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特表2022-531285染色体外ＤＮＡの特定および使用の方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-06
(54)【発明の名称】染色体外ＤＮＡの特定および使用の方法
(51)【国際特許分類】
   C12Q 1/6806 20180101AFI20220629BHJP
   C12Q 1/686 20180101ALI20220629BHJP
   C12Q 1/6869 20180101ALI20220629BHJP
   C12N 15/09 20060101ALN20220629BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021564693
(86)(22)【出願日】2020-04-29
(85)【翻訳文提出日】2021-12-22
(86)【国際出願番号】 US2020030408
(87)【国際公開番号】W WO2020223309
(87)【国際公開日】2020-11-05
(31)【優先権主張番号】62/840,735
(32)【優先日】2019-04-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】398066918
【氏名又は名称】ザ ジャクソン ラボラトリー
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＪＡＣＫＳＯＮ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100188374
【弁理士】
【氏名又は名称】一宮 維幸
(72)【発明者】
【氏名】ウエイ，チア－リン
(72)【発明者】
【氏名】ウォン，チー・ホーン
(72)【発明者】
【氏名】チョン，ハリアント
(72)【発明者】
【氏名】バーハーク，ロエル
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QR20
4B063QR48
4B063QR50
4B063QS25
4B063QS33
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、染色体外環状ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）を特定する方法、ならびにｅｃＤＮＡと腫瘍遺伝子転写との間の相互作用を特定し、評価する方法を、部分的に包含する。
【選択図】図２Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞において染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）を特定する方法であって、
（ａ）非線形ＤＮＡ分子と、染色体対の少なくとも１つの線形染色体との間のクロマチン相互作用を検出するステップであって、前記相互作用が、前記非線形ＤＮＡ分子と、前記染色体対の前記少なくとも１つの線形染色体との間の接触を含み、
（ｉ）前記細胞における、有意に高い頻度の、検出されたクロマチン相互作用、
（ｉｉ）前記細胞における、前記非線形ＤＮＡ分子と、前記染色体対のそれぞれの少なくとも１つの線形染色体との間の接触、および
（ｉｉｉ）複数の細胞における、前記非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数の経時的な増加
の存在が、前記非線形ＤＮＡ分子をｅｃＤＮＡとして特定する、ステップ
を含む、方法。
【請求項2】
検出されたクロマチン相互作用の頻度を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記非線形ＤＮＡのサイズを決定するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記細胞における前記非線形ＤＮＡ分子のコピー数を決定するステップをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
第１の時点で、複数の細胞において前記非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数を決定するステップと、決定された平均を、対照の前記非線形ＤＮＡの細胞当たりの平均コピー数と比較するステップとをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記対照の前記非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数が、異なる時点で前記複数の細胞において決定された前記非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記非線形ＤＮＡの少なくとも一部分の配列を決定するステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
決定された配列において、腫瘍遺伝子配列の存在を特定するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記細胞が、がん細胞である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記細胞が、前記がん細胞を含む複数の細胞から得られたものである、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記細胞が、対象から得られたものである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記対象が、がんと診断されているか、がんを有することが疑われるか、およびがんを有する危険性があるかのうちの少なくとも１つである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞が、細胞培養物から得られたものである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記細胞が、脊椎動物細胞である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞が、哺乳動物細胞であり、任意選択で、ヒト細胞である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
ｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子を特定する方法であって、
（ａ）ｅｃＤＮＡと、細胞内に位置する１つまたは複数の標的遺伝子との間の相互作用を検出するステップであって、前記ｅｃＤＮＡと、前記１つまたは複数の標的遺伝子の制御エレメントとの間のクロマチン相互作用を直接的に測定することを含む、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において検出された相互作用によって前記標的遺伝子の転写がモジュレートされている、前記相互作用に係る前記標的遺伝子のうちの１つまたは複数を特定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において特定された前記標的遺伝子のうちの１つまたは複数が、腫瘍遺伝子であるかどうかを決定するステップであって、前記標的遺伝子を腫瘍遺伝子として決定することが、前記腫瘍遺伝子を、ｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子として特定する、ステップと
を含む、方法。
【請求項17】
ステップ（ｂ）における前記特定が、前記特定された標的遺伝子の転写レベルを測定すること、および測定されたレベルを、対照の前記標的遺伝子の転写レベルと比較することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記転写のモジュレーションが、転写の増加である、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
ステップ（ａ）における検出手段が、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ法を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
ステップ（ａ）における検出手段が、Ｈｉ－Ｃ法を含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記制御エレメントが、前記標的遺伝子のプロモーターを含む、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記標的遺伝子が、線形染色体上に位置する、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記標的遺伝子が、第２のｅｃＤＮＡ上に位置する、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記細胞が、がん細胞である、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記細胞が、前記がん細胞を含む複数の細胞から得られたものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞が、対象から得られたものである、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記対象が、がんと診断されているか、がんを有することが疑われるか、およびがんを有する危険性があるかのうちの少なくとも１つである、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記細胞が、細胞培養物から得られたものである、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記細胞が、脊椎動物細胞である、請求項１６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記細胞が、哺乳動物細胞であり、任意選択で、ヒト細胞である、請求項１６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
がんの腫瘍遺伝子ステータスを決定する方法であって、
（ａ）がん細胞において、ｅｃＤＮＡによってモジュレートされる腫瘍遺伝子を特定するステップと、（ｂ）前記がんの前記腫瘍遺伝子ステータスの決定として、前記腫瘍遺伝子の前記ｅｃＤＮＡモジュレーションのレベルおよび作用のうちの１つまたは複数を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項32】
ステップ（ａ）における特定手段が、
（ｉ）ｅｃＤＮＡと、がん細胞のＤＮＡに位置する１つまたは複数の標的遺伝子との間の相互作用を検出するステップであって、前記検出が、前記ｅｃＤＮＡと前記１つまたは複数の標的遺伝子の制御エレメントとの間のクロマチン相互作用を直接的に測定することを含む、ステップと、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において検出された相互作用によって前記１つまたは複数の標的遺伝子の転写がモジュレートされている、前記検出された相互作用における前記標的遺伝子を特定するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において特定された前記標的遺伝子のうちの１つまたは複数が、腫瘍遺伝子であるかどうかを決定するステップであって、前記標的遺伝子を腫瘍遺伝子として決定することが、前記腫瘍遺伝子を、がん細胞においてｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子として特定する、ステップと
を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
ステップ（ｉｉ）における前記特定が、前記特定された標的遺伝子の転写レベルを測定すること、および測定されたレベルを、対照の前記標的遺伝子の転写レベルと比較することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記転写のモジュレーションが、転写の増加である、請求項３１に記載の方法。
【請求項35】
ステップ（ｉ）における検出手段が、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ法を含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
ステップ（ｉ）における検出手段が、Ｈｉ－Ｃ法を含む、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
前記制御エレメントが、前記標的遺伝子のプロモーターを含む、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項38】
前記標的遺伝子が、線形染色体上に位置する、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記標的遺伝子が、第２のｅｃＤＮＡ上に位置する、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記細胞が、がん細胞である、請求項３１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記細胞が、前記がん細胞を含む複数の細胞から得られたものである、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記細胞が、対象から得られたものである、請求項３１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記対象が、がんと診断されているか、がんを有することが疑われるか、およびがんを有する危険性があるかのうちの少なくとも１つである、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記細胞が、細胞培養物から得られたものである、請求項３１から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記細胞が、脊椎動物細胞である、請求項３１から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記細胞が、哺乳動物細胞であり、任意選択で、ヒト細胞である、請求項３１から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記腫瘍遺伝子の前記ｅｃＤＮＡモジュレーションのレベルおよび作用のうちの１つまたは複数を検出するための手段が、モジュレートするｅｃＤＮＡとモジュレートされる腫瘍遺伝子との間の染色体間クロマチン接触頻度を直接的に測定することを含む、請求項３１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
腫瘍遺伝子のｅｃＤＮＡモジュレーションのレベルおよび作用のうちの１つまたは複数を検出するための手段が、前記１つまたは複数のｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子の転写のレベルを決定することを含み、転写のレベルが前記がんの腫瘍遺伝子ステータスを決定する、請求項３１から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
がんを含む第２の複数の細胞から得られたがん細胞において、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、第１の複数の細胞から得られたがん細胞において検出された１つまたは複数のレベルまたは作用を、それぞれ、前記第２の複数の細胞から得られたがん細胞において検出されたレベルまたは作用と比較するステップとをさらに含み、
レベルおよび作用のうちの一方または両方における差が、前記がんの前記腫瘍遺伝子ステータスにおける変化を示す、請求項４１から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記第１の複数のがん細胞の前記がんにおける前記腫瘍遺伝子ステータスを決定した後、および前記第２の複数のがん細胞の前記腫瘍遺伝子ステータスを決定する前に、候補治療剤を、前記第２の複数のがん細胞と接触させるステップと、
前記第２の複数のがん細胞の前記腫瘍遺伝子ステータスに対する、前記候補治療剤との前記接触の作用を決定するステップと
をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記第１および第２の複数の細胞が、対象から得られたものである、請求項４１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記対象が、がんと診断されているか、がんを有することが疑われるか、およびがんを有する危険性があるかのうちの１つまたは複数である、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記第１および第２の複数の細胞が、細胞培養物から得られたものである、請求項４１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記がん細胞が、哺乳動物細胞であり、任意選択で、ヒト細胞である、請求項３１から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記第１および第２の複数の細胞が、がん細胞を含む、請求項４１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
決定された前記がんの腫瘍遺伝子ステータスに少なくとも部分的に基づいて、前記がんの処置の選択を補助するステップ
をさらに含む、請求項３１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
がん細胞において、１つまたは複数の追加のｅｃＤＮＡによってモジュレートされる１つまたは複数の追加の腫瘍遺伝子を特定するステップと、前記がんの前記腫瘍遺伝子ステータスの決定として、前記特定された１つまたは複数の追加の腫瘍遺伝子の前記ｅｃＤＮＡモジュレーションのレベルおよび作用のうちの１つまたは複数を決定するステップとをさらに含む、請求項３１から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
細胞において染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）を特定する方法であって、クロマチン相互作用分析法を使用して、非線形ＤＮＡ分子と少なくとも１つの線形染色体との間の物理的相互作用を直接的に検出するステップを含み、クロマチン相互作用分析法が、
ａ）細胞を固定液と接触させ、前記細胞から単離されたＤＮＡに対してクロマチン近接ライゲーションを行うステップと、
ｂ）クロマチン免疫沈降を行うステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）において免疫沈降したＤＮＡからライブラリーを生成するステップと、
ｄ）ステップ（ｃ）において生成されたライブラリーをシーケンシングして、シーケンシングデータを生成するステップと、
ｅ）ステップ（ｄ）において生成されたシーケンシングデータを分析して、ｅｃＤＮＡを検出するステップと
を含む、方法。
【請求項59】
ステップ（ａ）～（ｃ）が、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ法またはＨＩ－Ｃ法を使用して行われる、請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
ステップ（ｂ）が、前記クロマチン免疫沈降における抗ＲＮＡＰＩＩ抗体の使用を含む、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項61】
ステップ（ｃ）および（ｄ）が、それぞれ、ペアエンドタグおよび高スループットシーケンシングの使用を含む、請求項５８から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記検出された物理的相互作用の頻度を決定するステップをさらに含む、請求項５８から６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
前記非線形ＤＮＡ分子のサイズを決定するステップをさらに含む、請求項５８から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記細胞における前記非線形ＤＮＡ分子のコピー数を決定するステップをさらに含む、請求項５８から６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
第１の時点で、複数の細胞において前記非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数を決定するステップと、決定された平均を、対照の前記非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数と比較するステップとをさらに含む、請求項５８から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記対照の前記非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数が、異なる時点で前記複数の細胞において決定された前記非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数である、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記非線形ＤＮＡ分子の少なくとも一部分の配列を決定するステップをさらに含む、請求項５８から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
決定された配列において、腫瘍遺伝子配列の存在を特定するステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
前記細胞が、がん細胞である、請求項５８から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記細胞が、がん細胞を含む複数の細胞から得られたものである、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記細胞が、対象から得られたものである、請求項５８から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記対象が、がんと診断されているか、がんを有することが疑われるか、およびがんを有する危険性があるかのうちの少なくとも１つである、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記細胞が、細胞培養物から得られたものである、請求項５８から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項74】
前記細胞が、脊椎動物細胞である、請求項５８から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項75】
前記細胞が、哺乳動物細胞であり、任意選択で、ヒト細胞である、請求項５８から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
複数の細胞にステップ（ａ）～（ｅ）を行うステップをさらに含む、請求項５８から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項77】
対象においてがんを低減させるための処置を選択する方法であって、
対象から得られたがん細胞において１つまたは複数の特定のｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子の存在を特定するステップと、前記特定されたｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子に基づいて１つまたは複数の処置を選択するステップと
を含む、方法。
【請求項78】
前記特定するステップが、請求項１から１５および５８から７６のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）のもとに、２０１９年４月３０日に出願された米国仮出願第６２／８４０，７３５号の利益を主張し、そのすべての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府の関与
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＨＩ）によって授与された付与番号ＮＣＩ Ｐ３０ＣＡ０３４１９６、Ｕ５４ ＤＫ１０７９６７、ＵＭ１ ＨＧ００９４０９、およびＲ０１ ＣＡ１９０１２１のもとに、政府の支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【0003】
発明の分野
本発明は、一部の態様において、染色体外環状ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）を特定する方法、およびｅｃＤＮＡを使用して標的遺伝子の転写を評価する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）は、染色体外の環状クロマチンエレメントである［Cox, D. et al. (1965) Lancet 1, 55-58、Spriggs, A. I. et al. (1962) Br Med J 2, 1431-1435］。最初は顕微鏡イメージングにより細胞の核型において「二重微小クロマチン体」として説明されており［Cox, D. et al. (1965) Lancet 1, 55-58］、ｅｃＤＮＡは、インビトロ薬物耐性と関連する遺伝子増幅の様式であると考えられていた［Spriggs, A. I. et al. (1962) Br Med J 2, 1431-1435、deCarvalho, A. C. et al. (2018) Nat Genet 50, 708-717、Nathanson, D. A. et al. (2014) Science 343, 72-76］。より最近では、ｅｃＤＮＡは、原発性がんに共通していること［Xu, K. et al. (2018) Acta Neuropathol, doi:10.1007/s00401-018-1912-1］、および腫瘍遺伝子の増幅のための真正な機序および適応性リザーバを構成すること［Turner, K. M. et al. (2017) Nature 543, 122-125］が見出されている。ｅｃＤＮＡは、クロモスリプシスゲノム破砕事象を通じて誘導され得、その結果として、数百個のＤＮＡセグメントからなり得る［Ma, K. et al. (2012) Int J Mol Sci 13, 11974-11999］。がん細胞におけるこれらの蓄積は、腫瘍微小環境における選択圧に応答して、および細胞傷害性治療剤に応答して、競合的利点をもたらす［Spriggs, A. I. et al. (1962) Br Med J 2, 1431-1435、Kohl, N. E. et al. (1983) Cell 35, 359-367］。遺伝様式の崩壊の結果として起こるｅｃＤＮＡレベルの急速な変動［Spriggs, A. I. et al. (1962) Br Med J 2, 1431-1435］は、腫瘍発達機序に寄与する可能性が高い。神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、ｅｃＤＮＡが高頻度で観察される侵攻性の脳腫瘍である［Rausch, T. et al. (2012) Cell 148, 59-71、Xue, Y. et al. (2017) Nat Med 23, 929-937］。標準的なゲノムアプローチを使用した固有なＧＢＭ由来のニューロスフェア培養物セットのこれまでの分析により、ＥＧＦＲ、ＭＹＣ、およびＣＤＫ４を含む、腫瘍遺伝子を有する複数のｅｃＤＮＡが検出された［Spriggs, A. I. et al. (1962) Br Med J 2, 1431-1435］。ｅｃＤＮＡの存在およびそれらの構造情報は、これらの標準的なアプローチによって特徴付けられ始めているが、ｅｃＤＮＡが展開されてがん進行をモジュレートし、がん薬物耐性に寄与する機序については、依然としてわかっていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明の態様によると、細胞において染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）を特定する方法であって、（ａ）非線形ＤＮＡ分子と、染色体対の少なくとも１つの線形染色体との間のクロマチン相互作用を検出するステップであって、相互作用が、非線形ＤＮＡ分子と染色体対の少なくとも１つの線形染色体との間の接触を含み、（ｉ）細胞における、有意に高い頻度の検出されたクロマチン相互作用、（ｉｉ）細胞における、非線形ＤＮＡ分子と染色体対のそれぞれの少なくとも１つの線形染色体との間の接触、ならびに（ｉｉｉ）複数の細胞における非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数の経時的な増加の存在が、非線形ＤＮＡ分子をｅｃＤＮＡとして特定する、ステップを含む、方法が、提供される。一部の実施形態において、本方法はまた、検出されたクロマチン相互作用の頻度を決定するステップも含む。ある特定の実施形態において、本方法はまた、非線形ＤＮＡのサイズを決定するステップも含む。一部の実施形態において、本方法はまた、細胞における非線形ＤＮＡ分子のコピー数を決定するステップも含む。一部の実施形態において、本方法はまた、第１の時点で、複数の細胞において非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数を決定するステップと、決定された平均を、対照の非線形ＤＮＡの細胞当たりの平均コピー数と比較するステップとを含む。ある特定の実施形態において、対照の非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数は、異なる時点で複数の細胞において決定された非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数である。一部の実施形態において、本方法はまた、非線形ＤＮＡの少なくとも一部分の配列を決定するステップも含む。ある特定の実施形態において、本方法は、決定された配列において腫瘍遺伝子配列の存在を特定するステップも含む。一部の実施形態において、細胞は、がん細胞である。一部の実施形態において、細胞は、前がん性細胞である。一部の実施形態において、細胞は、がん細胞を含む複数の細胞から得られたものである。ある特定の実施形態において、細胞は、対象から得られたものである。一部の実施形態において、対象は、がんと診断されているか、がんを有することが疑われるか、およびがんを有する危険性があるかのうちの少なくとも１つである。一部の実施形態において、細胞は、細胞培養物から得られたものである。ある特定の実施形態において、細胞は、脊椎動物細胞である。一部の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞であり、任意選択で、ヒト細胞である。
