特表 2022-531582 細胞外小胞を高濃度で培養するための細胞培養培地及びその細胞培養培地を使用した細胞外小胞高含有馴化培養液の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-07

(54)【発明の名称】細胞外小胞を高濃度で培養するための細胞培養培地及びその細胞培養培地を使用した細胞外小胞高含有馴化培養液の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20220630BHJP

【ＦＩ】

C12N1/00 G

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021564563

(86)(22)【出願日】2020-03-05

(85)【翻訳文提出日】2021-10-28

(86)【国際出願番号】 KR2020003126

(87)【国際公開番号】W WO2020230990

(87)【国際公開日】2020-11-19

(31)【優先権主張番号】10-2019-0055184

(32)【優先日】2019-05-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521473594

【氏名又は名称】バイオソリューション・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＳＯＬＵＴＩＯＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジュンホ

(72)【発明者】

【氏名】ユ，ガウン

(72)【発明者】

【氏名】イ，ジョンソン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ソンソン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AC14

4B065AC15

4B065AC20

4B065BB02

4B065BB19

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

本発明は、ラクトフェリン（lactoferrin）を含む細胞外小胞（extracellular vesicles）を高濃度で培養するための細胞培養培地；細胞を前記細胞培養培地で培養することを含む細胞外小胞を高濃度で含有する馴化培養液（conditioned medium）の製造方法；及び細胞外小胞を高濃度で含有する馴化培養液を製造するのに使用するためのラクトフェリンの使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラクトフェリンを含む、細胞外小胞を高濃度で培養するための細胞培養培地。

【請求項2】

ラクトフェリンが、０．１μｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの濃度で含まれる、請求項１に記載の細胞培養培地。

【請求項3】

ラクトフェリンが、Ｈｏｌｏ－ラクトフェリン、Ａｐｏ－ラクトフェリン及びＰｉｓ－ラクトフェリンからなる群より選択される、請求項１に記載の細胞培養培地。

【請求項4】

カルシウムがさらに添加される、請求項１に記載の細胞培養培地。

【請求項5】

カルシウムが、０．２μＭ～１０ｍＭの濃度で添加される、請求項４に記載の細胞培養培地。

【請求項6】

無添加培地、血清代替剤及び血清からなる群より選択される少なくとも１つの物質がさらに添加される、請求項１に記載の細胞培養培地。

【請求項7】

ヒトまたは動物由来の細胞に適用される、請求項１に記載の細胞培養培地。

【請求項8】

細胞を請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞培養培地で培養することを含む、細胞外小胞を高濃度で含有する馴化培養液の製造方法。

【請求項9】

馴化培養液中の細胞外小胞の数が、１．０×１０^８／ｍＬ～１．０×１０^１１／ｍＬの範囲である、請求項８に記載の製造方法。

【請求項10】

細胞培養培地の使用が、細胞培養中の特定の時点に設定されず、繰り返し使用される、請求項８に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ラクトフェリンを含む細胞外小胞（extracellular vesicles）を高濃度で培養するための細胞培養培地；細胞を前記細胞培養培地で培養することを含む細胞外小胞を高濃度で含有する馴化培養液（conditioned medium）の製造方法；及び細胞外小胞を高濃度で含有する馴化培養液を製造するのに使用するためのラクトフェリンの使用に関するものである。

【背景技術】

【0002】

細胞分泌物質の中でも、最近「細胞外小胞（extracellular vesicles）」が注目されている。細胞外小胞は、細胞から排出される細胞模倣送達体としてのサイズが３０ｎｍ～２μｍ（２,０００ｎｍ）の小さな球状の物体である。細胞外小胞とは、細胞から排出される様々な小胞（vesicle）を指し、主な分類は「エキソーム（exosome）」及び「微小胞（microvesicle）」である。細胞外小胞の種類は、機能や小胞の起源に応じて学者によって異なる名前が付けられ、エクトソーム（Ectosome）、微粒子（Microparticle）、トレロソーム（Tolerosomes）、プロスタトソーム（Prostatosomes）、カルディオソーム（Cardiosomes）、ベキソソーム（Vexosomes）などの様々な名前で呼ばれているが、最終的には生成の原理に従って、エンドソーム腔内小胞（Endosome intraluminal vesicle）由来のエキソーム及び細胞膜（Plasma membrane）由来の微小胞と名付けられることが適切であると報告されている（非特許文献１）。その主な特徴は、細胞由来の脂質二重層（lipid bilayer）に封入され膜タンパク質を有し、内部に細胞調節タンパク質を含むことである。

