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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-01
(54)【発明の名称】ＣＬＥＣ９Ａベースキメラタンパク質複合体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20220624BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220624BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220624BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220624BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220624BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220624BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20220624BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220624BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220624BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220624BHJP
C07K 14/56 20060101ALN20220624BHJP
C07K 16/18 20060101ALN20220624BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K38/16
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 D
A61K39/395 N
C07K14/56
C07K16/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021558521
(86)(22)【出願日】2020-03-27
(85)【翻訳文提出日】2021-11-25
(86)【国際出願番号】 US2020025423
(87)【国際公開番号】W WO2020198662
(87)【国際公開日】2020-10-01
(31)【優先権主張番号】62/825,584
(32)【優先日】2019-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/906,442
(32)【優先日】2019-09-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521437068
【氏名又は名称】オリオニス バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド
(71)【出願人】
【識別番号】518268352
【氏名又は名称】オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】クレイ，ニコライ
(72)【発明者】
【氏名】デプラ，エリク
(72)【発明者】
【氏名】ザビュー，レンナート
(72)【発明者】
【氏名】タヴェルニエル，ジャン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA22
4C084CA53
4C084MA17
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB26
4C084ZB27
4C085AA13
4C085AA14
4C085AA16
4C085BB42
4C085CC32
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA16
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、一部は、抗Ｃｌｅｃ９Ａターゲティング部分、改変Ｆｃドメイン、および改変ヒトＩＦＮαを含むキメラタンパク質複合体ならびに治療薬としてのそれらの使用に関する。本発明は、キメラタンパク質複合体を含む医薬組成物および種々の疾患の治療でのそれらの使用にさらに関する。
【選択図】図６
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラタンパク質複合体であって、（ｉ）Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９Ａ）に特異的に結合するターゲティング部分、
（ｉｉ）改変ヒトＩＦＮα２、および
（ｉｉｉ）改変Ｆｃドメイン、
を含む、キメラタンパク質複合体。
【請求項2】
前記キメラタンパク質複合体が、ヘテロダイマーである、請求項１に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項3】
前記キメラタンパク質複合体が、配列番号１～４および４３のいずれか１つと少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項２に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項4】
前記キメラタンパク質複合体が、配列番号１～４および４３から選択されるアミノ酸配列および前記アミノ酸配列に対し１０個未満の変異を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項5】
前記キメラタンパク質複合体が、配列番号１～４および４３から選択されるアミノ酸配列および前記アミノ酸配列に対し５個未満の変異を有するポリペプチドを含む、請求項４に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項6】
前記キメラタンパク質複合体が、配列番号１～４および４３から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項7】
前記キメラタンパク質複合体が、配列番号５～８、２９～３６、または４１～４２のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項8】
前記キメラタンパク質複合体が、配列番号５～８、２９～３６、または４１～４２のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさらに含む、請求項７に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項9】
前記キメラタンパク質複合体が、配列番号５～８、２９～３６、または４１～４２のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをさらに含む、請求項８に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項10】
（ｉ）配列番号１または３のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項11】
（ｉ）配列番号１または３のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項１０に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項12】
（ｉ）配列番号１または３のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項１１に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項13】
（ｉ）配列番号２または４のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号７または８のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項14】
（ｉ）配列番号２または４のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号７または８のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項１３に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項15】
（ｉ）配列番号２または４のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号７または８のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項１４に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項16】
（ｉ）配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号３１または３２のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項17】
（ｉ）配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号３１または３２のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項18】
（ｉ）配列番号２と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号３１または３２のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項１７に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項19】
（ｉ）配列番号４３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号４１または４２のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項20】
（ｉ）配列番号４３と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号４１または４２のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項１６に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項21】
（ｉ）配列番号４３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号４１または４２のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
を含む、請求項１７に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項22】
前記改変ヒトＩＦＮα２が、配列番号９または１０と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１～２１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項23】
前記改変ヒトＩＦＮα２が、配列番号９または１０と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項24】
前記改変ヒトＩＦＮα２が、配列番号９または１０と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項25】
前記改変ヒトＩＦＮα２が、配列番号９または１０のアミノ酸配列に対し１～３個の変異を有する、請求項１～２４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項26】
前記改変ヒトＩＦＮα２が、配列番号９または１０を基準にしてＲ１４９Ａ変異または配列番号９または１０を基準にしてＲ３３Ａ、Ｒ１４４Ａ、Ｒ１４４Ｉ、Ｒ１４４Ｌ、Ｒ１４４Ｓ、Ｒ１４４Ｔ、Ｒ１４４Ｙ、Ａ１４５Ｄ、Ａ１４５Ｇ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｙ、Ｍ１４８ＡおよびＬ１５３Ａ変異の１つの変異、任意選択でＡ１４５Ｇを含む、請求項２５に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項27】
組換え型の重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項28】
ＶＨＨが、配列番号１１または１２の１つと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項29】
ＶＨＨが、配列番号１１または１２の１つと少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２８に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項30】
ＶＨＨが、配列番号１１または１２の１つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項31】
