特表 2022-531269 異常ヘモグロビン症の治療の有効性を予測するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-06

(54)【発明の名称】異常ヘモグロビン症の治療の有効性を予測するための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20220629BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20220629BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20220629BHJP

   A61K 31/33 20060101ALI20220629BHJP

   C12Q 1/06 20060101ALI20220629BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220629BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20220629BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20220629BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALN20220629BHJP

【ＦＩ】

A61K35/28

A61P7/00

A61K35/15 Z

A61K45/00

A61K38/19

A61K31/33

C12Q1/06 ZNA

C12N15/09 100

C12N15/09 110

C12N15/113 Z

G01N33/53 K

C12N5/0789

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021564630

(86)(22)【出願日】2020-04-29

(85)【翻訳文提出日】2021-12-28

(86)【国際出願番号】 CN2020087766

(87)【国際公開番号】W WO2020221291

(87)【国際公開日】2020-11-05

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/085116

(32)【優先日】2019-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520042939

【氏名又は名称】博雅▲輯▼因（北京）生物科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＥＤＩＧＥＮＥ ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ，Ｆｌｏｏｒ ２，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ２，２２ ＫｅＸｕｅＹｕａｎ Ｒｏａｄ，Ｃｈａｎｇｐｉｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２２０６ Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】特許業務法人栄光特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】方 日国

(72)【発明者】

【氏名】于 玲玲

(72)【発明者】

【氏名】▲楊▼ 卉慧

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ08

4B063QQ53

4B063QQ79

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS32

4B063QX01

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA17

4C084DA19

4C084ZA511

4C084ZB262

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4C086BC58

4C086GA07

4C086MA02

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4C086NA05

4C086NA06

4C086ZA51

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA51

(57)【要約】

本発明は、ａ）修飾されたＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞の第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビンを生成する能力を評価することを含み、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、ＢＣＬ１１Ａ機能を低下させるように修飾されている、評価ステップ；及び、ｂ）個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団を個体に投与することを含む治療ステップを含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療するための方法に関する。同時に、本発明はまた、個体の異常ヘモグロビン症を治療するための方法、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団を使用する治療のために異常ヘモグロビン症に罹患している個体を選択するための方法、及び異常ヘモグロビン症に罹患している個体が、個体に由来し、ＢＣＬ１１Ａの機能を低下させるように修飾された修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団を使用する治療に適するかまたは適しないかを決定する方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）修飾されたＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞（「ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ」）の第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、ＢＣＬ１１Ａ機能を低下させるように修飾されている（「修飾されたＥＶ細胞」）、評価ステップ；及び、
ｂ）前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップ
を含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療するための方法。

【請求項2】

個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップを含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、
評価ステップによる機能評価に基づいて前記個体を治療のために選択し、前記評価ステップは、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下した（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記方法。

【請求項3】

異常ヘモグロビン症に罹患している個体に、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）による治療に適するかどうかを決定する方法であって、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成した場合、前記個体が治療に適し、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成しない場合、前記個体が、前記修飾されたＴＲ細胞による治療には適しない、前記方法。

【請求項4】

前記評価ステップは、
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記治療ステップは、
ａ）前記個体の骨髄中のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員して末梢血中のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの量を増加させること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与することを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

１）前記評価ステップには、
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、
２）前記治療ステップには、
ａ）前記個体のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員すること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記修飾されたＥＶ細胞は、遺伝子修飾することによって修飾されたものである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記単離されたＥＶ細胞を修飾することは、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾することを含む、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術からなる群から選択される技術により、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾する、請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾されたＥＶ細胞の能力を評価し、前記ステップは、１）赤血球集団を得るように分化を可能にする条件下で、修飾されたＥＶ細胞を培養すること、及び２）前記赤血球によって生成されるγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルを決定することを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾されたＥＶ細胞の能力を評価することは、γ－グロビンのｍＲＮＡのレベルを決定することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾されたＥＶ細胞の能力を評価することは、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のタンパク質のレベルを決定することを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記個体は、評価ステップの前に動員または前処理を経ていない、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記評価ステップは、前記治療ステップの前に少なくとも１回繰り返される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記修飾されたＴＲ細胞は、遺伝子修飾することによって修飾されたものである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記単離されたＴＲ細胞を修飾することは、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾することを含む、請求項５～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術からなる群から選択される技術により、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾する、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

前記治療ステップにおけるＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの動員は、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）および／またはプレリキサフォル（ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）を使用して前記個体を治療することを含む、請求項５～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記治療ステップは、前記修飾されたＴＲ細胞を投与する前に前記個体を前処理することをさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記前処理は、化学療法、モノクローナル抗体療法、または全身放射線療法を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記前処理は、化学療法を含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記化学療法は、ブスルファン、シクロホスファミド、およびフルダラビンからなる群から選択される１つ以上の化学療法剤を前記個体に投与することを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記単離されたＴＲ細胞は、修飾する前に１日以上培養され、請求項５～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

個体に投与する前に、前記修飾されたＴＲ細胞を１日以上培養する、請求項５～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

修飾されたＴＲ細胞を個体に投与する前に、前記修飾されたＴＲ細胞を凍結条件下で少なくとも２４時間保存する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

凍結条件下で保存する前に、修飾されたＴＲ細胞を１日以上培養する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症、鎌状赤血球形質、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＣ形質、ヘモグロビンＳ／Ｃ症、ヘモグロビンＤ症、ヘモグロビンＥ症、サラセミア、酸素親和性が増加したヘモグロビン関連障害、酸素親和性が低下したヘモグロビン関連障害、不安定なヘモグロビン症、およびメトヘモグロビン血症からなる群から選択される、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記異常ヘモグロビン症は、β－サラセミアと鎌状赤血球貧血からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記異常ヘモグロビン症は、β０またはβ＋サラセミアである、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記個体がヒトである、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記治療ステップは、前記評価ステップの直後に実行される、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願及び相互参照）
本出願は、２０１９年４月３０日に提出されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１９／０８５１１６の優先権を享有することを主張する。その内容は、その全体が参照により本出願に取り込まれる。

【0002】

（ＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表の提出）
ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された次の内容は、参照によりその全体が本出願に組み込まれる：コンピュータ可読形式の配列表（ＣＲＦ）（ファイル名：ＦＤ００２２２ＰＣＴ－ＰＤ０１０１７－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５、記録日：２０２０年４月２２日、サイズ：１１ＫＢ）。

【0003】

本出願は、異常ヘモグロビン症の治療における遺伝子編集技術の有効性を予測するためのコンパニオン予測方法に関する。この予測方法は、疾患を治療する前に患者のＣＤ３４陽性造血幹細胞を事前に分離し、遺伝子編集技術を使用してＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位を破壊し、ガンマグロビンと胎児ヘモグロビン発現のアップレギュレーションの程度を評価し、異常ヘモグロビン症の治療における遺伝子編集されたＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーの有効性を事前に予測し、疾患の治療を支援する。

【背景技術】

【0004】

異常ヘモグロビン症（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｙ）は、異常なヘモグロビン分子構造またはグロビンペプチド鎖の異常な合成によって引き起こされる一組の遺伝性血液疾患である。異常ヘモグロビン症の２つの主な疾患タイプは、β－サラセミアと鎌状赤血球貧血である。β－サラセミアの発症メカニズムは、βグロビンペプチド鎖の遺伝子変異に起因し、ほとんどの患者は点変異であるが、少数の患者は大きいフラグメントの遺伝子欠失である。遺伝子欠失と特定の点変異により、βグロビンペプチド鎖の一部の合成が完全に阻害される可能性があり、このタイプはβ⁰ラセミアと呼ばれる。少数の点変異により、β鎖の合成部分は阻害され、それでもペプチド鎖合成の一部が保持され、このタイプはβ⁺サラセミアと呼ばれる。組み合わせによって異なる臨床症状が示される可能性がある。β－グロビン発現の欠如または減少により、血液内の過剰なα鎖は赤血球に沈着して封入体を形成し、赤血球膜の表面に付着する。これによって、赤血球膜の特性が変化し、細胞が硬くなり、変形能が低下し、慢性溶血性貧血になり、さらに骨髄組成の変化を引き起こす。β－サラセミアと同様に、鎌状赤血球貧血は、常染色体劣性遺伝病に属するが、β－サラセミアとの違いは、当該貧血症の変異部位が単一であることであり、これは、βグロビンの単一の塩基変異により、正常なβ遺伝子の６番目のコドンがＧＡＧ（グルタミン酸をコードする）からＧＴＧ（バリン）に変異したからである。変異ホモ接合体の状態では、正常なαグロビンと異常なβグロビンは、ＨｂＳと呼ばれる四量体複合体を形成し、この四量体は、酸素を持つ能力が正常なヘモグロビンの能力の半分であり、脱酸素状態で凝集してポリマーになる。形成されたポリマーの配向方向は、膜と平行で細胞膜に緊密に接触しているため、ポリマーの数がある程度になると、細胞膜は通常の凹型から鎌型に変える。鎌状赤血球は変形能に乏しく、破砕しやすくて溶血を起こし、血管の閉塞、損傷、壊死などを引き起こす（Ｄ．Ｒｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００５，７１８－７３９）。

【0005】

βサラセミア及び鎌状赤血球貧血の現在の標準的な治療法には、鉄除去剤による鉄除去を伴う長期の大量輸血療法及び同種造血幹細胞移植治療技術が含まれる。しかし、鉄除去剤による鉄除去を伴う長期の大量輸血療法は鉄過剰症につながり、患者の脾臓、肝臓、心臓、腎臓などの重要な臓器で大量の鉄が沈着することによって引き起こされる臓器の損傷は、サラセミア患児の主な死因の１つである。同種造血幹細胞移植はβサラセミアと鎌状細胞貧血を治療することができるが、ＨＬＡ完全適合型の割合が低く、移植後のＧＶＨＤ（Ｇｒａｆｔ－Ｖｅｒｓｕｓ－Ｈｏｓｔ Ｄｉｓｅａｓｅ、移植片対宿主病）、免疫拒絶反応による死亡のため、現在の治療技術は、治療を受ける患者の膨大なニーズを満たすことが困難である。異種造血幹細胞治療技術の問題を解決するために、遺伝子修飾された自己造血幹細胞に基づく導入遺伝子療法および遺伝子編集療法が出現した。その中で、遺伝子編集療法の治療スキームは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｅｒ Ｎｕｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮなどの遺伝子編集ツールを使用して、患者の自己供給造血幹細胞を編集し、胎児ヘモグロビン（Ｆｅｔａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ＨｂＦ）の発現を増加させ、その後、遺伝子修飾された自己供給造血幹細胞を患者に注入し、患者の総ヘモグロビンを正常レベルに戻し、疾患の治療という目標を達成することである。

【0006】

βサラセミアや鎌状赤血球貧血を治療するための遺伝子編集療法の主なメカニズムは、人体に自然に存在する生物学的現象、すなわちヘモグロビンスイッチ（Ｇｌｏｂｉｎ Ｓｗｉｔｃｈ）を使用することである。成人ヘモグロビン（Ａｄｕｌｔ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ））は、２つのαグロビンと２つのβグロビンで構成される四量体複合体であるが、胎児が母親の体内にある時及び出生後１２０日以内に人体のヘモグロビンは、２つのαグロビンと２つのγグロビンからなる四量体複合体であるＨｂＦであり、強い酸素運搬能力と弱い酸素放出能力が特徴であり、胎児が母親から栄養素を得るのに寄与する。しかし、胎児出生の１２０日後、人体の赤血球はＨｂＦからＨｂＡに切り替わり、正常なヘモグロビンＨｂＡを発現し始める（Ｍａｒｉｎａ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１７；Ｍｅｇａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５）。クリニックには、βサラセミアや鎌状赤血球貧血に変異があるが、臨床症状は軽度か全くない患者がいる。これは、ＨｂＦの発現を阻害する遺伝子にも変異があり、これらの遺伝子の発現が低下し、最終的には、患者の遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ＨＰＦＨ）を引き起こし、β－グロビンの欠失または減少によって引き起こされる赤血球の全体的なヘモグロビンレベルの低下を補償し、全体的なヘモグロビンを通常のレベルに近づけるか、通常のレベルに戻す（Ｖｉｎｊａｍｕｒ ＤＳ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０１８）。

【0007】

したがって、遺伝子編集方法を通じて赤血球中の胎児ヘモグロビンの発現を増加させるための適切な遺伝子標的を見つける方法は、まったく新しい治療戦略になった。しかしながら、人体では、ＨｂＦとＨｂＡの発現は動的平衡状態にあり、トレードオフの比較的定常状態であり、その調節メカニズムは非常に複雑である。研究によると、β－グロビンの上流４０～６０ｋｂの間に約１６ｋｂの長さのＬＣＲ（Ｌｏｃｕｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ，遺伝子座制御領域）があり、この領域には、ＨｂＦおよびＨｂＡの発現の調節に関与するＤＮａｓｅの５つの高感度部位が含まれている。さらに、ＧＡＴＡ－１、ＢＣＬ１１Ａ、ＦＯＧ１、ＮｕＲＤ、ＬＲＦ、ＭＹＢ、ＫＬＦ１、ＴＡＬ１、Ｅ２Ａ、ＬＭＯ２、ＬＤＢ１など、造血系の発達、及び赤血球の分化と成熟に関与するいくつかの重要な転写因子がこの領域に緊密に組み合わされており、共同でＨｂＦとＨｂＡの発現の調節に関与している（Ｇ．Ｌｅｔｔｒｅ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．２００８，１１８６９－１１８７４；Ｍａｒｉｎａ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１７；Ｍｅｇａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５）。現在、見つかった適切な標的は、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー（＋５８）の位置であり、この領域を遺伝子編集によって修飾し、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の発現をダウンレギュレートすることによってγグロビンとＨｂＦの発現に対するＢＣＬ１１Ａ遺伝子の阻害を解除し、γグロビンとＨｂＦの発現を増加させると同時に、他の系統の分化と発達に影響を与えることはなく、一部の臨床的に無症状の患者もこの部位に変異を持ち、ＨＰＦＨを引き起こしたのである（Ｕ． Ｍａｎｕｅｌａ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．２００８；Ｐ．Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００３；Ｄ．Ｅ．Ｂａｕｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３；Ｖ．Ｇ．Ｓａｎｋａｒａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８；Ｍａｔｔｈｅｗ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５）。

【0008】

ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位に対する臨床試験が実施されており、つまり、遺伝子編集技術によって開発された自家造血幹細胞移植によるβ－サラセミアおよび鎌状赤血球貧血の治療の臨床Ｐｈａｓｅ １／２試験が実施されている（Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、コードはＮＣＴ０３６５５６７８、ＮＣＴ０３７４５２８７、ＮＣＴ０３４３２３６４である）。しかしながら、患者間の個人差により、ＨｂＦに対するＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節の程度は、患者によって影響が異なる。たとえば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子がすでに特定の患者で非常に低い発現状態にあると仮定すると、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子によるＨｂＦ発現の阻害が解除されたことを示し、患者を治療するためにＨｂＦを増加させるようにＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーをさらに編集することは失敗する可能性がある。そして患者が骨髄と免疫系を取り除くために化学療法を受けた場合、これは予測できない潜在的な害を引き起こすことになる。また、γグロビンとＨｂＦ胎児ヘモグロビンの発現を調節するメカニズムは非常に複雑であり、特定の遺伝子やいくつかの遺伝子の発現を検出することによって治療法の有効性を事前に予測することは困難である。したがって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子によるγグロビンとＨｂＦ発現のアップレギュレーションの程度と可能性を事前に予測することは、遺伝子編集された自己造血幹細胞治療において緊急に解決する必要がある重要な問題である。

【発明の概要】

【0009】

本願は、ＨｂＦに対するＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節の程度を事前評価する戦略を使用し、異常ヘモグロビン症の治療における遺伝子編集技術の有効性を予測するためのコンパニオン診断方法を開発し、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位の遺伝子編集によるγグロビンとＨｂＦ発現の増加程度を事前に予測し、患者細胞におけるＢＣＬ１１Ａの発現の低下または機能の低下による該療法の失効または有効性の低下のリスクを軽減でき、臨床治療プロセスにおける患者の分級診断および治療に役立つように、ＢＣＬ１１Ａの高発現および／またはγグロビンとＨｂＦの調節に対して主要な役割を果たす患者を優先的に選択して治療し、コンパニオン診断と遺伝子編集自己造血幹細胞を用いた新しい治療スキームを開発し、既存技術の空白を埋め、遺伝子編集技術自己造血幹細胞による異常ヘモグロビン症の治療のための新しい治療戦略の迅速な発展を促進し、臨床応用のニーズを満たしている。

【0010】

本願は、異なるドナーからの末梢血に由来する造血幹細胞の動員がＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーの同じ部位の効率的な遺伝子編集後、赤血球分化後、γグロビンｍＲＮＡおよびＨｂＦタンパク質のレベルが異なる程度に増加したことを実験を通じて初めて証明し、これは、個体差がγグロビンとＨｂＦタンパク質の発現に対するＢＣＬ１１Ａの阻害能力と程度に影響を与えていることを示している。さらに、同じドナーからの末梢血由来造血幹細胞の動員は、異なるバッチの実験でＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーの同じ部位で高効率の遺伝子編集を通して、赤血球の分化後、γグロビンｍＲＮＡとＨｂＦタンパク質のレベルは安定して同様に増加する。さらなる実験結果によって明らかに、同じバッチでγグロブリンとＨｂＦタンパク質の発現がより高いドナーは、別の実験バッチでγグロブリンとＨｂＦタンパク質の発現もより高く、その逆も同様である。最後に、本願は、コンパニオン診断＋遺伝子編集された自己造血幹細胞ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位による異常ヘモグロビン症の治療のための新しい治療スキームと戦略を初めて提案する。

【0011】

一態様では、本願は、
（ａ）修飾されたＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞（「ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ」）の第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、ＢＣＬ１１Ａ機能を低下させるように修飾されている（「修飾されたＥＶ細胞」）、評価ステップ；及び、
（ｂ）前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップ
を含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療するための方法を提供する。

【0012】

一態様では、本願は、
（ａ）修飾されたＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞（「ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ」）の第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、ＢＣＬ１１Ａ機能を低下させるように修飾されている（「修飾されたＥＶ細胞」）、評価ステップ；及び、
（ｂ）前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップ
を含む、個体における胎児ヘモグロビンの発現を増強するための方法を提供する。