【0003】

細胞外小胞の分野が最近活性化された理由の一つは、細胞外小胞のサイズが小さいため、他の分泌タンパク質からそれらを分離することが困難であり、培養液中の細胞外小胞の含有量が少ないため、これらの効果を確認することが困難であることである。現在、細胞外小胞を分離する技術が確保されており（非特許文献２）、その有効性が確認され、臨床試験が行われている最中である（非特許文献３）。

【0004】

しかし、細胞分泌物質の含有量が少ない細胞外小胞用の一般的な細胞培養培地で細胞を培養することによって得られる一般的な馴化培養液においてのみ細胞外小胞の特異的効果を確認することは困難であり、細胞他小胞が馴化培養液から分離されて利用されたとしても、細胞他小胞の絶対量が不足しているため、制限がある。

【0005】

現在、細胞がより多くの細胞外小胞を排出できるようにすることにより、馴化培養液中の細胞外小胞の含有率を増やすための研究が進行中である。基本的に、同じ空間で多くの細胞を増殖させることにより、細胞から分泌される分泌物の総濃度を高める方法が使用される（非特許文献４）。しかし、この方法は細胞外小胞の比率を上げるだけの方法ではないため、原因を解決する方法ではなく、分泌量を増加に限界があり、コスト面で問題がある。

【0006】

従って、細胞が特異的に細胞外小胞を排出する方法が必要である。るまり、細胞から排出される細胞外小胞のみが特異的に増加すると、培養液中の細胞外小胞含有量が増加し、絶対量も増加する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Nat Rev Drug Discov. 2013 May; 12(5):347-57

【非特許文献2】Biomed Res Int. 2018 Jan 30; 2018:8545347

【非特許文献3】J Extracell Vesicles. (2015)31; 4:30087

【非特許文献4】Sci Rep. 2018 Jan 19; 8(1):1171

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

単一細胞当たり排出する細胞外小胞の生産能力を向上させる技術開発の核心は、細胞培養培地が人体有毒物質を含まず、高コスト／非効率的な作業を必要としないことである。また、使用される物質は、細胞外小胞の機能に悪影響を与えてはならず、さらに、使用される物質が細胞外小胞の機能を向上させることができれば、それはより効果的な方法になるだろう。

【0009】

従って、本発明は、前述したすべての条件を満たす高濃度の胞外小胞を培養するための細胞培養培地の開発及び高濃度で細胞外小胞を含む培養液の製造方法を提供することをその技術的課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、前記の課題の解決に努め、その結果、ラクトフェリンと呼ばれるタンパク質が前記条件をすべて満たし、細胞外小胞の生成量を増加させるのに非常に効果的であることを見出した。さらに、本発明者らは、ラクトフェリンにカルシウムを追加すると、ラクトフェリンによる細胞外小胞の生産能力がさらに最大化できることを発見し、本発明を完成させた。

【0011】

本発明者らは、ラクトフェリンによって単一細胞当たり生成される細胞外小胞の排出量を増加させる効果に基づいて、高濃度のエキソームを含む馴化培養液が自発的に形成されることを確認した。また、ラクトフェリンを添加した細胞培養培地を製造し、高濃度の馴化培養液を製造可能であることが見出された。

【0012】

したがって、本発明は、ラクトフェリンを含む細胞外小胞を高濃度で培養するための細胞培養培地を提供する。

【0013】

また、本発明は、前記細胞培養培地中で細胞を培養することを含む、高濃度の細胞外小胞を含有する馴化培養液（conditioned medium）の製造方法を提供する。

【0014】

さらに、本発明は、細胞外小胞を高濃度で含有する馴化培養液を製造するときに使用するためのラクトフェリンの使用を提供する。

【発明の効果】

【0015】

本発明のラクトフェリンを含む細胞外小胞を高濃度で培養することができる細胞培養培地を、人体に毒性のないラクトフェリンの使用しているため安全であり、生成される細胞外小胞の量を増やすことができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】無添加培地にラクトフェリンが濃度によって組み合わせられたとき、ＣＤ８１による馴化培養液での細胞外小胞の生成率と、カルネキシンによるアポトーシス小胞（apoptotic vesicle）の生成率を確認したＥＬＩＳＡの結果である。

