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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-06
(54)【発明の名称】遺伝性ニューロパチーおよび関連障害の処置および検出
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20220629BHJP
A61K 31/426 20060101ALI20220629BHJP
A61K 31/499 20060101ALI20220629BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220629BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220629BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20220629BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220629BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220629BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220629BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20220629BHJP
C12N 9/04 20060101ALI20220629BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61K31/426
A61K31/499
A61P25/28
A61P43/00 105
A61P43/00 111
C12Q1/6827 Z
C12N15/09 110
C12N15/12
C12N15/113 130Z
C12Q1/06
C12N9/04 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021565930
(86)(22)【出願日】2020-05-06
(85)【翻訳文提出日】2021-12-29
(86)【国際出願番号】 US2020031708
(87)【国際公開番号】W WO2020227430
(87)【国際公開日】2020-11-12
(31)【優先権主張番号】62/844,370
(32)【優先日】2019-05-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/987,151
(32)【優先日】2020-03-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514198183
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ マイアミ
(71)【出願人】
【識別番号】507245021
【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ ロチェスター
(71)【出願人】
【識別番号】507299817
【氏名又は名称】ユーシーエル ビジネス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ザックナー， スティーブン エル．
(72)【発明者】
【氏名】レベロ， アドリアーナ
(72)【発明者】
【氏名】コルティース， アンドレア
(72)【発明者】
【氏名】ジャイ， ロン グレース
(72)【発明者】
【氏名】ハーマン， デイビッド エヌ．
【テーマコード（参考）】
4B050
4B063
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B050DD11
4B050LL01
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA17
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ68
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR44
4B063QR72
4B063QR77
4B063QS36
4B063QX01
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZB211
4C084ZB212
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC82
4C086CB05
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA15
(57)【要約】
本開示は、遺伝性ニューロパチーを検出および処置する方法に関する。種々の局面において、上記方法は、被験体に由来するサンプル中でソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異の存在を検出することを包含する。種々の実施形態において、上記ＳＯＲＤ変異は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＡＣＭＧ）基準に従って病原性またはおそらく病原性として分類されるＤＮＡバリアントである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
哺乳動物被験体において遺伝性ニューロパチーを処置する方法であって、前記方法は、（ａ）前記被験体に由来するサンプル中でソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異の存在を検出すること；および
（ｂ）前記被験体に、ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチド、アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤、ＳＯＲＤ遺伝子における前記変異を矯正する薬剤、または前記のうちのいずれかの組み合わせを投与すること、
を包含する方法。
【請求項2】
前記方法は、前記ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記方法は、前記ＳＯＲＤ遺伝子における前記変異を矯正する薬剤を投与することを包含し、ここで前記薬剤は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９タンパク質および１またはこれより多くのガイドＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
哺乳動物被験体において遺伝性ニューロパチーを処置する方法であって、前記方法は、（ａ）前記被験体に由来するサンプル中でソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異の存在を検出すること；および
（ｂ）前記被験体に、アルレスタチン、エパルレスタット、ジエパルレスタット、フィダレスタット、イミレスタット、リドレスタット、ミナルレスタット、ポナルレスタット、ラニレスタット、サルフレジン Ｂ１１、ソルビニル、トルレスタット、ゼナレスタット、またはゾポルレスタットを投与すること、
を包含する方法。
【請求項5】
哺乳動物被験体において遺伝性ニューロパチーを処置する方法であって、前記方法は、（ａ）前記被験体に由来するサンプル中でソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異の存在を検出すること；および
（ｂ）前記被験体に、ＳＯＲＤペプチドを投与すること、
を包含する方法。
【請求項6】
前記ＳＯＲＤ遺伝子における前記変異は、ｃ．７５３ｄｅｌＧ； ｐ．Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７、ｃ．３２９Ｇ＞Ｃ； ｐ．Ａｒｇ１１０Ｐｒｏ、ｃ．２９８Ｃ＞Ｔ； ｐ．Ａｒｇ１００Ｔｅｒ、またはｃ．４５８Ｃ＞Ａ； ｐ．Ａｌａ１５３Ａｓｐである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＳＯＲＤ遺伝子における前記変異は、ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７、ｃ．２８Ｃ＞Ｔ； ｐ．Ｌｅｕ１０Ｐｈｅ、ｃ．３１６＿４２５＋１６５ｄｅｌ； ｐ．Ｃｙｓ１０６Ｔｅｒ、ｃ．２９５Ｃ＞Ｔ； ｐ．Ａｒｇ２９９Ｔｅｒ、ｃ．９６４Ｇ＞Ａ； ｐ．Ｖａｌ３２２Ｉｌｅ、または個々のもしくは複数のコードエキソンまたは前記ＳＯＲＤ遺伝子全体の欠失である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記被験体に由来するサンプル中でソルビトールを測定することをさらに包含する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
哺乳動物被験体におけるニューロパチーを特徴づける方法であって、前記方法は、ニューロパチーに罹患している被験体におけるソルビトールのレベルを測定することであって、ここで約１０ｇ／Ｌより大きいソルビトールレベルは、前記ニューロパチーが、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異と関連することを示すことを包含する方法。
【請求項10】
被験体における遺伝性ニューロパチーの処置の有効性を評価する方法であって、前記方法は、前記被験体に、アルドースレダクターゼインヒビター、アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＳＯＲＤペプチド、変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤、およびＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤、または前記のうちのいずれかの組み合わせからなる群より選択される薬剤を投与すること；ならびに
被験体におけるソルビトールのレベルを測定すること、
を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
助成金資金調達の開示
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号ＮＳ０６５７１２およびＮＳ０７５７６４の下で政府の支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）によって授与された助成金番号ＮＳ０６５７１２およびＮＳ０７５７６４の下で政府の支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【0002】
関連出願の相互参照および電子的に提出された資料の参照による援用
本出願は、これによって、２０１９年５月７日出願の米国仮特許出願第６２／８４４，３７０号および２０２０年３月９日出願の同第６２／９８７，１５１号（これらの各々は、それらの全体において参照により援用される）への優先権を主張する。
本出願は、これによって、２０１９年５月７日出願の米国仮特許出願第６２／８４４，３７０号および２０２０年３月９日出願の同第６２／９８７，１５１号（これらの各々は、それらの全体において参照により援用される）への優先権を主張する。
【0003】
それと共に併せて提出されかつ以下のとおり特定される、コンピューター可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表が、その全体において参照により援用される： ファイル名： ５４０９５Ａ ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ； サイズ：１４１，９３０バイト； 作成日： ２０２０年５月５日。
【0004】
発明の分野
本開示は、遺伝性ニューロパチーを検出および処置する方法に関する。
本開示は、遺伝性ニューロパチーを検出および処置する方法に関する。
【背景技術】
【0005】
背景
末梢性ニューロパチーは、最も頻度の高い神経変性疾患の１つであり、最も一般的な作用機序の中には、糖尿病性ニューロパチーおよび遺伝性起源のものがある。遺伝性ニューロパチー（シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ），としても公知）に関しては、患者の診断ギャップは、約５０％残っている。本発明者らの理解では、ＣＭＴは、末梢神経に影響を及ぼす臨床上のおよび遺伝的に不均一な遺伝性の単一遺伝子の高度に表現型的に浸透性の状態に関する包括的概念を表す。ＣＭＴは、伝導速度に応じて脱髄型（ＣＭＴ１）および軸索型（ＣＭＴ２）として分類される。遠位型遺伝性運動ニューロパチー（ｄＨＭＮ）は、疾病負荷が主にまたは専ら運動神経に降りかかるＣＭＴ２の一形態を表す（Ｒｏｓｓｏｒ， Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ， ａｎｄ Ｒｅｉｌｌｙ ２０１６）。類似の状態としては、ＡＬＳ４（若年性ｄＨＭＮ＋上位運動ニューロン関与の徴候としての活発な反射（ｂｒｉｓｋ ｒｅｆｌｅｘ））が挙げられる。症例のうちの９０％超が既知の遺伝子における変異を有するＣＭＴ１とは対照的に、ＣＭＴ２および遠位型ＨＭＮ患者のうち２０～３０％が、遺伝子診断を受けるに過ぎない（Ｆｒｉｄｍａｎら． ２０１５）。
末梢性ニューロパチーは、最も頻度の高い神経変性疾患の１つであり、最も一般的な作用機序の中には、糖尿病性ニューロパチーおよび遺伝性起源のものがある。遺伝性ニューロパチー（シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ），としても公知）に関しては、患者の診断ギャップは、約５０％残っている。本発明者らの理解では、ＣＭＴは、末梢神経に影響を及ぼす臨床上のおよび遺伝的に不均一な遺伝性の単一遺伝子の高度に表現型的に浸透性の状態に関する包括的概念を表す。ＣＭＴは、伝導速度に応じて脱髄型（ＣＭＴ１）および軸索型（ＣＭＴ２）として分類される。遠位型遺伝性運動ニューロパチー（ｄＨＭＮ）は、疾病負荷が主にまたは専ら運動神経に降りかかるＣＭＴ２の一形態を表す（Ｒｏｓｓｏｒ， Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ， ａｎｄ Ｒｅｉｌｌｙ ２０１６）。類似の状態としては、ＡＬＳ４（若年性ｄＨＭＮ＋上位運動ニューロン関与の徴候としての活発な反射（ｂｒｉｓｋ ｒｅｆｌｅｘ））が挙げられる。症例のうちの９０％超が既知の遺伝子における変異を有するＣＭＴ１とは対照的に、ＣＭＴ２および遠位型ＨＭＮ患者のうち２０～３０％が、遺伝子診断を受けるに過ぎない（Ｆｒｉｄｍａｎら． ２０１５）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
要旨
本開示は、遺伝性ニューロパチーを処置および／または検出する方法を提供する。種々の局面において、上記方法は、被験体に由来するサンプル中でソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異の存在を検出することを包含する。種々の実施形態において、上記ＳＯＲＤ変異は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （ＡＣＭＧ）基準に従って病原性またはおそらく病原性として分類されるＤＮＡバリアントである。必要に応じて、上記方法は、ＳＯＲＤ遺伝子における変異の存在が検出される場合に、遺伝性ニューロパチーを有する被験体を診断することを包含する。必要に応じて、上記方法は、上記被験体に、アルドースレダクターゼインヒビター；アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチド；ＳＯＲＤペプチド；変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤；およびＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤からなる群より選択される薬剤を含む組成物を投与することを包含する。種々の局面において、上記方法は、上記被験体に、アルレスタチン、エパルレスタット、ジエパルレスタット（diepalrestat）、フィダレスタット、イミレスタット、リドレスタット、ミナルレスタット、ポナルレスタット、ラニレスタット、サルフレジン Ｂ１１、ソルビニル、トルレスタット、ゼナレスタット、またはゾポルレスタット（またはこれらの組み合わせ）を投与することを包含する。種々の局面において、上記方法は、上記被験体に、アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチド；変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤；ＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤；または前記のうちのいずれかの組み合わせを投与することを包含する。種々の局面において、上記方法は、上記被験体にＳＯＲＤペプチドを投与することを包含する。前記のうちのいずれかの組み合わせの投与も企図される。必要に応じて、上記方法は、上記被験体に由来するサンプル中でソルビトールレベルを測定することを包含する。
