特表 2022-530986 カウレン酸１３－ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）バリアント及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-05

(54)【発明の名称】カウレン酸１３－ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）バリアント及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/53 20060101AFI20220628BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20220628BHJP

   C12N 15/29 20060101ALI20220628BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220628BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220628BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220628BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220628BHJP

   C12N 1/13 20060101ALI20220628BHJP

   C12P 19/00 20060101ALI20220628BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20220628BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20220628BHJP

   C12N 15/60 20060101ALN20220628BHJP

   C12N 15/61 20060101ALN20220628BHJP

   C12R 1/865 20060101ALN20220628BHJP

【ＦＩ】

C12N15/53

C12N9/02 ZNA

C12N15/29

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N1/13

C12P19/00

C12N15/31

C12N15/54

C12N15/60

C12N15/61

C12R1:865

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021564945

(86)(22)【出願日】2020-05-01

(85)【翻訳文提出日】2021-11-18

(86)【国際出願番号】 US2020031171

(87)【国際公開番号】W WO2020227148

(87)【国際公開日】2020-11-12

(31)【優先権主張番号】62/842,810

(32)【優先日】2019-05-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510079008

【氏名又は名称】アミリス，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】クライン、アンドリュー ピー．

(72)【発明者】

【氏名】ルンド、ショーン

(72)【発明者】

【氏名】ウィッチマン、ゲイル

(72)【発明者】

【氏名】コルヤキナ、イリーナ

(72)【発明者】

【氏名】ホーガン、カイル

(72)【発明者】

【氏名】ボリソヴァ、スヴェトラーナ

【テーマコード（参考）】

4B050

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050CC04

4B050DD03

4B050DD04

4B050DD07

4B050DD09

4B050LL02

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4B065AA01X

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4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA27

4B065CA41

(57)【要約】

本明細書で提供されるのは、ステビオール配糖体の生成を改善するための遺伝的に改変された宿主細胞、組成物、及び方法である。この宿主細胞は、Ｒｏ．ＫＡＨの新規でかつ最適化されたバリアントを発現する異種核酸を含むように遺伝子改変されている。この宿主細胞は、宿主細胞において１つ以上のステビオール配糖体を産生し得る経路のさらなる酵素をコードする１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に記載の宿主細胞、組成物、及び方法は、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＤ、及びレバウディオサイドＭを含むステビオール配糖体の異種生産のための効率的な経路を提供する。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記配列が１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む、バリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチド。

【請求項2】

前記１つ以上のアミノ酸置換が、Ｋ６９Ｒ、Ｖ３４３Ｇ、Ｔ４０３Ｖ、Ｈ４９１Ｐ、Ｐ７２Ｄ、Ｌ６４Ｄ、Ｑ８４Ｃ、Ｌ６４Ｇ、Ｅ２０６Ｄ、Ｙ２３８Ｃ、Ａ２１０Ｇ、Ｌ６４Ｎ、Ｉ２３７Ｃ、Ｌ１１Ｖ、Ｎ２０７Ｆ、Ｍ７３Ｇ、Ｗ８Ｇ、Ｅ６０Ｒ、Ｙ５５Ｓ、Ｎ４７５Ｇ、Ｄ２９２Ｐ、Ｐ１６１Ｃ、Ｋ２６７Ｄ、Ｌ４８５Ｆ、Ａ３９６Ｆ、Ｒ５０７Ａ、Ｐ７２Ｔ、Ｉ１３２Ｇ、Ｎ６１Ｐ、Ｋ１１９Ｖ、Ｔ２２０Ｅ、Ｐ７２Ｇ、Ｑ５１３Ｒ、Ｓ１３３Ｇ、Ｙ５０６Ｖ、Ｋ６９Ｐ、Ｅ６０Ｇ、Ｋ２２４Ｃ、Ｍ７３Ｈ、Ｈ３７９Ｇ、Ｐ７２Ｃ、Ｋ３１４Ｐ、Ｗ２０２Ａ、Ｇ４６６Ｆ、Ｎ４９Ａ、Ｓ３３９Ｇ、Ｎ１６０Ｄ、Ｔ２１６Ｇ、Ｄ１０２Ｙ、Ｆ２４６Ｇ、Ｍ５８Ｐ、Ｔ２２０Ｒ、Ｒ４５８Ｄ、Ｍ５８Ｇ、Ａ６８Ｉ、Ｓ７０Ｐ、Ｆ８８Ｖ、Ｔ２４０Ｄ、Ｌ２０５Ｉ、Ｋ１６７Ｇ、Ｌ２３２Ｍ、Ｓ６２Ｒ、Ｇ５６Ｄ、Ｑ２４４Ｇ、Ａ２４２Ｄ、Ｎ４９Ｒ、Ｑ５１３Ｇ、Ｗ２９Ｔ、Ｌ３０３Ｄ、Ｔ３７８Ｄ、Ｉ５０８Ｌ、Ｗ２０２Ｑ、Ｓ５０５Ｒ、Ｒ２３３Ｃ、Ｉ１０４Ｄ、Ｍ２５８Ｇ、Ｋ６９Ｇ、Ｆ８８Ｄ、Ｆ８８Ｓ、Ａ２１７Ｖ、Ｅ２３０Ｃ、Ｒ５０７Ｇ、Ｇ４６６Ｓ、Ｇ５６Ｓ、Ｅ２３０Ｇ、Ｙ５５Ｇ、Ａ５０３Ｃ、Ｓ４６０Ｉ、Ｉ１２９Ｒ、Ｓ２４５Ｇ、Ｆ２４６Ｓ、Ｑ８４Ｌ、Ｓ１３３Ｒ、Ｔ５０９Ｖ、Ｒ５０７Ｅ、Ｒ２３３Ｔ、Ｖ３０Ｆ、Ａ６８Ｇ、Ｇ５６Ｎ、Ｔ１６２Ｇ、Ａ６８Ｐ、Ｓ１６５Ｄ、Ｋ１１９Ｙ、Ｗ２９Ｃ、Ｓ１６５Ｐ、Ｗ２９Ｖ、Ｉ２８４Ｇ、Ａ２１７Ｌ、Ｑ３３５Ｖ、Ｌ６５Ｓ、Ｆ５３Ｒ、Ｙ５５Ｐ、Ｗ２０２Ｖ、Ｋ２２４Ｖ、Ｗ２９Ａ、Ｈ１６４Ｇ、Ｑ２４４Ｄ、Ｋ２９１Ｃ、Ｌ６５Ｇ、Ｋ１６７Ｓ、Ｃ３２７Ｉ、Ｋ２９１Ｓ、Ｄ５７Ｇ、Ｋ１６７Ｈ、Ｎ１６０Ｔ、Ｗ２０２Ｃ、Ａ２４２Ｇ、Ｆ８８Ｒ、Ｉ１０４Ｎ、Ｇ４６６Ｄ、Ｎ４７５Ｄ、Ｋ１１９Ｓ、Ｔ１２３Ｄ、Ｔ２１６Ａ、Ｓ３３９Ａ、Ｐ１６１Ｄ、Ｉ１０４Ｒ、Ｌ５４Ｇ、Ｍ１７１Ｆ、Ｌ２３２Ｙ、Ｄ２９３Ｃ、Ｖ３４０Ａ、Ｔ１６２Ａ、Ａ２９７Ｖ、Ｉ１０４Ｈ、Ｆ３３２Ｌ、Ａ２３６Ｒ、Ｋ２２４Ｉ、Ｓ４５２Ｄ、Ｉ１０４Ａ、Ｖ３４０Ｓ、Ｆ２２９Ｙ、Ａ２９７Ｙ、及びＡ２９７Ｆから選択される、請求項１に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項3】

前記１つ以上のアミノ酸置換が、Ａ２９７Ｖ、Ｉ１０４Ｈ、Ｆ３３２Ｌ、Ａ２３６Ｒ、Ｋ２２４Ｉ、Ｓ４５２Ｄ、Ｉ１０４Ａ、Ｉ１０４Ａ、Ｖ３４０Ｓ、Ｆ２２９Ｙ、Ａ２９７Ｙ、及びＡ２９７Ｆから選択される、請求項２に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項4】

前記１つ以上のアミノ酸置換が、Ｓ４５２Ｄ、Ｉ１０４Ａ、Ｖ３４０Ｓ、Ｆ２２９Ｙ、Ａ２９７Ｙ、及びＡ２９７Ｆから選択される、請求項３に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項5】

前記１つ以上のアミノ酸置換が、Ｎ１４６Ｗ、Ａ２９７Ｙ、Ａ２３６Ｓ、Ｖ９Ｓ、Ｇ４６６Ｆ、Ｔ２８３Ｄ、Ｔ１４２Ｇ、Ｔ４２５Ｖ、Ｌ４５９Ｃ、Ｔ２８３Ａ、Ｔ２８３Ｇ、Ｓ４６０Ｖ、Ｓ１３３Ｇ、Ｉ１２９Ｖ、Ｗ５２Ｇ、Ｓ５０５Ｉ、Ｉ２４３Ｔ、Ｖ３４０Ｓ、Ｓ４６０Ｃ、Ｓ４５２Ｄ、Ｌ１１８Ｉ、Ｓ５０５Ｖ、Ｔ１２３Ｄ、Ｗ５２Ｃ、Ｓ４６０Ｉ、Ｓ４５７Ｇ、Ｗ５２Ｒ、Ｗ５２Ｎ、Ｎ１４６Ｔ、Ｇ４６６Ａ、及びＷ５２Ｔから選択される、請求項１に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項6】

前記１つ以上のアミノ酸置換がＡ２９７Ｙを含む、請求項１に記載のポリペプチドのバリアント。

【請求項7】

前記１つ以上のアミノ酸置換がＮ１４６Ｔを含む、請求項１または６に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項8】

前記１つ以上のアミノ酸置換がＮ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ、Ｗ５２Ｔ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ、Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ、Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ、及びＷ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａから選択される、請求項１に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項9】

１つ以上のアミノ酸置換がＷ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｇ４６６Ａ、Ａ１４５Ｇ／Ｎ１４６Ｆ／Ａ２９７Ｙ；Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ／Ｓ４６０Ｉ、Ｗ５２Ｎ／Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ、Ｆ３３２Ｌ／Ｓ４５２Ｄ、Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ、及びＱ８４Ｒ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙから選択される、請求項１に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項10】

Ｎ末端シグナル配列をコードする前記アミノ酸が、異種植物ｐ４５０ポリペプチドのＮ末端シグナル配列をコードする対応するアミノ酸配列で置き換えられている、先行請求項のいずれか１項に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項11】

前記Ｎ末端シグナル配列が配列番号１のアミノ酸１～２５に対応する、請求項１０に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項12】

前記対応するアミノ酸配列が配列番号２２を含む、請求項１１に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項13】

配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１から選択される前記アミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のバリアントポリペプチド。

【請求項14】

先行請求項のいずれか１項に記載の前記バリアントポリペプチドをコードする、核酸。

【請求項15】

請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１４に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項16】

前記宿主細胞が、１つ以上のステビオール配糖体を産生することができる、請求項１５に記載の宿主細胞。

【請求項17】

前記１つ以上のステビオール配糖体が、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、及びＲｅｂＭから選択される、請求項１６に記載の宿主細胞。

【請求項18】

前記１つ以上のステビオール配糖体がＲｅｂＭを含む、請求項１７に記載の宿主細胞。

【請求項19】

ステビオール配糖体を作製するための経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項20】

ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１９に記載の宿主細胞。

【請求項21】

コパリル二リン酸シンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１９に記載の宿主細胞。

【請求項22】

ｅｎｔ－カウレンシンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１９に記載の宿主細胞。

【請求項23】

カウレンオキシダーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１９に記載の宿主細胞。

【請求項24】

シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１９に記載の宿主細胞。

【請求項25】

１つ以上のウリジン５’－二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１９に記載の宿主細胞。

【請求項26】

ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、ｅｎｔ－カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＵＧＴ４００８７、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＥＵＧＴ１１、及びＵＧＴ９１Ｄをコードする１つ以上の核酸をさらに含む、請求項１９に記載の宿主細胞。

【請求項27】

前記細胞が、細菌細胞、酵母細胞、藻細胞、昆虫細胞、及び植物細胞から選択される、請求項１５～１６のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項28】

前記細胞が、酵母細胞である、請求項２７に記載の宿主細胞。

【請求項29】

前記細胞が Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項２８に記載の宿主細胞。

【請求項30】

１つ以上のステビオール配糖体を産生するための方法であって、
１つ以上のステビオール配糖体を作製して培養ブロスを生成するのに適した条件下で、炭素源を含む培地中で、請求項１５～２９のいずれか１項に記載の宿主細胞の集団を培養することと、
前記培養ブロスから１つ以上のステビオール配糖体を回収することと、を含む、前記方法。

【請求項31】

前記１つ以上のステビオール配糖体がＲｅｂＭである、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

発酵組成物であって、
請求項１５～２９のいずれか１項に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む宿主細胞と、
前記宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオール配糖体と、を含む前記発酵組成物。

【請求項33】

前記１つ以上のステビオール配糖体がＲｅｂＭである、請求項３２に記載の発酵組成物。

【請求項34】

請求項３１に記載の方法によって製造されたＲｅｂＭを含む組成物。

【請求項35】

配列番号１の前記アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを含む宿主細胞。

【請求項36】

前記カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドの前記アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１から選択される前記アミノ配列を含む、請求項３５に記載の宿主細胞。

【請求項37】

前記宿主細胞が、１つ以上のステビオール配糖体を産生することができる、請求項３５または３６に記載の宿主細胞。

【請求項38】

前記１つ以上のステビオール配糖体が、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、及びＲｅｂＭから選択される、請求項３７に記載の宿主細胞。

【請求項39】

前記１つ以上のステビオール配糖体がＲｅｂＭである、請求項３８に記載の宿主細胞。

【請求項40】

ステビオール配糖体を作製するための経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の核酸をさらに含む、請求項３５～３９のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項41】

ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、ｅｎｔ－カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＵＧＴ４００８７、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＥＵＧＴ１１、及びＵＧＴ９１Ｄをコードする１つ以上の核酸をさらに含む、請求項４０に記載の宿主細胞。

【請求項42】

細菌細胞、酵母細胞、藻細胞、昆虫細胞、及び植物細胞から選択される、請求項３５～４１のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項43】

前記細胞が、酵母細胞である、請求項４２に記載の宿主細胞。

【請求項44】

前記細胞が Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項４３に記載の宿主細胞。

【請求項45】

１つ以上のステビオール配糖体を産生するための方法であって、
１つ以上のステビオール配糖体を作製して培養ブロスを生成するのに適した条件下で、炭素源を含む培地中で、請求項３５～４４のいずれか１項に記載の宿主細胞の集団を培養することと、
前記培養ブロスから前記１つ以上のステビオール配糖体を回収することと、を含む、前記方法。

【請求項46】

前記１つ以上のステビオール配糖体がＲｅｂＭである、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

発酵組成物であって、
請求項３５～４４のいずれか１項に記載のカウレン酸ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む宿主細胞と、
前記宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオール配糖体と、を含む前記発酵組成物。

【請求項48】

１つ以上のステビオール配糖体がＲｅｂＭである、請求項４７に記載の発酵組成物。

【請求項49】

請求項４６に記載の方法によって産生されたＲｅｂＭを含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年４月３０日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５１４９４－００９ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿４＿３０＿２０＿ＳＴ２５と命名され、１００，１０６バイトの大きさである。

【0002】

発明の分野
本開示は、カウレン酸１３－ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）バリアント、それを含む宿主細胞、及び異種分子の産生のためのそれらの使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

天然の供給源に由来する低カロリー甘味料は、高糖消費の健康への影響を制限するために望まれている。ステビア植物（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ）は、ステビオール配糖体と呼ばれるさまざまな甘味のあるグリコシル化ジテルペンを生成する。公知の全てのステビオール配糖体の中で、Ｒｅｂ Ｍは最も高い効力（ショ糖の約３００倍の甘味）を有し、最も魅力的なフレーバープロファイルを有する。ただし、Ｒｅｂ Ｍは、ステビア植物によって少量しか生成されず、ステビオール配糖体の総含有量のごく一部（１．０％未満）であるので、ステビアの葉からＲｅｂＭを分離することは現実的ではない。ＲｅｂＭを取得する別の方法が必要である。そのようなアプローチの１つは、持続可能な原料供給源から大量のＲｅｂ Ｍを生成する微生物（例えば、酵母）を設計するための合成生物学の適用である。

【0004】

合成生物学を使用して生成物を経済的に生産するためには、原料から生成物への生物変換の各ステップは、高い変換効率（理想的には９０％超）を有する必要がある。Ｒｅｂ Ｍを生成する酵母で本発明者らの操作において、野生型酵素を使用した場合、特定の酵素ステップが酵母でうまく機能しないことに気づいた。微生物におけるＲｅｂ Ｍの生産性及び収量を向上させるために、野生型酵素よりも優れた性能を発揮するバリアント酵素の生産を目指した。そのような酵素の１つは、ｅｎｔ－カウレン酸のステビオールへの変換を触媒する、カウレン酸１３－ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）である。

【発明の概要】

【0005】

本明細書に提供されるのは、カウレン酸のステビオールへの改善された変換のための組成物及び方法である。これらの組成物及び方法は、カウレン酸を高効率でステビオールに変換することができる、ある特定のバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）の生成に部分的に基づいている。

【0006】

一態様では、本発明は、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを有する宿主細胞を提供する。

【0007】

一態様では、本発明は、一般に、配列番号１のアミノ酸配列を有するバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを提供し、この配列は、１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。

【0008】

別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする核酸を提供し、この配列は、１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のバリアントポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸を提供する。

【0009】

さらに別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを含む宿主細胞を提供し、この配列は、１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは核酸のいずれか１つを含む宿主細胞を提供する。

【0010】

さらなる態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞提供し、この配列は、１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。

【0011】

ある実施形態では、本発明は、１つ以上のアミノ酸置換が、Ｋ６９Ｒ、Ｖ３４３Ｇ、Ｔ４０３Ｖ、Ｈ４９１Ｐ、Ｐ７２Ｄ、Ｌ６４Ｄ、Ｑ８４Ｃ、Ｌ６４Ｇ、Ｅ２０６Ｄ、Ｙ２３８Ｃ、Ａ２１０Ｇ、Ｌ６４Ｎ、Ｉ２３７Ｃ、Ｌ１１Ｖ、Ｎ２０７Ｆ、Ｍ７３Ｇ、Ｗ８Ｇ、Ｅ６０Ｒ、Ｙ５５Ｓ、Ｎ４７５Ｇ、Ｄ２９２Ｐ、Ｐ１６１Ｃ、Ｋ２６７Ｄ、Ｌ４８５Ｆ、Ａ３９６Ｆ、Ｒ５０７Ａ、Ｐ７２Ｔ、Ｉ１３２Ｇ、Ｎ６１Ｐ、Ｋ１１９Ｖ、Ｔ２２０Ｅ、Ｐ７２Ｇ、Ｑ５１３Ｒ、Ｓ１３３Ｇ、Ｙ５０６Ｖ、Ｋ６９Ｐ、Ｅ６０Ｇ、Ｋ２２４Ｃ、Ｍ７３Ｈ、Ｈ３７９Ｇ、Ｐ７２Ｃ、Ｋ３１４Ｐ、Ｗ２０２Ａ、Ｇ４６６Ｆ、Ｎ４９Ａ、Ｓ３３９Ｇ、Ｎ１６０Ｄ、Ｔ２１６Ｇ、Ｄ１０２Ｙ、Ｆ２４６Ｇ、Ｍ５８Ｐ、Ｔ２２０Ｒ、Ｒ４５８Ｄ、Ｍ５８Ｇ、Ａ６８Ｉ、Ｓ７０Ｐ、Ｆ８８Ｖ、Ｔ２４０Ｄ、Ｌ２０５Ｉ、Ｋ１６７Ｇ、Ｌ２３２Ｍ、Ｓ６２Ｒ、Ｇ５６Ｄ、Ｑ２４４Ｇ、Ａ２４２Ｄ、Ｎ４９Ｒ、Ｑ５１３Ｇ、Ｗ２９Ｔ、Ｌ３０３Ｄ、Ｔ３７８Ｄ、Ｉ５０８Ｌ、Ｗ２０２Ｑ、Ｓ５０５Ｒ、Ｒ２３３Ｃ、Ｉ１０４Ｄ、Ｍ２５８Ｇ、Ｋ６９Ｇ、Ｆ８８Ｄ、Ｆ８８Ｓ、Ａ２１７Ｖ、Ｅ２３０Ｃ、Ｒ５０７Ｇ、Ｇ４６６Ｓ、Ｇ５６Ｓ、Ｅ２３０Ｇ、Ｙ５５Ｇ、Ａ５０３Ｃ、Ｓ４６０Ｉ、Ｉ１２９Ｒ、Ｓ２４５Ｇ、Ｆ２４６Ｓ、Ｑ８４Ｌ、Ｓ１３３Ｒ、Ｔ５０９Ｖ、Ｒ５０７Ｅ、Ｒ２３３Ｔ、Ｖ３０Ｆ、Ａ６８Ｇ、Ｇ５６Ｎ、Ｔ１６２Ｇ、Ａ６８Ｐ、Ｓ１６５Ｄ、Ｋ１１９Ｙ、Ｗ２９Ｃ、Ｓ１６５Ｐ、Ｗ２９Ｖ、Ｉ２８４Ｇ、Ａ２１７Ｌ、Ｑ３３５Ｖ、Ｌ６５Ｓ、Ｆ５３Ｒ、Ｙ５５Ｐ、Ｗ２０２Ｖ、Ｋ２２４Ｖ、Ｗ２９Ａ、Ｈ１６４Ｇ、Ｑ２４４Ｄ、Ｋ２９１Ｃ、Ｌ６５Ｇ、Ｋ１６７Ｓ、Ｃ３２７Ｉ、Ｋ２９１Ｓ、Ｄ５７Ｇ、Ｋ１６７Ｈ、Ｎ１６０Ｔ、Ｗ２０２Ｃ、Ａ２４２Ｇ、Ｆ８８Ｒ、Ｉ１０４Ｎ、Ｇ４６６Ｄ、Ｎ４７５Ｄ、Ｋ１１９Ｓ、Ｔ１２３Ｄ、Ｔ２１６Ａ、Ｓ３３９Ａ、Ｐ１６１Ｄ、Ｉ１０４Ｒ、Ｌ５４Ｇ、Ｍ１７１Ｆ、Ｌ２３２Ｙ、Ｄ２９３Ｃ、Ｖ３４０Ａ、Ｔ１６２Ａ、Ａ２９７Ｖ、Ｉ１０４Ｈ、Ｆ３３２Ｌ、Ａ２３６Ｒ、Ｋ２２４Ｉ、Ｓ４５２Ｄ、Ｉ１０４Ａ、Ｖ３４０Ｓ、Ｆ２２９Ｙ、Ａ２９７Ｙ、及びＡ２９７Ｆから選択される。別の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｎ１４６Ｗ、Ａ２９７Ｙ、Ａ２３６Ｓ、Ｖ９Ｓ、Ｇ４６６Ｆ、Ｔ２８３Ｄ、Ｔ１４２Ｇ、Ｔ４２５Ｖ、Ｌ４５９Ｃ、Ｔ２８３Ａ、Ｔ２８３Ｇ、Ｓ４６０Ｖ、Ｓ１３３Ｇ、Ｉ１２９Ｖ、Ｗ５２Ｇ、Ｓ５０５Ｉ、Ｉ２４３Ｔ、Ｖ３４０Ｓ、Ｓ４６０Ｃ、Ｓ４５２Ｄ、Ｌ１１８Ｉ、Ｓ５０５Ｖ、Ｔ１２３Ｄ、Ｗ５２Ｃ、Ｓ４６０Ｉ、Ｓ４５７Ｇ、Ｗ５２Ｒ、Ｗ５２Ｎ、Ｎ１４６Ｔ、Ｇ４６６Ａ、及びＷ５２Ｔから選択される。特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ａ２９７Ｖ、Ｉ１０４Ｈ、Ｆ３３２Ｌ、Ａ２３６Ｒ、Ｋ２２４Ｉ、Ｓ４５２Ｄ、Ｉ１０４Ａ、Ｉ１０４Ａ、Ｖ３４０Ｓ、Ｆ２２９Ｙ、Ａ２９７Ｙ、及びＡ２９７Ｆから選択される。好ましい実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ４５２Ｄ、Ｉ１０４Ａ、Ｖ３４０Ｓ、Ｆ２２９Ｙ、Ａ２９７Ｙ、及びＡ２９７Ｆから選択される。さらなる実施形態では、バリアントポリペプチドは、Ｎ末端シグナル配列が別のｐ４５０ポリペプチドのシグナル配列で置換されている。いくつかの実施形態では、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１～２５に対応する。いくつかの実施形態では、別のｐ４５０ポリペプチドのシグナル配列は、配列番号２２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、アミノ酸置換Ａ２９７Ｙを含み、１つ以上の追加のアミノ酸置換も含み得る。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙを含むアミノ酸置換を含み、また１つ以上の追加のアミノ酸置換も含み得る。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ、Ｗ５２Ｔ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ、Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ、Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ、及びＷ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａから選択されるアミノ酸置換を有する。好ましい実施形態では、バリアントポリペプチドは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｇ４６６Ａ、Ａ１４５Ｇ／Ｎ１４Ｆ／Ａ２９７Ｙ、Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ／Ｓ４６０Ｉ、Ｗ５２Ｎ／Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ、Ｆ３３２Ｌ／Ｓ４５２Ｄ、Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ、及びＱ８４Ｒ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙから選択されるアミノ酸置換を有する。

