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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-07
(54)【発明の名称】ＰＡＲ２調節及びその方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220630BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220630BHJP
C12Q 1/37 20060101ALI20220630BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20220630BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220630BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220630BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220630BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220630BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220630BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220630BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20220630BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20220630BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C07K14/705
C12Q1/37
C12Q1/68
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
G01N33/574
C07K7/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021564917
(86)(22)【出願日】2020-04-30
(85)【翻訳文提出日】2021-12-03
(86)【国際出願番号】 IB2020054114
(87)【国際公開番号】W WO2020225677
(87)【国際公開日】2020-11-12
(31)【優先権主張番号】62/842,869
(32)【優先日】2019-05-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】リウ，チャンルー
(72)【発明者】
【氏名】サン，シクアン
(72)【発明者】
【氏名】スティーマーズ‐リー，グレイス
(72)【発明者】
【氏名】リウ，ベリンダ
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QQ79
4B063QR16
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR48
4B063QR72
4B063QR77
4B063QR80
4B063QS36
4B063QS38
4B063QX01
4B064AG20
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA13
4H045BA14
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書では、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法が提供される。また、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチド、変異体ＰＡＲ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法であって、ａ．細胞の表面に前記ＰＡＲ２を発現する前記細胞を提供することであって、前記ＰＡＲ２がシグナルペプチド配列を含む、ことと、
ｂ．前記細胞を薬剤と接触させることと、
ｃ．前記細胞の表面上のＰＡＲ２のレベルを測定することであって、対照と比較しての前記細胞の表面上のＰＡＲ２の前記レベルの低下は、前記薬剤が細胞内でＰＡＲ２を活性化可能であることを示す、ことと、を含む、方法。
【請求項2】
ＰＡＲ２が内因的に又は外因的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ＰＡＲ２が外因的に発現される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
内因性ＰＡＲ２発現が実質的に排除される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、及びＨＥＫ２９３細胞からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記薬剤が、小分子、ポリペプチド、抗体、脂質、多糖類、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記対照が、変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記変異体ＰＡＲ２ポリペプチドが、配列番号５５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記薬剤が、前記ＰＡＲ２の前記シグナルペプチド配列に細胞内で結合してシグナルペプチド機能を妨害する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記薬剤が、前記ＰＡＲ２上のアロステリック部位に結合し、前記アロステリック部位への前記薬剤の結合が、シグナルペプチド機能を妨害する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法であって、ａ．細胞の表面に前記ＰＡＲ２を発現する前記細胞を提供することであって、前記ＰＡＲ２がシグナルペプチド配列を含む、ことと、
ｂ．前記細胞を薬剤と接触させることと、
ｃ．前記細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンド若しくは小分子と接触させることと、
ｄ．前記細胞を前記プロテアーゼ及び／又はペプチドリガンドと接触させたときのＰＡＲ２の活性化レベルを測定することであって、対照と比較してのＰＡＲ２の前記活性化レベルの低下は、前記薬剤がＰＡＲ２を細胞内で活性化可能であることを示す、ことと、を含む、方法。
【請求項12】
ＰＡＲ２が内因的に又は外因的に発現される、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ＰＡＲ２が外因的に発現される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
内因性ＰＡＲ２発現が実質的に排除される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、及びＨＥＫ２９３細胞からなる群から選択される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記薬剤が、小分子、ポリペプチド、抗体、脂質、多糖類、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記対照が、変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記変異体ＰＡＲ２ポリペプチドが、配列番号５５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記薬剤が、前記ＰＡＲ２の前記シグナルペプチド配列に細胞内で結合してシグナルペプチド機能を妨害する、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記薬剤が、前記ＰＡＲ２上のアロステリック部位に結合し、前記アロステリック部位への前記薬剤の結合が、シグナルペプチド機能を妨害する、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記プロテアーゼが、トリプシン、トリプターゼ、第Ｘａ因子ＴＦ、第ＶＩＩａ因子、マトリプターゼ／ＭＴ－セリンプロテアーゼ１、システインプロテイナーゼ（ＲｇｐＢ）、チリダニプロテイナーゼＤｅｒ ｐ３、チリダニプロテイナーゼＤｅｒ ｐ９、フリン、及びトロンビンからなる群から選択される、請求項１１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ペプチドリガンドが、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号１）、ＳＬＩＧＲＬ－ＮＨ２（配列番号５８）、又は２－フロイル－ＬＩＧＲＬ－ＮＨ２（配列番号５９）を含む、請求項１１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記小分子がＧＢ１１０である、請求項１１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
配列番号４５、配列番号５１、配列番号５３、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチド。
【請求項25】
請求項２４に記載の変異体ＰＡＲ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項26】
請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項27】
請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項28】
単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを産生する方法であって、前記方法は、請求項２７に記載の宿主細胞を前記変異体ＰＡＲ２ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養することと、前記細胞又は培養物から前記変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを回収することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年５月３日出願の米国特許仮出願第６２／８４２，８６９号の優先権を主張し、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年５月３日出願の米国特許仮出願第６２／８４２，８６９号の優先権を主張し、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
（発明の分野）
本発明は、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法の特定に関する。本発明はまた、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチド、ペプチドをコードする核酸、核酸を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞にも関する。
本発明は、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法の特定に関する。本発明はまた、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチド、ペプチドをコードする核酸、核酸を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞にも関する。
【0003】
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名「ＪＢＩ６０９０ＷＯＰＣＴ１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ」及び２０２０年４月１５日の作成日で、５７ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ファイル名「ＪＢＩ６０９０ＷＯＰＣＴ１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ」及び２０２０年４月１５日の作成日で、５７ｋｂのサイズを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、７回膜貫通ドメイン細胞表面受容体の一種であり、哺乳動物及び他の有機体における最大の受容体ファミリーからなる。それらは、感覚（視覚、味覚、嗅覚）、代謝、内分泌腺、免疫、及び神経系を含む、ヒト生理学におけるほぼ全ての系のシグナル伝達に関与する。タンパク質を細胞表面に導くための古典的なシグナルペプチドを有する多くの他の細胞表面受容体とは異なり、ＧＰＣＲの大部分（＞９０％）はシグナルペプチドを有しない（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。一般に、比較的大きなＮ末端細胞外ドメインを有する、セクレチン受容体（Ｔａｍ ｅｔ．２０１４）、ＣＲＨ受容体（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、グルカゴン受容体（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、及びグルカゴン様ペプチド受容体（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）などのクラスＢ受容体、並びに代謝型グルタミン酸受容体（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ，２０１１）、ＧＡＢＡ受容体（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、及び接着型ＧＰＣＲ（Ｌｉｅｂｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）などのクラスＣ ＧＰＣＲは、クラスＡ受容体よりもシグナルペプチドを有する可能性が高い（図１Ａ）。シグナルペプチドの存在は、大きな親水性Ｎ末端が形質膜を横切るのを助けると仮定される。ほとんどのクラスＡ ＧＰＣＲは、古典的なシグナルペプチドを有しない。これらのクラスＡ ＧＰＣＲの第１の膜貫通ドメインは、これらの受容体が、小胞体（ＥＲ）内での翻訳及び組み立て後に細胞膜に移動するのを助けるシグナルアンカー配列として機能すると考えられる（Ｒｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
【0005】
ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４を含むプロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）は、クラスＡ ＧＰＣＲ受容体サブファミリーに属する（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，２００１）。相同性に関して、それらは、システイニルロイコトリエン受容体（ＣＹＳＬＴ）、ナイアシン受容体（ＧＰＲ１０９）、乳酸受容体（ＧＰＲ８１）、及びコハク酸受容体（ＧＰＲ９１）に非常に密接に関連する。シグナルペプチドを保有しない、最も近い隣接群（図１Ｂ）とは異なり、全てのＰＡＲは、そのＮ末端に予測シグナルペプチドを有する（図１Ｃ）。ゲノム解析は、ＰＡＲが、単一エクソン遺伝子によって全てコードされるそれらの最も近い隣接群とは対照的に、シグナルペプチドのみをコードする追加のエクソンを有することを示し（図１Ｃ）、これらのシグナルペプチドがＰＡＲに特異的な役割を果たし得ることを示唆している。本明細書に開示されるように、ＰＡＲ２を利用して、ＰＡＲ受容体機能及び局在におけるシグナルペプチドの重要性を研究した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
一般的な一態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法の特定に関する。本発明はまた、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチド、ペプチドをコードする核酸、核酸を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞にも関する。
【0007】
本明細書では、プロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法が提供される。この方法は、（ａ）細胞の表面にプロテアーゼ活性化受容体を発現する細胞を提供することであって、プロテアーゼ活性化受容体がシグナルペプチド配列を含む、ことと、（ｂ）細胞を薬剤と接触させることと、（ｃ）細胞の表面上のプロテアーゼ活性化受容体のレベルを測定することであって、対照と比較しての細胞の表面上のプロテアーゼ活性化受容体のレベルの低下は、薬剤が細胞内でプロテアーゼ活性化受容体を活性化可能であることを示す、ことと、を含む。
【0008】
特定の実施形態では、プロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法は、（ａ）細胞の表面にプロテアーゼ活性化受容体を発現する細胞を提供することであって、プロテアーゼ活性化受容体がシグナルペプチド配列を含む、ことと、（ｂ）細胞を薬剤と接触させることと、（ｃ）細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンド若しくは小分子と接触させることと、（ｄ）細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンドと接触させたときのプロテアーゼ活性化受容体の活性化レベルを測定することであって、対照と比較してのプロテアーゼ活性化受容体の活性化レベルの低下は、薬剤がプロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化可能であることを示す、ことと、を含む。
【0009】
特定の実施形態では、プロテアーゼ活性化受容体は、プロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ１）、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４からなる群から選択される。
【0010】
本明細書では、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法が提供される。この方法は、（ａ）細胞の表面にＰＡＲ２を発現する細胞を提供することであって、ＰＡＲ２がシグナルペプチド配列を含む、ことと、（ｂ）細胞を薬剤と接触させることと、（ｃ）細胞の表面上のＰＡＲ２のレベルを測定することであって、対照と比較しての細胞の表面上のＰＡＲ２のレベルの低下は、薬剤が細胞内でＰＡＲ２を活性化可能であることを示す、ことと、を含む。
【0011】
特定の実施形態では、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法は、（ａ）細胞の表面にＰＡＲ２を発現する細胞を提供することであって、ＰＡＲ２がシグナルペプチド配列を含む、ことと、（ｂ）細胞を薬剤と接触させることと、（ｃ）細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンド若しくは小分子と接触させることと、（ｄ）細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンドと接触させたときのＰＡＲ２の活性化レベルを測定することであって、対照と比較してのＰＡＲ２の活性化レベルの低下は、薬剤がＰＡＲ２を細胞内で活性化可能であることを示す、ことと、を含む。
【0012】
特定の実施形態では、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４は、内因的に又は外因的に発現される。特定の実施形態では、内因性のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４発現は実質的に排除される。
【0013】
特定の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、及びＨＥＫ２９３細胞からなる群から選択される。
【0014】
特定の実施形態では、薬剤は、小分子、ポリペプチド、抗体、脂質、多糖類、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【0015】
特定の実施形態では、対照は、変異体プロテアーゼ活性化受容体ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞であり、好ましくは、変異体プロテアーゼ活性化受容体ポリペプチドは変異体ＰＡＲ２ポリペプチドである。変異体ＰＡＲ２ポリペプチドは、例えば、配列番号５５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【0016】
特定の実施形態では、薬剤は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４のシグナルペプチド配列に細胞内で結合してシグナルペプチド機能を妨害する。特定の実施形態では、薬剤は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４上のアロステリック部位に結合し、アロステリック部位への薬剤の結合は、シグナルペプチド機能を妨害する。
【0017】
特定の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシン、トリプターゼ、第Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子、マトリプターゼ／ＭＴ－セリンプロテアーゼ１、システインプロテイナーゼ（ＲｇｐＢ）、チリダニプロテイナーゼＤｅｒ ｐ３、チリダニプロテイナーゼＤｅｒ ｐ９、フリン、及びトロンビンからなる群から選択される。
【0018】
特定の実施形態では、ペプチドリガンドは、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号１）、ＳＬＩＧＲＬ－ＮＨ２（配列番号５８）、又は２－フロイル－ＬＩＧＲＬ－ＮＨ２（配列番号５９）を含むことができる。
【0019】
特定の実施形態では、小分子は、ＧＢ１１０とすることができる。
【0020】
また、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５３、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドも提供される。
【0021】
また、本発明の変異体ＰＡＲ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供される。また、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。また、本発明のベクターを含む宿主細胞も提供される。