【図2】無添加培地にトランスフェリンが濃度によって組み合わせられたとき、ＣＤ８１による馴化培養液内での細胞外小胞の生成率と、カルネキシンによるアポトーシス小胞（apoptotic vesicle）の生成率を確認したＥＬＩＳＡの結果である。

【図3】無添加培地に血清代替剤、ラクトフェリン、カルシウムを組み合わせたとき、馴化培養液内の細胞内カルシウム濃度の変化を確認した結果である。

【図4】無添加培地に血清代替剤、ラクトフェリン、カルシウムを組み合わせたとき、馴化培養液内で生成された細胞外小胞の数をナノ粒子追跡分析器で測定した結果である。

【図5】無添加培地に血清代替剤、ラクトフェリン、カルシウムを組み合わせたとき、馴化培養液内で生成された細胞外小胞のサイズをナノ粒子追跡分析器で確認した結果である。

【図6】無添加培地単独、血清代替剤単独、又は血清代替剤＋ラクトフェリン＋カルシウムを組み合わせたとき、馴化培養液内で同じ細胞によって生成されたアポトーシス小胞の相対量を示すカルネキシンＥＬＩＳＡ結果である。

【図7】無添加培地単独、血清代替剤単独、又は血清代替剤＋ラクトフェリン＋カルシウムを組み合わせたとき、馴化培養液内で同じ細胞によって生成された細胞外小胞の相対量を示すＣＤ９ ＥＬＩＳＡ結果である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

本発明者らは、ラクトフェリンが、細胞受容体に結合して生成される細胞外小胞の量を増加させるのに効果的であることを見出した。さらに、本発明者らは、ラクトフェリンのカルシウム送達能力を高めるために、ラクトフェリンを必須的に含み、任意にカルシウムをさらに含む細胞外小胞の生成のための細胞培養培地を製造し、前記培養培地を細胞培養に使用すると、細胞から排出される細胞外小胞の生成能力が急激に増加することが確認された。

【0018】

本発明の細胞培養培地及びそれを用いた細胞の培養方法は、人体に毒性のないラクトフェリンタンパク質とカルシウムイオンとの組み合わせを使用するという点で安全であり、効率的に細胞外小胞の生成量を増加させることができる。

【0019】

本発明は、ラクトフェリン（lactoferrin）を含む細胞外小胞（extracellular vesicles）を高濃度で培養するための細胞培養培地に関することものである。

【0020】

また、本発明は、細胞を前記細胞培養培地中で培養することを含む、細胞外小胞を高濃度で含有する馴化培養液（conditioned medium）の製造方法に関するものである。

【0021】

さらに、本発明は、細胞外小胞を高濃度で含有する馴化培養液を製造するときに使用するためのラクトフェリンの使用に関するものである。

【0022】

本明細書で使用される用語「細胞外小胞」は、細胞から排出される様々な小胞を指し、「エキソーム（Exosome）」及び「微小胞（microvesicle）」を含むことを意味する。また、用語「細胞外小胞」は、エクトソーム（Ectosome）、微細粒子（Microparticle）、トレロソーム（Tolerosomes）、プロスタトソーム（Prostatosomes）、カルディオソーム（Cardiosomes）及びベキソソーム（Vexosomes）を含むという意味でも使用される。

【0023】

本明細書で使用される用語「細胞培養培地（cell culture medium）」は、細胞を培養する前の培地を指し、「馴化培養液（conditioned medium）」は、細胞を培養した後に得られる培養液（培地）を指す。

【0024】

一実施形態において、ラクトフェリンは、０．１μｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬの濃度で細胞培養培地に添加され得る。一実施形態では、ラクトフェリンは、Ｈｏｌｏ－ラクトフェリン、Ａｐｏ－ラクトフェリン及びＰｉｓ－ラクトフェリンからなる群より選択することができる。具体的には、前記ラクトフェリンは、合成又は抽出によって得られてもよく、ヒト又はヒト以外の動物由来の両方を含む。

【0025】

一実施形態において、本発明の馴化培養液（conditioned medium）の製造方法によって得られた馴化培養液中の細胞外小胞の数は、１．０×１０^８／ｍＬ～１．０×１０^１１／ｍＬの範囲であってもよく、具体的には、１．０×１０^９／ｍＬ～１．０×１０^１１／ｍＬの範囲であってもよい。

