセンス鎖または上記アンチセンス鎖の一部がアルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼによって使用される上記二本鎖核酸阻害剤分子をいう。

【0066】

二重鎖：本明細書では、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関する用語「二重鎖」とは、ヌクレオチドの２つの逆平行の配列の相補的塩基対合によって形成される構造をいう。

【0067】

賦形剤：本明細書では、用語「賦形剤」とは、例えば、所望の形状保持性もしくは安定化効果を付与するまたはそれらに寄与ように組成物に添加してもよい、治療効果をもたない物質をいう。

【0068】

フラノシル：本明細書では、用語「フラノシル」とは、４つの炭素原子及び１つの酸素原子を有する５員環を含む構造をいう。

【0069】

ハロ：本明細書では、用語「ハロ」及び「ハロゲン」は同義であり、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択される原子をいう。

【0070】

ヘテロ環：本明細書では、用語「ヘテロ環」または「ヘテロ環式」とは、環構造の一部として1つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓなど）を含み、且つ３～１４個の範囲の炭素原子を有する非芳香族環式（すなわち、環含有）基をいう。「置換ヘテロ環式」または「置換ヘテロ環」とは、1つ以上の置換基をさらに有するヘテロ環式基をいう。

【0071】

特定の実施形態において：本明細書では、用語「特定の実施形態において」とは、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、本開示のすべての態様の実施形態をいう。

【0072】

ヌクレオチド間結合基：本明細書では、用語「ヌクレオチド間結合基」または「ヌクレオチド間結合」とは、２つのヌクレオシド部分を共有結合で結合することができる化学基をいう。一般的には、上記化学基は、ホスホまたはホスファイト基を含むリン含有結合基である。ホスホ結合基とは、ホスホジエステル結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホロチオアート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホナート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、ホスホルアミダイト結合、ホスホナート結合、及び／またはボラノホスファート結合を含むことを意味する。多くのリン含有結合が、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号、及び第５，６２５，０５０号に開示されるように、当技術分野で周知である。他の実施形態において、上記オリゴヌクレオチドは、シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート及びスルホンアミド骨格；ならびにアミド骨格を有するものを含む、但しこれらに限定されない、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、または1つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオチド間結合などの、リン原子を含まない１つ以上のヌクレオチド間結合を含む。非リン含有結合は、例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９、及び第５，６７７，４３９号に開示されるように、当技術分野で周知である。

【0073】

ループ：本明細書では、用語「ループ」とは、一本鎖核酸によって形成される構造であって、該構造中で、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補的領域が、上記相補的領域間の上記一本鎖ヌクレオチド領域が二重鎖形成またはワトソン・クリック塩基対合から排除される形態でハイブリダイズする、上記構造をいう。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例としては、ヘアピン及びテトラループなどの構造中に存在する不対ヌクレオチドが挙げられる。

【0074】

融解温度：本明細書では、用語「融解温度」または「Ｔ_m」とは、二重鎖核酸の２本の鎖が分離する温度を意味する。Ｔ_mは、二重鎖の安定性または相補的な核酸の２本の鎖もしくはその一部の結合親和性の尺度としてよく使用される。Ｔ_mは、ＵＶスペクトルを使用して測定し、ハイブリダイゼーションの形成及び分解（融解）を判定することができる。ハイブリダイゼーション中に発生する塩基スタッキングは、ＵＶ吸収の低下（淡色効果）を伴う。結果として、ＵＶ吸収の低下はより高いＴ_mを示す。

【0075】

修飾核酸塩基：本明細書では、用語「修飾核酸塩基」とは、天然の核酸塩基またはユニバーサル核酸塩基ではない任意の核酸塩基をいう。好適な修飾核酸塩基としては、ジアミノプリン及びその誘導体、アルキル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、チオール化プリンまたはピリミジンなどが挙げられる。他の好適な修飾核酸塩基としては、プリン及びピリミジンの類似体が挙げられる。好適な類似体としては、１－メチルアデニン、２－メチルアデニン、Ｎ６－メチルアデニン、Ｎ６－イソペンチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアデニン、８－ブロモアデニン、２－チオシトシン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、５－エチルシトシン、４－アセチルシトシン、１－メチルグアニン、２－メチルグアニン、７－メチルグアニン、２，２－ジメチルグアニン、８－ブロモグアニン、８－クロログアニン、８－アミノグアニン、８－メチルグアニン、８－チオグアニン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、５－エチルウラシル、５－プロピルウラシル、５－メトキシウラシル、５－ヒドロキシメチルウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）ウラシル、５－（カルボキシメチルアミノメチル）ウラシル、２－チオウラシル、５－メチル－２－チオウラシル、５－（２－ブロモビニル）ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、１－メチルシュードウラシル、クエオシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２－アミノプリン、６－ヒドロキシアミノプリン、ニトロピロリル、ニトロインドリル、及びジフルオロトリル、６－チオプリン及び２，６－ジアミノプリンニトロピロリル、ニトロインドリル及びジフルオロトリルが挙げられるが、これらに限定はされない。一般的には、核酸塩基としては窒素塩基を含む。特定の実施形態において、上記核酸塩基は窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４６４２号を参照されたい。

【0076】

修飾ヌクレオシド：本明細書では、用語「修飾ヌクレオシド」とは、リン酸基または修飾リン酸基（本明細書で定義される）に結合しておらず、修飾核酸塩基（本明細書で定義される）、ユニバーサル核酸塩基（本明細書で定義される）、または修飾糖部分（本明細書で定義される）の１つ以上を含む糖（例えば、デオキシリボースもしくはリボースまたはそれらの類似体）とＮ－グリコシド結合しているヘテロ環式窒素塩基をいう。上記修飾核酸塩基またはユニバーサル核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、一般にヌクレオシド糖部分の１’位に位置し、１’位のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル以外の核酸塩基をいう。特定の実施形態において、上記修飾核酸塩基またはユニバーサル核酸塩基は窒素塩基である。特定の実施形態において、上記修飾核酸塩基またはユニバーサル核酸塩基は窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４４６２号を参照されたい。特定の実施形態において、上記修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含まない（無塩基）。本開示の文脈における好適な上記修飾核酸塩基もしくはユニバーサル核酸塩基または修飾糖は本明細書に記載されている。

【0077】

修飾ヌクレオチド：本明細書では、用語「修飾ヌクレオチド」とは、ホスファート基または修飾ホスファート基（本明細書で定義される）に結合しており、且つ修飾核酸塩基（本明細書で定義される）、ユニバーサル核酸塩基（本明細書で定義される）、または修飾糖部分（本明細書で定義される）の１つ以上を含有する糖（例えば、リボースもしくはデオキシリボースまたはその類似体）とＮ－グリコシル結合しているヘテロ環式窒素塩基をいう。上記修飾核酸塩基またはユニバーサル核酸塩基（本明細書では塩基類似体とも呼ばれる）は、一般にヌクレオシド糖部分の１’位に位置し、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル以外の核酸塩基をいう。特定の実施形態において、上記修飾核酸塩基またはユニバーサル核酸塩基は窒素含有塩基である。特定の実施形態において、上記修飾核酸塩基は窒素原子を含有しない。例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４４６２号を参照のこと。特定の実施形態において、上記修飾ヌクレオチドは核酸塩基を含有しない（無塩基）。本開示の文脈における好適な修飾核酸塩基もしくはユニバーサル核酸塩基、修飾糖部分、または修飾ホスファート基は本明細書に記載される。

【0078】

修飾ホスファート基：本明細書では、用語「修飾ホスファート基」とは、天然ヌクレオチド中には存在しないホスファート基の修飾をいい、リン原子を含むホスファート模倣物を含む、本明細書に記載の天然に存在しないホスファート模倣物及びホスファートを含まないアニオン性ホスファート模倣物（例えば、アセタート）を含む。修飾ホスファート基はまた、本明細書に記載の、例えば、ホスホロチオアートを含むリン含有ヌクレオチド間結合基及び非リン含有結合基の両方を含む、天然に存在しないヌクレオチド間結合基を含む。

【0079】

修飾糖部分：本明細書では、「修飾糖部分」とは、置換糖部分（本明細書で定義される）または糖類似体（本明細書で定義される）をいう。

【0080】

天然核酸塩基：本明細書では、用語「天然核酸塩基」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡの、５種の主要な天然に存在するヘテロ環式核酸塩基、すなわち、プリン塩基：アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基：チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）をいう。

【0081】

天然ヌクレオシド：本明細書では、用語「天然ヌクレオシド」とは、ホスファート基に結合していない天然糖部分（本明細書で定義される）とＮ－グリコシド結合している天然核酸塩基（本明細書で定義される）をいう。

【0082】

天然ヌクレオチド：本明細書では、用語「天然ヌクレオチド」とは、ホスファート基に結合している天然糖部分（本明細書で定義される）とＮ－グリコシド結合している天然核酸塩基（本明細書で定義される）をいう。

【0083】

天然糖部分：本明細書では、用語「天然糖部分」とは、リボフラノシル（本明細書で定義される）またはデオキシリボフラノシル（本明細書で定義される）をいう。

【0084】

核酸阻害剤分子：本明細書では、用語「核酸阻害剤分子」とは、標的遺伝子発現を低減または除去するオリゴヌクレオチド分子をいい、上記オリゴヌクレオチド分子は、標的遺伝子ｍＲＮＡの配列を特異的に標的とする領域を含有する。通常、本核酸阻害剤分子の標的化領域は、該核酸阻害剤分子の作用が特定の標的遺伝子に対して指向するように、上記標的遺伝子ｍＲＮＡ上の配列に十分に相補的である配列を含む。上記核酸阻害剤分子は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び／または修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。上記標的遺伝子は、任意の目的の遺伝子であってよい。

【0085】

核酸塩基：本明細書では、用語「核酸塩基」とは、天然核酸塩基（本明細書で定義される）、修飾核酸塩基（本明細書で定義される）、またはユニバーサル核酸塩基（本明細書で定義される）をいう。

【0086】

ヌクレオシド：本明細書では、用語「ヌクレオシド」とは、天然ヌクレオシド（本明細書で定義される）または修飾ヌクレオシド（本明細書で定義される）をいう。

【0087】

ヌクレオチド：本明細書では、用語「ヌクレオチド」とは、天然ヌクレオチド（本明細書で定義される）または修飾ヌクレオチド（本明細書で定義される）をいう。

【0088】

オーバーハング：本明細書では、用語「オーバーハング」とは、二本鎖核酸阻害剤分子のいずれかの鎖のいずれかの末端にある末端非塩基対合ヌクレオチド（複数可）をいう。特定の実施形態において、上記オーバーハングは、第１の鎖もしくは第１の領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を越えて伸長する１つの鎖または領域から生じる。塩基対の水素結合を介して二重鎖を形成することができる２つのオリゴヌクレオチド領域の一方または両方が、２つのポリヌクレオチドもしくは領域により共有される相補性の５’末端及び／または３’末端を越えて伸長する３’末端ならびに／あるいは５’末端を有していてもよい。上記二重鎖の３’末端及び／または５’末端を越えて伸長する一本鎖領域がオーバーハングと呼ばれる。

【0089】

医薬組成物：本明細書では、用語「医薬組成物」は、薬理学的有効量の二本鎖核酸阻害剤分子及び薬学的に許容される賦形剤（本明細書で定義される）を含む。

【0090】

薬学的に許容される賦形剤：本明細書では、用語「薬学的に許容される賦形剤」とは、該賦形剤が、合理的な利益／リスク比に見合う、過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激、及びアレルギー反応）のないヒト及び／または動物での使用に適するものであることを意味する。

【0091】

ホスファート模倣物：本明細書では、用語「ホスファート模倣物」とは、ホスファート基の静電特性及び立体特性を模倣するオリゴヌクレオチドの５’末端の化学部分をいう。オリゴヌクレオチドの５’末端に結合することができる多くのホスファート模倣物が開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号；Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０１５，４３（６）：２９９３－３０１１を参照のこと）。通常、これらの５’－ホスファート模倣物は、ホスファターゼ耐性結合を含む。好適なホスファート模倣物としては、国際公開第ＷＯ２０１８／０４５３１７号（本記述をもってその全体が援用される）に記載される５’－ホスホナート、例えば、５’－メチレンホスホナート（５’－ＭＰ）及び５’－（Ｅ）－ビニルホスホナート（５’－ＶＰ）、ならびにオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドの糖部分（例えば、リボースもしくはデオキシリボースまたはその類似体）の４’炭素に結合している４’－ホスファート類似体、例えば、４’－オキシメチルホスホナート、４’－チオメチルホスホナート、または４’－アミノメチルホスホナート、が挙げられる。特定の実施形態において、上記４’－オキシメチルホスホナートは式－Ｏ－ＣＨ₂－ＰＯ（ＯＨ）₂または－Ｏ－ＣＨ₂－ＰＯ（ＯＲ）₂で表され、式中、Ｒは独立に、Ｈ、ＣＨ₃、アルキル基、または保護基から選択される。特定の実施形態において、上記アルキル基はＣＨ₂ＣＨ₃である。より一般的には、Ｒは独立に、Ｈ、ＣＨ₃、またはＣＨ₂ＣＨ₃から選択される。オリゴヌクレオチドの５’末端に対する他の修飾が開発されている（例えば、ＷＯ２０１１／１３３８７１を参照のこと）。