【0012】

本発明の一実施形態では、宿主細胞は、１つ以上のステビオール配糖体を産生し得る。別の実施形態では、１つ以上のステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、及びＲｅｂＭから選択される。好ましい実施形態では、１つ以上のステビオール配糖体は、ＲｅｂＭである。

【0013】

一実施形態では、本発明の宿主細胞は、ステビオール配糖体を作製するための経路の１つ以上の酵素をコードする１つ以上の核酸を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする核酸を含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞は、コパリル二リン酸シンターゼをコードする核酸を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、ｅｎｔ－カウレンシンターゼをコードする核酸を含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞は、カウレンオキシダーゼをコードする核酸を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、シトクロムＰ４５０レダクターゼをコードする核酸を含む。さらに別の実施形態では、宿主細胞は、１つ以上のウリジン５’－二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、ｅｎｔ－カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＵＧＴ４００８７、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＥＵＧＴ１１、及びＵＧＴ９１Ｄをコードする１つ以上の核酸を含む。

【0014】

ある実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または植物細胞であり得る。特定の実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。

【0015】

さらに別の態様では、本発明は、１つ以上のステビオール配糖体を生成するための方法を提供し、この方法は、以下のステップａ）１つ以上のステビオール配糖体を作製するために適切な条件下で炭素源を有する培地中で本発明の宿主細胞の集団を培養して培養ブロスを生成するというステップと、ｂ）この培養ブロスから１つ以上のステビオール配糖体を回収するというステップとを含む。好ましい実施形態では、この方法は、ＲｅｂＭの回収を伴う。

【0016】

さらなる実施形態では、本発明は、本発明のバリアントカウレン酸ヒドロキシラーゼをコードする核酸を含む宿主細胞を含む発酵組成物、及び宿主細胞によって産生される１つ以上のステビオール配糖体を提供する。好ましい実施形態では、この発酵組成物はＲｅｂＭを含む。

【0017】

一実施形態では、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、配列番号１の配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一であるアミノ酸配列を有する。好ましい実施形態では、本発明の宿主細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを有する。いくつかの実施形態では、本発明の宿主細胞は、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドのアミノ酸配列を有するカウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを有し、配列番号１、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１から選択されるアミノ配列を含む。

【0018】

一態様では、本発明は、本発明の方法によってまたは本発明の宿主細胞によって生成されたＲｅｂＭを含む組成物及び食品を提供する。別の態様では、本発明は、なんら他の植物由来物質を含まないステビオール配糖体（例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、またはＲｅｂＭ）を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ステビオール配糖体はＲｅｂＭである。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】天然酵母代謝産物ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）からレバウディオサイドＭ（Ｒｅｂ Ｍ）への酵素経路を示す概略図である。

【図2】ＫＡＨ遺伝子をＲｅｂＭ株に挿入するために使用されるランディングパッドＤＮＡ構築物の概略図である。ランディングパッドは、選択した酵母遺伝子座の上流及び下流のゲノム領域への構築物の両端にある５００ｂｐの遺伝子座標的化ＤＮＡ配列で構成されている。ランディングパッドを挿入しても遺伝子が削除されないように遺伝子座を選択する。内部的には、ランディングパッドにはＧＡＬプロモーターと、それに続くＦ－ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼ及び酵母ターミネーターの認識部位が含まれている。エンドヌクレアーゼＦ－ＣｐｈＩは、認識配列を切断し、ランディングパッドで二本鎖切断を作成して、その部位でのＲｏ．ＫＡＨＤＮＡバリアントの相同組換えを促進する。

【図3】Ｒｓ．ＫＡＨ対照と比較した全細胞ブロス中の総ステビオール配糖体（μＭで測定）のグラフである。異なる過剰発現ＫＡＨ遺伝子を有する酵母株をマイクロタイタープレートで増殖させた。ＫＡＨを含まない親株のデータも示されている。濃い垂直線は、平均の９５％信頼区間を表す（Ｎ＝８）。

【図4】野生型Ｒｏ．ＫＡＨ含有酵母と比較して、部位飽和突然変異誘発ライブラリーで生成されたＲｏ．ＫＡＨの変異体を含むＲｅｂ Ｍ産生酵母の全細胞ブロス中の総ステビオール配糖体（μＭで測定）のグラフである。異なる過剰発現ＫＡＨ遺伝子を有する酵母株をマイクロタイタープレートで増殖させた。また、ＫＡＨを含まない親株、ならびに野生型Ｒｏ．ＫＡＨ及びＳｒ．ＫＡＨを含む酵母株のデータも示している。

【図5】野生型Ｒｏ．ＫＡＨ含有酵母（これも示されている）と比較したコンビナトリアルライブラリーで生成されたＲｏ．ＫＡＨの変異体を含むＲｅｂ Ｍ産生酵母の全細胞ブロス中の総ステビオール配糖体（μＭで測定）のグラフである。異なる過剰発現ＫＡＨ遺伝子を有する酵母株を、マイクロタイタープレートで増殖させた。

【図6】Ａ～Ｄは、カウレン酸に対するＲｏ．ＫＡＨ活性の副産物に由来する不純物Ｃ２０Ｈ３２Ｏ４ ＋ １Ｇｌｃの提案された構造（Ａ）及び不純物同定を支持する実験的証拠（Ｂ～Ｄ）を示す。Ｂは、野生型Ｒｏ．ＫＡＨ、Ｓｒ．ＫＡＨ、Ｒｓ．ＫＡＨを発現するか、またはＫＡＨを発現しない酵母培養物の全細胞ブロス抽出物のＣＡＤクロマトグラム由来の目的の領域である。ＲｅｂＭ及びＣ２０Ｈ３２Ｏ４＋１Ｇｌｃのピークにラベルが付けられている。Ｃは、Ｒｏ．ＫＡＨクロマトグラムの９．５分のピークのフルマススペクトルである。Ｄは、Ｒｏ．ＫＡＨクロマトグラムの９．５分のピークのＭＳ２フラグメンテーションスペクトルである。

【図7】野生型Ｒｏ．ＫＡＨと比較した、Ｒｏ．ＫＡＨ Ａ２９７Ｙの部位特異的飽和突然変異誘発を介して生成されたＲｏ．ＫＡＨ変異体のインビボ活性及び生成物特異性の改善を示すグラフである。活性（ｙ軸）の改善は次のように計算される。

【数1】

特異性の改善（ｘ軸）は次のように計算される。

【数2】

【図8】野生型Ｒｏ．ＫＡＨと比較した、Ｒｏ．ＫＡＨ Ａ２９７Ｙのコンビナトリアル部位特異的飽和突然変異誘発を介して生成されたＲｏ．ＫＡＨ突然変異体のインビボ活性及び生成物特異性の改善を示すグラフである。活性（ｙ軸）と特異性（ｘ軸）の改善は、図７の凡例で説明されているように計算される。

【図9】Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙと比較した、Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙの完全な部位特異的飽和突然変異誘発を介して生成されたＲｏ．ＫＡＨ変異体のインビボ活性及び生成物特異性の改善を示すグラフである。活性（ｙ軸）及び特異性（ｘ軸）の改善は、図７の凡例で説明されているように計算される。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、自然界では通常見られないものを指す。「異種ヌクレオチド配列」という用語は、自然界の所与の細胞には通常見られないヌクレオチド配列を指す。したがって、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞に対して外来性（すなわち、細胞に対して「外因性」）であってもよいし、（ｂ）宿主細胞に自然に見られてもよい（すなわち、「内因性」であり得る）が、細胞内に不自然な量（すなわち、宿主細胞に自然に見られるよりも多いかまたは少ない量）で存在してもよく、または（ｃ）宿主細胞に自然に見られるが、その自然の遺伝子座の外側に位置していてもよい。

【0021】

本明細書で使用される場合、分子、特にポリペプチド及びポリヌクレオチドに関する「天然」または「内因性」という用語は、それらが起源であるかまたは自然界に見出される生物で発現される分子を示す。天然のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現は、組換え生物において改変され得ることが理解される。

【0022】

本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、構造または配列のいずれかにおいて具体的に記載された「参照」分子とは異なる分子、特にポリペプチド及びポリヌクレオチドを指す。好ましい実施形態では、参照は野生型分子である。ポリペプチド及びポリヌクレオチドに関して、バリアントとは、それぞれ、アミノ酸またはヌクレオチド配列の置換、付加、または欠失を指す。

【0023】

本明細書で使用される場合、「異種核酸発現カセット」という用語は、宿主細胞においてコード配列を発現するのに十分な１つ以上の調節エレメントに作動可能に連結されたコード配列を含む核酸配列を指す。

【0024】

本明細書で使用される場合、「カウレン酸１３－ヒドロキシラーゼ」または「ＫＡＨ」という用語は、ｅｎｔ－カウレン酸をステビオールへ変換することができる触媒酵素を指す。

【0025】

本明細書で使用される場合、「親細胞」という用語は、改変宿主細胞に操作される１つ以上の特定の遺伝子改変、例えば、ステビオール経路の酵素の異種発現、ステビオールグリコシド経路、ステビオールグリコシド経路の酵素の異種発現、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼの異種発現、コパリル二リン酸シンターゼの異種発現、カウレンシンターゼの異種発現、カウレンオキシダーゼの異種発現、ステビオールシンターゼ（カウレン酸ヒドロキシラーゼ）の異種発現、シトクロムＰ４５０レダクターゼの異種発現、例えばＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ９１Ｄ、及びＵＧＴ４００８７またはそのバリアントを含むＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼの異種発現からなる群より選択される１つ以上の改変を含まないことを除いて、本明細書に開示される遺伝子改変宿主細胞と同一の遺伝的背景を有する細胞を指す。

【0026】

本明細書で使用される場合、「培地」という用語は、培養培地及び／または発酵培地を指す。

【0027】

本明細書で使用される場合、「発酵組成物」という用語は、遺伝子改変された宿主細胞及び遺伝子改変された宿主細胞によって産生される生成物または代謝産物を含む組成物を指す。発酵組成物の例は、全細胞ブロスであり、これは、細胞、水相、及び遺伝子改変された宿主細胞から生成された化合物を含む、容器の全内容物であり得る。

【0028】

本明細書で使用される場合、「産生」という用語は、一般に、本明細書で提供される遺伝子改変された宿主細胞によって産生される量のステビオール配糖体を指す。いくつかの実施形態では、産生は、宿主細胞によるステビオール配糖体の収量として表される。他の実施形態では、産生は、ステビオール配糖体を産生する際の宿主細胞の生産性として表される。

【0029】

本明細書で使用される場合、「収量」という用語は、宿主細胞によって消費される炭素源の１重量あたりに産生されるステビオール配糖体の重量として表される、宿主細胞によるステビオール配糖体の産生を指す。

【0030】

本明細書で使用される場合、「生産性」という用語は、宿主細胞によるステビオール配糖体の産生であって、経時的（１時間あたり）に宿主細胞が培養される発酵ブロスの量（容積）あたりで生成されるステビオール配糖体の量（重量）として表される産生を指す。

【0031】

本明細書で使用される場合、「シグナル配列」または「Ｎ末端シグナル配列」という用語は、ポリペプチドのＮ末端にある短いペプチド（例えば、長さが５～５０アミノ酸）であって、ポリペプチドを分泌経路（例えば、細胞外空間）に向かわせるポリペプチドを指す。シグナルペプチドは通常、ポリペプチドの分泌中に切断される。シグナル配列は、ポリペプチドを細胞内区画または細胞小器官、例えば小胞体に向ける場合がある。シグナル配列は、ポリペプチドを細胞の特定の領域に標的化するという既知の機能を有するペプチドに対する相同性または生物学的活性によって同定され得る。当技術分野の通常の技術の１つは、容易に入手可能なソフトウェア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， １７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．５３７０５， ＢＬＡＳＴ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸ ｐｒｏｇｒａｍｓ）を使用することによってシグナルペプチドを同定し得る。シグナルペプチドは、例えば、配列番号２２のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～２５と実質的に同一であるものであり得る。Ｎ末端シグナル配列は、異種のＮ末端シグナル配列（例えば、植物ｐ４５０ポリペプチドからのＮ末端シグナル配列）をコードする対応するアミノ酸配列で置き換えられ得る。

【0032】

本明細書で使用される場合、「カウレン酸」という用語は、カウレン酸の任意の立体異性体を含む化合物カウレン酸を指す。好ましい実施形態では、この用語は、当技術分野でｅｎｔ－カウレン酸として知られており、以下の構造を有するエナンチオマーを指す。

【化1】

【0033】

本明細書で使用される場合、「ステビオール」という用語は、ステビオールの任意の立体異性体を含む、化合物ステビオールを指す。好ましい実施形態では、この用語は、以下の構造を有する化合物を指す。

【化2】

【0034】

本明細書で使用される場合、「ステビオールグリコシド」という用語は、１９－グリコシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ダルコシドＢ、ダルコシドＡ、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＧ、レバウディオサイドＨ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＬ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＤ２、レバウディオサイドＭ２を含むがこれらに限定されないステビオールのグリコシドを指す。

【0035】

本明細書で使用される場合、「レバウディオサイドＭ」または「Ｒｅｂ Ｍ」という用語は、以下の構造を有するステビオール配糖体を指す。

【化3】

【0036】

本明細書で使用される場合、２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性パーセント」という用語は、同一であるか、または同一であるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を特定のパーセンテージで有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。例えば、配列は、比較ウィンドウ上で最大の対応を得るために比較及び整列された場合の参照配列、または配列比較アルゴリズムを使用して、もしくは手動の整列及び目視検査によって測定された指定された領域に対して、特定の領域にわたって、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％という同一性パーセント、またはより高い同一性を有し得る。例えば、同一性パーセントは、配列中の同一のヌクレオチド（またはアミノ酸残基）の数を、全ヌクレオチド（またはアミノ酸残基）の長さからギャップの長さを引いたもので割った比率を計算することによって決定される。

【0037】

便宜上、２つの配列間の同一性の程度は、当技術分野で公知のコンピュータープログラム及び数学的アルゴリズムを使用して確認し得る。パーセント配列同一性を計算するそのようなアルゴリズムは、一般に、比較領域にわたる配列ギャップ及びミスマッチを考慮する。配列を比較及び整列させるプログラム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２２，ｐｐ．４６７３－４６８０），ＡＬＩＧＮ（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ，ｖｏｌ．４，ｐｐ．１１－１７），ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．８５，ｐｐ．２４４４－２４４８；Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．１８３，ｐｐ．６３－９８）、及びギャップのあるＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２５，ｐｐ．３３８９－３４０２）が、この目的に有用である。ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．２１５ｐｐ．４０３－４１０）は、いくつかの供給源、例としては、米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）から、及びインターネットでは、配列分析プログラムＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、及びＴＢＬＡＳＴＸに関連して使用のために入手可能である。追加情報はＮＣＢＩのウェブサイトで見出し得る。

【0038】

ある特定の実施形態では、配列アラインメント及び同一性パーセントの計算は、その標準的なデフォルトパラメーターを使用して、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定され得る。ヌクレオチド配列アラインメント及び配列同一性の計算では、ＢＬＡＳＴＮプログラムがデフォルトのパラメーター（ギャップ開口ペナルティ＝５、ギャップ拡張ペナルティ＝２、核酸一致＝２、核酸不一致＝－３、期待値＝１０．０、ワードサイズ＝１１、クエリ範囲で最大一致＝０）で使用される。ポリペプチド配列アラインメント及び配列同一性の計算では、ＢＬＡＳＴＰプログラムがデフォルトのパラメーター（アラインメントマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在＝１１、拡張＝１；組成調整＝条件付き組成スコア、マトリックス調整；期待値＝１０．０；ワードサイズ＝６；クエリ範囲での最大一致＝０）で使用される。または、次のプログラム及びパラメーターも使用され得る。Ｃｌｏｎｅ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｕｉｔｅバージョン５のＡｌｉｇｎ Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｓｃｉ－Ｅｄソフトウェア）；ＤＮＡ比較：グローバル比較、標準線形スコアリングマトリックス、ミスマッチペナルテ＝２、オープンギャップペナルティ＝４、拡張ギャップペナルティ＝１。アミノ酸比較：グローバル比較、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス。本明細書に記載の実施形態では、配列同一性は、それらのデフォルトパラメーターを使用して、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて計算される。本明細書に記載の実施形態では、２つ以上の配列の配列アラインメントは、提案されたデフォルトパラメーター（入力配列の整列解除：いいえ；Ｍｂｅｄ－ｌｉｋｅクラスタリングガイドツリー：はい；Ｍｂｅｄ－ｌｉｋｅクラスタリング反復：はい；組み合わされた反復の数：デフォルト（０）；最大ガイドツリー反復：デフォルト；最大ＨＭＭ反復：デフォルト；オーダー：入力）を使用して、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて実行される。

【0039】

発明のある特定の実施形態では、親宿主細胞は、カウレン酸を生成することができる１つ以上の酵素経路を含み得る。本明細書に記載されるように、宿主細胞は、カウレン酸をステビオールに変換することができる、本明細書に提供されるＲｕｂｕｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓカウレン酸ヒドロキシラーゼ及びそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ファルネシル二リン酸をゲラニルゲラニル二リン酸に変換することができる１つ以上の酵素をさらに含む。さらなる実施形態では、宿主細胞は、コパリル二リン酸をカウレンに変換することができる１つ以上の酵素を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に変換することができる１つ以上の酵素をさらに含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ステビオールを１つ以上のステビオール配糖体に変換することができる１つ以上の酵素をさらに含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ステビオールをＲｅｂ Ａに変換することができる１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の酵素を一緒にさらに含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することができる１つ以上の酵素をさらに含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｒｅｂ ＤをＲｅｂ Ｍに変換し得る１つ以上の酵素をさらに含む。有用な酵素及びこの酵素をコードする核酸は当業者に公知である。特に有用な酵素及び核酸は、以下のセクションに記載され、さらに、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号、同第２０１４／０３５７５８８Ａ１号、同第２０１５／０１５９１８８号、ＷＯ２０１６／０３８０９５Ａ２、及び米国特許出願公開第２０１６／０１９８７４８Ａ１号に記載されている。

【0040】

さらなる実施形態では、宿主細胞は、炭素源からゲラニルゲラニル二リン酸を作製することができる１つ以上の酵素をさらに含む。これらには、ＤＸＰ経路の酵素及びＭＥＶ経路の酵素が含まれる。有用な酵素及び酵素をコードする核酸は当業者に公知である。各経路の例示的な酵素は、以下に記載され、さらに、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０１７７３４１Ａ１号にさらに記載される。

【0041】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、以下からなる群から選択されるイソプレノイド経路酵素の１つ以上または全てを含む。（ａ）アセチル補酵素Ａの２つの分子を縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素（例えば、アセチルＣｏＡチオラーゼ）、（ｂ）アセトアセチル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡの別の分子と縮合させて３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）を形成する酵素（例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ）、（ｃ）ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素（例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ）、（ｄ）メバロン酸をメバロン酸５－リン酸に変換する酵素（例えば、メバロン酸キナーゼ）、（ｅ）メバロン酸５－リン酸をメバロン酸５－ピロリン酸に変換する酵素（例えば、ホスホメバロン酸キナーゼ）、（ｆ）メバロン酸５－ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に変換する酵素（例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ）、（ｇ）ＩＰＰをジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する酵素（例えば、ＩＰＰイソメラーゼ）、（ｈ）ＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して５つ以上の炭素を含むポリプレニル化合物を形成し得るポリプレニルシンターゼ、（ｉ）ＩＰＰをＤＭＡＰＰと縮合させてゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）を形成する酵素（例えば、ＧＰＰシンターゼ）、（ｊ）２分子のＩＰＰを１分子のＤＭＡＰＰと縮合させる酵素（例えば、ＦＰＰシンターゼ）、（ｋ）ＩＰＰをＧＰＰと縮合させてファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）を形成する酵素（例えば、ＦＰＰシンターゼ）、（ｌ）ＩＰＰとＤＭＡＰＰを縮合してゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を形成する酵素、ならびに（ｍ）ＩＰＰとＦＰＰを縮合してＧＧＰＰを形成する酵素。

【0042】

ある特定の実施形態では、追加の酵素は天然である。有利な実施形態では、追加の酵素は異種である。ある特定の実施形態では、２つ以上の酵素を１つのポリペプチドに組み合わせてもよい。

【0043】

細胞株
本明細書で提供される本発明の宿主細胞としては、古細菌、原核生物、及び真核生物の細胞が挙げられる。

【0044】

適切な生物宿主細胞としては、限定するものではないが、グラム陽性、グラム陰性、及びグラム可変細菌のいずれかが挙げられる。例としては、限定するものではないが、以下の属に属する細胞が挙げられる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、及びＺｙｍｏｍｏｎａｓ。原核菌株の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｄｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ。特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。

【0045】

適切な古細菌宿主としては、限定するものではないが、以下の属に属する細胞が挙げられる。Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、及びＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ。古細菌株の例としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、及びＡｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ。