【0026】

本発明の一実施形態によれば、本発明の細胞培養培地は、カルシウムをさらに含むことができる。本発明者らは、ラクトフェリンと組合せたカルシウムの濃度を制御することにより、ラクトフェリンによる細胞外小胞の生産能力をさらに最大化することとができることを確認した。一実施形態では、前記カルシウムは、カルシウムイオン（Ｃａ^2＋）の形態で添加してもよく、前記カルシウムイオンの供給源は、カルシウムイオンを供給することができるすべての塩を含む。

【0027】

一実施形態において、カルシウムは、０．２μＭ～１０ｍＭの濃度で細胞培養培地に添加され得る。

【0028】

一実施形態において、本発明の細胞培養培地は、細胞培養中の特定の時点で設定されなくてもよく、繰り返し使用される。

【0029】

本発明の一実施形態によれば、本発明の細胞培養培地又は馴化培養液の製造方法は、既存の細胞を培養するために使用される培地、例えば、血清代替剤が含まれた培地などと組合せることができる。一実施形態において、本発明の細胞培養培地及び馴化培養液の製造方法は、無添加培地（basal media）、血清代替剤（serum replacement）及び血清（serum）からなる群より選択される一つ以上の物質を添加することをさらに含んでいてもよい。一実施形態において、本発明の細胞培養培地は、無添加培地（basal media）、血清代替剤（serum replacement）及び血清（serum）からなる群より選択される１つ以上の物質をさらに含むことができる。前記「血清代替剤」は、無血清培地を製作するための血清に代える組成物質を指す。

【0030】

本発明の一実施形態によれば、ラクトフェリン、カルシウムイオン及び血清代替剤の組み合わせが、細胞の細胞外小胞の生産能力を最大化することができる。

【0031】

血清代替剤に含まれたトランスフェリンは、細胞内カルシウムの濃度を増加させることによって、細胞外小胞の生成を増加させることが知られている（J Biol Chem. 2003 May 30; 278(22):20083－90）。ラクトフェリンは、トランスフェリンファミリーであり、その配列はトランスフェリンと約６０％同じである。したがって、ラクトフェリンは、その構造的特徴及び鉄イオンを結合する能力などの代表的な機能的特徴においてトランスフェリンに類似している。しかし、ラクトフェリンは、トランスフェリンとは等電点が異なるため、表面の正電荷の程度が異なるためにイオン結合能力が異なり、ファミリーが結合する受容体も異なる（Biochem Cell Biol. 2002; 80(1):27－34）。後述する実施例において、生成される細胞外小胞の量に対するこれらの違いを示すラクトフェリン及びトランスフェリンの効果は、酵素結合免疫沈降分析法（ＥＬＩＳＡ）を使用して確認し、細胞外小胞マーカーであるＣＤ８１とアポトーシス小胞（apoptotic vesicle）の生成程度は、マーカーであるカルネキシンで観察した。その結果、トランスフェリンの細胞外小胞の生成効果は、ラクトフェリンのそれよりも高くないことが観察された。ラクトフェリンの場合、イオン結合及び細胞受容体に結合する能力の特定の違いに基づいて、血清代替剤を超えることにより、細胞内カルシウム濃度を有意に増加させ、細胞外小胞の生成量を増加させることが観察された。

【0032】

後述する実施例で確認できるように、本発明によってラクトフェリンが添加される細胞培養培地が細胞外小胞の数を増加させるという原理は、細胞の増殖又は死滅物質の増加の結果ではなく、細胞内カルシウムの濃度を増加させることにより、細胞が細胞外小胞を直接生成する能力が増加するためである（PHYSIOLOGY 20: 22－27, 2005; 10.1152）。また、ラクトフェリンが細胞の受容体であるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）に結合して細胞内部に移動する過程は、ヒトを含む動物の全細胞に共通する現象である（GAPDH: Biological Properties and Diversity, ISBN 978－94. －007－4716－6）。したがって、ラクトフェリンを添加した細胞培養培地で高濃度のエキソームを含有する馴化培養液を製造することは、ヒトを含むあらゆる種類の細胞に適用できる普遍的な方法である。