本開示は、遺伝性ニューロパチーを処置および／または検出する方法を提供する。種々の局面において、上記方法は、被験体に由来するサンプル中でソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異の存在を検出することを包含する。種々の実施形態において、上記ＳＯＲＤ変異は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （ＡＣＭＧ）基準に従って病原性またはおそらく病原性として分類されるＤＮＡバリアントである。必要に応じて、上記方法は、ＳＯＲＤ遺伝子における変異の存在が検出される場合に、遺伝性ニューロパチーを有する被験体を診断することを包含する。必要に応じて、上記方法は、上記被験体に、アルドースレダクターゼインヒビター；アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチド；ＳＯＲＤペプチド；変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤；およびＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤からなる群より選択される薬剤を含む組成物を投与することを包含する。種々の局面において、上記方法は、上記被験体に、アルレスタチン、エパルレスタット、ジエパルレスタット（diepalrestat）、フィダレスタット、イミレスタット、リドレスタット、ミナルレスタット、ポナルレスタット、ラニレスタット、サルフレジン Ｂ１１、ソルビニル、トルレスタット、ゼナレスタット、またはゾポルレスタット（またはこれらの組み合わせ）を投与することを包含する。種々の局面において、上記方法は、上記被験体に、アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチド；変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤；ＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤；または前記のうちのいずれかの組み合わせを投与することを包含する。種々の局面において、上記方法は、上記被験体にＳＯＲＤペプチドを投与することを包含する。前記のうちのいずれかの組み合わせの投与も企図される。必要に応じて、上記方法は、上記被験体に由来するサンプル中でソルビトールレベルを測定することを包含する。
【0007】
ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異の存在に関して試験した被験体における遺伝性ニューロパチーの処置のための（または遺伝性ニューロパチーの処置のための医薬の調製における使用のための）、（ｉ）アルドースレダクターゼインヒビター（例えば、アルレスタチン、エパルレスタット、ジエパルレスタット、フィダレスタット、イミレスタット、リドレスタット、ミナルレスタット、ポナルレスタット、ラニレスタット、サルフレジン Ｂ１１、ソルビニル、トルレスタット、ゼナレスタット、および／またはゾポルレスタット）；（ｉｉ）アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチド、変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤、および／もしくはＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤；ならびに／または（ｉｉｉ）ＳＯＲＤペプチドの使用がまた、提供される。
【0008】
本開示は、哺乳動物被験体におけるニューロパチーを特徴づける方法であって、上記方法は、ニューロパチーに罹患している被験体におけるソルビトールのレベルを測定することを包含し、ここで約１０ｇ／Ｌより大きいソルビトールレベルは、上記ニューロパチーが、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異と関連することを示す方法をさらに提供する。本開示はまた、被験体における遺伝性ニューロパチーの処置の有効性を評価する方法であって、上記方法は、上記被験体に、アルドースレダクターゼインヒビター（例えば、アルレスタチン、エパルレスタット、ジエパルレスタット、フィダレスタット、イミレスタット、リドレスタット、ミナルレスタット、ポナルレスタット、ラニレスタット、サルフレジン Ｂ１１、ソルビニル、トルレスタット、ゼナレスタット、および／またはゾポルレスタット）、アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＳＯＲＤペプチド、変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤、およびＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤（または前記のうちのいずれかの組み合わせ）からなる群より選択される薬剤を投与すること；ならびに被験体におけるソルビトールのレベルを測定すること、を包含する方法を提供する。
【0009】
本明細書で記載される各特徴もしくは実施形態、または組み合わせが、本開示の局面のうちのいずれかの非限定的な例証的例であり、よって、本明細書で記載される任意の他の特徴もしくは実施形態、または組み合わせと組み合わせ可能であることが意味されることは、理解される。例えば、特徴が、「１つの実施形態」、「いくつかの実施形態」、「種々の実施形態」、「関連する実施形態」のような文言とともに記載される場合、これらのタイプの実施形態の各々は、あらゆる考えられる組み合わせを列挙する必要なしに、本明細書で記載される任意の他の特徴、または特徴の組み合わせと組み合わされることが意図される、特徴の非限定的な例である。このような特徴または特徴の組み合わせは、本発明の局面のうちのいずれかに該当する。
【0010】
本明細書中の見出しは、読み手の便宜のためであって、限定であることは意図しない。本発明のさらなる局面、実施形態、およびバリエーションは、詳細な説明および／または図面および／または特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1-1】図１Ａ～Ｆ。ＳＯＲＤ遺伝子および系図。ＳＯＲＤにおける両アレル変異は、常染色体劣性ｄＨＭＮ／ＣＭＴ２を引きおこす。（図１Ａ）ＳＯＲＤにおいて両アレル変異を有するｄＨＭＮ／ＣＭＴ２家族の代表的系図。四角は男性を、丸は女性を示す。斜線は、死亡した個体に関して使用される。患者は、黒塗りの形で示される。（図１Ｂ）ＮＣＢＩ参照配列： ＮＭ＿００３１０４．６に基づいてＳＯＲＤの全てのエキソン、イントロンおよび非翻訳領域（ＵＴＲ）を示す模式的ダイアグラム。灰色および白のボックスは、それぞれ、ＳＯＲＤのコード配列およびＵＴＲを表す。本研究の中で考慮される家族の中で同定されたバリアントは、遺伝子のコード領域全体にわたってマップする。エキソン７上のナンセンスｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）バリアントを、特定の高い頻度で同定した。（図１Ｃ）ＳＯＲＤタンパク質ドメインにわたる変異の分布。（図１Ｄ）この研究におけるｄＨＭＮ／ＣＭＴ２家族の中で同定された４つのミスセンス置換が、ヒトからゾウまでの種にわたって高度に保存された残基に位置することを示すＳＯＲＤタンパク質オルソログアラインメント。（図１Ｅおよび１Ｆ）ＳＯＲＤ（逆方向鎖）およびＳＯＲＤ２Ｐ（順方向鎖）のエキソン７における高度に相同性の領域のヌクレオチド配列の拡大図。ＳＯＲＤに由来するＳＯＲＤ２Ｐにおいて異なるヌクレオチドは、図１ＣのＳＯＲＤ２Ｐにおける欠失を含め、矢印で示される。代表的な電気泳動図は、ＳＯＲＤにおいて、ｄＨＭＮ／ＣＭＴ２患者においてホモ接合性状態、および入手可能な特許におけるヘテロ接合性状態（右側のボックス、上側のプロット）で見出されるｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）バリアントが、健常コントロール（右側のボックス、下側のプロット）から両アレル状態で存在しないが、ＳＯＲＰ２Ｐにおいて固定される（左のボックス、下側のプロット）ことを示す。
【図1-2】同上。
【図1-3】同上。
【0012】
【図2】図２Ａ～Ｃ。患者の線維芽細胞における減少したＳＯＲＤ発現およびソルビトール蓄積。（図２Ａ）グルコースをフルクトースに変換する２段階ポリオール経路の模式図。（図２Ｂ）健常コントロール（ｎ＝４、レーン１～４）、ＳＯＲＤにおいてｃ．７５７ｄｅｌＧ；ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）バリアントのヘテロ接合性キャリア（ｎ＝２、レーン１０～１１）およびホモ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ；ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）変化を有する患者（ｎ＝４、レーン５～８）または第２のナンセンスｃ．８９５Ｃ＞Ｔ；ｐ．（Ａｒｇ２９９Ｔｅｒ）変異を一緒に有する複合性ヘテロ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ；ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）バリアント（ｎ＝１、レーン９）におけるポリクローナル抗体ａｂ１８９２４８を使用し、チューブリンで正規化したＳＯＲＤのタンパク質レベルを示すイムノブロット。（図２Ｃ）ＵＰＬＣによって測定され、健常コントロール（ｎ＝５）およびＳＯＲＤにおいて両アレルナンセンス変異を有する患者（ｎ＝５）におけるタンパク質含有量に対して正規化した場合の細胞内ソルビトールのレベル。グラフは、平均±ｓ．ｄ．およびデータ分布（ドット）を示す。両側ｔ検定を行って、群にわたってＳＯＲＤによってコードされるタンパク質（図２Ｂ）またはソルビトールレベル（図２Ｃ）を比較した。統計的有意性を、Ｐ値が＜０．０５、＜０．０１または＜０．００１である場合に、それぞれ、＊、＊＊または＊＊＊として示す。全ての実験を独立して２回反復したところ、類似の結果を得た。
【0013】
【図3-1】図３Ａ～Ｆ。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｏｒｄ２の喪失は、年齢依存性シナプス変性を引きおこす。（図３Ａ）視葉板（lamina）、視髄（medulla）、および視小葉（lobula）を示すＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ視覚系の３Ｄ構造。光受容体末端および視葉板ニューロンを示すｘｙ面およびｘｚ面が、示される。（図３Ｂ）２ ＤＡＥでのｙｗコントロールハエの視葉板。組織化した視葉板カートリッジおよび円柱状光受容体ニューロン（ｃｏｌｕｍｎａｒ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ）を、それぞれ、ｘｙ面およびｘｚ面に示す。（図３Ｃ）２ ＤＡＥおよび１０ ＤＡＥにおけるＳｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５ホモ接合性ハエの視葉板。矢頭は、視葉板空胞を示す。ボックスは、視葉板のより高倍率の領域を示す。ＢＲＰの強度を示す。点線は、視葉板空胞の領域を示す。スケールバー：３０μｍ。（図３Ｄ）空胞の数、サイズ、およびＢＲＰ強度の定量。各群の合計３個の視葉板を定量した。データを平均±ｓ．ｄ．として示す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を使用して行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図３Ｅ～３Ｆ）コントロールハエ（ｙｗ）およびＳｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５（図３Ｅ）またはＳｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２汎ニューロン二重ノックダウン（ＲＮＡｉ）（図３Ｆ）ハエの自発運動活性。各群においてｎ＝１０。データを平均±ｓ．ｄ．として示す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を使用して行った。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図3-2】同上。
【0014】
【図4-1】図４Ａ～Ｇ。アルドースレダクターゼインヒビターであるエパルレスタットおよびラニレスタットでの処置は、ソルビトールレベルを減少させ、機能を回復させる。（図４Ａ）エパルレスタット １００μＭ、ラニレスタット １０μＭまたはＤＭＳＯでの処置の３日後に健常コントロール（ｎ＝５、丸のドット）およびＳＯＲＤにおいて両アレルナンセンス変異を有する患者（ｎ＝５、四角のドット）に由来する線維芽細胞において、ＵＰＬＣによって測定し、タンパク質含有量に対して正規化した細胞内ソルビトールレベル。（図４Ｂ）卵封入後１０日間での野生型（ｙｗ、白丸のドット）、Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５（黒丸のドット）、ならびにＲＮＡｉによるＳｏｄｈ１およびＳｏｄｈ１のニューロン特異的ノックダウン（四角のドット）のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｅからの、脳／頭部ホモジネート由来のＵＰＬＣによって測定され、タンパク質濃度に対して正規化した場合のソルビトールレベル。Ｓｏｄｈ２模倣物（Ｓｏｄｈ２ Ｍｉｍｉｃ）ならびにＳｏｄｈ１およびＳｏｈ２ ＲＮＡｉ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｅに、８０μＭ エパルレスタット、８０μＭ ラニレスタットまたはＤＭＳＯのいずれかを供給した。グラフは、平均±ｓ．ｄ．を示す。両側ｔ検定を行って、ソルビトールレベルを比較した。統計的有意性は、別段特定されなければ、Ｐ値が＜０．０５、＜０．０１または＜０．００１である場合、それぞれ、＊、＊＊または＊＊＊として示される。全ての実験を独立して２回反復したところ、類似の結果を得た。（図４Ｃ）ＤＭＳＯを供給したコントロールハエ（ｙｗ）、ＤＭＳＯ、８０μＭ エパルレスタット、または８０μＭ ラニレスタットを供給したＳｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５ハエ（各群においてｎ＝１０）の自発運動活性。データを平均±ｓ．ｄ．として示す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を使用して行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（図４Ｄ～４Ｆ）ＤＭＳＯ（図４Ｄ）、８０μＭ エパルレスタット（図４Ｅ）、または８０μＭ ラニレスタット（図４Ｆ）を供給した１０ ＤＡＥおよび４０ ＤＡＥでのＳｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５ホモ接合性ハエの視葉板。矢頭は、視葉板空胞を示す。ボックスは、視葉板のより高倍率の領域を示す。ＢＲＰの強度を示す。点線は、視葉板空胞の領域を示す。スケールバー：３０μｍ。（図４Ｇ）空胞の数、サイズ、およびＢＲＰ強度の定量（図４Ｄ～４Ｆ）。ｎ＝３。データを平均±ｓ．ｄ．として示す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を使用して行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図4-2】同上。
【0015】
【0016】
【図6】図６Ａ～Ｂ。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２の二重ノックダウンは、年齢依存性シナプス変性をもたらす。（図６Ａ）２ ＤＡＥおよび１０ ＤＡＥでのＳｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２二重ノックダウンホモ接合性ハエの視葉板。矢頭は、視葉板空胞を示す。ボックスは、視葉板のより高倍率の領域を示す。ＢＲＰの強度を示す。点線は、視葉板空胞の領域を示す。スケールバー：３０μｍ。（図６Ｂ）空胞の数、サイズ、およびＢＲＰ強度の定量。各群の合計３個の視葉板を定量した。データを平均±ｓ．ｄ．として示す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を使用して行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【0017】