【0046】

適切な真核生物宿主としては、限定するものではないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、本方法において有用な酵母としては、微生物寄託（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）で寄託され、以下の属に属する。Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ、Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ、Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ、Ａｒｘｉｏｚｙｍａ、Ａｓｈｂｙａ、Ｂａｂｊｅｖｉａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋａｒａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｅｅｎｉｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ、Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｓｅｇａｗａｅａ、Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ、Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｎｄｏａ、Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍａｌａｓｓｅｒｚｉａ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｒａｋｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｎａｋａｚａｗａｅａ、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｐｏｒｉｏｎ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、及びＺｙｇｏｚｙｍａ。

【0047】

いくつかの実施形態では、宿主微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｄｅｋｋｅｒａ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（前には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓと呼ばれる）、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａとして公知）。いくつかの実施形態では、宿主微生物は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の株、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｓである。

【0048】

好ましい実施形態では、宿主微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。いくつかの実施形態では、宿主は、パン酵母、ＣＥＮ．ＰＫ２、ＣＢＳ ７９５９、ＣＢＳ ７９６０、ＣＢＳ ７９６１、ＣＢＳ ７９６２、ＣＢＳ ７９６３、ＣＢＳ ７９６４、ＩＺ－１９０４、ＴＡ、ＢＧ－１、ＣＲ－１、ＳＡ－１、Ｍ－２６、Ｙ－９０４、ＰＥ－２、ＰＥ－５、ＶＲ－１ ＢＲ－１、ＢＲ－２、ＭＥ－２、ＶＲ－２、ＭＡ－３、ＭＡ－４、ＣＡＴ－１、ＣＢ－１、ＮＲ－１、ＢＴ－１、及びＡＬ－１から選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。いくつかの実施形態では、宿主微生物は、ＰＥ－２、ＣＡＴ－１、ＶＲ－１、ＢＧ－１、ＣＲ－１、及びＳＡ－１から選択されるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株である。特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株は、ＰＥ－２である。別の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株は、ＣＡＴ－１である。別の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの菌株は、ＢＧ－１である。

【0049】

ステビオール配糖体生合成経路
いくつかの実施形態では、ステビオール配糖体生合成経路は、ステビオール配糖体の生合成を触媒することができる酵素をコードするポリヌクレオチドを発現するように細胞を操作することによって、遺伝子改変された宿主細胞において活性化される。

【0050】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）をコードする異種ポリヌクレオチド、コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）をコードする異種ポリヌクレオチド、カウレンシンターゼ（ＫＳ）をコードする異種ポリヌクレオチド、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）をコードする異種ポリヌクレオチド、カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）をコードする異種ポリヌクレオチド、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）をコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＤＰ－グルコーストランスフェラーゼをコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＧＴ７４Ｇ１をコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＧＴ７６Ｇ１をコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＧＴ８５Ｃ２をコードする異種ポリヌクレオチド、ＵＧＴ９１Ｄをコードする異種ポリヌクレオチド、ＥＵＧＴ１１をコードする異種ポリヌクレオチド、及び／またはＵＧＴ４００８７をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、バリアントＧＧＰＰＳ、ＣＤＰＳ、ＫＳ、ＫＯ、ＫＡＨ、ＣＰＲ、ＵＤＰ－グルコーストランスフェラーゼ、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ９１Ｄ、ＥＵＧＴ１１、及び／またはＵＧＴ４００８７をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、バリアント酵素は、参照酵素と比較して、１～最大２０までのアミノ酸置換を有し得る。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドのコード配列は、特定の宿主細胞に対して最適化されたコドンである。

【0051】

ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）
ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．２９）は、ファルネシルピロリン酸のゲラニルゲラニル二リン酸への変換を触媒する。ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼの例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（アクセッション番号ＡＢＤ９２９２６）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（アクセッション番号ＣＡＡ７５５６８）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（アクセッション番号ＡＡＨ６９９１３）、Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ（アクセッション番号ＸＰ＿００２２８８３３９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（アクセッション番号ＺＰ－０５００４５７０）、Ｓｕｌｆｕｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（アクセッション番号ＢＡＡ４３２００）、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．（アクセッション番号ＡＢＣ９８５９６）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アクセッション番号ＭＰ＿１９５３９９）、及びＢｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ（アクセッション番号ＡＦＣ９２７９８．１）のシンターゼ、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号に記載されているシンターゼが挙げられる。

【0052】

コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）
コパリル二リン酸シンターゼ（ＥＣ５．５．１．１３）は、ゲラニルゲラニル二リン酸のコパリル二リン酸への変換を触媒する。コパリル二リン酸シンターゼの例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（アクセッション番号ＡＡＢ８７０９１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ（アクセッション番号ＥＤＹ５１６６７）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｏｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（アクセッション番号ＡＡＣ２８８９５．１）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（アクセッション番号ＡＹ５６２４９０）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アクセッション番号ＮＭ＿１１６５１２）、及びＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（アクセッション番号Ｑ５ＭＱ８５．１）由来のシンターゼ、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号に記載されているシンターゼが挙げられる。

【0053】

カウレンシンターゼ（ＫＳ）
カウレンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１９）は、コパリル二リン酸のカウレン及び二リン酸への変換を触媒する。酵素の例としては、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（アクセッション番号ＡＡＣ２８８９５．１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アクセッション番号Ｑ９ＳＡＫ２）、及びＰｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ（アクセッション番号ＡＤＢ５５７１１．１）の酵素、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号に記載されている酵素が挙げられる。

【0054】

二官能性コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）及びカウレンシンターゼ（ＫＳ）
ＣＤＰＳ－ＫＳ二機能性酵素（ＥＣ５．５．１．１３及びＥＣ４．２．３．１９）も本発明の宿主細胞で使用してもよい。例としては、Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ａｍｙｇｄａｌｉ（アクセッション番号ＢＡＧ３０９６２）、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ ｓｐ．（アクセッション番号Ｏ１３２８４）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ（アクセッション番号ＢＡＦ６１１３５）、及びＧｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（アクセッション番号Ｑ９ＵＶＹ５．１）の酵素、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８Ａ１号、同第２０１４／０３５７５８８Ａ１号、同第２０１５／０１５９１８８号、ＷＯ２０１６／０３８０９５に記載されている酵素が挙げられる。

【0055】

Ｅｎｔ－カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）
本明細書ではカウレンオキシダーゼとも呼ばれるＥｎｔ－カウレンオキシダーゼ（ＥＣ１．１４．１３．８８）は、カウレンのカウレン酸への変換を触媒する。酵素の実例としては、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（アクセッション番号Ｑ５Ｚ５Ｒ４）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（アクセッション番号Ｏ９４１４２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アクセッション番号Ｑ９３ＺＢ２）、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（アクセッション番号ＡＡＱ６３４６４．１）、及びＰｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（ユニプロット（Ｕｎｉｐｒｏｔ）番号Ｑ６ＸＡＦ４）の酵素、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号、米国特許出願公開第２０１４／０３５７５８８Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１８８号、及びＷＯ２０１６／０３８０９５に記載されている酵素が挙げられる。

【0056】

カウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）
ステビオールシンターゼとも呼ばれるカウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＥＣ１．１４．１３）は、カウレン酸のステビオールへの変換を触媒する。酵素の例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（アクセッション番号ＡＣＤ９３７２２）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アクセッション番号ＮＰ＿１９７８７２）、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（アクセッション番号ＸＰ＿００２２８２０９１）、及びＭｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃｕｌａｔａ（アクセッション番号ＡＢＣ５９０７６）の酵素、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１号、同第２０１４／０３５７５８８号、同第２０１５／０１５９１８８号、及びＷＯ２０１６／０３８０９５に記載されている酵素が挙げられる。いくつかの実施形態では、カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドは、バリアントＫＡＨであり得る。いくつかの実施形態では、バリアントＫＡＨは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、この１つ以上のアミノ酸置換は、Ｋ６９Ｒ、Ｖ３４３Ｇ、Ｔ４０３Ｖ、Ｈ４９１Ｐ、Ｐ７２Ｄ、Ｌ６４Ｄ、Ｑ８４Ｃ、Ｌ６４Ｇ、Ｅ２０６Ｄ、Ｙ２３８Ｃ、Ａ２１０Ｇ、Ｌ６４Ｎ、Ｉ２３７Ｃ、Ｌ１１Ｖ、Ｎ２０７Ｆ、Ｍ７３Ｇ、Ｗ８Ｇ、Ｅ６０Ｒ、Ｙ５５Ｓ、Ｎ４７５Ｇ、Ｄ２９２Ｐ、Ｐ１６１Ｃ、Ｋ２６７Ｄ、Ｌ４８５Ｆ、Ａ３９６Ｆ、Ｒ５０７Ａ、Ｐ７２Ｔ、Ｉ１３２Ｇ、Ｎ６１Ｐ、Ｋ１１９Ｖ、Ｔ２２０Ｅ、Ｐ７２Ｇ、Ｑ５１３Ｒ、Ｓ１３３Ｇ、Ｙ５０６Ｖ、Ｋ６９Ｐ、Ｅ６０Ｇ、Ｋ２２４Ｃ、Ｍ７３Ｈ、Ｈ３７９Ｇ、Ｐ７２Ｃ、Ｋ３１４Ｐ、Ｗ２０２Ａ、Ｇ４６６Ｆ、Ｎ４９Ａ、Ｓ３３９Ｇ、Ｎ１６０Ｄ、Ｔ２１６Ｇ、Ｄ１０２Ｙ、Ｆ２４６Ｇ、Ｍ５８Ｐ、Ｔ２２０Ｒ、Ｒ４５８Ｄ、Ｍ５８Ｇ、Ａ６８Ｉ、Ｓ７０Ｐ、Ｆ８８Ｖ、Ｔ２４０Ｄ、Ｌ２０５Ｉ、Ｋ１６７Ｇ、Ｌ２３２Ｍ、Ｓ６２Ｒ、Ｇ５６Ｄ、Ｑ２４４Ｇ、Ａ２４２Ｄ、Ｎ４９Ｒ、Ｑ５１３Ｇ、Ｗ２９Ｔ、Ｌ３０３Ｄ、Ｔ３７８Ｄ、Ｉ５０８Ｌ、Ｗ２０２Ｑ、Ｓ５０５Ｒ、Ｒ２３３Ｃ、Ｉ１０４Ｄ、Ｍ２５８Ｇ、Ｋ６９Ｇ、Ｆ８８Ｄ、Ｆ８８Ｓ、Ａ２１７Ｖ、Ｅ２３０Ｃ、Ｒ５０７Ｇ、Ｇ４６６Ｓ、Ｇ５６Ｓ、Ｅ２３０Ｇ、Ｙ５５Ｇ、Ａ５０３Ｃ、Ｓ４６０Ｉ、Ｉ１２９Ｒ、Ｓ２４５Ｇ、Ｆ２４６Ｓ、Ｑ８４Ｌ、Ｓ１３３Ｒ、Ｔ５０９Ｖ、Ｒ５０７Ｅ、Ｒ２３３Ｔ、Ｖ３０Ｆ、Ａ６８Ｇ、Ｇ５６Ｎ、Ｔ１６２Ｇ、Ａ６８Ｐ、Ｓ１６５Ｄ、Ｋ１１９Ｙ、Ｗ２９Ｃ、Ｓ１６５Ｐ、Ｗ２９Ｖ、Ｉ２８４Ｇ、Ａ２１７Ｌ、Ｑ３３５Ｖ、Ｌ６５Ｓ、Ｆ５３Ｒ、Ｙ５５Ｐ、Ｗ２０２Ｖ、Ｋ２２４Ｖ、Ｗ２９Ａ、Ｈ１６４Ｇ、Ｑ２４４Ｄ、Ｋ２９１Ｃ、Ｌ６５Ｇ、Ｋ１６７Ｓ、Ｃ３２７Ｉ、Ｋ２９１Ｓ、Ｄ５７Ｇ、Ｋ１６７Ｈ、Ｎ１６０Ｔ、Ｗ２０２Ｃ、Ａ２４２Ｇ、Ｆ８８Ｒ、Ｉ１０４Ｎ、Ｇ４６６Ｄ、Ｎ４７５Ｄ、Ｋ１１９Ｓ、Ｔ１２３Ｄ、Ｔ２１６Ａ、Ｓ３３９Ａ、Ｐ１６１Ｄ、Ｉ１０４Ｒ、Ｌ５４Ｇ、Ｍ１７１Ｆ、Ｌ２３２Ｙ、Ｄ２９３Ｃ、Ｖ３４０Ａ、Ｔ１６２Ａ、Ａ２９７Ｖ、Ｉ１０４Ｈ、Ｆ３３２Ｌ、Ａ２３６Ｒ、Ｋ２２４Ｉ、Ｓ４５２Ｄ、Ｉ１０４Ａ、Ｖ３４０Ｓ、Ｆ２２９Ｙ、Ａ２９７Ｙ、及びＡ２９７Ｆから選択される。いくつかの実施形態では、この１つ以上のアミノ酸置換は、Ａ２９７Ｖ、Ｉ１０４Ｈ、Ｆ３３２Ｌ、Ａ２３６Ｒ、Ｋ２２４Ｉ、Ｓ４５２Ｄ、Ｉ１０４Ａ、Ｉ１０４Ａ、Ｖ３４０Ｓ、Ｆ２２９Ｙ、Ａ２９７Ｙ、及びＡ２９７Ｆから選択される。いくつかの実施形態では、この１つ以上のアミノ酸置換は、Ｓ４５２Ｄ、Ｉ１０４Ａ、Ｖ３４０Ｓ、Ｆ２２９Ｙ、Ａ２９７Ｙ、及びＡ２９７Ｆから選択される。いくつかの実施形態では、この１つ以上のアミノ酸置換は、Ｎ１４６Ｗ、Ａ２９７Ｙ、Ａ２３６Ｓ、Ｖ９Ｓ、Ｇ４６６Ｆ、Ｔ２８３Ｄ、Ｔ１４２Ｇ、Ｔ４２５Ｖ、Ｌ４５９Ｃ、Ｔ２８３Ａ、Ｔ２８３Ｇ、Ｓ４６０Ｖ、Ｓ１３３Ｇ、Ｉ１２９Ｖ、Ｗ５２Ｇ、Ｓ５０５Ｉ、Ｉ２４３Ｔ、Ｖ３４０Ｓ、Ｓ４６０Ｃ、Ｓ４５２Ｄ、Ｌ１１８Ｉ、Ｓ５０５Ｖ、Ｔ１２３Ｄ、Ｗ５２Ｃ、Ｓ４６０Ｉ、Ｓ４５７Ｇ、Ｗ５２Ｒ、Ｗ５２Ｎ、Ｎ１４６Ｔ、Ｇ４６６Ａ、及びＷ５２Ｔから選択される。いくつかの実施形態では、この１つ以上のアミノ酸置換は、Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ、Ｗ５２Ｔ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ、Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ、Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ、及びＷ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ、及びＷ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａから選択される。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ｗ５２Ｔ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｇ４６６Ａを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ａ１４５Ｇ／Ｎ１４６Ｆ／Ａ２９７Ｙを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ／Ｓ４６０Ｉを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ｗ５２Ｎ／Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ｆ３３２Ｌ／Ｓ４５２Ｄを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙを含む。いくつかの実施形態では、このアミノ酸置換は、Ａ２９７Ｙを含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、Ｑ８４Ｒ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙを含む。いくつかの実施形態では、このバリアントポリペプチドは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１から選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、このバリアントポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このバリアントポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このバリアントポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このバリアントポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、このバリアントポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端シグナル配列をコードするアミノ酸が、異種植物ｐ４５０ポリペプチドのＮ末端シグナル配列をコードする対応するアミノ酸配列で置き換えられる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端シグナル配列は、配列番号１のアミノ酸１～２５に対応する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端シグナル配列に対応するアミノ酸配列は、配列番号２２を含む。

【0057】

シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）
上記のＫＯ及び／またはＫＡＨの活性には、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．４）が必要である。酵素の例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ（アクセッション番号ＡＢＢ８８８３９）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（アクセッション番号ＮＰ＿１９４１８３）、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ（アクセッション番号ＣＡＥ０９０５５）、及びＡｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ（アクセッション番号ＡＢＣ４７９４６．１）の酵素、ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１、米国特許出願公開第２０１４／０３５７５８８号、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１８８号、及びＷＯ２０１６／０３８０９５に記載される酵素が挙げられる。

【0058】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ７４Ｇ１（ＵＧＴ７４Ｇ１）
ＵＧＴ７４Ｇ１は、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール１９－ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして、及びウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１３－Ｏ－グルコシド１９－ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能することができる。したがって、ＵＧＴ７４Ｇ１は、ステビオールを１９－グリコシドに、ステビオールを１９－グリコシドに、ステビオールモノシドをルブソシドに、及びステビオシドをステビオシドに変換することができる。ＵＧＴ７４Ｇ１は、Ｒｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｐｌａｎｔ Ｊ．，ｖｏｌ．４１，ｐｐ．５６－６７、米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１号、ＷＯ２０１６／０３８０９５、及びアクセッション番号ＡＡＲ０６９２０．１に記載されている。

【0059】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ７６Ｇ１（ＵＧＴ７６Ｇ１）
ＵＧＴ７６Ｇ１は、グルコース部分を、アクセプター分子ステビオールグリコシド（ここで、グリコシド＝Ｇｌｃｂ（１－＞ ２）Ｇｌｃ）のＣ－３’位置に転移し得る。この化学的性質は、アクセプター分子のＣ－１３－Ｏ－結合型グルコース、またはＣ－１９－Ｏ－結合型グルコースアクセプター分子のいずれで発生してもよい。したがって、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ウリジン５’－ジホスホグルコシルトランスフェラーゼとして、以下に対して機能し得る。（１）Ｒｅｂ Ｂを形成するベータ結合におけるステビオシド上の１３－Ｏ－結合型グルコースのＣ－３’位置、（２）ＲｅｂＡを形成するベータ結合におけるステビオシド上の１９－Ｏ－結合型グルコースのＣ－３’位置、及び（３）ＲｅｂＭを形成するベータ結合におけるＲｅｂＤ上の１９－Ｏ－結合型グルコースのＣ－３’位置。ＵＧＴ７６Ｇ１は、Ｒｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｐｌａｎｔ Ｊ．、ｖｏｌ．４１，ｐｐ．５６－６７、米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１、ＷＯ２０１６／０３８０９５、及びアクセッション番号ＡＡＲ０６９２．１に記載されている。

【0060】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ８５Ｃ２（ＵＧＴ８５Ｃ２）
ＵＧＴ８５Ｃ２は、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール１３－ＯＨトランスフェラーゼとして、及びウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１９－Ｏ－グルコシド１３－ＯＨトランスフェラーゼとして機能することができる。ＵＧＴ８５Ｃ２は、ステビオールをステビオールモノシドに変換することができ、かつまた１９－グリコシドをルブソシドに変換することができる。ＵＧＴ８５Ｃ２酵素の例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素が挙げられる。例えば、Ｒｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５），Ｐｌａｎｔ Ｊ．，ｖｏｌ．４１，ｐｐ．５６－６７、米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１、ＷＯ２０１６／０３８０９５；及びアクセッション番号ＡＡＲ０６９１６．１を参照のこと。

【0061】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ９１Ｄ（ＵＧＴ９１Ｄ）
ＵＧＴ９１Ｄは、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ステビオール－１３－Ｏ－グルコシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分をアクセプター分子、ステビオール－１３－Ｏ－グルコシド（ステビオールモノシド）の１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’に転移してステビオールビオシドを生成することができる。ＵＧＴ９１Ｄは、ウリジン５’－ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分をアクセプター分子であるルブソシドの１３－Ｏ－グルコースのＣ－２’に転移してステビオシドを提供することができる。ＵＧＴ９１Ｄはまた、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、またはＵＧＴ９１Ｄ様３とも呼ばれる。ＵＧＴ９１Ｄ酵素の例としては、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａの酵素が挙げられる：例えば、アクセッション番号ＡＣＥ８７８５５．１、米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１、及びＷＯ２０１６／０３８０９５を参照のこと。

【0062】

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ４００８７（ＵＧＴ４００８７）
ＵＧＴ４００８７は、グルコース部分をＲｅｂ Ａの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位置に移して、Ｒｅｂ Ｄを生成することができる。ＵＧＴ４００８７はまた、グルコース部分をステビオシドの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位置に移して、ＲｅｂＥを生成することができる。ＵＧＴ４００８７の例としては、アクセッション番号ＸＰ＿００４９８２０５９．１及びＷＯ２０１８／０３１９５５のものが挙げられる。

【0063】

ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換することができる追加のウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴＡＤ）
ＵＧＴ４００８７に加えて、他のＵＧＴＡＤが、グルコース部分をＲｅｂ Ａの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位置に移して、Ｒｅｂ Ｄを生成することができる。ＵＧＴＡＤはまた、グルコース部分をステビオシドの１９－Ｏ－グルコースのＣ－２’位置に移してＲｅｂＥを生成することができる。ＵＧＴＡＤの例としては、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来のＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１（ＥＵＧＴ１１とも呼ばれる（ＷＯ２０１３／０２２９８９及びアクセッション番号ＸＰ＿０１５２９１４１．１を参照））、Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ由来のＳ１＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１（ＵＧＴＳＬ２とも呼ばれる（ＷＯ２０１４／１９３８８８及びアクセッション番号ＸＰ＿００４２５０４８５１を参照のこと））、ｓｒ．ＵＧＴ＿９２５７７８、Ｂｄ＿ＵＧＴ０８４０（アクセッション番号ＸＰ＿００３５６０６６９．１を参照のこと）、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１（アクセッション番号ＢＡＪ９４０５５．１を参照のこと）、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０（アクセッション番号ＸＰ＿０１０２３０８７１．１を参照のこと）、及びＯＢ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅ（アクセッション番号ＸＰ＿００６６５０４５５１を参照のこと）が挙げられる。

【0064】

ＭＥＶ経路ＦＰＰ及び／またはＧＧＰＰ生産
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ＦＰＰ及び／またはＧＧＰＰの形成に有用な、ＭＥＶ経路の１つ以上の異種酵素を含む。ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素としては、アセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡと縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素、２分子のアセチルＣｏＡを縮合してアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素、アセトアセチルＣｏＡをアセチルＣｏＡと縮合させてＨＭＧ－ＣｏＡを形成する酵素、またはＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素が挙げられる。さらに、遺伝子改変された宿主細胞は、メバロン酸をメバロン酸５－リン酸にリン酸化するＭＥＶ経路酵素、メバロン酸５－リン酸をメバロン酸５－ピロリン酸に変換するＭＥＶ経路酵素、メバロン酸５－ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換するＭＥＶ経路酵素、またはイソペンテニルピロリン酸をジメチルアリル二リン酸に変換するＭＥＶ経路酵素を含み得る。特に、ＭＥＶ経路の１つ以上の酵素は、アセチル－ＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡシンテターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンチル二リン酸：ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩまたはＩＰＰイソメラーゼ）から選択される。本発明の遺伝子改変された宿主細胞は、１つ以上のＭＥＶ経路酵素のコード配列を含む１つ以上の異種ヌクレオチド配列から、ＭＥＶの１つ以上の異種酵素を発現し得る。