【0022】
また、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを産生する方法も提供される。この方法は、本発明の宿主細胞を変異体ＰＡＲ２ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養することと、細胞又は培養物から変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを回収することと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0023】
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
【図1A】ＰＡＲ受容体がクラスＡサブファミリー内の受容体の固有の群であることを示す。図１Ａは、ＧＰＣＲサブファミリーメンバー及びシグナルペプチド保有の例を示す。クラスＢ及びＣにおいてシグナルペプチド領域が示されている。
【図1C】ＰＡＲ受容体がクラスＡサブファミリー内の受容体の固有の群であることを示す。図１Ｃは、ＰＡＲ１～４のＮ末端アミノ酸配列を示す。シグナルペプチドは太字で示されている。各ＰＡＲ受容体は、２つのエクソンによってコードされる。第１のエクソンによってコード化されたタンパク質領域には、下線が引かれている。受容体の開裂及び活性化に関与するＡｒｇ（Ｒ）残基は太字で示されている。
【図2A】古典的なシグナルペプチドのように挙動するＰＡＲ２シグナルペプチドを示す。図２Ａは、ＩｇＧ－Ｆｃ分泌を誘導する際のＰＡＲ２のシグナルペプチドの役割を試験するための発現コンストラクトを示す。シグナルペプチドを有するＰＡＲ２のＮ末端（ＰＡＲ２）、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２のＮ末端（ＰＡＲ２ΔＳＰ）、インスリンのＮ末端（ＩＮ）、及びインスリン受容体のＮ末端（ＩＲ）は、それぞれヒトＩｇＧ－Ｆｃフラグメントに融合されている。ＰＡＲ２、インスリン、及びインスリン受容体のシグナルペプチド領域は強調され、下線が引かれている。ヒトＩｇＧ－Ｆｃフラグメントは強調されている。
【図2B】古典的なシグナルペプチドのように挙動するＰＡＲ２シグナルペプチドを示す。図２Ｂは、免疫蛍光染色及びＥＬＩＳＡによる、細胞におけるＩｇＧ－Ｆｃ発現の検出を示す。示されるように、様々なＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＯＳ７細胞を固定し、洗剤を用いて浸透させた後、ＦＴＩＣ標識蛍光抗体（図２Ｂ）によって検出又は染色した。
【図2C】古典的なシグナルペプチドのように挙動するＰＡＲ２シグナルペプチドを示す。図２Ｃは、免疫蛍光染色及びＥＬＩＳＡによる、細胞におけるＩｇＧ－Ｆｃ発現の検出を示す。示されるように、様々なＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＯＳ７細胞を固定し、洗剤を用いて浸透させた後、ＥＬＩＳＡ（図２Ｃ）によって検出又は染色した。ＥＬＩＳＡについては、実験を４連で実施し、結果は平均±標準偏差で示されている。統計分析（一元配置分散分析）は、対照（ＮＣ）と比較して、ＰＡＲ２（＊＊ｐ＝０．００１９）、ＰＡＲ２ΔＳＰ（＊ｐ＝０．０２４９）、ＩＮ（＊＊ｐ＝０．００２４）、及びＩＲ（＊＊ｐ＝０．００３８）が有意なレベルで発現されたことを実証した。
【図2D】古典的なシグナルペプチドのように挙動するＰＡＲ２シグナルペプチドを示す。図２Ｄは、ＥＬＩＳＡによる培地へのＩｇＧ－Ｆｃ分泌の検出を示す。ＰＡＲ２ Ｎ末端（ＰＡＲ２）、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２ Ｎ末端（ＰＡＲ２ΔＳＰ）、インスリンのＮ末端（ＩＮ）、及びインスリン受容体（ＩＲ）のＮ末端を含む、異なるＮ末端を有する様々なＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＯＳ７細胞由来の無血清馴化培地。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照（ＮＣ）として使用した。実験を４連で実施し、結果は平均±標準偏差で示されている。統計分析（一元配置分散分析）は、対照（ＮＣ）と比較して、ＰＡＲ２、ＩＮ、及びＩＲが多量の分泌されたＩｇＧ－Ｆｃタンパク質を示すことを示した（＊＊＊ｐ＜０．０００１）。全ての実験は３回実施され、非常によく似た結果が観察された。
【図3】ＰＡＲ２成熟タンパク質のアミノ（Ｎ）末端配列の決定を示す。ＰＡＲ２のＮ末端細胞外領域は、ＩｇＧ－ＦｃのＮ末端に融合されている。ＰＡＲ２の予測シグナルペプチドが示され、下線が引かれている。ＩｇＧ－Ｆｃ領域が示されている。潜在的なＮ－結合型グリコシル化部位、ＮＲＳには、下線が引かれている。タンパク質をＣＯＳ７細胞において発現させ、アフィニティー精製した。精製したタンパク質のＮ末端を、トリプシン消化後のＭＳ配列決定によって決定した。２つの配列、すなわち、非グリコシル化及びグリコシル化ＰＡＲ２ Ｎ末端を表すＴＩＱＧＴＮＲ（配列番号４２）及びＴＩＱＧＴＤＲ（配列番号４３）が観察された。
【図4A】ＰＡＲ１及びＰＡＲ２受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ７、及びＨＥＫ２９３細胞を示す。図４Ａは、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ７、及びＨＥＫ２９３細胞が、高レベルのＰＡＲ１及びＰＡＲ２ ｍＲＮＡを自然発現するが、ＰＡＲ３及びＰＡＲ４ ｍＲＮＡをほとんど又は全く自然発現しないことを実証する。ｍＲＮＡ発現を定量化するために、ｑＰＣＲ分析を使用した。テンプレートとして各細胞株から作製されたｃＤＮＡを使用してそれぞれのｍＲＮＡ発現を定量化するために、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４のそれぞれの特異的プライマーを使用した。β－アクチンプライマーを使用して、β－アクチンｍＲＮＡ発現を内部対照として定量化した。ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４の相対ｍＲＮＡ発現を、最初に、β－アクチン発現を用いて正規化し、次いで、１００％として任意に設定される、ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるＰＡＲ１発現レベルを用いて正規化した。他の遺伝子の相対発現は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるＰＡＲ１ ｍＲＮＡレベルの百分率として表した。示されている結果は、平均±標準偏差（ｎ＝３）である。統計分析（一元配置分散分析）は、これらの細胞において検出不可能である、ＰＡＲ４のｍＲＮＡ発現と比較して、ＣＨＯ細胞が、ＰＡＲ１（＊＊ｐ＝０．００３７）、ＰＡＲ２（＊ｐ＝０．０２３）、及びＰＡＲ３（＊ｐ＝０．０３５）に対して高レベルのｍＲＮＡを発現することを示した。ＣＯＳ７及びＨＥＫ２９３細胞は、検出可能なＰＡＲ３及びＰＡＲ４ ｍＲＮＡを発現せずに、ＰＡＲ１（それぞれ、＊＊ｐ＝０．００２９、＊ｐ＝０．０３２）及びＰＡＲ２（それぞれ、＊＊ｐ＝０．００１３、＊＊ｐ＝０．００２７）に対して高レベルのｍＲＮＡを発現する。
【図4B】ＰＡＲ１及びＰＡＲ２受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ７、及びＨＥＫ２９３細胞を示す。図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ７、及びＨＥＫ２９３細胞が、ＰＡＲ１及びＰＡＲ２受容体を自然発現し、トロンビン（ＰＡＲ１リガンド）及びトリプシン（ＰＡＲ２リガンド）刺激に反応することを実証した。ＦＬＩＰＲアッセイを使用して、細胞内Ｃａ２＋動員によって示される受容体活性化を測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、Ｃａ２＋動員シグナルに対する蛍光強度の読み出し情報であった。様々な濃度のトロンビン又はトリプシンをリガンドとして使用して受容体を活性化した。アッセイは各データ点において３連で実施され、平均±標準偏差が示されている。
【図4C】ＰＡＲ１及びＰＡＲ２受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ７、及びＨＥＫ２９３細胞を示す。図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ７、及びＨＥＫ２９３細胞が、ＰＡＲ１及びＰＡＲ２受容体を自然発現し、トロンビン（ＰＡＲ１リガンド）及びトリプシン（ＰＡＲ２リガンド）刺激に反応することを実証した。ＦＬＩＰＲアッセイを使用して、細胞内Ｃａ２＋動員によって示される受容体活性化を測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、Ｃａ２＋動員シグナルに対する蛍光強度の読み出し情報であった。様々な濃度のトロンビン又はトリプシンをリガンドとして使用して受容体を活性化した。アッセイは各データ点において３連で実施され、平均±標準偏差が示されている。
【図4D】ＰＡＲ１及びＰＡＲ２受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ７、及びＨＥＫ２９３細胞を示す。図４Ｂ、図４Ｃ、及び図４Ｄは、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ７、及びＨＥＫ２９３細胞が、ＰＡＲ１及びＰＡＲ２受容体を自然発現し、トロンビン（ＰＡＲ１リガンド）及びトリプシン（ＰＡＲ２リガンド）刺激に反応することを実証した。ＦＬＩＰＲアッセイを使用して、細胞内Ｃａ２＋動員によって示される受容体活性化を測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）は、Ｃａ２＋動員シグナルに対する蛍光強度の読み出し情報であった。様々な濃度のトロンビン又はトリプシンをリガンドとして使用して受容体を活性化した。アッセイは各データ点において３連で実施され、平均±標準偏差が示されている。
【図4E】ＰＡＲ１及びＰＡＲ２受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ７、及びＨＥＫ２９３細胞を示す。図４Ｅは、ｐａｒ１及びｐａｒ２ノックアウトＨＥＫ２９３細胞からのゲノムＤＮＡの配列解析を示す。結果は、ｐａｒ１遺伝子における２７０ｂｐ欠失及びｐａｒ２遺伝子における３４７ｂｐ欠失が達成されたことを示す。欠失は、ＰＡＲ１及びＰＡＲ２タンパク質の両方について、ＴＭ２からＴＭ３までのコード領域を除去した。垂直線は、欠失部位を示す。
【図4F】ＰＡＲ１及びＰＡＲ２受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１、ＣＯＳ７、及びＨＥＫ２９３細胞を示す。図４Ｆは、ｐａｒ１及びｐａｒ２ノックアウトＨＥＫ２９３細胞の特性評価を示す。示されるように受容体活性化を特性評価するために、ＦＬＩＰＲアッセイを使用した。野生型ＨＥＫ２９３細胞を陽性対照として使用した。アッセイは各データ点において３連で実施され、平均±標準偏差が示されている。
【図5A】シグナルペプチドがＰＡＲ２の機能発現に重要であることを実証する。図５Ａは、ＰＡＲ２受容体に対する修正を示す概略図を示す。様々なＰＡＲ２変異体のＮ末端細胞外配列が示されている。ヒトＰＡＲ２野生型（ＰＡＲ２）（配列番号５７）、シグナルペプチドが欠失しているＰＡＲ２（ＰＡＲ２ΔＳＰ）（配列番号４５）、インスリンシグナルペプチドを有するＰＡＲ２（ＰＡＲ２－ＩＮＳＰ）（配列番号４７）、及びインスリン受容体シグナルペプチドを有するＰＡＲ２（ＰＡＲ２－ＩＲＳＰ）（配列番号４９）。ＰＡＲ２の天然シグナルペプチド、インスリンシグナルペプチド、及びインスリン受容体シグナルペプチドが示されている。ＰＡＲ２のテザーリガンド配列（ＳＬＩＧＫＶ）（配列番号１）には、下線が引かれている。
【図5B】シグナルペプチドがＰＡＲ２の機能発現に重要であることを実証する。図５Ｂ及び図５Ｃは、トリプシン又は合成ＰＡＲ２アゴニストペプチド（ＰＡＲ２－ＡＰ）（配列番号１）をリガンドとして使用したＦＬＩＰＲアッセイにおけるＰＡＲ２変異体の特性評価を示す。ＰＡＲ２野生型受容体及び様々な修正の発現コンストラクトをｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞で一過的に発現させた。様々な濃度のトリプシン（図５Ｂ）又はＰＡＲ－ＡＰ（配列番号１）（図５Ｃ）を添加して、細胞内Ｃａ２＋動員を刺激した。相対蛍光強度単位（ＲＦＵ）が示されている。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。ｐａｒ１及びｐａｒ２遺伝子がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、様々なＰＡＲ２受容体の組換え発現のための宿主細胞として使用した。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照（ＮＣ）として使用した。
【図5C】シグナルペプチドがＰＡＲ２の機能発現に重要であることを実証する。図５Ｂ及び図５Ｃは、トリプシン又は合成ＰＡＲ２アゴニストペプチド（ＰＡＲ２－ＡＰ）（配列番号１）をリガンドとして使用したＦＬＩＰＲアッセイにおけるＰＡＲ２変異体の特性評価を示す。ＰＡＲ２野生型受容体及び様々な修正の発現コンストラクトをｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞で一過的に発現させた。様々な濃度のトリプシン（図５Ｂ）又はＰＡＲ－ＡＰ（配列番号１）（図５Ｃ）を添加して、細胞内Ｃａ２＋動員を刺激した。相対蛍光強度単位（ＲＦＵ）が示されている。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。ｐａｒ１及びｐａｒ２遺伝子がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、様々なＰＡＲ２受容体の組換え発現のための宿主細胞として使用した。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照（ＮＣ）として使用した。
【図6A】テザーリガンドの更なる欠失が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現をレスキューすることを示す。図６Ａは、ＰＡＲ２受容体に対する修正を示す概略図を示す。様々なＰＡＲ２変異体のＮ末端細胞外配列が示されている。ヒトＰＡＲ２野生型（ＰＡＲ２）（配列番号５７）、シグナルペプチドが欠失しているＰＡＲ２（ＰＡＲ２ΔＳＰ）（配列番号４５）、シグナルペプチドが欠失し、かつテザーリガンド領域に対する更なる欠失を有するＰＡＲ２（ＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ）（配列番号５１）。ＰＡＲ２のシグナルペプチドが示されている。ＰＡＲ２のテザーリガンド配列（ＳＬＩＧＫＶ）（配列番号１）には、下線が引かれている。
【図6B】テザーリガンドの更なる欠失が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現をレスキューすることを示す。図６Ｂ及び図６Ｃは、ＦＬＩＰＲアッセイを用いた変異体ＰＡＲ２受容体の特性評価を示す。様々なＰＡＲ２発現コンストラクトを、ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３において一過的に発現させた。トリプシン（図６Ｂ）又は合成アゴニストペプチドＰＡＲ２リガンド（ＰＡＲ２－ＡＰ）（配列番号１）（図６Ｃ）をリガンドとして使用して、受容体活性化を刺激した。ｐａｒ１及びｐａｒ２遺伝子がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、様々なＰＡＲ２受容体の組換え発現のための宿主細胞として使用した。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照（ＮＣ）として使用した。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。
【図6C】テザーリガンドの更なる欠失が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現をレスキューすることを示す。図６Ｂ及び図６Ｃは、ＦＬＩＰＲアッセイを用いた変異体ＰＡＲ２受容体の特性評価を示す。様々なＰＡＲ２発現コンストラクトを、ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３において一過的に発現させた。トリプシン（図６Ｂ）又は合成アゴニストペプチドＰＡＲ２リガンド（ＰＡＲ２－ＡＰ）（配列番号１）（図６Ｃ）をリガンドとして使用して、受容体活性化を刺激した。ｐａｒ１及びｐａｒ２遺伝子がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、様々なＰＡＲ２受容体の組換え発現のための宿主細胞として使用した。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照（ＮＣ）として使用した。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。
【図7A】Ａｒｇ３６からＡｌａへの変異が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を助けることを示す。図７Ａは、ＰＡＲ２受容体に対する修正／変異を示す概略図を示す。様々なＰＡＲ２変異体のＮ末端細胞外配列が示されている。特性評価のために、ＰＡＲ２野生型（ＰＡＲ２）（配列番号５７）、Ａｒｇ３６Ａｌａ変異を有するＰＡＲ２（ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ））（配列番号５５）、シグナルペプチドが欠失しているＰＡＲ２（ＰＡＲ２ΔＳＰ）（配列番号４５）、シグナルペプチドが欠失し、かつＡｒｇ３６Ａｌａ変異を有するＰＡＲ２（ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ））（配列番号５３）を使用した。ＰＡＲ２のシグナルペプチドが示されている。ＰＡＲ２のテザーリガンド配列（ＳＬＩＧＫＶ）（配列番号１）には、下線が引かれている。ＰＡＲ２のトリプシン開裂／活性化に関与する、Ａｒｇ３６を置換したＡｌａ残基が強調されている。
【図7B】Ａｒｇ３６からＡｌａへの変異が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を助けることを示す。変異体受容体を、トリプシン（図７Ｂ）又はＰＡＲ２－ＡＰ（図７Ｃ）のいずれかをリガンドとして使用したＦＬＩＰＲアッセイで特性評価した。ｐａｒ１及びｐａｒ２遺伝子がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、組換え発現のための宿主細胞として使用した。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照（ＮＣ）として使用した。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。
【図7C】Ａｒｇ３６からＡｌａへの変異が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を助けることを示す。変異体受容体を、トリプシン（図７Ｂ）又はＰＡＲ２－ＡＰ（図７Ｃ）のいずれかをリガンドとして使用したＦＬＩＰＲアッセイで特性評価した。ｐａｒ１及びｐａｒ２遺伝子がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、組換え発現のための宿主細胞として使用した。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照（ＮＣ）として使用した。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。
【図8A】セリンプロテアーゼ阻害剤カクテルが、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を増加させることを示す。ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、様々なＰＡＲ２タンパク質の一過性発現のために使用した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）による処理は、全ての受容体について同様の程度でＥｍａｘ値を低下させた。プロテアーゼ処理サンプルは、Ｅｍａｘ値において未処理細胞のものと比較して約８０％の反応を示した。プロテアーゼ阻害剤カクテルで処理されたサンプルと処理されていないサンプルとの間でＥＣ５０値を比較するために、それらのＥｍａｘ値を用いて結果を正規化し、データをＥｍａｘの百分率として表した。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。
【図8B】セリンプロテアーゼ阻害剤カクテルが、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を増加させることを示す。ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、様々なＰＡＲ２タンパク質の一過性発現のために使用した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）による処理は、全ての受容体について同様の程度でＥｍａｘ値を低下させた。プロテアーゼ処理サンプルは、Ｅｍａｘ値において未処理細胞のものと比較して約８０％の反応を示した。プロテアーゼ阻害剤カクテルで処理されたサンプルと処理されていないサンプルとの間でＥＣ５０値を比較するために、それらのＥｍａｘ値を用いて結果を正規化し、データをＥｍａｘの百分率として表した。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。
【図8C】セリンプロテアーゼ阻害剤カクテルが、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を増加させることを示す。ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、様々なＰＡＲ２タンパク質の一過性発現のために使用した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）による処理は、全ての受容体について同様の程度でＥｍａｘ値を低下させた。プロテアーゼ処理サンプルは、Ｅｍａｘ値において未処理細胞のものと比較して約８０％の反応を示した。プロテアーゼ阻害剤カクテルで処理されたサンプルと処理されていないサンプルとの間でＥＣ５０値を比較するために、それらのＥｍａｘ値を用いて結果を正規化し、データをＥｍａｘの百分率として表した。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。
