特表 2022-531207 組成的に画定されたプラスミドＤＮＡ／ポリカチオンナノ粒子およびその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-06

(54)【発明の名称】組成的に画定されたプラスミドＤＮＡ／ポリカチオンナノ粒子およびその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/14 20060101AFI20220629BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20220629BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20220629BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220629BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220629BHJP

【ＦＩ】

A61K9/14

A61K9/19

A61K47/36

A61K47/34

A61K47/42

A61K47/04

A61K38/18

A61K38/19

A61K48/00

A61K31/7088

A61K31/713

A61K31/711

A61K31/7105

A61K45/00

A61P43/00 105

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021564392

(86)(22)【出願日】2020-04-29

(85)【翻訳文提出日】2021-12-20

(86)【国際出願番号】 US2020030429

(87)【国際公開番号】W WO2020223323

(87)【国際公開日】2020-11-05

(31)【優先権主張番号】62/840,152

(32)【優先日】2019-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】501335771

【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100119530

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 和幸

(72)【発明者】

【氏名】ハイクアン マオ

(72)【発明者】

【氏名】イチョン フー

(72)【発明者】

【氏名】マーティン ギルバート ポンパー

(72)【発明者】

【氏名】ホンウェン リウ

(72)【発明者】

【氏名】イル ミン

(72)【発明者】

【氏名】クリストファー アルマン

(72)【発明者】

【氏名】クリスティン カーリントン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076CC26

4C076CC29

4C076DD26

4C076EE13

4C076EE25

4C076EE26

4C076EE30

4C076EE36

4C076EE37

4C076EE41

4C076FF36

4C076FF63

4C076GG06

4C084AA03

4C084AA13

4C084AA17

4C084AA19

4C084BA03

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4C084DB52

4C084MA05

4C084MA41

4C084MA44

4C084NA03

4C084ZB211

4C084ZB212

4C086AA01

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086MA06

4C086MA41

4C086MA44

4C086NA03

4C086ZB21

(57)【要約】

現在開示されている対象は、本明細書において「フラッシュ・ナノ複合体形成」または「（ＦＮＣ）」と呼ばれる、速度論的に制御された混合過程を提供し、ポリアニオン溶液、例えば、プラスミドＤＮＡ溶液の、ポリカチオン溶液との混合を加速させ、マイクロチャンバー内の乱流混合を通じて、高分子電解質複合体（ＰＥＣ）の集合速度を一致させ、それにより、ナノ粒子サイズ、組成、流体力学的サイズ、流体力学密度、表面電荷、およびポリアニオンペイロードの調整可能性により証明されるようなナノ粒子集合に関する速度論的条件の明示制御を達成する。
【選択図】図２Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーおよび１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーが均一的に混合される特性混合時間（τ_Ｍ）よりも長い、高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子の集合が生じる特性集合時間（τ_Ａ）を有する条件下で、前記１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーを前記１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーと均一的に混合することを含む、均一なＰＥＣナノ粒子を製造する方法。

【請求項2】

フラッシュ・ナノ複合体形成（ＦＮＣ）法を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

Ａ
（ａ）第１の可変流量において、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーを含む第１のストリームを拘束チャンバに流すことと、
（ｂ）第２の可変流量において、１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーを含む第２のストリームを前記拘束チャンバに流すことであって、前記第１のストリームおよび前記第２のストリームは、前記拘束チャンバに入る際、相反する側にあることと、
（ｃ）任意に、第３の可変流量において、１つまたは複数の水溶性治療薬、１つまたは複数の混和性有機溶剤、および／または１つまたは複数の凍結保護物質からなる群から選択される１つまたは複数の成分を含む第３のストリームを前記拘束チャンバに流すことであって、前記各ストリームは、前記拘束チャンバに入る際、前記他の２つのストリームから等距離にあることと、
前記第１の可変流量、前記第２の可変流量、およびもし存在する場合、前記第３の可変流量は、同一または異なりうることと、
（ｄ）レイノルズ数が約１，０００から約２０，０００になるまで、前記拘束チャンバ内で、前記第１のストリーム、前記第２のストリーム、およびもし存在する場合、前記第３のストリームを衝突させ、それにより、前記１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーおよび前記１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーを、ＰＥＣナノ粒子を継続的に生成する高分子電解質複合体形成過程を経るようにすることであって、前記高分子電解質複合体形成過程は、前記第１のストリーム、第２のストリーム、およびもし存在する場合、第３のストリームの成分が均一的に混合される特性混合時間（τ_Ｍ）よりも長い、前記ＰＥＣナノ粒子の集合が生じる特性集合時間（τ_Ａ）を有する条件下で生じることとを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１の可変流量、前記第２の可変流量、およびもし存在する場合、前記第３の可変流量は、それぞれ、約１０ミリリットル／分（ｍＬ／ｍｉｎ）以上である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記第１の可変流量、前記第２の可変流量、およびもし存在する場合、前記第３の可変流量は、それぞれ、約３ｍＬ／ｍｉｎから約３０ｍＬ／ｍｉｎである、請求項３または４に記載の方法。

【請求項6】

前記特性混合時間は、約１ｍｓから約２００ｍｓである、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記特性混合時間は、約１５ｍｓである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記レイノルズ数は、約２，０００から約５，０００の範囲を有する、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記第１のストリームのｐＨ値および前記第２のストリームのｐＨ値は、それぞれ、約２．５から約８．４の範囲を有する、請求項３～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記第１のストリームのｐＨ値および前記第２のストリームのｐＨ値は、それぞれ、約３．５である、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーは、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、プロタミン、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、ポリ（βアミノエステル）、カチオン性ペプチドおよびその誘導体からなる群から選択される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーは、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、負電荷ブロック共重合体、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、トリポリリン酸（ＴＰＰ）、オリゴ（グルタミン酸）、サイトカイン、タンパク質、ペプチド、成長因子、および核酸からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記第１のストリームおよび／または前記第２のストリームは、更に、１つまたは複数の水溶性治療薬を含む、請求項３～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記１つまたは複数の水溶性治療薬は、小分子、炭水化物、糖、タンパク質、ペプチド、核酸、抗体またはその抗体断片、ホルモン、ホルモン受容体、受容体リガンド、サイトカイン、および成長因子からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーは、プラスミドＤＮＡであり、前記１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーは、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはその誘導体である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

約２５から約８００μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡ濃度を有する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記プラスミド濃度は、約２５μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、および約８００μｇ／ｍＬからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法から生成される均一な１つの高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子または複数のＰＥＣナノ粒子。

【請求項20】

前記ナノ粒子は、ナノ粒子あたり平均約１から約５０部のｐＤＮＡを有する、請求項１９に記載のＰＥＣナノ粒子。

【請求項21】

前記ＰＥＣナノ粒子は、平均、ナノ粒子あたり約１．３から約２１．８部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約１．４部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約１．６部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約１．７部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約２．３部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約２．６部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約３．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約４．４部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約４．７部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約５．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約６．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約８．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約８．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約９．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約９．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約３．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約４．４部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約５．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約６．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約８．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約８．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約８．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約９．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約９．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約１０．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約１３．５部のｐＤＮＡ；またはナノ粒子あたり約２１．８部のｐＤＮＡを有する、請求項２０に記載のＰＥＣナノ粒子。

【請求項22】

前記ＰＥＣナノ粒子は、ナノ粒子あたり１つのｐＤＮＡを有する、請求項２０に記載のＰＥＣナノ粒子。

【請求項23】

前記ナノ粒子は、約３０ｎｍから約１３０ｎｍの平均サイズを有する、請求項１９～２２のいずれか一項に記載のＰＥＣナノ粒子。

【請求項24】

前記１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミンを含み、前記１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーは、プラスミドＤＮＡを含む、請求項１９～２３のいずれか一項に記載のＰＥＣナノ粒子。

【請求項25】

前記ＰＥＣナノ粒子は、前記プラスミドＤＮＡ内のリン酸塩に対する前記ポリエチレンイミン内のアミンの比率（Ｎ／Ｐ）が約３から約１０である、請求項１９～２４のいずれか一項に記載のＰＥＣナノ粒子。

【請求項26】

前記ＰＥＣナノ粒子は、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、および約１０からなる群から選択されるＮ／Ｐを有する、請求項２５に記載のＰＥＣナノ粒子。

【請求項27】

前記ＰＥＣナノ粒子は、全ｌＰＥＩに対する結合ｌＰＥＩのパーセンテージが約５０％から約７５％である、請求項１９～２６のいずれか一項に記載のＰＥＣナノ粒子。

【請求項28】

前記複数のＰＥＣナノ粒子は、約０．１から約０．２５の多分散指数（ＰＤＩ）を有する、請求項１９～２８のいずれか一項に記載のＰＥＣナノ粒子。

【請求項29】

前記ナノ粒子は、約６０Ｄａ／ｎｍ^３から約８０Ｄａ／ｎｍ^３の見掛け流体力学密度を有する、請求項１９～２８のいずれか一項に記載のＰＥＣナノ粒子。

【請求項30】

薬学的に容認可能な担体内に、請求項１９～２９のいずれか一項に記載の１つのＰＥＣナノ粒子または複数のＰＥＣナノ粒子を備える医薬製剤。

【請求項31】

前記製剤は、凍結乾燥製剤を含む、請求項３０に記載の医薬製剤。

【請求項32】

前記１つのＰＥＣナノ粒子または複数のＰＥＣナノ粒子は、少なくとも９カ月間、－２０°Ｃで長期的な安定性を示す、請求項３１に記載の医薬製剤。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

［連邦支援研究または開発］
本発明は、国立衛生研究所によりもたらされたＥＢ０１８３５８およびＥＢ０２４４９５の下、政府支援によりなされた。政府は、発明の一定の権利を有する。

【0002】

高分子電解質複合体（ＰＥＣ）形成は、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、タンパク質、およびペプチドを含む広範囲の高分子治療法の導入にかかる微粒子伝達手段を集めるために広く使用されている。有望な非ウイルス遺伝子導入アプローチとして、水溶液内のポリカチオン性担体を使用して、ｐＤＮＡ分子が凝縮され、ＰＥＣナノ粒子にパッケージ化される。集められたｐＤＮＡ／ポリカチオンナノ粒子は、標的細胞および細胞内コンパートメントへの輸送およびアクセスを促進し、酵素分解からｐＤＮＡを保護する（Ｓｈｉ他、２０１７）。遺伝子導入にかかる体内運命および有効性、およびナノ粒子のトランスフェクション比率は、近年の多くの努力により明らかにされるように、それらのサイズ範囲および分布（Ｈｉｃｋｅｙ他、２０１５）、形態学（Ｗｉｌｌｉｆｏｒｄ他）、表面特性、組成、および構造（Ｂｌａｎｃｏ他、２０１５）などのナノ粒子特性に依存する。難易度が高いが、これらのナノ粒子特性およびそれらの生体系との相互作用の間の関係についての詳細な理解に努める。この挑戦は、主にＰＥＣ集合速度の十分な制御の欠如に起因し、集められたナノ粒子の特性に影響する。

【発明の概要】

【0003】

いくつかの態様において、現在開示されている対象は、均一な高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子を製造する方法を提供し、方法は、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーおよび１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーが均一的に混合される特性混合時間（τ_Ｍ）よりも長い、ＰＥＣナノ粒子の集合が生じる特性集合時間（τ_Ａ）を有する条件下で、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーを１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーと均一的に混合することを含む。

【0004】

特定の態様において、方法は、フラッシュ・ナノ複合体形成（ＦＮＣ）法を含む。そのような態様において、方法は、（ａ）第１の可変流量において、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーを含む第１のストリームを拘束チャンバに流すことと、（ｂ）第２の可変流量において、１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーを含む第２のストリームを拘束チャンバに流すことであって、第１のストリームおよび第２のストリームは、拘束チャンバに入る際、相反する側にあることと、（ｃ）任意に、第３の可変流量において、１つまたは複数の水溶性治療薬、１つまたは複数の混和性有機溶剤、および／または１つまたは複数の凍結保護物質からなる群から選択される１つまたは複数の成分を含む第３のストリームを拘束チャンバに流すことであって、各ストリームは、拘束チャンバに入る際、他の２つのストリームから等距離にあり、第１の可変流量、第２の可変流量、およびもし存在する場合、第３の可変流量は、同一または異なりうることと、（ｄ）レイノルズ数が約１，０００から約２０，０００になるまで、拘束チャンバ内で、第１のストリーム、第２のストリーム、およびもし存在する場合、第３のストリームを衝突させ、それにより、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーおよび１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーを、ＰＥＣナノ粒子を継続的に生成する高分子電解質複合体形成過程を経るようにすることであって、高分子電解質複合体形成過程は、第１のストリーム、第２のストリーム、およびもし存在する場合、第３のストリームの成分が均一的に混合される特性混合時間（τ_Ｍ）よりも長い、ＰＥＣナノ粒子の集合が生じる特性集合時間（τ_Ａ）を有する条件下で生じることとにより、均一な高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子を継続的に生成することを含む。

【0005】

態様によっては、第１の可変流量、第２の可変流量、およびもし存在する場合、第３の可変流量は、それぞれ、約３ミリリットル／分（ｍＬ／ｍｉｎ）以上である。特定の態様において、第１の可変流量、第２の可変流量、およびもし存在する場合、第３の可変流量は、それぞれ、約３ｍＬ／ｍｉｎから約５０ｍＬ／ｍｉｎである。

【0006】

態様によっては、特性混合時間は、約１ｍｓから約２００ｍｓである。特定の態様において、特性混合時間は、約１５ｍｓである。

【0007】

いくつかの態様において、レイノルズ数は、約２，０００から約８，０００または約３，０００から約５，０００の範囲を有する。いくつかの態様において、第１のストリームのｐＨ値および第２のストリームのｐＨ値は、それぞれ、約２．５から約８．４の範囲を有する。特定の態様において、第１のストリームのｐＨ値および第２のストリームのｐＨ値は、それぞれ、約３．５である。

【0008】

いくつかの態様において、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーは、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、プロタミン、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、ポリ（βアミノエステル）、カチオン性ペプチドおよびその誘導体からなる群から選択される。

【0009】

いくつかの態様において、１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーは、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、負電荷ブロック共重合体、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、トリポリリン酸（ＴＰＰ）、オリゴ（グルタミン酸）、サイトカイン、タンパク質、ペプチド、成長因子、および核酸からなる群から選択される。特定の態様において、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される。

【0010】

更なる態様において、第１のストリームおよび／または第２のストリームは、更に、１つまたは複数の水溶性治療薬を含む。態様によっては、１つまたは複数の水溶性治療薬は、小分子、炭水化物、糖、タンパク質、ペプチド、核酸、抗体またはその抗体断片、ホルモン、ホルモン受容体、受容体リガンド、サイトカイン、および成長因子からなる群から選択される。

【0011】

態様によっては、１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーは、プラスミドＤＮＡであり、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーは、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはその誘導体である。そのような態様において、プラスミドＤＮＡ濃度は、約２５から約８００μｇ／ｍＬである。特定の態様において、プラスミド濃度は、約２５μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、および約８００μｇ／ｍＬからなる群から選択される。

【0012】

他の態様において、現在開示されている対象は、現在開示されている方法から生成される均一な高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子または複数のＰＥＣナノ粒子を提供する。

【0013】

いくつかの態様において、ＰＥＣナノ粒子は、ナノ粒子あたり平均、約１から約５０部のｐＤＮＡを有する。特定の態様において、ＰＥＣナノ粒子は、平均、ナノ粒子あたり約１．７から約２１．８部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．７から約３．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．７から約５．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．７から約６．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．７から約８．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．７から約８．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．７から約９．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．７から約９．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．７部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約３．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約４．４部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約５．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約６．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約８．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約８．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約８．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約９．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約９．５部のｐＤＮＡ；またはナノ粒子あたり約２１．８部のｐＤＮＡを有する。更により特定の態様において、ＰＥＣナノ粒子は、ナノ粒子あたり１つのｐＤＮＡを有する。

【0014】

いくつかの態様において、ＰＥＣナノ粒子は、約３５ｎｍから約１３０ｎｍの平均サイズを有する。特定の態様において、ＰＥＣナノ粒子は、約８０ｎｍの平均サイズを有する。

【0015】

態様によっては、ＰＥＣナノ粒子は、ポリエチレンイミンおよびプラスミドＤＮＡを含む。そのような態様において、ＰＥＣナノ粒子は、プラスミドＤＮＡ内のリン酸塩に対するポリエチレンイミン内のアミンの比率（Ｎ／Ｐ）が約３から約１０である。特定の態様において、ＰＥＣナノ粒子は、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、および約１０からなる群から選択されるＮ／Ｐを有する。

【0016】

いくつかの態様において、ＰＥＣナノ粒子は、ｌＰＥＩの全量に対する結合ｌＰＥＩのパーセンテージが約５０％から約７５％である。態様によっては、複数のＰＥＣナノ粒子は、約０．１および約０．２５の間の多分散指数（ＰＤＩ）を有する。態様によっては、ＰＥＣナノ粒子は、約＋２０から約＋５０ｍＶの表面電荷を有する。態様によっては、ＰＥＣナノ粒子は、ナノ粒子を懸濁させるために使用される媒体に依存し、約６０Ｄａ／ｎｍ^３から約８０Ｄａ／ｎｍ^３の見掛け流体力学密度を有する。

【0017】

他の態様において、現在開示されている対象は、現在開示されているＰＥＣナノ粒子または複数のＰＥＣナノ粒子を含む製剤を提供する。特定の態様において、製剤は、凍結乾燥製剤を含む。態様によっては、ＰＥＣナノ粒子または複数のＰＥＣナノ粒子は、少なくとも９カ月間、－２０°Ｃで長期的な安定性を示す。

【0018】

現在開示されている対象により全体をまたは一部を取り上げられている、現在開示されている対象のある態様は上述されており、他の態様は、本明細書で以下に記載されるような添付の例および図に関連した説明が進むにつれ明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0019】

特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願広報のコピーは、要求および必要な手数料の支払いに応じて庁より提供されるであろう。