前記ＶＨＨが、配列番号１１および１２のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、請求項３０に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項32】
前記改変Ｆｃドメインが、１個または複数の次の変異：配列番号１３～１６のいずれか１つに対するＰ３２９Ｇ、Ｋ３２２Ｑ、Ｋ３２２Ａ、またはＰ３３１Ｓ、を含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項33】
前記改変Ｆｃドメインが、１個または複数の次の変異：ヒトＩｇＧ１ Ｆｃに対するＰ３２９Ｇ、Ｋ３２２Ｑ、Ｋ３２２Ａ、またはＰ３３１Ｓ、を含む、請求項３２に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項34】
前記改変Ｆｃドメインが、配列番号１３～１６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、請求項３２または３３に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項35】
前記改変Ｆｃドメインが、配列番号１３～１６と少なくとも９３％同一のアミノ酸配列を有する、請求項３２または３３に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項36】
前記改変Ｆｃドメインが、配列番号１３～１６と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、請求項３２または３３に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項37】
癌を治療するまたは予防するための方法であって、それを必要としている患者に請求項１～３６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項38】
前記癌が、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳および中枢神経系癌；乳癌；腹膜の癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸および直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部の癌；胃癌（胃腸癌を含む）；神経膠芽腫；肝癌；ヘパトーマ；上皮内腫瘍；腎臓癌または腎性癌（ｋｉｄｎｅｙ ｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽腫；口腔癌（唇、舌状、舌、口内、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系癌；唾液腺癌腫；肉腫（例えば、カポジ肉腫）；皮膚癌；扁平上皮細胞癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫；ならびにＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他の癌腫および肉腫；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）；ならびに母斑症に関連する異常血管増殖；浮腫（例えば脳腫瘍に関連するもの）；およびメグズ症候群の１種または複数から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
請求項１～３６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項40】
癌を治療するまたは予防するための方法であって、それを必要としている患者に請求項３９に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項41】
前記癌が、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳および中枢神経系癌；乳癌；腹膜の癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸および直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部の癌；胃癌（胃腸癌を含む）；神経膠芽腫；肝癌；ヘパトーマ；上皮内腫瘍；腎臓癌または腎性癌（ｋｉｄｎｅｙ ｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽腫；口腔癌（唇、舌状、舌、口内、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系癌；唾液腺癌腫；肉腫（例えば、カポジ肉腫）；皮膚癌；扁平上皮細胞癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫；ならびにＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他の癌腫および肉腫；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）；ならびに母斑症に関連する異常血管増殖；浮腫（例えば脳腫瘍に関連するもの）；およびメグズ症候群の１種または複数から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
請求項１～３６のいずれか１項に記載の１個または複数のキメラタンパク質複合体、またはその成分をコードする組換え核酸組成物。
【請求項43】
請求項４２に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項44】
前記キメラタンパク質複合体が、図１または図７で記載の配向および／または配置を有する、請求項１～３６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質複合体。
【請求項45】
多価のまたは二価のキメラタンパク質複合体であって、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド；
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド；
配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド；
配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド；
配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド；または
配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド、
を含む、多価のまたは二価のキメラタンパク質複合体。
【請求項46】
癌を治療するまたは予防するための方法であって、それを必要としている患者に請求項４５に記載の多価のまたは二価のキメラタンパク質複合体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項47】
配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％、または１００％同一である配列を有する少なくとも２個のポリペプチドを含むキメラタンパク質複合体。
【請求項48】
癌を治療するまたは予防するための方法であって、それを必要としている患者に請求項４７に記載のキメラタンパク質複合体の有効量を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月２６日に出願された米国特許仮出願第６２／９０６，４４２号、および２０１９年３月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／８２５，５８４号の利益および優先権を主張する。これら両仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年９月２６日に出願された米国特許仮出願第６２／９０６，４４２号、および２０１９年３月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／８２５，５８４号の利益および優先権を主張する。これら両仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本発明は、一部は、断片結晶化可能ドメイン（Ｆｃ）、ターゲティング部分としてＣｌｅｃ９Ａ ＶＨＨ、およびシグナル伝達物質として改変インターフェロンα２（ＩＦＮα２）を含むキメラタンパク質複合体に関する。
これらのキメラタンパク質複合体の治療薬としての使用も開示される。
本発明は、一部は、断片結晶化可能ドメイン（Ｆｃ）、ターゲティング部分としてＣｌｅｃ９Ａ ＶＨＨ、およびシグナル伝達物質として改変インターフェロンα２（ＩＦＮα２）を含むキメラタンパク質複合体に関する。
これらのキメラタンパク質複合体の治療薬としての使用も開示される。
【0003】
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを経由してＡＳＣＩＩフォーマットで申請された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年３月２６日に作成された記ＡＳＣＩＩコピーは、ＯＲＮ－０６３ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、１３９，２６４バイトのサイズである。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを経由してＡＳＣＩＩフォーマットで申請された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年３月２６日に作成された記ＡＳＣＩＩコピーは、ＯＲＮ－０６３ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、１３９，２６４バイトのサイズである。
【背景技術】
【0004】
エフェクター機能を有する生物製剤は、多くの潜在的治療用途を有する生物製剤の一群である。いくつかの事例では、これらの生物製剤、例えば、サイトカインは、ヒトに投与されると全身毒性を呈する可能性のあるエフェクター機能をコードする。従って、ヒトにおけるこれらの生物製剤の耐容性および治療指数を最大化することは、ヒトまたは対象における全身毒性を低減するために重要である。
【0005】
多くの場合、これらの生物製剤は、これらが効果的であるために対象内のそれらの標的に高精度および制御された方式で送達される必要がある。従って、高い固有の安全性プロファイルを有する、対象内の標的に高精度で到達する能力を有する、および制御された方式で作用できる生体分子を設計することが必要である。
【0006】
このような生物製剤の１例は、ターゲティング要素（高精度でその標的を探索する能力を有する）に連結されたシグナル伝達物質（エフェクター機能を有する、例えば、サイトカイン）を有するキメラタンパク質である。これらの生物製剤では、シグナル伝達物質は野生型シグナル伝達物質または改変されたシグナル伝達物質（例えば、変異により）であり得る。改変されたシグナル伝達物質は通常、シグナル伝達物質のエフェクター機能がその標的（例えば、標的細胞上の抗原）へのターゲティング要素の結合時に回復され得る方式で、シグナル伝達物質の活性を減弱化させる（例えば、その受容体と相互作用／結合する能力を実質的に低減する）ように改変される。
【0007】
しかし、このようなキメラタンパク質は、特定の条件、例えば、大規模生産される能力、治療上有益な効果を誘発するために薬物を暴露する十分な時間を確保するインビボ半減期、急速な排出または限定された組織浸透性および限られた体内分布を回避するための適切なサイズ、ならびに機能の大きな低下のない適切な溶解度、安定性および貯蔵を保証する他の性質、が満たされる場合のみに、治療的使用に適用できる。重要なのは、全ての、または実質的にほとんどの上記性質が、エフェクター機能の条件付きターゲティングおよび改変シグナル伝達物質のその受容体との条件付き結合の維持の低下なしに、達成されなくてはならないことである。多くの場合、単一の連続ポリペプチド鎖をコードするまたはそれにより表されるキメラタンパク質を用いて全てのこれらの目的を達成するのは困難である。その生物製剤の耐容性および治療指数を維持するのと同時に、このような望ましい特性の生物製剤を得ることができるという必要性が当該技術分野で存在する。
【発明の概要】
【0008】
本発明の技術は、そのエフェクター機能を選択標的へと高精度に、限られた交差反応性および限られた全身性有害事象で送達でき、同時に、例えば、所望のインビボ暴露時間（例えば、半減期）、サイズ（例えば、体内分布およびクリアランス特性のための）、ならびに商業生産のための大量生産および／または精製特性（例えば、適切な溶解度、安定性および貯蔵特性）を有する治療薬の製造を可能にする医薬品特性を付与する特徴ももたらす生物学的治療薬を含むキメラタンパク質複合体を提供する。
【0009】
一態様では、本発明は、ヘテロダイマータンパク質複合体およびその個々のポリペプチド鎖サブユニット（構成要素）に関し、タンパク質複合体は、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９Ａ）、改変ヒトＩＦＮα２、および改変Ｆｃドメインに特異的に結合するターゲティング部分を含む。
【0010】