【図7】図７。アルドースレダクターゼインヒビターであるエパルレスタットおよびラニレスタットでの処置は、Ｓｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２二重ノックダウンハエの自発運動機能を回復させる。ＤＭＳＯを供給するコントロールハエ（ｙｗ）（ドット、示した各ＤＡＥ点に関して左から１番目のデータ点）、またはＤＭＳＯ（四角、示した各ＤＡＥ点に関して左から２番目のデータ点）、８０μＭ エパルレスタット（四角、示した各ＤＡＥ点に関して左から３番目のデータ点）、もしくは８０μＭ ラニレスタット（四角、示した各ＤＡＥ点に関して左から４番目のデータ点）を供給するＳｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２のニューロン特異的ノックダウンを有するハエの自発運動活性。各群においてｎ＝１０。データを平均±ｓ．ｄ．として示す。統計分析を、二元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定を使用して行った。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【図15-1】図１５Ａ～１５Ｄ。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（ＡＲ １Ａ、（配列番号２２））を介するアルドースレダクターゼ（ＡＲ）（ＡＫＲ１Ｂ１遺伝子）の有意なノックダウン。標的化ＡＳＯ（ＡＲ １Ａ）配列およびＡＳＯ－Ｓ混合配列（ＡＲ－Ｓ １Ａ、（配列番号４７））を、図１５Ａに示す。図１５Ｂは、ＡＳＯのヌクレオチド骨格に対する改変を示す。これは、ＳＯＲＤ患者線維芽細胞およびコントロール線維芽細胞において行い、β－チューブリンに対して正規化し、ウェスタンブロットを介して測定した（図１５Ｃ～１５Ｄ）。さらなるコントロールは、ランダムヌクレオチドを示すＡＳＯ－Ｓの混合バージョン（ＡＲ－Ｓ １Ａ）を使用した（図１５Ｃ）。
【図15-2】同上。
【0026】
【図16-1】図１６。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓアルド－ケトレダクターゼファミリー１メンバーＢ（ＡＫＲ１Ｂ１）におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列および標的部位（エキソン標的のみ）の表。フィルター基準： Ａ）４０％≦ＧＣ％≦６０％； Ｂ）アンチセンスオリゴ結合エネルギー≦－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ； Ｃ）標的配列の中にＧＧＧＧがない。
【図16-2】同上。
【図16-3】同上。
【図16-4】同上。
【図16-5】同上。
【図16-6】同上。
【0027】
【図17】図１７。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓアルド－ケトレダクターゼファミリー１メンバーＢ（ＡＫＲ１Ｂ１）におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）配列および標的部位（エキソン標的のみ）の表。フィルター基準： Ａ）４０％≦ＧＣ％≦６０％； Ｂ）標的配列の中にＧＧＧＧがない； Ｃ）標的部位ヌクレオチドの平均非対形成確率（average unpaired probability）≧０．５； Ｄ）閾値確率０．５を上回るアクセシビリティプロファイルにおける各ピークに関しては、この同じピークに標的化される全ての部位を、それらの平均非対形成確率によってランク付けし（高いほどよい）、ピーク毎に多くてもｎ個の部位が選択され、ここで、ｎが最大（［ピーク幅／部位の長さ］、２）によって決定される； Ｅ）基準Ａ～Ｄを満たす部位の中でも、最高の平均非対形成確率を有する上位２０個の特有のものを列挙する。
【0028】
【図18-1】図１８。Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓアルド－ケトレダクターゼファミリー１メンバーＢ（ＡＫＲ１Ｂ１）， ｈｇ１９＿ｄｎａ ｒａｎｇｅ＝ｃｈｒ７：１３４１２７１０２－１３４１４３９４４におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）配列および標的部位（イントロン標的のみ）の表。フィルター基準： Ａ）４０％≦ＧＣ％≦６０％； Ｂ）標的配列の中にＧＧＧＧがない； Ｃ）標的部位ヌクレオチドの平均非対形成確率≧０．５； Ｄ）閾値確率０．５を上回るアクセシビリティプロファイルにおける各ピークに関しては、この同じピークに標的化される全ての部位を、それらの平均非対形成確率によってランク付けし（高いほどよい）、ピーク毎に多くてもｎ個の部位が選択され、ここで、ｎが最大（［ピーク幅／部位の長さ］、２）によって決定される； Ｅ）基準Ａ～Ｄを満たす部位の中でも、最高の平均非対形成確率を有する上位２０個の特有のものを列挙する。
【図18-2】同上。
【図18-3】同上。
【発明を実施するための形態】
【0029】
詳細な説明
本開示は、遺伝性ニューロパチーおよび関連する遺伝状態を検出および／または処置する方法を提供する。
本開示は、遺伝性ニューロパチーおよび関連する遺伝状態を検出および／または処置する方法を提供する。
【0030】
遺伝性（ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ）（または遺伝性（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ））ニューロパチーとしては、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、遺伝性運動感覚性ニューロパシー、遺伝性運動ニューロパチー、遠位型遺伝性運動ニューロパチー（ｄＨＭＮ）、軸索型ニューロパチー、中間型ニューロパチー、および筋萎縮性側索硬化症型ＡＬＳ４が挙げられるが、これらに限定されない。
【0031】
種々の局面において、本開示は、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異の存在が被験体に由来するサンプル中で検出される方法を提供する。上記変異は、遺伝子のＤＮＡ配列を調べるか、ＲＮＡを調べるか、またはある機能喪失を生じる変異を有するタンパク質を調べることによって検出され得る。
【0032】
ＣＭＴの最も頻度の高い劣性形態と関連するソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＳＯＲＤ）における両アレル変異の同定が、本明細書で開示される。ＳＯＲＤは、ソルビトールをフルクトースに変換する酵素であるソルビトールデヒドロゲナーゼをコードする。それは、糖尿病の高血糖状態における神経損傷に中心的と以前に同定された２段階ポリオール経路に属する。異なる民族性にわたるＣＭＴの４２症例を、ホモ接合性状態または複合性ヘテロ接合性状態のいずれかにあるＳＯＲＤにおけるナンセンス変異、ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７を有すると同定した。さらなる症例および複数のコントロールセットにおけるｐ．Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７変化をスクリーニングすることによって、このバリアントを、メンデルの法則に従って遺伝した男性における最も一般的な病原性アレルのうちの１つとして確立した（ＭＡＦ＝０．００３）。患者線維芽細胞培養物は、ＳＯＲＤタンパク質の完全な喪失および組織損傷を引きおこす細胞内ソルビトール蓄積の喪失を示す。ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるＳｏｄｈ１の喪失は、シナプス変性および進行性の運動障害をもたらした。顕著なことには、アルドースレダクターゼインヒビターでの処置によるポリオール流入の低減は、患者線維芽細胞およびＳｏｄｈ１ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａモデルにおける細胞内ソルビトールレベルを十分に救済した。後者のモデルにおいて、上記処置はまた、運動および眼の表現型を完全に改善した。まとめると、これらの所見は、遺伝性ニューロパチーにおけるポリオール経路およびソルビトール蓄積の主要な役割を示し、症例の有意な割合において潜在的に処置可能な状態の分子的な根拠を確立する。これらの所見はまた、糖尿病の分野においてより広い影響とともに、遺伝性および後天性のニューロパチーの集中的な病理機序の一例を表す。
【0033】
従って、本開示の種々の局面において、上記方法は、ＳＯＲＤ遺伝子変異、７５３ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）、ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７、ｃ．２８Ｃ＞Ｔ； ｐ．Ｌｅｕ１０Ｐｈｅ、ｃ．３１６＿４２５＋１６５ｄｅｌ； ｐ．Ｃｙｓ１０６Ｔｅｒ、ｃ．３２９Ｇ＞Ｃ； ｐ．Ａｒｇ１１０Ｐｒｏ、ｃ．２９８Ｃ＞Ｔ； ｐ．Ａｒｇ１００Ｔｅｒ、ｃ．２９５Ｃ＞Ｔ； ｐ．Ａｒｇ２９９Ｔｅｒ、ｃ．９６４Ｇ＞Ａ； ｐ．Ｖａｌ３２２Ｉｌｅ、ｃ．４５８Ｃ＞Ａ； ｐ．Ａｌａ１５３Ａｓｐ；コピー数バリエーションを介する個々のもしくは複数のコードエキソンまたはＳＯＲＤ遺伝子全体の欠失；あるいは任意のタンパク質短縮変異および／またはタンパク質の「機能喪失」もしくは低次形態機能（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）をもたらす変異を検出することを包含する。
【0034】
種々の局面において、上記ＳＯＲＤ変異は、ＤＮＡシーケンシング法、例えば、全エキソームシーケンシング、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）および／または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、アレル特異的オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的またはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、多重ＰＣＲ、ネスト化ＰＣＲ、増幅不応性変異システム（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＲＭＳ）ＰＣＲ、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、タンパク質短縮試験（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ）（ＰＴＴ）、ＲＦＬＰ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡ－ｓｅｑを使用して、ＣＲＩＳＰＲベースの変異検出（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃｈｉｐ， Ｈａｊｉａｎら．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ３， ４２７－４３７（２０１９））、または変異検出に適した他のＤＮＡもしくはＲＮＡ変異検出法を使用して検出される。
【0035】
種々の局面において、上記ＳＯＲＤ変異は、ウェスタンブロット法（イムノブロット）、高速液体クラマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ／ＭＳ）、抗体依存性の方法（例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質免疫沈降法、タンパク質免疫染色法、タンパク質チップ法または変異検出に適した他のタンパク質検出法を使用してタンパク質を調べることによって検出される。
【0036】
必要に応じて、上記方法は、被験体のサンプル中でソルビトールレベルを測定することをさらに包含する。ソルビトールを測定するための方法としては、例えば、酵素アッセイ、蛍光アッセイ、クロマトグラフィーベースの方法、および分光法ベースの方法が挙げられる。ソルビトール測定の例示的方法は、実施例の中で提供される。
【0037】
本開示は、ＳＯＲＤ変異が関わるニューロパチー（例えば、遺伝性ニューロパチー）および関連状態を特徴づける方法をさらに提供する。種々の局面において、上記方法は、ニューロパチーに罹患している被験体の生物学的サンプル中でソルビトールレベルを測定することを包含する。種々の局面において、上記方法は、上記生物学的サンプル中でソルビトールの増加したレベルを検出することを包含する。「ソルビトールの増加したレベル」とは、例えば、約１０ｍｇ／Ｌを上回るソルビトールレベルを意味する。ＳＯＲＤ関連ニューロパチーは、実施例および図１３に記載されるように、患者において高レベルのソルビトールをもたらす。よって、約１０ｍｇ／Ｌを上回るソルビトールレベルの検出は、上記ニューロパチーが、ＳＯＲＤ変異と関連する遺伝性ニューロパチーであり、それによって、臨床医が上記被験体を悩ますニューロパチーを特徴づけることを可能にすることを示す。必要に応じて、上記方法は、上記被験体に、アルドースレダクターゼインヒビター；アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチド；ＳＯＲＤペプチド；変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤；およびＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤からなる群より選択される薬剤を投与することを包含する処置ステップを包含する。
【0038】
種々の局面において、本開示は、被験体におけるソルビトールレベルを測定することの前または後に、上記被験体に由来するサンプル中でソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）遺伝子における変異を同定することを包含する方法を提供する。この点において、上記方法は、遺伝性ニューロパチーの診断を確定するために使用され得る。同様に、本開示は、病原性であるＳＯＲＤ変異を同定するための方法であって、上記方法は、ＳＯＲＤ遺伝子において変異を含む被験体においてソルビトールレベルを測定することを包含する方法を提供する。増加したソルビトールレベル（例えば、約１０ｍｇ／Ｌより高い）の存在は、ＳＯＲＤ変異が病原性であることを示す。
【0039】
代わりに（またはさらに）、上記方法は、被験体において遺伝性ニューロパチーの処置の有効性を評価するために使用され得る。この点において、上記方法は、上記被験体に治療を投与すること、次いで、生物学的サンプル中でソルビトールレベルを測定することを包含する。前処置で観察されたソルビトールのレベルと比較したソルビトールレベルの減少（例えば、約１０ｇ／Ｌを下回るソルビトールレベルの低減）は、上記被験体の状態の改善を示す。本明細書で記載される材料および方法はまた、ＳＯＲＤ関連遺伝性ニューロパチーの処置のための医薬を摂取するにあたって、患者コンプライアンスを特徴付け得るか、または臨床試験における候補治療剤の成功をモニターし得る。
【0040】
上記サンプルは、上記被験体から採取された任意の生物学的サンプル（目的の形質（例えば、核酸（例えば、ＳＯＲＤ ｍＲＮＡ）、タンパク質（例えば、ＳＯＲＤタンパク質）、またはソルビトールの存在または量）に関して分析され得る任意の組織、細胞、または流体（例えば、血液、血漿、血清、または尿）が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。種々の実施形態において、上記生物学的サンプルは、血漿、血清、唾液、尿、または皮膚サンプルである。
【0041】
「被験体」とは、本明細書で言及される場合、任意の哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。飼い慣らされた愛玩動物（イヌおよびネコが挙げられる）として重要な動物；研究において重要な動物（齧歯類および霊長類が挙げられる）；および大型の絶滅危惧種および動物園動物（例えば、霊長類、猫、キリン、ゾウ、サイ）だけでなく、農業上重要な動物（例えば、ウシ、ウマ、およびブタ動物）が企図される。
【0042】