【0020】

このように現在開示されている対象を一般的な言葉で説明してきており、ここでは添付の図面について参照するが、必ずしも縮尺どおりに記述されているわけではない。

【図1】図１Ａおよび図１Ｂは、現在開示されている拘束衝突噴流（ＣＩＪ）デバイスの代表的な実施形態の図を示す。図１Ａは、急速混合条件下で高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子を製造するために使用されるＣＩＪデバイスの実施形態を示す。ストリームは、それぞれ直鎖状ポリエチレンイミン（ｌＰＥＩ）およびプラスミドＤＮＡで満たされ、ｌＰＥＩ－ＤＮＡ複合体ナノ粒子は、収集される前に小さな拘束チャンバ内に形成される図１Ｂは３つの噴出口が１２０°の角度で離れているＣＩＪデバイスを示す模式図を示す。噴出口１は、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ＰＥＩ、プロタミン硫酸塩、ポリ（アルギニン、ポリ（リジン）および正荷電ブロック共重合体を含む正電荷ポリマーで満たされうる。噴出口２は、ポリ（アスパラギン酸）、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、トリポリリン酸、オリゴ（グルタミン酸）、サイトカイン、タンパク質、ペプチド、成長因子、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡを含む負電荷高分子で満たされている。噴出口３は、水混和性有機溶剤で蓋をされ、または水混和性有機溶剤で満たされ、最終製剤の極性をそのままで制御しうる（先行技術；米国仮特許出願第２０１７００４２８２９号、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＰＯＬＹＥＬＥＣＴＲＯＬＹＴＥ ＣＯＭＰＬＥＸ ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥＳ（高分子電解質複合体ナノ粒子の製造方法）、Ｍａｏ他、２０１７年２月１６日公開、参照によりその全体を本明細書に援用する。）

【図2】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ、および図２Ｇは、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子集合における特性混合時間τ_Ｍの効果を示す。（図２Ａ、図２Ｂ）平均ナノ粒子サイズＤｇにおける混合速度プロファイル（τ_Ａおよび流量Ｑ）の効果（図２Ａ）およびＤＬＳにより定められるサイズ分布幅として示される均一性（図２Ｂ）。混合速度スケールは、領域Ｉ（τ_Ｍ＜τ_Ａ）および領域ＩＩ（τ_Ｍ＞τ_Ａ）の２つの領域に分けられる。標識１、２および３は、３つの異なる混合条件から生成される３つの代表的な調製を示す。（図２Ｃ）Ｑ＝１．２５ｍＬ／ｍｉｎ、τ_Ｍ＝１．８×１０^５ｍｓ（調製１）、Ｑ＝５ｍＬ／ｍｉｎ、τ_Ｍ＝７９０ｍｓ（調製２）、およびＱ＝２０ｍＬ／ｍｉｎ、τ_Ｍ＝１５ｍｓ（調製３）で製造される３セットのナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像およびＤＬＳプロファイル。スケールバー＝５０ｎｍ（左パネル）および２００ｎｍ（右パネル）。（図２Ｄ、図２Ｅ）τ_Ｍ＝１５ｍｓにより製造される、平均ナノ粒子サイズＤｇ（図２Ｄ）およびゼータ電位（図２Ｅ）における入力ｐＤＮＡ濃度およびプラスミドサイズの効果。（図２Ｆ、図２Ｇ）τ_Ｍ＝１５ｍｓにより製造される、平均ナノ粒子サイズＤｇ（図２Ｆ）およびゼータ電位（図２Ｇ）におけるＮ／Ｐ比の効果。テストされた条件について、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子のサイズプロファイルおよびゼータ電位は、４から６のＮ／Ｐ比で変化しなかった。

【図3】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ、および図３Ｅは、ＦＮＣ集合ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子の組成を示す。（図３Ａ）結合ｌＰＥＩの分率および集められたナノ粒子の組成は、ナノ粒子が様々な入力ｐＤＮＡ濃度で、または様々なプラスミドにより製造された場合と同様のままであった。（図３Ｂ）乱流混合条件（Ｑ＝２０ｍＬ／ｍｉｎ、τ_Ｍ＝１５ｍｓ＜τ_Ａ）および層流混合条件（Ｑ＝５ｍＬ／ｍｉｎ、τ_Ｍ＝７９０ｍｓ＞τ_Ａ）下で集められた、ｇＷｉｚ－ＬｕｃおよびｇＷｉｚ－ＧＦＰナノ粒子製剤に対する３から６の入力Ｎ／Ｐ比を備える結合対遊離ｌＰＥＩの量および割合。ｇＷｉｚ－ＬｕｃおよびｇＷｉｚ－ＧＦＰプラスミドナノ粒子、それぞれに対する標識：ＬｕｃおよびＧＦＰ。（図３Ｃ）様々な流量下で５０または２００μｇ／ｍＬのｇＷｉｚ－Ｌｕｃ ｐＤＮＡにより製造されるナノ粒子の結合ｌＰＥＩ分率およびゼータ電位であって、全てのｇＷｉｚ－Ｌｕｃ／ｌＰＥＩナノ粒子が同一の平均的な組成を共有することを示唆している。（図３Ｄ）５．３２×１０^７Ｄａのモル質量を有するＩ２／ｌＰＥＩナノ粒子についての代表的ジムプロットであって、また、ゼロに近づく第２ビリアル（ｖｉｒａｌ）係数Ａ_２を示す。（図３Ｅ）Ｉ２プラスミドの変更された入力濃度により製造されるｇＷｉｚ－ＧＦＰ／ｌＰＥＩナノ粒子についての代表的なデバイプロット。

【図4】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄ、および図４Ｅは、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩ ＰＥＣナノ粒子の集合を示す。（図４Ａ、図４Ｂ）乱流混合条件（Ｑ＝２０ｍＬ／ｍｉｎ、τ_Ｍ＝１５ｍｓ）下で集められたナノ粒子についての、ナノ粒子の平均モル質量およびサイズの相関関係（図４Ａ）および回転半径（図４Ｂ）。（図４Ａ）および（図４Ｂ）における各データ点は、独立した製剤バッチを表す。（図４Ｃ）Ｑ＝２０ｍＬ／ｍｉｎにおいて様々なＮ／Ｐ比で調合されたナノ粒子への方程式２（上のパネル）および方程式３（下のパネル）の線状フィットの適用。（図４Ｄ）様々な混合条件により、すなわち様々なτ_Ｍで生産されたナノ粒子についての、ナノ粒子平均モル質量およびサイズの相関関係。２５μｇ／ｍＬの入力ｐＤＮＡ濃度（オレンジ）について、標識１から８は、７、１１、１５、２３、１６３、５８５５、４×１０^５ｍｓのτ_Ｍ、およびピペット操作をそれぞれ表す。１００μｇ／ｍＬ（青）について、標識１から６は、８、１５、４２、７９５、１０^４および２×１０^５ｍｓのτ_Ｍを、それぞれ表す。（図４Ｅ）乱流混合条件（τ_Ｍ＜τ_Ａ）下での提案された２ステップのｐＤＮＡ／ｌＰＥＩ ＰＥＣナノ粒子集合モデル。

【図5】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、および図５Ｄは、粒子あたり様々な数のｐＤＮＡを有するｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子のトランスフェクション過程および効率を示す。（図５Ａ）４時間の培養時間に続いて、ＰＣ３前立腺細胞株内で３Ｈ標識されたｐＤＮＡで製造されたナノ粒子の細胞取込定量分析（ｐＤＮＡ投与量＝０．６μｇ／１０^４細胞）。（図５Ｂ）４時間の培養での、ＰＣ３細胞内の様々なＮを有するナノ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏ（体外）トランスフェクション効率（ｐＤＮＡ投与量＝０．６μｇ／１０^４細胞）。アスタリスクは、Ｎ＝６．１ナノ粒子グループと比較した場合の有意水準を示す。（図５Ｃ）ナノ粒子の静脈注射後１２時間の、Ｂａｌｂ／ｃマウスの肺におけるｉｎ ｖｉｖｏ（体内）トランスフェクション効率（生物発光放射輝度）（投与量＝マウスあたり３０μｇのｐＤＮＡ）。（図５Ｄ）マウスあたり、３０μｇのｐＤＮＡを含有する^３Ｈ標識されたナノ粒子の静脈注射後１時間の、ナノ粒子の全身体内分布。標識：Ｈ：心臓、Ｋ：腎臓、Ｓ：胃、ＳＩ：小腸。統計解析について、一元配置分散分析および多重比較から＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図6】図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、および図６Ｅは、様々なＮ／Ｐ比およびペイロードレベル（Ｎ）で、速度論的制御条件下で生産されたｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子の導入遺伝子発現を示す。（図６Ａ）ＰＣ３がん細胞株内のナノ粒子（Ｗ１－８、表４参照）のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率（投与量＝０．６μｇのｇＷｉｚ－Ｌｕｃプラスミド／１０^４細胞）。（図６Ｂ）マウスあたり４０μｇのｇＷｉｚ－Ｌｕｃプラスミドを含有するナノ粒子（Ｗ１－８、表４参照）の静脈注射後１２時間の、健康なＢａｌｂ／ｃマウスの肺におけるｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション効率（左）および導入遺伝子発現に有意差を有するグループの代表的ＩＶＩＳ画像（右）。（図６Ｃ）マウスあたり４０μｇのＰＥＧ－Ｌｕｃプラスミドを含有するナノ粒子（Ｐ１－８、表４参照）の注射後４８時間の、ＮＳＧマウスのＬＬ２転移モデルの肺におけるｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション効率（左）および導入遺伝子発現に有意差を有するグループの代表的ＩＶＩＳ画像（右）。（図６Ｄ）マウスあたり４０μｇの３Ｈ標識されたｇＷｉｚ－Ｌｕｃプラスミドを含有するナノ粒子（Ｗ１、Ｗ２、Ｗ６、Ｗ８）の注射後１時間の、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける全身体内分布。標識：Ｈ：心臓、Ｋ：腎臓、Ｓ：胃、ＳＩ：小腸。（図６Ｅ）（図６Ｄ）において占めされるマウスの肺への体内分布。

【図7】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ、および図７Ｅは、既製のｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子のスケールアップ生産および長期保存安定性を示す。（図７Ａ）ＦＮＣセットアップを使用して製造されたナノ粒子の凍結乾燥および再構成。（図７Ｂ）０、１、３、６および９カ月間－２０°Ｃで保存された凍結乾燥ナノ粒子の再構成にかかるナノ粒子特性。０カ月は、凍結乾燥の完了直後に再構成された試料を表す。

【図8】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、および図８Ｄは、τ_Ｍ＜τ_Ａの様々な入力ｐＤＮＡ濃度および入力Ｎ／Ｐ比で調合されたＰＥＣナノ粒子のサイズ分布を示す。様々な入力ｐＤＮＡ濃度により製造されたナノ粒子の（図８Ａ）サイズ分布および（図８Ｂ）多分散指数（ＰＤＩ）。様々な入力Ｎ／Ｐ比により製造されたナノ粒子の（図８Ａ）サイズ分布および（図８Ｂ）多分散指数（ＰＤＩ）。

【図9】図９Ａおよび図９Ｂは、様々な入力ｐＤＮＡ濃度およびＮ／Ｐ比により製造されたナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。（図９Ａ）５０および８００μｇ／ｍＬの入力ｐＤＮＡ濃度で製造されたｇＷｉｚ－Ｌｕｃ ＰＥＣナノ粒子のＴＥＭ画像。２００μｇ／ｍＬの入力ｐＤＮＡ濃度で製造されたｇＷｉｚ－Ｌｕｃ ＰＥＣナノ粒子のＴＥＭ画像が図２Ｃに示されていることは注意すること。これらのＴＥＭ観察は、Ｑ＝２０ｍＬ／ｍｉｎの衝突流量における乱流混合条件下で製造されたｐＤＮＡ／ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）ナノ粒子の均一性を示す。（図９Ｂ）３または６の入力Ｎ／Ｐ比で製造されたｇＷｉｚ－ＧＦＰ ＰＥＣナノ粒子であって、様々なＮ／Ｐ比での調製にわたるサイズの類似性を明らかにしている。スケールバー＝５０ｎｍ（左側２つのパネル（ｐｅｎａｌ））および２００ｎｍ（右のパネル）。

【図10】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１０Ｅ、および図１０Ｆは、入力ｐＤＮＡ濃度によるサイズの調整可能性なしで、ピペット操作方法により生産された不均一なＰＥＣナノ粒子を示す。（図１０Ａ）Ｉ２プラスミド、（図１０Ｂ）ｇＷｉｚ－ＧＦＰプラスミド、（図１０Ｃ）ｇＷｉｚ－Ｌｕｃプラスミドにより作成されたＰＥＣナノ粒子のサイズ、および（図１０Ｄ）Ｉ２プラスミド、（図１０Ｅ）ｇＷｉｚ－ＧＦＰプラスミド、（図１０Ｆ）ｇＷｉｚ－Ｌｕｃプラスミドから作成されたＰＥＣナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ）。標識：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４は、ピペット操作によりナノ粒子を作成した後に続く４つの異なる手順を表す、表２参照。

【図11】図１１は、ＰＥＣナノ粒子懸濁液のｐＤＮＡ濃度の決定を示す。ＰＥＩ結合および集合に応じて、ｐＤＮＡ分子による２６０ｎｍでの吸収度は増加するが、なお、ｐＤＮＡ濃度に対する直線関係を維持している。この標準曲線は、任意のＰＥＣナノ粒子懸濁液のｐＤＮＡ濃度を評価するために使用された。

【図12】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅ、および図１２Ｆは、様々な入力ｐＤＮＡ濃度およびＮ／Ｐ比で、２０ｍＬ／ｍｉｎの流量により製造されたナノ粒子のＳＬＳデータを示す。（図１２Ａ）ナノ粒子あたり１．０２×１０^７Ｄａのモル質量、および１．７のｐＤＮＡ；（図１２Ｂ）ナノ粒子あたり３．５９×１０^７Ｄａのモル質量、および６．１のｐＤＮＡ；（図１２Ｃ）ナノ粒子あたり１．２７×１０^８Ｄａのモル質量、および２１．８のｐＤＮＡを有するｇＷｉｚ－Ｌｕｃ ＰＥＣナノ粒子のフルジムプロットであって、普遍的なゼロ第２ビリアル係数を明らかにする。（図１２Ｄ）Ｉ２プラスミドおよび（図１２Ｅ）ｇＷｉｚ－Ｌｕｃプラスミドにより様々な入力ｐＤＮＡ濃度で；または（図１２Ｆ）ｇＷｉｚ－Ｌｕｃプラスミドにより様々な入力Ｎ／Ｐ比で、製造されたＰＥＣナノ粒子の結合デバイプロット。（図１２Ａ）について、元の３４μｇ／ｍＬ（ナノ粒子の全質量濃度）の試料は、８１μｇ／ｍＬに濃縮され、続いて、５４μｇ／ｍＬになるように希釈された。モル質量は、濃度に応じてわずかに減少したように思われた。しかしながら、全体として、システムは０と同等な第２ビリアル係数を提示した。

【図13】図１３は、生体試料内の^３Ｈ標識されたｐＤＮＡの絶対量の定量的評価に対する標準曲線である。様々な量の^３Ｈ標識されたｐＤＮＡ溶液は、７ｍＬのガラスシンチレーションバイアルに含まれた４ｍＬのシンチレーション流体に追加された。同一の読み取り手順がセクション１．６に記載されたように適用され、標準曲線が得られた。実生体試料（細胞可溶化物またはマウス組織溶質）の全ての読み取りが、この標準曲線で示される量範囲に該当した。

【図14】図１４Ａおよび図１４Ｂは、ナノ粒子あたり様々な平均ｐＤＮＡコピー数ＮのＰＥＣナノ粒子の投与に応じた肺のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション効率を示す。（図１４Ａ）マウスあたり３０μｇのｐＤＮＡを含有するナノ粒子の注射後１２時間の、全てのグループのＩＶＩＳ全身生物発光画像。スケールバー：１０^－６フォトン（ｐｈｏｔｏｎ）／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒの単位での局所放射輝度。（図１４Ｂ）最高シグナルで３匹のマウスの均一化された肺で測定されたようなルシフェラーゼ存在量であって、よりＮが高いＰＥＣナノ粒子が、肺でのより高いトランスフェクション効率をもたらしたという知覚傾向を示す。

【図15】図１５Ａ、図１５Ｂ、および図１５Ｃは、ナノ粒子あたり様々なｐＤＮＡコピー数Ｎの投与されたＰＥＣナノ粒子の体内分布を示す。（図１５Ａ）肺、（図１５Ｂ）肝臓、および（図１５Ｃ）脾臓に導入されたｐＤＮＡの存在量。

【図16】図１６は、ＩＶＩＳ関心領域（ＲＯＩ）の定量的結果および組織内のルシフェラーゼ存在量の間の相関関係を示す。ＩＶＩＳ ＲＯＩ定量分析は、図１５で示されるように様々なＮのＰＥＣナノ粒子が投与されたマウスの肺領域への３０秒の暴露により実施された。肺は、撮像直後にマウスから採取され、超音波処理によりルシフェラーゼアッセイ報告の溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳ）内で均一化され、ルシフェラーゼタンパク質を放出した。続いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率評価についてのセクション１．６に記載されているように、組織試料内のルシフェラーゼ量が定められた。

【図17】図１７Ａ、図１７Ｂ、および図１７Ｃは、健康なＢａｌｂ／ｃマウスで速度論的制御条件により製造された様々なｐＤＮＡペイロードおよびＰＥＩ組成のＰＥＣナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション効率を示す。（図１７Ａ）マウスあたり４０μｇのｐＤＮＡを含有するＰＥＣナノ粒子の注射後１２、２４および４８時間における、表４に記載されている製剤が投与された全てのグループのＩＶＩＳ全身画像。標識Ｄは、毒性のため死亡したマウスを示す。スケールバー：１０^－７フォトン／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒの単位での局所放射輝度；および注射後（図１７Ｂ）２４時間および（図１７Ｃ）４８時間におけるＩＶＩＳ ＲＯＩ定量分析結果。