【0092】

保護基：本明細書では、用語「保護基」とは、所望の反応の特定の条件下で官能基を可逆的に非反応性にする基としての、従来の化学的意味で使用される。上記所望の反応後に保護基を除去し、保護された官能基を脱保護することができる。全ての保護基は、合成される分子が実質的な率で分解することのない条件下で除去可能でなければならない。

【0093】

低減する（ｒｅｄｕｃｅ（ｓ））：本明細書では、用語「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「低減する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」とは、当技術分野で一般に認められているその意味を有する。核酸阻害剤分子に関しては、上記用語は一般に、遺伝子の発現、１種以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子または同等のＲＮＡ分子のレベル、あるいは１種以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性の低減であって、上記核酸阻害剤分子の非存在下で観測される上記発現、レベル、または活性を下回る該発現、レベル、または活性への上記低減をいう。

【0094】

リボフラノシル：本明細書では、用語「リボフラノシル」とは、以下、すなわち、

に示すような、天然由来のＲＮＡ中に存在し、且つ２’炭素にヒドロキシル基を有するフラノシルをいう。

【0095】

リボヌクレオチド：本明細書では、用語「リボヌクレオチド」とは、糖部分の２’位にヒドロキシル基を有する天然ヌクレオチド（本明細書で定義される）または修飾ヌクレオチド（本明細書で定義される）をいう。

【0096】

センス鎖：二本鎖核酸阻害剤分子は、２本のオリゴヌクレオチド鎖、すなわち、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。センス鎖またはその領域は、本二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖またはその領域に部分的に、実質的に、または完全に相補的である。特定の実施形態において、センス鎖はまた、アンチセンス鎖に対して非相補的であるヌクレオチドを含有していてもよい。上記非相補的ヌクレオチドは、上記相補的配列のいずれかの側にあっても、上記相補的配列の両側にあってもよい。センス鎖またはその領域がアンチセンス鎖もしくはその領域に部分的にまたは実質的に相補的である特定の実施形態において、上記非相補的ヌクレオチドは、相補性の１つ以上の領域の間に配置されていてもよい（例えば、１つ以上のミスマッチ）。センス鎖はパッセンジャー鎖とも呼ばれる。センス鎖中のヌクレオチドの位置は、例えば、第１のヌクレオチドが「ヌクレオチド１」または「Ｐ１」として識別され、第２のヌクレオチドが「ヌクレオチド２」または「Ｐ２」として識別され、第３のヌクレオチドが「ヌクレオチド３」または「Ｐ３」として識別され、以後同様となるように、センス鎖の５’末端から開始してヌクレオチドを数えることによって識別することができる。

【0097】

対象：本明細書では、用語「対象」とは、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。一実施形態において、上記対象はヒトである。用語「個体」または「患者」は「対象」と同義であることが意図される。

【0098】

置換基または置換された：本明細書では、用語「置換基」または「置換された」とは、所与の構造中の水素ラジカルの置換基のラジカルによる置換をいう。任意の所与の構造における複数の位置を複数の置換基で置換することができる場合、当該置換基は、別段の指示がない限り、いずれの位置でも、同一であってもまたは異なっていてもよい。本明細書では、用語「置換された」とは、有機化合物と適合性のある全ての許容される置換基を包含することが企図される。上記許容される置換基としては、非環式及び環式の、分枝状及び非分枝状の、炭素環式及びヘテロ環式の、芳香族及び非芳香族の有機化合物の置換基が挙げられる。本開示は、有機化合物の許容される置換基によって限定されることを何ら意図するものではない。

【0099】

置換糖部分：本明細書では、「置換糖部分」は、１つ以上の修飾を含むフラノシルを含む。通常、上記修飾は、糖の２’、３’、４’、または５’炭素位で行われる。特定の実施形態において、上記置換糖部分は、当該フラノシルの２’炭素を４炭素と連結する架橋を含む二環式糖部分である。

【0100】

糖類似体：本明細書では、用語「糖類似体」とは、フラノシルを含まず且つヌクレオチドの天然に存在する糖部分を置換することができる構造であって、その結果、得られるヌクレオチドが、（１）オリゴヌクレオチド中に組み込まれること、及び（２）相補的ヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能である上記構造をいう。かかる構造は通常、異なる数の原子を含む環（例えば、４、６、もしくは７員環）などの、フラノシルに対する比較的単純な変化；フラノシルの酸素の非酸素原子（例えば、炭素、硫黄、もしくは窒素）による置換、または上記原子数の変化及び上記酸素の置換の両方を含む。かかる構造はまた、置換糖部分に関して記載した置換に対応する置換を含んでいてもよい。糖類似体はまた、より複雑な糖代替物（例えば、非環系のペプチド核酸）も包含する。糖類似体としては、モルホリノ、シクロヘキセニル、及びシクロヘキシトールが挙げられるが、これらに限定はされない。

【0101】

糖部分：本明細書では、用語「糖部分」とは、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの天然糖部分または修飾糖部分をいう。

【0102】

標的部位：本明細書では、用語「標的部位」、「標的配列」、「標的核酸」、「標的領域」、「標的遺伝子」は同義で使用され、例えば、ＲＮＡｉ阻害剤分子であって、当該標的配列に対して、部分的に、実質的に、もしくは完全に、または十分に相補的である配列を、そのガイド／アンチセンス領域内に含む上記ＲＮＡｉ阻害剤分子によって媒介される切断の「標的とされる」ＲＮＡまたはＤＮＡ配列をいう。

【0103】

テトラループ：本明細書では、用語「テトラループ」とは、隣接するワトソン・クリック型でハイブリダイズした（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）ヌクレオチドの安定性に寄与する安定な２次構造を形成するループ（一本鎖領域）をいう。理論に制限されるものではないが、テトラループは、スタッキング相互作用により、隣接するワトソン・クリック塩基対を安定化することができる。さらに、テトラループ中のヌクレオチド間の相互作用としては、非ワトソン・クリック塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用が挙げられるが（Ｃｈｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９０；３４６（６２８５）：６８０－２；Ｈｅｕｓ ａｎｄ Ｐａｒｄｉ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１；２５３（５０１６）：１９１－４）、これらに限定はされない。テトラループは隣接する二重鎖の融解温度（Ｔ_m）を上昇させ、上記融点はランダムな塩基で構成される単純なモデルループ配列から予想されるよりも高い。例えば、テトラループによって、少なくとも２塩基対の長さの二重鎖を含むヘアピンの１０ｍＭのＮａＨＰＯ₄中での融解温度が、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、または少なくとも７５℃になる場合がある。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含んでいてもよい。特定の実施形態において、テトラループは４ヌクレオチドからなる。特定の実施形態において、テトラループは５ヌクレオチドからなる。

【0104】

ＲＮＡテトラループの例としては、ＵＮＣＧファミリーのテトラループ（例えば、ＵＵＣＧ）、ＧＮＲＡファミリーのテトラループ（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループを含むＣＵＹＧファミリーのテトラループが挙げられる。（Ｗｏｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９０，８７（２１）：８４６７－７１、Ａｎｔａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９１，１９（２１）：５９０１－５）。ＲＮＡテトラループの他の例としては、ＧＡＮＣ、Ａ／ＵＧＮＮ、及びＵＵＵＭテトラループファミリー（Ｔｈａｐａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ， ２０１４， ５（１）：１－２８）ならびにＧＧＵＧ、ＲＮＹＡ、及びＡＧＮＮテトラループファミリー（Ｂｏｔｔａｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．， ２０１７， １１３：２５７－６７）が挙げられる。ＤＮＡテトラループの例としては、ｄ（ＧＮＮＡ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、ｄ（ＧＮＲＡ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＧＮＡＢ）ファミリーのテトラループ、ｄ（ＣＮＮＧ）ファミリーのテトラループ、及びｄ（ＴＮＣＧ）ファミリーのテトラループ（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。（Ｎａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００２， ４１（４８）：１４２８１－１４２９２． Ｓｈｉｎｊｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｉｐｐｏｎ Ｋａｇａｋｋａｉ Ｋｏｅｎ Ｙｏｋｏｓｈｕ， ２０００， ７８（２）：７３１）。

【0105】

トリループ：本明細書では、用語「トリループ」とは、隣接するワトソン・クリック型でハイブリダイズしたヌクレオチドの安定性に寄与し、且つ３ヌクレオチドからなる安定な２次構造を形成するループ（一本鎖領域）をいう。理論に制限されるものではないが、トリループを、当該トリループ内のヌクレオチドの非ワトソン・クリック塩基対合及び塩基スタッキング相互作用により安定化することができる。（Ｙｏｓｈｉｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７；３６， ４７６１－４７６７）。トリループはまた、隣接する二重鎖の融解温度（Ｔ_m）を上昇させることもでき、上記融点はランダムな塩基で構成される単純なモデルループ配列から予想されるよりも高い。トリループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含有していてもよい。トリループの例としては、ＧＮＡファミリーのトリループ（例えば、ＧＡＡ、ＧＴＡ、ＧＣＡ、及びＧＧＡ）が挙げられる（Ｙｏｓｈｉｚａｗａ １９９７）。

【0106】

治療的有効量：本明細書では、「治療有効量」または「薬理学的有効量」とは、意図する薬理学的な、治療上の、または予防上の結果を生み出すのに有効な二本鎖核酸阻害剤分子の量をいう。

【0107】

Ｔ_mを上昇させるヌクレオチド：本明細書では、用語「Ｔ_mを上昇させるヌクレオチド」とは、該Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドを含まないオリゴヌクレオチド二重鎖と比較して、オリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度（Ｔ_m）を上昇させるヌクレオチドをいう。Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドとしては、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、Ｇクランプ及びその類似体、ならびにヘキシトールヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定はされない。修飾糖部分または修飾核酸塩基を有する特定の修飾ヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチド二重鎖のＴ_mを上昇させることもできる。本明細書では、用語「Ｔ_mを上昇させるヌクレオチド」は、糖部分の２’位が２’－ＯＭｅまたは２’－Ｆで修飾されているヌクレオチドを特に除外する。

【0108】

ユニバーサル核酸塩基：本明細書では、「ユニバーサル核酸塩基」とは、天然由来の核酸中に通常存在する複数の塩基と対合することができ、したがって、二重鎖中のかかる天然由来の塩基と置換することができる塩基をいう。上記塩基は、上記天然由来の塩基のそれぞれと対合することが可能である必要はない。例えば、特定の塩基は、プリンとのみもしくは選択的に、またはピリミジンとのみまたは選択的に対合する。上記ユニバーサル核酸塩基は、ワトソン・クリック相互作用または非ワトソン・クリック相互作用（例えば、フーグスティーン相互作用）を介して水素結合を形成することにより、塩基対合することができる。代表的なユニバーサル核酸塩基としては、イノシン及びその誘導体が挙げられる。

【0109】

詳細な説明
本出願は、ステムループ構造をもつセンス鎖、及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子であって、センス鎖の長さが、その５’末端において短縮されており、その結果、アンチセンス鎖の３’末端により長い一本鎖オーバーハングが生じる、上記二本鎖核酸阻害剤分子を提供する。実施例に示すように、短縮センス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子を使用して、インビボでの標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を低減することができる。センス鎖の領域１（Ｒ１）中の特定の位置にＴ_mを上昇させるヌクレオチドを導入すること、及び／またはアンチセンス鎖中に修飾したヌクレオチド間結合を導入することによって、短縮センス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子を安定化するのに役立てることができる。このようにして、効力を低下させることなく、センス鎖を短縮することができる。より短いセンス鎖を使用することにより、時間及びコストの両方が低下し、製造プロセスにおける利点が得られる。センス鎖の長さを低減することにより、投薬においても利点が得られる。これは、二本鎖核酸阻害剤分子の分子量が低下することに起因して、モル基準でより多くの上記阻害剤分子を投与することが可能になるためである。

【0110】

疾患の治療方法及び疾患の治療のための組成物を含む、インビトロもしくインビボで標的遺伝子のレベルまたは発現を低減するための、短縮センス鎖を有する上記二本鎖核酸阻害剤分子の使用方法、ならびに、本二本鎖核酸阻害剤分子を含む組成物も提供される。

【0111】

二本鎖核酸阻害剤分子
本出願は、ステムループ構造をもつ短縮センス鎖、及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子であって、上記センス鎖及びアンチセンス鎖が、それぞれ５’末端及び３’末端を有する別個の鎖であり、したがって、連続したオリゴヌクレオチドを形成しない、上記二本鎖核酸阻害剤分子を開示する。典型的なステム／ループ含有二本鎖核酸阻害剤分子を図１Ａに示し、センス鎖（「Ｓ」）及びアンチセンス鎖（「ＡＳ」）を強調表示している。