ある態様では、本発明は、（ｉ）Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９Ａ）に特異的に結合するターゲティング部分、（ｉｉ）改変ヒトＩＦＮα２、および（ｉｉｉ）改変Ｆｃドメイン、を含むキメラタンパク質複合体に関する。
【0011】
一態様では、本発明は、キメラタンパク質複合体が、Ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９Ａ）、改変ヒトＩＦＮα２、および改変Ｆｃドメインに特異的に結合するターゲティング部分を含む、キメラタンパク質複合体に関する。
【0012】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号１～４および４３のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性、または配列番号１～４および４３のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性、または配列番号１～４および４３のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。 いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、任意選択で０、または１、または２、または３、または４、または５個の変異を有する、配列番号１～４および４３のいずれか１つのポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号１～４および４３のいずれか１つのポリペプチドを含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号１～４および４３のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性、または配列番号１～４および４３のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有する連続アミノ酸を組み込むポリペプチドを含む。
【0014】
別の態様では、本発明は、癌を治療または予防するための方法に関し、方法は、それを必要としている患者に本明細書で開示のキメラタンパク質複合体の有効量を投与することを含む。本発明の別の態様は、本明細書で開示のキメラタンパク質複合体、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。別の態様では、本発明は、癌を治療または予防するための方法に関し、方法は、それを必要としている患者に本明細書で開示の医薬組成物の有効量を投与することを含む。別の態様では、本発明は、本明細書で開示のキメラタンパク質複合体の１個または複数のポリペプチドをコードする組換え核酸組成物に関する。別の態様では、本発明は、本明細書で開示の１個または複数のキメラタンパク質複合体をコードする核酸組成物を含む宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】本発明のキメラタンパク質複合体の種々の非限定的概略図の例を示す。いくつかの実施形態では、それぞれの概略図は、本発明の組成物である。ここで、「ＩＦＮ」は、本明細書に記載のＩＦＮα２を指し、「ＶＨＨ」は、本明細書に記載の抗Ｃｌｅｃ９Ａ ＶＨＨを指し、
【化1】
【図2】マウスへの静脈内投与後のＦｃ－ＡＦＮの血漿中濃度を示す。時点毎の３つの個別試料の平均値（＋ＳＥＭ）がプロットされている。
【図3】マウスでの静脈内投与後のＣＬＥＣ９Ａ ＡＦＮ（Ｆｃを欠く構築物）の血漿中濃度を示す。時点毎の３つの個別試料の平均値（＋ＳＥＭ）がプロットされている。
【図4A-D】対照細胞（ＨＬ１１６およびＨＥＫ２９３Ｔ）と比較した、ＣＬＥＣ９Ａ－ＡＦＮ Ｆｃ構築物のヒトＣＬＥＣ９Ａを発現する細胞（ＨＬ１１６－ｈＣｌｅｃ９Ａ）への特異的結合を示す。
【図5】緩衝液または４種の異なるＣＬＥＣ９Ａ－ＡＦＮ Ｆｃ構築物で治療後のヒト化マウスにおける腫瘍増殖曲線を示す。時点毎の５匹の動物の平均値（＋ＳＥＭ）（ｍｍ３単位）がプロットされている。
【図6】緩衝液または漸増用量の単一ＣＬＥＣ９Ａ－ＡＦＮ Ｆｃ構築物で治療後のヒト化マウスにおける腫瘍増殖曲線を示す。時点毎の５匹の動物の平均値（＋ＳＥＭ）（ｍｍ３単位）がプロットされている。
【図7】本発明により包含される種々の二価配向および／または配置を示す。二価性を達成するための第２のＶＨＨ部分は、網掛され、付着されたリンカーと一緒に図に記載の配列番号のＮまたはＣ末端の延長を形成する。配列番号が示されているが、これらは例示目的のみのためのものであり、例えば、本明細書に記載のＲ１４９Ａ以外の別の変異が使用される場合には、それらは、変化する。さらに、ＶＨＨは同一であってもよい。明確にするために、図１の説明を参照されたい。
【図8A】Ｃｌｅｃ９Ａ－／ＣＤ１４１－およびＣｌｅｃ９Ａ＋／ＣＤ１４１＋ＰＢＭＣにおけるＩＦＮα２によるｐＳＴＡＴ１リン酸化の結果を示す。
【図8B】Ｃｌｅｃ９Ａ－／ＣＤ１４１－およびＣｌｅｃ９Ａ＋／ＣＤ１４１＋ＰＢＭＣにおけるＡ１４５ＧまたはＭ１４８Ａ変異を有するＡＦＮによるｐＳＴＡＴ１リン酸化の結果を示す。
【図9】緩衝液または２種の異なるＣＬＥＣ９Ａ－ＡＦＮ Ｆｃ構築物の７．５ブタ用量で治療後のヒト化マウスにおける腫瘍増殖曲線を示す。時点毎の６匹の動物の腫瘍サイズ（ｍｍ３単位）の平均値（＋ＳＥＭ）がプロットされた。
【図10A-C】ＩＦＮα２中にＴ１０６ Ｏ－グリコシル化のある（図１０Ａ）およびない（図１０Ｂ）Ｃｌｅｃ９Ａ標的化ＡＦＮ、および非標的化バリアント（図１０Ｃ）で治療後のＣＬＥＣ９Ａ－／ＣＤ１４１－およびＣｌｅｃ９Ａ＋／ＣＤ１４１＋ＰＢＭＣにおけるｐＳＴＡＴ１活性を示す。
【図11】ＩＦＮα２のＡ１４５Ｇ変異を有するＣｌｅｃ９Ａ標的化ＡＦＮ Ｆｃの抗腫瘍活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
一態様では、本発明は、キメラタンパク質複合体がＣ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９Ａ）、改変ヒトＩＦＮα２、および改変Ｆｃドメインに特異的に結合するターゲティング部分を含む、キメラタンパク質複合体に関する。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号１～４および４３のいずれか１つと少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号１～４および４３のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性、または配列番号１～４および４３のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号１～４および４３のポリペプチドを含み、配列は選択配列に比べて１０個未満の変異を有する。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号１～４および４３のポリペプチドを含み、配列は選択配列に比べて５個未満の変異を有する。
【0017】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ｃｌｅｃ９Ａに対する単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）（すなわち、Ｒ１ＣＨＣＬ５０（ｏｐｔ４））、リンカー（すなわち、５＊ＧＧＳ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有するＦｃ ｈｏｌｅ Ｒｉｄｇｗａｙ配列（すなわち、Ｆｃ ｈｏｌｅ Ｒｉｄｇｗａｙ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６；９：６１７－６２１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。この配列番号１の配列の構築物は、次のように表される：バリエーション１ ＶＨＨ－Ｆｃ Ｒ１ＣＨＣＬ５０（ｏｐｔ４）－５＊ＧＧＳ－Ｆｃ ｈｏｌｅ Ｒｉｄｇｗａｙ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）。
【0018】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ｃｌｅｃ９Ａに対する単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）（すなわち、Ｒ１ＣＨＣＬ５０（ｏｐｔ４））、リンカー（すなわち、５＊ＧＧＳ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有するＦｃ ｈｏｌｅ Ｍｅｒｃｈａｎｔ配列（すなわち、Ｆｃ ｈｏｌｅ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６：６７７－６８１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。この配列番号２の構築物は、次のように表される：ＶＨＨ－Ｆｃ：Ｒ１ＣＨＣＬ５０（ｏｐｔ４）－５＊ＧＧＳ－Ｆｃ ｈｏｌｅ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）。
【0019】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ｃｌｅｃ９Ａに対する単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）（すなわち、３ＬＥＣ８９（ｏｐｔ４））、リンカー（すなわち、５＊ＧＧＳ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有するＦｃ ｈｏｌｅ Ｒｉｄｇｗａｙ配列（すなわち、Ｆｃ ｈｏｌｅ Ｒｉｄｇｗａｙ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６；９：６１７－６２１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。この配列番号３の構築物は、次のように表される： ＶＨＨ－Ｆｃ：３ＬＥＣ８９（ｏｐｔ４）－５＊ＧＧＳ－Ｆｃ ｈｏｌｅ Ｒｉｄｇｗａｙ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）。
【0020】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ｃｌｅｃ９Ａに対する単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）（すなわち、３ＬＥＣ８９（ｏｐｔ４））、リンカー（すなわち、５＊ＧＧＳ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有するＦｃ ｈｏｌｅ Ｍｅｒｃｈａｎｔ配列（すなわち、Ｆｃ ｈｏｌｅ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６：６７７－６８１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。この配列番号４の構築物は、次のように表される：ＶＨＨ－Ｆｃ：３ＬＥＣ８９（ｏｐｔ４）－５＊ＧＧＳ－Ｆｃ ｈｏｌｅ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）。
【0021】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号４３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ｃｌｅｃ９Ａに対する単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）（すなわち、Ｒ１ＣＨＣＬ５０（ｏｐｔ４））、リンカー（すなわち、５＊ＧＧＳ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有し、Ｃ末端リシンを有しないＦｃ ｈｏｌｅ Ｍｅｒｃｈａｎｔ配列（すなわち、Ｆｃ ｈｏｌｅ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６：６７７－６８１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。
【0022】
本発明のキメラタンパク質複合体は、配列番号５～８、２９～３６、または４１～４２のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号５～８、２９～３６、または４１～４２のいずれか１つと少なくとも９８％、または配列番号５～８、２９～３６、または４１～４２のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドを含む。 いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号５～８、２９～３６、または４１～４２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、配列は、選択配列に比べて、１０個未満の変異を有する。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号５～８、２９～３６、または４１～４２から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、配列は、選択配列に比べて、５個未満の変異を有する。