【0006】
本発明の別の態様によると、ｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子を特定する方法であって、（ａ）ｅｃＤＮＡと、細胞に位置する１つまたは複数の標的遺伝子との間の相互作用を検出するステップであって、検出が、ｅｃＤＮＡと１つまたは複数の標的遺伝子の制御エレメントとの間のクロマチン相互作用を直接的に測定することを含む、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において検出された相互作用によって前記標的遺伝子の転写がモジュレートされている、前記相互作用に係る前記標的遺伝子のうちの１つまたは複数を特定するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において特定された標的遺伝子のうちの１つまたは複数が腫瘍遺伝子であるかどうかを決定するステップであって、標的遺伝子を腫瘍遺伝子として決定することが、腫瘍遺伝子をｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子として特定する、ステップとを含む、方法が、提供される。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）における特定は、特定された標的遺伝子の転写のレベルを測定すること、および測定されたレベルを、対照の標的遺伝子の転写レベルと比較することを含む。ある特定の実施形態において、転写のモジュレーションは、転写の増加である。一部の実施形態において、ステップ（ａ）における検出の手段は、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ法を含む。一部の実施形態において、ステップ（ａ）の検出の手段は、Ｈｉ－Ｃ法を含む。一部の実施形態において、制御エレメントは、標的遺伝子のプロモーターを含む。ある特定の実施形態において、標的遺伝子は、線形染色体上に位置している。一部の実施形態において、標的遺伝子は、ｅｃＤＮＡに位置している。ある特定の実施形態において、標的遺伝子は、第２のｅｃＤＮＡに位置している。一部の実施形態において、細胞は、がん細胞である。一部の実施形態において、細胞は、前がん性細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、がん細胞を含む複数の細胞から得られたものである。一部の実施形態において、細胞は、対象から得られたものである。一部の実施形態において、対象は、がんと診断されているか、がんを有することが疑われるか、およびがんを有する危険性があるかのうちの少なくとも１つである。一部の実施形態において、細胞は、細胞培養物から得られたものである。ある特定の実施形態において、細胞は、脊椎動物細胞である。一部の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞であり、任意選択で、ヒト細胞である。
【0007】
本発明の別の態様によると、がんの腫瘍遺伝子ステータスを決定する方法であって、（ａ）がん細胞において、ｅｃＤＮＡによってモジュレートされる腫瘍遺伝子を特定するステップと、（ｂ）がんの腫瘍遺伝子ステータスの決定として、腫瘍遺伝子のｅｃＤＮＡモジュレーションのレベルおよび作用のうちの１つまたは複数を決定するステップとを含む、方法が提供される。一部の実施形態において、ステップ（ａ）における特定の手段は、（ｉ）ｅｃＤＮＡと、がん細胞のＤＮＡに位置する１つまたは複数の標的遺伝子との間の相互作用を検出するステップであって、検出が、ｅｃＤＮＡと１つまたは複数の標的遺伝子の制御エレメントとの間のクロマチン相互作用を直接的に測定することを含む、ステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）において検出された相互作用によって前記１つまたは複数の標的遺伝子の転写がモジュレートされている、前記検出された相互作用における前記標的遺伝子を特定するステップと、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において特定された標的遺伝子のうちの１つまたは複数が、腫瘍遺伝子であるかどうかを決定するステップであって、標的遺伝子を腫瘍遺伝子として決定することが、腫瘍遺伝子をがん細胞におけるｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子として特定する、ステップとを含む。ある特定の実施形態において、ステップ（ｉｉ）における特定は、特定された標的遺伝子の転写のレベルを測定すること、および測定されたレベルを、対照の標的遺伝子の転写レベルと比較することを含む。一部の実施形態において、転写のモジュレーションは、転写の増加である。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）における検出の手段は、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ法を含む。一部の実施形態において、ステップ（ｉ）の検出の手段は、Ｈｉ－Ｃ法を含む。ある特定の実施形態において、制御エレメントは、標的遺伝子のプロモーターを含む。一部の実施形態において、プロモーターの活性化は、標的遺伝子の転写を増加させる。一部の実施形態において、標的遺伝子は、線形染色体上に位置している。ある特定の実施形態において、標的遺伝子は、ｅｃＤＮＡに位置している。一部の実施形態において、標的遺伝子は、第２のｅｃＤＮＡに位置している。一部の実施形態において、細胞は、がん細胞である。一部の実施形態において、細胞は、前がん性細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、がん細胞を含む複数の細胞から得られたものである。一部の実施形態において、細胞は、対象から得られたものである。一部の実施形態において、対象は、がんと診断されているか、がんを有することが疑われるか、およびがんを有する危険性があるかのうちの少なくとも１つである。一部の実施形態において、細胞は、細胞培養物から得られたものである。一部の実施形態において、細胞は、脊椎動物細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞であり、任意選択で、ヒト細胞である。一部の実施形態において、腫瘍遺伝子のｅｃＤＮＡモジュレーションのレベルおよび作用のうちの１つまたは複数を検出するための手段は、モジュレートするｅｃＤＮＡとモジュレートされる腫瘍遺伝子との間の染色体間クロマチン接触頻度を直接的に測定することを含む。一部の実施形態において、腫瘍遺伝子のｅｃＤＮＡモジュレーションのレベルおよび作用のうちの１つまたは複数を検出するための手段は、１つまたは複数のｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子の転写のレベルを決定することを含み、転写のレベルにより、がんの腫瘍遺伝子ステータスを決定する。ある特定の実施形態において、本方法はまた、がんを含む第２の複数の細胞から得られたがん細胞において、ステップ（ａ）および（ｂ）を繰り返すステップと、第１の複数の細胞から得られたがん細胞において検出された１つまたは複数のレベルまたは作用を、それぞれ、第２の複数の細胞から得られたがん細胞において検出されたレベルまたは作用と比較するステップとを含み、レベルおよび作用のうちの一方または両方における差が、がんの腫瘍遺伝子ステータスにおける変化を示す。一部の実施形態において、本方法はまた、第１の複数のがん細胞のがんにおける腫瘍遺伝子ステータスを決定した後、および第２の複数のがん細胞の腫瘍遺伝子ステータスを決定する前に、候補治療剤を、第２の複数のがん細胞と接触させるステップ、ならびに第２の複数のがん細胞の腫瘍遺伝子ステータスに対する候補治療剤との接触の作用を決定するステップも含む。一部の実施形態において、第１および第２の複数の細胞は、対象から得られたものである。ある特定の実施形態において、対象は、がんと診断されているか、がんを有することが疑われるか、およびがんを有する危険性があるかのうちの１つまたは複数である。一部の実施形態において、第１および第２の複数の細胞は、細胞培養物から得られたものである。一部の実施形態において、がん細胞は、哺乳動物細胞であり、任意選択で、ヒト細胞である。ある特定の実施形態において、第１および第２の複数の細胞は、がん細胞を含む。一部の実施形態において、本方法はまた、決定されたがんの腫瘍遺伝子ステータスに少なくとも部分的に基づいて、がんの処置の選択を補助するステップを含む。ある特定の実施形態において、本方法はまた、がん細胞において、１つまたは複数の追加のｅｃＤＮＡによってモジュレートされる１つまたは複数の追加の腫瘍遺伝子を特定するステップと、がんの腫瘍遺伝子ステータスの決定として、特定された１つまたは複数の追加の腫瘍遺伝子のｅｃＤＮＡモジュレーションのレベルおよび作用のうちの１つまたは複数を決定するステップとを含む。
【0008】
本発明の別の態様によると、細胞において染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）を特定する方法であって、クロマチン相互作用分析法を使用して、非線形ＤＮＡ分子と少なくとも１つの線形染色体との間の物理的相互作用を直接的に検出するステップを含み、この分析方法が、（ａ）細胞を固定液と接触させ、細胞から単離されたＤＮＡに対してクロマチン近接ライゲーションを行うステップと、（ｂ）クロマチン免疫沈降を行うステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において免疫沈降されたＤＮＡからライブラリーを生成するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）において生成されたライブラリーをシーケンシングして、シーケンシングデータを生成するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において生成されたシーケンシングデータを分析して、ｅｃＤＮＡを検出するステップとを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態において、ステップ（ａ）～（ｃ）は、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ法またはＨＩ－Ｃ法を使用して行われる。一部の実施形態において、ステップ（ｂ）は、クロマチン免疫沈降における抗ＲＮＡＰＩＩ抗体の使用を含む。一部の実施形態において、ステップ（ｃ）および（ｄ）は、それぞれ、ペアエンドタグおよび高スループットシーケンシングの使用を含む。ある特定の実施形態において、本方法はまた、検出された物理的相互作用の頻度を決定するステップも含む。一部の実施形態において、本方法はまた、非線形ＤＮＡ分子のサイズを決定するステップも含む。一部の実施形態において、本方法はまた、細胞における非線形ＤＮＡ分子のコピー数を決定するステップも含む。一部の実施形態において、本方法はまた、第１の時点で、複数の細胞において非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数を決定するステップと、決定された平均を、対照の非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数と比較するステップとを含む。ある特定の実施形態において、対照の非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数は、異なる時点で複数の細胞において決定された非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数である。一部の実施形態において、本方法はまた、非線形ＤＮＡ分子の少なくとも一部分の配列を決定するステップも含む。一部の実施形態において、本方法はまた、決定された配列において腫瘍遺伝子配列の存在を特定するステップも含む。ある特定の実施形態において、細胞は、がん細胞である。一部の実施形態において、細胞は、前がん性細胞である。一部の実施形態において、細胞は、がん細胞を含む複数の細胞から得られたものである。ある特定の実施形態において、細胞は、対象から得られたものである。一部の実施形態において、対象は、がんと診断されているか、がんを有することが疑われるか、およびがんを有する危険性があるかのうちの少なくとも１つである。ある特定の実施形態において、細胞は、細胞培養物から得られたものである。一部の実施形態において、細胞は、脊椎動物細胞である。一部の実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞であり、任意選択で、ヒト細胞である。ある特定の実施形態において、本方法はまた、複数の細胞にステップ（ａ）～（ｅ）を行うことも含む。
【0009】
本発明のさらに別の態様によると、対象においてがんを低減させるための処置を選択する方法であって、対象から得られたがん細胞において１つまたは複数の特定のｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子の存在を特定するステップと、特定されたｅｃＤＮＡによりモジュレートされる腫瘍遺伝子に基づいて１つまたは複数の処置を選択するステップとを含む、方法が、提供される。一部の実施形態において、特定するステップは、細胞において染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）を特定する前述の方法の任意の実施形態を含み、この方法は、（ａ）非線形ＤＮＡ分子と、染色体対の少なくとも１つの線形染色体との間のクロマチン相互作用を検出するステップであって、相互作用が、非線形ＤＮＡ分子と、染色体対の少なくとも１つの線形染色体との間の接触を含み、（ｉ）細胞における有意に高い頻度の検出されたクロマチン相互作用、（ｉｉ）細胞における非線形ＤＮＡ分子と染色体対のそれぞれの少なくとも１つの線形染色体との間の接触、および（ｉｉｉ）複数の細胞における非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数の経時的な増加の存在が、非線形ＤＮＡ分子をｅｃＤＮＡとして特定する、ステップを含む。一部の実施形態において、特定するステップは、細胞において染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）を特定する前述の方法のいずれかの実施形態を含み、この方法は、クロマチン相互作用分析を使用して、非線形ＤＮＡ分子と、少なくとも１つの線形染色体との間の物理的相互作用を直接的に検出するステップを含み、この分析方法が、（ａ）細胞を固定液と接触させ、細胞から単離されたＤＮＡに対してクロマチン近接ライゲーションを行うステップと、（ｂ）クロマチン免疫沈降を行うステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）において免疫沈降されたＤＮＡからライブラリーを生成するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）において生成されたライブラリーをシーケンシングして、シーケンシングＤＮＡを生成するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）において生成されたシーケンシングデータを分析して、ｅｃＤＮＡを検出するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1A】図１Ａ～Ｂは、ｅｃＤＮＡシグネチャーが、２３個の染色体にわたるトランス染色体相互作用頻度（ｎｓＴＩＦ）の分布によって区別することができることを示す、図およびトレースである。図１Ａは、ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７ ｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における２３個すべての染色体にわたるｅｃＤＮＡ領域によって媒介されるトランス相互作用のサーコスプロットを提供する。ｅｃＭＹＣ、ｅｃＥＧＦＲ、およびｅｃＣＤＫ４領域間の強力な接続が示されている。図１Ｂは、ｅｃＤＮＡ（＋）ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７細胞株、ならびにｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株における５０Ｋｂのビンサイズの全ゲノム正規化総和ＴＩＦ（ｎｓＴＩＦ）の分布を示す。ｎｓＴＩＦの上昇が、第７染色体、第８染色体、および第１２染色体で観察される。全長第７染色体、第８染色体、および第１２染色体に沿ったｎｓＴＩＦの分布が下に示され、ｎｓＴＩＦ値が上昇している領域は、公知のｅｃＥＧＦＲ、ｅｃＭＹＣ、およびｅｃＣＤＫ４領域と良好に一致する。
【図1B-1】図１Ａ～Ｂは、ｅｃＤＮＡシグネチャーが、２３個の染色体にわたるトランス染色体相互作用頻度（ｎｓＴＩＦ）の分布によって区別することができることを示す、図およびトレースである。図１Ａは、ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７ ｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における２３個すべての染色体にわたるｅｃＤＮＡ領域によって媒介されるトランス相互作用のサーコスプロットを提供する。ｅｃＭＹＣ、ｅｃＥＧＦＲ、およびｅｃＣＤＫ４領域間の強力な接続が示されている。図１Ｂは、ｅｃＤＮＡ（＋）ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７細胞株、ならびにｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株における５０Ｋｂのビンサイズの全ゲノム正規化総和ＴＩＦ（ｎｓＴＩＦ）の分布を示す。ｎｓＴＩＦの上昇が、第７染色体、第８染色体、および第１２染色体で観察される。全長第７染色体、第８染色体、および第１２染色体に沿ったｎｓＴＩＦの分布が下に示され、ｎｓＴＩＦ値が上昇している領域は、公知のｅｃＥＧＦＲ、ｅｃＭＹＣ、およびｅｃＣＤＫ４領域と良好に一致する。
【図1B-2】図１Ａ～Ｂは、ｅｃＤＮＡシグネチャーが、２３個の染色体にわたるトランス染色体相互作用頻度（ｎｓＴＩＦ）の分布によって区別することができることを示す、図およびトレースである。図１Ａは、ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７ ｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における２３個すべての染色体にわたるｅｃＤＮＡ領域によって媒介されるトランス相互作用のサーコスプロットを提供する。ｅｃＭＹＣ、ｅｃＥＧＦＲ、およびｅｃＣＤＫ４領域間の強力な接続が示されている。図１Ｂは、ｅｃＤＮＡ（＋）ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７細胞株、ならびにｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株における５０Ｋｂのビンサイズの全ゲノム正規化総和ＴＩＦ（ｎｓＴＩＦ）の分布を示す。ｎｓＴＩＦの上昇が、第７染色体、第８染色体、および第１２染色体で観察される。全長第７染色体、第８染色体、および第１２染色体に沿ったｎｓＴＩＦの分布が下に示され、ｎｓＴＩＦ値が上昇している領域は、公知のｅｃＥＧＦＲ、ｅｃＭＹＣ、およびｅｃＣＤＫ４領域と良好に一致する。
【図2A】図２Ａ～Ｄは、ｅｃＤＮＡが広いスパンのＨ３Ｋ２７ａｃ改変の強力な増強を示すという根拠を示す、プロファイル、グラフ、および箱ひげ図を示す。図２Ａは、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７にわたってｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれにおいて見出されたｅｃ－腫瘍遺伝子のプロモーターと相互作用する染色体の非コーディングアンカーの±３Ｋｂ以内のＨ３Ｋ２７ａｃ改変濃縮プロファイルを提供する。それぞれの株において見出されたアンカーの数をラベル付けし、それぞれの領域を、それらの対応する細胞株において検出されたシグナル強度で（上から下に、高い強度から低い強度へ）並べた行として示す。図２Ｂは、ＨＦ－２９２７のｅｃＥＧＦＲ領域（ｃｈｒ７： ５４，９２９，２９２－５５，４４１，７６５）にわたるクロマチン相互作用頻度の分布とＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度との間の一致を示す。下のパネル：ｅｃＤＮＡ（＋）ＨＦ－２９２７におけるｅｃＥＧＦＲ領域のＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度プロファイル（上）。比較のために、ｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株の同じ領域から得られたＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度プロファイルを示す（下）。領域は、シグナル強度およびスパンの差を示すためにハイライトされている。図２Ｃ～Ｄは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）株のそれぞれから得られたｅｃＤＮＡにおけるＨ３Ｋ２７ａｃピーク（群Ａ、ｎ＝１７、１６、９６、および７０）、それらの対応するトランス相互作用染色体アンカー（群Ｂ、ｎ＝１６６、６３４、９１３、および７４５）、ならびに残りの全ゲノムピーク（群Ｃ、ｎ＝３８，２５９、４０，４１３、４８，７５１、および５６，０４１）の濃縮倍数（図２Ｃ）およびスパンサイズ分布（図２Ｄ）を示す箱ひげ図を示す。ｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株では、群Ａ（ｎ＝１８２）は、集合的なｅｃＤＮＡ相当領域において見出されたＨ３Ｋ２７ａｃピークを指し、群Ｃ（ｎ＝５３，５２９）は、検出された残りの全ゲノムピークを表す。Ｙ軸は、図２ＣおよびＤにおいて、それぞれ、ｌｏｇ２およびｌｏｇ１０のスケールである。中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。＊：Ｐ値＜０．００５（片側ウィルコクソンの順位和検定）。それぞれの対応のある比較のサンプルサイズおよび正確なＰ値に関して。図２Ｃおよび図２Ｄのそれぞれにおいて、Ｘ軸の左から右に、１つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－２３５４からのデータを示し、２つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－２９２７からのデータを示し、３つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－３０１６からの結果を示し、４つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－３１７７からのデータを示し、最後のＡおよびＣは、ＨＦ－３０３５からのデータを示す。
【図2B】図２Ａ～Ｄは、ｅｃＤＮＡが広いスパンのＨ３Ｋ２７ａｃ改変の強力な増強を示すという根拠を示す、プロファイル、グラフ、および箱ひげ図を示す。図２Ａは、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７にわたってｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれにおいて見出されたｅｃ－腫瘍遺伝子のプロモーターと相互作用する染色体の非コーディングアンカーの±３Ｋｂ以内のＨ３Ｋ２７ａｃ改変濃縮プロファイルを提供する。それぞれの株において見出されたアンカーの数をラベル付けし、それぞれの領域を、それらの対応する細胞株において検出されたシグナル強度で（上から下に、高い強度から低い強度へ）並べた行として示す。図２Ｂは、ＨＦ－２９２７のｅｃＥＧＦＲ領域（ｃｈｒ７： ５４，９２９，２９２－５５，４４１，７６５）にわたるクロマチン相互作用頻度の分布とＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度との間の一致を示す。下のパネル：ｅｃＤＮＡ（＋）ＨＦ－２９２７におけるｅｃＥＧＦＲ領域のＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度プロファイル（上）。比較のために、ｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株の同じ領域から得られたＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度プロファイルを示す（下）。領域は、シグナル強度およびスパンの差を示すためにハイライトされている。図２Ｃ～Ｄは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）株のそれぞれから得られたｅｃＤＮＡにおけるＨ３Ｋ２７ａｃピーク（群Ａ、ｎ＝１７、１６、９６、および７０）、それらの対応するトランス相互作用染色体アンカー（群Ｂ、ｎ＝１６６、６３４、９１３、および７４５）、ならびに残りの全ゲノムピーク（群Ｃ、ｎ＝３８，２５９、４０，４１３、４８，７５１、および５６，０４１）の濃縮倍数（図２Ｃ）およびスパンサイズ分布（図２Ｄ）を示す箱ひげ図を示す。ｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株では、群Ａ（ｎ＝１８２）は、集合的なｅｃＤＮＡ相当領域において見出されたＨ３Ｋ２７ａｃピークを指し、群Ｃ（ｎ＝５３，５２９）は、検出された残りの全ゲノムピークを表す。Ｙ軸は、図２ＣおよびＤにおいて、それぞれ、ｌｏｇ２およびｌｏｇ１０のスケールである。中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。＊：Ｐ値＜０．００５（片側ウィルコクソンの順位和検定）。それぞれの対応のある比較のサンプルサイズおよび正確なＰ値に関して。図２Ｃおよび図２Ｄのそれぞれにおいて、Ｘ軸の左から右に、１つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－２３５４からのデータを示し、２つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－２９２７からのデータを示し、３つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－３０１６からの結果を示し、４つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－３１７７からのデータを示し、最後のＡおよびＣは、ＨＦ－３０３５からのデータを示す。