【0065】

いくつかの実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換し得る酵素をコードする異種核酸を含む。さらに、宿主細胞は、ＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合してポリプレニル化合物を形成し得る酵素をコードする異種核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された宿主細胞は、ＩＰＰまたはポリプレニルを改変して、ＦＰＰなどのイソプレノイド化合物を形成し得る酵素をコードする異種核酸をさらに含む。

【0066】

アセチルＣｏＡのアセトアセチルＣｏＡへの変換
遺伝子改変された宿主細胞は、２分子のアセチル補酵素Ａを縮合してアセトアセチルＣｏＡ（アセチルＣｏＡチオラーゼ）を形成し得る酵素をコードする異種核酸を含み得る。アセチルＣｏＡチオラーゼをコードするヌクレオチド配列の例としては以下が挙げられる。（アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３ ＲＥＧＩＯＮ：２３２４１３１．２３２５３１５（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））、（Ｄ４９３６２（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ））、及び（Ｌ２０４２８（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））。

【0067】

アセチル－ＣｏＡチオラーゼは、２分子のアセチル－ＣｏＡの可逆的縮合を触媒してアセトアセチル－ＣｏＡを生成するが、この反応は熱力学的に有利ではない。アセトアセチルＣｏＡチオール分解は、アセトアセチルＣｏＡ合成よりも有利である。アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＡＡＣＳ）（アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシルトランスフェラーゼとも呼ばれる；ＥＣ ２．３．１．１９４）は、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する。アセチルＣｏＡチオラーゼとは対照的に、ＡＡＣＳ触媒によるアセトアセチルＣｏＡ合成は、マロニルＣｏＡの関連する脱炭酸に起因して、本質的にエネルギーに有利な反応である。さらに、ＡＡＣＳは、アセトアセチルＣｏＡに対してチオール分解活性を示さないため、反応は不可逆的である。

【0068】

アセチル－ＣｏＡチオラーゼ及び異種ＡＤＡ及び／またはホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）を発現する細胞において、アセトアセチル－ＣｏＡチオール分解に有利なアセチル－ＣｏＡチオラーゼによって触媒される可逆的反応は、大きなアセチル－ＣｏＡプールをもたらす場合がある。ＡＤＡの可逆的活性を考慮すると、このアセチルＣｏＡプールは、アセチルＣｏＡをアセトアルデヒドに変換する逆反応へとＡＤＡを向かわせる可能性があり、それによってＡＤＡがアセチルＣｏＡの生成にもたらす利点を減少させる。同様に、ＰＴＡの活性は可逆的であり、したがって、大きなアセチルＣｏＡプールは、アセチルＣｏＡをアセチルホスフェートに変換する逆反応に向けてＰＴＡを駆動し得る。したがって、いくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡを強力に引き寄せて、ＡＤＡ及びＰＴＡの順方向反応を駆動するために、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞のＭＥＶ経路は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを利用して、アセトアセチル－ＣｏＡを、アセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡから形成する。

【0069】

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＣＬ１９０株から得られたＡＡＣＳを使用してもよい（Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０），ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１０７，ｐｐ．１１２６５－１１２７０を参照のこと）。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＣＬ１９０株由来の核酸配列をコードする代表的なＡＡＣＳには、アクセッション番号ＡＢ５４０１３１．１の配列を含み、及び対応するＡＡＣＳタンパク質配列には、アクセッション番号Ｄ７ＵＲＶ０及びＢＡＪ１００４８の配列を含む。本発明に有用な他のアセトアセチルＣｏＡシンターゼとしては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．（アクセッション番号ＡＢ１８３７５０、ＫＯ－３９８８ ＢＡＤ８６８０６、ＫＯ－３９８８ ＡＢ２１２６２４、及びＫＯ－２９８８ ＢＡＥ７８９８３を参照のこと）、Ｓ．ａｎｕｌａｔｕｓ株９６６３（アクセッション番号ＦＮ１７８４９８及びＣＡＸ４８６６２を参照のこと）、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｓｐ．Ａ４０６４４（アクセッション番号ＡＢ１１３５６８及びＢＡＤ０７３８１を参照のこと）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｃ（アクセッション番号ＮＺ＿ＡＣＥＷ０１００００６４０及びＺＰ＿０５５１１７０２を参照のこと）；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ ＤＳＭ ４３１１１（アクセッション番号ＮＺ＿ＡＢＵＩ０１００００２３及びＺＰ＿０４３３５２８８を参照のこと）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ Ａｇｙ９９（アクセッション番号ＮＣ＿００８６１１及びＹＰ＿９０７１５２を参照のこと）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ Ｍ（アクセッション番号ＮＣ＿０１０６１２及びＹＰ＿００１８５１５０２を参照のこと）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｍｇ１（参照、アクセッション番号ＮＺ＿ＤＳ５７０５０１及びＺＰ＿０５００２６２６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＡＡ４（アクセッション番号ＮＺ＿ＡＣＥＶ０１００００３７及びＺＰ＿０５４７８９９２を参照）、Ｓ．ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓＮＲＲＬ １５９９８（アクセッション番号ＮＺ＿ＡＢＹＢ０１０００２９５及びＺＰ＿０４６９６７６３を参照）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＡＣＴＥ（アクセッション番号ＮＺ＿ＡＤＦＤ０１００００３０及びＺＰ＿０６２７５８３４を参照）、Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ ＤＳＭ ４０７３６（アクセッション番号ＮＺ＿ＡＣＥＺ０１００００３１及びＺＰ＿０５５２９６９１を参照）、Ｆｒａｎｋｉａ ｓｐ．ＣｃＩ３（アクセッション番号ＮＣ＿００７７７７及びＹＰ＿４８０１０１を参照）、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ（アクセッション番号ＮＣ＿０１８６８１及びＹＰ＿００６８１２４４０．１を参照）、及びＡｕｓｔｗｉｃｋｉａ ｃｈｅｌｏｎａｅ（アクセッション番号ＮＺ＿ＢＡＧＺ０１０００００５及びＺＰ＿１０９５０４９３．１を参照）のシンターゼが挙げられる。追加の適切なアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼとしては、米国特許出願公開番号２０１０／０２８５５４９及び２０１１／０２８１３１５に記載されているシンターゼが挙げられる。

【0070】

本明細書で提供される組成物及び方法においても有用なアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼとしては、本明細書に記載のアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼのいずれかの「誘導体」であると言われる分子が挙げられる。そのような「誘導体」は、以下の特徴を有する。（１）本明細書に記載のアセトアセチル－ＣｏＡシンターゼのいずれかと実質的な相同性を共有する、及び（２）アセチル－ＣｏＡとマロニル－ＣｏＡとの不可逆的縮合を触媒してアセトアセチル－ＣｏＡを形成することができる。アセトアセチル－ＣｏＡシンターゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が、アセトアセチル－ＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同じである場合、アセトアセチル－ＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列と「実質的な相同性」を共有すると言われる。

【0071】

アセチルＣｏＡのＨＭＧ－ＣｏＡへの変換
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アセトアセチル－ＣｏＡをアセチル－ＣｏＡの別の分子と縮合して、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）を形成することができる酵素、例えば、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の例としては以下が挙げられる。（ＮＣ＿００１１４５．補体１９０６１．２０５３６；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ９６６１７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ８３８８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＢ０３７９０７；Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ ｇｒｉｓｅｏｌａ）、（ＢＴ００７３０２；Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、及び（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ ｔａｇ ＳＡＶ２５４６、ＧｅｎｅＩＤ １１２２５７１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）。

【0072】

ＨＭＧ－ＣｏＡのメバロン酸への変換
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＭＧ－ＣｏＡをメバロン酸に変換し得る酵素、例えばＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨを使用するヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡレダクターゼ－ＣｏＡレダクターゼであり得る。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．３４；ＥＣ １．１．１．８８）は、（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡから（Ｒ）－メバロン酸への還元的脱アシル化を触媒し、クラスＩとクラスＩＩのＨＭＧｒの２つのクラスに分類され得る。クラスＩには真核生物とほとんどの古細菌の酵素が含まれ、クラスＩＩには特定の原核生物と古細菌のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼが含まれる。配列の相違に加えて、２つのクラスの酵素もそれらの補因子の特異性に関して異なる。ＮＡＤＰＨのみを利用するクラスＩ酵素とは異なり、クラスＩＩ ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨを区別する能力が異なる（例えば、Ｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８６，ｐｐ．１９２７－１９３２を参照のこと）。選ばれたクラスＩＩＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのための補因子特異性を表１に示す。

【表1】

【0073】

本発明に有用なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼとしては、補因子としてＮＡＤＨを利用することができるＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ．由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、補因子としてＮＡＤＨ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ、またはＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来のＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのみを利用することができる。

【0074】

いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉに由来する。ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ １．１．１．８８）をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉの野生型ｍｖａＡ遺伝子の配列は、以前に記載されている（Ｂｅａｃｈ ａｎｄ Ｒｏｄｗｅｌｌ，（１９８９），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７１，ｐｐ．２９９４－３００１を参照のこと）。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉの代表的なｍｖａＡ ヌクレオチド配列には、アクセッション番号Ｍ２４０１５が挙げられる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｅｖａｌｏｎｉｉの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、アクセッション番号ＡＡＡ２５８３７、Ｐ１３７０２、及びＭＶＡＡ＿ＰＳＥＭＶが挙げられる。

【0075】

いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉに由来する。Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列には、アクセッション番号ＮＣ＿００６５６９．１が挙げられる。Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列には、アクセッション番号ＹＰ＿１６４９９４が含まれている。

【0076】

いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓに由来する。Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列には、ＮＣ＿０１０００２ ＲＥＧＩＯＮ：補体（３１９９８０．．３２１２６９）が含まれる。Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓの代表的なＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列には、アクセッション番号ＹＰ＿００１５６１３１８が含まれている。

【0077】

いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（Ｃｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２），Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５９，ｐｐ．１３０１－１３０７を参照のこと）由来である。

【0078】

本発明の実施に有用なＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼはまた、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ及びＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来の本明細書に記載の任意のＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの「誘導体」であると言われる分子を含む。そのような「誘導体」は、以下の特徴を有する。（１）本明細書に記載のＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのいずれかと実質的な相同性を共有する、及び（２）補因子としてＮＡＤＨを優先的に使用しながら、（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡから（Ｒ）－メバロン酸への還元的脱アシル化を触媒することができる。ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同じである場合、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼと「実質的な相同性」を共有すると言われている。

【0079】

本明細書で使用される場合、「ＮＡＤＨを使用する」という表現は、例えば、ＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨに対してより高い比活性を示すことにより、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼが補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨに対して選択的であることを意味する。補因子としてのＮＡＤＨの選択性は、ｋｃａｔ^{（ＮＡＤＨ）}／ｋｃａｔ^{（ＮＡＤＰＨ）}比として表される。本発明のＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５または２５を超えるｋｃａｔ^{（ＮＡＤＨ）}／ｋｃａｔ^{（ＮＡＤＰＨ）}比を有し得る。ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨのみを使用する場合がある。例えば、ＮＡＤＨのみを使用するＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは インビトロでＮＡＤＨを唯一の補因子として供給されて、ある程度の活性を示し、ＮＡＤＰＨを唯一の補因子として供給した場合は検出可能な活性を示さない。補因子としてＮＡＤＨを優先するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼを同定するために、当技術分野で知られている補因子特異性を決定するための任意の方法を利用してもよい（例えば、（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．９，ｐｐ．１２２６－１２３４）及び（Ｗｉｌｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１８２，ｐｐ．５１４７－５１５２を参照のこと）。

【0080】

場合によっては、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、例えば、補因子結合ポケットの部位特異的変異誘発を通じて、ＮＡＰＤＨよりもＮＡＤＨに対して選択的であるように操作される。ＮＡＤＨ選択性を操作する方法は、Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００７），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５３、ｐｐ．３０４４－３０５４）、及びＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの補因子特異性を決定するための方法は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．９，ｐｐ．１２２６－１２３４）に記載される。

【0081】

ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、メバロン酸分解経路を本来含む宿主種、例えば、その唯一の炭素源としてメバロン酸を異化する宿主種に由来し得る。これらの場合、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼは、通常、そのネイティブ宿主細胞内で内部移行された（Ｒ）－メバロン酸から（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡへの酸化的アシル化を触媒し、逆反応、すなわち、メバロン酸生合成経路を含む遺伝子改変宿主細胞における（Ｓ）－ＨＭＧ－ＣｏＡの（Ｒ）－メバロン酸への還元的脱アシル化を触媒するために利用される。唯一の炭素源としてメバロネート上で増殖することができる原核生物は、以下によって記載されている：（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，ｖｏｌ．１７１，ｐｐ．６４６８－６４７２）；（Ｂｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１７１，ｐｐ．２９９４－３００１）；Ｂｅｎｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２４５，ｐｐ．３７５５－３７６２）；（Ｆｉｍｏｎｇｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９６５），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．４，ｐｐ．２０８６－２０９０）；Ｓｉｄｄｉｑｉ ｅｔ ａｌ．，（１９６２），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，ｖｏｌ．８，ｐｐ．１１０－１１３）；（Ｓｉｄｄｉｑｉ ｅｔ ａｌ．，（１９６７），Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．９３，ｐｐ．２０７－２１４）；ａｎｄ（Ｔａｋａｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８３），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，ｖｏｌ．１１０，ｐｐ．１８７－１９３）。

【0082】

宿主細胞は、ＮＡＤＨを使用するＨＭＧｒ及びＮＡＤＰＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼの両方を含み得る。ＮＡＤＰＨを使用するＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードするヌクレオチド配列の例としては、（ＮＭ＿２０６５４８、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、（ＮＣ＿００２７５８、遺伝子座タグＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ １１２２５７０、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、（ＡＢ０１５６２７、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＫＯ ３９８８）、（ＡＸ１２８２１３、短縮型ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼをコードする配列を提供、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及び（ＮＣ＿００１１４５：補体（１１５７３４．１１８８９８、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。

【0083】

メバロン酸からメバロン酸－５－リン酸塩への変換
宿主細胞は、メバロン酸をメバロン酸５－リン酸に変換することができる酵素、例えば、メバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含んでもよい。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、（Ｌ７７６８８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）及び（Ｘ５５８７５；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。

【0084】

メバロン酸－５－リン酸塩からメバロン酸－５－ピロリン酸塩への変換
宿主細胞は、メバロン酸５－リン酸塩をメバロン酸５－ピロリン酸塩に変換することができる酵素、例えば、ホスホメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含んでもよい。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、以下が挙げられる。（ＡＦ４２９３８５、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＮＭ＿００６５５６、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、及び（ＮＣ＿００１１４５．補体７１２３１５．７１３６７０、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。

【0085】

メバロン酸－５－ピロリン酸のＩＰＰへの変換
宿主細胞は、メバロン酸５－ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）、に変換することができる酵素、例えば、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含み得る。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては：（Ｘ９７５５７、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＦ２９００９５、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、及び（Ｕ４９２６０、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）が挙げられる。

【0086】

ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの変換
宿主細胞は、ＭＥＶ経路を介して生成されたＩＰＰをジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、例えば、ＩＰＰイソメラーゼに変換することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含み得る。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．３０３１６３５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、及び（ＡＦ０８２３２６、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）が挙げられる。

【0087】

ポリプレニルシンターゼ
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰ及び／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合して５つを超える炭素を含むポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。

【0088】

宿主細胞は、１分子のＩＰＰを１分子のＤＭＡＰＰと縮合して、１分子のゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）を形成することができる酵素、例えば、ＧＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含み得る。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる。（ＡＦ５１３１１１、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１２、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１３、Ａｂｉｅｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ５３４６８６、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ５３４６８７、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｍａｊｕｓ）、（Ｙ１７３７６、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＥ０１６８７７，Ｌｏｃｕｓ ＡＰ１１０９２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、ＡＴＣＣ １４５７９）、（ＡＪ２４３７３９、Ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、（ＡＹ５３４７４５、Ｃｌａｒｋｉａ ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ９５３５０８、Ｉｐｓ ｐｉｎｉ）、（ＤＱ２８６９３０、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＡＦ１８２８２８、Ｍｅｎｔｈａ ｘ ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＡＦ１８２８２７、Ｍｅｎｔｈａ ｘ ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＭＰＩ２４９４５３、Ｍｅｎｔｈａ ｘ ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＰＺＥ４３１６９７、Ｌｏｃｕｓ ＣＡＤ２４４２５、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、（ＡＹ８６６４９８、Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ ｋｕｒｒｏｏａ）、（ＡＹ３５１８６２、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、及び（ＡＦ２０３８８１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＦ１２８４３、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）。

【0089】

宿主細胞は、２分子のＩＰＰを１分子のＤＭＡＰＰと縮合するか、またはＩＰＰの分子をＧＰＰの分子に付加して、ファルネシルピロリン酸の分子（「ＦＰＰ」）を形成することができる酵素、例えば、ＦＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含み得る。ＦＰＰシンターゼをコードするヌクレオチド配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる。（ＡＴＵ８０６０５、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＡＵ３６３７６、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）、（ＡＦ４６１０５０、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ）、（Ｄ００６９４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２）、（ＡＥ００９９５１，Ｌｏｃｕｓ ＡＡＬ９５５２３、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ＡＴＣＣ ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＣＰ０００００９、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＷ６００３４、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ６２１Ｈ）、（ＡＦ０１９８９２、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、（ＨＵＭＦＡＰＳ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、（ＬＡＵ１５７７７、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）、（ＬＡＵ２０７７１、Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）、（ＡＦ３０９５０８、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、（ＰＡＦＰＳ１、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＰＡＦＰＳ２、Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＲＡＴＦＡＰＳ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＹＳＣＦＰＰ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｄ８９１０４、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、（ＣＰ０００００３，Ｌｏｃｕｓ ＡＡＴ８７３８６、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＣＰ００００１７，Ｌｏｃｕｓ ＡＡＺ５１８４９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＮＣ＿００８０２２，Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿５９８８５６、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３，Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿６００８４５、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４，Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿６０２８３２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＭＧＡＳ１０７５０）、（ＭＺＥＦＰＳ、Ｚｅａ ｍａｙｓ）、（ＡＥ０００６５７、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ０６９１３、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、（Ｄ８４４３２，Ｌｏｃｕｓ ＢＡＡ１２５７５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、（Ｕ１２６７８，Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ２８８９４、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ ＵＳＤＡ １１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４０、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ＿８７３７５４、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ ３５０００ＨＰ）、（Ｌ４２０２３、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＣ２３０８７、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ ＫＷ２０）、（Ｊ０５２６２、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＹＰ＿３９５２９４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ ｓｕｂｓｐ．ｓａｋｅｉ ２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３，Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿０００２７３、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ ｓｔｒ．Ｆｉｏｃｒｕｚ Ｌ１－１３０）、（ＡＢ００３１８７、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４６、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿２０８７６８、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ ＦＡ １０９０）、（Ｕ０００９０，Ｌｏｃｕｓ ＡＡＢ９１７５２、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、（ＣＰ００００３１，Ｌｏｃｕｓ ＡＡＶ９３５６８、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉ ＤＳＳ－３）、（ＡＥ００８４８１、Ｌｏｃｕｓ ＡＡＫ９９８９０、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ６）、及び（ＮＣ＿００４５５６、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ ７７９７０６、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）。

【0090】

さらに、宿主細胞は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰ、またはＩＰＰとＦＰＰを組み合わせてゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）を形成し得る酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含み得る。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる。（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＢＴ００５３２８、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１９８４５、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０，Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００７４３０５２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ，ＡＴＣＣ ３５６４６ ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４，Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００１４４５０９、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ ｓｕｂｓｐ．ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、ＡＴＣＣ ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＡＹ３７１３２１、Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ）、（ＡＢ０５５４９６、Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＡＢ０１７９７１、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＭＣＩ２７６１２９、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ ｆ．ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ）、（ＡＢ０１６０４４、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８，Ｌｏｃｕｓ ＮＣＵ０１４２７、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、（ＮＣＵ２０９４０、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、Ｌｏｃｕｓ ＺＰ＿００９４３５６６、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＳＣＵ３１６３２、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＢ０１６０９５、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）、（ＳＡＧＧＰＳ、Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ）、（ＳＳＯＧＤＳ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、（ＮＣ＿００７７５９、Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿４６１８３２、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＳＢ）、（ＮＣ＿００６８４０，Ｌｏｃｕｓ ＹＰ＿２０４０９５、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＥＳ１１４）、（ＮＭ＿１１２３１５、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＥＲＷＣＲＴＥ、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、（Ｄ９００８７，Ｌｏｃｕｓ ＢＡＡ１４１２４、Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）、（Ｘ５２２９１、Ｌｏｃｕｓ ＣＡＡ３６５３８、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、（ＡＦ１９５１２２，Ｌｏｃｕｓ ＡＡＦ２４２９４、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、及び（ＮＣ＿００４３５０、Ｌｏｃｕｓ ＮＰ＿７２１０１５、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ＵＡ１５９）。

【0091】

メバロン酸経路の酵素の例が上に記載されているが、ある特定の実施形態では、ＤＸＰ経路の酵素を、本明細書で記載された宿主細胞、組成物及び方法においてＤＭＡＰＰ及びＩＰＰを生成するための代替または追加の経路として使用することができる。ＤＸＰ経路の酵素をコードする酵素及び核酸は、当技術分野（例えば、ＷＯ２０１２／１３５５９１）で周知であり、かつ特徴付けられている。

【0092】

ステビオール配糖体の製造方法
本発明は、（ａ）ステビオール配糖体を生成することができる本明細書で記載の任意の遺伝子改変宿主細胞の集団を、炭素源を有する培地において、ステビオール配糖体化合物を作成するために適切な条件下で培養すること、及び（ｂ）この培地からステビオール配糖体化合物を回収することによって、ステビオールグリコシドの生成をもたらす。

【0093】

遺伝子改変された宿主細胞は、遺伝子改変を有さない親細胞、または遺伝子改変のサブセットのみを有するがそれ以外は遺伝的に同一である親細胞と比較して、増加した量のステビオールグリコシドを産生する。いくつかの実施形態では、増加量は、例えば、収量、生産、及び／または生産性において、１リットルの細胞培養物あたりのグラム数、乾燥細胞重量１グラムあたりのミリグラム数、細胞培養の単位容積あたり、乾燥細胞重量の単位あたり、単位時間あたりの細胞培養の単位体積あたり、または単位時間あたり乾燥単位細胞重量あたり、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、または１００％を超える。

【0094】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発酵培地１リットルあたり約１グラムを超える高レベルのステビオール配糖体を産生し得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発酵培地１リットルあたり約５グラムを超える高レベルのステビオール配糖体を産生する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発酵培地１リットルあたり約１０グラムを超える高レベルのステビオール配糖体を産生する。いくつかの実施形態では、ステビオール配糖体は、細胞培養１リットルあたり、約１０～約５０グラム、約１０～約１５グラム、約１５グラムを超える、約２０グラムを超える、約２５グラムを超える、または約４０グラムを超える量で生成される。

【0095】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、乾燥細胞重量１グラムあたり約５０ミリグラムを超える高レベルのステビオール配糖体を産生する。いくつかのそのような実施形態では、ステビオール配糖体は、乾燥細胞重量１グラムあたり、約５０～約１５００ミリグラム、約１００ミリグラムを超える、約１５０ミリグラムを超える、約２００ミリグラムを超える、約２５０ミリグラムを超える、約５００ミリグラムを超える、約７５０ミリグラムを超える、または約１０００ミリグラムを超える量で産生される。