【図8D】セリンプロテアーゼ阻害剤カクテルが、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を増加させることを示す。ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、様々なＰＡＲ２タンパク質の一過性発現のために使用した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）による処理は、全ての受容体について同様の程度でＥｍａｘ値を低下させた。プロテアーゼ処理サンプルは、Ｅｍａｘ値において未処理細胞のものと比較して約８０％の反応を示した。プロテアーゼ阻害剤カクテルで処理されたサンプルと処理されていないサンプルとの間でＥＣ５０値を比較するために、それらのＥｍａｘ値を用いて結果を正規化し、データをＥｍａｘの百分率として表した。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。
【図8E】セリンプロテアーゼ阻害剤カクテルが、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を増加させることを示す。ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、様々なＰＡＲ２タンパク質の一過性発現のために使用した。プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）による処理は、全ての受容体について同様の程度でＥｍａｘ値を低下させた。プロテアーゼ処理サンプルは、Ｅｍａｘ値において未処理細胞のものと比較して約８０％の反応を示した。プロテアーゼ阻害剤カクテルで処理されたサンプルと処理されていないサンプルとの間でＥＣ５０値を比較するために、それらのＥｍａｘ値を用いて結果を正規化し、データをＥｍａｘの百分率として表した。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。
【図9】ＰＡＲ２野生型及び変異体の細胞表面タンパク質発現及び総タンパク質発現を示す。ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞を、様々なＰＡＲ２タンパク質の一過性発現のために使用した。ＰＡＲ２ペプチドリガンド、ＰＡＲ２－ＡＰ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）を処理に使用した。対照処理として培地を使用した。細胞浸透性試薬あり又はなしでＥＬＩＳＡを使用して、総細胞表面タンパク質発現及び総タンパク質発現を測定した。実験は各データ点において３連で実施され、示されている結果は平均±標準偏差である。統計分析（一元配置分散分析）は、細胞表面タンパク質及び総タンパク質の両方について、ＰＡＲ２ΔＳＰ、ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ）、及びＰＡＲ２ΔＳＰΔＬが、ＰＡＲ２と比較してより低いタンパク質発現を有することを示した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＰＡＲ２ΔＳＰと比較して、ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ）は、はるかに高いタンパク質発現を有する（＄＄＄＄ｐ＜０．０００１）。ＰＡＲ２ΔＳＰを除いて、ＰＡＲ２－ＡＰは、他の全てに対してタンパク質発現を減少させた（＃＃＃＃ｐ＜０．０００１）。プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）は、ＰＡＲ２ΔＳＰに対してタンパク質発現を増加させただけであり（＋＋＋＋ｐ＜０．０００１）、他に対してはタンパク質発現に影響を与えなかった。実験は３回実施され、非常によく似た結果が観察された。
【図10A】Ａｒｇ３６Ａｌａ変異及びプロテアーゼ阻害剤が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２－ＧＦＰの細胞表面発現を増加させることを示す。図１０Ａは、様々なＰＡＲ２－ＧＦＰ融合タンパク質発現コンストラクトの概略表示を示す。
【図10B】Ａｒｇ３６Ａｌａ変異及びプロテアーゼ阻害剤が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２－ＧＦＰの細胞表面発現を増加させることを示す。図１０Ｂは、ＰＡＲ２－ＡＰ又はプロテアーゼ阻害剤の処理を有する様々なＰＡＲ２－ＧＦＰタンパク質の発現レベルを示す。様々なＰＡＲ２－ＧＦＰ発現コンストラクトを、ｐａｒ１及びｐａｒ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現させた。トランスフェクトされた細胞を、培地（培地）、ペプチドアゴニスト（ＰＡＲ２－ＡＰ）、又はプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）のいずれかで処理し、ＰＡＲ２－ＧＦＰ融合タンパク質を発現している細胞の蛍光強度を測定した。アッセイは各データ点において４連で実施され、示されている結果は平均＋標準偏差である。統計分析（一元配置分散分析）は、ＰＡＲ２と比較して、ＰＡＲ２ΔＳＰ及びＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ）が、より低いタンパク質発現を有することを示した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。ＰＡＲ２ΔＳＰと比較して、ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ）は、はるかに高いタンパク質発現を有する（＄＄＄＄ｐ＜０．０００１）。ＰＡＲ２ΔＳＰを除いて、ＰＡＲ２－ＡＰは、他の全てに対してタンパク質発現を減少させた（＃＃＃＃ｐ＜０．０００１）。プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩ）は、ＰＡＲ２ΔＳＰに対してタンパク質発現を増加させただけであり（＋＋＋＋ｐ＜０．０００１）、他に対してはタンパク質発現に影響を与えなかった。
【図10C】Ａｒｇ３６Ａｌａ変異及びプロテアーゼ阻害剤が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２－ＧＦＰの細胞表面発現を増加させることを示す。図１０Ｃは、ＰＡＲ２－ＡＰ又はプロテアーゼ阻害剤の処理下での様々なＰＡＲ２－ＧＦＰ融合タンパク質の細胞分布を示す共焦点顕微鏡からの蛍光画像を示す。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照（ＮＣ）として使用した。蛍光強度は、タンパク質細胞分布のより良好な観察のために自動的に調整されている。
【図11】形質膜に到達する前のプロテアーゼ開裂からＰＡＲ２を保護する際のＰＡＲ２シグナルペプチドの提案された役割を示す概略図を示す。シグナルペプチドを有しない場合、ＰＡＲ２のプロテアーゼ活性化部位は、ＥＲ及びゴルジ中でプロテアーゼ開裂を受けやすく、これは、細胞表面に到達する前のＰＡＲ２活性化、及びその後の分解のためのリソソームへの移動につながる。シグナルペプチドを有する場合、ＰＡＲ２は、シグナルペプチド関連トランスロコン複合体によって結合され、ＥＲ／ゴルジプロテアーゼによる開裂から分離／保護され、これにより、受容体は、細胞外トリプシン活性化を感知するために、形質膜に到達することが可能になる。Ｎ末端におけるＰＡＲ２のシグナルペプチドが示されている。ＰＡＲ２のＮ末端における星は、トリプシンによる開裂／活性化部位（Ａｒｇ３６）を表す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【0025】
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。
【0026】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
【0027】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
【0028】
別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した特定の実施形態に対して多くの同等物を認識するか、又は確認することができよう。このような等価物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0029】
本明細書で使用するとき、用語「備える（comprises）、「備える（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（has）」、「有する（having）」、「含有する（contains）」、又は「含有する（containing）」あるいはこれらの任意の他の変形形態は、述べられている整数又は整数群を含むことが意図されるが、これら以外の他の整数又は整数群を除外するものではなく、非排他的又は非制限的であることが意図されることが理解されよう。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されない、又はそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に本来存在しない他の要素を含んでもよい。更に、明示的に反対に明記されない限り、「又は」は包括的な「又は」を指すものであり、排他的な「又は」を指すものではない。例えば、条件Ａ又はＢは、Ａが真であり（又は存在する）かつＢが偽である（又は存在しない）場合、Ａが偽であり（又は存在しない）かつＢが真である（又は存在する）場合、並びにＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）場合、のいずれか１つによって充足される。
【0030】
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の接続的な用語「及び／又は」は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用されるとき、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすことが理解される。
【0031】
本明細書で使用するとき、用語「からなる（consists of）」又は「からなる（consist of）」若しくは「からなる（consisting of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含するが、追加の整数又は整数群が、指定の方法、構造、又は組成物に追加されることはないことを示す。
【0032】
本明細書で使用するとき、用語「から本質的になる（consists essentially of）」又は「から本質的になる（consist essentially of）」若しくは「から本質的になる（consisting essentially of）」などの変形は、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって使用するとき、任意の列挙された整数又は整数群を包含し、任意選択で、指定の方法、構造、又は組成物の基本的又は新規の特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数群も包含することを示す。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．§２１１１．０３を参照されたい。
【0033】
本明細書で使用される場合、「被験体／対象」は、任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書で使用するとき、用語「哺乳動物」は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、これらに限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられる。
【0034】
好ましい発明の構成要素の寸法又は特徴を指すときに本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概ね」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されるように、記載の寸法／特徴が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似する、それらからのわずかな相違を除外するものではないことを示すことも理解すべきである。最小値では、数値パラメータを含むこのような参照は、当該技術分野において受け入れられている数学的及び工業的原理（例えば、四捨五入、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用すると、最小有効数字は変化しない変形形態を含むであろう。
【0035】
「同一」又は「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列（例えば、ＰＡＲ２ポリペプチド及びそれをコードするＰＡＲ２ポリヌクレオチド）に関連して、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して又は目視検査によって測定したとき、一致が最大になるように比較及びアラインメントした場合に同じであるか、又は特定のパーセントの同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。
【0036】
配列比較のために、典型的には、１つの配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて、サブシーケンス座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
【0037】
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般的に、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって行うことができる。
【0038】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの例は、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントしたときに一致するか、又はいくつかの正の値の閾値スコアＴを満たすかのいずれかの、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、上記）と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿ってワードヒットを両方向に延長する。
【0039】
ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（一致する残基の対についてのリワードスコア、常に＞０）及びＮ（不一致の残基についてのペナルティスコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大獲得値から量Ｘだけ低下したとき、１つ以上の負のスコアリング残基のアラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に達したときに、各方向におけるワードヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照）。
【0040】
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似しているとみなされる。
【0041】
２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの更なる指標は、以下に記載されるように、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。したがって、ポリペプチドは、典型的には、第２のポリペプチドと実質的に同一であり、例えば、２つのペプチドは保存的置換によってのみ異なる。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件で互いにハイブリダイズすることである。
【0042】
本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」は、アミノ酸から構成される分子を指すことができ、当業者によってタンパク質として認識され得る。本明細書では、アミノ酸残基の従来の１文字又は３文字コードが使用される。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書において互換的に使用することができる。ポリマーは、直鎖又は分枝鎖であり得、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸により中断され得る。本用語はまた、自然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識構成成分とのコンジュゲート。また、定義には、例えば、アミノ酸の１つ又は２つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾が含まれる。
【0043】
本明細書に記載のペプチド配列は、通常の慣習に従って記載され、ペプチドのＮ末端領域は左側にあり、Ｃ末端領域は右側にある。アミノ酸の異性体形態は既知であるが、別途明示的に示されない限り、示されるのはアミノ酸のＬ型である。
【0044】
本明細書で使用するとき、用語「ＰＡＲ２」は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である、プロテアーゼ活性化受容体２タンパク質を指す。ＰＡＲ２は、ファミリーメンバーＰＡＲ１、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４と共に、クラスＡ ＧＰＣＲ受容体サブファミリーのメンバーである。ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４タンパク質は、ＰＡＲ１（Ｆ２Ｒ）、ＰＡＲ２（Ｆ２ＲＬ１）、ＰＡＲ３（Ｆ２ＲＬ２）、及びＰＡＲ４（Ｆ２ＲＬ３）をコードする遺伝子内の追加のエクソンによってコードされる、予測シグナルペプチドを有する。
【0045】
本明細書で使用するとき、用語「活性化」は、アゴニストが受容体（例えば、ＰＡＲ２）に結合し、その結果、受容体の下流経路へのシグナルカスケードをもたらす。一例として、薬剤によるＰＡＲ２の活性化は、本明細書に記載のように、Ｃａ２＋細胞内流入を増加させ、ＧＴＰγＳ結合を増加させ（例えば、非加水分解性ＧＴＰアナログＧＴＰγＳへのＧタンパク質の結合の増加において）、β－アレスチンリクルートメントを増加させ（例えば、ＧＰＣＲへのβ－アレスチンのリクルートメントの増加）、サイクリックＡＭＰ阻害を増加させ、イノシトールリン酸－１（ＩＰ）産生を増加させる経路の活性化をもたらす。
【0046】
本明細書で使用するとき、用語「調節」は、受容体（例えば、ＰＡＲ２）の活性化レベルの変化を指す。一例として、薬剤は、ＰＡＲ２活性化のレベルを低下させること（例えば、Ｃａ２＋細胞内流入を低減すること、ＧＴＰγＳ結合を低減すること、β－アレスチンリクルートメントを低減すること、サイクリックＡＭＰ阻害を低減すること、及びＩＰ産生を低減すること）によって活性化レベルを調節することができる。ＰＡＲ２活性化のレベルを低下させる薬剤は、ＰＡＲ２活性化の阻害剤（例えば、アンタゴニスト）である。別の例として、薬剤は、ＰＡＲ２活性化のレベルを増加させること（例えば、Ｃａ２＋細胞内流入を増加させること、ＧＴＰγＳ結合を増加させること、β－アレスチンリクルートメントを増加させること、サイクリックＡＭＰ阻害を増加させること、及びＩＰ産生を増加させること）によって活性化レベルを調節することができる。ＰＡＲ２活性化のレベルを増加させる薬剤は、ＰＡＲ２活性化のエンハンサ（例えば、アゴニスト）である。
【0047】
細胞内プロテアーゼ活性化受容体（例えば、ＰＡＲ２）活性化を増加させる薬剤を同定する方法
本明細書では、プロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法が提供される。この方法は、（ａ）細胞の表面にプロテアーゼ活性化受容体を発現する細胞を提供することであって、プロテアーゼ活性化受容体がシグナルペプチド配列を含む、ことと、（ｂ）細胞を薬剤と接触させることと、（ｃ）細胞の表面上のプロテアーゼ活性化受容体のレベルを測定することであって、対照と比較しての細胞の表面上のプロテアーゼ活性化受容体のレベルの低下は、薬剤が細胞内でプロテアーゼ活性化受容体を活性化可能であることを示す、ことと、を含む。
本明細書では、プロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法が提供される。この方法は、（ａ）細胞の表面にプロテアーゼ活性化受容体を発現する細胞を提供することであって、プロテアーゼ活性化受容体がシグナルペプチド配列を含む、ことと、（ｂ）細胞を薬剤と接触させることと、（ｃ）細胞の表面上のプロテアーゼ活性化受容体のレベルを測定することであって、対照と比較しての細胞の表面上のプロテアーゼ活性化受容体のレベルの低下は、薬剤が細胞内でプロテアーゼ活性化受容体を活性化可能であることを示す、ことと、を含む。
【0048】
特定の実施形態では、プロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法は、（ａ）細胞の表面にプロテアーゼ活性化受容体を発現する細胞を提供することであって、プロテアーゼ活性化受容体がシグナルペプチド配列を含む、ことと、（ｂ）細胞を薬剤と接触させることと、（ｃ）細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンド若しくは小分子と接触させることと、（ｄ）細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンドと接触させたときのプロテアーゼ活性化受容体の活性化レベルを測定することであって、対照と比較してのプロテアーゼ活性化受容体の活性化レベルの低下は、薬剤がプロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化可能であることを示す、ことと、を含む。
【0049】
特定の実施形態では、プロテアーゼ活性化受容体は、プロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ１）、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４からなる群から選択される。
【0050】
本明細書では、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法が提供される。この方法は、（ａ）細胞の表面にＰＡＲ２を発現する細胞を提供することであって、ＰＡＲ２がシグナルペプチド配列を含む、ことと、（ｂ）細胞を薬剤と接触させることと、（ｃ）細胞の表面上のＰＡＲ２のレベルを測定することであって、対照と比較しての細胞の表面上のＰＡＲ２のレベルの低下は、薬剤が細胞内でＰＡＲ２を活性化可能であることを示す、ことと、を含む。
【0051】