【図18】図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＮＳＧマウスのＬＬ２肺転移モデルにおいて、速度論的制御条件により製造された様々なｐＤＮＡペイロードおよびＰＥＩ組成のＰＥＣナノ粒子の腫瘍特異的トランスフェクションおよび発現効率を示す。（図１８Ａ）マウスあたり４０μｇのｐＤＮＡを含有するＰＥＣナノ粒子の注射後４８時間および７２時間における、表４に記載されている製剤が投与された全てのグループのＩＶＩＳ全身画像。スケールバー：１０^－５フォトン／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒの単位での局所放射輝度。（図１８Ｂ）注射後７２時間時点でのＩＶＩＳ ＲＯＩ定量分析結果。

【図19】図１９Ａおよび図１９Ｂは、トランスフェクションおよび導入遺伝子活性における重要な発見を伴うＰＥＣナノ粒子製剤の体内分布データを示す。（図１９Ａ）肝臓のｐＤＮＡ存在量、（図１９Ｂ）脾臓のｐＤＮＡ存在量。

【図20】図２０Ａは、ピペット操作でナノ粒子を製造し、再現性を示さない、３つの独立した実験を示す。図２０Ｂは、現在開示されているＦＮＣ集合方法でナノ粒子を製造し、優れた再現性を示す、３つの独立した実験を示す。

【図21】図２１Ａは、調製後１時間観察され、激しい凝集を示した、ピペット操作で製造されたナノ粒子を示す。図２１Ｂは、調製後９６時間観察され、良好な安定性を示した、ＦＮＣ集合ナノ粒子を示す。

【0021】

図面の簡単な説明中、図１４～図１６のＮの表記は下記の通りである。

【発明を実施するための形態】

【0022】

ここで、現在開示されている対象は、現在開示されている対象の全ての実施形態ではないが、いくつかの実施形態が示されている、添付の図面を参照して、以下においてより完全に説明されるであろう。全体にわたって、類似の数字は類似の要素を指す。現在開示されている対象は、多くの異なる形式で具現化されてもよく、本明細書に記載されている実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たすために提供される。実際、上述の説明および関連図面において提示された教示の利益を有する、現在開示されている対象に関係する当業者には、本明細書に記載されている、現在開示されている対象の多くの変型例および他の実施形態が思い浮かぶであろう。従って、現在開示されている対象が開示されている特定の実施形態に限定されないこと、および変型例および他の実施形態が添付の請求項の範囲内に含まれることが意図されていることを理解されたい。

【0023】

現在開示されている対象は、継続的および拡張可能な方法で高分子電解質複合体ナノ粒子を生産するフラッシュ・ナノ複合体形成（ＦＮＣ）法を提供する。現在開示されているＦＮＣ法は、共重合体の溶媒誘起の過飽和に頼ることなく、高分子電解質複合体形成の結果としてナノ粒子を生成する。ＦＮＣにより生産された高分子電解質複合体ナノ粒子は、従来の方法を使用して製造された高分子電解質複合体より、小さいサイズ、良好な均一性および低い多分散性を有する。例えば、大量調製方法と比較して、ＦＮＣ過程は、継続的なフロー操作過程において、調節可能なサイズで均一なナノ粒子の形成を可能にし、スケールアップ生産に適している。ＦＮＣは、また、より高い多用途性および粒子サイズおよび分布にかかる制御、より高い薬剤封入効率、およびコロイド安定性の改善を提供する（Ｓｈｅｎ他、２０１１；Ｄ’Ａｄｄｉｏ他、２０１３；Ｄ’Ａｄｄｉｏ他、２１０２；Ｇｉｎｄｙ他、２００８；Ｌｅｗｉｓ他、２０１５；Ｄ’Ａｄｄｉｏ他、２０１１；Ｌｕｏ他、２０１４；Ｓａｎｔｏｓ他、２０１４）。

【0024】

さらに、現在開示されている方法は、ポリマー鎖の絡み合いの改善を通じて、結果として凝縮および圧縮された高分子電解質ナノ粒子をもたらす。加えて、方法は、タンパク質または核酸などの治療薬を、それらの固有の生理化学的性質を保ったまま、高分子電解質ナノ粒子内に効率的に封入する手段を提供する。さらに、これらの新しい方法で製造されたＤＮＡ含有ナノ粒子の製剤は、粒子サイズおよび形状分布を改善し、大量調製方法と比較した場合に、より高い細胞トランスフェクション効率を示した。

【0025】

Ｉ．組成的に画定されたプラスミドＤＮＡ／ポリカチオンナノ粒子およびその製造方法
いくつかの実施形態において、現在開示されている対象は、均一な高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子を製造する方法を提供し、方法は、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーおよび１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーが均一的に混合される特性混合時間（τ_Ｍ）よりも長い、ＰＥＣナノ粒子の集合が生じる特性集合時間（τ_Ａ）を有する条件下で、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーを１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーと均一的に混合することを含む。

【0026】

特定の実施形態において、方法は、フラッシュ・ナノ複合体形成（ＦＮＣ）法を含む。そのような態様において、方法は、（ａ）第１の可変流量において、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーを含む第１のストリームを拘束チャンバに流すことと、（ｂ）第２の可変流量において、１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーを含む第２のストリームを拘束チャンバに流すことであって、第１のストリームおよび第２のストリームは、拘束チャンバに入る際、相反する側にあることと、（ｃ）任意に、第３の可変流量において、１つまたは複数の水溶性治療薬、１つまたは複数の混和性有機溶剤、および／または１つまたは複数の凍結保護物質からなる群から選択される１つまたは複数の成分を含む第３のストリームを拘束チャンバに流すことであって、各ストリームは、拘束チャンバに入る際、他の２つのストリームから等距離にあり、第１の可変流量、第２の可変流量、およびもし存在する場合、第３の可変流量は、同一または異なりうることと、（ｄ）レイノルズ数が約１，０００から約２０，０００になるまで、拘束チャンバ内で、第１のストリーム、第２のストリーム、およびもし存在する場合、第３のストリームを衝突させ、それにより、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーおよび１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーを、ＰＥＣナノ粒子を継続的に生成する高分子電解質複合体形成過程を経るようにすることであって、高分子電解質複合体形成過程は、第１のストリーム、第２のストリーム、およびもし存在する場合、第３のストリームの成分が均一的に混合される特性混合時間（τ_Ｍ）よりも長い、ＰＥＣナノ粒子の集合が生じる特性集合時間（τ_Ａ）を有する条件下で生じることとにより、均一な高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子を継続的に生成することを含む。

【0027】

本明細書に使用されているように、「高分子電解質複合体」（高分子電解質コアセルベートまたは「ＰＥＣ」としても知られる）は、逆荷電粒子（例えば、ポリマー－ポリマー、ポリマー－薬剤、およびポリマー－薬剤－ポリマー）間に形成された会合複合体である。高分子電解質複合体は、逆荷電ポリイオン、すなわち水溶性ポリカチオンおよび水溶性ポリアニオン間の静電相互作用により形成される。本明細書に使用されているように、「継続的に」という用語は、少なくとも２つの現在開示されているストリームが拘束チャンバに流れている間のＰＥＣナノ粒子の生成などの、時間的に連続した過程を指す。本明細書に使用されているように、「水溶性の」という用語は、水に溶解可能な化合物の能力を指す。

【0028】

いくつかの実施形態において、水溶性ポリイオンは、好適な溶剤に溶解され、結果として、高分子鎖に沿って分布する素電荷をもたらす。様々な実施形態において、高分子電解質複合体は、逆荷電の高分子が相互作用可能になったときに形成される。例えば、いくつかの実施形態において、高分子電解質複合体のフラッシュ沈殿ナノ粒子は、急速におよび均一的にストリーム、すなわち、ストリームに溶解された水溶性ポリカチオンおよびストリームに溶解された水溶性ポリアニオンを混合することにより形成される。

【0029】

いくつかの実施形態において、ストリームは、１つまたは複数の液体成分を含む組成であり、溶液または懸濁液内の固体または複数の固体を運搬可能である。典型的に、ストリームは有極性で、例えば酢酸または水である。より典型的に、ストリームは水である。

【0030】

ストリームは、レイノルズ数が約１，０００から約２０，０００になるまで、拘束チャンバ内で衝突し、それにより、水溶性ポリカチオン性ポリマーおよび水溶性ポリアニオン性ポリマーが、ＰＥＣナノ粒子を継続的に生成する高分子電解質複合体形成過程を経るようにする。本明細書に使用されているように、「衝突する」という用語は、高流量で拘束チャンバ内で互いに打ち合っている少なくとも２つのストリームを指す。現在開示されている方法およびデバイスを使用すると、驚くべきことに、ＤＮＡ分子などの分子が、そのような高いせん断条件下で損傷を受けないままでいることが示されている。

【0031】

高分子電解質複合体ナノ粒子を生成するための第１および第２のストリームの急速で均質な混合は、例えば、流量および混合効率および速度が制御されている間に、様々な方法を通して達成されうる。いくつかの実施形態において、高分子電解質複合体ナノ粒子は、求心ミキサまたはバッチフラッシュミキサを使用して、フラッシュ・ナノ複合体形成により生産されてもよい。例えば、参照によりその全体を本明細書に援用する、Ｊｏｈｎｓｏｎ他、米国仮特許出願第２００４／００９１５４６号参照。

【0032】

別の例として、第１および第２のストリームの混合は、少なくとも２つの高速噴流（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ）を伴う拘束衝突噴流（ＣＩＪ）デバイスを使用して達成されてもよく、このことは、参照によりその全体を本明細書に援用する、２０１７年２月１６日に公開された、Ｍａｏ他による、米国仮特許出願第２０１７００４２８２９号、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＲＥＰＡＲＩＮＧ ＰＯＬＹＥＬＥＣＴＲＯＬＹＴＥ ＣＯＭＰＬＥＸ ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥＳ（高分子電解質複合体ナノ粒子の製造方法）に開示されている。典型的な実施形態において、逆荷電ストリームは、別々の注射器に充填され、デジタル処理で制御された注射器ポンプ（例えば、Ｎｅｗ Ｅｒａ Ｐｕｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ、モデルＮＥ－４０００）によりＣＩＪデバイスの拘束チャンバに供給される。いくつかの実施形態において、拘束チャンバに運ばれた、相反するストリームが収集前に完全に反応できるように、出口としての役目を果たす長管ランナーが使用される。いくつかの実施形態において、第１のストリームおよび第２のストリームは、拘束チャンバに入る際、相反する側にある。本明細書に使用されているように、「相反する側」という用語は、ストリームが、通常、互いに反対側にあることを意味する。いくつかの実施形態において、ストリームは、互いに正反対にある。いくつかの実施形態において、ストリームは、互いに正反対でなくてもよい。

【0033】

本開示の方法は、また、１つまたは複数の追加のストリームを提供することを含む。例えば、いくつかの実施形態において、方法は、本明細書で以下に記載されているような治療薬、生理食塩水、水混和性有機溶剤（例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、イソプロパノール）などの、さらなる添加物を含む第３のストリームを提供することを含み、最終製剤の極性をそのままで、または凍結保護物質（例えば、グリセロール、トレハロース、スクロース、ブドウ糖）を制御し、再構成にかかるナノ粒子のコロイド安定性を改善することができうる。いくつかの実施形態において、第３の、第４のまたは更にもっと多くの噴流が、ＣＩＪデバイスに追加され、本明細書に記載のものなどの添加物で追加のストリームを調整してもよい。

【0034】

いくつかの実施形態において、現在開示されている方法は、更に、第３のストリームを拘束チャンバに流すことを含み、各ストリームは、拘束チャンバに入る際、他の２つのストリームから等距離にある。いくつかの実施形態において、ストリームを互いに等距離に保つことにより、ストリームの均一な混合が可能になる。

【0035】

いくつかの実施形態において、第１のストリームのｐＨ値および第２のストリームのｐＨ値は、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、および８．４を含む、約２．５から約８．４の範囲にある。いくつかの実施形態において、第１のストリームのｐＨ値および第２のストリームのｐＨ値は、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、および７．４を含む、約３．５から約７．４の範囲にある。いくつかの実施形態において、第１のストリームのｐＨ値および第２のストリームのｐＨ値は、それぞれ、３．５である。

【0036】

上述のＣＩＪデバイスの注射器に含まれるストリームが拘束チャンバ内で衝突させられる流量は、例えば、プログラム可能な注射器ポンプ経由で容易に調整されてもよい。さらに、いくつかの実施形態において、特性混合時間は、流量の関数であり、流量を変更することにより調整されうる。例えば、高流量において、フローパターンは、乱流様の特性を想定してもよく、混合時間は、数ミリ秒のオーダーであってもよい。これらの条件下で、効率的な質量移動が達成され、狭いサイズ分布の別々で均一なナノ粒子が生産されうる。様々な実施形態において、最終的な平均粒子サイズは、高分子電解質の混合時間、濃度および化学組成の関数である。

【0037】

混合速度に影響を与える、フローの混合効率および性質は、一般に、レイノルズ数（Ｒｅ）により画定され、無次元数は、粘性力に対する慣性流の比率を表す。ＣＩＪデバイスについて、総Ｒｅ数は、多数のストリームの寄与を累算することにより計算される：

【数1】

ここで、ρ_ｉはｉ番目の入口ストリームの溶液の密度（ｋｇ／ｍ^３）であり、Ｑ_ｉはｉ番目の入口ストリームの流量（ｍ^３／ｓ）であり、μ_ｉはｉ番目の入口ストリームの流体粘性（Ｐａ ｓ）であり、ｄ_ｉはｉ番目の入口ノズルの直径（ｍ）であり、ｎはストリームの数である。

【0038】

いくつかの実施形態において、反応物の混合の間に達成されたレイノルズ数は、約１，６００から約１０，０００、約２，０００から約１０，０００、約２，０００から約８，０００、約１，９００から約５，０００、および約３，０００から約５，０００など、約１，０００から約２０，０００である。

【0039】

いくつかの実施形態において、ストリームの可変流量は、約３ｍＬ／分から約５０ｍＬ／分の間など、約５ｍＬ／分から約３０ｍＬ／分の間、および約１０ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間など、約１ミリリットル（ｍＬ）／分から約５０ｍＬ／分の範囲である。いくつかの実施形態において、ストリームの可変流量は、約１０ｍＬ／分より多い。他の実施形態において、ストリームの可変流量は、約３ｍＬ／分より多い。

【0040】

特定の実施形態において、第１の可変流量、第２の可変流量、およびもし存在する場合、第３の可変流量は、それぞれ、約１０ミリリットル／分（ｍＬ／ｍｉｎ）以上である。更により特定の実施形態において、第１の可変流量、第２の可変流量、およびもし存在する場合、第３の可変流量は、それぞれ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０ｍＬ／ｍｉｎを含む、約１０ｍＬ／ｍｉｎから約２０ｍＬ／ｍｉｎの間である。

【0041】

実施形態によっては、特性混合時間は、約１ｍｓから約１００ｍｓの間、および約１ｍｓから約２５ｍｓの間を含む、約１ｍｓから約２００ｍｓの間である。いくつかの実施形態において、特性混合時間は、約２０ｍｓより短い。実施形態によっては、特性混合時間は、約１、１０、１５、２０、および２５ｍｓを含む、約１ｍｓから約２５ｍｓの間である。特定の実施形態において、特性混合時間は、約１５ｍｓである。

【0042】

いくつかの実施形態において、第１のストリームの流量に対する第２のストリームの流量の比率は、約０．１から約１０である。

【0043】

いくつかの実施形態において、添加物がストリーム内に含まれる。例えば、治療薬は、水溶性ポリカチオンを含有するストリームおよび／または水溶性ポリアニオンを含有する第２のストリームのいずれかに追加されてもよい。いくつかの実施形態において、第１のストリームおよび／または第２のストリームは、更に、１つまたは複数の水溶性治療薬を含む。いくつかの実施形態において、生成されたＰＥＣナノ粒子は、少なくとも１つまたは複数の水溶性治療薬を封入する。

【0044】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の水溶性治療薬は、小有機または無機分子などの小分子；単糖類；オリゴ糖；多糖類；ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体および誘導体からなる群から選択される生体高分子；ペプチド模倣薬；ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびリボザイム、デンドリマーおよびアプタマーからなる群から選択されるＤＮＡ、ＲＮＡ干渉分子などの核酸；抗体断片および細胞内抗体を含む抗体；細菌、植物、真菌、動物細胞、および動物組織からなる群から選択される生体物質から作成される抽出物；自然発生のまたは合成の物質；および任意のその組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の水溶性治療薬は、小分子、炭水化物、糖、タンパク質、ペプチド、核酸、抗体またはその抗体断片、ホルモン、ホルモン受容体、受容体リガンド、サイトカイン、および成長因子からなる群から選択される。

【0045】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーは、キトサン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、プロタミン、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、ポリ（β－アミノエステル）、カチオン性ペプチドおよびその誘導体からなる群から選択される。

【0046】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーは、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（グルタミン酸）、負電荷ブロック共重合体（ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（グルタミン酸）、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、トリポリリン酸（ＴＰＰ）、ポリ（グルタミン酸）、サイトカイン（例えば、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子）、タンパク質、ペプチド、成長因子、および核酸からなる群から選択される。

【0047】

本明細書に使用されているような「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸のポリマーを指す。本明細書に使用されているように、「ペプチド」は、約５０以下のアミノ酸などの、アミノ酸モノマーの短鎖を指す。

【0048】

本明細書に使用されているように、「成長因子」は、細胞の成長、増殖、治癒、および／または細胞分化を刺激可能な、タンパク質またはホルモンなどの物質を指す。成長因子の限定されない例には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子－ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、β－２－ミクログロブリン（ＢＤＧＦ ＩＩ）、および骨形成因子が含まれる。