【0023】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ｒ１４９Ａ変異を有する改変ヒトインターフェロンα２ｂ（すなわち、ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａ）、リンカー（すなわち、１０＊ＧＧＳ－Ｇ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有するＦｃ ｋｎｏｂ Ｒｉｄｇｗａｙ配列（すなわち、Ｆｃ ｋｎｏｂ Ｒｉｄｇｗａｙ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６；９：６１７－６２１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。この配列番号５の配列の構築物は、次のように表される：バリエーション１ Ｆｃ－ＡＦＮ：Ｆｃ ｋｎｏｂ Ｒｉｄｇｗａｙ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）－１０＊ＧＧＳ－Ｇ－ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａ。
【0024】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ｒ１４９ＡおよびＴ１０６Ｅ変異を有する改変ヒトインターフェロンα２ｂ（すなわち、ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａ＿Ｔ１０６Ｅ）、リンカー（すなわち、１０＊ＧＧＳ－Ｇ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有するＦｃ ｋｎｏｂ Ｒｉｄｇｗａｙ配列（すなわち、Ｆｃ ｋｎｏｂ Ｒｉｄｇｗａｙ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６；９：６１７－６２１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。この配列番号６の配列の構築物は、次のように表される：バリエーション２ Ｆｃ－ＡＦＮ：Ｆｃ ｋｎｏｂ Ｒｉｄｇｗａｙ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）－１０＊ＧＧＳ－Ｇ－ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａ＿Ｔ１０６Ｅ。
【0025】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ｒ１４９Ａ変異を有する改変ヒトインターフェロンα２ｂ（すなわち、ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａ）、リンカー（すなわち、１０＊ＧＧＳ－Ｇ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有するＦｃ ｋｎｏｂ Ｍｅｒｃｈａｎｔ配列（すなわち、Ｆｃ ｋｎｏｂ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６：６７７－６８１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。この配列番号７の配列の構築物は、次のように表される：バリエーション３ Ｆｃ－ＡＦＮ：Ｆｃ ｋｎｏｂ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）－１０＊ＧＧＳ－Ｇ－ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａ。
【0026】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ｒ１４９ＡおよびＴ１０６Ｅ変異を有する改変ヒトインターフェロンα２ｂ（すなわち、ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａ＿Ｔ１０６Ｅ）、リンカー（すなわち、１０＊ＧＧＳ－Ｇ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有するＦｃ ｋｎｏｂ Ｍｅｒｃｈａｎｔ配列（すなわち、Ｆｃ ｋｎｏｂ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６：６７７－６８１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。この配列番号８の配列の構築物は、次のように表される：バリエーション４ Ｆｃ－ＡＦＮ：Ｆｃ ｋｎｏｂ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）－１０＊ＧＧＳ－Ｇ－ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａ＿Ｔ１０６Ｅ。
【0027】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号４１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ａ１４５Ｇ変異を有する改変インターフェロンα２ｂ、リンカー（すなわち、１０＊ＧＧＳ－Ｇ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有するＦｃ ｋｎｏｂ Ｍｅｒｃｈａｎｔ配列（すなわち、Ｆｃ ｋｎｏｂ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６：６７７－６８１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。この配列番号４１の配列の構築物は、次のように表される：Ｆｃ４’－ＩＦＮａ２ｂ＿Ａ１４５Ｇ。
【0028】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号４２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。この配列は、Ｔ１０６ＡおよびＡ１４５Ｇ変異を有する改変インターフェロンα２ｂ、リンカー（すなわち、１０＊ＧＧＳ－Ｇ）、およびＬＡＬＡ－ＫＱ変異を有するＦｃ ｋｎｏｂ Ｍｅｒｃｈａｎｔ配列（すなわち、Ｆｃ ｋｎｏｂ Ｍｅｒｃｈａｎｔ（ＬＡＬＡ－ＫＱ）、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６：６７７－６８１参照、この文献は、その全体が参照により組み込まれる）を含む。この配列番号４２の配列の構築物は、次のように表される：Ｆｃ４’－ＩＦＮａ２ａ＿Ｔ１０６Ｅ＿Ａ１４５Ｇ。
【0029】
一実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号１または３のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。別の実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号１または３のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。別の実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号１または３のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。ある実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２または４のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号７または８のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。ある実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２または４のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号７または８のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。別の実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２または４のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号７または８のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号３１または３２のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号３１または３２のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号３１または３２のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号４３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号４１または４２のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号４３と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号４１または４２のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号４３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号４１または４２のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号１または３のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号１または３のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号１または３のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号５または６のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２または４のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号７または８のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２または４のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号７または８のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２または４のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号７または８のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号３１または３２のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号３１または３２のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号２と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号３１または３２のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0040】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号４３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号４１または４２のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号４３と少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号４１または４２のいずれか１つと少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、（ｉ）配列番号４３と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｉｉ）配列番号４１または４２のいずれか１つと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、を含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、本発明は、次記を含む、多価または二価キメラタンパク質複合体に関する：配列番号１７のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド；配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号１９のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド；配列番号１８のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド；配列番号２０のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド；配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号２２のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド；配列番号２１のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチドおよび配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一である配列を有するポリペプチド。