【0013】

一態様では、本願は、
（ａ）修飾されたＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞（「ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ」）の第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、ＢＣＬ１１Ａ機能を低下させるように修飾されている（「修飾されたＥＶ細胞」）、評価ステップ；及び、
（ｂ）前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップ
を含む、個体におけるヘモグロビンが機能するための方法を提供する。

【0014】

一態様では、本願は、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップを含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療する方法を提供し、
ここで、評価ステップによる機能評価に基づいて前記個体を治療のために選択し、前記評価ステップは、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下した（「修飾されたＥＶ細胞」）。

【0015】

一態様では、本願は、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）による治療のために異常ヘモグロビン症に罹患している個体を選択する方法を提供し、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、ここで、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成した場合、前記個体を治療のために選択する。

【0016】

一態様では、本願は、異常ヘモグロビン症に罹患している個体が、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を使用する治療に適するかどうかを決定する方法を提供し、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、ここで、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成した場合、前記個体が治療に適する。

【0017】

一態様では、本願は、異常ヘモグロビン症に罹患している個体が、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を使用する治療に適しないことを決定する方法を提供し、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、ここで、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成しない場合、前記個体が、前記修飾されたＴＲ細胞による治療に適しない。

【0018】

上記の実施形態において、分化後に必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成するための修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団の能力を評価することとは、修飾されてＢＣＬ１１Ａの機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後にγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成するレベルが、この修飾なしのＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成するγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルより、少なくとも約１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２０％増加しているかどうかを評価することをいう。

【0019】

修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団の分化後に生成したγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルは、この修飾なしのＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成したγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルより少なくとも約１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２０％増加している場合、前記個体が、前記修飾されたＴＲ細胞による治療に適する。

【0020】

上記方法の一部の実施形態において、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成したγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビンのレベルは、修飾されていないＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成したγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビンのレベルの１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、またはそれ以上のレベルである。

【0021】

上記方法の一部の実施形態において、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成した胎児ヘモグロビンは、６．５ｇ／ｄＬ、７．０ｇ／ｄＬ、７．５ｇ／ｄＬ、８．０ｇ／ｄＬ、８．５ｇ／ｄＬ、９．０ｇ／ｄＬ、９．５ｇ／ｄＬ、１０ｇ／ｄＬ、１０．５ｇ／ｄＬ、１１．０ｇ／ｄＬ末梢血を超え、またはそれ以上のレベルである。いくつかの実施形態において、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成した胎児ヘモグロビンは、約９．０～１８ｇ／ｄＬ、例えば、１０～１７ｇ／ｄＬ、１１～１５ｇ／ｄＬまたは１２～１６ｇ／ｄＬ末梢血である。

【0022】

上記方法の一部の実施形態において、前記必要なレベルのγ－グロブリンは、修飾されていないＣＤ３４陽性ＨＳＰＣと比較して、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％を超え、またはそれ以上のレベルのγ－グロブリンｍＲＮＡを生成する。

【0023】

上記方法の一部の実施形態において、前記評価ステップは、
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む。上記方法の一部の実施形態において、前記治療ステップは、
ａ）前記個体の骨髄中のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員して末梢血中のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの量を増加させること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与することを含む。

【0024】

一態様では、本願は、
１）
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップと、
２）
ａ）前記個体のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員すること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与することを含む治療ステップと
を含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療する方法を提供する。

【0025】

一態様では、本願は、
１）
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾（例えば、ＣＲＩＳＰＲ方法による遺伝子修飾）して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップと、
２）
ａ）前記個体のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員すること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾（例えば、ＣＲＩＳＰＲ方法による遺伝子修飾）して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与（例えば、１回の静脈内注射を含む静脈内注射）することを含む治療ステップと
を含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療する方法を提供する。

【0026】

上記方法の一部の実施形態において、単離されたＥＶ細胞を生成するためにＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの単離に使用される骨髄または末梢血サンプルは少量であり、例えば、骨髄サンプリング量は２０ｍｌ以下、例えば、５～２０ｍｌ、５～１０ｍｌであり、末梢血サンプリング量は３０ｍｌ以下、例えば、１０～３０ｍｌ、１５～２０ｍｌである。

【0027】

上記方法の一部の実施形態において、単離されたＴＲ細胞を生成するためにＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの単離に使用される骨髄または末梢血サンプルは大量であり、例えば、５０ｍｌ以上、例えば、５０～３００ｍｌ、１００～２００ｍｌである。

【0028】

上記方法の一部の実施形態において、前記ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞は、個体の骨髄または末梢血から単離されて得ることができる。いくつかの実施形態では、前記単離方法は、磁気ビーズ単離を含む。上記方法のいくつかの実施形態では、前記方法は、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾することを含む。上記の方法のいくつかの実施形態において、前記遺伝子修飾は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術のうちのいずれか一つの方法またはそれらの組み合わせにより、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾することを含む。上記方法のいくつかの実施形態において、６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までのヒト２番染色体の領域のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾することによってＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。上記方法のいくつかの実施形態において、ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって遺伝子修飾し、ＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。上記方法のいくつかの実施形態において、ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞をＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤によって修飾し、ＢＣＬ１１Ａ機能を低下させる。いくつかの実施形態において、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなど）、ペプチド核酸、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡなどの、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写および／または発現を阻害するタンパク質または核酸分子である。いくつかの実施形態では、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域の遺伝子の転写および／または発現を阻害するタンパク質または核酸分子である。いくつかの実施形態では、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域の遺伝子の転写および／または発現を干渉、阻害、または破壊するタンパク質または核酸分子である。いくつかの実施形態において、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域を干渉、阻害、または破壊するヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなど）、ペプチド核酸、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡである。

【0029】

上記方法の一部の実施形態において、評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾ＥＶ細胞の能力を評価し、前記ステップは、１）赤血球集団を得るように分化を可能にする条件下で、修飾されたＥＶ細胞を培養すること、及び２）前記赤血球によって生成されるγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルを決定することを含む。

【0030】

上記方法の一部の実施形態において、評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾ＥＶ細胞の能力を評価することは、γ－グロビンのｍＲＮＡレベルを決定することを含む。上記方法の一部の実施形態において、評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾ＥＶ細胞の能力を評価することは、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のタンパク質レベルを決定することを含む。上記方法の一部の実施形態において、前記個体は、評価ステップの前にＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞動員または前処理を経ていない。たとえば、個体は、評価ステップの前に、ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）やフルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）などの骨髄およびリンパ液除去薬を注射していない。上記方法のいくつかの実施形態では、前記評価ステップは、前記治療ステップの前に少なくとも１回繰り返される。

【0031】

単離されたＴＲ細胞を修飾する方法は、単離されたＥＶ細胞を修飾する方法と同じであっても異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、単離されたＴＲ細胞を修飾する方法は、単離されたＥＶ細胞を修飾する方法と同じであり得る。上記の方法のいくつかの実施形態において、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾する。上記の方法のいくつかの実施形態において、前記遺伝子修飾は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術のうちのいずれか一つの方法またはそれらの組み合わせにより、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾することを含む。上記の方法のいくつかの実施形態において、６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までのヒト２番染色体の領域のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾することによってＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。上記方法のいくつかの実施形態において、ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって遺伝子修飾し、ＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。上記方法のいくつかの実施形態において、ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞をＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤によって修飾し、ＢＣＬ１１Ａ機能を低下させる。いくつかの実施形態において、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなど）、ペプチド核酸、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡなどの、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の転写および／または発現を阻害するタンパク質または核酸分子である。いくつかの実施形態では、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域の遺伝子の転写および／または発現を阻害するタンパク質または核酸分子である。いくつかの実施形態では、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域の遺伝子の転写および／または発現を干渉、阻害、または破壊するタンパク質または核酸分子である。いくつかの実施形態において、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域を干渉、阻害、または破壊するヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなど）、ペプチド核酸、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡである。

【0032】

一部の実施形態において、治療ステップには、個体の骨髄を動員して、骨髄から大量の造血幹細胞が生成して末梢血循環系に放出されることが含まれる。ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの動員は、ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞を収集する前に（例えば、４～１０日、５～８日、６～７日）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）および／またはプレリキサフォル（ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）を前記個体に投与することを含む。

【0033】

上記方法の一部の実施形態において、前記治療ステップは、前記修飾されたＴＲ細胞を投与する前に前記個体を前処理することをさらに含む。前処理は、骨髄除去及び／またはリンパ液除去の処理を含み得る。一部の実施形態において、前記前処理は、化学療法、モノクローナル抗体療法、または全身放射線療法を含む。一部の実施形態において、前記化学療法は、ブスルファン、シクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、およびフルダラビンからなる群から選択される１つ以上の化学療法剤を前記個体に投与することを含む。

【0034】

上記方法の一部の実施形態において、前記治療ステップは、２ｘ１０⁶以上、５ｘ１０⁶以上、１ｘ１０⁷以上、２ｘ１０⁷以上の細胞／ｋｇ体重の修飾されたＴＲ細胞を個体に投与（例えば、１回の静脈内注射を含む静脈内注射）することを含む。

【0035】

一部の実施形態において、単離されたＴＲ細胞は、修飾する前に１日以上培養され、その後、単離されたＴＲ細胞を修飾する。一部の実施形態において、個体に投与する前に、前記修飾されたＴＲ細胞を１日以上（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日）培養する。一部の実施形態において、修飾されたＴＲ細胞を個体に投与する前に、修飾されたＴＲ細胞を凍結条件下で少なくとも２４時間保存する。一部の実施形態において、凍結条件下で保存する前に、修飾されたＴＲ細胞を１日以上（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日）を培養する。

【0036】

上記方法の一部の実施形態において、前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症、鎌状赤血球形質、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＣ形質、ヘモグロビンＳ／Ｃ症、ヘモグロビンＤ症、ヘモグロビンＥ症、サラセミア、酸素親和性が増加したヘモグロビン関連障害、酸素親和性が低下したヘモグロビン関連障害、不安定なヘモグロビン症、およびメトヘモグロビン血症からなる群から選択される。一部の実施形態において、前記異常ヘモグロビン症は、β－サラセミアと鎌状赤血球貧血からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記異常ヘモグロビン症は、β０またはβ＋サラセミアである。

【0037】

上記方法の一部の実施形態において、前記個体はヒトである。一部の実施形態において、前記個体は３５歳未満のヒトである。一部の実施形態において、前記個体は男性である。一部の実施形態において、前記個体は女性である。一部の実施形態において、前記個体は、心臓、肝臓、肺、または脾臓の合併症のないヒトである。一部の実施形態において、治療前の前記個体のヘモグロビンレベルは、５．０ｇ／ｄＬ、６．０ｇ／ｄＬ、７．０ｇ／ｄＬ、８．０ｇ／ｄＬ、９．０ｇ／ｄＬ末梢血以下である。上記の方法のいくつかの実施形態では、前記治療ステップは、前記評価ステップの直後に実行される。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡコーディング遺伝子（配列番号１）およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊する２つのｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２をそれぞれエレクトロポレーションにより、５人の異なるサラセミア患者と２人の健康なドナーの動員末梢血由来の造血幹細胞に形質転換し、４日後、「Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ Ａｎａｌｙｓｉｓ」オンラインソフトウェア解析により、インデルス生成効率の統計分析が行われことを示す図である。

【図2】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊する２つのｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２をそれぞれエレクトロポレーションにより、５人の異なるサラセミア患者と２人の健康なドナーの動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞に形質転換して赤血球分化をし、１８日後に、赤血球分化の効率を表すものとして、ヒトＣＤ７１とヒトＣＤ２３５ａとの２つの膜タンパク質の発現比を検出したことを示す図である。対照群は、遺伝子編集されていない細胞を表し、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２はそれぞれ２つのｓｇＲＮＡ遺伝子編集がされた細胞を表す。

【図3】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊する２つのｓｇＲＮＡ、すなわち、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２をそれぞれエレクトロポレーションにより、５人の異なるサラセミア患者と２人の健康なドナーの動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞に形質転換して赤血球分化をし、１８日後に、ＨＢＧ（γ－グロビン）遺伝子ｍＲＮＡの発現を蛍光定量ＰＣＲによって検出したことを示す図である。対照群は、遺伝子編集されていない細胞を表す。実験群は、それぞれ２つのｓｇＲＮＡ遺伝子編集がされた細胞を表す。Ｎは３回の実験の繰り返しを表す。ＨＢＧ遺伝子とＧＡＰＤＨ遺伝子は正規化された。

【図4A】図４Ａは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊するｓｇＲＮＡ－２をエレクトロポレーションにより２人の異なる健康なドナーの動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の３つのバッチの実験に形質転換し、４日後、「Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ Ａｎａｌｙｓｉｓ」オンラインソフトウェア解析により、インデルス効率の統計解析が行われことを示す図である。図４Ｂは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊するｓｇＲＮＡ－２をエレクトロポレーションにより１０人のサラセミア患者の動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の複数のバッチの実験に形質転換し（患者ドナー１は３つのバッチ、患者ドナー６、患者ドナー９、及び患者ドナー１０はそれぞれ２つの独立したバッチ）、２日後、「Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ Ａｎａｌｙｓｉｓ」オンラインソフトウェア解析により、インデルス生成効率の統計解析が行われことを示す図である。

【図4B】図４Ａは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊するｓｇＲＮＡ－２をエレクトロポレーションにより２人の異なる健康なドナーの動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の３つのバッチの実験に形質転換し、４日後、「Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ Ａｎａｌｙｓｉｓ」オンラインソフトウェア解析により、インデルス効率の統計解析が行われことを示す図である。図４Ｂは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊するｓｇＲＮＡ－２をエレクトロポレーションにより１０人のサラセミア患者の動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の複数のバッチの実験に形質転換し（患者ドナー１は３つのバッチ、患者ドナー６、患者ドナー９、及び患者ドナー１０はそれぞれ２つの独立したバッチ）、２日後、「Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ Ａｎａｌｙｓｉｓ」オンラインソフトウェア解析により、インデルス生成効率の統計解析が行われことを示す図である。

【図5】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊するｓｇＲＮＡ－２をエレクトロポレーションにより２人の異なる健康なドナーの動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の３つのバッチの実験に形質転換して赤血球分化をし、１８日後に、赤血球分化の効率を表すものとして、ヒトＣＤ７１とヒトＣＤ２３５ａとの２つの膜タンパク質の発現を検出したことを示す図である。対照群は、遺伝子編集されていない細胞を表し、実験群はｓｇＲＮＡ－２遺伝子編集がされた細胞を表す。

【図6】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊するｓｇＲＮＡ－２をエレクトロポレーションにより１０人のサラセミア患者の動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の複数のバッチの実験に形質転換して赤血球分化をし、１８日後に、赤血球分化の効率を表すものとして、ヒトＣＤ７１とヒトＣＤ２３５ａとの２つの膜タンパク質の発現を検出したことを示す図である。対照群は、遺伝子編集されていない細胞を表し、実験群はｓｇＲＮＡ－２遺伝子編集がされた細胞を表す。

【図7】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊するｓｇＲＮＡ－２が１人目の健康なドナーの動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の３つのバッチをエレクトロポレーションにより形質転換して赤血球分化実験をし、分化して１８日後に、ＢＣＬ１１Ａ、ＨＢＧ（γ－グロビン）などの遺伝子ｍＲＮＡの発現を蛍光定量ＰＣＲによって検出したことを示す図である。対照群は、遺伝子編集されていない細胞を表す。実験群は、ｓｇＲＮＡ－２遺伝子編集がされた細胞を表す。Ｎ＝３回の実験を繰り返した。ＨＢＧ遺伝子とＢＣＬ１１Ａ遺伝子はそれぞれＧＡＰＤＨ遺伝子と正規化された。

【図8】Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊するｓｇＲＮＡ－２が２人目の健康なドナーの動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の３つのバッチをエレクトロポレーションにより形質転換して赤血球分化実験をし、分化して１８日後に、ＢＣＬ１１Ａ、ＨＢＧ（γ－グロビン）などの遺伝子ｍＲＮＡの発現を蛍光定量ＰＣＲによって検出したことを示す図である。対照群は、遺伝子編集されていない細胞を表す。実験群は、ｓｇＲＮＡ－２遺伝子編集がされた細胞を表す。Ｎ＝３回の実験を繰り返した。ＨＢＧ遺伝子とＢＣＬ１１Ａ遺伝子はそれぞれＧＡＰＤＨ遺伝子と正規化された。

【図9A】図９Ａは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊するｓｇＲＮＡ－２が１０人のサラセミア患者の動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の複数のバッチをエレクトロポレーションにより形質転換して赤血球分化実験をし、分化して１８日後に、分化した赤血球におけるＨｂＦの発現比をフローサイトメトリーで検出したことを示す図である。対照群は、遺伝子編集されていない細胞を表す。実験群は、ｓｇＲＮＡ－２遺伝子編集がされた細胞を表す。図９Ｂは、異なるサラセミア患者由来の実験群ＨｂＦ＋％と対照群ＨｂＦ＋％の倍数の統計解析を示す図である。

【図9B】図９Ａは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、およびＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーを破壊するｓｇＲＮＡ－２が１０人のサラセミア患者の動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞の複数のバッチをエレクトロポレーションにより形質転換して赤血球分化実験をし、分化して１８日後に、分化した赤血球におけるＨｂＦの発現比をフローサイトメトリーで検出したことを示す図である。対照群は、遺伝子編集されていない細胞を表す。実験群は、ｓｇＲＮＡ－２遺伝子編集がされた細胞を表す。図９Ｂは、異なるサラセミア患者由来の実験群ＨｂＦ＋％と対照群ＨｂＦ＋％の倍数の統計解析を示す図である。

【図10】サラセミア患者１由来の実験群ＨｂＦ＋％と対照群ＨｂＦ＋％の倍数の統計解析を示す図である。ｎは３回の実験を示す。

【図11】異常ヘモグロビン症を治療するためのＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位の遺伝子編集の新しい治療スキームの概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0039】

本出願は、ＢＣＬ１１Ａの機能を低下させることにより、例えば、ゲノム編集技術によって造血幹細胞のＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位を破壊し、遺伝子編集された造血幹細胞の赤血球分化を実行し、γグロビンと胎児ヘモグロビンの発現のアップレギュレーションの程度を評価することにより、遺伝子編集技術が、βサラセミアや鎌状赤血球貧血などの異常ヘモグロビン症の治療に有効かどうか、または有効性の高さを予測することができる。