【0049】

本明細書に使用されているように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、リン酸エステル多量体型のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）、または単鎖型または二重らせんのいずれかの、ホスホロチオエートおよびチオエステルなどの、任意のそのリン酸エステル類似体（ａｎｏｌｏｇｓ）を指す。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＲＮＡらせんが考えられる。核酸分子という用語、および特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、分子の一次および二次構造のみを指し、それを任意の特定の第３の形式に限定しない。従って、この用語は、とりわけ、線状または環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、および染色体で見つかる二本鎖ＤＮＡを含む。

【0050】

いくつかの実施形態において、核酸は、ＲＮＡ阻害剤である。本明細書に使用されているように、「ＲＮＡ阻害剤」は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、標的遺伝子の発現に干渉または阻害する任意の作用薬として画定される。このようなＲＮＡ阻害剤は、アンチセンス分子、リボザイム、小抑制性核酸配列を含むが、それらに限定されず、例えば、ガイドＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡまたは小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、標的遺伝子と相動性のあるＲＮＡ分子を含む核酸分子、またはその断片、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により標的遺伝子の発現を干渉または阻害する任意の分子に限定されない。

【0051】

いくつかの実施形態において、核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ベクターＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、核酸は、ｓｉＲＮＡではない。本明細書に使用されているように、「プラスミドＤＮＡ」という用語は、典型的に環状であり、単独で複製可能な小ＤＮＡ分子を指す。

【0052】

いくつかの実施形態において、プラスミドＤＮＡ濃度は、２５、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、および８００μｇ／ｍＬを含む、約２５から約８００μｇ／ｍＬの間である。特定の実施形態において、プラスミド濃度は、約２５μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、および約８００μｇ／ｍＬからなる群から選択される。

【0053】

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーは、プラスミドＤＮＡであり、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ＰＥＩおよびポリ（エチレングリコール）－ｇ－ＰＥＩ等だが、それらに限定されない、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびその誘導体からなる群から選択される。

【0054】

いくつかの実施形態において、第２のストリームは１つまたは複数の水溶性治療薬を含み、高分子電解質複合体形成過程は、生成された高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子内の１つまたは複数の水溶性治療薬を封入する。

【0055】

いくつかの実施形態において、高分子電解質複合体ナノ粒子は、キトサン／ＴＰＰ、プロタミン／ヘパリン硫酸、ＰＥＩ／ＤＮＡ、キトサン－ｇ－ＰＥＧ１７／Ｇｌｕ５、キトサン／ポリ－アスパラギン酸ナトリウム塩およびプロタミン硫酸塩／ヘパリンなどの、ポリカチオンおよびポリアニオンを含む。いくつかの実施形態において、第１のストリームは、キトサンを含み、第２のストリームは、トリポリリン酸（ＴＰＰ）およびタンパク質を含み、タンパク質は、生成された高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子内のＴＰＰおよびキトサンにより、共に封入される。ポリカチオンおよびポリアニオンの濃度は、使用される特定の高分子および結果として生じる高分子電解質複合体ナノ粒子の所望の形および均一性に依存することになる。特定の実施形態は、下記の例に記載される。

【0056】

いくつかの実施形態において、水溶性ポリカチオンおよび／または水溶性ポリアニオンの濃度を増加させることおよび／またはストリームのｐＨを増加させることは、形、粒子サイズおよび／または粒子サイズ均一性に影響を及ぼしうる。例えば、ＤＮＡを含有するストリームの濃度が増加すると、ＰＥＩなどの水溶性ポリカチオンの濃度は一定のままである一方、フラッシュ・ナノ複合体形成の間に形成される結果として得られるナノ粒子の形は、いくつかの実施形態において、通常、球状よりはむしろ、より棒状であるかもしれない。さらに、水溶性ポリカチオンおよび／または水溶性ポリアニオンのストリームのいずれかのｐＨを増加させることは、また、結果としてより棒状のナノ粒子を生じさせうる。反対に、球状のナノ粒子は、通常、いくつかの実施形態において、水溶性ポリカチオンおよび／または水溶性ポリアニオンのストリームの濃度および／またはｐＨを増加させることにより取得されるかもしれない。

【0057】

本明細書に記載されているように、いくつかの実施形態において、ストリームは、治療薬、例えば、水溶性治療薬などの添加物を含有することになる。例えば、タンパク質などの水溶性治療薬は、ＴＰＰなどの水溶性ポリアニオンを含有するストリームに追加されてもよい。タンパク質を含有する水溶性ポリアニオンのストリーム、およびキトサンを含有する水溶性ポリカチオン性のストリームは、例えば、ＣＩＪデバイスの注射器にそれぞれ充填され、キトサンおよびＴＰＰにより共に封入されるタンパク質含有のナノ粒子を取得してもよい。

【0058】

いくつかの実施形態において、核酸、例えばｓｉＲＮＡなどの水溶性治療薬は、例えば、ナノ粒子内のＰＥＩなどの水溶性ポリカチオンと複合化されてもよい。従って、本開示の水溶性ポリアニオンは、本明細書に記載のインスタント高分子電解質複合体ナノ粒子を形成する、および治療薬として作用することの両方に使用されてもよい。

【0059】

ＩＩ．高分子電解質複合体ナノ粒子
いくつかの実施形態において、現在開示されている対象は、フラッシュ・ナノ複合体形成（ＦＮＣ）法から生成される均一な高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子調製を提供し、方法は、（ａ）第１の可変流量において、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーを含む第１のストリームを拘束チャンバに流すことと、（ｂ）第２の可変流量において、１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーを含む第２のストリームを拘束チャンバに流すことであって、第１のストリームおよび第２のストリームは、拘束チャンバに入る際、相反する側にあることと、（ｃ）任意に、第３の可変流量において、１つまたは複数の水溶性治療薬、１つまたは複数の混和性有機溶剤、および／または１つまたは複数の凍結保護物質からなる群から選択される１つまたは複数の成分を含む第３のストリームを拘束チャンバに流すことであって、各ストリームは、拘束チャンバに入る際、他の２つのストリームから等距離にあり、第１の可変流量、第２の可変流量、およびもし存在する場合、第３の可変流量は、同一または異なりうることと、（ｄ）レイノルズ数が約１，０００から約２０，０００になるまで、拘束チャンバ内で、第１のストリーム、第２のストリーム、およびもし存在する場合、第３のストリームを衝突させ、それにより、１つまたは複数の水溶性ポリカチオン性ポリマーおよび１つまたは複数の水溶性ポリアニオン性ポリマーを、ＰＥＣナノ粒子を継続的に生成する高分子電解質複合体形成過程を経るようにすることであって、高分子電解質複合体形成過程は、第１のストリーム、第２のストリーム、およびもし存在する場合、第３のストリームの成分が均一的に混合される特性混合時間（τＭ）よりも長い、ＰＥＣナノ粒子の集合が生じる特性集合時間（τ_Ａ）を有する条件下で生じることとを含む。

【0060】

現在開示されている均一な高分子電解質複合体ナノ粒子は、上述のような、および下記の例におけるような、粒子サイズ、粒子サイズの分布、およびポリアニオンおよびポリカチオン成分を有する。いくつかの実施形態において、本開示の均一な高分子電解質複合体ナノ粒子は、本明細書に記載されているように、水溶性治療薬などの、１つまたは複数の添加物を封入する。

【0061】

いくつかの実施形態において、本方法にかかり形成される、高分子電解質複合体ナノ粒子は、粒子サイズが均一である、すなわち、粒子サイズの分布が狭い。例えば、いくつかの実施形態において、本ナノ粒子は、約５００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、または約４０ｎｍ未満の平均粒子サイズ（均質な直径）を有する。いくつかの実施形態において、生成された高分子電解質複合体ナノ粒子のサイズの範囲は、直径約２０ｎｍから約５００ｎｍである。いくつかの実施形態において、生成された高分子電解質複合体ナノ粒子のサイズの範囲は、直径約２５ｎｍから約１００ｎｍである。いくつかの実施形態において、生成された高分子電解質複合体ナノ粒子のサイズの範囲は、直径約３０ｎｍから約８０ｎｍである。いくつかの実施形態において、生成された高分子電解質複合体ナノ粒子のサイズの範囲は、直径約２５ｎｍから約６０ｎｍである。いくつかの実施形態において、生成された高分子電解質複合体ナノ粒子のサイズの範囲は、直径約３０ｎｍから約４５ｎｍである。いくつかの実施形態において、生成された高分子電解質複合体ナノ粒子は、直径約３０ｎｍである。特定の実施形態において、生成された高分子電解質複合体ナノ粒子のサイズの範囲は、直径約３０ｎｍから約８０ｎｍである。更により特定の実施形態において、ナノ粒子は、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、および１３０ｎｍを含む、約３５ｎｍから約１３０ｎｍの平均サイズを有する。特定の実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、約８０ｎｍの平均サイズを有する。

【0062】

いくつかの実施形態において、現在開示されているＰＥＣナノ粒子は、ナノ粒子あたり、１、１．５、２．０、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、および５０部のｐＤＮＡを含む、ナノ粒子あたり平均約１から約５０部のｐＤＮＡを有する。特定の実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、ナノ粒子あたり平均約１．３から約２１．８部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約１．４部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約１．６部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約１．７部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約２．３部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約２．６部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約３．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約４．４部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約４．７部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約５．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約６．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約８．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約８．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約９．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約９．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約３．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約４．４部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約５．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約６．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約８．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約８．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約８．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約９．１部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約９．５部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約１０．０部のｐＤＮＡ；ナノ粒子あたり約１．３から約１３．５部のｐＤＮＡ；またはナノ粒子あたり約２１．８部のｐＤＮＡを有する。特定の実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、ナノ粒子あたり平均４０部未満のｐＤＮＡを有する。

【0063】

特定の実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、ナノ粒子あたり平均約１．３から約２１．８部のｐＤＮＡを；いくつかの実施形態において、例えば、Ｉ２プラスミドに対して、ナノ粒子あたり１．３、１．７、２．３、４．７、および１３．５部のｐＤＮＡを含む、ナノ粒子あたり約１．３から約１３．５部のｐＤＮＡを；いくつかの実施形態において、例えば、ｇＷｉｚ－ＧＦＰに対して、ナノ粒子あたり１．６、１．７、２．６、６．１、および１０．０部のｐＤＮＡを含む、ナノ粒子あたり約１．６から約１０．０部のｐＤＮＡを；いくつかの実施形態において、例えば、ｇＷｉｚ－Ｌｕｃに対して、ナノ粒子あたり１．４、１．７、３．５、６．１、および２１．８部のｐＤＮＡを含む、ナノ粒子あたり約１．４から約２１．８部のｐＤＮＡを；および、いくつかの実施形態において、例えば、様々なＮ／Ｐ比を備えるｇＷｉｚ－Ｌｕｃに対して、ナノ粒子あたり４．４、５．０、６．１、および９．１部のｐＤＮＡを含む、ナノ粒子あたり約４．４から約９．１部のｐＤＮＡを有する。更により特定の実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、ナノ粒子あたり１つのｐＤＮＡを有する。

【0064】

いくつかの実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、ポリエチレンイミンおよびプラスミドＤＮＡを含む。実施形態によっては、ＰＥＣナノ粒子は、約３から約６の、プラスミドＤＮＡ内のリン酸塩に対するポリエチレンイミン内のアミンの比率（Ｎ／Ｐ）を有する。特定の実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、約３、約４、約５、および約６からなる群から選択されるＮ／Ｐを有する。更により特定の実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、全ｌＰＥＩに対して約５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、および７５％の結合ｌＰＥＩを含む、全ｌＰＥＩに対する約５０％から約７５％の結合ｌＰＥＩのパーセンテージを有する。

【0065】

いくつかの実施形態において、複数の生成された高分子電解質複合体ナノ粒子の多分散指数（ＰＤＩ）は、約０．０５から約０．２の範囲であってもよい。特定の実施形態において、複数のＰＥＣナノ粒子は、０．０１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、および０．２５を含む、約０．１から約０．２５のＰＤＩを有する。

【0066】

いくつかの実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、＋２０、＋２１、＋２２、＋２３、＋２４、＋２５、＋２６、＋２７、＋２８、＋２９、＋３０、＋３１、＋３２、＋３３、＋３４、＋３５、＋３６、＋３７、＋３８、＋３９、＋４０、＋４１、＋４２、＋４３、＋４４、＋４５、＋４６、＋４７、＋４８、＋４９、および＋５０ｍＶを含む、約＋２０から約＋５０ｍＶの表面電荷を有する。いくつかの実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、および８０Ｄａ／ｎｍ^３を含む、約６０Ｄａ／ｎｍ^３から約８０Ｄａ／ｎｍ^３の見掛け流体力学密度を有する。特定の実施形態において、ＰＥＣナノ粒子は、約６７．６８Ｄａ／ｎｍ^３の見掛け流体力学密度を有する。

【0067】

いくつかの実施形態において、現在開示されている対象は、薬学的に容認可能な担体内に現在開示されているＰＥＣナノ粒子または複数のＰＥＣナノ粒子を含む医薬製剤を提供する。実施形態によっては、医薬製剤は、凍結乾燥製剤を含む。特定の実施形態において、ＰＥＣナノ粒子または複数のＰＥＣナノ粒子の医薬製剤は、１、２、３、４、５、６、７、８、および９カ月を含む、少なくとも９カ月間、－２０°Ｃで長期的な安定性を示す。

【0068】

本明細書に使用されているように、「薬学的に容認可能な担体」は、水、生理食塩水、ブドウ糖液、ヒト血清アルブミン、リポソーム、ヒドロゲル、微小粒子およびナノ粒子を含むことが意図されているが、それらに限定されない。薬剤活性のある組成物に対するこのような媒体および作用薬の使用は、当技術分野で周知であり、よって、効果的なレベルでそれぞれを組成物に組み込むさらなる例および方法については、ここで議論される必要はない。

【0069】

扱われている特定の条件により、現在開示されているナノ粒子は、液体または固体の剤形に調合され、全身的にまたは局所的に投与されてもよい。作用薬は、当業者には周知のように、例えば、時限的または持続的な徐放性の形態で与えられてもよい。製剤および投与に関する技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ ｅｄ．）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）で見つけてもよい。好適な経路には、経口、口腔、吸入噴霧により、舌下、直腸、経皮、膣内、経粘膜、鼻腔または腸内投与；筋肉内、皮下、髄内注射、およびくも膜下腔内、脳室内直接、静脈内、関節内、胸骨内、関節滑液嚢内、肝内、病巣内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射または他の導入形態を含む、非経口投与を含んでもよい。

【0070】

投与の形式および／または経路は変化しうるが、いくつかの実施形態において、現在開示されているナノ粒子または医薬組成物は、非経口で（例えば、皮下、静脈内、または筋肉内投与により）投与され、また、いくつかの実施形態において、肺に直接投与される。肺への局所投与は、溶液エアロゾルまたは粉末エアロゾルであってもよい、エアロゾル式医薬品を含む、様々な製剤方針を使用して達成されうる。粉末製剤は、典型的に、小粒子を含む。好適な粒子は、例えば、空気ジェットミル、ボールミルまたは振動ミル、ふるい分け、微量沈降、噴霧乾燥、凍結乾燥または制御結晶化で粉砕することにより、当技術分野で周知の任意の手段を使用して製造されうる。典型的に、粒子は、直径約１０ミクロン以下になるであろう。粉末製剤は、任意に、当業者には周知の、少なくとも１つの粒子性の薬学的に容認可能な担体を含有してもよい。好適な医薬担体の例には、アラビノース、グルコース、フルクトース、リボース、マンノース、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、デンプン、デキストラン、マンニトールまたはソルビトールなどの、単糖類、二糖類、多糖類および糖アルコールを含む糖類が含まれるが、それらに限定されない。あるいは、溶液エアロゾルは、当業者には周知の任意の手段、例えば、組成物の定量投与を行うために適した弁で提供されるエアロゾルバイアルを使用して製造されてもよい。活性成分の吸入可能な形式が噴霧可能な水分、有機または水分／有機分散である場合、吸入デバイスは、噴霧器、例えば、１ｍＬから５０ｍＬ、一般に１ｍＬから１０ｍＬの分散を含む空気ジェット噴霧器、または超音波噴霧器などの、例えば、従来の空気噴霧器；または例えば、１０μＬから１００μＬのより少ない噴霧量が可能なハンドヘルド噴霧器であってもよい。

【0071】

注入に関して、開示の作用薬は、ハンクス液、リンゲル液などの生理的に適合する緩衝液、または生理食塩水緩衝液または等張糖液などの、水溶液内で調合および希釈されてもよい。

【0072】

全身投与に適した投与への開示の実施のため、本明細書に開示された化合物を調合するために薬学的に容認可能な不活性担体を使用することは、開示の範囲内である。適切な担体の選択および好適な製造の実施により、本開示の組成物、特に、溶液として調合されたものは、例えば静脈注射により、非経口で投与されてもよい。化合物は、当技術分野でよく知られている薬学的に容認可能な担体を使用して、経口投与に適した投与量に容易に調合されうる。このような担体により、治療を受ける対象者（例えば、患者）が経口摂取するために、開示の化合物を錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として調合できるようになる。

【0073】

経鼻または吸入投与のため、開示の作用薬は、また、当業者には周知の方法により調合されてもよく、例として、生理食塩水などの、可溶化、希釈、または分散物質、ベンジルアルコール、吸収促進剤、およびフッ化炭素などの防腐剤を含んでもよいが、それらに限定されない。

【0074】

本明細書には特定の用語が用いられているが、それらは、単に総称および記述的な意味で使用され、限定することを目的としていない。他に画定されていない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、この現在記載されている対象が属する技術分野における当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。

【0075】

長年の特許法の慣習に従い、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、請求項を含む本出願で使用される場合、「１つまたは複数」を指す。従って、例えば、「対象者（ａ ｓｕｂｊｅｃｔ）」への言及には、文脈上明らかに正反対である場合（例えば、複数の対象者（ａ ｐｌｕｒａｌｉｔｙ ｏｆ ｓｕｂｊｅｃｔｓ））等を除き、複数の対象者を含む。