【0033】

一実施形態において、本発明の細胞培養培地及び馴化培養液の製造方法のために使用される細胞は、ヒト又は動物由来のすべての種類の細胞であってもよい。

【0034】

本発明の馴化培養液の製造方法によって、高濃度細胞外小胞を含有する馴化培養液は容易に製造することができる。また、本発明の細胞培養培地を使用することによって、細胞外小胞を高濃度で含有する細胞培養液を容易に製造することができる。

【0035】

本明細書で使用される用語「高濃度の細胞外小胞」は、細胞を培養して得られる培養液中の細胞外小胞の数が、少なくとも１．０×１０^８／ｍＬ～１．０×１０^１１／ｍＬの範囲にある場合を指す。

【0036】

この方法で得られた馴化培養液又は細胞培養培地は、細胞外小胞を高濃度で含有しているため、化粧品や治療薬の原料として広く便利に使用することができる。

【0037】

以下、実施例は、本発明の構成及び効についてより詳細に説明することを意図している。しかし、以下の施例は、本発明を例示することのみ意図しており、本発明の範囲はそれに限定されない。

【実施例】

【0038】

実施例１：ラクトフェリンを用いた細胞外小胞の生成量の増大
ラクトフェリン（ＬＦ）は、トランスフェリン（Ｔｆ）ファミリーであり、その配列はトランスフェリンと約６０％同じである。したがって、ラクトフェリンは、その構造的特徴及び鉄イオンと結合する能力などの代表的な機能的特徴においてトランスフェリンに類似している。一方、ラクトフェリンは、トランスフェリンとは等電点が異なるため、表面の正電荷の程度が異なるためイオン結合能力が異なり、ファミリーが結合する受容体も異なる（Biochem Cell Biol. 2002; 80(1):27-34）。生成される細胞外小胞の量に対するこれらの違いを示すラクトフェリン及びトランスフェリンの効果は、酵素結合免疫沈降分析法（ＥＬＩＳＡ）を使用して確認し、細胞外小胞マーカーであるＣＤ８１とアポトーシス小胞（apoptotic vesicle）の生成程度は、マーカーであるカルネキシンで観察した。

【0039】

具体的には、プレート培養皿（４８ウェルプレート）でヒト脂肪由来間葉系幹細胞を２４時間培養した。２４時間後、基本培地に、ラクトフェリン（aspira Scientific, USA）又はトランスフェリン（Sigma, USA）を、最終濃度が５、１０、２０、５０、１００、２５０、５００、１０００μｇ／ｍＬになるように水と混合して、２５μｌずつ接種した。陰性対照群には、水２５μLの水を接種した。処理後、５％のＣＯ₂を供給する３７℃の培養器で２４時間培養した後、各培養液を取得し、死細胞を除去するために１，５００ｇで１０分間遠心分離した。

【0040】

ＣＤ８１ ＥＬＩＳＡキット（Mybiosource, USA）とカルネキシンＥＬＩＳＡキット（Mybiosource, USA）を使用してＣＤ８１とカルネキシンを測定した。具体的な方法は次の通りである。コーティングされた９６ウェルプレートに前記得られた培養液と定量物質（standard）をそれぞれ１００μＬずつ加えた後、１－２時間３７℃で反応した。その後、定量物質と培養液を除去し、一次抗体（検出抗体）を加え、３７℃で反応した。１時間後、混合物を洗浄緩衝液で３回洗浄し、二次抗体（ＨＲＰ抗体）を加えて反応し、０．５－１時間が再度洗浄した。最後に、基質と停止緩衝液を加え、ＥＬＩＳＡリーダー（Molecular Devices, USA）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、陰性対照群に基づいて計算した比率を図１（ラクトフェリン）と図２（トランスフェリン）に示した。ＣＤ８１に対する結果値は、黒いバーで表され、カルネキシンの結果値は白いバーで表された。

【0041】

図１に示されるように、ラクトフェリンは、特定の濃度で細胞から排出される細胞外小胞の生成量を増加させることが確認された。細胞外小胞マーカーであるＣＤ８１は、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬのラクトフェリン濃度での非処理群（０μｇ／ｍＬ）と比較して、小さくは１．５倍（５０μｇ／ｍＬのラクトフェリンの場合）、大きくは５倍（５μｇ／ｍＬのラクトフェリンの場合）まで増加していることが確認された。相対的に、アポトーシス小胞のマーカーであるカルネキシンは、ラクトフェリン濃度に有意差はなかった。結論として、ラクトフェリンは、使用された濃度範囲で２種類の細胞外小胞であるエキソーム及び微小胞の生成量を特異的に増加させるタンパク質として同定された。

