特表 2022-530706 ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-06-30

(54)【発明の名称】ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20220623BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20220623BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220623BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220623BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220623BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220623BHJP

   C12P 19/18 20060101ALI20220623BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54

C12N9/10 ZNA

C12N1/21

C12N1/15

C12N1/19

C12N5/10

C12P19/18

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021576711

(86)(22)【出願日】2020-06-25

(85)【翻訳文提出日】2022-02-08

(86)【国際出願番号】 US2020039648

(87)【国際公開番号】W WO2020264179

(87)【国際公開日】2020-12-30

(31)【優先権主張番号】62/866,148

(32)【優先日】2019-06-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519271159

【氏名又は名称】マナス バイオ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ドナルド ジェイソン エリック

(72)【発明者】

【氏名】クマラン アジクマール パライル

(72)【発明者】

【氏名】ラブ アーロン

(72)【発明者】

【氏名】トゥーミー クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】サントス クリスティーン ニコル エス．

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD13

4B050EE10

4B050LL02

4B064AF41

4B064CA19

4B064CA21

4B064CB30

4B064CC24

4B064DA10

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA19

4B065CA29

4B065CA41

4B065CA46

(57)【要約】

さまざまな態様において、本発明は、テルペノイドグリカンなどの基質の糖部分の３’炭素へのＮＤＰ糖の単糖部分の転移を触媒することができ、それによって「１－３ＵＧＴ」として機能するウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を提供する。他の態様において、本発明は、１－３ＵＧＴをコードするポリヌクレオチド、及びそれを含む宿主細胞を提供する。さらに他の態様において、本発明は、本開示の酵素及び宿主細胞を使用した、ステビオールグリコシドを含む、グリコシル化基質を調製するための方法を提供する。
【選択図】図５

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも約７５％一致するアミノ酸配列を含む、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素。

【請求項2】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６と少なくとも約８０％一致する、請求項１に記載の酵素。

【請求項3】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６と少なくとも約８５％一致する、請求項１に記載の酵素。

【請求項4】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６と少なくとも約９０％一致する、請求項１に記載の酵素。

【請求項5】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６と少なくとも約９５％一致する、請求項１に記載の酵素。

【請求項6】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６と少なくとも約９８％一致する、請求項１に記載の酵素。

【請求項7】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６の前記アミノ酸である、請求項１に記載の酵素。

【請求項8】

前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列配列番号５または配列番号６に対して、置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から２０個のアミノ酸改変を有する、請求項１に記載の酵素。

【請求項9】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６の前記アミノ酸配列に対して、置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から１０個のアミノ酸改変を有する、請求項８に記載の酵素。

【請求項10】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６の前記アミノ酸配列に対して、置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から５個のアミノ酸改変を有する、請求項８に記載の酵素。

【請求項11】

前記酵素は、配列番号１の位置２９、２００、３５７、及び４１４の１つ以上と対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項８から１０のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項12】

配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）、
配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）、及び
配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）のうちの１つ以上を含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項13】

前記酵素は、配列番号５の位置５４と対応する前記位置にＧｌｙ、配列番号５の位置１１１と対応する前記位置にＬｅｕ、及び配列番号５の位置１８３と対応する前記位置にＭｅｔを有する、請求項１２に記載の酵素。

【請求項14】

前記酵素は、配列番号５の位置１５５と対応する位置の後に約６から約１２個のアミノ酸の挿入を含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項15】

前記挿入は、大部分がグリシン及びセリン残基である柔軟で親水性の配列であり、任意にＧＳＧＧＳＧ（配列番号７）またはＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号８）である、請求項１４に記載の酵素。

【請求項16】

前記酵素は、配列番号６の前記アミノ酸配列に対してアミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２と対応する１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項17】

前記酵素は、配列番号６のアミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２と対応する前記アミノ酸の欠失を含む、請求項１６に記載の酵素。

【請求項18】

前記酵素は、配列番号６の位置７２、位置３０５、位置３４５、及び位置４２８と対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項19】

前記酵素は、配列番号６の位置７２と対応する前記位置にグルタミン（Ｑ）、配列番号６の位置３０５と対応する前記位置にシステイン（Ｃ）、配列番号６の位置３４５と対応する前記位置にフェニルアラニン（Ｆ）、及び配列番号６の位置４２８と対応する前記位置にイソロイシン（Ｉ）から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１８に記載の酵素。

【請求項20】

配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも約６０％一致するアミノ酸配列を含む、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素であって、
配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）、
配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）、及び
配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）を含む、前記酵素。

【請求項21】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６の前記アミノ酸配列と少なくとも約７０％一致する、請求項２０に記載の酵素。

【請求項22】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６の前記アミノ酸配列と少なくとも約８０％一致する、請求項２０に記載の酵素。

【請求項23】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６の前記アミノ酸配列と少なくとも約９０％一致する、請求項２０に記載の酵素。

【請求項24】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６の前記アミノ酸配列と少なくとも約９５％である、請求項２０に記載の酵素。

【請求項25】

前記１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置１５５と対応する位置の後に約５から約１５個のアミノ酸の挿入を含む、請求項２０から２４のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項26】

前記挿入は、大部分がグリシン及びセリン残基である柔軟で親水性の配列であり、任意にＧＳＧＧＳＧ（配列番号７）及びＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号８）である、請求項２５に記載の酵素。

【請求項27】

前記酵素は、配列番号６の前記アミノ酸配列に対してアミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２と対応する１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項２０から２６のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項28】

前記酵素は、配列番号６のアミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２と対応する前記アミノ酸の欠失を含む、請求項２７に記載の酵素。

【請求項29】

前記酵素は、配列番号６の位置７２、位置３０５、位置３４５、及び位置４２８と対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項２０から２８のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項30】

前記酵素は、配列番号６の位置７２と対応する前記位置にグルタミン（Ｑ）、配列番号６の位置３０５と対応する前記位置にシステイン（Ｃ）、配列番号６の位置３４５と対応する前記位置にフェニルアラニン（Ｆ）、及び配列番号６の位置４２８と対応する前記位置にイソロイシン（Ｉ）から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２９に記載の酵素。

【請求項31】

前記アミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％一致する、請求項２０から３０のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項32】

前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列配列番号９に対して、置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から２０個のアミノ酸改変を有する、請求項２０～３１のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項33】

前記アミノ酸配列は、配列番号９の前記アミノ酸配列に対して、置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から１０個のアミノ酸改変を有する、請求項２０～３１のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項34】

前記アミノ酸配列は、配列番号９の前記アミノ酸配列に対して、置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から５個のアミノ酸改変を有する、請求項２０～３１のいずれか１項に記載の酵素。

【請求項35】

配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
Ｅ７４からＴ８１と対応する１つ以上のアミノ酸の欠失、
任意にグリシンである、位置３５７と対応する位置の置換、
任意にロイシンである、位置４１４と対応する位置の置換、
任意にメチオニンである、位置２９と対応する位置の置換、
任意にグルタミンである、位置４０２と対応する位置の置換、
任意にシステインである、位置１５４と対応する位置の置換、
任意にフェニルアラニンである、位置１９４と対応する位置の置換、
任意にイソロイシンである、位置２７７と対応する位置の置換、
任意にグルタミンである、位置２０８と対応する位置の置換、
任意にプロリンである、位置１４０と対応する位置の置換、及び
任意にグルタミン酸である、位置２５９と対応する位置の置換
から選択される配列番号１に対する１つ以上の改変を含む、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素。

【請求項36】

前記ＵＧＴ酵素は、Ｅ７４からＴ８１と対応する少なくとも２個または少なくとも３個のアミノ酸の欠失を含む、請求項３５に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項37】

前記ＵＧＴ酵素は、Ｅ７４からＴ８１と対応する少なくとも４個または少なくとも５個のアミノ酸の欠失を含む、請求項３５に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項38】

前記ＵＧＴ酵素は、Ｅ７４からＴ８１と対応する少なくとも６個または少なくとも７個のアミノ酸の欠失を含む、請求項３５に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項39】

前記ＵＧＴ酵素は、Ｅ７４からＴ８１と対応する前記アミノ酸の欠失を含む、請求項３５に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項40】

前記酵素は、配列番号１の位置２００と対応する位置にアラニンの置換をさらに含む、請求項３５から３９のいずれか１項に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項41】

前記酵素は、それぞれ配列番号１に従って番号づけされた３５７Ｇ、４１４Ｌ、２９Ｍ、４０２Ｑ、１５４Ｃ、１９４Ｆ、２７７Ｉ、２０８Ｑ、１４０Ｐ、及び２５９Ｅのうちの少なくとも２、３、または４個を有する、請求項３５から４０のいずれか１項に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項42】

前記酵素は、配列番号１の前記アミノ酸配列と少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％一致する、請求項３５から４１のいずれか１項に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項43】

前記酵素は、配列番号１に対するアミノ酸置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から２０個、または１から１０個のアミノ酸改変を有する、請求項４２に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項44】

ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１の円順列変異体であり、任意に配列番号１の対応する位置に対してアミノ酸置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から２０個または１から１５個、または１から１０個のアミノ酸改変を有し、ただし、前記円順列変異体は、
Ｅ７４からＴ８１と対応する１つ以上のアミノ酸の欠失、
任意にグリシンである、位置３５７と対応する位置の置換、
任意にロイシンである、位置４１４と対応する位置の置換、
任意にメチオニンである、位置２９と対応する位置の置換、
任意にグルタミンである、位置４０２と対応する位置の置換、
任意にシステインである、位置１５４と対応する位置の置換、
任意にフェニルアラニンである、位置１９４と対応する位置の置換、
任意にイソロイシンである、位置２７７と対応する位置の置換、
任意にグルタミンである、位置２０８と対応する位置の置換、
任意にプロリンである、位置１４０と対応する位置の置換、及び
任意にグルタミン酸である、位置２５９と対応する位置の置換
から選択される配列番号１に対する１つ以上の改変を含む、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素。

【請求項45】

請求項１から４４のいずれか１項に記載の酵素をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項46】

請求項４５に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【請求項47】

前記細胞は、微生物である、請求項４６に記載の宿主細胞。

【請求項48】

前記微生物は、細菌である、請求項４７に記載の宿主細胞。

【請求項49】

前記細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項４８に記載の宿主細胞。

【請求項50】

前記宿主細胞は、ｕｓｈＡ及びｇａｌＥＴＫＭの欠失または不活性化、ｐｇｉの欠失または不活性化、ならびにｐｇｍ及びｇａｌＵの過剰発現または活性の増加を含む、請求項４９に記載の宿主細胞。

【請求項51】

前記微生物は、酵母である、請求項４７に記載の宿主細胞。

【請求項52】

前記細胞は、植物である、請求項４６に記載の宿主細胞。

【請求項53】

前記植物は、ステビア植物である、請求項５２に記載の宿主細胞。

【請求項54】

前記宿主細胞は、Ｃ－１３ＵＧＴ酵素、Ｃ－１９ＵＧＴ酵素、及び１－２’ＵＧＴ酵素から選択される１つ以上の付加的なＵＧＴ酵素を発現する、請求項４６から５３のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項55】

前記宿主細胞は、異種Ｃ－１３ＵＧＴ酵素、異種Ｃ－１９ＵＧＴ酵素、及び異種１－２ＵＧＴ酵素をさらに発現する、請求項５４に記載の宿主細胞。

【請求項56】

前記宿主細胞は、ステビオールの生合成のための内因性及び／または異種酵素の発現によってステビオールを産生する、請求項４７から５５のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項57】

単糖基を基質に転移するための方法であって、ＮＤＰ糖及び前記基質を、請求項１から４４のいずれか１項に記載のＵＧＴ酵素、または請求項４６から５６のいずれか１項に記載の宿主細胞もしくはそのライセートと接触させることを含む、前記方法。

【請求項58】

前記基質は、テルペノイドである、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記テルペノイドは、ジテルペノイドである、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記ジテルペノイドは、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドである、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記ステビオールグリコシドは、ステビオシド及び／またはＲｅｂＤである、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記基質は、植物抽出物であり、任意にステビアの葉抽出物である、請求項５７に記載の方法。

【請求項63】

前記テルペノイドは、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、またはトリテルペノイドである、請求項５８に記載の方法。

【請求項64】

前記テルペノイドは、トリテルペノイドであり、任意にモグロールまたはモグロシドである、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記ＮＤＰ糖は、ＵＤＰグルコースである、請求項５７から６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項66】