【0096】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞培養の単位容積あたり、親細胞によって生成されるステビオール配糖体のレベルよりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上高い上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。

【0097】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単位乾燥細胞重量あたり、親細胞によって生成されるステビオール配糖体のレベルよりも、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上高い上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。

【0098】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単位時間あたり、細胞培養の単位容積あたり、親細胞によって生成されるステビオール配糖体のレベルよりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上高い上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。

【0099】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単位時間あたり、乾燥細胞重量あたり、親細胞によって生成されるステビオール配糖体のレベルよりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍以上高い上昇したレベルのステビオール配糖体を産生する。

【0100】

ほとんどの実施形態では、宿主細胞による上昇したレベルのステビオール配糖体の産生は、誘導化合物の存在によって誘導可能である。そのような宿主細胞は、誘導化合物の非存在下で容易に操作され得る。次いで、上昇した誘導化合物を添加して、宿主細胞による高レベルのステビオール配糖体の産生を誘導する。他の実施形態では、宿主細胞による上昇したレベルのステビオール配糖体の産生は、例えば、増殖温度、培地成分などの培養条件を変えることによって誘導可能である。

【0101】

培地及び条件
微生物培養物の維持及び増殖のための材料及び方法は、微生物学または発酵科学の当業者に周知である（例えば、Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６を参照のこと）。宿主細胞の特定の要件、発酵、及びプロセスに応じて、適切な培養培地、ｐＨ、温度、及び好気性、微好気性、または嫌気性条件のための要件を考慮する必要がある。

【0102】

本明細書で提供されるステビオール配糖体を産生する方法は、細胞培養プレート、マイクロタイタープレート、フラスコまたは発酵槽を含むがこれらに限定されない適切な容器内の適切な培養培地（例えば、パントテン酸補充ありまたはなし）で実施され得る。さらに、この方法は、微生物製品の工業生産を支援するために当技術分野で公知の任意の規模の発酵で実施し得る。撹拌槽型発酵槽、エアリフト発酵槽、気泡発酵槽、またはそれらの任意の組み合わせを含む、任意の適切な発酵槽を使用してもよい。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主細胞として利用する特定の実施形態では、株は、ＫｏｓａｒｉｃらによってＵｌｌｍａｎｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．３９８－４７３，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＤａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙに詳細に記載される発酵槽で増殖され得る。

【0103】

いくつかの実施形態では、培養培地は、ステビオール配糖体を産生することができる遺伝子改変微生物が存続し得る任意の培養培地である。培養培地は、同化可能な炭素、窒素、及びリン酸塩源を含む水性培地であり得る。このような培地はまた、適切な塩、ミネラル、金属、及びその他の栄養素も含んでもよい。炭素源及び各必須細胞栄養素は、発酵培地に段階的または連続的に添加してもよく、必要な各栄養素は、例えば、炭素源をバイオマスに変換する細胞の代謝または呼吸機能に基づく所定の成長曲線に従って細胞を増殖させることによる、効率的な同化に必要な本質的に最小レベルに維持され得る。

【0104】

微生物を培養するための適切な条件及び適切な培地は、当技術分野で周知である。例えば、適切な培地は、例えば、インデューサー（例えば、遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）、リプレッサー（例えば、遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列が抑制可能なプロモーターの制御下にある場合）、または選択剤（例えば、遺伝子改変を含む微生物を選択するための抗生物質）などの１つ以上の追加の薬剤で補充してもよい。

【0105】

炭素源は、単糖、二糖、多糖、非発酵性炭素源、またはそれらの１つ以上の組み合わせであり得る。適切な単糖の非限定的な例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロース、リボース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適切な二糖の非限定的な例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適切な多糖類の非限定的な例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適切な非発酵性炭素源の非限定的な例としては、酢酸塩及びグリセロールが挙げられる。

【0106】

培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、細胞増殖を促進するのに十分であり得るが、使用される微生物の増殖を抑制するほど高くはない。通常、培養は、グルコースなどの炭素源を、所望のレベルの成長及びバイオマスを達成するためのレベルで添加して実行する。培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、約１ｇ／Ｌより大きく、好ましくは約２ｇ／Ｌより大きく、より好ましくは約５ｇ／Ｌより大きくてもよい。さらに、培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、典型的には約１００ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２０ｇ／Ｌ未満である。培養成分濃度への言及は、初期及び／または進行中の成分濃度の両方を指す場合があることに注意する必要がある。場合によっては、培養中に培養培地から炭素源を枯渇させることが望ましい場合がある。

【0107】

適切な培地で使用することができる同化可能な窒素源としては、単純な窒素源、有機窒素源、及び複合窒素源が挙げられる。このような窒素源としては、無水アンモニア、アンモニウム塩、ならびに動物、植物、及び／または微生物由来の物質が挙げられる。適切な窒素源としては、タンパク質加水分解物、微生物バイオマス加水分解物、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、尿素、及びアミノ酸が挙げられる。典型的には、培養培地中の窒素源の濃度は、約０．１ｇ／Ｌより大きく、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌより大きく、より好ましくは約１．０ｇ／Ｌより大きい。しかしながら、ある特定の濃度を超えると、培養培地への窒素源の添加は、微生物の増殖にとって有利ではない。その結果、培養培地中の窒素源の濃度は、約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約５ｇ／Ｌ未満である。さらに、場合によっては、培養中に培養培地から窒素源を枯渇させることが望ましい場合がある。

【0108】

有効な培養培地は、無機塩、ビタミン、微量金属、または成長促進剤などの他の化合物を含んでもよい。そのような他の化合物はまた、有効な培地中の炭素、窒素、もしくはミネラル源に存在してもよいし、または培地に特異的に添加されてもよい。

【0109】

培養培地はまた、適切なリン酸塩源を含んでもよい。そのようなリン酸塩源としては、無機及び有機リン酸塩源の両方が挙げられる。好ましいリン酸塩源としては、リン酸塩、例えば、一塩基性または二塩基性のリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム、リン酸アンモニウム、及びそれらの混合物が挙げられる。典型的には、培養培地中のリン酸塩源の濃度は、約０．１ｇ／Ｌより大きく、好ましくは約０．２．０ｇ／Ｌより大きく、より好ましくは約５．０ｇ／Ｌより大きい。しかしながら、ある特定の濃度を超えると、培養培地への窒素源の添加は、微生物の増殖にとって有利ではない。したがって、培養培地中のリン酸塩の濃度は、典型的には約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満である。

【0110】

適切な培養培地はまた、好ましくは硫酸マグネシウム七水和物などの生理学的に許容される塩の形態のマグネシウム源を含んでもよいが、同様の量のマグネシウムに寄与する濃度の他のマグネシウム源を使用してもよい。典型的には、培養培地中のマグネシウムの濃度は、約０．５ｇ／Ｌより大きく、好ましくは約１．０ｇ／Ｌより大きく、より好ましくは約２．０ｇ／Ｌより大きい。しかしながら、ある特定の濃度を超えると、培養培地へのマグネシウムの添加は、微生物の増殖にとって有利ではない。したがって、培養培地中のマグネシウムの濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約３ｇ／Ｌ未満である。さらに、場合によっては、培養中に培養培地からマグネシウム源を枯渇させることが望ましい場合がある。

【0111】

培養培地はまた、クエン酸三ナトリウムの二水和物などの生物学的に許容されるキレート剤も含んでもよい。このような場合、培養培地中のキレート剤の濃度は、約０．２ｇ／Ｌより大きく、好ましくは約０．５ｇ／Ｌより大きく、より好ましくは約１ｇ／Ｌより大きい。しかしながら、ある特定の濃度を超えると、培養培地へのキレート剤の添加は、微生物の増殖に有利ではない。したがって、培養培地中のキレート剤の濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２ｇ／Ｌ未満である。

【0112】

培養培地はまた、その培養培地の所望のｐＨを維持するために、生物学的に許容される酸または塩基も最初に含み得る。生物学的に許容される酸としては、限定するものではないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、及びそれらの混合物が挙げられる。生物学的に許容される塩基としては、限定するものではないが、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及びそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、用いられる塩基は、水酸化アンモニウムである。

【0113】

培養培地はまた、塩化カルシウムを含むがこれに限定されない、生物学的に許容されるカルシウム源を含んでもよい。典型的には、培養培地中の塩化カルシウム、二水和物などのカルシウム源の濃度は、約５ｍｇ／Ｌ～約２０００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは、約２０ｍｇ／Ｌ～約１０００ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約５０ｍｇ／Ｌ～約５００ｍｇ／Ｌの範囲である。

【0114】

培養培地はまた、塩化ナトリウムを含んでもよい。典型的には、培養培地中の塩化ナトリウムの濃度は、約０．１ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約１ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約２ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌの範囲内である。

【0115】

培養培地はまた、微量金属も含んでもよい。そのような微量金属は、便宜上、残りの培養培地とは別に調製し得るストック溶液として培養培地に加えてもよい。通常、培養培地に添加されるそのような微量金属溶液の量は、約１ｍｌ／Ｌより多く、好ましくは約５ｍＬ／Ｌより多く、より好ましくは約１０ｍＬ／Ｌより多い。ただし、ある特定の濃度を超えると、培養培地に微量金属を添加しても微生物の増殖には有利ではない。したがって、培養培地に添加されるそのような微量金属溶液の量は、典型的には約１００ｍＬ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｍＬ／Ｌ未満、より好ましくは約３０ｍＬ／Ｌ未満である。ストック溶液に微量金属を添加することに加えて、個々の成分を別々に添加してもよく、それぞれが上記の微量金属溶液の範囲によって決定される成分の量に独立して対応する範囲内にあることに留意されたい。

【0116】

この培養培地は、パントテン酸塩、ビオチン、カルシウム、パントテン酸塩、イノシトール、ピリドキシン－ＨＣｌ、及びチアミン－ＨＣｌなどの他のビタミンを含み得る。そのようなビタミン類を、便宜上、残りの培養培地とは別に調製し得るストック溶液として培養培地に加えてもよい。しかしながら、ある特定の濃度を超えると、培養培地へのビタミン類の添加は微生物の増殖にとって有利ではない。

【0117】

本明細書に記載の発酵方法は、バッチ、流加（フェッドバッチ）、細胞のリサイクル、連続、及び半連続を含むがこれらに限定されない従来の培養モードで実施され得る。いくつかの実施形態では、発酵は、流加モードで実施される。このような場合、発酵の生産段階でのパントテン酸塩など、培地の成分の一部は培養中に枯渇する。いくつかの実施形態では、培養物は、例えば、生産段階の開始時に比較的高濃度のそのような成分で補充され得、その結果、増殖及び／またはステビオール配糖体の生産は、添加が必要とされる前の期間支持される。これらの成分の好ましい範囲が、培養によってレベルが枯渇するにつれて追加を行うことによって、培養全体を通して維持される。培養培地中の成分のレベルを、例えば、培養培地を定期的にサンプリングすること、及び濃度をアッセイすることによってモニターすることができる。あるいは、標準的な培養手順が開発されると、培養中の特定の時間における既知のレベルに対応する時間間隔で追加を行ってもよい。当業者によって認識されるように、培地の細胞密度が増大するにつれて、培養中に栄養素の消費速度が増大する。さらに、培養培地への外来微生物の導入を回避するために、当技術分野で公知のように、無菌添加法を使用して添加を行う。さらに、培養中に消泡剤を添加してもよい。

【0118】

培養培地の温度は、遺伝子改変された細胞の増殖及び／またはステビオール配糖体の産生に適した任意の温度であり得る。例えば、培養培地に接種物を接種する前に、その培養培地を、約２０℃～約４５℃の範囲の温度、好ましくは、約２５℃～約４０℃、より好ましくは約２８℃から約３２℃の範囲の温度に持って行き、維持してもよい。培養培地のｐＨは、この培養培地に酸または塩基を添加することで制御され得る。このような場合、水酸化アンモニウムを使用してｐＨを制御すると、培養培地中の窒素源としても好都合に役立つ。好ましくは、ｐＨは、約３．０～約８．０、より好ましくは約３．５～約７．０、最も好ましくは約４．０～約６．５に維持される。

【0119】

培養培地のグルコース濃度などの炭素源濃度は、培養中にモニターする。培養培地のグルコース濃度は、例えば、上清中のグルコース濃度（例えば、培養培地の無細胞成分）をモニターするために使用され得る、グルコースオキシダーゼ酵素試験または高圧液体クロマトグラフィーの使用などの既知の技術を使用してモニターしてもよい。炭素源濃度は、通常、細胞増殖阻害が発生するレベル未満に維持される。このような濃度は生物によって異なり得るが、炭素源としてのグルコースの場合、細胞増殖阻害は、約６０ｇ／Ｌを超えるグルコース濃度で発生し、トライアルによって容易に決定され得る。したがって、グルコースが炭素源として使用される場合、グルコースは好ましくは発酵槽に供給され、検出限界未満に維持される。あるいは、培養培地中のグルコース濃度は、約１ｇ／Ｌ～約１００ｇ／Ｌの範囲、より好ましくは約２ｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌの範囲、さらにより好ましくは、約５ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌの範囲に維持される。炭素源濃度は、例えば、実質的に純粋なグルコース溶液を添加することによって所望のレベル内に維持することができるが、元の培養培地のアリコートを添加することによって培養培地の炭素源濃度を維持することが許容され、好ましい場合がある。培地中の他の栄養素（例えば、窒素及びリン酸塩源）の濃度を同時に維持し得るので、元の培養培地のアリコートの使用が望ましい場合がある。同様に、微量金属溶液のアリコートを添加することにより、微量金属濃度を培養培地中で維持してもよい。

【0120】

他の適切な発酵培地及び方法は、例えば、ＷＯ２０１６／１９６３２１に記載されている。

【0121】

発酵組成物
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の遺伝子改変宿主細胞及び遺伝子改変宿主細胞によって産生されるステビオール配糖体を含む発酵組成物である。発酵組成物は、さらに培地を含み得る。発酵組成物は、遺伝子改変された宿主細胞、Ｒｅｂ Ａ、Ｒｅｂ Ｄ、及び／またはＲｅｂ Ｍを含んでもよい。本明細書で提供される発酵組成物は、遺伝子改変された宿主細胞によって産生されるステビオール配糖体の主成分としてＲｅｂ Ｍを含み得る。発酵組成物は、少なくとも１：７：５０の比率でＲｅｂ Ａ、Ｒｅｂ Ｄ、及びＲｅｂ Ｍを含み得る。発酵組成物は、少なくとも１：７：５０～１：０．５：１５０の比率でＲｅｂ Ａ、Ｒｅｂ Ｄ、及びＲｅｂ Ｍを含み得る。Ｒｅｂ Ａ、Ｒｅｂ Ｄ、及びＲｅｂ Ｍの比率は、遺伝子組み換え宿主細胞及び培地に関連するステビオール配糖体の総含有量に基づく場合がある。あるいは、Ｒｅｂ Ａ、Ｒｅｂ Ｄ、及びＲｅｂ Ｍの比率は、培地中のステビオール配糖体の総含有量に基づく場合がある。さらに、Ｒｅｂ Ａ、Ｒｅｂ Ｄ、及びＲｅｂ Ｍの比率は、遺伝子組み換え宿主細胞に関連するステビオール配糖体の総含有量に基づく場合がある。

【0122】

発酵組成物は、Ｒｅｂ Ｍ２を検出不可能なレベルで含んでもよい。さらに、発酵組成物は、検出できないレベルで天然には存在しないステビオール配糖体を含む場合がある。

【0123】

ステビオール配糖体の回収
ステビオール配糖体が宿主細胞によって産生されると、それは、当技術分野で公知である任意の適切な分離及び精製方法を使用して、その後の使用のために回収または単離され得る。例えば、ステビオール配糖体を含む浄化水相は、遠心分離によって発酵から分離され得る。あるいは、ステビオール配糖体を含む浄化水相は、解乳化剤を発酵反応に加えることによって発酵から分離され得る。解乳化剤の例としては、凝集剤及び凝固剤が挙げられる。

【0124】

宿主細胞で産生されたステビオール配糖体は、培養上清中に存在してもよく、及び／または宿主細胞に伴っていてもよい。ステビオール配糖体の一部が宿主細胞伴っている場合、ステビオール配糖体の回収には、細胞からのステビオール配糖体の放出を改善する方法が含まれる場合がある。これは、界面活性剤の有無にかかわらず、及び緩衝液または塩の添加の有無にかかわらず、熱水または緩衝液処理で細胞を洗浄するという形をとり得る。温度は、ステビオール配糖体を放出するのに適していると思われる任意の温度であり得る。例えば、温度は４０～９５℃；または６０～９０℃；または７５～８５℃の範囲であり得る。あるいは、温度は、４０、４５、５０、５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５℃であり得る。物理的または化学的細胞破壊を使用して、宿主細胞からのステビオール配糖体の放出を増強し得る。あるいは、及び／またはその後、培養培地中のステビオール配糖体は、溶媒抽出、膜清澄化、膜濃縮、吸着、クロマトグラフィー、エバポレーション、化学的誘導体化、結晶化、及び乾燥を含む単離単位操作を使用して回収され得る。

【0125】

遺伝子改変細胞の作製法
本明細書では、上記の修飾の１つ以上、例えば、カウレン酸ヒドロキシラーゼ及び／または生合成経路酵素（例えば、ステビオール配糖体化合物の場合）をコードする１つ以上の異種核酸を含むように遺伝子操作されている宿主細胞を生成する方法も提供される。宿主細胞における異種酵素の発現は、宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの制御下で酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞に導入することによって達成し得る。核酸は、染色体外プラスミド、ヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込み得る染色体組み込みベクター、または相同性を介してヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込み得る二本鎖ＤＮＡの線状断片であり得る。

【0126】

これらのタンパク質をコードする核酸は、当業者に公知の任意の方法によって宿主細胞に導入され得る（例えば、Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７５，ｐｐ．１２９２－１２９３；Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８５），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．５，ｐｐ．３３７６－３３８５；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ －－ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ －－ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）。例示的な技術としては、スフェロプラスト化、エレクトロポレーション、ＰＥＧ１０００媒介形質転換、及び酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介形質転換が挙げられる。

【0127】

宿主細胞における酵素の量は、酵素をコードする遺伝子の転写を改変することによって変更され得る。これは、酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を改変することによって（例えば、ヌクレオチド配列を含むより高いかまたはより低いコピー数の発現ベクターを使用することによって、あるいはヌクレオチド配列の追加のコピーを宿主細胞のゲノムに導入することによって、または宿主細胞のゲノム内のヌクレオチド配列を削除もしくは破壊することによって）、オペロンのポリシストロン性ｍＲＮＡ上のコード配列の順序を変更することによって、またはオペロンをそれぞれ独自の制御要素を有する個々の遺伝子に分割することによって、またはヌクレオチド配列が作動可能に連結されているプロモーターもしくはオペレーターの強度を増大することによって、達成され得る。あるいは、またはさらに、宿主細胞における酵素のコピー数は、酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳のレベルを改変することによって変更され得る。これは、ｍＲＮＡの安定性の変更、リボソーム結合部位の配列を変更すること、リボソーム結合部位と酵素コード配列の開始コドンとの間の距離もしくは配列を変更すること、酵素コード領域の開始コドンの５’側の「上流」もしくはそれに隣接して位置するシストロン間領域全体を改変すること、ヘアピン及び特殊な配列を使用してｍＲＮＡ転写産物の３’末端を安定化すること、酵素のコドン使用頻度を変更すること、酵素の生合成に用いられるまれなコドンｔＲＮＡの発現を変更すること、及び／または、例えば、そのコード配列の変異を介するなどの、酵素の安定性の増加によって達成され得る。

【0128】

宿主細胞における酵素の活性は、宿主細胞において増加または減少した溶解性を示す酵素の改変形態を発現すること、酵素の活性が阻害されるドメインを欠く酵素の変化した形態を発現すること、基質に対してより高いもしくはより低いＫ_ｃａｔまたはより低いもしくはより高いＫ_ｍを有する酵素の改変形態を発現すること、より高いまたはより低い熱安定性を有する酵素の改変形態を発現すること、細胞のｐＨで、より高いまたはより低い活性を有する酵素の改変形態を発現すること、細胞内区画またはオルガネラにおいてより高いまたはより低い蓄積を有する酵素の改変形態を発現すること、細胞膜に挿入または会合する能力が増大または減少している酵素の改変形態を発現すること、反応を実行するために必要なアクセサリータンパク質に対してより高いまたはより低い親和性を有する酵素の改変形態を発現すること、必要な補因子またはリガンドに対してより高いまたはより低い親和性を有する酵素の改変形態を発現すること、活性部位のスペースが増加または減少した酵素の改変形態を発現すること（それにより、反応の異なる基質を示差的に可能にするかまたは排除する）、あるいは経路内の別の分子によるフィードバックまたはフィードフォワード調節によって多かれ少なかれ影響を受ける酵素の変化した形態を発現することを含む多数の方法で変更され得る。

【0129】

宿主細胞を遺伝子改変するために使用される核酸は、形質転換された宿主細胞の選択及び外来ＤＮＡを維持するために宿主細胞に選択的圧力をかけるために有用な１つ以上の選択可能なマーカーを含んでもよい。

【0130】

選択可能なマーカーは、抗生物質耐性マーカーであり得る。抗生物質耐性マーカーの例としては、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１－Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮ^Ｒ、及びＳＨ ＢＬＥの遺伝子産物が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬＡ遺伝子産物は、ベータラクタム系抗生物質（例えば、狭スペクトルセファロスポリン、セファマイシン、及びカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、及びセフォペラゾン）に対して、及びテモシリンを除く全ての抗グラム陰性菌ペニシリンに対する耐性を付与する。Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉのＮＡＴ１ 遺伝子産物は、ヌールセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性を付与する。Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓＴｕ９４のＰＡＴ遺伝子産物は、ビアロホスに対する耐性を付与する。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＵＲ１－Ｃ遺伝子産物は、Ａｕｅｒｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ（ＡｂＡ）に対する耐性を付与する。ＰＤＲ４遺伝子産物は、セルレニンに対する耐性を付与する。ＳＭＲ１遺伝子産物は、スルホメツロンメチルに対する耐性を付与する。Ｔｎ９トランスポゾン由来のＣＡＴ遺伝子産物は、クロラムフェニコールに対する耐性を付与する。マウスのｄｈｆｒ遺伝子産物は、メトトレキサートに対する耐性を付与する。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＨＰＨ遺伝子産物は、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＳＤＡ遺伝子産物により、Ｄ－セリンを唯一の窒素源とするプレート上で細胞を増殖させることが可能になる。Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ 遺伝子は、Ｇ４１８に対する耐性を付与する。Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓのＳＨＢＬＥ遺伝子産物は、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）（ブレオマイシン）に対する耐性を付与する。抗生物質耐性マーカーは、本明細書に開示される遺伝子改変された宿主細胞が単離された後に欠失されてもよい。