【0076】

本明細書および請求項を通じて、「含む（備える）」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）という用語は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、非排他的な意味で使用される。同様に、「含む」（「ｉｎｃｌｕｄｅ」）という用語およびその文法上の変化形は、リスト内の項目の列挙が、リスト化された項目に置換または追加されうる他の類似の項目を除外しないように、限定しないことを意図している。

【0077】

本明細書および添付の請求項のため、「約」という用語は明示的に値、量または範囲と共に記されないかもしれないが、別段の指示がない限り、明細書および請求項で使用される、量、サイズ、寸法、割合、形、形成、パラメーター、パーセンテージ、パラメーター、数量、特性、その他の数値を表す全ての数は、「約」という用語によりいかなる場合も改変されるものとして理解される。従って、反対に指示されていない限り、以下の明細書および添付の請求項で説明される数値パラメーターは、正確ではなく、正確である必要がないが、現在開示されている対象により取得されるように求められた所望の特性に応じた許容範囲、換算係数、四捨五入、測定誤差等、および当業者には周知のその他の要因を反映して、要望通り、おおよそであってもよく、および／またはより大きくてもよく、またはより小さくてもよい。例えば、「約」という用語は、値に言及する場合、開示された方法を実施するために、または開示された組成を採用するために、変動量が適切である限り、指定された量から、いくつかの実施形態において±１００％、いくつかの実施形態において±５０％、いくつかの実施形態において±２０％、いくつかの実施形態において±１０％、いくつかの実施形態において±５％、いくつかの実施形態において±１％、いくつかの実施形態において±０．５％、およびいくつかの実施形態において±０．１％の変化量を含むように意図されうる。

【0078】

さらに、「約」という用語は、１つまたは複数の数または数値範囲に関連して使用される場合、範囲内の全ての数を含む、全てのそのような数を指すと理解されるべきであり、説明された数値の上および下の境界を拡大することにより、その範囲が改変される。端点による数値範囲の列挙には、全ての数、例えば、その範囲内（例えば、１から５の列挙には、１、２、３、４、および５、およびその分数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１等が含まれる）およびその範囲内の任意の範囲内に属している、その分数を含む全整数が含まれる。

【実施例】

【0079】

以下の例には、現在開示されている対象の代表的な実施形態を実施するために当業者に指針を与えることが含まれている。本開示および当該技術分野の一般的なレベルに照らすと、当業者は、以下の例が単に例示的であるにすぎないこと意図しており、現在開示されている対象の範囲を逸脱しない限り、多数の変更、改変、および代替が採用されうることが理解できる。以下の例は、説明のために提供されるのであり、限定するためではない。

【0080】

例１ プラスミドＤＮＡ／ポリカチオン複合体ナノ粒子の集合にかかる速度論的制御
１．１ 概要． 直鎖状ポリエチレンイミン（ｌＰＥＩ）などの、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）およびポリカチオンから集められた高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子は、遺伝子治療のための主要な非ウイルス導入手段に相当する。ｐＤＮＡ／ポリカチオンナノ粒子のサイズ、形および表面特性を制御するための試みは、主として、ポリカチオン性担体の微調整分子構造および媒体極性、ｐＨ、および温度などの集合条件に焦点を当ててきた。これらのナノ粒子の再現可能な生産は、しかしながら、集合過程およびナノ粒子構造の非平衡性質を考慮すると、集合速度を制御する能力にかかっている。

【0081】

いくつかの実施形態において、現在開示されている対象は、本明細書で「フラッシュ・ナノ複合体形成」または「（ＦＮＣ）」と呼ばれる、速度論的に制御された混合過程を採用し、ｐＤＮＡ溶液とポリカチオンｌＰＥＩ溶液との混合を加速させ、マイクロチャンバー内の乱流混合を通してＰＥＣ集合速度を一致させ、それにより、ナノ粒子サイズ、組成、およびｐＤＮＡペイロードの調整可能性により証明されるようなｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子集合についての速度論的条件の明示制御が達成される。実験およびシミュレーションを組み合わせたアプローチを使用して、ナノ粒子あたり平均約１．７から約２１．８部のｐＤＮＡを有し、約３５ｎｍから約１３０ｎｍの平均サイズを有するｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子が、大量混合方法よりも均一に、拡張可能に製造された。明確に画定された組成およびサイズを有するこれらのナノ粒子を使用すると、ｐＤＮＡペイロードおよびナノ粒子製剤組成は、これらのナノ粒子のトランスフェクション効率および毒性と相関関係を持ちうる。これらのナノ粒子は、凍結乾燥製剤内で少なくとも９カ月間、－２０°Ｃで長期的な安定性を示し、遺伝子治療のために明確に画定された特性を備えた既製のナノ粒子生成物が拡張可能に製造できることを実証した。

【0082】

１．２ 背景． 集合成分の高分子電解質性は、それらの静電複合体形成率と比較して、ポリマー鎖の拡散率が遅いことを示す。結果として、ＰＥＣ集合は、非平衡で、速度論的に阻害された複合体構造を生み出す。集合過程の間、様々な成分の一時的で局所的な濃度プロファイルは、各ＰＥＣ集合が明確なナノ粒子の形成をどのように開始し、広め、終了するのかを決定する。これらの速度論的条件にかかる制御は、ナノ粒子が集合を始める前に、集合成分の均質な分布が可能になるように、混合が集合過程よりも速い場合にのみ可能になる。均一な混合により、ＰＥＣナノ粒子が均一な特性で生産できるようになるだけでなく、集合システムへの入力条件の操作を通じて、ナノ粒子のサイズ、表面特性、および組成を制御する機会も提供される。この集合条件には、様々な集合成分が均一的に混合される、特性混合時間（τ_Ｍ）を、ＰＥＣナノ粒子集合が生じる、特性集合時間（τ_Ａ）未満に減少させることが必要となる。ピペット操作およびボルテックスを含む従来の混合方法では、この要求を満たすことができない。

【0083】

混合は、様々なフローの接触部分にわたる集合成分の拡散を通じて生じる。τ_Ｍを短くするための最も一般的なアプローチは、層流および乱流の両セットアップにより達成されうる、拡散経路の短縮である。層流セットアップにおいて、混合は、様々な流路が小さい区画内に導かれることにより達成される。しかしながら、製造が困難なため、流体力学的集束（Ｌｕ他、２０１４；Ｌｕ他、２０１６）、および液滴の閉じ込め（Ｊｕｕｌ他、２０１２）などの工学的アプローチが開発され、表面積対体積率を更に増加させた。一方、乱流セットアップにおいて、乱流渦は、効率的な拡散ために、急流の断絶を非常に小さくすることが可能である。流れ乱流は、「Ｔ」コネクタ（Ｋａｓｐｅｒ他、２０１１）、テスラミキサおよびヘリンボンミキサ（Ｆｅｎｇ他、２０１６）、同軸ジェットミキサ（Ｌｉｕ他、２０１５；Ｌｉｕ他、２０１７）、拘束衝突噴流（ＣＩＪ）（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＰｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ；ＬｉｕおよびＦｏｘ、２００６）、およびマルチインレットボルテックスミキサ（ＭＩＶＭ）（Ｌｉｕ他、２００８；Ｈｅ他、２０１７；Ｈｅ他、２０１８）により与えられうる。

【0084】

集合成分の混合速度のより高度な制御のおかげで、従来の方法と比較してより均一な特性を備えた、薬剤を負荷したナノ粒子を製造することにおいて、様々な程度の成功が果たされている。近年、ＣＩＪミキサにおける乱流混合が採用され、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子を生成し、方法の拡張性およびサイズを制御する実現可能性が証明された（Ｓａｎｔｏｓ他、２０１６）が、混合およびナノ粒子集合の反応速度論は、分析されていない。速度論的に限定された集合は、ナノ粒子形成がフラッシュ・ナノ沈殿（ＦＮＰ）と呼ばれる過程で混合された溶媒の溶媒混合率対高分子凝集および薬剤分配率により調整されうる、両親媒性高分子ミセルの自己集合に関して、よく説明されてきている（ＳａａｄおよびＰｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ、２０１６）。ＦＮＰには、疎水性鎖凝集のための特性時間よりも短い時間で、混和性溶媒を運搬する２つの相反する噴出を混合するＭＩＶＭまたはＣＩＪミキサでの乱流混合が使用される。均一なナノ粒子は、均質な過飽和条件の結果として生産されうる（Ｎｉｋｏｕｂａｓｈｍａｎ他、２０１６；Ｚｈａｎｇ他、２０１２）。このような混合状況下で速度論的条件を変化させることにより、ナノ粒子形成のための拡散律則および溶解支配型凝集メカニズム（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＰｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ、２００３）、およびナノ粒子サイズを予測するための数量モデル（Ｐａｇｅｌｓ他、２０１８）が提案されている。

【0085】

１．３ 作業の範囲． 現在開示されている対象は、一部において、ｐＤＮＡ／ポリカチオンＰＥＣナノ粒子集合の速度論的制御態様を調査する。より具体的には、現在開示されている対象は、「フラッシュ・ナノ複合体形成（ＦＮＣ）」と呼ばれるＣＩＪミキサでの乱流混合アプローチを使用した、ＰＥＣ集合およびナノ粒子形成の速度論的制御を証明する。ＦＮＣにおける高分子電解質ｐＤＮＡおよび直鎖状ポリエチレンイミン（ｌＰＥＩ）の拡散速度は、ＦＮＰにおける溶媒およびポリマーの拡散速度とは著しく異なり、ここで、高分子電解質電荷中和によってもたらされる複合体形成速度は、ＦＮＰにおけるポリマー鎖セグメントの疎水性凝集よりも速く、ＰＥＣは、ＦＮＰで起こる有機溶剤混合なしに、水媒体で生じる。これらの要因は、ＦＮＣにおけるナノ粒子へのＰＥＣ集合の速度論的制御についての独特の過程および追加的な挑戦に寄与する。現在開示されている研究について、ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）が、検査担体として選択された。それは、非ウイルス担体についてのベンチマークとしてのそのｉｎ ｖｉｖｏでの高いトランスフェクション効率、ＧＭＰ品質でのその有効性、および均一な電荷密度を伴うポリカチオンとしてのその分子の単純さによるものである。ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）のＰＥＣナノ粒子および４ｋｂから７ｋｂの典型的なサイズのプラスミドをモデルシステムとして使用して、ＣＩＪミキサにおける混合フローレジメンが流体力学シミュレーションを使用して検査され、ＰＥＣ集合過程にかかる速度論的制御を達成する必要条件が分析された。ｐＤＮＡ／ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）ナノ粒子組成にかかる精巧な制御が、速度論的条件の操作を通じて証明され、ナノ粒子組成、サイズおよび表面特性のそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのトランスフェクション効率への効果が特徴付けられた。速度論的制御条件下で集められたｐＤＮＡ／ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）ナノ粒子の利点が、それらの非ウイルス遺伝子治療に対するトランスフェクション効率および翻訳ポテンシャルに関して分析された。

【0086】

１．４ 代表的結果および議論． 混合は、乱流構造におけるｐＤＮＡおよびｌＰＥＩフロー間の接触部分にわたる分子拡散として生じる。

【0087】

１．４．１．ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子集合についての結果における特性混合時間τ_Ｍの効果． 次に、ｇＷｉｚ－Ｌｕｃ ｐＤＮＡ（６．７ｋｂ）溶液を衝突させた際のｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子のＦＮＣ集合における流量Ｑの効果が実験的に検査された。以下の条件は、本研究において変更しなかった：ｌＰＥＩ溶液のｐＨは、３．５で一貫して維持され、ｌＰＥＩの同一のプロトン化の程度を７５％程度に維持し、それによりｌＰＥＩの同一の電荷密度を維持した（Ｃｕｒｔｉｓ他、２０１６）。同様に、ＤＮＡ溶液の濃度は、検査の際、２００μｇ／ｍＬの濃度で維持され、ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）溶液は、４のＮ／Ｐに対応する濃度で維持された。Ｑを増加させる、すなわち、τ_Ｍを減少させると、ナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）測定により与えられたサイズ（ｚ平均流体力学直径、Ｄｇ）は、下限の安定期に到達するまで減少した（図２Ａ）。

【0088】

プラスミド濃度が２００μｇ／ｍＬから５０μｇ／ｍＬまで減少したとき、またはプラスミドサイズが６．７ｋｂから４．４ｋｂまで減少したとき（Ｉ２プラスミド、表１参照）、測定されたナノ粒子サイズも同一の傾向をたどった。一貫したＤＬＳサイズが得られた臨界Ｑ_０は、入力ｐＤＮＡ濃度の低下により、およそ１５ｍＬ／ｍｉｎからおよそ８．５ｍＬ／ｍｉｎに低下した（臨界τ_Ｍ、_０は、およそ２０ｍｓからおよそ８５ｍｓに増加した）。ＤＬＳにより与えられたナノ粒子のサイズ分布幅（セクション１．６参照）は、Ｑにおいて同一の依存度を示し（図２Ｂ）、τ_Ｍが減少するにつれて、ナノ粒子の均一性が上昇したことを示した。流量依存の平均サイズおよび均一性は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により確認された（図２Ｃ）。

【0089】

【表1】

【0090】

これらの発見に基づいて、特性混合時間τ_Ｍまたは流量Ｑの分野は、２つの領域に分けることができた：
「領域Ｉ」は、平均ＤＬＳサイズおよび均一性が、Ｑまたはτ_Ｍと無関係に、一定のままである、速度論的条件に対応する。このことは、全てのナノ粒子が同様の集合経路を有するように、マイクロチャンバー内の混合条件が、均一な集合の発生を可能にする最大程度の均一性に達したことを示す。この集合過程は、特性集合時間（τ_Ａ）として画定される時間スケールを有し、τ_Ｍ＜τ_Ａのとき、ほぼ全てのｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子が、同一の画定条件（ｐＤＮＡおよびｌＰＥＩの濃度、温度、媒体ｐＨ、イオン強度等）下で集められる。言い換えれば、集合成分ｐＤＮＡおよびｌＰＥＩは、ナノ粒子形成よりも速い速度で混合され、ほとんど「同時に」およびほとんど同一の微小環境でナノ粒子集合を開始しうる。上述されるように、Ｄ_ＰＥＩ≫Ｄ_ＤＮＡであり、ｐＤＮＡフロー領域に主として拡散するのはｌＰＥＩ分子であり、その結果、ｐＤＮＡ分子の近辺にｌＰＥＩ分子が均一に分布される。これにより、ｐＤＮＡおよびｌＰＥＩの入力濃度プロファイルにより画定される一様な初期速度論的条件が確立される。

【0091】

「領域ＩＩ」は、分子混合過程がナノ粒子集合過程より長い時間スケールで生じるような、τ_Ｍ＞τ_Ａである速度論的条件に対応する。この条件下で、ナノ粒子集合は、混合が進むにつれて不均一に生じ、部分的に形成されたナノ粒子は、更に、不明確に遅延分子と結び付きうる。これにより、ナノ粒子サイズが不均一で、おそらくより大きくなり、ナノ粒子の組成は、流量および混合条件に依存する。流量が増加し、τ_Ｍ＝τ_Ａを許容する臨界条件に近づくにつれ、集合混合物は、より乱流混合構造に近づき、より均質になる。混合物組成は、ｐＤＮＡおよびｌＰＥＩの入力濃度プロファイルに近くなる。例えば、調製１（Ｑ＝１．２５ｍＬ／ｍｉｎおよびτ_Ｍ＝１．８×１０^５ｍｓ）、調製２（Ｑ＝５ｍＬ／ｍｉｎおよびτ_Ｍ＝７．９×１０^２ｍｓ）、および調製３（Ｑ＝２０ｍＬ／ｍｉｎおよびτ_Ｍ＝１５ｍｓ）を比較すると、ナノ粒子の集合体は、本分析と一致する特性を示した（図２Ａ、図２Ｃ）。流量が増加するにつれ、すなわち、τ_Ｍが減少するにつれ、フロー混合プロファイルは、層流混合から乱流混合への遷移を経るが、これは、領域ＩＩ（τ_Ｍ＞τ_Ａ）から領域Ｉ（τ_Ｍ＜τ_Ａ）へのナノ粒子集合遷移と同時に起こる。これにより、流量を１ｍＬ／ｍｉｎから５０ｍＬ／ｍｉｎに変更することにより、溶液混合時間スケールをｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子集合時間スケールと一致させる、ＣＩＪデバイスにおける乱流混合の能力が示される。

【0092】

１．４．２． ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子集合におけるｐＤＮＡ濃度およびＮ／Ｐ比の効果． 領域Ｉで画定される速度論的条件下で集合が生じる場合、ｐＤＮＡおよびｌＰＥＩの集合濃度プロファイルは、入力濃度プロファイル（すなわち、衝突溶液におけるｐＤＮＡ濃度およびＮ／Ｐ比）によりうまく画定される。これにより、ナノ粒子特性における集合濃度プロファイルの効果を検討する機会が提供される。２０ｍＬ／ｍｉｎの流量（図２Ａ、図２Ｂに記されるように、τ_Ｍ＝１５ｍｓ）がこの比較に対して選択された。図２Ｄで示されるように、ｐＤＮＡ濃度の増加は、結果としてナノ粒子サイズの拡大をもたらした。これらの製剤の比較的狭いサイズ分布および低いＰＤＩ（０．１２－０．１６）（図８Ａ、図８Ｂ）、およびＴＥＭ観察（図９Ａ）により、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子の速度論的に制御された混合および均一な集合が確認された。他方、入力ｐＤＮＡ濃度が４００μｇ／ｍＬで固定された場合、様々なＮ／Ｐ比で集められたナノ粒子は、同様のサイズに帰し（図２Ｅおよび図９Ｂ）、プラスミドが、初期ｌＰＥＩ濃度と無関係に、この混合条件下で、Ｎ／Ｐ比が３まで減少した場合も最大圧縮度まで、最も効果的に圧縮されたことが示されている。本観察では、更に、集合過程の間、ｐＤＮＡと複合体を形成するためのｌＰＥＩ分子のアクセスを最大化する際に、τ_Ｍ＜τ_Ａである乱流混合の効果が確認される。加えて、ゼータ電位評価により、使用されるプラスミド、ｐＤＮＡ濃度（図２Ｅ）または入力Ｎ／Ｐ比（図２Ｇ）にかかわらず、全ての製剤に対する表面電荷が＋４０ｍＶ程度で同様であることが明らかになった。このことは、ナノ粒子表面が類似しており、過量のｌＰＥＩ分子から成ることを示唆する。ピペット操作などの、ｐＤＮＡ／ポリカチオンナノ粒子の調製のための従来の混合方法は、数秒の単位の混合時間をもたらすため、この速度論的スケールでは領域ＩＩに該当する。続いてボルテックスを行う、ピペット操作方法（表２）により、流量Ｑ＜１．５ｍＬ／ｍｉｎで、ＦＮＣ調製のナノ粒子と類似した平均サイズおよび均一性のナノ粒子が生成された（図９）。入力ｐＤＮＡ濃度に対するナノ粒子サイズの明確な依存性は見られなかった。さらに、例１．４．７で用いられる様々なピペット操作手順（表２）の結果として、より高い変動率が見られた。