種々の局面において、上記方法は、１またはこれより多くのアルドースレダクターゼインヒビターを含む組成物を上記被験体に投与することによって、上記被験体を処置することを包含する。いくつかの実施形態において、上記アルドースレダクターゼインヒビターは、アルレスタチン、エパルレスタット、ジエパルレスタット、フィダレスタット、イミレスタット、リドレスタット、ミナルレスタット、ポナルレスタット、ラニレスタット、サルフレジン Ｂ１１、ソルビニル、トルレスタット、ゼナレスタット、またはゾポルレスタットである。アルドースレダクターゼインヒビターは、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｐａｔ． ２０１９；２９（３）：１９９－２１３； Ｃｈａｔｚｏｐｏｕｌｏｕら．， Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｐａｔ． ２０１２；２２（１１）：１３０３－２３（それらの全体において参照により援用される）において総説される。
【0043】
いくつかの実施形態において、酵素補充療法が使用され、ＳＯＲＤペプチドが上記被験体に投与される。よって、上記治療は、内因性ＳＯＲＤレベルが不適切であるかまたは存在しないＳＯＲＤペプチドレベルを補う。例示的なＳＯＲＤペプチドは、配列番号４６に提供される。本開示は、配列番号４６と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％ 同一性を構成するペプチドの使用を企図する。
【0044】
種々の実施形態において、上記方法は、ポリヌクレオチド（例えば、アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＯＲＤペプチド／タンパク質をコードするポリヌクレオチド、変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤、および／またはＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤）を上記被験体に投与することを包含する。ポリヌクレオチドは、代表的には、発現ベクターを介して宿主細胞に送達され、その発現ベクターは、送達および発現に必要な調節配列を含むが、発現ベクターの使用は、本開示との関係では要求されない。いくつかの局面において、本明細書で記載される構築物は、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはＣＢ７プロモーター）、タンパク質コード領域（必要に応じて、発現を促進する非コード（例えば、３’－ＵＴＲ）領域を伴う）、転写終結配列、ならびに／またはレギュレーターエレメント配列（例えば、転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ポリ（Ａ）エレメント、複製起点（ｐＵＣ－ｏｒｉ）および／もしくはＩＴＲ配列（逆方向末端反復配列））を含む。種々の局面において、本明細書で記載される構築物は、表１に列挙されるベクター特徴のうちの１またはこれより多くを含む。ベクター特徴はまた、Ｐｏｗｅｌｌら．， Ｄｉｓｃｏｖ Ｍｅｄ． ２０１５； １９（１０２）： ４９－５７（その全体において参照により援用される）に総説される。例えば、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムは、目的のペプチドを（例えば、ＳＯＲＤペプチドを、必要に応じて、目的の特異的組織において）発現させるために利用され得る。発現ベクターは、ウイルスベース（例えば、レトロウイルスベース、アデノウイルスベース、またはアデノ随伴ウイルスベース）であっても、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）であってもよい。非ベクターベースの方法（例えば、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体などを使用する）がまた、使用されてもよい。必要に応じて、上記ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターまたはバキュロウイルスベクター）であり、種々の好ましい実施形態において、上記ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。上記発現ベクターは、任意のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、またはＡＡＶ－１３を含む）に基づき得る。ポリヌクレオチドはまた、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小小胞、流体力学ベースの遺伝子送達を介するか、または「遺伝子銃」を介して送達され得る。
【0045】
【表1】
【0046】
本開示の方法において投与されるべきＡＡＶの力価は、例えば、特定のＡＡＶ、投与様式、処置目的、個体、標的化されている細胞タイプ（複数可）に依存して変動し、当該分野で公知の方法によって決定され得る。ＡＡＶの力価は、１ｍｌあたり約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、約１×１０１２、約１×１０１３～約１×１０１４またはより多くのＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の範囲に及び得る。投与量はまた、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表され得る。
【0047】
種々の実施形態において、ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチドは、上記被験体に投与される。ＳＯＲＤのアミノ酸配列は、配列番号４６として提供される（図１４Ｃ、ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿００３０９５．２）。上記方法で使用されるポリヌクレオチドは、必要に応じて、配列番号４６のアミノ酸配列、または配列番号４６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％ 同一である配列（これはＳＯＲＤの機能を保持する）をコードする。必要に応じて、上記ポリヌクレオチドは、配列番号４５（図１４Ｂ）、または配列番号４５のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは１００％ 同一である配列（そしてこれは、ＳＯＲＤをコードする）を含む。上記ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む例示的な発現ベクターは、図８および１４Ａに図示される。上記ポリヌクレオチドは、本開示の少なくとも1つの局面において、図９に示される核酸配列（配列番号１）を含み、この配列は、ＳＯＲＤをコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターの配列に相当する。
【0048】
種々の実施形態において、上記方法は、変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤を上記被験体に投与することを包含する。変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤とは、ＳＯＲＤ遺伝子発現および／またはＳＯＲＤタンパク質レベルが、基底／野生型レベルと比較して低減されるように、ＳＯＲＤ遺伝子の発現に干渉する薬剤に言及する。変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を「遮断すること」は、発現およびＳＯＲＤ生成の１００％消滅（ａｂｏｌｉｔｉｏｎ）を要求しない；異常なＳＯＲＤの低減した発現の任意のレベルが、被験体に有益であり得ることが認識される。例示的な薬剤としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0049】
種々の実施形態において、上記方法は、アルドースレダクターゼ配列を標的とするアルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチドを、上記酵素の発現が遮断されるように、上記被験体に投与することを包含する。アルドースレダクターゼ、アルド－ケトレダクターゼファミリー１メンバーＢ（ＡＫＲ１Ｂ１）は、配列番号４８（ＮＣＢＩ参照配列： ＮＭ＿００１６２８）によってコードされる。アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＫＲ１Ｂ１遺伝子発現および／またはアルドースレダクターゼタンパク質レベルが、基底／野生型レベルと比較して低減されるように、アルドースレダクターゼ遺伝子（ＡＫＲ１Ｂ１）の発現に干渉する。アルドースレダクターゼ遺伝子（ＡＫＲ１Ｂ１遺伝子）の発現の「遮断」は、発現およびアルドースレダクターゼ生成の１００％消滅を要求しない；アルドースレダクターゼの低減した発現の任意のレベルが、被験体に有益であり得ることが認識される。例えば、種々の局面において、上記アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アルドースレダクターゼの発現を低減する。ＡＳＯは、1本鎖デオキシリボヌクレオチドであり、これは、ｍＲＮＡ標的配列に相補的である。種々の局面において、上記アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アルドースレダクターゼ遺伝子のエキソン配列またはイントロン配列を標的とする。
【0050】
アルドースレダクターゼを標的とするＡＳＯ配列を同定するための例示的方法において、以下の基準を使用した： Ａ）アルドースレダクターゼ（ＡＫＲ１Ｂ１）を標的とする配列は、≦４０％ ＧＣまたは≦６０％ ＧＣ含有量を含むものを選択した； Ｂ）ＧＧＧＧヌクレオチドを含む配列を排除した； Ｃ）標的部位ヌクレオチドの平均非対形成確率≧０．５を有する配列を選択した； Ｄ）閾値確率０．５を上回ったアクセシビリティプロファイルにおける各ピークに関して、その同じピークに標的化される全ての部位を、それらの平均非対形成確率によってランク付けし（高いほどよい）、ピーク毎に多くてもｎ個の部位が選択され、ここで、ｎが最大ピーク幅／部位の長さによって決定される。これらの基準を満たす例示的な薬剤は、表２に提供される。さらなる例示的なＡＳＯ配列およびフィルター基準は、図１６～１８に示される。
【0051】
【表2】
【0052】
種々の実施形態において、ＡＳＯ配列のヌクレオチド骨格を、基底／野生型レベルと比較した場合に、遺伝子発現を低減するために、キメラまたはギャプマーデザインに改変される。種々の実施形態において、ギャップマーデザインは、ＲＮａｓｅ Ｈ認識および他のヌクレアーゼに対して耐性のリボース糖部分における改変を有するように、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド配列の各末端上で３－５ヌクレオチドの指定を必要とする一方で、全ての他のヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ Ｈ適合性改変を含む。ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖（例えば、異常なｍＲＮＡ転写物と合成的にデザインされたＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドとの間で形成されるもの）の切断を担う。種々の実施形態において、ＡＳＯ配列の改変としては、ホスホロチオエート（ＰＳ）－ＲＮａｓｅ Ｈ認識可能、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）－ＲＮａｓｅ Ｈ耐性、２’－Ｏ－メチル－ＲＮａｓｅ Ｈ耐性、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）－ＲＮａｓｅ Ｈ耐性、ロック核酸（ＬＮＡ）－ＲＮａｓｅ Ｈ耐性、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）－ＲＮａｓｅ Ｈ耐性、または（Ｓ）－拘束エチル（ｃＥｔ）－ＲＮａｓｅ Ｈ耐性が挙げられるが、これらに限定されない。ＡＳＯ配列の例示的な改変は、図１５Ａ～１５Ｂに示される。ＡＳＯ配列に対する改変は、Ｓｃｏｌｅｓら．， Ｎｅｕｒｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ２０１９；５（２）：ｅ３２３（その全体において参照により援用される）において総説される。
【0053】
種々の局面において、上記方法は、ＳＯＲＤの発現を調節するためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用する。ＲＮＡｉ経路は、Ｍｕｓｃｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ， ＬＬＣ（２０１０）の第７章の７．３節、Ｄｕａｎ（編）にまとめられている。適切な薬剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡが挙げられる。ｓｈＲＮＡ／Ｈａｉｒｐｉｎベクターは、ＲＮＡｉを介して標的遺伝子発現をサイレントにするために使用され得るタイトなヘアピンターンを有する人工ＲＮＡ分子（ヌクレオチド）である。ｓｈＲＮＡは、比較的遅い分解およびターンオーバー速度を有するという点で、ＲＮＡｉの有利なメディエーターであるが、それはしばしば、発現ベクターの使用を必要とする。例示的な局面において、本開示はｌ、ＳＯＲＤを標的とする１またはこれより多くのｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶベクターの生成および投与を含む。ｓｈＲＮＡの発現は、種々のプロモーターの使用によって調節される。種々の局面において、ポリメラーゼＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６およびＨ１）、およびポリメラーゼＩＩＩプロモーターが、使用される。いくつかの局面において、Ｕ６ ｓｈＲＮＡが使用される。ＲＮＡｉはまた、アルドースレダクターゼ（例えば、ＡＫＲ１Ｂ１）の発現をダウンレギュレートする（すなわち、遮断する）ために使用され得ることが認識される；よって、本開示は、アルドースレダクターゼの発現を遮断するために、アルドースレダクターゼイントロン配列またはエキソン配列（ｅｘｔｒｏｎｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を標的とするｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡの使用（ｓｕｅ）を企図する。
【0054】
旧来の低分子／ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列は、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６）を含むベクターから細胞核の内部で通常転写される。内因性Ｕ６プロモーターは通常、Ｕ６ ＲＮＡ（スプライシングに関与する低分子ＲＮＡ）の発現を制御し、十分に特徴づけられている（Ｋｕｎｋｅｌら．， Ｎａｔｕｒｅ． ３２２（６０７４）：７３－７ （１９８６）； Ｋｕｎｋｅｌら．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ２（２）：１９６－２０４ （１９８８）； Ｐａｕｌｅら．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８（６）：１２８３－９８ （２０００））。本開示は、マウスおよびヒト両方のＵ６またはＨ１プロモーターを含む。ループによって接続された標的遺伝子からのセンス配列およびアンチセンス配列を含むｓｈＲＮＡは、核から、ＤｉｃｅｒがこれをｓｉＲＮＡへと処理する場所である細胞質へと輸送される。
【0055】
本開示のいくつかの局面において、ＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤が使用される。ＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤とは、ＳＯＲＤコード配列もしくは調節エレメントおよび／またはＳＯＲＤ遺伝子と関連する非コード領域を改変して、配列の中で所望の変化を達成し得る薬剤に言及する。種々の局面において、ゲノム編集は、ＳＯＲＤ遺伝子配列のうちの一部もしくは全てを置き換えるか、またはＳＯＲＤタンパク質発現レベルを変化させるために、使用され得る。種々の実施形態において、上記薬剤は、ゲノム編集技術（例えば、デザイナージンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート－ＣＲＩＳＰＲ関連）システムにおいて使用される構成成分を含み得る。本開示の方法における使用のための例示的な薬剤は、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡである。Ｃａｓ９およびｇＲＮＡは、単一発現ベクターまたは別個の発現ベクターの中に存在し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのアデノウイルス送達は、Ｈｏｌｋｅｒｓら．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１４）， １１（１０）：１０５１－１０５７（これは、その全体において参照により援用される）に記載される。