【0112】

センス鎖は、図１Ｂ及び１Ｃに示すように、アンチセンス鎖（ＡＳ）と第１の二重鎖（Ｄ１）を形成する第１の領域（Ｒ１）と、第１の小領域（Ｓ１）と第２の小領域（Ｓ２）を結合するループ（Ｌ）を含む第２の領域（Ｒ２）とにさらに分割することができる。Ｓ１及びＳ２は互いに十分に相補的であり、ステムまたはステム二重鎖とも呼ばれる第２の二重鎖（Ｄ２）を形成する。例えば、図１Ｃ及びＩＤを参照されたい。特定の実施形態において、上記ループはテトラループであり、特定の実施形態において、上記ループはトリループである。特定の実施形態において、本二本鎖核酸分子はｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子である。特定の実施形態において、上記二本鎖核酸分子は、センス鎖のＲ１またはＤ２中に、１つ以上のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。通常、上記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは二環式ヌクレオチドである。但し、本明細書に記載のすべての二本鎖核酸阻害剤分子において、任意の本明細書で定義されるＴ_mを上昇させるヌクレオチドを、上記二環式ヌクレオチドに代えて使用することができる。

【0113】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、センス鎖は、ループを含むステム二重鎖（Ｄ２）を含み、長さが１５～４３ヌクレオチドである。特定の実施形態において、上記ステム二重鎖は、長さが１～６塩基対である。特定の実施形態において、上記ステム二重鎖は、長さが１～３塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、上記ステム二重鎖は、３～６塩基対の長さである。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、長さが１８～３３ヌクレオチドであり、３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、上記ループの長さは３～２０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、上記ループの長さは３～８ヌクレオチドである。通常、上記ループはテトラループまたはトリループである。特定の実施形態において、ステム二重鎖（Ｄ２）とループを含む上記センス鎖の延長部分は、当該の鎖の３’末端上に存在する。特定の他の実施形態において、ステム（Ｄ２）及びループを含むセンス鎖の上記延長部分は、当該の鎖の５’末端上に存在する。

【0114】

特定の実施形態において、センス鎖は、ステム二重鎖（Ｄ２）及びテトラループまたはトリループを含み、長さが１５～４３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、長さが１８～３３ヌクレオチドであり、３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、長さが１８～２５ヌクレオチドであり、３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１５～３０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１６～３１ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１７～３２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１８～３３ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１９～３４ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２０～３５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２１～３６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２２～３７ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２３～３８ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２４～３９ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２５～４０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２６～４１ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２７～４２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２８～４３ヌクレオチドである。

【0115】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、上記センス鎖及びアンチセンス鎖は別個の鎖であり、８～２９塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、第２の二重鎖（Ｄ２）及びテトラループまたはトリループを含み、長さが１５～４３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、長さが１８～３５ヌクレオチドであり、３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、センス鎖の長さは、１５～２６、１９～２６、１５～２４、または１９～２４ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１５～２５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１９～２５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１５～２３ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２１～２３ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１７ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１８ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１９ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２１ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２３ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２４ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２４ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２６ヌクレオチドである。

【0116】

特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは８～２９塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１０～２５塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは８～１２塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは９～１３塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１０～１４塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１１～１５塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１２～１６塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１３～１７塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１４～１８塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１５～１９塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１６～２０塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１７～２１塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１８～２２塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１９～２３塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは２０～２４塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは２１～２５塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは２２～２６塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは２３～２７塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは２４～２８塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは２５～２９塩基対である。

【0117】

特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは８塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは９塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１０塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１１塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１２塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１３塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１４塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１５塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１６塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１７塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１８塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは１９塩基対である。特定の実施形態において、第１の二重鎖の長さは２０塩基対である。第１の二重鎖の長さはまた、８～１８塩基対の範囲内の任意の２つの数字を選択することによって決定される範囲の塩基対（例えば、８～１２、１２～１４、１２～１５、１３～１４、１３～１５等）であってもよい。

【0118】

特定の実施形態において、第２の二重鎖（Ｄ２）の長さは１～６塩基対である。特定の実施形態において、第２の二重鎖の長さは１～３塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは１塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは２塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは３塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは４塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは５塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは６塩基対である。

【0119】

上記アンチセンス鎖の３’末端は、少なくとも３ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端は、少なくとも６ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、その３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、その３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端における一本鎖オーバーハングは、６ヌクレオチドからなる。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端における一本鎖オーバーハングは、７ヌクレオチドからなる。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端における一本鎖オーバーハングは、８ヌクレオチドからなる。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端の一本鎖オーバーハングは９ヌクレオチドからなる。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端における一本鎖オーバーハングは、１０ヌクレオチドからなる。

【0120】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、上記センス鎖及びアンチセンス鎖は別個の鎖であり、１２～１６塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、第２の二重鎖（Ｄ２）及びテトラループまたはトリループを含み、長さが１７～３２ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖は、長さが１８～２５ヌクレオチドであり、３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、センス鎖の長さは２８～３２ヌクレオチドであり、第２の二重鎖（Ｄ２）は、長さが６塩基対であり、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドを含まない。特定の実施形態において、センス鎖の長さは１８～２５ヌクレオチドであり、第２の二重鎖（Ｄ２）は、長さが１～５塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは１塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは２塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは３塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは４塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは５塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２の長さは６塩基対である。

【0121】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、上記センス鎖及びアンチセンス鎖は別個の鎖であり、１２～１６塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、１２～１６ヌクレオチドの第１の領域（Ｒ１）及び第１の小領域（Ｓ１）と第２の小領域（Ｓ２）を結合するテトラループまたはトリループを含む５～１６ヌクレオチドの第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、長さが１～６ヌクレオチドであり、互いに十分に相補的であって第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、上記アンチセンス鎖は、長さが２０～２３ヌクレオチドであり、その３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは５～１６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは６～１６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは７ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは８ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは９ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは１０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは１１ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは１２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは１３ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２は１４ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは１５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｒ２の長さは１６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｓ１及びＳ２のそれぞれの長さは１～６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｓ１及びＳ２のそれぞれの長さは１～３ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｓ１とＳ２のそれぞれの長さは３～６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｓ１及びＳ２のそれぞれの長さは３～５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｓ１及びＳ２のそれぞれの長さは１ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｓ１及びＳ２のそれぞれの長さは２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｓ１及びＳ２のそれぞれの長さは３ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｓ１及びＳ２のそれぞれの長さは４ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｓ１及びＳ２のそれぞれの長さは５ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｓ１及びＳ２のそれぞれの長さは６ヌクレオチドである。

【0122】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、上記センス鎖及びアンチセンス鎖は別個の鎖であり、１２～１６塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、長さが１６～３３ヌクレオチドであり、１２～１６ヌクレオチドの第１の領域（Ｒ１）及び第１の小領域（Ｓ１）と第２の小領域（Ｓ２）を結合するテトラループまたはトリループを含む５～１０ヌクレオチドの第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、長さが１～３ヌクレオチドであり、１～３塩基対の第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、アンチセンス鎖は、長さが２１～２３ヌクレオチドであり、その３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、アンチセンス鎖の長さは２２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つのヌクレオチドはＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、第２の二重鎖（Ｄ２）中の各ヌクレオチドは、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドである。

【0123】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、上記センス鎖及びアンチセンス鎖は別個の鎖であり、１２～１６塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、１２～１６ヌクレオチドの第１の領域（Ｒ１）及び第１の小領域（Ｓ１）と第２の小領域（Ｓ２）を結合するテトラループを含む６～１０ヌクレオチドの第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、長さが１～３ヌクレオチドであり、１～３塩基対の第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、アンチセンス鎖の長さは、その３’末端の６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２２ヌクレオチドである。特定の実施形態において、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つのヌクレオチドはＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、第２の二重鎖（Ｄ２）中の各ヌクレオチドはＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、第１の二重鎖は１２塩基対を有する。特定の実施形態において、第１の二重鎖は１４塩基対を有する。特定の実施形態において、第１の二重鎖は１６塩基対を有する。

【0124】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、上記センス鎖及びアンチセンス鎖は別個の鎖であり、１２～１６塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、１２～１６ヌクレオチドの第１の領域（Ｒ１）及び第１の小領域（Ｓ１）と第２の小領域（Ｓ２）を結合するトリループを含む５～９ヌクレオチドの第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、長さが１～３ヌクレオチドであり、１～３塩基対の第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、アンチセンス鎖は、長さが２２ヌクレオチドであり、その３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態において、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つのヌクレオチドはＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、第２の二重鎖（Ｄ２）中の各ヌクレオチドはＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、第１の二重鎖は１２塩基対を有する。特定の実施形態において、第１の二重鎖は１４塩基対を有する。特定の実施形態において、第１の二重鎖は１６塩基対を有する。

【0125】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、センス鎖は２１～２５ヌクレオチドを有し；アンチセンス鎖は、３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２２ヌクレオチドを有し、５’末端ヌクレオチドは、任意選択でリン酸模倣物を含み；第１の二重鎖の長さは１２～１６塩基対であり；センス鎖の第２の領域はトリループを含み、第２の二重鎖は、長さが３塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第２の二重鎖中のいずれのヌクレオチドも、ＬＮＡなどのＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。

【0126】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、センス鎖は２２～２６ヌクレオチドを有し；アンチセンス鎖は、３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２２ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、任意選択でリン酸模倣物を含み；第１の二重鎖の長さは１２～１６塩基対であり；センス鎖の第２の領域はテトラループを含み、第２の二重鎖は、長さが３塩基対であり、少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、第２の二重鎖中のいずれのヌクレオチドも、ＬＮＡなどのＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。

【0127】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、センス鎖は２１～３１ヌクレオチドを有し；アンチセンス鎖は、３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２２ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、任意選択でリン酸模倣物を含み；第１の二重鎖の長さは１２～１６塩基対であり；センス鎖の第２の領域はトリループを含み、第２の二重鎖は、長さが３～５塩基対であり、且つ少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含むか、または長さが６塩基対であり、且つＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含まない。特定の実施形態において、第２の二重鎖は、長さが３塩基対であり、第２の二重鎖のいずれのヌクレオチドも、ＬＮＡなどのＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。

【0128】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、センス鎖は２２～３２ヌクレオチドを有し；アンチセンス鎖は、３’末端に６～１０ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む２２ヌクレオチドを有し、上記アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは、任意選択でリン酸模倣物を含み；第１の二重鎖の長さは１２～１６塩基対であり；センス鎖の第２の領域はテトラループを含み、第２の二重鎖は、長さが３～５塩基対であり、且つ少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含むか、または長さが６塩基対であり、且つＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含まない。特定の実施形態において、第２の二重鎖は、長さが３塩基対であり、第２の二重鎖のいずれのヌクレオチドも、ＬＮＡなどのＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。

【0129】

特定の実施形態において、上記テトラループは、以下の配列、すなわち、ＵＮＣＧ（例えば、ＵＵＣＧ、ＵＣＣＧ、ＵＡＣＧ、もしくはＵＧＣＧ）、ＧＮＲＡ（例えば、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＣＡＡ、もしくはＧＵＡＡ）、ＣＵＹＧ（例えばＣＵＵＧ）、ＧＡＮＣ、Ａ／ＵＧＮＮ（例えばＵＧＡＡ）、及びＵＵＵＭ、ＧＧＵＧ、ＲＮＹＡ（例えばＡＡＣＡ）、及びＡＧＮＮ（例えば、ＡＧＵＡ、ＡＧＡＡ、もしくはＡＧＧＧ）、ＧＧＡＧ、ＵＵＵＧ、ＣＡＡＣ、ＣＵＵＧＵ、ＧＡＣＡＡ、またはＧＡＡＧＡ（但し、Ｎは任意の核酸塩基であり、Ｒはプリンであり、Ｙはピリミジンであり、ＭはＡまたはＣである）の１つを有する。特定の実施形態において、上記テトラループは、ＵＮＣＧ、ＧＮＲＡ、またはＣＵＵＧから選択されるＲＮＡテトラループである。特定の実施形態において、上記テトラループは配列ＧＮＲＡを有する。特定の実施形態において、上記テトラループは配列ＧＡＡＡを有する。特定の実施形態において、上記トリループは配列ＧＮＡを有する。特定の実施形態において、上記トリループは配列ＧＡＡを有する。

【0130】

本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、第２の二重鎖（Ｄ２）はＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含まない。特定の実施形態において、第２の二重鎖は、２～１２個のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、長さが１～６塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２は２～６個のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、長さが１～３塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２は２～１０個のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、長さが３～５塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２は２～８個のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、長さが３～４塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２は６個のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、長さが３塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２は４つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、長さが２塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２は２つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、長さが１塩基対である。特定の実施形態において、Ｄ２中の各ヌクレオチドはＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｄ２は、３つの不対のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ｄ２は、２つの不対のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、Ｄ２は、１つの不対のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。

