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特表2022-531253標的化核酸配列に多様性を生じさせるための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-06
(54)【発明の名称】標的化核酸配列に多様性を生じさせるための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/10 20060101AFI20220629BHJP
A01H 1/06 20060101ALI20220629BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20220629BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20220629BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220629BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220629BHJP
【ＦＩ】
C12N15/10 200Z
A01H1/06 ZNA
A01H1/00 A
A01H5/00 A
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021564580
(86)(22)【出願日】2020-05-01
(85)【翻訳文提出日】2022-01-04
(86)【国際出願番号】 US2020031053
(87)【国際公開番号】W WO2020223642
(87)【国際公開日】2020-11-05
(31)【優先権主張番号】62/842,184
(32)【優先日】2019-05-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501231613
【氏名又は名称】モンサント テクノロジー エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】グレーム・エス・ガーベイ
(72)【発明者】
【氏名】ファルハード・モシリ
【テーマコード（参考）】
2B030
4B065
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AB03
2B030CA08
2B030CA15
4B065AA26X
4B065AA89X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA01
4B065BA16
4B065CA44
4B065CA46
4B065CA53
(57)【要約】
本開示は、変異原と組み合わせて触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼを使用して、標的核酸において標的化改変を生成するために有用な方法及びキットを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的核酸分子に標的化改変を誘発する方法であって、前記標的核酸分子を（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、及び
（ｂ）少なくとも１つの変異原
と接触させることを含み、
少なくとも１つの改変が、前記標的核酸分子に誘発される、前記方法。
【請求項2】
標的核酸分子に標的化改変を誘発する方法であって、前記標的核酸分子を（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、
（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸であって、前記少なくとも１つのガイド核酸が前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと共に複合体を形成し、前記少なくとも１つのガイド核酸が前記標的核酸分子とハイブリダイズする、前記少なくとも１つのガイド核酸、及び
（ｃ）少なくとも１つの変異原
と接触させることを含み、
前記標的核酸分子が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を含み、少なくとも１つの改変が、前記ＰＡＭ部位から１００のヌクレオチド内の前記標的核酸分子において誘発される、前記方法。
【請求項3】
核酸分子の標的化領域における変異率を増加させる方法であって、前記核酸分子を（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、
（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸であって、前記少なくとも１つのガイド核酸が前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと共に複合体を形成し、前記少なくとも１つのガイド核酸が前記標的核酸分子とハイブリダイズする、前記少なくとも１つのガイド核酸、及び
（ｃ）少なくとも１つの変異原
と接触させることを含み、
前記標的核酸分子が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を含み、前記核酸分子の前記標的化領域における前記変異率が、非標的化核酸分子と比較して増加する、前記方法。
【請求項4】
植物のゲノム内の核酸分子の標的化領域における対立遺伝子多様性を増加させる方法であって、前記植物に（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼまたは前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、
（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸または前記少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸であって、前記少なくとも１つのガイド核酸が、前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと共に複合体を形成し、前記少なくとも１つのガイド核酸が前記核酸分子とハイブリダイズする、前記少なくとも１つのガイド核酸または前記少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸、及び
（ｃ）少なくとも１つの変異原
を提供することを含み、
前記核酸が前記標的化領域に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を含み、前記核酸分子の前記標的化領域の対立遺伝子多様性が増加する、前記方法。
【請求項5】
改善された作物栽培特性を植物に提供する方法であって、（ａ）最初の植物に
（ｉ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼまたは前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、
（ｉｉ）少なくとも１つのガイド核酸または前記ガイド核酸をコードする核酸であって、前記少なくとも１つのガイド核酸が、前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、前記少なくとも１つのガイド核酸が前記植物のゲノム中の標的核酸分子とハイブリダイズし、前記標的核酸分子がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を含む、前記少なくとも１つのガイド核酸または前記ガイド核酸をコードする核酸、及び
（ｉｉｉ）少なくとも１つの変異原
を提供すること、を含み、
少なくとも１つの改変が、前記標的核酸分子に誘発され、さらに方法が、
（ｂ）前記第１の植物から少なくとも１つの子孫植物を生成すること、ならびに
（ｃ）前記少なくとも１つの改変及び前記改善された作物栽培特性を含む少なくとも１つの子孫植物を選抜すること、
を含む、前記方法。
【請求項6】
標的核酸において標的化改変を誘発するためのキットであり、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、及び
（ｂ）少なくとも１つの化学的変異原
を含む、前記キット。
【請求項7】
前記方法またはキットが、さらに、（ｃ）少なくとも１つのガイド核酸または前記少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸を含み、前記少なくとも１つのガイド核酸が、前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、前記少なくとも１つのガイド核酸が、前記標的核酸分子とハイブリダイズする、請求項１に記載の方法、または請求項６に記載のキット。
【請求項8】
前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼが、ＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法、または請求項６に記載のキット。
【請求項9】
前記標的核酸分子が、細胞内に位置する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞が、植物細胞または動物細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記植物細胞が、トウモロコシ細胞、ワタ細胞、キャノーラ細胞、ダイズ細胞、イネ細胞、トマト細胞、コムギ細胞、ムラサキウマゴヤシ細胞、モロコシ細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞、キュウリ細胞、ジャガイモ細胞、及び藻類細胞からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
（ｉ）前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、もしくは前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸；または（ｉｉ）前記少なくとも１つのガイド核酸、もしくは前記少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸；または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションからなる群より選択される方法により、前記細胞に提供される、請求項９に記載の方法。
【請求項14】
前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ及び前記少なくとも１つのガイドＲＮＡが、リボヌクレオタンパク質として提供される、請求項２～５もしくは７のいずれか１項に記載の方法、または請求項７に記載のキット。
【請求項15】
前記リボヌクレオタンパク質が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションからなる群より選択される方法により細胞に提供される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記１つ以上の送達粒子が、エクソソーム、リポソーム、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ナノ粒子、ポリカチオン、及びカチオン性オリゴペプチドからなる群より選択される、請求項１３または１５に記載の方法。
【請求項17】
（ｉ）前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、もしくは前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、または（ｉｉ）前記少なくとも１つのガイド核酸、もしくは前記少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸が、前記細胞に、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで提供される、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
前記リボヌクレオタンパク質が、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで前記細胞に提供される、請求項１５に記載の方法。
【請求項19】
前記少なくとも１つの変異原が、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される化学的変異原である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法、または請求項６に記載のキット。
【請求項20】
前記触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼが、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法、または請求項６に記載のキット。
【請求項21】
前記触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、触媒的に不活性なＣａｓ９、触媒的に不活性なＣｐｆ１、触媒的に不活性なＣａｓＸ、触媒的に不活性なＣａｓＹ、触媒的に不活性なＣ２ｃ２、触媒的に不活性なＣａｓ１、触媒的に不活性なＣａｓ１Ｂ、触媒的に不活性なＣａｓ２、触媒的に不活性なＣａｓ３、触媒的に不活性なＣａｓ４、触媒的に不活性なＣａｓ５、触媒的に不活性なＣａｓ６、触媒的に不活性なＣａｓ７、触媒的に不活性なＣａｓ８、触媒的に不活性なＣａｓ１０、触媒的に不活性なＣｓｙ１、触媒的に不活性なＣｓｙ２、触媒的に不活性なＣｓｙ３、触媒的に不活性なＣｓｅ１、触媒的に不活性なＣｓｅ２、触媒的に不活性なＣｓｃ１、触媒的に不活性なＣｓｃ２、触媒的に不活性なＣｓａ５、触媒的に不活性なＣｓｎ２、触媒的に不活性なＣｓｍ１、触媒的に不活性なＣｓｍ２、触媒的に不活性なＣｓｍ３、触媒的に不活性なＣｓｍ４、触媒的に不活性なＣｓｍ５、触媒的に不活性なＣｓｍ６、触媒的に不活性なＣｍｒ１、触媒的に不活性なＣｍｒ３、触媒的に不活性なＣｍｒ４、触媒的に不活性なＣｍｒ５、触媒的に不活性なＣｍｒ６、触媒的に不活性なＣｓｂ１、触媒的に不活性なＣｓｂ２、触媒的に不活性なＣｓｂ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１７、触媒的に不活性なＣｓｘ１４、触媒的に不活性なＣｓｘ１０、触媒的に不活性なＣｓｘ１６、触媒的に不活性なＣｓａＸ、触媒的に不活性なＣｓｘ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１、触媒的に不活性なＣｓｘ１５、触媒的に不活性なＣｓｆ１、触媒的に不活性なＣｓｆ２、触媒的に不活性なＣｓｆ３、及び触媒的に不活性なＣｓｆ４からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法またはキット。
【請求項22】
前記少なくとも１つのガイド核酸が、１分子ガイドを含む、請求項２～５もしくは７のいずれか１項に記載の方法、または請求項７に記載のキット。
【請求項23】
前記少なくとも１つのガイド核酸が、前記標的核酸分子の標的領域と少なくとも８０％の相補性を含む、請求項２～５もしくは７のいずれか１項に記載の方法、または請求項７に記載のキット。
【請求項24】
前記標的化改変が、置換、挿入、及び欠失からなる群より選択される、請求項１もしくは２に記載の方法、または請求項６に記載のキット。
【請求項25】
前記標的核酸分子が、遺伝子をコードする、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法、または請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月２日に出願された米国仮出願第６２／８４２，１８４号（全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
本出願は、２０１９年５月２日に出願された米国仮出願第６２／８４２，１８４号（全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【0002】
本開示は、標的化核酸に改変を生成するために、変異原と組み合わせて、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼを使用することに関連する組成物及び方法に関する。
【0003】
配列表の組み込み
１０４，２１３バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）であるＰ３４７１６ＷＯ００＿ＳＥＱ．ｔｘｔという名称のファイルに含有され、２０２０年５月１日に作成され、４３の配列を含む配列表は、これと共に電子的に出願され、全体が参照により組み込まれる。
１０４，２１３バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）であるＰ３４７１６ＷＯ００＿ＳＥＱ．ｔｘｔという名称のファイルに含有され、２０２０年５月１日に作成され、４３の配列を含む配列表は、これと共に電子的に出願され、全体が参照により組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）などの化学的変異原、及び電離放射線は、遺伝的変化を誘発するための植物育種のツールとして長い間使用されている。より大きな種子サイズ、耐病性、及びより良い繊維品質などの望ましい形質を有する植物品種が、変異導入により開発されている。変異原により導入された遺伝的変化は、ゲノム内でランダムに発生し、これは、育種家に変異数、ゲノム中での位置、または変異原により標的とされる細胞（例えば、体細胞対生殖細胞）の精密な制御を提供しない。育種家は、導入される変異数を制限または最大化するために、変異原の投薬量を調整してもよい。高用量の変異原は、高い変異率を誘発し、所望の標的で発生する変異の可能性を増加させるために使用されてもよいが、高変異率は、高死亡率ももたらす。低用量の変異原は、より高い生存率及びゲノム内のより低い変異をもたらし、それにより、変異が所望の標的で生じる可能性が減少し、有益な変異を同定するために、多数の植物のスクリーニングが必要とされる。ゲノムの選択領域に変異原活性を標的とすることができないことは、所望の位置にランダムに生じている変異を同定及び回収するために、多数の植物を変異原に曝露させる際に、及び多数の変異導入植物をスクリーニングする際に、育種家がリソースを消費することを必要とする。それ故、変異原の変異原活性をゲノム内の標的化領域に集中させることが望ましいであろう。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】標的化ｄＣａｓ９の非存在下で、化学的変異原であるＥＭＳにより誘発されたｒｐｏＢ遺伝子内のＲｉｆｒ変異及び出現頻度を示す。０．１％または１％のＥＭＳで処置された、ｄＣａｓ９及びＺｍ７．１（Ｅ．ｃｏｌｉゲノムには見られない配列）を標的とするｇＲＮＡを発現する細胞から、Ｒｉｆｒコロニーを生成した。ｒｐｏＢ遺伝子（配列番号１）のフラグメントである配列番号３内に変異を有していた位置のみが示される。『位置』＝配列番号１のヌクレオチド位置。
【図2】標的化及び非標的化の触媒的に不活性なＲＮＡガイドヌクレアーゼと組み合わせて、化学的変異原であるＥＭＡにより誘発されたｒｐｏＢ変異及び出現頻度の概要を示す。ｒｐｏＢ遺伝子（配列番号１）のフラグメントである配列番号３内に変異を有していた位置のみが示される。０．１％のＥＭＳで処置された、ｄＣｐｆ１またはｄＣａｓ９及び同族のｇＲＮＡを発現する細胞から、Ｒｉｆｒコロニーを生成した。『Ｃａｓ９－ＴＳ』＝Ｓｐ－ｒｐｏＢ－１５２６ Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ標的部位内に存在するヌクレオチド。『Ｃｐｆ１－ＴＳ』＝Ｓｐ－ｒｐｏＢ－１５７８ Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡ標的部位内に存在するヌクレオチド。『ＷＴ ｓｅｑ』＝配列番号１。『位置』＝配列番号１に対するヌクレオチドの位置。ＥＭＳ誘発性トランジションの潜在的な標的として機能するＷＴ ｓｅｑ内のＧ及びＣ残基は、灰色で網掛けされている。『－』＝インフレーム／３ｎの欠失。１５９０位の『ＣＡＴ』＝インフレーム挿入。１５３０位のＡ＊＝サイレント変異。
【図3】ｄＣａｓ９＋ｇ－ｒｐｏＢ－１５２６；ｄＣａｓ９＋ｇ－Ｚｍ７．１；またはｄＣｐｆ１＋ｇ－ｒｐｏＢ－１５７８を発現する、ＥＭＳで処置されたＥ．ｃｏｌｉ細胞のコロニーにおいて、ＰＣＲにより検出された二重変異の頻度を示す。数＝コロニー数。
【図4】サイクル照明（明）及び暗の両方の条件で、試験された各プラスミドの組み合わせの、総ＣＦＵに対する５－ＦＵ耐性ＣＦＵの割合のプロットを示す。
【発明の概要】
【0006】
一態様では、本開示は、標的核酸分子に改変を導入する方法を提供し、方法は、標的核酸分子を、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、及び（ｂ）少なくとも１つの変異原（少なくとも１つの改変が、標的核酸分子に導入される）、と接触させること、を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、さらに、少なくとも１つのガイド核酸と接触させ、少なくとも１つのガイド核酸は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、直接ＤＮＡ結合ドメインを介して標的核酸分子と相互作用する。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで接触させる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、原核細胞のゲノム中にある。いくつかの実施形態では、原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ細胞、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ細胞、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、真核細胞のゲノム中にある。いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、藻類細胞、及び酵母細胞から選択される。いくつかの実施形態では、植物細胞は、トウモロコシ細胞、ワタ細胞、キャノーラ細胞、ダイズ細胞、オオムギ細胞、ライムギ細胞、イネ細胞、トマト細胞、コショウ細胞、コムギ細胞、ムラサキウマゴヤシ細胞、モロコシ細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞、キュウリ細胞、ジャガイモ細胞、サツマイモ細胞、ニンジン細胞、リンゴ細胞、バナナ細胞、パイナップル細胞、ブルーベリー細胞、ブラックベリー細胞、ラズベリー細胞、イチゴ細胞、ウリ科植物細胞、アブラナ細胞、柑橘類細胞、及びタマネギ細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９、触媒的に不活性なＣｐｆ１、触媒的に不活性なＣａｓＸ、触媒的に不活性なＣａｓＹ、触媒的に不活性なＣ２ｃ２、触媒的に不活性なＣａｓ１、触媒的に不活性なＣａｓ１Ｂ、触媒的に不活性なＣａｓ２、触媒的に不活性なＣａｓ３、触媒的に不活性なＣａｓ４、触媒的に不活性なＣａｓ５、触媒的に不活性なＣａｓ６、触媒的に不活性なＣａｓ７、触媒的に不活性なＣａｓ８、触媒的に不活性なＣａｓ１０、触媒的に不活性なＣｓｙ１、触媒的に不活性なＣｓｙ２、触媒的に不活性なＣｓｙ３、触媒的に不活性なＣｓｅ１、触媒的に不活性なＣｓｅ２、触媒的に不活性なＣｓｃ１、触媒的に不活性なＣｓｃ２、触媒的に不活性なＣｓａ５、触媒的に不活性なＣｓｎ２、触媒的に不活性なＣｓｍ１、触媒的に不活性なＣｓｍ２、触媒的に不活性なＣｓｍ３、触媒的に不活性なＣｓｍ４、触媒的に不活性なＣｓｍ５、触媒的に不活性なＣｓｍ６、触媒的に不活性なＣｍｒ１、触媒的に不活性なＣｍｒ３、触媒的に不活性なＣｍｒ４、触媒的に不活性なＣｍｒ５、触媒的に不活性なＣｍｒ６、触媒的に不活性なＣｓｂ１、触媒的に不活性なＣｓｂ２、触媒的に不活性なＣｓｂ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１７、触媒的に不活性なＣｓｘ１４、触媒的に不活性なＣｓｘ１０、触媒的に不活性なＣｓｘ１６、触媒的に不活性なＣｓａＸ、触媒的に不活性なＣｓｘ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１、触媒的に不活性なＣｓｘ１５、触媒的に不活性なＣｓｆ１、触媒的に不活性なＣｓｆ２、触媒的に不活性なＣｓｆ３、及び触媒的に不活性なＣｓｆ４からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＴＴＴＮ、ＹＧ、ＹＴＮ、ＴＴＣＮ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＴＹＣＶ、ＮＧＲＲＴ、ＮＧＲＲＮ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＲＹＡＣ、ＮＮＡＧＡＡＷ、及びＮＡＡＡＡＣからなる群より選択される、５’から３’へのヌクレオチド配列を含む。
【0007】
一態様では、本開示は、標的核酸分子に標的化改変を誘発する方法を提供し、方法は、標的核酸分子を、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸（少なくとも１つのガイド核酸が、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸が、標的核酸分子とハイブリダイズする）、及び（ｃ）少なくとも１つの変異原、と接触させること、を含み、標的核酸分子は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を含み、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から１００ヌクレオチド内の標的核酸分子に誘発される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から９０ヌクレオチド内の標的核酸分子において誘発される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から８０ヌクレオチド内の標的核酸分子において誘発される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から７０ヌクレオチド内の標的核酸分子において誘発される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から６０ヌクレオチド内の標的核酸分子において誘発される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から５０ヌクレオチド内の標的核酸分子において誘発される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から４０ヌクレオチド内の標的核酸分子において誘発される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から３０ヌクレオチド内の標的核酸分子において誘発される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から２０ヌクレオチド内の標的核酸分子において誘発される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から１０ヌクレオチド内の標的核酸分子において誘発される。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ部位は、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＴＴＴＮ、ＹＧ、ＹＴＮ、ＴＴＣＮ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＴＹＣＶ、ＮＧＲＲＴ、ＮＧＲＲＮ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＲＹＡＣ、ＮＮＡＧＡＡＷ、及びＮＡＡＡＡＣからなる群より選択される、５’から３’へのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９、触媒的に不活性なＣｐｆ１、触媒的に不活性なＣａｓＸ、触媒的に不活性なＣａｓＹ、触媒的に不活性なＣ２ｃ２、触媒的に不活性なＣａｓ１、触媒的に不活性なＣａｓ１Ｂ、触媒的に不活性なＣａｓ２、触媒的に不活性なＣａｓ３、触媒的に不活性なＣａｓ４、触媒的に不活性なＣａｓ５、触媒的に不活性なＣａｓ６、触媒的に不活性なＣａｓ７、触媒的に不活性なＣａｓ８、触媒的に不活性なＣａｓ１０、触媒的に不活性なＣｓｙ１、触媒的に不活性なＣｓｙ２、触媒的に不活性なＣｓｙ３、触媒的に不活性なＣｓｅ１、触媒的に不活性なＣｓｅ２、触媒的に不活性なＣｓｃ１、触媒的に不活性なＣｓｃ２、触媒的に不活性なＣｓａ５、触媒的に不活性なＣｓｎ２、触媒的に不活性なＣｓｍ１、触媒的に不活性なＣｓｍ２、触媒的に不活性なＣｓｍ３、触媒的に不活性なＣｓｍ４、触媒的に不活性なＣｓｍ５、触媒的に不活性なＣｓｍ６、触媒的に不活性なＣｍｒ１、触媒的に不活性なＣｍｒ３、触媒的に不活性なＣｍｒ４、触媒的に不活性なＣｍｒ５、触媒的に不活性なＣｍｒ６、触媒的に不活性なＣｓｂ１、触媒的に不活性なＣｓｂ２、触媒的に不活性なＣｓｂ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１７、触媒的に不活性なＣｓｘ１４、触媒的に不活性なＣｓｘ１０、触媒的に不活性なＣｓｘ１６、触媒的に不活性なＣｓａＸ、触媒的に不活性なＣｓｘ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１、触媒的に不活性なＣｓｘ１５、触媒的に不活性なＣｓｆ１、触媒的に不活性なＣｓｆ２、触媒的に不活性なＣｓｆ３、及び触媒的に不活性なＣｓｆ４からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、１分子ガイドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子の標的領域と少なくとも８０％の相補性を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで接触させる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、原核細胞のゲノム中にある。いくつかの実施形態では、原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ細胞、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ細胞、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、真核細胞のゲノム中にある。いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、藻類細胞、及び酵母細胞から選択される。いくつかの実施形態では、植物細胞は、トウモロコシ細胞、ワタ細胞、キャノーラ細胞、ダイズ細胞、イネ細胞、トマト細胞、コムギ細胞、ムラサキウマゴヤシ細胞、モロコシ細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞、キュウリ細胞、ジャガイモ細胞、ニンジン細胞、リンゴ細胞、バナナ細胞、パイナップル細胞、ブルーベリー細胞、ブラックベリー細胞、ラズベリー細胞、ウリ科植物細胞、柑橘類細胞、及びタマネギ細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。
【0008】
一態様では、本開示は、核酸分子の標的化領域の変異率を増加させる方法を提供し、方法は、標的核酸分子を、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸（少なくとも１つのガイド核酸が、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸が、標的化領域に隣接する核酸分子とハイブリダイズする）、及び（ｃ）少なくとも１つの変異原、と接触させること、を含み、核酸分子は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を含み、核酸分子の標的化領域における変異率は、非標的化核酸分子と比較して増加する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ部位は、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＴＴＴＮ、ＹＧ、ＹＴＮ、ＴＴＣＮ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＴＹＣＶ、ＮＧＲＲＴ、ＮＧＲＲＮ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＲＹＡＣ、ＮＮＡＧＡＡＷ、及びＮＡＡＡＡＣからなる群より選択される、５’から３’へのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９、触媒的に不活性なＣｐｆ１、触媒的に不活性なＣａｓＸ、触媒的に不活性なＣａｓＹ、触媒的に不活性なＣ２ｃ２、触媒的に不活性なＣａｓ１、触媒的に不活性なＣａｓ１Ｂ、触媒的に不活性なＣａｓ２、触媒的に不活性なＣａｓ３、触媒的に不活性なＣａｓ４、触媒的に不活性なＣａｓ５、触媒的に不活性なＣａｓ６、触媒的に不活性なＣａｓ７、触媒的に不活性なＣａｓ８、触媒的に不活性なＣａｓ１０、触媒的に不活性なＣｓｙ１、触媒的に不活性なＣｓｙ２、触媒的に不活性なＣｓｙ３、触媒的に不活性なＣｓｅ１、触媒的に不活性なＣｓｅ２、触媒的に不活性なＣｓｃ１、触媒的に不活性なＣｓｃ２、触媒的に不活性なＣｓａ５、触媒的に不活性なＣｓｎ２、触媒的に不活性なＣｓｍ１、触媒的に不活性なＣｓｍ２、触媒的に不活性なＣｓｍ３、触媒的に不活性なＣｓｍ４、触媒的に不活性なＣｓｍ５、触媒的に不活性なＣｓｍ６、触媒的に不活性なＣｍｒ１、触媒的に不活性なＣｍｒ３、触媒的に不活性なＣｍｒ４、触媒的に不活性なＣｍｒ５、触媒的に不活性なＣｍｒ６、触媒的に不活性なＣｓｂ１、触媒的に不活性なＣｓｂ２、触媒的に不活性なＣｓｂ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１７、触媒的に不活性なＣｓｘ１４、触媒的に不活性なＣｓｘ１０、触媒的に不活性なＣｓｘ１６、触媒的に不活性なＣｓａＸ、触媒的に不活性なＣｓｘ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１、触媒的に不活性なＣｓｘ１５、触媒的に不活性なＣｓｆ１、触媒的に不活性なＣｓｆ２、触媒的に不活性なＣｓｆ３、及び触媒的に不活性なＣｓｆ４からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、１分子ガイドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子の標的領域と少なくとも８０％の相補性を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで接触させる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、原核細胞のゲノム中にある。いくつかの実施形態では、原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ細胞、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ細胞、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、真核細胞のゲノム中にある。いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、藻類細胞、及び酵母細胞から選択される。いくつかの実施形態では、植物細胞は、トウモロコシ細胞、ワタ細胞、キャノーラ細胞、ダイズ細胞、イネ細胞、トマト細胞、コムギ細胞、ムラサキウマゴヤシ細胞、モロコシ細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞、キュウリ細胞、ジャガイモ細胞、ニンジン細胞、リンゴ細胞、バナナ細胞、パイナップル細胞、ブルーベリー細胞、ブラックベリー細胞、ラズベリー細胞、ウリ科植物細胞、柑橘類細胞、及びタマネギ細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。
【0009】
一態様では、本開示は、植物のゲノム内の核酸分子の標的化領域において対立遺伝子多様性を増加させる方法を提供し、方法は、植物に、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼまたは触媒的に誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸または少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸（少なくとも１つのガイド核酸が、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸が、核酸分子の標的化領域に隣接してハイブリダイズする）、及び（ｃ）少なくとも１つの変異原、を提供すること、を含み、核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、核酸の標的化領域の対立遺伝子多様性が増加する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の５’側の、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００ヌクレオチド以内にある。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の５’側の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の３’側の、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００ヌクレオチド以内にある。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の３’側の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ部位は、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＴＴＴＮ、ＹＧ、ＹＴＮ、ＴＴＣＮ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＴＹＣＶ、ＮＧＲＲＴ、ＮＧＲＲＮ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＲＹＡＣ、ＮＮＡＧＡＡＷ、及びＮＡＡＡＡＣからなる群より選択される、５’から３’へのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９、触媒的に不活性なＣｐｆ１、触媒的に不活性なＣａｓＸ、触媒的に不活性なＣａｓＹ、触媒的に不活性なＣ２ｃ２、触媒的に不活性なＣａｓ１、触媒的に不活性なＣａｓ１Ｂ、触媒的に不活性なＣａｓ２、触媒的に不活性なＣａｓ３、触媒的に不活性なＣａｓ４、触媒的に不活性なＣａｓ５、触媒的に不活性なＣａｓ６、触媒的に不活性なＣａｓ７、触媒的に不活性なＣａｓ８、触媒的に不活性なＣａｓ１０、触媒的に不活性なＣｓｙ１、触媒的に不活性なＣｓｙ２、触媒的に不活性なＣｓｙ３、触媒的に不活性なＣｓｅ１、触媒的に不活性なＣｓｅ２、触媒的に不活性なＣｓｃ１、触媒的に不活性なＣｓｃ２、触媒的に不活性なＣｓａ５、触媒的に不活性なＣｓｎ２、触媒的に不活性なＣｓｍ１、触媒的に不活性なＣｓｍ２、触媒的に不活性なＣｓｍ３、触媒的に不活性なＣｓｍ４、触媒的に不活性なＣｓｍ５、触媒的に不活性なＣｓｍ６、触媒的に不活性なＣｍｒ１、触媒的に不活性なＣｍｒ３、触媒的に不活性なＣｍｒ４、触媒的に不活性なＣｍｒ５、触媒的に不活性なＣｍｒ６、触媒的に不活性なＣｓｂ１、触媒的に不活性なＣｓｂ２、触媒的に不活性なＣｓｂ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１７、触媒的に不活性なＣｓｘ１４、触媒的に不活性なＣｓｘ１０、触媒的に不活性なＣｓｘ１６、触媒的に不活性なＣｓａＸ、触媒的に不活性なＣｓｘ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１、触媒的に不活性なＣｓｘ１５、触媒的に不活性なＣｓｆ１、触媒的に不活性なＣｓｆ２、触媒的に不活性なＣｓｆ３、及び触媒的に不活性なＣｓｆ４からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、１分子ガイドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子の標的領域と少なくとも８０％の相補性を含む。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。いくつかの実施形態では、植物は、トウモロコシ、ワタ、ダイズ、キャノーラ、コムギ、オオムギ、イネ、トマト、タマネギ、コショウ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、イチゴ、スイカ、ウリ科植物、アブラナ、ホウレンソウ、ナス、ジャガイモ、サツマイモ、サトウキビ、オート麦、キビ、ライムギ、アマ、ムラサキウマゴヤシ、及びテンサイから選択される。いくつかの実施形態では、植物は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸及び少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸及び少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸のうちの１つ以上は、アグロバクテリウム媒介形質転換、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションからなる群より選択される方法により植物に提供される。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ及び少なくとも１つのガイドＲＮＡは、リボヌクレオタンパク質として植物に提供される。いくつかの実施形態では、リボヌクレオタンパク質は、アグロバクテリウム媒介形質転換、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションからなる群より選択される方法により植物に提供される。いくつかの実施形態では、Ｂｒａｃｈｙｔｉｃ１、Ｂｒａｃｈｙｔｉｃ２、Ｂｒａｃｈｙｔｉｃ３、開花遺伝子座Ｔ、Ｒｇｈ１、Ｒｓｐ１、Ｒｓｐ２、Ｒｓｐ３、５－エノールピルビルシキマート－３－ホスファートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、パラ－アミノ安息香酸シンターゼ、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロームＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータ－チューブリン、ＲＵＢＩＳＣＯ、翻訳開始因子、フィトエンデサチュラーゼ２本鎖ＤＮＡアデノシントリポリホスファターゼ（ｄｄＡＴＰ）、脂肪酸デサチュラーゼ２（ＦＡＤ２）、ジベレリン２０オキシダーゼ（ＧＡ２０ｏｘ）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、ｐ－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、ヒドロキシメチルジヒドロプテリンピロホスホキナーゼ（ＤＨＰＳ）、オーキシン／インドール－３－酢酸（ＡＵＸ／ＩＡＡ）、Ｗａｘｙ（Ｗｘ）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ＯｓＥＲＦ９２２、ＯｓＳＷＥＥＴ１３、ＯｓＳＷＥＥＴ１４、ＴａＭＬＯ、ＧＬ２、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ２）、Ｍａｔｒｉｌｉｎｅａｌ（ＭＴＬ）、Ｆｒｉｇｉｄａ、Ｇｒａｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ ２（ＧＷ２）、Ｇｎ１ａ、ＤＥＰ１、ＧＳ３、ＳｌＭＬＯ１、ＳｌＪＡＺ２、ＣｓＬＯＢ１、ＥＤＲ１、Ｓｅｌｆ－Ｐｒｕｎｉｎｇ ５Ｇ（ＳＰ５Ｇ）、Ｓｌａｇａｍｏｕｓ－Ｌｉｋｅ ６（ＳｌＡＧＬ６）、温度感受性遺伝子雄性不稔５遺伝子（ＴＭＳ５）、ＯｓＭＡＴＬ、ＡＲＧＯＳ８、真核生物の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）、または液胞インベルターゼ（ＶＩｎｖ）をコードする核酸分子において、対立遺伝子多様性が増加する。