【0056】
ＣＲＩＳＰＲシステムおよびＣａｓ９を記載する他の刊行物としては、以下が挙げられる：Ｃｏｎｇら． Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１３） ３３９：８１９－２３； Ｊｉｎｅｋら．， Ｅｌｉｆｅ． （２０１３） ２：ｅ００４７１； Ｌｅｉら． Ｃｅｌｌ （２０１３） １５２： １１７３－１１８３； Ｇｉｌｂｅｒｔら． Ｃｅｌｌ （２０１３） １５４：４４２－５１； Ｌｅｉら． Ｅｌｉｆｅ （２０１４） ３：ｅ０４７６６； Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｌａら． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１３） １０： ９７３－９７６； Ｍａｉｄｅｒら． Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ （２０１３） １０， ９７７－９７９； 米国特許第８，６９７，３５９号；同第８，７７１，９４５号；同第８，７９５，９６５号；同第８，８６５，４０６号；同第８，８７１，４４５号；同第８，８８９，３５６号；同第８，８９５，３０８号；同第８，９０６，６１６号；同第８，９３２，８１４号；同第８，９４５，８３９号；同第８，９９３，２３３号；同第８，９９９，６４１号；米国特許公開番号２０１４／００６８７９７；および国際特許公開番号ＷＯ ２０１４／１９７５６８（全て、それらの全体において参照により援用される）。
【0057】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９多重化は、２またはこれより多くのガイドＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ １０１：Ａ Ｄｅｓｋｔｏｐ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ （１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， Ａｄｄｇｅｎｅ， Ｊａｎｕａｒｙ ２０１６（これは、その全体において参照により援用される）に記載されるように発現される複数のゲノム遺伝子座を標的とするために使用され得る。
【0058】
用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、遺伝性ニューロパチーおよび／または関連障害および／またはこれらと関連する症状を低減または改善することに言及する。これらの用語は、上記ニューロパチーまたはこれと関連する症状の発生または再発の頻度を低減または遅らせる（すなわち、その障害に罹患した患者における寛解の期間を長くする）、ならびに上記障害またはこれと関連する任意の障害の重症度を低減することを含む。排除はされないが、障害または状態を「処置すること」または「処置」は、その障害、状態、またはこれと関連する症状が、完全に排除されることを要求しないことは、認識される。
【0059】
活性薬剤（例えば、アルドースレダクターゼインヒビター、アルドースレダクターゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＳＯＲＤペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＳＯＲＤペプチド、変異型ＳＯＲＤ遺伝子の発現を遮断する薬剤、またはＳＯＲＤ遺伝子における変異を矯正する薬剤）の用量は、投与経路（例えば、局所 対 全身）、患者の特性（例えば、性別、体重、健康状態、副作用）、遺伝性ニューロパチーまたは関連障害の性質および程度、ならびに特定の活性薬剤または投与のために選択された活性薬剤の組み合わせのような要因に依存する。
【0060】
本明細書で記載される活性薬剤は、被験体への投与に適した製剤構成成分、およびさらなる治療剤を含み得る組成物（例えば、薬学的に受容可能な組成物）中に提供される。薬学的に受容可能な組成物（例えば、本明細書で記載される薬剤を含む医薬組成物）の適切な投与方法は、当該分野で周知である。種々の局面において、１より多くの経路が、本明細書で開示される薬剤のうちの１またはこれより多くを投与するために使用され得る。特定の経路が、別の経路よりも即座のかつ効果的な反応を提供し得る。例えば、ある特定の状況において、上記組成物を経口的に；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病変内、髄内、髄腔内（intrathecal）、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸的、局所的、舌下、尿道、膣、もしくは直腸手段による；制御された、遅延した、徐放のもしくは別の方法で改変された放出システムによる；移植デバイスによる；ナノ粒子を使用する；またはコンジュゲートとしての注射または注入を通じて送達することは望ましい。
【0061】
本明細書で記載される２またはこれより多くの活性薬剤が治療レジメンの一部として投与され得ることは、企図される。代わりにまたはさらに、上記活性薬剤のうちの１またはこれより多くが、治療レジメンの一部として他の治療剤とともに投与され得る。上記活性薬剤（複数可）は、単剤療法として、または同時にもしくは規則正しく（metronomically）投与される他の処置との併用療法として、投与され得る。用語「同時の」または「同時に」とは、２種の薬剤を６時間以内またはそれ未満で（例えば、互いに３時間以内または１時間以内）に投与することに言及する。この点において、複数の活性（または治療）薬剤が、同じ組成物の中で、または短期間内に（例えば、３０分以内に）提供される別個の組成物において投与され得る。用語「規則正しく」とは、異なる薬剤を異なる時間でかつ反復投与に関連する頻度で投与することを意味する。活性薬剤は、同じ時間にまたは同じ経路によって投与される必要はない；好ましくは、種々の実施形態において、異なる活性薬剤がそれらの治療効果を発揮している期間において重複が存在する。本開示のさらなる局面および詳細は、以下の実施例から明らかであり、この実施例は、例証であって限定ではないことが意図される。
【実施例】
【0062】
一般的方法
家族
全ての家族に、書面によるインフォームド・コンセントを提供して、試験に参加してもらった。その試験プロトコールは、提供機関の機関内審査委員会による承認を得た。全ての患者は、神経科医によって臨床的に評価された。
家族
全ての家族に、書面によるインフォームド・コンセントを提供して、試験に参加してもらった。その試験プロトコールは、提供機関の機関内審査委員会による承認を得た。全ての患者は、神経科医によって臨床的に評価された。
【0063】
全エキソームおよびサンガーシーケンシング
全エキソームシーケンシングを、散発性および劣性のＣＭＴおよびｄＨＭＮ家族の指標個体において行った。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ ５０ ＭＢ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、液中富化（ｉｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のために使用し、ＨｉＳｅｑ ２５００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、約１２０ｂｐペアエンド配列リードを生成した。Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ ａｌｉｇｎｅｒ、およびＦｒｅｅｂａｙｅｒｓを使用して、配列リードのアラインメントおよびバリアントコールを行った。最終的なデータを、分析のためにＧＥＮＥＳＩＳソフトウェアにアップロードした。同じホモ接合性バリアントを共有する家族の検索のためのフィルタリングアプローチを、データベースの中の全エキソームにわたって適用した。サンガーシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓが行った）は、ＳＯＲＤバリアントの分離を確認した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｖｅｒｉｔｉ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で行い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、標的変異を含む領域を増幅した。以下のプライマーを使用して、ＳＯＲ２ＰではなくＳＯＲＤを特異的に標的とした（図１０）。
全エキソームシーケンシングを、散発性および劣性のＣＭＴおよびｄＨＭＮ家族の指標個体において行った。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ａｌｌ Ｅｘｏｎ ５０ ＭＢ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、液中富化（ｉｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のために使用し、ＨｉＳｅｑ ２５００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、約１２０ｂｐペアエンド配列リードを生成した。Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ ａｌｉｇｎｅｒ、およびＦｒｅｅｂａｙｅｒｓを使用して、配列リードのアラインメントおよびバリアントコールを行った。最終的なデータを、分析のためにＧＥＮＥＳＩＳソフトウェアにアップロードした。同じホモ接合性バリアントを共有する家族の検索のためのフィルタリングアプローチを、データベースの中の全エキソームにわたって適用した。サンガーシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓが行った）は、ＳＯＲＤバリアントの分離を確認した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、Ｖｅｒｉｔｉ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で行い、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、標的変異を含む領域を増幅した。以下のプライマーを使用して、ＳＯＲ２ＰではなくＳＯＲＤを特異的に標的とした（図１０）。
【0064】
線維芽細胞培養
線維芽細胞を患者から得て、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した。細胞を、５％ ＣＯ２中、３７℃で加湿インキュベーターの中で維持した。非同期細胞培養物を、およそ８０％コンフルエントになるまで成長させ、エパルレスタット（１００μＭ）、ラニレスタット（１０μＭ）またはＤＭＳＯで７２時間処理した。上記薬物またはＤＭＳＯを含む培地を、２４時間ごとに交換した。
線維芽細胞を患者から得て、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で培養した。細胞を、５％ ＣＯ２中、３７℃で加湿インキュベーターの中で維持した。非同期細胞培養物を、およそ８０％コンフルエントになるまで成長させ、エパルレスタット（１００μＭ）、ラニレスタット（１０μＭ）またはＤＭＳＯで７２時間処理した。上記薬物またはＤＭＳＯを含む培地を、２４時間ごとに交換した。
【0065】
ウェスタンブロット
線維芽細胞を、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で溶解し、５分間、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ超音波デバイス（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）で超音波処理した。細胞溶解物を１３，０００×ｇで１０分間、４℃において遠心分離し、その上清を、タンパク質定量（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）のために集めた。３０μｇのタンパク質サンプルを、Ｂｏｌｔ ＬＤＳサンプル緩衝液およびサンプル還元剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と混合し、９０℃で５分間加熱した。サンプルを、Ｂｏｌｔ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓミニゲルにロードし、続いて、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写した。膜を５％ 無脂肪乳でブロッキングし、抗ＳＯＲＤ（ａｂ１８９２４８， Ａｂｃａｍ）抗体とともに２時間インキュベートし、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＴＢＳ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で洗浄し、二次抗ウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともにインキュベートした。膜を、続いて、ＧＡＰＤＨ一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）および二次抗マウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともにインキュベートした。化学発光検出を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで行い、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｅ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）で画像化した。
線維芽細胞を、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で溶解し、５分間、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ超音波デバイス（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）で超音波処理した。細胞溶解物を１３，０００×ｇで１０分間、４℃において遠心分離し、その上清を、タンパク質定量（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）のために集めた。３０μｇのタンパク質サンプルを、Ｂｏｌｔ ＬＤＳサンプル緩衝液およびサンプル還元剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と混合し、９０℃で５分間加熱した。サンプルを、Ｂｏｌｔ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓミニゲルにロードし、続いて、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写した。膜を５％ 無脂肪乳でブロッキングし、抗ＳＯＲＤ（ａｂ１８９２４８， Ａｂｃａｍ）抗体とともに２時間インキュベートし、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含むＴＢＳ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で洗浄し、二次抗ウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともにインキュベートした。膜を、続いて、ＧＡＰＤＨ一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）および二次抗マウス抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）とともにインキュベートした。化学発光検出を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで行い、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｅ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）で画像化した。