【0042】

一方、同じ濃度条件下でのトランスフェリンは、ラクトフェリンのＣＤ８１の増加量と比較して、変化に有意差を示さなかった（図２）。これは、ラクトフェリンが、細胞が排出する細胞外小胞の生成増加に特に効果的な物質であることを確認している。

【0043】

実施例２：ラクトフェリン／カルシウム組成物による細胞内カルシウムレベルの増加
細胞内のカルシウム濃度の増加は、細胞外小胞の生成増加に直接関係している。細胞内カルシウムの増加は、細胞膜タンパク質の非対称性を対称的に転換させ、バランスを維持する膜を破壊する（Physiology (Bethesda) 2005 Feb; 20:22-7）。細胞内カルシウム濃度の増加は、エンドソームにおける管腔内小胞（Intraluminal vesicle）の生成を増加させることも知られている。

【0044】

血清代替剤は、トランスフェリンに加えて多くの栄養成分を介して細胞代謝を活性化するため、細胞外小胞を生成する培養液に血清代替剤が含まれていることが有利である。一方、血清代替剤に含まれたトランスフェリンは、細胞内カルシウムの濃度を増加させることにより細胞外小胞の生成を増加させることが知られているが（J Biol Chem. 2003 May 30;278(22): 20083-90）、トランスフェリンの細胞外小胞の生成効果は、前記実施例１の結果から確認されるように、ラクトフェリンのそれよりも高くない。

【0045】

一方、ラクトフェリンは、イオン結合及び細胞受容体に結合する能力の特定の違いに基づいて血清代替剤を超えることにより、細胞内カルシウム濃度を大幅に増加させ、細胞外小胞の生成をさらに増加させる可能性があるため、以下の実験が設計された。

【0046】

ラクトフェリンの濃度による細胞内カルシウムレベルを測定するために、カルシウム比色測定キット（Biovision, USA）を使用した。カルシウム比色測定キットは、０－クレゾールフタレインとカルシウムの反応によって表示される色を測定する原理を利用して、カルシウムの濃度を測定する。

【0047】

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を４日間培養した。培養液を除去し、リン酸緩衝溶液で洗浄した後、血清代替剤が含まれた培地中で、カルシウム及びラクトフェリン（Aspira Scientific, USA）を様々な濃度（２、５、１０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬ）で混合して細胞に処理した。これに伴い、血清代替剤＋カルシウムのみを組み合わせた群とラクトフェリン１０μｇ／ｍＬのみで処理した群、血清代替剤のみで処理した群、及び無添加の無添加培地群で実験を行った。４８時間後、細胞をリン酸緩衝溶液で洗浄し、１×トリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％トリプシン、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ、welgene, Korea）溶液で培養皿から分離した。

【0048】

自動細胞計数装置（Nucleocounter NC-250, Chemometec, USA）で各群の細胞数を測定し、同じ数の細胞をカルシウムアッセイバッファー（Biovision, USA）に溶解した。続いて、カルシウム比色測定キットを利用して実験を行った。９６ウェルプレートにウェル当たり５０μＬのサンプル又は定量のカルシウムと９０μＬの発色試薬（０－クレゾールフタレイン）、６０μＬのカルシウムアッセイバッファーを加え、光を遮断して、５分の間反応させた。続いて、５７５ｎｍで吸光度を測定し、相対的な増加量を示すために、無添加培地で培養する間葉系幹細胞を１００％に設定した。

【0049】

図３に示されるように、ラクトフェリン／カルシウム組成物が血清代替剤と組合せて、細胞内カルシウム濃度を有意に増加させることが確認された。無添加培地に血清代替剤のみを添加した場合、予想通りに、約１５０％のカルシウム濃度が増加していることが確認された。しかし、より多くのカルシウムが供給された場合でも、血清代替剤による細胞内カルシウム濃度はそれ以上増加しなかった（テューキーの検定、ｐ＞０．０５）。一方、２μｇ／ｍＬのラクトフェリンにカルシウムを追加供給した場合、血清代替剤と比較して細胞内カルシウム濃度が増加し、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬの濃度で最高の細胞内カルシウム濃度が示された。一般に、ラクトフェリン５、１０、２５μｇ／ｍＬとカルシウム組成物が、無添加培地と比較して有意に細胞内カルシウム濃度を増加させることができることが確認された（テューキーの検定、ｐ＞０．０５）。