【0010】
一態様では、本開示は、原核生物のゲノム内の核酸分子の標的化領域において対立遺伝子多様性を増加させる方法を提供し、方法は、原核生物に、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼまたは触媒的に誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸または少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸（少なくとも１つのガイド核酸が、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸が、核酸分子の標的化領域に隣接してハイブリダイズする）、及び（ｃ）少なくとも１つの変異原、を提供すること、を含み、核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、核酸の標的化領域の対立遺伝子多様性が増加する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の５’側の、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００ヌクレオチド以内にある。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の５’側の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の３’側の、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００ヌクレオチド以内にある。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の３’側の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ部位は、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＴＴＴＮ、ＹＧ、ＹＴＮ、ＴＴＣＮ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＴＹＣＶ、ＮＧＲＲＴ、ＮＧＲＲＮ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＲＹＡＣ、ＮＮＡＧＡＡＷ、及びＮＡＡＡＡＣからなる群より選択される、５’から３’へのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９、触媒的に不活性なＣｐｆ１、触媒的に不活性なＣａｓＸ、触媒的に不活性なＣａｓＹ、触媒的に不活性なＣ２ｃ２、触媒的に不活性なＣａｓ１、触媒的に不活性なＣａｓ１Ｂ、触媒的に不活性なＣａｓ２、触媒的に不活性なＣａｓ３、触媒的に不活性なＣａｓ４、触媒的に不活性なＣａｓ５、触媒的に不活性なＣａｓ６、触媒的に不活性なＣａｓ７、触媒的に不活性なＣａｓ８、触媒的に不活性なＣａｓ１０、触媒的に不活性なＣｓｙ１、触媒的に不活性なＣｓｙ２、触媒的に不活性なＣｓｙ３、触媒的に不活性なＣｓｅ１、触媒的に不活性なＣｓｅ２、触媒的に不活性なＣｓｃ１、触媒的に不活性なＣｓｃ２、触媒的に不活性なＣｓａ５、触媒的に不活性なＣｓｎ２、触媒的に不活性なＣｓｍ１、触媒的に不活性なＣｓｍ２、触媒的に不活性なＣｓｍ３、触媒的に不活性なＣｓｍ４、触媒的に不活性なＣｓｍ５、触媒的に不活性なＣｓｍ６、触媒的に不活性なＣｍｒ１、触媒的に不活性なＣｍｒ３、触媒的に不活性なＣｍｒ４、触媒的に不活性なＣｍｒ５、触媒的に不活性なＣｍｒ６、触媒的に不活性なＣｓｂ１、触媒的に不活性なＣｓｂ２、触媒的に不活性なＣｓｂ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１７、触媒的に不活性なＣｓｘ１４、触媒的に不活性なＣｓｘ１０、触媒的に不活性なＣｓｘ１６、触媒的に不活性なＣｓａＸ、触媒的に不活性なＣｓｘ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１、触媒的に不活性なＣｓｘ１５、触媒的に不活性なＣｓｆ１、触媒的に不活性なＣｓｆ２、触媒的に不活性なＣｓｆ３、及び触媒的に不活性なＣｓｆ４からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、１分子ガイドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子の標的領域と少なくとも８０％の相補性を含む。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。いくつかの実施形態では、原核生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓから選択される。いくつかの実施形態では、対立遺伝子多様性は、殺虫性毒素をコードする核酸において増加する。
【0011】
一態様では、本開示は、植物に作物栽培特性の改善を提供する方法を提供し、方法は、（ａ）第１の植物に、（ｉ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼまたは触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）少なくとも１つのガイド核酸またはガイド核酸をコードする核酸（少なくとも１つのガイド核酸は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸は、植物のゲノム中の核酸分子の標的化領域とハイブリダイズし、核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を含む）、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの変異原（少なくとも１つの改変は、核酸分子の標的化領域に誘発される）、を提供すること、（ｂ）第１の植物から少なくとも１つの子孫植物を生成すること、ならびに（ｃ）少なくとも１つの改変及び改善された作物栽培特性を含む少なくとも１つの子孫植物を選抜すること、を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の５’側の、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００ヌクレオチド以内にある。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の５’側の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の３’側の、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００ヌクレオチド以内にある。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の３’側の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ部位は、ＮＧＧ、ＮＧＡ、ＴＴＴＮ、ＹＧ、ＹＴＮ、ＴＴＣＮ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＴＹＣＶ、ＮＧＲＲＴ、ＮＧＲＲＮ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＮＮＲＹＡＣ、ＮＮＡＧＡＡＷ、及びＮＡＡＡＡＣからなる群より選択される、５’から３’へのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９、触媒的に不活性なＣｐｆ１、触媒的に不活性なＣａｓＸ、触媒的に不活性なＣａｓＹ、触媒的に不活性なＣ２ｃ２、触媒的に不活性なＣａｓ１、触媒的に不活性なＣａｓ１Ｂ、触媒的に不活性なＣａｓ２、触媒的に不活性なＣａｓ３、触媒的に不活性なＣａｓ４、触媒的に不活性なＣａｓ５、触媒的に不活性なＣａｓ６、触媒的に不活性なＣａｓ７、触媒的に不活性なＣａｓ８、触媒的に不活性なＣａｓ１０、触媒的に不活性なＣｓｙ１、触媒的に不活性なＣｓｙ２、触媒的に不活性なＣｓｙ３、触媒的に不活性なＣｓｅ１、触媒的に不活性なＣｓｅ２、触媒的に不活性なＣｓｃ１、触媒的に不活性なＣｓｃ２、触媒的に不活性なＣｓａ５、触媒的に不活性なＣｓｎ２、触媒的に不活性なＣｓｍ１、触媒的に不活性なＣｓｍ２、触媒的に不活性なＣｓｍ３、触媒的に不活性なＣｓｍ４、触媒的に不活性なＣｓｍ５、触媒的に不活性なＣｓｍ６、触媒的に不活性なＣｍｒ１、触媒的に不活性なＣｍｒ３、触媒的に不活性なＣｍｒ４、触媒的に不活性なＣｍｒ５、触媒的に不活性なＣｍｒ６、触媒的に不活性なＣｓｂ１、触媒的に不活性なＣｓｂ２、触媒的に不活性なＣｓｂ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１７、触媒的に不活性なＣｓｘ１４、触媒的に不活性なＣｓｘ１０、触媒的に不活性なＣｓｘ１６、触媒的に不活性なＣｓａＸ、触媒的に不活性なＣｓｘ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１、触媒的に不活性なＣｓｘ１５、触媒的に不活性なＣｓｆ１、触媒的に不活性なＣｓｆ２、触媒的に不活性なＣｓｆ３、及び触媒的に不活性なＣｓｆ４からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、１分子ガイドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子の標的領域と少なくとも８０％の相補性を含む。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。いくつかの実施形態では、植物は、トウモロコシ、ワタ、ダイズ、キャノーラ、コムギ、オオムギ、イネ、トマト、タマネギ、コショウ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、イチゴ、スイカ、ウリ科植物、アブラナ、ホウレンソウ、ナス、ジャガイモ、サツマイモ、サトウキビ、オート麦、キビ、ライムギ、アマ、ムラサキウマゴヤシ、及びテンサイから選択される。いくつかの実施形態では、植物は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸及び少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、改善された作物栽培特性は、耐病性、非生物的ストレス耐性、耐虫性、油含有量、高さ、耐乾性、成熟度、耐倒伏性、粒重、及び収量からなる群より選択される。
【0012】
一態様では、本開示は、標的核酸分子に標的化改変を誘発するためのキットを提供し、キットは、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、及び、（ｂ）少なくとも１つの化学的変異原、を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓ９、触媒的に不活性なＣｐｆ１、触媒的に不活性なＣａｓＸ、触媒的に不活性なＣａｓＹ、触媒的に不活性なＣ２ｃ２、触媒的に不活性なＣａｓ１、触媒的に不活性なＣａｓ１Ｂ、触媒的に不活性なＣａｓ２、触媒的に不活性なＣａｓ３、触媒的に不活性なＣａｓ４、触媒的に不活性なＣａｓ５、触媒的に不活性なＣａｓ６、触媒的に不活性なＣａｓ７、触媒的に不活性なＣａｓ８、触媒的に不活性なＣａｓ１０、触媒的に不活性なＣｓｙ１、触媒的に不活性なＣｓｙ２、触媒的に不活性なＣｓｙ３、触媒的に不活性なＣｓｅ１、触媒的に不活性なＣｓｅ２、触媒的に不活性なＣｓｃ１、触媒的に不活性なＣｓｃ２、触媒的に不活性なＣｓａ５、触媒的に不活性なＣｓｎ２、触媒的に不活性なＣｓｍ１、触媒的に不活性なＣｓｍ２、触媒的に不活性なＣｓｍ３、触媒的に不活性なＣｓｍ４、触媒的に不活性なＣｓｍ５、触媒的に不活性なＣｓｍ６、触媒的に不活性なＣｍｒ１、触媒的に不活性なＣｍｒ３、触媒的に不活性なＣｍｒ４、触媒的に不活性なＣｍｒ５、触媒的に不活性なＣｍｒ６、触媒的に不活性なＣｓｂ１、触媒的に不活性なＣｓｂ２、触媒的に不活性なＣｓｂ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１７、触媒的に不活性なＣｓｘ１４、触媒的に不活性なＣｓｘ１０、触媒的に不活性なＣｓｘ１６、触媒的に不活性なＣｓａＸ、触媒的に不活性なＣｓｘ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１、触媒的に不活性なＣｓｘ１５、触媒的に不活性なＣｓｆ１、触媒的に不活性なＣｓｆ２、触媒的に不活性なＣｓｆ３、及び触媒的に不活性なＣｓｆ４からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、キットは、さらに、少なくとも１つのガイド核酸またはガイド核酸をコードする核酸を含み、少なくとも１つのガイド核酸は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、キットは、さらに、ＤＮＡ標的化核酸、再構成及び／または希釈のための試薬のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは、さらに、細胞に触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼを導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡから触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをｉｎ ｖｉｔｒｏ産生するための試薬、ＤＮＡからＤＮＡ標的化核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏ産生するための試薬、アグロバクテリウム、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される試薬を含む。
【0013】
一態様では、本開示は、核酸分子の標的化領域に標的化改変を誘発する方法を提供し、方法は、標的核酸分子を、（ａ）標的化ＤＮＡ結合タンパク質、及び（ｂ）少なくとも１つの変異原（少なくとも１つの改変が核酸分子の標的化領域に誘発される）、と接触させること、を含む。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、及びトポイソメラーゼの群より選択される。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、固有の核酸切断活性を有さない。
【0014】
一態様では、本開示は、核酸分子の標的化領域に標的化改変を誘発する方法を提供し、方法は、核酸分子を、（ａ）標的化ＤＮＡ結合タンパク質（標的化ＤＮＡ結合タンパク質が核酸分子に結合する）、及び（ｂ）少なくとも１つの変異原（少なくとも１つの改変が核酸分子の標的化領域に誘発される）、と接触させること、を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで接触させる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、原核細胞のゲノム中にある。いくつかの実施形態では、原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ細胞、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ細胞、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、真核細胞のゲノム中にある。いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、藻類細胞、及び酵母細胞から選択される。いくつかの実施形態では、植物細胞は、トウモロコシ細胞、ワタ細胞、キャノーラ細胞、ダイズ細胞、オオムギ細胞、ライムギ細胞、イネ細胞、トマト細胞、コムギ細胞、ムラサキウマゴヤシ細胞、モロコシ細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞、キュウリ細胞、ジャガイモ細胞、サツマイモ細胞、コショウ細胞、ニンジン細胞、リンゴ細胞、バナナ細胞、パイナップル細胞、ブルーベリー細胞、ブラックベリー細胞、ラズベリー細胞、イチゴ細胞、ウリ科植物細胞、アブラナ細胞、柑橘類細胞、及びタマネギ細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、及びトポイソメラーゼの群より選択される。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、固有の核酸切断活性を有さない。
【0015】
一態様では、本開示は、核酸分子の標的化領域の変異率を増加させる方法を提供し、方法は、核酸分子を、（ａ）標的化ＤＮＡ結合タンパク質（標的化ＤＮＡ結合タンパク質が標的核酸分子に結合する）、及び（ｂ）少なくとも１つの変異原、と接触させること、を含み、核酸分子の標的化領域における変異率は、核酸分子の非標的化領域と比較して増加する。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、ｉｎ ｖｉｖｏで接触させる。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、原核細胞のゲノム中にある。いくつかの実施形態では、原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ細胞、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ細胞、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、真核細胞のゲノム中にある。いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、藻類細胞、及び酵母細胞から選択される。いくつかの実施形態では、植物細胞は、トウモロコシ細胞、ワタ細胞、キャノーラ細胞、ダイズ細胞、イネ細胞、トマト細胞、コショウ細胞、コムギ細胞、ムラサキウマゴヤシ細胞、モロコシ細胞、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞、キュウリ細胞、ジャガイモ細胞、ニンジン細胞、リンゴ細胞、バナナ細胞、パイナップル細胞、ブルーベリー細胞、ブラックベリー細胞、ラズベリー細胞、イチゴ細胞、ウリ科植物細胞、アブラナ細胞、柑橘類細胞、及びタマネギ細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、及びトポイソメラーゼの群より選択される。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、固有の核酸切断活性を有さない。
【0016】
一態様では、本開示は、植物のゲノム内の核酸分子の標的化領域において対立遺伝子多様性を増加させる方法を提供し、方法は、（ａ）標的化ＤＮＡ結合タンパク質または標的化ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸（標的化ＤＮＡ結合タンパク質が、標的核酸分子に結合する）、及び（ｃ）少なくとも１つの変異原、を植物に提供すること、を含み、核酸の標的化領域の対立遺伝子多様性が増加する。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。いくつかの実施形態では、植物は、トウモロコシ、ワタ、ダイズ、キャノーラ、コムギ、オオムギ、イネ、トマト、タマネギ、コショウ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、イチゴ、スイカ、ウリ科植物、アブラナ、ホウレンソウ、ナス、ジャガイモ、サツマイモ、サトウキビ、オート麦、キビ、ライムギ、アマ、ムラサキウマゴヤシ、及びテンサイから選択される。いくつかの実施形態では、植物は、標的化ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸は、アグロバクテリウム媒介形質転換、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションからなる群より選択される方法により植物に提供される。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、アグロバクテリウム媒介形質転換、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションからなる群より選択される方法により植物に提供される。いくつかの実施形態では、Ｂｒａｃｈｙｔｉｃ１、Ｂｒａｃｈｙｔｉｃ２、Ｂｒａｃｈｙｔｉｃ３、開花遺伝子座Ｔ、Ｒｇｈ１、Ｒｓｐ１、Ｒｓｐ２、Ｒｓｐ３、５－エノールピルビルシキマート－３－ホスファートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、パラ－アミノ安息香酸シンターゼ、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロームＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータ－チューブリン、ＲＵＢＩＳＣＯ、翻訳開始因子、フィトエンデサチュラーゼ２本鎖ＤＮＡアデノシントリポリホスファターゼ（ｄｄＡＴＰ）、脂肪酸デサチュラーゼ２（ＦＡＤ２）、ジベレリン２０オキシダーゼ（ＧＡ２０ｏｘ）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、ｐ－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、ヒドロキシメチルジヒドロプテリンピロホスホキナーゼ（ＤＨＰＳ）、オーキシン／インドール－３－酢酸（ＡＵＸ／ＩＡＡ）、Ｗａｘｙ（Ｗｘ）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ＯｓＥＲＦ９２２、ＯｓＳＷＥＥＴ１３、ＯｓＳＷＥＥＴ１４、ＴａＭＬＯ、ＧＬ２、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ２）、Ｍａｔｒｉｌｉｎｅａｌ（ＭＴＬ）、Ｆｒｉｇｉｄａ、Ｇｒａｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ ２（ＧＷ２）、Ｇｎ１ａ、ＤＥＰ１、ＧＳ３、ＳｌＭＬＯ１、ＳｌＪＡＺ２、ＣｓＬＯＢ１、ＥＤＲ１、Ｓｅｌｆ－Ｐｒｕｎｉｎｇ ５Ｇ（ＳＰ５Ｇ）、Ｓｌａｇａｍｏｕｓ－Ｌｉｋｅ ６（ＳｌＡＧＬ６）、温度感受性遺伝子雄性不稔５遺伝子（ＴＭＳ５）、ＯｓＭＡＴＬ、ＡＲＧＯＳ８、真核生物の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）、または液胞インベルターゼ（ＶＩｎｖ）をコードする核酸分子において、対立遺伝子多様性が増加する。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、及びトポイソメラーゼの群より選択される。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、固有の核酸切断活性を有さない。
【0017】
一態様では、本開示は、原核生物のゲノム内の核酸分子の標的化領域において対立遺伝子多様性を増加させる方法を提供し、方法は、原核生物に、（ａ）標的化ＤＮＡ結合タンパク質または標的化ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を提供すること（標的化ＤＮＡ結合タンパク質が核酸分子の標的化領域に結合する）、及び（ｂ）少なくとも１つの変異原、を提供すること、を含み、核酸の標的化領域の対立遺伝子多様性が増加する。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。いくつかの実施形態では、原核生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓから選択される。いくつかの実施形態では、対立遺伝子多様性は、殺虫性毒素をコードする核酸において増加する。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、及びトポイソメラーゼの群より選択される。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、固有の核酸切断活性を有さない。
【0018】
一態様では、本開示は、植物に改善された作物栽培特性を提供する方法を提供し、方法は、（ａ）第１の植物に、（ｉ）標的化ＤＮＡ結合タンパク質または標的化ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸（標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、植物のゲノム中の核酸分子の標的化領域に結合する）、及び（ｉｉ）少なくとも１つの変異原（少なくとも１つの改変は、核酸分子の標的化領域に誘発される）、を提供すること、（ｂ）第１の植物から少なくとも１つの子孫植物を生成すること、ならびに、（ｃ）少なくとも１つの改変及び改善された作物栽培特性を含む少なくとも１つの子孫植物を選抜すること、を含む。いくつかの実施形態では、変異原は、化学的変異原である。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、変異原は、物理的変異原である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、電離放射線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、Ｘ線である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、可視光である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、熱である。いくつかの実施形態では、物理的変異原は、紫外光である。いくつかの実施形態では、植物は、トウモロコシ、ワタ、ダイズ、キャノーラ、コムギ、オオムギ、イネ、トマト、タマネギ、コショウ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、イチゴ、スイカ、ウリ科植物、アブラナ、ホウレンソウ、ナス、ジャガイモ、サツマイモ、サトウキビ、オート麦、キビ、ライムギ、アマ、ムラサキウマゴヤシ、及びテンサイから選択される。いくつかの実施形態では、改善された作物栽培特性は、耐病性、非生物的ストレス耐性、耐虫性、油含有量、高さ、耐乾性、成熟度、耐倒伏性、粒重、及び収量からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、及びトポイソメラーゼの群より選択される。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、固有の核酸切断活性を有さない。
【0019】
一態様では、本開示は、標的核酸分子に標的化改変を誘発するためのキットを提供し、キットは、（ａ）標的化ＤＮＡ結合タンパク質、または標的化ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸、及び（ｂ）少なくとも１つの化学的変異原、を含む。いくつかの実施形態では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、キットは、さらに、ＤＮＡ標的化核酸、再構成及び／または希釈のための試薬のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは、さらに、標的化ＤＮＡ結合タンパク質を細胞に導入するための緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡから標的化ＤＮＡ結合タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生するための試薬、ＤＮＡから標的化ＤＮＡ結合タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生するための試薬、アグロバクテリウム、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される試薬を含む。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、及びトポイソメラーゼの群より選択される。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、固有の核酸切断活性を有さない。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本開示は、標的化配列内で変異を増加させるために変異原と組み合わせた、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ（例えば、限定されないが、核酸配列を標的とするガイド核酸と対合した、不活性型Ｃａｓ９または不活性型Ｃｐｆ１などの触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）を利用する組成物及び方法に関する。
【0021】
別途記載のない限り、使用される全ての専門及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。用語が単数形で提供される場合、発明者らは、また、その用語の複数形により記載される開示の態様を企図する。参照により組み込まれる参考文献で使用される用語及び定義に矛盾がある場合、本出願で使用される用語は、本明細書で与えられる定義を有するものとする。使用される他の専門用語は、様々な技術分野固有の辞書、例えば、「Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ（登録商標）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅｒｉｔａｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓの編集者、２０１１、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ Ｍｉｆｆｌｉｎ Ｈａｒｃｏｕｒｔ、Ｂｏｓｔｏｎ及びＮｅｗ Ｙｏｒｋ）、「ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ」（第６版、２００２、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、または「Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（第６版、２００８、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ及びＮｅｗ Ｙｏｒｋ）により例示されるように、それらが使用される技術分野における通常の意味を有する。本発明者らは、作用機序または作用様式に限定されることを意図しない。それへの参照は、例示のみを目的として提供される。
【0022】
本開示に記載の実施形態の実施は、別途指示のない限り、当該技術分野の技術の範囲内である、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、植物生物学、ゲノミクス、バイオテクノロジー、及び遺伝学の従来の手法を利用することを含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｆ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８－１１４２－７５，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｃ．Ｎ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ａ．Ｔｏｕｒａｅｖ，Ｖ．Ｃｉｔｏｖｓｋｙ，Ｔ．Ｔｚｆｉｒａ ｅｄｓ．（２０１１）Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）；及びＲ．Ｈ．Ｓｍｉｔｈ（２０１３）Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
【0023】
例えば、全ての特許、公開された特許出願、及び非特許公開を含む、本明細書で引用された任意の参照は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0024】
代替物の群が提示される場合、代替物の群を構成するメンバーのありとあらゆる組み合わせが具体的に想定される。例えば、部材が、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤからなる群より選択される場合、本発明者らは、各選択肢を個別に（例えば、Ａのみ、Ｂのみなど）、ならびにＡ、Ｂ、及びＤ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣなどの組み合わせで具体的に想定する。
【0025】
本明細書で使用される場合、単数形及び単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の用語は、例えば、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。
【0026】
本明細書で提供される任意の組成物、核酸分子、ポリペプチド、細胞、植物などは、特に、本明細書で提供される任意の方法と共に使用するために想定される。
【0027】
一態様では、本開示は、標的核酸に標的化改変を誘発する方法を提供し、方法は、標的核酸を（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、及び（ｂ）少なくとも１つの変異原（少なくとも１つの改変が標的核酸に誘発される）、と接触させること、を含む。さらなる態様では、本明細書で提供される方法は、さらに、（ｃ）少なくとも１つのガイド核酸を含み、少なくとも１つのガイド核酸は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子とハイブリダイズする。
【0028】
一態様では、本開示は、標的核酸に標的化改変を誘発する方法を提供し、方法は、標的核酸を（ａ）標的化ＤＮＡ結合タンパク質、及び（ｂ）少なくとも１つの変異原（少なくとも１つの改変が標的核酸に誘発される）、と接触させること、を含む。さらなる態様では、本明細書で提供される方法は、さらに、（ｃ）少なくとも１つのガイド核酸を含み、少なくとも１つのガイド核酸は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子とハイブリダイズする。
【0029】
一態様では、本開示は、標的核酸に標的化改変を誘発する方法を提供し、方法は、標的核酸を（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸（少なくとも１つのガイド核酸が、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸が、標的核酸とハイブリダイズする）、及び（ｃ）少なくとも１つの変異原、と接触させること、を含み、標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を含み、少なくとも１つの改変は、ＰＡＭ部位から１００ヌクレオチド内の標的核酸に誘発される。
【0030】
一態様では、本開示は、ゲノム中の標的化位置での変異原の活性を増加させる方法を提供し、方法は、ゲノムを、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、及び（ｂ）少なくとも１つの変異原（変異率が、ゲノム中の非標的化位置と比較して、標的化位置で増加する）、と接触させること、を含む。さらなる態様では、本明細書で提供される方法は、さらに、（ｃ）少なくとも１つのガイド核酸を含み、少なくとも１つのガイド核酸は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸は、標的化位置内またはそれと隣接してハイブリダイズする。
【0031】
一態様では、本開示は、ゲノム中の標的化位置での変異原の活性を増加させる方法を提供し、方法は、ゲノムを、（ａ）標的化ＤＮＡ結合タンパク質（標的化ＤＮＡ結合タンパク質が標的化位置内のまたはそれに隣接するＤＮＡに結合する）、及び（ｂ）少なくとも１つの変異原（変異率が、ゲノム中の非標的化位置と比較して、標的化位置で増加する）、と接触させること、を含む。
【0032】
一態様では、本開示は、標的核酸に標的化改変を誘発するためのキットを提供し、キットは、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、及び、（ｂ）少なくとも１つの化学的変異原、を含む。さらなる態様では、本明細書で提供されるキットは、さらに、（ｃ）少なくとも１つのガイド核酸または少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸、を含み、少なくとも１つのガイド核酸は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子とハイブリダイズする。
【0033】
一態様では、本開示は、標的核酸に標的化改変を誘発するためのキットを提供し、キットは、（ａ）標的化ＤＮＡ結合タンパク質、または標的化ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸、及び（ｂ）少なくとも１つの化学的変異原、を含む。
【0034】
一態様では、本開示は、植物のゲノムの標的領域において対立遺伝子多様性を増加させる方法を提供し、方法は、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼまたは触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸またはガイド核酸をコードする核酸（少なくとも１つのガイド核酸が、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸が、標的核酸分子とハイブリダイズする）、及び（ｃ）少なくとも１つの変異原、を植物に提供すること、を含み、標的領域は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位に隣接し、植物ゲノムの標的領域の対立遺伝子多様性が増加する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の３’側の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、核酸の標的化領域の５’側の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれ以上のヌクレオチドである。
【0035】
本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」は、２つのヌクレオチド間の少なくとも１つのホスホジエステル結合を切断することが可能である酵素を指す。本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ活性」は、核酸分子の切断を指す。ヌクレアーゼ活性の測定は、当該技術分野における任意の好適な方法標準を使用して達成することができる。一態様では、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。別の態様では、ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼである。別の態様では、ヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼである。別の態様では、ヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼである。一態様では、ヌクレアーゼは、１本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を切断する。別の態様では、ヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡを切断する。一態様では、ヌクレアーゼは、１本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）を切断する。さらなる態様では、ヌクレアーゼは、２本鎖ＲＮＡを切断する。一態様では、ヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡの１本鎖を切断する。一態様では、ヌクレアーゼは、２本鎖ＲＮＡの１本鎖を切断する。一態様では、ヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡの両方の鎖を切断する。一態様では、ヌクレアーゼは、２本鎖ＲＮＡの両方の鎖を切断する。一態様では、ヌクレアーゼは、ガイド核酸と複合体を形成する。
【0036】
標的核酸配列に特異的に結合するか、または標的核酸配列に誘導することができる、当該技術分野で既知の任意のヌクレアーゼが具体的に想定される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼの触媒活性は、低下または排除されてもよい。一態様では、ヌクレアーゼは、ＥＣ３．１及びそのサブグループに基づいて、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙにより列挙される（ｗｗｗ．ｅｎｚｙｍｅ－ｄａｔａｂａｓｅ．ｏｒｇの酵素データベース、及びＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３７：Ｄ５９３－Ｄ５９７（２００９）を参照）。