特定の実施形態では、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法は、（ａ）細胞の表面にＰＡＲ２を発現する細胞を提供することであって、ＰＡＲ２がシグナルペプチド配列を含む、ことと、（ｂ）細胞を薬剤と接触させることと、（ｃ）細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンド若しくは小分子と接触させることと、（ｄ）細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンドと接触させたときのＰＡＲ２の活性化レベルを測定することであって、対照と比較してのＰＡＲ２の活性化レベルの低下は、薬剤がＰＡＲ２を細胞内で活性化可能であることを示す、ことと、を含む。
【0052】
細胞内のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４のレベルを決定することは、当該技術分野において既知である、以下に記載される方法を使用して行うことができる。薬剤がＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４を細胞内で活性化することができるかどうかを判定するときに、細胞の表面上のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４のレベルを決定することができる。薬剤と接触した細胞の表面上のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４のレベルは、対照細胞の表面上のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４のレベルと比較することができる。特定の実施形態では、対照細胞は、薬剤と接触しない。特定の実施形態では、対照細胞は、変異体プロテアーゼ活性化受容体ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作され、好ましくは、変異体プロテアーゼ活性化受容体は、変異体ＰＡＲ２ポリペプチド（例えば、配列番号５５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＡＲ２ポリペプチドを発現する細胞）である。
【0053】
細胞内のプロテアーゼ活性化受容体（例えば、ＰＡＲ２）の活性化レベルを決定することは、当該技術分野において既知である、以下に記載される方法を使用して行うことができる。プロテアーゼ活性化受容体（例えば、ＰＡＲ２）の活性化レベルを決定することは、細胞内Ｃａ２＋動員、サイクリックＡＭＰ阻害、β－アレスチンリクルートメント、ＧＴＰγＳ結合、及び／又はＩＰ産生の変化を決定することによって達成することができる。薬剤がプロテアーゼ活性化受容体（例えば、ＰＡＲ２）を細胞内で活性化することができるかどうかを判定するときに、プロテアーゼ活性化受容体（例えば、ＰＡＲ２）活性化のレベルを決定することができる。薬剤と接触した細胞内でのプロテアーゼ活性化受容体（例えば、ＰＡＲ２）活性化のレベルは、対照細胞のプロテアーゼ活性化受容体（例えば、ＰＡＲ２）活性化のレベルと比較することができる。特定の実施形態では、対照細胞は、薬剤と接触しない。特定の実施形態では、対照細胞は、変異体プロテアーゼ活性化受容体（例えば、ＰＡＲ２）ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作される（例えば、配列番号５５に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＰＡＲ２ポリペプチドを発現する細胞）。
【0054】
ＰＡＲ２の活性化レベルを決定することは、細胞内Ｃａ２＋流入、サイクリックＡＭＰ阻害、β－アレスチンリクルートメント、ＧＴＰγＳ結合、及び／又はイノシトールリン酸－１（ＩＰ）産生の変化を決定することによって達成することができる。細胞内ＰＡＲ２活性化の増加は、細胞内Ｃａ２＋流入の増加、サイクリックＡＭＰ阻害の増加、β－アレスチンリクルートメントの増加、ＧＴＰγＳ結合の増加、及びＩＰ産生の増加につながり得る。細胞内ＰＡＲ２活性化の減少は、細胞内Ｃａ２＋流入の減少、サイクリックＡＭＰ阻害の減少、β－アレスチンリクルートメントの減少、ＧＴＰγＳ結合の減少、及びＩＰ産生の減少につながり得る。細胞内Ｃａ２＋流入、サイクリックＡＭＰ阻害、β－アレスチンリクルートメント、ＧＴＰγＳ結合、及びＩＰ産生の変化を決定するアッセイは、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８８：９１１－２５（２０１５）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：２８１１－２２（２００９）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７５（７３５７）：５１９－２３（２０１１）、及びＴｒｉｎｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．６：９８１－９４（２０１１）を参照されたい。
【0055】
特定の実施形態では、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４は、内因的に発現される。ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４を内因的に発現する細胞は、当該技術分野において既知であり、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、及びＨＥＫ２９３細胞を含むことができるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、内因性のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４発現は実質的に排除される。内因性のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４発現は、ヌクレオチド配列をノックアウトするための当該技術分野において既知の方法（例えば、相同組換え、標的欠失など）を用いて、細胞内のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４をコードするヌクレオチド配列をノックアウトすることによって排除することができる。内因性のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４発現は、ＲＮＡｉ技術を用いてＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４のｍＲＮＡ発現をノックダウンすることにより、排除することができる（例えば、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、若しくはＰＡＲ４ ｍＲＮＡ発現をノックダウンすることができる短干渉ＲＮＡ、及び／又はそれができるｍｉＲＮＡ若しくは短干渉ＲＮＡを産生するように設計されたコンストラクトの安定発現）。
【0056】
特定の実施形態では、薬剤は、小分子、ポリペプチド、抗体、脂質、多糖類、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される。薬剤は、化学ライブラリ、天然物ライブラリ、抗体ライブラリ、ペプチドライブラリ、多糖類ライブラリ、及びポリヌクレオチドライブラリから同定することができる。
【0057】
特定の実施形態では、薬剤は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４のシグナルペプチド配列に細胞内で結合してシグナルペプチド機能を妨害する。シグナルペプチド機能の妨害は、細胞内でのＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４の発現の低下につながり得る。細胞内でのＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４の発現の低下は、例えば、細胞内プロテアーゼ（例えば、トリプシン）によるＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４の開裂に起因し得る。したがって、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４のシグナルペプチド配列への薬剤の結合は、シグナルペプチド機能の妨害につながり得、これは、細胞の表面上のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、若しくはＰＡＲ４のレベルの低下、及び／又は細胞内のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、若しくはＰＡＲ４活性化のレベルの低下をもたらし得る。
【0058】
特定の実施形態では、薬剤は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４上のアロステリック部位に結合し、アロステリック部位への薬剤の結合は、シグナルペプチド機能を妨害する。ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４上のアロステリック部位への薬剤の結合は、例えば、シグナルペプチド機能の妨害につながり得るＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４の構造の変化につながり得る。シグナルペプチド機能の妨害は、細胞内でのＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４の発現の低下につながり得る。あるいは、シグナルペプチド機能の妨害は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４の構造の変化が、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４を活性化するプロテアーゼによるアクセシビリティの低下につながり得るので、細胞内でのＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４の活性化の低下につながり得る。したがって、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４上のアロステリック部位への薬剤の結合は、細胞の表面上のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、若しくはＰＡＲ４のレベルの低下、及び／又は細胞内のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、若しくはＰＡＲ４活性化のレベルの低下をもたらし得る。
【0059】
特定の実施形態では、プロテアーゼは、トリプシン、トリプターゼ、第Ｘａ因子ＴＦ、第ＶＩＩａ因子、マトリプターゼ／ＭＴ－セリンプロテアーゼ１、システインプロテイナーゼ（ＲｇｐＢ）、チリダニプロテイナーゼＤｅｒ ｐ３、チリダニプロテイナーゼＤｅｒ ｐ９、フリン、及びトロンビンからなる群から選択される。トリプシンとしては、例えば、トリプシン－２、トリプシン－３、トリプシンＩＶ、及びトリプシン（Ｔ１４２６）ａを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0060】
特定の実施形態では、ペプチドリガンドは、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号１）、ＳＬＩＧＲＬ－ＮＨ２（配列番号５８）、又は２－フロイル－ＬＩＧＲＬ－ＮＨ２（配列番号５９）を含む。ＰＡＲ２のペプチドリガンドは、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｋａｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４５：２５５－２６３（２００５）を参照されたい。
【0061】
特定の実施形態では、小分子はＧＢ１１０である。ＰＡＲ２の小分子アゴニストは、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５３：７４２８－４０（２０１０）を参照されたい。
【0062】
変異体ＰＡＲ２ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及びそれを含む細胞
一般的な態様では、本発明は、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドに関する。単離された変異体ポリペプチドは、例えば、シグナルペプチドの欠失、テザーリガンドの欠失、シグナルペプチド及びテザーリガンドの欠失、プロテアーゼ開裂部位（例えば、配列番号５７のＡｒｇ３６）の置換を含むことができる。特定の実施形態では、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドは、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５３、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一般的な態様では、本発明は、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドに関する。単離された変異体ポリペプチドは、例えば、シグナルペプチドの欠失、テザーリガンドの欠失、シグナルペプチド及びテザーリガンドの欠失、プロテアーゼ開裂部位（例えば、配列番号５７のＡｒｇ３６）の置換を含むことができる。特定の実施形態では、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドは、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５３、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【0063】
特定の実施形態では、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドは、配列番号５７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性、より好ましくは配列番号５７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、更により好ましくは配列番号５７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性、更により好ましくは配列番号５７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９８％の同一性、最も好ましくは配列番号５７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドは、配列番号５７に記載されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0064】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の変異体ＰＡＲ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、タンパク質のコード配列を変える（例えば置換する、欠失する、挿入するなど）ことができることが、当業者には理解されよう。したがって、本発明の変異体ＰＡＲ２ポリペプチドをコードする核酸配列を、タンパク質のアミノ酸配列を変えずに変化させることができる点は当業者には理解されるであろう。
【0065】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の変異体ＰＡＲ２をコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターに関する。プラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターなどの、本開示の観点から当業者に公知の任意のベクターも使用することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドなどの組換え発現ベクターである。ベクターは、例えば、プロモータ、リボソーム結合エレメント、ターミネータ、エンハンサ、選択マーカー、及び複製起点という、発現ベクターの従来の機能を確立するための任意のエレメントを含むことができる。プロモータは、常時発現型、誘導型、又は再形成可能なプロモータであり得る。細胞に核酸を送達することができる多数の発現ベクターが当該技術分野において既知であり、細胞内で融合ペプチドを生成するために、本明細書で使用することができる。従来のクローニング技術、又は人工遺伝子合成を使用して、本発明の実施形態に従った組換え発現ベクターを生成することができる。
【0066】
別の一般的態様では、本発明は、本発明の変異体ＰＡＲ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞、又は本発明の変異体ＰＡＲ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含むベクターに関する。本開示の観点から、当業者に既知の任意の宿主細胞を、本発明の変異体ポリペプチドの組換え発現に使用することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌ＴＧ１又はＢＬ２１細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４若しくはＣＨＯ－Ｋ１細胞、又はＨＥＫ２９３細胞である。特定の実施形態によれば、組換え発現ベクターは、組換え核酸が効果的に発現するように宿主細胞ゲノムに安定的に組み込まれる、化学的トランスフェクション、熱ショック、又はエレクトロポレーションなどの従来の方法によって宿主細胞に形質転換される。
【0067】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを産生する方法に関する。この方法は、本発明の変異体ＰＡＲ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、変異体ＰＡＲ２ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養することと、細胞又は培養物から（例えば、上清から）変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを回収することと、を含む。発現された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドは、当該技術分野において既知の従来技術に従って、また、本明細書に記載されるように、細胞から採取し、精製することができる。
【0068】
実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。
【0069】
実施形態１は、プロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法であって、
ａ．細胞の表面にプロテアーゼ活性化受容体を発現する細胞を提供することであって、プロテアーゼ活性化受容体がシグナルペプチド配列を含む、ことと、
ｂ．細胞を薬剤と接触させることと、
ｃ．細胞の表面上のプロテアーゼ活性化受容体のレベルを測定することであって、対照と比較しての細胞の表面上のプロテアーゼ活性化受容体のレベルの低下は、薬剤が細胞内でプロテアーゼ活性化受容体を活性化可能であることを示す、ことと、を含む、方法である。
ａ．細胞の表面にプロテアーゼ活性化受容体を発現する細胞を提供することであって、プロテアーゼ活性化受容体がシグナルペプチド配列を含む、ことと、
ｂ．細胞を薬剤と接触させることと、
ｃ．細胞の表面上のプロテアーゼ活性化受容体のレベルを測定することであって、対照と比較しての細胞の表面上のプロテアーゼ活性化受容体のレベルの低下は、薬剤が細胞内でプロテアーゼ活性化受容体を活性化可能であることを示す、ことと、を含む、方法である。
【0070】
実施形態２は、プロテアーゼ活性化受容体が、プロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ１）、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法である。
【0071】
実施形態３は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４が、内因的に又は外因的に発現される、実施形態２又は３に記載の方法である。
【0072】
実施形態４は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４が外因的に発現される、実施形態３に記載の方法である。
【0073】
実施形態５は、内因性のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４発現が実質的に排除される、実施形態４に記載の方法である。
【0074】
実施形態６は、細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、及びＨＥＫ２９３細胞からなる群から選択される、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法である。
【0075】
実施形態７は、薬剤が、小分子、ポリペプチド、抗体、脂質、多糖類、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法である。
【0076】
実施形態８は、対照が、変異体プロテアーゼ活性化受容体ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞であり、好ましくは、変異体プロテアーゼ活性化受容体ポリペプチドが変異体ＰＡＲ２ポリペプチドである、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法である。
【0077】
実施形態９は、変異体ＰＡＲ２ポリペプチドが、配列番号５５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態８に記載の方法である。
【0078】
実施形態１０は、薬剤が、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４のシグナルペプチド配列に細胞内で結合してシグナルペプチド機能を妨害する、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法である。
【0079】
実施形態１１は、薬剤が、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４上のアロステリック部位に結合し、アロステリック部位への薬剤の結合が、シグナルペプチド機能を妨害する、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法である。
【0080】
実施形態１２は、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法であって、