反応は、内因性ＵＤＰグルコースを有する宿主細胞において起こる、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

グリコシル基を基質に転移するための方法であって、前記基質の存在下において請求項４６から５６のいずれか１項に記載の宿主細胞を増殖させることを含む、前記方法。

【請求項68】

前記基質は、前記宿主細胞によって合成される、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記基質は、テルペノイドである、請求項６７または６８に記載の方法。

【請求項70】

前記テルペノイドは、ジテルペノイドである、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記ジテルペノイドは、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドである、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記ステビオールグリコシドは、ステビオシド及び／またはＲｅｂＤである、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記テルペノイドは、トリテルペノイドであり、任意にモグロールまたはモグロシドである、請求項６９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１９年６月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／８６６，１４８号の利益を主張するものであり、その全開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、酵素、コードポリヌクレオチド、宿主細胞、及びグリコシル化基質を生成するための方法に関する。

【0003】

電子的に提出されたテキストファイルの記載
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＭＡＮ－０２４ＰＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２０年６月２４日、ファイルサイズ：２８，４５７バイト）。

【背景技術】

【0004】

高強度甘味料は、スクロースの甘味レベルよりも何倍も高い甘味レベルを有する。それらは、基本的にノンカロリーで、一般的に食品及び飲料を含むダイエットならびに低カロリー製品に使用される。高強度甘味料は、血糖反応を誘発せず、それを、糖尿病患者及び炭水化物の摂取を管理することに関心のあるその他の人を標的とする製品に使用するのに適したものにする。

【0005】

ステビオールグリコシドは、南アメリカの特定の地域原産のＡｓｔｅｒａｃｅａｅ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）科の多年生低木であるＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉの葉に見られる化合物のクラスである。それらは、単一の基部であるステビオールによって構造的に特徴づけられ、Ｃ１３及びＣ１９位の炭水化物残基の存在によって異なる。それらは、ステビアの葉に蓄積して、総乾燥重量のおよそ１０％から２０％を構成する。乾燥重量に基づいて、ステビアの葉に見られる主要な４つのグリコシドとしては、一般にステビオシド（９．１％）、レバウジオシドＡ（３．８％）、レバウジオシドＣ（０．６～１．０％）及びズルコシドＡ（０．３％）が挙げられる。その他の既知のステビオールグリコシドとしては、レバウジオシドＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＭ、ステビオールビオシドならびにルブソシドが挙げられる。

【0006】

微量グリコシル化生成物レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）は、スクロースよりも約２００～３５０倍強力であると推定され、やや苦いか、または甘草の後味を伴う爽快な甘味を持つと示されている。Ｐｒａｋａｓｈ Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｔｅｖｉａ Ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ： Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｍ， Ｆｏｏｄｓ ３（１）， １６２－１７５ （２０１４）。Ｒｅｂ Ｍは、世界の食品産業にとって非常に興味深いものである。

【0007】

ステビア植物からステビオールグリコシドを調製するためのプロセスは持続可能ではなく、ステビアの葉の微量グリコシル化生成物を得るためには適していない。したがって、高度に精製されたステビオールグリコシド組成物を含む、ステビオールグリコシドを含む組成物を調製するための持続可能で経済的な方法が依然として必要とされている。さらに、ＲｅｂＭ及びその他などの微量グリコシル化生成物を多量に生成するための方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

さまざまな態様において、本発明は、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を提供し、これは、テルペノイドグリカンなどの基質の糖部分の３’炭素へのＮＤＰ糖（例えば、ＵＤＰ糖）の単糖部分の転移を触媒することができ、それによって「１－３ＵＧＴ」として機能する。他の態様において、本発明は、１－３ＵＧＴをコードするポリヌクレオチド、及びそれを含む宿主細胞を提供する。さらに他の態様において、本発明は、本開示の酵素及び宿主細胞を使用したステビオールグリコシドを含む、グリコシル化基質を調製するための方法を提供する。

【0009】

１－３ＵＧＴは、ステビオールグリコシドなどのテルペノイドグリコシドに対して高いグリコシルトランスフェラーゼ活性を示す。例えば、１－３ＵＧＴは、ステビオシド及びＲｅｂＤなどのテルペノイドグリカン上の糖部分の３’炭素へのＮＤＰ糖の単糖部分の転移を触媒する。すなわち、基質がステビオールグリコシドである場合、１－３ＵＧＴは、Ｃ１３またはＣ１９結合グルコース部分の両方の３’炭素への単糖部分のＮＤＰ依存性転移を触媒することができる。さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴは、ＲｅｂＭの生合成を触媒する。

【0010】

一態様において、本発明は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも約７５％一致するアミノ酸配列を含む１－３ＵＧＴ酵素を提供する。いくつかの実施形態において、酵素は、配列番号１（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ７６Ｇ１）の位置２９、２００、３５７、及び４１４と対応する位置にアミノ酸置換を含む。配列番号５及び６の酵素に含まれるこれらの位置（配列番号５のそれぞれ位置１８３、３５４、５４、及び１１１）の置換は、配列番号１の酵素と比較して大幅な活性の向上をもたらすことができる。

【0011】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、（配列番号１に対して）配列番号５の位置１５５と対応する位置の後に５から約１５個のアミノ酸、または約６から約１２個のアミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、大部分がグリシン及びセリン残基であってもよい柔軟で親水性の配列である。いくつかの実施形態において、配列は、ＧＳＧＧＳＧ（配列番号７）またはＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号８）である。

【0012】

さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、ＵＧＴ７６Ｇ１－Ｌ２００Ａ（配列番号３）と比較してステビオシドのＲｅｂＡへの向上した変換、及びＲｅｂＤのＲｅｂＭへの向上した変換を示す。

【0013】

いくつかの実施形態において、配列番号５の位置１８３、３５４、５４、及び１１１と対応する位置のアミノ酸の一致は、他の位置のさらなる改変を可能にする。例えば、いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約６０％一致するアミノ酸配列を含み、ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）またはトレオニン（Ｔ）、配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）、配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）またはロイシン（Ｌ）、及び配列番号５の位置３５４と対応する位置にアラニン（Ａ）、またはグリシン（Ｇ）、またはセリン（Ｓ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴは、配列番号５の位置１８３と対応する位置に２または３個のメチオニン（Ｍ）、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）、及び配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）を有する。これらの改変は、配列番号１の対応する位置におけるアミノ酸の一致と比較して酵素の活性に大幅な向上をもたらすことができる。

【0014】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５のアミノ酸配列を参照してアミノ残基１５９から１６１の欠失、それぞれの場合に、配列番号５のアミノ酸配列を参照して位置２６２の置換（例えば、Ｌ２６２Ｑ）、位置２９４の置換（例えば、Ｒ２９４）、及び位置４１３の置換（例えば、Ｄ４１３Ｅ）のうちの１つ以上を含む。

【0015】

実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、それぞれ配列番号５のアミノ酸配列を参照してアミノ残基１５９から１６１の欠失ならびにアミノ酸置換Ｌ２６２Ｑ、Ｒ２９４Ｐ及びＤ４１３Ｅを含む。これらの実施形態による例となるＵＧＴ酵素は、本明細書中で配列番号６として開示されている。

【0016】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号６のアミノ酸配列を参照して残基Ｅ２２５からＴ２３２の１つ以上の残基の欠失を含む。これらまたはその他の実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、それぞれの場合に配列番号６のアミノ酸配列を参照して位置７２（例えば、Ｓ７２Ｑ）、位置３０５（例えば、Ａ３０５Ｃ）、位置３４５（例えば、Ｙ３４５Ｆ）、及び位置４２８（例えば、Ｌ４２８Ｉ）から選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。例となる実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、それぞれの場合に配列番号６のアミノ酸配列を参照してアミノ残基Ｅ２２５からＴ２３２の欠失ならびにアミノ酸置換Ｓ７２Ｑ、Ａ３０５Ｃ、Ｙ３４５Ｆ、及びＬ４２８Ｉを含む。これらの実施形態による例となるＵＧＴ酵素は、本明細書中で配列番号９として開示されている。

【0017】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているアミノ酸改変は、代わりに、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１、またはその円順列変異体に適用される。

【0018】

他の態様において、本発明は、本明細書中で開示されている１－３ＵＧＴ酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにそれを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、微生物、真菌細胞、藻類細胞、または植物細胞であってもよい。植物は、ステビア植物、または特にＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物であってもよい。ステビア植物は、もともとステビオール及びステビオールグリコシドを合成するために必要とされる酵素を発現するが、ＲｅｂＭなどの高度にグリコシル化されたステビオールグリコシドは微量にしか産生しない。対照的に、１－３ＵＧＴをコードするポリヌクレオチドを発現するステビアまたはＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物のＲｅｂＭ含有量は、比較的高レベルのＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＭ、あるいはＲｅｂＢ、ＲｅｂＧ、ＲｅｂＩ、及びＲｅｂ４などの１－３グリコシル化を含むその他の一般に微量のステビオールグリコシドをもたらすこともある。さまざまな実施形態において、細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物細胞である。

【0019】

さまざまな実施形態において、宿主細胞は、Ｃ－１３ＵＧＴ酵素、Ｃ－１９ＵＧＴ酵素、及び１－２ＵＧＴ酵素から選択される１つ以上の付加的なＵＧＴ酵素を発現してもよい。「Ｃ－１３ＵＧＴ」またはＵＧＴｃ１３は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ１３ヒドロキシル基においてグリコシル化することができるグリコシルトランスフェラーゼである。「Ｃ－１９ＵＧＴ」またはＵＧＴｃ１９は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ１９カルボキシル基においてグリコシル化することができるグリコシルトランスフェラーゼである。「１－２ＵＧＴ」またはＵＧＴ１－２は、１３－Ｏ－グルコース、及び／または１９－Ｏ－グルコースのＣ２’をβ１，２グリコシル化することができるグリコシルトランスフェラーゼである。「１－３ＵＧＴ」またはＵＧＴ１－３は、１３－Ｏ－グルコース、及び／または１９－Ｏ－グルコースのＣ３’をβ１，３グリコシル化することができるグリコシルトランスフェラーゼである。

【0020】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、（１－３ＵＧＴ酵素に加えて）異種Ｃ－１３ＵＧＴ酵素、異種Ｃ－１９ＵＧＴ酵素、及び異種１－２ＵＧＴ酵素を発現し、それにより、ステビオール及びステビオールグリコシド基質をグリコシル化して、ＲｅｂＭを産生することができる。

【0021】

いくつかの実施形態において、宿主細胞（例えば、細菌または酵母細胞）は、ステビオールの生合成のための内因性及び／または異種酵素の発現によってステビオール基質を産生する。これらの実施形態において、細胞は、とりわけグルコース、スクロース、またはグリセロールなどの炭素源からＲｅｂＭなどのステビオールグリコシドを産生する。

【0022】

いくつかの態様において、本発明は、単糖基を基質に転移するための方法を提供する。本方法は、ＮＤＰ糖（例えば、ＵＤＰ単糖）及び基質を、本明細書に記載の１－３ＵＧＴ酵素、または１－３ＵＧＴ酵素を発現する宿主細胞またはそのライセートと接触させることを含む。テルペノイドを含むが、これに限定されないさまざまな基質が、本開示に従ってグリコシル化されてもよい。いくつかの実施形態において、基質は、テルペノイド基質であり、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドなどのジテルペノイドであってもよい。いくつかの実施形態において、基質は、ステビオシド及び／またはＲｅｂＤを含む。さまざまな実施形態において、ヌクレオチドジホスファートは、ＵＤＰもしくはＡＤＰ、またはグリコシル供与体分子として作用することができるその他のＮＤＰである。さまざまな実施形態において、単糖は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、ラムノース、またはキシロースである。いくつかの実施形態において、単糖は、グルコースである。ＮＤＰ糖は、インビトロ反応に関しては外因的に供給されてもよく、あるいは微生物発酵または生体内変換反応を使用する実施形態に関しては宿主細胞によって内因的に産生される。反応を助ける利用可能なＵＤＰグルコースを増加させるために宿主細胞にさまざまな改変が行われてもよい。