【0131】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）またはアンチセンス鎖中に、如何なるＴ_mを上昇させるヌクレオチドも含まない。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）の外側に如何なるＴ_mを上昇させるヌクレオチドも含まない。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）中に少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチド１（Ｐ１）はＴ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖は、ヌクレオチド１にＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、且つセンス鎖の第１の領域（Ｒ１）中に２つのさらなるＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖は、ヌクレオチド１にＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、且つセンス鎖の第１の領域（Ｒ１）中に３つのさらなるＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖は、ヌクレオチド１にＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含み、且つセンス鎖の第１の領域（Ｒ１）中に４つのさらなるＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含む。本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド６（Ｇ６）と塩基対合するセンス鎖の第１の領域（Ｒ１）中のヌクレオチドは、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド５（Ｇ５）と塩基対合するセンス鎖の第１の領域（Ｒ１）中のヌクレオチドは、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド６及びヌクレオチド５と塩基対合するセンス鎖の第１の領域（Ｒ１）中のヌクレオチドは、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドである。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド１～４（Ｇ１～４）と塩基対合するセンス鎖の第１の領域（Ｒ１）中のヌクレオチドはいずれも、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドではない。

【0132】

本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子において、上記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、本明細書に記載の、またはその他の当技術分野において利用可能な二環式ヌクレオチドのいずれかであってよい。特定の実施形態において、本二本鎖核酸分子は、少なくとも２つの二環式ヌクレオチドを含み、それぞれの二環式ヌクレオチドは同一である。特定の実施形態において、上記二本鎖核酸分子は、少なくとも２つの異なる二環式ヌクレオチドを含む。

【0133】

本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは二環式糖部分を含み、上記二環式糖部分は、置換フラノシルであって、該フラノシルの２’炭素及び４’炭素を連結する架橋を含む上記置換フラノシルである。

【0134】

本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、本明細書に記載の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖａ、またはＶｂの構造を有する。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは式Ｉの構造を有する。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは式ＩＩの構造を有する。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは式ＩＩＩの構造を有する。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは式ＩＶの構造を有する。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは式Ｖａの構造を有する。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは式Ｖｂの構造を有する。

【0135】

特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、本明細書に記載の式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、またはＩｆの１種以上の構造を有する。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、本明細書に記載の式ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、またはＩＩｄの１種以上の構造を有する。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、本明細書に記載の式ＩＩＩａ及び／またはＩｌｌｂの構造を有する。特定の実施形態において、上記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、本明細書に記載の式ＩＶａ及び／またはＩＶｂの構造を有する。

【0136】

特定の実施形態において、第２の二重鎖（Ｄ２）及び／またはセンス鎖の第１の領域（Ｒ１）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチド（ＢＮ）は、以下、すなわち、（ａ）メチレンオキシＢＮ、（ｂ）エチレンオキシＢＮ、（ｃ）アミノオキシＢＮ、（ｄ）オキシアミノＢＮ、（ｅ）メチル（メチレンオキシ）ＢＮ（拘束エチルまたはｃＥＴとしても知られる）、（ｆ）メチレンチオＢＮ、（ｇ）メチレンアミノＢＮ、（ｈ）メチル炭素環式ＢＮ、及び（ｉ）プロピレン炭素環式ＢＮの１種以上である。一実施形態において、上記少なくとも１つのＢＮは、（ａ）メチレンオキシＢＮまたは（ｄ）オキシアミノＢＮ（但し、Ｒ₂はＣＨ₃である）。一実施形態において、上記少なくとも１つのＢＮは上記オキシアミノＢＮ（ｄ）である（但し、Ｒ₂はＣＨ₃である）。

【0137】

本明細書に開示される二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖中の少なくとも１つのヌクレオチドは２’－Ｆで修飾されている。特定の実施形態において、アンチセンス鎖中の少なくとも１つのヌクレオチドは、２’－Ｆで修飾され、上記２’－Ｆ修飾ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合以外の２つのリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している。特定の実施形態において、アンチセンス鎖中の少なくとも２つのヌクレオチドは２’－Ｆで修飾され、上記少なくとも２つの２’－Ｆ修飾ヌクレオチドはそれぞれ、ホスホジエステル結合以外の２つのリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している。特定の実施形態において、アンチセンス鎖中の少なくとも３つのヌクレオチドは２’－Ｆで修飾されており、上記少なくとも３つの２’－Ｆ修飾ヌクレオチドはそれぞれ、ホスホジエステル結合以外の２つのリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している。特定の実施形態において、アンチセンス鎖中の少なくとも４つのヌクレオチドは２’－Ｆで修飾され、上記少なくとも４つの２’－Ｆ修飾ヌクレオチドはそれぞれ、ホスホジエステル結合以外の２つのリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している。特定の実施形態において、２’－Ｆで修飾されたアンチセンス鎖中のいずれのヌクレオチドも、ホスホロチオアート結合などのホスホジエステル結合以外の２つのリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している。

【0138】

特定の実施形態において、上記アンチセンス鎖のヌクレオチド２（Ｇ２）は２’－Ｆで修飾されており、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合によってアンチセンス鎖のヌクレオチド１（Ｇ１）及びヌクレオチド３（Ｇ３）に結合している。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド７（Ｇ７）は２’－Ｆで修飾されており、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合によってアンチセンス鎖のヌクレオチド６（Ｇ６）及びヌクレオチド８（Ｇ８）に結合している。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０（Ｇ１０）は２’－Ｆで修飾されており、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合によってアンチセンス鎖のヌクレオチド９（Ｇ９）及びヌクレオチド１１（Ｇ１１）に結合している。特定の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチド１４（Ｇ１４）は２’－Ｆで修飾されており、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合によってアンチセンス鎖のヌクレオチド１３（Ｇ１３）及びヌクレオチド１５（Ｇ１５）に結合している。特定の実施形態において、Ｇ２、Ｇ７、Ｇ１０、及びＧ１４の１つ以上が２’－Ｆで修飾されており、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している。特定の実施形態において、Ｇ２及びＧ１４は２’－Ｆで修飾され、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している。特定の実施形態において、上記リン含有ヌクレオチド間結合はホスホロチオアート結合である。

【0139】

特定の実施形態において、センス鎖中の少なくとも１つのヌクレオチドは、ホスホジエステル結合以外のリン含有ヌクレオチド間結合に隣接している。特定の実施形態において、センス鎖のヌクレオチド１及び２は、ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合によって連結されている。特定の実施形態において、上記リン含有ヌクレオチド間結合はホスホロチオアート結合である。

【0140】

Ｔ_mを上昇させるヌクレオチド
本明細書に開示される二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）及び／またはセンス鎖中に存在するステムループ構造のステム部分（Ｄ２）に1つ以上のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを含んでいてもよい。

【0141】

Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドとしては、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、Ｇクランプ及びそれらの類似体、ヘキシトールヌクレオチド、または修飾ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定はされない。

【0142】

二環式ヌクレオチド
二環式ヌクレオチドは通常、４～７員環（フラノシルを含む、但しこれに限定されない）であって、該４～７員環の２つの原子を連結して第２の環を形成し、その結果二環式構造を生じる架橋を含む上記４～７員環をもつ糖部分を有する。かかる二環式ヌクレオチドは、二環式核酸及びロック核酸に対して、それぞれＢＮＡ及びＬＮＡを含むさまざまな名称を有する。二環式ヌクレオチドの合成及びそれらの核酸化合物中への組み込みも、例えば、Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９９８， ４， ４５５－４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， １９９８， ５４， ３６０７－３６３０；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ２０００， ９７， ５６３３－５６３８；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １９９８， ８， ２２１９－２２２２；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９９８， ６３， １００３５－１００３９；米国特許第７，４２７，６７２号、第７，０５３，２０７号、第６，７９４，４９９号、第６，７７０，７４８号、第６，２６８，４９０号、及び第６，７９４，４９９号、ならびに米国出願公開２００４０２１９５６５、２００４００１４９５９、２００３０２０７８４１、２００４０１９２９１８、２００３０２２４３７７、２００４０１４３１１４、及び２００３００８２８０７（これらのそれぞれは、その全体が本明細書に援用される）を含む文献に報告されている。

【0143】

上記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、二環式糖部分を含む二環式ヌクレオチドであってよい。特定の実施形態において、上記二環式糖部分は、４～７員の第１の環、及び上記糖部分の第１の環の任意の２つの原子を連結して第２の環を形成するノース型糖立体配座を形成する架橋を含む。特定の実施形態において、上記架橋は、第１の環の２’炭素及び４’炭素を連結して第２の環を形成する。

【0144】

通常、上記架橋は２～８個の原子を含む。特定の実施形態において、上記架橋は３個の原子を含む。特定の実施形態において、上記架橋は４個の原子を含む。特定の実施形態において、上記架橋は５個の原子を含む。特定の実施形態において、上記架橋は６個の原子を含む。特定の実施形態において、上記架橋は７個の原子を含む。特定の実施形態において、上記架橋は８個の原子を含む。特定の実施形態において、上記架橋は８個を超える原子を含む。

【0145】

特定の実施形態において、上記二環式糖部分は、置換フラノシルであって、該フラノシルの２’炭素及び４’炭素を連結して第２の環を形成する架橋を含む上記置換フラノシルである。特定の実施形態において、上記二環式ヌクレオチドは、式Ｉ：

式Ｉ
（式中、Ｂは核酸塩基であり、
Ｇは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ₂、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、Ｃ₂～Ｃ₆アルケニル、Ｃ₂～Ｃ₆アルキニル、置換Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、置換Ｃ₂～Ｃ₆アルケニル、置換Ｃ₂～Ｃ₆アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、または置換チオであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ₁であり、但し、Ｒ₁は、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、Ｃ₁～Ｃ₆アルコキシ、フェニル、またはピレニルであり、
Ｗ_a及びＷ_bはそれぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または式Ｉで表されるヌクレオチドを別のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基であり、Ｗ_aまたはＷ_bの少なくとも一方は、式Ｉで表されるヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基である）
の構造を有する。

【0146】

式Ｉの特定の実施形態において、ＧはＨであり、ＸはＮＲ₁であり、但し、Ｒ₁はフェニルまたはピレニルである。式Ｉの特定の実施形態において、ＧはＨであり、ＸはＳである。

【0147】

式Ｉの特定の実施形態において、ＧはＨであり、ＸはＯである。

式Ｉａ

【0148】

式Ｉの特定の実施形態において、ＧはＨであり、ＸはＮＲ₁であり、但し、Ｒ₁は、Ｈ、ＣＨ₃、またはＯＣＨ₃である。

式Ｉｂ

【0149】

式Ｉの特定の実施形態において、ＧはＯＨまたはＮＨ₂であり、ＸはＯである。

【0150】

式Ｉの特定の実施形態において、ＧはＯＨであり、ＸはＯである。

式Ｉｃ

【0151】

式Ｉの特定の実施形態において、ＧはＮＨ₂であり、ＸはＯである。

式Ｉｄ

【0152】

式Ｉの特定の実施形態において、ＧはＣＨ₃またはＣＨ₂ＯＣＨ₃であり、ＸはＯである。式Ｉの特定の実施形態において、ＧはＣＨ₃であり、ＸはＯである。

式Ｉｅ

【0153】

式Ｉの特定の実施形態において、ＧはＣＨ₂ＯＣＨ₃であり、ＸはＯである。

式Ｉｆ

【0154】

式Ｉの特定の実施形態において、上記二環式ヌクレオチドは、式ＩＩ：

式ＩＩ
（式中、Ｂは核酸塩基であり、
Ｑ₁はＣＨ₂またはＯであり
Ｘは、ＣＨ₂、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ₁であり、但し、Ｒ₁は、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、Ｃ₁～Ｃ₆アルコキシ、フェニル、またはピレニルであり、
Ｑ₁がＯである場合は、ＸはＣＨ₂であり、
Ｑ₁がＣＨ₂である場合は、Ｘは、ＣＨ₂、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ₁であり、但し、Ｒ₁は、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、Ｃ₁～Ｃ₆アルコキシ、フェニル、またはピレニルであり、
Ｗ_a及びＷ_bはそれぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または式ＩＩで表されるヌクレオチドを別のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基であり、Ｗ_aまたはＷ_bの少なくとも一方は、式ＩＩで表されるヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基である）
の構造を有する。

【0155】

式ＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₁はＯであり、ＸはＣＨ₂である。

式ＩＩａ

【0156】

式ＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₁はＣＨ₂であり、ＸはＯである。

式ＩＩｂ

【0157】

式ＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₁はＣＨ₂であり、ＸはＮＲ₁であり、但し、Ｒ₁は、Ｈ、ＣＨ₃、またはＯＣＨ₃である。

式ＩＩｃ

【0158】

式ＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₁はＣＨ₂であり、ＸはＮＨである。

式ＩＩｄ

【0159】

特定の実施形態において、上記二環式ヌクレオチドは、式ＩＩＩ：

式ＩＩＩ
（式中、Ｂは核酸塩基であり、
Ｑ₂はＯまたはＮＲ₁であり、但し、Ｒ₁は、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、Ｃ₁～Ｃ₆アルコキシ、フェニル、またはピレニルであり、
Ｘは、ＣＨ₂、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ₁であり、但し、Ｒ₁は、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、Ｃ₁～Ｃ₆アルコキシ、フェニル、またはピレニルであり、
Ｑ₂がＯである場合は、ＸはＮＲ₁であり、
Ｑ₂がＮＲ₁である場合は、ＸはＯまたはＳであり、
Ｗ_a及びＷ_bはそれぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または式ＩＩＩで表されるヌクレオチドを別のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基であり、Ｗ_aまたはＷ_bの少なくとも一方は、式ＩＩＩで表されるヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基である）
の構造を有する。