【0050】

前記結果から、ラクトフェリン／カルシウム組成物が細胞内カルシウム濃度を増加させ、この組成物は、血清代替剤と組合せて生成される細胞外小胞の量をさらに増加させる可能性があることが見出された。また、ラクトフェリン／カルシウム組成物が細胞内カルシウム濃度の増加という細胞外小胞の生成の汎用的原理を通じて、細胞外小胞産生量を増加させることを確認することによって、ラクトフェリンが適用可能な細胞の範囲は、前記実験で使用された脂肪由来間葉系幹細胞だけでなく、すべての種類の細胞に適用できることが分かった。

【0051】

一元配置分散分析を行って、群全体で差異があることが確認され、個々の平均間の差異をテューキーの検定を使用して分析した。群間の統計的の明確性は、＊＝（ｐ＜０．０５）、Ｎ．Ｓ＝（ｐ＞０．０５）としてプロットされた。前記統計はPrism software version 5を利用して分析された。

【0052】

実施例３：ラクトフェリン／カルシウム組成物による細胞外小胞産生の増加
ラクトフェリンの濃度による培養液中の細胞外小胞の数とサイズの変化を観察するために、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を行った。

【0053】

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を２日間培養した。５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬのラクトフェリンの濃度をカルシウムと組み合わせした後、血清代替剤と組み合わせ、無添加培地で混合し、交替した。また、血清代替剤を含む無添加培地（ａｌｐｈａ－ＭＥＭ）のみを含む群と無添加培地のみを含むゴンとを比較して、実験を行った。４８時間後、培養液を回収し、１５００ｇで１０分間遠心分離した後、培養液中の細胞外小胞の数とサイズをナノ粒子追跡分析器（NTA, Nanosight NS300, Malvern, UK）で測定し、図４と図５に示した。

【0054】

図４は、培養液１ｍＬ当たりに含まれる細胞外小胞の数を示すグラフであり、細胞外小胞の相対的数は無添加培地（１００％）に基づいて計算され、各グラフの上部に示されている。図４に示されるように、ナノ粒子測定装置で培地に含まれた細胞外小胞の数を確認した結果、平均細胞外小胞が無添加培地で１．１×１０^８細胞／ｍＬであることが確認された。血清代替剤処理群では、約５．６×１０^８細胞／ｍＬ程度で確認され、細胞外小胞が４．５×１０^８細胞／ｍＬ増加した。一方、ラクトフェリン５μｇ／ｍＬ＋カルシウム組成物が血清代替剤に添加されたた処理群では、細胞外小胞の生成量が約１６．１×１０^８細胞／ｍＬであることが確認され、約１４×１０^８細胞／ｍＬが増加し、無添加培地と比較して１４５０％増加した。ラクトフェリン１０μｇ／ｍＬ＋カルシウム組成物では、細胞外小胞の生成量が約１７×１０^８細胞／ｍＬであり、無添加培地と比較して１５９０％増加した。

【0055】

前記結果は、ラクトフェリン＋カルシウム組成物が、血清代替剤との組み合わせにより、濃度に比例して生成量を増加させることができることを示している。

【0056】

一方、図５に示されるように、無添加培地処理群、血清代替剤処理群、及びラクトフェリン（５または１０μｇ／ｍＬ）＋カルシウム組成物処理群では、細胞外小胞は１２０～１４０ｎｍのサイズ範囲で存在することが確認された。サイズ測定に使用した胞外小胞の画像はグラフの右側に示されている。

【0057】

実施例４：ラクトフェリン／カルシウム組成物による細胞外小胞の増加が細胞の細胞外小胞の生成能力の増加によるものであることを確認
血清代替剤は、トランスフェリンによる細胞外小胞の生成に影響を与えるが、栄養の供給による活発な代謝は細胞の増殖を増加させ、細胞外小胞の生成を増加させる。ラクトフェリン＋カルシウム組成物が、細胞増殖又はアポトーシス物質の増加ではなく、細胞ごとに発現される細胞外小胞の生成能力を明らかに増加させることを証明するために、実験を準備した。