【図2C】図２Ａ～Ｄは、ｅｃＤＮＡが広いスパンのＨ３Ｋ２７ａｃ改変の強力な増強を示すという根拠を示す、プロファイル、グラフ、および箱ひげ図を示す。図２Ａは、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７にわたってｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれにおいて見出されたｅｃ－腫瘍遺伝子のプロモーターと相互作用する染色体の非コーディングアンカーの±３Ｋｂ以内のＨ３Ｋ２７ａｃ改変濃縮プロファイルを提供する。それぞれの株において見出されたアンカーの数をラベル付けし、それぞれの領域を、それらの対応する細胞株において検出されたシグナル強度で（上から下に、高い強度から低い強度へ）並べた行として示す。図２Ｂは、ＨＦ－２９２７のｅｃＥＧＦＲ領域（ｃｈｒ７： ５４，９２９，２９２－５５，４４１，７６５）にわたるクロマチン相互作用頻度の分布とＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度との間の一致を示す。下のパネル：ｅｃＤＮＡ（＋）ＨＦ－２９２７におけるｅｃＥＧＦＲ領域のＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度プロファイル（上）。比較のために、ｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株の同じ領域から得られたＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度プロファイルを示す（下）。領域は、シグナル強度およびスパンの差を示すためにハイライトされている。図２Ｃ～Ｄは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）株のそれぞれから得られたｅｃＤＮＡにおけるＨ３Ｋ２７ａｃピーク（群Ａ、ｎ＝１７、１６、９６、および７０）、それらの対応するトランス相互作用染色体アンカー（群Ｂ、ｎ＝１６６、６３４、９１３、および７４５）、ならびに残りの全ゲノムピーク（群Ｃ、ｎ＝３８，２５９、４０，４１３、４８，７５１、および５６，０４１）の濃縮倍数（図２Ｃ）およびスパンサイズ分布（図２Ｄ）を示す箱ひげ図を示す。ｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株では、群Ａ（ｎ＝１８２）は、集合的なｅｃＤＮＡ相当領域において見出されたＨ３Ｋ２７ａｃピークを指し、群Ｃ（ｎ＝５３，５２９）は、検出された残りの全ゲノムピークを表す。Ｙ軸は、図２ＣおよびＤにおいて、それぞれ、ｌｏｇ２およびｌｏｇ１０のスケールである。中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。＊：Ｐ値＜０．００５（片側ウィルコクソンの順位和検定）。それぞれの対応のある比較のサンプルサイズおよび正確なＰ値に関して。図２Ｃおよび図２Ｄのそれぞれにおいて、Ｘ軸の左から右に、１つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－２３５４からのデータを示し、２つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－２９２７からのデータを示し、３つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－３０１６からの結果を示し、４つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－３１７７からのデータを示し、最後のＡおよびＣは、ＨＦ－３０３５からのデータを示す。
【図2D】図２Ａ～Ｄは、ｅｃＤＮＡが広いスパンのＨ３Ｋ２７ａｃ改変の強力な増強を示すという根拠を示す、プロファイル、グラフ、および箱ひげ図を示す。図２Ａは、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７にわたってｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれにおいて見出されたｅｃ－腫瘍遺伝子のプロモーターと相互作用する染色体の非コーディングアンカーの±３Ｋｂ以内のＨ３Ｋ２７ａｃ改変濃縮プロファイルを提供する。それぞれの株において見出されたアンカーの数をラベル付けし、それぞれの領域を、それらの対応する細胞株において検出されたシグナル強度で（上から下に、高い強度から低い強度へ）並べた行として示す。図２Ｂは、ＨＦ－２９２７のｅｃＥＧＦＲ領域（ｃｈｒ７： ５４，９２９，２９２－５５，４４１，７６５）にわたるクロマチン相互作用頻度の分布とＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度との間の一致を示す。下のパネル：ｅｃＤＮＡ（＋）ＨＦ－２９２７におけるｅｃＥＧＦＲ領域のＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度プロファイル（上）。比較のために、ｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株の同じ領域から得られたＨ３Ｋ２７ａｃシグナル密度プロファイルを示す（下）。領域は、シグナル強度およびスパンの差を示すためにハイライトされている。図２Ｃ～Ｄは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）株のそれぞれから得られたｅｃＤＮＡにおけるＨ３Ｋ２７ａｃピーク（群Ａ、ｎ＝１７、１６、９６、および７０）、それらの対応するトランス相互作用染色体アンカーのピーク（群Ｂ、ｎ＝１６６、６３４、９１３、および７４５）、ならびに残りの全ゲノムピーク（群Ｃ、ｎ＝３８，２５９、４０，４１３、４８，７５１、および５６，０４１）の濃縮倍数（図２Ｃ）およびスパンサイズ分布（図２Ｄ）を示す箱ひげ図を示す。ｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５株では、群Ａ（ｎ＝１８２）は、集合的なｅｃＤＮＡ相当領域において見出されたＨ３Ｋ２７ａｃピークを指し、群Ｃ（ｎ＝５３，５２９）は、検出された残りの全ゲノムピークを表す。Ｙ軸は、図２ＣおよびＤにおいて、それぞれ、ｌｏｇ２およびｌｏｇ１０のスケールである。中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。＊：Ｐ値＜０．００５（片側ウィルコクソンの順位和検定）。それぞれの対応のある比較のサンプルサイズおよび正確なＰ値に関して。図２Ｃおよび図２Ｄのそれぞれにおいて、Ｘ軸の左から右に、１つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－２３５４からのデータを示し、２つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－２９２７からのデータを示し、３つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－３０１６からの結果を示し、４つ目のＡ、Ｂ、およびＣは、ＨＦ－３１７７からのデータを示し、最後のＡおよびＣは、ＨＦ－３０３５からのデータを示す。
【図3A】図３Ａ～Ｃは、ｅｃＤＮＡに媒介されるトランス相互作用遺伝子およびそれらの関連する相互作用ネットワークを示すベン図、概略図、および表を提供する。図３Ａ～Ｂは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれにおけるｅｃＤＮＡに接続された遺伝子（図３Ａ）および腫瘍遺伝子（図３Ｂ）の数、ならびにそれらのオーバーラップを提示するベン図を示す。図３Ｃは、相互作用のアンカー、ノード、ハブ、およびコミュニティを定義するプロセスフローを示す（実施例の節の方法を参照されたい）。クロマチンループによって接続されているゲノム領域を、アンカーとして定義した。オーバーラップしないアンカーは、接続性スコア（接続しているノードの数）を有するノードとして統合され、その中で、接続性の高いノード（平均接続性スコアが＋３標準偏差以上である）を、ハブとして分類した。広範囲の接続性を有するハブおよびノードは、集合的に、コミュニティとして定義した。ｅｃＤＮＡと関連するコミュニティ、ハブ、および腫瘍遺伝子の数を、ｅｃＤＮＡ（＋）株のそれぞれについて要約している。
【図3B】図３Ａ～Ｃは、ｅｃＤＮＡに媒介されるトランス相互作用遺伝子およびそれらの関連する相互作用ネットワークを示すベン図、概略図、および表を提供する。図３Ａ～Ｂは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれにおけるｅｃＤＮＡに接続された遺伝子（図３Ａ）および腫瘍遺伝子（図３Ｂ）の数、ならびにそれらのオーバーラップを提示するベン図を示す。図３Ｃは、相互作用のアンカー、ノード、ハブ、およびコミュニティを定義するプロセスフローを示す（実施例の節の方法を参照されたい）。クロマチンループによって接続されているゲノム領域を、アンカーとして定義した。オーバーラップしないアンカーは、接続性スコア（接続しているノードの数）を有するノードとして統合され、その中で、接続性の高いノード（平均接続性スコアが＋３標準偏差以上である）を、ハブとして分類した。広範囲の接続性を有するハブおよびノードは、集合的に、コミュニティとして定義した。ｅｃＤＮＡと関連するコミュニティ、ハブ、および腫瘍遺伝子の数を、ｅｃＤＮＡ（＋）株のそれぞれについて要約している。
【図3C】図３Ａ～Ｃは、ｅｃＤＮＡに媒介されるトランス相互作用遺伝子およびそれらの関連する相互作用ネットワークを示すベン図、概略図、および表を提供する。図３Ａ～Ｂは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれにおけるｅｃＤＮＡに接続された遺伝子（図３Ａ）および腫瘍遺伝子（図３Ｂ）の数、ならびにそれらのオーバーラップを提示するベン図を示す。図３Ｃは、相互作用のアンカー、ノード、ハブ、およびコミュニティを定義するプロセスフローを示す（実施例の節の方法を参照されたい）。クロマチンループによって接続されているゲノム領域を、アンカーとして定義した。オーバーラップしないアンカーは、接続性スコア（接続しているノードの数）を有するノードとして統合され、その中で、接続性の高いノード（平均接続性スコアが＋３標準偏差以上である）を、ハブとして分類した。広範囲の接続性を有するハブおよびノードは、集合的に、コミュニティとして定義した。ｅｃＤＮＡと関連するコミュニティ、ハブ、および腫瘍遺伝子の数を、ｅｃＤＮＡ（＋）株のそれぞれについて要約している。
【図4A】図４Ａ～Ｂは、５つのＧＢＭ由来のニューロスフェア細胞株におけるＣｈＩＡ－ＰＥＴ分析の概要を示す。図４Ａは、ｅｃＤＮＡ（＋）ＧＢＭ由来の細胞株からのｅｃＤＮＡ内で増幅された遺伝子の定常状態での発現レベルを示す。図４Ｂは、ＣｈＩＡ－ＰＥＴデータから５つの細胞株のそれぞれにおいて検出されたＲＮＡＰＩＩ結合部位および長距離のクロマチン相互作用の数を示す。相互作用は、全ゲノムでの有意なシス相互作用（ＰＥＴカウントが３以上、Ｐ値が０．０５未満、およびＦＤＲが０．０５未満、実施例の節の方法を参照されたい）、ｅｃＤＮＡ領域間の相互作用（ｅｃＤＮＡ内相互作用）、およびｅｃＤＮＡ領域と２３個の線形染色体との間の相互作用（ｅｃＤＮＡトランス染色体）の３つのカテゴリーで報告する。両方のアンカーにおいて検出されたＲＮＡＰＩＩ結合部位との相互作用のみが報告されている。
【図4B】図４Ａ～Ｂは、５つのＧＢＭ由来のニューロスフェア細胞株におけるＣｈＩＡ－ＰＥＴ分析の概要を示す。図４Ａは、ｅｃＤＮＡ（＋）ＧＢＭ由来の細胞株からのｅｃＤＮＡ内で増幅された遺伝子の定常状態での発現レベルを示す。図４Ｂは、ＣｈＩＡ－ＰＥＴデータから５つの細胞株のそれぞれにおいて検出されたＲＮＡＰＩＩ結合部位および長距離のクロマチン相互作用の数を示す。相互作用は、全ゲノムでの有意なシス相互作用（ＰＥＴカウントが３以上、Ｐ値が０．０５未満、およびＦＤＲが０．０５未満、実施例の節の方法を参照されたい）、ｅｃＤＮＡ領域間の相互作用（ｅｃＤＮＡ内相互作用）、およびｅｃＤＮＡ領域と２３個の線形染色体との間の相互作用（ｅｃＤＮＡトランス染色体）の３つのカテゴリーで報告する。両方のアンカーにおいて検出されたＲＮＡＰＩＩ結合部位との相互作用のみが報告されている。
【図5A】図５Ａ～Ｃは、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ分析によるｅｃＤＮＡシグネチャーの発見を示す結果の概略図、分布、および箱ひげ図を示す。図５Ａは、ｅｃＤＮＡにおいて増幅されたゲノム領域およびそれらに関連するクロマチン接触を検出するために使用したクロマチン相互作用分析を示す概略図である。ＲＮＡＰＩＩ ＣｈＩＡ－ＰＥＴアッセイを行って、すべてのＲＮＡＰＩＩ会合クロマチンを捕捉した。ｅｃＤＮＡは、活動的に発現される腫瘍遺伝子を保持し、クロマチンテリトリーによる制約を受けず、他の染色体領域と広範に接触を行っており、このことから、活性な転写ハブ内でｅｃＤＮＡ特異的シグネチャーを発見し、それらの共制御される遺伝子を特徴付けるために使用することができる。図５Ｂは、ＨＦ－２９２７およびＨＦ－２３５４において５０Ｋｂのビンサイズでの２３個の染色体にわたるトランス相互作用頻度の正規化総和（ｎｓＴＩＦ）の分布を示す。それらの対応する細胞株において、それぞれ第７染色体および第８染色体の正規化ｎｓＴＩＦの分布（拡大ｎｓＴＩＦプロットに示されている）により、それぞれＥＧＦＲおよびＭＹＣを包含することが予測されるｅｃＤＮＡの位置が明らかとなる。図５Ｂの左側は、染色体７ｐ１１および８ｑ２４上の領域にはっきりした線の対を示す全ゲノム２Ｄクロマチン接触ヒートマップを示し、ゲノム全体で強力な接触を示している。図５Ｂの右側は、ｅｃＥＧＦＲおよびｅｃＭＹＣ領域により媒介される２３個すべての染色体にわたるトランス染色体接触頻度のサーコスプロットを示す。図５Ｃは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株において、公知のｅｃＤＮＡ領域とコピー数の増加が３以上である染色体ＤＮＡ領域との間の正規化されたｎｓＴＩＦの箱ひげ図の提示を提供する。左から右へ、ｎ＝３１、３，４２３、１１、５、１５、８２、２５、８３３である。ｅｃＤＮＡ領域におけるｎｓＴＩＦは、コピー数増加を有する領域におけるｎｓＴＩＦよりも統計学的に高い。Ｐ値（片側ウィルコクソンの順位和検定）は、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７について、それぞれ、４Ｅ－２２、４．５Ｅ－４、４．４Ｅ－１０、および７．１Ｅ－１８である。中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。
【図5B】図５Ａ～Ｃは、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ分析によるｅｃＤＮＡシグネチャーの発見を示す結果の概略図、分布、および箱ひげ図を示す。図５Ａは、ｅｃＤＮＡにおいて増幅されたゲノム領域およびそれらに関連するクロマチン接触を検出するために使用したクロマチン相互作用分析を示す概略図である。ＲＮＡＰＩＩ ＣｈＩＡ－ＰＥＴアッセイを行って、すべてのＲＮＡＰＩＩ会合クロマチンを捕捉した。ｅｃＤＮＡは、活動的に発現される腫瘍遺伝子を保持し、クロマチンテリトリーによる制約を受けず、他の染色体領域と広範に接触を行っており、このことから、活性な転写ハブ内でｅｃＤＮＡ特異的シグネチャーを発見し、それらの共制御される遺伝子を特徴付けるために使用することができる。図５Ｂは、ＨＦ－２９２７およびＨＦ－２３５４において５０Ｋｂのビンサイズでの２３個の染色体にわたるトランス相互作用頻度の正規化総和（ｎｓＴＩＦ）の分布を示す。それらの対応する細胞株において、それぞれ第７染色体および第８染色体の正規化ｎｓＴＩＦの分布（拡大ｎｓＴＩＦプロットに示されている）により、それぞれＥＧＦＲおよびＭＹＣを包含することが予測されるｅｃＤＮＡの位置が明らかとなる。図５Ｂの左側は、染色体７ｐ１１および８ｑ２４上の領域にはっきりした線の対を示す全ゲノム２Ｄクロマチン接触ヒートマップを示し、ゲノム全体で強力な接触を示している。図５Ｂの右側は、ｅｃＥＧＦＲおよびｅｃＭＹＣ領域により媒介される２３個すべての染色体にわたるトランス染色体接触頻度のサーコスプロットを示す。図５Ｃは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株において、公知のｅｃＤＮＡ領域とコピー数の増加が３以上である染色体ＤＮＡ領域との間の正規化されたｎｓＴＩＦの箱ひげ図の提示を提供する。左から右へ、ｎ＝３１、３，４２３、１１、５、１５、８２、２５、８３３である。ｅｃＤＮＡ領域におけるｎｓＴＩＦは、コピー数増加を有する領域におけるｎｓＴＩＦよりも統計学的に高い。Ｐ値（片側ウィルコクソンの順位和検定）は、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７について、それぞれ、４Ｅ－２２、４．５Ｅ－４、４．４Ｅ－１０、および７．１Ｅ－１８である。中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。
【図5C】図５Ａ～Ｃは、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ分析によるｅｃＤＮＡシグネチャーの発見を示す結果の概略図、分布、および箱ひげ図を示す。図５Ａは、ｅｃＤＮＡにおいて増幅されたゲノム領域およびそれらに関連するクロマチン接触を検出するために使用したクロマチン相互作用分析を示す概略図である。ＲＮＡＰＩＩ ＣｈＩＡ－ＰＥＴアッセイを行って、すべてのＲＮＡＰＩＩ会合クロマチンを捕捉した。ｅｃＤＮＡは、活動的に発現される腫瘍遺伝子を保持し、クロマチンテリトリーによる制約を受けず、他の染色体領域と広範に接触を行っており、このことから、活性な転写ハブ内でｅｃＤＮＡ特異的シグネチャーを発見し、それらの共制御される遺伝子を特徴付けるために使用することができる。図５Ｂは、ＨＦ－２９２７およびＨＦ－２３５４において５０Ｋｂのビンサイズでの２３個の染色体にわたるトランス相互作用頻度の正規化総和（ｎｓＴＩＦ）の分布を示す。それらの対応する細胞株において、それぞれ第７染色体および第８染色体の正規化ｎｓＴＩＦの分布（拡大ｎｓＴＩＦプロットに示されている）により、それぞれＥＧＦＲおよびＭＹＣを包含することが予測されるｅｃＤＮＡの位置が明らかとなる。図５Ｂの左側は、染色体７ｐ１１および８ｑ２４上の領域にはっきりした線の対を示す全ゲノム２Ｄクロマチン接触ヒートマップを示し、ゲノム全体で強力な接触を示している。図５Ｂの右側は、ｅｃＥＧＦＲおよびｅｃＭＹＣ領域により媒介される２３個すべての染色体にわたるトランス染色体接触頻度のサーコスプロットを示す。図５Ｃは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株において、公知のｅｃＤＮＡ領域とコピー数の増加が３以上である染色体ＤＮＡ領域との間の正規化されたｎｓＴＩＦの箱ひげ図の提示を提供する。左から右へ、ｎ＝３１、３，４２３、１１、５、１５、８２、２５、８３３である。ｅｃＤＮＡ領域におけるｎｓＴＩＦは、コピー数増加を有する領域におけるｎｓＴＩＦよりも統計学的に高い。Ｐ値（片側ウィルコクソンの順位和検定）は、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７について、それぞれ、４Ｅ－２２、４．５Ｅ－４、４．４Ｅ－１０、および７．１Ｅ－１８である。中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。
【図6A】図６Ａ～Ｃは、ゲノム構造バリアントにより反映されるクロマチントポロジー変化のＣｈＩＡ－ＰＥＴアッセイ検出を示すヒートマップを提供する。図６Ａは、２Ｄ接触ヒートマップによって視覚化することができる、ＣｈＩＡ－ＰＥＴデータにおいて一般的なクロマチン接触によって測定される空間的クロマチントポロジーを示す。５つすべてのＧＢＭ患者由来のニューロスフェア細胞株から得られた第２染色体のヒートマップが示されている。図６Ｂは、それぞれ、ＨＦ－２９２７およびＨＦ－３０３５において、ＰＴＥＮ（上）ならびにＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ｂ（下）が欠失しているゲノム領域の２Ｄ接触ヒートマップを提供する。ＴＡＤ領域は、青色の線によって区切られている。遺伝子座の欠失は、クロマチン接触の喪失によって表される。図６Ｃは、２Ｄヒートマップによって異常な接触パターンとして視覚化される、ＤＭＤ遺伝子における欠失、第３染色体における複雑な再構成、および二重転位ｔ（３；６）という追加の構造バリアントを示す。
【図6B】図６Ａ～Ｃは、ゲノム構造バリアントにより反映されるクロマチントポロジー変化のＣｈＩＡ－ＰＥＴアッセイ検出を示すヒートマップを提供する。図６Ａは、２Ｄ接触ヒートマップによって視覚化することができる、ＣｈＩＡ－ＰＥＴデータにおいて一般的なクロマチン接触によって測定される空間的クロマチントポロジーを示す。５つすべてのＧＢＭ患者由来のニューロスフェア細胞株から得られた第２染色体のヒートマップが示されている。図６Ｂは、それぞれ、ＨＦ－２９２７およびＨＦ－３０３５において、ＰＴＥＮ（上）ならびにＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ｂ（下）が欠失しているゲノム領域の２Ｄ接触ヒートマップを提供する。ＴＡＤ領域は、青色の線によって区切られている。遺伝子座の欠失は、クロマチン接触の喪失によって表される。図６Ｃは、２Ｄヒートマップによって異常な接触パターンとして視覚化される、ＤＭＤ遺伝子における欠失、第３染色体における複雑な再構成、および二重転位ｔ（３；６）という追加の構造バリアントを示す。
【図6C】図６Ａ～Ｃは、ゲノム構造バリアントにより反映されるクロマチントポロジー変化のＣｈＩＡ－ＰＥＴアッセイ検出を示すヒートマップを提供する。図６Ａは、２Ｄ接触ヒートマップによって視覚化することができる、ＣｈＩＡ－ＰＥＴデータにおいて一般的なクロマチン接触によって測定される空間的クロマチントポロジーを示す。５つすべてのＧＢＭ患者由来のニューロスフェア細胞株から得られた第２染色体のヒートマップが示されている。図６Ｂは、それぞれ、ＨＦ－２９２７およびＨＦ－３０３５において、ＰＴＥＮ（上）ならびにＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ｂ（下）が欠失しているゲノム領域の２Ｄ接触ヒートマップを提供する。ＴＡＤ領域は、青色の線によって区切られている。遺伝子座の欠失は、クロマチン接触の喪失によって表される。図６Ｃは、２Ｄヒートマップによって異常な接触パターンとして視覚化される、ＤＭＤ遺伝子における欠失、第３染色体における複雑な再構成、および二重転位ｔ（３；６）という追加の構造バリアントを示す。
【図7A】図７Ａ～Ｃは、ＥｃＤＮＡが、ＲＮＡＰＩＩによって結合され、広範囲の染色体外内およびトランス染色体相互作用を媒介することを示す、ヒートマップ、サーカスプロット（circus plot）、および概略図を示す。図７Ａは、ｅｃＤＮＡ（＋）ＨＦ－２９２７およびＨＦ－２３５４とｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５細胞株との間の２Ｄ接触ヒートマップ比較を提供する。ＨＦ－３０３５における非ｅｃＤＮＡ ＥＧＦＲ遺伝子コーディング領域と比べたＨＦ－２９２７におけるｅｃＥＧＦＲ領域（ｃｈｒ７：５４，８６０，２５４－５５，５３５，８５６）の、ならびにＨＦ－３０３５における非ｅｃＤＮＡ ＭＹＣコーディング遺伝子と比べたＨＦ－２３５４におけるｅｃＭＹＣ領域の２つのセグメント（ｃｈｒ８：１２８，０３２，０１１－１２８，８０６，４９３およびｃｈｒ８：１２９，５７３，２４１－１３０，９６８，６２８）の、シス相互作用およびＲＮＡＰＩＩ結合強度のプロファイルを示す。図７Ｂは、ＨＦ－２９２７（左）およびＨＦ－３１７７（右）のｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における定義されたｅｃＤＮＡ領域のサーコスプロットを提供する。内側の円から外側の円へ：ｅｃＤＮＡ内の異なる領域間におけるｅｃＤＮＡ内相互作用ループ、青色：ｅｃＤＮＡ内相互作用頻度の分布、緑色：ｅｃＤＮＡ－染色体トランス相互作用頻度の分布、オレンジ色（外から３番目の輪）：Ｈ３Ｋ２７ａｃの濃縮強度倍数、褐色（外から２番目の輪）：ＲＮＡＰＩＩ結合濃縮強度。シグナルトラックは、１Ｋｂの分解能である。Ｈ３Ｋ２７ａｃシグナルと相互作用頻度との間の高い一致は、灰色で強調表示されている。図７Ｃは、ｅｃＤＮＡに由来するトランス相互作用アンカーおよびそれらの染色体標的と関連するゲノム特徴（プロモーター、遺伝子間、および遺伝子内の領域）を示す図である。
【図7B】図７Ａ～Ｃは、ＥｃＤＮＡが、ＲＮＡＰＩＩによって結合され、広範囲の染色体外内およびトランス染色体相互作用を媒介することを示す、ヒートマップ、サーカスプロット、および概略図を示す。図７Ａは、ｅｃＤＮＡ（＋）ＨＦ－２９２７およびＨＦ－２３５４とｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５細胞株との間の２Ｄ接触ヒートマップ比較を提供する。ＨＦ－３０３５における非ｅｃＤＮＡ ＥＧＦＲ遺伝子コーディング領域と比べたＨＦ－２９２７におけるｅｃＥＧＦＲ領域（ｃｈｒ７：５４，８６０，２５４－５５，５３５，８５６）の、ならびにＨＦ－３０３５における非ｅｃＤＮＡ ＭＹＣコーディング遺伝子と比べたＨＦ－２３５４におけるｅｃＭＹＣ領域の２つのセグメント（ｃｈｒ８：１２８，０３２，０１１－１２８，８０６，４９３およびｃｈｒ８：１２９，５７３，２４１－１３０，９６８，６２８）の、シス相互作用およびＲＮＡＰＩＩ結合強度のプロファイルを示す。図７Ｂは、ＨＦ－２９２７（左）およびＨＦ－３１７７（右）のｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における定義されたｅｃＤＮＡ領域のサーコスプロットを提供する。内側の円から外側の円へ：ｅｃＤＮＡ内の異なる領域間におけるｅｃＤＮＡ内相互作用ループ、青色：ｅｃＤＮＡ内相互作用頻度の分布、緑色：ｅｃＤＮＡ－染色体トランス相互作用頻度の分布、オレンジ色（外から３番目の輪）：Ｈ３Ｋ２７ａｃの濃縮強度倍数、褐色（外から２番目の輪）：ＲＮＡＰＩＩ結合濃縮強度。シグナルトラックは、１Ｋｂの分解能である。Ｈ３Ｋ２７ａｃシグナルと相互作用頻度との間の高い一致は、灰色で強調表示されている。図７Ｃは、ｅｃＤＮＡに由来するトランス相互作用アンカーおよびそれらの染色体標的と関連するゲノム特徴（プロモーター、遺伝子間、および遺伝子内の領域）を示す図である。
【図7C】図７Ａ～Ｃは、ＥｃＤＮＡが、ＲＮＡＰＩＩによって結合され、広範囲の染色体外内およびトランス染色体相互作用を媒介することを示す、ヒートマップ、サーカスプロット、および概略図を示す。図７Ａは、ｅｃＤＮＡ（＋）ＨＦ－２９２７およびＨＦ－２３５４とｅｃＤＮＡ（－）ＨＦ－３０３５細胞株との間の２Ｄ接触ヒートマップ比較を提供する。ＨＦ－３０３５における非ｅｃＤＮＡ ＥＧＦＲ遺伝子コーディング領域と比べたＨＦ－２９２７におけるｅｃＥＧＦＲ領域（ｃｈｒ７：５４，８６０，２５４－５５，５３５，８５６）の、ならびにＨＦ－３０３５における非ｅｃＤＮＡ ＭＹＣコーディング遺伝子と比べたＨＦ－２３５４におけるｅｃＭＹＣ領域の２つのセグメント（ｃｈｒ８：１２８，０３２，０１１－１２８，８０６，４９３およびｃｈｒ８：１２９，５７３，２４１－１３０，９６８，６２８）の、シス相互作用およびＲＮＡＰＩＩ結合強度のプロファイルを示す。図７Ｂは、ＨＦ－２９２７（左）およびＨＦ－３１７７（右）のｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における定義されたｅｃＤＮＡ領域のサーコスプロットを提供する。内側の円から外側の円へ：ｅｃＤＮＡ内の異なる領域間におけるｅｃＤＮＡ内相互作用ループ、青色：ｅｃＤＮＡ内相互作用頻度の分布、緑色：ｅｃＤＮＡ－染色体トランス相互作用頻度の分布、オレンジ色（外から３番目の輪）：Ｈ３Ｋ２７ａｃの濃縮強度倍数、褐色（外から２番目の輪）：ＲＮＡＰＩＩ結合濃縮強度。シグナルトラックは、１Ｋｂの分解能である。Ｈ３Ｋ２７ａｃシグナルと相互作用頻度との間の高い一致は、灰色で強調表示されている。図７Ｃは、ｅｃＤＮＡに由来するトランス相互作用アンカーおよびそれらの染色体標的と関連するゲノム特徴（プロモーター、遺伝子間、および遺伝子内の領域）を示す図である。
【図8A】図８Ａ～Ｄは、ｅｃＤＮＡ領域が、強いＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮を伴う強力なシスおよびトランス相互作用を呈することを示す、サーコスプロット、概略図、および顕微鏡写真を提供する。図８Ａは、ＨＦ－２３５４（左）およびＨＦ－３０１６（右）のｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における定義されたｅｃＤＮＡ領域のサーコスプロットを示す。内側の円から外側の円へ：ｅｃＤＮＡの異なる領域間におけるｅｃＤＮＡ内相互作用ループ、青色：ｅｃ内相互作用頻度の分布、緑色：ｅｃＤＮＡ－染色体トランス相互作用頻度の分布、オレンジ色の外から３番目の輪：Ｈ３Ｋ２７ａｃの濃縮強度倍数、褐色の外から２番目の輪：ＲＮＡＰＩＩ結合濃縮強度。シグナルトラックは、１Ｋｂの分解能である。高いＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮と相互作用頻度との間の高い一致は、灰色で強調表示されている。図８Ｂは、Ｈ３Ｋ２７ａｃピークとオーバーラップした、ｅｃＤＮＡとの接続を有しないアンカー（青色）と対比した、ｅｃＤＮＡにより接続される染色体相互作用アンカー（オレンジ色）のパーセンテージを示す。図８Ｂの左は、遺伝子内領域（Ｇ）における染色体アンカーを示す。図８Ｂの右は、遺伝子間領域（Ｉ）（遺伝子コーディング領域の外側）における染色体アンカーを示す。図８Ｃは、ｅｃＭＹＣプロモーターと相互作用する細胞特異的染色体のＨ３Ｋ２７ａｃピークを示す。これらの広いピークが存在するゲノム位置を、ＨＦ－３１７７においてｃｈｒ３：４２，０９０，０００、ｃｈｒ５：１４８，９３８，０００、ｃｈｒ１：２２４，３５３，０００、ｃｈｒ１：３３，９０６，５００、ｃｈｒ１９：１８，４０８，０００、ｃｈｒ１：２０７，０６０，０００、ＨＦ－３０１６においてｃｈｒ３：１９５，９０２，０００、ｃｈｒ１０：１０，０１２０，０００、ＨＦ－２３５４においてｃｈｒ７：６３，９２０，０００の開始位置で、１０Ｋｂのウインドウで示す。図８Ｄは、ＨＦ－２９２７細胞に由来する中期染色体のＨ３Ｋ２７ａｃ免疫染色を示す画像を提供する。はっきりとしたＤＡＰＩ陽性染色体外スポットが、Ｈ３Ｋ２７ａｃ染色スポットとオーバーラップする。