【0023】

いくつかの実施形態において、基質は、植物抽出物を含み、これは、任意にステビアの葉抽出物である。さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴを発現する微生物細胞は、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭを含む、高次ステビオールグリコシドの産生のためにステビオールまたは低次ステビオールグリコシドを供給されてもよい。ステビアの葉抽出物からの高度な中間体は、ステビオールグリコシドの既存の工業的抽出から容易に入手可能である。

【0024】

さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴは、低次ステビオールグリコシドを高次ステビオールグリコシドに変換する。例えば、ＵＧＴ酵素は、ステビオビオシドからＲｅｂＢ、ルブソシドからＲｅｂＧ、ステビオシドからＲｅｂＡ、ＲｅｂＡからＲｅｂＩ、ＲｅｂＧからＲｅｂ４、ＲｅｂＥからＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＤからＲｅｂＭへの変換に関する１－３’ＵＧＴ活性を有してもよい。あるいは、ＵＧＴは、別の１－３ＵＧＴ酵素（複数可）または特定の基質に対して特異性の優先度を有する酵素と組み合わせて使用されてもよい。例えば、あるＵＧＴは、１－３ＵＧＴとしてＣ１３グリコシル基質には優先的に作用することがあり得るのに対して、別のＵＧＴ酵素は、１－３ＵＧＴとしてＣ１９グリコシル基質に優先的に作用する。

【0025】

いくつかの実施形態において、本方法は、基質の存在下において宿主細胞を増殖させることを含む。基質は、培養物に供給されてもよく、いくつかの実施形態では、基質は、宿主細胞によって合成される。いくつかの実施形態において、基質は、ステビオールを含むか、または主要な構成成分としてステビオシド及びＲｅｂＡの混合物を含み、宿主細胞は、複数のＵＧＴ酵素を発現して、ＲｅｂＭなどの標的ステビオールグリコシドを産生する。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】ステビオールグリコシドファミリーの微量な構成成分であるレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）の化学構造を示す。ＲｅｂＭは、６つのグルコシル修飾を有するジテルペノイドステビオール（枠）の誘導体である。

【図2】ステビオールからＲｅｂＭ及びその他のステビオールグリコシドへのグリコシル化経路を示す。ＵＧＴｃ１３は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ１３ヒドロキシル基においてグリコシル化することができるグリコシルトランスフェラーゼである。ＵＧＴｃ１９は、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ１９カルボキシル基においてグリコシル化することができるグリコシルトランスフェラーゼである。ＵＧＴ１－２は、１３－Ｏ－グルコース、及び／または１９－Ｏ－グルコースのＣ２’をβ１，２グリコシル化することができるグリコシルトランスフェラーゼである。ＵＧＴ１－３は、１３－Ｏ－グルコース、及び／または１９－Ｏ－グルコースのＣ３’をβ１，３グリコシル化することができるグリコシルトランスフェラーゼである。

【図3】ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号１）及びＳｒＵＧＴ７６Ｇ１の円順列変異型であるＭｂＵＧＴ１－３＿２（配列番号６）のアミノ酸配列アライメントを示す。パネルＡは、ＭｂＵＧＴ１－３＿２のＣ末端部分に整列したＳｒＵＧＴ７６Ｇ１のＮ末端部分を示す。パネルＢは、ＭｂＵＧＴ１－３＿２のＮ末端部分に整列したＳｒＵＧＴ７６Ｇ１のＣ末端部分を示す。

【図4】以下のグリコシルトランスフェラーゼ：ＵＧＴ７６Ｇ１－Ｌ２００Ａ（配列番号３）、ＭｂＵＧＴ１－３＿０（配列番号４）、ＭｂＵＧＴ１－３＿１（配列番号５）及びＭｂＵＧＴ１－３＿２（配列番号６）によるインビトロにおけるステビオシドのＲｅｂＡへの変換パーセント、及びＲｅｂＤのＲｅｂＭへの変換パーセントを示す。

【図5】ＵＧＴ７６Ｇ１－Ｌ２００Ａと比較したステビオシドのＲｅｂＡへの変換及びＲｅｂＤのＲｅｂＭへの変換に関する向上倍率を示す。ＭｂＵＧＴ１－３＿１及びＭｂＵＧＴ１－３＿２は、両変換に関する酵素生産性の非常に際立った向上を示している。

【発明を実施するための形態】

【0027】

さまざまな態様において、本発明は、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素を提供し、これは、テルペノイドグリカンなどの基質の糖部分の３’炭素へのＮＤＰ糖（例えば、ＵＧＴグルコース）の単糖部分の転移を触媒することができ、それによって「１－３ＵＧＴ」として機能する。他の態様において、本発明は、１－３ＵＧＴをコードするポリヌクレオチド、及びそれを含む宿主細胞を提供する。さらに他の態様において、本発明は、本開示の酵素及び宿主細胞を使用したステビオールグリコシドを含む、グリコシル化基質を調製するための方法を提供する。

【0028】

１－３ＵＧＴ酵素は、ステビオールグリコシドなどのテルペノイドグリコシドに対して高いグリコシルトランスフェラーゼ活性を示す。例えば、１－３ＵＧＴ酵素は、ステビオシド及びＲｅｂＤなどのテルペノイドグリカン上の糖部分の３’炭素へのＮＤＰ糖の単糖部分の転移を触媒する。すなわち、基質がステビオールグリコシドである場合、１－３ＵＧＴは、Ｃ１３またはＣ１９結合糖（例えば、グルコース）部分の両方の３’炭素への単糖部分のＮＤＰ依存性転移を触媒することができる。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、Ｃ１３結合糖と比較してＣ１９結合糖におけるグリコシル化に関してより高い速度または産生性を有する。いくつかの実施形態において、単糖は、グルコースであるが、他の実施形態では、単糖は、ガラクトース、フルクトース、ラムノース、キシロース、またはその他の単糖であってもよい。

【0029】

さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴは、ＲｅｂＭの生合成を触媒する。ＲｅｂＭの構造を図１に示す。ＲｅｂＭは、６つのグリコシル化：（１）Ｃ１３ Ｏ－グリコシル化、（２）Ｃ１３ １－２グリコシル化、（３）Ｃ１３ １－３グリコシル化、（４）Ｃ１９ Ｏ－グリコシル化、（５）Ｃ１９ １－２グリコシル化、及び（６）Ｃ１９ １－３グリコシル化を有するステビオール骨格を含む。図２に示されるとおり、１－３ＵＧＴは、付加的なグルコースのＲｅｂＤ基質への転移によりＲｅｂＭを生成することができる。さらに、１－３ＵＧＴ酵素は、他のステビオールグリコシド基質への単糖の転移を触媒して、ＲｅｂＢ（ステビオールビオシドから）、ＲｅｂＧ（ルブソシドから）、Ｒｅｂ４（ＲｅｂＧから）、ＲｅｂＡ（ステビオシドから）、ＲｅｂＤ（ＲｅｂＥから）、及びＲｅｂＩ（ＲｅｂＡから）などの生成物を生成することができる。いくつかの実施形態において、基質は、ステビアの葉抽出物などの植物抽出物を含み、１－３ＵＧＴは（他のグリコシルトランスフェラーゼ酵素の作用とともに）、さまざまな主要または微量なグリコシル化生成物をグリコシル化して、大部分がＲｅｂＭである生成物を生成することができる。

【0030】

一態様において、本発明は、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも約７５％一致するアミノ酸配列を含む１－３ＵＧＴ酵素を提供する。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴは、配列番号５または６と少なくとも約８０％一致するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号５または６と少なくとも約８５％一致するか、あるいは配列番号５または６と少なくとも約９０％一致するか、あるいは配列番号５または６と少なくとも約９５％一致するか、あるいは配列番号５または６と少なくとも約９８％一致する。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号５または６のアミノ酸を含む。

【0031】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約７５％一致するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴは、配列番号９と少なくとも約８０％一致するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号９と少なくとも約８５％一致するか、あるいは配列番号９と少なくとも約９０％一致するか、あるいは配列番号９と少なくとも約９５％一致するか、あるいは配列番号９と少なくとも約９８％一致する。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸を含む。

【0032】

例えば、アミノ酸配列は、アミノ酸配列配列番号５または６に対して、置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から２０個のアミノ酸改変を有してもよい。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号５または６のアミノ酸配列に対して、置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から１０個のアミノ酸改変（例えば、１から５個）を有する。いくつかの実施形態において、ＵＧＴアミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列に対して、置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から２０個のアミノ酸改変を有する。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列に対して、置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から１０個のアミノ酸改変（例えば、１から５個）を有する。配列番号５、６、または９のアミノ酸配列に対するアミノ酸改変は、利用可能な酵素構造及びホモロジーモデルの構築によって誘導されてもよい。例となる構造は、例えば、Ｌｉ， ｅｔ ａｌ．， “Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＵＧＴ８５Ｈ２－ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ （ｉｓｏ） Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，” Ｊ． ｏｆ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３７０．５ （２００７）： ９５１－９６３ならびにＬｅｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｓｔｅｖｉｏｌ Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，” ＰＮＡＳ １１６：１３１３１－１３１３６ （２０１９）に記載されている。アミノ酸改変の情報を与えるために公的に利用可能な結晶構造（例えば、ＰＤＢ登録：２ＰＱ６）が使用されてもよい。例えば、基質の結合を向上させるため、及び／またはこれらの基質の触媒の側鎖との反応幾何学を向上させるために活性部位もしくは活性部位の周辺に１つ以上のアミノ酸改変が行われてもよい。

【0033】

いくつかの実施形態において、酵素は、配列番号１（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ ＵＧＴ７６Ｇ１）の位置２９、２００、３５７、及び４１４と対応する位置にアミノ酸置換を含む。配列番号５、６及び９の酵素に含まれるこれらの位置の置換（配列番号５のそれぞれ位置１８３、３５４、５４、及び１１１）は、大幅な活性の向上をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、配列番号５の位置１８３、３５４、５４、及び１１１と対応する位置のアミノ酸の一致は、その他の位置にさらなる改変を可能にする。例えば、いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５、６または９のアミノ酸配列と少なくとも約６０％一致するアミノ酸配列を含み、ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）またはトレオニン（Ｔ）、配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）、配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）またはロイシン（Ｌ）、及び配列番号５の位置３５４と対応する位置にアラニン（Ａ）、またはグリシン（Ｇ）、またはセリン（Ｓ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴは、配列番号５の位置１８３と対応する位置に２または３個のメチオニン（Ｍ）、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）、及び配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）を有する。これらの改変は、酵素の活性に大幅な向上をもたらすことができる。

【0034】

１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置５４と対応する位置に配列番号１の対応する位置（３５７）にあるセリン以外の他の置換を含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態において、配列番号５の位置５４と対応する位置の置換は、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはメチオニン（Ｍ）などの疎水性アミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号５の位置５４と対応する位置のアミノ酸は、水素結合をもたらす能力を有さない側鎖を有する。他の実施形態において、配列番号５の位置５４と対応する位置のアミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、またはチロシン（Ｙ）である。

【0035】

さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、この位置にロイシン以外のアミノ酸を含んでもよい。さまざまな実施形態において、配列番号５の位置１１１と対応する位置は、配列番号１の対応する位置のアミノ酸であるバリンにはならない。位置１１１と対応する位置のその他の適した置換は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）またはメチオニン（Ｍ）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号５の位置１１１と対応する位置のアミノ酸は、バリンよりも疎水性でなく、及び／または大きくない側鎖を有する。

【0036】

さまざまな実施形態において、ＵＧＴは、配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）アミノ酸を含む。さまざまな実施形態において、ＵＧＴは、配列番号１の対応する位置にあるイソロイシン以外の別の適したアミノ酸をこの位置に含む。例えば、この位置のアミノ酸は、イソロイシンよりも疎水性でなく、及び／または水素結合をもたらしてもよい側鎖を有してもよい。配列番号５の位置１８３と対応する位置のいくつかの例となる置換としては、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン酸（Ｄ）、及びグルタミン酸（Ｅ）が挙げられる。

【0037】

さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴは、配列番号５の位置３５４と対応する位置にアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）を含む。さまざまな実施形態において、この位置のアミノ酸は、配列番号１の対応する位置にあるロイシンよりも疎水性でなく、及び／または大きくない側鎖を有する。