【0160】

式ＩＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₂はＯであり、ＸはＮＲ₁である。式ＩＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₂はＯであり、ＸはＮＲ₁であり、但し、Ｒ₁は、Ｃ₁～Ｃ₆アルキルである。式ＩＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₂はＯであり、ＸはＮＲ₁であり、Ｒ₁はＨまたはＣＨ₃である。

【0161】

式ＩＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₂はＯであり、ＸはＮＲ₁であり、Ｒ₁はＣＨ₃である。

式ＩＩＩａ

【0162】

式ＩＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₂はＮＲ₁であり、ＸはＯである。式ＩＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₂はＮＲ₁であり、Ｒ₁はＣ₁～Ｃ₆アルキルであり、ＸはＯである。

【0163】

式ＩＩＩの特定の実施形態において、Ｑ₂はＮＣＨ₃であり、ＸはＯである。

式ＩＩＩｂ

【0164】

特定の実施形態において、上記二環式ヌクレオチドは式ＩＶ：

式ＩＶ
（式中、Ｂは核酸塩基であり、
Ｐ₁及びＰ₃はＣＨ₂であり、Ｐ₂はＣＨ₂またはＯであり、Ｐ₄はＯであり、
Ｗ_a及びＷ_bはそれぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または式ＩＶで表されるヌクレオチドを別のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基であり、Ｗ_aまたはＷ_bの少なくとも一方は、式ＩＶで表されるヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基である）
の構造を有する。

【0165】

式ＩＶの特定の実施形態において、Ｐ₁、Ｐ₂、及びＰ₃はＣＨ₂であり、Ｐ₄はＯである。

式ＩＶａ

【0166】

式ＩＶの特定の実施形態において、Ｐ₁及びＰ₃はＣＨ₂であり、Ｐ₂はＯであり、Ｐ₄はＯである。

式ＩＶｂ

【0167】

特定の実施形態において、上記二環式ヌクレオチドは、式ＶａまたはＶｂ：

（式中、Ｂは核酸塩基であり、
ｒ₁、ｒ₂、ｒ₃、及びｒ₄はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ₁～Ｃ₁₂アルキル、置換Ｃ₁～Ｃ₁₂アルキル、Ｃ₂～Ｃ₁₂アルケニル、置換Ｃ₂～Ｃ₁₂アルケニル、Ｃ₂～Ｃ₁₂アルキニル、置換Ｃ₂～Ｃ₁₂アルキニル、Ｃ₁～Ｃ₁₂アルコキシ、置換Ｃ₁～Ｃ₁₂アルコキシ、ＯＴ₁、ＳＴ₁、ＳＯＴ₁、ＳＯ₂Ｔ₁、ＮＴ₁Ｔ₂、Ｎ₃、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＴ₁、Ｃ（＝Ｏ）ＮＴ₁Ｔ₂、Ｃ（＝Ｏ）Ｔ₁、Ｏ─Ｃ（＝Ｏ）ＮＴ₁Ｔ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＴ₁Ｔ₂、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＴ₁Ｔ₂、もしくはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＴ₁Ｔ₂であり、但し、Ｔ₁及びＴ₂のそれぞれは独立に、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、もしくは置換Ｃ₁～Ｃ₁₆アルキルであるか、または
ｒ₁及びｒ₂もしくはｒ₃及びｒ₄は互いに結合して＝Ｃ（ｒ₅）（ｒ₆）となり、但し、ｒ₅及びｒ₆はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ₁～Ｃ₁₂アルキル、もしくは置換Ｃ₁～Ｃ₁₂アルキルであり、
Ｗ_a及びＷ_bはそれぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または式Ｖで表されるヌクレオチドを別のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基であり、Ｗ_aまたはＷ_bの少なくとも一方は、式Ｖで表されるヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基である）
の構造を有する。

【0168】

特定の実施形態において、上記二環式糖部分は、置換フラノシルであって、該フラノシルの２’炭素及び４’炭素を連結して第２の環を形成する架橋を含む上記置換フラノシルであり、フラノシルの２’炭素及び４’炭素を連結する上記架橋としては、
ａ）例えば、４’－ＣＨ₂－ＮＨ－Ｏ－２’（ＢＮＡ^NCとしても知られる）、４’－ＣＨ₂－Ｎ（ＣＨ₃）－Ｏ－２’（ＢＮＡ^NC［ＮＭｅ］としても知られる）を含む、４’－ＣＨ₂－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’及び４’－ＣＨ₂－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₁₂アルキル、または保護基である）（本記述をもってその全体が援用される米国特許第７，４２７，６７２号に記載される）、
ｂ）４’－ＣＨ₂－２’、４’－（ＣＨ₂）₂－２’、４’－（ＣＨ₂）₃－２’、４’－（ＣＨ₂）－Ｏ－２’（ＬＮＡとしても知られる）、４’－（ＣＨ₂）－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ₂）₂－Ｏ－２’（ＥＮＡとしても知られる）、４’－ＣＨ（ＣＨ₃）－Ｏ－２’（ｃＥｔとしても知られる）、及び４’－ＣＨ（ＣＨ₂ＯＣＨ₃）－Ｏ－２’（ｃＭＯＥとしても知られる）、ならびにそれらの類似体（本記述をもってその全体が援用される米国特許第７，３９９，８４５号に記載される）、
ｃ）４’－Ｃ（ＣＨ₃）（ＣＨ₃）－Ｏ－２’及びその類似体（本記述をもってその全体が援用される米国特許第８，２７８，２８３号に記載される）、
ｄ）４’－ＣＨ₂－Ｎ（ＯＣＨ₃）－２’及びその類似体（本記述をもってその全体が援用される米国特許第８，２７８，４２５号に記載される）、
ｅ）４’－ＣＨ₂－Ｏ－Ｎ（ＣＨ₃）－２’及びその類似体（本記述をもってその全体が援用される米国特許公開第２００４／０１７１５７０号に記載される）、
ｆ）４’－ＣＨ₂－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ₃）－２’及びその類似体（本記述をもってその全体が援用されるＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ２００９， ７４， １１８－３４に記載される）、ならびに
ｇ）４’－ＣＨ₂－Ｃ（＝ＣＨ₂）－２’及びその類似体（本記述をもってその全体が援用される米国特許第８，２７８，４２６号に記載される）
が挙げられるが、これらに限定はされない。

【0169】

特定の実施形態において、上記二環式ヌクレオチド（ＢＮ）は、以下、すなわち、（ａ）メチレンオキシＢＮ、（ｂ）エチレンオキシＢＮ、（ｃ）アミノオキシＢＮ、ｄ）オキシアミノＢＮ、（ｅ）メチル（メチレンオキシ）ＢＮ（拘束エチルまたはｃＥＴとしても知られる）、（ｆ）メチレンチオＢＮ、（ｇ）メチレンアミノＢＮ、（ｈ）メチル炭素環式ＢＮ、及び（ｉ）プロピレン炭素環式ＢＮ（以下に示す）の１種以上である。

【0170】

上記（ａ）～（ｉ）の二環式ヌクレオチドにおいて、Ｂは核酸塩基であり、Ｒ₂はＨまたはＣＨ₃であり、Ｗ_a及びＷ_bはそれぞれ独立に、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または上記二環式ヌクレオチドを別のヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基であり、Ｗ_aまたはＷ_bの少なくとも一方は、上記二環式ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基である。

【0171】

上記オキシアミノＢＮ（ｄ）の一実施形態において、Ｒ₂は以下のようにＣＨ₃である（ＢＮＡ^NC［ＮＭｅ］としても知られる）。

【0172】

特定の実施形態において、二環式糖部分及びかかる二環式糖部分を組み込む二環式ヌクレオチドはさらに、異性体の立体配置によって規定される。特定の実施形態において、上記二環式糖部分または二環式ヌクレオチドはα－Ｌ立体配置をとっている。特定の実施形態において、上記二環式糖部分または二環式ヌクレオチドはβ－Ｄ立体配置をとっている。例えば、特定の実施形態において、上記二環式糖部分または二環式ヌクレオチドは、α－Ｌ立体配置（α－Ｌ ＬＮＡ）において２’Ｏ、４’－Ｃ－メチレン架橋（２’－Ｏ－ＣＨ₂－４’）を含む。特定の実施形態において、上記二環式糖部分または二環式ヌクレオチドはＲ立体配置をとっている。特定の実施形態において、上記二環式糖部分または二環式ヌクレオチドはＳ立体配置をとっている。例えば、特定の実施形態において、上記二環式糖部分または二環式ヌクレオチドは、Ｓ立体配置の４’－ＣＨ（ＣＨ₃）－Ｏ－２’架橋（すなわちｃＥｔ）を含む。

【0173】

三環式ヌクレオチド
特定の実施形態において、上記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは三環式ヌクレオチドであってよい。三環式ヌクレオチドの合成及びそれらの核酸化合物中への組み込みも、例えば、Ｓｔｅｆｆｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９７；１１９：１１５４８－１１５４９；Ｓｔｅｆｆｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９９９；１２１（１４）：３２４９－３２５５；Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００２；１２４：５９９３－６００２；Ｉｔｔｉｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００４；３２（１）：３４６－３５３；Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００６；１２：８０１４－８０２３；Ｉｖａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ２００７；１７：５４－６５（これらのそれぞれは、本記述をもってその全体が援用される）を含む文献に報告されている。

【0174】

特定の実施形態において、上記三環式ヌクレオチドは、例えば、Ｌｅｕｍａｎｎ ＣＪ， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２００２；１０：８４１－８５４ならびに米国出願公開２０１５／０２５９６８１及び２０１８／０１６２８９７（これらはそれぞれ、本記述をもって援用される）において議論されているように、３’炭素中心と５’炭素中心が、シクロプロパン環に融合したエチレンによって連結されているトリシクロヌクレオチド（トリシクロＤＮＡとも呼ばれる）である。特定の実施形態において、上記三環式ヌクレオチドは、例えば、米国出願公開２０１５／０１１２０５５（本記述をもって援用される）で議論されているように、置換フラノシル環であって、該フラノシルの２’炭素と４’炭素を連結して第２の環を形成する架橋を含む上記置換フラノシル環、及び上記フラノシルの２’炭素と４’炭素を連結する上記架橋のメチレン基に５’炭素を連結する基から生じる第３の縮合環を含む。

【0175】

他のＴ_mを上昇させるヌクレオチド
二環式及び三環式ヌクレオチドに加えて、他のＴ_mを上昇させるヌクレオチドを、本明細書に記載の核酸阻害剤分子に使用することができる。例えば、特定の実施形態において、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、Ｇクランプ、グアニジンＧクランプ、もしくはそれらの類似体（Ｗｉｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ， ２００２；１１４：１２３及びＷｉｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ２００３；１１４：１２３）、ヘキシトールヌクレオチド（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ， Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ２０１０；７：１－５９）、または修飾ヌクレオチドである。上記修飾ヌクレオチドは、例えば、５－ブロモ－ウラシル、５－ヨード－ウラシル、５－プロピニル修飾ピリミジン、もしくは２－アミノアデニン（２，６－ジアミノプリンとも呼ばれる）（Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． ＆ Ｂｉｏｌ．２０１２；１９：９３７－５４）、または２－チオウリジン、５Ｍｅ－チオウリジン、及びシュードウリジンを含む、本明細書に記載の修飾核酸塩基を有していてもよい。上記修飾ヌクレオチドは、上記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドが、糖部分の２’炭素において、２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅで修飾されていないことを除いて、例えば、米国特許第８，９７５，３８９号（本記述をもって援用される）に記載されるか、または本明細書に記載される修飾糖部分を有していてもよい。

【0176】

特定の実施形態において、上記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは二環式ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは三環式ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、Ｇクランプ、グアニジンＧクランプ、またはそれらの類似体である。特定の実施形態において、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドはヘキシトールヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは二環式または三環式ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、またはＧクランプ、グアニジンＧクランプもしくはそれらの類似体である。特定の実施形態において、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、Ｇクランプ、グアニジンＧクランプ、もしくはそれらの類似体、またはヘキシトールヌクレオチドである。

【0177】

特定の実施形態において、上記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、１つの該ヌクレオチドの取り込み当り当該核酸阻害剤分子のＴ_mを少なくとも２℃上昇させる。特定の実施形態において、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、１つの該ヌクレオチドの取り込み当り当該核酸阻害剤分子のＴ_mを少なくとも３℃上昇させる。特定の実施形態において、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、１つの該ヌクレオチドの取り込み当り当該核酸阻害剤分子のＴ_mを少なくとも４℃上昇させる。特定の実施形態において、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドは、１つの該ヌクレオチドの取り込み当り当該核酸阻害剤分子のＴ_mを少なくとも５℃上昇させる。