【0093】

【表2】

【0094】

１．４．３． 平均的ナノ粒子組成および遊離ｌＰＥＩ測定． ｌＰＥＩによるｐＤＮＡの完全複合体形成は、３より大きいＮ／Ｐ比で達成される。従って、Ｎ／Ｐ≧３の集合は、結果として、ナノ粒子懸濁液における過度の非結合または遊離ｌＰＥＩをもたらすだろう（Ｙｕｅ他、２０１１）。集められたナノ粒子の実際の組成を評価するため、遊離ｌＰＥＩの量が、公開されたプロトコルに従って、まず特徴付けられた（Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ他、２００４）。ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子が図２で画定されるような乱流混合条件（Ｑ＝２０ｍＬ／ｍｉｎおよびτ_Ｍ＝１５ｍｓ）下で集められた場合、様々なｐＤＮＡ濃度入力を備える全てのナノ粒子製剤は、入力Ｎ／Ｐ比が４で固定される限り、同一の結合対遊離ｌＰＥＩ組成を有した（図３Ａ）。結合ｌＰＥＩの量は、ほぼ７０％前後で、ナノ粒子における２．７のＮ／Ｐ比に対応した。ｐＤＮＡ濃度入力を一貫させて入力Ｎ／Ｐを３から６に調整した場合（図３Ｂ、左パネル）、ナノ粒子に結合したｌＰＥＩの量は、入力Ｎ／Ｐ比にかかわらず一貫していたことがわかった。これにより、ｐＤＮＡに結合したｌＰＥＩの量が、様々な調製条件下で製造されたナノ粒子間で同一であったことが示され、この平均的組成は、ナノ粒子における２．７４±０．１４のＮ／Ｐ比（ｎ＝２８の個別の調製）に対応する。結果として生じるこれらの「過電荷」ナノ粒子は、全ての電荷されたグループがＰＥＣ形成の過程の電荷中和に関与可能なわけではないという事実と一致する（Ｂｅｒｒｅｔ、２００５）。ｇＷｉｚ－Ｌｕｃは、結果として、Ｎ／Ｐ比が減少するにつれ、わずかに少ない量の結合ｌＰＥＩをもたらすようだという点で、テストされた２つのプラスミドの間にわずかな違いがあった。とはいえ、総体的結論として、ｐＤＮＡにｌＰＥＩが結合されてＰＥＣを形成するにあたっては、ｐＤＮＡまたはｌＰＥＩの濃度にも、入力Ｎ／Ｐ比にも影響を受けないということは明確である。

【0095】

１．４．４． 電荷中和はＰＥＣナノ粒子集合に対する律速段階ではない． ｐＤＮＡ中和に対する結合Ｎ／Ｐ比がこのように一貫して最小であることは、非乱流混合条件下で製造されたナノ粒子にも当てはまったことが分かった（図３Ｂの右パネルおよび図３Ｃ）。様々な混合条件下で製造されたナノ粒子に対して測定された表面電荷（すなわち、ゼータ電位）も、同一のままであった（図３Ｃ）。ナノ粒子のｌＰＥＩ含有量およびゼータ電位は、電荷中和および複合体形成過程に直接関連しているため、図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃで明らかになった発見は、電荷中和およびｐＤＮＡ－ｌＰＥＩ結合がナノ粒子集合に対して律速していないことを示唆する。言い換えれば、電荷中和は、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩ ＰＥＣの、ナノ粒子への凝縮および鎖の折り畳みよりもずっと速い速度で起こる。すなわち、電荷中和は、全特性集合時間τ_Ａよりもずっと短い時間スケールで起こる。速度論的に制御された混合条件下で達成されるｐＤＮＡ／ｌＰＥＩ ＰＥＣナノ粒子集合過程は、現在、２つの明確なステップにモデル化でき、これは、幾つかの文献報告（ＢａｒｒｅｌｅｉｒｏおよびＬｉｎｄｍａｎ、２００３；Ｓａｎｔｈｉｙａ他、２０１２）に一致する：
ステップ１：ｌＰＥＩ分子がｐＤＮＡ分子の近辺に拡散するするとすぐに、ｐＤＮＡに結合する、電荷中和段階。本研究において、入力ｐＤＮＡ濃度またはＮ／Ｐ比にかかわらず、ｌＰＥＩは、およそ２．７のＮ／Ｐ比で一貫してｐＤＮＡと複合体を形成した。本段階では、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩ ＰＥＣが形成され、律速していない。
ステップ２：中和されたｐＤＮＡ／ｌＰＥＩ複合体が折り畳みによる変形および凝縮を経て（Ｏｓａｄａ他、２０１２；Ｔａｋｅｄａ他、２０１７）、複合体の体積を著しく減少させる、すなわち、圧縮が生じる、ＰＥＣ鎖集合。これは、ステップ２に対する時間スケールがステップ１の時間スケールよりずっと大きく、律速段階である。従って、特性集合時間τ_Ａは、主としてステップ２の完了時刻により決定される。構造が正味の正の表面電荷からの反発力により安定化される前の、集合過程の間、隣接するｐＤＮＡまたはＰＥＣが、互いに十分拡散するほど近い場合、多数のＰＥＣを伴う圧縮および集合が起こりうる。その結果、多数のｐＤＮＡが明確な単一のナノ粒子にパッケージ化される。

【0096】

１．４．５． 各ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子の平均ｐＤＮＡコピー数の特性評価． 現在開示されているナノ粒子が狭いサイズ分布および一貫した組成で製造されうると仮定すると、ナノ粒子のモル質量は、静的光散乱（ＳＬＳ）技術を使用して特徴付けられた。ナノ粒子内ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩ質量比が固定された場合（図３Ａ）、ナノ粒子の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）値が一定で、加法規則に従うことが想定された（セクション１．６参照）（ＤａｉおよびＷｕ、２０１２）。散乱光の強度を測定して、各散乱角および各ナノ粒子質量濃度に関するレイリー散乱比を取得することにより、および濃度および角依存曲線をジムプロットにおけるゼロ濃度およびゼロ角度に外挿することにより、ナノ粒子の重量平均モル質量、

【数2】

が計算され、そこから、ナノ粒子あたりのｐＤＮＡの平均コピー数

【数3】

が計算されうる（セクション１．６参照）（Ｄｕｂｉｎ他、２０１２；ＨｉｅｍｅｎｚおよびＬｏｄｇｅ、２００７）。

【0097】

【数4】

＝１３．５のｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子に対する代表的ジムプロットが図３Ｄに示される。本方法により測定された全てのナノ粒子について（図３Ｄおよび図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ）、ジムプロット分析では、これらのナノ粒子の第２ビリアル係数（Ａ）はゼロに近づくことが示される。本発見は、ＳＬＳ測定に使用された溶媒（水）および温度（２５℃）条件がθ条件を満たす、すなわち、ＰＥＣ鎖圧縮がランダム充填法で生じて、ＰＥＣ－溶媒相互作用がファンデルワールス相互作用およびＰＥＣ鎖の体積膨張を打ち消すことを意味する。このθ条件は、これらのナノ粒子の光散乱挙動の濃度依存が無視でき、レイリー比が固定された濃度で測定でき、デバイプロットを使用した計算が測定できるため、平均モル質量の測定を著しく容易にする（図３Ｅおよび図１２Ｄ、図１２Ｅ、図１２Ｆ）。他方、入力Ｎ／Ｐ比を変更することにより、各ナノ粒子のプラスミドの平均数にわずかな変化が示された。４００μｇ／ｍＬのｐＤＮＡの入力に対して、入力Ｎ／Ｐ比が３から６に変わると、Ｎは、Ｎ／Ｐ＝３に対して９．２から、Ｎ／Ｐ＝４に対して６．１、Ｎ／Ｐ＝５に対して５．０、およびＮ／Ｐ＝６に対して４．４まで減少した（図１２Ｆ）。

【0098】

１．４．６． ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子のＤＬＳサイズおよびモル質量の相関関係． ３つ全てのプラスミドに対して異なる条件下で製造されたナノ粒子の測定された重量平均モル質量がそれらの流体力学的体積寸法（すなわち、Ｄ_ｚ ^３）に対してプロットされた場合（図４Ａ）、共通の線形相関が現れた：

【数5】

ここで、Ｄ_ｚは、ナノ粒子懸濁液のＤＬＳにより測定されるｚ平均サイズであり、М_ｗは、ＳＬＳにより与えられたナノ粒子の重量平均モル質量である。このような、プラスミドおよびナノ粒子集合で使用された条件と無関係な様々なナノ粒子への「普遍的な」フィットは、ＰＥＣ集合ユニットおよびこれらのナノ粒子の圧縮度が類似していることを示唆する。より具体的には、これらのナノ粒子は、６７．６８Ｄａ／ｎｍ^３の同一の見掛け流体力学密度を有する。すなわち、ｐＤＮＡは、そのうちどんなに多くのｐＤＮＡが単一のナノ粒子に充填されていたとしても、同一程度に凝縮される。

【0099】

同様に、ナノ粒子の重量平均モル質量が回転半径の二乗（すなわちＲ_ｇ ^２）に直線比例する、別の組成－サイズ相関関係も特定された（図４Ｂ）：

【数6】

この相関関係は、５０から１３０ｎｍのＤ_ｚを備えるナノ粒子にうまくフィットし、実験データ点からの偏差は、サイズが５０ｎｍ未満になるにつれて増加する。この

【数7】

およびＲ_ｇ ^２間の直線関係により、更に、これらのｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子がθ条件下で集められることが確認され、ＰＥＣユニットは、テストされた溶媒および温度条件下でのランダム充填挙動を想定する（ＨｉｅｍｅｎｚおよびＬｏｄｇｅ、２００７）。

【0100】

ステップ１で形成された各ＰＥＣ鎖（その結合ｌＰＥＩ全てを備えるｐＤＮＡ）がステップ２のナノ粒子集合に対する充填ユニット（すなわち、ＰＥＣユニット）として見なされる場合、ｐＤＮＡ／ＰＥＩナノ粒子は、１つまたは多数のＰＥＣユニットのいずれかを含む実態としてモデル化されうる。ナノ粒子集合は、量子化された組み合わせパターンに従う。４から６に変化するＮ／Ｐにより生成されたナノ粒子が同様のモル質量を有する一方、Ｎ／Ｐ＝３により生成されたナノ粒子は、モル質量が重いが、なお、方程式２および方程式３の２つの線状フィットに該当する（図４Ｃ）。ｌＰＥＩがｐＤＮＡを十分に圧縮するのに必要な量を超過している、２．７より大きい入力Ｎ／Ｐでは、量子化された組み合わせが有効なままであることが推定される。このモデルは、更に、層流混合条件（τ_Ｍ＞τ_Ａ）下で製造されたナノ粒子も、同一の相関関係に従う（図４Ｄ）という事実により支持される。均一性がより低い（すなわち、分布がより広い）ナノ粒子が、ナノ粒子あたりより少ない部数のｐＤＮＡを備えるより均一なナノ粒子と同一の見掛け流体力学密度を有するように見えることは注目に値する。本分析は、ステップ１で形成されたＰＥＣユニットがナノ粒子集合の構成要素であり、それらのＰＥＣユニットが、θ条件下での溶液のＰＥＣユニット鎖のランダムな折り畳みと同様の方法で圧縮され、結び付けられるという仮説と一致する。

【0101】

１．４．７． 乱流混合条件下のＦＮＣにおけるｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子集合速度のモデリング． これらの発見および上述のナノ粒子集合モデルに基づいて、τ_Ｍ＜τ_Ａ条件下の集合速度が分析され、ナノ粒子あたりのｐＤＮＡコピー数を決定するための濃度依存メカニズムが理解された（図４Ｅ）。ステップ１におけるｐＤＮＡ－ｌＰＥＩ結合（すなわち、ＰＥＣユニット形成）の速度は、τ_{Ｓｔｅｐ １}≪τ_{Ｓｔｅｐ ２}、およびτ_Ａ≒τ_{Ｓｔｅｐ ２}であるように、（図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃからの結論として）ステップ２のＰＥＣ圧縮および結び付きの速度よりもずっと速い。

【0102】

特性集合時間τ_Ａは、恐らく、プラスミド長さ、ｌＰＥＩ構造および分子量、ｐＤＮＡ－ｌＰＥＩ結合の化学量論的性質および立体的性質などの、ナノ粒子集合に関与する高分子電解質の固有特性に影響される。（ｔ＝０として画定される）乱流構造の生成に応じて、混合は、主として、ｐＤＮＡ溶液領域に拡散するｌＰＥＩ分子により生じ、ｌＰＥＩ拡散は、τ_Ｍの経時変化で進行する。ｐＤＮＡ上の急速なｌＰＥＩ結合は、ｌＰＥＩが拡散するにつれ、およそ２．７のＮ／Ｐ比で生じる。ｔ≧τ_Ｍの場合、混合が完了し、結果として、ほぼ全てのｐＤＮＡが同量のｌＰＥＩと結合し、ナノ粒子集合の構成要素としてまさにステップ２に進もうとする均一なＰＥＣユニットを形成する。集合は、θ条件下で生じ（図３Ｄ、図４Ｂ、および方程式２）、ＰＥＣ鎖間の相互作用はＰＥＣ－溶媒相互作用を取り消す。単一ＰＥＣ鎖の折り畳みとは対照的に、マルチＰＥＣ鎖の折り畳みおよび結び付きに対する追加的な障壁は存在しない。結果として、ＰＥＣユニットの圧縮は、単一ナノ粒子の集合に関与するｐＤＮＡの数にかかわらず（すなわち、最終的な

【数8】

にかかわらず）、同一の凝縮程度で終了する。

【数9】

＞１が成立するのは、多数のＰＥＣユニットが、単一ナノ粒子に圧縮されるマルチＰＥＣ鎖に対して十分に速い速度で拡散し、接触する場合である。従って、単一ナノ粒子の集合に関与するＰＥＣユニットの数は、主として、τ_Ａの経時変化内のＰＥＣ拡散により決定づけられる。ＰＥＣユニット間の拡散距離が短くなった結果、より多くのＰＥＣユニットがτ_Ａに類似する時間スケール内に結び付けられるように、入力ｐＤＮＡ濃度が高くなると、乱流構造のｐＤＮＡフロー領域のｐＤＮＡ濃度が上昇し、それにより、溶液のｐＤＮＡ分子間の平均距離が短くなる。従って、ＦＮＣ過程で画定された速度論的に制御された混合条件下では（すなわち、τ_Ｍ＜τ_Ａの場合）、単一ナノ粒子にパッケージ化されるｐＤＮＡの数を明示的に制御することが可能である。

【0103】

上記の分析に基づいて、入力ｐＤＮＡ濃度が十分低い場合、つまり、任意の２つのｐＤＮＡ分子間の平均距離がτ_Ａの時間スケールの間に互いに拡散するには長すぎる場合、ナノ粒子を含有する単一のプラスミドが生産されうる。重量平均モル質量およびナノ粒子サイズの相関関係（図４Ａ）により、ｃ→０の場合の外挿されたサイズ制限は、本研究でテストされたプラスミド（４．４ｋｂから６．７ｋｂ）に対して３０から４０ｎｍの間に該当し（図２Ｄ）、ナノ粒子あたり１つのｐＤＮＡのみを含有するｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子の典型的なサイズを表す。この小さいサイズおよび単一ｐＤＮＡペイロードは、図１０で示されるように、２５μｇ／ｍＬの最低入力ｐＤＮＡ濃度では混合速度の制御が不十分である、ピペット操作では決して得られなかった。

【0104】

１．４．８． ナノ粒子あたり様々なコピー数のｐＤＮＡを備えるｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子のトランスフェクション効率． 様々な濃度のｇＷｉｚ－Ｌｕｃプラスミドを使用して、

【数10】

＝１．７（入力ｃ＝１００μｇ／ｍＬ）、３．５（入力ｃ＝２００μｇ／ｍＬ）、６．１（入力ｃ＝４００μｇ／ｍＬ）および２１．８（入力ｃ＝８００μｇ／ｍＬ）で、２０ｍＬ／ｍｉｎの流量により、ＦＮＣデバイスにおいてナノ粒子が生成された。この一連のナノ粒子により、これらのナノ粒子のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション効率における

【数11】

の効果が検査された。表面電荷（ゼータ電位）および組成（結合および遊離ｌＰＥＩ分率）は同一であるとしても、これらのナノ粒子のサイズも異なることに注意すべきである（表３）。

【0105】

【表3】

＊データは、ｎ＝３の測定での平均的な±標準偏差の形式で示される。

【0106】

これまでの報告で、表面接触、親和性および輸送速度の違いによる細胞取込のナノ粒子サイズ依存性が証明された（Ｈｉｃｋｅｙ他、２０１５）。３Ｈ標識されたｐＤＮＡが使用され、様々な

【数12】

によりナノ粒子を集めて（セクション１．６参照）、ＰＣ３前立腺がん細胞での４時間の培養時間にわたって、それらの細胞取込を評価した。データでは、これらのナノ粒子グループ間の違いは示されなかった（図５Ａ）。トランスフェクションテストのため、全ｐＤＮＡ投与量が固定された（２４ウェルプレートでウェルにつき５×１０^４で、１×１０^４の細胞あたり０．６μｇ）ため、（投与された全ナノ粒子のうち）測定されたナノ粒子取り込みの全分率は、細胞あたり入手可能なナノ粒子の総数および取り込み率の関数になる。恐らく、製剤の