【0038】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、（ＵＧＴ７６Ｇ１、配列番号１に対して）配列番号５の位置１５５と対応する位置の後に５から約１５個のアミノ酸、例えば、６から１２個のアミノ酸または約６もしくは約１１個のアミノ酸の挿入を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、大部分がグリシン及びセリン残基である柔軟で親水性の配列である。いくつかの実施形態において、配列は、ＧＳＧＧＳＧ（配列番号７）またはＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号８）である。

【0039】

さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、ＵＧＴ７６Ｇ１－Ｌ２００Ａ（配列番号３）と比較してステビオシドのＲｅｂＡへの向上した変換、及びＲｅｂＤのＲｅｂＭへの向上した変換を示す。この向上した変換は、ステビオシドまたはＲｅｂＤ基質が本開示の１－３ＵＧＴ酵素を発現する微生物細胞に供給される生物変換アッセイにおいて示される。向上した変換は、組み換え発現された１－３ＵＧＴを含む細胞ライセートを用いた反応において、あるいは精製されたまたは部分的に精製された１－３ＵＧＴを用いたインビトロ反応において示すことができる。そのような反応は、当該技術分野において周知である。あるいは、ホールセルアッセイが、使用されてもよい。例えば、１－３ＵＧＴ酵素を発現するＥ．ｃｏｌｉ株（ΔｕｓｈＡ、ΔｇａｌＥＴＫＭ、Δｐｇｉ、過剰発現ｐｇｍ、ｇａｌＵ）を、９６ウェルプレートにおいて２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩増殖させる。次に、その細胞を、新しい生産培養物に総体積の１０％まで移す。生産培養物に０．５ｍＭの基質（例えば、ステビオシドまたはレバウジオシドＤ）が含まれる。その生産培養物を、その後、９６ウェルプレートにおいて２５０ｒｐｍ、３７℃で４８時間増殖させる。生成物は、ＬＣ－ＭＳ ＱＱＱを使用して定量することができる。

【0040】

いくつかの実施形態において、配列番号５の位置１８３、３５４、５４、及び１１１と対応する位置のアミノ酸の一致は、その他の位置にさらなる改変を可能にする。例えば、いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５、６または９のアミノ酸配列と少なくとも約６０％一致するアミノ酸配列を含み、ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）またはトレオニン（Ｔ）、配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）、配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）またはロイシン（Ｌ）、及び配列番号５の位置３５４と対応する位置にアラニン（Ａ）、またはグリシン（Ｇ）、またはセリン（Ｓ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）を含む。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴは、配列番号５の位置１８３と対応する位置に２または３個のメチオニン（Ｍ）、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）、及び配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）を有する。これらの改変は、酵素の活性に大幅な向上をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列は、配列番号５、６、または９のアミノ酸配列と少なくとも約７０％一致するか、あるいは配列番号５、６、または９のアミノ酸配列と少なくとも約８０％一致するか、あるいは配列番号５、６、または９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％一致するか、あるいは配列番号５、６、または９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％である。

【0041】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）アミノ酸、配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）アミノ酸、及び配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）アミノ酸を含む。

【0042】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）アミノ酸、及び配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）アミノ酸を含む。

【0043】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）アミノ酸、及び配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）アミノ酸を含む。

【0044】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）アミノ酸及び配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）アミノ酸を含む。

【0045】

これらまたはその他の実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号６のアミノ酸配列に対して、位置Ｅ２２５からＴ２３２に１つ以上のアミノ酸の欠失を有する。例えば、ＵＧＴは、配列番号６のアミノ酸Ｅ２２５～Ｔ２３２と対応する少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、または８個のアミノ酸の欠失を有してもよい。

【0046】

これらまたはその他の実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、位置７２、位置３０５、位置３４５、及び位置４２８と対応する位置に１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。例えば、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号６の位置７２と対応する位置にグルタミン（Ｑ）またはアスパラギン（Ｎ）の置換を有してもよい。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号６の位置３０５と対応する位置にシステイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、またはトレオニン（Ｔ）などの中性親水性アミノ酸の置換を有する。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号６の位置３４５と対応する位置にフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）の置換を有する。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号６の位置４２８と対応する位置にイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、またはアラニン（Ａ）の置換を有する。いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号６に対して以下の置換：Ｓ７２Ｑ、Ａ３０５Ｃ、Ｙ３４５Ｆ、及びＬ４２８Ｉのうちの２、３、または４つを有する。

【0047】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５の位置１５５と対応する位置の後に、５から約１５個のアミノ酸、例えば、約６から約１２個のアミノ酸、または約６もしくは約１１個のアミノ酸の挿入（７６Ｇ１に対して）を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、大部分がグリシン及びセリン残基であるアミノ酸配列などの柔軟で親水性の配列である。いくつかの実施形態において、配列は、ＧＳＧＧＳＧ（配列番号７）またはＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号８）である。

【0048】

さらに他の態様及び実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、ＵＧＴ７６Ｇ１の円順列変異体ではなく、すなわち、酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。そのような実施形態において、酵素は、本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸改変を含んでもよい。ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号１）の例となる改変としては、配列番号１に対する以下から選択される改変が挙げられる：（ｉ）Ｅ７４からＴ８１と対応する１つ以上のアミノ酸の欠失、（ｉｉ）任意にグリシンである、位置３５７と対応する位置の置換、（ｉｉｉ）任意にロイシンである、位置４１４と対応する位置の置換、（ｉｖ）任意にメチオニンである、位置２９と対応する位置の置換、（ｖ）任意にグルタミンである、位置４０２と対応する位置の置換、（ｖｉ）任意にシステインである、位置１５４と対応する位置の置換、（ｖｉｉ）任意にフェニルアラニンである、位置１９４と対応する位置の置換、（ｖｉｉｉ）任意にイソロイシンである、位置２７７と対応する位置の置換、（ｉｘ）任意にグルタミンである、位置２０８と対応する位置の置換、（ｘ）任意にプロリンである、位置１４０と対応する位置の置換、及び（ｘｉ）任意にグルタミン酸である、位置２５９と対応する位置の置換。

【0049】

例えば、いくつかの実施形態において、ＵＧＴ酵素は、配列番号１のＥ７４からＴ８１と対応する少なくとも２個、または少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、または８個すべてのアミノ酸の欠失を含む。さまざまな実施形態において、酵素は、配列番号１の位置２００と対応する位置にアラニンの置換をさらに含む。いくつかの実施形態において、酵素は、それぞれ配列番号１に従って番号づけされた３５７Ｇ、４１４Ｌ、２９Ｍ、４０２Ｑ、１５４Ｃ、１９４Ｆ、２７７Ｉ、２０８Ｑ、１４０Ｐ、及び２５９Ｅのうちの少なくとも２個、３個、または４個を有する。

【0050】

そのような実施形態において、酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約８５％の配列同一性、または少なくとも約９０％の配列同一性、または少なくとも約９５％の配列同一性、または少なくとも約９８％の配列同一性を有してもよい。例えば、酵素は、配列番号１に対するアミノ酸置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から２０個、または１から１０個のアミノ酸改変を有してもよい。

【0051】

さらに他の態様及び実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１の円順列変異体であり（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ ２０１７／０３３２６７３を参照）、任意に配列番号１の対応する位置に対してアミノ酸置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から２０個または１から１５個、または１から１０個のアミノ酸改変を有する。配列番号１の位置に対する例となる改変は、以下から選択されてもよい：（ｉ）（本明細書に記載されるとおり）Ｅ７４からＴ８１と対応する１つ以上のアミノ酸の欠失、（ｉｉ）任意にグリシンである、位置３５７と対応する位置の置換、（ｉｉｉ）任意にロイシンである、位置４１４と対応する位置の置換、（ｉｖ）任意にメチオニンである、位置２９と対応する位置の置換、（ｖ）任意にグルタミンである、位置４０２と対応する位置の置換、（ｖｉ）任意にシステインである、位置１５４と対応する位置の置換、（ｖｉｉ）任意にフェニルアラニンである、位置１９４と対応する位置の置換、（ｖｉｉｉ）任意にイソロイシンである、位置２７７と対応する位置の置換、（ｉｘ）任意にグルタミンである、位置２０８と対応する位置の置換、（ｘ）任意にプロリンである、位置１４０と対応する位置の置換、及び（ｘｉ）任意にグルタミン酸である、位置２５９と対応する位置の置換。いくつかの実施形態において、ＵＧＴ酵素は、Ｅ７４からＴ８１と対応するアミノ酸の欠失を含む。

【0052】

酵素のアミノ酸配列の変化は、その活性を変える場合があり、または測定可能な影響がない場合もある。測定可能な影響のないサイレントな変化は、保存的置換ならびに活性部位及び基質結合部位から離れて位置する溶媒に曝露される表面における小さな挿入または欠失である可能性が最も高い。対照的に、酵素活性は、非保存的置換、大きな挿入または欠失、ならびに活性部位、基質結合部位内、及びタンパク質フォールディングまたは立体構造に重要な埋もれた位置における変化によって影響を受ける可能性がより高い。酵素活性を変える変化は、反応速度を増加または低下させる場合もあり、あるいは特有の基質に対する親和性もしくは特異性を増加または低下させる場合もある。例えば、基質結合部位の大きさを増加させる変化は、酵素がより大きな基質に作用することを可能にする場合もあり、触媒のアミノ酸側鎖を基質の標的部位のより近くに配置する変化は、酵素の速度を増加させる場合もある。

【0053】

酵素三次元構造ならびに関連する活性部位、基質結合部位、及びその他の相互作用部位の位置の知識は、変異の合理的な設計を容易にし、特定の変化の表現型について機構的な洞察を提供することができる。植物ＵＧＴは、高度に保存された二次及び三次構造を共有すると同時に比較的低いアミノ酸配列同一性を有する。Ｏｓｍａｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ＵＤＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７０ （２００９） ３２５－３４７。ＵＧＴの糖受容体及び糖供与体基質は、Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間に形成される割れ目に収容される。一次配列のいくつかの領域は、ともにアミノ酸配列及び配列長さに関して異なる構造的に保存されたドメインならびにループ領域を含む基質結合ポケットの形成に寄与する。

【0054】

ＵＧＴ誘導体の構築は、構造解析及びホモロジーモデリングに基づいて誘導されてもよい。Ｓｏｏｎ Ｇｏｏ Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｓｔｅｖｉｏｌ Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＰＮＡＳ， Ｊｕｎｅ １９， ２０１９を参照。

【0055】

例えば、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１＿Ｌ２００Ａの独立結晶構造作製及び解析ならびにＭｂＵＧＴ３－１＿１に対するＳｒＵＧＴ７６Ｇ１のアミノ酸配列アライメントに基づいて、ステビオシドのステビオールコアがＭｂＵＧＴ３－１＿１の以下の残基：Ｉ２４４、Ｌ２８０、Ｗ３５１、Ａ３５４、Ｉ３５７、Ｍ３６２、及びＴ４３８に近い（４Å以内）ことが予測される。さらに、Ｃ１９ １－２グリコシル化は、Ｔ４３８に近い（４Å以内）と予測される。ＲｅｂＤのステビオールコアは、ＭｂＵＧＴ３－１＿１の以下の疎水性側鎖：Ｌ２３９、Ｍ２４２、Ｉ２４４、Ｌ２８０、Ｉ３５３、Ａ３５４、及びＩ３５７に近い（４Å以内）と予測される。Ｃ１３ １－２’グリコシル化は、ＭｂＵＧＴ３－１＿１の以下の水素結合側鎖：Ｓ３０１及びＤ７７に近い（４Å以内）と予測される。Ｌ２００Ａと対応する変異がＭｂＵＧＴ３－１＿１のＶ３４１～Ｑ３５２及びＫ３５５～Ａ３６７ヘリックス間のループにあるため、ＭｂＵＧＴ３－１＿１のこれらのヘリックスの配置及びアミノ酸含有量が触媒反応に重要な可能性がある。ＭｂＵＧＴ３－１＿１の位置Ｌ７６及び／またはＤ７７は、ステビオシドのＣ１３グリコシル化と相互作用する場合もある。

【0056】

アミノ酸の置換は、保存的置換であっても、または非保存的置換であってもよい。保存的置換は、古い及び新しいアミノ酸が大きさ及び電荷などの類似した特性を有する場合に定義される。天然に生じる残基は、一般的な以下の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：
（グループ１）疎水性（脂肪族）：メチオニン（Ｍｅｔ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、
（グループ２）中性親水性：システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、
（グループ３）酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、
（グループ４）塩基性：ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、
（グループ５）鎖配向に影響を与える残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、及び
（グループ６）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）。