【0066】
ソルビトール測定
線維芽細胞を集め、ウェスタンブロットの節で記載されるように、プロテイナーゼインヒビターの非存在下で溶解した。ヒト線維芽細胞溶解物中のソルビトールの決定を、超高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＆ ＴＱＤ質量分析計－ Ｗａｔｅｒｓ， Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ， ＵＳＡ）で行った。線維芽細胞を集め、ウェスタンブロットの節で記載されるように、プロテイナーゼインヒビターの非存在下で溶解した。プロテイナーゼインヒビターは、高濃度マンニトール（マンニトールはソルビトールのエナンチオマーである）を含み、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳソルビトール決定に干渉する可能性がある。溶解物サンプルは、ＵＰＬＣに注入（３μＬ）する前に、アセトニトリル（１：５）でタンパク質沈殿およびアセトニトリル－水（５０／５０）での１０倍希釈、およびＯａｓｉｓ ＨＬＢカートリッジでのクリーンアップ（１０ｍｇ／１ｍｌ）を受けた。ＵＰＬＣ条件： カラム， ８８℃でＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７μｍ（２．１×１００ｍｍ）、溶離液Ａ， アセトニトリル ９０％－水 ５％－イソプロパノール ５％、溶離液Ｂ， アセトニトリル ８０％－水２０％、勾配溶離０分， １００％ Ａ、３．６分 １００％ Ｂ、流速 ０．４５ｍｌ／分。ソルビトールの保持時間は、２．７分であった。ＭＳ／ＭＳ条件： インターフェース， 陰イオンモードにおいてエレクトロスプレーインターフェース、多重反応モニタリング収集（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）， ｍ／ｚ １８０．９→８８．９（ＣＶ ２４， ＣＥ １５）。
線維芽細胞を集め、ウェスタンブロットの節で記載されるように、プロテイナーゼインヒビターの非存在下で溶解した。ヒト線維芽細胞溶解物中のソルビトールの決定を、超高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＆ ＴＱＤ質量分析計－ Ｗａｔｅｒｓ， Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ， ＵＳＡ）で行った。線維芽細胞を集め、ウェスタンブロットの節で記載されるように、プロテイナーゼインヒビターの非存在下で溶解した。プロテイナーゼインヒビターは、高濃度マンニトール（マンニトールはソルビトールのエナンチオマーである）を含み、ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳソルビトール決定に干渉する可能性がある。溶解物サンプルは、ＵＰＬＣに注入（３μＬ）する前に、アセトニトリル（１：５）でタンパク質沈殿およびアセトニトリル－水（５０／５０）での１０倍希釈、およびＯａｓｉｓ ＨＬＢカートリッジでのクリーンアップ（１０ｍｇ／１ｍｌ）を受けた。ＵＰＬＣ条件： カラム， ８８℃でＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７μｍ（２．１×１００ｍｍ）、溶離液Ａ， アセトニトリル ９０％－水 ５％－イソプロパノール ５％、溶離液Ｂ， アセトニトリル ８０％－水２０％、勾配溶離０分， １００％ Ａ、３．６分 １００％ Ｂ、流速 ０．４５ｍｌ／分。ソルビトールの保持時間は、２．７分であった。ＭＳ／ＭＳ条件： インターフェース， 陰イオンモードにおいてエレクトロスプレーインターフェース、多重反応モニタリング収集（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）， ｍ／ｚ １８０．９→８８．９（ＣＶ ２４， ＣＥ １５）。
【0067】
空腹時ソルビトールレベル検査のために、一晩絶食（最後の食事は前夜）後に、血清分離チューブの中に血液を集めた。サンプルを、５００ｇで１０分間遠心分離した。血清を分離し、採血から１時間以内に凍結した。ソルビトールレベルを、Ｌｉら． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２００９ Ｏｃｔ ２；３８７（４）：７７８－８３から修正した方法を使用して、ＵＰＬＣによって検査した。条件は以下のとおりであった： カラム， ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ １．７μｍを２５℃で（４５℃の代わりに）維持； 溶離液Ａ， １０ｍＭ 酢酸アンモニウム ｐＨ１０； 溶離液Ｂ， アセトニトリル、流速， ０．６ｍｌ／分で２０回の同じ勾配。ソルビトールの保持時間は、６．０分であった。ＭＳ／ＭＳ条件は、線維芽細胞分析のものと同じであった。血清サンプルは、ＵＰＬＣに注入（３μＬ）する前に、冷メタノール（１：５）でタンパク質沈殿、アセトニトリル－水（５０／５０）で５倍希釈およびＯａｓｉｓ ＨＬＢカートリッジでクリーンアップ（１０ｍｇ／１ｍｌ）を受けた。較正曲線を、ソルビトール濃度範囲０．１～２０ｍｇ／Ｌにおいて血清中で作成した。
【0068】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａストックおよび遺伝学
特定されなければ、全てのハエは、コーンミール－糖蜜－酵母培地上で、２５℃で６５％湿度において、１２時間明／１２時間暗サイクルで維持した。この試験において使用した以下のハエ系統は、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから得た： ｅｌａｖＣ１５５－ＧＡＬ４、ＧＭＲ－ＧＡＬ４， Ｓｄｈ２ＭＢ０１２６５、ＵＡＳ－Ｓｄｈ１ＲＮＡｉ、およびＵＡＳ－Ｓｄｈ２ＲＮＡｉ。
特定されなければ、全てのハエは、コーンミール－糖蜜－酵母培地上で、２５℃で６５％湿度において、１２時間明／１２時間暗サイクルで維持した。この試験において使用した以下のハエ系統は、Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから得た： ｅｌａｖＣ１５５－ＧＡＬ４、ＧＭＲ－ＧＡＬ４， Ｓｄｈ２ＭＢ０１２６５、ＵＡＳ－Ｓｄｈ１ＲＮＡｉ、およびＵＡＳ－Ｓｄｈ２ＲＮＡｉ。
【0069】
薬物供給
エパルレスタットまたはラニレスタットを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解してストック濃度 １０ｍｇ／ｍｌを達成し、次いで、１０ｍｌ ハエ飼料の中に最終濃度８０μｇ／ｍｌで混合した。コントロールとして、等量のＤＭＳＯをハエ飼料の中に混合した。供給する前に、バイアルを室温で１２時間乾燥させた。
エパルレスタットまたはラニレスタットを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解してストック濃度 １０ｍｇ／ｍｌを達成し、次いで、１０ｍｌ ハエ飼料の中に最終濃度８０μｇ／ｍｌで混合した。コントロールとして、等量のＤＭＳＯをハエ飼料の中に混合した。供給する前に、バイアルを室温で１２時間乾燥させた。
【0070】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ寿命アッセイおよび負の走地性アッセイ
寿命アッセイに関しては、各群の１００匹の新たに閉じ込めた雌性ハエを集め、２０の個体のバイアルに入れた。ハエを２日ごとに新たなバイアルの中に移し、死んだハエの数を計数した。生存データを、カプラン－マイアープロットを使用してプロットし、ログランク検定を使用して群間比較を行った。負の走地性行動アッセイ（negative geotaxis behavior assay）に関しては、１０匹の年齢を合わせた雌性ハエを、底から８ｃｍ上に黒の水平線を引いて印を付けたバイアルの中に入れた。ハエに、ＣＯ２麻酔から完全回復するために６０分間を与え、底面を穏やかにタップして、１０秒間を与えて登らせた。８ｃｍの線を越えたハエを計数した。各バイアルに関して、このアッセイを１０回反復し、各群１０個の独立したバイアル（１群あたり合計１００匹のハエ）を試験した。観察者期待バイアスを最小限にするために、このアッセイは、実験者には群割り当てを盲検にして行われた。
寿命アッセイに関しては、各群の１００匹の新たに閉じ込めた雌性ハエを集め、２０の個体のバイアルに入れた。ハエを２日ごとに新たなバイアルの中に移し、死んだハエの数を計数した。生存データを、カプラン－マイアープロットを使用してプロットし、ログランク検定を使用して群間比較を行った。負の走地性行動アッセイ（negative geotaxis behavior assay）に関しては、１０匹の年齢を合わせた雌性ハエを、底から８ｃｍ上に黒の水平線を引いて印を付けたバイアルの中に入れた。ハエに、ＣＯ２麻酔から完全回復するために６０分間を与え、底面を穏やかにタップして、１０秒間を与えて登らせた。８ｃｍの線を越えたハエを計数した。各バイアルに関して、このアッセイを１０回反復し、各群１０個の独立したバイアル（１群あたり合計１００匹のハエ）を試験した。観察者期待バイアスを最小限にするために、このアッセイは、実験者には群割り当てを盲検にして行われた。
【0071】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ脳解剖、免疫染色、および共焦点顕微鏡検査
脳解剖および染色を、以前に記載されるように行った（Ｂｒａｚｉｌｌら．， Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ． ２０１８；（１３８））。簡潔には、ハエの脳を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ， ｐＨ ７．４）中で解剖し、４％ ホルムアルデヒド中で１０分間固定し、ＰＢＴＸ（０．４％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）中で３回（各１５分間）洗浄した。次いで、脳を、５％ 正常ヤギ血清を含む０．４％ ＰＢＴＸ中で１：２５０希釈した一次マウス抗ＢＲＰ抗体（ｎｃ８２， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）とともに４℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートした。その後、脳を、１：２５０希釈したＣｙ３コンジュゲート抗マウス二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）およびＣｙ５コンジュゲート抗ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＬａｂ）とともに、４℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートし、続いて、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ， １：３００， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色を室温で１０分間行った。サンプルを、ガラススライド上にＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）とともに載せた。ハエの脳スライドを、スキャン速度８．０μｓ／画素および空間分解能１０２４×１０２４画素で、６０×油浸対物レンズ付きのＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１共焦点顕微鏡を使用して撮像した。画像を処理し、ＦｌｕｏＶｉｅｗ １０－ＡＳＷ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して分析した。
脳解剖および染色を、以前に記載されるように行った（Ｂｒａｚｉｌｌら．， Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ． ２０１８；（１３８））。簡潔には、ハエの脳を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ， ｐＨ ７．４）中で解剖し、４％ ホルムアルデヒド中で１０分間固定し、ＰＢＴＸ（０．４％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ）中で３回（各１５分間）洗浄した。次いで、脳を、５％ 正常ヤギ血清を含む０．４％ ＰＢＴＸ中で１：２５０希釈した一次マウス抗ＢＲＰ抗体（ｎｃ８２， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）とともに４℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートした。その後、脳を、１：２５０希釈したＣｙ３コンジュゲート抗マウス二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）およびＣｙ５コンジュゲート抗ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＬａｂ）とともに、４℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートし、続いて、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ， １：３００， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色を室温で１０分間行った。サンプルを、ガラススライド上にＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）とともに載せた。ハエの脳スライドを、スキャン速度８．０μｓ／画素および空間分解能１０２４×１０２４画素で、６０×油浸対物レンズ付きのＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８１共焦点顕微鏡を使用して撮像した。画像を処理し、ＦｌｕｏＶｉｅｗ １０－ＡＳＷ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して分析した。
【0072】
本開示のさらなる局面および詳細は、以下の実施例から明らかであり、この実施例は、例証であって限定ではないことが意図される。
【0073】
実施例１： ＧＥＮＥＳＩＳ分析を使用するＣＭＴにおけるＤＮＡバリアントの同定
遺伝性ニューロパチー（シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）を含む）は、末梢神経に影響を及ぼす臨床上および遺伝的に不均一な状態に関する包括的概念を表す。ＣＭＴは、伝導速度に応じて、脱髄型（ＣＭＴ１）および軸索型（ＣＭＴ２）として分類される。遠位型遺伝性運動ニューロパチー（ｄＨＭＮ）は、疾病負荷が主にまたは専ら運動神経にかかるＣＭＴ２の一形態を表す（Ｒｏｓｓｏｒ， Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ， ａｎｄ Ｒｅｉｌｌｙ ２０１６）。症例のうちの９０％超が既知の遺伝子における変異を有するＣＭＴ１とは対照的に、ＣＭＴ２および遠位型ＨＭＮ患者のうちの２０～３０％が、遺伝子診断を受けるに過ぎない（Ｆｒｉｄｍａｎら． ２０１５）。ＣＭＴ２およびｄＨＭＮ症例のうちの７０％までが散発性であることから、１つの症例の全エキソームおよびゲノム配列から候補の病原性遺伝子を同定することはより困難になる；従って、大きな集合的データセットが必要である。ＧＥＮＥＳＩＳ分析プラットフォームで利用可能な１，１００を超えるＣＭＴ全エキソームシーケンシング（ＷＥＳ）および全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）のデータ集約を使用することで、このような高品質データの最大の収集が利用可能になった（Ｇｏｎｚａｌｅｚら． ２０１５）。複数の家族に存在する有意なＤＮＡバリアントを有する遺伝子を、ＣＭＴ症例で大きな比率を占める個々のアレルと同様に同定した。＞３家族によって共有されかつｇｎｏｍＡＤコントロールデータベースにおけるマイナーアレル頻度＜１％を有する遺伝子における劣性のナンセンスバリアントに関して、５９８名の診断されていないＣＭＴ患者の部分セットを問い合わせする場合に、１２症例を、ＳＯＲＤにおいてホモ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）変異を有する１１の血縁でない家族から同定した。血縁でない３家族からさらに４症例が、ヘテロ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）バリアントを、第２のバリアント、家族２ではｃ．２９８Ｃ＞Ｔ； ｐ．（Ａｒｇ１００Ｔｅｒ）、家族３ではｃ．３２９Ｇ＞Ｃ； ｐ．（Ａｒｇ１１０Ｐｒｏ）、ならびに家族１４のＩＩ－１およびＩＩ－２ではｃ．４５８Ｃ＞Ａ； ｐ．（Ａｌａ１５３Ａｓｐ）と一緒に有した（図１Ａ～Ｄおよび図５）。全ての変異は、ｃ．３２９Ｇ＞Ｃ； ｐ．（Ａｒｇ１１０Ｐｒｏ）を除いて、機能喪失型（ＬＯＦ）アレルを表した。興味深いことに、Ａｒｇ１１０Ｐｒｏ変化は、以前に報告した、Ｔｙｒ１１１Ｐｈｅ（ラットにおけるＴｙｒ１１０Ｐｈｅに相当）（これは、ＳＯＲＤ酵素活性を消滅させ、タンパク質を不安定化することが示された（Ｈｅｌｌｇｒｅｎら． ２００７））に隣り合っている。