【0037】
いずれの科学理論にも束縛されないが、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に直接または間接に結合するヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ結合部位の付近にＤＮＡのコンフォメーションを部分的に巻き戻すか、または広げる。ヌクレアーゼがｄｓＤＮＡに結合され、ｄｓＤＮＡが部分的に巻き戻されている場合、ｄｓＤＮＡは、変異原がよりアクセス可能である。
【0038】
本明細書で使用される場合、「触媒的に不活性なヌクレアーゼ」は、標的核酸に結合する能力を保持するが、対照ヌクレアーゼと比較して、核酸分子を切断する能力の低下または排除があるドメインを含むヌクレアーゼを指す。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、「対照」または「野生型」ヌクレアーゼに由来する。本明細書で使用される場合、「対照」ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なヌクレアーゼとの比較点として使用することができる天然に存在するヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９は、標的化鎖にニックを生成する。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９は、ＲｕｖＣドメイン（Ｄ１０Ａ）における重要な残基のアラニン置換を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９は、非標的化鎖にニックを生成する。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９は、ＨＮＨドメインのＨ８４０Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）として既知の触媒的に不活性なＣａｓ９は、全てのヌクレアーゼ活性を欠いている。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ変異の両方を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても既知）である。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣｐｆ１は、標的化鎖にニックを生成する。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣｐｆ１は、非標的化鎖にニックを生成する。いくつかの実施形態では、不活性型Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）として既知の触媒的に不活性なＣｐｆ１は、全てのＤＮａｓｅ活性を欠いている。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣｐｆ１は、ＮｕｃドメインにおけるＲ１２２６Ａ変異を含む。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣｐｆ１は、ＲｕｖＣドメインにおけるＥ９９３Ａ変異を含み、標的ＤＮＡの両方の鎖に対するＤＮａｓｅ活性が排除される。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣｐｆ１は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種ＢＶ３Ｌ６由来の不活性型Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼである（ｄＡｓＣｐｆ１）。
【0039】
いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣａｓ１、触媒的に不活性なＣａｓ１Ｂ、触媒的に不活性なＣａｓ２、触媒的に不活性なＣａｓ３、触媒的に不活性なＣａｓ４、触媒的に不活性なＣａｓ５、触媒的に不活性なＣａｓ６、触媒的に不活性なＣａｓ７、触媒的に不活性なＣａｓ８、触媒的に不活性なＣａｓ１０、触媒的に不活性なＣｓｙ１、触媒的に不活性なＣｓｙ２、触媒的に不活性なＣｓｙ３、触媒的に不活性なＣｓｅ１、触媒的に不活性なＣｓｅ２、触媒的に不活性なＣｓｃ１、触媒的に不活性なＣｓｃ２、触媒的に不活性なＣｓａ５、触媒的に不活性なＣｓｎ２、触媒的に不活性なＣｓｍ１、触媒的に不活性なＣｓｍ２、触媒的に不活性なＣｓｍ３、触媒的に不活性なＣｓｍ４、触媒的に不活性なＣｓｍ５、触媒的に不活性なＣｓｍ６、触媒的に不活性なＣｍｒ１、触媒的に不活性なＣｍｒ３、触媒的に不活性なＣｍｒ４、触媒的に不活性なＣｍｒ５、触媒的に不活性なＣｍｒ６、触媒的に不活性なＣｓｂ１、触媒的に不活性なＣｓｂ２、触媒的に不活性なＣｓｂ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１７、触媒的に不活性なＣｓｘ１４、触媒的に不活性なＣｓｘ１０、触媒的に不活性なＣｓｘ１６、触媒的に不活性なＣｓａＸ、触媒的に不活性なＣｓｘ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１、触媒的に不活性なＣｓｘ１５、触媒的に不活性なＣｓｆ１、触媒的に不活性なＣｓｆ２、触媒的に不活性なＣｓｆ３、または触媒的に不活性なＣｓｆ４である。
【0040】
ヌクレアーゼに加えて、ＤＮＡを巻き戻して露出させ且つＤＮＡ塩基が改変に利用可能になる「標的化ＤＮＡ結合タンパク質」は、提供される方法及びキットで使用することができる。「標的化ＤＮＡ結合タンパク質」の非限定例としては、リコンビナーゼ、ヘリカーゼ、ジンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、及びトポイソメラーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的化ＤＮＡ結合タンパク質は、固有の核酸切断活性を有さないことがある。
【0041】
一態様では、「標的化ＤＮＡ結合タンパク質」は、本明細書で提供される方法及びキットにおいて、「触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ」の代わりに使用することができる。
【0042】
本明細書で使用される場合、核酸分子を切断する能力の「低下」は、対照ヌクレアーゼと比較して、少なくとも５０％のヌクレアーゼ活性の低減を指す。本明細書で使用される場合、核酸分子を切断する能力の「排除」は、当該技術分野で方法標準を使用して、検出不可能なヌクレアーゼ活性を指す。
【0043】
一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の５０％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の２５％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の２０％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の１５％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の１０％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の７．５％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の５％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の４％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の３％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の２％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の１％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の０．５％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性の０．１％未満を有する。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、検出可能なヌクレアーゼ活性を有さない。
【0044】
非限定例として、不活性型Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、対照Ｃｐｆ１ヌクレアーゼと比較して、１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。一態様では、本明細書で提供されるヌクレアーゼは、不活性型ヌクレアーゼである。
【0045】
一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９９．９％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９９．５％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９９％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９８％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９７％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９６％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９４％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９３％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９２％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９１％同一または類似のアミノ酸配列を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と少なくとも９０％同一または類似のアミノ酸配列を含む。
【0046】
一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼのアミノ酸配列は、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼのアミノ酸配列は、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と比較して、少なくとも２つのアミノ酸変異を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼのアミノ酸配列は、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と比較して、少なくとも３つのアミノ酸変異を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼのアミノ酸配列は、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と比較して、少なくとも４つのアミノ酸変異を含む。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼのアミノ酸配列は、対照ヌクレアーゼのアミノ酸配列と比較して、少なくとも５つのアミノ酸変異を含む。
【0047】
一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、１本鎖核酸または２本鎖核酸を切断することができない。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断することができない。さらなる態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、ＲＮＡを切断することができない。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、ＤＮＡと相互作用する。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、ＲＮＡと相互作用する。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、ＤＮＡと結合またはハイブリダイズする。別の態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、ＲＮＡと結合またはハイブリダイズする。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、標的核酸分子に結合する。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、ＲＮＡに結合する。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、ＤＮＡに結合する。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、ガイド核酸と複合体を形成する。一態様では、触媒的に不活性なヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと複合体を形成する。触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼに関する詳細については、以下の実施例２を参照のこと。
【0048】
本明細書で使用される場合、「誘導型ヌクレアーゼ」は、触媒ドメインが結合及び切断のために特定の標的核酸配列に誘導されるヌクレアーゼを指す。一態様では、本明細書で使用される誘導型ヌクレアーゼは、依然として標的核酸に結合し得るが、標的核酸分子を切断する活性を低下または排除している、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼである。一態様では、本明細書で使用される誘導型ヌクレアーゼは、依然として標的核酸に結合し得るが、２本鎖ＤＮＡ分子の１本鎖のみを切断する、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼである。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、１本鎖核酸に結合する。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、２本鎖核酸に結合する。さらなる態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ＲＮＡ分子に結合する。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に結合する。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、１本鎖ＲＮＡ分子に結合する。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、１本鎖ＤＮＡ分子に結合する。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、２本鎖ＲＮＡ分子に結合する。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、２本鎖ＤＮＡ分子に結合する。
【0049】
一態様では、誘導型ヌクレアーゼは、さらに、標的核酸配列を特異的に認識して結合する核酸結合ドメインを含む。一態様では、核酸結合ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインである。別の態様では、核酸結合ドメインは、ＲＮＡ結合ドメインである。
【0050】
一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、さらに、ＤＮＡ結合ドメインを含む。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、さらに、ＲＮＡ結合ドメインを含む。さらなる態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ガイド核酸と複合体を形成する。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ガイドＤＮＡと複合体を形成する。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと複合体を形成する。
【0051】
一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと標的核酸分子の間の直接的な相互作用を介して標的核酸分子に誘導される。触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと標的核酸分子の間の直接的な相互作用は、標的核酸分子と、共有または非共有的な相互作用を形成する触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼのアミノ酸を指す。いかなる理論にも束縛されることなく、このタイプの直接的な相互作用では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインまたはモチーフが、標的核酸分子内の特定の核酸配列を認識して結合、ハイブリダイズ、または相互作用し得る。
【0052】
別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ガイド核酸を介して標的核酸分子の特定の配列に誘導される。いかなる理論にも束縛されることなく、このタイプの直接的な相互作用では、ガイド核酸は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し得、ガイド核酸は、配列固有の手段で、標的核酸分子に結合、ハイブリダイズ、または相互作用し得る。
【0053】
一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）関連タンパク質である。本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）」は、細菌及び古細菌種に見られるヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーに由来する任意のヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、クラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、Ｉ型、ＩＡ型、ＩＢ型、ＩＣ型、ＩＤ型、ＩＥ型、ＩＦ型、ＩＵ型、ＩＩＩ型、ＩＩＩＡ型、ＩＩＩＢ型、ＩＩＩＣ型、ＩＩＩＤ型、ＩＶ型、ＩＶＡ型、ＩＶＢ型からなる群より選択されるクラス１のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、ＩＩ型、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、ＩＩＣ型、Ｖ型、ＶＩ型からなる群より選択されるクラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓである。一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓ９、触媒的に不活性なＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとしても既知）、触媒的に不活性なＣａｓＸ、触媒的に不活性なＣａｓＹ、触媒的に不活性なＣ２ｃ２からなる群より選択される。一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓ９である。一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、不活性型Ｃｐｆ１である。一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓＸである。一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓＹである。一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、触媒的に不活性なＣ２ｃ２である。一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、触媒的に不活性なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である。別の態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、触媒的に不活性なＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）である。別の態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列であるｄＳｐＣａｓ９ ＰＴＮを含む。別の態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、配列番号２４のアミノ酸配列であるｄＬｂＣｐｆ１ ＰＴＮを含む。
【0054】
一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓ１、触媒的に不活性なＣａｓ１Ｂ、触媒的に不活性なＣａｓ２、触媒的に不活性なＣａｓ３、触媒的に不活性なＣａｓ４、触媒的に不活性なＣａｓ５、触媒的に不活性なＣａｓ６、触媒的に不活性なＣａｓ７、触媒的に不活性なＣａｓ８、触媒的に不活性なＣａｓ１０、触媒的に不活性なＣｓｙ１、触媒的に不活性なＣｓｙ２、触媒的に不活性なＣｓｙ３、触媒的に不活性なＣｓｅ１、触媒的に不活性なＣｓｅ２、触媒的に不活性なＣｓｃ１、触媒的に不活性なＣｓｃ２、触媒的に不活性なＣｓａ５、触媒的に不活性なＣｓｎ２、触媒的に不活性なＣｓｍ１、触媒的に不活性なＣｓｍ２、触媒的に不活性なＣｓｍ３、触媒的に不活性なＣｓｍ４、触媒的に不活性なＣｓｍ５、触媒的に不活性なＣｓｍ６、触媒的に不活性なＣｍｒ１、触媒的に不活性なＣｍｒ３、触媒的に不活性なＣｍｒ４、触媒的に不活性なＣｍｒ５、触媒的に不活性なＣｍｒ６、触媒的に不活性なＣｓｂ１、触媒的に不活性なＣｓｂ２、触媒的に不活性なＣｓｂ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１７、触媒的に不活性なＣｓｘ１４、触媒的に不活性なＣｓｘ１０、触媒的に不活性なＣｓｘ１６、触媒的に不活性なＣｓａＸ、触媒的に不活性なＣｓｘ３、触媒的に不活性なＣｓｘ１、触媒的に不活性なＣｓｘ１５、触媒的に不活性なＣｓｆ１、触媒的に不活性なＣｓｆ２、触媒的に不活性なＣｓｆ３、及び触媒的に不活性なＣｓｆ４からなる群より選択される。
【0055】
一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ガイド核酸に結合する。別の態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ガイドＲＮＡに結合する。一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ガイド核酸と複合体を形成する。別の態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と一緒に、核酸配列の配列特異的な標的化を提供する標的化配列を含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、標的核酸の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のセグメント、及び触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用する第２のセグメントを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸中の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むガイドの第１のセグメントは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ反復）に対応する。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用する核酸配列を含むガイドの第２のセグメントは、トランス作用型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に対応する。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、互いにハイブリダイズする２つの別々の核酸分子（標的核酸中の配列に相補的であるポリヌクレオチド及び触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用するポリヌクレオチド）を含み、本明細書では、「二重ガイド」または「２分子ガイド」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、二重ガイドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ及びＲＮＡの組み合わせを含んでもよい。他の実施形態では、ガイド核酸は、単一ポリヌクレオチドであり、本明細書では「１分子ガイド」または「単一ガイド」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、単一ガイドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ及びＲＮＡの組み合わせを含んでもよい。「ガイド核酸」という用語は、包括的であり、２分子ガイド及び１分子ガイドの両方を指す。
【0057】
一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏで組み換えベクターから発現させることができる。一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組み換えベクターから発現させることができる。一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｅｘ ｖｉｖｏで組み換えベクターから発現させることができる。一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸分子から発現させることができる。一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸分子から発現させることができる。一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｅｘ ｖｉｖｏで核酸分子から発現させることができる。別の態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、合成的に合成することができる。
【0058】
一態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｅｒｏｐｙｖｒｕｍ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ、Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｎｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ、Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｚａｒｃｕｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、及びＴｈｅｒｍｏｔｏｇａからなる群より選択される細菌属に由来する触媒的に不活性なＣａｓ９を含む。
【0059】
別の態様では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｒｉｄｉｕｍ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｅｔｈｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｈｅｌｃｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｅｔｏｓｐｉｒａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｕｍ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｔｕｂｅｒｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、及びＬｅｐｔｏｓｐｉｒａからなる群より選択される細菌属に由来する触媒的に不活性なＣｐｆ１を含む。
【0060】
別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なメガヌクレアーゼ、触媒的に不活性なジンクフィンガーヌクレアーゼ、及び触媒的に不活性な転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）からなる群より選択される。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なメガヌクレアーゼである。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なジンクフィンガーヌクレアーゼである。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、触媒的に不活性なＴＡＬＥＮである。
【0061】
一態様では、触媒的に不活性なメガヌクレアーゼは、標的核酸分子に結合する。一態様では、触媒的に不活性なジンクフィンガーヌクレアーゼは、標的核酸分子に結合する。一態様では、触媒的に不活性なＴＡＬＥＮは、標的核酸分子に結合する。一態様では、ジンクフィンガータンパク質は、標的核酸分子に結合する。一態様では、ＴＡＬＥタンパク質は、標的核酸分子に結合する。
【0062】
一態様では、本明細書で提供される触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏで組み換えベクターから発現させることができる。一態様では、本明細書で提供される触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組み換えベクターから発現させることができる。一態様では、本明細書で提供される触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ｅｘ ｖｉｖｏで組み換えベクターから発現させることができる。一態様では、本明細書で提供される触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸分子から発現させることができる。一態様では、本明細書で提供される触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸分子から発現させることができる。一態様では、本明細書で提供される触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、ｅｘ ｖｉｖｏで核酸分子から発現させることができる。別の態様では、本明細書で提供される触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、合成的に合成することができる。
【0063】
本明細書で使用される場合、「コドン最適化」は、元のアミノ酸配列を維持しながら（例えば、サイレント変異を導入しながら）、配列の少なくとも１つのコドン（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、またはそれ以上のコドン）を、宿主細胞の遺伝子で、より頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることにより、目的の宿主細胞における発現を強化するために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、これは、同様に、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定の転写ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の入手可能性に依存すると考えられる。細胞内で選択されたｔＲＮＡが優勢であることは、一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度の表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎで入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能であり、これらの表は、多数の手段で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２を参照のこと。特定の宿主細胞における発現のための特定の配列を最適化するコドンためのコンピュータアルゴリズムもまた利用可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）もまた利用可能である。藻類を含む植物におけるコドン使用頻度に関して、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ，１９９０，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９２：１－１１；及びＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：４７７－９８について言及される。
【0064】
一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、原核細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、真核細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、動物細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、ヒト細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、マウス細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、ブタ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、哺乳動物細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、昆虫細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、頭足類細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、節足動物細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、植物細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、トウモロコシ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、イネ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、コムギ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、ダイズ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、ワタ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、ムラサキウマゴヤシ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、オオムギ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、モロコシ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、サトウキビ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、キャノーラ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、トマト細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、キュウリ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、ジャガイモ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、藻類細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、シバ細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、単子葉植物細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、双子葉植物細胞に対してコドン最適化される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、裸子植物細胞に対してコドン最適化される。
【0065】
いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な不活性型誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、バイオリスティック法による送達のために最適化され得る。本明細書で使用される場合、「ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１」は、天然のＬｂＣｐｆ１配列（ＷＯ２０１６２０５７１１－１１５０）に存在する９つのシステインが全て変異するＬｂＣｐｆ１タンパク質多様体を指す。一態様では、ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１は、ｗｔ ＬｂＣｐｆ１タンパク質配列と比較した場合、以下の９つのアミノ酸置換を含む：Ｃ１０Ｌ、Ｃ１７５Ｌ、Ｃ５６５Ｓ、Ｃ６３２Ｌ、Ｃ８０５Ａ、Ｃ９１２Ｖ、Ｃ９６５Ｓ、Ｃ１０９０Ｐ、Ｃ１１１６Ｌ。タンパク質のシステイン残基は、システイン間に強力な可逆的結合を提供するジスルフィド架橋を形成することが可能である。標的法でＣｐｆ１の結合を制御及び指示するには、天然システインは、これらのブリッジの形成を制御するために、除去しなければならない。タンパク質骨格からのシステインの除去により、ジスルフィド結合による、これらの可逆的結合の配置を制御する新しいシステイン残基の挿入の標的化が可能になるであろう。これは、タンパク質ドメイン間のものであるか、またはバイオリスティック送達のための金粒子などの粒子に対するものであり得る。システインのいくつかの残基を含むタグが、均一な手段で、金属ビーズ（特に、金）に特異的に結合することが可能になるｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１に、添加され得る。
【0066】
触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼを細胞の核に導くことが望ましい可能性がある。そのような場合、１つ以上の核局在化シグナルは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼの局在化を導くために使用することができる。本明細書で使用される場合、「核局在化シグナル」は、細胞の核に移入するために、タンパク質（例えば、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ）を「タグ付け」するアミノ酸配列を指す。一態様では、本明細書で提供される核酸分子は、核局在化シグナルをコードする。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、２つ以上の核局在化シグナルをコードする。一態様では、本明細書で提供される触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼは、核局在化シグナルを含む。一態様では、核局在化シグナルは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼのＮ末端に位置する。さらなる態様では、核局在化シグナルは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼのＣ末端に位置する。さらに別の態様では、核局在化シグナルは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼのＮ末端及びＣ末端の両方に位置する。
【0067】
特定の科学理論に束縛されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ガイド核酸と複合体を形成し、これは、標的核酸分子における相補的な配列とハイブリダイズし、それにより、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を標的核酸分子に誘導する。クラス２のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムでは、スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイは、認識された侵襲性ＤＮＡとの遭遇時に転写され、低分子干渉ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。ｃｒＲＮＡは、侵入する病原体の特定のプロトスペーサー配列に相補的な反復配列及びスペーサー配列を含む。スペーサー配列は、真核生物ゲノムの標的配列に相補的であるように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、それぞれのｃｒＲＮＡと活性形態で結合する。
【0068】
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びガイドＲＮＡが複合体を形成する場合、システム全体が「リボヌクレオタンパク質」と呼ばれる。ガイドＲＮＡは、リボヌクレオタンパク質を相補的な標的配列に誘導し、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、１本鎖または２本鎖のいずれかのＤＮＡを切断する。タンパク質に応じて、切断は、ＰＡＭ部位から特定数のヌクレオチド（例えば、Ｃｐｆ１の場合は、１８～２３ヌクレオチド）内で生じ得る。ＰＡＭ部位は、Ｉ型及びＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質にのみ必要とされ；ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、適切な標的化または切断のためにＰＡＭ部位を必要としない。