【0057】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスの別のアミノ酸と交換することを伴うことになる。

【0058】

ＵＧＴ酵素のアミノ酸配列は、任意に、位置２に挿入または置換されたアラニンを含み、細胞における代謝回転を低下させることができる。さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素は、配列番号５、６、または９に対して位置２に挿入または置換されたアラニンアミノ酸残基を含み、インビボにおけるさらなる安定性をもたらす。

【0059】

アミノ酸配列の同一性、すなわち、配列同一性のパーセンテージは、配列アライメントにより求めることができる。そのようなアライメントは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ （Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ５８７３－５８７７）によって記載されているものなどのいくつかの既知のアルゴリズムを用いて、ｈｍｍａｌｉｇｎ（ＨＭＭＥＲパッケージ）を用いて、またはＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ． Ｄ．， Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ． Ｇ． ＆ Ｇｉｂｓｏｎ， Ｔ． Ｊ． （１９９４） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， ４６７３－８０）を用いて行うことができる。配列同一性（配列マッチング）のグレードは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴまたはＢｌａｓｔＺ（もしくはＢｌａｓｔＸ）を使用して計算してもよい。同様のアルゴリズムが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質アライメントは、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施されてもよい。比較のためのギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９－３４０２に記載されているとおりにギャップＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータを使用する。

【0060】

他の態様において、本発明は、本明細書中で開示されている１－３ＵＧＴ酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにそれを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、微生物、真菌細胞、藻類細胞、または植物細胞であってもよい。植物は、ステビア植物、または特にＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物であってもよい。ステビア植物は、もともとステビオール及びステビオールグリコシドを合成するために必要とされる酵素を発現するが、ＲｅｂＭなどの高度にグリコシル化されたステビオールグリコシドは微量にしか産生しない。対照的に、１－３ＵＧＴをコードするポリヌクレオチドを発現するステビアまたはＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物のＲｅｂＭ含有量は、植物の葉のステビオールグリコシド含有量の約１％超、または約２％超、または約５％超、または約１０％超であってもよい。さらに、１－３ＵＧＴをコードするポリヌクレオチドを発現するステビアまたはＳｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物のＲｅｂＡ含有量は、植物の葉のステビオールグリコシド含有量の約５％超、または約１０％超または約１５％超であってもよい。

【0061】

さまざまな実施形態における微生物宿主細胞は、原核生物または真核生物であってもよい。いくつかの実施形態では、微生物宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属から選択される細菌である。例えば、いくつかの実施形態において、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａから選択される種である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。あるいは、微生物細胞は、酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、及びＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを含む、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、またはＹａｒｒｏｗｉａの種であってもよいが、これらに限定されない。

【0062】

１－３ＵＧＴ酵素をコードするポリヌクレオチドは、微生物細胞の染色体に組み込まれてもよく、あるいは、染色体外で発現される。例えば、１－３ＵＧＴ酵素は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはプラスミドから発現されてもよい。

【0063】

ＵＧＴ酵素の発現は、例えば、遺伝子モジュール（例えば、オペロン）を使用した最適な活性、またはＵＧＴ酵素の非依存的発現のために調整されてもよい。例えば、遺伝子またはオペロンの発現は、異なる強度（例えば、強い、中程度、または弱い）を有するプロモーター、例えば、誘導型プロモーターまたは構成型プロモーターを選択することにより調節することができる。異なる強度のプロモーターのいくつかの非限定的な例として、Ｔｒｃ、Ｔ５及びＴ７が挙げられる。さらに、遺伝子またはオペロンの発現は、細胞内の遺伝子またはオペロンのコピー数を操作することによって調節することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、各ＵＧＴ酵素の単一のコピーを発現する。いくつかの実施形態において、遺伝子またはオペロンの発現は、モジュール内の遺伝子の順序を操作することにより調節することができ、この場合、最初に転写される遺伝子が一般により高レベルで発現される。いくつかの実施形態において、遺伝子またはオペロンの発現は、１つ以上の遺伝子またはオペロンを染色体へ組み込むことにより調節される。

【0064】

ＵＧＴ発現の最適化は、適切なプロモーター及びリボソーム結合部位を選択することにより達成することができる。いくつかの実施形態において、これは、高コピー数のプラスミド、または単一コピー、低コピーもしくは中程度のコピー数のプラスミドを選択することを含んでもよい。転写終結の工程は、ステムループなどの構造の導入または排除により遺伝子発現の調節を標的とすることもできる。

【0065】

いくつかの実施形態において、細胞は、植物細胞である。例えば、ポリヌクレオチドは、構成型または誘導型プロモーターなどの適したプロモーターの制御下でステビア植物において異種発現されてもよい。

【0066】

さまざまな実施形態において、宿主細胞は、Ｃ－１３ＵＧＴ酵素、Ｃ－１９ＵＧＴ酵素、及び１－２ＵＧＴ酵素から選択される１つ以上の付加的なＵＧＴ酵素を発現してもよい。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、（１－３ＵＧＴ酵素に加えて）異種Ｃ－１３ＵＧＴ酵素、異種Ｃ－１９ＵＧＴ酵素、及び異種１－２ＵＧＴ酵素を発現し、それにより、ステビオール及びステビオールグリコシド基質をグリコシル化して、ＲｅｂＭを産生することができる。

【0067】

図２は、ステビオール及びさまざまなステビオールグリコシドの構造を示し、ステビオールからＲｅｂＭに至る生合成経路における酵素活性を特定する。同様に、表１は、ステビオールからＲｅｂＭに至る生合成経路に関する基質及び生成物を特定する。各基質及び生成物の組に関して、表１は、グリコシル化のタイプを示し、必要な活性を有する酵素を特定する。４タイプのグリコシル化活性がＲｅｂＭの生成に必要とされる：Ｃ１３及びＣ１９炭素の第１のグリコシル化、ならびに第１のグリカンの２’または３’位置における第２のグリコシル化。グリカンは、一度に１つの６炭素単糖単位が付加される。したがって、第１のグリカンは、第２のグリカンが第１のグリカンに結合され得る前に、ステビオールまたはステビオールグリコシドのＣ１３またはＣ１９に結合されなければならない。ただし、ステビオールグリコシドのグリコシル化の順序は、他に制限されない。表２は、ステビオールからＲｅｂＭに至る生合成経路に必要とされる活性を有するさまざまな供給源からの酵素を特定し、ヌクレオチド及びアミノ酸配列に対する参考文献を示す。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７０３３２６７３号を参照。

【0068】

【表1】

【0069】

【表2】

【0070】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ステビオールの生合成のための内因性及び／または異種酵素の発現によってステビオールを産生する。宿主細胞は、１－３ＵＧＴを、Ｃ－１３ＵＧＴ酵素、Ｃ－１９ＵＧＴ酵素、及び１－２ＵＧＴ酵素などのテルペノイド及びテルペノイドグリコシドに活性なその他のＵＧＴ酵素（表１～２を参照）と共発現するよう操作されてもよい。微生物細胞は、ステビオール生合成のための酵素、例えば、ＭＥＰまたはＭＶＡ経路の酵素、コパリルシンターゼ及びカウレンシンターゼ（いくつかの実施形態では二機能性酵素として存在する場合がある）、Ｐ４５０酵素、例えば、カウレンオキシダーゼ及びカウレン酸ヒドロキシラーゼならびにＰ４５０レダクターゼ酵素を共発現するようさらに操作されてもよい。表３．ステビオールの生合成のための経路及び酵素が、参照により全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２０１７０３３２６７３に開示されている。

【0071】

【表3】

【0072】

いくつかの態様において、本発明は、単糖基を基質に転移するための方法を提供する。本方法は、ＮＤＰ糖（例えば、ＵＤＰ単糖）及び基質を本明細書に記載の１－３ＵＧＴ酵素、または１－３ＵＧＴ酵素を発現する宿主細胞もしくはそのライセートと接触させることを含む。テルペノイドを含むが、これに限定されないさまざまな基質が、本開示に従ってグリコシル化されてもよい。いくつかの実施形態において、基質は、テルペノイド基質であり、ステビオール及び／またはステビオールグリコシドなどのジテルペノイドであってもよい。いくつかの実施形態において、基質は、ステビオシド及び／またはＲｅｂＤを含む。さまざまな実施形態において、単糖は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、ラムノース、またはキシロースである。いくつかの実施形態において、単糖は、グルコースである。いくつかの実施形態において、本方法は、組み換え１－３ＵＧＴを用いてインビトロで行われ、外因的に添加されるＮＤＰ糖（例えば、ＵＤＰグルコースまたはＡＤＰグルコース）試薬を含む。他の実施形態において、１－３ＵＧＴは、細胞において組み換えで発現され、ＮＤＰグルコースは、内因的に利用可能である。これらの実施形態において、基質は、細胞に供給されてもよく、グリコシルトランスフェラーゼ反応のために細胞において利用可能である。

【0073】

細胞全体での変換（すなわち、「生体内変換反応」）は、基質（例えば、グリコシド中間体）及び生成物が、それぞれ細胞の内外に輸送されること、ならびに細胞がＵＤＰグルコース補酵素再生をもたらすことを必要とする。これは、細胞溶解または細胞外分泌からの酵素を使用するプロセスと対照的であり、このプロセスは、外因性ＮＤＰグルコース供給またはＮＤＰグルコース前駆体もしくはＮＤＰグルコース再生機構またはＮＤＰグルコース再生酵素系を必要とする。本発明の実施形態において、触媒反応（グリコシル化）は、生きた微生物細胞内で起こる。ＵＤＰグルコース補酵素再利用は、外部から提供される酵素または高価な基質の供給を必要とせずに天然の細胞代謝を使用して行われる。いくつかの実施形態によると、グリコシド中間体は、細胞に輸送され、生成物は細胞外に輸送される。

【0074】

ＵＳ２０１７／０３３２６７３は、ＭＥＰ経路酵素を過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株を、下流のステビオール生合成経路、及びグルコースからＲｅｂＭの産生を駆動するＵＧＴ酵素とともに記載している。ただし、これらの菌株は、供給されたステビオールグリコシド中間体のＲｅｂＭへの生体触媒を行わない。これは、部分的に、宿主細胞がステビオールグリコシド基質を取り入れられないことによる可能性がある。いくつかの実施形態において、微生物細胞に対する遺伝子改変は、グリコシル化中間体が細胞内に移動するのを可能にさせると同時に、高度なグリコシル化生成物が培地に分泌される。

【0075】

いくつかの実施形態において、微生物細胞は、ＵＤＰグルコース利用能を高める１つ以上の遺伝子改変を有する。いくつかの実施形態において、理論に縛られることを望まないが、これらの改変はまた、グルコース利用能に対して細胞にストレスを与えて、ステビオールグリコシドを細胞に取り入れる内因性トランスポーターの発現の増加につながる可能性もある。指数関数的に増殖するＥ．ｃｏｌｉにおける野生型ＵＤＰグルコースレベルは、約２．５ｍＭである（Ｂｅｎｎｅｔｔ ＢＤ， ｅｔ ａｌ．， Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｃｃｕｐａｎｃｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２００９；５（８）：５９３－９）。いくつかの実施形態において、宿主細胞に対する遺伝子改変は、（例えば、ＵＧＴ酵素の組み換え発現がない）指数関数的に増殖する細胞においてＵＤＰグルコースを、例えば、少なくとも５ｍＭ、または少なくとも１０ｍＭに増加させるよう操作される。

【0076】

いくつかの実施形態において、微生物細胞は、ＵＤＰグルコースを消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活性化、または活性もしくは発現の低下を有する。例えば、微生物細胞は、ｕｓｈＡ（ＵＤＰ糖ヒドロラーゼ）及び／またはｇａｌＥ、ｇａｌＴ、ｇａｌＫ、及びｇａｌＭ（ＵＤＰグルコースからのＵＤＰガラクトース生合成に関与する）、または各種微生物種のそのオルソログの１つ以上の欠失、不活性化、または活性の低下を有してもよい。いくつかの実施形態において、ｇａｌＥＴＫＭ遺伝子は、不活性化される、除去される、または発現が実質的に低減される。