【0040】

具体的には、本願は、
（ａ）修飾されたＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞（「ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ」）の第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、第１の集団の修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが個体に由来し、ＢＣＬ１１Ａ機能を低下させるように修飾されている（「修飾されたＥＶ細胞」）、評価ステップ；及び、
（ｂ）前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップ
を含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療するための方法を提供する。上記方法の実施形態において、該第１の集団および／または第２の集団は、６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までのヒト２番染色体の領域のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって遺伝子修飾をし、配列番号３～配列番号２５から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡを前記ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞に導入してＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集することを含む）ことによってＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。

【0041】

一態様では、本願は、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップを含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療する方法を提供し、ここで、評価ステップによる機能評価に基づいて前記個体を治療のために選択し、前記評価ステップは、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、第１の集団の修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下した（「修飾されたＥＶ細胞」）。上記方法の実施形態において、該第１の集団および／または第２の集団は、６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までのヒト２番染色体の領域のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって遺伝子修飾をし、配列番号３～配列番号２５から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡを前記ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞に導入してＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集することを含む）ことによってＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。

【0042】

一態様では、本願は、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）による治療のために異常ヘモグロビン症に罹患している個体を選択する方法を提供し、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、ここで、第１の集団の修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記第１の集団の修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成した場合、前記個体を治療のために選択する。上記方法の実施形態において、該第１の集団および／または第２の集団は、６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までのヒト２番染色体の領域のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって遺伝子修飾をし、配列番号３～配列番号２５から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡを前記ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞に導入してＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集することを含む）ことによってＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。

【0043】

一態様では、本願は、
１）
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾（例えば、ＣＲＩＳＰＲ方法による遺伝子修飾）して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップと、
２）
ａ）前記個体のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員すること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾（例えば、ＣＲＩＳＰＲ方法による遺伝子修飾）して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与（例えば、１回の静脈内注射を含む静脈内注射）することを含む治療ステップと
を含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療する方法を提供する。上記方法の実施形態において、該第１の集団および／または第２の集団は、６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までのヒト２番染色体の領域のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって遺伝子修飾をし、配列番号３～配列番号２５から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡを前記ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞に導入してＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集することを含む）ことによってＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。

【0044】

上記方法の一部の実施形態において、単離されたＥＶ細胞を生成するためにＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの単離に使用される骨髄または末梢血サンプルは少量であり、例えば、骨髄サンプリング量は２０ｍｌ以下、例えば、５～２０ｍｌ、５～１０ｍｌであり、末梢血サンプリング量は３０ｍｌ以下、例えば、１０～３０ｍｌ、１５～２０ｍｌである。

【0045】

上記方法の一部の実施形態において、単離されたＴＲ細胞を生成するためにＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの単離に使用される骨髄または末梢血サンプルは大量であり、例えば、５０ｍｌ以上、例えば、５０～３００ｍｌ、１００～２００ｍｌである。

【0046】

上記方法の一部の実施形態において、前記ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞は、個体の骨髄または末梢血から単離されて得ることができる。いくつかの実施形態では、前記単離方法は、磁気ビーズ単離を含む。例えば、超常磁性ＭＡＣＳ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ＭＡＣＳマイクロ磁気ビーズ）を用いて骨髄または末梢血中の細胞を特異的に標識し、磁気標識後、これらの細胞を強力で安定した磁場に配置された選別カラム（選別カラムのマトリックスは、高勾配磁場を築く）に通す。磁気標識された細胞はカラムに残り、標識されていない細胞は流出する。選別カラムを磁場から外すと、カラム内に残った磁気標識された細胞は溶出でき、これによって、標識された細胞集団と標識されていない細胞集団の両方を取得することができる。具体的な実施形態において、Ｆｉｃｏｌｌ液体密度勾配遠心分離法を使用して、異なる成分の比重に差があり、低速密度勾配遠心分離により、血液中の異なる細胞層を分離することができる。赤血球と顆粒球の密度は成層液体の密度より高く、ｆｉｃоｌｌ液体に会ったら、赤血球はすぐにひも状に凝縮してチューブの底に蓄積する。成層液体の密度に相当する単核細胞のみが血漿層と成層液体、すなわち、造血幹細胞が存在する白い膜層との間に濃縮される。後続の磁気ビーズ選別によってＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞を取得することができる。

【0047】

一態様では、本願は、異常ヘモグロビン症に罹患している個体が、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を使用する治療に適するかどうかを決定する方法を提供し、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、ここで、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成した場合、前記個体が治療に適する。

【0048】

一態様では、本願は、異常ヘモグロビン症に罹患している個体が、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を使用する治療に適しないことを決定する方法を提供し、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、ここで、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成しない場合、前記個体が、前記第２の集団の修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ（「修飾されたＴＲ細胞」）による治療に適しない。

【0049】

「造血幹細胞」とは、強力な増殖能、多方向分化能、及び自己再生能を有する細胞集団のことである。造血幹細胞は、さまざまな血球を分化・補充するだけではなく、幹細胞の特性と数量を自己再生により維持することもできる。造血幹細胞は分化および増殖能力が異なり、異質である。多能性造血幹細胞は最も原始的であり、最初に定方向多能性造血幹細胞、例えば、顆粒球、赤血球、単核、及び巨核球‐血小板を生成できる骨髄造血幹細胞、及びＢリンパ球とＴリンパ球を生成できるリンパ幹細胞など、に分化する。この二種の幹細胞は、造血幹細胞の基本的な特徴を持っていながらわずかに分化し、それぞれ「骨髄成分」とリンパ球の発生に関与するので、定方向多能性造血幹細胞と呼ばれる。これらはさらに造血前駆細胞に分化する。この細胞は原始的な血球でもあるが、造血幹細胞の多くの基本的な特徴を失っている。例えば、多方向分化能力を失って、１系統または密接に関連する２系統の細胞にしか分化できなくなったり、繰り返し再生する能力を失い、数量を補うために造血幹細胞の増殖分化に依存するしかなくなったり、増殖の可能性が限られており、数回しか分割することができなくなったりする。造血前駆細胞が分化して生成できる血液細胞株の数に応じて、また単能性造血前駆細胞（１つの血液細胞株のみに分化する）とオリゴ能性造血前駆細胞（２～３つの血液細胞株に分化できる）に分けられる。本発明の用語の「造血幹細胞／前駆細胞」と「造血幹細胞」とは、取り替えて使用することができ、多能性造血幹細胞、定方向多能性造血幹細胞、及び造血前駆細胞を含み、異質性の異なる造血幹細胞の総称である。

【0050】

本出願に記載の「ＣＤ３４陽性造血幹／前駆細胞」は、ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ、ＨＳＰＣ）と略され、表面にＣＤ３４マーカーを発現し、造血機能を持っている幹細胞および前駆細胞の集団を指す。たとえば、フローサイトメトリーと蛍光標識された抗ＣＤ３４抗体を使用して、ＣＤ３４陽性の造血幹細胞／前駆細胞を検出およびカウントできる。

【0051】

具体的な実施形態において、ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞は、造血起源の細胞を含む生物（個体）から単離されるまたは得られる。「単離」とは、元の環境から取り出すことを意味する。たとえば、細胞は、その自然な状態で通常に付随するコンポーネントの一部またはすべてから分離されている場合、その細胞は単離されている。

【0052】

造血幹細胞／前駆細胞は、大腿骨、寛骨、肋骨、胸骨および他の骨を含む成人の未分画または分画された骨髄から取得または単離することができる。造血幹細胞および前駆細胞は、針と注射器を使用して寛骨から直接取得または分離するか、血液から取得できる。通常、Ｇ－ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）などの造血幹細胞動員剤で前処理した後の血液から得られる。造血幹細胞および前駆細胞の他の供給源には、臍帯血、胎盤血、および動員された個体の末梢血が含まれる。

【0053】

個体（骨髄や末梢血など）から細胞集団を単離して取得した後、それらをさらに精製して、ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞を取得することができる。例えば、単離された細胞集団における成熟した系統指向性細胞は、免疫化によって、例えば、一連の「系統」抗原（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、およびＣＤ２３５ａ）に結合した抗体を使用して固体マトリックスを標記してから、ＣＤ３４陽性抗原に結合した抗体で元の造血幹細胞と前駆細胞を単離することによって除去することができる。様々な細胞源から造血幹細胞および前駆細胞を精製するためのキットが市販されており、特定の実施形態において、これらのキットは、本発明の方法と共に使用することができる。

【0054】

「ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞」は、ＣＤ３４陽性細胞が豊富な細胞集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞集団を表すことができる。

【0055】

「修飾された」細胞とは、生物学的または化学的方法によって分子レベルまたは細胞レベルで変化した細胞を指す。例えば、単離されたＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞（「ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ」）は、遺伝子編集方法、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、ＲＮＡ編集またはＲＮＡｉ技術によってＢＣＬ１１Ａ遺伝子或いはそのコーティングＲＮＡを破壊し、ＢＣＬ１１Ａの機能が低下した修飾されたＥＶ細胞または修飾されたＴＲ細胞を生成する。また、ヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなど）、ペプチド核酸、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡなどのＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤により、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の機能を阻害し、単離されたＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞（「ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ」）に対する修飾を実現し、修飾されたＥＶ細胞または修飾されたＴＲ細胞を生成することができる。

【0056】

ＣＤ３４陽性
本明細書の「ＥＶ細胞」は、本明細書で評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、ＥＶ）に使用される細胞を表し、「ＴＲ細胞」は、本明細書で治療（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、ＴＲ）に使用される細胞を表す。

【0057】

造血幹細胞の「動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」とは、造血微小環境内の造血幹細胞が、動員剤の影響を受けた後、特定の骨髄微小環境から末梢循環に移動するプロセスを指す。

【0058】

異常ヘモグロビン症（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｏｐａｔｈｙ）は、異常なヘモグロビン分子構造またはグロビンペプチド鎖の異常な合成によって引き起こされる一組の遺伝性血液疾患である。その臨床症状として、溶血性貧血、メトヘモグロビン血症、またはヘモグロビン酸素親和性の増加または減少による組織低酸素症または代償性赤血球増加によるチアノーゼが挙げられる。

【0059】

「ヘモグロビン」は、グロビンとヘムからなる結合タンパク質である。グロビン分子には２対のペプチド鎖があり、１対はα鎖、もう１対は非α鎖であり、β、γ、δ、ξ（α鎖に似た構造を有する）及びεの５種類がある。ヒトヘモグロビンは、２対（４つ）のヘモグロビンモノマー（各ペプチド鎖が１つのヘムに接続されてヘモグロビンモノマーを形成する）が特定の空間的関係に従って結合し、ＨｂＡ（またはＨｂＡ１、α２β２）、ＨｂＡ２（α２δ２）およびＨｂＦ（α２γ２）などの四量体を構成する。その中で、ＨｂＦ（α２γ２）は胎児ヘモグロビンの四量体である。

【0060】

本明細書で使用する「ＢＣＬ１１Ａ」は転写因子であり、レトロウイルスの結合部位としてマウスで最初に発見され、Ｅｖｉ９と名付けられた。その後、この遺伝子はヒトゲノムでも発見され、２番染色体の短腕２ｐ１３部位に位置付けられる。

【0061】

修飾によりＢＣＬ１１Ａの機能が低下することは、遺伝子修飾（例えば、ＤＮＡレベルおよび／またはＲＮＡレベルの遺伝子編集）などの修飾、またはＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤（例えば、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子に対するヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなど）、ペプチド核酸、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）を添加することによって、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子を破壊、発現および／または転写を阻害、弱体化、遮断、干渉することである。

【0062】

本出願で使用されたように、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」は遺伝子編集技術であり、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのような、自然に存在するまたは人工的に設計された様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むが、これらに限られていない。自然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ）は、細菌と古細菌が長期的な進化中に形成した適応性免疫防御であり、侵入するウイルスおよび外因性ＤＮＡと対抗することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の作動原理は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＮＡ）が塩基対を通してｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＲＮＡ）と結合してｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体を形成し、この複合体は、ヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質をガイドしてｃｒＲＮＡとペアになっている配列標的部位で二本鎖ＤＮＡを切断する。ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡを人工的に設計することにより、ガイド作用を有するｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を改変形成し、Ｃａｓ９がＤＮＡを部位特異的に切断することをガイドするようにすることができる。ＲＮＡ指向性ｄｓＤＮＡ結合タンパク質として、Ｃａｓ９エフェクターヌクレアーゼは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質に共局在化することができるため、巨大な改変可能性を有する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、クラス１、クラス２、またはクラス３のＣａｓタンパク質が使用可能である。本発明の一部の実施形態では、前記方法にはＣａｓ９が使用される。その他の適用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＷＯ２０１３１７６７７２、ＷＯ２０１４０６５５９６、ＷＯ２０１４０１８４２３、ＵＳ８，６９７，３５９、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１２０６８、ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１２０２７に記載されているシステムと方法を含むが、これらに限られていない。

【0063】

上記方法のいくつかの実施形態では、前記方法は、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾することを含む。上記の方法のいくつかの実施形態において、前記遺伝子修飾は、
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術のうちのいずれか一つの方法またはそれらの組み合わせにより、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾することを含む。

【0064】

本発明のいくつかの実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、遺伝子修飾（例えば、（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、ＲＮＡ編集またはＲＮＡｉ）から選択される）方法によって破壊される（例えば、ＢＣＬ１１ａの発現または機能を亢進する核酸配列に影響を与える）。前記ＢＣＬ１１ａエンハンサーについては、例えば、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ［Ｓｃｉｅｎｃｅ］、Ｖｏｌ．３４２、２０１３、第２５３～２５７頁を参照されたい。前記ＢＣＬ１１ａエンハンサーの１つの例は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列である（例えば、ｈｇ３８に記録された位置＋５５：Ｃｈｒ２：６０４９７６７６－６０４９８９４１；＋５８：Ｃｈｒ２：６０４９４２５１－６０４９５５４６；＋６２：Ｃｈｒ２：６０４９０４０９－６０４９１７３４に位置するか、またはそれに対応する）。前記ＢＣＬ１１ａエンハンサーの１つの例は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列の＋６２領域である。前記ＢＣＬ１１ａエンハンサーの１つの例は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列の＋５８領域である（ＢＣＬ１１Ａ遺伝子５８Ｋ部位１５０ｂｐ配列：ｃｔｇｃｃａｇｔｃｃｔｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｃｃｃａｃｇｃｃｃｃｃａｃｃｃｔａａｔｃａｇａｇｇｃｃａａａｃｃｃｔｔｃｃｔｇｇａｇｃｃｔｇｔｇａｔａａａａｇｃａａｃｔｇｔｔａｇｃｔｔｇｃａｃｔａｇａｃｔａｇｃｔｔｃａａａｇｔｔｇｔａｔｔｇａｃｃｃｔｇｇｔｇｔｇｔｔａｔｇｔｃｔａａｇａｇｔａｇａｔｇｃｃ）（配列番号２）。いくつかの実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列の＋５５領域である。

【0065】

上記方法のいくつかの実施形態において、６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までのヒト２番染色体の領域のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾することによってＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。上記方法のいくつかの実施形態において、ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって修飾し、ＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。いくつかの実施形態において、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域の遺伝子の転写および／または発現を阻害するタンパク質または核酸分子である。いくつかの実施形態では、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域の遺伝子の転写および／または発現を干渉、阻害、または破壊するタンパク質または核酸分子である。いくつかの実施形態において、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域を干渉、阻害、または破壊するヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなど）、ペプチド核酸、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡである。上記方法のいくつかの実施形態において、前記造血幹細胞の２番染色体の６０４９５２１９番目から６０４９５３３６番目までのＢＣＬ１１Ａゲノム領域を遺伝子編集技術によって破壊してＢＣＬ１１Ａ機能を低下させる。上記方法のいくつかの実施形態において、前記遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術、ＲＮＡ編集技術、ＲＮＡｉ技術である。上記方法のいくつかの実施形態において、遺伝子編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である。上記方法のいくつかの実施形態において、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム標的ヌクレオチド配列は、配列番号３～配列番号２５から選択されるいずれかの配列と相補的である。

【0066】

上記方法のいくつかの実施形態において、配列番号３～配列番号２５から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡを前記ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞に導入してＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集し、ＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。上記方法のいくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたものである。上記方法のいくつかの実施形態において、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／または３つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修飾である。上記方法のいくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとを一緒にＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞に導入する。上記方法のいくつかの実施形態において、エレクトロポレーションによってｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとを一緒に造血幹細胞に導入する。上記方法のいくつかの実施形態において、前記エレクトロポレーション条件は、２００～６００Ｖ、０．５～２ｍｓである。

【0067】

細胞の「分化」とは、同じ供給源からの細胞が、異なる形態学的構造および機能的特徴を有する細胞群を徐々に生成するプロセスを指す。

【0068】

造血幹細胞から赤血球への「分化」には、造血幹細胞期、赤血球前駆細胞期、赤血球前駆細胞（初代赤血球から後期赤血球）の増殖および分化期、網状赤血球の増殖および成熟過程、ならびに網状赤血球が末梢血から放出され、成熟して赤血球になる段階を含む。造血幹細胞期：造血幹細胞は主に骨髄、脾臓、肝臓、その他の造血組織に存在することが現在知られている。末梢血にも少量に循環している。赤血球前駆細胞期：赤血球前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）期では、細胞は造血幹細胞と赤血球前駆細胞の間の細胞群である。造血幹細胞は、骨髄造血微小環境の影響下で赤血球前駆細胞に分化する。造血微小環境には、微小血管系、神経系、および造血間質が含まれる。体液性因子とサイトカインは、造血幹細胞の分化に特別な効果と影響を及ぼす。原始赤血球、初期の若い赤血球、中期の若い赤血球、後期の若い赤血球を含む赤血球前駆細胞期および網状赤血球期を経て成熟した赤血球に到達する。