【図8B】図８Ａ～Ｄは、ｅｃＤＮＡ領域が、強いＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮を伴う強力なシスおよびトランス相互作用を呈することを示す、サーコスプロット、概略図、および顕微鏡写真を提供する。図８Ａは、ＨＦ－２３５４（左）およびＨＦ－３０１６（右）のｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における定義されたｅｃＤＮＡ領域のサーコスプロットを示す。内側の円から外側の円へ：ｅｃＤＮＡの異なる領域間におけるｅｃＤＮＡ内相互作用ループ、青色：ｅｃ内相互作用頻度の分布、緑色：ｅｃＤＮＡ－染色体トランス相互作用頻度の分布、オレンジ色の外から３番目の輪：Ｈ３Ｋ２７ａｃの濃縮強度倍数、褐色の外から２番目の輪：ＲＮＡＰＩＩ結合濃縮強度。シグナルトラックは、１Ｋｂの分解能である。高いＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮と相互作用頻度との間の高い一致は、灰色で強調表示されている。図８Ｂは、Ｈ３Ｋ２７ａｃピークとオーバーラップした、ｅｃＤＮＡとの接続を有しないアンカー（青色）と対比した、ｅｃＤＮＡにより接続される染色体相互作用アンカー（オレンジ色）のパーセンテージを示す。図８Ｂの左は、遺伝子内領域（Ｇ）における染色体アンカーを示す。図８Ｂの右は、遺伝子間領域（Ｉ）（遺伝子コーディング領域の外側）における染色体アンカーを示す。図８Ｃは、ｅｃＭＹＣプロモーターと相互作用する細胞特異的染色体のＨ３Ｋ２７ａｃピークを示す。これらの広いピークが存在するゲノム位置を、ＨＦ－３１７７においてｃｈｒ３：４２，０９０，０００、ｃｈｒ５：１４８，９３８，０００、ｃｈｒ１：２２４，３５３，０００、ｃｈｒ１：３３，９０６，５００、ｃｈｒ１９：１８，４０８，０００、ｃｈｒ１：２０７，０６０，０００、ＨＦ－３０１６においてｃｈｒ３：１９５，９０２，０００、ｃｈｒ１０：１０，０１２０，０００、ＨＦ－２３５４においてｃｈｒ７：６３，９２０，０００の開始位置で、１０Ｋｂのウインドウで示す。図８Ｄは、ＨＦ－２９２７細胞に由来する中期染色体のＨ３Ｋ２７ａｃ免疫染色を示す画像を提供する。はっきりとしたＤＡＰＩ陽性染色体外スポットが、Ｈ３Ｋ２７ａｃ染色スポットとオーバーラップする。
【図8C】図８Ａ～Ｄは、ｅｃＤＮＡ領域が、強いＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮を伴う強力なシスおよびトランス相互作用を呈することを示す、サーコスプロット、概略図、および顕微鏡写真を提供する。図８Ａは、ＨＦ－２３５４（左）およびＨＦ－３０１６（右）のｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における定義されたｅｃＤＮＡ領域のサーコスプロットを示す。内側の円から外側の円へ：ｅｃＤＮＡの異なる領域間におけるｅｃＤＮＡ内相互作用ループ、青色：ｅｃ内相互作用頻度の分布、緑色：ｅｃＤＮＡ－染色体トランス相互作用頻度の分布、オレンジ色の外から３番目の輪：Ｈ３Ｋ２７ａｃの濃縮強度倍数、褐色の外から２番目の輪：ＲＮＡＰＩＩ結合濃縮強度。シグナルトラックは、１Ｋｂの分解能である。高いＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮と相互作用頻度との間の高い一致は、灰色で強調表示されている。図８Ｂは、Ｈ３Ｋ２７ａｃピークとオーバーラップした、ｅｃＤＮＡとの接続を有しないアンカー（青色）と対比した、ｅｃＤＮＡにより接続される染色体相互作用アンカー（オレンジ色）のパーセンテージを示す。図８Ｂの左は、遺伝子内領域（Ｇ）における染色体アンカーを示す。図８Ｂの右は、遺伝子間領域（Ｉ）（遺伝子コーディング領域の外側）における染色体アンカーを示す。図８Ｃは、ｅｃＭＹＣプロモーターと相互作用する細胞特異的染色体のＨ３Ｋ２７ａｃピークを示す。これらの広いピークが存在するゲノム位置を、ＨＦ－３１７７においてｃｈｒ３：４２，０９０，０００、ｃｈｒ５：１４８，９３８，０００、ｃｈｒ１：２２４，３５３，０００、ｃｈｒ１：３３，９０６，５００、ｃｈｒ１９：１８，４０８，０００、ｃｈｒ１：２０７，０６０，０００、ＨＦ－３０１６においてｃｈｒ３：１９５，９０２，０００、ｃｈｒ１０：１０，０１２０，０００、ＨＦ－２３５４においてｃｈｒ７：６３，９２０，０００の開始位置で、１０Ｋｂのウインドウで示す。図８Ｄは、ＨＦ－２９２７細胞に由来する中期染色体のＨ３Ｋ２７ａｃ免疫染色を示す画像を提供する。はっきりとしたＤＡＰＩ陽性染色体外スポットが、Ｈ３Ｋ２７ａｃ染色スポットとオーバーラップする。
【図8D】図８Ａ～Ｄは、ｅｃＤＮＡ領域が、強いＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮を伴う強力なシスおよびトランス相互作用を呈することを示す、サーコスプロット、概略図、および顕微鏡写真を提供する。図８Ａは、ＨＦ－２３５４（左）およびＨＦ－３０１６（右）のｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における定義されたｅｃＤＮＡ領域のサーコスプロットを示す。内側の円から外側の円へ：ｅｃＤＮＡの異なる領域間におけるｅｃＤＮＡ内相互作用ループ、青色：ｅｃ内相互作用頻度の分布、緑色：ｅｃＤＮＡ－染色体トランス相互作用頻度の分布、オレンジ色の外から３番目の輪：Ｈ３Ｋ２７ａｃの濃縮強度倍数、褐色の外から２番目の輪：ＲＮＡＰＩＩ結合濃縮強度。シグナルトラックは、１Ｋｂの分解能である。高いＨ３Ｋ２７ａｃ濃縮と相互作用頻度との間の高い一致は、灰色で強調表示されている。図８Ｂは、Ｈ３Ｋ２７ａｃピークとオーバーラップした、ｅｃＤＮＡとの接続を有しないアンカー（青色）と対比した、ｅｃＤＮＡにより接続される染色体相互作用アンカー（オレンジ色）のパーセンテージを示す。図８Ｂの左は、遺伝子内領域（Ｇ）における染色体アンカーを示す。図８Ｂの右は、遺伝子間領域（Ｉ）（遺伝子コーディング領域の外側）における染色体アンカーを示す。図８Ｃは、ｅｃＭＹＣプロモーターと相互作用する細胞特異的染色体のＨ３Ｋ２７ａｃピークを示す。これらの広いピークが存在するゲノム位置を、ＨＦ－３１７７においてｃｈｒ３：４２，０９０，０００、ｃｈｒ５：１４８，９３８，０００、ｃｈｒ１：２２４，３５３，０００、ｃｈｒ１：３３，９０６，５００、ｃｈｒ１９：１８，４０８，０００、ｃｈｒ１：２０７，０６０，０００、ＨＦ－３０１６においてｃｈｒ３：１９５，９０２，０００、ｃｈｒ１０：１０，０１２０，０００、ＨＦ－２３５４においてｃｈｒ７：６３，９２０，０００の開始位置で、１０Ｋｂのウインドウで示す。図８Ｄは、ＨＦ－２９２７細胞に由来する中期染色体のＨ３Ｋ２７ａｃ免疫染色を示す画像を提供する。はっきりとしたＤＡＰＩ陽性染色体外スポットが、Ｈ３Ｋ２７ａｃ染色スポットとオーバーラップする。
【図9A】図９Ａ～Ｅは、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用が、空間的に凝集された核内ネットワークにおいて、活性な転写について腫瘍遺伝子を標的とすることを示す、箱ひげ図および概略図を提供する。図９Ａは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれから得られた、ｅｃＤＮＡとトランス相互作用する染色体遺伝子（ｎ＝１，８８７、１，２７０、１，４８３、および１，１５７）と、トランス染色体相互作用を有しない遺伝子（ｎ＝４８３、１９４、６５３、および５９７）との間のＲＮＡ発現（ＦＰＫＭ）の分布を示す。＊は、０．００５未満のＰ値を示す（片側ウィルコクソンの順位和検定）。それぞれの対応のある比較のサンプルサイズおよび正確なＰ値に関して。図９Ａは、Ｘ軸の左から右に、最初の＋、－は、ＨＦ－２３５４の結果を示し、２番目の＋、－は、ＨＦ－２９２７の結果を示し、３番目の＋、－は、ＨＦ－３０１６の結果を示し、４番目の＋、－は、ＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｂは、ｅｃＤＮＡ接触頻度の程度の増加（０～９）に応じた染色体遺伝子の遺伝子発現（ＦＰＫＭ）の分布を示す。それぞれのｅｃＤＮＡ（＋）株について、当てはめた値の９５％の信頼区間を、影付きで示す。平滑化したＦＰＫＭを、当てはめた実線として表す。図９Ｂは、それぞれのトランス相互作用頻度（１～１０）のそれぞれ４つの箱のセットが、左から右に、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｃは、全トランスクリプトーム（ｎ＝２１，１８６、１８，９８８、１９，２０６、および１９，１８０）と対比した、ｅｃＤＮＡに接続された腫瘍遺伝子（ｎ＝８７、５６、７８、および５４）の発現レベルを示す箱ひげ図である。片側ウィルコクソンの順位和検定による対応のある比較のＰ値は、１．２Ｅ－７、１．４Ｅ－５、９．０Ｅ－８、および１．１Ｅ－５である。図９Ａ～Ｃ、中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。図９Ｃは、Ｘ軸の左から右に、腫瘍、野生型（ＷＴ）が、ＨＦ－２３５４の結果を示し、２番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－２９２７の結果を示し、３番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－３０１６の結果を示し、４番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｄは、腫瘍遺伝子が、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用を介して空間的に近接してクラスター化されることを示す図である。ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７においてｅｃＤＮＡ接続ハブによって媒介される２つのコミュニティの例が、示されている。ノード間のトランス相互作用は、太さがｌｏｇ１０（ｉＰＥＴカウント）で表される黄褐色の線で表されている。青色の円は、遺伝子（プロモーター）ノードであり、紫色の円は、腫瘍遺伝子として注釈が付けられた遺伝子（プロモーター）ノードであり、灰色の円は、遺伝子間ノードである。円のサイズは、接続性スコア（全ゲノムネットワーク全体におけるエッジの数）に比例するが、手作業により小さいサイズに調整されたｅｃＤＮＡ円は除く。選択された遺伝子は、コミュニティ間での変動性を示すようにラベル付けされている。図９Ｅは、ｅｃＤＮＡが、移動性エンハンサーとして機能し、広範囲のシスおよびトランス染色体相互作用を行って、腫瘍遺伝子を活性な転写ハブに動員し、がん細胞における全体的な転写増幅を促進することを示すモデルの概略図である。
【図9B】図９Ａ～Ｅは、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用が、空間的に凝集された核内ネットワークにおいて、活性な転写について腫瘍遺伝子を標的とすることを示す、箱ひげ図および概略図を提供する。図９Ａは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれから得られた、ｅｃＤＮＡとトランス相互作用する染色体遺伝子（ｎ＝１，８８７、１，２７０、１，４８３、および１，１５７）と、トランス染色体相互作用を有しない遺伝子（ｎ＝４８３、１９４、６５３、および５９７）との間のＲＮＡ発現（ＦＰＫＭ）の分布を示す。＊は、０．００５未満のＰ値を示す（片側ウィルコクソンの順位和検定）。それぞれの対応のある比較のサンプルサイズおよび正確なＰ値に関して。図９Ａは、Ｘ軸の左から右に、最初の＋、－は、ＨＦ－２３５４の結果を示し、２番目の＋、－は、ＨＦ－２９２７の結果を示し、３番目の＋、－は、ＨＦ－３０１６の結果を示し、４番目の＋、－は、ＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｂは、ｅｃＤＮＡ接触頻度の程度の増加（０～９）に応じた染色体遺伝子の遺伝子発現（ＦＰＫＭ）の分布を示す。それぞれのｅｃＤＮＡ（＋）株について、当てはめた値の９５％の信頼区間を、影付きで示す。平滑化したＦＰＫＭを、当てはめた実線として表す。図９Ｂは、それぞれのトランス相互作用頻度（１～１０）のそれぞれ４つの箱のセットが、左から右に、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｃは、全トランスクリプトーム（ｎ＝２１，１８６、１８，９８８、１９，２０６、および１９，１８０）と対比した、ｅｃＤＮＡに接続された腫瘍遺伝子（ｎ＝８７、５６、７８、および５４）の発現レベルを示す箱ひげ図である。片側ウィルコクソンの順位和検定による対応のある比較のＰ値は、１．２Ｅ－７、１．４Ｅ－５、９．０Ｅ－８、および１．１Ｅ－５である。図９Ａ～Ｃ、中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。図９Ｃは、Ｘ軸の左から右に、腫瘍、野生型（ＷＴ）が、ＨＦ－２３５４の結果を示し、２番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－２９２７の結果を示し、３番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－３０１６の結果を示し、４番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｄは、腫瘍遺伝子が、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用を介して空間的に近接してクラスター化されることを示す図である。ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７においてｅｃＤＮＡ接続ハブによって媒介される２つのコミュニティの例が、示されている。ノード間のトランス相互作用は、太さがｌｏｇ１０（ｉＰＥＴカウント）で表される黄褐色の線で表されている。青色の円は、遺伝子（プロモーター）ノードであり、紫色の円は、腫瘍遺伝子として注釈が付けられた遺伝子（プロモーター）ノードであり、灰色の円は、遺伝子間ノードである。円のサイズは、接続性スコア（全ゲノムネットワーク全体におけるエッジの数）に比例するが、手作業により小さいサイズに調整されたｅｃＤＮＡ円は除く。選択された遺伝子は、コミュニティ間での変動性を示すようにラベル付けされている。図９Ｅは、ｅｃＤＮＡが、移動性エンハンサーとして機能し、広範囲のシスおよびトランス染色体相互作用を行って、腫瘍遺伝子を活性な転写ハブに動員し、がん細胞における全体的な転写増幅を促進することを示すモデルの概略図である。
【図9C】図９Ａ～Ｅは、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用が、空間的に凝集された核内ネットワークにおいて、活性な転写について腫瘍遺伝子を標的とすることを示す、箱ひげ図および概略図を提供する。図９Ａは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれから得られた、ｅｃＤＮＡとトランス相互作用する染色体遺伝子（ｎ＝１，８８７、１，２７０、１，４８３、および１，１５７）と、トランス染色体相互作用を有しない遺伝子（ｎ＝４８３、１９４、６５３、および５９７）との間のＲＮＡ発現（ＦＰＫＭ）の分布を示す。＊は、０．００５未満のＰ値を示す（片側ウィルコクソンの順位和検定）。それぞれの対応のある比較のサンプルサイズおよび正確なＰ値に関して。図９Ａは、Ｘ軸の左から右に、最初の＋、－は、ＨＦ－２３５４の結果を示し、２番目の＋、－は、ＨＦ－２９２７の結果を示し、３番目の＋、－は、ＨＦ－３０１６の結果を示し、４番目の＋、－は、ＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｂは、ｅｃＤＮＡ接触頻度の程度の増加（０～９）に応じた染色体遺伝子の遺伝子発現（ＦＰＫＭ）の分布を示す。それぞれのｅｃＤＮＡ（＋）株について、当てはめた値の９５％の信頼区間を、影付きで示す。平滑化したＦＰＫＭを、当てはめた実線として表す。図９Ｂは、それぞれのトランス相互作用頻度（１～１０）のそれぞれ４つの箱のセットが、左から右に、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｃは、全トランスクリプトーム（ｎ＝２１，１８６、１８，９８８、１９，２０６、および１９，１８０）と対比した、ｅｃＤＮＡに接続された腫瘍遺伝子（ｎ＝８７、５６、７８、および５４）の発現レベルを示す箱ひげ図である。片側ウィルコクソンの順位和検定による対応のある比較のＰ値は、１．２Ｅ－７、１．４Ｅ－５、９．０Ｅ－８、および１．１Ｅ－５である。図９Ａ～Ｃ、中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。図９Ｃは、Ｘ軸の左から右に、腫瘍、野生型（ＷＴ）が、ＨＦ－２３５４の結果を示し、２番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－２９２７の結果を示し、３番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－３０１６の結果を示し、４番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｄは、腫瘍遺伝子が、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用を介して空間的に近接してクラスター化されることを示す図である。ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７においてｅｃＤＮＡ接続ハブによって媒介される２つのコミュニティの例が、示されている。ノード間のトランス相互作用は、太さがｌｏｇ１０（ｉＰＥＴカウント）で表される黄褐色の線で表されている。青色の円は、遺伝子（プロモーター）ノードであり、紫色の円は、腫瘍遺伝子として注釈が付けられた遺伝子（プロモーター）ノードであり、灰色の円は、遺伝子間ノードである。円のサイズは、接続性スコア（全ゲノムネットワーク全体におけるエッジの数）に比例するが、手作業により小さいサイズに調整されたｅｃＤＮＡ円は除く。選択された遺伝子は、コミュニティ間での変動性を示すようにラベル付けされている。図９Ｅは、ｅｃＤＮＡが、移動性エンハンサーとして機能し、広範囲のシスおよびトランス染色体相互作用を行って、腫瘍遺伝子を活性な転写ハブに動員し、がん細胞における全体的な転写増幅を促進することを示すモデルの概略図である。
【図9D】図９Ａ～Ｅは、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用が、空間的に凝集された核内ネットワークにおいて、活性な転写について腫瘍遺伝子を標的とすることを示す、箱ひげ図および概略図を提供する。図９Ａは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれから得られた、ｅｃＤＮＡとトランス相互作用する染色体遺伝子（ｎ＝１，８８７、１，２７０、１，４８３、および１，１５７）と、トランス染色体相互作用を有しない遺伝子（ｎ＝４８３、１９４、６５３、および５９７）との間のＲＮＡ発現（ＦＰＫＭ）の分布を示す。＊は、０．００５未満のＰ値を示す（片側ウィルコクソンの順位和検定）。それぞれの対応のある比較のサンプルサイズおよび正確なＰ値に関して。図９Ａは、Ｘ軸の左から右に、最初の＋、－は、ＨＦ－２３５４の結果を示し、２番目の＋、－は、ＨＦ－２９２７の結果を示し、３番目の＋、－は、ＨＦ－３０１６の結果を示し、４番目の＋、－は、ＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｂは、ｅｃＤＮＡ接触頻度の程度の増加（０～９）に応じた染色体遺伝子の遺伝子発現（ＦＰＫＭ）の分布を示す。それぞれのｅｃＤＮＡ（＋）株について、当てはめた値の９５％の信頼区間を、影付きで示す。平滑化したＦＰＫＭを、当てはめた実線として表す。図９Ｂは、それぞれのトランス相互作用頻度（１～１０）のそれぞれ４つの箱のセットが、左から右に、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｃは、全トランスクリプトーム（ｎ＝２１，１８６、１８，９８８、１９，２０６、および１９，１８０）と対比した、ｅｃＤＮＡに接続された腫瘍遺伝子（ｎ＝８７、５６、７８、および５４）の発現レベルを示す箱ひげ図である。片側ウィルコクソンの順位和検定による対応のある比較のＰ値は、１．２Ｅ－７、１．４Ｅ－５、９．０Ｅ－８、および１．１Ｅ－５である。図９Ａ～Ｃ、中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。図９Ｃは、Ｘ軸の左から右に、腫瘍、野生型（ＷＴ）が、ＨＦ－２３５４の結果を示し、２番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－２９２７の結果を示し、３番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－３０１６の結果を示し、４番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｄは、腫瘍遺伝子が、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用を介して空間的に近接してクラスター化されることを示す図である。ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７においてｅｃＤＮＡ接続ハブによって媒介される２つのコミュニティの例が、示されている。ノード間のトランス相互作用は、太さがｌｏｇ１０（ｉＰＥＴカウント）で表される黄褐色の線で表されている。青色の円は、遺伝子（プロモーター）ノードであり、紫色の円は、腫瘍遺伝子として注釈が付けられた遺伝子（プロモーター）ノードであり、灰色の円は、遺伝子間ノードである。円のサイズは、接続性スコア（全ゲノムネットワーク全体におけるエッジの数）に比例するが、手作業により小さいサイズに調整されたｅｃＤＮＡ円は除く。選択された遺伝子は、コミュニティ間での変動性を示すようにラベル付けされている。図９Ｅは、ｅｃＤＮＡが、移動性エンハンサーとして機能し、広範囲のシスおよびトランス染色体相互作用を行って、腫瘍遺伝子を活性な転写ハブに動員し、がん細胞における全体的な転写増幅を促進することを示すモデルの概略図である。
【図9E】図９Ａ～Ｅは、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用が、空間的に凝集された核内ネットワークにおいて、活性な転写について腫瘍遺伝子を標的とすることを示す、箱ひげ図および概略図を提供する。図９Ａは、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれから得られた、ｅｃＤＮＡとトランス相互作用する染色体遺伝子（ｎ＝１，８８７、１，２７０、１，４８３、および１，１５７）と、トランス染色体相互作用を有しない遺伝子（ｎ＝４８３、１９４、６５３、および５９７）との間のＲＮＡ発現（ＦＰＫＭ）の分布を示す。＊は、０．００５未満のＰ値を示す（片側ウィルコクソンの順位和検定）。それぞれの対応のある比較のサンプルサイズおよび正確なＰ値に関して。図９Ａは、Ｘ軸の左から右に、最初の＋、－は、ＨＦ－２３５４の結果を示し、２番目の＋、－は、ＨＦ－２９２７の結果を示し、３番目の＋、－は、ＨＦ－３０１６の結果を示し、４番目の＋、－は、ＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｂは、ｅｃＤＮＡ接触頻度の程度の増加（０～９）に応じた染色体遺伝子の遺伝子発現（ＦＰＫＭ）の分布を示す。それぞれのｅｃＤＮＡ（＋）株について、当てはめた値の９５％の信頼区間を、影付きで示す。平滑化したＦＰＫＭを、当てはめた実線として表す。図９Ｂは、それぞれのトランス相互作用頻度（１～１０）のそれぞれ４つの箱のセットが、左から右に、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｃは、全トランスクリプトーム（ｎ＝２１，１８６、１８，９８８、１９，２０６、および１９，１８０）と対比した、ｅｃＤＮＡに接続された腫瘍遺伝子（ｎ＝８７、５６、７８、および５４）の発現レベルを示す箱ひげ図である。片側ウィルコクソンの順位和検定による対応のある比較のＰ値は、１．２Ｅ－７、１．４Ｅ－５、９．０Ｅ－８、および１．１Ｅ－５である。図９Ａ～Ｃ、中央線は中央値、枠は第１および第３の四分位、ひげは１．５×四分位間範囲（ＩＱＲ）、点は外れ値である。図９Ｃは、Ｘ軸の左から右に、腫瘍、野生型（ＷＴ）が、ＨＦ－２３５４の結果を示し、２番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－２９２７の結果を示し、３番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－３０１６の結果を示し、４番目の腫瘍、ＷＴは、ＨＦ－３１７７の結果を示す。図９Ｄは、腫瘍遺伝子が、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用を介して空間的に近接してクラスター化されることを示す図である。ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７においてｅｃＤＮＡ接続ハブによって媒介される２つのコミュニティの例が、示されている。ノード間のトランス相互作用は、太さがｌｏｇ１０（ｉＰＥＴカウント）で表される黄褐色の線で表されている。青色の円は、遺伝子（プロモーター）ノードであり、紫色の円は、腫瘍遺伝子として注釈が付けられた遺伝子（プロモーター）ノードであり、灰色の円は、遺伝子間ノードである。円のサイズは、接続性スコア（全ゲノムネットワーク全体におけるエッジの数）に比例するが、手作業により小さいサイズに調整されたｅｃＤＮＡ円は除く。選択された遺伝子は、コミュニティ間での変動性を示すようにラベル付けされている。図９Ｅは、ｅｃＤＮＡが、移動性エンハンサーとして機能し、広範囲のシスおよびトランス染色体相互作用を行って、腫瘍遺伝子を活性な転写ハブに動員し、がん細胞における全体的な転写増幅を促進することを示すモデルの概略図である。
【図10A】図１０Ａ～Ｃは、ｅｃＤＮＡトランス接続性遺伝子が、活動的に転写されることを示す図、概略図、および箱ひげ図を提供する。図１０Ａは、５つのＧＢＭ由来のニューロスフェア細胞株から測定されたすべての発現されるＲＮＡ間における高い相関性を示し、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析の一貫性を表す。図１０Ｂは、それらのｅｃＤＮＡ接続性ステータスに基づいて、遺伝子が、群Ｉ：ｅｃＤＮＡに接続するプロモーターを有する遺伝子、群ＩＩ：他のプロモーターとトランス接続するが、ｅｃＤＮＡ接続は有しないプロモーターを有する遺伝子、および群ＩＩＩ：トランス相互作用を有しない遺伝子という３つの異なるカテゴリーに分類されることを示す。図１０Ｃは、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１７、およびＨＦ－３１７７ ｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における群Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩからの遺伝子の定常状態のＲＮＡ発現（ＦＰＫＭ）の箱ひげ図を提供する。＊は、片側ウィルコクソンの順位和検定に基づく有意なＰ値を表す。対応のある比較の正確なＰ値を特定し、遺伝子を、群Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩのそれぞれに分類した。
【図10B】図１０Ａ～Ｃは、ｅｃＤＮＡトランス接続性遺伝子が、活動的に転写されることを示す図、概略図、および箱ひげ図を提供する。図１０Ａは、５つのＧＢＭ由来のニューロスフェア細胞株から測定されたすべての発現されるＲＮＡ間における高い相関性を示し、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析の一貫性を表す。図１０Ｂは、それらのｅｃＤＮＡ接続性ステータスに基づいて、遺伝子が、群Ｉ：ｅｃＤＮＡに接続するプロモーターを有する遺伝子、群ＩＩ：他のプロモーターとトランス接続するが、ｅｃＤＮＡ接続は有しないプロモーターを有する遺伝子、および群ＩＩＩ：トランス相互作用を有しない遺伝子という３つの異なるカテゴリーに分類されることを示す。図１０Ｃは、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１７、およびＨＦ－３１７７ ｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における群Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩからの遺伝子の定常状態のＲＮＡ発現（ＦＰＫＭ）の箱ひげ図を提供する。＊は、片側ウィルコクソンの順位和検定に基づく有意なＰ値を表す。対応のある比較の正確なＰ値を特定し、遺伝子を、群Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩのそれぞれに分類した。