遺伝性ニューロパチー（シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）を含む）は、末梢神経に影響を及ぼす臨床上および遺伝的に不均一な状態に関する包括的概念を表す。ＣＭＴは、伝導速度に応じて、脱髄型（ＣＭＴ１）および軸索型（ＣＭＴ２）として分類される。遠位型遺伝性運動ニューロパチー（ｄＨＭＮ）は、疾病負荷が主にまたは専ら運動神経にかかるＣＭＴ２の一形態を表す（Ｒｏｓｓｏｒ， Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ， ａｎｄ Ｒｅｉｌｌｙ ２０１６）。症例のうちの９０％超が既知の遺伝子における変異を有するＣＭＴ１とは対照的に、ＣＭＴ２および遠位型ＨＭＮ患者のうちの２０～３０％が、遺伝子診断を受けるに過ぎない（Ｆｒｉｄｍａｎら． ２０１５）。ＣＭＴ２およびｄＨＭＮ症例のうちの７０％までが散発性であることから、１つの症例の全エキソームおよびゲノム配列から候補の病原性遺伝子を同定することはより困難になる；従って、大きな集合的データセットが必要である。ＧＥＮＥＳＩＳ分析プラットフォームで利用可能な１，１００を超えるＣＭＴ全エキソームシーケンシング（ＷＥＳ）および全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）のデータ集約を使用することで、このような高品質データの最大の収集が利用可能になった（Ｇｏｎｚａｌｅｚら． ２０１５）。複数の家族に存在する有意なＤＮＡバリアントを有する遺伝子を、ＣＭＴ症例で大きな比率を占める個々のアレルと同様に同定した。＞３家族によって共有されかつｇｎｏｍＡＤコントロールデータベースにおけるマイナーアレル頻度＜１％を有する遺伝子における劣性のナンセンスバリアントに関して、５９８名の診断されていないＣＭＴ患者の部分セットを問い合わせする場合に、１２症例を、ＳＯＲＤにおいてホモ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）変異を有する１１の血縁でない家族から同定した。血縁でない３家族からさらに４症例が、ヘテロ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）バリアントを、第２のバリアント、家族２ではｃ．２９８Ｃ＞Ｔ； ｐ．（Ａｒｇ１００Ｔｅｒ）、家族３ではｃ．３２９Ｇ＞Ｃ； ｐ．（Ａｒｇ１１０Ｐｒｏ）、ならびに家族１４のＩＩ－１およびＩＩ－２ではｃ．４５８Ｃ＞Ａ； ｐ．（Ａｌａ１５３Ａｓｐ）と一緒に有した（図１Ａ～Ｄおよび図５）。全ての変異は、ｃ．３２９Ｇ＞Ｃ； ｐ．（Ａｒｇ１１０Ｐｒｏ）を除いて、機能喪失型（ＬＯＦ）アレルを表した。興味深いことに、Ａｒｇ１１０Ｐｒｏ変化は、以前に報告した、Ｔｙｒ１１１Ｐｈｅ（ラットにおけるＴｙｒ１１０Ｐｈｅに相当）（これは、ＳＯＲＤ酵素活性を消滅させ、タンパク質を不安定化することが示された（Ｈｅｌｌｇｒｅｎら． ２００７））に隣り合っている。
【0074】
興味深いことに、ＳＯＲＤは、非機能的な高度に相同性のパラログ、偽遺伝子ＳＯＲＤ２Ｐを有し、この偽遺伝子は、第１５染色体上の０．５Ｍｂ領域内でのＳＯＲＤの重複から生じると考えられる（Ｃａｒｒら． ２０１６）（図１Ｅ）。Ｓａｎｇｅｒ確認試験においてＳＯＲＤ２Ｐではなく、ＳＯＲＤを特異的に増幅するために、プライマーを、両方の遺伝子領域においてヌクレオチド配列差異および別個のレトロトランスポゾン挿入を利用してデザインした（図５）。顕著なことには、ＳＯＲＤのエキソン７におけるｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）変異は、多くのさらなるエキソンインデル変異（これは、ＳＯＰＲ２Ｐの効果的な翻訳を防止する（１０００ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍら． ２０１５； Ｌｅｋら． ２０１６））とともに、コントロール染色体の９５％超において偽遺伝子ＳＯＲＰ２Ｐの中に固定される。上記領域の高い類似性が原因で、ネスト化ＰＣＲアプローチは、ＳＯＲＤのエキソン７の特異的増幅を得、それをＳＯＲＤ２Ｐにおける相同領域から区別することが必要であった。ＷＥＳによって検出されたバリアントの存在は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによって全症例で確認され、直近親族のキャリアにおける分離データを提供した（図１Ｆおよび図５）。
【0075】
（ロンドン（ＵＫ）のＵＣＬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）での１０３の未解明のＣＭＴ２／ｄＨＭＮ症例のＷＥＳの独立したセットをスクリーニングした。血縁でない６家族から、ＳＯＲＤにおいてホモ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）変異を有する９症例を同定した（８．７％）。２９７名の劣性または散発性のＣＭＴ２／ｄＨＭＮ患者の第３の独立したセットを、ＳＯＲＤのエキソン７の標的化Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによってスクリーニングし、これを、１つのｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）が同定された場合に他のコードエキソンに拡げたところ、ＳＯＲＤにおいて両アレル変異を有する１８家族から２０の追加症例（７％）が明らかになった：１６症例は、ホモ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）変異を有し、４症例は、ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）を、第２のおそらく病原性バリアントとの複合性ヘテロ接合性状態において有する。後者は、家族２９においてｃ．９６４Ｇ＞Ａ； ｐ．（Ｖａｌ３２２Ｉｌｅ）を、家族３０においてエキソン４中の２７５ｂｐ欠失 ｃ．３１６＿４２５＋１６５ｄｅｌを、家族３２において新規なｃ．２８Ｃ＞Ｔ； ｐ．（Ｌｅｕ１０Ｐｈｅ）を、および家族３３においてｃ．８９５Ｃ＞Ｔ； ｐ．（Ａｒｇ２９９Ｔｅｒ）を含んだ。全ての変化は、ｇｎｏｍＡＤにおいてマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）＜０．０００１を有する（Ｌｅｋら． ２０１６）。ミスセンス変異によって影響を及ぼされた残基は、３より大きいＧＥＲＰスコアを有する複数の種にわたって高度に保存されている（図１Ｄ）。さらに、ＳＯＲＤにおける両アレルのナンセンスバリアントは、ＧＥＮＥＳＩＳデータベースの中に存在するＣＭＴ以外の別個の神経学的障害に罹患した４，５９８の指標症例には存在しなかった。
【0076】
正常集団におけるｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）バリアントのアレルキャリア頻度は、ｇｎｏｍＡＤゲノムの中の３０，８７２のうち９４というアレル数に基づいて０．００３％である（Ｌｅｋら． ２０１６）。注目すべきは、ｇｎｏｍＡＤエキソームセットは、ランダムフォレストフィルターを通過しなかったことに起因して、ＭＡＦ＝０．００００８において有意に低い割合でｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）変化を検出した。ＧＥＮＥＳＩＳは、バリアントコーリングにＦｒｅｅＢａｙｅｓソフトウェアを使用する（Ｇｏｎｚａｌｅｚら． ２０１５）。これは、ｇｎｏｍＡＤゲノムベースのコールセット（ＭＡＦＧＥＮＥＳＩＳ＝０．００２、９，１９６のうち２２）により近いアレル頻度を生じた可能性がある。６００の健常コントロールのＳａｎｇｅｒシーケンシングを行い（欧州起源の２００のサンプル、トルコ起源の１００のサンプル、および中東起源の２００のサンプルを含む）、３つのヘテロ接合性を同定したが、ホモ接合性、ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）アレルは同定されなかった（ＭＡＦ＝０．００２５）。これらの計算は、約１／１００，０００個体というホモ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）アレル単独の予測有症率を裏付け、このことは、そのアレルを軸索型ニューロパチーにおいて最も一般的な個々の病原性アレルかつ任意のメンデル疾患の最も一般的なアレルのうちの１つにしている。
【0077】
血縁でない３８家族から、遺伝性ニューロパチーに冒された全４５名の個体を本試験においてＳＯＲＤにおいて両アレル変異を有すると同定した（図１１および１２）。注目すべきは、症例のうちの７１％が、家族歴または血族の証拠もない散発性であった。正式の臨床診断は、症例のうちの５１％（ｎ＝１６）において軸索型ＣＭＴ、４０％（ｎ＝１８）において遠位型ＨＭＮ、および９％（ｎ＝４）において中間型ＣＭＴであてた。ニューロパチーの平均発症年齢は、１７±８歳であり、歩行困難が、発症時の最も共通する主訴であった。運動発達のマイルストーンの遅滞は希であったが、患者のうちの２／３が、足の変形を報告した。これは、ニューロパチーが、おそらく人生の早い時期に始まったことを示す。最初の試験において、全個体が、四肢の虚弱を有したが、半数のみが感覚障害を示した。虚弱は、上肢遠位において軽度であり、下肢遠位では、軽度からほぼ完全な麻痺までの範囲に及んだ。上肢および下肢の近位の筋は、代表的には影響を及ぼされていなかった。７名の患者は上肢の振戦を有し、４名は軽度側弯症を有し、２名は軽度難聴を有した。１症例は、同時の、おそらく関連のない、異形成顔貌（ｄｙｓｍｏｒｐｈｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ）、３歳齢以来の非進行性の精神遅滞、および脳ＭＲＩで小脳萎縮の証拠がある痙性運動失調を含む症候性の障害を有した。患者はいずれも、白内障も他の器官の関与もなかった。ＣＭＴニューロパチースコアによれば、ニューロパチーは、６７％（ｎ＝３０）が軽度、３１％（ｎ＝１４）が中程度、および１症例が重度であった。患者のうちの４２％（ｎ＝１９）が、歩行時に足を支えるために短下肢装具を必要とし、１名の患者は、片側の支持を必要とし、１名の患者は、車椅子に依存した。詳細な神経伝導試験は、４２名の患者において利用可能であり、常に運動性軸索型ニューロパチーを示し、２６％（ｎ＝１１）では中程度の神経伝導速度の低下および２６％（ｎ＝６５）では感覚活動電位の低下が伴った。
【0078】
実施例２： ヒト線維芽細胞におけるＳＯＲＤタンパク質発現および血中のＳＯＲＤレベルの評価
ソルビトールデヒドロゲナーゼは、３８ｋＤａサブユニットのホモテトラマー酵素であり、これは、哺乳動物組織において広く分布している（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら． ２００１； Ｈｅｌｌｇｒｅｎら． ２００７； Ｌｉｎｄｓｔａｄ， Ｔｅｉｇｅｎ， ａｎｄ Ｓｋｊｅｌｄａｌ ２０１３）。それは、２段階ポリオール経路の第２の酵素を表し、その経路においてグルコースは、酵素アルドースレダクターゼ（ＡＲ）によって、比較的非代謝性の糖であるソルビトールに変換される。次いで、ソルビトールは、ＳＯＲＤによってフルクトースへと酸化される（図２Ａ）。さらなる洞察をＳＯＲＤにおける劣性変異の機能的結論へと集めるために、次のＳＯＲＤ発現を、ホモ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）（ｎ＝４）またはｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）およびｃ．８９５Ｃ＞Ｔ； ｐ．（Ａｒｇ２９９Ｔｅｒ）（ｎ＝１）バリアントを有する血縁でない５名の罹患被験体、ならびにヘテロ接合性状態においてｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）の２名の非罹患キャリアに由来する線維芽細胞において評価した。ＳＯＲＤタンパク質は、全患者において存在せず、野生型レベルは、コントロールと比較して、非罹患キャリアにおいて低減した（図２Ｂ）。よって、細胞内ソルビトール濃度は、ＳＯＲＤ酵素活性の喪失と一致して、コントロールと比較して患者の線維芽細胞において１０倍を超えて高かった（図２Ｃ）。ホモ接合性ｐ．Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７変異を有する１０名の患者および血縁でない１０名のコントロールに由来する血清中の空腹時ソルビトールレベルを決定したところ、１００倍を超えて高い（１４．８２±０．７８０ 対 ０．０４６±０．００４ｍｇ／Ｌ， ｐ＜０．０００１）ことが見出された。これは、患者においてＳＯＲＤ酵素活性を欠いていることを確認する（図１３）。この試験はまた、ソルビトールが、哺乳動物被験体においてＳＯＲＤ変異と関連する遺伝性ニューロパチーを検出または特徴づけるために有用なマーカーであることを示す。
ソルビトールデヒドロゲナーゼは、３８ｋＤａサブユニットのホモテトラマー酵素であり、これは、哺乳動物組織において広く分布している（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら． ２００１； Ｈｅｌｌｇｒｅｎら． ２００７； Ｌｉｎｄｓｔａｄ， Ｔｅｉｇｅｎ， ａｎｄ Ｓｋｊｅｌｄａｌ ２０１３）。それは、２段階ポリオール経路の第２の酵素を表し、その経路においてグルコースは、酵素アルドースレダクターゼ（ＡＲ）によって、比較的非代謝性の糖であるソルビトールに変換される。次いで、ソルビトールは、ＳＯＲＤによってフルクトースへと酸化される（図２Ａ）。さらなる洞察をＳＯＲＤにおける劣性変異の機能的結論へと集めるために、次のＳＯＲＤ発現を、ホモ接合性ｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）（ｎ＝４）またはｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）およびｃ．８９５Ｃ＞Ｔ； ｐ．（Ａｒｇ２９９Ｔｅｒ）（ｎ＝１）バリアントを有する血縁でない５名の罹患被験体、ならびにヘテロ接合性状態においてｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）の２名の非罹患キャリアに由来する線維芽細胞において評価した。ＳＯＲＤタンパク質は、全患者において存在せず、野生型レベルは、コントロールと比較して、非罹患キャリアにおいて低減した（図２Ｂ）。よって、細胞内ソルビトール濃度は、ＳＯＲＤ酵素活性の喪失と一致して、コントロールと比較して患者の線維芽細胞において１０倍を超えて高かった（図２Ｃ）。ホモ接合性ｐ．Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７変異を有する１０名の患者および血縁でない１０名のコントロールに由来する血清中の空腹時ソルビトールレベルを決定したところ、１００倍を超えて高い（１４．８２±０．７８０ 対 ０．０４６±０．００４ｍｇ／Ｌ， ｐ＜０．０００１）ことが見出された。これは、患者においてＳＯＲＤ酵素活性を欠いていることを確認する（図１３）。この試験はまた、ソルビトールが、哺乳動物被験体においてＳＯＲＤ変異と関連する遺伝性ニューロパチーを検出または特徴づけるために有用なマーカーであることを示す。
【0079】
実施例３： ＳＯＲＤ欠損症のモデルにおけるＳＯＲＤ変異の調査