【0069】
一態様では、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、及び（ｂ）ガイド核酸、を必要とする、本明細書で提供される任意の方法またはキットは、リボヌクレオタンパク質として、具体的には、（ａ）及び（ｂ）を提供することが想定される。
【0070】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、リボヌクレオタンパク質を含む。一態様では、リボヌクレオタンパク質は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸を含む。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びガイド核酸を含む。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質及びガイド核酸を含む。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、触媒的に不活性なＣｐｆ１タンパク質及びガイド核酸を含む。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓＸタンパク質及びガイド核酸を含む。
【0071】
一態様では、リボヌクレオタンパク質は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びガイドＲＮＡを含む。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを含む。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、触媒的に不活性なＣｐｆ１タンパク質及びガイドＲＮＡを含む。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓＸタンパク質及びガイドＲＮＡを含む。
【0072】
一態様では、リボヌクレオタンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで生成される。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成される。さらなる態様では、リボヌクレオタンパク質は、ｅｘ ｖｉｖｏで生成される。
【0073】
一態様では、リボヌクレオタンパク質は、細胞に送達される。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、細胞に導入される。別の態様では、リボヌクレオタンパク質は、衝撃により植物細胞に導入される。
【0074】
改変
本明細書で使用される場合、「改変」は、参照アミノ酸配列または参照ヌクレオチド配列と比較した、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの挿入、欠失、置換、複製、または反転を指す。「標的化改変」は、核酸分子の標的化領域内で生じる改変を指す。
本明細書で使用される場合、「改変」は、参照アミノ酸配列または参照ヌクレオチド配列と比較した、１つ以上のアミノ酸またはヌクレオチドの挿入、欠失、置換、複製、または反転を指す。「標的化改変」は、核酸分子の標的化領域内で生じる改変を指す。
【0075】
一態様では、改変は、置換を含む。別の態様では、改変は、挿入を含む。別の態様では、改変は、欠失を含む。別の態様では、改変は、置換、挿入、及び欠失からなる群より選択される。一態様では、改変は、ｉｎ ｖｉｖｏで生じる。別の態様では、改変は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生じる。さらなる態様では、改変は、ｅｘ ｖｉｖｏで生じる。一態様では、改変は、ゲノムＤＮＡにおいて生じる。一態様では、改変は、染色体ＤＮＡにおいて生じる。
【0076】
本明細書で使用される場合、「ＩＮＤＥＬ」という用語は、ゲノムＤＮＡにおける１つ以上のヌクレオチドの挿入及び／または欠失を指す。ＩＮＤＥＬは、単一ヌクレオチドの挿入及び／または欠失、多くとも、長さ１ｋｂ未満の挿入及び／または欠失を含む。ＩＮＤＥＬが、３で割り切れない場合、ＩＮＤＥＬは、リーディングフレームを変更し得、コドンによる遺伝子発現のトリプレットの性質により、元の配列とは完全に異なる翻訳がもたらされる。
【0077】
一態様では、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２つのヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５つのヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１０のヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２５のヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５０のヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、改変は、少なくとも７５のヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１００のヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２５０のヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５００のヌクレオチドの挿入を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１０００のヌクレオチドの挿入を含む。
【0078】
一態様では、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２つのヌクレオチドの欠失を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５つのヌクレオチドの欠失を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１０のヌクレオチドの欠失を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２５のヌクレオチドの欠失を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５０のヌクレオチドの欠失を含む。別の態様では、改変は、少なくとも７５のヌクレオチドの欠失を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１００のヌクレオチドの欠失を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２５０のヌクレオチドの欠失を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５００のヌクレオチドの欠失を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１０００のヌクレオチドの欠失を含む。
【0079】
一態様では、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２つのヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５つのヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１０のヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２５のヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５０のヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、改変は、少なくとも７５のヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１００のヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２５０のヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５００のヌクレオチドの置換を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１０００のヌクレオチドの置換を含む。
【0080】
一態様では、改変は、少なくとも２つのヌクレオチドの反転を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５つのヌクレオチドの反転を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１０のヌクレオチドの反転を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２５のヌクレオチドの反転を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５０のヌクレオチドの反転を含む。別の態様では、改変は、少なくとも７５のヌクレオチドの反転を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１００のヌクレオチドの反転を含む。別の態様では、改変は、少なくとも２５０のヌクレオチドの反転を含む。別の態様では、改変は、少なくとも５００のヌクレオチドの反転を含む。別の態様では、改変は、少なくとも１０００のヌクレオチドの反転を含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＰＡＭ配列を含む。本明細書で使用される場合、「ＰＡＭ部位」または「ＰＡＭ配列」は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質／ガイド核酸システム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃｐｆ１、による切断の標的となるＤＮＡ領域に隣接する短いＤＮＡ配列（通常は、２～６塩基対長）を指す。いくつかのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、Ｉ型及びＩＩ型）は、標的核酸と結合するためのＰＡＭ部位が必要である。
【0082】
一態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１０００ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから７５０ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから５００ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから２５０ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから２００ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１００ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから７５ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから５０ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから４０ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから３５ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから３０ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから２５ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから２０ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１９ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１８ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１７ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１６ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１５ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１４ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１３ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１２ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１１ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１０ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから９ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから８ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから７ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから６ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから５ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから４ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから３ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから２ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１ヌクレオチド内に誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１ヌクレオチド～７５０ヌクレオチドに誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１ヌクレオチド～２５０ヌクレオチドに誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１ヌクレオチド～１００ヌクレオチドに誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１ヌクレオチド～５０ヌクレオチドに誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１ヌクレオチド～２５ヌクレオチドに誘発される。別の態様では、核酸分子の標的化領域における改変は、ＰＡＭから１０ヌクレオチド～５０ヌクレオチドに誘発される。
【0083】
一態様では、標的核酸分子は、少なくとも１つのＰＡＭを含む。別の態様では、標的核酸分子は、少なくとも２つのＰＡＭを含む。別の態様では、標的核酸分子は、少なくとも５つのＰＡＭを含む。さらなる態様では、標的核酸分子は、１つのＰＡＭ～５０のＰＡＭを含む。理論に束縛されることなく、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質などのいくつかの誘導型ヌクレアーゼは、ガイド核酸及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を含む複合体が核酸分子の標的化領域に結合するために、標的核酸分子中に特定のＰＡＭが存在することを必要とする。一態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＧＧ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＧＡ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＴＴＴＮ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＴＴＴＶ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＹＧ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＹＴＮ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＴＴＣＮ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＧＡＮ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＧＮＧ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＧＡＧ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＧＣＧ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＴＹＣＶ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＧＲＲＴ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＧＲＲＮ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＮＮＮＲＹＡＣ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ－３’のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、ＰＡＭは、５’－ＮＡＡＡＡＣ－３’のヌクレオチド配列を含む。当該技術分野で既知の通り、ヌクレオチドに関して、「Ａ」は、アデニンを指し；「Ｔ」は、チミンを指し；「Ｃ」は、シトシンを指し；「Ｇ」は、グアニンを指し；「Ｎ」は、任意のヌクレオチドを指し；「Ｒ」は、アデニンまたはグアニンを指し；「Ｙ」は、シトシンまたはチミンを指し；「Ｖ」は、アデニン、グアニン、またはシトシンを指し；「Ｗ」は、アデニンまたはチミンを指す。
【0084】
改変核酸分子、または改変核酸分子を含む細胞のスクリーニング及び選択は、当業者らに既知の任意の方法を介することができる。スクリーニング及び選択方法の例としては、サザン分析、ポリヌクレオチドの検出のためのＰＣＲ増幅、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅ保護、プライマー伸長、ＲＮＡ転写物を検出するためのＲＴ－ＰＣＲ増幅、サンガーシーケンシング、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための次世代シーケンシング技術（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＰａｃＢｉｏ、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、４５４）の酵素アッセイ、ならびにポリペプチドを検出するタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び酵素結合免疫アッセイが含まれるが、これらに限定されない。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、酵素染色、及び免疫染色などの他の手法もまた、ポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出するために使用することができる。参照手法の全てを実施するための方法は既知である。
【0085】
変異原
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、少なくとも１つの変異原を含む。本明細書で使用される場合、「変異原」は、核酸配列への改変または変異を生成することが可能である任意の手段を指す。一態様では、変異原は、自然のバックグラウンドレベルを超える変異の頻度を増加させる。一態様では、変異原は、化学的変異原である。一態様では、変異原は、物理的変異原である。物理的変異原は、ＤＮＡバックボーンの切断を引き起こすことにより変異原効果を発揮する。別の態様では、変異原は、電離放射線である。別の態様では、変異原は、紫外線放射である。別の態様では、変異原は、アルファ粒子放射線である。別の態様では、変異原は、ベータ粒子放射線である。別の態様では、変異原は、ガンマ線放射線である。別の態様では、変異原は、電磁放射線である。別の態様では、変異原は、中性子放射線である。別の態様では、変異原は、活性酸素種である。別の態様では、変異原は、脱アミノ化剤である。別の態様では、変異原は、アルキル化剤である。別の態様では、変異原は、芳香族アミンである。別の態様では、変異原は、臭化エチジウムまたはプロフラビンなどの挿入剤である。別の態様では、変異原は、Ｘ線である。別の態様では、変異原は、長波長紫外線である。別の態様では、変異原は、中波長紫外線である。別の態様では、変異原は、可視光線である。別の態様では、変異原は、化学的変異原及び電離放射線からなる群より選択される。
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、少なくとも１つの変異原を含む。本明細書で使用される場合、「変異原」は、核酸配列への改変または変異を生成することが可能である任意の手段を指す。一態様では、変異原は、自然のバックグラウンドレベルを超える変異の頻度を増加させる。一態様では、変異原は、化学的変異原である。一態様では、変異原は、物理的変異原である。物理的変異原は、ＤＮＡバックボーンの切断を引き起こすことにより変異原効果を発揮する。別の態様では、変異原は、電離放射線である。別の態様では、変異原は、紫外線放射である。別の態様では、変異原は、アルファ粒子放射線である。別の態様では、変異原は、ベータ粒子放射線である。別の態様では、変異原は、ガンマ線放射線である。別の態様では、変異原は、電磁放射線である。別の態様では、変異原は、中性子放射線である。別の態様では、変異原は、活性酸素種である。別の態様では、変異原は、脱アミノ化剤である。別の態様では、変異原は、アルキル化剤である。別の態様では、変異原は、芳香族アミンである。別の態様では、変異原は、臭化エチジウムまたはプロフラビンなどの挿入剤である。別の態様では、変異原は、Ｘ線である。別の態様では、変異原は、長波長紫外線である。別の態様では、変異原は、中波長紫外線である。別の態様では、変異原は、可視光線である。別の態様では、変異原は、化学的変異原及び電離放射線からなる群より選択される。
【0086】
一態様では、化学的変異原は、エチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホナート、ジエチルスルホナート、ジメチルスルファート、ジメチルスルホキシド、ジエチルニトロソアミン、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－ジエチル尿素、Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソ尿素、ヒ素、コルヒチン、エチレンイミン、ニトロソメチル尿素、ニトロソグアニジン、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、ジエポキシブタン、アジ化ナトリウム、マレイン酸ヒドラジド、シクロホスファミド、ジアゾアセチルブタン、ソラレン、ベンゼン、ダチュラ抽出物、ブロモデオキシウリジン、及び酸化ベリリウムからなる群より選択される。
【0087】
別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．０００００１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．０００００５％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．００００１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．００００５％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．０００１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．０００５％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．００１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．００５％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．０１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．０５％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも０．５％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも５％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、少なくとも１０％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、０．０００１％～１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、０．００１％～１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、０．０１％～１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、０．１％～１％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、０．０１％～５％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、０．０１％～１０％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、１％～５％の濃度で提供される。別の態様では、化学的変異原は、１％～１０％の濃度で提供される。
【0088】
一態様では、化学的変異原は、気体形態で提供される。別の態様では、化学的変異原は、液体形態で提供される。別の態様では、化学的変異原は、固体形態で提供される。別の態様では、化学的変異原は、結晶化形態で提供される。別の態様では、化学的変異原は、粉末形態で提供される。
【0089】
いくつかの化学的変異原は、核酸配列の個々のヌクレオチドの改変を引き起こすことが可能であることが知られている。特定のタイプの置換は、トランスバージョン（例えば、プリンがピリミジンに変化するか、もしくはピリミジンがプリンに変化する、核酸配列における点変異）またはトランジション（例えば、プリンが異なるプリンに変更されるか、またはピリミジンが異なるピリミジンに変更される、核酸配列における点変異）と呼ばれる。プリンの非限定例としては、アデニン及びグアニンが挙げられる。ピリミジンの非限定例としては、シトシン、チミン、及びウラシルが挙げられる。
【0090】
一態様では、置換は、アデニンのグアニンへの置換を含む。別の態様では、置換は、シトシンのグアニンへの置換を含む。別の態様では、置換は、チミンのグアニンへの置換を含む。別の態様では、置換は、グアニンのアデニンへの置換を含む。別の態様では、置換は、シトシンのアデニンへの置換を含む。別の態様では、置換は、チミンのアデニンへの置換を含む。別の態様では、置換は、グアニンのシトシンへの置換を含む。別の態様では、置換は、アデニンのシトシンへの置換を含む。別の態様では、置換は、チミンのシトシンへの置換を含む。別の態様では、置換は、グアニンのチミンへの置換を含む。別の態様では、置換は、アデニンのチミンへの置換を含む。別の態様では、置換は、シトシンのチミンへの置換を含む。
【0091】
一態様では、電離放射線は、Ｘ線放射線、ガンマ線放射線、アルファ粒子放射線、及び紫外線（ＵＶ）放射線からなる群より選択される。
【0092】
一態様では、化学的変異原は、リボヌクレオタンパク質と同時に細胞に提供される。別の態様では、化学的変異原は、リボヌクレオタンパク質が細胞に提供される前に、細胞に提供される。さらなる態様では、化学的変異原は、リボヌクレオタンパク質が細胞に提供された後に、細胞に提供される。
【0093】
一態様では、化学的変異原は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと同時に細胞に、提供される。別の態様では、化学的変異原は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼが細胞に提供される前に、細胞に提供される。さらなる態様では、化学的変異原は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼが細胞に提供された後に、細胞に提供される。
【0094】
一態様では、化学的変異原は、ガイド核酸と同時に、細胞に提供される。別の態様では、化学的変異原は、ガイド核酸が細胞に提供される前に、細胞に提供される。さらなる態様では、化学的変異原は、ガイド核酸が細胞に提供された後に、細胞に提供される。
【0095】
一態様では、化学的変異原は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼを発現する細胞に提供される。別の態様では、化学的変異原は、ガイド核酸を発現する細胞に提供される。
【0096】
一態様では、物理的変異原は、リボヌクレオタンパク質と同時に細胞に提供される。別の態様では、物理的変異原は、リボヌクレオタンパク質が細胞に提供される前に、細胞に提供される。さらなる態様では、物理的変異原は、リボヌクレオタンパク質が細胞に提供された後に、細胞に提供される。
【0097】
一態様では、物理的変異原は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと同時に、細胞に提供される。別の態様では、物理的変異原は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼが細胞に提供される前に、細胞に提供される。さらなる態様では、物理的変異原は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼが細胞に提供された後に、細胞に提供される。
【0098】
一態様では、物理的変異原は、ガイド核酸と同時に、細胞に提供される。別の態様では、物理的変異原は、ガイド核酸が細胞に提供される前に、細胞に提供される。さらなる態様では、物理的変異原は、ガイド核酸が細胞に提供された後に、細胞に提供される。
【0099】
対立遺伝子多様性
本開示で提供される方法及びキットは、ゲノム内の標的化遺伝子座の対立遺伝子多様性を増加させるために使用することができる。本明細書で使用される場合、「対立遺伝子多様性」は、ゲノム中の所与の遺伝子座の対立遺伝子の数を指す。対立遺伝子多様性の増加は、標的遺伝子座での改変により対立遺伝子を生成することからもたらされる。
本開示で提供される方法及びキットは、ゲノム内の標的化遺伝子座の対立遺伝子多様性を増加させるために使用することができる。本明細書で使用される場合、「対立遺伝子多様性」は、ゲノム中の所与の遺伝子座の対立遺伝子の数を指す。対立遺伝子多様性の増加は、標的遺伝子座での改変により対立遺伝子を生成することからもたらされる。
【0100】
一態様では、本開示は、植物のゲノム内の核酸分子の標的化領域において対立遺伝子多様性を増加させる方法を提供し、方法は、植物に、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼまたは触媒的に誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸または少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸（少なくとも１つのガイド核酸が、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸が、核酸分子とハイブリダイズする）、及び（ｃ）少なくとも１つの変異原、を提供すること、を含み、核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含み、標的核酸の対立遺伝子多様性が増加する。
【0101】
一態様では、対立遺伝子多様性の増加は、未改変野生型標的核酸と比較して、標的核酸の少なくとも１つの改変対立遺伝子の生成を含む。一態様では、対立遺伝子多様性の増加は、未改変野生型標的核酸と比較して、標的核酸の少なくとも２つの改変対立遺伝子の生成を含む。一態様では、対立遺伝子多様性の増加は、未改変野生型標的核酸と比較して、標的核酸の少なくとも３つの改変対立遺伝子の生成を含む。一態様では、対立遺伝子多様性の増加は、未改変野生型標的核酸と比較して、標的核酸の少なくとも４つの改変対立遺伝子の生成を含む。一態様では、対立遺伝子多様性の増加は、未改変野生型標的核酸と比較して、標的核酸の少なくとも５つの改変対立遺伝子の生成を含む。一態様では、対立遺伝子多様性の増加は、未改変野生型標的核酸と比較して、標的核酸の少なくとも１０の改変対立遺伝子の生成を含む。一態様では、対立遺伝子多様性の増加は、未改変野生型標的核酸と比較して、標的核酸の少なくとも１５の改変対立遺伝子の生成を含む。一態様では、対立遺伝子多様性の増加は、未改変野生型標的核酸と比較して、標的核酸の少なくとも２０の改変対立遺伝子の生成を含む。一態様では、対立遺伝子多様性の増加は、未改変野生型標的核酸と比較して、標的核酸の少なくとも３０の改変対立遺伝子の生成を含む。一態様では、対立遺伝子多様性の増加は、未改変野生型標的核酸と比較して、標的核酸の少なくとも５０の改変対立遺伝子の生成を含む。
【0102】
対立遺伝子シリーズは、最適な植物形質を生ずる改変を同定するのに有用であり得る。本明細書で使用される場合、「対立遺伝子シリーズ」は、標的化遺伝子座内の２つ以上の異なる改変を指し、２つ以上の異なる改変は、２つ以上の異なる表現型を引き起こす。
【0103】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代の対立遺伝子シリーズを生成する。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ１世代の対立遺伝子シリーズを生成する。一態様では、対立遺伝子シリーズは、少なくとも１つの劣性改変を含む。別の態様では、対立遺伝子シリーズは、少なくとも１つの優性改変を含む。本明細書で使用される場合、「劣性改変」は、ホモ接合状態でゲノム中に存在する場合にのみ表現型を生成する改変を指す。対照的に、「優性改変」は、ヘテロ接合状態でゲノム中に存在する場合に表現型を生成する改変を指す。
【0104】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．００１の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．００２５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．００５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．００７５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．０１の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．０２５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．０５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．０７５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．１の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．２５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも０．７５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも１の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも２．５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも７．５の改変を生成することを含む。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、産生されたＲ０植物１００当たり、標的核酸において平均で少なくとも１０の改変を生成することを含む。
【0105】
変異率
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的化領域でのバックグラウンド変異率と比較して、増加した変異率を提供する。本明細書で使用される場合、「変異率」は、野生型配列が対照細胞において改変される頻度を指す。通常、変異率は、細胞分裂１つ当たりの変異数として表される。変異率の計算は、当該技術分野で周知であり、ゲノムの異なる部分について変化し得る。
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的化領域でのバックグラウンド変異率と比較して、増加した変異率を提供する。本明細書で使用される場合、「変異率」は、野生型配列が対照細胞において改変される頻度を指す。通常、変異率は、細胞分裂１つ当たりの変異数として表される。変異率の計算は、当該技術分野で周知であり、ゲノムの異なる部分について変化し得る。
【0106】
ヒトでは、例えば、バックグラウンド変異率は、１細胞世代当たり１部位当たり約１．１ｘ１０－８であると推定されている。トウモロコシの平均バックグラウンド変異率は、１世代当たり１部位当たり約７．７ｘ１０－５であると推定されている。例えば、Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｔｅｓ ｏｆ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ｍｕｔａｔｉｏｎ，”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４８：１６６７－１６８６（１９９８）を参照のこと。
【0107】
一態様では、本開示は、核酸分子の標的化領域の変異率を増加させる方法を提供し、方法は、核酸分子を、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、（ｂ）少なくとも１つのガイド核酸（少なくとも１つのガイド核酸が、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸が、核酸分子とハイブリダイズする）、及び（ｃ）少なくとも１つの変異原、と接触させること、を含み、核酸は、核酸分子の標的化領域に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を含み、核酸分子の標的化領域における変異率は、核酸分子の非標的化領域と比較して増加する。
【0108】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－９増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－９増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－９増加させる。
【0109】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－８増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－８増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－８増加させる。
【0110】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－７増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－７増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－７増加させる。
【0111】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－６増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－６増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－６増加させる。
【0112】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－５増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－５増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－５増加させる。
【0113】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－４増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－４増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－４増加させる。
【0114】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－３増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－３増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、バックグラウンド変異率と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－３増加させる。
【0115】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－９増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－９増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－９増加させる。