【0069】

細胞成熟の過程は、ヘモグロビンが増加し、細胞核の活性が減少する過程である。細胞が成熟するにつれて、有核赤血球のヘモグロビン含有量は増加し続け、ＲＮＡ含有量は減少し続ける。赤血球中のヘモグロビンの増加により、細胞核は活性を失い、ＤＮＡまたはＲＮＡを合成しなくなる。実験により、これはヘモグロビンが核膜の細孔を通って核に入り、ヌクレオヒストン（ｎｕｃｌｅｏｈｉｓｔｏｎｅｓ）に作用して染色体の不活性化と核凝縮の促進をもたらすからであることが確認されている。後期の未成熟赤血球は分裂を続ける能力を失い、その後、細胞核は濃縮されて脱出し、単核マクロファージに飲み込まれるか、脾臓に断片化して溶解し、細胞核のない網状赤血球になる。ヘモグロビンは、成熟した赤血球の段階ではもはや合成されない。細胞内ヘモグロビン濃度の上昇は細胞核の活性を失わせるという理論によれば、成熟中の赤血球の分裂数と細胞の最終的なサイズは、ヘモグロビン合成の速度と一定の関係がある。細胞が成熟するにつれて、赤血球細胞の直径は徐々に減少し、細胞の体積も徐々に減少する。これは、細胞内でヘモグロビン、基質タンパク質、及びさまざまな酵素を合成するために使用される一部の細胞小器官（ミトコンドリア、ゴルジ体、ポリソームなど）が徐々に減少し、細胞小器官も徐々に変性して消失するからである。遺伝子活性は、赤血球成熟の過程でのグロビンの発現によって支配される。グロビンは原始赤血球のタンパク質の０．１％しか占めておらず、網状赤血球では９５％に達している。ヒトグロビンの合成は主にＨｂＡ（α２β２）、少量のＨｂＡ２（α２δ２）およびＨｂＦ（α２γ２）であることが知られている。赤血球の増殖時間は、指向性放射性核種標識細胞の増殖サイクルＤＮＡ合成能力を指標として推定できる。原始赤血球の増殖時間は約２０時間、初期赤血球の増殖時間は約１６時間、中期の若い赤血球の時間は２５～３０時間であり、後期の若い赤血球はＤＮＡを合成する能力がなく、非増殖性の細胞である。したがって、正常な赤血球前駆細胞は骨髄から生成され、増殖と分化後、新しい網状赤血球が骨髄から脱出するまでに約３～５日かかる。その後、網状赤血球は脾臓に１～２日間留まり、成熟を続けて膜の脂質組成を変化させ、血液循環に入る。

【0070】

「必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の能力」とは、修飾されないＥＶ細胞が分化して生成するγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビンのレベルと比較して、ＥＶ細胞が修飾されて分化した後に生成するγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビンのレベルが増加し、例えば、少なくとも０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、１．０倍、１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６．０倍またはそれ以上増加することを意味する。例えば、本出願のいくつかの実施形態において、γ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビンの必要なレベルは、修飾されないＣＤ３４陽性ＨＳＰＣと比較して、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、またはそれ以上のレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビンを生成する。

【0071】

上記の実施形態において、分化後に必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成するための修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団の能力を評価することとは、修飾されてＢＣＬ１１Ａの機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後にγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成するレベルが、この修飾なしのＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成するγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルより、少なくとも約１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２０％増加しているかどうかを評価することをいう。

【0072】

上記方法の一部の実施形態において、前記必要なレベルの胎児ヘモグロビンは、６．５ｇ／ｄＬ、７．０ｇ／ｄＬ、７．５ｇ／ｄＬ、８．０ｇ／ｄＬ、８．５ｇ／ｄＬ、９．０ｇ／ｄＬ、９．５ｇ／ｄＬ、１０ｇ／ｄＬ、１０．５ｇ／ｄＬ、１１．０ｇ／ｄＬ末梢血を超え、またはそれ以上のレベルである。

【0073】

上記方法の一部の実施形態において、前記必要なレベルのγ－グロブリンは、修飾されていないＣＤ３４陽性ＨＳＰＣと比較して、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％を超え、またはそれ以上のレベルのγ－グロブリンｍＲＮＡを生成する。

【0074】

上記のγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルは、ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣから分化した非核赤血球が全分化細胞集団の総数の１０％以上（例えば、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％）を占めた後に、例えば、γ－グロブリンｍＲＮＡまたはヘモグロビン（ＨｂＦ）検出を介して検出することにより、修飾されてＢＣＬ１１Ａの機能を低下させるＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成したγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルが、この修飾なしのＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成したγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルより少なくとも約１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２０％増加しているかどうかを比較することができる。

【0075】

いくつかの実施形態において、前記修飾されてＢＣＬ１１Ａの機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣは、６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までのヒト２番染色体の領域のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって遺伝子修飾をし、配列番号３～配列番号２５から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡを前記ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞に導入してＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集することを含む）ことによってＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。

【0076】

上記方法の一部の実施形態において、評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾ＥＶ細胞の能力を評価し、前記ステップは、１）赤血球集団を得るように分化を可能にする条件下で、修飾されたＥＶ細胞を培養すること、及び２）前記赤血球によって生成されるγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルを決定することを含む。

【0077】

上記方法の一部の実施形態において、評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾ＥＶ細胞の能力を評価することは、γ－グロビンのｍＲＮＡレベルを決定することを含む。上記方法の一部の実施形態において、評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾ＥＶ細胞の能力を評価することは、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のタンパク質レベルを決定することを含む。上記方法の一部の実施形態において、前記個体は、評価ステップの前にＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の動員または前処理を経ていない。

【0078】

いくつかの実施形態では、前記ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の動員は、Ｇ－ＣＳＦおよび／またはＭｏｚｏｂｉｌＴＭ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）または他の造血幹細胞動員剤を被験者に投与することを含む。

【0079】

上記方法のいくつかの実施形態では、前記評価ステップは、前記治療ステップの前に少なくとも１回、例えば、２、３、４、５回またはそれ以上繰り返される。

【0080】

単離されたＴＲ細胞は、修飾単離されたＥＶ細胞と同じまたは異なる方法を使用して修飾することができる。上記方法のいくつかの実施形態では、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾する。上記方法の一部の実施形態において、前記方法は、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾することを含む。上記の方法のいくつかの実施形態において、前記遺伝子修飾は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）のうちのいずれか一つの方法またはそれらの組み合わせにより、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾することを含む。

【0081】

本発明のいくつかの実施形態において、単離されたＥＶ細胞またはＴＲ細胞のＢＣＬ１１ａエンハンサーは、遺伝子修飾（例えば、（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、ＲＮＡ編集またはＲＮＡｉ）から選択される）方法によって破壊される（例えば、ＢＣＬ１１ａの発現または機能を強化する核酸配列に影響を与える）。前記ＢＣＬ１１ａエンハンサーについては、例えば、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ［Ｓｃｉｅｎｃｅ］、Ｖｏｌ．３４２、２０１３、第２５３～２５７頁を参照されたい。前記ＢＣＬ１１ａエンハンサーの１つの例は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列である（例えば、ｈｇ３８に記録された位置＋５５：Ｃｈｒ２：６０４９７６７６－６０４９８９４１；＋５８：Ｃｈｒ２：６０４９４２５１－６０４９５５４６；＋６２：Ｃｈｒ２：６０４９０４０９－６０４９１７３４に位置するか、またはそれに対応する）。前記ＢＣＬ１１ａエンハンサーの１つの例は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列の＋６２領域である。前記ＢＣＬ１１ａエンハンサーの１つの例は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列の＋５８領域である。いくつかの実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列の＋５５領域である。

【0082】

上記方法のいくつかの実施形態において、６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までのヒト２番染色体の領域のＢＣＬ１１Ａ遺伝子を修飾することによってＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。上記方法のいくつかの実施形態において、ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によって修飾し、ＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。いくつかの実施形態において、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域の遺伝子の転写および／または発現を阻害するタンパク質または核酸分子である。いくつかの実施形態では、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域の遺伝子の転写および／または発現を干渉、阻害、または破壊するタンパク質または核酸分子である。いくつかの実施形態において、前記ＢＣＬ１１Ａ機能阻害剤は、ヒト２番染色体の６０４９５１９７番目から６０４９５３４６番目までの領域を干渉、阻害、または破壊するヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮなど）、ペプチド核酸、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡである。

【0083】

上記方法のいくつかの実施形態において、前記造血幹細胞の２番染色体の６０４９５２１９番目から６０４９５３３６番目までのＢＣＬ１１Ａゲノム領域を遺伝子編集技術によって破壊してＢＣＬ１１Ａ機能を低下させる。上記方法のいくつかの実施形態において、前記遺伝子編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに基づく遺伝子編集技術、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集技術またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術、ＲＮＡ編集技術、ＲＮＡｉ技術である。上記方法のいくつかの実施形態において、前記遺伝子編集技術は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術である。上記方法のいくつかの実施形態において、前記ＢＣＬ１１Ａゲノム標的ヌクレオチド配列は、配列番号３～配列番号２５から選択されるいずれかの配列と相補的である。

【0084】

次の表に、配列番号３から配列番号２５に示すｓｇＲＮＡが標的とするヒト２番染色体上のゲノム配列位置と、各ｓｇＲＮＡによって引き起こされるＣａｓ９切断の切断部位を示す。

【0085】

【表1】

【0086】

配列番号３：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｃａｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇａａｇｇｇｔｔ
配列番号４：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－２と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ａｔｃａｇａｇｇｃｃａａａｃｃｃｔｔｃｃ
配列番号５：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐３と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－３と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｃｔａａｃａｇｔｔｇｃｔｔｔｔａｔｃａｃ
配列番号６：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐４と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－４と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｔｔｇｃｔｔｔｔａｔｃａｃａｇｇｃｔｃｃ
配列番号７：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐５と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－５と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｔｔｔｔａｔｃａｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇａ
配列番号８：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐６と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－６と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｔｔｔａｔｃａｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇａａ
配列番号９：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐７と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－７と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｔｇｇｇｔｇｇｇｇｔａｇａａｇａｇｇａｃ
配列番号１０：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐８と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－８と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｇｇｇｃｇｔｇｇｇｔｇｇｇｇｔａｇａａｇ
配列番号１１：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐９と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－９と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｔｔａｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃｇｔｇｇｇｔｇ
配列番号１２：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１０と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１０と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ａｔｔａｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃｇｔｇｇｇｔ
配列番号１３：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１１と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１１と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｇａｔｔａｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃｇｔｇｇｇ
配列番号１４：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１２と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１２と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｔｃｔｇａｔｔａｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃｇｔ
配列番号１５：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１３と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１３と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｃｔｃｔｇａｔｔａｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃｇ
配列番号１６：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１４と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１４と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｃａｃｇｃｃｃｃｃａｃｃｃｔａａｔｃａｇ
配列番号１７：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１５と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１５と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｔｔｇｇｃｃｔｃｔｇａｔｔａｇｇｇｔｇｇ
配列番号１８：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１６と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１６と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｔｔｔｇｇｃｃｔｃｔｇａｔｔａｇｇｇｔｇ
配列番号１９：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１７と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１７と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｇｔｔｔｇｇｃｃｔｃｔｇａｔｔａｇｇｇｔ
配列番号２０：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１８と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１８と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｇｇｔｔｔｇｇｃｃｔｃｔｇａｔｔａｇｇｇ
配列番号２１：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐１９と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－１９と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ａａｇｇｇｔｔｔｇｇｃｃｔｃｔｇａｔｔａ
配列番号２２：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２０と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－２０と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｇａａｇｇｇｔｔｔｇｇｃｃｔｃｔｇａｔｔ
配列番号２３：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２１と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－２１と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ａｃｔｃｔｔａｇａｃａｔａａｃａｃａｃｃ
配列番号２４：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２２と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－２２と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｃｔｔｃａａａｇｔｔｇｔａｔｔｇａｃｃｃ
配列番号２５：ＢＣＬ１１Ａのエンハンサー‐２３と呼ばれるｓｇＲＮＡ（単にｅｎｈａｎｃｅｒ－２３と呼ばれることもある）ｓｇＲＮＡコード配列：
ｃｔｃｔｔａｇａｃａｔａａｃａｃａｃｃａ

【0087】

上記の２３個のｓｇＲＮＡ切断部位の解析により、これらのｓｇＲＮＡによって引き起こされるＣａｓ９切断の切断部位は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の６０４９５２１９番目から６０４９５３３６番目のゲノム領域に集中していることがわかった。

【0088】

一般的に言えば、ｓｇＲＮＡのガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を指示するのに十分な標的配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適なアラインメントを行う場合、ガイド配列およびそれに対応する標的配列間の相補程度は約８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７．５％以上、９９％以上またはそれ以上であってもよい。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定でき、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づいたアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｉＸ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＬＡＮＤ（（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が含まれる。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、またはそれ以上のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約７５未満、７０未満、６５未満、６０未満、５５未満、５０未満、４５未満、４０未満、３５未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１２未満、またはそれより少ないヌクレオチドであってもよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列の配列特異的結合をガイドするガイド配列の能力は、任意の適切な測定方法により評価することができる。例えば、対応する標的配列を有する宿主細胞に、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するには十分なＣＲＩＳＰＲシステムのコンポーネント（テストされるガイド配列を含む）を提供してもよく、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列コンポーネントをコードするベクターを使用してトランスフェクションし、そして標的配列内の優先的な切断（例えば、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒにより測定する）を評価することで行うことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験管内で、標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体（テストされるガイド配列と、ガイド配列と異なる対照ガイド配列とを含む）のコンポーネントを提供し、標的配列へのテストと対照ガイド配列の結合または切断率を比較して評価することができる。また、当業者に既知の他の測定方法を使用して上記測定と評価を行うことができる。

【0089】

いくつかの実施形態において、遺伝子編集過程において使用されるｓｇＲＮＡは、好ましくは化学修飾されたものである。「化学修飾されたｓｇＲＮＡ」とは、ｓｇＲＮＡについて行った特定の化学修飾であり、例えば、その５’末端および３’末端の３つの塩基にある２’－Ｏ－メチル類縁体による修飾および／またはヌクレオチド間の３’チオによる修飾である。

【0090】

化学修飾されたｓｇＲＮＡは、以下の２つの利点を有する。第一に、ｓｇＲＮＡは一本鎖ＲＮＡであり、半減期が非常に短いため、細胞に入ると急速に分解する（最長１２時間）が、Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡとが結合して遺伝子編集の役割を発揮するには少なくとも４８時間がかかる。そのため、化学修飾されたｓｇＲＮＡは細胞に入った後、安定して発現し、Ｃａｓ９タンパク質に結合した後、効率的にゲノムを遺伝子編集してＩｎｄｅｌｓを生成することができる。第二に、未修飾のｓｇＲＮＡは細胞膜を透過する能力が低く、細胞または組織に効果的に入って対応する機能を発揮することができない。化学修飾されたｓｇＲＮＡは細胞膜を透過する能力が一般的に強化されている。本発明において、本分野で常用の化学修飾方法を使用することができ、ｓｇＲＮＡの安定性（半減期を延長する）と細胞膜への侵入能力を向上させることができる限り、いずれも使用できる。実施例に使用されている具体的な化学修飾の他に、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ ＧＦ１，Ｄａｍｈａ ＭＪ． Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ａｕｇ ２４；１９（８）：９３７－５４、およびＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｅｎｈａｎｃｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１５ Ｓｅｐ；３３（９）：９８５－９８９の文献に報告された化学修飾方法など、その他の修飾方法を含む。

【0091】

一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ、及び／またはＣａｓ９をコードするヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）をエレクトロポレーションによって造血幹細胞に導入する。例えば、２５０～３６０Ｖ、０．５～１ｍｓ；２５０～３００Ｖ、０．５～１ｍｓ；２５０Ｖ、１ｍｓ；２５０Ｖ、２ｍｓ；３００Ｖ、０．５ｍｓ；３００Ｖ、１ｍｓ；３６０Ｖ、０．５ｍｓ；または３６０Ｖ、１ｍｓのエレクトロポレーション条件で造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとをエレクトロポレーションによって一緒に造血幹細胞に導入する。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションによってＣａｓを発現する造血幹細胞に導入する。

【0092】

一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドはｍＲＮＡであり、例えば、ＡＲＣＡキャップを含むｍＲＮＡである。一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターにある。一部の実施形態では、前記Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドは、例えば、配列番号２６の配列を含む。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとは同一のベクターにある。

【0093】

上記方法の一部の実施形態において、配列番号３～配列番号２５から選択されるいずれかの配列を含むｓｇＲＮＡを前記ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞に導入してＢＣＬ１１Ａ遺伝子を編集することによってＢＣＬ１１Ａの機能を低下させる。上記方法のいくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル類縁体及び／またはヌクレオチド間３’チオにより修飾されたものである。上記方法のいくつかの実施形態において、前記化学修飾は、前記ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の１つ、２つ、及び／または３つの塩基及び／または３’末端の最後の１つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修飾である。上記方法のいくつかの実施形態において、前記ｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとを一緒に前記ＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞に導入する。上記方法のいくつかの実施形態において、エレクトロポレーションによってｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチドとを一緒に造血幹細胞に導入する。上記方法のいくつかの実施形態において、前記エレクトロポレーションの条件は、２００～６００Ｖ、０．５～２ｍｓである。

【0094】

上記方法の一部の実施形態において、治療ステップにおいてＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを動員することは、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）および／またはプレリキサフォル（ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）によって前記個体を治療することを含む。

【0095】

上記方法の一部の実施形態において、前記治療ステップは、前記修飾されたＴＲ細胞を投与する前に前記個体を前処理することをさらに含む。

【0096】

一部の実施形態において、前記前処理は、化学療法、モノクローナル抗体療法、または全身放射線療法を含む。一部の実施形態において、前記化学療法は、ブスルファン、シクロホスファミド、およびフルダラビンからなる群から選択される１つ以上の化学療法剤を前記個体に投与することを含む。

【0097】

上記の方法のいくつかの実施形態において、修飾されたＥＶ細胞集団は、インビトロで培養されて、γ－グロビンまたは胎児ヘモグロビンを発現する赤血球前駆細胞または成熟赤血球にさらに分化する。

【0098】

いくつかの実施形態において、前記赤血球前駆細胞は、成熟赤血球の前にγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビンを発現することができる前駆細胞である。