【0131】

選択可能なマーカーは、遺伝子改変微生物における栄養要求性（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ）（例えば、栄養の要求性（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ））のレスキューによって機能し得る。栄養要求性では、親微生物は、アミノ酸またはヌクレオチド生合成経路で機能し、かつ１つ以上の栄養素を補充せずに親細胞を培地で増殖できないようにする、１つ以上の遺伝子産物に機能的破壊を含む。このような遺伝子産物としては、酵母のＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、及びＵＲＡ３遺伝子産物が挙げられる。次に、栄養要求性表現型は、破壊された遺伝子産物の機能的コピーをコードする発現ベクターまたは染色体組み込み構築物で親細胞を形質転換することによってレスキューされ得、生成された遺伝子改変宿主細胞は、親細胞の栄養要求性表現型の喪失に基づいて選択され得る。ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、及びＬＹＳ２遺伝子を選択マーカーとして利用することには、ポジティブ選択とネガティブ選択の両方が可能であるので、顕著な利点がある。ポジティブ選択は、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、及びＬＹＳ２変異の栄養要求性補完によって実行され、ネガティブ選択は、原栄養性株の増殖を防ぐが、それぞれ ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、及びＬＹＳ２変異体の増殖を可能にする、特定の阻害剤、すなわち、それぞれ、５－フルオロオロト酸（ＦＯＡ）、５－フルオロアントラニル酸、及びアミノアジピン酸（ａＡＡ）に基づく。選択可能なマーカーは、公知の選択方法によって特定され得る他の非致死性の欠陥または表現型をレスキューし得る。

【0132】

本明細書に記載されているのは、本発明の方法、組成物、及び宿主細胞において有用な特定の遺伝子及びタンパク質である。ただし、そのような遺伝子との絶対的な同一性は必要ない。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子またはポリヌクレオチドの変化を実施し、活性についてスクリーニングしてもよい。通常、このような変更には、保存的変異とサイレント変異が含まれる。そのような修飾または変異したポリヌクレオチド及びポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を使用して、機能的酵素の発現についてスクリーニングしてもよい。

【0133】

遺伝暗号の固有の縮重に起因して、実質的に同じまたは機能的に同等のポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドもまた、酵素を発現するために使用され得る。

【0134】

特定の宿主におけるその発現を増強するためにコード配列を改変することは有利であり得る。遺伝子コードは６４の可能なコドンと冗長であるが、ほとんどの生物は通常これらのコドンのサブセットを使用する。ある種で最も頻繁に利用されるコドンは最適コドンと呼ばれ、それほど頻繁には利用されないコドンは、希少または低使用のコドンとして分類される。コドンは、「コドン最適化」または「種のコドンバイアスの制御」と呼ばれることもあるプロセスで、宿主の好ましいコドン使用を反映するように置き換えてもよい。他の宿主細胞のコドン最適化は、コドン使用量表を使用して容易に決定し得、またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣｏｄｏｎＯｐなどの市販のソフトウェアを使用して実行してもよい。

【0135】

特定の原核生物または真核生物の宿主によって好ましいコドンを含む最適化されたコード配列（Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．４７７－５０８）を調製して、最適化されていない配列から生成された転写物と比較して、より長い半減期などの望ましい特性を有する、まれな翻訳物を増大するか、または組換えＲＮＡ転写物を生成してもよい。翻訳停止コドンを、宿主の好みを反映するように変更してもよい。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと哺乳動物の典型的な終止コドンは、それぞれＵＡＡとＵＧＡである。単子葉植物の典型的な終止コドンはＵＧＡであるが、昆虫及びＥ．ｃｏｌｉは一般にＵＡＡを終止コドンとして使用する（Ｄａｌｐｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．２１６－２１８）。

【0136】

遺伝暗号の縮重性に起因して、それらのヌクレオチド配列が異なる様々なＤＮＡ分子を使用して、本開示の所与の酵素をコードし得る。上記の生合成酵素をコードする天然のＤＮＡ配列は、本明細書では、本開示の実施形態を単に説明するために参照されるものであり、本開示は、ポリペプチドのアミノ酸配列及び本発明の方法で利用される酵素のタンパク質をコードする任意の配列のＤＮＡ分子を含む。同様の方法で、ポリペプチドは、典型的には、所望の活性の喪失または有意な喪失なしに、そのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び挿入を許容し得る。本発明は、修飾またはバリアントポリペプチドが参照ポリペプチドの酵素活性を有する限り、本明細書に記載の特定のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するそのようなポリペプチドを含む。さらに、本明細書に示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、本発明の例を単に例示するだけである。

【0137】

さらに、組成物、方法、または宿主細胞の実施に有用な酵素の相同体が本発明に含まれる。アミノ酸配列が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する場合、２つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は実質的に相同であると見なされる。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、この配列を最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適な整列のために、ギャップを第１及び第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入してもよく、比較目的に関しては非相同配列を無視してもよい）。比較目的で整列させた参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、典型的には少なくとも４０％、より典型的には少なくとも５０％、さらにより典型的には少なくとも６０％、さらにより典型的には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％の長さであり得る。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、その分子は、その位置にて同一である（本明細書で使用されるとき、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等しい）。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適な整列のために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

【0138】

「相同」を、タンパク質またはペプチドに関して使用する場合、同一ではない残基の位置は、しばしば、保存的なアミノ酸置換によって異なることを認識されたい。「保存的なアミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が、類似した化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは相同性の程度は、置換の保存的な性質によって補正するように上方調整されてもよい。この調整を行うための手段は、当業者に周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ Ｗ．Ｒ．，（１９９４），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ．２５，ｐｐ．３６５－３８９を参照のこと）。

【0139】

以下の６つの群は、それぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む。１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）；及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

【0140】

配列同一性パーセントとも称されるポリペプチドの配列相同性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。分子配列と、異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースとを比較するために使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴである。多数の異なる生物体由来の配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが典型的である。

【0141】

さらに、前述の酵素をコードする任意の遺伝子、またはそれらの発現を制御もしくは調節する任意の調節エレメントは、定向進化または合理的突然変異誘発などの遺伝子／タンパク質工学技術によって最適化され得る。そのような作用は、当業者が酵母における発現及び活性のために酵素を最適化することを可能にする。

【0142】

さらに、これらの酵素をコードする遺伝子は、他の真菌及び細菌種から同定されてもよく、ステビオール配糖体経路の調節のために発現されてもよい。種々の生物体が、これらの酵素の供給源として役立ち得、例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ、例としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｕｖａｒｕｍ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、例としては、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐｐ．、例としてはＨ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｓｐｐ．、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ ｓｐｐ．、例としてはＹ．ｓｐｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、例としてはＳ．ｐｏｍｂｅ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．、またはＵｓｔｉｌａｇｏ ｓｐｐである。嫌気性真菌からの遺伝子の供給源としては、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．，Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．またはＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ ｓｐｐ．が挙げられる。有用な原核生物酵素の供給源としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．が挙げられる。

【0143】

当業者に公知の技術は、追加の相同遺伝子及び酵素を同定するのに適している場合がある。一般に、類似の遺伝子及び／または類似の酵素は、機能分析によって同定してもよく、機能的類似性を有するであろう。類似の遺伝子及び類似の酵素を同定するのに適していることが公知の技術としては、ＰＣＲ、縮重ＰＣＲ、低ストリンジェンシー核酸ハイブリダイゼーション、発現クローニング、及びハイスループットスクリーニングが挙げられる。例えば、相同または類似のＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ、ＫＡＨ、または任意のステビオールグリコシド生合成経路遺伝子、タンパク質、または酵素を同定するための技術としては、限定するものではないが、目的の遺伝子／酵素の公開された配列に基づくプライマーを使用するＰＣＲによる、または目的の遺伝子間の保存領域を増幅するように設計された縮重プライマーを使用した縮重ＰＣＲによる、遺伝子のクローニングが挙げられる。さらに、機能的相同性または類似性を有する相同または類似の遺伝子、タンパク質、または酵素を同定する技術が使用され得る。技術には、酵素の触媒活性についての細胞または細胞培養物を、前記活性についてのインビトロ酵素アッセイ（例えば、本明細書またはＫｉｒｉｔａｎｉ，Ｋ．，Ｂｒａｎｃｈｅｄ－Ｃｈａｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９７０に記載されている）を通して調べること、次いで精製により、前記活性を有する酵素を単離すること、エドマン分解、可能性の高い核酸配列に対するＰＣＲプライマーの設計、ＰＣＲによる前記ＤＮＡ配列の増幅、及び前記核酸配列のクローニングなどの技術により酵素のタンパク質配列を決定することが挙げられる。相同または類似の遺伝子及び／または相同もしくは類似の酵素、類似の遺伝子及び／または類似の酵素もしくはタンパク質を同定するために、技術はまた、候補遺伝子または酵素に関するデータとＢＲＥＮＤＡ、ＫＥＧＧ、またはＭｅｔａＣＹＣなどのデータベースとの比較を含む。候補遺伝子または酵素は、本明細書の教示に従って、上記のデータベース内で同定され得る。

【実施例】

【0144】

実施例１：酵母の形質転換法
各ＤＮＡ構築物は、最適化された酢酸リチウム形質転換において標準的な分子生物学技術を使用して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＣＥＮ．ＰＫ１１３－７Ｄ）に組み込まれた。簡単に説明すると、細胞を酵母抽出物ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地で、振とう（２００ｒｐｍ）しながら３０℃で一晩増殖させ、１００ｍＬのＹＰＤで０．１のＯＤ_６００に希釈し、０．６～０．８というＯＤ_６００に増殖させた。各形質転換について、５ｍＬの培養物を遠心分離によって回収し、５ｍＬの滅菌水で洗浄し、再度スピンダウンし、１ｍＬの１００ｍＭ酢酸リチウムに再懸濁し、マイクロ遠心分離管に移した。細胞を３０秒間スピンダウン（１３，０００ｘｇ）し、上清を除去し、その細胞を２４０μＬの５０％ＰＥＧ、３６μＬの１Ｍ酢酸リチウム、１０μＬの煮沸サケ精子ＤＮＡ、及び７４μＬのドナーＤＮＡからなる形質転換ミックスに再懸濁した。エンドヌクレアーゼＦ－ＣｐｈＩの発現を必要とする形質転換の場合、ドナーＤＮＡには、酵母ＴＤＨ３プロモーター下で発現するＦ－ＣｐｈＩ遺伝子を保持するプラスミドが含まれていた。このように発現されたＦ－ＣｐｈＩエンドヌクレアーゼは、宿主株で操作された特定の認識部位を切断して、目的の標的遺伝子の組み込みを促進する。４２℃で４０分間の熱ショックに続いて、細胞をＹＰＤ培地で一晩回収した後、選択培地に播種した。ＤＮＡの組み込みは、組み込みに固有のプライマーを使用したコロニーＰＣＲによって確認した。

【0145】

実施例２：ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）及びイソプレノイドファルネセンへの高フラックスが可能なベース株の生成
ファルネセン産生株を、天然ＧＡＬプロモーターの制御下でメバロン酸経路の遺伝子を発現することにより、野生型Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＣＥＮ．ＰＫ１１３－７Ｄ）から作製した。この株は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の以下の染色体に組み込まれたメバロン酸経路遺伝子を含んでいた。アセチル－ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、及びＩＰＰ：ＤＭＡＰＰイソメラーゼ。さらに、この菌株には、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ由来のファルネセンシンターゼの複数のコピーが含まれており、これもネイティブＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモーターのいずれかの制御下にある。本明細書に記載されている全ての異種遺伝子は、公的に利用可能なまたは他の適切なアルゴリズムを使用してコドン最適化された。この菌株にはＧＡＬ８０遺伝子の欠失も含まれており、スクアレンシンターゼをコードするＥＲＧ９遺伝子が、ネイティブプロモーターを酵母遺伝子ＭＥＴ３のプロモーターに置き換えることで下方制御される。イソプレノイドへの高フラックスを有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を作製する方法の例は、それらの全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，４１５，１３６号及び同第８，２３６，５１２号に記載されている。

【0146】

実施例３：新規カウレン酸ヒドロキシラーゼＰ４５０酵素の迅速なスクリーニングのための一連の菌株の構築
図１は、カウレン酸中間体を有するＦＰＰからＲｅｂ Ｍへの例示的な生合成経路を示している。上記のファルネセンベース株は、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）の６コピー、コパリル二リン酸シンターゼの４コピー、及びカウレンシンターゼの４コピーをゲノムに統合することにより、Ｃ２０イソプレノイドカウレンへの高フラックスを有するようにさらに設計された。続いて、ファルネセンシンターゼの全てのコピーを、株から除去し、この株がｅｎｔ－カウレンを産生し、ファルネセンを産生しないことを確認した。

【0147】

Ｋａｕｒｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＫＡＨ）は、カウレン酸の酸化を触媒して、Ｒｅｂ Ｍを生成するために必要なステビオール（図１を参照のこと）を生成するシトクロムＰ４５０酵素である。インビボにおけるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＫＡＨ活性について新規なＰ４５０酵素をスクリーニングするために、ＫＡＨ遺伝子のコピーを欠いていることを除いて、Ｒｅｂ Ｍを生成するために必要な全ての遺伝子を含むいくつかの株を作成した。表１に、使用した全てのＲｅｂＭ経路遺伝子及びプロモーターを列挙する。表１に記載されている全ての遺伝子を含む菌株は、主にＫＡＨの基質であるカウレン酸を産生する。

【表2】

【0148】

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で、インビボでのＫＡＨバリアントの活性を測定するために、最初に、ＫＡＨ遺伝子のコピーを欠いたことを除いて、Ｒｅｂ Ｍを産生するために必要な全ての遺伝子を含む第１のスクリーニング株を構築した（表１及び図１）。代わりに、それは、ＫＡＨバリアントの迅速な挿入を可能にするためのランディングパッドを含む（図２）。このランディングパッドは、選択した酵母遺伝子座（上流遺伝子座及び下流遺伝子座）の上流及び下流のゲノム領域に対して、構築物のいずれかの末端にある５００ｂｐの遺伝子座標的化ＤＮＡ配列で構成され、これにより、ランディングパッドが酵母染色体に組み込まれると遺伝子座が欠失される。内部的に、ランディングパッドは、酵母ＧＡＬレギュロンのＧＡＬ１、ＧＡＬ３、または任意の他のプロモーターであることができるプロモーター（プロモーター）及びエンドヌクレアーゼ認識部位（Ｆ－ＣｐｈＩ）に隣接する選択された酵母ターミネーター（ターミネーター）を含む。Ｒｏ．ＫＡＨのＤＮＡバリアント（配列番号１）を使用して、エンドヌクレアーゼＦ－ＣｐｈＩを発現するプラスミドで株を形質転換した。Ｆ－ＣｐｈＩは、認識配列を切断し、ランディングパッドで二本鎖切断を作成し、この部位のＲｏ．ＫＡＨＤＮＡバリアントの相同組み換えを容易にする。

【0149】

Ｓｒ．ＫＯがＰｓ．ＫＯ（配列番号１０）で置き換えられたことを除いて、第１のスクリーニング株と同じ操作をされている第２のスクリーニング株を生成した。Ｐｓ．ＫＯ酵素は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４６３５９（２０１８年８月１０日に出願されたＰＩＳＵＭ ＳＡＴＩＶＵＭ ＫＡＵＲＥＮＥ ＯＸＩＤＡＳＥ ＦＯＲ ＨＩＧＨ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＲＥＢＡＵＤＩＯＳＩＤＥＳ）に記載されており、カウレンをカウレン酸に変換するのに非常に活性がある（図１）。したがって、第２のスクリーニング株は、ＫＡＨＰ４５０の基質であるカウレン酸への炭素フラックスが高くなる。

【0150】

これらの株及びそれらの改変誘導体（例えば、異なるＧＡＬプロモーター及び酵母ターミネーターを、ランディングパッド内で使用して、ＫＡＨ遺伝子の発現を調整し得る）は、機能的ＫＡＨ遺伝子を欠くＲｅｂ Ｍ産生酵母と呼ばれる。

【0151】

実施例４：酵母の培養条件
予想されるＫＡＨ遺伝子を含むことが確認された酵母コロニーを、２０ｇ／Ｌのスクロース、３７．５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、及び１ｇ／Ｌのリジンを含む、バードシード培地（Ｂｉｒｄ Ｓｅｅｄ Ｍｅｄｉａ）（ＢＳＭ、元々はｖａｎ Ｈｏｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６８（５），２０００，ｐｐ．５１７－５２３に記載）を含む９６ウェルマイクロタイタープレートに拾い上げた。細胞を、培養物が炭素枯渇に達するまで、１０００ｒｐｍ及び湿度８０％で、振とうする大容量マイクロタイタープレートインキュベーター内で３０℃で、３日間培養した。増殖飽和培養物を、飽和培養物から１４．４μＬを取り出し、３６０μＬの新鮮な培地に希釈することにより、４０ｇ／Ｌスクロース、１５０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、及び１ｇ／Ｌリジンを含むＢＳＭを含む新鮮なプレートに継代培養した。生産培地中の細胞は、抽出と分析の前に、高容量マイクロタイタープレートシェーカー内で１０００ｒｐｍ、湿度８０％にて３０℃でさらに３日間、培養した。

【0152】

実施例５：ステビオール配糖体の分析のための全細胞ブロスサンプル調製条件
細胞によって作製された全てのステビオール配糖体を抽出するために（図１を参照のこと）、培養が完了したら、細胞ブロス全体を、６２８μＬの１００％エタノールで希釈し、ホイルシールで密封し、１２５０ｒｐｍで３０秒間振とうした。水（３１４μＬ）を各ウェルに直接加えて抽出液を希釈し、プレートを短時間遠心分離して、固形物をペレット化した。０．４８ｍｇ／ＬのレバウディオサイドＮ（内部標準として使用）を含むエタノール：水混合物（５０：５０の１９８μＬ）を新しい２５０μＬアッセイプレートに分注し、２μＬの培養液／エタノール混合物をアッセイプレートに添加した。分析のためにホイルシールをプレートに適用した。

【0153】

実施例６：分析方法
酵母産生ステビオール配糖体（実施例５）に由来するサンプルを、Ｃ８カートリッジを有するＲａｐｉｃＦａｒｅ ３６５システムオートサンプラーを備えた質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ ６４７０－ＱＱＱ）を使用して日常的に分析した。ステビオール配糖体とＣ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃと略される望ましくない不純物をアッセイで測定した。

【表3】

【表4】

【0154】

質量分析計は、負イオン多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作された。各ステビオール配糖体は、前駆イオンの質量とＭＲＭ遷移から特定した（表４）。Ｃ１９での不安定なカルボン酸エステル結合でのフラグメンテーションにより、位置異性体ＲｅｂＡとＲｅｂＥとの間を区別できたが、この方法を使用すると、ルブソシドとステビオールビオシド（ステビオール＋２Ｇｌｃ）またはステビオシドとＲｅｂ Ｂ（ステビオール＋３Ｇｌｃ）との間を区別できない。

【表5】

【0155】

質量分析計からのクロマトグラムからのピーク面積を使用して、真正標準を使用して検量線を作成した。関連する化合物のモル比は、真正の標準を使用した外部較正によって各化合物のモル数を定量化し、次に適切な比をとることによって決定された。Ｃ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃの精製された真正の標準がないことに起因して、異なる酵母株におけるＣ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃの相対的な生成は、対応するピーク面積のみから評価した。

【0156】

特定のステビオール配糖体を決定し、新しい副産物の存在を評価するために、選択されたサンプルはまた、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１５ｃｍ、２．１ｍｍ、１．７μｍ、１３０Å；部品番号１８６００２３５３）を備えたサーモフィッシャーサイエンティフィックバンキッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖａｎｑｕｉｓｈ）ＵＨＰＬＣシステムで超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）を使用して分析した（表５）。二重検出を、Ｖａｎｑｕｉｓｈ荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）（表６）とＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（表７）を使用し、Ｒｅｓｔｅｋバイナリ固定フロースプリッタを使用してポストカラムフロースプリット５：１（ＣＡＤが５及びＭＳが１）で実行した。

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【0157】

ピーク同一性は、真正の標準、分子イオン、及びＭＳフラグメンテーションパターンから決定された保持時間に基づいて、ステビオール配糖体及びＣ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃに割り当てられた（表８）。

【表10】

【0158】

実施例７：Ｒｕｂｕｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ のＫＡＨは、ＫＡＨ活性を有する新規Ｐ４５０酵素である。
植物のＲｕｂｕｓ ｓｕａｖｉｓｓｉｍｕｓ（チャイニーズブラックベリーまたはチャイニーズスイートリーフとしても公知である）から以前に同定されたＫＡＨ酵素（Ｒｓ．ＫＡＨ、配列番号３）を、関連する植物ブラックラズベリー（Ｒｕｂｕｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）のゲノムを検索するためのクエリとして使用した。Ｒ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓの全ゲノムアセンブリは、（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｏｓａｃｅａｅ．ｏｒｇ／ｏｒｇａｎｉｓｍ／Ｒｕｂｕｓ／ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）で公開されている。ＷｅｂサイトのデフォルトのｔＢＬＡＳＴｎ機能、及びクエリ配列としてＲｓ．ＫＡＨアミノ酸配列を使用して、染色体３上の５つのエクソンによってコードされる推定ＫＡＨオルソログを特定した。推定Ｒｏ．ＫＡＨのタンパク質配列を、５つのエクソンのＤＮＡコード配列を単一のタンパク質配列（配列番号１）に翻訳することによって推定した。推定上のＲｏ．ＫＡＨタンパク質の酵母コドン最適化ＤＮＡ配列（配列番号２）を生成し、対応する合成ＤＮＡ配列をアセンブルした。

【0159】

酵母コドン最適化Ｒｏ．ＫＡＨ遺伝子を、ランディングパッド内のプロモーター及び酵母ターミネーターＤＮＡ配列に対して４０ｂｐの隣接相同性を有するように設計されたプライマーを使用してＰＣＲ増幅した（図２を参照のこと）。これらのフランクを、宿主株の特定の遺伝子座でのランディングパッドへの相同組換えを促進するために、増幅された遺伝子の末端に追加した。実験対照として使用された追加の他のＫＡＨ遺伝子も、ランディングパッドに同じ４０ｂｐの隣接配列を含むプライマーで増幅した。各ＫＡＨ遺伝子を、単一コピーとして上記のＲｅｂ Ｍスクリーニング株に個別に形質転換し（実施例３）、インビボで発現された場合にステビオール配糖体を産生する能力についてスクリーニングした。実施例３に記載の宿主株は、ＫＡＨ遺伝子を欠いているため、ステビオール配糖体を産生することができない。したがって、ステビオール配糖体を生成するためには、形質転換体に導入される遺伝子産物は、ＫＡＨ活性を有しており、かつ宿主酵母のＵＧＴ遺伝子によるさらなるグリコシル化のためにカウレン酸をステビオールに変換できなければならない。

【0160】

宿主株におけるインビボのＫＡＨ活性を決定するために、株によって産生された全細胞ブロス中のステビオール配糖体を抽出し、質量分析によって測定した（実施例４～６）。全てのステビオール配糖体の合計を計算し（μＭ）、総ステビオール配糖体（ＴＳＧ）として報告した。個々のＫＡＨバリアントの活性は、特定のＫＡＨ酵素を含む株のＴＳＧ測定値を、野生型Ｒｓ．ＫＡＨ酵素を含む株のＴＳＧ測定値に正規化することによって算出した。