いくつかの実施形態では、本発明は、癌を治療または予防するための方法に関し、方法は、それを必要としている患者に本明細書で記載の多価または二価キメラタンパク質複合体の有効量を投与することを含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％、または１００％同一である配列を有する少なくとも２個のポリペプチドを含むキメラタンパク質複合体に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、癌の治療または予防するための方法に関し、方法は、それを必要としている患者に配列番号１～４３のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも９５％、または９７％、または９８％、または９９％、または１００％同一である配列を有する少なくとも２個のポリペプチドを含むキメラタンパク質複合体の有効量を投与することを含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、改変ヒトインターフェロンα２を含む。いくつかの実施形態では、改変ＩＦＮα２物質は、ＩＦＮα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）、すなわち、ＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２鎖に対する低減された親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、改変ＩＦＮα２物質は、ＩＦＮα／β受容体（ＩＦＮＡＲ）、すなわち、ＩＦＮＡＲ１および／またはＩＦＮＡＲ２鎖に対する実質的に低減または除去された親和性および／または活性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示の改変ヒトインターフェロンα２は、配列番号９または１０と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、改変ヒトＩＦＮα２は、配列番号９または１０と少なくとも９８％の同一性または少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、改変ヒトＩＦＮα２は、配列番号９または１０のアミノ酸配列に対し、１～３個の変異を有する。一実施形態では、改変ヒトＩＦＮα２は、配列番号９または１０を基準にして、Ｒ１４９Ａ変異を含む。一実施形態では、改変ヒトＩＦＮα２は、配列番号９または１０を基準にして、Ａ１４５Ｇ変異を含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示のキメラタンパク質複合体のターゲティング部分は、組換え型の重鎖のみの抗体（ＶＨＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＨは、配列番号１１または１２の１つと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号１１または１２の１つと少なくとも９８％同一または配列番号１１または１２の１つと少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＨＨは、配列番号１１および１２のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。
【0047】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示のキメラタンパク質複合体は、２個のターゲティング部分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示のキメラタンパク質複合体は、２個の同一のターゲティング部分を含む。いくつかの実施形態では、これらの二価モードは、図７に示すように、向きが定められる。
【0048】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示のキメラタンパク質複合体は、２個のターゲティング部分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示のキメラタンパク質複合体は、２個の同一でないターゲティング部分を含む。いくつかの実施形態では、これらの二価モードは、図７に示すように、向きが定められる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で開示のキメラタンパク質複合体は、Ｃｌｅｃ９ＡおよびＰＤ－Ｌ１に対するターゲティング部分（限定されないが、ＶＨＨ）を含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、Ｒ１４９Ａ変異が、ＩＦＮα２中に存在する。
【0050】
いくつかの実施形態では、Ｒ１４９Ａ変異は、ＩＦＮα２に存在せず、代わりに、別の変異が存在する。例えば、この代わりの変異は、位置Ｒ３３、Ｒ１４４、Ａ１４５、Ｍ１４８、およびＬ１５３の１つにあり得る。いくつかの実施形態では、代わりの変異は、Ｒ３３Ａ、Ｒ１４４Ａ、Ｒ１４４Ｉ、Ｒ１４４Ｌ、Ｒ１４４Ｓ、Ｒ１４４Ｔ、Ｒ１４４Ｙ、Ａ１４５Ｄ、Ａ１４５Ｇ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｙ、Ｍ１４８Ａ、およびＬ１５３Ａの１つである。明確にするために記すと、いくつかの実施形態では、本明細書でのＲ１４９Ａへの何らかの言及は、Ｒ３３Ａ、Ｒ１４４Ａ、Ｒ１４４Ｉ、Ｒ１４４Ｌ、Ｒ１４４Ｓ、Ｒ１４４Ｔ、Ｒ１４４Ｙ、Ａ１４５Ｄ、Ａ１４５Ｇ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｙ、Ｍ１４８Ａ、およびＬ１５３Ａの１つで置き換え可能である。いくつかの実施形態では、本明細書でのＲ１４９Ａへの何らかの言及は、Ａ１４５Ｇで置き換え可能である。
【0051】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示のキメラタンパク質複合体は、少なくとも１個のＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、改変Ｆｃドメインを含み、改変Ｆｃドメインは、１個または複数の次の変異を含む：配列番号１３～１６のいずれか１つに対する、Ｐ３２９Ｇ、Ｋ３２２Ｑ、Ｋ３２２Ａ、またはＰ３３１Ｓ。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃドメインは、１個または複数の次の変異を含む：ＩｇＧ１ Ｆｃに対する、Ｐ３２９Ｇ、Ｋ３２２Ｑ、Ｋ３２２Ａ、またはＰ３３１Ｓ。
【0052】
いくつかの実施形態では、キメラタンパク質複合体は、配列番号１３～１６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する改変Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃドメインは、配列番号１３～１６と少なくとも９３％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、改変Ｆｃドメインは、配列番号１３～１６と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【0053】
別の態様では、本発明は、癌を治療または予防するための方法に関し、方法は、それを必要としている患者に本明細書で開示のキメラタンパク質複合体の有効量を投与することを含む。方法は、次記の１種または複数から選択される癌の治療または予防に使用できる：基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳および中枢神経系癌；乳癌；腹膜の癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸および直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部の癌；胃癌（胃腸癌を含む）；神経膠芽腫；肝癌；ヘパトーマ；上皮内腫瘍；腎臓癌または腎性癌（ｋｉｄｎｅｙ ｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽腫；口腔癌（唇、舌状、舌、口内、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系癌；唾液腺癌腫；肉腫（例えば、カポジ肉腫）；皮膚癌；扁平上皮細胞癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫；ならびにＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他の癌腫および肉腫；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）；ならびに母斑症に関連する異常血管増殖；浮腫（例えば脳腫瘍に関連するもの）；およびメグズ症候群。
【0054】
本発明の別の態様は、本明細書で開示のキメラタンパク質複合体、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のキメラタンパク質複合体を含む医薬組成物に関する。
【0055】
本発明の別の態様は、癌を治療または予防するための方法に関し、方法は、それを必要としている患者に本明細書で開示の医薬組成物の有効量を投与することを含む。医薬組成物は、次記の１種または複数から選択される癌の治療または予防に使用できる：基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳および中枢神経系癌；乳癌；腹膜の癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸および直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部の癌；胃癌（胃腸癌を含む）；神経膠芽腫；肝癌；ヘパトーマ；上皮内腫瘍；腎臓癌または腎性癌（ｋｉｄｎｅｙ ｏｒ ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽腫；口腔癌（唇、舌状、舌、口内、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系癌；唾液腺癌腫；肉腫（例えば、カポジ肉腫）；皮膚癌；扁平上皮細胞癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫；ならびにＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を含む）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；毛様細胞性白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他の癌腫および肉腫；および移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）；ならびに母斑症に関連する異常血管増殖；浮腫（例えば脳腫瘍に関連するもの）；およびメグズ症候群。
【0056】
別の態様では、本発明は、本明細書で開示の１個または複数のキメラタンパク質複合体をコードする、例えば全キメラタンパク質複合体またはその構成成分ポリペプチドをコードする組換え核酸組成物に関する。別の態様では、本発明は、本明細書で開示の組換え核酸組成物複合体を含む宿主細胞に関する。
【0057】
定義
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つ（１種）または１つ（１種）を超える、を意味し得る。
さらに、参照数値表示に関連して使われる用語の「約」は、参照数値表示±参照数値表示の最大で１０％を意味する。例えば、用語の「約５０」は、４５から５５の範囲を対象とする。
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つ（１種）または１つ（１種）を超える、を意味し得る。
さらに、参照数値表示に関連して使われる用語の「約」は、参照数値表示±参照数値表示の最大で１０％を意味する。例えば、用語の「約５０」は、４５から５５の範囲を対象とする。