ＳＯＲＤ変異の病態生理をインビボでさらに調査するために、ＳＯＲＤ欠損症のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒモデルを樹立した。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａは、９０％ 残基同一性を共有する２つの機能的ＳＯＲＤ遺伝子（Ｓｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２）を有する（Ｌｕｑｕｅら． １９９８）。ＳＯＲＤは、遠い系統間で保存されており、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓｏｄｈ１（ＮＰ＿００１２８７２０３．１）およびＳｏｄｈ２（ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿５２４３１１．１）によってコードされるタンパク質は、ヒトＳＯＲＤタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿００３０９５．２（配列番号４６））と、それぞれ、７５％および７３％の同一性を共有する。Ｓｏｄｈ２の変異型アレルは、その遺伝子がトランスポゾンＭｉｎｏｓ媒介性組み込みカセット（ＭｉＭＩＣ）挿入（Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５）によって破壊される場合に得られる（Ｂｅｌｌｅｎら． ２０１１）。ホモ接合性Ｓｏｄｈ２（Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５）変異体は、正常の寿命で生存できる。神経変性性表現型を特徴づけるために、そのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの視覚系を使用して、微細なニューロンおよびシナプスの病理的変化のインビボ検出を可能にする複眼の高度に組織化された平行軸索を利用した（Ｂａｕｓｅｎｗｅｉｎ， Ｄｉｔｔｒｉｃｈ， ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ １９９２）。外側の光受容体軸索は、視葉板皮質を横断し、視葉板の層における視葉板の単極性ニューロンとのシナプス接続を作る（図３Ａ）。羽化後２日（ＤＡＥ）のコントロールハエ（ｙｗ）において、光受容体シナプスの組織化された視葉板カートリッジが、それぞれ、ｘｙ面およびｘｚ面において可視化され得る（図３Ｂ）。Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５変異体の視葉板層における光受容体末端の喪失は、羽化後２日（ＤＡＥ）で観察された（図３Ｃ）。その表現型は、１０ ＤＡＥで進行性に重篤になり、空胞は、数がより多く、サイズがより大きくなり、シナプス視葉板層にわたって分布した（図３Ｃ、Ｄ）。これらの空胞は、ニューロン膜の喪失（ＨＲＰ標識によって顕著）、およびＢｒｕｃｈｐｉｌｏｔ（ＢＲＰ、シナプス活性ゾーンサイトマトリクスタンパク質）標識の減少を示した。これは、シナプス変性を示す（図３Ｃ、Ｄ）。本明細書で記載される所見を検証するために、第２のＳＯＲＤモデルを、汎ニューロン駆動因子ｅｌａｖＣ１５５を使用して、ニューロンにおけるＳｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２の両方の発現の特異的ノックダウンによって生成した。Ｓｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２の両方の喪失は、ホモ接合性Ｓｏｄｈ２（Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５）のものと同様に、年齢依存性シナプス変性を生じた（図６）。Ｓｏｄｈ２における機能を全身的に喪失した、ＳＯＲＤ欠損症の行動表現型Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５ ホモ接合性ハエを特徴付けたところ、これらのハエは、正常寿命を示したが、それらの自発運動活性は、後期ステージ（４０ ＤＡＥ）において有意に損なわれた（図３Ｅ、Ｆ）。これは、遺伝性ニューロパチーを思い起こさせる進行性の年齢依存性神経筋機能障害を示した。さらに、ソルビトールレベルを１０ ＤＡＥにおいてハエの頭部で測定したところ、患者線維芽細胞における観察と一致して、Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５モデルにおいて有意な増加を観察した（図４Ｂ）。まとめると、ＳＯＲＤ欠損症のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａモデルは、成功裡に樹立され、（１）正常寿命、（２）進行性かつ年齢依存性のシナプス変性および自発運動欠陥、ならびに（３）増加したソルビトールレベルを含め、ヒト患者における代表的病的表現型を再現した。
ＳＯＲＤ変異の病態生理をインビボでさらに調査するために、ＳＯＲＤ欠損症のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒモデルを樹立した。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａは、９０％ 残基同一性を共有する２つの機能的ＳＯＲＤ遺伝子（Ｓｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２）を有する（Ｌｕｑｕｅら． １９９８）。ＳＯＲＤは、遠い系統間で保存されており、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓｏｄｈ１（ＮＰ＿００１２８７２０３．１）およびＳｏｄｈ２（ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿５２４３１１．１）によってコードされるタンパク質は、ヒトＳＯＲＤタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列： ＮＰ＿００３０９５．２（配列番号４６））と、それぞれ、７５％および７３％の同一性を共有する。Ｓｏｄｈ２の変異型アレルは、その遺伝子がトランスポゾンＭｉｎｏｓ媒介性組み込みカセット（ＭｉＭＩＣ）挿入（Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５）によって破壊される場合に得られる（Ｂｅｌｌｅｎら． ２０１１）。ホモ接合性Ｓｏｄｈ２（Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５）変異体は、正常の寿命で生存できる。神経変性性表現型を特徴づけるために、そのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの視覚系を使用して、微細なニューロンおよびシナプスの病理的変化のインビボ検出を可能にする複眼の高度に組織化された平行軸索を利用した（Ｂａｕｓｅｎｗｅｉｎ， Ｄｉｔｔｒｉｃｈ， ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ １９９２）。外側の光受容体軸索は、視葉板皮質を横断し、視葉板の層における視葉板の単極性ニューロンとのシナプス接続を作る（図３Ａ）。羽化後２日（ＤＡＥ）のコントロールハエ（ｙｗ）において、光受容体シナプスの組織化された視葉板カートリッジが、それぞれ、ｘｙ面およびｘｚ面において可視化され得る（図３Ｂ）。Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５変異体の視葉板層における光受容体末端の喪失は、羽化後２日（ＤＡＥ）で観察された（図３Ｃ）。その表現型は、１０ ＤＡＥで進行性に重篤になり、空胞は、数がより多く、サイズがより大きくなり、シナプス視葉板層にわたって分布した（図３Ｃ、Ｄ）。これらの空胞は、ニューロン膜の喪失（ＨＲＰ標識によって顕著）、およびＢｒｕｃｈｐｉｌｏｔ（ＢＲＰ、シナプス活性ゾーンサイトマトリクスタンパク質）標識の減少を示した。これは、シナプス変性を示す（図３Ｃ、Ｄ）。本明細書で記載される所見を検証するために、第２のＳＯＲＤモデルを、汎ニューロン駆動因子ｅｌａｖＣ１５５を使用して、ニューロンにおけるＳｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２の両方の発現の特異的ノックダウンによって生成した。Ｓｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２の両方の喪失は、ホモ接合性Ｓｏｄｈ２（Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５）のものと同様に、年齢依存性シナプス変性を生じた（図６）。Ｓｏｄｈ２における機能を全身的に喪失した、ＳＯＲＤ欠損症の行動表現型Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５ ホモ接合性ハエを特徴付けたところ、これらのハエは、正常寿命を示したが、それらの自発運動活性は、後期ステージ（４０ ＤＡＥ）において有意に損なわれた（図３Ｅ、Ｆ）。これは、遺伝性ニューロパチーを思い起こさせる進行性の年齢依存性神経筋機能障害を示した。さらに、ソルビトールレベルを１０ ＤＡＥにおいてハエの頭部で測定したところ、患者線維芽細胞における観察と一致して、Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５モデルにおいて有意な増加を観察した（図４Ｂ）。まとめると、ＳＯＲＤ欠損症のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａモデルは、成功裡に樹立され、（１）正常寿命、（２）進行性かつ年齢依存性のシナプス変性および自発運動欠陥、ならびに（３）増加したソルビトールレベルを含め、ヒト患者における代表的病的表現型を再現した。
【0080】
作用機序および既知の酵素経路として機能喪失を確立した後に、ＳＯＲＤ関連遺伝性ニューロパチーの処置選択肢を調査した。アルドースレダクターゼ（ＳＯＲＤの上流にある酵素）の薬理学的阻害が、糖尿病の細胞モデルおよび動物モデル（Ｋｉｋｋａｗａら． １９８３； Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら． ２００８； Ｒａｍｉｒｅｚ ａｎｄ Ｂｏｒｊａ ２００８； Ｈａｏら． ２０１５； Ｇｒｅｗａｌら． ２０１６）、ならびに議論の余地はあるものの、同様にヒト（Ｃｈａｌｋ， Ｂｅｎｓｔｅａｄ， ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ２００７； Ｐｏｌｙｄｅｆｋｉｓら． ２０１５； Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉら． ２０１９）において毒性のソルビトール蓄積を低減する成功裡のストラテジーを表すことは、以前示された。２種の市販のアルドースレダクターゼインヒビター（ＡＲＩ）、エパルレスタットおよびラニレスタットの効果を、機能的ＳＯＲＤを欠いている患者線維芽細胞において細胞内ソルビトール蓄積に対して試験した。患者およびコントロールの線維芽細胞を、エパルレスタット（１００μＭ）またはラニレスタット（１０μＭ）の存在下または非存在下で７２時間成長させ、細胞内ソルビトールレベルを後に測定した。ＡＲＩであるエパルレスタットおよびラニレスタットはともに、ソルビトールの有意な低減を、コントロールに匹敵するレベルへと達成した（図４Ａ）。さらに、ＳＯＲＤのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａモデルに、２ ＤＡＥにおいて開始してエパルレスタットおよびラニレスタットを供給した。ソルビトールレベルの有意な低減が、１０ ＤＡＥにおいてＳｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５ハエの頭部で観察された（図４Ｂ）。重要なことには、Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５ハエならびにＳｏｄｈ１およびＳｏｄｈ２の両方のニューロン特異的ノックダウンを有するハエの自発運動活性は、ｙｗコントロールハエのレベルへと救済された（図４Ｃ、図７）。さらに、エパルレスタットまたはラニレスタット供給は、Ｓｏｄｈ２ＭＢ０１２６５／ＭＢ０１２６５変異型ハエにおける年齢依存性シナプス欠陥を回復させた。ＤＭＳＯビヒクル処置したハエでは、シナプス末端の喪失は、隣り合う空胞の拡大が、複数のシナプスカートリッジを含む融合した遙かに大きな空胞を生じた４０ ＤＡＥという高齢において非常に顕著であった（図４Ｄ）。著しくも、エパルレスタット／ラニレスタット供給は、空胞の数を低減し、１０ ＤＡＥおよび４０ ＤＡＥの両方において、シナプスサイトマトリクスタンパク質ＢＲＰの局在を回復させた（図４Ｅ～Ｇ）。
【0081】
まとめると、ＳＯＲＤは、軸索型／中間型の、運動優勢型（ｍｏｔｏｒ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）ＣＭＴを引きおこす新規な劣性遺伝子を表す。コホート由来のおよびコントロールデータベース由来の遺伝的データは、ＳＯＲＤにおける優勢な病原性バリアントであるｃ．７５７ｄｅｌＧ； ｐ．（Ａｌａ２５３ＧｌｎｆｓＴｅｒ２７）（キャリア頻度は、集団において約３／１，０００個体）が、劣性のメンデル疾患を引きおこす最も一般的な特異的アレルのうちの１つを表し得ることを示唆する。実際に、診断されていないＣＭＴ２およびｄＨＭＮ症例における頻度は、約１０％までであるが、それは、遺伝性の軸索型ニューロパチーにおける診断ギャップの有意な割合をおそらく説明する。それらの頻度にもかかわらず、ＳＯＲＤにおける変異が、以前の研究によってＣＭＴの原因として同定されていなかったことは、好奇心をそそるものである。ヒトＳＯＲＤ２Ｐ遺伝子重複の存在は、機能的ＳＯＲＤにおけるバリアントの検出を妨げた可能性がある。なぜなら利用可能な註釈プログラムが、現在の次世代シーケンシング技術によって生成される１５０～３００ｂｐ長のリードの特有のマッピングに高度に依存するからである。他の公知の病原性バリアントは、偽遺伝子の存在によって隠されていることが以前示された（Ｄｅ Ｖｏｓら． ２００４）。ＳＯＲＤ変異の病原性は、ＳＯＲＤタンパク質の非存在および細胞内ソルビトール蓄積を示した患者由来の線維芽細胞のインビトロデータによってさらに裏付けられる。２つのインビボＤｒｏｓｏｐｈｉｌａモデルは、進行性のシナプス変性および運動障害、ＳＯＲＤ欠損症、および増加したソルビトールレベルを有するヒト表現型を再現した。
【0082】
本明細書で記載される試験は、酵素の機能喪失およびその後のソルビトール蓄積が、ＳＯＲＤ関連ＣＭＴの作用機序であることを示す。糖尿病の細胞モデルおよび動物モデルにおける以前の研究は、増加したポリオール流入と細胞内ソルビトール蓄積とが、細胞の容量オスモル濃度の増加、酸化的ストレスおよび減少したＮＡＤＰＨレベルに平行しており、これらが全て、末梢神経に対して有害な効果を有し得ることを示した（Ｓｃｈｍｉｄｔら． ２００１； Ｏｂｒｏｓｏｖａ ２００５； Ｓａｎｇｏら． ２００６）。しかし、イントロンスプライシング変異に起因して低減したレベルのＳＯＲＤタンパク質を発現する成体Ｃ５７ＢＬ／ＬｉＡマウスに対する以前の研究から、明白な神経学的欠陥は同定されなかった（Ｈｏｌｍｅｓ， Ｄｕｌｅｙ， ａｎｄ Ｈｉｌｇｅｒｓ １９８２； Ｌｅｅ， Ｃｈｕｎｇ， ａｎｄ Ｃｈｕｎｇ １９９５； Ｎｇら． １９９８）。患者臨床データおよびハエにおける後期発症型表現型に基づくと、加齢しているＣ５７ＢＬ／ＬｉＡマウスに対する観察を拡張するか、または完全ノックアウトＳＯＲＤマウスもしくはラットモデルを作製することは、重要である。その研究はさらに、正常血糖状態における末梢神経代謝および生存におけるポリオール経路の中心的役割を解明する。細胞内ソルビトール蓄積が末梢神経の選択的変性をもたらし得る機序は未知であるが、この試験における患者由来細胞の増加したソルビトールレベルの観察には、基質低減、遺伝子置換または矯正、およびＳＯＲＤ酵素置換のための方法を含め、疾患の成体マーカーとして、および将来的な治療的介入の標的としての両方の有望な暗示がある。よって、ヒト由来細胞およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａモデルにおけるＡＲＩ適用を介して基質低減の有益な効果を示す前臨床試験が、本明細書で開示される。エパルレスタットは現在、糖尿病合併症の処置のために数カ国において市場で販売されている（Ｇｒｅｗａｌら． ２０１６）。その一方で、ラニレスタットは、臨床試験の後期ステージに進んでいる（Ｐｏｌｙｄｅｆｋｉｓら． ２０１５； Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉら． ２０１９）。
【0083】
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【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図11-4】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15-1】
【図15-2】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図16-4】
【図16-5】
【図16-6】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図18-3】
【配列表】
【国際調査報告】