【0116】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－８増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－８増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－８増加させる。
【0117】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－７増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－７増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－７増加させる。
【0118】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－６増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－６増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－６増加させる。
【0119】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－５増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－５増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－５増加させる。
【0120】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－４増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－４増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－４増加させる。
【0121】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも１ｘ１０－３増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも５ｘ１０－３増加させる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、標的核酸の変異率を、非標的化核酸と比較して、１細胞世代当たり、１部位当たり、少なくとも２５ｘ１０－３増加させる。
【0122】
標的化領域の変異率を増加させることにより、少ない植物しか、標的化領域の改変を同定するためにスクリーニングされる必要がないことが想定される。
【0123】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼの非存在下で化学的変異原のみを使用する場合と比較して、標的化領域における改変を同定するために、より少ない植物しかスクリーニングされることを要しない。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼの非存在下でＥＭＳのみを使用する場合と比較して、標的化領域における改変を同定するために、より少ない植物しかスクリーニングされることを要しない。
【0124】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される１つの植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される２つの植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される３つの植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される４つの植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される５つの植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される６つの植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される７つの植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される８つの植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される９つの植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される１０の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される１５の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される２０の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される２５の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される３０の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される３５の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される４０の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される５０の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される７５の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される１００の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される１５０の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される２００の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される２５０の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される３００の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される４００の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、Ｒ０世代で産生される５００の植物毎に、標的化領域において平均で少なくとも１つの改変を生じる。
【0125】
本明細書で使用される場合、「Ｒ０世代」は、本明細書で提供される方法及びキットにより作成された初期世代を指す。Ｒ０世代から生じる後続世代は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３などと呼ばれるであろう。
【0126】
ガイド核酸
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、少なくとも１つのガイド核酸または少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸を含み、少なくとも１つのガイド核酸は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子とハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ガイド核酸」は、ヌクレアーゼと複合体を形成し、次に、標的核酸分子内の特定の配列と複合体を誘導する核酸を指し、ガイド核酸及び標的核酸分子が、相補的な配列を共有する。
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、少なくとも１つのガイド核酸または少なくとも１つのガイド核酸をコードする核酸を含み、少なくとも１つのガイド核酸は、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸は、標的核酸分子とハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ガイド核酸」は、ヌクレアーゼと複合体を形成し、次に、標的核酸分子内の特定の配列と複合体を誘導する核酸を指し、ガイド核酸及び標的核酸分子が、相補的な配列を共有する。
【0127】
一態様では、ガイド核酸は、ＤＮＡを含む。別の態様では、ガイド核酸は、ＲＮＡを含む。ガイド核酸は、ＲＮＡを含む場合、「ガイドＲＮＡ」と呼ぶことができる。別の態様では、ガイド核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。別の態様では、ガイド核酸は、１本鎖である。別の態様では、ガイド核酸は、２本鎖である。さらなる態様では、ガイド核酸は、部分的に２本鎖である。
【0128】
別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１０ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１１ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１２ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１３ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１４ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１５ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１６ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１７ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１８ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも１９ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも２０ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも２１ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも２２ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも２３ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも２４ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも２５ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも２６ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも２７ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも２８ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも３０ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも３５ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも４０ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも４５ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、少なくとも５０ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、１０ヌクレオチド～５０ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、１０ヌクレオチド～４０ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、１０ヌクレオチド～３０ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、１０ヌクレオチド～２０ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、１６ヌクレオチド～２８ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、１６ヌクレオチド～２５ヌクレオチドを含む。別の態様では、ガイド核酸は、１６ヌクレオチド～２０ヌクレオチドを含む。
【0129】
一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも７０％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも７５％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも８０％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも８５％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも９０％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも９１％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも９２％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも９３％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも９４％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも９５％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも９６％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも９７％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも９８％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して少なくとも９９％の配列相補性を含む。一態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して１００％の配列相補性を含む。別の態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して７０％～１００％の配列相補性を含む。別の態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して８０％～１００％の配列相補性を含む。別の態様では、ガイド核酸は、標的核酸配列に対して９０％～１００％の配列相補性を含む。
【0130】
ＣａｓＸ及びＣａｓ９などのいくつかのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、機能的活性を有するために、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる別の非コードＲＮＡ構成要素を必要とする。本明細書で提供されるガイド核酸分子は、本明細書で「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれるものにおいて、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて１つの核酸分子にすることができる。ｇＲＮＡは、活性なＣａｓＸ複合体を標的部位に誘導し、ＣａｓＸは、標的部位を切断し得る。
【0131】
一態様では、ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含む。別の態様では、ガイド核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。さらなる態様では、ガイド核酸は、ｓｇＲＮＡを含む。
【0132】
一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏで組み換えベクターから発現させることができる。一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組み換えベクターから発現させることができる。一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｅｘ ｖｉｖｏで組み換えベクターから発現させることができる。一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸分子から発現させることができる。一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸分子から発現させることができる。一態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、ｅｘ ｖｉｖｏで核酸分子から発現させることができる。別の態様では、本明細書で提供されるガイド核酸は、合成的に合成することができる。
【0133】
核酸及びポリペプチド
「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語の使用は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むポリヌクレオチドに、本開示を限定することが意図されるものではない。例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）分子も想定される。当業者らは、ポリヌクレオチド及び核酸分子が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含み得ることを認識するであろう。そのようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは、天然に存在する分子及び合成アナログの両方を含む。本開示のポリヌクレオチドは、限定されないが、１本鎖形態、２本鎖形態、ヘアピン、ステム・ループ構造などを含む全形態の配列も包含する。一態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ＤＮＡ分子である。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ＲＮＡ分子である。一態様では、本明細書で提供される核酸分子は、１本鎖である。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、２本鎖である。
「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語の使用は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むポリヌクレオチドに、本開示を限定することが意図されるものではない。例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）分子も想定される。当業者らは、ポリヌクレオチド及び核酸分子が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含み得ることを認識するであろう。そのようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは、天然に存在する分子及び合成アナログの両方を含む。本開示のポリヌクレオチドは、限定されないが、１本鎖形態、２本鎖形態、ヘアピン、ステム・ループ構造などを含む全形態の配列も包含する。一態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ＤＮＡ分子である。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、ＲＮＡ分子である。一態様では、本明細書で提供される核酸分子は、１本鎖である。別の態様では、本明細書で提供される核酸分子は、２本鎖である。
【0134】
一態様では、本明細書で提供される方法及び組成物は、ベクターを含む。本明細書で使用される場合、「ベクター」または「プラスミド」という用語は、互換的に使用され、染色体ＤＮＡから物理的に分離した円形の２本鎖ＤＮＡ分子を指す。一態様では、本明細書で使用されるプラスミドまたはベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで複製することが可能である。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸がベクター中で提供される。さらなる態様では、ガイド核酸をコードする核酸は、ベクター中で提供される。さらに別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸及びガイド核酸をコードする核酸が、単一ベクター中で提供される。
【0135】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸の鎖を指す。ポリペプチドは、本明細書で提供されるポリヌクレオチドによりコードすることができる。ポリペプチドの例は、タンパク質である。本明細書で提供されるタンパク質は、本明細書で提供される核酸分子によりコードすることができる。
【0136】
核酸は、当該技術分野で日常的な手法を使用して単離することができる。例えば、核酸は、組み換え核酸技術、及び／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むが、限定されない任意の方法を使用して単離することができる。一般的なＰＣＲ手法は、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ＆ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載される。組み換え核酸手法は、例えば、核酸を単離するために使用することができる制限酵素消化及びライゲーションを含む。単離核酸は、単一核酸分子として、または一連のオリゴヌクレオチドとして、化学的に合成することもできる。ポリペプチドは、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの既知の方法により天然源（例えば、生物学的試料）から精製することができる。ポリペプチドは、例えば、発現ベクターにおいて核酸を発現させることにより精製することもできる。さらに、精製ポリペプチドは、化学合成により得ることができる。ポリペプチドの純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析を使用して測定することができる。
【0137】
限定することなく、核酸は、ハイブリダイゼーションを使用して検出することができる。核酸間のハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）で詳細に考察されている。
【0138】
ポリペプチドは、抗体を使用して検出することができる。抗体を使用してポリペプチドを検出するための手法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降、及び免疫蛍光を含む。本明細書で提供される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本明細書で提供されるポリペプチドに対して特異的な結合親和性を有する抗体は、当該技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で既知の方法を使用して、マイクロタイタープレートなどの固体支持体に付着させることができる。
【0139】
２つ以上のヌクレオチドまたはタンパク質配列に関して本明細書で使用される「パーセント同一性」または「パーセント同一」という用語は、（ｉ）比較のウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（ヌクレオチドまたはタンパク質）を比較すること、（ｉｉ）同一の核酸塩基（ヌクレオチド配列の場合）またはアミノ酸残基（タンパク質の場合）が両方の配列で生じる位置の数を決定して、一致する位置の数を得ること、（ｉｉｉ）比較ウィンドウで、一致した位置の数を位置の総数で除すること、及び、その後の（ｉｖ）この商に１００％を乗して、パーセント同一性を得ること、により算出される。特定の比較ウィンドウが指定されていない参照配列に関連して「パーセント同一性」が算出されている場合、パーセント同一性は、アラインメント領域にわたって一致した位置の数を、参照配列の全長で除することにより決定される。したがって、本出願の目的のために、２つの配列（クエリ及びサブジェクト）が（それらのアラインメントにおけるギャップを考慮して）最適にアラインされる場合、クエリ配列の「パーセント同一性」は、２つ配列間の同一位置の数を、長さ（または比較ウィンドウ）にわたるクエリ配列中の位置の総数で除し、１００％を乗したものに等しい。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一ではない残基位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換が異なることが認識され、アミノ酸残基は、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、それ故、分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質を補正するために、上方に調整することができる。そのような保存的置換が異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。
【0140】
２つのヌクレオチド配列に関して本明細書で使用される「パーセント配列相補性」または「パーセント相補性」という用語は、パーセント同一性の概念に類似しているが、クエリ配列及びサブジェクト配列が線状に配置され、ループ、ステム、またはヘアピンなどの２次折り畳み構造なしで最適に塩基対合される場合の、ヌクレオチドにサブジェクト配列を最適に塩基対合またはハイブリダイズするクエリ配列のヌクレオチドのパーセンテージを指す。そのようなパーセント相補性は、２つのＤＮＡ鎖間、２つのＲＮＡ鎖間、またはＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の間に存在し得る。「パーセント相補性」は、（ｉ）比較ウィンドウ上で、線形で完全に拡張された配置の（すなわち、折り畳みまたは２次構造なしの）２つのヌクレオチド配列を最適に塩基対合またはハイブリダイズすること、（ｉｉ）比較ウィンドウ上で２つの配列間で塩基対合する位置の数を決定して、相補的位置の数を得ること、（ｉｉｉ）比較ウィンドウにおける位置の総数で相補的位置の数を除すこと、及び（ｉｖ）この商に１００％を乗して、２つの配列のパーセント相補性を得ること、により算出することができる。２つの配列の最適な塩基対合は、水素結合を介して、既知の対合、例えば、Ｇ－Ｃ、Ａ－Ｔ、及びＡ－Ｕなどのヌクレオチド塩基に基づいて決定することができる。「パーセント相補性」は、特定の比較ウィンドウを指定せずに参照配列に関連して計算されている場合、パーセント同一性は、２つの線形配列間の相補的位置の数を参照配列の全長で除することにより決定される。したがって、本出願の目的のために、２つの配列（クエリ及びサブジェクト）が（ミスマッチまたは塩基対合していないヌクレオチドを考慮に入れて）最適に塩基対合する場合、クエリ配列に対する「パーセント相補性」は、２つの配列間の塩基対合の位置の数を、長さにわたるクエリ配列中の位置の総数で除し、１００％を乗したものに等しい。
【0141】
パーセント同一性を計算するための配列の最適なアラインメントのための、様々なペアワイズまたは複数の配列アラインメントアルゴリズム及びプログラム、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷまたはＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（登録商標））などは、当該技術分野で既知であり、これらは、２つ以上のヌクレオチド間またはタンパク質配列間の配列同一性または類似性を比較するために使用することができる。他のアラインメント及び比較方法が当該技術分野で既知であり、２つの配列間のアラインメント及びパーセント同一性（上記のパーセント同一性の範囲を含む）は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムで決定されるようなものであり得、例えば、Ｃｈｅｎｎａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃｌｕｓｔａｌ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：３４９７－３５００（２００３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＤ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：４６７３－４６８０（１９９４）；Ｌａｒｋｉｎ ＭＡ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ ａｎｄ Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０，”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３：２９４７－４８（２００７）；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）”Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）（これらの全内容及び開示は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【0142】
本明細書で使用される場合、第１の核酸分子は、温度及び溶液イオン強度の適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ条件下、配列特異的逆平行法（すなわち、核酸が、相補的核酸を特異的に結合する）において、非共有相互作用（例えば、ワトソン－クリック塩基対合）を介して、第２の核酸分子を「ハイブリダイズ」をし得る。当該技術分野で既知の通り、標準的なワトソン－クリック塩基対合は、チミンとのアデニン対合、ウラシルとのアデニン対合、及びシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対合を含む［ＤＮＡ、ＲＮＡ］。さらに、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションのために、グアニンがウラシルと塩基対合することも当該技術分野で既知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡのコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対合の文脈における遺伝コードの縮退（すなわち、冗長）に部分的に関与している。本開示の文脈において、本ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニンは、ウラシルに対して相補的とみなされ、逆もまた同様である。そのようなものであるから、Ｇ／Ｕ塩基対が、所与のヌクレオチド位置で、本ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を作成することができる場合、位置は、非相補的であるとみなされないが、その代わりに、相補的であるとみなされる。
【0143】
ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中のＣｈａｐｔｅｒ １１とＴａｂｌｅ １１．１；及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２００１）で例示される。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。
【0144】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含有するが、塩基間のミスマッチが起こり得ることを必要とする。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、当該技術分野で周知の変数である、核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値が大きくなる。短いストレッチの相補性（例えば、３５以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置が重要となる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照）。通常は、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチド；少なくとも約２０ヌクレオチド；少なくとも約２２ヌクレオチド；少なくとも約２５ヌクレオチド；及び少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、相補性の領域の長さ及び相補性の程度などの要因に従って、必要に応じて温度及び洗浄液の塩濃度が調整され得ることを、当業者は認識するであろう。
【0145】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能またはハイブリダイズ可能であるように、標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はないことが、当該技術分野で理解されている。さらに、ポリヌクレオチドは、介在または隣接セグメントがハイブリダイゼーションイベント（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）に関与しないように、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい。例えば、アンチセンス化合物の２０ヌクレオチドのうちの１８が標的領域に相補的であり、したがって、特異的にハイブリダイズすることになるアンチセンス核酸は、９０パーセントの相補性を表すであろう。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化されるか、または相補的ヌクレオチドにはさまっている可能性があり、互いにまたは相補的ヌクレオチドに隣接している必要はない。核酸内の核酸配列の特定のストレッチ間のパーセント相補性は、日常的に、当該技術分野で既知のＢＬＡＳＴ（登録商標）プログラム（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９－６５６を参照）を使用して、または、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２－４８９）のアルゴリズムを使用して、デフォルト設定を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用することにより、決定することができる。
【0146】
標的核酸
本明細書で使用される場合、「標的核酸」または「標的核酸分子」または「標的核酸配列」は、本明細書に記載の変異原による改変が望ましい、選択された核酸分子または核酸分子の選択された配列もしくは領域を指す。
本明細書で使用される場合、「標的核酸」または「標的核酸分子」または「標的核酸配列」は、本明細書に記載の変異原による改変が望ましい、選択された核酸分子または核酸分子の選択された配列もしくは領域を指す。
【0147】
本明細書で使用される場合、「標的領域」または「標的化領域」は、変異原により改変される標的核酸の部分を指す。一態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して１００％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して９９％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して９８％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して９７％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して９６％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して９５％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して９４％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して９３％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して９２％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して９１％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して９０％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して８５％相補的である。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に対して８０％相補的である。一態様では、標的領域は、ガイド核酸に１００％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に９９％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に９８％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に９７％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に９６％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に９５％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に９４％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に９３％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に９２％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に９１％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に９０％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に８５％相補的である核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、ガイド核酸に８０％相補的である核酸配列に隣接する。
【0148】
一態様では、標的領域は、少なくとも１つのＰＡＭ部位を含む。一態様では、標的領域は、少なくとも１つのＰＡＭ部位を含む核酸配列に隣接する。別の態様では、標的領域は、少なくとも１つのＰＡＭ部位から５ヌクレオチド以内にある。さらなる態様では、標的領域は、少なくとも１つのＰＡＭ部位から１０ヌクレオチド以内にある。別の態様では、標的領域は、少なくとも１つのＰＡＭ部位から１５ヌクレオチド以内にある。別の態様では、標的領域は、少なくとも１つのＰＡＭ部位から２０ヌクレオチド以内にある。別の態様では、標的領域は、少なくとも１つのＰＡＭ部位から２５ヌクレオチド以内にある。別の態様では、標的領域は、少なくとも１つのＰＡＭ部位から３０ヌクレオチド以内にある。
【0149】
一態様では、標的核酸は、ＲＮＡを含む。別の態様では、標的核酸は、ＤＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、１本鎖である。別の態様では、標的核酸は、２本鎖である。一態様では、標的核酸は、１本鎖ＲＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、１本鎖ＤＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、２本鎖ＲＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、２本鎖ＤＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、核ゲノム内に位置する。一態様では、標的核酸は、染色体ＤＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、プラスミドＤＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、プラスミド内に位置する。一態様では、標的核酸は、ミトコンドリアＤＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、ミトコンドリアゲノム内に位置する。一態様では、標的核酸は、色素体ＤＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、色素体ゲノム内に位置する。一態様では、標的核酸は、葉緑体ＤＮＡを含む。一態様では、標的核酸は、葉緑体ゲノム内に位置する。一態様では、標的核酸は、核ゲノム、ミトコンドリアゲノム、及び色素体ゲノムからなる群より選択されるゲノム内に位置する。
【0150】
一態様では、標的核酸は、遺伝子をコードする。本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、機能単位を生じ得るポリヌクレオチド（例えば、限定されないが、例えば、タンパク質、または非コードＲＮＡ分子）を指す。遺伝子は、プロモーター、エンハンサー配列、リーダー配列、転写開始部位、転写停止部位、ポリアデニル化部位、１つ以上のエクソン、１つ以上のイントロン、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。「遺伝子配列」は、プロモーター、エンハンサー配列、リーダー配列、転写開始部位、転写停止部位、ポリアデニル化部位、１つ以上のエクソン、１つ以上のイントロン、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、またはそれらの任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。一態様では、遺伝子は、非タンパク質コードＲＮＡ分子またはその前駆体をコードする。別の態様では、遺伝子は、タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、標的核酸は、プロモーター、エンハンサー配列、リーダー配列、転写開始部位、転写停止部位、ポリアデニル化部位、エクソン、イントロン、スプライス部位、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、タンパク質コード配列、非タンパク質コード配列、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡ結合部位からなる群より選択される。