【数13】

が高くなると、ナノ粒子の数が少なくなり、従って、細胞取込率が高くなる。時点ごとの同様の取り込みｐＤＮＡ量を考慮すると、

【数14】

＝６．１および２１．８の場合、エンドソームエスケープ、ｐＤＮＡ解離、および核輸送などの、細胞内導入過程における効率が高くなるかもしれない。これまでの文献報告において、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子は、典型的に、静脈（ｉ．ｖ．）注射に続いて、肺でのトランスフェクションおよび導入遺伝子活性をもたらす（Ｂｏｅｃｋｌｅ他、２００４）。ＰＣ３がん細胞株におけるｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション効率実験では、

【数15】

＝６．１および２１．８の場合、同様のトランスフェクション効率レベルを有し、そのレベルは

【数16】

＝１．７または３．５のいずれかのレベルよりもずっと高かったことが示された（図５Ｂ）。

【0107】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの発見と一致して、

【数17】

＝１．７の場合、他の製剤よりもトランスフェクション効率がかなり低いことが示され、

【数18】

が高くなると、トランスフェクション効率が良くなるという、

【数19】

＝３．５、６．１、および２１．８
の場合のナノ粒子についての認識傾向が見られた（図５Ｃおよび図１４）。体内分布研究は、マウスあたり３０μｇのｐＤＮＡの投与量で、３Ｈ標識されたナノ粒子の静脈注射により、Ｂａｌｂ／ｃマウスで実施された。マウスは、ナノ粒子の投与後１時間で犠牲になり、主要組織および血液試料が採取され、重さが測定された（ｗｅｉｇｈｔｅｄ）。生体試料は可溶化され、溶液は液体シンチレーション評価を受け、試料内の３Ｈ標識されたｐＤＮＡを数値化した。結果、全ての製剤について、ナノ粒子が１時間以内に臓器および組織に迅速に分布したこと（＞９５％）が明らかになった。これらのナノ粒子の分布パターンは、肺に沈着するナノ粒子が少ない結果となった１．７の

【数20】

の場合を除いて、同様であった（図５Ｄおよび図１５Ａ）。そして、脾臓を通るクリアランスは、より顕著であった（図１５Ｃ）。全てのグループについて、投与量の５－８％が肺（図１５Ｂ）に行き着いたのと比較して、全投与量の４２－４５％が肝臓に行き着いたにも関わらず、肝臓での導入遺伝子発現は検出可能なレベルではなかった。これは、恐らく、肝臓のクッパー細胞によるナノ粒子の迅速なクリアランスおよび分解のためであった（Ｔｓｏｉ他、２０１６）。

【0108】

これらのナノ粒子間のｉｎ ｖｉｖｏ導入効率のわずかな差は、恐らく、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子が血清成分と強く相互作用し、静脈注射後に急速に集合し、肺微小血管系への閉じ込めおよびエンドサイトーシスの細胞による肝臓および肺への実質的な取り込みにつながる（Ｏｇｒｉｓ他、１９９９）という事実によるものであり、これは、

【数21】

を制御した結果として、ペイロード能力の差を隠すことになる。オプソニン化および凝集の傾向が低いナノ粒子（例えば、ペグ化ナノ粒子）を識別すること、および血清コーティングのメカニズムの理解することは、ｉｎ ｖｉｖｏのトランスフェクション効率における組成およびサイズが画定されたナノ粒子の詳細な効果をより明らかにする助けになるだろう。

【0109】

１．４．９． 速度論的制御条件下で製造されたｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子のｐＤＮＡペイロードおよびＰＥＩ組成（すなわち、結合対遊離ＰＥＩ濃度）のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション効率にかかる効果． 上記の予備研究は、６以上の

【数22】

を備えるナノ粒子は、より低いプラスミドペイロードを備えたナノ粒子よりもｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのトランスフェクション効率が良いことを明らかにした。乱流混合条件（Ｑ＝２０ｍＬ／ｍｉｎ、τ_Ｍ＝１５ｍｓ＜τ_Ａ）下で製造されたナノ粒子は、続いて、様々なＮ／Ｐ比で検査され、Ｑ＝５ｍＬ／ｍｉｎ、τ_Ｍ＝７９０ｍｓ≫τ_Ａ）で製造されたナノ粒子と比較された。２つの一連のナノ粒子は、ｇＷｉｚ－Ｌｕｃプラスミドで製造され、表４で示される詳細な特徴を有した。

【0110】

【表4】

＊方程式２および７に基づいて計算。

【0111】

まず、ｇＷｉｚ－Ｌｕｃプラスミドで製造された全てのナノ粒子が、ＰＣ３がん細胞株でテストされた（図６Ａ）。ナノ粒子のセット（Ｗ１－４およびＷ５－８）はいずれも、Ｎ／Ｐ比が高いほど（すなわち、結果として遊離ＰＥＩ分率が高いほど）、高いトランスフェクション効率をもたらし、このことは、これまでの文献報告に一致してした（Ｂｏｅｃｋｌｅ他、２００４；Ｋｌａｕｂｅｒ他、２０１６）。

【0112】

ペイロードが低いナノ粒子は、ペイロードが高い、特にＮ／Ｐ＝４および６のナノ粒子よりも良いパフォーマンスを示した。同一のナノ粒子のセットは、続いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスに投与され、それらの肺でのトランスフェクション効率が注射後１２時間、２４時間および４８時間の時点で測定された。結果（図６Ｂおよび図１７）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験と同様のパターンを示した。導入遺伝子発現活性は、低ペイロードおよび高ペイロードのナノ粒子のいずれについても、３のＮ／Ｐ比で製造されたナノ粒子で低かった。Ｎ／Ｐ＝４の場合、低ペイロード（

【数23】

＝６．１）
のナノ粒子は、より高いペイロード（

【数24】

＝４５．６）
のナノ粒子よりも効果的であった。Ｎ／Ｐ＝４、

【数25】

＝６．１の製剤、およびＮ／Ｐ＝５および６で製造されたナノ粒子についての導入遺伝子活性は、ペイロードレベル

【数26】

にかかわらず同様のルシフェラーゼ発現レベルを示した。

【0113】

この一連のナノ粒子から選択された４つナノ粒子製剤の体内分布も、それらのトランスフェクション効率における最大の差を以て特徴付けられた：ペイロードが低く、Ｎ／Ｐ比が低いナノ粒子
（表４、Ｗ１：Ｎ／Ｐ＝３および

【数27】

＝９．１、Ｗ２：Ｎ／Ｐ＝４および

【数28】

＝６．１）、およびペイロードが高く、Ｎ／Ｐ比が高いナノ粒子（表４、Ｗ６：Ｎ／Ｐ＝４および

【数29】

＝４５．６、Ｗ８：Ｎ／Ｐ＝６および

【数30】

＝４２．８）。
３Ｈ標識されたナノ粒子が、図６Ｂおよび図６Ｃで使用されたときと同一の投与量でＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内に注射された。注射されたナノ粒子投与量の大半（＞９５％）は、１時間以内に組織および臓器に分布した（図６Ｅ）。Ｗ１ナノ粒子は、他のナノ粒子製剤と比較して、肺に分布したナノ粒子の分率は最低（１．４％）（図６Ｄ、図６Ｅ）で、肝臓（統計的有意性はないが、５４．０％）および脾臓（６．０％）に最高レベルで分布し（図１９）、肺での最低のトランスフェクション効率と相関関係を持っている。Ｗ２は、Ｗ８と同様のレベルの肺への分布を示し（図６Ｄ、図６Ｅ）、これらの２つの製剤間の同様の導入遺伝子発現レベルと相関関係がある（図６Ｃ）。Ｗ６は、Ｗ２と同様の体内分布プロファイルを生み出したにも関わらず、Ｗ２によりも著しく低いトランスフェクション効率をもたらした。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの研究で示されるような低い細胞内導入効率（図６Ａ）、および肺に導入されたナノ粒子の数が７．５倍少ないことにも原因があるかもしれない。ペイロードが低いナノ粒子製剤に対して、非常に多くのナノ粒子が、より多数の細胞のより多くのトランスフェクションイベントを促進するかもしれない。他方、これらのナノ粒子のうち、より小さいサイズのものは、組織のナノ粒子輸送および腫瘍組織へのアクセスに影響を及ぼすかもしれない。Ｗ６およびＷ８ナノ粒子と比較すると、それらのペイロード（

【数31】

＝４５．６および４２．８）およびサイズ（Ｄｇ＝１５８．９および１５５．５ｎｍ）は同様であるにも関わらず、より高いレベルの遊離ｌＰＥＩ（図３Ｂ、１．７５ｍＭ対０．７４ｍＭ）がより低いレベルの肝臓のクリアランス（図６Ｄおよび図１９Ａ）につながった。この要因は、より高い細胞内導入効率（図６Ａ）とともに、肺での比較的高い導入遺伝子発現活性の原因であるかもしれない。

【0114】

１．４．１０． 既製の凍結乾燥ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子のスケールアップ生産． 非ウイルスＤＮＡ導入遺伝子治療の臨床解釈の成功は、高い導入およびトランスフェクション効率、良好な生体適合性、拡張可能な生産過程、長期保存安定性、および高いパフォーマンス一貫性（すなわち、低いバッチ間変動性）に依存する。ＰＥＣナノ粒子を通じたｐＤＮＡの全身導入に関する現行の手法は、投与直前のクリニックでの治療的ｐＤＮＡおよびｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）溶液の現地混合に依存する（すなわち、表４のＷ９などの手動ピペット操作に類似）。予想されるように、ナノ粒子形成の再現性およびパフォーマンス一貫性は、画定が難しいだろう（図９）。ここで報告されたＦＮＣ過程によるナノ粒子調製は、継続的で、拡張性および再現性が高い方法１５－１７を提供する。単一ベンチモデルデバイスにより、０．５グラムのｐＤＮＡが１時間以内にｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子にパッケージ化でき、これは、マウスあたり４０μｇのｐＤＮＡの１２，５００の投与量に相当する。結果として生じたナノ粒子懸濁液は、最適化された凍結乾燥プロトコルにさらされ、抗凍結剤として９．５％ｗ／ｗのトレハロースを含む粉体形状（図７Ａ）に変えられうる。凍結乾燥ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子は、－２０℃で保存された場合、少なくとも９カ月安定していた。各時点で再構成された場合、サイズ、ＰＤＩ、ゼータ電位、ＰＥＩ回復、およびＤＮＡ回復は、全て、新たに製造された試料と一致していた（図７Ｂ）。再構成過程は、単に、水を追加し、ボルテックスの必要はなく、室温で１分未満置かれた後に凝集のない澄んだ懸濁液を生成することによる（図７Ａ）。再構成されたｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子は、少なくとも４日間、安定性を維持した。

【0115】

１．５ 要約
現在開示されている対象は、シミュレーション方法および実験的アプローチを結び付け、特性混合時間と相関関係がある入力ｐＤＮＡおよびｌＰＥＩ溶液の流量を実現する、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子のＦＮＣ集合に使用されるＣＩＪマイクロチャンバーにおける混合の反応速度論への詳細な理解を提供する。マイクロチャンバー内の溶液の乱流混合を可能にする混合速度を制御することにより、高い均一性および拡張性を備えるナノ粒子サイズ、表面電荷および組成にかかる明示制御が証明された。ＦＮＣ集合ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子の静的光散乱測定および組成分析から、ナノ粒子流体力学的サイズおよびナノ粒子あたりのｐＤＮＡペイロード間の「普遍的な」相関関係が実現され、これは、ｐＤＮＡ中和および圧縮が、様々な条件下にて様々なｐＤＮＡペイロードで集められたナノ粒子について、同程度で達成されたことを示唆している。これらの発見は、ナノ粒子サイズの制御を超えたｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子のより細かい組成制御を可能にするだけではなく、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子集合の速度論的過程を調べる実験的証拠を提供した。ＰＥＣユニットを形成する際のｐＤＮＡおよびｌＰＥＩ分子間の電荷中和は、律速段階ではないことが確認され、特性集合時間は、主として、ＰＥＣユニットの鎖の折り畳みおよび圧縮により決定されることが分かった。各ナノ粒子にパッケージ化されたｐＤＮＡの数は、主として、ＰＥＣユニットの拡散距離（すなわち、局所ｐＤＮＡ濃度）により決定される。ＦＮＣによる速度論的制御条件下で、入力ｐＤＮＡ濃度を５０μｇ／ｍＬから８００μｇ／ｍＬに制御することにより、３５から１３０ｎｍの平均流体力学的サイズに対応する、平均約１．７のｐＤＮＡから約２１．８のｐＤＮＡが集められた。これらの明確に画定されたナノ粒子により、これらのナノ粒子のトランスフェクション効率におけるｐＤＮＡペイロードおよび製剤組成の効果を調査することが可能になった。本研究でテストされたがん細胞モデルにおいて、ナノ粒子のプラスミドＤＮＡの媒体ペイロードは、最高のｉｎ ｖｉｖｏ導入効率で最適となり、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション活性とよく相関することが分かった。健康なマウスモデルおよび担がんのマウスモデルの両方のｉｎ ｖｉｖｏ導入遺伝子発現により、ｐＤＮＡ／ｌＰＥＩナノ粒子の媒体ｐＤＮＡペイロードが肺での導入遺伝子発現に有利に働くことが示された。これらのナノ粒子は、安定性が－２０°Ｃでの保存で少なくとも９カ月続く既製の凍結乾燥製剤として、拡張可能に生産されうる。さらに、このナノ製剤は、再構成しやすく、投与しやすい。本方法は担体構造およびプラスミド長さおよび種類に特に依存しないため、通常、多くの他の潜在的なポリカチオン担体に適用可能である。従って、このＦＮＣ生産過程は、遺伝子導入のための非ウイルスナノ粒子伝達手段の臨床解釈に向けた明確な技術的優位性を提供する。

【0116】

１．６ 実験
１．６．１． ｐＤＮＡ／ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）高分子電解質複合体（ＰＥＣ）ナノ粒子の調製． 全てのＣＩＪデバイスは、典型的なＣＩＪ設計に基づいて、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｗｈｉｔｉｎｇ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇの工作室で製造された（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＰｒｕｄ’ｈｏｍｍｅ、２００３）。ｉｎ ｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）が与えられ、３から６の異なる入力Ｎ／Ｐ比に対応する所望の濃度まで超純水により希釈されて使用された。溶液のｐＨは（濃度にかかわらず）、ＮａＯＨまたはＨＣｌにより３．５０まで調整され、全ての実験にわたってＰＥＩ分子の電荷密度を一貫させた。４の入力Ｎ／Ｐ比のナノ粒子における入力ｐＤＮＡ濃度の効果を調査する際、ｐＤＮＡは、製造業者により純水内で運ばれ（表１）、５０から８００μｇ／ｍＬの濃度範囲まで超純水により希釈された。ＰＥＣナノ粒子は、高圧注射器ポンプによりあらかじめ設定された流量で、２つの希釈標準溶液をＣＩＪチャンバに注入することにより調合された。ＰＥＣナノ粒子は、追加的な培養時間を必要とすることなく、ＣＩＪから出て直ちに安定し、下流で直接、特性評価および適用を受けた。等張条件が要求される場合、ｐＤＮＡおよびＰＥＩ希釈標準溶液は、水の代わりに９．５％（ｗ／ｗ）のトレハロースで製造された。全ての製剤は、室温で少なくとも１カ月安定した。ピペット操作によるＰＥＣナノ粒子の調製（Ｗ９、表４）については、表２で示されるように手順Ｂ３が使用された。

【0117】

１．６．２． 非複合体ＰＥＩ評価． 方法は、これまでの報告から採用された（Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ他、２００４）。希釈されたナノ粒子懸濁液の５００μＬのアリコートが、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００遠心濃縮器に追加された（ＰＥＳ、１００，０００ＭＷＣＯ、縫工筋、試料ごとにｎ＝４の濃縮器）。濃縮器は、続いて、１分間遠心分離され、ナノ粒子を含まず、非複合体ＰＥＩ分子のみを含有する素通り画分溶液を得た。６０μＬの素通り画分溶液のアリコートが、９６ウェルプレートの１つのウェルに追加された（濾過された溶液ごとにｎ＝３のウェル）。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＰＲＡＰＡ、Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ＵＳ）溶液（２００μＬ）がウェルに追加され、混合物は室温で１０分間培養された。

【0118】

１．６．３． ＰＥＣナノ粒子の特性評価． サイズ測定のための動的光散乱（ＤＬＳ）およびゼータ電位測定のための位相解析光散乱（ＰＡＬＳ）は、２５℃でＭａｌｖｅｒｎ ＺＥＮ３６９０ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して実施された。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒからの最も信頼できる結果として、ｚ平均流体力学直径が得られ、本研究の全ての分析に対するＰＥＣナノ粒子のサイズとして使用された。（ＩＳＯ１３３２１の手順に従う）ＤＬＳ装置により与えられた多分散性（ＰＤＩ）がナノ粒子サイズに依存するため、我々は、サイズ分布幅を使用し、図２Ａの様々なサイズのナノ粒子の均一性を評価した。このサイズ分布幅は、サイズ標準偏差の標準項として、単一のサイズピークに対して、ＤＬＳ装置から直接与えられる：