【図10C】図１０Ａ～Ｃは、ｅｃＤＮＡトランス接続性遺伝子が、活動的に転写されることを示す図、概略図、および箱ひげ図を提供する。図１０Ａは、５つのＧＢＭ由来のニューロスフェア細胞株から測定されたすべての発現されるＲＮＡ間における高い相関性を示し、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析の一貫性を表す。図１０Ｂは、それらのｅｃＤＮＡ接続性ステータスに基づいて、遺伝子が、群Ｉ：ｅｃＤＮＡに接続するプロモーターを有する遺伝子、群ＩＩ：他のプロモーターとトランス接続するが、ｅｃＤＮＡ接続は有しないプロモーターを有する遺伝子、および群ＩＩＩ：トランス相互作用を有しない遺伝子という３つの異なるカテゴリーに分類されることを示す。図１０Ｃは、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１７、およびＨＦ－３１７７ ｅｃＤＮＡ（＋）細胞株における群Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩからの遺伝子の定常状態のＲＮＡ発現（ＦＰＫＭ）の箱ひげ図を提供する。＊は、片側ウィルコクソンの順位和検定に基づく有意なＰ値を表す。対応のある比較の正確なＰ値を特定し、遺伝子を、群Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩのそれぞれに分類した。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明は、部分的に、染色体外環状ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）およびがんなどの疾患におけるｅｃＤＮＡの役割を特定する方法に関する。本発明のある特定の方法は、ｅｃＤＮＡおよびがんゲノムにおけるその発がん性変化の特徴付けを含む。現在では、ＣｈＩＡ－ＰＥＴクロマチン相互作用アッセイなどであるがこれに限定されない、クロマチン相互作用アッセイを利用して、ｅｃＤＮＡの特定を進行させ、がんなどであるがこれに限定されない疾患において転写プログラムに機能的に影響を及ぼすゲノム全体のｅｃＤＮＡにより媒介されるクロマチン接触を特徴付けることができることが、決定されている。神経膠芽腫患者に由来するニューロスフェア培養物において、ｅｃＤＮＡを使用して研究が行われており、そのうちのいくつかは本明細書に記載されている。これらの研究において、ｅｃＤＮＡは、それらの広範囲の染色体間相互作用の存在によって特定された。ｅｃＤＮＡ－クロマチン接触の中心点は、主として染色体プロモーターに収束する広範かつ高レベルのシグナルによって示されたが、このことは染色体遺伝子転写のゲノム全体での活性化における重要な制御的役割を示している。本発明の一部の実施形態において、シグナルは、Ｈ３Ｋ２７ａｃシグナルを含んでいた。ｅｃＤＮＡの染色体標的を解読することにより、ｅｃＤＮＡ－クロマチン接続性ネットワーク内に空間的に収束される活動的に発現される腫瘍遺伝子との関係が判明した。行った研究の結果により、ｅｃＤＮＡが、腫瘍遺伝子増幅の兆候の他に、がんにおける腫瘍遺伝子発現を活性化する移動性転写増幅エレメントとして機能することが示された。
【0012】
ｅｃＤＮＡの特定
ｅｃＤＮＡのクロマチン構成を特定し、その構成が遺伝子転写の制御にどのように寄与しているかを特定するために、クロマチン相互作用アッセイを利用して、同じ細胞株において、一般的な空間的クロマチン構成およびタンパク質因子に媒介される長距離のクロマチン相互作用の両方を試験し調査した。本発明の一部の実施形態において使用することができるクロマチン相互作用アッセイの非限定的な例は、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ法、ＣｈＩＰ法、およびＨｉ－Ｃ法である。現在では、公知のｅｃＤＮＡを、それらの強力かつ異常な分子内および分子間での全ゲノムクロマチン接触を通じて特定することができることが、実証されている。また、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）に媒介されるｅｃＤＮＡコネクトームおよびそれらの染色体パートナーを解読するために行われた研究により、ｅｃＤＮＡと、活動的に発現される常染色体性腫瘍遺伝子との間の関係性が特定された。この発見は、腫瘍進行を促進する移動性転写エンハンサーとして機能するｅｃＤＮＡの機序を示している。
【0013】
がんゲノムにおけるｅｃＤＮＡ標的化クロマチンインタラクトームの詳細な特徴付けを提供することに加えて、本明細書に開示されるクロマチン相互作用アッセイの使用により、ｅｃＤＮＡ内およびｅｃＤＮＡ間、ならびにｅｃＤＮＡと線形ＤＮＡとの間の強力なクロマチン接触に基づいて、ｅｃＤＮＡ内の増幅されたゲノムドメインを正確にマッピングするのに有効な手段が得られる。ｅｃＤＮＡを特徴付ける目的で使用されていた以前の方法は、全ゲノムシーケンシングおよびＤＮＡコピー数データの画像に基づく分析または計算による分析のいずれかを利用していた。本明細書に開示される本発明の実施形態は、少なくとも、本明細書に提供される方法を使用して、ＣｈＩＡ－ＰＥＴおよびＨｉ－Ｃなどであるがこれらに限定されないクロマチン相互作用アッセイを通じて染色体間のクロマチン接触頻度を直接的に測定することができるという点で、コピー数の増加を有する領域の構造分析または顕微鏡イメージングアプローチに頼るこれまでの方法とは異なる。本発明の方法の実施形態は、ｅｃＤＮＡのサイズ、異なるｅｃＤＮＡ間でのサイズの比較、ｅｃＤＮＡコピー数、ｅｃＤＮＡの配列情報、およびｅｃＤＮＡ配列の内容などであるがこれらに限定されない１つまたは複数のｅｃＤＮＡシグネチャーを特定するために使用することができる、偏りのないアプローチを提供する。加えて、本発明の方法の実施形態は、ｅｃＤＮＡ分子および染色体ＤＮＡ分子の異なる領域間での接触頻度およびパターンなどであるがこれらに限定されない、１つまたは複数の特徴を決定および／または評価するために使用することができる。本発明の方法におけるクロマチン相互作用アッセイの使用は、ｅｃＤＮＡ分子の物理的構造および連続性に関する見識を提供する。
【0014】
本発明のある特定の態様は、１つの細胞または複数の細胞において１つまたは複数のｅｃＤＮＡを特定する方法を含む。本方法は、非線形ＤＮＡ分子と少なくとも１つの線形染色体との間のクロマチン相互作用を検出する手段を含み得る。本発明の一部の実施形態において、本方法は、非線形ＤＮＡ分子と、染色体対の少なくとも１つの染色体との間のクロマチン相互作用を検出するステップを含む。「クロマチン相互作用を検出する」という用語は、本明細書で使用される場合、クロマチン相互作用の頻度、相互作用に含まれるｅｃＤＮＡ、相互作用に含まれる標的遺伝子、およびクロマチン相互作用の他の特徴のうちの１つまたは複数を検出することを意味する。クロマチン相互作用の特徴としては、非線形ＤＮＡのサイズ、細胞における非線形ＤＮＡ分子のコピー数のうちの１つまたは複数を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、本発明の方法は、クロマチン相互作用の１つまたは複数の特徴を比較するステップ、例えば、第１の決定時点で複数の細胞において非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数を決定するステップと、決定された平均を、対照の非線形ＤＮＡの細胞当たりの平均コピー数と比較するステップとを含む。本発明の一部の実施形態において、クロマチン相互作用の１つまたは複数の特徴を比較するステップは、第１の決定時点で複数の細胞において非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数を決定するステップと、決定された平均を、対照の非線形ＤＮＡの細胞当たりの平均コピー数と比較するステップとを含み得る。本発明の一部の実施形態において、対照の非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数は、別の決定時点とは異なる時点で複数の細胞において決定された非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数である。クロマチン相互作用の特徴を検出する他の非限定的な例としては、非線形ＤＮＡの少なくとも一部分の配列を決定するステップ、および決定された配列における腫瘍遺伝子配列の存在を特定するステップが挙げられる。
【0015】
細胞におけるｅｃＤＮＡを特定するために使用することができる特定の特性が、ここで特定されている。特性は、細胞におけるクロマチン相互作用の１つまたは複数の決定された特徴によって特定される。例えば、クロマチン相互作用を、ｅｃＤＮＡと少なくとも１つの線形染色体との間の接触を含むとして特定することは、（ｉ）細胞において検出されたクロマチン相互作用の頻度が有意に高いこと、（ｉｉ）非線形ＤＮＡ分子と、少なくとも１つの線形染色体（例えば、細胞内の染色体対のそれぞれの少なくとも１つの線形染色体であるが、これに限定されない）との間の接触、ならびに（ｉｉｉ）複数の細胞における非線形ＤＮＡ分子の細胞当たりの平均コピー数の経時的な増加を特定することを含む。本発明の一部の実施形態において、これらの３つの特性（特性ｉ～ｉｉｉ）の存在が、非線形ＤＮＡ分子をｅｃＤＮＡとして特定する。
【0016】
ｅｃＤＮＡのいくつかの特徴が、ここに特定されており、本発明の方法の一部の実施形態において、細胞内の非線形ＤＮＡ分子にこれらの特徴が存在することにより、非線形ＤＮＡ分子のｅｃＤＮＡとしての同一性が確認される。本発明の方法のある特定の実施形態は、検出された非線形ＤＮＡのｅｃＤＮＡとしての特定を確認するための手段として、以下の特徴のうちの１つ、２つ、または３つを決定することを含む。ここで特定されているｅｃＤＮＡの１つのそのような特徴は、ｅｃＤＮＡおよびその標的遺伝子を含むクロマチン相互作用が、細胞内の他の種類のクロマチン相互作用よりも有意に高いレベルおよび頻度で生じることである。本明細書で使用される場合、検出されたクロマチン相互作用の「有意に高い頻度」という用語は、検出されたそのようなクロマチン相互作用の数が、クロマチン相互作用がｅｃＤＮＡを含まない場合に検出されたクロマチン相互作用の数よりも統計学的に有意に高いことを意味する。
【0017】
ここで特定されているｅｃＤＮＡの別の特徴は、細胞におけるｅｃＤＮＡと少なくとも１つの線形染色体との間の接触の存在である。本発明の一部の実施形態において、ｅｃＤＮＡの特徴は、細胞におけるｅｃＤＮＡとそれぞれの染色体対の少なくとも１つの線形染色体との間の接触の存在を含む。例えば、制限することを意図するものではないが、細胞内の少なくとも１つの染色体との接触を有すると特定された非線形ＤＮＡ分子は、ｅｃＤＮＡとして特定される。別の非限定的な例において、細胞内の染色体のそれぞれ（例えば、ヒト二倍体細胞内の２３対の染色体のそれぞれ）における少なくとも１つの染色体との接触を有すると特定された非線形ＤＮＡ分子は、ｅｃＤＮＡとして特定される。後者の例では、ヒト細胞内の２３個の染色体対のそれぞれにおいて、少なくとも１つの線形染色体に位置する遺伝子標的とのｅｃＤＮＡ相互作用が存在するであろう。
【0018】
ここで特定されているｅｃＤＮＡの第３の特徴は、経時的に、ｅｃＤＮＡの細胞当たりの平均コピー数が増加することである。したがって、非限定的な例として、細胞集団から得られた細胞サンプルにおいて、非線形ＤＮＡのコピー数の平均が決定される。その後の時点で、第２の細胞サンプルが細胞集団から得られ、非線形ＤＮＡのコピー数の平均が決定され、第１のサンプルで決定された平均数と比較される。後のサンプルにおける非線形ＤＮＡの平均数の増加は、非線形ＤＮＡがｅｃＤＮＡであるという結論を裏付ける。本発明の一部の実施形態において、平均数の増加は、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、２００％、２５０％、または５００％の増加であり得、これには、示された範囲内のすべてのパーセンテージが含まれる。本発明の一部の実施形態において、平均数の増加は、少なくとも５００％、１０００％、１５００％、２０００％、または５０００％の増加であり得る。
【0019】
本発明の一部の実施形態において、１つの細胞または複数の細胞は、２つまたはそれを上回る異なる時点において、サンプル、培養物、または対象から得られる。２つの細胞サンプルを取得する間の時間の長さは、対象にとっての利便性、医療従事者にとっての利便性、がんのステータスもしくはステージ、がんの発達速度、腫瘍成長速度などを含むがこれらに限定されない因子に基づいて、独立して選択することができる。本発明の一部の実施形態では、２つの細胞サンプルを取得する間の時間間隔は、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、および３０日間である。本発明の一部の実施形態では、２つの細胞サンプルを取得する間の時間間隔は、少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間、２７週間、２８週間、２９週間、３０週間、３１週間、３２週間、３３週間、３４週間、３５週間、３６週間、３７週間、３８週間、３９週間、４０週間、４１週間、４２週間、４３週間、４４週間、４５週間、４６週間、４７週間、４８週間、４９週間、５０週間、５１週間、および５２週間である。本発明の一部の実施形態では、２つの細胞サンプルを取得する間の時間間隔は、少なくとも１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１３カ月間、１４カ月間、１５カ月間、１６カ月間、１７カ月間、１８カ月間、１９カ月間、２０カ月間、２１カ月間、２２カ月間、２３カ月間、２４カ月間、２５カ月間、２６カ月間、２７カ月間、２８カ月間、２９カ月間、３０カ月間、３１カ月間、３２カ月間、３３カ月間、３４カ月間、３５カ月間、３６カ月間、３７カ月間、３８カ月間、３９カ月間、４０カ月間、４１カ月間、４２カ月間、４３カ月間、４４カ月間、４５カ月間、４６カ月間、４７カ月間、４８カ月間、またはそれ以上である。本発明の一部の実施形態では、２つの細胞サンプルを取得する間の時間間隔は、少なくとも１年間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間、またはそれ以上である。２つを上回る細胞サンプルを、本発明の方法のある特定の実施形態において使用するために採取することができること、および任意の２つのサンプルを取得する間の時間間隔は独立して選択され得るが、細胞サンプルを取得する他の時間間隔と必ずしも同一でなくてもよいことが、理解されるであろう。
【0020】
ｅｃＤＮＡおよび標的腫瘍遺伝子
本明細書に記載される研究は、ｅｃＤＮＡと標的遺伝子、非限定的な例では腫瘍遺伝子との間の制御関係を示す。本明細書で使用される場合、「標的腫瘍遺伝子」という用語は、活性がｅｃＤＮＡによってモジュレートされる腫瘍遺伝子を意味する。標的腫瘍遺伝子の転写をモジュレートするｅｃＤＮＡは、遺伝子制御システム（ＧＲＳ）を介してそれを行い得る。ＧＲＳは、ｅｃＤＮＡにおける遺伝子制御因子を含む。ｅｃＤＮＡ遺伝子制御因子は、遺伝子活性化因子であってもよく、または一部の事例においては、遺伝子サイレンサーであってもよい。ｅｃＤＮＡとその標的遺伝子との間の相互作用が、ｅｃＤＮＡ遺伝子制御因子配列と転写因子との結合を含み得、転写因子は標的腫瘍因子の遺伝子制御エレメントにも結合することが、理解されるであろう。転写因子と、ＤＮＡの特定の短い領域を含む遺伝子制御エレメントとの結合は、標的腫瘍遺伝子の転写を刺激する。
【0021】
ｅｃＤＮＡ遺伝子制御因子および標的腫瘍遺伝子に結合する転写因子は、ポリペプチドの複合体を含み得、ｅｃＤＮＡ遺伝子制御因子と標的腫瘍遺伝子の遺伝子制御エレメントとの間の「接続因子」として作用する。「遺伝子制御エレメント」という用語は、標的腫瘍遺伝子の転写を担うおよび／またはそれに関与するプロモーターまたはエンハンサー配列などであるがこれらに限定されない、ＤＮＡ配列を意味する。本明細書で使用される場合、ｅｃＤＮＡ遺伝子制御因子とその標的腫瘍遺伝子との間の相互作用は、ｅｃＤＮＡ遺伝子制御因子の転写因子との接触を含み、これはまた、標的腫瘍遺伝子の遺伝子制御エレメント、例えば、標的腫瘍遺伝子のプロモーター配列とも接触する。ｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子の相互作用は、標的腫瘍遺伝子の転写を増強し、これが、がんの発達をもたらし得るか、またはそれを促進し得る。一部の実施形態において、がんは、ｅｃＤＮＡおよびその標的腫瘍遺伝子を含む細胞に存在し得る。ｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子の相互作用により生じるがん細胞が、対象に存在し得る。様々な標的腫瘍遺伝子は、ｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子の相互作用に起因して、増強された転写を有し得、細胞は、転写がｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子の相互作用によって増加する１つ、２つ、またはそれ以上の異なる腫瘍遺伝子を含み得る。対象における２つまたはそれを上回る細胞は、同じ標的腫瘍遺伝子を含んでもよく、または転写が１つもしくは複数のｅｃＤＮＡによってモジュレートされる異なる標的腫瘍遺伝子を含んでもよい。対象におけるがんは、１つ、２つ、またはそれを上回る異なる腫瘍遺伝子の活性によって生じ得る、および／またはそれによって維持され得、それぞれの転写は、１つまたは複数のｅｃＤＮＡによってモジュレートされる。
【0022】
２つまたはそれを上回る異なる腫瘍遺伝子が、対象のがんにおいて活性化されている事例では、異なる腫瘍遺伝子および／または異なるｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子の相互作用へと指向される２つまたはそれを上回る異なるがん治療薬を使用して、対象におけるがんを効果的に処置することができる。本発明の一部の実施形態において、がん治療薬は、ｅｃＤＮＡと特定の腫瘍遺伝子との間の相互作用の存在または不在、および相互作用によるその腫瘍遺伝子のモジュレーションに少なくとも部分的に基づいて、選択され得る、および／または対象に投与され得る。
【0023】
ｅｃＤＮＡを特定するために使用することができる本発明の方法に加えて、本発明のある特定の方法を使用して、ｅｃＤＮＡとその標的腫瘍遺伝子との間の相互作用の存在または不在を評価することによって、細胞におけるがんのステータスを評価することができる。これらの方法は、３次元ゲノム構成および遺伝子制御におけるその役割の理解の改善に部分的に基づく。本発明のある特定の実施形態は、細胞において、ｅｃＤＮＡと、少なくとも１つの標的腫瘍遺伝子との間の相互作用を特定する方法を含む。加えて、本発明の方法のある特定の実施形態は、ｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用の頻度および作用を評価するために使用することができる。本発明の一部の実施形態において、ｅｃＤＮＡの、その標的腫瘍遺伝子との相互作用は、標的腫瘍遺伝子の転写を増強させる（本明細書において、「増加させる」とも称される）。
【0024】
クロマチン相互作用アッセイ
本発明のある特定の態様は、クロマチン相互作用アッセイの使用を含む。本発明の方法のある特定の実施形態において、クロマチン相互作用アッセイは、染色体の構造特性を決定し、細胞内のｅｃＤＮＡを特定し、ｅｃＤＮＡと、腫瘍遺伝子などであるがこれに限定されない標的遺伝子との間の相互作用を決定するために使用される。本明細書に開示されるクロマチン相互作用アッセイおよび分析はまた、ｅｃＤＮＡによる標的腫瘍遺伝子の転写制御の決定も可能にする。
【0025】
細胞におけるクロマチン相互作用をアッセイするための手段の非限定的な例は、ＣｈＩＰをクロマチン構成捕捉（３Ｃ）技術と組み合わせたペアエンドタグシーケンシングによるクロマチン相互作用分析（ＣｈＩＡ－ＰＥＴ）である（Fullwood, et al. 2009, Nature, Vol. 426 (7269):58-64を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣｈＩＡ－ＰＥＴ法は、目的のタンパク質またはタンパク質複合体を介して互いと相互作用する離れたＤＮＡ領域間の相互作用の検出を可能にする。ＣｈＩＡ－ＰＥＴ法の非限定的な例において、細胞由来のクロマチンは、架橋され、消化され、目的のタンパク質に対する抗体を使用して取り出される。リンカー配列が、ＤＮＡの末端にライゲーションされ、リンカー配列の存在により、互いとのライゲーションが促進される（Zhang et al., 2012, Methods Vol. 58, No. 3:289-299、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これにより、ゲノムの２つの異なる領域に由来するハイブリッドＤＮＡフラグメントが得られる。結果として得られるライブラリーをシーケンシングし、その結果により、互いにおよび目的のタンパク質と相互作用するＤＮＡ領域が特定される。ＣｈＩＡ－ＰＥＴは、これまでに、転写因子の相互作用をマッピングするために使用されており、本発明の方法の実施形態におけるその使用により、ｅｃＤＮＡ、ｅｃＤＮＡの標的遺伝子、およびｅｃＤＮＡ／標的遺伝子の相互作用による標的遺伝子の転写のモジュレーションの特定が可能となる。ＣｈＩＡ－ＰＥＴを使用したクロマチン相互作用分析は、現在では、ゲノム全体でのクロマチン相互作用の発見に使用されている。以前の視覚的方法および計算による方法は、一般に、弱いかまたは動的な相互作用を検出するには好適ではなかったが、この欠点は、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ法の使用を通じて改善される。
【0026】
本発明のある特定の実施形態において使用されるクロマチン相互作用を特定および評価する手段の別の非限定的な例は、Ｈｉ－Ｃ評価方法である。Ｈｉ－Ｃに基づく方法は、任意の２つの所与のゲノム遺伝子座間でのクロマチン相互作用強度を測定することができる偏りのない全ゲノムカバレッジを提供するその能力に部分的に起因して、本発明の実施形態において使用され得る。本発明のある特定の実施形態において、Ｈｉ－Ｃデータを使用して、３次元空間において関連するゲノムの線形連続領域であるトポロジー的関連ドメイン（ＴＡＤ、topologically associating domain）など、全ゲノムクロマチン構成を評価することができる。Ｈｉ－ＣデータからＴＡＤを特定するために、様々な当該技術分野において公知のアルゴリズムが、日常的に使用されている（例えば、Dixon et al, 2012 Nature 485 (7398):376-80を参照されたく、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0027】
以下は、Ｈｉ－Ｃ分析におけるエレメントの全般的な概要である。細胞のゲノムは架橋され、それによって、ゲノム遺伝子座間の相互作用が保持される。Ｈｉ－Ｃ法において細胞ゲノムを架橋するために使用するのに好適ないくつかの当該技術分野で公知の固定方法が存在する。架橋させた後、架橋したゲノムを、制限酵素を使用して切断し、結果として得られたフラグメントのサイズにより、Ｈｉ－Ｃ法による相互作用マッピングの分解能を決定する。使用することができる制限酵素の非限定的な例は、ＥｃｏＲ１またはＨｉｎｄＩＩＩなど、４０００ｂｐごとに切断を行い、ヒトゲノムに約１００万個のフラグメントをもたらすものである。より分解能の高い相互作用マッピングのために、より高い頻度で切断する制限酵素も使用され得る。消化ステップの後に、小片を、架橋していないフラグメント間でのライゲーションではなく、架橋した相互作用するフラグメント間でのライゲーションに適した条件下において、ランダムにライゲーションさせる。相互作用する遺伝子座を、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などであるがこれに限定されない方法を使用して、ライゲーションされた接合部を増幅させることによって、定量することができ、例えば、Naumova, et al., 2012 Methods. 58 (3):192-203およびGavrilov, et al., 2013 PLOS One. 8 (3):e60403を参照されたく、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ある特定のＨｉ－Ｃ法は、フラグメントのヌクレオチド配列、例えば、ｅｃＤＮＡの配列を見出すための高スループットのシーケンシングを含み得る。
【0028】
本発明の実施形態において使用されるＣｈＩＡ－ＰＥＴおよび／またはＨＩ－Ｃ法に含まれ得る追加のステップおよび手順は、本明細書に記載されている。例えば、計算方法、分析方法、データ評価方法などである。ＣｈＩＡ－ＰＥＴおよびＨＩ－Ｃに関連するクロマチン相互作用分析法に加えて、他のクロマチン相互作用アッセイおよび分析方法が、当該技術分野において公知であり使用されており、本発明の方法の実施形態における使用に好適である。さらなるクロマチン相互作用アッセイ／分析方法の非限定的な例としては、４Ｃ（Nat Genet. 2006 Nov;38(11):1348-54）、Ｈｉ－Ｃ（Lieberman-Aiden, E. et al. 326, 289-293 (2009)、捕捉Ｈｉ－Ｃ（Nat Genet. 2015 Jun;47(6):598-606）、ＰＬＡＣ－ｓｅｑ（Cell research. 2016;26(12):1345-8）、およびＨｉＣｈＩＰ（Nat Methods. 2016 Nov;13(11):919-922）が挙げられ、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0029】
相互作用分析－一般的な情報および非限定的な実施形態
相互作用分析に関する以下の説明は、制限することを意図するものではなく、本発明の方法の実施形態を使用して得られる結果および情報を例示することを意図するものであることが理解されるであろう。他の特定の細胞型、領域、腫瘍遺伝子などを、本発明の実施形態において使用することができる。ｅｃＤＮＡとそれらの標的腫瘍遺伝子との間の相互作用の分析に関する追加の情報は、本明細書において実施例の節に記載されている。そのような情報としては、ＣｈＩＡ－ＰＥＴデータ、ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリー構築、およびデータ分析などを使用した、公知および公知ではないｅｃＤＮＡ領域の発見のための本発明の方法の実施形態の使用の提示が挙げられるが、これらに限定されない。
【0030】
本発明の方法のある特定の実施形態は、クロマチン接触の程度の定量を含んでいた。非限定的な例において、定量は、２３個すべての染色体にわたって正規化した全ゲノムトランス相互作用頻度（ｎｓＴＩＦ）を表す尺度を使用して行われる。ｅｃＤＮＡ領域は、ｅｃＤＮＡを有する領域において高度に上昇したｎｓＴＩＦレベルを有するとして特定された。加えて、ｅｃＤＮＡセグメントと連結した高ｎｓＴＩＦ領域は、ゲノム全体にわたってトランス接触を示し、染色体外遺伝子エレメントからの動的なｅｃＤＮＡ接続性を示している。この例で観察された全ゲノム接触パターンは、ｅｃＤＮＡの移動性により生じる。この非限定的な例では、特定された高いｎｓＴＩＦが、ｅｃＤＮＡの染色体外の性質に特異的であったことを検証するために、検証ステップを行った。この例において、ゲノム全体にわたるｅｃＤＮＡの接触頻度の上昇が、ＤＮＡ投薬作用単独の結果ではなく、その自律的能力によって決定されていたことを、結果により確認した。
【0031】
別の非限定的な例において、高頻度のシス相互作用が、ｅｃＤＮＡのゲノム領域内で検出された。ＨＦ－２９２７ ｅｃＤＮＡ（＋）細胞において、約５３０ＫｂのｅｃＤＮＡ領域内で観察されたシス相互作用強度は、２，８７９であり、ｅｃＤＮＡ（－） ＨＦ－３０３５細胞の同じ領域におけるわずか１２と比較して、２４０倍の増加であった。この高い接触の増加は、このｅｃＥＧＦＲのサイズおよびゲノム構造の両方を直接的に反映していた。同様に、結果は、ＨＦ－２３５４における所与のｅｃＭＹＣ領域の２つのセグメント内およびセグメント間での強力なシス相互作用を示した。広範囲のＲＮＡＰＩＩがテザーしたクロマチン接触（アンカーと称される、相互作用によって接続されるＤＮＡ領域で検出されたＲＮＡＰＩＩ結合として定義される）が、ｅｃＤＮＡ内の異なる領域間においてシスで（ｅｃＤＮＡ内と称される）および線形染色体上の他の遺伝子または制御エレメントとトランスで（トランス－相互作用と称される）の両方で検出された。染色体外内の接続性パターンは、高頻度の相互作用を有するループのペアおよび強い接触の集中点をはっきりと示すことが特定され、これらは、異なるｅｃＤＮＡ分子間の接触および個々のｅｃＤＮＡ内のフォールディングにまとめて由来することが予測された。ｅｃＤＮＡとそれらの染色体パートナーとの間のトランス相互作用の中で、ｅｃＤＮＡ上のアンカーは、主として遺伝子内または遺伝子間の非コーディング領域にあるとして特定され、それらのトランス相互作用染色体アンカーは、主としてプロモーターに局在していた。これらの相互作用のこの並存は、これらの接触の転写機能を補助する。