【0151】
非タンパク質コードＲＮＡ分子の非限定例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ＲＮＡ（長さ１８～２６ｎｔ）及びそれをコードする前駆体、異質染色質ｓｉＲＮＡ（ｈｃ－ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ヘアピン２本鎖ＲＮＡ（ヘアピンｄｓＲＮＡ）、トランス作用型ｓｉＲＮＡ（ｔａ－ｓｉＲＮＡ）、天然に存在するアンチセンスｓｉＲＮＡ（ｎａｔ－ｓｉＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が挙げられる。
【0152】
植物における標的核酸の非限定例としては、Ｂｒａｃｈｙｔｉｃ１、Ｂｒａｃｈｙｔｉｃ２、Ｂｒａｃｈｙｔｉｃ３、開花遺伝子座Ｔ、Ｒｇｈ１、Ｒｓｐ１、Ｒｓｐ２、Ｒｓｐ３、５－エノールピルビルシキマート－３－ホスファートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）、プロトポルフィリンＩＸオキシゲナーゼ（ＰＰＯ）、パラ－アミノ安息香酸シンターゼ、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－リン酸（ＤＯＸＰ）シンターゼ、ジヒドロプテロイン酸（ＤＨＰ）シンターゼ、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光化学系ＩＩのＤ１タンパク質、モノオキシゲナーゼ、シトクロームＰ４５０、セルロースシンターゼ、ベータ－チューブリン、ＲＵＢＩＳＣＯ、翻訳開始因子、フィトエンデサチュラーゼ２本鎖ＤＮＡアデノシントリポリホスファターゼ（ｄｄＡＴＰ）、脂肪酸デサチュラーゼ２（ＦＡＤ２）、ジベレリン２０オキシダーゼ（ＧＡ２０ｏｘ）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、ｐ－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）、ヒドロキシメチルジヒドロプテリンピロホスホキナーゼ（ＤＨＰＳ）、オーキシン／インドール－３－酢酸（ＡＵＸ／ＩＡＡ）、Ｗａｘｙ（Ｗｘ）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ＯｓＥＲＦ９２２、ＯｓＳＷＥＥＴ１３、ＯｓＳＷＥＥＴ１４、ＴａＭＬＯ、ＧＬ２、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢＡＤＨ２）、Ｍａｔｒｉｌｉｎｅａｌ（ＭＴＬ）、Ｆｒｉｇｉｄａ、Ｇｒａｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ ２（ＧＷ２）、Ｇｎ１ａ、ＤＥＰ１、ＧＳ３、ＳｌＭＬＯ１、ＳｌＪＡＺ２、ＣｓＬＯＢ１、ＥＤＲ１、Ｓｅｌｆ－Ｐｒｕｎｉｎｇ ５Ｇ（ＳＰ５Ｇ）、Ｓｌａｇａｍｏｕｓ－Ｌｉｋｅ ６（ＳｌＡＧＬ６）、温度感受性遺伝子雄性不稔５遺伝子（ＴＭＳ５）、ＯｓＭＡＴＬ、ＡＲＧＯＳ８、真核生物の翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）、または液胞インベルターゼ（ＶＩｎｖ）をコードする遺伝子が挙げられる。
【0153】
細胞
一態様では、標的核酸は、細胞内にある。別の態様では、標的核酸は、原核細胞内にある。一態様では、原核細胞は、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｏｔａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、及びＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａからなる群より選択される門の細胞である。別の態様では、原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。別の態様では、原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓからなる群より選択される属から選択される。別の態様では、原核細胞は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、及びＢａｃｉｌｌｕｓからなる群より選択される属から選択される。
一態様では、標的核酸は、細胞内にある。別の態様では、標的核酸は、原核細胞内にある。一態様では、原核細胞は、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｏｐｒｏｔｈｅｒｍｏｂａｃｔｅｒｏｔａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ－Ｔｈｅｒｍｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、及びＶｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａからなる群より選択される門の細胞である。別の態様では、原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。別の態様では、原核細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓからなる群より選択される属から選択される。別の態様では、原核細胞は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、及びＢａｃｉｌｌｕｓからなる群より選択される属から選択される。
【0154】
別の態様では、標的核酸は、真核細胞内にある。さらなる態様では、真核細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞である。別の態様では、真核細胞は、酵母細胞である。別の態様では、真核細胞は、植物細胞である。別の態様では、真核細胞は、培養中の植物細胞である。別の態様では、真核細胞は、被子植物の植物細胞である。別の態様では、真核細胞は、裸子植物の植物細胞である。別の態様では、真核細胞は、単子葉植物の植物細胞である。別の態様では、真核細胞は、双子葉植物の植物細胞である。別の態様では、真核細胞は、トウモロコシ細胞である。別の態様では、真核細胞は、イネ細胞である。別の態様では、真核細胞は、モロコシ細胞である。別の態様では、真核細胞は、コムギ細胞である。別の態様では、真核細胞は、ナタネ細胞である。別の態様では、真核細胞は、ムラサキウマゴヤシ細胞である。別の態様では、真核細胞は、ダイズ細胞である。別の態様では、真核細胞は、ワタ細胞である。別の態様では、真核細胞は、トマト細胞である。別の態様では、真核細胞は、ジャガイモ細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、キュウリ細胞である。別の態様では、真核細胞は、キビ細胞である。別の態様では、真核細胞は、オオムギ細胞である。別の態様では、真核細胞は、アマ細胞である。別の態様では、真核細胞は、スイカ細胞である。別の態様では、真核細胞は、ブラックベリー細胞である。別の態様では、真核細胞は、イチゴ細胞である。別の態様では、真核細胞は、ウリ科植物細胞である。別の態様では、真核細胞は、Ｂｒａｓｓｉｃａ細胞である。別の態様では、真核細胞は、シバ細胞である。別の態様では、真核細胞は、Ｓｅｔａｒｉａ細胞である。別の態様では、真核細胞は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、藻類細胞である。
【0155】
一態様では、植物細胞は、表皮細胞である。別の態様では、植物細胞は、気孔細胞である。別の態様では、植物細胞は、トリコーム細胞である。別の態様では、植物細胞は、根細胞である。別の態様では、植物細胞は、葉細胞である。別の態様では、植物細胞は、カルス細胞である。別の態様では、植物細胞は、プロトプラスト細胞である。別の態様では、植物細胞は、花粉細胞である。別の態様では、植物細胞は、卵巣細胞である。別の態様では、植物細胞は、花細胞である。別の態様では、植物細胞は、分裂組織細胞である。別の態様では、植物細胞は、内胚乳細胞である。別の態様では、植物細胞は、生殖材料を含まず、植物の自然な生殖を媒介しない。別の態様では、植物細胞は、体細胞植物細胞である。
【0156】
追加で提供される植物細胞、組織、及び器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、分裂組織、胚、内胚乳、根、芽、茎、鞘、花、花序、柄、小花梗、花柱、柱頭、花托、花弁、萼片、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、篩部、及び維管束組織に由来し得る。
【0157】
さらなる態様では、真核細胞は、動物細胞である。別の態様では、真核細胞は、培養中の動物細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、ヒト細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、培養中のヒト細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、体細胞ヒト細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、がん細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、マウス細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、ブタ細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、ウシ科細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、鳥類細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、爬虫類細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、両生類細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、昆虫細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、節足動物細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、頭足類細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、クモ形類細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、軟体動物細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、線虫細胞である。さらなる態様では、真核細胞は、魚類細胞である。
【0158】
キット
一態様では、本開示は、標的核酸に標的化改変を誘発するためのキットを提供し、キットは、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、及び、（ｂ）少なくとも１つの化学的変異原、を含む。
一態様では、本開示は、標的核酸に標的化改変を誘発するためのキットを提供し、キットは、（ａ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、及び、（ｂ）少なくとも１つの化学的変異原、を含む。
【0159】
一態様では、キットは、さらに、ガイド核酸を含む。別の態様では、キットは、さらに、ガイドＲＮＡを含む。別の態様では、キットは、さらに、ガイドＤＮＡを含む。別の態様では、キットは、さらに、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むガイド核酸を含む。別の態様では、キットは、ガイド核酸をコードする核酸を含む。さらなる態様では、キットは、ガイドＲＮＡをコードする核酸を含む。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、さらに、ガイド核酸をコードする核酸配列を含む。
【0160】
一態様では、キットは、リボヌクレオタンパク質を含む。一態様では、キットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ及びガイド核酸を含むリボヌクレオタンパク質を含む。
【0161】
別の態様では、キットは、少なくとも１つの細菌細胞を含む。一態様では、キットは、少なくとも１つのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を含む。一態様では、キットは、少なくとも１つのバクテリオファージを含む。別の態様では、キットは、細菌成長培地を含む。別の態様では、キットは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ成長培地を含む。
【0162】
一態様では、キットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼを再構成するための少なくとも１つの希釈剤を含む。別の態様では、キットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼを希釈するための少なくとも１つの希釈剤を含む。別の態様では、キットは、化学的変異原を再構成するための少なくとも１つの希釈剤を含む。別の態様では、キットは、化学的変異原を希釈するための少なくとも１つの希釈剤を含む。
【0163】
一態様では、キットは、少なくとも１つの緩衝液を含む。別の態様では、キットは、少なくとも１つの洗浄緩衝液を含む。
【0164】
一態様では、キットで提供される試薬は、ｉｎ ｖｉｖｏで触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼの生成を可能にする。一態様では、キットで提供される試薬は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼの生成を可能にする。一態様では、キットで提供される試薬は、ｅｘ ｖｉｖｏで触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼの生成を可能にする。
【0165】
一態様では、キットで提供される試薬は、リボヌクレオタンパク質の細胞への導入を可能にする。別の態様では、キットで提供される試薬は、細胞への触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸の導入を可能にする。一態様では、キットで提供される試薬は、ガイド核酸の細胞への導入を可能にする。
【0166】
試薬、希釈剤、緩衝液、及び洗浄緩衝液は、水、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ナトリウム、塩化ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、トリス－ＨＣｌ、酢酸、酢酸塩、ホウ酸、グリシン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、グリシン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、カリウム、リン酸、リン酸カリウム、酢酸カリウム、アンモニア、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、塩酸、リンゴ酸、マレイン酸、エタノール、及びメタノールを含み得るが、これらに限定されない。
【0167】
また、限定されないが、本明細書で提供される試薬は、送達粒子、送達小胞、ウイルスベクター、ナノ粒子、カチオン性脂質、ポリカチオン、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、及びタンパク質を含み得る。試薬のさらなる非限定例としては、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）が挙げられる。試薬に含まれるタンパク質は、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、ＲＮａｓｅ Ａ、及びＲＮａｓｅ Ｈを含み得るが、これらに限定されない。
【0168】
一態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、３～１２のｐＨを含む。別の態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、６～８のｐＨを含む。別の態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、少なくとも３のｐＨを含む。別の態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、少なくとも４のｐＨを含む。別の態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、少なくとも５のｐＨを含む。別の態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、少なくとも６のｐＨを含む。別の態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、少なくとも７のｐＨを含む。別の態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、少なくとも８のｐＨを含む。別の態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、少なくとも９のｐＨを含む。別の態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、少なくとも１０のｐＨを含む。別の態様では、試薬、希釈剤、緩衝液、または洗浄緩衝液は、少なくとも１１のｐＨを含む。
【0169】
一態様では、キットで提供される試薬は、ｉｎ ｖｉｖｏで触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸の発現を可能にする。一態様では、キットで提供される試薬は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸の発現を可能にする。一態様では、キットで提供される試薬は、ｅｘ ｖｉｖｏで触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸の発現を可能にする。
【0170】
一態様では、キットは、少なくとも１つの対照発現ベクターを含む。
【0171】
プロモーター
一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、プロモーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。別の態様では、ガイド核酸をコードする核酸配列は、プロモーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。一態様では、プロモーターは、作動可能に連結されている配列に対して異種である。
一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸は、プロモーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。別の態様では、ガイド核酸をコードする核酸配列は、プロモーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。一態様では、プロモーターは、作動可能に連結されている配列に対して異種である。
【0172】
「作動可能に連結されている」という用語は、プロモーターなどが、少なくとも特定の組織（複数可）、発生段階（複数可）、及び／または状態（複数可）において、関連する転写可能なＤＮＡ配列またはコード配列の転写及び発現を開始し、支援し、影響を与え、引き起こし、及び／または促進するように動作するように、プロモーターまたは他の調節エレメントと、関連する転写可能なＤＮＡ配列または遺伝子のコード配列（もしくは導入遺伝子）の間の機能的な連結を指す。プロモーターに加えて、調節エレメントは、細胞内の遺伝子または転写可能なＤＮＡ配列の発現を調節または可能にするのに適する、必要な、または好ましい、エンハンサー、リーダー、転写開始部位（ＴＳＳ）、リンカー、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ならびに終結領域または配列などを含むが、これらに限定されない。そのような追加の調節エレメント（複数可）は、任意であり、遺伝子または転写可能なＤＮＡ配列の発現を強化または最適化するために使用することができる。
【0173】
当該技術分野で一般に理解されるように、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、転写開始部位、及び／またはＴＡＴＡボックスを含有し且つ関連する転写可能なポリヌクレオチド配列及び／または遺伝子（もしくは導入遺伝子）の転写及び発現を支援または促進するＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、既知のまたは天然に存在するプロモーター配列または他のプロモーター配列から合成的に生成、変更、または誘導することができる。プロモーターは、２つ以上の異種配列の組み合わせを含むキメラプロモーターも含み得る。したがって、本出願のプロモーターは、組成が類似しているが、既知のまたは本明細書で提供される他のプロモーター配列（複数可）と同一ではないプロモーター配列の多様体を含み得る。プロモーターに作動可能に連結されている関連するコードまたは転写可能配列もしくは遺伝子（導入遺伝子を含む）の発現のパターンに関する様々な基準、例えば、構成的、発生的、組織特異的、誘導性など、に従って、プロモーターを分類することができる。生物の全てまたはほとんどの組織で発現を引き起こすプロモーターは、「構成的」プロモーターと呼ばれる。発達の特定の期間または段階の間に発現を引き起こすプロモーターは、「発生」プロモーターと呼ばれる。生物の他の組織と比較して、生物の特定の組織において強化された発現を引き起こすプロモーターは、「組織優先」プロモーターと呼ばれる。したがって、「組織優先」プロモーターは、生物の特定の組織（複数可）において比較的高いまたは優先的な発現を引き起こすが、生物の他の組織（複数可）における発現のレベルがより低い。生物の特定の組織（複数可）内で発現し、他の組織で発現がほとんどないかまたは全くないプロモーターは、「組織特異的」プロモーターと呼ばれる。「誘導性」プロモーターは、環境刺激、例えば、熱、寒さ、干ばつ、光、または他の刺激、例えば、創傷または化学用途に応答して、転写を開始させるプロモーターである。プロモーターは、異種、相同、キメラ、合成などの起源の観点から分類することもできる。
【0174】
本明細書で使用される場合、プロモーターに関する「異種」という用語は、関連する転写可能なＤＮＡ配列、コード配列または遺伝子（もしくは導入遺伝子）に対して異なる起源を有し、及び／あるいは形質転換されるべき植物種において天然に存在しない、プロモーター配列である。「異種」という用語は、より広くは、そのような組み合わせが人工であり且つ自然界では通常見られない場合、プロモーター及び関連する転写可能なＤＮＡ配列、コード配列または遺伝子などの２つ以上のＤＮＡ分子または配列の組み合わせを指し得る。
【0175】
一態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、構成的プロモーターである。別の態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、組織特異的プロモーターである。さらなる態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、組織優先プロモーターである。さらに別の態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、誘導性プロモーターである。一態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、組織優先プロモーター、及び誘導性プロモーターからなる群より選択される。
【0176】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターは、ガイド核酸を含む非タンパク質コーディングＲＮＡ分子の発現を促進するために使用することができる。一態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。別の態様では、本明細書で提供されるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、非タンパク質コーディングＲＮＡをコードする核酸分子に作動可能に連結されている。さらに別の態様では、本明細書で提供されるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子に作動可能に連結されている。さらに別の態様では、本明細書で提供されるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、単一ガイドＲＮＡをコードする核酸分子に作動可能に連結されている。さらなる態様では、本明細書で提供されるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードする核酸分子に作動可能に連結されている。別の態様では、本明細書で提供されるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、トレーサーＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする核酸分子に作動可能に連結されている。
【0177】
Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定例としては、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、５Ｓプロモーター、アデノウイルス２（Ａｄ２）ＶＡＩプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び７ＳＫプロモーターが挙げられる。例えば、Ｓｃｈｒａｍｍ ａｎｄ Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，２００２，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１６：２５９３－２６２０（全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。一態様では、本明細書で提供されるＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、５Ｓプロモーター、アデノウイルス２（Ａｄ２）ＶＡＩプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び７ＳＫプロモーターからなる群より選択される。別の態様では、本明細書で提供されるガイドＲＮＡは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、５Ｓプロモーター、アデノウイルス２（Ａｄ２）ＶＡＩプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び７ＳＫプロモーターからなる群より選択されるプロモーターに作動可能に連結されている。別の態様では、本明細書で提供される単一ガイドＲＮＡは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、５Ｓプロモーター、アデノウイルス２（Ａｄ２）ＶＡＩプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び７ＳＫプロモーターからなる群より選択されるプロモーターに作動可能に連結されている。別の態様では、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、５Ｓプロモーター、アデノウイルス２（Ａｄ２）ＶＡＩプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び７ＳＫプロモーターからなる群より選択されるプロモーターに作動可能に連結されている。別の態様では、本明細書で提供されるトレーサーＲＮＡは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、５Ｓプロモーター、アデノウイルス２（Ａｄ２）ＶＡＩプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、及び７ＳＫプロモーターからなる群より選択されるプロモーターに作動可能に連結されている。
【0178】
一態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、ダリアモザイクウイルス（ＤａＭＶ）プロモーターである。別の態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、Ｕ６プロモーターである。別の態様では、本明細書で提供されるプロモーターは、アクチンプロモーターである。
【0179】
本明細書で使用することができるプロモーターについて記載する例としては、米国特許第６，４３７，２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）、米国特許第５，６４１，８７６号（コメアクチンプロモーター）、米国特許第６，４２６，４４６号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）、米国特許第６，４２９，３６２号（トウモロコシＰＲ－１プロモーター）、米国特許第６，２３２，５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）、米国特許第６，１７７，６１１号（構成的トウモロコシプロモーター）、米国特許第５，３２２，９３８号、同第５，３５２，６０５号、同第５，３５９，１４２号、及び同第５，５３０，１９６号（３５Ｓプロモーター）、米国特許第６，４３３，２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）、米国特許第６，４２９，３５７号（コメアクチン２プロモーター及びコメアクチン２イントロン）、米国特許第５，８３７，８４８号（根特異的プロモーター）、米国特許第６，２９４，７１４号（光誘導性プロモーター）、米国特許第６，１４０，０７８号（塩誘導性プロモーター）、米国特許第６，２５２，１３８号（病原体誘導性プロモーター）、米国特許第６，１７５，０６０号（リン欠乏症誘導性プロモーター）、米国特許第６，６３５，８０６号（ガンマコイキシンプロモーター）、ならびに米国特許出願第０９／７５７，０８９号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。用途を見つけることができる追加のプロモーターは、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９８７）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘発プラスミドで実施される）、カウリモウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーター（Ｌａｗｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）９：３１５－３２４）、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：８１０－８１２）、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（米国特許第６，０５１，７５３号；同第５，３７８，６１９号）、スクロースシンターゼプロモーター（Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ（１９９０）８７：４１４４－４１４８）、Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Ｃｈａｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（１９８９）１：１１７５－１１８３）、及びクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター、ＰＣ１ＳＶ（米国特許第５，８５０，０１９号）、ならびにＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＶ０００８７；Ｄｅｐｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８２）１：５６１－５７３；Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）プロモーターである。
【0180】
プロモーターハイブリッドは、転写活性を強化するために（米国特許第５，１０６，７３９号を参照）、または望ましい転写活性、誘導性及び組織特異性、もしくは発育特異性を組み合わせるために、使用及び構成することもできる。植物で機能するプロモーターは、誘導性、ウイルス性、合成性、構成的、時間的調節、空間的調節、及び時空間的調節であるプロモーターを含むが、これらに限定されない。組織強化、組織特異的、または発生的に調節される他のプロモーターもまた、当該分野で既知であり、本開示の実施において有用性を有することが想定される。
【0181】
形質転換／トランスフェクション
本明細書で提供される任意の方法は、目的の細胞（例えば、真核細胞、原核細胞）の一過性トランスフェクションまたは安定した形質転換を含み得る。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸分子は、安定して形質転換される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸分子は、一過性にトランスフェクトされる。一態様では、ガイド核酸をコードする核酸分子は、安定して形質転換される。別の態様では、ガイド核酸をコードする核酸分子は、一過性にトランスフェクトされる。
本明細書で提供される任意の方法は、目的の細胞（例えば、真核細胞、原核細胞）の一過性トランスフェクションまたは安定した形質転換を含み得る。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸分子は、安定して形質転換される。別の態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸分子は、一過性にトランスフェクトされる。一態様では、ガイド核酸をコードする核酸分子は、安定して形質転換される。別の態様では、ガイド核酸をコードする核酸分子は、一過性にトランスフェクトされる。
【0182】
組み換え核酸分子または構築物で細胞を形質転換するための多数の方法が、当該技術分野で既知であり、これは、本出願の方法に従って使用することができる。当該技術分野で既知の細胞の形質転換のための任意の好適な方法または手法を、本方法に従って使用することができる。植物の形質転換のための効果的な方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ媒介形質転換などの細菌媒介形質転換、及び微小発射体衝撃媒介形質転換を含む。細菌媒介形質転換または微小発射体衝撃により形質転換ベクターで外植片を形質転換し、次に、それらの外植片を培養して、トランスジェニック植物を再生または発育させるための様々な方法が当該技術分野で既知である。
【0183】
一態様では、方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換により、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、ポリエチレングリコール媒介形質転換により、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、バイオリスティック媒介形質転換により、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、リポソーム媒介トランスフェクションにより、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、ウイルス形質導入により、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、１つ以上の送達粒子の使用を介して、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、マイクロインジェクションにより、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、エレクトロポレーションにより、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸を、細胞に提供することを含む。
【0184】
一態様では、方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換により、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、ポリエチレングリコール媒介形質転換により、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、バイオリスティック形質転換により、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、リポソーム媒介トランスフェクションにより、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、ウイルス形質導入により、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、１つ以上の送達粒子の使用を介して、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸を細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、マイクロインジェクションにより、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸を、細胞に提供することを含む。一態様では、方法は、エレクトロポレーションにより、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸を、細胞に提供することを含む。
【0185】
一態様では、リボヌクレオタンパク質は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換、ポリエチレングリコール媒介形質転換、バイオリスティック形質転換、リポソーム媒介トランスフェクション、ウイルス形質導入、１つ以上の送達粒子の使用、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションからなる群より選択される方法により細胞に提供される。
【0186】
形質転換のための他の方法、例えば、減圧浸潤、圧力、超音波処理、及び炭化ケイ素繊維撹拌は、また、当該技術分野で既知であり、本明細書で提供される任意の方法で使用するために想定される。
【0187】
細胞を形質転換する方法は、当業者らに周知である。例えば、組み換えＤＮＡでコーティングされた粒子を用いる微小発射体衝撃（例えば、バイオリスティック形質転換）により、植物細胞を形質転換するための特定の使用説明書は、米国特許第５，５５０，３１８号；同第５，５３８，８８０号；同第６，１６０，２０８号；同第６，３９９，８６１号；及び同第６，１５３，８１２号に見出だされ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換は、米国特許第５，１５９，１３５号；同第５，８２４，８７７号；同第５，５９１，６１６号；同第６，３８４，３０１号；同第５，７５０，８７１号；同第５，４６３，１７４号；及び同第５，１８８，９５８号（これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。植物を形質転換するための追加の方法は、例えば、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｃｒｏｐ Ｐｌａｎｔｓ（２００９）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに見出すことができる。当業者らに既知の任意の適切な方法は、本明細書で提供される核酸分子のいずれかで植物細胞を形質転換するために使用することができる。
【0188】
リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、及び同第４，８９７，３５５号に記載され、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適するカチオン性及び中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４のものを含む。送達は、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ投与）への送達であり得る。
【0189】
核酸分子またはタンパク質のうちの１つ以上の要素を発現させるための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、及びそれらの構成成分は、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）で使用される通りである。一態様では、核酸分子またはタンパク質を細胞に提供する方法は、送達粒子を介した送達を含む。一態様では、核酸分子またはタンパク質を細胞に提供する方法は、送達小胞を介した送達を含む。一態様では、送達小胞は、エクソソーム及びリポソームからなる群より選択される。一態様では、核酸分子またはタンパク質を細胞に提供する方法は、ウイルスベクターを介した送達を含む。一態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択される。別の態様では、核酸分子またはタンパク質を細胞に提供する方法は、ナノ粒子を介した送達を含む。一態様では、核酸分子またはタンパク質を細胞に提供する方法は、マイクロインジェクションを含む。一態様では、核酸分子またはタンパク質を細胞に提供する方法は、ポリカチオンを含む。一態様では、核酸分子またはタンパク質を細胞に提供する方法は、カチオン性オリゴペプチドを含む。
【0190】
一態様では、送達粒子は、エクソソーム、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ナノ粒子、ポリカチオン、及びカチオン性オリゴペプチドからなる群より選択される。一態様では、本明細書で提供される方法は、１つ以上の送達粒子の使用を含む。別の態様では、本明細書で提供される方法は、２つ以上の送達粒子の使用を含む。別の態様では、本明細書で提供される方法は、３つ以上の送達粒子の使用を含む。