【0178】

他の修飾
本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）及び／またはセンス鎖の第１の領域（Ｒ１）中の少なくとも１つのＴ_mを上昇させるヌクレオチドに加えて、他のヌクレオチド修飾を含んでいてもよい。一般的には、本二本鎖核酸阻害剤分子の複数のヌクレオチドが、ヌクレアーゼに対する耐性または免疫原性の低下などの上記分子の種々の特性を改善するために修飾される。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００９）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３７， ２８６７－２８８１を参照されたい。多くのヌクレオチド修飾が、オリゴヌクレオチド分野で、特に核酸阻害剤分子に関して使用されてきた。かかる修飾は、糖部分、ホスホジエステル結合、及び核酸塩基を含む当該ヌクレオチドの任意の部分に対して行うことができる。ヌクレオチド修飾の一般的な例としては、２’－Ｆ、２’－Ｏ－メチル（「２’－ＯＭｅ」または「２’－ＯＣＨ₃」、及び２’－Ｏ－メトキシエチル（「２’－ＭＯＥ」または「２’－ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＯＣＨ₃」）が挙げられるが、これらに限定はされない。本明細書に記載されるように、修飾は、５’炭素などの、ヌクレオチドの糖部分の他の部分で行うこともできる。

【0179】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子はまた、当技術分野で公知であり、且つ本明細書に記載されるように、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル以外の１種以上の修飾核酸塩基を１’位に含むことができる。特定の実施形態において、上記修飾核酸塩基またはユニバーサル核酸塩基は窒素塩基である。特定の実施形態において、上記修飾核酸塩基は窒素原子を含まない。例えば、米国特許出願公開第２００８０２７４４６２号を参照されたい。特定の実施形態において、上記修飾ヌクレオチドは核酸塩基を含まない（無塩基）。修飾核酸塩基の一般的な例は５’－メチルシトシンである。

【0180】

ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に存在するヌクレオチド間結合は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。修飾ホスホジエステル結合は、当技術分野において公知であり、且つ本明細書に記載される、リン原子を含有するヌクレオチド間結合及びリン原子を含有しないヌクレオチド間結合を含む、天然に存在しないヌクレオチド間結合基を含む。通常は、本二本鎖核酸阻害剤分子は、本明細書に記載される１つ以上のリン含有ヌクレオチド間結合基を含む。他の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子の上記ヌクレオチド間結合基の１つ以上は、本明細書に記載の非リン含有結合である。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、１つ以上のリン含有ヌクレオチド間結合基及び１つ以上の非リン含有ヌクレオチド間結合基を含む。

【0181】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、少なくとも１つのホスホロチオアートヌクレオチド間連結基を含む。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、１２個未満、例えば１０個未満のホスホロチオアートヌクレオチド間連結基を含む。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は５～１１個のホスホロチオアートヌクレオチド間連結基「ＰＳ」を含む。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は５つのＰＳを含む。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は７個のＰＳを含む。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は９個のＰＳを含む。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は１１個のＰＳを含む。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖中に１つのＰＳを含む。特定の実施形態において、２’－Ｆで修飾された各ヌクレオチドは、２つのＰＳに隣接している。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、アンチセンス鎖中に２つのＰＳを含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は４つのＰＳを含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は６個のＰＳを含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は８個のＰＳを含む。特定の実施形態において、アンチセンス鎖は１０個のＰＳを含む。

【0182】

本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端は、ヒドロキシルまたはホスファート基などの天然の置換基を含んでいてもよい。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端にヒドロキシル基が結合している。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端にホスファート基が結合している。通常は、上記ホスファートは、オリゴヌクレオチド合成の前にモノマーに添加される。他の実施形態において、５’リン酸化は、核酸阻害剤分子が細胞質ゾルに導入された後に、例えば細胞質ゾルＣｌｐ１キナーゼによって自然に行われる。いくつかの実施形態において、５’末端ホスファートは、５’－モノホスファート［（ＨＯ）₂（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’］、５’－ジホスファート［（ＨＯ）₂（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’］、または５’－トリホスファート［（ＨＯ）₂（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’］などのホスファート基である。

【0183】

本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端も修飾されていてよい。例えば、いくつかの実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端は、ホスホルアミダート［（ＨＯ）₂（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ₂）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’］に結合している。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端は、ホスファート模倣物に結合している。好適なホスファート模倣物としては、５’－メチレンホスホナート（５’－ＭＰ）、５’－（Ｅ）－ビニルホスホナート（５’－ＶＰ）などの５’－ホスホナートが挙げられる。Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ２０１２， １５０－８８３－９４；ＷＯ２０１４／１３０６０７。他の好適なホスファート模倣物としては、国際公開第ＷＯ２０１８／０４５３１７号（本記述をもってその全体が援用される）に記載の、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドの糖部分（例えば、リボースもしくはデオキシリボースまたはそれらの類似体）の４’炭素に結合している４－ホスファート類似体が挙げられる。例えば、いくつかの実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端は、オキシメチルホスホナートに結合しており、上記オキシメチル基の酸素原子は、上記糖部分またはその類似体の４’炭素に結合している。他の実施形態において、上記ホスファート類似体は、チオメチルホスホナートまたはアミノメチルホスホナートであり、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子は、上記糖部分またはその類似体の４’炭素に結合している。

【0184】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。通常は、本二本鎖核酸阻害剤分子が含むデオキシリボヌクレオチドは５つ未満である。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は１つ以上のリボヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子の全てのヌクレオチドがリボヌクレオチドである。

【0185】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のステム（第２の二重鎖またはＤ２）外の１つ以上のヌクレオチドは、本明細書に記載の、二環式または三環式ヌクレオチド中に存在する修飾環構造を含む、但しこれらに限定されない、修飾環構造を有する糖部分、及び非ロック核酸（「ＵＮＡ」）を含む（例えば、Ｓｎｅａｄ ｅｔ ａｌ． （２０１３）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ２，ｅ１０３（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１３．３６）を参照のこと）。

【0186】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子の１つまたは２つのヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾されている。一般的には、上記グルタチオン感受性部分は、糖部分の２’炭素に位置し、スルホニル基を含む。特定の実施形態において、上記グルタチオン感受性部分は、例えば、国際公開第ＷＯ２０１８／０４５３１７号（本記述をもってその全体が援用される）に記載されるホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成法と適合性がある。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子の３つ以上のヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾されている。特定の実施形態において、上記ヌクレオチドのほとんどがグルタチオン感受性部分で可逆的に修飾されている。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子の全てまたは実質的に全てのヌクレオチドが、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾されている。

【0187】

上記少なくとも１つのグルタチオン感受性部分は通常、本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端または３’末端ヌクレオチドに位置する。しかし、上記少なくとも１つのグルタチオン感受性部分は、本二本鎖核酸阻害剤分子中の任意の目的のヌクレオチドに位置していてもよい。

【0188】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は完全に修飾されており、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれのヌクレオチドも修飾されており、通常は、いずれのヌクレオチドも糖部分の２’位で修飾されている。特定の実施形態において、完全に修飾された核酸阻害剤分子は可逆的な修飾を含まない。いくつかの実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖の少なくとも１個、例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、または４３個のヌクレオチドが修飾されている。いくつかの実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖の少なくとも１個、例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、または３３個のヌクレオチドが修飾されている。

【0189】

特定の実施形態において、上記完全に修飾された核酸阻害剤分子は、１種以上の可逆的なグルタチオン感受性部分で修飾されている。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子の実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子のヌクレオチドの半分以上が、可逆的な修飾以外の化学修飾で修飾されている。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子の、可逆的な修飾以外の化学修飾で修飾されているヌクレオチドは半分未満である。修飾は、本核酸阻害剤分子上において群で行われていてもよく、または異なる修飾ヌクレオチドを点在させてもよい。

【0190】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、１つから全てのヌクレオチドが２’炭素で修飾されている。特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、２’－Ｆ、２’－ＯＭｅ、及び／または２’－ＭＯＥで部分的にまたは完全に修飾されている。本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、１つから全てのリン原子が修飾されており、且つ１つから全てのヌクレオチドが、糖部分の２’炭素で修飾されている。

【0191】

本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖上のいずれのヌクレオチドも、糖部分の２’炭素で修飾されている。本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖上のいずれのヌクレオチドも、センス鎖の第２の領域（Ｒ２）中のヌクレオチドを除いて、糖部分の２’炭素で２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅによって修飾されている。本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれのヌクレオチドも、上記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドを除いて、糖部分の２’炭素で２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅによって修飾されている。本二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれのヌクレオチドも、上記Ｔ_mを上昇させるヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃなどの糖リガンド部分にコンジュゲートしたループ領域中のヌクレオチドを除いて、糖部分の２’炭素で２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅによって修飾されている。

【0192】

標的遺伝子発現の低減方法
本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子は、任意の目的の標的遺伝子の標的ｍＲＮＡ発現の低減方法に使用することができる。一般的に、ｍＲＮＡ発現の低減方法は、本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子を、試料またはそれを必要とする対象に、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を低減するのに十分な量で投与することを含む。上記方法は、インビトロまたはインビボで実施することができる。

【0193】

標的ＲＮＡのレベルまたは活性は、当技術分野で現在公知の、または後に開発される好適な方法により測定することができる。標的ＲＮＡ及び／または標的遺伝子の「発現」を測定するために使用される方法は、当該標的遺伝子及びそのコードされるＲＮＡの性質に依存する場合があることを理解することができる。例えば、標的ＲＮＡ配列がタンパク質をコードする場合、用語「発現」とは、標的遺伝子（ゲノムまたは外因性起源のいずれか）に由来するタンパク質または標的ＲＮＡ／転写物を指す場合がある。かかる場合には、標的ＲＮＡの発現は、上記標的ＲＮＡ／転写物の量を直接測定することにより、または上記標的ＲＮＡ／転写物によりコードされるタンパク質の量を測定することによって測定することができる。タンパク質は、タンパク質アッセイにおいて、例えば、染色もしくは免疫ブロッティングにより、または当該タンパク質が、測定することができる反応を触媒する場合、反応速度を測定することによって測定することができる。全てのかかる方法は当技術分野で公知であり、使用することができる。標的ＲＮＡレベルが測定されることになる場合、ＲＮＡレベルを検出するための当技術分野で認められている方法を使用することができる（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなど）。上記の測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物、または他の好適な原物質に対して実施することができる。

【0194】

上記標的遺伝子は、ヒト標的遺伝子などの任意の哺乳動物由来の標的遺伝子であってよい。本方法によれば、任意の標的遺伝子を発現停止させることができる。特定の実施形態において、標的遺伝子は、慢性肝疾患または慢性腎疾患に関連し、例えば、ＡＧＸＴ、ＧＲＨＰＲ、ＨＯＧＡ１、ＨＡＯ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、またはＬＤＨＡを含む。特定の実施形態において、標的遺伝子はウイルス感染症に関連し、例えば、ＨＢＶ遺伝子またはＨＣＶ遺伝子を含む。特定の実施形態において、標的遺伝子は心血管疾患に関連し、例えば、ＡＰＯＣ３またはＰＣＳＫ９を含む。特定の実施形態において、標的遺伝子はアルコール代謝及び肝機能に関連し、例えば、ＡＬＤＨ２を含む。

【0195】

その他の例示的な標的遺伝子としては、ＫＲＡＳ、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ１、ＴＴＲ、ＰＤＧＦベータ遺伝子、Ｅｒｂ－Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ－２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ－１遺伝子、ベータカテニン遺伝子、ｃ－ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩアルファ遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、腫瘍抑制遺伝子の変異、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされない。

【0196】

医薬組成物
本開示は、治療有効量の本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

【0197】

これらの医薬組成物は、従来の滅菌技法によって滅菌しても、または滅菌ろ過してもよい。得られた水溶液は、そのままでの使用向けに包装しても、または凍結乾燥してもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水性賦形剤と混合される。製剤のｐＨは通常、３～１１、より好ましくは、５～９または６～８、最も好ましくは、７～８、例えば、７～７．５となる。

【0198】

本開示の医薬組成物は、治療上の使用に適用される。従って、本開示の一態様は、疾患または疾病に罹患しているヒトを含む、但しこれに限定されない対象に、治療有効量の本開示の医薬組成物を投与することによって、上記対象を治療するために使用することができる医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、上記疾患または疾病は本明細書に記載のがんである。

【0199】

特定の実施形態において、本開示は、治療有効量の、それを必要とする対象の治療用の本明細書に記載の医薬組成物の使用を特徴とする。特定の実施形態において、上記対象は本明細書に記載のがんを有する。

【0200】

薬学的に許容される賦形剤
本開示において有用な上記薬学的に許容される賦形剤は通常は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ｂｙ Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ， １５^th Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９７５）は、１種以上の治療用組成物の薬学的な送達に好適な組成物及び製剤について記載する。薬学的に許容される賦形剤として機能することができる材料のいくつかの例としては、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロースならびにナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロースの誘導体；麦芽；ゼラチン；カカオバター及び坐剤用ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油などの油；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（等張性生理学的食塩水；リンガー溶液）；エチルアルコール；ｐＨ緩衝液；グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリオール；ならびに医薬製剤に使用される、他の非毒性の適合性のある物質が挙げられる。

【0201】

剤形
本医薬組成物は、通常の慣行に従って選択することができる、任意の意図される投与経路向けに、従来の賦形剤と共に製剤化することができる。

【0202】

一実施形態において、本医薬組成物は、本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子を含み、例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、または硬膜外注射による非経口投与に適する。通常、本開示の本医薬組成物は、非経口投与用に液体形態で製剤化される。