【0058】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、目的の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、疾患もしくは障害または疾患または障害と関連する１つまたは複数の兆候または症状の予防または軽減をもたらす量を意味する。治療効果があるまたは予防適用の場合、対象に投与される組成物の量は、疾患の程度、タイプ、および重症度、ならびに総体的な健康、年齢、性別、体重および薬物耐性などの個体の特性に依存するであろう。当業者なら、これらおよび他の因子に基づいて適切な投与量を決定できるであろう。前記組成物はまた１種または複数の追加の治療化合物と組み合わせて投与できる。本明細書に記載される方法において、治療化合物は、疾患または障害の１種または複数の兆候または症状を有する対象に投与され得る。本明細書で使用される場合、物質または刺激の存在下で、このような調節の非存在下に比べて、活性および／または効果の出力値がかなりの量、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、またはそれを超えて、少なくとも最大約１００％（約１００％を含む）低減されるとき、何かが「低減されている」。当業者により理解されるように、いくつかの実施形態では、活性は低下し、かついくつかの下流の出力値は低下するが、他のものは増加し得る。
【0059】
逆に、物質または刺激の存在下で、このような物質または刺激の非存在下に比べて、活性および／または効果の出力値がかなりの量、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、またはそれを超えて、最大少なくとも約１００％（約１００％を含む）またはそれを超えて、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍増加する場合、活性は「高く」なる。
【0060】
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、またはｈａｖｉｎｇなどの用語の同義語としてのオープンエンド用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を本明細書で使用して本発明を記載および請求するが、本発明、またはその実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの代替用語を使って、代わりに記載することができる。
【0061】
治療効果の達成に必要な本明細書で記載の組成物の量は、特定目的のための従来の手順に従って経験的に決定されてよい。一般に、治療目的のために治療薬を投与する場合、治療薬は薬理学的有効量で投与される。「薬理学的有効量」、「薬理学的有効用量」、「治療有効量」、または「有効量」は、特に障害または疾患を治療するために、目的の生理的な効果を生み出すのに十分な量または目的の結果を達成することができる量を意味する。本明細書で使用される場合、有効量には、例えば、障害または疾患の症状の進展を遅らせる、障害または疾患の症状の経過を変える（例えば、疾患の症状の進展を遅らせる）、障害または疾患の１つまたは複数の症状または発症を減らすまたはなくする、および障害または疾患の症状を逆転させるのに十分な量を含めることが可能である。治療効果はまた、改善が実現されるかどうかにかかわらず、根底にある疾患または障害の進行を止めるまたは遅らせることも含む。
【0062】
本明細書で使用される場合、「治療方法」は、本明細書に記載の疾患または障害の治療のための組成物および／または本明細書に記載の疾患または障害の治療のための薬剤の製造での使用および／または複数使用のための組成物に等しく適用可能である。
【0063】
本明細書で使用される場合、Ｆｃドメイン変異は、ＥＵ規則に従って番号が付けられる（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １９６９；６３（１）７８－８５、参照によりその全体が組み込まれる）。本明細書で使用される場合、「ＬＡＬＡ」変異という用語は、Ｌ２３４Ａ変異およびＬ２３５Ａ変異を有する二重変異体Ｆｃドメインを指す。本明細書で使用される場合、「ＫＱ」変異という用語は、Ｋ３２２Ｑ変異を有する二重変異体Ｆｃドメインを指す。
【0064】
ノブインホール変異体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６；９：６１７－６２１に記載のもの、すなわち、Ｙ４０７Ｔ／Ｔ３６６Ｙである。
【0065】
あるいは、ノブインホール変異体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６：６７７－６８１に記載のもの、すなわち、Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖである。
【0066】
特に断りのない限り、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１由来である。
【0067】
配列
他の配列は、本文中のどこかで同定される。
【化2】
【0068】
実施例
いくつかの実施例では、ノブインホール技術の２個のバリアントが使用される：Ｒｉｄｇｗａｙ（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６；９：６１７－６２１に由来する）およびＭｅｒｃｈａｎｔ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６：６７７－６８１に由来する）。
いくつかの実施例では、ノブインホール技術の２個のバリアントが使用される：Ｒｉｄｇｗａｙ（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６；９：６１７－６２１に由来する）およびＭｅｒｃｈａｎｔ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８；１６：６７７－６８１に由来する）。
【0069】
Ｒｉｄｇｗａｙ構築物中の「標準的」エフェクター変異は、ＬＡＬＡ－ＰＧ（Ｐ３２９Ｇ）であり、これは本明細書で言及される。Ｍｅｒｃｈａｎｔ構築物中の「標準的」エフェクター変異は、ＬＡＬＡ－ＫＱ（Ｋ３２２Ｑ）であり、これは本明細書で言及される。
【0070】
用語「ＡｃＴａｆｅｒｏｎ（ＡＦＮ）」、または「ＡｃＴａｋｉｎｅ」は必要に応じ、本明細書で記載のキメラタンパク質に言及するために本明細書で使用される（詳細は、キメラタンパク質のフォーマットに関する実施例で提供される）。
【0071】
実施例１：ＦｃベースＡｃＴａｆｅｒｏｎ
ＣＬＥＣ９Ａ特異的（ＣＬＥＣ９Ａは高度に特異的なｃＤＣ１マーカーである）の半減期を増加させるために、ＡｃＴａｆｅｒｏｎヒトＣＬＥＣ９Ａ－ＶＨＨ＿ｈｕＩＦＮａ２融合タンパク質をＦｃ融合体に変換した。このために、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃを２０＊ＧＧＳリンカーを介してＡｃＴａｆｅｒｏｎ（ＶＨＨ ３ＬＥＣ８９－２０＊ＧＧＳ－ｈｕＩＦＮａ２＿Ｒ１４９）に融合した。第２バージョンでは、ＶＨＨとＩＦＮ部分の間にＦｃドメインを構築した。ヒトＩｇＧ１－Ｆｃのエフェクター機能は、ＬＡＬＡ－Ｐ３２９Ｇ変異を導入することにより低減される。
ＣＬＥＣ９Ａ特異的（ＣＬＥＣ９Ａは高度に特異的なｃＤＣ１マーカーである）の半減期を増加させるために、ＡｃＴａｆｅｒｏｎヒトＣＬＥＣ９Ａ－ＶＨＨ＿ｈｕＩＦＮａ２融合タンパク質をＦｃ融合体に変換した。このために、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃを２０＊ＧＧＳリンカーを介してＡｃＴａｆｅｒｏｎ（ＶＨＨ ３ＬＥＣ８９－２０＊ＧＧＳ－ｈｕＩＦＮａ２＿Ｒ１４９）に融合した。第２バージョンでは、ＶＨＨとＩＦＮ部分の間にＦｃドメインを構築した。ヒトＩｇＧ１－Ｆｃのエフェクター機能は、ＬＡＬＡ－Ｐ３２９Ｇ変異を導入することにより低減される。
【0072】
哺乳動物細胞中での発現のための当該配列は次記の通りである：
【化3】
【0073】
構築物を、製造業者の説明書に従ってＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により作製しＥｘｐｉＣＨＯ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で一過的に発現させた。遺伝子導入後１０日に、上清を集め、細胞を遠心分離により取り出した。組換えタンパク質を、製造業者の説明書に従いｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ｒｅｓｉｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使って培地から精製した。意外にも、タンパク質は、７０～１７０ｍｇ／Ｌで発現されたが、深刻な溶解度の問題を示し、それらは４℃で貯蔵される際に、または単回の凍結－解凍サイクル後に、１ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でも、凝集および沈殿する傾向を示した。ＶＨＨ ３ＬＥＣ８９がヒトＰＤ－Ｌ１に特異的な関連のないＶＨＨ ２ＬＩＧ９９により置き換えられた場合、類似の観察がなされ、ＦｃベースＡｃＴａｋｉｎｅフォーマットは製造性の不都合があることを示す。
【0074】
意外にも、溶解度の問題は、異なるタイプのＦｃ構築物を設計することにより解決された。この新規フォーマットでは、ヘテロダイマーＦｃ複合体が、ノブ・イントゥ・ホール変異Ｙ４０７Ｔ／Ｔ３６６ＹまたはＳ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖのいずれかを用いて、ＶＨＨ－Ｆｃ融合をＦｃ－ＩＦＮ融合と組み合わせることにより生成される。追加のバリアントは、Ｔ１０６Ｅ変異によるｈｕＩＦＮα２中のＯ－グリコシル化部位の任意のノックアウトを含む。合計８個の構築物を、２種の異なるＶＨＨ特異的ヒト化ヒトＣＬＥＣ９Ａをベースにして設計した。ＩｇＧ１－Ｆｃタンパク質のエフェクター機能を低減するために、変異ＬＡＬＡ－Ｋ３２２Ｑを用いた。成熟タンパク質の配列は、配列番号１～８により表される。これは、図１に示すように、ノブおよびホール構築物を組み合わせることにより生成できる合計で８個のＦｃ複合体をもたらす。
【0075】
哺乳動物細胞中での発現のために、配列を、リーダー配列に連結し、構築物を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により作製した。産生は、上述のようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞中で実施した。組換えタンパク質を、Ｈｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で上清から精製し、溶出したタンパク質を、中和後、Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩し、続いて最後の０．２２μｍの濾過を行った。タンパク質は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、４℃で、または繰り返される凍結／解凍サイクルの後に、可溶性のままであることを示した。
【0076】
実施例２：Ｆｃを有するまたは有しないキメラのＰＫ効果
Ｒ１ＣＨＣＬ５０ベースＦｃタンパク質の４種の異なるバリアントを用いたマウスにおけるＰＫ（薬物動態学）試験
合計９匹のマウスに、各構築物の１ｍｇ／ｋｇを静脈内に投与した。Ｋ－ＥＤＴＡ血液を、３匹のマウスの第１群から５分、８時間および６日目に採取し、３匹のマウスの第２群から１５分、１日および１０日目に採取し、３匹のマウスの第３群から２時間、３日および１４日目に採取した。未処理のＣＬＥＣ９Ａ－ＡＦＮ Ｆｃ構築物の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。簡単に説明すると、ＭＡＸＩＳＯＲＰ Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｅプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトインターフェロンアルファｍＡｂ（クローンＭＭＨＡ－１３；ＰＢＬ Ａｓｓａｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて一晩コートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％ツイーン－２０で４回洗浄後、ＰＢＳ中の０．１％カゼインを用いて室温で少なくとも１時間ブロッキングした。その後、希釈試料および標準物質を、０．１％カゼイン含有ＰＢＳ中、室温下で２時間インキュベートした。別の洗浄サイクル後、注文製作のウサギ抗ＶＨＨ（ＰＢＳ中０．１％中で１／２００００に希釈）を室温で２時間インキュベートし、続けて、追加の洗浄サイクルおよびＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ－１１１－０３５－１４４；０．１％カゼイン中１：５０００に希釈）と共に室温で１時間のインキュベーションを行った。最後の洗浄サイクル後、ＫＰＬ基質（５１２０－００４７；ＳｅｒａＣａｒｅ）を用いて製造業者の説明書に従ってペルオキシダーゼ活性を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使って、試料からの濃度を計算した。測定した濃度を図２でプロットし、４種全ての構築物が、最後のサンプリング時点でＲｉｄｇｗａｙベースＦｃ構築物の排出が幾分速いことを除いて、類似のＰＫプロファイルを有することを示す。終末相半減期は、Ｒｉｄｇｗａｙ構築物について平均で約３日およびＭｅｒｃｈａｎｔ構築物について４．５日と推定された。
Ｒ１ＣＨＣＬ５０ベースＦｃタンパク質の４種の異なるバリアントを用いたマウスにおけるＰＫ（薬物動態学）試験