【0058】

ラクトフェリンとカルシウムの組み合わせによる細胞外小胞の生成能力の変化を観察するために、細胞外小胞のマーカーであるＣＤ９とアポトーシス小胞のマーカーであるカルネキシンを使用して、酵素結合免疫沈降分析法（ＥＬＩＳＡ）で確認した。

【0059】

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞を、無添加培地（ａｌｐｈａ－ＭＥＭ）、血清代替剤を含む培地、及び血清代替剤＋ラクトフェリン１０μｇ／ｍＬ＋カルシウムを含む培地で処理した。４８時間後、培養液を１５００ｇで１０分遠心分離した、後上清として、ＣＤ９ＥＬＩＳＡ（exoquant overall exosome capture and quantification assay kit, Biovision, USA）とカルネキシンＥＬＩＳＡ（Calnexin ELISA kit, Mybiosource, USA）を行った。

【0060】

ＣＤ９のＥＬＩＳＡの具体的な方法は以下の通りである。コーティングされた９６ウェルプレートに、各定量物質（standard）と得られた培養液１００μＬを加え、２０時間３７℃で反応した。その後、定量物質と培養液を除去して３回洗浄した後、一次抗体（検出抗体）を加え、３７℃で反応した。２時間後、洗浄緩衝液で３回洗浄し、二次抗体（ＨＲＰ抗体）を加えて反応させ、１時間後、再度洗浄した。最後に、基質と停止緩衝液を加え、ＥＬＩＳＡリーダー（Molecular Devices, USA）を使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0061】

カルネキシンとＣＤ９の測定値を、培養液が得られたときに細胞で測定された増殖速度（MTT assay）で割った。前記ＭＴＴアッセイ方法は以下の通りである。培地を除去した後、細胞をリン酸緩衝溶液で３回洗浄した。処理濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるように、ＭＴＴ試薬を培地で希釈した後、３７℃で２時間反応させた。リン酸緩衝溶液で洗浄した後、５００μＬのイソプロピルアルコール溶液で３０分撹拌することにより、５７０ｎｍで吸光度を測定した。

【0062】

アポトーシス指標の結果は、１００％の無添加培地を使用して図６に示された。図６に示されるように、アポトーシス因子は、生成された細胞外小胞で特異的に過剰発現されなかった。全体として、カルネキシンの発現レベルは、無添加培地、血清代替剤を含む培地、及び血清代替剤＋ラクトフェリン+カルシウム組成物を含む培地で類似していることが確認された（一元配置分散分析、Ｆ（２,３）＝１．７９７、ｐ＞０．０５）。

【0063】

しかし、細胞外小胞のマーカーであるＣＤ９は、ラクトフェリン＋カルシウム組成物が有意に増加していることが確認された。図７に示されるように、無添加培地を１００％使用した血清代替剤を含む培地は、無添加培地と比較して細胞当たりのＣＤ９の発現を有意に増加させなかったため、血清代替剤の効果は、細胞当たり生成される細胞外小胞の量の増加ではなく、細胞数の増加であり、細胞外小胞の生成が増加することが確認された（テューキーの検定、ｐ＞０．０５）。

【0064】

一方、血清代替剤を含むラクトフェリン＋カルシウム組成物を使用した培地場合では、細胞当たり発現するＣＤ９が、無添加培地と比較して、１４６３％増加し、実施例３に示した細胞外小胞の増加率（１５９０％）と同様の結果が確認された。これらの結果は、ラクトフェリン＋カルシウム組成物が、単一細胞によって生成される細胞外小胞の生成能力を増加させたことを明確に示している（テューキーの検定、ｐ＞０．０５）。また、ラクトフェリン＋カルシウム組成物は、使用される濃度範囲での細胞外小胞の２つの分類であるエキソームと微小胞の生成量を特異的に増加させる組成物として同定された。

【0065】

一元配置分散分析を行うことにより、群全体で差異があることが確認され、個々の平均間の差異がテューキーの検定を使用して分析された。群間の統計的の明確性は、＊＝（ｐ＜０．０５）、Ｎ．Ｓ＝（ｐ＞０．０５）としてプロットされた。前記統計は、Prism software version 5を使用して分析された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】