【0077】

これらまたは他の実施形態において、微生物細胞は、ＵＤＰグルコースの前駆体を消費する酵素をコードする遺伝子の欠失、不活性化、または活性もしくは発現の低下を有する。例えば、いくつかの実施形態において、微生物細胞は、ｐｇｉ（グルコース－６リン酸イソメラーゼ）、または宿主細胞の各種微生物種のそのオルソログの欠失、不活性化、または活性もしくは発現の低下を有する。

【0078】

これらまたはその他の実施形態において、細胞は、グルコース－６－ホスフェートのＵＤＰグルコースへの変換に関与する酵素をコードする１つ以上の遺伝子の過剰発現または活性の増加を有する。例えば、ｐｇｍ（ホスホグルコムターゼ）及び／またはｇａｌＵ（ＵＴＰグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）（またはそのオルソログもしくは誘導体）は、過剰発現させられても、または酵素産生性を高めるよう改変されてもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ ２０２０／００８７６９２を参照。

【0079】

いくつかの実施形態において、基質は、植物抽出物であり、これは、任意にステビアの葉抽出物である。さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴを発現する微生物細胞は、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭを含む、高次ステビオールグリコシドの生成のためにステビオールまたは低次ステビオールグリコシドを供給されてもよい。ステビアの葉抽出物からの高度な中間体は、ステビオールグリコシドの既存の工業的抽出から容易に入手可能である。表４に示されるとおり、入手可能な葉抽出物は、主に経路中間体ステビオシド及びレバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）を含む。さまざまな実施形態において、ステビアの葉抽出物は、ステビオールグリコシドの抽出である。いくつかの実施形態において、抽出物は、ステビオシド、ステビオールビオシド、及びレバウジオシドＡのうちの１つ以上を主要な構成成分として含む。主要な構成成分は、一般に抽出物中のステビオールグリコシドの少なくとも約１０％を占めるが、いくつかの実施形態では、抽出物中のステビオールグリコシドの少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％を占める場合もある。

【0080】

【表4】

【0081】

さまざまな実施形態において、１－３ＵＧＴは、低次ステビオールグリコシドを高次ステビオールグリコシドに変換する。例えば、ＵＧＴ酵素は、ステビオビオシドからＲｅｂＢ、ルブソシドからＲｅｂＧ、ステビオシドからＲｅｂＡ、ＲｅｂＡからＲｅｂＩ、ＲｅｂＧからＲｅｂ４、ＲｅｂＥからＲｅｂＤ、及び／またはＲｅｂＤからＲｅｂＭへの変換に関する１－３’ＵＧＴ活性を有してもよい。あるいは、ＵＧＴは、別の１－３ＵＧＴ酵素（複数可）または特定の基質に対して特異性の優先度を有する酵素と組み合わせて使用されてもよい。例えば、あるＵＧＴは、１－３ＵＧＴとしてＣ１３グリコシル基質に優先的には作用することがあり得るのに対して、別のＵＧＴ酵素は、１－３ＵＧＴとしてＣ１９グリコシル基質に優先的に作用する。

【0082】

いくつかの実施形態において、１－３ＵＧＴ酵素を発現する微生物細胞は、ＲｅｂＤを供給され、ＲｅｂＤの少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％をＲｅｂＭに変換する。さまざまな実施形態において、そのような変換は、少なくとも約８時間、またはいくつかの実施形態では少なくとも約２４時間起こることが可能である。例えば、変換は、培養物中で８時間から約７２時間起こることが可能である場合もある。いくつかの実施形態において、変換は、約２４時間から約６０時間起こることが可能である場合もある。いくつかの実施形態において、微生物細胞は、ＲｅｂＤの少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％をＲｅｂＭに約４８時間以下でまたは約２４時間以下で変換する。

【0083】

いくつかの実施形態において、微生物細胞は、ステビオシドを供給され、１－３ＵＧＴを発現し、ステビオシドの少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約５０％をＲｅｂＡに変換する。いくつかの実施形態において、酵素は、ステビオシドの少なくとも約７５％または少なくとも約９０％をＲｅｂＡに変換する。さまざまな実施形態において、そのような変換は、少なくとも約８時間、またはいくつかの実施形態では少なくとも約２４時間起こることが可能である。例えば、変換は、培養物中で８時間から約７２時間起こることが可能である場合もある。いくつかの実施形態において、変換は、約２４時間から約６０時間起こることが可能である場合もある。いくつかの実施形態において、微生物細胞は、ステビオシドの少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％をＲｅｂＡに約４８時間以下でまたは約２４時間以下で変換する。

【0084】

天然のＵＧＴ酵素は、一般に（２０～２４℃の範囲の最適温度を有することが多い）植物酵素であるか、または植物酵素から誘導されるが、いくつかの実施形態では、本開示は、２４℃から３７℃、または２７℃から３７℃、または３０℃から３７℃などの２４℃を超える温度における酵素産生性を有する微生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞）においてグリコシル化生成物の生成を高い収率で可能にする。いくつかの実施形態において、培養は、３０から３４℃で行われる。

【0085】

いくつかの実施形態において、プロセスは、大規模生成に対してスケーラブルである。例えば、いくつかの実施形態において、培養のサイズは、少なくとも約１００Ｌ、少なくとも約２００Ｌ、少なくとも約５００Ｌ、少なくとも約１，０００Ｌ、または少なくとも約１０，０００Ｌ、または少なくとも約１００，０００Ｌ、または少なくとも約５００，０００Ｌである。

【0086】

さまざまな実施形態において、方法は、グリコシル化生成物を細胞培養物または細胞ライセートから回収することをさらに含む。いくつかの実施形態において、培養は、少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約５００ｍｇ／Ｌ、または少なくとも約１ｇ／Ｌ、または少なくとも約２ｇ／Ｌ、または少なくとも約５ｇ／Ｌ、または少なくとも約１０ｇ／Ｌ、または少なくとも約２０ｇ／Ｌ、または少なくとも約３０ｇ／Ｌ、または少なくとも約４０ｇ／Ｌ、または少なくとも約５０ｇ／Ｌのグリコシル化生成物を生成し、これは、いくつかの実施形態では、培養培地から抽出される。

【0087】

いくつかの実施形態において、基質は、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、またはトリテルペノイドなどのテルペノイドである。いくつかの実施形態において、テルペノイドは、トリテルペノイドであり、任意にモグロールまたはモグロシドである。いくつかの実施形態において、本開示の１－３ＵＧＴ酵素は、グリコシド、脂肪族及び分岐アルコール、置換フェノール、フラボノイドならびにガラートに対して広い基質活性を有する。例えば、Ｄｅｗｉｔｔ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｂｒｏａｄ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｔｅｖｉａ ＵＧＴ－７６Ｇ１， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３３ （２０１６） ４９－５５を参照。ＵＧＴ酵素の基質としては、ステビオールグリコシドなどのジテルペノイドグリコシド及びモグロシドなどのトリテルペノイドグリコシドを含む、テルペノイドグリコシド（イソプレノイド）を挙げることができる。

【0088】

いくつかの実施形態において、本方法は、基質の存在下において宿主細胞を増殖させることを含む。基質は、培養物に供給されてもよく、いくつかの実施形態では、基質は、宿主細胞によって合成される。いくつかの実施形態において、基質は、ステビオールであり、宿主細胞は、複数のＵＧＴ酵素を発現して、ＲｅｂＭなどの標的ステビオールグリコシドを産生する。

【0089】

いくつかの実施形態において、グリコシル化生成物（例えば、ＲｅｂＭ）は、培地構成成分から精製される。したがって、いくつかの実施形態において、本方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞から増殖培地を分離すること、及び増殖培地から所望のグリコシル化生成物（例えば、ＲｅｂＭ）を単離することを含む。いくつかの実施形態において、ＲｅｂＭなどの生成物は、細胞物質からさらに抽出される。

【0090】

いくつかの態様において、本発明は、ＲｅｂＭなどのグリコシル化生成物を含む生成物を生成するための方法を提供する。本方法は、（本開示により生成される）標的ステビオールグリコシドを食品、飲料、オーラルケア製品、甘味料、香味剤、またはその他の製品などの製品に組み込むことを含む。本発明により調製される精製されたステビオールグリコシドは、食品、飲料、テクスチャラント（例えば、デンプン、繊維、ガム、脂肪及び脂肪模倣物、ならびに乳化剤）、医薬組成物、タバコ製品、機能性食品組成物、口腔衛生組成物、及び化粧用組成物を含むが、それらに限定されないさまざまな製品に使用されてもよい。ＲｅｂＭが組み合わせて使用され得る香味料の非限定例としては、ライム、レモン、オレンジ、果物、バナナ、ブドウ、西洋ナシ、パイナップル、マンゴー、ビターアーモンド、コーラ、シナモン、砂糖、綿あめ及びバニラフレーバーが挙げられる。他の食品成分の非限定例としては、香味料、酸味料、及びアミノ酸、着色剤、増量剤、加工デンプン、ガム、テクスチャライザー、保存料、抗酸化剤、乳化剤、安定剤、増粘剤、及びゲル化剤が挙げられる。

【0091】

いくつかの態様において、本発明は、複数の高強度甘味料を含む甘味料製品を製造するための方法を提供し、当該複数は、ステビオールグリコシド、モグロシド、スクラロース、アスパルテーム、ネオテーム、アドバンテーム、アセスルファムカリウム、サッカリン、シクラマート、ネオヘスペリジンジヒドロカルコン、グネチホリンＥ、及び／またはピセアタンノール４’－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシドのうちの２つ以上を含む。本方法は、食品、飲料、オーラルケア製品、甘味料、香味剤、または上記のものを含むその他の製品に甘味料製品を組み込むことをさらに含んでもよい。

【0092】

ＲｅｂＭなどの標的ステビオールグリコシド（複数可）、及びそれを含む甘味料組成物は、さまざまな生理学的活性物質または機能性成分と組み合わせて使用することができる。機能性成分は、一般的に、カロテノイド、食物繊維、脂肪酸、サポニン、抗酸化剤、機能性食品、フラボノイド、イソチオシアナート、フェノール、植物ステロール及びスタノール（フィトステロール及びフィトスタノール）、ポリオール、プレバイオティクス、プロバイオティクス、フィトエストロゲン、ダイズタンパク質、硫化物／チオール、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、及びミネラルなどのカテゴリに分類される。機能性成分はまた、心血管性、コレステロール低下、及び抗炎症性などの健康上の利点に基づいて分類されてもよい。

【0093】

さらに、本発明により得られるＲｅｂＭなどの標的ステビオールグリコシド（複数可）、及び甘味料組成物を、高強度甘味料として利用し、味特性の向上を伴う、ゼロカロリー、低カロリーまたは糖尿病飲料及び食品を製造してもよい。それはまた、砂糖を使用することができない飲料、食品、医薬品、及びその他の製品にも使用することができる。さらに、ＲｅｂＭ及び甘味料組成物は、特性が改善されたヒトの消費専用の飲料、食品、及びその他の製品だけでなく、動物の食餌及び飼料にも甘味料として使用することができる。

【0094】

標的ステビオールグリコシド（複数可）及び甘味料組成物が使用され得る製品の例としては、ウォッカ、ワイン、ビール、蒸留酒、及び日本酒などのアルコール飲料、天然ジュース、炭酸ソフトドリンク、ダイエット飲料、ゼロカロリー飲料、低カロリー飲料及び食品、ヨーグルト飲料、インスタントジュース、インスタントコーヒー、粉末タイプのインスタント飲料、缶詰製品、シロップ、発酵味噌、醤油、酢、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、カレー、スープ、インスタントブイヨン、粉末醤油、粉末酢、ビスケットの種類、煎餅、クラッカー、パン、チョコレート、キャラメル、キャンディー、チューインガム、ゼリー、プリン、保存果物及び野菜、生クリーム、ジャム、マーマレード、フラワーペースト、粉ミルク、アイスクリーム、シャーベット、瓶詰め野菜及び果物、缶詰の煮豆、肉及び食物の甘煮ソース煮込み、農業野菜食品、シーフード、ハム、ソーセージ、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、練り魚肉、魚フライ製品、乾燥シーフード製品、冷凍食品、保存海藻、保存肉、タバコ、医薬品、ならびにその他多数が挙げられるが、これらに限定されない。

【0095】

食品、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品、及びチューインガムなどの製品の製造中に、混合、混練、溶解、酢漬け、浸透、抽出、振りかけ、噴霧、浸出、及びその他の方法などの従来の方法が使用されてもよい。