【0099】

上記の方法のいくつかの実施形態において、造血幹細胞赤血球増殖および分化培地は、修飾されたＥＶ細胞集団に対して造血幹細胞赤血球増殖および分化を実施するために使用され、前記造血幹細胞赤血球増殖および分化培地は、基礎培地、および成長因子の組成物を含み、前記成長因子の組成物は、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ－３）およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む。いくつかの実施形態において、赤血球分化脱核培地を使用して造血幹細胞の赤血球分化脱核を行うことをさらに含み、前記赤血球分化脱核培地は、基礎培地、成長因子、及びプロゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬および／または阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、前記赤血球分化脱核培地における成長因子は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を含み、前記プロゲステロン受容体とグルココルチコイド受容体の拮抗薬および／または阻害剤は、下記化合物（Ｉ）～（ＩＶ）から選択されるいずれか１つまたは２つ以上である。

【0100】

【化1】

【0101】

一部の実施形態では、前記造血幹細胞赤血球増殖および分化培地は、基礎培地と成長因子添加剤とを含み、前記基礎培地は、無血清の基礎培地から選択することができ、例えば、ＳＴＥＭＳＰＡＮ^TM ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｉｎｃ．）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）が挙げられ、必要に応じて、ＩＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｌ－ｇｕｌｕｔａｍｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ビタミンＣ、および／またはウシ血清アルブミンを補充する。成長因子添加剤は、ＩＬ－３、ＳＣＦ、およびＥＰＯの１つまたは複数の組み合わせから選択される。

【0102】

上記の方法のいくつかの実施形態において、修飾されたＥＶ細胞集団を５～１０日間、例えば６～１０日、７～１０日増殖および分化して、赤芽球（ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ）、有核赤血球、未成熟赤血球および網赤血球などのような赤血球前駆細胞を得る。次に、赤血球前駆細胞は、約４～１４日間、例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間の分化（または分化脱核）で処理して成熟した赤血球を得る。

【0103】

いくつかの実施形態において、修飾されたＥＶ細胞集団を、必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する成熟赤血球に分化させるステップは、
ａ）ヒト末梢血（骨髄造血幹細胞動員の有無にかかわらず）または骨髄からＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞（単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ）を得ること、
ｂ）ＢＣＬ１１Ａの機能を低下させるように上記のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを遺伝子修飾すること、
ｃ）追加の成長因子を無血清培地（Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭＥ））に添加し、５～１０日、例えば、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、増殖および分化した後、ＨＳＰＣを赤血球前駆細胞に分化させること、
ｄ）追加の成長因子を無血清培地（Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＳＦＭＥ））に添加し、約４～１４日（例えば、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日またはそれ以上）分化した後、成熟した赤血球を得ることを含み得る。いくつかの実施形態において、前記造血幹細胞の赤血球分化脱核培地は、基礎培地、成長因子、および化学的小分子添加剤を含み、前記基礎培地は無血清基礎培地であり、例えば、ＳＴＥＭＳＰＡＮ^TM ＳＦＥＭ ＩＩ（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｉｎｃ．）やＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）であってもよく、必要に応じてさらにＩＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｌ－ｇｕｌｕｔａｍｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、ビタミンＣ及び／またはウシ血清アルブミンを追加してもよい。成長因子および化学的小分子添加剤は、ＥＰＯ、ヒトトランスフェリン、及び／または化学的小分子ミフェプリストン（ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）を含む。

【0104】

修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ（ＥＶ細胞集団）は分化してγ－グロビンｍＲＮＡまたはヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成し、生成されたγ－グロビンｍＲＮＡまたはヘモグロビン（ＨｂＦ）は当技術分野の従来の方法によって検出することができる。例えば、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ（ＥＶ細胞集団）から分化した非核赤血球が全分化細胞集団の総数の１０％以上（例えば、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％）を占めた後に、当技術分野の従来の方法により、生成したγ－グロブリンｍＲＮＡまたはヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルを検出することができ、修飾されてＢＣＬ１１Ａの機能を低下させるＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成したγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルが、この修飾なしのＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成したγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルより増加しているかどうかを比較することができる。少なくとも約１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２０％増加している場合、本発明の方法を使用して治療できることを表す。一般的に使用される任意の基礎培地は、上記の造血幹細胞赤血球増殖分化培地及び造血幹細胞赤血球分化脱核培地で使用できる。例えば、ＳＴＥＭＳＰＡＮ^TM ＳＦＥＭ ＩＩ（（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳから購入）や、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入したＩＭＤＭ、ＤＦ１２、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ １６４０、Ａｌｐｈａ ＭＥＭ、ＤＭＥＭなど、一般的に使用される基礎培地が挙げられる。また、上記の基礎培地には、必要に応じて、ＩＴＳ（主にインスリン、ヒトトランスフェリン、及びセレン元素を含む）、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンなど他の成分をさらに添加することができる。例えば、ＩＭＤＭ培地に、ＩＴＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０～５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ、及び０．５～５質量％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を添加することができる。また、上記ＤＦ１２には、同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することができる。Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭには、同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することができ、ＲＰＭＩ １６４０には、同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することができ、Ａｌｐｈａ ＭＥＭには、同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することができ、ＤＭＥＭにも同じ濃度のＩＴＳ、Ｌ－グルタミン、ビタミンＣ、及びウシ血清アルブミンを添加することができる。ここで、各基礎培地に追加されるＩＴＳの濃度として、インスリン濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ、ヒトトランスフェリンが０．００５５ｍｇ／ｍｌ、セレン元素が６．７×１０^-6ｍｇ／ｍｌであってもよい。また、追加されるＩＴＳの各成分の濃度も、実際のニーズに合わせて調整できる。ＩＴＳはＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入でき、必要に応じて適切な最終使用濃度に調整できる。

【0105】

上記の方法のいくつかの実施形態において、修飾されたＴＲ細胞集団は、個体に投与される前に、エクスビボまたはインビトロで増殖されない。特定の実施形態において、前記修飾されたＴＲ細胞は、治療試薬を除去するために洗浄され得、そしてそれらをエクスビボで増殖させることなく患者に投与され得る。いくつかの実施形態において、修飾されたＴＲ細胞は、有意なエクスビボ細胞分裂が起こる前、または有意なエクスビボ細胞分裂に必要な時間の前に、患者に投与される。いくつかの実施形態において、修飾されたＴＲ細胞は、修飾された後に個体に投与される前に、１日以上培養される。いくつかの実施形態において、修飾されたＴＲ細胞は、修飾されてから２、４、６、１２、２４、または４８時間以内に患者に投与される。

【0106】

いくつかの実施形態において、修飾されたＴＲ細胞を個体に投与する前に、修飾されたＴＲ細胞は、少なくとも２４時間、凍結条件下で保存される。いくつかの実施形態において、修飾されたＴＲ細胞は、凍結条件下で保存する前に、１日以上培養される。修飾されたＴＲ細胞は、無血清基礎培地に基づいて細胞生存率を維持するサイトカインを補充した培地で１日以上（例えば、１日から３日）培養することができる。前記サイトカインとして、ＳＣＦ（幹細胞因子、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）、ＴＰＯ（トロンボポエチン、Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＦＬＴ－３Ｌ（ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、ＦＭＳ－ｌｉｋｅ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ３ Ｌｉｇａｎｄ）、ＩＬ－６（インターロイキン－６、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６）が挙げられる。例えば、幹細胞増殖培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で１日以上（例えば、１日から３日）培養することができる。

【0107】

いくつかの実施形態において、単離されたＴＲ細胞を、修飾前に１日以上培養し、次いで、単離されたＴＲ細胞を修飾する。

【0108】

上記方法の一部の実施形態において、前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症、鎌状赤血球形質、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＣ形質、ヘモグロビンＳ／Ｃ症、ヘモグロビンＤ症、ヘモグロビンＥ症、サラセミア、酸素親和性が増加したヘモグロビン関連障害、酸素親和性が低下したヘモグロビン関連障害、不安定なヘモグロビン症、およびメトヘモグロビン血症からなる群から選択される。一部の実施形態において、前記異常ヘモグロビン症は、β－サラセミアと鎌状赤血球貧血からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記異常ヘモグロビン症は、β０またはβ＋サラセミアである。

【0109】

上記方法の一部の実施形態において、前記個体はヒトである。上記の方法のいくつかの実施形態では、前記治療ステップは、前記評価ステップの直後に実行される。

【0110】

本明細書で使用される場合、「治療」という用語は、疾患症状の改善または除去を達成することを含むがこれらに限定されない、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は予防的であり得、疾患またはその症状の完全または部分的な予防として表され、および／または効果は治療的であり得、症状の改善または除去を達成することによって、または疾患および／または病気副作用に対する部分的または完全な治癒を提供することとして表される。本明細書で使用される場合、「治療」には、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療が含まれ、（ａ）個体の発症を予防すること；（ｂ）疾患を阻害する、すなわちその発症を阻止すること；（ｃ）疾患、例えば、疾患の寛解、例えば、疾患の症状の完全または部分的な除去、および（ｄ）個人を病気前の状態に戻す、例えば、血液系を再構築することが含まれる。本願において、「治療」は、必ずしも疾患または病状もしくはその関連症状の完全な根絶または治癒を意味するものではなく、疾患または病状の１つまたは複数の測定可能な症状の最小限の改善または緩和を包含する。上記の特定の方法において、治療は、造血再構成の改善または個体の生存を含む。

【0111】

例示的な実施形態：
１、ａ）修飾されたＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞（「ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ」）の第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、ＢＣＬ１１Ａ機能を低下させるように修飾されている（「修飾されたＥＶ細胞」）、評価ステップ；及び、
ｂ）前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップ
を含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療するための方法。

【0112】

２、個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップを含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、
評価ステップによる機能評価に基づいて前記個体を治療のために選択し、前記評価ステップは、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下した（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記方法。

【0113】

３、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）による治療のために異常ヘモグロビン症に罹患している個体を選択する方法であって、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成した場合、前記個体を治療のために選択する、前記方法。

【0114】

４、異常ヘモグロビン症に罹患している個体が、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を使用する治療に適するかどうかを決定する方法であって、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成した場合、前記個体が治療に適する、前記方法。

【0115】

５、異常ヘモグロビン症に罹患している個体が、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を使用する治療に適しないことを決定する方法を提供し、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成しない場合、前記個体が、前記修飾されたＴＲ細胞による治療に適しない、前記方法。

【0116】

６、前記評価ステップは、
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む、実施形態１～５のいずれか１項に記載の方法。

【0117】

７、前記治療ステップは、
ａ）前記個体の骨髄中のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員して末梢血中のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの量を増加させること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与することを含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載の方法。

【0118】

８、１）
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップと、
２）
ａ）前記個体のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員すること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与することを含む治療ステップと
を含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療する方法。

【0119】

９、前記修飾されたＥＶ細胞は、遺伝子修飾することによって修飾されたものである、実施形態１～８のいずれか１項に記載の方法。

【0120】

１０、前記単離されたＥＶ細胞を修飾することは、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾することを含む、実施形態６～８のいずれか１項に記載の方法。

【0121】

１１、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術からなる群から選択される技術により、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾する、実施形態９または１０に記載の方法。

【0122】

１２、前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾されたＥＶ細胞の能力を評価し、前記ステップは、１）赤血球集団を得るように分化を可能にする条件下で、修飾されたＥＶ細胞を培養すること、及び２）前記赤血球によって生成されるγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルを決定することを含む、実施形態１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【0123】

１３、前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾されたＥＶ細胞の能力を評価することは、γ－グロビンのｍＲＮＡレベルを決定することを含む、実施形態１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【0124】

１４、前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾されたＥＶ細胞の能力を評価することは、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のタンパク質レベルを決定することを含む、実施形態１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【0125】

１５、前記個体は、評価ステップの前に動員または前処理を経ていない、実施形態１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【0126】

１６、前記評価ステップは、前記治療ステップの前に少なくとも１回繰り返される、実施形態１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【0127】

１７、前記修飾されたＴＲ細胞は、遺伝子修飾することによって修飾されたものである、実施形態１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【0128】

１８、前記単離されたＴＲ細胞を修飾することは、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾することを含む、実施形態７～１６のいずれか１項に記載の方法。

【0129】

１９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術からなる群から選択される技術により、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾する、実施形態１７または１８に記載の方法。

【0130】

２０、前記治療ステップにおけるＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの動員は、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）および／またはプレリキサフォル（ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）を使用して前記個体を治療することを含む、実施形態７～１９のいずれか１項に記載の方法。

【0131】

２１、前記治療ステップは、前記修飾されたＴＲ細胞を投与する前に前記個体を前処理することをさらに含む、実施形態１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【0132】

２２、前記前処理は、化学療法、モノクローナル抗体療法、または全身放射線療法を含む、実施形態２１に記載の方法。

【0133】

２３、前記前処理は、化学療法を含む、実施形態２２に記載の方法。

【0134】

２４、前記化学療法は、ブスルファン、シクロホスファミド、およびフルダラビンからなる群から選択される１つ以上の化学療法剤を前記個体に投与することを含む、実施形態２３に記載の方法。

【0135】

２５、前記単離されたＴＲ細胞は、修飾する前に１日以上培養され、実施形態７～２４のいずれか１項に記載の方法。

【0136】

２６、個体に投与する前に、前記修飾されたＴＲ細胞を１日以上培養する、実施形態７～２５のいずれか１項に記載の方法。

【0137】

２７、修飾されたＴＲ細胞を個体に投与する前に、前記修飾されたＴＲ細胞を凍結条件下で少なくとも２４時間保存する、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の方法。

【0138】

２８、凍結条件下で保存する前に、修飾されたＴＲ細胞を１日以上培養する、実施形態２７に記載の方法。

【0139】

２９、前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症、鎌状赤血球形質、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＣ形質、ヘモグロビンＳ／Ｃ症、ヘモグロビンＤ症、ヘモグロビンＥ症、サラセミア、酸素親和性が増加したヘモグロビン関連障害、酸素親和性が低下したヘモグロビン関連障害、不安定なヘモグロビン症、およびメトヘモグロビン血症からなる群から選択される、実施形態１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【0140】

３０、前記異常ヘモグロビン症は、β－サラセミアと鎌状赤血球貧血からなる群から選択される、実施形態２９に記載の方法。

【0141】

３１、前記異常ヘモグロビン症は、β０またはβ＋サラセミアである、実施形態３０に記載の方法。

【0142】

３２、前記個体がヒトである、実施形態１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【0143】

３３、前記治療ステップは、前記評価ステップの直後に実行される。実施形態１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【0144】

上記のすべての実施形態のいくつかの特定の実施形態において、分化後に必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成するための修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団の能力を評価することとは、修飾されてＢＣＬ１１Ａの機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後にγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成するレベルが、この修飾なしのＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成するγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルより、少なくとも約１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％増加しているかどうかを評価することをいう。

【0145】

本願はさらに下記の実施形態に係る。
１、（ａ）修飾されたＣＤ３４陽性造血幹細胞／前駆細胞（「ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ」）の第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、ＢＣＬ１１Ａ機能を低下させるように修飾されている（「修飾されたＥＶ細胞」）、評価ステップ；及び、
（ｂ）前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップ
を含む、個体の異常ヘモグロビン症を治療するための方法に使用される薬剤の製造における修飾されたＴＲ細胞の使用。

【0146】

２、個体の異常ヘモグロビン症を治療するための方法に使用される薬剤の製造における修飾されたＴＲ細胞の使用であって、前記方法は、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を前記個体に投与することを含む治療ステップを含み、
評価ステップによる機能評価に基づいて前記個体を治療のために選択し、前記評価ステップは、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下した（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記使用。

【0147】

３、異常ヘモグロビン症に罹患している個体に、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）による治療に適するかどうかを決定する方法に使用される製品の製造における修飾されたＥＶ細胞の使用であって、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成した場合、前記個体が治療に適し、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成しない場合、前記個体が、前記修飾されたＴＲ細胞による治療には適しない、前記使用。

【0148】

４、前記評価ステップは、
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む、実施形態１～３のいずれか１項に記載の使用。

【0149】

５、前記治療ステップは、
ａ）前記個体の骨髄中のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員して末梢血中のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの量を増加させること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与することを含む、実施形態１～４のいずれか１項に記載の使用。

【0150】

６、１）前記評価ステップには、
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む、
２）前記治療ステップには、
ａ）前記個体のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員すること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与することを含む、実施形態１～５のいずれか１項に記載の使用。

【0151】

７、前記修飾されたＥＶ細胞は、遺伝子修飾することによって修飾されたものである、実施形態１～６のいずれか１項に記載の使用。

【0152】

８、前記単離されたＥＶ細胞を修飾することは、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾することを含む、実施形態４～６のいずれか１項に記載の使用。

【0153】

９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術からなる群から選択される技術により、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾する、実施形態７または８に記載の使用。

【0154】

１０、前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾ＥＶ細胞の能力を評価し、前記ステップは、１）赤血球集団を得るように分化を可能にする条件下で、修飾されたＥＶ細胞を培養すること、及び２）前記赤血球によって生成されるγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルを決定することを含む、実施形態１～９のいずれか１項に記載の使用。

【0155】

１１、前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾ＥＶ細胞の能力を評価することは、γ－グロビンのｍＲＮＡレベルを決定することを含む、実施形態１～１０のいずれか１項に記載の使用。

【0156】

１２、前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾ＥＶ細胞の能力を評価することは、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のタンパク質レベルを決定することを含む、実施形態１～１０のいずれか１項に記載の使用。

【0157】

１３、前記個体は、評価ステップの前に動員または前処理を経ていない、実施形態１～１２のいずれか１項に記載の用途。

【0158】

１４、前記評価ステップは、前記治療ステップの前に少なくとも１回繰り返される、実施形態１～１３のいずれか１項に記載の使用。

【0159】

１５、前記修飾されたＴＲ細胞は、遺伝子修飾することによって修飾されたものである、実施形態１～１４のいずれか１項に記載の使用。

【0160】

１６、前記単離されたＴＲ細胞を修飾することは、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾することを含む、実施形態５～１４のいずれか１項に記載の使用。

【0161】

１７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術からなる群から選択される技術により、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾する、実施形態１５または１６に記載の使用。

【0162】

１８、前記治療ステップにおけるＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの動員は、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）および／またはプレリキサフォル（ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）を使用して前記個体を治療することを含む、実施形態５～１７のいずれか１項に記載の使用。