合計９匹のマウスに、各構築物の１ｍｇ／ｋｇを静脈内に投与した。Ｋ－ＥＤＴＡ血液を、３匹のマウスの第１群から５分、８時間および６日目に採取し、３匹のマウスの第２群から１５分、１日および１０日目に採取し、３匹のマウスの第３群から２時間、３日および１４日目に採取した。未処理のＣＬＥＣ９Ａ－ＡＦＮ Ｆｃ構築物の濃度をＥＬＩＳＡで測定した。簡単に説明すると、ＭＡＸＩＳＯＲＰ Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｅプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳ中０．５μｇ／ｍｌの濃度の抗ヒトインターフェロンアルファｍＡｂ（クローンＭＭＨＡ－１３；ＰＢＬ Ａｓｓａｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて一晩コートした。プレートをＰＢＳ＋０．０５％ツイーン－２０で４回洗浄後、ＰＢＳ中の０．１％カゼインを用いて室温で少なくとも１時間ブロッキングした。その後、希釈試料および標準物質を、０．１％カゼイン含有ＰＢＳ中、室温下で２時間インキュベートした。別の洗浄サイクル後、注文製作のウサギ抗ＶＨＨ（ＰＢＳ中０．１％中で１／２００００に希釈）を室温で２時間インキュベートし、続けて、追加の洗浄サイクルおよびＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ－１１１－０３５－１４４；０．１％カゼイン中１：５０００に希釈）と共に室温で１時間のインキュベーションを行った。最後の洗浄サイクル後、ＫＰＬ基質（５１２０－００４７；ＳｅｒａＣａｒｅ）を用いて製造業者の説明書に従ってペルオキシダーゼ活性を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使って、試料からの濃度を計算した。測定した濃度を図２でプロットし、４種全ての構築物が、最後のサンプリング時点でＲｉｄｇｗａｙベースＦｃ構築物の排出が幾分速いことを除いて、類似のＰＫプロファイルを有することを示す。終末相半減期は、Ｒｉｄｇｗａｙ構築物について平均で約３日およびＭｅｒｃｈａｎｔ構築物について４．５日と推定された。
【0077】
Ｆｃ融合なしのＣＬＥＣ９Ａ ＡｃＴａｆｅｒｏｎを用いたマウスにおけるＰＫ試験
別の試験で、マウスにおいてＦｃなしのＡＦＮ（３ＬＥＣ８９－２０＊ＧＧＳ－ｈｕＩＦＮａ２＿Ｒ１４９Ａ－ｈｉｓ６）のＰＫを評価した。このキメラは次記の配列を有する：
Ｐ－６０２配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＳＶＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＮＱＧＡＰＴＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＧＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＡＦＴＲＧＤＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＶＤＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＲＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＡＡＡＭＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＲＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＡＳＦＳＬＳＴＮＬＱＥＳＬＲＳＫＥＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号２５）。
別の試験で、マウスにおいてＦｃなしのＡＦＮ（３ＬＥＣ８９－２０＊ＧＧＳ－ｈｕＩＦＮａ２＿Ｒ１４９Ａ－ｈｉｓ６）のＰＫを評価した。このキメラは次記の配列を有する：
Ｐ－６０２配列
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＳＶＮＡＭＧＷＹＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡＡＩＴＮＱＧＡＰＴＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＧＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＫＡＦＴＲＧＤＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＶＤＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＲＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＡＡＡＭＣＤＬＰＱＴＨＳＬＧＳＲＲＴＬＭＬＬＡＱＭＲＲＩＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱＦＱＫＡＥＴＩＰＶＬＨＥＭＩＱＱＩＦＮＬＦＳＴＫＤＳＳＡＡＷＤＥＴＬＬＤＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬＮＤＬＥＡＣＶＩＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶＲＫＹＦＱＲＩＴＬＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＡＥＩＭＡＳＦＳＬＳＴＮＬＱＥＳＬＲＳＫＥＬＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号２５）。
【0078】
９匹のマウスに、３ｍｇ／ｋｇの静脈内投与を実施した。Ｋ－ＥＤＴＡ血液を、３匹のマウスの第１群から５分、および１時間目に採取し、３匹のマウスの第２群から１５分および３時間目に採取し、最後に、最後の群から８時間目に採取した。血漿試料中の濃度をＦｃ融合タンパク質に対し記載のものと同じＥＬＩＳＡを用いて測定した。測定した濃度（図３）は、このタイプの分子の急速排出を示し、８時間の時点で、検出限界（０．１２μｇ／ｍｌ）未満の濃度をもたらした。推定終末相半減期はわずかに２時間の範囲であり、ＦｃベースＡｃＴａｋｉｎｅの優れた半減期特性を明確に示す。
【0079】
実施例３：構築物の結合およびインビボ効果
相対的結合親和性を測定するために、実施例２で示したものと同じ４分子を、ＨＬ１１６－ｈＣｌｅｃ９Ａ細胞上で段階希釈したＣＬＥＣ９Ａ－ＡＦＮ Ｆｃ構築物とインキュベートした。結合特異性を評価するためにまた、親ＨＬ１１６細胞および親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（両方とも、Ｃｌｅｃ９Ａの検出可能な発現を欠いている）を同一の段階希釈したＣＬＥＣ９Ａ－ＡＦＮ Ｆｃ構築物とインキュベートした。結合を、ＦＩＴＣ標識抗ヒト二次Ａｂとのその後のインキュベーションにより検出し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｘ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で測定し、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃソフトウェア（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて分析した。図４のデータは、ＦｃベースＡＦＮがＨＬ１１６－ｈＣｌｅｃ９Ａ細胞に対し類似の結合ＥＣ５０を有し、一方で結合は、Ｃｌｅｃ９Ａを発現していない細胞株上では検出されなかったことを示す。
相対的結合親和性を測定するために、実施例２で示したものと同じ４分子を、ＨＬ１１６－ｈＣｌｅｃ９Ａ細胞上で段階希釈したＣＬＥＣ９Ａ－ＡＦＮ Ｆｃ構築物とインキュベートした。結合特異性を評価するためにまた、親ＨＬ１１６細胞および親ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（両方とも、Ｃｌｅｃ９Ａの検出可能な発現を欠いている）を同一の段階希釈したＣＬＥＣ９Ａ－ＡＦＮ Ｆｃ構築物とインキュベートした。結合を、ＦＩＴＣ標識抗ヒト二次Ａｂとのその後のインキュベーションにより検出し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ｘ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で測定し、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃソフトウェア（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて分析した。図４のデータは、ＦｃベースＡＦＮがＨＬ１１６－ｈＣｌｅｃ９Ａ細胞に対し類似の結合ＥＣ５０を有し、一方で結合は、Ｃｌｅｃ９Ａを発現していない細胞株上では検出されなかったことを示す。
【0080】
ＦｃベースＡＦＮの有効性を評価するために、分子をヒト化マウスの腫瘍モデルで試験した。簡単に説明すると、新生児ＮＳＧマウス（１～２日齢）を、１００ｃＧｙで亜致死量照射を行い、その後、１ｘ１０５個のＣＤ３４＋ヒト幹細胞（ＨＬＡ－Ａ２陽性臍帯血由来）を肝内に送達した。１３週後、幹細胞移入マウスに２５ｘ１０５個のヒトＲＬ濾胞性リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２６１；ＩＦＮの直接抗増殖作用に感受性がない）を皮下に接種した。マウスを、腫瘍接種後１０日目～１９日目に、３０μｇのヒトＦｌｔ３Ｌタンパク質で毎日腹腔内治療した。緩衝液またはＦｃ－ＡＦＮ（８または７５μｇ）を用いた毎週の静脈内注射を、触知できる腫瘍が認められた、腫瘍接種後の１１日目に開始した（群当たりｎ＝５匹のマウス）。腫瘍サイズ（ノギス測定値）、体重および体温を、毎日評価した。図５および図６のデータは、第２の治療後６日までの腫瘍増殖を示す。図５は、全ての構築物が、８μｇの低い投与量で、類似のレベルの腫瘍増殖抑制を誘導したことを示す。図６は、増大する腫瘍増殖抑制をもたらすＭｅｒｃｈａｎｔ構築物についてのより高い投与量の結果を示す。体重および体温のデータは、緩衝液治療およびＡＦＮ治療間で何らかの大きな差異を示さず、全てのＡＦＮ治療が耐容性良好であったことを裏付けた。
【0081】
実施例４：二価および二重特異的バリアント
分子の標的化能力をさらに高めるために、追加のＶＨＨ部分を加え、その配置の非限定例が図７に示される、構築物を得る。これらの新規構築物は、二価モードでＣＬＥＣ９Ａを標的とするか、または例えばＣＬＥＣ９ＡおよびＰＤ－Ｌ１の両方を共標的とする。一例として、以下の構築物は、ＣＬＥＣ９Ａに対するＲ１ＣＨＣＬ５０（ｏｐｔ４）ＶＨＨおよび／またはＰＤ－Ｌ１およびｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａに対する２ＬＩＧ９９ ＶＨＨに基づく。Ｒ１ＣＨＣＬ５０（ｏｐｔ４）を３ＬＥＣ８９（ｏｐｔ４）で置換することにより、類似のシリーズが生成できる。あるいは、ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａを、ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａ＿Ｔ１０６Ｅで置換できる。最終的に、以下の例は、Ｆｃ部分をＲｉｄｇｗａｙベースノブ・イントゥ・ホール変異と交換することが可能であるＭｅｒｃｈａｎｔベースノブ・イントゥ・ホール変異を含むＦｃ部分に基づく。
新規構築物
分子の標的化能力をさらに高めるために、追加のＶＨＨ部分を加え、その配置の非限定例が図７に示される、構築物を得る。これらの新規構築物は、二価モードでＣＬＥＣ９Ａを標的とするか、または例えばＣＬＥＣ９ＡおよびＰＤ－Ｌ１の両方を共標的とする。一例として、以下の構築物は、ＣＬＥＣ９Ａに対するＲ１ＣＨＣＬ５０（ｏｐｔ４）ＶＨＨおよび／またはＰＤ－Ｌ１およびｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａに対する２ＬＩＧ９９ ＶＨＨに基づく。Ｒ１ＣＨＣＬ５０（ｏｐｔ４）を３ＬＥＣ８９（ｏｐｔ４）で置換することにより、類似のシリーズが生成できる。あるいは、ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａを、ｈｕＩＦＮａ２Ｂ＿Ｒ１４９Ａ＿Ｔ１０６Ｅで置換できる。最終的に、以下の例は、Ｆｃ部分をＲｉｄｇｗａｙベースノブ・イントゥ・ホール変異と交換することが可能であるＭｅｒｃｈａｎｔベースノブ・イントゥ・ホール変異を含むＦｃ部分に基づく。
新規構築物
【化4】
【0082】
哺乳動物細胞中での発現のために、配列を、リーダー配列に連結し、発現構築物を、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により作製した。産生を、上述のようにＥｘｐｉＣＨＯ細胞で実施した。組換えタンパク質を、Ｈｉｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で上清から精製し、溶出タンパク質を、中和後、Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩し、続いて最後の０．２２μｍの濾過を行う。より具体的には、次の発現構築物を組み合わせてＦｃベースＡｃＴａｆｅｒｏｎを生成する。
・配列番号１７を含む構築物＋配列番号７を含む構築物
・配列番号２を含む構築物＋配列番号１９を含む構築物