【0032】
ｅｃＤＮＡと転写制御領域との相互作用を評価する非限定的な例において、Ｈ３Ｋ２７ａｃプロファイリングを行って、活性なエンハンサーおよびプロモーターを示す。ｅｃＤＮＡにおいて増幅された腫瘍遺伝子の制御を、それらのトランス染色体相互作用領域を評価することによって試験する。これらのｅｃＤＮＡ接続型非コーディング染色体アンカーは、Ｈ３Ｋ２７ａｃピークとの高いオーバーラップを呈し、これは、ｅｃＤＮＡ接触を有しないトランス相互作用非コーディング染色体アンカーによるものよりも有意に高く、ｅｃＤＮＡ上の腫瘍遺伝子の転写が、クロマチン接触を通じて線形染色体上のエンハンサーと結合することによってさらに増強されるという結論を支持する。
【0033】
本発明のある特定の実施形態において、ｅｃＤＮＡ相互作用を、高頻度の接触集中点とｅｃＤＮＡ内のＨ３Ｋ２７ａｃピークとの同時発生を観察することによって評価し、結果は、これらの相互作用アンカーが、活性なエンハンサーのように挙動するという結論を支持する。相互作用評価方法のこの非限定的な例において、５３０ＫｂのｅｃＥＧＦＲ領域内のＨ３Ｋ２７ａｃピークは、ＨＦ－２９２７において高い相互作用頻度の領域と共アライメントし、ｅｃＤＮＡ（－）細胞（ＨＦ－３０３５）の染色体ＥＧＦＲ領域におけるＨ３Ｋ２７ａｃピークと比較すると、より広いゲノムスパンで近接したクラスターとしてのパターンを呈し、エンハンサーシグナルが、ｅｃＤＮＡのクロマチン接触部位に凝集していたという結論を支持する。この実施例において、中期ＨＦ２９２７細胞に対するＨ３Ｋ２７ａｃを標的とする抗体を使用した免疫染色により、Ｈ３Ｋ２７ａｃと、ｅｃＤＮＡを示すＤＡＰＩシグナルとの間でオーバーラップするシグナルが示され、これにより、エンハンサー機能とｅｃＤＮＡとの間の関係が確認された。
【0034】
本発明のある特定の実施形態において、方法は、ｅｃＤＮＡにより媒介されるトランスクロマチン相互作用と関連するＨ３Ｋ２７ａｃシグナルの増加を定量的に評価することを含み、ｅｃＤＮＡクロマチン相互作用アンカーと関連するＨ３Ｋ２７ａｃピークが、ｅｃＤＮＡ接触を有しない全ゲノムＨ３Ｋ２７ａｃピークのものと比較して、有意に高い濃縮を有することが見出された。評価のこの非限定的な例において、Ｈ３Ｋ２７ａｃシグナルの強い増強は、ｅｃＤＮＡに特異的であると確認された。
【0035】
本発明の方法の使用の別の非限定的な例において、「スーパーエンハンサー」を想起させるｅｃＤＮＡにおいて観察されるエンハンサーシグネチャーを評価するための方法を、使用した。この非限定的な例において、ｅｃＤＮＡおよびそれらのトランス相互作用する染色体アンカーにおいて検出されたＨ３Ｋ２７ａｃピークのスパンサイズに関する試験を行った。ｅｃＤＮＡにおけるＨ３Ｋ２７ａｃピークは、ｅｃＤＮＡ接触を有しない染色体Ｈ３Ｋ２７ピークよりも有意に長いスパンを有したことが見出された。配列分析により、ＪＵＮ、ＦＯＳ、およびＡＴＦを含む、ＲＮＡＰＩＩの全体的な転写および細胞増殖を制御するのに重要な転写因子の結合モチーフの濃縮が示された。まとめると、Ｈ３Ｋ２７ａｃシグナルの強い増強を伴うＲＮＡＰＩＩシグナルのシスおよびトランス両方の収束により、ｅｃＤＮＡ分子が、ゲノム全体に広範にＲＮＡポリメラーゼ機構に接続することができるという結論が支持され、全ゲノム転写増幅因子としての機能が裏付けられる。
【0036】
非限定的な例において、本発明の方法を使用して、ｅｃＤＮＡトランス相互作用と関連するエンハンサーシグナルの増加が、活性な転写をもたらすかどうかを決定する。この例において、ＲＮＡ発現を試験し、結果により、ｅｃＤＮＡ相互作用遺伝子が、他のトランス染色体接触を有しない遺伝子、またはｅｃＤＮＡとの接触を有しないが他の遺伝子とのトランス染色体相互作用を有する遺伝子のいずれと比較しても、有意に高いレベルの発現を有したことが示された。さらに、この例の方法において、ｅｃＤＮＡ接続遺伝子の発現レベルは、それらのｅｃＤＮＡ接触の頻度（独立したトランス相互作用の数によって測定される）と正相関するとして特定され、ｅｃＤＮＡ接続性が、転写活性および高度に増強されたＨ３Ｋ２７ａｃシグネチャーと高度に関連するという発見を裏付け、ｅｃＤＮＡが、全体的な転写増幅機構として作用し得ることを示唆する。
【0037】
個々の腫瘍遺伝子の動員の他に、ｅｃＤＮＡは、多数の腫瘍遺伝子がｅｃＤＮＡとの相互作用を介して一緒に空間的に近接する集中点として特定された。これらのｅｃＤＮＡに接続される腫瘍遺伝子の多くは、クロマチンネットワークのそれぞれ内に存在し、腫瘍遺伝子の共凝集は、協調的な転写共活性化を達成して腫瘍新生を促進するためにｅｃＤＮＡが採る構造に基づく機序であるという結論を裏付ける。
【0038】
がんステータスの評価
ｅｃＤＮＡが、クロマチン相互作用を通じて染色体外および染色体遺伝子転写を増強させ得ることが、今や示されている。本発明の実施形態は、細胞においてｅｃＤＮＡを特定するための方法を含む。本発明のある特定の実施形態は、標的遺伝子、例えば、転写が１つまたは複数のｅｃＤＮＡによってモジュレートされる腫瘍遺伝子に対するｅｃＤＮＡの作用を決定するための方法を提供する。ｅｃＤＮＡが、クロマチン相互作用を通じて染色体外および染色体遺伝子転写の発現を増強させ得ることが、ここで特定されている。この発見を、ｅｃＤＮＡの存在率および多様性と組み合わせて、がんなどの疾患における治療介入の標的として、ｅｃＤＮＡ、ｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子相互作用、および標的遺伝子を特定する。本発明の方法は、部分的に、腫瘍進化における遺伝子構造とエピジェネティックな結果との間の相互作用を特定することに基づく。本発明の方法の実施形態は、ｅｃＤＮＡを特定するため、ｅｃＤＮＡと標的遺伝子との相互作用を特定するため、および標的遺伝子とのｅｃＤＮＡ相互作用の作用を特定するための手段を提供する。がんにおけるｅｃＤＮＡ活性の役割およびこの染色体外構造体の固有なゲノム動態により、例えば、治療適用において使用するために、ｅｃＤＮＡおよびそれらの活性化された染色体標的遺伝子および活性化されたｅｃＤＮＡ標的遺伝子を標的とするための新しいアプローチが提供される。
【0039】
細胞のステータスまたは状態を確立し、それに関与する遺伝子発現プログラムとしては、ｅｃＤＮＡ遺伝子制御因子および標的腫瘍遺伝子の遺伝子制御エレメントに結合する１つまたは複数の転写因子の活性が挙げられるが、これに限定されない。特定のゲノムエレメントの非限定的な例は、転写因子に結合し、長い距離をループして特定の遺伝子に接触しそれを調節することができる、エンハンサーエレメントである。ｅｃＤＮＡ遺伝子制御因子配列と、標的腫瘍遺伝子のプロモーターなどであるがこれに限定されない遺伝子制御エレメントとの間の相互作用を、ｅｃＤＮＡと、線形染色体上の遺伝子制御エレメントとの間の相互作用が、ここで研究されている。本発明のある特定の態様を使用して、線形ゲノムエレメント、例えば、腫瘍遺伝子プロモーターとの相互作用を通じて細胞内遺伝子制御プロセスに関与する染色体外ＤＮＡ（ｅｃＤＮＡ）の同一性に関する情報を得ることができる。加えて、本発明のある特定の方法を使用して、一部の事例においては異常な遺伝子発現プログラム、例えば、がん細胞において存在するものを含む、細胞の遺伝子発現プログラムに関与する２つまたはそれよりも多くのｅｃＤＮＡの間の調節性相互作用を評価することができる。
【0040】
候補治療剤の特定およびがんの処置の選択
本発明の一部の態様において、がん細胞において１つまたは複数の腫瘍遺伝子のステータスを特定するための方法が、提供される。本発明の方法を使用して、１つまたは複数の標的腫瘍遺伝子の転写のレベルを決定することができ、ここで、１つまたは複数の標的腫瘍遺伝子のレベルの上昇により、がんの可能性が特定される。本発明の一部の実施形態において、複数のがん細胞は、比較研究において使用するためおよび候補処置を試験するための細胞を得るための供給源であり得る。例えば、制限することを意図するものではないが、複数のがん細胞は、培養物または対象内のがん細胞であってもよく、同じ環境で維持されていてもよい。本発明の一部の実施形態において、そのような培養物または対象に由来する１つまたは複数のがん細胞が、ｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用に関する細胞のステータスを評価するために、本発明の方法に含まれる。異なる１つまたは複数のがん細胞を、治療剤または候補治療剤と接触させ、接触した細胞は、ｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用に関する細胞のステータスを評価するために、本発明の方法に含まれる。接触していないがん細胞および接触させたがん細胞において決定されるｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用を決定し、互いに、または適切な対照と比較して、ｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用に対する治療薬または候補治療薬の作用、およびがんのステータスに関する情報を得ることができる。
【0041】
本明細書で使用される場合、「ステータス」という用語は、がん細胞を参照して使用される場合、１つまたは複数の特定のｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用の存在または不在を意味する。例えば、制限することを意図するものではないが、がんの初期ステータスには、ｅｃＤＮＡと腫瘍遺伝子ＡおよびＢとの間の相互作用が含まれ得、がんが進行するにつれて、そのステータスは、ｅｃＤＮＡと腫瘍遺伝子Ａ、Ｂ、およびＣとの間の相互作用を含めて決定される場合がある。
【0042】
本発明の一部の実施形態において、ｅｃＤＮＡによってモジュレートされる腫瘍遺伝子を特定することにより、がんを有する対象の処置を選択するのを補助するために使用することができる情報が得られる。一部の実施形態において、対象は、がんの素因についてスクリーニングされ得るか、または対象に存在するかもしくは存在することが疑われるがんのステージを決定するためにスクリーニングされ得る。本発明の方法の実施形態を使用して、対象におけるがんまたはがんのステータスについてスクリーニングすることができ、そのような方法には、細胞においてｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用を特定すること、および標的腫瘍遺伝子に対するｅｃＤＮＡのモジュレート作用を決定することのうちの１つまたは複数が含まれ得る。そのような方法を使用して、対象におけるがんのステータスを特定することができる。加えて、本発明の方法を使用して、がんにおけるｅｃＤＮＡのその標的腫瘍遺伝子に対するモジュレート作用に対する、候補剤の作用を評価することができ、評価の結果を使用して、がんの処置を選択するのを補助することができる。
【0043】
本発明の方法の実施形態を使用して、細胞、組織、対象、および複数の細胞（または集団）のうちの１つまたは複数におけるがんのステータスを評価することができる。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、悪性新生物を指して使用される。例示的ながんとしては、聴神経腫、腺癌、副腎がん、肛門がん、血管肉腫、虫垂がん、胆道がん（例えば、胆管細胞癌）、膀胱がん、乳がん（例えば、乳房の腺癌、乳房の乳頭状癌腫、乳がん、乳房の髄様癌）、脳がん（例えば、髄膜腫、神経膠芽腫、神経膠腫（例えば、星状細胞腫、乏突起神経膠腫）、髄芽細胞腫）、子宮頸がん（例えば、子宮頸腺癌）、結腸直腸がん（例えば、結腸がん、直腸がん、結腸直腸腺癌）、結合組織がん、上皮癌、上衣腫、内皮肉腫（例えば、カポジ肉腫、多発性特発性出血性肉腫）、子宮内膜がん（例えば、子宮がん、子宮肉腫）、食道がん（例えば、食道の腺癌、バレット腺癌）、ユーイング肉腫、眼のがん（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）、一般的な好酸球増加症、胆嚢がん、胃がん（例えば、胃腺癌）、消化管がん、頭頸部がん（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌、口腔がん）、咽頭がん、造血がん（例えば、白血病、例えば、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、血管芽細胞腫、腎臓がん（例えば、ウイルムス腫瘍としても知られる腎芽細胞腫、腎細胞癌）、肝臓がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ）、悪性ヘパトーマ）、肺がん（例えば、気管支原性癌、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌）、平滑筋肉腫（ＬＭＳ）、脂肪細胞症（例えば、全身性肥満細胞症）、悪性中皮腫、筋肉がん、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経内分泌がん、骨肉腫、卵巣がん、乳頭状腺癌、膵臓がん、陰茎がん、前立腺がん、直腸がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん、黒色腫、小腸がん（small bowel cancer）、軟部組織肉腫、脂腺癌、小腸がん（small intestine cancer）、汗腺癌、滑膜腫、精巣がん、甲状腺がん、尿道がん、膣がん、および外陰部がんが挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
がんは、原発性がんである場合も転移性がんである場合もあり、早期もしくは後期ステージのがんと考えられ得るか、または対象におけるがんのステージは、１つもしくは複数の公知のがんステージ分類および当該技術分野における慣習により特徴付けることができる。本発明の一部の態様では、がんは、対象における最初のがんであり、本発明のある特定の態様では、がんは、以前のがんの再発または再発生であり得る。一部の事例において、本発明の方法の実施形態は、がん治療により処置されていない対象においてがんのステータスを評価するために使用され得る。ある特定の実施形態において、本発明の方法は、１つまたは複数のがん治療により処置されたことがあるかまたは現在処置されている対象においてがんのステータスを評価するために使用される。がん治療の非限定的な例としては、外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、食事治療、または他の当該技術分野で公知の治療的アプローチが挙げられる。
【0045】
本発明のある特定の実施形態は、対象の１つまたは複数の治療プロトコールを決定および／または選択するのを補助するための方法を含む。例えば、制限することを意図するものではないが、本発明の一部の実施形態は、対象から得られたがん細胞において特定されるｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用のステータスに少なくとも部分的に基づいて、対象におけるがんの処置を選択するのを補助するために使用することができる。本発明の方法の実施形態を使用して、対象におけるがんのステータスを決定することにより、特定されたｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用に基づいた１つまたは複数の治療の選択が可能となる。例えば、制限することを意図するものではないが、本発明の方法は、対象から得られたがん細胞における１つまたは複数のｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子相互作用の特定を通じて、対象におけるがんのステータスを検出するために使用することができる。本発明の方法はまた、検出されたｅｃＤＮＡ／相互作用における１つまたは複数の特定の腫瘍遺伝子および他の構成要素を特定するためにも使用することができ、この情報を、対象におけるがんの処置を選択するのを補助するために使用することができる。例えば、ｅｃＤＮＡと腫瘍遺伝子Ａおよび腫瘍遺伝子Ｂとの間の相互作用が、対象に由来するがん細胞において検出された場合、この情報は、（ｉ）ｅｃＤＮＡと腫瘍遺伝子Ａとの相互作用を低減させること、および（ｉｉ）ｅｃＤＮＡと腫瘍遺伝子Ｂとの相互作用を低減させることのうちの１つまたは複数をもたらすがんの処置を選択することに役立ち得る。本発明の方法の実施形態を使用して決定されたｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用の情報に基づいて、対象におけるがんは、特定の腫瘍遺伝子／ｅｃＤＮＡ相互作用によって分類することができ、特定の腫瘍遺伝子／ｅｃＤＮＡ相互作用を低減させるのに適切な処置を選択し、対象に投与することができる。
【0046】
本発明のある特定の実施形態において、がん細胞に、またはがんを有するか、がんを有することが疑われるか、もしくはがんを有する危険性が増加している対象に投与される、がん治療の有効性を決定することを可能にする方法が、提供される。非限定的な例において、本発明の方法の実施形態は、対象から得られたがん細胞においてがんの初期ステータスを決定するために使用される。がんのステータスは、１つまたは複数のｅｃＤＮＡと、腫瘍遺伝子Ａ、腫瘍遺伝子Ｂ、および腫瘍遺伝子Ｃとの間で特定された相互作用を含むように決定される。がんの処置は、ｅｃＤＮＡと３つの腫瘍遺伝子との特定された相互作用に少なくとも部分的に基づいて対象に関して選択される。選択された処置を対象に投与した後、本発明の方法は、処置後に対象から得られたがん細胞の後続のステータス決定に使用される。以前に得られたがん細胞において決定されたがんのステータス、処置の投与後に得られたがん細胞において決定されたがんのステータスは、対象におけるがんに対する処置の有効性を示し得る。例えば、処置後の対象から得られたがん細胞において、ｅｃＤＮＡと腫瘍遺伝子Ａとの間の相互作用が認められるが、ｅｃＤＮＡと腫瘍遺伝子Ｂまたは腫瘍遺伝子Ｃとの間の相互作用が示されないことは、対象におけるがん処置の有効性を支持し、ｅｃＤＮＡと腫瘍遺伝子Ｂおよび腫瘍遺伝子Ｃとの間の増強している相互作用を低減させる処置の有効性を確認することができる。
【0047】
ｅｃＤＮＡによって活性化される腫瘍遺伝子の非限定的な例は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、マウス二重微小型２（ＭＤＭ２）、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）、およびｃＭＹＣである。特定の腫瘍遺伝子が活性化されているがんを処置するために使用することができる薬剤としては、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＤＭ２阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、およびｃＭＹＣ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例において、本発明の方法を使用して、ｅｃＤＮＡとＥＧＦＲ腫瘍遺伝子との相互作用によるＥＧＦＲ増幅を含むとして特定されたがんは、そのがんを有する対象へのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）薬の投与によって処置することができる。ＴＫＩの非限定的な例は、ゲフィチニブおよびエルロチニブである。別の非限定的な例において、本発明の方法を使用して、ｅｃＤＮＡとＣＤＫ４腫瘍遺伝子との相互作用によって生じるＣＤＫ４転写の増加を含むとして特定されたがんは、パルボシクリブおよびリボシクリブのうちの一方または両方の投与によって処置することができる。本明細書に提示される教示に基づいて、当業者であれば、腫瘍遺伝子の転写の増加をもたらすｅｃＤＮＡと腫瘍遺伝子との間の１つまたは複数の相互作用の特定に少なくとも部分的に基づいて、他の当該技術分野において公知の治療を選択することができるであろう。
【0048】
がんの処置の非限定的な例は、がんを有すると診断されたか、がんを有する危険性が増加しているか、またはがんを有すると考えられる対象に、ｅｃＤＮＡとｅｃＤＮＡの標的腫瘍遺伝子との間の相互作用を妨害し、それを低減させる有効量の薬剤を投与することを含み得る。細胞内のｅｃＤＮＡ遺伝子制御系（ＧＲＳ）において、ｅｃＤＮＡは、「遺伝子制御因子」配列と称され得る配列を含み、その非限定的な例は、ｅｃＤＮＡにおける遺伝子アクチュエータ配列および遺伝子サイレンサー配列である。ｅｃＤＮＡを含むＧＲＳはまた、「転写因子」も含み、これは、ｅｃＤＮＡとその標的腫瘍遺伝子との間の「接触点」としての機能を果たす複合体である。転写因子は、転写因子が標的腫瘍遺伝子の「遺伝子制御エレメント」に結合することを通じて、ｅｃＤＮＡの遺伝子制御因子とｅｃＤＮＡの標的腫瘍遺伝子とを連結させるポリペプチドの複合体を構成し得る。例えば、制限することを意図するものではないが、標的腫瘍遺伝子の転写を制御するプロモーターがある。一部の実施形態において、本発明の方法は、ｅｃＤＮＡとその標的腫瘍遺伝子との間の相互作用に存在する候補標的を特定することを含み、特定された候補標的の破壊により、ｅｃＤＮＡとその標的腫瘍遺伝子との間の相互作用を破壊し、ｅｃＤＮＡによるその標的腫瘍遺伝子の転写の増強を低減させる。非限定的な例として、転写因子の複合体に含まれるポリペプチドは、ＧＲＳを破壊させる治療剤と接触すると、ｅｃＤＮＡによる標的腫瘍遺伝子の転写の増強を低減させる候補標的として特定され得る。
【0049】
本発明の一部の実施形態において、方法は、がん細胞を、ＧＲＳにおける候補標的を破壊させ、ｅｃＤＮＡとその標的腫瘍遺伝子との間の相互作用を低減させ、それによって、ｅｃＤＮＡによるその標的腫瘍遺伝子の転写の増強を低減させる治療剤と接触させること、および／またはそのような治療剤を対象に投与することを含む。本発明の一部の実施形態において、候補標的は、ｅｃＤＮＡにおける遺伝子アクチュエータを含む。本明細書で使用される場合、「遺伝子アクチュエータ」および「遺伝子エンハンサー」という用語は、遺伝子制御因子を指して互換可能に使用され得る。本発明の一部の態様において、候補標的は、転写因子の１つまたは複数の構成成分である。本発明の一部の実施形態において、候補標的は、遺伝子制御因子エレメント、例えば、ｅｃＤＮＡの標的腫瘍遺伝子のプロモーターエレメントであるが、これに限定されない。したがって、本発明のある特定の実施形態において、ｅｃＤＮＡ作動因子、転写因子、および遺伝子制御エレメントのうちの１つまたは複数が、がんを処置するために１つまたは複数の治療剤を指向させる候補標的として特定され得る。
【0050】
本発明の一部の実施形態において、治療剤は、第２の治療剤と組み合わせて投与してもよい。一部の実施形態において、薬剤は、例えば、がん治療剤の投薬または投与の前、後、またはその間に、がん治療剤と組み合わせて、または放射線療法、化学療法、外科手術のうちの１つもしくは複数などであるがこれらに限定されない別のがん処置と組み合わせて、投与される。一部の実施形態において、本発明の薬剤は、従来的な化学療法および／または放射線療法を受けている対象に投与される。一部の実施形態において、がん治療剤は、化学療法剤である。一部の実施形態において、がん治療剤は、免疫療法剤である。一部の実施形態において、がん治療剤は、放射線療法剤である。
【0051】
細胞
本発明の方法に含まれる細胞は、複数の細胞のうちの１つであり得ることが理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「複数の」細胞という用語は、細胞集団を意味し得る。複数の細胞は、すべてが同じ種類のものであってもよく、および／またはすべてが同じ疾患もしくは状態を有してもよい。非限定的な例として、ある細胞を、肝臓細胞集団から得ることができ、この細胞集団から得られる他の細胞もまた、肝臓細胞となる。本発明の一部の実施形態において、複数の細胞は、細胞集団の混合物であってもよく、これは、すべての細胞が、同じ種類というわけではないことを意味する。別の非限定的な例において、細胞は、複数のがん細胞から得られた１つのがん細胞であり得る。本発明の方法の実施形態において使用される細胞は、単一細胞、単離された細胞、複数の細胞のうちの１つである細胞、２つまたはそれを上回る相互接続された細胞のネットワーク内のものである細胞、互いに物理的に接触している２つまたはそれを上回る細胞のうちの１つである細胞などのうちの１つまたは複数であり得る。
【0052】
本発明の一部の態様において、細胞は、生きた動物、例えば、哺乳動物から得られてもよく、または単離された細胞であってもよい。単離された細胞は、初代細胞、例えば、最近動物から単離されたもの（例えば、単離後に集団倍加および／もしくは継代を受けていないかもしくは数回だけ受けた細胞）であってもよく、または培養物における長期増殖（例えば、３カ月を上回る）もしくは培養物における不定増殖（不死化細胞）が可能な細胞株の細胞であってもよい。本発明の一部の実施形態において、細胞は、体細胞である。体細胞は、個体、例えば、ヒトから得ることができ、当業者に公知の標準的な細胞培養プロトコールに従って培養することができる。細胞は、外科手術標本、組織または細胞生検などから得ることができる。細胞は、皮膚、肺、軟骨、脳、乳房、血液、血管（例えば、動脈または静脈）、脂肪、膵臓、肝臓、筋肉、消化管、心臓、膀胱、腎臓、尿道、および前立腺を含むがこれらに限定されない、任意の目的の器官または組織から得ることができる。本発明の一部の実施形態において、細胞は、ＨＦ－３０３５細胞またはＨＦ－２３５４細胞である。
【0053】
一部の実施形態において、本発明と併せて使用される細胞は、疾患、障害、または異常な状態を有することが知られていない健康な正常細胞であり得る。一部の実施形態において、本発明の方法および組成物と併せて使用される宿主細胞は、異常な細胞、例えば、障害、疾患、または状態を有すると診断された対象から得られた細胞であり、これには、変性細胞、神経疾患保持細胞、疾患または状態の細胞モデル、損傷した細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一部の実施形態において、細胞は、対照細胞であってもよい。本発明の一部の態様において、宿主細胞は、疾患または状態のモデル細胞であり得る。
【0054】
本発明のある特定の実施形態において使用され得る細胞は、ヒト細胞である。本発明の方法の実施形態において使用することができる細胞の非限定的な例は、真核生物細胞、脊椎動物細胞のうちの１つまたは複数であり、これは、本発明の一部の実施形態において、哺乳動物細胞であり得る。本発明の方法において使用することができる細胞の非限定的な例は、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、および非ヒト霊長類細胞である。本発明の方法の実施形態において使用することができる細胞のさらなる非限定的な例は、げっ歯動物細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、鳥類細胞、魚類細胞、野生動物から得られた細胞、家畜動物から得られた細胞、および目的とされる他の好適な細胞のうちの１つまたは複数である。一部の実施形態において、細胞は、胚性幹細胞または胚性幹細胞様細胞である。一部の実施形態において、細胞は、神経細胞、グリア細胞、または他の種類の中枢神経系（ＣＮＳ）もしくは末梢神経系（ＰＮＳ）細胞である。一部の実施形態において、細胞は、星状細胞である。本発明の一部の実施形態において、細胞は、天然の細胞であり、本発明のある特定の実施形態において、細胞は、操作された細胞である。
【0055】
本発明の方法の実施形態において有用な細胞は、それらを単離した後、細胞培養物において維持され得る。細胞は、本発明の様々な実施形態において、遺伝子改変されていてもよく、または遺伝子改変されていなくてもよい。細胞は、正常または罹患した組織から得ることができる。一部の実施形態において、細胞は、ドナーから得られ、それらの状態または種類は、本発明の方法を使用してｅｘ ｖｉｖｏで改変される。本発明のある特定の実施形態において、細胞は、培養物中の浮遊細胞、対象から得られた遊離細胞、対象、器官、または固形培養物から得られた固体生検において得られた細胞などであり得る。
【0056】
本発明の任意の実施形態における集団または複数の単離された細胞は、主としてまたは本質的に全体として、特定の細胞型または特定の状態の細胞から構成され得る。一部の実施形態において、単離された細胞集団は、例えば、１つもしくは複数のマーカーの発現または任意の他の好適な方法によって決定した場合に、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の特定の種類または状態の細胞からなる（すなわち、集団が、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％純粋である）。
【0057】
対照