【0191】
植物細胞内へのタンパク質、核酸、変異原、及びリボヌクレオタンパク質の移動を容易にする好適な薬剤は、植物の外側の透過性を増加させるか、またはオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、タンパク質、もしくはリボヌクレオタンパク質への植物細胞の透過性を増加させる薬剤を含む。組成物の植物細胞への移動を容易にするそのような薬剤は、化学的薬剤、もしくは物理的薬剤、またはそれらの組み合わせを含む。調整用の化学薬品は、（ａ）界面活性剤、（ｂ）有機溶媒または有機溶媒の水溶液もしくは水性混合物、（ｃ）酸化剤、（ｅ）酸、（ｆ）塩基、（ｇ）油、（ｈ）酵素、あるいはそれらの組み合わせを含む。
【0192】
ポリヌクレオチドにより浸透するように植物を調整するのに有用な有機溶媒は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ピリジン、Ｎ－ピロリジン、ヘキサメチルホスホルアミド、アセトニトリル、ジオキサン、ポリプロピレングリコール、水と混和性があるかまたは非水系でホスホヌクレオチドを溶解することになる（例えば、合成反応で使用される）他の溶媒を含む。界面活性剤または乳化剤を含むまたは含まない天然由来の油または合成油を使用することができ、例えば、植物由来の油、作物油（例えば、ｗｗｗ．ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ．ａｄｊｕｖａｎｔｓ．ｃｏｍで、オンラインで公開されている９ｔｈ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓに列挙のもの）、例えば、パラフィン系オイル、脂肪酸エステル、またはポリエチレンイミンもしくはＮ－ピロリジンなどのアミドもしくはポリアミンで修飾された短鎖分子を有する油、を使用することができる。
【0193】
有用な界面活性剤の例としては、脂肪酸のナトリウム塩またはリチウム塩（例えば、獣脂または獣脂アミンまたはリン脂質）及び有機シリコーン界面活性剤が挙げられる。他の有用な界面活性剤は、非イオン性有機シリコーン界面活性剤、例えば、トリシロキサンエトキシラート界面活性剤、またはシリコーンポリエーテルコポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド修飾ヘプタメチルトリシロキサンとアリルオキシポリプロピレングリコールメチルエーテルのコポリマー（Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ－７７として市販）を含む有機シリコーン界面活性剤を含む。
【0194】
有用な物理的作用物質は、（ａ）カーボランダム、コランダム、砂、方解石、軽石、ガーネットなどの研磨剤、（ｂ）カーボンナノチューブなどのナノ粒子、または（ｃ）物理的力、を含み得る。カーボンナノチューブは、Ｋａｍ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２６（２２）：６８５０－６８５１、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ，９（３）：１００７－１０１０、及びＫｈｏｄａｋｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＡＣＳ Ｎａｎｏ，３（１０）：３２２１－３２２７により開示される。物理的作用物質は、加熱、冷却、正圧の適用、または超音波処理を含み得る。方法の実施形態は、任意に、インキュベーションステップ、中和ステップ（例えば、酸、塩基、もしくは酸化剤を中和するか、または酵素を不活化する）、すすぎステップ、またはこれらの組み合わせを含み得る。本発明の方法は、さらに、特定の遺伝子のサイレンシングのために効果を強化している他の薬剤の適用を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、除草剤耐性を提供する遺伝子を調節するように設計される場合、その後の除草剤の適用は、除草剤の有効性に劇的な影響を及ぼし得る。
【0195】
ポリヌクレオチドによる浸透に対する植物細胞の実験用調整のための手段は、例えば、化学薬品の適用、酵素処理、加熱もしくは冷却、正圧もしくは負圧による処理、または超音波処理を含む。圃場の植物を調整するための薬剤は、界面活性剤及び塩などの化学薬品を含む。
【0196】
一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸が、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に提供される。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に提供される。一態様では、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼ、または触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸が、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞に提供される。
【0197】
一態様では、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞に提供される。一態様では、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に提供される。一態様では、ガイド核酸、またはガイド核酸をコードする核酸は、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞に提供される。
【0198】
一態様では、標的核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏで触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと接触させる。一態様では、標的核酸は、ｅｘ ｖｉｖｏで触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと接触させる。一態様では、標的核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと接触させる。一態様では、標的核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏでガイド核酸分子と接触させる。一態様では、標的核酸は、ｅｘ ｖｉｖｏでガイド核酸分子と接触させる。一態様では、標的核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでガイド核酸分子と接触させる。
【0199】
一態様では、標的核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏでリボヌクレオタンパク質及び変異原と接触させる。一態様では、標的核酸は、ｅｘ ｖｉｖｏでリボヌクレオタンパク質及び変異原と接触させる。一態様では、標的核酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリボヌクレオタンパク質及び変異原と接触させる。
【0200】
形質転換のためのレシピエント植物細胞または外植片標的は、種子細胞、果実細胞、葉細胞、子葉細胞、胚軸細胞、分裂組織細胞、胚細胞、内胚乳細胞、根細胞、芽細胞、茎部細胞、鞘細胞、花細胞、花序細胞、柄細胞、小花梗細胞、花柱細胞、柱頭細胞、花托細胞、花弁細胞、萼片細胞、花粉細胞、葯細胞、フィラメント細胞、子房細胞、胚珠細胞、果皮細胞、篩部細胞、蕾細胞、または維管束組織細胞を含むが、これらに限定されない。別の態様では、本開示は、植物葉緑体を提供する。さらなる態様では、本開示は、表皮細胞、気孔細胞、トリコーム細胞、根毛細胞、貯蔵根細胞、または塊茎細胞を提供する。別の態様では、本開示は、プロトプラストを提供する。別の態様では、本開示は、植物カルス細胞を提供する。稔性植物を再生することができる任意の細胞は、本開示の実施のための有用なレシピエント細胞として企図される。カルスは、限定されないが、未成熟胚または胚の一部、実生の頂端分裂組織、小胞子などを含む、様々な組織源から開始することができる。カルスとして増殖することが可能な細胞は、形質転換のためのレシピエント細胞として役立ち得る。本開示のトランスジェニック植物を作製するための実用的な形質転換方法及び材料（例えば、様々な培地及びレシピエント標的細胞、未熟胚の形質転換、ならびにその後の稔性トランスジェニック植物の再生）は、例えば、米国特許第６，１９４，６３６号及び同第６，２３２，５２６号ならびに米国特許出願公開第２００４／０２１６１８９号（これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる）に開示される。形質転換された外植片、細胞または組織は、当該技術分野で知られている通り、カルス誘導、選択、再生などの追加の培養ステップにかけることができる。組み換えＤＮＡ挿入を含有する形質転換された細胞、組織、または外植片は、当該技術分野で既知の方法に従って、培養物、プラグ、または土壌中でトランスジェニック植物に成長、発育、または再生させることができる。一態様では、本開示は、生殖材料ではなく、植物の自然な生殖を媒介しない植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、生殖材料であり且つ植物の自然な生殖を媒介する植物細胞も提供する。別の態様では、本開示は、光合成によりそれ自体を維持することができない植物細胞を提供する。別の態様では、本開示は、体細胞植物細胞を提供する。体細胞は、生殖系列細胞とは異なり、植物の生殖を媒介しない。一態様では、本開示は、非生殖性植物細胞を提供する。
【0201】
一態様では、方法は、さらに、標的化改変を含む細胞から植物を再生することを含む。
【0202】
植物育種
本明細書で提供される方法またはキットから誘導される植物は、当該技術分野の１つ以上の既知の方法、例えば、系統育種、循環選抜、集団選抜、及び変異育種、を使用する追加の育種にかけることもできる。本明細書で提供される方法により生じる改変は、異なる遺伝的背景に遺伝子移入し、遺伝子型または表現型スクリーニングにより選択することができる。
本明細書で提供される方法またはキットから誘導される植物は、当該技術分野の１つ以上の既知の方法、例えば、系統育種、循環選抜、集団選抜、及び変異育種、を使用する追加の育種にかけることもできる。本明細書で提供される方法により生じる改変は、異なる遺伝的背景に遺伝子移入し、遺伝子型または表現型スクリーニングにより選択することができる。
【0203】
系統育種は、改変を含む最初の植物及び改変を欠いている別の植物などの２つの遺伝子型の交配から始まる。２つの元の親が、全ての望ましい特徴を提供しない場合、他の供給元は、育種個体群に含まれ得る。系統方法では、優れた植物は、自家受粉し、次に続く雑種世代で選抜される。後続の雑種世代では、ヘテロ接合状態は、自家受精及び選抜の結果として均質な品種に取って代わられる。さらに、例えば、オフターゲット改変のために選択されていない改変が失われる。通常は、系統育種法では、５つ以上の連続する雑種世代の自家受粉及び選抜が実施される：Ｆ１→Ｆ２；Ｆ２→Ｆ３；Ｆ３→Ｆ４；Ｆ４→Ｆ５など。十分な量の同系交配の後、次の雑種世代は、開発された品種の種子を増加させるのに役立つであろう。開発された品種は、遺伝子座の約９５％以上にホモ接合性対立遺伝子を含んでもよい。
【0204】
戻し交配変換を作成するために使用されることに加えて、戻し交配は、系統育種と組み合わせて使用することもできる。戻し交配は、１つの品種（ドナー親）由来の１つ以上の特に望ましい形質を、反復親と呼ばれる開発された品種に移すために使用することができ、これは、全体的に良好な作物栽培特性を有するが、望ましい形質（複数可）を欠いている。しかし、同じ手順は、子孫を反復親の遺伝子型に近づけるために使用することができるが、同時に、初期に戻し交配を停止させ且つ自家受粉及び選抜を進めることにより、非反復親の多くの構成要素を保持する。例えば、第１の植物品種は、第１世代の子孫植物を生成するために、第２の植物品種と交配されてもよい。次に、第１世代の子孫植物は、ＢＣ１またはＢＣ２を生成するために、その親品種のうちの１つに戻し交配されてもよい。子孫は、新たに開発された品種が、反復親の多くの属性、さらに、非反復親の所望の属性のいくつかを有するように、自家受粉及び選抜される。このアプローチは、新しい植物品種で使用される反復親の価値及び強みを活用する。
【0205】
循環選抜は、植物の個体群を改善するために、植物育種プログラムで使用される方法である。方法は、子孫を形成するために、個々の植物が互いに他家受粉することを伴う。子孫は成長し、所望の改変を含む子孫は、任意数の選抜方法により選抜され、これは、個々の植物、半同胞子孫、全同胞子孫、及び自家受粉子孫を含む。選抜された子孫は、別の個体群の子孫を形成するために、互いに他家受粉される。この個体群が植えられ、再度、所望の改変を含む植物が互いに他家受粉するように選抜される。循環選抜は、循環プロセスであり、それ故、必要に応じて、何度でも繰り返すことができる。循環選抜の目的は、個体群の形質を改善することである。次に、改善された個体群は、合成系統の産生を含む、商業用途または育種用途の新しい品種を得るために、育種材料の供給源として使用することができる。合成系統は、いくつかの選抜された品種の交配により形成された得られた子孫である。
【0206】
集団選抜は、分子マーカーで強化された選抜と組み合わせて使用される場合のもう１つの有用な手法である。集団選抜では、個体からの種子は、表現型または遺伝子型に基づいて選抜される。次に、これらの選抜された種子は、バルク化され、次世代を成長させるために使用される。バルク選抜は、次世代を植えるために、バルクプロットで植物の個体群を成長させること、植物が自家受粉することが可能になること、種子を大量に収穫すること、それに続いて、大量に収穫された種子の試料を使用すること、を必要とする。また、自家受粉の代わりに、直接受粉を育種プログラムの一部として使用することができる。
【0207】
本明細書で提供される方法及びキットは、植物の作物栽培特性を改善し得る。本明細書で使用される場合、「作物栽培特性」という用語は、測定することができる任意の作物栽培上重要な表現型を指す。作物栽培特性の非限定例としては、花の分裂組織サイズ、花の分裂組織数、穂の分裂組織サイズ、芽の分裂組織サイズ、根の分裂組織サイズ、雄穂のサイズ、穂のサイズ、青さ、収量、成長速度、生物量、成熟時の新鮮重、成熟時の乾物重、成熟種子の数、果実収量、種子収量、総植物窒素含有量、窒素利用効率、耐倒伏性、草高、根の深さ、根量、種子の油含有量、種子のタンパク質含有量、種子の遊離アミノ酸含有量、種子の炭水化物含有量、種子のビタミン含有量、種子の発芽率、種子の発芽速度、成熟までの日数、乾燥耐性、耐塩性、耐熱性、耐寒性、紫外線耐性、二酸化炭素耐性、冠水耐性、窒素吸収、穂高、穂幅、穂径、穂長、節間数、炭素同化率、日陰回避、日陰耐性、生成された花粉重量、鞘の数、除草剤耐性、耐虫性、及び耐病性が挙げられる。
【0208】
一態様では、本開示は、植物に作物栽培特性の改善を提供する方法を提供し、方法は、（ａ）第１の植物に、（ｉ）触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼまたは触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）少なくとも１つのガイド核酸またはガイド核酸をコードする核酸（少なくとも１つのガイド核酸が、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、少なくとも１つのガイド核酸が、植物のゲノム中の標的核酸分子とハイブリダイズし、標的核酸が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を含む）、及び（ｉｉｉ）少なくとも１つの変異原（少なくとも１つの改変が、標的核酸分子に誘発される）を提供すること；（ｂ）第１の植物から少なくとも１つの子孫植物を生成すること、ならびに（ｃ）少なくとも１つの改変及び改善された作物栽培特性を含む少なくとも１つの子孫植物を選抜すること、を含む。
【0209】
化学療法
多くの化学療法処置は、望ましくない細胞に変異を誘発する変異原に依存し、これにより、ＤＮＡ損傷を修復する能力が低減するので、望ましくない細胞の死がもたらされ得る。非限定例として、望ましくない細胞は、前がん性細胞、がん細胞、及び腫瘍細胞を含む。
多くの化学療法処置は、望ましくない細胞に変異を誘発する変異原に依存し、これにより、ＤＮＡ損傷を修復する能力が低減するので、望ましくない細胞の死がもたらされ得る。非限定例として、望ましくない細胞は、前がん性細胞、がん細胞、及び腫瘍細胞を含む。
【0210】
本明細書で提供される方法及びキットは、望ましくない細胞に死を誘発するために必要な変異原の量または濃度を低減するために、使用することができる。
【0211】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、望ましくない細胞の必須遺伝子を標的とすることにより、望ましくない細胞を死滅させるのに必要とされる変異原の量を低減させる。本明細書で使用される場合、「必須遺伝子」は、望ましくない細胞の生存に重要または必要である任意の遺伝子を指す。一態様では、必須遺伝子の改変は、望ましくない細胞を死に至らしめる。
【0212】
一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼなしの変異原の使用と比較して、少なくとも１％低い濃度の変異原を使用することにより望ましくない細胞の死を誘発する。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼなしの変異原の使用と比較して、少なくとも５％低い濃度の変異原を使用することにより望ましくない細胞の死を誘発する。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼなしの変異原の使用と比較して、少なくとも１０％低い濃度の変異原を使用することにより望ましくない細胞の死を誘発する。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼなしの変異原の使用と比較して、少なくとも２５％低い濃度の変異原を使用することにより望ましくない細胞の死を誘発する。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼなしの変異原の使用と比較して、少なくとも５０％低い濃度の変異原を使用することにより望ましくない細胞の死を誘発する。一態様では、本明細書で提供される方法またはキットは、触媒的に不活性な誘導型ヌクレアーゼなしの変異原の使用と比較して、少なくとも７５％低い濃度の変異原を使用することにより望ましくない細胞の死を誘発する。
【実施例】
【0213】
実施例１．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｐｏＢ／Ｒｉｆｒアッセイシステム
この例は、化学的変異原により誘発される変異率及び変異タイプを特徴付けるシステムとして、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｐｏＢ遺伝子及びｒｐｏＢにマッピングされるリファンピシン耐性（Ｒｉｆｒ）変異について記載する。
この例は、化学的変異原により誘発される変異率及び変異タイプを特徴付けるシステムとして、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｐｏＢ遺伝子及びｒｐｏＢにマッピングされるリファンピシン耐性（Ｒｉｆｒ）変異について記載する。
【0214】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２（ＭＧ１６５５株）ｒｐｏＢ遺伝子（配列番号１）は、ＲＮＡポリメラーゼ複合体（配列番号２）のサブユニットをコードし、細菌の転写阻害剤である抗生物質リファンピシンの標的である。ｒｐｏＢ遺伝子のユニークな特徴は、２４のアミノ酸コドンにある少なくとも６９のヌクレオチド置換が、Ｅ．ｃｏｌｉにＲｉｆｒ表現型を付与し得ることである。これにより、ｒｐｏＢが、ヌクレオチド変化のタイプ及び頻度をスクリーニング及び分析するための有用な標的になる（例えば、変異原による誘発される追加、欠失、及び置換（Ｇａｒｉｂｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ，２：５９３－６０８で概説））。さらに、リファンピシン耐性を付与する変異の大部分（９０％超）は、ｒｐｏＢ遺伝子の、比較的小さな２６８ヌクレオチド長の領域にマッピングされる。これにより、オリゴヌクレオチドプライマーの単一ペアを用いるＰＣＲ増幅、それに続く、シーケンシングが可能になり、これは、多数の潜在的な変異の迅速な分析を可能にする。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ｒｐｏＢ遺伝子の上述の２６８ｂｐフラグメントは、配列番号３として記載される。必須遺伝子として、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｒｐｏＢ遺伝子座におけるフレームシフトまたはナンセンス変異を許容しないという点に留意すべきである。しかし、短いインフレームの欠失（最大５アミノ酸）を含む変異体が見出されているが、はるかに低い頻度である（例えば、Ｊｉｎ ａｎｄ Ｇｒｏｓｓ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０２：４５－５８（１９８８）を参照）。
【0215】
ｒｐｏＢでのＥＭＳ誘発型変異：化学的変異原ＥＭＳ（エチルメタンスルホナート）は、グアニン塩基を選択的にアルキル化し、ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ複製中に０～６つのエチルグアニンの向かいに、シトシン残基よりもチミン残基を配置することを促進し、これにより、Ｇ→Ａトランジション変異がもたらされる。ＥＭＳで変異した個体群で観察された改変の大部分（７０％～９９％）は、Ｇ：Ｃ→Ａ：Ｔ塩基対トランジションである。多数の研究が、ｒｐｏＢ遺伝子に対するＥＭＳ処置の効果を分析しており、この中で最も包括的なものは、Ｇａｒｉｂｙａｎ ｅｔ．ａｌ．により実施された研究である（ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ２：５９３－６０８（２００３））。このレポートでは、ｒｐｏＢ遺伝子の２６８ｂｐのストレッチ（配列番号３）内の８つの部位で合計４０の変異を同定し；４０の変異は全て、Ｇ：Ｃ→Ａ：Ｔトランジションであった。Ｇａｒｉｂｙａｎ ｅｔ ａｌ．による４０のＥＭＳ変異体に見られないが、他の処置による他のＲｉｆｒ変異体または「自然Ｒｉｆｒ」に見られる、さらなる５つのＧ：Ｃ部位もまた報告されている（例えば、Ｇａｒｉｂｙａｎ ｅｔ．ａｌ．を参照）。Ｒｉｆｒ表現型をもたらすｒｐｏＢ遺伝子座内の利用可能なＧ：ＣのＥＭＳ標的部位の総数は１３である。これらの部位は、以下の表１に記載される。配列番号１の１５４６位及び１５９２位での変異は、それぞれ、Ｄ５１６Ｎ及びＳ５３１Ｆ置換をもたらし、Ｇａｒｉｂｙａｎ ｅｔ．ａｌにより見出されるシーケンシングされた変異の半分超（２２／４０）を占めている。最後に、Ｇａｒｉｂｙａｎ ｅｔ．ａｌ．は、Ｒｉｆｒ表現型ももたらすトランスバージョン（例えば、Ａ：Ｔ→Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ→Ｔ：Ａ、Ａ：Ｔ→Ｃ：Ｇ、Ｇ：Ｃ→Ｔ：Ａ、Ｇ：Ｃ→Ｃ：Ｇ）である２６８－ｂｐのフラグメント（配列番号３）内の追加の４９の変異について記載する。
【表1】
【0216】
実施例２．ｒｐｏＢを標的とするＣａｓ９及びＣｐｆ１ガイドＲＮＡの検証
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼＣａｓ９及びＣｐｆ１のｒｐｏＢ標的部位：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）は、関連ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と標的部位の間のハイブリダイゼーションによりプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）付近の標的遺伝子座に導くことができる、エンドヌクレアーゼである。ハイブリダイズすると、エンドヌクレアーゼは、標的部位でｄｓＤＮＡ切断を行う。ｒｐｏＢ遺伝子（配列番号３）内の２６８ｂｐのフラグメントを、ＳｐＣａｓ９及びＬｂＣｐｆ１ ＰＡＭ部位の存在について調査した。ＬｂＣｐｆ１の２つの標的部位を同定し、これらを、ｒｐｏＢ－１５４０（配列番号４）及びｒｐｏＢ－１５７８（配列番号５）と称した。表２を参照のこと。ｒｐｏＢ－１５２６（配列番号６）、ｒｐｏＢ－１５９９（配列番号７）、及びｒｐｏＢ－１６０５（配列番号８）と呼ばれる３つの標的部位をＳｐＣａｓ９について同定した。表３を参照のこと。各標的部位に対して、適切なガイドＲＮＡをコードする発現ベクターを生成した。対照として、トウモロコシＺｍ７．１遺伝子座（Ｅ．ｃｏｌｉゲノムに存在しない配列）を標的とするガイドＲＮＡをコードする発現ベクターも生成した。Ｚｍ７．１内のＣｐｆ１標的部位は、配列番号９として記載され、Ｚｍ７．１内のＣａｓ９標的部位は、配列番号１０として記載される。
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼＣａｓ９及びＣｐｆ１のｒｐｏＢ標的部位：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）及びＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）は、関連ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と標的部位の間のハイブリダイゼーションによりプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）付近の標的遺伝子座に導くことができる、エンドヌクレアーゼである。ハイブリダイズすると、エンドヌクレアーゼは、標的部位でｄｓＤＮＡ切断を行う。ｒｐｏＢ遺伝子（配列番号３）内の２６８ｂｐのフラグメントを、ＳｐＣａｓ９及びＬｂＣｐｆ１ ＰＡＭ部位の存在について調査した。ＬｂＣｐｆ１の２つの標的部位を同定し、これらを、ｒｐｏＢ－１５４０（配列番号４）及びｒｐｏＢ－１５７８（配列番号５）と称した。表２を参照のこと。ｒｐｏＢ－１５２６（配列番号６）、ｒｐｏＢ－１５９９（配列番号７）、及びｒｐｏＢ－１６０５（配列番号８）と呼ばれる３つの標的部位をＳｐＣａｓ９について同定した。表３を参照のこと。各標的部位に対して、適切なガイドＲＮＡをコードする発現ベクターを生成した。対照として、トウモロコシＺｍ７．１遺伝子座（Ｅ．ｃｏｌｉゲノムに存在しない配列）を標的とするガイドＲＮＡをコードする発現ベクターも生成した。Ｚｍ７．１内のＣｐｆ１標的部位は、配列番号９として記載され、Ｚｍ７．１内のＣａｓ９標的部位は、配列番号１０として記載される。
【表2】
【表3】
【0217】
ｐＧＵＩＤＥベクター：３つのＬｂＣｐｆ１ ｐＧＵＩＤＥベクターを作成した：ｐＧＵＩＤＥ－Ｌｂ－ｒｐｏＢ－１５４０、ｐＧＵＩＤＥ－Ｌｂ－ｒｐｏＢ１５７８、及び対照ベクターｐＧＵＩＤＥ－Ｌｂ－Ｚｍ７．１。ベクターは、ｃｒＲＮＡ配列（配列番号１２）をコードする１９ヌクレオチドＤＮＡ配列に作動可能に連結されている合成プロモーターＰ－Ｊ２３１１９（配列番号１１）；ｒｐｏＢ－１５４０（配列番号４）またはｒｐｏＢ－１５７８部位（配列番号５）またはＺｍ７．１（配列番号９）のいずれかを標的とする２３～２５ヌクレオチドのスペーサーＤＮＡ配列；それに続く、１９ヌクレオチドのｃｒＲＮＡ配列（配列番号１２）をコードするＤＮＡ配列、及びＴ７終結配列（ＵＳ２０１８００９２３６４－０００５を参照）を含むガイドＲＮＡ発現カセットを含む。
【0218】
４つのＳｐＣａｓ９ ｐＧＵＩＤＥベクターを生成した：ｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－ｒｐｏＢ－１５２６、ｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－ｒｐｏＢ１５９９、ｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－ｒｐｏＢ１６０５、及び対照ｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－Ｚｍ７．１。各ベクターは、４つの標的部位ｒｐｏＢ－１５２６（配列番号６）、ｒｐｏＢ－１５９９（配列番号７）、ｒｐｏＢ－１６０５（配列番号８）、またはＺｍ７．１（配列番号１１）のうちの１つを標的とするスペーサー配列とそれに続くＣａｓ９ガイドＲＮＡ配列（配列番号１３）をコードする１０３ヌクレオチドのＤＮＡ配列及びＴ７終結配列（ＵＳ２０１８００９２３６４－０００５を参照）に作動可能に連結されている合成プロモーターＰ－Ｊ２３１１９（配列番号１１）を有するガイドＲＮＡ発現カセットを含む。
【0219】
各Ｃａｓ９及びＣｐｆ１ ｐＧＵＩＤＥベクターは、抗生物質スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ＋）及びｐＣＤＦ複製起点に対する耐性を付与する選択マーカーの発現カセットも含んでいた。
【0220】
ｐＮＵＣＬＥＡＳＥ（ｐＮＵＣ）ベクター：４つのｐＮＵＣベクター：ｐＮＵＣ－ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１、ｐＮＵＣ－ｄＬｂＣｐｆ１、ｐＮＵＣ－Ｃａｓ９、ｐＮＵＣ－ｄＣａｓ９を標準的なクローニング手法により生成した。これは、以下に記載される。
（１）ｐＮＵＣ ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１ベクターは、ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１ヌクレアーゼの発現カセットを含む。ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１のタンパク質配列が、配列番号２５として記載される。ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１ヌクレオチド配列をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化し（配列番号１４）、５’末端で核局在化シグナル（ＮＬＳ１）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１５）に融合させ、３’末端でＮＬＳ２をコードする配列（配列番号１６）に融合させた。ヒスチジンタグ（配列番号１７）をコードするヌクレオチド配列を、ＮＬＳ１－ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１－ＮＬＳ２の５’末端に導入した。融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ－ｔａｃプロモーターを含む調節配列、バクテリオファージＴ７遺伝子１０リーダー配列、及びリボソーム結合部位（配列番号１８）に作動可能に連結されていた（Ｏｌｉｎｓ ａｎｄ Ｒａｎｇｗａｌａ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６４：１６９７３－１６９７６（１９８９）を参照）。
（２）ｐＮＵＣ ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１内のｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１のＯＲＦをコードする配列を、不活性型ＬｂＣｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１９）と置き換えることにより、ｐＮＵＣ－ｄＬｂＣｐｆ１を生成した。ＬｂＣｐｆ１タンパク質と比較して、ｄＬｂＣｐｆ１タンパク質は、８３２位にアスパラギン酸からアラニンアミノ酸への置換、及び９２５位にグルタミン酸からアラニンアミノ酸への置換を含む。ｄＬｂＣｐｆ１タンパク質の配列は、配列番号２４と記載される。これらの置換は、ＬｂＣｐｆ１のＤＮＡ切断活性の完全な消失をもたらすことが示される（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：７５９－７７１（２０１５）；及びＹａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，６７：６３３－６４５（２０１７）を参照）。
（３）ｃｙｓフリーｐＮＵＣ ＬｂＣｐｆ１内のｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１のＯＲＦをコードする配列を、ＳｐＣａｓ９遺伝子配列（配列番号２０）で置き換えることにより、ｐＮＵＣ－ＳｐＣａｓ９ベクターを生成した。
（４）ｐＮＵＣ ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１内のｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１のＯＲＦをコードする配列を、不活性型ＳｐＣａｓ９（ｄＳｐＣａｓ９）をコードするＤＮＡ配列（配列番号２１）に置き換えることにより、ｐＮＵＣ－ｄＳｐＣａｓ９ベクターを生成した。ＳｐＣａｓ９タンパク質（配列番号２３）と比較して、ｄＳｐＣａｓ９タンパク質（配列番号２２）は、１０位にアスパラギン酸からアラニンへのアミノ酸置換、及び８４０位にヒスチジンからアラニンへのアミノ酸置換があり、これにより、ＳｐＣａｓ９のＤＮＡ切断活性の完全な消失がもたらされる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６－８２１（２０１２）を参照）。
（１）ｐＮＵＣ ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１ベクターは、ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１ヌクレアーゼの発現カセットを含む。ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１のタンパク質配列が、配列番号２５として記載される。ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１ヌクレオチド配列をＥ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化し（配列番号１４）、５’末端で核局在化シグナル（ＮＬＳ１）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１５）に融合させ、３’末端でＮＬＳ２をコードする配列（配列番号１６）に融合させた。ヒスチジンタグ（配列番号１７）をコードするヌクレオチド配列を、ＮＬＳ１－ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１－ＮＬＳ２の５’末端に導入した。融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐ－ｔａｃプロモーターを含む調節配列、バクテリオファージＴ７遺伝子１０リーダー配列、及びリボソーム結合部位（配列番号１８）に作動可能に連結されていた（Ｏｌｉｎｓ ａｎｄ Ｒａｎｇｗａｌａ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６４：１６９７３－１６９７６（１９８９）を参照）。
（２）ｐＮＵＣ ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１内のｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１のＯＲＦをコードする配列を、不活性型ＬｂＣｐｆ１（ｄＬｂＣｐｆ１）をコードするＤＮＡ配列（配列番号１９）と置き換えることにより、ｐＮＵＣ－ｄＬｂＣｐｆ１を生成した。ＬｂＣｐｆ１タンパク質と比較して、ｄＬｂＣｐｆ１タンパク質は、８３２位にアスパラギン酸からアラニンアミノ酸への置換、及び９２５位にグルタミン酸からアラニンアミノ酸への置換を含む。ｄＬｂＣｐｆ１タンパク質の配列は、配列番号２４と記載される。これらの置換は、ＬｂＣｐｆ１のＤＮＡ切断活性の完全な消失をもたらすことが示される（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：７５９－７７１（２０１５）；及びＹａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，６７：６３３－６４５（２０１７）を参照）。
（３）ｃｙｓフリーｐＮＵＣ ＬｂＣｐｆ１内のｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１のＯＲＦをコードする配列を、ＳｐＣａｓ９遺伝子配列（配列番号２０）で置き換えることにより、ｐＮＵＣ－ＳｐＣａｓ９ベクターを生成した。
（４）ｐＮＵＣ ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１内のｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１のＯＲＦをコードする配列を、不活性型ＳｐＣａｓ９（ｄＳｐＣａｓ９）をコードするＤＮＡ配列（配列番号２１）に置き換えることにより、ｐＮＵＣ－ｄＳｐＣａｓ９ベクターを生成した。ＳｐＣａｓ９タンパク質（配列番号２３）と比較して、ｄＳｐＣａｓ９タンパク質（配列番号２２）は、１０位にアスパラギン酸からアラニンへのアミノ酸置換、及び８４０位にヒスチジンからアラニンへのアミノ酸置換があり、これにより、ＳｐＣａｓ９のＤＮＡ切断活性の完全な消失がもたらされる（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６－８２１（２０１２）を参照）。
【0221】
各ｐＮＵＣベクターは、抗生物質クロラムフェニコール（Ｃｍ＋）及びＣｏ１Ｅ１複製起点に対する耐性を付与する選択マーカーの発現カセットも含まれていた。
【0222】
Ｅ．ｃｏｌｉでのｇＲＮＡ活性の検証。Ｃｕｉ ａｎｄ Ｂｉｋａｒｄは、以前に、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて同族のガイドＲＮＡとのＣａｓ９の発現の結果を調査していた（Ｃｕｉ ａｎｄ Ｂｉｋａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４：４２４３－４２５１（２０１６）を参照）。それらの分析は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体を標的とし得る同族のガイドＲＮＡとの活性Ｃａｓ９タンパク質の同時形質転換は、この組み合わせがｄｓＤＮＡ切断を生じ得るので、形質転換効率の大幅な低減につながることを示した。これは、多くの場合、Ｅ．ｃｏｌｉでは致命的である。標的配列が必須遺伝子にある場合、効果がさらに顕著である。Ｅ．ｃｏｌｉゲノムに存在しない配列を標的とするガイドとの活性Ｃａｓ９タンパク質の同時形質転換／共発現は十分に許容される。同様に、全ガイドＲＮＡの組み合わせとの触媒的に不活性な／不活性型Ｃａｓ９タンパク質の共発現は非致死性である。それにより、いくつかの組み合わせが、おそらくＣＲＩＳＰＲ干渉効果のために発育遅延表現型を示し得、結合している不活性なＣａｓ９－ｇＲＮＡ複合体が必須遺伝子の適切な転写のブロックとして作用し得ることも観察された。
【0223】
異なるｐＧＵＩＤＥの活性及び不活性ヌクレアーゼとの組み合わせが上記の予想される効果を示すかどうかを試験するために、エレクトロポレーションにより、ｐＮＵＣ及びｐＧＵＩＤＥベクターを、ＫＬ１６細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｙａｌｅ）、野生型ｒｅｃＡ＋株に同時形質転換した。ｐＮＵＣ及びｐＧＵＩＤＥの組み合わせが、以下の表４に詳述される。
【表4】
【0224】
エレクトロコンピテント細胞を、標準プロトコールに従ってＥ．ｃｏｌｉ ＫＬ１６から調製し、液体窒素中、２５０μＬのアリコートで凍結させた。表２に記載の約０．７μＬのｐＮＵＣ及びｐＧＵＩＤＥプラスミドＤＮＡの組み合わせ（概算ＤＮＡ濃度５０～１５０ｎｇ／μＬを含む）を、ＫＬ１６細胞の３０μＬアリコートに添加した。Ｅ．ｃｏｌｉの標準設定（１．８ｋＶ、２５μＦの静電容量、２００オームの抵抗）を使用するＢｉｏ－Ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＩＩを使用して、１ｍｍギャップキュベットで、細胞及びＤＮＡをエレクトロポレーションした。時定数は、約４．８５～５．０５ミリ秒であった。約１ｍＬのＳ．Ｏ．Ｃ．培地を添加し、混合し、培養チューブに移し、３７℃のインキュベーター中、２８０ＲＰＭで約９０分間振盪した。次に、約２０μＬの混合物を、３８０μＬのＳ．Ｏ．Ｃ．培地（１：２０希釈に相当）で希釈し、１００μＬを適切な選択抗生物質（＋２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール（Ｃｍ）、＋５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｔ））を含有するＬＢアガープレートにプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。
【0225】
表４に示されるように、ｐＮＵＣ－ｄＬｂＣｐｆ１で同時形質転換された３つのｐＧＵＩＤＥは、二重選択プレート上に約２００～５００の均一なコロニーを生じた（表４、形質転換４～６を参照）。ｐＧＵＩＤＥ－Ｌｂ－Ｚｍ７．１を、ｐＮＵＣ－ＬｂＣｐｆ１と同時形質転換した場合、選択プレート上で約３００のコロニーが観察された（表４、形質転換３を参照）。しかし、ｐＮＵＣ－ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１と共形質転換された場合、ｒｐｏＢを標的とするＬｂＣｐｆ１ガイドを発現する両方のｐＧＵＩＤＥは、０～２つのコロニーを生じた（表４、形質転換１～２を参照）。これらの観察結果は、ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１が機能的なヌクレアーゼであることを示す。これらの観察は、Ｃｕｉ及びＢｉｋａｒｄにより行われた観察と一致し、ｒｐｏＢなどの必須の遺伝子を切断し得る複合体に対して予想される。
【0226】
同様に、４つのＳｐＣａｓ９ ｐＧＵＩＤＥを触媒的に不活性なｐＮＵＣ－ｄＳｐＣａｓ９と同時形質転換した場合、４つのプレート全てが二重選択プレート上で約２００～３００の均一なコロニーを示した（表４、形質転換１１～１４を参照）。アクティブなｐＮＵＣ－ＳｐＣａｓ９を用いるｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－Ｚｍ７．１の形質転換でも、二重選択プレート上に約２００～３００の均一なコロニーを生じた（表４、形質転換１０を参照）。しかし、ｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－ｒｐｏＢ－１５２６、ｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－ｒｐｏＢ－１５９９、またはｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－ｒｐｏＢ－１６０５をｐＮＵＣ－ＳｐＣａｓ９と同時形質転換し、０～２つのコロニーを回収した（表４、形質転換７～９を参照）。総合すると、これらのデータは、同族の活性ヌクレアーゼと対合した場合、全てのｒｐｏＢ標的化ｐＧＵＩＤＥがｒｐｏＢ遺伝子座内の切断を可能にしたことを示す。