【0203】

非経口投与に適する剤形は通常、例として、滅菌水溶液、生理学的食塩水、プロピレングリコールなどの低分子量アルコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゼラチン、オレイン酸エチルなどの脂肪酸エステルなどを含む、非経口投与に適する１種以上のビヒクルを含む。非経口製剤は、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、当該製剤を意図される被投与者の血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含んでいてもよい。例えば、界面活性剤を使用することにより、妥当な流動性を維持することができる。本二本鎖核酸阻害剤を含む液体製剤を凍結乾燥して保存し、後に無菌注射用溶液で再構成した上で使用することができる。

【0204】

本医薬組成物はまた、周知の技法を使用して、局所もしくは経皮投与、経直腸もしくは経膣投与、眼内投与、鼻腔内投与、口腔内投与、または舌下投与を含む他の投与経路向けに製剤化することもできる。

【0205】

送達助剤
本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子を、例えば、米国特許第６，８１５，４３２号、第６，５８６，４１０号、第６，８５８，２２５号、第７，８１１，６０２号、第７，２４４，４４８号、及び第８，１５８，６０１号に開示されるものなどのリポソーム及び脂質；米国特許第６，８３５，３９３号、第７，３７４，７７８号、第７，７３７，１０８号、第７，７１８，１９３号、第８，１３７，６９５号、ならびに米国特許出願公開第２０１１／０１４３４３４号、第２０１１／０１２９９２１号、第２０１１／０１２３６３６号、第２０１１／０１４３４３５号、第２０１１／０１４２９５１号、第２０１２／００２１５１４号、第２０１１／０２８１９３４号、第２０１１／０２８６９５７号、及び第２００８／０１５２６６１号に開示されるものなどのポリマー材料；取り込み、分布、または吸収を支援するためのカプシド、カプソイド、もしくは受容体標的化分子を含む、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合する、上記でカプセル化する、上記とコンジュゲートさせる、あるいは他の方法で会合させてもよい。

【0206】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化される。脂質－核酸ナノ粒子は、通常複合体を形成させるために脂質を核酸と混合すると自発的に形成される。所望の粒度分布によっては、得られたナノ粒子混合物を任意選択で、例えば、ＬＩＰＥＸ（登録商標）押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ， Ｉｎｃ）などのバレル加熱型押出機を使用して、ポリカーボナート膜（例えば、１００ｎｍのカットオフ）を通して押し出してもよい。治療上の使用向けの脂質ナノ粒子を調製するには、当該ナノ粒子を形成させるために使用した溶媒（例えばエタノール）を除去すること及び／または緩衝液を交換することが望ましい場合があり、これは、例えば、透析またはタンジェンシャルフローろ過により実現することができる。核酸干渉分子を含む脂質ナノ粒子の製造方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８４２号及び第２０１４／０１０７１７８号に開示されるように、当技術分野で公知である。

【0207】

特定の実施形態において、上記ＬＮＰは、カチオン性リポソーム及びペグ化脂質を含むコア脂質成分を含む。上記ＬＮＰは、カチオン性脂質、構造脂質もしくは中性脂質、ステロール、ペグ化脂質、またはそれらの混合物などの、１種以上のエンベロープ脂質をさらに含んでいてもよい。

【0208】

ＬＮＰに使用されるカチオン性脂質は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８４２号及び第２０１４／０１０７１７８号で議論されるように、当技術分野で公知である。通常、上記カチオン性脂質は、生理学的ｐＨにおいて正味の正電荷を有する脂質である。特定の実施形態において、上記カチオン性リポソームは、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＬ－０４８、またはＤＬ－１０３である。特定の実施形態において、上記構造脂質または中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＤＯＰＣである。特定の実施形態において、上記ステロールはコレステロールである。特定の実施形態において、上記ペグ化脂質は、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＧ－ＰＥＧ、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２Ｋ、ＤＳＧ－ＰＥＧ２Ｋ、またはＤＳＧ－ｍＰＥＧである。一実施形態において、上記カチオン性脂質はＤＬ－０４８であり、上記ペグ化脂質はＤＳＧ－ｍＰＥＧであり、上記１種以上のエンベロープ脂質は、ＤＬ－１０３、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ－ｍＰＥＧである。例えば、本二本鎖核酸阻害剤分子を製剤化するために使用することができるＬＮＰの非限定的な一実施形態を示す図１１を参照されたい。

【0209】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、目的の組織への上記オリゴヌクレオチドの送達を誘導するリガンドに共有結合でコンジュゲートされる。多くのかかるリガンドが探索されている。例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ， Ｔｈｅｒ． Ｄｅｌｉｖ． ４（７）： ７９１－８０９ （２０１３）を参照されたい。例えば、本二本鎖核酸阻害剤分子を１つ以上の糖リガンド部分（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））にコンジュゲートさせて、上記オリゴヌクレオチドの肝臓への取り込みを誘導してもよい。例えば、米国特許第５，９９４，５１７号、米国特許第５，５７４，１４２号、ＷＯ２０１６／１００４０１を参照されたい。特定の実施形態において、上記１つ以上のリガンドは、本二本鎖核酸阻害剤分子のテトラループまたはトリループ中の１つ以上のヌクレオチドにコンジュゲートされる。

【0210】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、上記テトラループ中の２～４個の糖リガンド部分、または上記トリループ中の２つまたは３つの糖リガンド部分にコンジュゲートしている。一実施形態において、テトラループ中のヌクレオチドの２つが糖リガンド部分にコンジュゲートしている。一実施形態において、テトラループ中のヌクレオチドの３つが糖リガンド部分にコンジュゲートしている。別の実施形態において、テトラループ中の４つヌクレオチドが糖リガンド部分にコンジュゲートしている。一実施形態において、上記トリループ中のヌクレオチドの２つが糖部分にコンジュゲートしている。一実施形態において、トリループ中のヌクレオチドの３つが糖部分にコンジュゲートしている。特定の実施形態において、上記糖リガンド部分はＧａｌＮＡｃである。使用することができる他のリガンドとしては、マンノース－６－リン酸、コレステロール、葉酸、トランスフェリン、及びガラクトースが挙げられるが、これらに限定はされない（他の具体的な例示的リガンドについては、例えば、ＷＯ２０１２／０８９３５２を参照されたい）。

【0211】

上記リガンドは、それが目的の組織へのオリゴヌクレオチドの送達を誘導することが可能な限り、ヌクレオチドの任意の部分にコンジュゲートすることができる。特定の実施形態において、リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ）は、糖部分の２’位のヌクレオチドにコンジュゲートされる。

【0212】

投与／治療方法
一実施形態は、治療有効量の本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、障害の治療方法に関する。

【0213】

特定の実施形態において、本明細書に開示の医薬組成物は、増殖性、炎症性、自己免疫性、神経性、眼性、呼吸性、代謝性、皮膚病学的、聴覚性、肝臓、腎臓、もしくは感染性疾患に関連する症状の治療または予防に有用である可能性がある。一実施形態は、治療有効量の本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、増殖性、炎症性、自己免疫性、神経性、眼性、呼吸性、代謝性、皮膚病学的、聴覚性、肝臓、腎臓、または感染性疾患の治療方法に関する。

【0214】

特定の実施形態において、上記障害は、希少疾患、慢性肝疾患、慢性腎疾患、心血管疾患、またはウイルス感染性疾患である。特定の実施形態において、上記障害は、原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１、ＰＨ２、もしくはＰＨ３）または特発性高シュウ酸尿症を含む高シュウ酸尿症である。特定の実施形態において、上記障害は慢性腎障害（ＣＫＤ）である。特定の実施形態において、上記障害はピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症である。特定の実施形態において、上記障害はα１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠乏症である。

【0215】

特定の実施形態において、上記障害はがんである。かかるがんの非限定的な例としては、胆管癌、膀胱癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳癌、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生性癌、子宮頸癌、子宮頸部扁平上皮癌、直腸癌、大腸癌、結腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、大腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道癌、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼メラノーマ、ブドウ膜メラノーマ、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、淡明細胞型腎細胞癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、ウイルムス腫瘍、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝細胞癌、胆管細胞癌、肝芽腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽腫、口腔咽頭癌、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵管腺癌、偽乳頭状新生物、腺房細胞癌、前立腺癌、前立腺腺癌、皮膚癌、メラノーマ、悪性メラノーマ、皮膚メラノーマ、小腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮癌、または子宮肉腫が挙げられる。一般的には、本開示は、治療有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することによる、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝細胞癌、胆管細胞癌、及び肝芽腫の治療方法を特徴とする。

【0216】

いくつかの実施形態において、本開示は、標的遺伝子の発現を低減するのに十分な量の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における標的遺伝子の発現の低減方法であって、上記医薬組成物が、本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子及び同じく本明細書に記載される薬学的に許容される賦形剤を含む、上記方法を提供する。

【0217】

投薬及びスケジュール
一般的には、本二本鎖核酸阻害剤分子は非経口投与される（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与を介して）。他の実施形態において、上記医薬組成物は局所投与または全身投与を介して送達される。但し、本明細書に開示の医薬組成物はまた、例えば、口腔内投与、舌下投与、経直腸投与、経膣東洋、尿道内投与、局所投与、眼内投与、鼻腔内投与、及び／または耳内投与を含む、当技術分野で公知の任意の方法により投与されてもよく、この投与は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、水性懸濁液剤、ゲル剤、噴霧剤、坐剤、軟膏（ｓａｌｖｅ）、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）などを含んでいてもよい。

【0218】

特定の実施形態において、本二本鎖核酸阻害剤分子は、１日当たり被投与者の体重キログラム当たり２０マイクログラム～１０ミリグラム、キログラム当たり１００マイクログラム～５ミリグラム、キログラム当たり０．２５ミリグラム～５．０ミリグラム、またはキログラム当たり０．５～３．０ミリグラムの投薬量で投与される。通常は、本二本鎖核酸阻害剤分子は、１日当たり被投与者の体重キログラム当たり約０．２５～２．０ミリグラムの投薬量で投与される。

【0219】

本開示の医薬組成物は、毎日または間欠的に投与されてもよい。例えば、本二本鎖核酸阻害剤分子の間欠投与は、週に１～６日、月に１～６日、週に１回、隔週に１回、月に１回、隔月に１回、３ヶ月毎に１回、または年に１回もしくは２回の投与であってもよく、あるいは年に、月に、週に、もしくは日に複数回の投与に分けられてもよい。いくつかの実施形態において、間欠投与は、最初に二本鎖核酸阻害剤分子の投与があり、それに続いて、最大１週間、最大１ヶ月間、最大２ヶ月間、最大３ヶ月間、もしくは最大６ヶ月間以上の投与がない休止期間のサイクルでの投与を意味する場合があり、または間欠投与は、隔日、隔週、隔月、もしくは隔年での投与を意味する場合がある。

【0220】

本二本鎖核酸阻害剤分子の上記治療有効量は、投与経路ならびに対象の身長及び体重などの患者の身体的特徴、疾患の進行または浸透の程度、対象の年齢、健康状態、ならびに性別に依存する場合があり、これらの及び他の要因に応じ、必要次第で調整することができる。

【実施例】

【0221】

例１：短縮センス鎖を含む二本鎖核酸阻害剤分子のインビボ効力
種々の長さのセンス鎖を含む二本鎖核酸阻害剤分子の、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を低減する効力を評価した。例１で使用した８種の被験核酸阻害剤分子（構築物１～８）を図２Ａ～Ｈに示す。被験核酸阻害剤分子中の他のいずれのヌクレオチドも、ＧａｌＮＡｃに結合している上記ループ中のヌクレオチド及び上記二環式ヌクレオチドを除いて、糖部分の２’位で、２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅのいずれかによって修飾されている。構築物１は、短縮センス鎖を含まない対照分子を表す。構築物１において、センス鎖の長さは２９ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の３’末端は２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを含む。構築物２～８は、構築物１と、センス鎖の長さが異なり、その結果アンチセンス鎖の３’末端に一本鎖オーバーハングが生じる点で異なっていた。加えて、構築物２～８は、アンチセンス鎖上に、２’－Ｆ修飾ヌクレオチドであるヌクレオチド１４（Ｇ１４）に隣接するさらに２つのＰＳ結合を含んでいた。図２Ａ～Ｈの核酸阻害剤分子を以下の表にまとめる。
表１ 図１の被験核酸阻害剤

【0222】

構築物２～８は、アンチセンス鎖上のＧ１４に隣接する追加の２つのＰＳ結合及び短縮センス鎖長を除いて、構築物１と同一である。同様に、構築物２～８は、センス鎖の長さが異なることを除いて、互いに同一である。

【0223】

ＣＤ－１雌マウスをそれぞれ４頭のマウスの試験群に分け、その群に割り当てられた０．５ｍｇ／ｋｇの被験核酸阻害剤分子を投与した。加えて、４頭の対照ＣＤ－１マウスにプラセボ（ＰＢＳ）を投与した。投与は皮下で単回投与であり、投与の４日後にマウスを屠殺した。薬力学的検討を実施し、２つの４ｍｍパンチ生検を得ることによって肝臓組織を採取し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）中に保存し、後にｍＲＮＡ分析を実施した。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）を使用し、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）溶解試薬中で組織試料を均質化した。次いで、ＭａｇＭＡＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用し、製造元の使用説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）に従ってＲＮＡを精製した。大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を使用してｃＤＮＡを調製した。標的配列のプライマーを使用して、ＣＦＸ３８４リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）上でＰＣＲを実施した。