標的腫瘍遺伝子に対するｅｃＤＮＡの作用、ｅｃＤＮＡ／腫瘍遺伝子相互作用に関する細胞のステータス、ｅｃＤＮＡとその標的腫瘍遺伝子との間の相互作用に対する候補治療薬の作用などのうちの１つまたは複数を評価するために使用される本発明の方法のある特定の実施形態。細胞、組織、および／または対象におけるｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子の特徴のそのような評価は、サンプル細胞、組織、または対象において得られた結果を、それぞれ、対照細胞、組織、または対象において得られた結果と比較することによって行うことができる。非限定的な例として、本発明の一部の実施形態は、サンプルがん細胞および対照がん細胞における１つまたは複数のｅｃＤＮＡ標的腫瘍遺伝子のステータスを決定すること、ならびにサンプルがん細胞および対照がん細胞のステータスの差の尺度として、結果を比較することを含む。別の非限定的な例において、ｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子相互作用のステータスを、がんを有する対象において特定し、続いて、対象に、特定されたｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子相互作用を破壊することが意図される候補治療剤を投与し、候補治療剤の投与の前および後でステータスを比較する。まだ候補治療剤と接触していない対象から得られた結果は、「対照結果」と称され得、非接触対象は、「対照対象」と称され得ることを、理解されたい。
【0058】
本明細書で使用される場合、対照は、上述の通りであり得、様々な形態をとり得る所定の値でもあり得る。これは、中央値または平均など単一のカットオフ値であってもよい。これは、比較群に基づいて構築され得る。比較群の他の例としては、特定のがんまたはｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子ステータスを有する細胞または対象、および特定のがんまたはｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子ステータスを有しない細胞または対象を挙げることができる。別の比較群は、がんの家族歴を有する群に由来する対象およびそのような家族歴を有しない群に由来する対象であってもよい。例えば、試験する集団が、試験結果に基づいて均等に（または不均等に）群に分割される所定の値を設定することができる。当業者であれば、本発明の比較方法において使用するのに適切な対照群および値を選択することができる。
【0059】
本発明の候補治療剤特定方法は、対象に存在するか、または培養もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ宿主細胞に存在する１つの細胞または複数の細胞において実行することができる。対象において実行される本発明の候補治療剤特定方法には、ｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子相互作用を破壊することが意図される候補薬剤を対象の細胞に送達すること、ならびに（候補治療剤の送達の前および／もしくは後にｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子相互作用および腫瘍遺伝子ステータスを評価することが含まれ得る。宿主細胞、組織、および／または対象を、候補治療剤と接触させた結果を測定し、ｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子相互作用を破壊することにおける候補薬物の有効性の決定として、対照値と比較することができる。
【0060】
組成物
本発明の方法において使用される組成物は、医薬組成物であり得るが、必ずしもそうでなくてもよい。「医薬組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に安全で、非毒性で、生物学的にもそれ以外にも望ましくないことのない、医薬組成物を調製するのに有用である少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、組成物を意味する。医薬組成物は、本発明の方法のある特定の実施形態において使用することができ、その非限定的な例は、ｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子相互作用を破壊するために細胞または対象に候補治療剤を投与するためである。
【0061】
本発明のある特定の態様において、医薬組成物は、１つまたは複数の治療剤または候補治療剤を、同様に細胞および／または対象に投与される１つまたは複数の他の追加の分子、治療剤、候補剤、候補処置、および治療レジメンとともに含む。本発明の方法の実施形態において使用される医薬組成物は、ｅｃＤＮＡ／標的腫瘍遺伝子相互作用を低減させること、がん細胞における標的腫瘍遺伝子転写のステータスを変更することなどのうちの１つまたは複数を行うのに有効な量の候補治療剤を含み得る。本発明の一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。
【0062】
薬学的に許容される担体としては、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、および当該技術分野において周知である他の材料が挙げられる。例示的な薬学的に許容される担体は、米国特許第５，２１１，６５７号に記載されており、他のものは、当業者に公知である。本発明のある特定の実施形態において、そのような調製物は、塩、緩衝化剤、保存剤、適合性担体、水溶液、水などを含有し得る。
【0063】
細胞または対象への治療剤の送達は、本明細書に記載される様々な手段および他の当該技術分野において公知の手段によって達成することができる。そのような投与は、１回、または複数回行われ得る。複数回対象に投与される場合、１つまたは複数の治療剤は、単一経路または異なる経路によって投与されてもよい。例えば、制限することを意図するものではないが、１回目（または最初の数回）の投与は、処置しようとする対象の組織に直接的に行われてもよく、その後の投与は、全身的であってもよい。
【0064】
細胞または対象に送達される治療剤の量は、本発明のある特定の実施形態において、ｅｃＤＮＡとその標的腫瘍遺伝子との相互作用を統計学的に有意に低減させる量であり得る。好適な量は、当該技術分野において公知の方法、例えば、臨床試験と併用して、また過度の実験を必要とすることなく、本明細書に提供されている教示を使用して、実施者によって容易に決定することができる。
【実施例】
【0065】
実施例１
核の内部で、染色体は、広範囲に折りたたまれてクロマチンループとなり、これが異なるクロマチンテリトリーを占めている［Zheng, S. et al. (2013) Genes Dev 27, 1462-1472］。そのような高度に組織化された３次元クロマチン構成は、離れた制御エレメントおよびそれらの標的とされる遺伝子を空間的に近接させることによって、転写を含む多数のゲノム機能のトポロジー基盤を提供している［Cremer, T. & Cremer, M. (2010) Cold Spring Harb Perspect Biol 2, a003889］。染色体再配列の結果としてのクロマチン構成の変更は、多数のヒト疾患、特にがんに関係している［Sexton, T. & Cavalli, G. (2015) Cell 160, 1049-1059］。ｅｃＤＮＡのクロマチン構成、およびこれが遺伝子転写制御にどのように寄与しているかを理解するために、クロマチン相互作用評価方法、例えば、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ［Taberlay, P. C. et al. (2016) Genome Res 26, 719-731］方法を適用した。一般的な空間的クロマチン構成［Zhang, Y. et al. (2013) Nature 504, 306-310］およびタンパク質因子に媒介される長距離のクロマチン相互作用の両方を、同じニューロスフェア細胞株に組み込む方法を設計した。公知のｅｃＤＮＡを、それらの強力かつ異常な分子内および分子間での全ゲノムクロマチン接触を通じて容易に認識可能であることが、研究により示された。加えて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰＩＩ）に媒介されるｅｃＤＮＡコネクトームおよびそれらの染色体パートナーの解読において、ｅｃＤＮＡと活動的に発現される常染色体性腫瘍遺伝子との間の関係性が特定された。この関係は、ｅｃＤＮＡが、腫瘍進行を促進する移動性転写エンハンサーとして機能するという発見を裏付ける。
【0066】
方法
ＧＢＭ患者の腫瘍に由来するニューロスフェア細胞の培養物
ニューロスフェア細胞株を生成し、記載されるように培養した［deCarvalho, A. C. et al. (2018) Nat Genet 50, 708-717］。脳腫瘍標本を、Ｈｅｎｒｙ Ｆｏｒｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認されているプロトコールで、患者からの書面による告知に基づく同意とともに得た。簡単に述べると、腫瘍標本を、切片にし、Ｎ－２補充物質（１７５０２－０４８、Ｇｉｂｃｏ）および成長因子（ＥＧＦおよびＦＧＦ－ｂａｓｉｃ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（１１３３０－０３２、Ｇｉｂｃｏ）において、ニューロスフェアとして培養した。１５～２６の継代の細胞を、実験のために採取した。
【0067】
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ実験およびデータ分析
１０００万個の細胞に、１．５ｍＭ ＥＧＳ（２１５６５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を４５分間、続いて１％のホルムアルデヒド（Ｆ８７７５、Ｓｉｇｍａ）を２０分間、室温（ＲＴ）を二重架橋させ、次いで、０．１２５Ｍグリシン（Ｇ８８９８、Ｓｉｇｍａ）で１０分間クエンチした。架橋した細胞を、１×ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬの０．５５％ ＳＤＳ中で溶解させ、室温、６２℃、および３７℃で順に１０分間ずつインキュベーションし、続いて３７℃で３０分間、２５μＬの２５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を添加して、ＳＤＳをクエンチし、３７℃で一晩、５０μＬのＡｌｕＩ （Ｒ０１３７Ｌ、ＮＥＢ）、５０μＬの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液、および２７５μＬのＨ２Ｏを添加して、クロマチンをフラグメント化した。ペレット化された消化核を、５０μＬの１０× ＣｕｔＳｍａｒｔ緩衝液、１０μＬ ＢＳＡ（Ｂ９０００Ｓ、ＮＥＢ）、１０μＬの１０ｍＭ ｄＡＴＰ（Ｎ０４４０Ｓ、ＮＥＢ）、１０μＬのＫｌｅｎｏｗ（３’－ ５’エクソ－）（Ｍ０２０２Ｌ、ＮＥＢ）、および４２０μＬのＨ２Ｏを含有する５００μＬのｄＡ－テーリング溶液中に再懸濁させ、１時間室温でインキュベートし、次いで、２００μＬの５×ライゲーション緩衝液（Ｂ６０５８Ｓ、ＮＥＢ）、６μＬのビオチン化架橋リンカー（２００ｎｇ／μＬ）、１０μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｍ０２０２Ｌ、ＮＥＢ）、および２８４μＬのＨ２Ｏを添加し、１６℃で一晩インキュベートすることによって、近接ライゲーションに供した。ライゲーションしたクロマチンを、次いで、超音波処理によってせん断し、抗ＲＮＡＰＩＩ抗体（９２０１０２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で免疫沈降させた。免疫沈降させたＤＮＡのタグメンテーション、ビオチン選択、ライブラリー調製、およびシーケンシングを、記載されるように行った［Tang, Z. et al. (2015) Cell 163, 1611-1627］。
【0068】
ＣｈＩＡ－ＰＥＴツールの拡張可能な再実装であるＣｈＩＡ－ＰＥＴのユーティリティ［Li, G. et al. (2010) Genome Biol 11, R22］（コード利用性を参照されたい）を使用して、ＣｈＩＡ－ＰＥＴデータを処理した。シーケンシングアダプターを除去した後、架橋リンカーを有するペアエンドリードを特定し、リンカーに隣接するタグを抽出した。特定したタグ（１６ｂｐ以上）を、タグの長さに応じてＢＷＡアライメント［Li, H. & Durbin, R. (2009)Bioinformatics 25, 1754-1760］およびｍｅｍ［Li, H. (2013) arXiv:1303.3997 [q-bio.GN]］を使用してｈｇ１９にマッピングした。固有にマッピングされた冗長ではないペアエンドタグ（ＰＥＴ）を、染色体間（左のタグおよび右のタグが異なる染色体に由来する）、染色体内（左のタグおよび右のタグが、８Ｋｂを上回るゲノムスパンである）、ならびに自己ライゲーションＰＥＴ（左のタグおよび右のタグが、８Ｋｂ以下のゲノムスパンである）として分類した。染色体間および染色体内のＰＥＴはいずれも、５００ｂｐ伸長した。両方の末端でオーバーラップするＰＥＴは、次いで、ｉＰＥＴ－２、３．．．としてクラスター化した。ｃｈｒ Ｍ、ｃｈｒ Ｙとオーバーラップする相互作用は、この研究では試験しなかった。ゲノム配列構成およびＴｎ５消化によって作成されるタグメンテーションバイアスによって生じる可能性のあるノイズを除去するために、アンカーがブラックリストとオーバーラップする相互作用（定義の方法については以下を参照されたい）をフィルタリングした。染色体内相互作用については、相互作用の有意性に関する統計学的評価を、ＣｈｉａＳｉｇの拡張可能な再実装であるＣｈｉａＳｉｇＳｃａｌｅｄ［Paulsen, J. et al. (2014) Nucleic Acids Res 42, e143］を使用して行った。ｉＰＥＴが３以上、ＦＤＲが０．０５未満であるとして定義される有意な相互作用およびｉＰＥＴが２以上としての染色体間相互作用を、すべての下流分析において使用したが、ｎｓＴＩＦ分析は除き、これは、すべての報告された染色体間相互作用を使用した（以下のインサイチュＣｈＩＡ－ＰＥＴデータからの公知のｅｃＤＮＡ領域の発見についての節を参照されたい）。ＲＮＡＰＩＩ結合ピークは、ＭＡＣＳ２（オプション：－－ｋｅｅｐ－ｄｕｐ ａｌｌ －－ｎｏｍｏｄｅｌ －－ｅｘｔｓｉｚｅ ２５０）を使用して、すべての固有にマッピングされたリードにより呼び出した［Liu, T. (2014) Methods Mol Biol 1150, 81-95］。ｅｃＤＮＡ内相互作用を定義するために、ｅｃＤＮＡ領域を使用して、報告された領域内のすべての相互作用を収集した。ｅｃＤＮＡに媒介されるトランス染色体相互作用については、ｅｃＤＮＡが存在する染色体以外の染色体を起源とする相互作用のみを含めた。相互作用の両方のアンカーにおけるＲＮＡＰＩＩ結合ステータスを、調べ、ＲＮＡＰＩＩに媒介される相互作用を、両方のアンカーにＲＮＡＰＩＩ結合を有する相互作用として定義した。相互作用を、プロモーター（Ｐ）領域（ＴＳＳの±２．５ｋｂとして定義される）、続いて遺伝子領域（Ｇ）を優先して、ＧＥＮＣＯＤＥ遺伝子モデルとオーバーラップするアンカーに基づいてさらに分類した（１９個放出、すべての偽遺伝子、ｍｉＲＮＡ以外のすべてのＲＮＡを除く）。いずれの遺伝子内領域ともオーバーラップしないアンカーを、遺伝子間（Ｉ）として分類した。ＮＣＧ ６［Repana, D. et al. (2019) Genome Biol 20, 1］およびＣＯＳＭＩＣ ｖ８７［Forbes, S. A. et al. (2015) Nucleic Acids Res 43, D805-811］のユニオンリストに由来する腫瘍遺伝子を使用して、ｅｃＤＮＡ相互作用遺伝子を注釈した。
【0069】
ブラックリスト領域
ゲノム上のある特定の遺伝子座におけるＴｎ５による過剰タグメンテーションなど、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ実験手順によって導入された偏りを除去するために、異なる抗体濃縮により作製した８つのヒト細胞ＣｈＩＡ－ＰＥＴライブラリー（４つは抗ＣＴＣＦ抗体を用い、４つは抗ＲＮＡＰＩＩ抗体を用いた）を使用して、グレイリストを作成し、ダウンサンプリングして、合計すると７５，２１５，７２７個のタグとなる同数のリードを表すようにした。ＭＡＣＳ２．１．０．２０１５１２２２［Liu, T. (2014) Methods Mol Biol 1150, 81-95］を使用して、０．０５未満のＦＤＲで、統合したデータセットからピークを呼び出し、これにより１５３，７３５個のピークを得た。常染色体およびＸ染色体上のこれらのピーク領域が、グレイリストの候補であった。短いピークを有する領域（Ｔｎ５タグメンテーションに起因する可能性が高い）を、ｑ値およびパイルアップによって測定されるもっとも高い信頼性を保持しながら、以下の基準によってさらにフィルタリングした：領域の長さ６００ｂｐ未満、上位１％のパイルアップ、下位１０％のｑ値、および上位１０％のピークの濃縮倍数。フィルタリングしたピーク（ｑ値が１Ｅ－１６５未満であり、濃縮倍数が１０～５０である１，１１９個の領域）のこれらの３つの量またはベクトル（逆数の長さ、濃縮倍数、およびパイルアップ）を、取得し、ベクトルのそれぞれを（Ｒのコマンド「ｓｃａｌｅ（ｃｅｎｔｅｒ＝Ｆ，ｓｃａｌｅ＝Ｔ）」を用いて）スケーリングした。次に、３つのベクトルを個別に正規化し、それぞれのベクトルの平均が１となるようにした。スコア付け関数を、ｓ＝濃縮倍数＋パイルアップ＋１／長さと定義した。グレイリストは、スコアｓが平均を上回る３２１個のピーク領域からなっていた。加えて、目視検査によるアーチファクトと見られた４つの領域が含まれた。採用した最終的なブラックリストは、ＣｈＩＡ－ＰＥＴグレイリストとＫｕｎｄａｊｅ ｌａｂ（github.com/kundajelab/HiC-pipeline/blob/master/hic_flexibleWindow-pipeline/data/reference_genomes/hg19/wgEncodeHg19ConsensusSignalArtifactRegions.bed.gz）から公的に入手可能なブラックリストを連結したものであった。
【0070】
インサイチュＣｈＩＡ－ＰＥＴデータからの公知のｅｃＤＮＡ領域の発見
それぞれの細胞株からＲＮＡＰＩＩ ＣｈＩＡ－ＰＥＴにより得られた処理済みの相互作用データを、全ゲノム相互作用頻度（ＩＦ）マトリックスＭＮｘＮ＝｛Ｍｉｊ｜ｉ，ｊ＝１，２，．．，Ｎ｝に集約した。ｈｇ１９ゲノムを、染色体の先頭から５０Ｋｂの間隔で、６０，７３９個のオーバーラップしないビンにセグメント化した（それぞれの染色体の最後のビンは、満５０Ｋｂを示さない場合がある）。ブラックリスト（以下を参照されたい）とオーバーラップするビンは、ＩＦマトリックスから除去した。公知のｅｃＤＮＡ領域は、ｅｃＤＮＡ領域内および全２３個の染色体全体に広範にの両方で、多数の相互作用を呈し、特に、ｅｃＤＮＡにおいて増幅されている異なる染色体領域間で、非常に高いＩＦ総和をもたらした。使用した方法は、公知のｅｃＤＮＡ領域［deCarvalho, A. C. et al. (2018) Nat Genet 50, 708-717］が、ＣｈＩＡ－ＰＥＴ相互作用データから明らかとなり得るかどうかを試験するため、またｅｃＤＮＡにおいて増幅されているさらなるゲノム領域の可能性のある予測のために、これらの特性を利用した。
【0071】
すべてのビンについてトランス染色体ＩＦ（ＴＩＦ）の総和を計算し、異なるライブラリーにまたがって比較できるように正規化した。このデータのベクトルをスケーリングして（その大きさで除し、ベクトルの長さを乗じて）、平均が１に等しくなるようにした。この正規化したベクトルのｉ番目のビンを、ｎｓＴＩＦｉとする。もっとも高いｎｓＴＩＦを有するビンを、ｅｃＤＮＡ（＋）データ内の公知のｅｃＤＮＡ領域と比較した。ｅｃＤＮＡ（－）細胞から得られたＣｈＩＡ－ＰＥＴデータにおけるｎｓＴＩＦの分布を理解するために、ｎｓＴＩＦの全ゲノム分布を、ＨＦ－３０３５細胞（図１Ｂ）ならびに他の多能性細胞株（データは示されない）において試験し、それらがすべて２０未満であることが見出された。したがって、ｅｃＤＮＡ候補領域を決定するための最初のパスとして閾値を導入した。ｅｃＤＮＡの候補としてビンに優先順位を付けるために、追加のｎｓＴＩＦ閾値も導入した。知識に基づくと、ｅｃＤＮＡによって増幅された遺伝子領域は、ゲノムサイズの０．１％を上回らなかったため、低い閾値（ｔｌ）を、上位０．１％におけるｎｓＴＩＦｉの平均として設定した。経験的には、高い閾値（ｔｈ）は、ｔｌが２５未満である場合には２５（すなわち、予測したものよりも２５倍高い）に設定し、それ以外の場合には、ｔｈ＝ｍａｘ（ｎｓＴＩＦ）とした。ｎｓＴＩＦｉがｔｌを上回るｉ番目のすべてのビンを、候補のリストに入れた。一方で、すべてのｎｓＴＩＦｉがｔｈを下回る場合、いずれの領域もｅｃＤＮＡとは考えなかった。この研究において、ｅｃＤＮＡ（－）データから得られたもっとも高いｎｓＴＩＦは、２１未満であり、ｅｃＤＮＡ（＋）データセットにおけるもの（約３８～８２）よりも実質的に低かった。
【0072】
候補のリストは、互いに近傍に位置する群が一緒にグループ分けされるように、すなわち、２つの群間の最小距離が１Ｍｂとなるように、それらのゲノム距離に基づいてグループ分けした。グループ分けの目的は、異なる群の候補への決まった接続（ＩＦによって測定される）に応じて、すべての候補をスコア付けすることであった。スコアは、それぞれの候補が接続されている群の数に基づいていた。候補の正規化されたＴＩＦが、閾値ｔＴよりも高い場合に、「接続」が定義される。マトリックスＭの正規化された染色体間エレメントをＴｉｊとすると、ビンｉの正規化されたＴＩＦベクトルは、Ｔｉであった（ｎｓＴＩＦと同じ正規化、すなわち、
【0073】
【数1】
【0074】
）。次に、それらの相互作用頻度が比較的高い場合、例えば、別の候補群に少なくとも１つのビン、例えば、ｋ番目のビンが、存在し、ＴｉｋがｔＴを上回る（式中、ｔＴは、１００と上位０．１％のＴｉの平均のうちの高い方の値である）場合、接続が存在することになる。接続スコア＋１を、次いで、候補ｉに加えた。
【0075】
次に、もっとも高いｎｓＴＩＦを有する候補の群を、それらの接続スコアのすべてがゼロであるかどうかを確認するために、まず調べた。この条件が真であった場合、ｎｓＴＩＦがｔｈ以上である群が５つを上回らなければ、この単一の群における候補領域のすべてがｅｃＤＮＡ領域であることが提示され、そうでなければいずれのｅｃＤＮＡ領域も予測されなかった（ノイズの多いデータは、接触性スコアが０でｎｓＴＩＦが高い閾値を上回る多くの群を呈し得るが、これは、偽陽性である可能性が高い）。この条件が偽であった場合、すなわち、ゼロではない接続スコアを有する複数の群が存在する場合、接続スコアがゼロを上回るこれらの群に由来する領域は、ｅｃＤＮＡであると予測された。ＣｈＩＡ－ＰＥＴデータからｅｃＤＮＡにおいて増幅されている領域の特異性を割り当てるために、追加の研究を行った。
【0076】
ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーの構築およびデータの分析
２００万個の細胞を、ＣｈＩＡ－ＰＥＴと同じ様式で架橋させ溶解させた。溶解させた後、核ペレットを超音波処理し、抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ抗体（３９１３３、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）で免疫沈降させた。抗体免疫沈降および入力の両方に由来する４ｎｇのＤＮＡを、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＫＫ８５０５、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて末端修復、Ａテーリング、およびアダプターライゲーションに供した。アダプターをライゲーションしたＤＮＡフラグメントを、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＲｅａｄｙＭｉｘ（ＫＫ２６１２、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＰＣＲ増幅させ、７５ｂｐの単一末端シーケンシングでＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームにおいてシーケンシングした。未加工の読み取りを、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅバージョン０．４．３（オプション：－－ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ３ －ｑ ３０ －ｅ ．２０ －－ｌｅｎｇｔｈ １５）を使用して品質を整え、ＢＷＡ ０．７．１２（コマンド：ａｌｎ）を使用してｈｇ１９ゲノムにマッピングした［Li, H. & Durbin, R. (2009) Bioinformatics 25, 1754-1760］。固有にマッピングし重複除去したリードを、ＭＡＣＳ２．１．０．２０１５１２２２（オプション：－－ｎｏｍｏｄｅｌ －－ｅｘｔｓｉｚｅ ２５０ －Ｂ －－ＳＰＭＲ －ｇ ｈｓ）でピークの呼び出しに使用した（０．０５未満のＦＤＲ）［Liu, T. (2014) Methods Mol Biol 1150, 81-95］。０．０５未満のＦＤＲで定義したピークを、すべての分析で使用した。図２Ｃ～ＤのＨ３Ｋ２７ａｃ分析については、さらに、０．００１未満のＰという要件を適用した。
【0077】
免疫染色
固定されていない中期の細胞を、スライドに滴下し、ＫＣＭ緩衝液（１２０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（体積／体積）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）において、室温で１０分間事前インキュベートした。スライドを、１％（重量／体積）ＢＳＡ／ＫＣＭ緩衝液において、室温で３０分間ブロッキングし、続いて、２％ ＢＳＡにおいて、４℃で一晩、一次Ｈ３Ｋ２７ａｃ抗体（３９１３３、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）とともにインキュベートし、ＫＣＭ緩衝液において、室温で１０分間、２回インキュベートし、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体（Ａ３２７３１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに室温で３０分間インキュベートした。ＫＣＭ緩衝液で２回洗浄した後、スライドを、４％（体積／体積）ホルムアルデヒド／ＫＣＭで１５分間架橋させ、５０μＬのＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてカバーガラスを載せ、透明なマニキュアで封止した。スライドを、Ｌｅｉｃａ ＳＴＥＤ ３Ｘ／ＤＬＳ共焦点顕微鏡下でスキャンした。
【0078】
転写因子モチーフ分析
Ｈｏｍｅｒ２［Heinz, S. et al. (2010) Mol Cell 38, 576-589］により、７１，２３２個のＨ３Ｋ２７ａｃピーク領域の正規化されたバックグラウンドに対して、２０６個の標的配列において４１４個の公知のモチーフを調べた。検索結果を、以下の基準に基づいて選択する：ｑ値＜０．００１、濃縮＞１．５、モチーフを有する標的配列に対する％＞２５％。
【0079】
ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの構築およびデータ分析
全ＲＮＡを、ＡｌｌＰｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（８０２０４、ＱＩＡＧＥＮ）を使用して生物学的複製物で単離した。鎖特異的ＲＮＡライブラリーを、ＫＡＰＡ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＫＫ８５０２、ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の説明書に従って使用して３００ｎｇの全ＲＮＡから生成した。ライブラリーを、７５ｂｐのペアエンドシーケンシングでＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームにおいてシーケンシングした。未加工のシーケンシングリードを、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅバージョン０．４．３（オプション：－－ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ３ －ｑ ２０ －ｅ ．２０ －－ｌｅｎｇｔｈ １５ －－ｐａｉｒｅｄ）を使用して整え、ｈｉｓａｔ ２．１．０（オプション：－－ｄｔａ－ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ）を使用してｈｇ１９ゲノムにアライメントした。転写産物を、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ ２．２．１［Trapnell, C. et al. (2010) Nat biotech 28, 511-515］を使用してアセンブルし、最終的な発現レベルを、Ｃｕｆｆｄｉｆｆ（オプション：－－ｌｉｂｒａｒｙ－ｔｙｐｅ ｆｒ－ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄ）を使用して定量した［Trapnell, C. et al. (2013) Nat biotech 31, 46-53］。異なるサンプルから得られたシーケンシングデータ間の相関を、Ｒ／ｐｈｅａｔｍａｐパッケージ（バージョン１．０．２．）を用いて分析した。
【0080】
ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチン相互作用コミュニティの定義