【0096】

ここで、以下の実施例を参照して本発明の態様及び実施形態を示す。

【実施例】

【0097】

ここで、以下の実施例を参照して本発明の態様及び実施形態を示す。

【0098】

実施例１：ＭｂＵＧＴ１－３＿１（配列番号５）の変異体のスクリーニング
ＵＧＴ ＭｂＵＧＴ１－３＿１（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド及び９５の選択された変異体を含むプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ΔｕｓｈＡ、ΔｇａｌＥＴＫＭ、Δｐｇｉ、過剰発現ｐｇｍ、ｇａｌＵ）に形質転換した。得られた菌株を豊富な種培地に播き、９６ウェルプレートにおいて２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩インキュベートして種培養物を生成した。

【0099】

４０μＬの種を、０．５ｍＭのステビオシド及び０．５ｍＭのレバウジオシドＤを含む３６０μＬの新しい生産培地に添加することによって種培養物を生産培養物に播いた。次に、生産培養物を９６ウェルプレートにおいて２５０ｒｐｍ、３７℃で４８時間増殖させた。生成物を、ＬＣ－ＭＳ ＱＱＱを使用して定量した。

【0100】

スクリーニングされた９５の変異体は、以下のものを含む（これらの変異体のアミノ酸位置は、ＭｂＵＧＴ１－３＿１（配列番号５）に関するものである）：
ｉ）置換：
Ｆ１１Ｌ、Ｋ１３Ｒ、Ｔ１６Ｅ、Ｖ１８Ｌ、Ｅ１９Ａ、Ｇ４８Ｔ、Ｓ６２Ａ、Ｄ７３Ｐ、Ｌ８９Ｗ、Ｖ９３Ｌ、Ｙ９４Ｅ、Ｗ９９Ｆ、Ｅ１００Ｃ、Ｎ１０６Ｒ、Ｅ１１５Ｋ、Ｙ１１９Ｔ、Ｑ１２２Ｅ、Ｋ１３０Ｗ、Ｖ１３３Ａ、Ｖ１３３Ｓ、Ｍ１３６Ｋ、Ｓ１５３Ｌ、Ｇ１６４Ｒ、Ｒ１６５Ｎ、Ｒ１６６Ｇ、Ｉ１６９Ｌ、Ｆ２００Ｌ、Ｆ２０４Ｈ、Ｆ２０４Ｐ、Ｋ２０６Ａ、Ｋ２０８Ｄ、Ｋ２０８Ｎ、Ｆ２１９Ｄ、Ｆ２１９Ｓ、Ｌ２２１Ｐ、Ｒ２２９Ａ、Ｉ２３０Ｆ、Ｌ２３３Ｉ、Ｇ２４１Ａ、Ｒ２４３Ｍ、Ｐ２４５Ｓ、Ｉ２４６Ｌ、Ｒ２５７Ｄ、Ｅ２６０Ａ、Ｌ２６１Ｋ、Ｌ２６２Ｑ、Ｌ２６４Ｓ、Ｄ２６９Ｅ、Ｅ２７１Ｐ、Ｓ２７３Ａ、Ｒ２９４Ｐ、Ｌ２９６Ｉ、Ｓ３０１Ｎ、Ｆ３０４Ｓ、Ｈ３０９Ｆ、Ｖ３１０Ａ、Ｔ３２７Ｓ、Ａ３３３Ｖ、Ｆ３３６Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ｙ３４８Ｔ、Ｑ３５２Ａ、Ｑ３５２Ｄ、Ｑ３５２Ｅ、Ａ３５４Ｓ、Ａ３５４Ｔ、Ｋ３５５Ｙ、Ｌ３５８Ｉ、Ｍ３６１Ｑ、Ｉ３６２Ｖ、Ｓ３７５Ｔ、Ｅ３８３Ｆ、Ｖ３８７Ｌ、Ｉ３８８Ｅ、Ｉ３８８Ｓ、Ｒ３８９Ｑ、Ｌ４００Ｆ、Ｌ４０４Ｆ、Ａ４０６Ｓ、Ｄ４１３Ｅ、Ｖ４１８Ｃ、Ｐ４２６Ａ、Ｓ４２８Ｋ、Ｓ４２８Ｇ、Ｖ４４１Ｉ、Ｄ４４５Ｅ、Ｄ４５５Ｎ、Ｑ４５７Ｇ、Ｑ４５７Ｋ／Ｓ４５８Ｑ、またはＱ４５７Ｋ。
ｉｉ）置換及び欠失：
Ｑ４５７Ｋ及びＳ４５８欠失（ΔＳ４５８）。
ｉｉｉ）欠失：
ΔＧ１５９、ΔＧ１５９ΔＧ１６１、またはΔＧ１５９ΔＳ１６０ΔＧ１６１。
ｉｖ）挿入：
位置１５８と１５９の間のＳの挿入または４５６と４５７の間のＫの挿入。

【0101】

ＭｂＵＧＴ１－３＿１の９５の変異体のすべてを、ステビオシド（基質）からＲｅｂＡ及びＲｅｂＩならびにＲｅｂＭを生成する能力に関してスクリーニングした。表５は、（Ｃ－１３－グルコースにおける１－３グルコシル化により）ＲｅｂＡ及びＲｅｂＩならびに（Ｃ－１９－グルコースにおける１－３グリコシル化により）ＲｅｂＭを生成するＭｂＵＧＴ１－３＿１の選択された変異体の向上倍率を示す。表５において、列２は、一般に基質のＣ１３－グルコースにおけるグリコシル化に対応し、列３は、一般に基質のＣ１９－グルコースにおけるグリコシル化に対応する。示されるとおり、Ｃ－１９グリコシル化が、Ｃ－１３グリコシル化よりも向上している。表５の変異を有する構築された変異体は、本明細書ではＭｂＵＧＴ１－３＿２（配列番号６）と呼ぶ。

【0102】

【表5】

【0103】

実施例２：１－３’グリコシル化酵素による生物変換
３つのＵＧＴ、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１－Ｌ２００Ａ（配列番号１）、ＭｂＵＧＴ１－３＿０（配列番号４）、ＭｂＵＧＴ１－３＿１（配列番号５）、及びＭｂＵＧＴ１－３＿２（配列番号６）をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを個別にＥ．ｃｏｌｉ細胞（ΔｕｓｈＡ、ΔｇａｌＥＴＫＭ、Δｐｇｉ、過剰発現ｐｇｍ、ｇａｌＵ）に形質転換した。得られた菌株を、１ｍＭのステビオシドまたは１ｍＭのＲｅｂＤを含む培養培地に播いた。増殖後、ステビオールグリコシドを、培養培地から回収した。菌株を９６ウェルプレートにおいて２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩増殖させた。次に、その細胞を、新しい生産培養物に総体積の１０％まで移した。ステビオシド（０．５ｍＭ）及びレバウジオシドＤ（０．５ｍＭ）のそれぞれが、生産培養物に含まれた。その生産培養物を、その後、９６ウェルプレートにおいて２５０ｒｐｍ、３７℃で４８時間増殖させた。生成物を、ＬＣ－ＭＳ ＱＱＱを使用して定量した。

【0104】

図４は、ステビオシドのＲｅｂＡへの変換パーセント及びＲｅｂＤのＲｅｂＭへの変換パーセントを示す。両反応の変換パーセントは、それぞれ配列番号５及び配列番号６のアミノ酸配列を有するＭｂＵＧＴ１－３＿１及びＭｂＵＧＴ１－３＿２で最も高かった。図５は、ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１－Ｌ２００Ａと比較したＭｂＵＧＴ１－３＿１及びＭｂＵＧＴ１－３＿２の向上倍率を示す。

【0105】

実施例３：ＭｂＵＧＴ１－３＿２（配列番号６）の変異体のスクリーニング
ＵＧＴ ＭｂＵＧＴ１－３＿２（配列番号６）をコードするポリヌクレオチド及び９６の選択されたＭｂＵＧＴ１－３＿２の変異体を含むプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ΔｕｓｈＡ、ΔｇａｌＥＴＫＭ、Δｐｇｉ、ΔａｒａＡ、過剰発現ｐｇｍ、ｇａｌＵ、ＵＧＴ１－２酵素）に形質転換した。得られた菌株を豊富な種培地に播き、９６ウェルプレートにおいて２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩インキュベートして種培養物を生成した。

【0106】

次に、４０μＬの種を、１ｇ／Ｌのステビオシド／ＲｅｂＡ葉抽出物を含む３６０μＬの新しい生産培地に添加することによって種培養物を生産培養物に播いた。その生産培養物を、その後、９６ウェルプレートにおいて２５０ｒｐｍ、３７℃で４８時間増殖させた。ＵＰＬＣ－ＤＡＤを使用して生成物を定量した。

【0107】

スクリーニングされた変異体は、以下のものを含む（アミノ酸位置は、ＭｂＵＧＴ１－３＿１（配列番号５）に関するものである）：
ｉ）置換：
Ｔ１６Ｇ、Ｖ１８Ｌ、Ｅ１９Ａ、Ｄ２３Ｅ、Ｒ３１Ｋ、Ｃ６４Ｓ、Ｉ７０Ｖ、Ｌ７６Ｎ、Ｐ７９Ｍ、Ｗ９９Ｆ、Ｄ１１４Ｅ、Ｒ１２５Ｌ、Ｖ１３３Ａ、Ｓ１５０Ｄ、Ｔ２０２Ｍ、Ｆ２０４Ｅ、Ｙ２１２Ｆ、Ｙ２１２Ｈ、Ｒ２１８Ｌ、Ｄ２２７Ｓ、Ｅ２２８Ｓ、Ｉ２３０Ｆ、Ｉ２３０Ｙ、Ｌ２３３Ｉ、Ｇ２３７Ｓ／Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｌ２３９Ｅ、Ｌ２３９Ｇ、Ａ２４０Ｓ、Ａ２４０Ｖ、Ｍ２４２Ａ、Ｍ２４２Ｉ、Ｉ２４６Ｙ、Ｉ２４７Ｆ、Ａ２５２Ｉ、Ｄ２５３Ｅ、Ｌ２６１Ｋ、Ｌ２６４Ｅ、Ａ２６５Ｄ、Ｅ２７１Ｐ、Ｓ２７３Ａ、Ｃ２７４Ｇ、Ｃ２７４Ｌ、Ｙ２８２Ｗ、Ｎ２９２Ｋ、Ｓ３０２Ｇ、Ｌ３０３Ｍ、Ｆ３０６Ｗ、Ｌ３１２Ｍ、Ｑ３１４Ｌ、Ｌ３１８Ｗ、Ｐ３２３Ｌ、Ｅ３３１Ａ、Ｋ３４０Ｒ、Ｓ３４６Ｖ、Ｙ３４８Ｆ／Ｓ３４９Ｄ／Ｎ３５０Ｔ／Ｗ３５１Ｌ／Ｑ３５２Ｅ／Ｉ３５３Ｎ、Ｙ３４８Ｇ／Ｓ３４９Ｅ／Ｎ３５０Ｆ／Ｗ３５１Ｇ／Ｑ３５２Ｅ／Ｉ３５３Ｋ、Ｙ３４８Ｔ／Ｓ３４９Ｎ／Ｎ３５０Ｅ／Ｗ３５１Ｐ／Ｑ３５２Ｅ／Ｉ３５３Ｅ、Ｗ３５１Ｆ／Ｑ３５２Ｅ／Ａ３５４Ｇ、Ｗ３５１Ｐ、Ｑ３５２Ｄ／Ａ３５４Ｇ、Ｑ３５２Ｅ、Ａ３５４Ｓ、Ｉ３６２Ｌ、Ａ３６７Ｎ、Ｅ３８３Ｓ、Ｅ３８５Ａ、Ｈ４０３Ｙ、Ｌ４０４Ｆ、Ｆ４１９Ｋ、Ｓ４２８Ｋ、Ｌ４３１Ｉ、Ｄ４４５Ｅ、Ｄ４４５Ｉ、Ａ４５０Ｌ、またはＱ４５７Ｇ。
ｉｉ）置換及び欠失：
Ｄ２２７Ｔ及びΔ２２８から２３４
ｉｉｉ）欠失：
ΔＧ１５８からＧ１６１、ΔＧ１５９からＧ１６１、ΔＳ１６０からΔＧ１６１、ΔＧ１６１、Δ２２８、Δ２２８から２２９、Δ２２８から２３０、Δ２２８～２３１、Δ２２８から２３２、Δ２２８から２３３、Δ２２８から２３４、Δ２２８から２３５、Δ２２８から２３６、Δ２２８から２３７、ΔＹ３２０からＰ３２３、ΔＤ３２５からＫ３２６、またはΔＫ３２６。
ｉｖ）挿入：
Ｆ２５とＬ２６の間にＬＥＡを挿入。
ｉｖ）置換：
Ｙ３４８～Ｉ３５３をＩＮＰＱＧと交換