【0224】

短縮センス鎖を有する被検核酸阻害剤分子（構築物２～８）を、対照核酸阻害剤分子（構築物１）、ならびにＰＢＳ対照と比較した。図３に示すように、短縮センス鎖を含む被検核酸阻害剤分子は、センス鎖の長さが減少するにつれて、ｍＲＮＡ発現が比較的なだらかに減少した。構築物２、３、及び４は、それぞれ長さが２５、２４、及び２３ヌクレオチドのセンス鎖を含み、それぞれ６、７、及び８ヌクレオチドの３’アンチセンスオーバーハングを有するが、ＰＢＳとの対比で少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇのＥＤ₅₀を維持した。構築物２～６では、効力は、アンチセンス鎖の一本鎖３’オーバーハングの長さに逆比例した。それぞれ６及び７ヌクレオチドの３’アンチセンスオーバーハングを有する構築物２ならびに３は、それぞれ８及び９ヌクレオチドの３’アンチセンスオーバーハングを有する構築物４ならびに５よりも、より強力な標的遺伝子ｍＲＮＡノックダウンを示した。

【0225】

例２：短縮パッセンジャー鎖及び５’末端二環式ヌクレオチドを含む二本鎖核酸阻害剤分子のインビボ効力
種々の長さのセンス鎖及び該センス鎖の５’末端の二環式ヌクレオチド（すなわち、センス鎖のヌクレオチド１）を含む二本鎖核酸阻害剤分子の、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を低減する効力を評価した。例２（構築物１及び９～１５）で使用された８種の被験核酸阻害剤分子を図４Ａ～Ｈに示す。上記被験核酸阻害剤分子中の他のいずれのヌクレオチドも、ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートしているループ中のヌクレオチド及び上記二環式ヌクレオチドを除いて、糖部分の２’位で２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅのいずれかによって修飾されている。上記被験核酸阻害剤分子は、以下の点、すなわち、（１）センス鎖の長さ；（２）アンチセンス鎖上の２’－Ｆ修飾ヌクレオチド１４（Ｇ１４）に隣接する２つのＰＳ結合の存在；及び（３）センス鎖の５’末端のヌクレオチド１（Ｐ１）における二環式ヌクレオチド（ＬＮＡ）の存在において、対照核酸阻害剤分子と異なっていた。図４Ａ～Ｈ中の核酸阻害剤分子を以下の表にまとめる。
表２ 図４の被験核酸阻害剤

【0226】

構築物９～１５は、センス鎖のＰ１における上記二環式ヌクレオチドを除いて、それぞれ構築物２～８と同一であった。同様に、構築物９～１５は、センス鎖の長さが異なることを除いて、互いに同一である。

【0227】

ＣＤ－１雌マウスをそれぞれ４頭のマウスの試験群に分け、例１に上記した手順を実施し、各マウスに、その群に割り当てられた０．５ｍｇ／ｋｇの被験核酸阻害剤分子を投与し、肝臓組織試料を分析した。

【0228】

短縮センス鎖、及び該センス鎖のＰ１の二環式ヌクレオチドを有する被検核酸阻害剤分子（構築物９～１５）を、２９ヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端における２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する対照核酸分子（構築物１）、ならびにＰＢＳ対照と比較した。図５に示すように、短縮センス鎖及び該センス鎖の５’末端の二環式ヌクレオチドを含む被検核酸阻害剤分子は、センス鎖の長さが２１ヌクレオチドに短縮された（アンチセンス鎖の３’末端に１０ヌクレオチドのオーバーハング）場合でも、強力な標的遺伝子ｍＲＮＡノックダウンを維持した。図５を参照されたい。それぞれ２０及び１９ヌクレオチドのセンス鎖を有する構築物１４と１５（アンチセンス鎖の３’末端にそれぞれ１１及び１２のオーバーハング）にはほとんどまたはまったく活性がなかった。図５。とりわけ、構築物１３はＰＢＳとの対比で少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇのＥＤ₅₀を維持した一方で、センス鎖の５’末端の二環式ヌクレオチドを除いて構築物１３と同一である構築物６は活性がなかった。図３及び５を参照されたい。

【0229】

例３：センス鎖のＲ１に２つの二環式ヌクレオチドを有する短縮センス鎖を含む二本鎖核酸阻害剤分子のインビボ効力
短縮センス鎖及び該センス鎖の第１の領域（Ｒ１）中に２つの二環式ヌクレオチドを含む二本鎖核酸阻害剤分子の、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を低減する効力を評価した。実施例３で使用した７種の被験核酸阻害剤分子（構築物１、４～６、及び１６～１８）を図６Ａ～Ｇに示す。上記被検核酸阻害剤分子中のいずれの他のヌクレオチドも、ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートしているループ中のヌクレオチド及び上記二環式ヌクレオチドを除いて、糖部分の２’位で２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅのいずれかによって修飾されている。上記被験核酸阻害剤分子は、以下の点、すなわち、（１）センス鎖の長さ；（２）アンチセンス鎖上の２’－Ｆ修飾ヌクレオチドであるヌクレオチド１４（Ｇ１４）に隣接する２つのＰＳ結合の存在；及び（３）センス鎖の５’末端の第１の二環式ヌクレオチド（ＬＮＡ）及びセンス鎖の当初のヌクレオチド１５（Ｐ１５）における第２の二環式ヌクレオチド（構築物１６、１７、及び１８に関して、それぞれ位置Ｐ９、Ｐ８、及びＰ７）において、対照核酸阻害剤分子と異なっていた。構築物１６～１８のすべてにおいて、センス鎖の第２の二環式ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のヌクレオチド６（Ｇ６）と塩基対合する。図６Ａ～Ｇ中の核酸阻害剤分子を以下の表にまとめる。
表３ 図６の被験核酸阻害剤

【0230】

構築物１６、１７、及び１８は、センス鎖のヌクレオチド１ならびにセンス鎖のヌクレオチド９、８、及び７の二環式ヌクレオチドを除いて、それぞれ構築物４、５、及び６と同一である。同様に、構築物１６、１７、及び１８は、センス鎖の長さが異なることを除いて互いに同一である。

【0231】

ＣＤ－１雌マウスをそれぞれ４頭のマウスの試験群に分け、例１に上記した手順を実施し、各マウスに、その群に割り当てられた０．５ｍｇ／ｋｇの被験核酸阻害剤分子を投与し、肝臓組織を分析した。

【0232】

短縮センス鎖ならびにセンス鎖のＰ１及びＰ９、Ｐ８、またはＰ７の１ヶ所の二環式ヌクレオチドを有する被検核酸阻害剤分子（構築物１６～１８）を、センス鎖の領域１（Ｒ１）中にいずれの二環式ヌクレオチドももたない、対応する被検核酸分子（構築物４～６）ならびにＰＢＳ対照と比較した。図７に示すように、短縮センス鎖ならびにセンス鎖のＰ１及びＰ９、Ｐ８、またはＰ７の１ヶ所の二環式ヌクレオチドを含む被検核酸分子は、センス鎖の領域１（Ｒ１）中にいずれの二環式ヌクレオチドももたない、それぞれの相当する被検核酸阻害剤分子と比較して、ｍＲＮＡノックダウン活性の向上を示した。例えば、アンチセンス鎖の３’末端の１０ヌクレオチドのオーバーハングならびにセンス鎖のＰ１及びＰ７の二環式ヌクレオチドを有する構築物１８は、強力なｍＲＮＡノックダウン活性を示した一方、１０ヌクレオチドの３’アンチセンスオーバーハングは同様に有するが、センス鎖の領域１（Ｒ１）中に二環式ヌクレオチドをもたない構築物６は活性がなかった。図７（それぞれ構築物４及び５と比較した構築物１６及び１７も参照のこと）。

【0233】

例２の被験核酸阻害剤分子を例３の被験核酸阻害剤分子と比較した。構築物１１～１３はそれぞれセンス鎖のＰ１に単一の二環式ヌクレオチドを含み、これらを、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）中のＰ９、Ｐ８、またはＰ７に追加の二環式ヌクレオチド有することを除いて構築物１１～１３と同一である、対応する構築物１６～１８と比較した。図８に示すように、構築物１１～１３及び構築物１６～１８の６種すべてが、ＰＢＳ対照と比較して有意なｍＲＮＡノックダウン活性を示した。構築物１６及び構築物１７のそれぞれＰ９ならびにＰ８に二環式ヌクレオチドを追加したことによって、対応する構築物１１及び１２と比較して効力が低下したように見えたが、構築物１８（アンチセンス鎖の３’末端に１０ヌクレオチドのオーバーハング）の効力は、対応する構築物１３と比較して増加した。図８を参照されたい。

【0234】

例４：短縮パッセンジャー鎖及びセンス鎖のＲ１中の複数の二環式ヌクレオチドを含む二本鎖核酸阻害剤分子のインビボ効力
短縮センス鎖、及び該センス鎖の第１の領域（Ｒ１）中の複数の二環式ヌクレオチドを含む二本鎖核酸阻害剤分子の、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現を低減する効力を評価した。例４（構築物４～６及び１６～２４）で使用した１２種の被験核酸阻害剤分子を図９Ａ～Ｌに示す。ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートしているループ中のヌクレオチド及び上記二環式ヌクレオチドを除いて、上記被検核酸阻害剤分子のいずれの他のヌクレオチドも、糖部分の２’－位で２’－Ｆまたは２’－ＯＭｅのいずれかによって修飾されている。上記被検核酸阻害剤分子は、以下の点、すなわち、（１）センス鎖の長さ；（２）センス鎖の５’末端ならびにセンス鎖の当初の位置（Ｐ１５）（構築物１６、１７、及び１８について、それぞれＰ９、Ｐ８、及びＰ７）における二環式ヌクレオチド（ＬＮＡ）の存在；ならびに（３）センス鎖の第１の領域（Ｒ１）における１つまたは３つの追加の二環式ヌクレオチドの存在において互いに異なっていた。図９Ａ～Ｌ中の核酸阻害剤分子を次の表にまとめる。
表４ 図９の被験核酸阻害剤

【0235】

構築物４、１６、１９、及び２２は、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）中の５’末端及び種々の位置に二環式ヌクレオチドが存在することを除いて同一であり（すべてがアンチセンス鎖の３’末端に８ヌクレオチドのオーバーハングを有する）、これは、構築物５、１７、２０、及び２３（すべてがアンチセンス鎖の３’末端に９ヌクレオチドのオーバーハングを有する）、ならびに構築物６、１８、２１、及び２４（すべてがアンチセンス鎖の３’末端に１０ヌクレオチドのオーバーハングを有する）がそうであるのと同様である。

【0236】

ＣＤ－１雌マウスをそれぞれ４頭のマウスの試験群に分け、例１に上記した手順を実施し、各マウスに、その群に割り当てられた０．５ｍｇ／ｋｇの被験核酸阻害剤分子を投与し、肝臓組織を分析した。

【0237】

図１０に示すように、短縮センス鎖を有する被検核酸阻害剤分子において、センス鎖のＰ１に二環式ヌクレオチドが、ならびに当初のヌクレオチド１５（Ｐ１５）（すなわち、構築物１６～１８について、それぞれＰ９、Ｐ８、及びＰ７）に単一の二環式ヌクレオチドが存在することにより、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）中にいずれの二環式ヌクレオチドももたない相当する被検核酸阻害剤分子よりも（構築物４～６に対する構築物１６～１８で）、標的遺伝子ｍＲＮＡノックダウン活性が向上した。さらに、当初のＰ１５位に隣接する追加の二環式ヌクレオチドが存在し、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）中の二環式ヌクレオチドが合計３つになることによっても、センス鎖の第１の領域中にいずれの二環式ヌクレオチドもたない相当する試験核酸阻害剤分子に対して（構築物４～６に対する構築物１９～２１で）、標的遺伝子ｍＲＮＡノックダウンが向上した。図１０を参照されたい。但し、当初のＰ１８及びＰ１９（構築物２２についてはＰ１２及びＰ１３、構築物２３についてはＰ１１及びＰ１２、構築物２４についてはＰ１０及びＰ１１）に２つの二環式ヌクレオチドを追加することにより、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）に２つの二環式ヌクレオチド（構築物１６～１８）またはセンス鎖の第１の領域（Ｒ１）に３つの二環式ヌクレオチド（構築物１９～２１）のいずれかを有する被検核酸阻害剤分子と比較して、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現が実質的に低下した。理論に拘束されることを望むものではないが、Ｔ_mを上昇させるヌクレオチドがアンチセンス鎖の５’末端に近接することにより、標的遺伝子ｍＲＮＡノックダウンに悪影響が及ぶ可能性があることが推定される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図9H】

【図9I】

【図9J】

【図9K】

【図9L】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】