【0163】

１９、前記治療ステップは、前記修飾されたＴＲ細胞を投与する前に前記個体を前処理することをさらに含む、実施形態１～１８のいずれか１項に記載の使用。

【0164】

２０、前記前処理は、化学療法、モノクローナル抗体療法、または全身放射線療法を含む、実施形態１９に記載の使用。

【0165】

２１、前記前処理は、化学療法を含む、実施形態２０に記載の使用。

【0166】

２２、前記化学療法は、ブスルファン、シクロホスファミド、およびフルダラビンからなる群から選択される１つ以上の化学療法剤を前記個体に投与することを含む、実施形態２１に記載の使用。

【0167】

２３、前記単離されたＴＲ細胞は、修飾する前に１日以上培養され、実施形態５～２２のいずれか１項に記載の使用。

【0168】

２４、個体に投与する前に、前記修飾されたＴＲ細胞を１日以上培養する、実施形態５～２３のいずれか１項に記載の使用。

【0169】

２５、修飾されたＴＲ細胞を個体に投与する前に、前記修飾されたＴＲ細胞を凍結条件下で少なくとも２４時間保存する、実施形態１～２４のいずれか１項に記載の使用。

【0170】

２６、凍結条件下で保存する前に、修飾されたＴＲ細胞を１日以上培養する、実施形態２５に記載の使用。

【0171】

２７、前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症、鎌状赤血球形質、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＣ形質、ヘモグロビンＳ／Ｃ症、ヘモグロビンＤ症、ヘモグロビンＥ症、サラセミア、酸素親和性が増加したヘモグロビン関連障害、酸素親和性が低下したヘモグロビン関連障害、不安定なヘモグロビン症、およびメトヘモグロビン血症からなる群から選択される、実施形態１～２６のいずれか１項に記載の使用。

【0172】

２８、前記異常ヘモグロビン症は、β－サラセミアと鎌状赤血球貧血からなる群から選択される、実施形態２７に記載の使用。

【0173】

２９、前記異常ヘモグロビン症は、β０またはβ＋サラセミアである、実施形態２８に記載の使用。

【0174】

３０、前記個体がヒトである、実施形態１～２９のいずれか１項に記載の使用。

【0175】

３１、前記治療ステップは、前記評価ステップの直後に実行される。実施形態１～３０のいずれか１項に記載の使用。

【0176】

上記のすべての実施形態のいくつかの特定の実施形態において、分化後に必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成するための修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団の能力を評価することとは、修飾されてＢＣＬ１１Ａの機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後にγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成するレベルが、この修飾なしのＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの分化後に生成するγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルより、少なくとも約１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％増加しているかどうかを評価することをいう。

【実施例】

【0177】

実施例１：造血幹細胞のＢＣＬ１１Ａエンハンサーの遺伝子編集
本実施例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してサラセミア（以下、サラセミアと呼ぶ）患者および健康なドナーの動員末梢血に由来するＣＤ３４陽性造血幹細胞ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位を遺伝子編集することに係る。
「ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ ＴＯＯＬＳ」ソフトウェアを使用して、ＢＣＬ１１Ａ（＋５８）部位をターゲットとするｓｇＲＮＡを設計し、２つの化学修飾されたｓｇＲＮＡを合成した。配列情報は次のとおりである。ｓｇＲＮＡ－１：ｃｔａａｃａｇｔｔｇｃｔｔｔｔａｔｃａｃ（配列番号５）、ｓｇＲＮＡ－２：ａｔｃａｇａｇｇｃｃａａａｃｃｃｔｔｃｃ 配列番号４。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡコード配列の情報は次の通りである。

【0178】

ｇａｃａａｇａａｇｔａｃａｇｃａｔｃｇｇｃｃｔｇｇａｃａｔｃｇｇｃａｃｃａａｃｔｃｔｇｔｇｇｇｃｔｇｇｇｃｃｇｔｇａｔｃａｃｃｇａｃｇａｇｔａｃａａｇｇｔｇｃｃｃａｇｃａａｇａａａｔｔｃａａｇｇｔｇｃｔｇｇｇｃａａｃａｃｃｇａｃｃｇｇｃａｃａｇｃａｔｃａａｇａａｇａａｃｃｔｇａｔｃｇｇａｇｃｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃｇａｃａｇｃｇｇｃｇａａａｃａｇｃｃｇａｇｇｃｃａｃｃｃｇｇｃｔｇａａｇａｇａａｃｃｇｃｃａｇａａｇａａｇａｔａｃａｃｃａｇａｃｇｇａａｇａａｃｃｇｇａｔｃｔｇｃｔａｔｃｔｇｃａａｇａｇａｔｃｔｔｃａｇｃａａｃｇａｇａｔｇｇｃｃａａｇｇｔｇｇａｃｇａｃａｇｃｔｔｃｔｔｃｃａｃａｇａｃｔｇｇａａｇａｇｔｃｃｔｔｃｃｔｇｇｔｇｇａａｇａｇｇａｔａａｇａａｇｃａｃｇａｇｃｇｇｃａｃｃｃｃａｔｃｔｔｃｇｇｃａａｃａｔｃｇｔｇｇａｃｇａｇｇｔｇｇｃｃｔａｃｃａｃｇａｇａａｇｔａｃｃｃｃａｃｃａｔｃｔａｃｃａｃｃｔｇａｇａａａｇａａａｃｔｇｇｔｇｇａｃａｇｃａｃｃｇａｃａａｇｇｃｃｇａｃｃｔｇｃｇｇｃｔｇａｔｃｔａｔｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃａｃａｔｇａｔｃａａｇｔｔｃｃｇｇｇｇｃｃａｃｔｔｃｃｔｇａｔｃｇａｇｇｇｃｇａｃｃｔｇａａｃｃｃｃｇａｃａａｃａｇｃｇａｃｇｔｇｇａｃａａｇｃｔｇｔｔｃａｔｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａｃｃｔａｃａａｃｃａｇｃｔｇｔｔｃｇａｇｇａａａａｃｃｃｃａｔｃａａｃｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｇａｃｇｃｃａａｇｇｃｃａｔｃｃｔｇｔｃｔｇｃｃａｇａｃｔｇａｇｃａａｇａｇｃａｇａｃｇｇｃｔｇｇａａａａｔｃｔｇａｔｃｇｃｃｃａｇｃｔｇｃｃｃｇｇｃｇａｇａａｇａａｇａａｔｇｇｃｃｔｇｔｔｃｇｇｃａａｃｃｔｇａｔｔｇｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｇｇｃｃｔｇａｃｃｃｃｃａａｃｔｔｃａａｇａｇｃａａｃｔｔｃｇａｃｃｔｇｇｃｃｇａｇｇａｔｇｃｃａａａｃｔｇｃａｇｃｔｇａｇｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｃｇａｃｇａｃｇａｃｃｔｇｇａｃａａｃｃｔｇｃｔｇｇｃｃｃａｇａｔｃｇｇｃｇａｃｃａｇｔａｃｇｃｃｇａｃｃｔｇｔｔｔｃｔｇｇｃｃｇｃｃａａｇａａｃｃｔｇｔｃｃｇａｃｇｃｃａｔｃｃｔｇｃｔｇａｇｃｇａｃａｔｃｃｔｇａｇａｇｔｇａａｃａｃｃｇａｇａｔｃａｃｃａａｇｇｃｃｃｃｃｃｔｇａｇｃｇｃｃｔｃｔａｔｇａｔｃａａｇａｇａｔａｃｇａｃｇａｇｃａｃｃａｃｃａｇｇａｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｃｔｇａａａｇｃｔｃｔｃｇｔｇｃｇｇｃａｇｃａｇｃｔｇｃｃｔｇａｇａａｇｔａｃａａａｇａｇａｔｔｔｔｃｔｔｃｇａｃｃａｇａｇｃａａｇａａｃｇｇｃｔａｃｇｃｃｇｇｃｔａｃａｔｔｇａｃｇｇｃｇｇａｇｃｃａｇｃｃａｇｇａａｇａｇｔｔｃｔａｃａａｇｔｔｃａｔｃａａｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｇａａａａｇａｔｇｇａｃｇｇｃａｃｃｇａｇｇａａｃｔｇｃｔｃｇｔｇａａｇｃｔｇａａｃａｇａｇａｇｇａｃｃｔｇｃｔｇｃｇｇａａｇｃａｇｃｇｇａｃｃｔｔｃｇａｃａａｃｇｇｃａｇｃａｔｃｃｃｃｃａｃｃａｇａｔｃｃａｃｃｔｇｇｇａｇａｇｃｔｇｃａｃｇｃｃａｔｔｃｔｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｇａａｇａｔｔｔｔｔａｃｃｃａｔｔｃｃｔｇａａｇｇａｃａａｃｃｇｇｇａａａａｇａｔｃｇａｇａａｇａｔｃｃｔｇａｃｃｔｔｃｃｇｃａｔｃｃｃｃｔａｃｔａｃｇｔｇｇｇｃｃｃｔｃｔｇｇｃｃａｇｇｇｇａａａｃａｇｃａｇａｔｔｃｇｃｃｔｇｇａｔｇａｃｃａｇａａａｇａｇｃｇａｇｇａａａｃｃａｔｃａｃｃｃｃｃｔｇｇａａｃｔｔｃｇａｇｇａａｇｔｇｇｔｇｇａｃａａｇｇｇｃｇｃｔｔｃｃｇｃｃｃａｇａｇｃｔｔｃａｔｃｇａｇｃｇｇａｔｇａｃｃａａｃｔｔｃｇａｔａａｇａａｃｃｔｇｃｃｃａａｃｇａｇａａｇｇｔｇｃｔｇｃｃｃａａｇｃａｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｔａｃｇａｇｔａｃｔｔｃａｃｃｇｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇａｃｃａａａｇｔｇａａａｔａｃｇｔｇａｃｃｇａｇｇｇａａｔｇａｇａａａｇｃｃｃｇｃｃｔｔｃｃｔｇａｇｃｇｇｃｇａｇｃａｇａａａａａｇｇｃｃａｔｃｇｔｇｇａｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃａａｇａｃｃａａｃｃｇｇａａａｇｔｇａｃｃｇｔｇａａｇｃａｇｃｔｇａａａｇａｇｇａｃｔａｃｔｔｃａａｇａａａａｔｃｇａｇｔｇｃｔｔｃｇａｃｔｃｃｇｔｇｇａａａｔｃｔｃｃｇｇｃｇｔｇｇａａｇａｔｃｇｇｔｔｃａａｃｇｃｃｔｃｃｃｔｇｇｇｃａｃａｔａｃｃａｃｇａｔｃｔｇｃｔｇａａａａｔｔａｔｃａａｇｇａｃａａｇｇａｃｔｔｃｃｔｇｇａｃａａｔｇａｇｇａａａａｃｇａｇｇａｃａｔｔｃｔｇｇａａｇａｔａｔｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａｃａｃｔｇｔｔｔｇａｇｇａｃａｇａｇａｇａｔｇａｔｃｇａｇｇａａｃｇｇｃｔｇａａａａｃｃｔａｔｇｃｃｃａｃｃｔｇｔｔｃｇａｃｇａｃａａａｇｔｇａｔｇａａｇｃａｇｃｔｇａａｇｃｇｇｃｇｇａｇａｔａｃａｃｃｇｇｃｔｇｇｇｇｃａｇｇｃｔｇａｇｃｃｇｇａａｇｃｔｇａｔｃａａｃｇｇｃａｔｃｃｇｇｇａｃａａｇｃａｇｔｃｃｇｇｃａａｇａｃａａｔｃｃｔｇｇａｔｔｔｃｃｔｇａａｇｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｔｃｇｃｃａａｃａｇａａａｃｔｔｃａｔｇｃａｇｃｔｇａｔｃｃａｃｇａｃｇａｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｔｔａａａｇａｇｇａｃａｔｃｃａｇａａａｇｃｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｇｇｃｃａｇｇｇｃｇａｔａｇｃｃｔｇｃａｃｇａｇｃａｃａｔｔｇｃｃａａｔｃｔｇｇｃｃｇｇｃａｇｃｃｃｃｇｃｃａｔｔａａｇａａｇｇｇｃａｔｃｃｔｇｃａｇａｃａｇｔｇａａｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇａｇｃｔｃｇｔｇａａａｇｔｇａｔｇｇｇｃｃｇｇｃａｃａａｇｃｃｃｇａｇａａｃａｔｃｇｔｇａｔｃｇａａａｔｇｇｃｃａｇａｇａｇａａｃｃａｇａｃｃａｃｃｃａｇａａｇｇｇａｃａｇａａｇａａｃａｇｃｃｇｃｇａｇａｇａａｔｇａａｇｃｇｇａｔｃｇａａｇａｇｇｇｃａｔｃａａａｇａｇｃｔｇｇｇｃａｇｃｃａｇａｔｃｃｔｇａａａｇａａｃａｃｃｃｃｇｔｇｇａａａａｃａｃｃｃａｇｃｔｇｃａｇａａｃｇａｇａａｇｃｔｇｔａｃｃｔｇｔａｃｔａｃｃｔｇｃａｇａａｔｇｇｇｃｇｇｇａｔａｔｇｔａｃｇｔｇｇａｃｃａｇｇａａｃｔｇｇａｃａｔｃａａｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｇａｃｔａｃｇａｔｇｔｇｇａｃｃａｔａｔｃｇｔｇｃｃｔｃａｇａｇｃｔｔｔｃｔｇａａｇｇａｃｇａｃｔｃｃａｔｃｇａｃａａｃａａｇｇｔｇｃｔｇａｃｃａｇａａｇｃｇａｃａａｇａａｃｃｇｇｇｇｃａａｇａｇｃｇａｃａａｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃｇａａｇａｇｇｔｃｇｔｇａａｇａａｇａｔｇａａｇａａｃｔａｃｔｇｇｃｇｇｃａｇｃｔｇｃｔｇａａｃｇｃｃａａｇｃｔｇａｔｔａｃｃｃａｇａｇａａａｇｔｔｃｇａｃａａｔｃｔｇａｃｃａａｇｇｃｃｇａｇａｇａｇｇｃｇｇｃｃｔｇａｇｃｇａａｃｔｇｇａｔａａｇｇｃｃｇｇｃｔｔｃａｔｃａａｇａｇａｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａａａｃｃｃｇｇｃａｇａｔｃａｃａａａｇｃａｃｇｔｇｇｃａｃａｇａｔｃｃｔｇｇａｃｔｃｃｃｇｇａｔｇａａｃａｃｔａａｇｔａｃｇａｃｇａｇａａｔｇａｃａａｇｃｔｇａｔｃｃｇｇｇａａｇｔｇａａａｇｔｇａｔｃａｃｃｃｔｇａａｇｔｃｃａａｇｃｔｇｇｔｇｔｃｃｇａｔｔｔｃｃｇｇａａｇｇａｔｔｔｃｃａｇｔｔｔｔａｃａａａｇｔｇｃｇｃｇａｇａｔｃａａｃａａｃｔａｃｃａｃｃａｃｇｃｃｃａｃｇａｃｇｃｃｔａｃｃｔｇａａｃｇｃｃｇｔｃｇｔｇｇｇａａｃｃｇｃｃｃｔｇａｔｃａａａａａｇｔａｃｃｃｔａａｇｃｔｇｇａａａｇｃｇａｇｔｔｃｇｔｇｔａｃｇｇｃｇａｃｔａｃａａｇｇｔｇｔａｃｇａｃｇｔｇｃｇｇａａｇａｔｇａｔｃｇｃｃａａｇａｇｃｇａｇｃａｇｇａａａｔｃｇｇｃａａｇｇｃｔａｃｃｇｃｃａａｇｔａｃｔｔｃｔｔｃｔａｃａｇｃａａｃａｔｃａｔｇａａｃｔｔｔｔｔｃａａｇａｃｃｇａｇａｔｔａｃｃｃｔｇｇｃｃａａｃｇｇｃｇａｇａｔｃｃｇｇａａｇｃｇｇｃｃｔｃｔｇａｔｃｇａｇａｃａａａｃｇｇｃｇａａａｃｃｇｇｇｇａｇａｔｃｇｔｇｔｇｇｇａｔａａｇｇｇｃｃｇｇｇａｔｔｔｔｇｃｃａｃｃｇｔｇｃｇｇａａａｇｔｇｃｔｇａｇｃａｔｇｃｃｃｃａａｇｔｇａａｔａｔｃｇｔｇａａａａａｇａｃｃｇａｇｇｔｇｃａｇａｃａｇｇｃｇｇｃｔｔｃａｇｃａａａｇａｇｔｃｔａｔｃｃｔｇｃｃｃａａｇａｇｇａａｃａｇｃｇａｔａａｇｃｔｇａｔｃｇｃｃａｇａａａｇａａｇｇａｃｔｇｇｇａｃｃｃｔａａｇａａｇｔａｃｇｇｃｇｇｃｔｔｃｇａｃａｇｃｃｃｃａｃｃｇｔｇｇｃｃｔａｔｔｃｔｇｔｇｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｃｃａａａｇｔｇｇａａａａｇｇｇｃａａｇｔｃｃａａｇａａａｃｔｇａａｇａｇｔｇｔｇａａａｇａｇｃｔｇｃｔｇｇｇｇａｔｃａｃｃａｔｃａｔｇｇａａａｇａａｇｃａｇｃｔｔｃｇａｇａａｇａａｔｃｃｃａｔｃｇａｃｔｔｔｃｔｇｇａａｇｃｃａａｇｇｇｃｔａｃａａａｇａａｇｔｇａａａａａｇｇａｃｃｔｇａｔｃａｔｃａａｇｃｔｇｃｃｔａａｇｔａｃｔｃｃｃｔｇｔｔｃｇａｇｃｔｇｇａａａａｃｇｇｃｃｇｇａａｇａｇａａｔｇｃｔｇｇｃｃｔｃｔｇｃｃｇｇｃｇａａｃｔｇｃａｇａａｇｇｇａａａｃｇａａｃｔｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃｔｃｃａａａｔａｔｇｔｇａａｃｔｔｃｃｔｇｔａｃｃｔｇｇｃｃａｇｃｃａｃｔａｔｇａｇａａｇｃｔｇａａｇｇｇｃｔｃｃｃｃｃｇａｇｇａｔａａｔｇａｇｃａｇａａａｃａｇｃｔｇｔｔｔｇｔｇｇａａｃａｇｃａｃａａｇｃａｃｔａｃｃｔｇｇａｃｇａｇａｔｃａｔｃｇａｇｃａｇａｔｃａｇｃｇａｇｔｔｃｔｃｃａａｇａｇａｇｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｃｇａｃｇｃｔａａｔｃｔｇｇａｃａａａｇｔｇｃｔｇｔｃｃｇｃｃｔａｃａａｃａａｇｃａｃｃｇｇｇａｔａａｇｃｃｃａｔｃａｇａｇａｇｃａｇｇｃｃｇａｇａａｔａｔｃａｔｃｃａｃｃｔｇｔｔｔａｃｃｃｔｇａｃｃａａｔｃｔｇｇｇａｇｃｃｃｃｔｇｃｃｇｃｃｔｔｃａａｇｔａｃｔｔｔｇａｃａｃｃａｃｃａｔｃｇａｃｃｇｇａａｇａｇｇｔａｃａｃｃａｇｃａｃｃａａａｇａｇｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｃｃａｃｃｃｔｇａｔｃｃａｃｃａｇａｇｃａｔｃａｃｃｇｇｃｃｔｇｔａｃｇａｇａｃａｃｇｇａｔｃｇａｃｃｔｇｔｃｔｃａｇｃｔｇｇｇａｇｇｃｇａｃ。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）