【0108】

表６は、ＲｅｂＭを産生する選択されたＭｂＵＧＴ１－３＿２（配列番号６）の変異体の能力を示す。表６の列２は、反応生成物中のＲｅｂＭのパーセンテージの向上倍率を示す。

【0109】

【表6】

【0110】

アミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２の欠失は、ＲｅｂＭの生成に驚異的な１１倍の向上をもたらした。ホモロジーモデリングに基づいて、アミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２は、結合した基質の近くにループを形成するようである。アミノ酸Ｅ２２５～Ｔ２３２の欠失は、ＵＧＴ酵素の基質特異性をＲｅｂＤからＲｅｂＭへの反応に有利なようにシフトさせる可能性がある。ＭｂＵＧＴ１－３＿２（配列番号６）に対してＥ２２５～Ｔ２３２ループの欠失ならびにＳ７２Ｑ、Ａ３０５Ｃ、Ｙ３４５Ｆ及びＬ４２８Ｉ変異を有する配列は、ＭｂＵＧＴ１－３＿３（配列番号９）と呼ぶ。

【0111】

Ｅ２２５からＴ２３２の領域中のいくつかの欠失を試験し、これらもＲｅｂＭ生成の増加を示した。表７は、（配列番号６に従って番号づけされた）Ｅ２２５～Ｔ２３２の領域の有益なさまざまな欠失を示す。

【0112】

【表7】

【0113】

配列
配列番号１
ＵＧＴ７６Ｇ１［Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ］
（配列番号１）
ＭＥＮＫＴＥＴＴＶＲＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＩＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＥＲＩＳＮＬＰＴＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＬＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＲＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＡＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＹＳＮＷＱＩＬＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＤＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＬＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳＫＱＳＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＳＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＳＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＶＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬ

【0114】

配列番号２
ＭｂＵＧＴ１－３
参考文献：ＵＳ２０１７／０３３２６７３

ＭＡＮＷＱＩＬＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＤＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＬＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳＫＱＳＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＳＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＳＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＶＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬＥＮＫＴＥＴＴＶＲＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＩＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＥＲＩＳＮＬＰＴＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＬＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＲＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＡＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＹＳ

【0115】

配列番号３
ＵＧＴ７６Ｇ１＿Ｌ２００Ａ
参考文献：ＵＳ２０１７／０３３２６７３

ＭＡＥＮＫＴＥＴＴＶＲＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＩＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＥＲＩＳＮＬＰＴＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＬＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＲＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＡＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＹＳＮＷＱＩＡＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＤＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＬＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳＫＱＳＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＳＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＳＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＶＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬ

【0116】

配列番号４
ＭｂＵＧＴ１－３＿０

ＭＡＫＱＳＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＳＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＳＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＶＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬＥＮＫＴＥＴＴＶＲＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＩＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＥＲＩＳＮＬＰＴＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＬＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＲＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＡＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＹＳＮＷＱＩＡＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＤＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＬＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳ

【0117】

配列番号５
ＭｂＵＧＴ１－３＿１

ＭＡＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＧＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＳＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＬＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬＧＳＧＧＳＧＧＳＧＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＭＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＥＲＩＳＮＬＰＴＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＬＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＲＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＡＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＹＳＮＷＱＩＡＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＤＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＬＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳＱＳ

【0118】

配列番号６
ＭｂＵＧＴ１－３＿２

ＭＡＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＧＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＳＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＬＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬＧＳＧＧＳＧＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＭＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＥＲＩＳＮＬＰＴＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＱＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＰＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＡＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＹＳＮＷＱＩＡＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＥＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＬＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳＱＳ

【0119】

配列番号７
リンカー

ＧＳＧＧＳＧ

【0120】

配列番号８
リンカー

ＧＳＧＧＳＧＧＳＧ

【0121】

配列番号９
ＭｂＵＧＴ１－３＿３

ＭＡＦＬＷＶＶＲＰＧＦＶＫＧＳＴＷＶＥＰＬＰＤＧＦＬＧＥＲＧＲＩＶＫＷＶＰＱＱＥＶＬＡＨＧＡＩＧＡＦＷＴＨＧＧＷＮＳＴＬＥＳＶＣＥＧＶＰＭＩＦＱＤＦＧＬＤＱＰＬＮＡＲＹＭＳＤＶＬＫＶＧＶＹＬＥＮＧＷＥＲＧＥＩＡＮＡＩＲＲＬＭＶＤＥＥＧＥＹＩＲＱＮＡＲＶＬＫＱＫＡＤＶＳＬＭＫＧＧＳＳＹＥＳＬＥＳＬＶＳＹＩＳＳＬＧＳＧＧＳＧＲＲＲＲＩＩＬＦＰＶＰＦＱＧＨＩＮＰＭＬＱＬＡＮＶＬＹＳＫＧＦＳＩＴＩＦＨＴＮＦＮＫＰＫＴＳＮＹＰＨＦＴＦＲＦＩＬＤＮＤＰＱＤＨＧＰＬＡＧＭＲＩＰＩＩＮＥＨＧＡＤＥＬＲＲＥＬＥＬＱＭＬＡＳＥＥＤＥＥＶＳＣＬＩＴＤＡＬＷＹＦＡＱＳＶＡＤＳＬＮＬＰＲＬＶＬＭＴＳＳＬＦＮＦＨＣＨＶＳＬＰＱＦＤＥＬＧＹＬＤＰＤＤＫＴＲＬＥＥＱＡＳＧＦＰＭＬＫＶＫＤＩＫＳＡＦＳＮＷＱＩＡＫＥＩＬＧＫＭＩＫＱＴＫＡＳＳＧＶＩＷＮＳＦＫＥＬＥＥＳＥＬＥＴＶＩＲＥＩＰＡＰＳＦＬＩＰＬＰＫＨＬＴＡＳＳＳＳＬＬＥＨＤＲＴＶＦＱＷＬＤＱＱＰＰＳＳＶＩＹＶＳＦＧＳＴＳＥＶＤＥＫＤＦＬＥＩＡＲＧＬＶＤＳＱＳ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

2022530706000001.app

【手続補正書】

【提出日】2022-05-06

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含む、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素であって、
前記酵素は、配列番号５の位置１５５と対応する位置の後に、大部分がグリシン及びセリン残基である６個から１２個のアミノ酸の柔軟で親水性の配列の挿入を配列番号１に対して有し、
前記酵素は、
配列番号５の位置５４と対応する位置のグリシン（Ｇ）、
配列番号５の位置１１１と対応する位置のロイシン（Ｌ）、及び
配列番号５の位置１８３と対応する位置のメチオニン（Ｍ）
の１つ以上を保持する、
前記酵素。

【請求項2】

前記アミノ酸配列は、配列番号５または配列番号６と少なくとも約９５％一致する、請求項１に記載の酵素。

【請求項3】

前記酵素は、配列番号５の位置５４と対応する前記位置にＧｌｙ、配列番号５の位置１１１と対応する前記位置にＬｅｕ、及び配列番号５の位置１８３と対応する前記位置にＭｅｔを有する、請求項１に記載の酵素。

【請求項4】

前記挿入は、ＧＳＧＧＳＧ（配列番号７）またはＧＳＧＧＳＧＧＳＧ（配列番号８）である、請求項１に記載の酵素。

【請求項5】

前記酵素は、配列番号６のアミノ酸配列に対してアミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２と対応する少なくとも３つのアミノ酸の欠失を含む、請求項１に記載の酵素。

【請求項6】

前記酵素は、配列番号６のアミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２と対応するアミノ酸の欠失を含む、請求項５に記載の酵素。

【請求項7】

前記酵素は、配列番号６の位置７２、位置３０５、位置３４５、及び位置４２８と対応する１つ以上の位置にアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の酵素。

【請求項8】

前記酵素は、配列番号６の位置７２と対応する前記位置にグルタミン（Ｑ）、配列番号６の位置３０５と対応する前記位置にシステイン（Ｃ）、配列番号６の位置３４５と対応する前記位置にフェニルアラニン（Ｆ）、及び配列番号６の位置４２８と対応する前記位置にイソロイシン（Ｉ）から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項７に記載の酵素。

【請求項9】

配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含む、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素であって、
配列番号５の位置５４と対応する位置にグリシン（Ｇ）、
配列番号５の位置１１１と対応する位置にロイシン（Ｌ）、及び
配列番号５の位置１８３と対応する位置にメチオニン（Ｍ）
を含む、前記酵素。

【請求項10】

配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１のＥ７４からＴ８１と対応するアミノ酸の欠失を含む、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素。

【請求項11】

ＳｒＵＧＴ７６Ｇ１の円順列変異体であり、配列番号１の対応する位置に対してアミノ酸置換、欠失、及び挿入から独立して選択される１から２０個のアミノ酸改変を有し、ただし、前記円順列変異体は、配列番号１のアミノ酸Ｅ７４からＴ８１と対応するアミノ酸の欠失を含む、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素。

【請求項12】

配列番号６のアミノ酸配列に対してアミノ酸Ｅ７４からＴ８１と対応する少なくとも５アミノ酸の欠失を含む、請求項５に記載の酵素。

【請求項13】

前記酵素は、配列番号６の位置７２と対応する位置にグルタミン（Ｑ）又はアスパラギン（N）の置換を含む、請求項７に記載の酵素。

【請求項14】

前記酵素は、配列番号６の位置３０５と対応する位置にシステイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、又はスレオニン（Ｔ）から選択される中性親水性アミノ酸を含む、請求項７に記載の酵素。

【請求項15】

前記酵素は、配列番号６の位置３４５と対応する位置にフェニルアラニン（Ｆ）又はトリプトファン（Ｗ）の置換を含む、請求項７に記載の酵素。

【請求項16】

前記酵素は、配列番号６の位置４２８と対応する位置にイソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）又はアラニン（Ａ）の置換を含む、請求項７に記載の酵素。

【請求項17】

前記酵素は、配列番号６に対して次の置換：Ｓ７２Ｑ、Ａ３０５Ｃ、Ｙ３４５Ｆ、及びＬ４２８Ｉの２つ、３つまたは４つを含む、請求項７に記載の酵素。

【請求項18】

配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％一致するアミノ酸配列を含む、ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素であって、配列番号６のアミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２に対応する少なくとも３つのアミノ酸の欠失を含む、前記酵素。

【請求項19】

配列番号６のアミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２に対応する少なくとも５つのアミノ酸の欠失を含む、請求項１８に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項20】

配列番号６のアミノ酸Ｅ２２５からＴ２３２に対応するアミノ酸の欠失を含む、請求項１８に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項21】

前記酵素は、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９０％一致する、請求項１８に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項22】

前記酵素は、配列番号５又は配列番号６と少なくとも９５％一致する、請求項１８に記載のＵＧＴ酵素。

【請求項23】

請求項１、９、１０、１１又は１８に記載の酵素をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項24】

請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む、単離された組み換え微生物。

【請求項25】

単糖基を基質に転移するための方法であって、ＮＤＰ糖及び基質を、請求項２４に記載の単離された組み換え微生物と接触させることを含む、方法。

【請求項26】

グリコシル基を基質に転移するための方法であって、基質の存在下において請求項２４に記載の単離された組み換え微生物を増殖させることを含む、方法。

【国際調査報告】