【0227】
実施例３：ｒｐｏＢ／Ｒｉｆｒアッセイを利用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＥＭＳ誘発型変異を調査する。
ｒｐｏＢにＥＭＳにより誘発された変異の率及びスペクトルを試験するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＬ１６細胞をｐＮＵＣ－ｄＳｐＣａｓ９及びｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－Ｚｍ７．１と同時形質転換し、０．１％または１％のＥＭＳで処置した実験を実施した。得られたＲｉｆｒ変異を選択し、スコア化した。各コロニーからｒｐｏＢ遺伝子フラグメント（配列番号３）をシーケンシングし、優勢な変異を同定した。上記の実施例２で述べられたように、ｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－Ｚｍ７．１は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体を標的とすることが予想されず、したがって、陰性対照として機能する。
ｒｐｏＢにＥＭＳにより誘発された変異の率及びスペクトルを試験するために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＬ１６細胞をｐＮＵＣ－ｄＳｐＣａｓ９及びｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－Ｚｍ７．１と同時形質転換し、０．１％または１％のＥＭＳで処置した実験を実施した。得られたＲｉｆｒ変異を選択し、スコア化した。各コロニーからｒｐｏＢ遺伝子フラグメント（配列番号３）をシーケンシングし、優勢な変異を同定した。上記の実施例２で述べられたように、ｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－Ｚｍ７．１は、Ｅ．ｃｏｌｉ染色体を標的とすることが予想されず、したがって、陰性対照として機能する。
【0228】
Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換：約０．７μＬのｐＮＵＣ－ｄＳｐＣａｓ９及びｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－Ｚｍ７．１プラスミドＤＮＡ（概算濃度５０～１５０ｎｇ／μＬ）を、エレクトロコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＫＬ１６細胞の３０μＬのアリコートに添加した。上記の実施例２に記載の設定でＢｉｏ－Ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＩＩを使用して、細胞及びＤＮＡを１ｍｍギャップキュベットでエレクトロポレーションした。約１ｍＬのＳ．Ｏ．Ｃ．培地をキュベットに添加し、混合し、培養チューブに移し、３７℃のインキュベーターシェーカー中、２８０ＲＰＭで約９０分間振盪した。約２０μＬの混合物を３８０μＬのＳ．Ｏ．Ｃ．培地で希釈し（１：２０希釈）、１００μＬを＋２５μｇ／ｍＬのＣｍ、＋５０μｇ／ｍＬのＳｐｅｃｔ抗生物質を含有するＬＢプレートにプレーティングし、続いて、３７℃で一晩インキュベートした。一晩成長させた後、プレートは、約１００～４００の均一な単一コロニーを含有していた。プレートから４～５つの単一コロニーを採取し、＋２５μｇ／ｍＬのＣｍ、＋５０μｇ／ｍＬのＳｐｅｃｔを含有する２．５ｍＬの液体ＬＢ培地で混合した。培養物を、２８０ＲＰＭで振盪しながら、３７℃で一晩成長させた。翌日、飽和した一晩培養物を、３ｍＬの新鮮なＬＢ＋２５μｇ／ｍＬのＣｍ、＋５０μｇ／ｍＬのＳｐｅｃｔに１：２０の比で希釈した。３７℃で約３時間振盪（２８０ＲＰＭ）しながら成長させた後、培養物は、指数関数的に成長し、Ａ６００の吸光度測定値は、約１であった。培養物をエッペンドルフチューブ中で３つの１ｍＬのアリコートに分割し、次に、最高速度で１分間回転させた。ＬＢ上清を除去し、小さなペレットを、１ｍＬのＰＢＳに穏やかにピペッティングすることにより再懸濁し、培養チューブに移した。
【0229】
ＥＭＳ変異導入処置：約１μＬのＥＭＳ（Ｓｉｇｍａ Ｍ０８８０）を第１のチューブに添加し（０．１％のＥＭＳ、最終濃度）、約１０μＬのＥＭＳを第２のチューブに添加した（１％のＥＭＳ、最終濃度）。第３のチューブは、ＥＭＳが加えられなかった（０％のＥＭＳ）。混合後、チューブを、３７℃、１時間振盪しながら、インキュベートした。１ｍＬの培養物をエッペンドルフチューブに戻し、１分間最高速度で回転させた。ペレットを、ＰＢＳで１回洗浄して、ＥＭＳを除去し、１ｍＬのＬＢ＋２５μｇ／ｍＬのＣｍ、＋５０μｇ／ｍＬのＳｐｅｃｔに再懸濁した。これらの懸濁液を、２ｍＬのＬＢ＋２５μｇ／ｍＬのＣｍ、＋５０μｇ／ｍＬのＳｐｅｃｔに１：２０で希釈し、振盪し（２８０ＲＰＭ）、３７℃で一晩インキュベートし、回収し、増殖させた。
【0230】
Ｒｉｆｒ変異体数の決定：各一晩培養物の約１００μＬを、ＬＢ（＋２５μｇ／ｍＬのＣｍ、＋５０μｇ／ｍＬのリファンピシン）またはＬＢ（＋５０μｇ／ｍＬのリファンピシン）に２回ずつプレーティングした。０．１％及び１％のＥＭＳで処置された細胞の場合、５μＬの培養物もプレーティングした。プレートを３７℃で一晩成長させた後、３０℃でもう一晩のインキュベーションを行った。Ｒｉｆｒコロニー形成単位の数を各処置について計数し、平均ＣＦＵスコアは、以下の表５に提供される。
【表5】
【0231】
総生菌数を決定するために、０．１％のＥＭＳ処置の一晩培養物を、ＰＢＳで１：１０６に希釈し、１００μＬをＬＢ＋Ｃｍ＋Ｓｐｅｃｔプレートにプレーティングした。プレートを３７℃で一晩、続いて、３０℃でもう一晩成長させた。０．１％のＥＭＳ処置プレート由来の生存可能なＣＦＵを、２．５×１０９／ｍＬであると算出した。飽和した一晩培養物由来の生存可能なＣＦＵが、３つの処置全てでほぼ同じ（約２．５×１０９）であると仮定すると、以下の式を使用して、各処置の変異率を計算した：
変異率＝１ｍＬ当たりのＲｉｆｒ ＣＦＵ／１ｍＬ当たりの生存可能なＣＦＵ。したがって、自然変異率（０％のＥＭＳ）は、約８０／２．５×１０９＝３．２×１０－８であった。自然変異率を１とした場合、０．１％のＥＭＳは、変異率を約４０倍増加させ、１．０％のＥＭＳは、自然変異率に対して約２６００倍変異率を増加させた。
変異率＝１ｍＬ当たりのＲｉｆｒ ＣＦＵ／１ｍＬ当たりの生存可能なＣＦＵ。したがって、自然変異率（０％のＥＭＳ）は、約８０／２．５×１０９＝３．２×１０－８であった。自然変異率を１とした場合、０．１％のＥＭＳは、変異率を約４０倍増加させ、１．０％のＥＭＳは、自然変異率に対して約２６００倍変異率を増加させた。
【0232】
ディープシーケンシングによる変異の位置及び頻度の特性決定：０．１％及び１％のＥＭＳ処置アッセイの９６のＲｉｆｒコロニーを採取し、コロニーＰＣＲを実施して、２６３ヌクレオチドのｒｐｏＢフラグメントを増幅した。Ｉｌｌｕｍｉｎａバーコード付きアダプターを含むフォワード及びリバースプライマーを使用して、約２０μＬのＰＣＲ反応を、９６ウェルプレートで実施し、Ｒｉｆｒ表現型を付与する変異と関連する２６３ヌクレオチドのｒｐｏＢフラグメントを増幅するように設計した。９６ウェル全体から採取された８～１２個の試料約５μＬを実行すること及び電子ゲル上で実行することにより、反応の達成をチェックした。次に、製造元が推奨する手順を使用して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ２Ｘ３００ ＭｉＳｅｑｐｌａｔｆｏｒｍを使用して、単一Ｒｉｆｒコロニーか生じた各アンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａベースのディープシーケンスに対して処理した。７０００～１４０００のアンプリコンを各コロニーから生成した。未処理のリードを取得した後、アダプター配列をプログラムＣｕｔａｄａｐｔで除去し（Ｍａｒｔｉｎ，ＥＭＢｎｅｔ．ｊｏｕｒｎａｌ，２０１１，［Ｓｌ］，ｖ１７，ｎ１，ｐ．ｐｐ．１０－１２，ＩＳＳＮ ２２２６－６０８９）、低品質のリードをＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ０．３６）で濾過した（Ｂｏｌｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３０：２１１４（２０１４））。プログラム『ｇｌｓｅａｒｃｈ』（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１３２：１８５－２１９（２０００））を使用して、リードを参照ｒｐｏＢ配列にマッピングし、置換及び小さなＩＮＤＥＬを検出した。ｐｙｔｈｏｎスクリプトを開発して、マッピング結果を解析した。
【0233】
各Ｒｉｆｒのコロニーから増幅された配列の９０％超は、単一点変異を有する１つの優勢な配列を有していた。各コロニーで同定された優勢な変異及びシーケンシングされたコロニー間での出現頻度が図１に記載される。図１に示されるように、Ｒｉｆｒ表現型を誘発するものとして当該技術分野で以前に記載された１３の変異のうちの１０を、このＥＭＳスクリーンで同定した。ＥＭＳ変異の大部分は、ヌクレオチド位置１５８５～１６００に集中していることがわかった。変異のほとんどは、ＥＭＳ変異導入の予想される効果と一致して、Ｇ：Ｃ→Ａ：Ｔトランジション変異である。３つの非Ｇ：Ｃ→Ａ：Ｔ変異、Ｔ１５３２Ｃ、Ａ１５３８Ｃ、及びＡ１６８７Ｃも同定した。低頻度ではあるが、全ゲノム変異導入研究は、以前に、出現を報告している、ＥＭＳ処置された個体群における、ＧＣ→ＴＡ、ＡＴ→ＴＡ、ＡＴ→ＣＧ、ＧＣ→ＣＧ、及びＡＴ→ＧＣ型のトランジション及びトランスバージョンの出現を報告している（例えば、Ｍｉｎｏｉａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｏｔｅｓ，３：６９（２０１０）；及びＳｈｒａｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：５１（２０１５）を参照のこと）。４つのコロニーは、インフレームで１５ヌクレオチドの欠失があり、５つのアミノ酸の欠失がもたらされ、これは、以前に報告していない。いくつかのＲｉｆｒ変異体は、２６８ヌクレオチドのアンプリコンにおいて変異を欠き、これは、当該技術分野の研究に一致する。重要なことに、ＩＮＤＥＬは、観察されたフレームシフト変異を引き起こさず、これは、ｒｐｏＢ遺伝子が必須遺伝子であるので予想された。
【0234】
実施例４：触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びｒｐｏＢガイドＲＮＡの存在下で、ｒｐｏＢ遺伝子の標的化ＥＭＳ変異導入。
この例は、ｄＬｂＣｐｆ１またはｄＳｐＣａｓ９及びｒｐｏＢ遺伝子の領域を標的とする同族のｇＲＮＡｓで形質転換された細胞においてＥＭＳ変異導入を実施することにより、ＥＭＳ誘発変異導入が標的化領域において増強することができるかどうかを調査するために実施された実験について記載する。
この例は、ｄＬｂＣｐｆ１またはｄＳｐＣａｓ９及びｒｐｏＢ遺伝子の領域を標的とする同族のｇＲＮＡｓで形質転換された細胞においてＥＭＳ変異導入を実施することにより、ＥＭＳ誘発変異導入が標的化領域において増強することができるかどうかを調査するために実施された実験について記載する。
【0235】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＬ１６細胞を、上記の実施例３に記載のプロトコールを使用して、以下の表６で記載のｐＮＵＣ及びｐＧＵＩＤＥベクターの組み合わせで形質転換した。
【表6】
【0236】
各処置から３～５つの均一な二重形質転換コロニーをプールし、ＬＢ＋２５μｇ／ｍＬのＣｍ、＋５０μｇ／ｍＬのＳＰＥＣＴで一晩成長させた。一晩の培養物を新鮮な抗生物質培地に１：２０で希釈し、３つに分割し（形質転換２及び３の場合）、または２つに分割し（形質転換１の場合）、再成長し、その後、０．１％のＥＭＳで約５０分間処置し、次に、実施例３で記載されるように洗浄及び回収した。回復のために一晩成長させた後、各複製からの１００μＬをＬＢ＋２５μｇ／ｍＬのＣｍ、＋５０μｇ／ｍＬのリファンピシン（Ｒｉｆ）プレートにプレーティングした。２日後（３７℃で１日目、３０℃で２日目）、各処置のＲｉｆｒ ＣＦＵを点数化し、表６に報告する。形質転換１の場合、Ｒｉｆｒコロニーを単一プレートから計数した。
【0237】
変異の位置及び頻度の特性決定：個々のコロニー及びプレートスクレープ（プールされたコロニー）をシーケンシングした。９２の単一Ｒｉｆｒコロニーを３つの処置のそれぞれから採取した。次に、プレートを、ＰＢＳで満たし、スクレープし、遠沈させた。ペレット化された細胞の少量のアリコートを、各処置の『プレートスクレープ試料」の鋳型として使用した。基本的には上記の実施例３の通り、アンプリコンの生成、ディープシーケンシング、及びｒｐｏＢ変異の検出を実施した。高品質のリードを、処置１の７１コロニー、処置２の９２コロニー、及び処置３の８９コロニーから得た。また、高品質のリードを、プレートスクレープ試料から得た。
【0238】
識別された全ての変異及びその発生頻度が図２で提供される。対照処置では、ｐＮＵＣ－ｄＣａｓ９＋ｐＧＵＩＤＥ－ＳｐＺｍ７．１、ＥＭＳ変異の８１％（７１／９２）が、ｒｐｏＢ遺伝子（配列番号１）のヌクレオチド位置１５８５～１６００に集中していたことがわかった。これらは全て、標準的なＧ：Ｃ→Ａ：Ｔタイプの変異であった。これは、Ｇａｒｉｂｙａｎ ｅｔ ａｌ．及び実施例３に記載された非標的化ｄＣａｓ９を用いる０．１％のＥＭＳの結果と一致する。ｄＣａｓ９試験処置（ｐＮＵＣ－ｄＣａｓ９＋ｐＧＵＩＤＥ－Ｓｐ－ｒｐｏＢ－１５２６）では、同定された変異の９７％（１２９／１３４）は、ｒｐｏＢ遺伝子内のヌクレオチド位置１５３０～１５５４に及ぶｒｐｏＢ－１５２６ガイドＲＮＡ標的領域内に観察された（配列番号１）。対照的に、対照処置で同定された変異の８％（７／９２）のみが、この領域に入った。ｄＣａｓ９試験処置から同定され且つｇＲＮＡ標的領域内に存在する１２９の変異のうち、９４は、通常ＥＭＳに誘発されたＧ：Ｃ→Ａ：Ｔトランジションであった。
【0239】
ｐＮＵＣ－ｄＣａｓ９＋ｐＧＵＩＤｅ－Ｓｐ－ｒｐｏＢ－１５２６試験処置で、より高い頻度の二重変異体が観察された（図３）。７６のＲｉｆｒコロニーのうちの５８のアンプリコンは、第２の単一ヌクレオチド置換またはインフレームＩＮＤＥＬと同様に、サイレントＧ１５３０Ａ変異を有していた。５８のコロニーから１２種類の２次変異が同定された。これらは表７で提供される。同定された１２種類の第２の変異のうち８つは、ガイドＲＮＡ標的化領域内に位置した。１２種類の同定された第２の変異のうちの９つは、以前に、Ｒｉｆｒ表現型をもたらすことが報告されている。１つの新規変異（配列番号１の１５３７位におけるシトシンからグアニンへの）は、ｒｐｏＢタンパク質の５１３位におけるグルタミンからグルタミン酸への置換（Ｑ５１３Ｅ）（配列番号２）をもたらした。これは、当該技術分野では報告されていないが、Ｑ５１３からアルギニン、ロイシン、プロリン、及びリジンへの置換は、Ｒｉｆｒ表現型をもたらすことが知られている（Ｇａｒｉｂｙａｎ ｅｔ ａｌ．を参照）。ｒｐｏＢ（配列番号１）の１５３０位における１つのグアニンからアデノシンへの置換は、Ｒｉｆｒ変異体が、６ヌクレオチド（２アミノ酸）のインフレーム欠失を有していた。これは、以前に報告されていないが、実施例３に記載の処置から得られたアンプリコンで観察された。最後に、配列番号１の１５９０～１５９１位に新規の３ヌクレオチドのインフレーム挿入は、また、Ｒｉｆｒ表現型をもたらした。
【表7】
【0240】
ｐＮＵＣ－ｄＣｐｆ１＋ｐＧＵＩＤＥ－Ｌｂ－ｒｐｏＢ１５７８処置の場合、同定された変異の２０％（１８／８９）は、配列番号１のヌクレオチド位置１５５４～１５７７にまたがるガイドＲＮＡ標的領域内にあった。比較すると、対照処置では、変異の３％（３／９２）のみが、この領域にマッピングされた。ガイドＲＮＡ標的領域内のｄＣｐｆ１試験処置から同定された１８の変異のうち、１２は、通常ＥＭＳにより誘発されたＧ：Ｃ→Ａ：Ｔトランジションであった。
【0241】
プレートスクレープＰＣＲ試料から観察された各変異のリードの多様性及びパーセンテージは、各処置のコロニーＰＣＲから見られたものと同様の分布及び割合を示した（図２）。
【0242】
これらの結果は、細菌ゲノムの選択領域（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｐｏＢ遺伝子）を標的とするガイドＲＮＡと対合しているＳｐＣａｓ９及びＬｂＣｐｆ１などの既知のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の触媒的に不活性な／不活性型多様体を使用すること、ならびにＤＮＡ変異原（例えば、ＥＭＳ）を用いる変異導入を実施することにより、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質／ガイド複合体により標的とされた部位内で変異の大幅な増加がもたらされ得る。さらに、新規変異を回復することができ、これは、選択スクリーンの一部ではなかった。
【0243】
実施例５：機能選択のための標的化変異導入。
この例は、触媒的に不活性なプログラム可能なＤＮＡ切断酵素を、ＤＮＡ塩基改変化学的変異原と組み合わせて、酵素５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の標的化領域における変異導入を増加させることについて記載する。
この例は、触媒的に不活性なプログラム可能なＤＮＡ切断酵素を、ＤＮＡ塩基改変化学的変異原と組み合わせて、酵素５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の標的化領域における変異導入を増加させることについて記載する。
【0244】
ＥＰＳＰＳは、ホスホエノールピルビン酸及び３－ホスホシキミ酸のリン酸及びＥＰＳＰＳへの変換を触媒する酵素である。この酵素は、除草剤として農業で広く使用されている競合阻害剤グリホサートにより阻害される。ＥＰＳＰＳの構造は、決定されており、グリホサート阻害を克服する活性部位内の単一点変異体が同定されている。グリホサートの存在下で改善されたＥＰＳＰＳ多様体の選択を可能にするＥ．ｃｏｌｉを用いる細菌スクリーニングが開発されている（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５：３５０（２００７）を参照）。エラープローンＰＣＲなどの非標的化方法、または標的化アプローチを含む複数の方法で、多様体ＥＰＳＰＳ酵素を生成しており、これらは、費用がかかり、飽和変異導入ライブラリーの設計及び分子生物学技能を開発するために熟練研究者のインプットを必要とする。
【0245】
触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質／ガイドＲＮＡ複合体と組み合わせたＤＮＡ塩基改変化学的変異原は、酵素ＥＰＳＰＳの選択された領域への変異導入を増加させるために、細菌ＥＰＳＰＳ機能選択アッセイなどの活性選択と共に併用することができる。
【0246】
活性部位の内側を覆う残基などの、ＥＰＳＰＳ酵素の特定の領域を標的とするＣｐｆ１またはＣａｓ９ｇＲＮＡが設計される。いくつかの実施形態では、所望の位置（複数可）にＰＡＭ部位を含有する合成ＥＰＳＰＳ遺伝子が使用される。ＥＰＳＰＳ遺伝子を発現するＥ．ｃｏｌｉは、ｄＬｂＣｐｆ１またはｄＳｐＣａｓ９及び同族のｇＲＮＡで形質転換される。形質転換された細胞は、その後、ＥＭＳで処置され、変異導入細胞は、グリホサートによる選択下に置かれる。変異は、ＥＰＳＰＳの標的化領域でより高い割合で蓄積し、グリホサートによる選択下に置かれる場合、標的化残基に由来する耐性を与える変異の回復が増加する。
【0247】
実施例６：Ｉｎ ｐｌａｎｔａで標的化された遺伝子改変
植物における遺伝的多様性を強化するランダム化学変異導入アプローチは、変異率、処置後の生存率及び生殖不能、個体群のサイズ、ならびに配列評価のウィンドウを含む、候補遺伝子の変異を見出すための複数の要因のバランスをとる必要がある。
植物における遺伝的多様性を強化するランダム化学変異導入アプローチは、変異率、処置後の生存率及び生殖不能、個体群のサイズ、ならびに配列評価のウィンドウを含む、候補遺伝子の変異を見出すための複数の要因のバランスをとる必要がある。
【0248】
変異率が減少すると、所望な変異を見出すためにスクリーニングされる個体数は、指数関数的に増加する。ＤＮＡ塩基改変化学的変異原により誘発される局所変異率は、配列標的化酵素（例えば、ｄＣｐｆ１及びｄＣａｓ９などの触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ酵素）を利用することにより増加させることができる。局所変異率が増加すると、所望の変異を見出すためにスクリーニングされる個体数が低減する。
【0249】
このアプローチを可能にするために、触媒的に不活性化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが、化学的変異原で処置された植物細胞の核に提供される。触媒的に不活性化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ｇＲＮＡ、及びＥＭＳは、規定の死亡率（通常、５０％の死亡率）につながる用量及び曝露時間のための初期のキル曲線分析を確立するために、当該技術分野の標準的な手順に従って滴定される。
【0250】
標的化改変は、例えば、植物細胞内の触媒的に不活性化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓ９）を発現することにより、触媒的に不活性化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡもしくはｍＲＮＡを同時送達することにより、または触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ酵素及び／もしくはｇＲＮＡをコードする導入遺伝子を用いる植物細胞の安定な形質転換により、複数の手段で達成することができる。触媒的に不活性化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡの発現後に、ＥＭＳは、標的部位の改変を誘発する標準的な方法を使用して適用される。
【0251】
触媒的に不活性化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ複合体を送達するための別のアプローチは、リボヌクレオタンパク質として一過性で複合体を送達することであり、葉、花粉、プロトプラスト、胚、カルス、及びその他を含む幅広い組織型においてこれは、実施することができる。送達後または送達と同時に、ＥＭＳは、標的部位の標的化改変を誘発するために、標準的な方法を使用して適用される。
【0252】
種子または再生植物の数が増加し、当該分野で既知の標準的な方法を使用して、標的化領域の変異についてスクリーニングされる。
【0253】
実施例７：治療的処置のためのＤＮＡ損傷化学物質の接近可能性の増加。
正常なＤＮＡ複製を妨げるＤＮＡの直接的な化学改変は、がん治療に効果的であることが示されている。がん細胞は、ＤＮＡ損傷の検知／修復の能力を緩和させており、これは、高い複製速度を達成するのに役立ち、また、ＤＮＡ損傷の影響をより受けやすくする。
正常なＤＮＡ複製を妨げるＤＮＡの直接的な化学改変は、がん治療に効果的であることが示されている。がん細胞は、ＤＮＡ損傷の検知／修復の能力を緩和させており、これは、高い複製速度を達成するのに役立ち、また、ＤＮＡ損傷の影響をより受けやすくする。
【0254】
損傷したＤＮＡの複製は、細胞死の可能性を増加させ、抗がん化合物の開発に焦点を当てている。ＤＮＡアルキル化様白金化合物シス－ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（シスプラチン）は、グアニン残基、程度は低いが、アデニン残基とＤＮＡ付加物を形成する。２つの白金付加物は、同じＤＮＡ鎖の隣接塩基に形成される場合、鎖内架橋を形成する。これらの鎖内架橋がＤＮＡ複製を遮断し、修復されない場合、細胞死を引き起こす（Ｃｈｅｕｎｇ－Ｏｎｇ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０：６４８－５９（２０１３）を参照）。これらの治療は、副作用がないわけではなく、シスプラチンアナログの発見の取り組みは、非標的化組織の毒性を低減させることを目的とする（Ｂｒｕｉｊｎｉｎｃｘ ａｎｄ Ｓａｄｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１２：１９７－２０６（２００８）を参照）。
【0255】
本明細書に記載の組成物及び方法は、非標的化化学的ＤＮＡ改変治療薬の効果を増加させるために、使用されてもよい。特定の理論に拘束されることを望まないが、必須遺伝子のＤＮＡ塩基は、触媒的に不活性化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ／ガイド複合体の巻き戻し作用による化学改変に、より利用可能にすることができる。がん細胞を標的とする触媒的に不活性化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ／ガイド複合体の送達は、開発の活発な領域であり、腫瘍細胞を選択的に標的とするための経路は、腫瘍溶解性ウイルス及びマイクロインジェクションを含み得る。これらの経路は、触媒的に不活性化されたＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの選択的送達のために使用することができる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２６６：１７－２６（２０１７）を参照）。がん細胞の化学改変のために（より保護されたｄｓＤＮＡヘリックス内から標的化塩基を露出させることにより）標的化ＤＮＡを選択的に巻き戻し、利用可能にする複合効果は、がん細胞死を誘発するために必要なＤＮＡ改変化学療法剤の総投薬量を低下させることがある。必要な化学治療薬の総投薬量を低下させることにより、非標的組織への有害毒性が低減すると予想されるであろう。
【0256】
実施例８：ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ切断活性
タンパク質のシステイン残基は、システイン間に強力な可逆的結合を提供するジスルフィド架橋を形成することが可能である。標的化された方法で、Ｃｐｆ１の結合を制御及び指示するために、天然のシステインが除去される。タンパク質骨格からのシステインの除去により、ジスルフィド結合による、これらの可逆的結合の配置を制御する新しいシステイン残基の挿入の標的化が可能になる。これは、タンパク質ドメイン間のものであるか、またはバイオリスティック送達のための金粒子などの粒子に対するものであり得る。ＬｂＣｐｆ１タンパク質（ＷＯ２０１６２０５７１１－１１５０）に存在する９つのシステイン残基が、ＤＮＡ切断活性に関与するかどうかは不明である。したがって、全くシステインを含有しない変異型ＬｂＣｐｆ１タンパク質を生成し、活性について試験した。以下の９つのアミノ酸置換を含有するｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１タンパク質を生成した：Ｃ１０Ｌ、Ｃ１７５Ｌ、Ｃ５６５Ｓ、Ｃ６３２Ｌ、Ｃ８０５Ａ、Ｃ９１２Ｖ、Ｃ９６５Ｓ、Ｃ１０９０Ｐ、及びＣ１１１６Ｌ。
タンパク質のシステイン残基は、システイン間に強力な可逆的結合を提供するジスルフィド架橋を形成することが可能である。標的化された方法で、Ｃｐｆ１の結合を制御及び指示するために、天然のシステインが除去される。タンパク質骨格からのシステインの除去により、ジスルフィド結合による、これらの可逆的結合の配置を制御する新しいシステイン残基の挿入の標的化が可能になる。これは、タンパク質ドメイン間のものであるか、またはバイオリスティック送達のための金粒子などの粒子に対するものであり得る。ＬｂＣｐｆ１タンパク質（ＷＯ２０１６２０５７１１－１１５０）に存在する９つのシステイン残基が、ＤＮＡ切断活性に関与するかどうかは不明である。したがって、全くシステインを含有しない変異型ＬｂＣｐｆ１タンパク質を生成し、活性について試験した。以下の９つのアミノ酸置換を含有するｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１タンパク質を生成した：Ｃ１０Ｌ、Ｃ１７５Ｌ、Ｃ５６５Ｓ、Ｃ６３２Ｌ、Ｃ８０５Ａ、Ｃ９１２Ｖ、Ｃ９６５Ｓ、Ｃ１０９０Ｐ、及びＣ１１１６Ｌ。
【0257】
ＬｂＣｐｆ１及びｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１の標的化２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ切断活性を調査するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮａｓｅ活性アッセイを開発した。アッセイで使用されたｄｓＤＮＡ鋳型は、配列番号２６のヌクレオチド２６９～２９１の領域に及ぶ、ＬｂＣｐｆ１標的部位であるＬｂ－Ｚｍ７．１を含有する４９２ｂｐのＰＣＲ産物（配列番号２６）であった（表８を参照）。ＬｂＣｐｆ１及びその同族のＣｐｆ１－Ｚｍ７．１ ｇＲＮＡにより切断活性により、１９７ｂｐ及び２９５ｂｐのＤＮＡの消化フラグメントがもたらされるであろう。
【0258】
ヌクレアーゼを、標準的な方法でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから発現及び精製した。この目的のために、実施例２に記載のｐＮＵＣ ｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１ベクター内のｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１のＯＲＦをコードする配列を、Ｅ．ｃｏｌｉコドン最適化ＬｂＣｐｆ１をコードするＤＮＡ配列と置き換えることにより、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＮＵＣ－ＬｂＣｐｆ１を作成した（配列番号２７）。ＬｂＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡ配列及びＬｂ－Ｚｍ７．１を標的とする２３ヌクレオチドスペーサー配列を含むＬｂＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（配列番号２８）を、標準的な方法で合成した。
【表8】
【0259】
代表的な反応を、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐｈ７．６）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＤＴＴからなる切断緩衝液中で実施した。精製ヌクレアーゼは、１Ｘの切断緩衝液中で２０μＭに予め希釈し、さらに、連続希釈（通常は、１：４）を同じ緩衝液中で行った。精製ガイドＲＮＡをｄｄＨ２０で２０μＭに前希釈し、さらに、ｄｄＨ２０で段階希釈（通常１：４）を行った。リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）成分（基質ＤＮＡなし）を混合した後、反応物を室温で１０～１５分間インキュベートした。表９に記載のＲＮＰ：ＤＮＡ比を達成する濃度の鋳型ＤＮＡを添加して反応を開始した。反応を３７℃で４５分間実施し、プロテイナーゼＫ処置を用いて、６５℃で１５分間クエンチした。次に、試料を分離、２％のＴＢＥアガロースゲル上で分析した。さらに、各アッセイのヌクレアーゼタンパク質濃度を定量化するために、試料のアリコートを分離し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。Ａ２８０ｎｍでの吸光度を計算することにより、タンパク質の濃度も測定した。
【0260】
アガロースゲルの目視検査は、２０：１のＲＮＰ：ＤＮＡ比のアッセイにおいて、ＬｂＣｐｆ１及びｃｙｓフリーＬｂＣｐｆ１の両方を用いて、４５分で、９０％を超える切断が達成されたことを示した。両方の酵素は、５：１のＲＮＰ：ＤＮＡ比のアッセイにおいて、４５分で部分的な切断活性を示した（表９を参照）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、アッセイ１及び２、３及び４で同等のタンパク質濃度が確認された。総合すると、データは、ｃｙｓフリーのＬｂＣｐｆ１が標的化ｄｓＤＮＡ切断活性を保持することを示唆する。
【表9】
【0261】
実施例９．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｕｐｐ／５－ＦＵアッセイシステム
この例は、ランダム変異導入により誘発される変異率及び変異タイプを特性決定するシステムとして、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に対する耐性をもたらすＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｕｐｐ遺伝子及びノックアウト変異について記載する。
この例は、ランダム変異導入により誘発される変異率及び変異タイプを特性決定するシステムとして、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に対する耐性をもたらすＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｕｐｐ遺伝子及びノックアウト変異について記載する。
【0262】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（亜系１６８）ｕｐｐ遺伝子（配列番号２９）は、ピリミジンサルベージ酵素であるウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする。この酵素は、また、５－フルオロウラシルを、５－フルオロウリジンモノリン酸塩に直接変換し、これは、チミジル酸シンテターゼの強力な阻害剤である（Ｎｅｕｈａｒｄ，Ｊ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａ．Ｍｕｎｃｈ－Ｐｅｔｅｒｓｅｎ（１９８３）を参照）。５－ＦＵが補われたプレート上でＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを培養すると、機能ｕｐｐ遺伝子を発現する全細胞で毒性が引き起こされ、機能的なコピーを欠いている細胞が選択される（Ｆａｂｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４６：２５－３６（２００２）を参照）。これにより、ｕｐｐが、選択可能な機能喪失をもたらす様々な潜在的な変異（例えば、付加、欠失、置換）を伴う低レベルの変異導入を検出するための有用な標的になる。この遺伝子の小さなサイズ（６３０ｂｐ、２１０ａａ）は、ＰＣＲアンプリコンシーケンシング及び多数の潜在的な変異の迅速な分析を可能にする。十分なウラシルが供給される場合、ｕｐｐ遺伝子が必須ではないという点に留意すべきである。
【0263】
ｕｐｐでの光誘発型変異：可視光のみから生じた変異導入が、以前に観察されている（ＭｃＧｉｎｔｙ ａｎｄ Ｆｏｗｌｅｒ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ９５，１７１－１８１（１９８２）を参照）。最も頻繁に観察された変異は、Ｇ：Ｃ→Ｔ：Ａ塩基対のトランスバージョンである。ｕｐｐ遺伝子の最初の４４１ｎｔにおける任意のアウトオブフレーム挿入／欠失変異は、ｕｐｐ機能喪失をもたらすＣ末端の活性部位の前に、未成熟終止をもたらすであろう。Ｃ末端の活性部位の前に未成熟終止をもたらす２１の潜在的なＧ：Ｃ→Ｔ：Ａ塩基対のトランスバージョンがある（表１０で提供）。
【表10】
【0264】
実施例１０．Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株１６８のＣｐｆ１発現株の生成
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ｄＬｂＣｐｆ１の同定されたｕｐｐ標的部位：５つのＬｂＣｐｆ１標的部位（配列番号３１～３５）を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｕｐｐ遺伝子（配列番号２９）内で同定した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのａｍｙＥ遺伝子内の５つの標的配列（配列番号３６～４０）をオフターゲット対照として選択した。両方のセットの場合、ＤｅｅｐＣｐｆ１を使用して、予測スコアについて標的配列を選択した（Ｋｉｍ、２０１８）。また、非鋳型鎖を標的とすることにより、ＣＲＩＳＰＲ誘発型阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）の影響を排除するように、標的を設計した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７ ６（７），１２７３－１２８２，ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．６ｂ００３６８）。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合タンパク質ｄＬｂＣｐｆ１の同定されたｕｐｐ標的部位：５つのＬｂＣｐｆ１標的部位（配列番号３１～３５）を、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｕｐｐ遺伝子（配列番号２９）内で同定した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのａｍｙＥ遺伝子内の５つの標的配列（配列番号３６～４０）をオフターゲット対照として選択した。両方のセットの場合、ＤｅｅｐＣｐｆ１を使用して、予測スコアについて標的配列を選択した（Ｋｉｍ、２０１８）。また、非鋳型鎖を標的とすることにより、ＣＲＩＳＰＲ誘発型阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）の影響を排除するように、標的を設計した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１７ ６（７），１２７３－１２８２，ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．６ｂ００３６８）。
【表11】
【0265】
ガイド発現構築物：ｕｐｐ遺伝子及びａｍｙ遺伝子を標的とする発現カセットを含むガイドＲＮＡ発現ベクターを作成した。各カセットは、一連の直接反復を引き起こす合成の広域スペクトル構成プロモーター及びＴ７ターミネーターで終了する５つの２３ｂｐの標的化配列を含んでいた。５Ｘｕｐａ ｇＲＮＡ発現カセットは、配列番号４１と記載され、５ＸａｍｙＥ発現カセットは、配列番号４２と記載される。ガイド発現カセットを、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位間に、ｐＭｉｎｉＭＡＤの改変誘導体であるｐＢＶ０７０（Ｐａｔｒｉｃｋ ａｎｄ Ｋｅａｒｎｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７０，１１６６－１１７９（２００８））に挿入した。これらのプラスミドは、抗生物質アンピシリン（Ｅ．ｃｏｌｉクローニング用）及びエリスロマイシン（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ維持用）、ｐＢＲ３２２の複製起点（Ｅ．ｃｏｌｉクローニング用）及び温度感受性ｐＥ１９４（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ維持用）、ならびに細菌コンジュゲーションを可能にする可動フラグメント（ｍｏｂ）に対する耐性を付与する選択可能なマーカーを含んでいた。
【0266】
Ｃａｓ－タンパク質発現構築物：ｄＬｂＣｐｆ１発現プラスミドを構築した。このプラスミドは、合成広域スペクトル構成的プロモーターにより引き起こされ且つＴ７ターミネーターで終端されたｄＬｂＣｐｆ１コード配列のいずれかの末端に核局在配列を含むｄＬｂＣｐｆ１発現カセット（配列番号４３）を含んでいた。ｄＬｂＣｐｆ１発現プラスミドに、抗生物質カナマイシン、及びｐＢＲ３２２由来の複製起点（Ｅ．ｃｏｌｉクローニング用）、及び温度感受性ｐＥ１９４（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ維持用）に対する耐性を付与する選択マーカーを含んでいた。
【0267】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの形質転換：要求にかなうＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株１６８を標準的な方法で調製した。
【0268】
実施例１１：触媒的に不活性なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びｕｐｐガイドＲＮＡの存在下でのｕｐｐ遺伝子の標的化光誘発型変異導入。
光誘発型変異導入により誘発された変異の率及びスペクトルを試験するために、実験を実施し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株１６８細胞をガイド発現とｄＬｂＣｐｆ１発現プラスミドの組合せと同時形質転換した（表１２）。
光誘発型変異導入により誘発された変異の率及びスペクトルを試験するために、実験を実施し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株１６８細胞をガイド発現とｄＬｂＣｐｆ１発現プラスミドの組合せと同時形質転換した（表１２）。
【表12】
【0269】
光誘発型変異導入処置：各プラスミドの組み合わせの単一コロニーを、リンコマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）、カナマイシン（５ｍｇ／Ｌ）、及びエリスロマイシン（１ｍｇ／Ｌ）が補充されたＬＢ培地に接種し、３０℃で一晩培養した。一晩の培養物を新しい選択培地に２５倍希釈し、撹拌しながら且つ２４時間にわたって照明サイクルを用いてまたは用いずに（１５分オン、１時間オフ）、３０℃でのインキュベーション用に２４ウェルブロックに配置した。
【0270】
５－ＦＵ耐性数の決定：培養物をＬＢで１０倍に希釈し、１００μｌを６．５ｍｇ／Ｌの５－ＦＵを含有するＬＢアガープレートに３回ずつプレーティングして、耐性ＣＦＵを定量した。３７℃で２４時間インキュベーションした後、耐性ＣＦＵを計数した。
【0271】
総生菌数を決定するために、処置された培養物をさらにＬＢ中１０５に希釈し、ＬＢアガープレートにプレーティングして総ＣＦＵを定量した。３０℃で一晩インキュベートした後、総ＣＦＵを計数した。この実験の結果は、図４に提供される耐性ＣＦＵの率により要約される。この実験では、ｕｐｐ遺伝子の標的化は、ａｍｙＥ遺伝子の標的化と比較して、耐性ＣＦＵの割合が３倍増加した。光サイクリングは、暗処理と比較して、耐性ＣＦＵの割合が５倍増加した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】