【0179】

ｓｇＲＮＡに対する化学修飾は、ｓｇＲＮＡの５’末端の最初の３つの塩基及び３’末端の最後の３つの塩基の２’－Ｏ－メチル類縁体による修飾およびヌクレオチド間の３’チオ修飾である。下記の化学式に示すように、左側は化学修飾されたｓｇＲＮＡであり、右側は修飾されていないｓｇＲＮＡである。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡは、米国Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。

【0180】

【化2】

【0181】

サラセミア患者５名と健常ドナー２名の動員末梢血からＣＤ３４陽性造血幹細胞を分離した（動員末梢血サンプルは、南方春冨（児童）血液病研究院より提供される）。ＢＴＸ ＥＣＭ８３０エレクトロポレーション装置では「３００Ｖ １ｍｓ」エレクトロポレーション条件を選択し、合成したＣａｓ９ ｍＲＮＡ、及び化学修飾合成したｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２をそれぞれ５人の患者と２人の健康なＣＤ３４陽性造血幹細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの４日後、ＣＤ３４陽性造血幹細胞のゲノムを抽出し、ｓｇＲＮＡ切断部位の左側に４５３ｂｐ、右側に４５０ｂｐ、全長９０３ｂｐの断片を増幅用に選択し、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを行った。
フォワードプライマー：ｃａｃｃｔｃａｇｃａｇａａａｃａａａｇｔｔａｔｃ（配列番号２６）
リバースプライマー：ｇｇｇａａｇｃｔｃｃａａａｃｔｃｔｃａａ（配列番号２７）
「Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ Ａｎａｌｙｓｉｓ」オンラインソフトウェアを使用してシーケンシング結果を解析し、Ｉｎｄｅｌｓ生成効率の統計解析を生成した。「Ｓｙｎｔｈｅｇｏ ＩＣＥ Ａｎａｌｙｓｉｓ」オンラインソフトウェアは、Ｉｎｄｅｌｓ効率をオンラインで解析するソフトウェアであり、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングの結果を基に、Ｉｎｄｅｌｓにより引き起こされたダブルピーク変異の効率を解析した。次のウエブサイトを参照されたい。
ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｙｎｔｈｅｇｏ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｃｒｉｓｐｒ－ａｎａｌｙｓｉｓ

【0182】

図１に示すように、その結果は、本実施例で合成された２つのｓｇＲＮＡが、異なるサラセミア患者と健康なドナーの動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞を遺伝子編集できることを示している。その中で、ｓｇＲＮＡ－１の遺伝子編集効率は３０％から７０％の間であり、Ｉｎｄｅｌｓ効率はドナーによって大きく異なる。それに対して、ｓｇＲＮＡ－２は、細胞をより効率的かつ安定的に編集してＩｎｄｅｌｓを生成し、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを破壊し、５人の患者ドナーと２人の健康なドナーに対して６０～８０％の遺伝子編集効率を達成できる。

【0183】

実施例２：γグロビンｍＲＮＡおよび赤血球分化関連タンパク質の発現
この実験は、動員後のサラセミア患者と健康なドナーの末梢血に由来する造血幹細胞が遺伝子編集されて分化後のγグロビン（ＨＢＧ遺伝子）ｍＲＮＡの発現を検証した。

【0184】

２．１ 赤血球の分化
３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ－１、およびＣａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ－２をエレクトロポレーションして５人のサラセミア患者と２人の健康なドナーの動員末梢血由来の造血幹細胞に導入し、対照群細胞にはエレクトロポレーションステップはなかった。そして、次の「二段階法」分化スキームを使用して赤血球分化実験を行った。
「二段階法」分化の第１のステップは、造血幹細胞の赤血球増殖および分化培地を使用して、ＣＤ３４＋造血幹前駆細胞を誘導して赤血球前駆細胞への分化を誘導し、次に造血幹細胞の赤血球分化脱核培地を使用して赤血球前駆細胞から成熟した赤血球への分化を誘導する。
造血幹細胞赤血球増殖および分化培地における基礎培地はＳｔｅｍＳｐａｎ^TM ＳＦＥＭ ＩＩであり、成長因子は、５０～２００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１０～１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、１～１０Ｕ ＥＰＯ／ｍｌであり、培養条件は、ＣＤ３４＋造血幹前駆細胞を１．０×１０⁵細胞／ｍｌの細胞密度で、造血幹細胞の赤血球増殖および分化培地を使用して培養し、７日間分化した後、ＣＤ３４＋造血幹前駆細胞が赤血球前駆細胞に分化した。
造血幹細胞赤血球分化脱核培地の基礎培地はＳＴＥＭＳＰＡＮ^TM ＳＦＥＭ ＩＩであり、成長因子は、１～１０Ｕ ＥＰＯ、１００～１０００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリンであり、化学的小分子は０．５～１０μｍのミフェプリストン（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）であり、前のステップで培養した赤血球前駆細胞を１．０×１０⁶細胞／ｍｌの細胞密度で造血幹細胞赤血球の分化脱核培地で１１日間分化させた後、赤血球前駆細胞が分化成熟して成熟赤血球になった。
図２に示すように、赤血球によって発現される細胞表面膜タンパク質ＣＤ７１およびＣＤ２３５ａの発現をテストし、ＣＤ７１とＣＤ２３５ａ二重陽性の比率を使用して、ＣＤ３４＋造血幹前駆細胞の赤血球への分化の効率を示した。実験群には、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２及び対照群はいずれも効率的に赤血球に分化でき、ＣＤ７１とＣＤ２３５ａの発現率はともに約８０％以上、分化効率が高く、これは、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２の編集効果が比較的良いことを示している。

【0185】

２．２造血幹細胞から分化した赤血球におけるγグロビン（ＨＢＧ）遺伝子のｍＲＮＡ発現の検出
図３に示すように、細胞のｍＲＮＡは、実施例２．１で造血幹細胞から分化した成熟赤血球から抽出され、ｃＤＮＡに逆転写され、ＨＢＧ遺伝子のｍＲＮＡ発現を蛍光定量的ＰＣＲによって検出した。
実験結果は次のことを示している。
１）サラセミア患者と健康なドナーからの動員サンプルに由来するＣＤ３４陽性造血幹細胞では、ＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサー部位を遺伝子編集することで、γグロビン（ＨＢＧ）と胎児ヘモグロビンＨｂＦに対するＢＣＬ１１Ａの阻害を解除し、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２の２つの実験群の細胞では、γグロビン（ＨＢＧ）のｍＲＮＡ発現レベルがいずれも増加している。
２）具体的には、
ａ．患者１の場合、ｓｇＲＮＡ－１は約４．２倍に増加し、ｓｇＲＮＡ－２は約３．８倍に増加した。
ｂ．患者２の場合、ｓｇＲＮＡ－１は約１．８倍に増加し、ｓｇＲＮＡ－２は約２倍に増加した。
ｃ．患者３の場合、ｓｇＲＮＡ－１は約２．１倍に増加し、ｓｇＲＮＡ－２は約３．１倍に増加した。
ｄ．患者４の場合、ｓｇＲＮＡ－１は約４倍に増加し、ｓｇＲＮＡ－２は約５．８倍に増加した。
ｅ．患者５の場合、ｓｇＲＮＡ－１は約１．６倍に増加し、ｓｇＲＮＡ－２は約２．２倍に増加した。
ｆ．健康なドナー１の場合、ｓｇＲＮＡ－１は約３．０倍に増加し、ｓｇＲＮＡ－２は約６．１倍に増加した。
ｇ．健康なドナー２の場合、ｓｇＲＮＡ－１は約１．７倍に増加し、ｓｇＲＮＡ－２は約１．７倍に増加した。

【0186】

上記のデータから分かるように、異なるドナー（患者と健康な人）で、ｓｇＲＮＡ－１またはｓｇＲＮＡ－２であるかどうかにかかわらず、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを編集し、γグロビン（ＨＢＧ）及び胎児ヘモグロビンＨｂＦに対するＢＣＬ１１Ａの阻害を解除したが、ドナーによってはγグロブリン（ＨＢＧ）の増加の程度も異なる。
また、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２は、γグロビン（ＨＢＧ）の増加程度では差があるが、γグロビン（ＨＢＧ）の増加程度が低いドナーと比較して、γグロビン（ＨＢＧ）の増加程度がより高いドナーには、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２は同じ傾向にあり、一貫性と安定性が高い。たとえば、患者ドナー１の場合、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２は両方とも約４倍に増加したが、患者ドナー２では、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２はどちらも約２倍しか増加しなかった。健康なドナー１の場合、ｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２は両方とも３．０～６．０倍増加したが、健康なドナー２ではｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２はいずれも２倍未満増加した。

【0187】

実施例３：遺伝子編集効率検出のためのマルチバッチ検証試験
３．１健康なドナーの動員末梢血由来
本実験は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して２人の健康なドナーの動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞のＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位を効率的に遺伝子編集したマルチバッチ検証試験に係る。
実施例１および実施例２の結果から分かるように、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ－２は、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位を効率的かつ安定的に編集できるだけでなく、遺伝子編集効率は６０～８０％であり、ｓｇＲＮＡ－よりも高い。さらに、γグロビン（ＨＢＧ）および胎児ヘモグロビンＨｂＦに対するＢＣＬ１１Ａの阻害を除去した後、ｓｇＲＮＡ－２はｓｇＲＮＡ－１よりもγグロビン（ＨＢＧ）のｍＲＮＡレベルをより高く増加させた。したがって、本実施例では、ｓｇＲＮＡ－２を後続の実験の好ましいターゲットとして選択した。
ＢＴＸ ＥＣＭ８３０エレクトロポレーション装置では「３００Ｖ １ｍｓ」エレクトロポレーション条件を選択し、合成したＣａｓ９ ｍＲＮＡ、及び化学修飾合成したｓｇＲＮＡ－１とｓｇＲＮＡ－２を２人の健康なドナーのＣＤ３４陽性造血幹細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの４日後、ＣＤ３４陽性造血幹細胞のゲノムを抽出し、ｓｇＲＮＡ切断部位の左右に各約４５０ｂｐ、全長９０３ｂｐの断片を増幅用に選択し、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを行った。シーケンシングプライマーおよび遺伝子編集効率解析方法については、実施例１を参照されたい。実験結果を図４Ａに示す。
その実験結果は、エレクトロポレーション条件下で、本実施例で合成されたｓｇＲＮＡ－２が、異なるドナーの動員末梢血に由来するＣＤ３４陽性造血幹細胞を首尾よく効率的に遺伝子編集でき、Ｉｎｄｅｌｓを効率よく生成でき、２人の健康なドナーに対する３つのバッチの実験では、遺伝子編集効率が７０～８０％に達したことを示している。その中で、「３つのバッチの実験」とは、健康なドナーごとに、末梢血動員のサンプルを１つ取得し、ＣＤ３４陽性造血幹細胞を単離したが、該細胞について、３回の独立した遺伝子編集実験を行ったことを意味する。

【0188】

３．２サラセミア患者の動員末梢血由来
ＢＴＸ ＥＣＭ８３０エレクトロポレーション装置では「３００Ｖ １ｍｓ」エレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及び化学修飾合成したｓｇＲＮＡ－２を１０人のサラセミア患者の動員末梢血由来のＣＤ３４陽性造血幹細胞にエレクトロポレーションした。対照群細胞にはエレクトロポレーションはなかった。２日後、ゲノムを抽出し、ｓｇＲＮＡ切断部位の左右に各約４５０ｂｐ、全長９０３ｂｐの断片をＰＣＲ増幅用に選択し、ＰＣＲ生成物に対してＳａｎｇｅｒシーケンシングを行った。シーケンシングプライマーおよび遺伝子編集効率解析方法については、実施例１を参照されたい。実験結果を図４Ｂに示す。
その実験結果は、該エレクトロポレーション条件下で、本実施例で合成されたｓｇＲＮＡ－２が、異なるサラセミア患者の動員末梢血に由来するＣＤ３４陽性造血幹細胞を首尾よく効率的に遺伝子編集でき、Ｉｎｄｅｌｓを効率よく生成でき、１０人のサラセミア患者に対する複数のバッチの実験では、遺伝子編集効率が６０～８０％またはそれ以上に達したことを示している。その中で、これら１０人のサラセミア患者のそれぞれから末梢血動員の１つのサンプルを取得し、遺伝子編集実験のためにＣＤ３４陽性造血幹細胞を単離した。これらの細胞について、患者ドナー１に対して３回の独立した遺伝子編集実験を行い、患者ドナー６、９、及び１０の３人のドナーに対して２回の独立した遺伝子編集実験を行い、残りの患者ドナーに対して１回の遺伝子編集実験を実施した。

【0189】

実施例４：造血幹細胞の分化後のγグロビンｍＲＮＡおよび胎児ヘモグロビンＨｂＦの発現
本実施例は、健康なドナーの動員末梢血に由来する造血幹細胞の赤血球分化後のＢＣＬ１１Ａ遺伝子及びγグロビンｍＲＮＡの発現を検出することに係る。
４．１ 赤血球の分化
４．１．１ 健康なドナー
３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ－２をエレクトロポレーションして２人の健康なドナーの動員末梢血由来の造血幹細胞に導入し、対照群細胞にはエレクトロポレーションステップはなかった。そして、次の「二段階法」分化スキームを使用して３つのバッチの赤血球分化実験を行った。
二段階法による分化は、造血幹細胞の赤血球増殖および分化培地を使用して分化させ、そして造血幹細胞の赤血球分化脱核培地を使用して分化させることである。
造血幹細胞赤血球増殖および分化培地としては、基礎培地はＳｔｅｍＳｐａｎ^TM ＳＦＥＭ ＩＩであり、成長因子は、５０～２００ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、１０～１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、１～１０Ｕ ＥＰＯ／ｍｌであり、培養条件は、造血幹細胞の赤血球増殖および分化培地を使用して造血幹細胞１．０×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌを培養し、７日間増殖した。
造血幹細胞赤血球分化脱核培地としては、基礎培地はＳＴＥＭＳＰＡＮ^TM ＳＦＥＭ ＩＩであり、成長因子は、１～１０Ｕ ＥＰＯ、１００～１０００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリンであり、化学的小分子は０．５～１０μｍのミフェプリストン（Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ）であり、前のステップで培養した１．０×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞を造血幹細胞赤血球の分化脱核培地で１１日間分化させた。
図５に示すように、ＣＤ７１とＣＤ２３５ａの発現をＦＡＣＳ方法で検出した。実験群と対照群はいずれも効率的に赤血球に分化でき、ＣＤ７１とＣＤ２３５ａの発現率はともに約８５％以上、分化効率が高く、効果はよかった。その中で、「３つのバッチの赤血球分化実験」とは、健康なドナーごとに、末梢血動員のサンプルを１つ取得し、ＣＤ３４陽性造血幹細胞を単離したが、これらの細胞について、３回の独立した遺伝子編集実験を行い、それぞれ３回の赤血球分化実験を行ったことを意味する。

【0190】

４．１．２ サラセミア患者
３００Ｖ １ｍｓのエレクトロポレーション条件を選択し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ－２をエレクトロポレーションして１０人のサラセミア患者の動員末梢血由来の造血幹細胞に導入し、対照群細胞にはエレクトロポレーションステップはなかった。そして、４．１．１の「二段階法」分化スキームを使用して複数のバッチの赤血球分化実験を行った。
図６に示すように、分化して１８日後に、ＣＤ７１とＣＤ２３５ａの発現を検出した。実験群と対照群はいずれも効率的に赤血球に分化でき、サラセミア患者によって赤血球の分化効率には差があり、ＣＤ７１とＣＤ２３５ａの二重陽性の比率は約６０～９５％である。これは、その分化効率が高く、効果がよいことを示している。
その中で、これら１０人のサラセミア患者のそれぞれから末梢血動員の１つのサンプルを取得し、ＣＤ３４陽性造血幹細胞を単離した。ここで、患者ドナー１のＣＤ３４陽性造血幹細胞に対して３回の独立した遺伝子編集実験を行い、及び３回の独立した赤血球分化実験を行った。患者ドナー６、９、及び１０のＣＤ３４陽性造血幹細胞に対してそれぞれ２回の独立した遺伝子編集実験および２回の赤血球分化実験を行った。残りの６人の患者ドナーに対して１回の遺伝子編集実験および１回の赤血球分化実験を行った。