ａ．細胞の表面にＰＡＲ２を発現する細胞を提供することであって、ＰＡＲ２がシグナルペプチド配列を含む、ことと、
ｂ．細胞を薬剤と接触させることと、
ｃ．細胞の表面上のＰＡＲ２のレベルを測定することであって、対照と比較しての細胞の表面上のＰＡＲ２のレベルの低下は、薬剤が細胞内でＰＡＲ２を活性化可能であることを示す、ことと、を含む、方法である。
ａ．細胞の表面にＰＡＲ２を発現する細胞を提供することであって、ＰＡＲ２がシグナルペプチド配列を含む、ことと、
ｂ．細胞を薬剤と接触させることと、
ｃ．細胞の表面上のＰＡＲ２のレベルを測定することであって、対照と比較しての細胞の表面上のＰＡＲ２のレベルの低下は、薬剤が細胞内でＰＡＲ２を活性化可能であることを示す、ことと、を含む、方法である。
【0081】
実施形態１３は、ＰＡＲ２が内因的に又は外因的に発現される、実施形態１２に記載の方法である。
【0082】
実施形態１４は、ＰＡＲ２が外因的に発現される、実施形態１３に記載の方法である。
【0083】
実施形態１５は、内因性ＰＡＲ２発現が実質的に排除される、実施形態１４に記載の方法である。
【0084】
実施形態１６は、細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、及びＨＥＫ２９３細胞からなる群から選択される、実施形態１２～１５のいずれか１つに記載の方法である。
【0085】
実施形態１７は、薬剤が、小分子、ポリペプチド、抗体、脂質、多糖類、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態１２～１６のいずれか１つに記載の方法である。
【0086】
実施形態１８は、対照が、変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞である、実施形態１２～１７のいずれか１つに記載の方法である。
【0087】
実施形態１９は、変異体ＰＡＲ２ポリペプチドが、配列番号５５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１８に記載の方法である。
【0088】
実施形態２０は、薬剤が、ＰＡＲ２のシグナルペプチド配列に細胞内で結合してシグナルペプチド機能を妨害する、実施形態１２～１９のいずれか１つに記載の方法である。
【0089】
実施形態２１は、薬剤が、ＰＡＲ２上のアロステリック部位に結合し、アロステリック部位への薬剤の結合が、シグナルペプチド機能を妨害する、実施形態１２～２０のいずれか１つに記載の方法である。
【0090】
実施形態２２は、プロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法であって、
ａ．細胞の表面にＰＡＲ２を発現する細胞を提供することであって、ＰＡＲ２がシグナルペプチド配列を含む、ことと、
ｂ．細胞を薬剤と接触させることと、
ｃ．細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンド若しくは小分子と接触させることと、
ｄ．細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンドと接触させたときのＰＡＲ２の活性化レベルを測定することであって、対照と比較してのＰＡＲ２の活性化レベルの低下は、薬剤がＰＡＲ２を細胞内で活性化可能であることを示す、ことと、を含む、方法である。
ａ．細胞の表面にＰＡＲ２を発現する細胞を提供することであって、ＰＡＲ２がシグナルペプチド配列を含む、ことと、
ｂ．細胞を薬剤と接触させることと、
ｃ．細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンド若しくは小分子と接触させることと、
ｄ．細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンドと接触させたときのＰＡＲ２の活性化レベルを測定することであって、対照と比較してのＰＡＲ２の活性化レベルの低下は、薬剤がＰＡＲ２を細胞内で活性化可能であることを示す、ことと、を含む、方法である。
【0091】
実施形態２３は、ＰＡＲ２が内因的に又は外因的に発現される、実施形態２２に記載の方法である。
【0092】
実施形態２４は、ＰＡＲ２が外因的に発現される、実施形態２３に記載の方法である。
【0093】
実施形態２５は、内因性ＰＡＲ２発現が実質的に排除される、実施形態２４に記載の方法である。
【0094】
実施形態２６は、細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、及びＨＥＫ２９３細胞からなる群から選択される、実施形態２２～２５のいずれか１つに記載の方法である。
【0095】
実施形態２７は、薬剤が、小分子、ポリペプチド、抗体、脂質、多糖類、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態２２～２６のいずれか１つに記載の方法である。
【0096】
実施形態２８は、対照が、変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞である、実施形態２２～２７のいずれか１つに記載の方法である。
【0097】
実施形態２９は、変異体ＰＡＲ２ポリペプチドが、配列番号５５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態２８に記載の方法である。
【0098】
実施形態３０は、薬剤が、ＰＡＲ２のシグナルペプチド配列に細胞内で結合してシグナルペプチド機能を妨害する、実施形態２２～２９のいずれか１つに記載の方法である。
【0099】
実施形態３１は、薬剤が、ＰＡＲ２上のアロステリック部位に結合し、アロステリック部位への薬剤の結合が、シグナルペプチド機能を妨害する、実施形態２２～３０のいずれか１つに記載の方法である。
【0100】
実施形態３２は、プロテアーゼが、トリプシン、トリプターゼ、第Ｘａ因子ＴＦ、第ＶＩＩａ因子、マトリプターゼ／ＭＴ－セリンプロテアーゼ１、システインプロテイナーゼ（ＲｇｐＢ）、チリダニプロテイナーゼＤｅｒ ｐ３、チリダニプロテイナーゼＤｅｒ ｐ９、フリン、及びトロンビンからなる群から選択される、実施形態２２～３１のいずれか１つに記載の方法である。
【0101】
実施形態３３は、ペプチドリガンドが、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号１）、ＳＬＩＧＲＬ－ＮＨ２（配列番号５８）、又は２－フロイル－ＬＩＧＲＬ－ＮＨ２（配列番号５９）を含む、実施形態２２～３２のいずれか１つに記載の方法である。
【0102】
実施形態３４は、小分子がＧＢ１１０である、実施形態２２～３３のいずれか１つに記載の方法である。
【0103】
実施形態３５は、プロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化する薬剤を同定する方法であって、
ａ．細胞の表面にプロテアーゼ活性化受容体を発現する細胞を提供することであって、プロテアーゼ活性化受容体がシグナルペプチド配列を含む、ことと、
ｂ．細胞を薬剤と接触させることと、
ｃ．細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンド若しくは小分子と接触させることと、
ｄ．細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンドと接触させたときのプロテアーゼ活性化受容体の活性化レベルを測定することであって、対照と比較してのプロテアーゼ活性化受容体の活性化レベルの低下は、薬剤がプロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化可能であることを示す、ことと、を含む、方法である。
ａ．細胞の表面にプロテアーゼ活性化受容体を発現する細胞を提供することであって、プロテアーゼ活性化受容体がシグナルペプチド配列を含む、ことと、
ｂ．細胞を薬剤と接触させることと、
ｃ．細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンド若しくは小分子と接触させることと、
ｄ．細胞をプロテアーゼ及び／又はペプチドリガンドと接触させたときのプロテアーゼ活性化受容体の活性化レベルを測定することであって、対照と比較してのプロテアーゼ活性化受容体の活性化レベルの低下は、薬剤がプロテアーゼ活性化受容体を細胞内で活性化可能であることを示す、ことと、を含む、方法である。
【0104】
実施形態３６は、プロテアーゼ活性化受容体が、プロテアーゼ活性化受容体１（ＰＡＲ１）、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４からなる群から選択される、実施形態３５に記載の方法である。
【0105】
実施形態３７は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４が、内因的に又は外因的に発現される、実施形態３５又は３６に記載の方法である。
【0106】
実施形態３８は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４が外因的に発現される、実施形態３７に記載の方法である。
【0107】
実施形態３９は、内因性のＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４発現が実質的に排除される、実施形態３８に記載の方法である。
【0108】
実施形態４０は、細胞が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＯＳ－７細胞、及びＨＥＫ２９３細胞からなる群から選択される、実施形態３５～３９のいずれか１つに記載の方法である。
【0109】
実施形態４１は、薬剤が、小分子、ポリペプチド、抗体、脂質、多糖類、及びポリヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態３５～４０のいずれか１つに記載の方法である。
【0110】
実施形態４２は、対照が、変異体プロテアーゼ活性化受容体ポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞であり、好ましくは、変異体プロテアーゼ活性化受容体ポリペプチドが変異体ＰＡＲ２ポリペプチドである、実施形態３５～４１のいずれか１つに記載の方法である。
【0111】
実施形態４３は、変異体ＰＡＲ２ポリペプチドが、配列番号５５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４２に記載の方法である。
【0112】
実施形態４４は、薬剤が、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４のシグナルペプチド配列に細胞内で結合してシグナルペプチド機能を妨害する、実施形態３５～４３のいずれか１つに記載の方法である。
【0113】
実施形態４５は、薬剤が、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、又はＰＡＲ４上のアロステリック部位に結合し、アロステリック部位への薬剤の結合が、シグナルペプチド機能を妨害する、実施形態３５～４４のいずれか１つに記載の方法である。
【0114】
実施形態４６は、プロテアーゼが、トリプシン、トリプターゼ、第Ｘａ因子ＴＦ、第ＶＩＩａ因子、マトリプターゼ／ＭＴ－セリンプロテアーゼ１、システインプロテイナーゼ（ＲｇｐＢ）、チリダニプロテイナーゼＤｅｒ ｐ３、チリダニプロテイナーゼＤｅｒ ｐ９、フリン、及びトロンビンからなる群から選択される、実施形態３５～４５のいずれか１つに記載の方法である。
【0115】
実施形態４７は、ペプチドリガンドが、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号１）、ＳＬＩＧＲＬ－ＮＨ２（配列番号５８）、又は２－フロイル－ＬＩＧＲＬ－ＮＨ２（配列番号５９）を含む、実施形態３５～４６のいずれか１つに記載の方法である。
【0116】
実施形態４８は、小分子がＧＢ１１０である、実施形態３５～４７のいずれか１つに記載の方法である。
【0117】
実施形態４９は、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５３、及び配列番号５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドである。
【0118】
実施形態５０は、実施形態４９に記載の変異体ＰＡＲ２ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドである。
【0119】
実施形態５１は、実施形態５０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターである。
【0120】
実施形態５２は、実施形態５１に記載のベクターを含む宿主細胞である。
【0121】
実施形態５３は、単離された変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを産生する方法であって、方法は、実施形態５２に記載の宿主細胞を変異体ＰＡＲ２ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養することと、細胞又は培養物から変異体ＰＡＲ２ポリペプチドを回収することと、を含む、方法である。
【実施例】
【0122】
材料及び方法
試薬
ＰＡＲ２アゴニストペプチドリガンド、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号１）は、Ｉｎｎｏｐｅｐ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって合成された。トリプシン（シークエンシンググレード）、トロンビン、及びプロテアーゼ阻害剤は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
試薬
ＰＡＲ２アゴニストペプチドリガンド、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号１）は、Ｉｎｎｏｐｅｐ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって合成された。トリプシン（シークエンシンググレード）、トロンビン、及びプロテアーゼ阻害剤は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【0123】
ＰＡＲのｍＲＮＡ発現レベルの定量ＰＣＲ分析
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＲＮＡ単離キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を使用して、ＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞から全ＲＮＡをそれぞれ単離した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のｃＤＮＡ合成キット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ－ＰＣＲキット）を使用して、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ヒト、サル、及びハムスターのＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４に従って設計された特異的プライマーを使用して、記載されるようにｑＰＣＲ機（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ，ＡＢＩ）を使用して各ｍＲＮＡ発現を定量化した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７５：５１９－２３（２０１１））。並行して、β－アクチン用のプライマーを使用して、β－アクチンｃＤＮＡを内部対照として増幅した。β－アクチンの発現レベルを使用して、異なるＰＡＲ ｍＲＮＡの相対発現を正規化した。ｑＰＣＲプライマーは、公開されたｃＤＮＡ配列に基づいて設計したものであり、プライマー配列を表１に示す。
Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＲＮＡ単離キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ）を使用して、ＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞から全ＲＮＡをそれぞれ単離した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のｃＤＮＡ合成キット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ－ＰＣＲキット）を使用して、単離したＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ヒト、サル、及びハムスターのＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、及びＰＡＲ４に従って設計された特異的プライマーを使用して、記載されるようにｑＰＣＲ機（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ，ＡＢＩ）を使用して各ｍＲＮＡ発現を定量化した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４７５：５１９－２３（２０１１））。並行して、β－アクチン用のプライマーを使用して、β－アクチンｃＤＮＡを内部対照として増幅した。β－アクチンの発現レベルを使用して、異なるＰＡＲ ｍＲＮＡの相対発現を正規化した。ｑＰＣＲプライマーは、公開されたｃＤＮＡ配列に基づいて設計したものであり、プライマー配列を表１に示す。
【0124】
【表1】
【0125】
ＰＡＲ１、ＰＡＲ２ノックアウト細胞株の生成。
ＰＡＲ１、ＰＡＲ２ノックアウトＨＥＫ２９３細胞株は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ（Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アプローチを用いて作製された。簡潔に述べると、ＰＡＲ１のタンパク質領域の膜貫通領域２（ＴＭ２）から膜貫通領域３（ＴＭ３）までをコードする、ＰＡＲ１のコード領域（ヌクレオチド３７４～６４３）を欠失させた。同様に、ＰＡＲ２のタンパク質領域ＴＭ２からＴＭ３までをコードする、ＰＡＲ２のコード領域（２８１～６２７）を欠失させた。単一細胞クローンを単離した。ＤＮＡフラグメントの欠失を確認するために、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析、続いてＤＮＡ配列決定を使用した。
ＰＡＲ１、ＰＡＲ２ノックアウトＨＥＫ２９３細胞株は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ（Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アプローチを用いて作製された。簡潔に述べると、ＰＡＲ１のタンパク質領域の膜貫通領域２（ＴＭ２）から膜貫通領域３（ＴＭ３）までをコードする、ＰＡＲ１のコード領域（ヌクレオチド３７４～６４３）を欠失させた。同様に、ＰＡＲ２のタンパク質領域ＴＭ２からＴＭ３までをコードする、ＰＡＲ２のコード領域（２８１～６２７）を欠失させた。単一細胞クローンを単離した。ＤＮＡフラグメントの欠失を確認するために、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析、続いてＤＮＡ配列決定を使用した。
【0126】
ＰＡＲ２コンストラクトの分子クローニング。
ＰＡＲ２コード領域を、公開されたＰＡＲ２コード配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５２４２．５）に基づいて設計されたプライマー（５’ ａｔｇ ｔｃｔ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ａｔｇ ｃｇｇ ａｇｃ ｃｃｃ ａｇｃ ｇｃｇ ｇｃｇ ｔｇｇ ｃｔｇ ｃｔｇ－３’（配列番号３２）、リバースプライマー：５’－ａｔｇ ｔｃｔ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣｔ ｃａａ ｔａｇ ｇａｇ ｇｔｃ ｔｔａ ａｃａ ｇｔｇ ｇｔｔ ｇａａ ｃｔ－３’（配列番号３３））を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したヒト結腸ｃＤＮＡをテンプレートとして使用した。エキスパンドハイファイＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、全長ＰＡＲ２ ｃＤＮＡコード領域を増幅した。得られたＤＮＡを、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１制限酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して消化し、次いでｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。次いで、挿入領域がＥｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって配列決定され、コード領域全体の同一性を確認した。
ＰＡＲ２コード領域を、公開されたＰＡＲ２コード配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５２４２．５）に基づいて設計されたプライマー（５’ ａｔｇ ｔｃｔ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ａｔｇ ｃｇｇ ａｇｃ ｃｃｃ ａｇｃ ｇｃｇ ｇｃｇ ｔｇｇ ｃｔｇ ｃｔｇ－３’（配列番号３２）、リバースプライマー：５’－ａｔｇ ｔｃｔ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣｔ ｃａａ ｔａｇ ｇａｇ ｇｔｃ ｔｔａ ａｃａ ｇｔｇ ｇｔｔ ｇａａ ｃｔ－３’（配列番号３３））を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したヒト結腸ｃＤＮＡをテンプレートとして使用した。エキスパンドハイファイＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、全長ＰＡＲ２ ｃＤＮＡコード領域を増幅した。得られたＤＮＡを、ＥｃｏＲ１及びＮｏｔ１制限酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して消化し、次いでｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。次いで、挿入領域がＥｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって配列決定され、コード領域全体の同一性を確認した。
【0127】