・配列番号１８を含む構築物＋配列番号７を含む構築物
・配列番号２０を含む構築物＋配列番号７を含む構築物
・配列番号２を含む構築物＋配列番号２２を含む構築物
・配列番号２１を含む構築物＋配列番号７を含む構築物
・配列番号１７を含む構築物＋配列番号７を含む構築物
・配列番号２を含む構築物＋配列番号１９を含む構築物
・配列番号１８を含む構築物＋配列番号７を含む構築物
・配列番号２０を含む構築物＋配列番号７を含む構築物
・配列番号２を含む構築物＋配列番号２２を含む構築物
・配列番号２１を含む構築物＋配列番号７を含む構築物
【0083】
実施例５：Ａ１４５ＧおよびＭ１４８Ａ ＡＦＮ変異
この実施例では、ＡＦＮ変異としてのＩＦＮバリエーションＡ１４５ＧおよびＭ１４８Ａの可能性（すなわち、生物活性の低下を生じるウォーヘッド（ｗａｒｈｅａｄ）変異、これはウォーヘッドの標的化時に回復させ得る）を、評価した。
この実施例では、ＡＦＮ変異としてのＩＦＮバリエーションＡ１４５ＧおよびＭ１４８Ａの可能性（すなわち、生物活性の低下を生じるウォーヘッド（ｗａｒｈｅａｄ）変異、これはウォーヘッドの標的化時に回復させ得る）を、評価した。
【0084】
変異を、ヘテロダイマーの「ノブインホール」Ｆｃ ＡＦＮ状況で評価した。ここで、Ｃｌｅｃ９Ａ ＶＨＨ Ｒ１ＣＨＣＬ５０配列は、フレキシブル２０＊ＧＧＳリンカーを介して、およびｐｃＤＮＡ３．４発現ベクター中で、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｋ３２２Ｑエフェクター変異および「ホール」改変Ｙ３４９Ｃ＿Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列に融合された（下記の配列Ｒ１ＣＨＣＬ５０－Ｆｃ３参照）。ｐｃＤＮＡ３．４ベクター中にまたクローン化される、第２のＡＦＮパートナーは、Ｌ２３４Ａ＿Ｌ２３５Ａ＿Ｋ３２２Ｑエフェクター変異および「ノブ」改変Ｓ３５４Ｃ＿Ｔ３６６Ｗを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列と、ＡＦＮ変異Ａ１４５ＧまたはＭ１４８ＡおよびＯ－グリコシル化変異Ｔ１０６Ｅを有するｈＩＦＮα２との間の融合から構成される（下記配列参照）。
【0085】
ヘテロダイマー「ノブインホール」ＡＦＮを産生するために、「ホール」および「ノブ」の両方のプラスミドの組み合わせを、製造業者の説明書に従いＥｘｐｉＣＨＯ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中に遺伝子導入した。遺伝子導入後７日に、組換えタンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａスピンプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて精製し、定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて純度試験した。
【0086】
得られたＡ１４５ＧおよびＭ１４８ ＡＦＮを、初代ｃＤＣ１細胞（Ｃｌｅｃ９Ａ発現、ＡＦＮの標的）中でＳＴＡＴ１リン酸化について試験し、他のＰＢＭＣ集団と比較した。簡単に説明すると、健康なドナーのバフィーコート由来のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた密度勾配遠心分離により単離した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ、ＰＢＳ中１ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄し、抗Ｃｌｅｃ９Ａおよび抗ＣＤ１４１ Ａｂ（両方Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で染色して、４℃で２０分間ｃＤＣ１集団を特定した。２回の洗浄後、細胞を、段階希釈の野生型ＩＦＮα２または両ＡＦＮを用いて、３７℃で１５分間刺激した。固定（１０分間、３７℃、Ｆｉｘ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、透過処理（３０分、氷上、Ｐｅｒｍ ＩＩＩ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および洗浄後に、細胞を、抗ＳＴＡＴ１ ｐＹ７０１ Ａｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。試料を、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ｘ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で取得し、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃ（商標）ソフトウェア（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて分析した。図８Ａ～Ｂのデータは、（ｉ）Ｃｌｅｃ９Ａ－／ＣＤ１４１－およびＣｌｅｃ９Ａ＋／ＣＤ１４１＋細胞は、野生型ＩＦＮα２野生型ＩＦＮα２に対し同等に感受性であること、および（ｉｉ）Ａ１４５ＧおよびＭ１４８Ａの両方の変異は、非ｃＤＣ１ ＰＢＭＣ（Ｃｌｅｃ９Ａ－／ＣＤ１４１－）中でほとんどのシグナル伝達を消滅させるが、Ｃｌｅｃ９Ａ陽性細胞（Ｃｌｅｃ９Ａ＋／ＣＤ１４１＋）への標的化は、このシグナル伝達を大幅に回復させること、を示す。これは、Ａ１４５ＧまたはＭ１４８Ａ変異の両方に対し少なくとも１００倍のＡＦＮ効果をもたらし、ＡＦＮの設計に対するこれらの変異の潜在能力を示す。
【0087】
配列：
【化5】
【0088】
実施例６：インビボでのＡ１４５ＧおよびＭ１４８Ａ ＡＦＮ変異
ＦｃベースＡＦＮの有効性を評価するために、分子を、ヒト化マウスの腫瘍モデルで試験した。簡単に説明すると、新生児ＮＳＧマウス（１～２日齢）を、１００ｃＧｙで亜致死量照射し、その後、１ｘ１０５個のＣＤ３４＋ヒト幹細胞（ＨＬＡ－Ａ２陽性臍帯血由来）を肝内に送達した。幹細胞移入後１３週に、マウスに、２５ｘ１０５個のヒトＲＬ濾胞性リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２６１；ＩＦＮの直接抗増殖作用に感受性でない）を皮下接種した。マウスを、腫瘍接種後９日目～２２日目に、３０μｇのヒトＦｌｔ３Ｌタンパク質で腹腔内治療した。緩衝液または例５で記載のＦｃ－ＡＦＮ（７．５μｇ）構築物での毎週の静脈内注射を、触知できる腫瘍が認められた、腫瘍接種後の９日目に開始した（群当たりｎ＝６匹のマウス）。腫瘍サイズ（ノギス測定値）、体重および体温を、毎日評価した。図９のデータは、第３の治療後１週間までの腫瘍増殖を示し、両方の構築物が強力なレベルの腫瘍増殖抑制を誘導したことを実証する。体重および体温のデータは、緩衝液治療およびＡＦＮ治療間で何らかの大きな差異を示さず、全てのＡＦＮ治療が耐容性良好であったことを裏付けた。
ＦｃベースＡＦＮの有効性を評価するために、分子を、ヒト化マウスの腫瘍モデルで試験した。簡単に説明すると、新生児ＮＳＧマウス（１～２日齢）を、１００ｃＧｙで亜致死量照射し、その後、１ｘ１０５個のＣＤ３４＋ヒト幹細胞（ＨＬＡ－Ａ２陽性臍帯血由来）を肝内に送達した。幹細胞移入後１３週に、マウスに、２５ｘ１０５個のヒトＲＬ濾胞性リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２６１；ＩＦＮの直接抗増殖作用に感受性でない）を皮下接種した。マウスを、腫瘍接種後９日目～２２日目に、３０μｇのヒトＦｌｔ３Ｌタンパク質で腹腔内治療した。緩衝液または例５で記載のＦｃ－ＡＦＮ（７．５μｇ）構築物での毎週の静脈内注射を、触知できる腫瘍が認められた、腫瘍接種後の９日目に開始した（群当たりｎ＝６匹のマウス）。腫瘍サイズ（ノギス測定値）、体重および体温を、毎日評価した。図９のデータは、第３の治療後１週間までの腫瘍増殖を示し、両方の構築物が強力なレベルの腫瘍増殖抑制を誘導したことを実証する。体重および体温のデータは、緩衝液治療およびＡＦＮ治療間で何らかの大きな差異を示さず、全てのＡＦＮ治療が耐容性良好であったことを裏付けた。
【0089】
実施例７：Ａ１４５ＧおよびＭ１４８Ａ変異をベースにした追加のＦｃ－ＡＦＮ構築物
減弱化されたヒトインターフェロンアルファ２を有する、次の追加のＦｃ構築物を生成した：
減弱化されたヒトインターフェロンアルファ２を有する、次の追加のＦｃ構築物を生成した：
【化6】
【0090】
ヒトＣＬＥＣ９Ａ標的化ＡＦＮを生成するために、上記構築物Ａ～Ｄのいずれかを、配列番号２または４のＣＬＥＣ９Ａ ＶＨＨ－Ｆｃ融合体と組み合わせて、８個の新規構築物を得た。加えて、上記構築物Ｅ～Ｈのいずれかを、配列番号１または３のＣＬＥＣ９Ａ ＶＨＨ－Ｆｃ融合体と組み合わせて、追加のセットの８個の新規構築物を得た。タンパク質を、実施例５で記載のように発現させ精製した。
【0091】
実施例８：Ｔ１０６上にＯ－グリコシル化有するまたは有しないＡ１４５Ｇ変異
この実験では、ＩＦＮα２中にＴ１０６ Ｏ－グリコシル化を有するまたは有しないＣｌｅｃ９Ａ標的化ＡＦＮ（Ｒ１ＣＨＣＬ５０－Ｆｃ３＋Ｆｃ４－ＩＦＮａ２＿Ａ１４５Ｇ対Ｒ１ＣＨＣＬ５０－Ｆｃ３＋Ｆｃ４－ＩＦＮａ２＿Ｔ１０６Ｅ＿Ａ１４５Ｇ）、および非標的化バリアント（Ｆｃ３＋Ｆｃ４－ＩＦＮａ２＿Ａ１４５Ｇ）を比較した。タンパク質を、実施例５で記載のように産生し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
この実験では、ＩＦＮα２中にＴ１０６ Ｏ－グリコシル化を有するまたは有しないＣｌｅｃ９Ａ標的化ＡＦＮ（Ｒ１ＣＨＣＬ５０－Ｆｃ３＋Ｆｃ４－ＩＦＮａ２＿Ａ１４５Ｇ対Ｒ１ＣＨＣＬ５０－Ｆｃ３＋Ｆｃ４－ＩＦＮａ２＿Ｔ１０６Ｅ＿Ａ１４５Ｇ）、および非標的化バリアント（Ｆｃ３＋Ｆｃ４－ＩＦＮａ２＿Ａ１４５Ｇ）を比較した。タンパク質を、実施例５で記載のように産生し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーとそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
【0092】
効力を評価するために、構築物を、実施例５で記載のように、ヒトＰＢＭＣ中の初代ｃＤＣ１（Ｃｌｅｃ９Ａ＋／ＣＤＣ１４１＋）および非ｃＤＣ１（Ｃｌｅｃ９Ａ－／ＣＤＣ１４１－）集団におけるＳＴＡＴ１リン酸化について試験した。図１０は、Ｔ１０６上にＯ－グリコシル化有するまたは有しないＣＬＥＣ９Ａ標的化構築物の特異性を示す。理由は、この構築物は、非ｃＤＣ１細胞に比べてｃＤＣ１細胞中のＩＦＮシグナル伝達の活性化において遙かにより強力であり、非標的化バリアントで治療したｃＤＣ１細胞に比べてｃＤＣ１細胞上で遙かにより強力であるためである。
【0093】
上述のヘテロダイマー、「ノブインホール」Ｆｃ ＡＦＮ構築物の有効性を評価するために、それらを、ヒト化マウスの腫瘍モデルで試験した。簡単に説明すると、新生児ＮＳＧマウス（１～２日齢）を、１００ｃＧｙで亜致死量照射し、その後、１ｘ１０５個のＣＤ３４＋ヒト幹細胞（ＨＬＡ－Ａ２陽性臍帯血由来）を肝内に送達した。幹細胞移入後１３週に、マウスに、２５ｘ１０５個のヒトＲＬ濾胞性リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２６１；ＩＦＮの直接抗増殖作用に感受性でない）を皮下接種した。マウスを、腫瘍接種後７日目～１７日目に、３０μｇのヒトＦｌｔ３Ｌタンパク質で腹腔内治療した。緩衝液またはＦｃ－ＡＦＮ（２．５μｇ）構築物による毎週の静脈内注射を、触知できる腫瘍が認められた、腫瘍接種後の９日目に開始した（群当たりｎ＝５匹のマウス）。腫瘍サイズ（ノギス測定値）、体重および体温を、毎日評価した。図１１のデータは、第３の治療後１週間までの腫瘍増殖を示し、両方の標的化ＡＦＮが強力なレベルの腫瘍増殖を誘導し、一方で有意な効果は、非標的化バリアントでは観察されなかったことを示す。体重および体温のデータは、緩衝液治療およびＡＦＮ治療間で何らかの大きな差異を示さず、全てのＡＦＮ治療が耐容性良好であったことを裏付けた。
【0094】
配列
【化7】
【0095】
実施例９：Ｆｃ－ＡＦＮ構築物
質量分析は、Ｒ１ＣＨＣＬ５０－Ｆｃ３鎖中のＣ末端リシンＫ残基が、ほぼ全ての成熟タンパク質で切断されることを示した。従って、両方のＦｃ－鎖でこのリシン残基が除去されたバリアントを、構築した。得られたタンパク質は、Ｆｃ’タンパク質と呼ばれる。一例として、ＩＦＮα２ｂ中の残基Ａ１４５がＧに変異された、またはＩＦＮα２ａ中の残基Ｔ１０６およびＡ１４５がそれぞれＥおよびＧに変異された、Ｒ１ＣＨＣＬ５０－Ｆｃ３’とＦｃ４’－ＡＦＮ融合体のキメラタンパク質の組み合わせを、下記に示す。
質量分析は、Ｒ１ＣＨＣＬ５０－Ｆｃ３鎖中のＣ末端リシンＫ残基が、ほぼ全ての成熟タンパク質で切断されることを示した。従って、両方のＦｃ－鎖でこのリシン残基が除去されたバリアントを、構築した。得られたタンパク質は、Ｆｃ’タンパク質と呼ばれる。一例として、ＩＦＮα２ｂ中の残基Ａ１４５がＧに変異された、またはＩＦＮα２ａ中の残基Ｔ１０６およびＡ１４５がそれぞれＥおよびＧに変異された、Ｒ１ＣＨＣＬ５０－Ｆｃ３’とＦｃ４’－ＡＦＮ融合体のキメラタンパク質の組み合わせを、下記に示す。
【0096】
配列：
【化8】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【手続補正書】
【提出日】2022-01-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】