【0161】

宿主株における推定Ｒｏ．ＫＡＨ配列の過剰発現によって、この遺伝子のタンパク質産物がＫＡＨ活性をコードすることが確認された（図３）。予想どおり、ＫＡＨ遺伝子を有さない宿主株は、ステビオール配糖体を全く生成しない。Ａｔ．ＫＡＨ（配列番号４）またはＲｓ．ＫＡＨ（配列番号３）をコードする以前に同定された遺伝子の発現は、ステビオール配糖体の産生をもたらした（図３）。このように測定されたＲｏ．ＫＡＨの活性は、Ａｔ．ＫＡＨまたはＲｓ．ＫＡＨのいずれかのＫＡＨ活性よりも高かった（それぞれ４倍及び１．５倍高かった）。

【0162】

実施例８：部位特異的飽和突然変異誘発による野生型Ｒｏ．ＫＡＨの進化
この実施例において、活性データが、野生型Ｒｏ．ＫＡＨ、及びＲｅｂ Ｍを含むステビオール配糖体の産生のために Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主で発現された場合にＲｏ．ＫＡＨ活性を改善する特定の変異について提供される。

【0163】

Ｒｏ．ＫＡＨの各アミノ酸残基を、２セットのライブラリーを生成する縮重コドンを使用して変異した。縮重コドンは、ＶＨＧと組み合わせたＮＤＴ（最初のセット）またはＮＮＹ（２番目のセット）のいずれかで構成されており、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドのアデニン、チミン、グアニン、及びシトシンを表す。Ｄは、アデニン、グアニン、及びチミンを表す。Ｔはチミンを表す。Ｖは、アデニン、シトシン、及びグアニンを表す。Ｈはアデニン、シトシン、及びチミンを表す。Ｇはグアニンを表す。そしてＹはシトシン及びグアニンを表す。縮重コドンＮＤＴは、１２の異なるアミノ酸（Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、及びＶ）をコードするが、縮退コドンＶＨＧは、９つの異なるアミノ酸（Ａ、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｔ、及びＶ）を等しい割合でコードする。ＶＨＧとＮＤＴを３：４の比率で混合すると、トリプトファンを除く全てのアミノ酸がほぼ等モル量で表される。縮重コドンＮＮＹは、１５の異なるアミノ酸（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹ）をコードする。各ライブラリーは、縮重コドンを導入するように設計されたプライマーを使用したＰＣＲによって構築され、その結果、各ＰＣＲ産物には、１９（第１セット）または１５（第２セット）の可能な異なるアミノ酸が単一のタンパク質残基に対応する特定の位置にコードされている遺伝子バリアントの混合物が含まれる。各ＰＣＲ産物では、前の実施例で説明したように、Ｒｏ．ＫＡＨ遺伝子バリアントのプールの両端に、宿主株のランディングパッドのプロモーター及びターミネーター領域に相同な４０ｂｐの配列が隣接している。

【0164】

Ｒｏ．ＫＡＨの単一アミノ酸での変化を表す各バリアントプールを、独立して宿主酵母に形質転換し、上記のようにＫＡＨ活性に対する変異の影響についてスクリーニングした。階層１のスクリーニングでは、スクリーニングする部位ごとに２４のコロニーを選択した（これはライブラリーのサンプリング率のおよそ１．４倍に相当する）。野生型Ｒｏ．ＫＡＨ配列（配列番号１）のあらゆるアミノ酸を、記載されているように突然変異誘発及びスクリーニングに供した。

【0165】

ＫＡＨによって生成されるステビオールの量は、全てのステビオール配糖体（総ステビオール配糖体、またはＴＳＧ（μＭ）を合計することによって推定される。特定の変異の影響は、変異体アミノ酸を含む株によって生成されたＴＳＧを、野生型Ｒｏ．ＫＡＨタンパク質を含む株によって生成されたＴＳＧと比較することによって算出した。インビボで酵素の活性を増大させたＲｏ．ＫＡＨの変異を発見した際、上記と同じ計算を使用して、ステビオール産生の改善を確認するために、より高い複製（Ｎ≧８）で階層２スクリーニングを実行した。変異体によって生成されたステビオール配糖体の中央値が、野生型Ｒｏ．ＫＡＨタンパク質によって生成されたステビオール配糖体の中央値より少なくとも１標準偏差高い場合、変異はＲｏ．ＫＡＨ活性を改善すると見なされた。

【0166】

野生型酵素の活性よりも１標準偏差を超えてＲｏ．ＫＡＨ活性を改善した上記の２セットのライブラリーをスクリーニングすることにより、合計１５４個の固有の変異が見出された（図４）。表９に、野生型Ｒｏ．ＫＡＨに対する各変異の改善倍率の中央値を列挙する。野生型Ｓｒ．ＫＡＨの活性は、参照のために図４及び表９に含まれている。Ｒｏ．ＫＡＨの最上位の６つの変異体（Ｓ４５２Ｄ、Ｉ１０４Ａ、Ｖ３４０Ｓ、Ｆ２２９Ｙ、Ａ２９７Ｙ、Ａ２９７Ｆ）は、野生型Ｓｒ．ＫＡＨよりも１標準偏差以上改善された活性を有することに注意のこと。

【表11-1】

【表11-2】

【表11-3】

【表11-4】

【0167】

実施例９：コンビナトリアル突然変異誘発によるＲｏ．ＫＡＨの進化（完全な階乗様式で突然変異誘発の標的となる２４アミノ酸残基）
２つの完全な階乗の組み合わせライブラリーを構築するために、実施例８に記載された独特の部位特異的飽和突然変異誘発ヒットから１２個の突然変異の２つのセットを選択した。最初のコンビナトリアルライブラリーには、変異Ｌ５４Ｇ、Ｙ５５Ｐ、Ｆ８８Ｒ、Ｉ１０４Ａ、Ｋ１１９Ｓ、Ｔ１２３Ｄ、Ｐ１６１Ｄ、Ｔ１６２Ａ、Ｓ１６５Ｄ、Ｍ１７１Ｆ、Ｔ２１６Ａ、Ｋ２２４Ｉが含まれ、第２のライブラリーには変異Ｆ２２９Ｙ、Ｌ２３２Ｙ、Ａ２３６Ｒ、Ｉ２８４Ｇ、Ｋ２９１Ｃ、Ｄ２９３Ｃ、Ａ２９７Ｙ、Ｆ３３２Ｌ、Ｓ３３９Ａ、Ｖ３４０Ａ、Ｓ４５２Ｄ、Ｌ４８５Ｆを含んだ。これらのライブラリーは、１２の変異の中で可能な全ての組み合わせを作成して、インビボでＲｏ．ＫＡＨの最高の活性をもたらす組み合わせを見つけるように設計した。遺伝子は、所望の変異を含むＰＣＲ増幅フラグメントの混合物からアセンブルした。各フラグメントは、各断片の端に重複する相同性を含んでいたため、断片は順番に重複していた。ＰＣＲを使用してインビトロで全ての断片を組み立てると、全長ＫＡＨ対立遺伝子が再構成された。末端の５’及び３’断片は、機能的なＫＡＨ遺伝子を欠くＲｅｂＭ産生酵母のランディングパッド配列のプロモーター及びターミネーターとも相同性があった。アセンブルされた全長ライブラリー遺伝子を酵母に形質転換した。

【0168】

階層１コンビナトリアルライブラリーＤＮＡを、０．９倍の被覆率でＲｅｂ Ｍ産生酵母においてスクリーニングした。特定の変異の組み合わせの効果を、複数の変異アミノ酸を含む株によって産生されたＴＳＧを、上記のように野生型Ｒｏ．ＫＡＨタンパク質を含む株によって産生されたＴＳＧと比較することによって算出した（実施例８）。コンビナトリアルライブラリースクリーニングから特定された５６の最高性能のＫＡＨ対立遺伝子を、Ｎ＝８の複製で階層２確認に昇格させた。これらのバリアントのほとんどは、野生型Ｒｏ．ＫＡＨと比較して少なくとも１．４倍高いＴＳＧを生成し、最上位のバリアントは５．０２倍改善された生成をもたらした（図５及び表１０）。興味深いことに、改良されたバリアントのほとんどは、バリアントごとに２つまたは３つの変異しか含まず、５つのバリアントのみが４つの変異を含み、４つを超える変異を含む改良されたバリアントは特定されなかった（表１０）。アミノ酸置換の最良の組み合わせは、Ｆ３３２ＬとＳ４５２Ｄの２つの変異のみで構成されていた。

【表12-1】

【表12-2】

【0169】

実施例１０：カウレン酸に対するＲｏ．ＫＡＨ活性の副産物に由来する望ましくない不純物Ｃ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃの同定
Ｒｏ．ＫＡＨを発現する酵母に由来するサンプルを、タンデムＣＡＤ及びＯｒｂｉｔｒａｐ－ＭＳ検出器を備えたＵＨＰＬＣを使用して、図１に示されるＲｅｂ Ｍ経路の一部ではない追加の代謝産物の産生について分析した（分析の詳細については、実施例６を参照のこと）。Ｒｏ．ＫＡＨ、Ｓｒ．ＫＡＨ、Ｒｓ．ＫＡＨを発現するか、またはＫＡＨを発現しない株のＣＡＤクロマトグラムの比較により、Ｒｏ．ＫＡＨに固有の１つのピークを特定した（図６Ｂ）。高分解能イオン質量及びＭＳ／ＭＳフラグメンテーションパターンをさらに検査すると、目的のこのピークは、単一グリコシル化カウレン酸＋酸素＋水と一致する分子式Ｃ_２６Ｈ_４２Ｏ_９を有することが確認された（図６Ｃ及び６Ｄ）。ＣＡＤクロマトグラムで同じ保持時間の小さなピークはまた、Ｒｓ．ＫＡＨを発現するＲｅｂＭ生成細胞でも検出可能であるが、ＭＳの特性評価には存在量が少なすぎる。

【0170】

シトクロムＰ４５０スーパーファミリーの既知の反応性の範囲に基づいて、Ｒｏ．ＫＡＨは、カウレン酸を２つの生成物、ステビオールまたはエポキシドのいずれかに変換し得るようである（図６Ａ）。次に、エポキシドは自発的にジオールに加水分解され、Ｒｅｂ Ｍ経路のグリコシルトランスフェラーゼの１つによってカルボキシレート部位（Ｃ１９）でグリコシル化され、新しいピークで検出されたイオン質量と一致するグルコシル化ジオール生成物を生成し得る。カウレン酸コアにすでに存在する立体中心は、Ｃ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃという名前のこのジオールに保存されている可能性があるが、Ｃ１６での立体化学は、この研究で使用した方法を使用して決定することはできない。

【0171】

Ｃ１６で定義されたＳ配置を有するＣ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃ（図６Ａに示されるような構造）は、以前にいくつかの植物から単離されている。最も注目すべきは、Ｃ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１ＧｌｃがＲｓ．ＫＡＨの供給源であるＲ．ｓｕａｖｉｓｓｉｍｕｓの甘い葉の無味の副成分として同定され（Ｏｈｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１（５），１９９２，ｐｐ．１５５３－１５５９）、ｓｕａｖｉｏｓｉｄｅ Ｅ．と名付けられた。Ｓｔｅｖｉａ ｐｈｌｅｂｏｐｈｙｌｌａ Ａ．Ｇｒａｙは、メキシコの希少種であり、同じ化合物を生成するようであり（Ｃｅｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ３７９，２０１３、ｐｐ．１－６）、ならびに アスター（Ａｓｔｅｒ）属のいくつかの中国の薬用植物種（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３（５），１９９３，ｐｐ．１１８１－１１８３；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ５６（１１），１９９３，ｐｐ．１９１７－１９２２；Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３（９），１９９５，ｐｐ．７４９－７５４）及びクッソニア（Ｃｕｓｓｏｎｉａ）属のアフリカの植物のいくつかの種（Ｈａｒｉｎａｎｔｅｎａｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５０（２），２００２，ｐｐ．２６８－２７１；Ｈａｒｉｎａｎｔｅｎａｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５０（８），２００２，ｐｐ．１１２２－１１２３；Ｈａｒｉｎａｎｔｅｎａｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６１（４），２００２，ｐｐ．３６７－３７２）も同様である。

【0172】

パニキュロシドＩＶと呼ばれる場合が多い、Ｃ１６で定義されたＲ構成を有するＣ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃ（図６Ａに示される構造）はまた、限定するものではないが、Ｃｕｓｓｏｎｉａ種（Ｈａｒｉｎａｎｔｅｎａｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５０（２），２００２，ｐｐ．２６８－２７１；Ｈａｒｉｎａｎｔｅｎａｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５０（８），２００２，ｐｐ．１１２２－１１２３；Ｈａｒｉｎａｎｔｅｎａｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６１（４），２００２，ｐｐ．３６７－３７２），Ｐｕｌｉｃａｒｉａ種（Ｄａｒｗｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １５（１），２００１，ｐｐ．２１－２４；Ｒａｓｏｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３（２），２００８，ｐｐ．１４１－１４４；Ｒａｓｏｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８（６），２０１３，ｐｐ．７５７－７５９）、Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｋｏｒｅａｎｕｍ（Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６（９），２００３，ｐｐ．７３１－７３４；Ｃａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８（８），２００４，ｐｐ．６７７－６８０）及び他のいくつかを含む多数の異なる植物からも単離された。

【0173】

上記の植物由来の天然物の以前の単離及び特徴付けの報告は、図６Ａに示されるＣ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃについて提案された構造の支持を提供するが、それを明確に確認しない。それにもかかわらず、Ｃ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃの生成は、Ｒｏ．ＫＡＨの存在下でのみ、ステビオールに加えて副産物のこの酵素による形成を確認する。これには、改善された全体的な活性に加えて、改善された生成物特異性、すなわち、望ましくない副産物の絶対量及び相対量が減少したステビオールの形成の増加を伴うＲｏ．ＫＡＨ酵素バリアントの進化を必要とした。

【0174】

実施例１１：４６アミノ酸残基を標的とする部位特異的飽和突然変異誘発によるＲｏ．ＫＡＨＡ２９７Ｙ活性及び生成物特異性の改善
実施例１０に記載されるように、Ｒｏ．ＫＡＨを発現する酵母は、Ｒｅｂ Ｍ及び他のマイナーなステビオールグリコシド（Ｒｅｂ Ｍ経路中間体として）だけでなく、約１対２（Ｃ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃ対ＲｅｂＭ）のモル比で望ましくない副産物Ｃ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃも産生する。したがって、Ｒｏ．ＫＡＨの活性と生成物特異性の両方の改善は、以下の実施例で説明するライブラリーで標的とされた。

【0175】

Ｒｏ．ＫＡＨの活性及び生成物特異性をさらに改善するために、別のラウンドの部位特異的飽和突然変異誘発を、実施例８に記載の最上位のＳＳＭバリアントの１つに適用した（Ｒｏ．ＫＡＨ Ａ２９７Ｙ）。選択した４６個のアミノ酸のそれぞれ（Ｆ１２８、Ｉ１２９、Ｉ１３２、Ｌ１３６、Ｌ１４０、Ａ１４１、Ｔ１４２、Ｇ１４３、Ｌ１４４、Ａ１４５、Ｎ１４６、Ｙ２３８、Ｋ２４１、Ｉ２４３、Ｉ２７３、Ｉ２７７、Ｋ３２８、Ｌ３２９、Ｆ３３０、Ｙ３３１、Ｆ３３２、Ａ３３３、Ｇ３３４、Ｑ３３５、Ｅ３３６、Ｔ３３７、Ｔ３３８、Ａ３９６、Ｖ３９７、Ｉ３９８、Ｅ３９９、Ｌ４００、Ｐ４０１、Ｐ４６３、Ｆ４６４、Ｇ４６５、Ｇ４６６、Ｇ４６７、Ｐ４６８、Ｒ４６９、Ｉ４７０、Ｉ４７２、Ｇ４７３、Ｙ５０６、Ｉ５０８、及びＴ５０９）を、Ｒｏ．ＫＡＨ Ａ２９７Ｙ配列において、縮重コドンＮＮＳ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドアデニン、チミン、グアニン、及びシトシンを表し、Ｓはグアニン及びシトシンを表す）によってコードされる２０の異なるアミノ酸（Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶ）に変異した。Ｒｏ．ＫＡＨ Ａ２９７Ｙ遺伝子バリアントのＮＮＳライブラリーを、実施例８に記載のように所望の位置にＮＮＳ縮重コドンを含むプライマーを使用するＰＣＲによって構築し、機能的なＫＡＨ遺伝子を欠くＲｅｂＭ産生酵母を形質転換するために使用した。

【0176】

ＮＮＳライブラリー変異体のインビボＫＡＨ活性を、階層１スクリーニングで測定した。特定の変異（Ａ２９７Ｙに加えて）の効果を、変異体株によって生成されたＲｅｂＭ力価を、野生型Ｒｏ．ＫＡＨタンパク質を含む株によって生成されたＲｅｂＭと比較することによって算出した。Ｒｅｂ Ｍ経路の下流のグリコシルトランスフェラーゼの効率が高いので、Ｒｅｂ Ｍは、ＴＳＧの大部分を構成するが、他のステビオール配糖体はごく少量しか存在しない。ＫＡＨインビボ活性の尺度として相対ＲｅｂＭ力価を使用すると、データ分析が簡素化され、相対ＴＳＧ測定と同じランクのバリアントが生成される。ＮＮＳライブラリー変異体のインビボＫＡＨ生成物特異性も、副産物Ｃ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１ＧｌｃのＭＳクロマトグラムのピーク面積及びＲｅｂＭ（μＭ）の力価を使用して、野生型Ｒｏ．ＫＡＨと比較した階層１スクリーニングで測定された。生成物特異性の変化倍数を、野生型Ｒｏ．ＫＡＨと比較して変異体によって生成されたＲｅｂ Ｍ（μＭ）と、野生型Ｒｏ．ＫＡＨと比較して変異体によって生成された副産物Ｃ_２０Ｈ_３２Ｏ_４＋１Ｇｌｃの比率を計算することによって推定した：

【数3】

【0177】

３９個の分離株を、タンパク質配列の変異位置ごとにスクリーニングし、それぞれの固有のバリアントについて、Ｎ＝１で約１．２倍の被覆率を与えた。インビボで酵素の活性と生成物特異性を増大させると思われるＲｏ．ＫＡＨＡ２９７Ｙと組み合わせた変異を発見した際には、目的の特定の変異体を含む株のより高い複製（Ｎ＝８）で階層２スクリーニングを実施し、上記の計算を使用した改善を確認した。ＮＮＳ由来の変異体Ｒｏ．ＫＡＨ対立遺伝子の、結果として生じる活性及び生成物特異性を、図７及び表１１において野生型Ｒｏ．ＫＡＨに対する改善の倍数で報告する。

【表13】

【0178】

活性及び生成物特異性の両方において野生型Ｒｏ．ＫＡＨを超える改善をもたらす、Ａ２９７Ｙと組み合わせた２３の変異が同定された（改善されたバリアントのほとんどは、位置１４１、１４２、及び１４６のアミノ酸置換から生じる）。この部位特異的変異誘発ＮＮＳライブラリー（Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ）からの最高の活性変異体は、野生型Ｒｏ．ＫＡＨと比較してインビボでのＫＡＨ活性の５．２倍の改善を提供する。最高の特異性変異体（Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ）は、野生型Ｒｏ．ＫＡＨと比較してＫＡＨ生成物特異性を１２．９７倍改善する。興味深いことに、活性と特異性の両方で最も高い改善が見られたのは、同じ位置Ｎ１４６だが、アミノ酸置換が異なっていた（それぞれＴ及びＷ）変異誘発であった。

【0179】

実施例１２：コンビナトリアル部位特異的飽和突然変異誘発によるＲｏ．ＫＡＨＡ２９７Ｙ活性及び生成物特異性の改善
Ｒｏ．ＫＡＨの活性及び生成物特異性をさらに改善するために、コンビナトリアル部位特異的飽和変異誘発を、実施例８に記載の最上位のＳＳＭバリアントの１つ（Ｒｏ．ＫＡＨ Ａ２９７Ｙ）に適用した。コンビナトリアル活性部位飽和試験（ＣＡＳＴ；Ｒｅｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ ４４（２７），２００５，ｐｐ．４１９２－４１９６）としても公知のこのタイプの突然変異誘発では、空間的に近い２つのアミノ酸残基は同時に変異し、側鎖の配向から生じる潜在的な相乗効果を可能にする。したがって、Ｒｏ．ＫＡＨ Ａ２９７Ｙ変異体の２つのアミノ酸残基が同時に変異した１０個のライブラリーが作成された：Ｆ１２８及びＦ１２９、Ｌ１４４及びＡ１４５、Ａ１４５及びＮ１４６、Ｋ３２８及びＦ３３２、Ｆ３３０及びＧ３３４、Ｆ３３２及びＴ３３７、Ａ３９６及びＶ３９７、Ｖ３９７及びＩ３９８、Ｒ５０７及びＩ５０８、Ｉ５０８及びＴ５０９。各アミノ酸残基は、縮重コドンＮＤＴによってコードされる１２の異なるアミノ酸（Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｓ、Ｙ、及びＶ）に変異した（ここで、Ｎはヌクレオチドアデニン、チミン、グアニン、及びシトシンを表し、Ｄはアデニン、グアニン、及びチミンを表し；Ｔはチミンを表す）。Ｒｏ．ＫＡＨ Ａ２９７Ｙ遺伝子バリアントのＮＤＴライブラリーを、実施例８に記載のように所望の位置にＮＤＴ縮重コドンを含むプライマーを使用するＰＣＲによって構築し、機能的なＫＡＨ遺伝子を欠くＲｅｂＭ産生酵母を形質転換するために使用した。

【0180】

変異体のインビボＫＡＨ活性及び生成物特異性の変化を、実施例１１に記載されるように測定した。３９の分離株を、タンパク質配列の変異位置ごとにスクリーニングし、階層１の固有のバリアントごとにＮ＝１で約２倍の被覆率とした。インビボでの酵素の活性及び生成物特異性を高めると思われたＲｏ．ＫＡＨＡ２９７Ｙと組み合わせた変異が見つかった場合、階層２スクリーニングを、目的の特定の変異体を含む株のより高い複製（Ｎ＝８）で実施して、改善を確認した。変異体Ｒｏ．ＫＡＨ対立遺伝子の結果として生じる活性及び生成物特異性を、図８において野生型Ｒｏ．ＫＡＨに対する増加倍数で報告する。表１２は、図８に示されるライブラリヒットのサブセット、具体的には、Ｒｏ．ＫＡＨ Ａ２９７Ｙに同時に導入された２つ（１つだけではない）のアミノ酸変化を有するものを列挙している。

【表14】

【0181】

野生型Ｒｏ．ＫＡＨと比較して生成物特異性が改善されたいくつかのバリアントが、このコンビナトリアルライブラリーから同定され、バリアントＡ１４５Ｇ／Ｎ１４６Ｆ／Ａ２９７Ｙは、野生型Ｒｏ．ＫＡＨと比較して９．６倍の特異性改善をもたらした。特異性の改善は、全体的な活性を犠牲にするという犠牲を払ってもたらされた。親Ｒｏ．ＫＡＨ Ａ２９７Ｙと比較して２つのアミノ酸変化を有するバリアントはなく、単一のアミノ酸変化を有するほんの一握りだけが親酵素よりも優れた活性を有した。２つ以上のアミノ酸残基が同時に変異している場合、これは驚くべきことではない。