Ａｒｇ３６Ａｌａ変異を有するＰＡＲ２（ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ））（配列番号５５）、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２（ＰＡＲ２ΔＳＰ）（配列番号４５）、Ａｒｇ３６Ａｌａ変異を有するＰＡＲ２ΔＳＰ（ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ））（配列番号５３）、並びにシグナルペプチド及びテザーリガンドを有しないＰＡＲ２（ＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ）（配列番号５１）の発現コンストラクトを、オーバーラッピングＰＣＲアプローチを使用した部位特異的変異導入によって生成した（Ｍａｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３５７：３９４－４１４（２０１６））。
【0128】
インスリンシグナルペプチド、又はインスリン受容体シグナルペプチドで置換されたシグナルペプチドコード領域を有するＰＡＲ２の遺伝子が、Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって合成された。同様に、Ｃ末端のヒトＩｇＧ－Ｆｃコード領域に融合されたＧＦＰを有する、ＰＡＲ２シグナルペプチドコード領域を有する若しくは有しない、インスリンを有する、又はインスリン受容体シグナルペプチドコード領域を有する様々なＰＡＲ２多様体の発現コンストラクトが合成された。遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１にクローニングし、コード領域全体を配列決定して同一性を確認した。
【0129】
細胞内Ｃａ２＋動員アッセイ
ＦＬＩＰＲ－Ｔｅｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＡＲ１及びＰＡＲ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞、並びに様々なＰＡＲ２発現コンストラクトで一過的にトランスフェクトされた細胞における細胞内Ｃａ２＋動員をモニターした。細胞を、９６ウェルのポリＤ－リジンコート黒色ＦＬＩＰＲプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２の３７℃にて増殖させた。一過性トランスフェクションのために、細胞を、９６ウェルのポリＤ－リジンコート黒色ＦＬＩＰＲプレートにおいて増殖させ、製造元の指示に従ってトランスフェクション試薬としてＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してトランスフェクトした。プロテアーゼ阻害剤で処理したサンプルについては、トランスフェクションの１日後にプロテアーゼカクテルを細胞培養物に添加し、一晩インキュベートした。トランスフェクションの２日後、細胞培養培地を除去し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを加えたＨＢＳＳ緩衝液を使用して細胞を洗浄した。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを加えたＨＢＳＳ緩衝液中に希釈されたＣａ２＋染料（Ｆｌｕｒａ ３）を使用して、Ｃａ２＋が細胞に入り込めるように細胞をＲＴで４０分間インキュベートした。様々な濃度のリガンド（トリプシン、又はペプチドリガンド）によって刺激された細胞内Ｃａ２＋動員を、記載されるようにＦＬＩＰＲ－Ｔｅｔｒａによってモニターした（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８８：９１１－２５（２０１５））。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照として使用した。
ＦＬＩＰＲ－Ｔｅｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＡＲ１及びＰＡＲ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞、並びに様々なＰＡＲ２発現コンストラクトで一過的にトランスフェクトされた細胞における細胞内Ｃａ２＋動員をモニターした。細胞を、９６ウェルのポリＤ－リジンコート黒色ＦＬＩＰＲプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２の３７℃にて増殖させた。一過性トランスフェクションのために、細胞を、９６ウェルのポリＤ－リジンコート黒色ＦＬＩＰＲプレートにおいて増殖させ、製造元の指示に従ってトランスフェクション試薬としてＦｕＧＥＮＥ ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してトランスフェクトした。プロテアーゼ阻害剤で処理したサンプルについては、トランスフェクションの１日後にプロテアーゼカクテルを細胞培養物に添加し、一晩インキュベートした。トランスフェクションの２日後、細胞培養培地を除去し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを加えたＨＢＳＳ緩衝液を使用して細胞を洗浄した。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを加えたＨＢＳＳ緩衝液中に希釈されたＣａ２＋染料（Ｆｌｕｒａ ３）を使用して、Ｃａ２＋が細胞に入り込めるように細胞をＲＴで４０分間インキュベートした。様々な濃度のリガンド（トリプシン、又はペプチドリガンド）によって刺激された細胞内Ｃａ２＋動員を、記載されるようにＦＬＩＰＲ－Ｔｅｔｒａによってモニターした（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．８８：９１１－２５（２０１５））。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照として使用した。
【0130】
ＩｇＧ－ＦＣ分泌の測定のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＣＯＳ７細胞を、６ウェルプレートにおいて、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭに、５％ＣＯ２の３７℃で増殖させ、製造元の指示に従ってトランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して様々なシグナルペプチドコード領域を有するヒトＩｇＧ－Ｆｃの異なる発現コンストラクトによってトランスフェクトした。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照として使用した。
ＣＯＳ７細胞を、６ウェルプレートにおいて、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭに、５％ＣＯ２の３７℃で増殖させ、製造元の指示に従ってトランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して様々なシグナルペプチドコード領域を有するヒトＩｇＧ－Ｆｃの異なる発現コンストラクトによってトランスフェクトした。トランスフェクトされていない細胞を陰性対照として使用した。
【0131】
培地中の分泌されたヒトＩｇＧ－ＦＣを測定するために、トランスフェクションの１日後、細胞を、ＰＢＳを使用して３回洗浄し、次いで、１ｍＭピルビン酸及び２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを加えた無血清ＤＭＥＭに培養した。トランスフェクションの３日後、トランスフェクトされた細胞からの馴化培地を採取し、４℃にて２０分間、１０，０００ｇで遠心分離して、細胞残屑を除去した。各トランスフェクションからの５０μＬの馴化培地を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＵｌｔｒａＣｒｕｚ（登録商標）ＥＬＩＳＡ Ｐｌａｔｅ、高結合、９６ウェル、平底、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）の１つのウェル内で、３７℃で１時間インキュベートして、培地中のタンパク質をプレートに吸着させた。プレートを、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳＴ）を使用して３回洗浄し、ＰＢＳＴ中の３％無脂肪乳を使用してＲＴで３０分間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中の３％無脂肪乳中に希釈されたＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇ－ＧＦ抗体（５０ｎｇ／ｍＬ）を使用して４℃で一晩インキュベートした。プレートを、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、次いで、ＥＬＩＳＡ構築キット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して構築した。４５０ｎｍにおける光学密度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して読み取った。
【0132】
細胞内ＩｇＧ－Ｆｃタンパク質を測定するために、トランスフェクションの１日後、細胞を、トリプシン処理し、９６ウェル培養プレートに播種し（３０，０００細胞／ウェル）、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭに増殖させた。トランスフェクションの３日後、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳを使用して洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の１０％ホルムアルデヒドによってＲＴで１５分間固定した。細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を使用してＲＴで１０分間浸透させ、ＰＢＳＴ中の３％無脂肪乳を使用してＲＴで３０分間ブロッキングした。次いで、細胞を、ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体を使用してインキュベートし、プレートを、上記のように構築して読み取った。
【0133】
細胞内ＩｇＧ－Ｆｃの免疫蛍光染色
ＣＯＳ７細胞を、様々なＩｇＧ－Ｆｃ発現コンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、細胞をトリプシン処理し、４ウェル細胞培養チャンバースライド（Ｓｔｅｌｌａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）に播種した（６０，０００細胞／ウェル）。トランスフェクションの３日後、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳを使用して洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の１０％ホルムアルデヒドによってＲＴで１５分間固定した。細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を使用してＲＴで１０分間浸透させ、ＰＢＳＴ中の３％無脂肪乳を使用してＲＴで３０分間ブロッキングした。次いで、細胞を、ＰＢＳＴ中の３％無脂肪乳中に希釈されたＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＣ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）（２００ｎｇ／μＬ）を使用して４℃で一晩インキュベートした。次いで、スライドを、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、冷気を使用して乾燥させ、蛍光顕微鏡下で観察した。
ＣＯＳ７細胞を、様々なＩｇＧ－Ｆｃ発現コンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、細胞をトリプシン処理し、４ウェル細胞培養チャンバースライド（Ｓｔｅｌｌａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）に播種した（６０，０００細胞／ウェル）。トランスフェクションの３日後、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳを使用して洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の１０％ホルムアルデヒドによってＲＴで１５分間固定した。細胞を、１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００を使用してＲＴで１０分間浸透させ、ＰＢＳＴ中の３％無脂肪乳を使用してＲＴで３０分間ブロッキングした。次いで、細胞を、ＰＢＳＴ中の３％無脂肪乳中に希釈されたＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＣ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）（２００ｎｇ／μＬ）を使用して４℃で一晩インキュベートした。次いで、スライドを、ＰＢＳＴを使用して３回洗浄し、冷気を使用して乾燥させ、蛍光顕微鏡下で観察した。
【0134】
ＰＡＲ２のシグナルペプチド開裂部位の同定
ＣＯＳ７細胞を、１５ｃｍディッシュにおいて、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭに、５％ＣＯ２の３７℃で増殖させた。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃＡｍｉｎｅを使用して、ＰＡＲ２のＮ末端を有するヒトＩｇＧ－ＦＣの発現コンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、細胞を、ＰＢＳを使用して３回洗浄し、次いで、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを加えた無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に培養した。トランスフェクションの３日後、培地を回収し、遠心分離して、細胞残屑を除去した。上清をプロテインＡ（Ｓｉｇｍａ）アフィニティーカラムに通した。カラムをＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．８）を使用して溶出し、次いで、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して中和した。溶出したタンパク質を、最初にＰＮＧａｓｅ－Ｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理してＮ－結合型グリコシル化を除去し、次いで、質量分析により分析してＮ末端配列を決定した。タンパク質配列決定を、一般的な溶液中タンパク質消化及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を使用して実施した。簡潔に述べると、５０ｍＭ重炭酸アンモニア緩衝液（ｐＨ７．８）中の１０μＬのタンパク質サンプルを、１１．３ｍＭジチオスレイトールによって６０℃で３０分間還元し（尿素なし）、３７．４ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化し（ＲＴ、４５分）、次いで、０．２μｇのトリプシンで消化した（３７℃、一晩）。ＬＣ／ＭＳ分析を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアバージョン４．０の制御下で、６５５０ｑＴＯＦ質量分析計に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＵＨＰＬＣ上で行った。クロマトグラフィーを、水／アセトニトリル／０．１％ギ酸を移動相としたＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐカラム（２．１×１００ｍｍ、２．７μｍ）でランし、質量分析データを、ＭＳモード及びＭＳＭＳモードの両方において取得した。
ＣＯＳ７細胞を、１５ｃｍディッシュにおいて、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＤＭＥＭに、５％ＣＯ２の３７℃で増殖させた。細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃＡｍｉｎｅを使用して、ＰＡＲ２のＮ末端を有するヒトＩｇＧ－ＦＣの発現コンストラクトでトランスフェクトした。トランスフェクションの１日後、細胞を、ＰＢＳを使用して３回洗浄し、次いで、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを加えた無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に培養した。トランスフェクションの３日後、培地を回収し、遠心分離して、細胞残屑を除去した。上清をプロテインＡ（Ｓｉｇｍａ）アフィニティーカラムに通した。カラムをＰＢＳで洗浄し、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．８）を使用して溶出し、次いで、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して中和した。溶出したタンパク質を、最初にＰＮＧａｓｅ－Ｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理してＮ－結合型グリコシル化を除去し、次いで、質量分析により分析してＮ末端配列を決定した。タンパク質配列決定を、一般的な溶液中タンパク質消化及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を使用して実施した。簡潔に述べると、５０ｍＭ重炭酸アンモニア緩衝液（ｐＨ７．８）中の１０μＬのタンパク質サンプルを、１１．３ｍＭジチオスレイトールによって６０℃で３０分間還元し（尿素なし）、３７．４ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化し（ＲＴ、４５分）、次いで、０．２μｇのトリプシンで消化した（３７℃、一晩）。ＬＣ／ＭＳ分析を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアバージョン４．０の制御下で、６５５０ｑＴＯＦ質量分析計に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＵＨＰＬＣ上で行った。クロマトグラフィーを、水／アセトニトリル／０．１％ギ酸を移動相としたＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐカラム（２．１×１００ｍｍ、２．７μｍ）でランし、質量分析データを、ＭＳモード及びＭＳＭＳモードの両方において取得した。
【0135】
ＰＡＲ２受容体を組換え発現する細胞のプロテアーゼ阻害剤処理
野生型及び様々な変異体ＰＡＲ２多様体発現コンストラクトを、ｐａｒ１及びｐａｒ２遺伝子がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ、５００μＭ）、ロイペプチン（５０μＭ）、アプロチニン（５０μＭ）を含むプロテアーゼ阻害剤カクテルで１２時間処理した。
野生型及び様々な変異体ＰＡＲ２多様体発現コンストラクトを、ｐａｒ１及びｐａｒ２遺伝子がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ、５００μＭ）、ロイペプチン（５０μＭ）、アプロチニン（５０μＭ）を含むプロテアーゼ阻害剤カクテルで１２時間処理した。
【0136】
ＥＬＩＳＡによるＰＡＲ２の総及び細胞表面発現の測定
ＥＬＩＳＡを使用して、総及び細胞表面ＰＡＲ２タンパク質発現を測定した。野生型及び異なる変異体ＰＡＲ２多様体を、内因性ＰＡＲ１及びＰＡＲ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現させた。細胞を、１０ｃｍ細胞培養ディッシュにおいてトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後、９６ウェルポリＤ－リジンコートプレートに分割した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を上記のように固定した。総ＰＡＲ２発現を測定するために、固定した細胞を、１％トリトン－Ｘ－１００を使用して浸透させ、３％無脂肪乳でブロッキングし、次いで、ヒトＰＡＲ２のＮ末端領域（アミノ酸残基３７～６２）を認識するモノクローナル抗体（３μｇ／ｍＬ、マウス抗ヒトＰＡＲ２（ＢｉｏＬｅｇａｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））と共に、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（３０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＲＴで１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳを使用して再度洗浄し、上記のようにＥＬＩＳＡ構築キットを使用して構築した。細胞表面ＰＡＲ２発現を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを、細胞浸透剤としてトリトン－Ｘ－１００を使用せずに総ＰＡＲ２測定と同じ方法で実施した。
ＥＬＩＳＡを使用して、総及び細胞表面ＰＡＲ２タンパク質発現を測定した。野生型及び異なる変異体ＰＡＲ２多様体を、内因性ＰＡＲ１及びＰＡＲ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現させた。細胞を、１０ｃｍ細胞培養ディッシュにおいてトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後、９６ウェルポリＤ－リジンコートプレートに分割した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を上記のように固定した。総ＰＡＲ２発現を測定するために、固定した細胞を、１％トリトン－Ｘ－１００を使用して浸透させ、３％無脂肪乳でブロッキングし、次いで、ヒトＰＡＲ２のＮ末端領域（アミノ酸残基３７～６２）を認識するモノクローナル抗体（３μｇ／ｍＬ、マウス抗ヒトＰＡＲ２（ＢｉｏＬｅｇａｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））と共に、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、冷ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（３０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＲＴで１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳを使用して再度洗浄し、上記のようにＥＬＩＳＡ構築キットを使用して構築した。細胞表面ＰＡＲ２発現を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを、細胞浸透剤としてトリトン－Ｘ－１００を使用せずに総ＰＡＲ２測定と同じ方法で実施した。