【0191】

４．２ 健康なドナーに由来の造血幹細胞から分化した赤血球におけるγグロビン（ＨＢＧ）遺伝子のｍＲＮＡ発現の検出
図７と８に示すように、細胞のｍＲＮＡは、実施例４．１．１で造血幹細胞から分化した成熟赤血球から抽出され、ｃＤＮＡに逆転写され、ＢＣＬ１１ＡやＨＢＧなどの遺伝子のｍＲＮＡ発現を蛍光定量的ＰＣＲによって検出した。
実験結果は次のことを示している。
１）健康なドナー１の場合、３つのバッチの結果は、造血幹細胞のＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを編集した後、実験群のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の発現がダウンレギュレーションされ、対照群の発現の約４０～８０％であり、γグロビン（ＨＢＧ遺伝子）の遺伝子発現が有意に向上し、３つのバッチでの増加は、対照群の増加の約６～１０倍であることを示している。結果には、一貫性と安定性が高い。
２）健康なドナー２の場合、３つのバッチの結果は、造血幹細胞のＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを編集した後、実験群のＢＣＬ１１Ａ遺伝子の発現がダウンレギュレーションされ、対照群の発現の約４０～８０％であり、γグロビン（ＨＢＧ遺伝子）の遺伝子発現が有意に向上し、３つのバッチの繰り返し実験での増加は、対照群の増加の約１．５～３．５倍であることを示している。その結果にも一貫性と安定性が高い。
この実験の結果は、異なるドナーについて、ＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーのｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡをターゲットとしてエレクトロポレーションした後、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子発現のダウンレギュレーション比が両方とも２０～６０％であることをさらに証明している。ただし、γグロブリンの発現増加には大きな違いがある。健康なドナー１の場合、γグロビンの発現は６～１０倍に増加し、健康なドナー２のγグロビンの発現は１．５～３．５倍に増加した。その中で、「３つのバッチの赤血球分化実験」とは、健康なドナーごとに、末梢血動員のサンプルを１つ取得し、ＣＤ３４陽性造血幹細胞を単離したが、これらの細胞について、３回の独立した遺伝子編集実験を行い、それぞれ３回の赤血球分化実験を行い、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子とγグロビン（ＨＢＧ遺伝子）のｍＲＮＡレベル発現を検出したことを意味する。

【0192】

４．３ サラセミア患者に由来の造血幹細胞から分化した赤血球における胎児ヘモグロビンＨｂＦ発現の検出
図９Ａ、９Ｂ、及び１０に示すように、実施例４．１．２で造血幹細胞から分化した成熟赤血球を使用して、フローサイトメトリーにより細胞中の胎児ヘモグロビンＨｂＦの陽性発現比を検出した。
実験結果は次のことを示している。
１）編集されていない対照群と比較して、編集されたＣＤ３４陽性造血幹細胞から分化して得られた赤血球におけるＨｂＦの発現が増加した。
２）異なるサラセミア患者では、ＨｂＦ発現の増加の程度に有意差がある。患者ドナー１の３つのバッチの実験と患者ドナー７のＨｂＦ発現は、対照群の約１．３倍であり、患者ドナー２のＨｂＦ発現は、対照群の約２．３倍である。同じサラセミア患者での異なるバッチの実験は、ＨｂＦ発現の程度が非常に類似していることを示している。患者ドナー１の実験の２つのバッチは、ＨｂＦ発現が対照群の約１．３倍であり、患者ドナー９のＨｂＦ発現が対照群の約１．４倍であり、患者ドナー１０のＨｂＦ発現が対照群の約１．５～１．６倍であることを示している。
３）患者ドナー１における実験群のＨｂＦ発現は、対照群の１．２９±０．１２倍であった。 したがって、遺伝子編集後のＨｂＦ発現レベルが対照群と比較して少なくとも約１２％増加した場合、つまり１標準偏差の値であれば、このサラセミア患者に有効であると考えられる。

【0193】

実施例５：ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーの遺伝子編集による異常ヘモグロビン症の治療
実施例２．２、実施例４．２、及び実施例４．３の結果から簡単に分かるように、異なるドナーでは、ＢＣＬ１１Ａの赤血球エンハンサーのＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび同じのｓｇＲＮＡのエレクトロポレーション後、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの発現の増加には有意な差があった。その主な理由としては、本願の背景技術で説明されているように、成熟赤血球におけるγグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦｂの発現を調節および阻害するメカニズムが複雑であり、遠隔調節領域のＬＣＲが関与するだけでなく、また、ＢＣＬ１１Ａ、ＭＹＢ、ＫＬＦ１などの複数の転写因子が組み合わさって、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦを調節するためのスイッチとして機能する複合体を形成する（Ｇ． Ｌｅｔｔｒｅ、ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．２００８，１１８６９－１１８７４；Ｍａｒｉｎａ ｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１７；Ｍｅｇａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５）。これは、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦに対するＢＣＬ１１Ａの阻害効果に有意な個体差があることを意味する。
また、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの調節メカニズムは複雑であるが、同じ個体の場合、胎児期から出生して成年まで、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの調節メカニズムは比較的に定常である。つまり、γグロビンおよび胎児ヘモグロビンＨｂＦに対するＢＣＬ１１Ａ遺伝子の阻害の程度および効果は基本的に変化しない（ＰａｉｋａｒｉＡ ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０１８；Ｌｅｔｔｒｅ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１６；Ｇ．Ｌｅｔｔｒｅ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ．２００８，１１８６９－１１８７４；Ｍａｒｉｎａ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１７；Ｍｅｇａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５）。これは実施例４．２および４．３の結果からさらに確認されている。同じドナーについて、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位を遺伝子編集し、赤血球に分化し、γグロビン（ＨＢＧ遺伝子）のｍＲＮＡ発現および胎児ヘモグロビンＨｂＦを検出して分析した複数のバッチの実験では、それらの増加程度は一貫して安定している。

【0194】

したがって、本願の実験結果と現象と組み合わせると、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーの遺伝子編集による異常ヘモグロビン症の治療という現在の治療戦略には明らかに潜在的な欠陥がある。つまり、先行技術は、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦに対するＢＣＬ１１Ａの調節の程度と効果を予測していない。患者が高用量の骨髄除去薬と自己造血幹細胞移植を受けた後、治療スキームが無効になるか、効果が有意ではない可能性が非常に高く、患者に大きな害を及ぼす可能性がある。それに対して、本願は効果的な予測方法を提供する。つまり、異なる個人では、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの増加程度と効果は異なり、その結果も一貫して安定している。同じ個体の造血幹細胞の実験の異なるバッチでは、遺伝子編集後、ＢＣＬ１１Ａの発現がダウンレギュレートされ、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの増加の程度と効果は一貫して安定している。遺伝子編集後、胎児ヘモグロビンＨｂＦが少なくとも約１２％増加することができるなら、該治療スキームがサラセミア患者に効果的であると考えられる。

【0195】

図１１に示すように、該実験結果に基づいて、本願は、遺伝子編集されたＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー、すなわち、コンパニオン診断＋遺伝子編集された自己造血幹細胞療法を使用した異常ヘモグロビン症の新しい治療法を提出する。

【0196】

コンパニオン診断：遺伝子編集されたＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを使用して異常ヘモグロビン症の患者を治療する前に、該治療スキームの有効性を事前に予測できる。つまり、患者から少量の骨髄または末梢血を事前に抽出し、ＣＤ３４陽性造血幹細胞を分離し、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位を遺伝子編集した後、編集した細胞を成熟赤血球に分化させ、一連の指標を使用してγグロビン（ＨＢＧ遺伝子）と胎児ヘモグロビンＨｂＦの発現レベルを評価し、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの発現の増加程度が高い患者を優先治療対象として選択する。これによって、該治療スキームの有効性の可能性が高くなる。その中で、編集されていない対照群と比較して、実験群の胎児ヘモグロビンＨｂＦの発現は少なくとも約１２％増加した場合しか、治療を受けている患者は臨床的に利益を得る可能性がない。なぜなら、ヘモグロビン含有量が９０ｇ／Ｌに達した患者は輸血依存性がなくなれると臨床的に考えられているから、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの発現の増加程度がより高い患者を治療に選択すると、輸血依存性がなくなる可能性がより高い。一方、９０ｇ／Ｌの患者は輸血を必要としなくなることができるが、それでも軽度の貧血（９０～１１０ｇ／Ｌ）を示し、骨の発達にも影響を与える可能性がある（正常な男性のヘモグロビン含有量は１２０～１６０ｇ／Ｌの範囲であり、女性は１１０～１５０ｇ／Ｌである）。γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの発現の増加程度がより高い患者を治療に選択すると、患者が完全に回復する可能性もより高くなる。したがって、異常ヘモグロビン症を治療するために遺伝子編集されたＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを使用する治療戦略の目標は、患者の総ヘモグロビンの発現量を可能な限り高くし、正常な人の基準に到達させることであり、その効果はより有意であり、患者はより大きい利益を得ることができる。また、本願で開発された予測方法は、少量の骨髄または末梢血を抽出するだけでよく、プロセスは簡単である。患者は、骨髄に造血幹細胞を大量に産生させるために複雑な手順を経て動員剤を受ける必要がなく、スクリーニング期間中にブスルファンやフルダラビンなどの骨髄除去薬やリンパ除去薬を大量に注射することはなく、患者の健康は保証される。

【0197】

遺伝子編集された自己造血幹細胞による治療：本願で開発されたコンパニオン診断法は、最終的に治療に含まれる異常ヘモグロビン症の被験者を決定するために使用される。次に、遺伝子編集された自己造血幹細胞治療プロセスに入る。１．被験者には、骨髄動員のために顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）または／およびｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ（デケモカイン受容体ＣＸＣＲ４のアンタゴニスト）を投与し、骨髄に大量の造血幹細胞を生成させて末梢血循環系に放出する。２．動員が完了した後、遺伝子編集細胞治療製品の製造プロセスに入り、まず、ＣＤ３４磁気ビーズのラベリングとソーティングによってＣＤ３４陽性造血幹細胞を取得して培養する。次に、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡをエレクトロポレーションして、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサー部位を編集する。最後に、細胞を凍結保存し、品質管理と安全性の評価段階に入り、リリース基準に達した後、患者に再注入するように準備できる。３．製品の準備とリリースが正常に行われた後、臨床医は被験者に入院を通知し、前処理の化学療法（骨髄除去薬ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆａｎ）または／および、リンパ除去薬シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）とフルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ））を投与する。ただし、異なる臨床機関が異なる前処理スキームを採用する可能性があり、ブスルファンなどの骨髄除去薬のみを使用する臨床機関もあり、シクロホスファミドやフルダラビンなどの骨髄除去およびリンパ除去薬を使用する臨床機関もある。前処理が完了した後、遺伝子編集された自己造血幹細胞を、２×１０⁶以上の活性ＣＤ３４陽性細胞／ｋｇの投与量で１回のみの静脈注射によって再注入する。４．注射が完了した後、安全性、耐容性、および有効性の指標を評価するために、少なくとも２年間被験者をフォローアップする。

【産業上の利用可能性】

【0198】

本願によれば、本出願の方法は、以下の利点を有する。第一に、本願は、異なる個体において、遺伝子編集された造血幹細胞が、ＢＣＬ１１Ａの発現をダウンレギュレートした後、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの増加程度と影響が異なり、同じ個体では、遺伝子編集された造血幹細胞がＢＣＬ１１Ａの発現をダウンレギュレートした後、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの増加程度と影響は一貫して安定していることを初めて発見し、先行技術の空白を埋めた。第二に、本願は、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーの遺伝子編集後の胎児ヘモグロビンＨｂＦの増加程度の有効性しきい値を初めて設定し、すなわち、編集後のＨｂＦが少なくとも約１２％増加する場合、患者が治療を受けた後、症状が大幅に改善する可能性があり、輸血の頻度を減らしたり、輸血をなくしたりする可能性がある。第三に、本願で開発されたコンパニオン診断方法は操作が簡単であり、スクリーニング期間（患者のスクリーニング期間は通常２～３か月続く）にある治療の予定の患者から少量の骨髄または末梢血を抽出し、ＣＤ３４陽性造血幹細胞を単離し、ＢＣＬ１１Ａ赤血球エンハンサーを遺伝子編集し、赤血球分化させ、γグロビンおよび胎児ヘモグロビンＨｂＦの増加の程度を検出するだけでよい。評価プロセス全体は完了するのに３～４週間しかかからず、γグロビンおよび胎児ヘモグロビンＨｂＦに対するＢＣＬ１１Ａ遺伝子の調節効果の個体差によって引き起こされる治療方法の失敗または効果が有意ではないリスクが回避される。第四に、本願で開発された方法は、遺伝子編集技術による異常ヘモグロビン症の治療スキームでの患者の層別化および分級治療に有益である。すなわち、γグロビンと胎児ヘモグロビンＨｂＦの増加程度がより高い患者は、優先治療レベルにある。第五に、本願は、コンパニオン診断と遺伝子編集された自己造血幹細胞療法を組み合わせて、遺伝子編集による異常ヘモグロビン症の治療の安全性と有効性を改善する斬新な治療スキームを提出している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2022-05-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

個体の異常ヘモグロビン症を治療するための個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）であって、当該集団を
評価ステップによる機能評価に基づいて前記個体を治療のために選択し、前記評価ステップは、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下した（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記集団。

【請求項2】

異常ヘモグロビン症に罹患している個体に、前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）による治療に適するかどうかを測定する方法であって、前記方法は、修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含む評価ステップを含み、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が前記個体に由来し、修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させており（「修飾されたＥＶ細胞」）、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成した場合、前記個体が治療に適し、前記修飾されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第１の集団が必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成しない場合、前記個体が、前記修飾されたＴＲ細胞による治療には適しない、前記方法。

【請求項3】

前記評価ステップは、
ａ）前記個体の骨髄または末梢血サンプルからＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＥＶ細胞」）を得ること、
ｂ）単離されたＥＶ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第１の集団（「修飾されたＥＶ細胞」）を得ること、及び
ｃ）修飾されたＥＶ細胞の分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する能力を評価することを含み、及び／又は
前記治療のステップは、
ａ）前記個体の骨髄中のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣが末梢血に入るように動員して末梢血中のＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの量を増加させること、
ｂ）前記個体の末梢血からＣＤ３４陽性ＨＳＰＣを単離して、単離されたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ集団（「単離されたＴＲ細胞」）を得ること、
ｃ）単離されたＴＲ細胞を修飾して、ＢＣＬ１１Ａ機能が低下した修飾ＣＤ３４陽性ＨＳＰＣ細胞の第２の集団（「修飾されたＴＲ細胞」）を得ること、及び
ｄ）有効量の修飾されたＴＲ細胞を前記個体に投与することを含む、
請求項１に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項２に記載する方法。

【請求項4】

前記修飾されたＥＶ細胞は、遺伝子修飾することによって修飾されたものであり、及び／又は
単離されたＥＶ細胞を修飾することは、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾することを含み、好ましくは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術からなる群から選択される技術により、単離されたＥＶ細胞を遺伝子修飾する、請求項１又は３のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項２若しくは３に記載する方法。

【請求項5】

前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロブリンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾されたＥＶ細胞の能力を評価し、前記評価ステップは、１）赤血球集団を得るように分化を可能にする条件下で、修飾されたＥＶ細胞を培養すること、及び２）前記赤血球によって生成されるγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のレベルを決定することを含む、請求項１、３又は４のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項２～４のいずれか１項に記載する方法。

【請求項6】

前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾されたＥＶ細胞の能力を評価することは、γ－グロビンのｍＲＮＡのレベルを決定することを含み、及び／又は
前記評価ステップでは、分化後に必要なレベルのγ－グロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を生成する修飾されたＥＶ細胞の能力を評価することは、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）のタンパク質のレベルを決定することを含む、
請求項１、３、４又は５のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項２～５のいずれか１項に記載する方法。

【請求項7】

前記個体は、評価ステップの前に動員または前処理を経ていなく、及び／又は、
前記評価ステップは、前記治療のステップの前に少なくとも１回繰り返される、
請求項１、３、４、５又は６のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項２～６のいずれか１項に記載する方法。

【請求項8】

前記修飾されたＴＲ細胞は、遺伝子修飾することによって修飾されたものである、請求項１、３、４、５、６又は７のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項２～７のいずれか１項に記載する方法。

【請求項9】

単離されたＴＲ細胞を修飾することは、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾することを含み、
好ましくは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、ＲＮＡ編集、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術からなる群から選択される技術により、単離されたＴＲ細胞を遺伝子修飾する、
請求項３～８のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項３～８のいずれか１項に記載する方法。

【請求項10】

前記治療のステップにおけるＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの動員は、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）および／またはプレリキサフォル（ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）を使用して前記個体を治療することを含む、請求項３～９のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項３～９のいずれか１項に記載する方法。

【請求項11】

前記治療のステップは、前記修飾されたＴＲ細胞を投与する前に前記個体を前処理することをさらに含み、
好ましくは、前記前処理は、化学療法、モノクローナル抗体療法、または全身放射線療法を含み、
更に好ましくは、前記前処理は、化学療法を含み、
更に好ましくは、前記化学療法は、ブスルファン、シクロホスファミド、およびフルダラビンからなる群から選択される１つ以上の化学療法剤を前記個体に投与することを含む、
請求項１又は３～１０のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項２～１０のいずれか１項に記載する方法。

【請求項12】

単離されたＴＲ細胞は、修飾する前に１日以上培養され、
好ましくは、個体に投与する前に、前記修飾されたＴＲ細胞を１日以上培養する、
請求項３～１１のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項３～１１のいずれか１項に記載する方法。

【請求項13】

修飾されたＴＲ細胞を個体に投与する前に、前記修飾されたＴＲ細胞を凍結条件下で少なくとも２４時間保存する、
好ましくは、凍結条件下で保存する前に、修飾されたＴＲ細胞を１日以上培養する、
請求項１又は３～１２のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項２～１２のいずれか１項に記載する方法。

【請求項14】

前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球症、鎌状赤血球形質、ヘモグロビンＣ症、ヘモグロビンＣ形質、ヘモグロビンＳ／Ｃ症、ヘモグロビンＤ症、ヘモグロビンＥ症、サラセミア、酸素親和性が増加したヘモグロビン関連障害、酸素親和性が低下したヘモグロビン関連障害、不安定なヘモグロビン症、およびメトヘモグロビン血症からなる群から選択され、
好ましくは、前記異常ヘモグロビン症は、β－サラセミアと鎌状赤血球貧血からなる群から選択され、
更に好ましくは、前記異常ヘモグロビン症は、β０またはβ＋サラセミアである、
請求項１又は３～１３のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項２～１３のいずれか１項に記載する方法。

【請求項15】

前記治療のステップは、前記評価ステップの直後に実行される、請求項１又は３～１４のいずれか１項に記載の修飾されてＢＣＬ１１Ａ機能を低下させたＣＤ３４陽性ＨＳＰＣの第２の集団又は請求項２～１４のいずれか１項に記載する方法。

【国際調査報告】