【数32】

ゼータ電位測定は、信頼できる評価のため、低塩濃度緩衝液（５ｍＭのＮａＣｌ）で実施され、懸濁液の０．６ｍＳ／ｃｍの伝導率を得た。

【0119】

１．６．４． 静的光散乱（ＳＬＳ）は、６５８ｎｍの波長のレーザ源および光学区画として石英ガラスフローセルを備えた、Ｗｙａｔｔ ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ１８角（ａｎｇｅｌ）レーザ光散乱光度計で実施された。装置は、等方散乱（３ｎｍのデキストラン、ＭＷ９０００－１１０００、Ｓｉｇｍａ ＵＳ）に対して正規化された全てのレーザ検知器で、マニュアルに従って適切に較正された。適切な濃度に希釈されたＰＥＣ懸濁液は、４５０ｎｍまたは１μｍのいずれかのサイズのカットオフで、フィルタを通してフローセルに導入された。各試料は、５分間、２００μＬ／ｍｉｎの流量で流され、検出器からの安定したシグナルを確立した。データ収集は、５分間継続され、各検出器の時間平均強度を得た。装置から出たＰＥＣナノ粒子が採取され、ＤＬＳおよびＤＮＡ回復評価（ＮａｎｏＤｒｏｐによる、図１１）を受け、過程の間に影響を受けていないナノ粒子特性および濃度を得た。データ処理（ジムまたはデバイプロットの生成）は、Ｗｙａｔｔ ＡＳＴＲＡ６．１ソフトウェアにより実施された。各試料はｎ＝３で別々に流され、本明細書に示されたモル質量結果は、平均値であった。ＰＥＣナノ粒子は、ＳＬＳ３６下で２つの成分から成る共重合体として扱われ、光散乱理論の指示どおりに、重量平均モル質量をもたらしうる（ＨｉｅｍｅｎｚおよびＬｏｄｇｅ、２００７）。

【0120】

ＰＥＣナノ粒子の屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）を決定するため、我々は、これまでに説明された加法ルールに従った（ＤａｉおよびＷｕ、２０１２）：

【数33】

ここで、Ｗ_ｐＤＮＡおよびＷ_ＰＥＩは、それぞれ、ＰＥＣナノ粒子に複合化されたｐＤＮＡおよびＰＥＩの重量分率である。ｄｎ／ｄｃ値は、遊離ＰＥＩ評価の結果の入力ｐＤＮＡ濃度および結合ＰＥＩ分率に代入することにより入手できる。ＦＮＣによるナノ粒子集合についての提案モデルに基づいて、ｐＤＮＡ分子の１つずつに対し、結びついた全ての結合ＰＥＩは、以下のモル質量を有する：

【数34】

ここで、γは、遊離ＰＥＩ評価により与えられた結合ＰＥＩ分率であり、Ｃ_ｍ（ＰＥＩ）およびＣ_ｍ（ｐＤＮＡ）は、それぞれ、製剤に対するＰＥＩおよびｐＤＮＡの入力質量濃度であり、Ｍ_ＤＮＡは、使用されたｐＤＮＡの分子量である。続いて、ナノ粒子あたりの（重量）平均ｐＤＮＡコピー数は、以下により計算されうる：

【数35】

ここで、

【数36】

は、ＳＬＳにより与えられたナノ粒子の重量平均モル質量である。

【0121】

１．６．５． 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）． 炭素被覆銅グリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ）は、フィルムを親水性にするための試料負荷の前に、３０秒間のプラズマ処理（Ｎ_２グロー放電）を受けた。ＰＥＣナノ粒子懸濁液は、２０分間グリッドで培養され、続いて、ろ紙により乾燥された。１０μＬの２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニル溶液のアリコートが、グリッド上に滴下され、１分間培養され、続いて、ろ紙により乾燥された。グリッドは、撮像の前に、２４時間フード下で乾燥されてもよかった。染料溶液がウラニル基を正荷電にする低ｐＨを有し、ｐＤＮＡ分子と強く反応する一方、ネガティブ染色パターン（明確に印を付けられた辺縁を備えた染料の層上に置かれたナノ粒子）が探査され、撮像された。撮像は、１００ｋＶで動作する、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ １２ Ｔｗｉｎ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで実施された。全ての画像は、Ｍｅｇａｖｉｅｗ ＩＩＩ広角カメラにより撮像された。

【0122】

１．６．６． ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション活性． ＰＣ３がん細胞は、５×１０^４細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種され、単層細胞培養を形成した。２４時間の培養後、各ウェルの培地は吸引された。３μｇのｐＤＮＡを含有する５０μＬのＰＥＣナノ粒子懸濁液のアリコートが、５００μＬの新鮮培地に追加され、２０秒間ボルテックスされて混合し、全混合物が各ウェルに追加された。細胞は、１から４時間ＰＥＣナノ粒子で培養された。培養の際、混合物は吸引され、細胞はＰＢＳにより２回洗浄され、新鮮培地に置かれた。再度の２４時間の培養後、細胞がルシフェラーゼを発現させるようにする。採取のため、１００μＬのレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳ）が各ウェルに追加され、プレート全体が２つの凍結融解サイクルを受けた。標準のルシフェラーゼ定量分析（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳ）およびタンパク質定量分析（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ試薬、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ）が実施され、可溶化液の総タンパク量のｍｇあたりのルシフェラーゼのｎｇを単位としたトランスフェクション効率を得た。全てのテストについて、グループごとにｎ＝４のウェルがテストされた。

【0123】

１．６．７． ｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション効率． 全てのｉｎ ｖｉｖｏ実験手順は、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＪＨＵ ＡＣＵＣ）により認可された。ＰＥＣナノ粒子は、２００μｇのｐＤＮＡ／ｍＬの濃度で、マウスあたり３０または４０μｇのｐＤＮＡの投与量で、マウス側部の尾静脈を通して静脈内に注射された。調製における入力ｐＤＮＡ濃度が低いグループに対して、ナノ粒子懸濁液は、３，０００ＭＷＣＯで、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－２遠心フィルタユニットにより２００μｇのｐＤＮＡ／ｍＬまで濃縮され、ＰＥＣおよび遊離ＰＥＩ分子のいずれも同率で濃縮した。ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光撮像は、ＩＶＩＳＲ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳ）を使用して実施され、画像は、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳ）で処理された。関心領域（ＲＯＩ）定量分析の結果は、直線関係を示す肺のルシフェラーゼタンパク質存在量と良好な相関関係を有している（図１６）ため、組織均質化は、導入遺伝子活性の速度を測定するために広くは普及しなかった。予備テストは、導入遺伝子発現レベル（健康な肺組織または肺の腫瘍細胞のルシフェラーゼ濃度）が健康なＢａｌｂ／ｃマウスモデルに対する注射後１２および４８時間後頃にピークに達することを明らかにした（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳ）。ＩＶＩＳ評価の時点は、従って、３０ｍｇ／ｍＬのＤ－ルシフェリン（Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳ）溶液の１００μＬの腹腔内注射および５分の拡散期間に応じて、イソフルランにより麻酔をかけられ、ＩＶＩＳシステムにより撮像されたマウスで、設定された。ＬＬ２腫瘍モデルに対して、接種は、ＰＥＣ投与に先立って３日間、５×１０^５のがん細胞を含有する２００μＬのＰＢＳ溶液の静脈注射により実施された。

【0124】

１．６．８． ３Ｈ標識されたＰＥＣナノ粒子の調製．細胞取込および体内分布研究． ＰＥＣナノ粒子のトリチウム標識法は、ナノ粒子調製に先立って、原料としてのＳ－アデノシル－Ｌ［メチル－３Ｈ］メチオニン（３Ｈ－ＳＡＭ）によるｐＤＮＡのメチル化により実施された。処理は、結果として、集合過程にはそれほど影響を及ぼさないｐＤＮＡのわずかな構造変化をもたらした。この標識法の大きな強みは、シンチレーション流体アッセイを通して、壊変毎分（ＤＰＭ）をカウントすることにより、生体試料の標識ｐＤＮＡの絶対量を評価する能力にあり、従って、ＰＥＣナノ粒子の投与に応じた細胞取込および体内分布研究に理想的である。操作範囲内で、ＤＰＭは、アッセイの標識ｐＤＮＡ量に線形比例する（図１３）。ｐＤＮＡを標識化するため、水、１０×ＮＥＢ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳ）、３Ｈ－ＳＡＭ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳ）、ｐＤＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）およびＭ．Ｓｓｓｌ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳ）が、５０－ｍＬの管に１２：２：２：１：１（ｖ／ｖ）の比率で追加された。

【0125】

溶液は、よく混合され、３７℃で２時間、反応のため培養され、６５℃まで＞３０分間加熱することにより、クエンチされた。反応混合物は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳ）を使用して精製された標識ｐＤＮＡと共に、ＥＢ緩衝液により希釈され、最後に非標識ｐＤＮＡと混合され、ＰＥＣ集合のための希釈標準溶液がもたらされた。細胞取込実験のため、同一の投与方法が、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション実験として採択された。各時点において、ナノ粒子含有の媒体は排出され、細胞は新しいＰＢＳにより２回洗浄され、続いて採取された。体内分布研究のため、同一の投与および製剤濃度が、ｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション実験として採択された。注射後１時間で、動物は、組織が採取されて犠牲になり、重さが測定された。十分にＳＯＬＶＡＢＬＥ（溶解可能）な可溶化流体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳ）が、組織に追加され、７０℃で４８時間培養された。組織可溶化液は、よく混合され、１００μＬの各試料（ｎ＝３単独測定）が、７－ｍＬのシンチレーションバイアルの４ｍＬのＵｌｔｉｍａ Ｇｏｌｄシンチレーションカクテル流体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳ）に追加された。ＤＰＭは、５分の測定経時変化で、Ｔｒｉ－Ｃａｒｂ ２２００ＣＡ液体シンチレーションアナライザ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳ）により評価された。

【0126】

例２ 比較例－大量混合により製造されたナノ粒子と比較したフラッシュ・ナノ複合体形成ＦＮＣ集合ナノ粒子の組成
上述の通り、現在開示されているＤＮＡナノ粒子の組成は、粒子あたりのＤＮＡの平均数、平均粒子サイズおよびサイズ分布、明確に画定されたＤＮＡおよびポリマー含量、および凍結乾燥および常温保存可能な形体での粒子製剤の観点において特有である。他の報告されたＤＮＡナノ粒子製剤は、正確に同一の組成報告を持たず、これらのベンチマークパラメーターのいくつかを直接比較することは困難である。しかしながら、現在開示されているＦＮＣ生産ナノ粒子、および大量混合方法、例えば、ピペット操作方法で生産されたナノ粒子間の明確な違いについての証拠を提供可能な、特有の物理的特性測定がある。

【0127】

現在開示されているＦＮＣ集合ナノ粒子は、ピペット操作方法、実験室規模で使用される一般的な大量調製方法により生成されたナノ粒子と比較して、明確な物理的特性を有する。ピペット操作方法は、大量混合調製の比較例として、本明細書で提供される。以下の結果は０．４ｍＬから１．０ｍＬの総量のバッチスケールで作成されたものであることに注意すべきである。より大きなバッチサイズでは、結果として生じるナノ粒子は、うまく画定されず、凝集体を生成しやすくなる。

【0128】

２００μｇ／ｍＬの同一のプラスミド濃度、３．５のｌＰＥＩ溶液のｐＨ、９．５％ｗ／ｗのトレハロース濃度、および４または６のＮ／Ｐ比（例えば、ＰＥＩ製造業者による最小推奨レベル）で製造された場合、ＦＮＣ集合ナノ粒子は、大量混合により生成された均一ではないナノ粒子と比較して、（プラスミドサイズに依存して）ナノ粒子あたり５から１０のプラスミドの平均ｐＤＮＡペイロードに対応して、約８０ｎｍに近い平均サイズでより均一になり、１６０ｎｍより大きな平均サイズを有し、ナノ粒子あたり４０より多いプラスミドの平均ｐＤＮＡペイロードに対応する。

【0129】

さらに、当技術分野で周知の大量混合方法により生成されたナノ粒子のサイズおよびペイロード（図２０Ａ）は、現在開示されているＦＮＣ方法により製造されたナノ粒子と比較して、再現性がずっと低く、変動の度合いが高い（図２０Ｂ）。これらの結果は、現在開示されているＦＮＣ方法によれば、調製ごとおよび操作者ごとのバッチ間変動のレベルがずっと低くなることを示している。さらに、ナノ粒子の品質は、どの溶液をピペットで移すか、ピペット操作速度、およびボルテックスなどの、追加的な混合方法がどのように続くかまたは追加的な混合方法が続くかどうかを含む、ピペット操作の正確な実施にかかっている。いくつかのピペット操作の実施は、結果として調製の時間内に安定しない凝集体をもたらす（図２１Ａ参照）。一方、現在開示されているＦＮＣ集合ナノ粒子は、室温で少なくとも９６時間、生産後に安定している（図２１Ｂ）。

【0130】

現在開示されているＦＮＣナノ粒子および大量混合で生成されたナノ粒子間のより詳細な比較が、表６で以下に提供される。

【0131】

例３ 比較例－大量混合により製造されたナノ粒子と比較したフラッシュ・ナノ複合体形成ＦＮＣ集合ナノ粒子のトランスフェクション効率および毒性
現在開示されているＦＮＣナノ粒子の特有な組成および特性は、同一の調製条件（Ｎ／Ｐ＝４）下で大量混合により製造されたナノ粒子と比較して、高いトランスフェクション効率につながる（表６参照）。現在開示されているＦＮＣナノ粒子は、より低いｉｎ ｖｉｖｏ毒性を示した（表６）。マウスあたり４０μｇのｐＤＮＡを投与した場合、６のＮ／Ｐ比で大量混合により生成されたナノ粒子は、結果として、４のＮ／Ｐ比のＦＮＣ集合ナノ粒子と比較して、激しい毒性をもたらし、注射の直後に１／５の動物が死亡し、より高レベルのアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、および肝臓の顕著な壊死をもたらした。同一の６のＮ／Ｐ比でナノ粒子を生産するＦＮＣを使用すると、結果として生じる壊死部分が２倍近く減少した。４のＮ／Ｐ比のＦＮＣ集合ナノ粒子は、全てのナノ粒子製剤中、最低レベルの肝臓毒性を示し、ＡＬＴ血清レベルの増加も最低であった。さらに、ＦＮＣナノ粒子では、組織学的検査により評価されたように、壊死部位の頻度が低い（＜５％）ことが観察された。

【0132】

【表5】

＊マウスあたり４０μｇのＤＮＡの投与量でテスト

【0133】

例４ 哺乳類細胞提示
哺乳類の提示は、細胞の表面に発現した分子のコンビナトリアルライブラリーから親和性試薬を選択するために使用される強力な方法である。プラスミドＤＮＡ分子のライブラリーが使用され、リーダー配列（例えば、Ｉｇκ）および膜貫通領域（例えば、ＰＧＦＲ）を使用して、細胞膜に向けられうる様々なタンパク質のライブラリーを発現させうる。抗体可変領域などの、様々な結合領域のライブラリーは、続いて、膜の細胞外側に露出され、標的リガンド、例えばがん抗原と自由に結合しうる。リガンドに対して好適な親和性を備えるライブラリーメンバーを発現させる細胞が、リガンドおよび標識を結び付け、フローサイトメトリーを使用して非結合クローンの集団から選択されうるように、標的抗原は、例えば、ビオチンで標識され、ストレプトアビジン－Ｒ－フィコエリトリンで検出されうる。ＤＮＡプラスミドは、続いて、細胞から分離され、転換され、例えば、大腸菌内で育成されうる。ＤＮＡプラスミドクローンは、哺乳類細胞に再びトランスフェクトされ、手順が繰り返されうる。そのため、発現、結合、分類および濃縮を何回か連続して繰り返した後、（バインダーおよび非バインダーを含有する）大きなコンビナトリアル集団から小さな結合集団が、標的リガンドに対する高い親和性を有して、分離されうる。

【0134】

選択過程を効率的にするため、細胞あたり限られた数のプラスミドがトランスフェクトされるべきである。そうでなければ、例えば、抗体断片の不均一な集団が各細胞の表面に発現するであろうため、非バインダーを発現させるプラスミドおよびバインダーを発現させるプラスミドのいずれもが、様々な細胞に十分に分離されないであろうし、フローサイトメトリーで共に濃縮されるであろう。従って、細胞あたり１つの（または少数の）抗体クローンが発現され、最高の親和性を備える抗体断片を発現させるクローンが非結合クローンからのフローサイトメトリーによる選択の各サイクルで効率的に選択され、濃縮が達成されるように、細胞あたり１つのプラスミドまたは少数のプラスミドをトランスフェクトすることが望ましい。

【0135】

哺乳類の提示のための方法が当技術分野で周知である（例えば、ＨｏおよびＰａｓｔａｎ、２００９参照）一方、ナノ粒子あたり画定された数のプラスミドのパッケージ化を達成する方法は、周知ではない。上述された例は、ナノ粒子あたり約１のプラスミドから約５０のプラスミドをパッケージ化し、高レベルのトランスフェクションを達成する方法を説明する。ライブラリーのため、細胞あたり（約１のプラスミドから約５０のプラスミドを含有する）約１のナノ粒子から約１０のナノ粒子を使用することは、細胞あたり少数のプラスミドクローンのトランスフェクションを達成するために適しており、従って、哺乳類の提示方法において、効率的な濃縮を達成するであろう。

【0136】

参考文献
明細書で言及された全ての出版物、特許出願、特許、その他の参考文献は、現在開示されている対象が関係する当業者のレベルを示している。明細書で言及された全ての出版物、特許出願、特許、その他の参考文献（例えば、ウェブサイト、データベース、等）は、各個別の出版物、特許出願、特許、その他の参考文献が具体的におよび個々に参照により援用すると示された場合と同程度に、それらの全体を参照により本明細書に援用する。多数の特許出願、特許、その他の参考文献が本明細書に参照されているが、このような参考文献は、これらの文書のいずれかが当該分野で共通の一般知識の一部を形成することを認めるものではないことが理解されるだろう。明細書および援用した参考文献のいずれかの間に対立がある場合、（援用した参考文献に基づいているかもしれない、その任意の改変を含む）明細書が優先される。他に明記されていない限り、本明細書では、当該分野で標準に受け入れられている用語の意味が使用される。本明細書では、様々な用語の標準の略語が使用される。

【0137】

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【0138】

前述の対象は、理解を明確にするために説明および例を使用して多少詳しく記載されてきたが、添付の請求項の範囲内で一定の変更および改変が可能なことは、当業者により理解されるであろう。

【図1A】

【図1B】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【国際調査報告】