【0137】
ＰＡＲ２－ＧＦＰ融合タンパク質の総発現及び細胞局在の測定
ＰＡＲ２野生型及び様々な変異体のＧＦＰ融合タンパク質を、細胞内Ｃａ２＋動員アッセイの方法で上述したように、９６ウェルポリ－Ｄ－リジンプレートにおいて、内因性ＰＡＲ１及びＰＡＲ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞に一過的に発現させた。トランスフェクションの４８時間後、培地を吸引し、細胞を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して固定した。細胞の蛍光強度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して読み取った。次いで、固定した細胞を、ＰＡＲ２細胞局在のための共焦点顕微鏡法を使用して分析した。
ＰＡＲ２野生型及び様々な変異体のＧＦＰ融合タンパク質を、細胞内Ｃａ２＋動員アッセイの方法で上述したように、９６ウェルポリ－Ｄ－リジンプレートにおいて、内因性ＰＡＲ１及びＰＡＲ２がノックアウトされているＨＥＫ２９３細胞に一過的に発現させた。トランスフェクションの４８時間後、培地を吸引し、細胞を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して固定した。細胞の蛍光強度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して読み取った。次いで、固定した細胞を、ＰＡＲ２細胞局在のための共焦点顕微鏡法を使用して分析した。
【0138】
結果と考察
ＰＡＲ２シグナルペプチドは古典的なシグナルペプチドのように挙動する
ＰＡＲ２シグナルペプチドは、培地へのＩｇＧ－Ｆｃフラグメント分泌をもたらす。
古典的なシグナルペプチドは、典型的には、分泌されたタンパク質（インスリンなど）又は細胞表面タンパク質（インスリン受容体など）のいずれかのＮ末端に見出される。これは、典型的には、２０～３０個の疎水性アミノ酸残基のストレッチからなる。その既知の機能は、分泌されたタンパク質又は細胞表面タンパク質が、タンパク質翻訳中にＥＲを標的とし、形質膜を横切るのを助けることである。ＰＡＲ２は、そのＮ末端に予測シグナルペプチド配列を有しており、これは、古典的なシグナルペプチドとして機能すると仮定された。これに対処するために、ＰＡＲ２のシグナルペプチドがシグナルペプチドを欠くヒトＩｇＧ－Ｆｃフラグメントの細胞培養培地への分泌を可能にするかどうかを試験する、いくつかの発現コンストラクトが考案された（図２Ａ）。ＩｇＧ－Ｆｃは、ＥＬＩＳＡアッセイ又は免疫染色で検出が容易であることから、対照として使用した。哺乳類細胞に組換え発現されるとき、シグナルペプチドなしでは、ＩｇＧ－Ｆｃは細胞内でのみ発現する。対照的に、シグナルペプチドありでは、ＩｇＧ－Ｆｃは細胞培養培地に分泌され得る。１つのＩｇＧ－Ｆｃコンストラクトは、ＰＡＲ２のＮ末端をそのシグナルペプチドと共に含有し（配列番号３４（ＤＮＡ）、配列番号３５（タンパク質））、別のＩｇＧ－Ｆｃコンストラクトは、シグナルペプチドが欠失したＰＡＲ２ Ｎ末端を含有していた（配列番号３６（ＤＮＡ）、配列番号３７（タンパク質））。ヒトＩｇＧ－Ｆｃに融合されたインスリンシグナルペプチド（分泌されたタンパク質シグナルペプチド）又はインスリン受容体シグナルペプチド（細胞表面受容体シグナルペプチド）（それぞれ、配列番号３８（ＤＮＡ）、配列番号３９（タンパク質）及び配列番号４０（ＤＮＡ）、配列番号４１（タンパク質））を有するコンストラクトもまた、実験における陽性対照として使用した。免疫染色（図２Ｂ）及びＥＬＩＳＡ（図２Ｃ）を使用して、トランスフェクトされた細胞におけるＩｇＧ－Ｆｃ発現を検出及び測定し、様々なＩｇＧ－Ｆｃ発現コンストラクトでトランスフェクトされた全ての細胞が、細胞内でＩｇＧ－Ｆｃを発現することを実証した。ＰＡＲ２シグナルペプチドを有するＰＡＲ２のＮ末端をヒトＩｇＧ－Ｆｃに融合させることが、培地へのＩｇＧ－Ｆｃの分泌を効果的にもたらし、したがって、インスリンシグナルペプチド又はインスリン受容体シグナルペプチドと同様に機能することが実証された（図２Ｄ）。対照的に、ＰＡＲ２シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２ Ｎ末端を融合させることは、培地へのＩｇＧ－Ｆｃの分泌をもたらすことに失敗した。
ＰＡＲ２シグナルペプチドは古典的なシグナルペプチドのように挙動する
ＰＡＲ２シグナルペプチドは、培地へのＩｇＧ－Ｆｃフラグメント分泌をもたらす。
古典的なシグナルペプチドは、典型的には、分泌されたタンパク質（インスリンなど）又は細胞表面タンパク質（インスリン受容体など）のいずれかのＮ末端に見出される。これは、典型的には、２０～３０個の疎水性アミノ酸残基のストレッチからなる。その既知の機能は、分泌されたタンパク質又は細胞表面タンパク質が、タンパク質翻訳中にＥＲを標的とし、形質膜を横切るのを助けることである。ＰＡＲ２は、そのＮ末端に予測シグナルペプチド配列を有しており、これは、古典的なシグナルペプチドとして機能すると仮定された。これに対処するために、ＰＡＲ２のシグナルペプチドがシグナルペプチドを欠くヒトＩｇＧ－Ｆｃフラグメントの細胞培養培地への分泌を可能にするかどうかを試験する、いくつかの発現コンストラクトが考案された（図２Ａ）。ＩｇＧ－Ｆｃは、ＥＬＩＳＡアッセイ又は免疫染色で検出が容易であることから、対照として使用した。哺乳類細胞に組換え発現されるとき、シグナルペプチドなしでは、ＩｇＧ－Ｆｃは細胞内でのみ発現する。対照的に、シグナルペプチドありでは、ＩｇＧ－Ｆｃは細胞培養培地に分泌され得る。１つのＩｇＧ－Ｆｃコンストラクトは、ＰＡＲ２のＮ末端をそのシグナルペプチドと共に含有し（配列番号３４（ＤＮＡ）、配列番号３５（タンパク質））、別のＩｇＧ－Ｆｃコンストラクトは、シグナルペプチドが欠失したＰＡＲ２ Ｎ末端を含有していた（配列番号３６（ＤＮＡ）、配列番号３７（タンパク質））。ヒトＩｇＧ－Ｆｃに融合されたインスリンシグナルペプチド（分泌されたタンパク質シグナルペプチド）又はインスリン受容体シグナルペプチド（細胞表面受容体シグナルペプチド）（それぞれ、配列番号３８（ＤＮＡ）、配列番号３９（タンパク質）及び配列番号４０（ＤＮＡ）、配列番号４１（タンパク質））を有するコンストラクトもまた、実験における陽性対照として使用した。免疫染色（図２Ｂ）及びＥＬＩＳＡ（図２Ｃ）を使用して、トランスフェクトされた細胞におけるＩｇＧ－Ｆｃ発現を検出及び測定し、様々なＩｇＧ－Ｆｃ発現コンストラクトでトランスフェクトされた全ての細胞が、細胞内でＩｇＧ－Ｆｃを発現することを実証した。ＰＡＲ２シグナルペプチドを有するＰＡＲ２のＮ末端をヒトＩｇＧ－Ｆｃに融合させることが、培地へのＩｇＧ－Ｆｃの分泌を効果的にもたらし、したがって、インスリンシグナルペプチド又はインスリン受容体シグナルペプチドと同様に機能することが実証された（図２Ｄ）。対照的に、ＰＡＲ２シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２ Ｎ末端を融合させることは、培地へのＩｇＧ－Ｆｃの分泌をもたらすことに失敗した。
【0139】
ＰＡＲ２シグナルペプチドは成熟タンパク質から開裂される
ＣＲＦ２（ａ）受容体について、シグナルペプチドが膜挿入後に成熟タンパク質から開裂されない場合があることが報告されている（Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２８７：２７２６５－７４（２０１２））。これがＰＡＲ２シグナルペプチドにも当てはまるかどうかを判定するために、ＰＡＲ２のシグナルペプチドが、分泌後に、ＰＡＲ２ Ｎ末端を有する成熟ＩｇＧ－Ｆｃタンパク質から開裂されるかどうかを調べた。ＩｇＧ－Ｆｃに融合したＰＡＲ２ Ｎ末端の発現コンストラクトでトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞からの馴化培地を回収した（図２Ａ）。分泌されたＰＡＲ２－ＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアフィニティー精製し、グリコシル化部分を除去し、次いで、質量分析（ＭＳ）タンパク質配列決定により分析した。結果は、ＰＡＲ２配列と一致する最大のＮ末端配列がＴＩＱＧＴＮＲ（配列番号４２）（図３）であることを実証し、このことは、シグナルペプチドがタンパク質分泌後に開裂され、開裂部位が残基Ｇｌｙ２４とＴｈｒ２５との間にあることを示唆している。興味深いことに、多様体配列ＴＩＱＧＴＤＲ（配列番号４３）も観察された。この配列は、ＴＩＱＧＴＮＲとは１つの残基（ＮからＤ）で異なる。残基Ａｓｎ３０はＮＲＳ配列（Ｎ－結合型グリコシル化部位、図３）の一部であり、グリコシル化Ａｓｎ残基は、ＰＮＧａｓｅ－Ｆによる脱グリコシル後にＡｓｐに変換されるので、結果は、発現されたタンパク質の少なくとも一部がこのＮ－結合型グリコシル化部位でグリコシル化されることを示唆した。
ＣＲＦ２（ａ）受容体について、シグナルペプチドが膜挿入後に成熟タンパク質から開裂されない場合があることが報告されている（Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２８７：２７２６５－７４（２０１２））。これがＰＡＲ２シグナルペプチドにも当てはまるかどうかを判定するために、ＰＡＲ２のシグナルペプチドが、分泌後に、ＰＡＲ２ Ｎ末端を有する成熟ＩｇＧ－Ｆｃタンパク質から開裂されるかどうかを調べた。ＩｇＧ－Ｆｃに融合したＰＡＲ２ Ｎ末端の発現コンストラクトでトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞からの馴化培地を回収した（図２Ａ）。分泌されたＰＡＲ２－ＩｇＧ－Ｆｃ融合タンパク質をアフィニティー精製し、グリコシル化部分を除去し、次いで、質量分析（ＭＳ）タンパク質配列決定により分析した。結果は、ＰＡＲ２配列と一致する最大のＮ末端配列がＴＩＱＧＴＮＲ（配列番号４２）（図３）であることを実証し、このことは、シグナルペプチドがタンパク質分泌後に開裂され、開裂部位が残基Ｇｌｙ２４とＴｈｒ２５との間にあることを示唆している。興味深いことに、多様体配列ＴＩＱＧＴＤＲ（配列番号４３）も観察された。この配列は、ＴＩＱＧＴＮＲとは１つの残基（ＮからＤ）で異なる。残基Ａｓｎ３０はＮＲＳ配列（Ｎ－結合型グリコシル化部位、図３）の一部であり、グリコシル化Ａｓｎ残基は、ＰＮＧａｓｅ－Ｆによる脱グリコシル後にＡｓｐに変換されるので、結果は、発現されたタンパク質の少なくとも一部がこのＮ－結合型グリコシル化部位でグリコシル化されることを示唆した。
【0140】
ＰＡＲ２シグナルペプチドは、ＰＡＲ２受容体機能発現及びそのリガンドによる活性化に重要である。
ＰＡＲ２受容体の組換え発現及び特性評価のためのＰＡＲ１及びＰＡＲ２ノックアウトＨＥＫ２９３細胞株の生成。
組換えＰＡＲ２の受容体局在及び機能を評価するために、内在性ＰＡＲ２も他のＰＡＲ受容体も発現しない宿主哺乳類細胞株を有することが必須であった。ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ－Ｋ１、及びＣＯＳ７細胞を含む、哺乳類細胞を、組換え発現について試験し、３つ全ての細胞株が、比較的高いＰＡＲ１及びＰＡＲ２ ｍＲＮＡを発現することが見出された（図４Ａ）。加えて、機能アッセイでは、細胞株は全て、ＰＡＲ１及びＰＡＲ２リガンド（それぞれ、トロンビン及びトリプシン）に反応した（図４Ｂ～図４Ｄ）。これらの宿主細胞内の自然発現したＰＡＲ１及びＰＡＲ２の存在は、組換え発現したＰＡＲ２の特性評価を複雑にすることがあるので、ＰＡＲ３及びＰＡＲ４を発現しない、ｐａｒ１及びｐａｒ２遺伝子の両方がＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９によってノックアウトされている、ＨＥＫ２９３細胞株を作成した（図４Ｅ）。この細胞株の薬理学的特性評価は、ｐａｒ１及びｐａｒ２の両方の欠損が、ＰＡＲ１リガンド、すなわちトロンビン、又はＰＡＲ２リガンド、すなわちトリプシンに対する反応の欠如をもたらすことを実証した（図４Ｆ）。次いで、これらの細胞を使用して、組換えＰＡＲ２の発現及び局在を研究した。
ＰＡＲ２受容体の組換え発現及び特性評価のためのＰＡＲ１及びＰＡＲ２ノックアウトＨＥＫ２９３細胞株の生成。
組換えＰＡＲ２の受容体局在及び機能を評価するために、内在性ＰＡＲ２も他のＰＡＲ受容体も発現しない宿主哺乳類細胞株を有することが必須であった。ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ－Ｋ１、及びＣＯＳ７細胞を含む、哺乳類細胞を、組換え発現について試験し、３つ全ての細胞株が、比較的高いＰＡＲ１及びＰＡＲ２ ｍＲＮＡを発現することが見出された（図４Ａ）。加えて、機能アッセイでは、細胞株は全て、ＰＡＲ１及びＰＡＲ２リガンド（それぞれ、トロンビン及びトリプシン）に反応した（図４Ｂ～図４Ｄ）。これらの宿主細胞内の自然発現したＰＡＲ１及びＰＡＲ２の存在は、組換え発現したＰＡＲ２の特性評価を複雑にすることがあるので、ＰＡＲ３及びＰＡＲ４を発現しない、ｐａｒ１及びｐａｒ２遺伝子の両方がＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９によってノックアウトされている、ＨＥＫ２９３細胞株を作成した（図４Ｅ）。この細胞株の薬理学的特性評価は、ｐａｒ１及びｐａｒ２の両方の欠損が、ＰＡＲ１リガンド、すなわちトロンビン、又はＰＡＲ２リガンド、すなわちトリプシンに対する反応の欠如をもたらすことを実証した（図４Ｆ）。次いで、これらの細胞を使用して、組換えＰＡＲ２の発現及び局在を研究した。
【0141】
シグナルペプチドの欠失はＰＡＲ２の機能発現を低下させたが、これは、置換シグナルペプチドによってレスキューすることができる。
ＰＡＲ２シグナルペプチドの機能的役割を評価するために、シグナルペプチドを除去するためのＮ末端欠失（ＰＡＲ２ΔＳＰ）（配列番号４５）、及びインスリンシグナルペプチド（ＰＡＲ２－ＩＮＳＰ）（配列番号４７）、又はインスリン受容体シグナルペプチド（ＰＡＲ２－ＩＲＳＰ）（配列番号４９）によるＰＡＲ２シグナルペプチドの置換を含む、いくつかの修正をＰＡＲ２ Ｎ末端に対して行った（図５Ａ）。ＦＬＩＰＲアッセイを使用した修正された受容体の薬理学的特性評価は、組換え発現したＰＡＲ２が、ＨＥＫ２９３細胞内の内因的に発現したＰＡＲ２（トリプシンの場合はＥＣ５０＝１０ｎＭ、ＰＡＲ２－ＡＰの場合はＥＣ５０＝１．５μＭ）と比較してはるかに高い感度で、トリプシン（ＥＣ５０＝１．５ｎＭ）及びＰＡＲ２アゴニストペプチド（ＰＡＲ２－ＡＰ）（ＥＣ５０＝５０ｎＭ）に反応することを示した（図５Ｂ及び図５Ｃ）。これは、組換え受容体の過剰発現が超薬理現象を引き起こしたことによるものである（Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８：４５６－６４（１９９７））。この場合、ＥＣ５０値は、細胞表面での受容体の相対数の良好な指標であった。野生型ＰＡＲ２を発現する細胞と比較して、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２を発現する細胞は、トリプシン及びＰＡＲ２－ＡＰに対する感度の劇的な低下を示し（トリプシンの場合のＥＣ５０：５０ｎＭ、ＰＡＲ２－ＡＰの場合のＥＣ５０：５．８μＭ）、シグナルペプチドがＰＡＲ２機能性細胞表面発現の重要な構成要素であることを示唆した。この仮説を支持すると、インスリンから又はインスリン受容体からのいずれかのシグナルペプチドによるＰＡＲ２シグナルペプチドの置換は、受容体リガンド感度を完全に回復させた（図５）。
ＰＡＲ２シグナルペプチドの機能的役割を評価するために、シグナルペプチドを除去するためのＮ末端欠失（ＰＡＲ２ΔＳＰ）（配列番号４５）、及びインスリンシグナルペプチド（ＰＡＲ２－ＩＮＳＰ）（配列番号４７）、又はインスリン受容体シグナルペプチド（ＰＡＲ２－ＩＲＳＰ）（配列番号４９）によるＰＡＲ２シグナルペプチドの置換を含む、いくつかの修正をＰＡＲ２ Ｎ末端に対して行った（図５Ａ）。ＦＬＩＰＲアッセイを使用した修正された受容体の薬理学的特性評価は、組換え発現したＰＡＲ２が、ＨＥＫ２９３細胞内の内因的に発現したＰＡＲ２（トリプシンの場合はＥＣ５０＝１０ｎＭ、ＰＡＲ２－ＡＰの場合はＥＣ５０＝１．５μＭ）と比較してはるかに高い感度で、トリプシン（ＥＣ５０＝１．５ｎＭ）及びＰＡＲ２アゴニストペプチド（ＰＡＲ２－ＡＰ）（ＥＣ５０＝５０ｎＭ）に反応することを示した（図５Ｂ及び図５Ｃ）。これは、組換え受容体の過剰発現が超薬理現象を引き起こしたことによるものである（Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８：４５６－６４（１９９７））。この場合、ＥＣ５０値は、細胞表面での受容体の相対数の良好な指標であった。野生型ＰＡＲ２を発現する細胞と比較して、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２を発現する細胞は、トリプシン及びＰＡＲ２－ＡＰに対する感度の劇的な低下を示し（トリプシンの場合のＥＣ５０：５０ｎＭ、ＰＡＲ２－ＡＰの場合のＥＣ５０：５．８μＭ）、シグナルペプチドがＰＡＲ２機能性細胞表面発現の重要な構成要素であることを示唆した。この仮説を支持すると、インスリンから又はインスリン受容体からのいずれかのシグナルペプチドによるＰＡＲ２シグナルペプチドの置換は、受容体リガンド感度を完全に回復させた（図５）。
【0142】
テザーリガンドはＰＡＲ２シグナルペプチドを必要とする。
テザーリガンド領域の更なる欠失は、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現をレスキューする。
ＰＡＲは、プロテアーゼによって活性化され、このプロテアーゼは、新しいＮ末端を生成し、受容体のＮ末端細胞外領域に存在するテザーペプチドリガンドを露出させる。この独特な受容体活性化機構は、シグナルペプチドのないＰＡＲ２がリガンド刺激に対して反応が乏しいという事実と組み合わさって、ＰＡＲ２のシグナルペプチドの必要性がテザーリガンドの存在に関連し得るという推測をもたらした。テザーリガンドの領域に更なる欠失を有するシグナルペプチドのないＰＡＲ２変異体（ＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ）（配列番号５１）を構築した（図６Ａ）。この変異体受容体は、シグナルペプチド及びテザーリガンド配列（ＳＬＩＧＫＶ）（配列番号１）を欠いており、トリプシンによって活性化されなかったが、ＦＬＩＰＲアッセイにおける野生型ＰＡＲ２受容体と同様に合成アゴニストペプチドＰＡＲ２－ＡＰ（配列番号１）によって完全に活性化することができた（図６Ｂ）。これは、テザーリガンド配列（ＳＬＩＧＫＶ）の更なる欠失が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能性細胞表面発現を回復させたことを示唆している。結果はまた、シグナルペプチドなしでは、ＰＡＲ２が意図されていない細胞内プロテアーゼ活性化を受けやすく、機能性細胞表面発現が乏しくなる可能性があることも示唆する。
テザーリガンド領域の更なる欠失は、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現をレスキューする。
ＰＡＲは、プロテアーゼによって活性化され、このプロテアーゼは、新しいＮ末端を生成し、受容体のＮ末端細胞外領域に存在するテザーペプチドリガンドを露出させる。この独特な受容体活性化機構は、シグナルペプチドのないＰＡＲ２がリガンド刺激に対して反応が乏しいという事実と組み合わさって、ＰＡＲ２のシグナルペプチドの必要性がテザーリガンドの存在に関連し得るという推測をもたらした。テザーリガンドの領域に更なる欠失を有するシグナルペプチドのないＰＡＲ２変異体（ＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ）（配列番号５１）を構築した（図６Ａ）。この変異体受容体は、シグナルペプチド及びテザーリガンド配列（ＳＬＩＧＫＶ）（配列番号１）を欠いており、トリプシンによって活性化されなかったが、ＦＬＩＰＲアッセイにおける野生型ＰＡＲ２受容体と同様に合成アゴニストペプチドＰＡＲ２－ＡＰ（配列番号１）によって完全に活性化することができた（図６Ｂ）。これは、テザーリガンド配列（ＳＬＩＧＫＶ）の更なる欠失が、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能性細胞表面発現を回復させたことを示唆している。結果はまた、シグナルペプチドなしでは、ＰＡＲ２が意図されていない細胞内プロテアーゼ活性化を受けやすく、機能性細胞表面発現が乏しくなる可能性があることも示唆する。
【0143】
トリプシン活性化部位をブロッキングする、Ａｒｇ３６からＡｌａへの変異は、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を増加させた。
トリプシンは、残基Ａｒｇ３６後の開裂によってＰＡＲ２を活性化する。これは、受容体を活性化するためのテザーリガンドとして機能する、新しいＮ末端（配列ＳＬＩＧＫＶ－－－を有する）を生成する。Ａｒｇ３６をＡｌａに変異させることは、この位置でのトリプシン開裂を防止し、したがってトリプシン媒介性受容体活性化をブロッキングする。シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２上のＡｒｇ３６位置における変異（ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ））（配列番号５３）を作製し、このコンストラクトを試験して、この変異が機能性受容体発現のレベルを変化させたかどうかを判定した。並行して、全長ＰＡＲ２受容体上の同じ変異（ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ））（配列番号５５）を作製し、これらの受容体を、トリプシン及びＰＡＲ２－ＡＰによる刺激後のＦＬＩＰＲアッセイで特性評価した。結果は、Ａｒｇ３６Ａｌａ変異が、予想されるように、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２のトリプシン活性化をブロッキングすることを実証した（図７Ａ）。しかしながら、ＰＡＲ２－ＡＰをリガンドとして使用した場合、変異体受容体（ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ））（配列番号５５）は、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）の感度と比較してＰＡＲ２－ＡＰに対する感度がはるかに高いことを示した（図７Ｂ）。対照として、全長ＰＡＲ２受容体での同じ変異（ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ））（配列番号５５）は、トリプシン刺激への反応が非常に乏しかったが（図７Ｂ）、ＰＡＲ２－ＡＰ刺激には、全長ＰＡＲ２受容体とほぼ同一に反応した（図７Ｃ）。トリプシンによるＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ）（配列番号５５）の小さいが検出可能な活性化（図７Ｂ）は、Ａｒｇ３１又はＬｙｓ３４位置でのトリプシンによるＰＡＲ２の開裂に起因する可能性があり、受容体活性化のために活性が不十分なテザーリガンドをもたらし得る。