【0182】

実施例１３：完全な部位特異的飽和突然変異誘発によるＲｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙの進化
Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ（最上位の活性バリアント、実施例１１）の活性をさらに改善するために、別のラウンドの部位特異的飽和変異誘発を適用して、カウレン酸をステビオールに変換する際にさらに高い活性を有する変異体バリアントを単離した（図１）。Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ配列の各アミノ酸残基は、縮重コドンＮＮＴによってコードされる１５の異なるアミノ酸（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ ［２つのコドンによってコードされる］、Ｔ、Ｖ、及びＹ）（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドアデニン、チミン、グアニン、及びシトシンを表し、Ｔはチミンを表す）に変異した。Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７ＹのＮＤＴライブラリーを、実施例８に記載のように所望の位置にＮＤＴ縮重コドンを含むプライマーを使用するＰＣＲによって構築し、機能的なＫＡＨ遺伝子を欠くＲｅｂＭ産生酵母を形質転換するために使用した。

【0183】

Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ変異体の相対的なインビボＫＡＨ活性及び生成物特異性を、実施例１１に記載されるように評価した １３の分離株を、タンパク質配列の変異位置ごとにスクリーニングし、階層１の固有のバリアントごとにＮ＝１で約０．８倍の被覆率とした。インビボでの酵素の活性を高めると思われたＲｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙにおいて変異が見つかった際、階層２スクリーニングを、目的の特定の変異体を含む株のより高い複製（Ｎ＝８）で実施して、改善を確認した。階層２で確認された活性が改善されたバリアントを階層３検証に供し、そこでは変異体バリアントのＤＮＡ配列を、プロモーター及びターミネーター配列との相同性を含むプライマーを使用して、パフォーマンスが改善されたＲｅｂ Ｍ産生株からＰＣＲ増幅し、これを使用して、ＫＡＨ遺伝子を欠くＲｅｂＭ産生酵母を形質転換した。階層３は、酵母ゲノムの他の場所での意図しないランダムに導入された変異に起因して生じる階層１及び階層の偽陽性を排除する。ＮＮＴ由来の変異体Ｒｏ．ＫＡＨＮ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ対立遺伝子の結果として生じる活性及び生成物特異性を、表１３においてＲｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙに対する増加倍数で報告する。

【表15】

【0184】

Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙに対して１．１８倍～１．２５倍の範囲で、活性の改善をもたらす５つの変異が同定された。これらのうち４つは、Ｑ８４Ｒ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ及びＮ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａの最上位２つのバリアントで、適度な特異性の改善をももたらし、１．２倍の特異性の改善がもたらされた。

【0185】

実施例１４：完全な部位特異的飽和変異誘発によるＲｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙの進化
Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ（最上位の特異性バリアント、実施例１１）の活性をさらに改善するために、別のラウンドの部位特異的飽和変異誘発を適用して、カウレン酸をステビオールに変換する際にさらに高い活性を有する変異体バリアントを単離した（図１）。Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ配列の各アミノ酸残基を、実施例１３に記載されているように、縮重コドンＮＮＴによってコードされる１５の異なるアミノ酸に変異させ、得られた変異体を、機能的なＫＡＨ遺伝子を欠くＲｅｂＭ産生酵母で試験した。

【0186】

Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ変異体の相対的な インビボ ＫＡＨ活性及び生成物特異性を、実施例１１に記載されるように評価した 実施例１３に記載されているように、ライブラリー被覆率及び階層的スクリーニングを実施した。ＮＮＴ由来の変異体Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ対立遺伝子の結果として生じる活性及び生成物特異性を、図９及び表１４においてＲｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙに対する増加倍数で報告する。

【表16】

【0187】

Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙの１．３倍～２．２倍の範囲の活性の改善をもたらす２６の変異を同定した。同じ２６の変異により、Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙよりも特異性が向上し、最上位のバリアントであるＲｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙ／Ｓ４６０Ｉでは、１．８倍の特異性の改善が生じた。

【0188】

実施例１５：部位特異的変異誘発及び変異の統合によるＲｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａの進化
最上位のＫＡＨ活性を有する最上位の変異体バリアントの活性をさらに改善する試みにおいて、Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ（実施例１３、表１３）を、多くが以前の実施例において活性を改善することが示された６８のアミノ酸を標的とするさらに別のラウンドの部位特異的飽和変異誘発に供した（Ｗ５２、Ｑ８４、Ｔ１２３、Ｉ１２９、Ｔ１４２、Ｔ２１６、Ｉ２６５、Ｋ２６７、Ｔ２８３、Ｆ３３２、Ｖ３４０、Ｓ４５２、Ｓ４５７、Ｓ４６０、Ｓ５０５）：Ｗ５２、Ｑ８４、Ｔ１２３、Ｉ１２９、Ｔ１４２、Ｒ１７０、Ｍ１７１、Ｌ１７２、Ｐ１７３、Ｓ１７４、Ｆ１７５、Ｈ１７６、Ｑ１７７、Ｓ１７８、Ｃ１７９、Ｔ１８０、Ｔ２１６、Ｉ２６５、Ｎ２６６、Ｋ２６７、Ｅ２６８、Ｉ２６９、Ｋ２７０、Ｇ２７１、Ｌ２７２、Ｉ２７３、Ｉ２７７、Ｉ２７８、Ｋ２７９、Ｒ２８０、Ｅ２８１、Ｈ２８２、Ｔ２８３、Ｉ２８４、Ｋ２８５、Ａ２８６、Ｇ２８７、Ｅ２８８、Ｆ３３２、Ｖ３４０、Ｑ４０９、Ｌ４１０、Ｇ４１１、Ｋ４１２、Ｆ４１３、Ｓ４１４、Ｌ４１５、Ｐ４１６、Ｅ４１７、Ｇ４１８、Ｖ４１９、Ｅ４２０、Ｖ４２１、Ｒ４２２、Ｌ４２３、Ｐ４２４、Ｔ４２５、Ｌ４２６、Ｌ４２７、Ｉ４２８、Ｈ４２９、Ｈ４３０、Ｄ４３１、Ｋ４３２、Ｓ４５２、Ｓ４５７、Ｓ４６０、Ｓ５０５）。Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ配列のこれらの６８の各アミノ酸のそれぞれを、実施例１３に記載されているように、縮重コドンＮＮＴによってコードされる１５の異なるアミノ酸に変異させ、得られた変異体を、機能的なＫＡＨ遺伝子を欠くＲｅｂＭ産生酵母で試験した。Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ変異体の相対的なインビボＫＡＨ活性及び生成物特異性を、実施例１１に記載されるように評価した。ライブラリー被覆率及び階層的スクリーニングは、実施例１３に記載されているとおりであった。

【0189】

このスクリーニングで識別されたヒットはごくわずかであり、これらでさえ、わずかな活動の改善しかなかった。したがって、新しい最上位の活性ヒットＲｏ．ＫＡＨ Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａは、ライブラリーの親であるＲｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａよりも１０％未満だけ多くのＲｅｂ Ｍを生成した（表１５）。興味深いことに、Ｒｏ．ＫＡＨ Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａバリアントが、このセットでも最高の生成物特異性を示した：ライブラリーの親よりも１．７倍改善した。特定の変異Ｔ１４２Ｇはまた、初期のラウンドの操作で活性及び生成物特異性の両方に有益であり、その後の操作のラウンドごとに活性の改善が減少したことも確認された。Ｒｏ．ＫＡＨＡ２９７Ｙでは４倍超（実施例１１、表１１）、及びＲｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｗ／Ａ２９７Ｙでは４０％（実施例１４、表１４）。

【0190】

変異体Ｔ１４２Ｇが他のバックグラウンドで有益であるか否かを調査するために、それを、他の最上位の有益な変異であるＷ５２Ｔ及びＧ４６６Ａと組み合わせて試験した。簡単に説明すると、バリアントＲｏ．ＫＡＨ Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ及びＲｏ．ＫＡＨ Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａの遺伝子配列を、所望の変異を含むＰＣＲ増幅フラグメントの混合物からアセンブルした。各フラグメントは、各断片の端に重複する相同性を含んでいたため、この断片は配列中で重複していた。ＰＣＲを使用してインビトロで全ての断片をアセンブルすると、全長ＫＡＨ対立遺伝子が再構成された。末端の５’及び３’断片は、ランディングパッド配列のプロモーター及びターミネーターとも相同性があった。アセンブルされた全長遺伝子を、機能的なＫＡＨ遺伝子を欠くＲｅｂ Ｍ産生酵母に形質転換し、それらの相対インビボＫＡＨ活性及び生成物特異性を、実施例１１に記載されるように評価した。結果として得られたＲｏ．ＫＡＨバリアントの活性及び生成物特異性を、表１５においてＲｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａに対する増加倍数として報告する。

【表17】

【0191】

Ｒｏ．ＫＡＨの新しい４倍及び５倍突然変異体について、三重変異体Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａに対する劇的な改善は検出されなかった。後続の操作のラウンドごとに回収が減少するため、極小値に達した可能性がある。興味深いことに、Ｒｏ．ＫＡＨ Ｗ５２Ｔ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ配列にＴ１４２Ｇ変異のみを組み込むと、活性は低下したが、生成物特異性は向上し、Ｔ１４２ＧとＧ４６６Ａを組み込むと、活性と特異性の両方が向上した（表１５）。

【0192】

実施例１６：Ｒｏ．ＫＡＨバリアントのインビボ活性を改善するためのＮ末端ドメインスワップ
この実施例は、改善された活性を示す置換されたＮ末端ドメインを有する修飾カウレン酸ヒドロキシラーゼポリペプチドを提供する。

【0193】

カウレン酸ヒドロキシラーゼは、シトクロムＰ４５０酵素である。ほとんどの真核生物のＰ４５０は、膜結合タンパク質であり、膜会合型シトクロムＰ４５０酵素の高レベルドメイン構造は高度に保存されている。植物のシトクロムＰ４５０酵素は、膜標的化を媒介する約３０～５０アミノ酸のＮ末端ポリペプチド鎖とともに小胞体（ＥＲ）に組み込まれている。Ｐ４５０酵素の触媒ドメインは、小胞体の細胞質側に面している。Ｓｒ．ＫＡＨのＥＲ関連Ｎ末端を、他のＮ末端膜貫通ドメイン、例えば、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ（Ａａ．ＣＰＲ）のシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）のドメインと交換すると、ＫＡＨ酵素活性が向上することが実証された。ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５６１５３を参照のこと。以下に説明するように、同様のアプローチをＲｏ．ＫＡＨバリアントに対して試験した。

【0194】

Ｒｏ．ＫＡＨの膜貫通ドメインを、ＴＭＨＭＭサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／で入手可能）を使用して予測した。次に、それをＡａ．ＣＰＲの最初の６６アミノ酸（配列番号２２）で置き換えた。これらの短縮のＮ末端に融合したＡａ．ＣＰＲの配列を一定に保ちながら、異なる長さの短縮（Ｒｏ．ＫＡＨのＮ末端から２３～５０アミノ酸を除去）を調べた。キメラタンパク質の遺伝子配列を、重複する相同性を含むＡａ．ＣＰＲ及びＲｏ．ＫＡＨバリアントのＰＣＲ増幅フラグメントの混合物からアセンブルし、機能的なＫＡＨ遺伝子を欠くＲｅｂＭ産生酵母に形質転換した。キメラタンパク質のインビボＫＡＨ活性を、実施例１１に記載されているように評価して、ドメインスワップなしの対応するＲｏ．ＫＡＨバリアントに対するＲｅｂＭ力価の増大倍数として表１６に報告する。Ｒｏ．ＫＡＨの最初の２５アミノ酸を短縮すると、試験した各バリアントのＮ末端融合の活性が最も高くなることが確立された。したがって、これらのキメラのデータのみを表１６に示す。

【表18】

【0195】

試験された全てのＲｏ．ＫＡＨ変異体について、Ａａ．ＣＰＲとのＮ末端ドメインスワップは、ＫＡＨ活性の１０～１７％の改善を伴うＲｏ．ＫＡＨバリアントをもたらした。キメラタンパク質の生成物プロファイル（ＲｅｂＭ及びＣ２０Ｈ３２Ｏ４＋１Ｇｌｃの相対力価）は、Ｎ末端ドメインスワップによって変化しなかった（データは示していない）。副産物への分配は、膜標的ドメインではなく、Ｐ４５０の触媒ドメインのアミノ酸によって決定される可能性が高いため、これは予想される。控えめではあるが、Ｎ末端ドメインスワップに起因するＫＡＨ活性の増加は、Ｒｏ．ＫＡＨ配列内の点変異に起因する活性の改善と相加的であり、活性を改善するためのさらに別の手段を提供する。

【0196】

本明細書で引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が明確に及び個々に示され、参照により援用されているかのように、参照により本明細書に援用される。理解の明瞭化ために図示及び実施例を用いてある程度詳しく前述の発明を記載しているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく、特定の範囲及び改変をそれに対してなし得ることが、当業者には容易に明らかであろう。
配列の付表
配列番号１：Ｒｏ．ＫＡＨアミノ酸配列
ＭＥＶＴＶＧＳＷＶＡＬＳＬＶＦＶＳＩＩＶＧＷＡＷＳＶＬＤＷＶＷＬＫＰＫＫＬＥＲＣＬＲＥＱＧＬＫＧＮＳＹＷＦＬＹＧＤＭＫＥＮＳＩＬＬＫＱＡＫＳＫＰＭＮＬＳＴＳＨＤＩＡＰＱＶＩＰＦＶＤＱＴＶＫＶＹＧＫＮＳＦＤＷＩＧＰＩＰＲＶＮＩＭＮＰＥＥＬＫＤＶＦＴＫＹＤＤＦＩＫＰＩＳＮＰＬＦＫＬＬＡＴＧＬＡＮＹＥＧＥＫＷＡＫＨＲＲＩＩＮＰＴＦＨＳＥＫＬＫＲＭＬＰＳＦＨＱＳＣＴＥＭＩＫＥＷＥＳＬＶＳＫＥＧＳＳＣＥＬＤＶＷＰＦＬＥＮＭＴＡＤＶＩＳＲＴＡＦＧＴＳＹＫＫＧＲＫＩＦＥＬＬＲＥＱＡＩＹＡＴＫＡＩＱＳＦＹＩＰＧＷＲＦＬＰＴＫＭＮＫＲＭＫＥＩＮＫＥＩＫＧＬＩＫＧＩＩＩＫＲＥＨＴＩＫＡＧＥＥＴＫＤＤＬＬＧＡＬＭＥＳＮＬＫＤＩＲＥＨＧＫＮＮＫＮＦＧＭＳＩＥＤＶＩＥＥＣＫＬＦＹＦＡＧＱＥＴＴＳＶＬＬＶＷＴＭＶＬＬＧＱＮＱＮＷＱＤＲＡＲＱＥＩＬＱＶＦＧＳＮＫＰＤＦＤＧＬＴＨＬＫＶＶＴＭＩＬＬＥＶＬＲＬＹＰＡＶＩＥＬＰＲＴＩＨＫＫＴＱＬＧＫＦＳＬＰＥＧＶＥＶＲＬＰＴＬＬＩＨＨＤＫＥＬＷＧＤＤＡＮＥＦＫＰＥＲＦＳＥＧＶＳＫＡＴＫＳＲＬＳＦＦＰＦＧＧＧＰＲＩＣＩＧＱＮＦＡＭＭＥＡＫＬＡＬＶＬＩＬＱＨＦＴＦＥＬＳＰＳＹＡＨＡＰＳＹＲＩＴＬＱＰＱＹＧＶＰＩＩＬＨＲＲ
配列番号２：Ｒｏ．ＫＡＨコード核酸配列
ＡＴＧＧＡＡＧＴＡＡＣＣＧＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＧＴＡＧＣＴＴＴＧＴＣＣＴＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＣＧＴＣＧＧＴＴＧＧＧＣＴＴＧＧＴＣＣＧＴＴＴＴＡＧＡＴＴＧＧＧＴＣＴＧＧＴＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＡＧＡＡＡＧＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＡＡＧＧＧＴＡＡＣＴＣＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＧＴＡＴＧＧＴＧＡＣＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＣＡＡＧＣＴＡＡＧＴＣＴＡＡＧＣＣＡＡＴＧＡＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＣＴＣＴＣＡＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＣＡＣＡＡＧＴＴＡＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＣＡＡＧＧＴＣＴＡＣＧＧＴＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＴＣＧＡＴＴＧＧＡＴＣＧＧＴＣＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＡＡＴＡＴＣＡＴＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＡＡＴＴＴＣＴＡＡＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧＴＴＧＴＴＧＧＣＴＡＣＣＧＧＴＴＴＧＧＣＴＡＡＴＴＡＣＧＡＡＧＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＴＡＡＧＣＡＣＡＧＡＣＧＴＡＴＴＡＴＣＡＡＣＣＣＡＡＣＴＴＴＣＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＡＡＡＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＴＴＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＴＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＡＣＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＴＣＴＴＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＡＣＣＧＣＴＧＡＣＧＴＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＧＣＴＴＴＣＧＧＴＡＣＴＴＣＴＴＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＴＡＧＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＧＡＡＴＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＡＣＡＡＧＣＴＡＴＴＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＡＴＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡＧＧＴＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＴＴＡＡＧＧＧＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＣＡＣＴＡＴＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＡＧＧＴＧＣＴＴＴＧＡＴＧＧＡＡＴＣＴＡＡＣＴＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＧＧＴＡＴＧＴＣＴＡＴＣＧＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴＣＧＡＡＧＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＧＴＴＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＧＡＡＡＣＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＡＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＧＧＧＴＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＧＣＡＡＧＴＴＴＴＴＧＧＴＴＣＴＡＡＴＡＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＧＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＡＣＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧＧＡＡＧＴＣＴＴＧＡＧＡＴＴＧＴＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＴＡＴＣＧＡＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＴＴＣＡＣＡＡＧＡＡＧＡＣＴＣＡＡＴＴＧＧＧＴＡＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＡＧＡＴＴＧＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＡＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡＡＧＧＡＡＴＴＧＴＧＧＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＣＴＡＡＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＣＡＧＡＡＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＴＴＴＣＴＡＡＧＧＣＴＡＣＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡＴＴＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＡＡＡＡＣＴＴＴＧＣＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＡＣＴＴＣＡＣＴＴＴＣＧＡＡＴＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＡＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＡＣＡＡＣＣＴＣＡＡＴＡＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＡＴＴＡＴＣＴＴＧＣＡＣＣＧＴＣＧＴＴＡ
配列番号３：Ｒｓ．ＫＡＨ
ＭＥＶＴＶＡＳＳＶＡＬＳＬＶＦＩＳＩＶＶＲＷＡＷＳＶＶＮＷＶＷＦＫＰＫＫＬＥＲＦＬＲＥＱＧＬＫＧＮＳＹＲＦＬＹＧＤＭＫＥＮＳＩＬＬＫＱＡＲＳＫＰＭＮＬＳＴＳＨＤＩＡＰＱＶＴＰＦＶＤＱＴＶＫＡＹＧＫＮＳＦＮＷＶＧＰＩＰＲＶＮＩＭＮＰＥＤＬＫＤＶＬＴＫＮＶＤＦＶＫＰＩＳＮＰＬＩＫＬＬＡＴＧＩＡＩＹＥＧＥＫＷＴＫＨＲＲＩＩＮＰＴＦＨＳＥＲＬＫＲＭＬＰＳＦＨＱＳＣＮＥＭＶＫＥＷＥＳＬＶＳＫＥＧＳＳＣＥＬＤＶＷＰＦＬＥＮＭＳＡＤＶＩＳＲＴＡＦＧＴＳＹＫＫＧＱＫＩＦＥＬＬＲＥＱＶＩＹＶＴＫＧＦＱＳＦＹＩＰＧＷＲＦＬＰＴＫＭＮＫＲＭＮＥＩＮＥＥＩＫＧＬＩＲＧＩＩＩＤＲＥＱＩＩＫＡＧＥＥＴＮＤＤＬＬＧＡＬＭＥＳＮＬＫＤＩＲＥＨＧＫＮＮＫＮＶＧＭＳＩＥＤＶＩＱＥＣＫＬＦＹＦＡＧＱＥＴＴＳＶＬＬＡＷＴＭＶＬＬＧＱＮＱＮＷＱＤＲＡＲＱＥＶＬＱＶＦＧＳＳＫＰＤＦＤＧＬＡＨＬＫＶＶＴＭＩＬＬＥＶＬＲＬＹＰＰＶＩＥＬＩＲＴＩＨＫＫＴＱＬＧＫＬＳＬＰＥＧＶＥＶＲＬＰＴＬＬＩＨＨＤＫＥＬＷＧＤＤＡＮＱＦＮＰＥＲＦＳＥＧＶＳＫＡＴＫＮＲＬＳＦＦＰＦＧＡＧＰＲＩＣＩＧＱＮＦＳＭＭＥＡＫＬＡＬＡＬＩＬＱＨＦＴＦＥＬＳＰＳＨＡＨＡＰＳＨＲＩＴＬＱＰＱＹＧＶＲＩＩＬＨＲＲ
配列番号４：Ａｔ．ＫＡＨ
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配列番号５：Ｓｒ．ＫＡＨ（野性型Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａカウレン酸ヒドロキシラーゼ）
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配列番号６：Ｓｒ．ＫＯ
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配列番号７：Ｂｔ．ＧＧＰＰＳ
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配列番号８：Ｅｎｔ－Ｏｓ．ＣＤＰＳ
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配列番号１０：Ｐｓ．ＫＯ
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配列番号１１：Ａｔ．ＣＰＲ
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配列番号１２：ＵＧＴ８５Ｃ２
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配列番号１３：ＵＧＴ７４Ｇ１
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配列番号１４：ＵＧＴ９１Ｄ様３
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配列番号１５：ＵＧＴ７６Ｇ１
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配列番号１６：ＵＧＴ４００８７
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配列番号１７：Ａａ．ＣＰＲ（１ａ：６６ａ）－Ｒｏ．ＫＡＨ Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ（２６ａ：５２３ａ）
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配列番号１８：Ａａ．ＣＰＲ（１ａ：６６ａ）－Ｒｏ．ＫＡＨ Ｗ５２Ｔ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ（２６ａ：５２３ａ）
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配列番号１９：Ａａ．ＣＰＲ（１ａ：６６ａ）－Ｒｏ．ＫＡＨ Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ（２６ａ：５２３ａ）
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配列番号２０：Ａａ．ＣＰＲ（１ａ：６６ａ）－Ｒｏ．ＫＡＨ Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ（２６ａ：５２３ａ）
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配列番号２１：Ａａ．ＣＰＲ（１ａ：６６ａ）－Ｒｏ．ＫＡＨ Ｗ５２Ｔ／Ｔ１４２Ｇ／Ｎ１４６Ｔ／Ａ２９７Ｙ／Ｇ４６６Ａ（２６ａ：５２３ａ）
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配列番号２２：Ａａ．ＣＰＲシグナル配列
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配列番号２３：ＥＵＧＴ１１
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】