両方のアンカーにおけるＲＮＡＰＩＩ結合により支持されるすべてのトランス染色体相互作用について、収集を行った。ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７細胞株に由来するＲＮＡＰＩＩに結合したアンカーをすべてプールし、ブラックリスト領域とオーバーラップするアンカーを除去して、２９，７２１個のオーバーラップしない相互作用ノードに統合した（図３Ｃ）。それぞれのノードについて、接続性スコア、すなわち、ノードが接続している相互作用パートナーノードの数を定義した。ハブは、平均を上回る標準偏差の３倍よりも高い接続性スコアを有するノードとして定義した。このパラメーターでは、ハブは、他のノードへの１０個を上回る連結を有する。合計で、６９、１０６、８２、および９９のハブが、それぞれ、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７細胞株から定義された。ハブ間のネットワークを使用して、コミュニティを、Ｒのｉｇｒａｐｈライブラリーにおいてｃｌｕｓｔｅｒ＿ｅｄｇｅ＿ｂｅｔｗｅｅｎｎｅｓｓ関数を用いて生成した［Csardi, G. & Nepusz, T. (2006) Computer Science］。ｅｃＤＮＡに関連するコミュニティの数は、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７細胞株において、それぞれ、８、８、１０、および４である。
【0081】
データ入手可能性に関する記述
この研究において記載されているすべてのデータは、ＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ ＧＳＥ１２４７６９に、以下のリンクwww.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE124769を使用して、レビュアーリンカーキー「ｕｘｋｈａｅｙｃｔｄｉｘｔｓ」で、受託されている。
【0082】
コードの入手可能性
ＣｈＩＡ－ＰＥＴデータからのｅｃＤＮＡ検出のコードは、www.dropbox.com/sh/2crbfjt1kr2yyws/AACLiUg6Ch9y6FurbbUzmcbPa?dl=0で入手可能である。
ＣｈＩＡ－ＰＥＴツール（コードはgithub.com/cheehongsg/CPUで入手可能）
ＣｈｉａＳｉｇＳｃａｌｅｄ（コードはgithub.com/cheehongsg/ChiaSigScaledで入手可能）
結果および考察
ＣｈＩＡ－ＰＥＴ分析を、ｅｃＤＮＡステータスが、全ゲノムシーケンシングデータからすでに確立されており、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析によって確認されている、５つのＧＢＭ患者由来のニューロスフェア細胞株に対して行った。５つのニューロスフェア株のうちの４つは、ｅｃＤＮＡ（＋）（ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７）であり、１つの株は、ｅｃＤＮＡ（－）（ＨＦ－３０３５）であった［deCarvalho, A. C. et al. (2018) Nat Genet 50, 708-717］。ｅｃＤＮＡ内で増幅された遺伝子から発現されるＲＮＡのレベルが高いことに基づいて（図４Ａ）、ｅｃＤＮＡが、活性クロマチンドメイン内でＲＮＡＰＩＩと高度に会合していると判断した。ＲＮＡＰＩＩクロマチン免疫沈降を使用して、ＲＮＡＰＩＩ会合クロマチンを引き出し、ＣｈＩＡ－ＰＥＴアッセイを使用して、ｅｃＤＮＡ－クロマチンインタラクトームを特徴付けた（図５Ａ）。得られたＣｈＩＡ－ＰＥＴデータにより、両方のＲＮＡＰＩＩ結合部位、制御エレメントとの間の長距離クロマチン相互作用［Zhang, Y. et al. (2013) Nature 504, 306-310］（図４Ｂ）、ならびに空間トポロジー的にクロマチンと関連するドメイン（ＴＡＤ）内の濃縮されていないクロマチン接触［Dixon, J. R. et al. (2012) Nature 485, 376-380］（図６Ａ）が検出された。１０ｑ２３および９ｐ２１染色体におけるＰＴＥＮならびにＣＤＫＮ２ＡおよびＣＤＫＮ２Ｂの欠失など、染色体構造バリアントは、クロマチン接触の排除をもたらした（図６Ｂ）。他の例としては、ＨＦ－２９２７におけるＤＭＤ遺伝子が関与するｃｈｒＸ：３１．４－３２ Ｍｂ共通脆弱部位の６００Ｋｂの欠失の検出［Ma, K. et al. (2012) Int J Mol Sci 13, 11974-11999］、ｃｈｒ３：１６８－１８３ Ｍｂの１５ Ｍｂの広範囲の再配列、ならびにＨＦ－２３５４ゲノムにおけるｃｈｒ３とｃｈｒ６との間の３．５および１１．５ Ｍｂの二重転位事象（図６Ｃ）が挙げられた。
【0083】
ＨＦ－２９２７は、ｅｃＥＧＦＲと称されるｃｈｒ７ｐ１１／ＥＧＦＲを含むｅｃＤＮＡ［deCarvalho, A. C. et al. (2018) Nat Genet 50, 708-717］を有し、一方でＨＦ－２３５４は、ｅｃＭＹＣと称されるｃｈｒ８ｑ２４／ＭＹＣ ｅｃＤＮＡを含む。同じ患者の原発性および再発性ＧＢＭに由来する２つのニューロスフェア株であるＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７において、３つの遺伝子が、染色体外で増幅されていることが見出され［deCarvalho, A. C. et al. (2018) Nat Genet 50, 708-717］、中でもｃｈｒ７ｐ１１／ＥＧＦＲおよびｃｈ１２ｑ１４．１／ＣＤＫ４が、ｅｃＤＮＡ上で共増幅していることが示され、同時にｃｈｒ８ｑ２４／ＭＹＣもまた、ｅｃＤＮＡ上に見出された（それぞれ、ｅｃＥＧＦＲ、ｅｃＣＤＫ４、およびｅｃＭＹＣと称される）。すべてのｅｃＤＮＡ遺伝子座は、ゲノム全体で広範囲の接触を呈し（図５Ｂ、図１Ａ）、これらのｅｃＤＮＡ領域の、すべての染色体にわたる領域に対する高いトランス接続性が示唆された。トランスクロマチン接触の程度を定量するために、２３個すべての染色体にわたって正規化された全ゲノムトランス相互作用頻度（ｎｓＴＩＦ）を忠実に説明する測定法を開発し、この測定法を、５つのニューロスフェア細胞株のそれぞれに適用した（本明細書における方法を参照されたい）。ＥｃＤＮＡ領域は、４つすべてのｅｃＤＮＡ（＋）株において高度に上昇したｎｓＴＩＦレベル（最大ｎｓＴＩＦは、約３８～８２であった）を示したが、ＨＦ－３０３５ ｅｃＤＮＡ（－）細胞（ｎｓＴＩＦが２１未満）においては示さなかった（図５Ｂ、図１Ｂ）。ｎｓＴＩＦスパイク領域は、ｅｃＤＮＡ領域と緊密に一致した。さらに、ｅｃＤＮＡセグメントと連結された高ｎｓＴＩＦ領域は、ゲノム全体にわたってトランス接触を示し（図５Ｂ）、染色体外遺伝子エレメントからの動的なｅｃＤＮＡ接続性を示唆している。特徴的な全ゲノム接触パターンは、ｅｃＤＮＡの移動性によって説明され得る。２つのジアンプリコン株ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７において、結果は、ｅｃＭＹＣ、ｅｃＥＧＦＲ、およびｅｃＣＤＫ４のｎｓＴＩＦレベルの上昇（図１Ｂ）、ならびに３つの遺伝子座間での交差相互作用を示しており、これらの株における優性ｅｃＤＮＡが、３つすべての腫瘍遺伝子を有すること、またはそれらが緊密な分子間近接性を有することを示唆している。高いｎｓＴＩＦが、増幅ステータスではなくｅｃＤＮＡの染色体外性に特異的であったことを検証するために、コピー数の増加が３以上である（３～６の範囲）すべてのゲノム領域からのｎｓＴＩＦ値を、ｅｃＤＮＡ領域からのｎｓＴＩＦと比較した。染色体増幅セグメントから得られたｎｓＴＩＦ値は、染色体テリトリー内に限定されていると予測される通り、ｅｃＤＮＡ領域からのｎｓＴＩＦよりも有意に低く（中央値ｎｓＴＩＦが１．５～４対２４～４３）（片側ウィルコクソンの順位和検定、Ｐ値＜０．０００５）（図５Ｃ）、ゲノム全体のｅｃＤＮＡの接触頻度の上昇が、ＤＮＡ投薬量作用単独によって説明されるのではなく、その自律的能力によって決定されることが確認された。
【0084】
高いトランス相互作用頻度に加えて、極めて高頻度のシス相互作用が、ｅｃＤＮＡのゲノム領域内で検出された。ＨＦ－２９２７ ｅｃＤＮＡ（＋）細胞において、約５３０ＫｂのｅｃＤＮＡ領域内で観察されたシス相互作用強度は、２，８７９であり、ｅｃＤＮＡ（－）のＨＦ－３０３５細胞の同じ領域におけるわずか１２と比較して、２４０倍の増加であった（図７Ａ）。この高い接触の増加は、このｅｃＥＧＦＲのサイズおよびゲノム構造の両方を直接的に反映していた。同様に、強力なシス相互作用が、ＨＦ－２３５４における定義されたｅｃＭＹＣ領域の２つのセグメント内およびそれらの間で観察された（図７Ａ）。広範囲のＲＮＡＰＩＩがテザーしたクロマチン接触（アンカーと称される、相互作用によって接続されるＤＮＡ領域で検出されたＲＮＡＰＩＩ結合として定義される）が、ｅｃＤＮＡ内の異なる領域間においてシスで（ｅｃＤＮＡ内と称される）（図７Ｂ、図８Ａ）および線形染色体上の他の遺伝子または制御エレメントとトランスで（トランス相互作用と称される）の両方で検出された（図７Ｃ）。染色体外内の接続性パターンは、高頻度の相互作用を有する異なるループのペアおよび強い接触の集中をはっきりと示し（図７Ｂ、図８Ａ）、これらは、異なるｅｃＤＮＡ分子間の接触および個々のｅｃＤＮＡ内のフォールディングにまとめて由来し得る。この仮説は、原発性および一致する再発性ニューロスフェア株（ＨＦ－３０１６対ＨＦ－３１７７）によって裏付けられ、いずれの株も、ｅｃＭＹＣ、ｅｃＥＧＦＲ、およびｅｃＣＤＫ４を含んでいるが、ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７において検出されたｅｃＤＮＡ内ループのうちの９２％および９５％は、それぞれの細胞にのみ見出される。ＨＦ－３０１６において検出されたｅｃＤＮＡ内ループは、主として、ｅｃＣＤＫ４遺伝子座（図８Ａにおける内側の円）にあるが、ＨＦ－３１７７では、ｅｃＭＹＣ領域は、より強力なルーピングを示し（図７Ｂにおける内側の円）、これは、ｅｃＤＮＡが、類似の腫瘍遺伝子作動因子を含み得るものの、異なった別の構造により生じることを示し得る。ｅｃＤＮＡとそれらの染色体パートナーとの間のトランス相互作用のなかで、ｅｃＤＮＡ上のアンカーは、主として（７５～９３％）遺伝子内または遺伝子間の非コーディング領域にあり、それらのトランス相互作用染色体アンカーは、主として（７９～８４％）、プロモーター（ＴＳＳ±２．５Ｋｂとして定義される）に局在化していた（図７Ｃ）。これらの相互作用のこのような並存は、これらの接触の転写機能を示唆する。
【0085】
ｅｃＤＮＡ相互作用がどのように転写制御領域と関連するかを調べるために、Ｈ３Ｋ２７ａｃプロファイリングを行って、活性なエンハンサーおよびプロモーターを示した。ｅｃＤＮＡにおいて増幅された腫瘍遺伝子の制御を、それらのトランス染色体相互作用領域を評価することによって、まず試験した。これらのｅｃＤＮＡ接続性非コーディング染色体アンカーは、Ｈ３Ｋ２７ａｃピークとの高いオーバーラップ（遺伝子間６１～８０％）を示し、これは、ｅｃＤＮＡ接触を有しないトランス相互作用非コーディング染色体アンカーによるものよりも有意に高かった（遺伝子間３８～６９％、図８Ｂ、Ｐ値０．０１９、片側ウィルコクソンの順位和検定）。具体的には、ｅｃＤＮＡ上に存在する腫瘍遺伝子のプロモーターと相互作用する染色体非コーディング領域のうちの７３％（１９６個中１４４個）は、対応する細胞株のＨ３Ｋ２７ａｃピークとオーバーラップし（図２Ａ）、ｅｃＤＮＡ上の腫瘍遺伝子の転写が、クロマチン接触を通じて線形染色体上のエンハンサーに結合することによってさらに増強されることが示唆された。エンハンサー接触は、変動性であり、異なるｅｃＤＮＡ（＋）株間で動的であり得る。ｅｃＭＹＣの事例では、ＭＹＣプロモーターは、３つのｅｃＭＹＣ（＋）細胞株において９個の異なるＨ３Ｋ２７ａｃエンハンサーと相互作用した（図８Ｃ）。
【0086】
高頻度接触集中点とｅｃＤＮＡ内のＨ３Ｋ２７ａｃピークとの間で共発生が観察され（図７Ｂ、図８Ａ）、これらの相互作用アンカーが、活性なエンハンサーのように挙動することを示唆した。５３０ＫｂのｅｃＥＧＦＲ領域内のＨ３Ｋ２７ａｃピークは、ＨＦ－２９２７において高い相互作用頻度の領域と共アライメントし、ｅｃＤＮＡ（－）細胞（ＨＦ－３０３５）の染色体ＥＧＦＲ領域におけるＨ３Ｋ２７ａｃピークと比較すると、より広いゲノムスパンで近接したクラスターとしてのパターンを呈し（図２Ｂ）、エンハンサーシグナルが、ｅｃＤＮＡのクロマチン接触部位に凝集していることを示した。中期ＨＦ２９２７細胞に対するＨ３Ｋ２７ａｃを標的とする抗体を使用した免疫染色により、Ｈ３Ｋ２７ａｃと、ｅｃＤＮＡを示すＤＡＰＩシグナルとの間でオーバーラップするシグナルが示され、これにより、エンハンサー機能とｅｃＤＮＡとの間の関係性が確認された（図８Ｄ）。
【0087】
４つすべてのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株にわたるｅｃＤＮＡに媒介されるトランスクロマチン相互作用と関連するＨ３Ｋ２７ａｃシグナルの増加を定量的に示すために、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれにおいて、ｅｃＤＮＡ領域（群Ａと称される）、それらの対応するトランス相互作用染色体パートナー（群Ｂ）、およびｅｃＤＮＡとの接触を有しない全ゲノムＨ３Ｋ２７ａｃピーク（群Ｃ）の間で、検出されたすべてのＨ３Ｋ２７ａｃピーク（ＦＤＲ＜０．０５、Ｐ＜０．００１）からの濃縮倍数の比較を行った。ｅｃＤＮＡクロマチン相互作用アンカーと関連するＨ３Ｋ２７ａｃピークは、ｅｃＤＮＡ接触を有しない全ゲノムＨ３Ｋ２７ａｃピークのもの（中央値１０－１２、Ｐ値５Ｅ－０９～２．３Ｅ－１６４、片側ウィルコクソンの順位和検定）よりも有意に高い濃縮を有した（中央値、群Ａ：５８～１３８および群Ｂ：４３～９１）（図２Ｃ）。それらはまた、ｅｃＤＮＡ（－）のＨＦ－３０３５細胞株において見出されるｅｃＭＹＣ、ｅｃＥＧＦＲ、およびｅｃＣＤＫ４に相当する領域からの濃縮倍数（中央値：９～１１）よりも高く、Ｈ３Ｋ２７ａｃシグナルの強い増強が、ｅｃＤＮＡに特異的であることを確認した。
【0088】
非常に高い強度および大きなドメインのＨ３Ｋ２７ａｃシグナルを有するエンハンサーは、「スーパーエンハンサー」と称されており［Whyte, W. A. et al. (2013) Cell 153, 307-319］、がんにおいて腫瘍遺伝子の転写を促進することがわかっている［Hnisz, D. et al. (2013) Cell 155, 934-947］。ｅｃＤＮＡにおいて観察されたエンハンサーシグネチャーが、「スーパーエンハンサー」を連想させるものであるかどうかを評価するために、ｅｃＤＮＡにおいて検出されたＨ３Ｋ２７ａｃピークのスパンサイズおよびそれらのトランス相互作用染色体アンカーの試験を行った。ｅｃＤＮＡにおけるＨ３Ｋ２７ａｃピークは、ｅｃＤＮＡ接触を有しない染色体Ｈ３Ｋ２７ピークよりも有意に長いスパンを有したことが見出された（スパンの中央値は、群Ａでは２～３．５Ｋｂ、群Ｂでは１．５～２．１Ｋｂ、対して群Ｃでは７００～８００ｂｐ、Ｐ値は９．６Ｅ－０８～４．４Ｅ－１５３である、片側ウィルコクソンの順位和検定）（図２Ｄ）。他のＨ３Ｋ２７ａｃピーク領域と比較した、ｅｃＤＮＡにおける群ＡのＨ３Ｋ２７ａｃピークの配列分析は、ＪＵＮ、ＦＯＳ、およびＡＴＦを含む、ＲＮＡＰＩＩの全般的な転写および細胞増殖の制御に重要な転写因子の結合モチーフの濃縮を示した（ｑ値＜０．００１、濃縮＞１．５）。まとめると、Ｈ３Ｋ２７ａｃシグナルの強い増強を伴うＲＮＡＰＩＩシグナルのシスおよびトランス両方での収束により、ｅｃＤＮＡ分子が、ゲノム全体に広範にＲＮＡポリメラーゼ機構に接続することができることが示唆され、全ゲノム転写増幅因子としての機能が裏付けられた。
【0089】
次に、同じ４つの株からのＲＮＡ発現の分析を通じて、ｅｃＤＮＡトランス相互作用と関連するエンハンサーシグナルの増加が、活性な転写をもたらすかどうかを決定した。総合すると、結果は、それぞれ、ＨＦ－２３５４、ＨＦ－２９２７、ＨＦ－３０１６、およびＨＦ－３１７７ ｅｃＤＮＡ（＋）細胞株において、プロモーターがｅｃＤＮＡと接触した１，８８７個、１，２７０個、１，４８３個、および１，１５７個の染色体遺伝子の検出を示した。ＥｃＤＮＡ相互作用遺伝子は、他のトランス染色体接触を有しない遺伝子（ＦＰＫＭ中央値０．７～４、Ｐ値４．３Ｅ－３４～１．８Ｅ－５５、片側ウィルコクソンの順位和検定）（図９Ａ）またはｅｃＤＮＡとの接触を有しないが他の遺伝子とのトランス染色体相互作用を有する遺伝子（ＦＰＫＭ中央値８～９、Ｐ値６．１Ｅ－０４～１．５Ｅ－０８、片側ウィルコクソンの順位和検定）のいずれかと比較して、有意に高いレベルの発現（ＦＰＫＭ中央値１２～１４）を示した（図１０）。さらに、ｅｃＤＮＡに接続している遺伝子の発現レベルは、それらのｅｃＤＮＡ接触の頻度（独立したトランス相互作用の数によって測定される）と正相関する（図９Ｂ）。まとめると、ｅｃＤＮＡ接続性は、転写活性、および高度に増強されたＨ３Ｋ２７ａｃシグネチャーと高度に関連しており、ｅｃＤＮＡが、全体的な転写増幅機構として機能し得ることが示唆された。
【0090】
４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株にわたって、合計で、４，７６３個の遺伝子が、ｅｃＤＮＡと接触しており、そのうちの８７７個（１８％）は、２つまたはそれよりも多くの細胞株に共通していた（図３Ａ）。これらの８７７個の遺伝子の機能は、細胞のコミュニケーションおよび増幅に関与する生物学的プロセスである翻訳開始（ＦＤＲ ２．０６Ｅ－０４）、細胞－細胞接着（ＦＤＲ ０．００３）、および転写（ＦＤＲ ０．０２）において有意に濃縮されていた（ＤＡＶＩＤオンライン分析［Huang da, W. et al. (2009) Nat Protoc 4, 44-57］）。４つすべてのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株において共通して見出された２０個の遺伝子のうち、半分を上回るものが、ＥＲＢＢ２、ＤＮＡＪＢ４、ＭＣＬ１、ＤＤＩＴ４およびＢＡＤ、ＪＵＮＤおよびその転写共因子ＦＯＳ、ならびに非コーディングＲＮＡ遺伝子ＭＡＬＡＴ１を含め、腫瘍原性、アポトーシスの制御、細胞成長または増殖と機能的に関連している遺伝子であった。ｅｃＤＮＡ接続性ネットワークにおける７３６個の染色体腫瘍遺伝子のセットの存在に関して、試験を行い［Forbes, S. A. et al. (2015) Nucleic Acids Res 43, D805-811、Repana, D. et al. (2019) Genome Biol 20, 1］、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株にわたって、それぞれ、８７個、５６個、７８個、および５４個の注釈された腫瘍遺伝子が、ｅｃＤＮＡに媒介されるクロマチンインタラクトーム内にあったことが見出された（図３Ｂ）。これは、ランダムな予測に対する２．１～２．５倍の濃縮を表し（Ｐ＜０．０５、片側ウィルコクソンの順位和検定）、ｅｃＤＮＡが、がん細胞における共活性化のためにクロマチン相互作用を通じてさらなる腫瘍遺伝子を動員するという仮説を裏付ける。転写活性化に対するｅｃＤＮＡの作用と一致して、トランス相互作用する腫瘍遺伝子は、４つのｅｃＤＮＡ（＋）株のそれぞれにおけるすべての遺伝子にわたる中央値転写レベルと比較して、６～１０倍のＦＰＫＭの増加を示した（Ｐ値１．３Ｅ－１４～２．１Ｅ－２４、片側ウィルコクソンの順位和検定）（図９Ｃ）。まとめると、７３６個の注釈された腫瘍遺伝子のうちの２１６個が、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のうちの少なくとも１つにおいて、ｅｃＤＮＡとのトランス染色体相互作用を呈したと決定された（図３Ｂ）。とりわけ、ＥＲＢＢ２およびＭＡＬＡＴ１は、４つすべてのニューロスフェア株においてｅｃＤＮＡとのクロマチン接続を呈した。ＥＲＢＢ２は、乳がんにおけるカノニカル腫瘍遺伝子であり、ＥＧＦＲと構造的類似性を共有し、これは、神経膠芽腫の５５％～６０％において変更されている。ＥＲＢＢ２およびＥＧＦＲは、ヘテロ二量体を形成して、その下流シグナル伝達経路を活性化し得る［Qian, X., et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91, 1500-1504］。ＥＲＢＢ２は、ＧＢＭにおいてゲノムが変更されることは珍しく、ＧＢＭのほぼ半数に発現されるが［Zhang, C. et al. (2016) J Natl Cancer Inst 108, doi:10.1093/jnci/djv375、Liu, G. et al. (2004) Cancer Res 64, 4980-4986］、非新生物脳細胞においては発現されない（ＧＥＰＩＡオンラインデータ［Tang, Z. et al. (2017) Nucleic Acids Res 45, W98-W102］）。ＧＢＭにおけるＭＡＬＡＴ１の発現は、ＷＮＴシグナル伝達をもたらし得［Vassallo, I. et al. (2016) Oncogene 35, 12-21］、これにより内皮トランス分化および遊走能の増加が作動される［Hu, B. et al. (2016) Cell 167, 1281-1295］。
【0091】
個々の腫瘍遺伝子の動員の他に、ｅｃＤＮＡはまた、多数の腫瘍遺伝子がｅｃＤＮＡとの相互作用を介して一緒に空間的に近接する集中点であるとも考えられる。ハブ間の広範のコミュニケーションによって定義される８個、１１個、１０個、および４個の全ゲノム相互作用ネットワーク間で、４つのｅｃＤＮＡ（＋）細胞株のそれぞれにおいて（方法、図３Ｃ）、ＨＦ－２９２７における３つを除くすべてが、ｅｃＤＮＡに由来する相互作用ハブを有する。これらのｅｃＤＮＡに接続した腫瘍遺伝子の多くは、クロマチンネットワークのそれぞれ内に存在する。具体的には、ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７における個々のコミュニティは、最大で１０～１２個の追加の腫瘍遺伝子に接続することができ（図９Ｄ）、これは、ランダムな予測よりも有意に高い（Ｐ＜０．０５、片側ウィルコクソンの順位和検定）。腫瘍遺伝子のこのような共凝集は、ｅｃＤＮＡが協調的な転写共活性化を達成して腫瘍新生を促進するために採用する構造に基づく機序であることが示された。注目すべきことに、ＨＦ－３０１６およびＨＦ－３１７７由来のｅｃＤＮＡが、同じ患者の原発性および再発性ＧＢＭに由来するにもかかわらず、ｅｃＤＮＡネットワークのコンビナトリアルコヒーレンスは、多くのオーバーラップ遺伝子を有さず、がんクローンの不均一性が、ｅｃＤＮＡ－クロマチンネットワークによってさらに拡大され得ることを示す。
【0092】
まとめると、ｅｃＤＮＡ転写インタラクトームおよびがん細胞における制御を特徴付けるために、クロマチン相互作用アッセイ、ＣｈＩＡ－ＰＥＴアッセイを使用して、研究を行った。全ゲノムｅｃＤＮＡ接続性集中点、トランス相互作用する染色体標的遺伝子、Ｈ３Ｋ２７ａｃ結合およびＲＮＡ発現のマルチオーミクス統合分析を通じて、ｅｃＤＮＡが、がん細胞における転写の共活性化のために腫瘍遺伝子を優先的に標的とすることができる移動性エンハンサーエレメントとしての機能を果たし得ることが示された（図９Ｅ）。これらの発見は、がん細胞に、腫瘍の進行および腫瘍の進化を作動させる競合的利点を提供する新しいｅｃＤＮＡ機序を概説する。さらに、ｅｃＤＮＡに標的とされる腫瘍遺伝子の特定により、標的化阻害処置戦略の候補を明らかにすることができ、ｅｃＤＮＡによって転写活性化される腫瘍遺伝子クラスターが、所与の腫瘍型に対する有効性を優先する機序であり得る。
【0093】
がんゲノムにおけるｅｃＤＮＡ標的化クロマチンインタラクトームの詳細な特徴付けを提供することに加えて、ＣｈＩＡ－ＰＥＴアッセイなどであるがこれに限定されない、クロマチン相互作用アッセイの使用により、それらの線形染色体との強力なクロマチン接触に基づいて、ｅｃＤＮＡ内の増幅されたゲノムドメインを正確にマッピングするのに有効な手段が得られる。ｅｃＤＮＡを特徴付けるために用いられる既存の方法は、イメージングに基づく分析［Turner, K. M. et al. (2017) Nature 543, 122-125］またはコピー数増加を有する領域の構造分析［Deshpande, V. et al. (2018) bioRxiv doi.org/10.1101/457333］のいずれかを通じたものである。これらの方法と比較すると、ＣｈＩＡ－ＰＥＴおよびＨｉ－Ｃが非限定的な例であるクロマチン相互作用アッセイを通じて染色体間クロマチン接触頻度を直接的に測定することは、異なるサイズ、コピー数、または配列内容のｅｃＤＮＡシグネチャーを明らかにするための偏りのないアプローチを提供する。さらに、ｅｃＤＮＡ分子の異なる領域間の接触頻度およびパターンは、それらの物理的構造および連続性に関する見識を提供し、これは、ゲノムの構造的変動およびアセンブリの特徴付けを補助する３次元クロマチン構成の能力と同様である［Spielmann, M. et al. (2018) Nat Rev Genet 19, 453-467、Dixon, J. R. et al. (2018) Nat Genet 50, 1388-1398］。
【0094】
まとめると、実験結果により、ｅｃＤＮＡが、クロマチン相互作用を通じて染色体外および染色体遺伝子転写の発現を増強させ得ることが示された。ｅｃＤＮＡの存在率および多様性と合わせて、これらの発見は、がんにおけるｅｃＤＮＡ作用の複雑さをさらなるレベルで提供する。重要なことに、これらの結果は、腫瘍進化において、遺伝子構造とエピジェネティックな結果との間の相互作用に関する見識を提供する。がんにおけるｅｃＤＮＡの存在率およびこの染色体外構造の固有なゲノム動態を考慮すると、これは、治療においてｅｃＤＮＡおよびそれらの活性化される染色体遺伝子を標的とすることを支持する。
【0095】
均等物
本発明のいくつかの実施形態が本明細書において説明され例示されているが、当業者であれば、本明細書に記載される機能を行うため、ならびに／またはその結果および／もしくはその利点のうちの１つもしくは複数を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想起し、そのような変動および／または修正のそれぞれは、本発明の範囲内であると考えられる。より一般的には、当業者であれば、本明細書に記載されるすべてのパラメーター、寸法、材料、および構成は例示であることを意味し、実際のパラメーター、寸法、材料、および／または構成が、本発明の教示が使用される具体的な適用に依存するであろうことを容易に理解するであろう。当業者であれば、本明細書において記載される本発明の具体的な実施形態に対する多数の均等物を認識するであろうし、または単に慣例的な実験を使用すれば確かめることができる。したがって、前述の実施形態は、例示の目的で提示されたに過ぎず、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明が、具体的に記載および特許請求されるものとは異なって実施されてもよいことを理解されたい。本発明は、本明細書に記載されるそれぞれ個々の特性、システム、物品、材料、および／または方法を対象とする。加えて、２つまたはそれよりも多くのそのような特性、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組み合わせは、そのような特性、システム、物品、材料、および／または方法が、相互に矛盾しない限り、本発明の範囲内に含まれる。
【0096】
値の範囲が提供されている場合、それぞれの間にある値が包含されることを理解されたい。言及された範囲が、上下限の一方または両方を含む場合、これらの含まれる上下限のうちのいずれかまたは両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。
【0097】
本明細書において定義され使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書内の定義、および／または定義される用語の通常の意味よりも優先されることを理解されたい。
【0098】
不定冠詞「１つの（a）」および「１つの（an）」は、本明細書および特許請求の範囲において、本明細書で使用される場合、そうでないことが明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されたい。「および／または」という語句は、本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、そのように接続されている要素のうちの「いずれかまたは両方」を意味する、すなわち、要素が一部の事例では接続されて存在し、他の事例では接続されずに存在するものとして理解される。具体的に特定された要素に関連するかしないかに関係なく、「および／または」の節で具体的に特定される要素以外の他の要素は、そうでないことが明確に示されない限り、必要に応じて存在してもよい。
【0099】
本出願において引用されているかまたは言及されているすべての参考文献、特許、および特許出願、ならびに刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図1A】
【図1B-1】
【図1B-2】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【国際調査報告】
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