トリプシンは、残基Ａｒｇ３６後の開裂によってＰＡＲ２を活性化する。これは、受容体を活性化するためのテザーリガンドとして機能する、新しいＮ末端（配列ＳＬＩＧＫＶ－－－を有する）を生成する。Ａｒｇ３６をＡｌａに変異させることは、この位置でのトリプシン開裂を防止し、したがってトリプシン媒介性受容体活性化をブロッキングする。シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２上のＡｒｇ３６位置における変異（ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ））（配列番号５３）を作製し、このコンストラクトを試験して、この変異が機能性受容体発現のレベルを変化させたかどうかを判定した。並行して、全長ＰＡＲ２受容体上の同じ変異（ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ））（配列番号５５）を作製し、これらの受容体を、トリプシン及びＰＡＲ２－ＡＰによる刺激後のＦＬＩＰＲアッセイで特性評価した。結果は、Ａｒｇ３６Ａｌａ変異が、予想されるように、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２のトリプシン活性化をブロッキングすることを実証した（図７Ａ）。しかしながら、ＰＡＲ２－ＡＰをリガンドとして使用した場合、変異体受容体（ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ））（配列番号５５）は、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）の感度と比較してＰＡＲ２－ＡＰに対する感度がはるかに高いことを示した（図７Ｂ）。対照として、全長ＰＡＲ２受容体での同じ変異（ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ））（配列番号５５）は、トリプシン刺激への反応が非常に乏しかったが（図７Ｂ）、ＰＡＲ２－ＡＰ刺激には、全長ＰＡＲ２受容体とほぼ同一に反応した（図７Ｃ）。トリプシンによるＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ）（配列番号５５）の小さいが検出可能な活性化（図７Ｂ）は、Ａｒｇ３１又はＬｙｓ３４位置でのトリプシンによるＰＡＲ２の開裂に起因する可能性があり、受容体活性化のために活性が不十分なテザーリガンドをもたらし得る。
【0144】
プロテアーゼ阻害剤処理は、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を増加させた。
セリンプロテアーゼ阻害剤は、早期の細胞内プロテアーゼ媒介性活性化をブロッキングすることによって、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を助けると仮定した。ＡＥＢＳＦ、ロイペプチン、及びアプロチニンを含むプロテアーゼカクテルを使用して、ＥＲ及びゴルジプロテアーゼを阻害した（Ｏｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３１０２４－３２（２００３）；Ｗｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９３７８－８２（１９９０））。野生型ＰＡＲ２及びＰＡＲ２の様々な変異体形態を発現する細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルで処理し、次いで、ＰＡＲ２－ＡＰ刺激に対するそれらの反応について試験した。トリプシンは、プロテアーゼ阻害剤カクテルによって阻害されるため、このアッセイでは使用しなかった。結果により、プロテアーゼ阻害剤は、ＰＡＲ２野生型（配列番号５７）、ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ）（配列番号５５）、ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ）（配列番号５３）、及びＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ（配列番号５１）に対するＰＡＲ２－ＡＰ刺激反応のＥＣ５０値に影響していないが、プロテアーゼカクテルは、ＥＣ５０値を（５．８μＭから０．７μＭに）減少させていることにより、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）の機能発現を明確に増加させていることが実証された（図８）。
セリンプロテアーゼ阻害剤は、早期の細胞内プロテアーゼ媒介性活性化をブロッキングすることによって、シグナルペプチドを有しないＰＡＲ２の機能発現を助けると仮定した。ＡＥＢＳＦ、ロイペプチン、及びアプロチニンを含むプロテアーゼカクテルを使用して、ＥＲ及びゴルジプロテアーゼを阻害した（Ｏｋａｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３１０２４－３２（２００３）；Ｗｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９３７８－８２（１９９０））。野生型ＰＡＲ２及びＰＡＲ２の様々な変異体形態を発現する細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルで処理し、次いで、ＰＡＲ２－ＡＰ刺激に対するそれらの反応について試験した。トリプシンは、プロテアーゼ阻害剤カクテルによって阻害されるため、このアッセイでは使用しなかった。結果により、プロテアーゼ阻害剤は、ＰＡＲ２野生型（配列番号５７）、ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ）（配列番号５５）、ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ）（配列番号５３）、及びＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ（配列番号５１）に対するＰＡＲ２－ＡＰ刺激反応のＥＣ５０値に影響していないが、プロテアーゼカクテルは、ＥＣ５０値を（５．８μＭから０．７μＭに）減少させていることにより、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）の機能発現を明確に増加させていることが実証された（図８）。
【0145】
Ａｒｇ３６Ａｌａ変異及びプロテアーゼ阻害剤処理は、シグナルペプチドのないＰＡＲ２の細胞表面発現を増加させる。
シグナルペプチドのないＰＡＲ２のリガンド刺激に対する反応の低下が、総受容体タンパク質発現の欠如、及び／又は細胞表面発現の欠如に起因するかどうかを確認するために、ＰＡＲ２のアミノ酸残基３７～６２に対するモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡアッセイで使用して、ＰＡＲ２の様々な形態の総及び細胞表面発現を測定し、プロテアーゼ阻害剤処理の効果を決定した。ＰＡＲ２野生型（配列番号５７）及びＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ）（配列番号５５）変異体は、ＥＬＩＳＡにより測定したときに最も高い総及び細胞表面タンパク質発現を有することが観察された。ＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ（配列番号５１）は、総発現及び細胞表面発現の両方において、ＰＡＲ２野生型（配列番号５７）の発現と比較してわずかに低い発現を有した。ＰＡＲ２のこの多様体はアミノ酸残基１～４２を失っているので、タンパク質発現の検出の減少は、不十分な抗体認識に起因する可能性がある。ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ）（配列番号５３）は、より低い総及び細胞表面発現を有し、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）は、最低の総及び細胞表面発現レベルを有した（図９）。データは、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）タンパク質の大部分が細胞内に位置し、このタンパク質のごくわずかな部分のみが細胞表面上に存在することを示した。ＰＡＲ２野生型（配列番号５７）、ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ）（配列番号５５）、及びＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ（配列番号５１）については、タンパク質の９０％超が細胞表面上に存在した。機能アッセイを補強すると、プロテアーゼ阻害剤処理は、ＰＡＲ２タンパク質の他の形態のタンパク質発現にほとんど又は全く影響を及ぼさずに、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）の総レベル、及び特に細胞表面発現レベルを増加させた（図９）。ＰＡＲ２ペプチドリガンド（ＰＡＲ２－ＡＰ）（配列番号１）を使用しての受容体の刺激は、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）を除く全てのＰＡＲ２の多様体に対して細胞表面タンパク質発現レベル及び総タンパク質発現レベルを低下させた。これは、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）の大部分が細胞内であり、刺激された受容体のその後の内部移行及び分解を引き起こす、細胞表面受容体のリガンド刺激が、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）にあまり適用されないことに起因する可能性が高かった。
シグナルペプチドのないＰＡＲ２のリガンド刺激に対する反応の低下が、総受容体タンパク質発現の欠如、及び／又は細胞表面発現の欠如に起因するかどうかを確認するために、ＰＡＲ２のアミノ酸残基３７～６２に対するモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡアッセイで使用して、ＰＡＲ２の様々な形態の総及び細胞表面発現を測定し、プロテアーゼ阻害剤処理の効果を決定した。ＰＡＲ２野生型（配列番号５７）及びＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ）（配列番号５５）変異体は、ＥＬＩＳＡにより測定したときに最も高い総及び細胞表面タンパク質発現を有することが観察された。ＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ（配列番号５１）は、総発現及び細胞表面発現の両方において、ＰＡＲ２野生型（配列番号５７）の発現と比較してわずかに低い発現を有した。ＰＡＲ２のこの多様体はアミノ酸残基１～４２を失っているので、タンパク質発現の検出の減少は、不十分な抗体認識に起因する可能性がある。ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ）（配列番号５３）は、より低い総及び細胞表面発現を有し、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）は、最低の総及び細胞表面発現レベルを有した（図９）。データは、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）タンパク質の大部分が細胞内に位置し、このタンパク質のごくわずかな部分のみが細胞表面上に存在することを示した。ＰＡＲ２野生型（配列番号５７）、ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ）（配列番号５５）、及びＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ（配列番号５１）については、タンパク質の９０％超が細胞表面上に存在した。機能アッセイを補強すると、プロテアーゼ阻害剤処理は、ＰＡＲ２タンパク質の他の形態のタンパク質発現にほとんど又は全く影響を及ぼさずに、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）の総レベル、及び特に細胞表面発現レベルを増加させた（図９）。ＰＡＲ２ペプチドリガンド（ＰＡＲ２－ＡＰ）（配列番号１）を使用しての受容体の刺激は、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）を除く全てのＰＡＲ２の多様体に対して細胞表面タンパク質発現レベル及び総タンパク質発現レベルを低下させた。これは、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）の大部分が細胞内であり、刺激された受容体のその後の内部移行及び分解を引き起こす、細胞表面受容体のリガンド刺激が、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）にあまり適用されないことに起因する可能性が高かった。
【0146】
並行して、タンパク質発現の測定及びタンパク質細胞局在の可視化を更に容易にするために、ＰＡＲ２野生型タンパク質及び様々なＰＡＲ２変異体のＣ末端にＧＦＰタグを融合することによって、様々なＰＡＲ２発現ベクターを構築した（図１０Ａ）。続いて、ＰＡＲ２発現ベクターを、ｐａｒ１及びｐａｒ２ ｎｕｌｌ ＨＥＫ２９３細胞株内で発現させた。様々なＧＦＰ融合タンパク質のＧＦＰ蛍光強度を測定することによって、ＰＡＲ２及び変異タンパク質の総発現レベルを測定した。一般に、結果は、ＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ（配列番号５１）を除けば、抗ＰＡＲ２抗体を使用してＥＬＩＳＡによって示された結果と同様であった。ＰＡＲ２ΔＳＰΔＬは、ＥＬＩＳＡアッセイではＰＡＲ２野生型（配列番号５７）の結果と比較して低いレベルを示したが、ＧＦＰ強度ではＰＡＲ２野生型（配列番号５７）の結果と同様の発現レベルを示した（図１０Ｂ）。この結果は、ＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ（配列番号５１）発現の検出の減少が、抗体によるＰＡＲ２ΔＳＰΔＬの認識が不十分である（認識部位のアミノ酸残基３７～４２が見つからなかった）ことに起因する可能性が高いという前述の推測を裏付けた。
【0147】
ＰＡＲ２タンパク質及びその多様体の細胞局在を調査するために、共焦点顕微鏡法を利用して、様々なＰＡＲ２タンパク質を発現する細胞を、ＰＡＲ２リガンド又はプロテアーゼ阻害剤による処理を含む様々な条件において分析した。ＰＡＲ２野生型（配列番号５７）、ＰＡＲ２（Ｒ３６Ａ）（配列番号５５）、及びＰＡＲ２ΔＳＰΔＬ（配列番号５１）タンパク質は、形質膜上に局在化した（図１０Ｃ）。ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）は細胞内でのみ見出され、形質膜上に位置するものはほとんど又は全くなかった。これは、ペプチドリガンドによって刺激されたＰＡＲ２野生型（配列番号５７）受容体（ＰＡＲ２＋ＰＡＲ２－ＡＰ、図１０Ｃ）と類似していた。ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ）（配列番号５３）については、タンパク質の一部が形質膜上に発現し、また有意な量のタンパク質が細胞内でも見出された。興味深いことに、プロテアーゼ阻害剤処理は、ＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）の形質膜発現を可能にした（ＰＡＲ２ΔＳＰ＋ＰＩ、図１０Ｃ）。
【0148】
全体として、観察されたＧＦＰタグ付きタンパク質細胞分布は、ＥＬＩＳＡデータ（図９）と一致した。興味深いことに、ＰＡＲ２ΔＳＰ（Ｒ３６Ａ）（配列番号５３）を発現する細胞及びＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）を発現するプロテアーゼ阻害剤処理細胞は、２つのサブカテゴリに属するように見えた。細胞の１つの集団は、良好なＰＡＲ２形質膜局在を有し、野生型ＰＡＲ２を模倣しており、細胞の別の集団は、細胞内ＰＡＲ２のみを有し、これは、プロテアーゼ阻害剤処理なしのＰＡＲ２ΔＳＰ（配列番号４５）のものと同様であった。Ａｒｇ３６Ａｌａ変異及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（アッセイで使用された）は、セリンプロテアーゼによるＰＡＲ２開裂／活性化をブロッキングした。しかしながら、ＰＡＲ２ΔＳＰを細胞内で開裂及び活性化することができるが、変異又はプロテアーゼ阻害剤処理によりブロッキングされない他のプロテアーゼを、細胞は発現することができる。細胞は、異なる細胞周期段階などの異なる条件下で異なるプロテアーゼを発現することが可能である（ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｇｏｕｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｉ Ｂａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【0149】
ＧＰＣＲは、小胞体（ＥＲ）で合成され、ゴルジ装置に輸送され、次いで形質膜に輸送される。小胞体及びゴルジ装置には、タンパク質合成及び輸送プロセス中にＡｒｇ３６位置においてプロテアーゼ感受性ＰＡＲ２活性化部位を開裂し得る多くのプロテアーゼが存在する（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３１０２４－３２（２００３）；Ｏｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４９５８－６１（１９９５）；Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｂｕｇｇｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２７：２１３－３５（２０１１）；Ｇｒｅｇｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：３８７６７５（２０１４）；Ｌｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３２３７３－６（１９９８））。これは、意図されていない又は早期の受容体活性化を引き起こすことがあり、それにより、その後の受容体の内部移行及び分解をもたらし得る。ＰＡＲ２のシグナルペプチドは、その機能発現に重要である。しかしながら、テザーリガンドの除去又はプロテアーゼによる受容体活性化のブロッキングは、シグナルペプチドの必要性をなくしたが、これは、シグナルペプチドが、タンパク質合成及び／又は輸送プロセス中の活性化部位におけるＰＡＲ２のこの意図されていない開裂を防止する助けとなり得ることを示唆している。シグナルペプチドを使用する細胞表面タンパク質の場合、それらのＥＲへの、最終的には形質膜への移動は、ＥＲトランスロコンによって媒介され（Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５：７９９－８４２（１９９９）；Ｎｉｋｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３１：１２５３－６（２００３））、これは、タンパク質の区画化（Ｓｃｈｅｅｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８７：６１１－２８（１９８０）；Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １６：２７９－９１（２００５）；Ｓｃｈｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１２：４９１－５０５（２００３）；Ｓｈａｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ９：５４５－５４（２００５）；Ｋａｔｅｒｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １４：４４２７－３６（２００３））及び隔離（Ｎｉｋｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３１：１２５３－６（２００３）；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１５：９５５７－６２（２０１８）；Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３４２５－４３０（１９９８））において役割を果たす。機構は不明なままであるが、ＥＲトランスロコンは、ＰＡＲ２をプロテアーゼ開裂から保護する役割を果たし得る（図１１）。
【0150】
古典的なシグナルペプチドは、分泌されたタンパク質及び細胞表面タンパク質が細胞膜を横切る又はそれに埋め込まれた状態になるのを助けることが知られている。上記のように、ＰＡＲ２のシグナルペプチドを研究することにより、シグナルペプチドの機能は、細胞内プロテアーゼ活性化からのＰＡＲ２の保護剤として機能することが観察された。細胞内プロテアーゼによるＰＡＲ２の開裂は、受容体の意図されていない活性化、及び細胞外シグナルを検知する機能の喪失をもたらし得る。したがって、プロテアーゼ保護機能により、シグナルペプチドは、ＰＡＲ２受容体の機能にとって重要であり得る。
【0151】
要約すると、ＰＡＲ２のシグナルペプチドの欠失は、ＰＡＲ２細胞表面発現を減少させ、ほとんどの受容体が細胞内に蓄積することが観察された。しかしながら、トリプシンによるＰＡＲ２の活性化を無効にした、ＰＡＲ２のテザーリガンドの更なる欠失は、受容体細胞表面発現を回復させたが、これは、ＰＡＲ２のシグナルペプチドの必要性が、テザーリガンド配列の存在及びプロテアーゼ活性化機構に関連することを示唆している。ＰＡＲ２のシグナルペプチドは、細胞内プロテアーゼ開裂及び活性化からＰＡＲ２を保護すると仮定される。シグナルペプチドを有しない場合、ＰＡＲ２は、小胞体又はゴルジ装置において細胞内プロテアーゼによって開裂及び活性化され、これにより、意図されていない、早期の受容体活性化がもたらされ、その結果、細胞内に蓄積し得る。この仮説を支持すると、トリプシン活性化部位におけるＡｒｇ３６Ａｌａ変異、及びプロテアーゼ阻害剤処理は、両方とも、シグナルペプチドのないＰＡＲ２の細胞表面発現及びリガンド刺激に対する機能的反応を増加させた。これらの結果は、ＰＡＲ２発現／機能の知識を拡大し、細胞表面タンパク質を、及び恐らくは分泌されたタンパク質も、細胞内プロテアーゼ開裂から保護する際のシグナルペプチドの新たな役割を明らかにした。
【0152】
当業者は、広い発明概念から逸脱することなく前述の実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図8E】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】