(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-08
(54)【発明の名称】トロロックス－ペプチド結合体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 7/08 20060101AFI20220701BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20220701BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20220701BHJP
A61K 31/353 20060101ALI20220701BHJP
A61P 17/14 20060101ALI20220701BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220701BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20220701BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20220701BHJP
A61K 8/49 20060101ALI20220701BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20220701BHJP
A61Q 7/00 20060101ALI20220701BHJP
A61Q 5/02 20060101ALI20220701BHJP
A61Q 5/00 20060101ALI20220701BHJP
A61Q 5/06 20060101ALI20220701BHJP
A61Q 5/12 20060101ALI20220701BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20220701BHJP
A61K 47/55 20170101ALI20220701BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20220701BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20220701BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20220701BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20220701BHJP
【ＦＩ】
C07K7/08 ZNA
C07K7/06
C07K14/00
A61K31/353
A61P17/14
A61P43/00 105
A61P43/00 111
A61K38/08
A61K38/10
A61K8/49
A61K8/64
A61Q7/00
A61Q5/02
A61Q5/00
A61Q5/06
A61Q5/12
A61K47/64
A61K47/55
A61K9/06
A61K9/08
A61K9/12
A61K9/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021565859
(86)(22)【出願日】2020-05-06
(85)【翻訳文提出日】2021-11-10
(86)【国際出願番号】 KR2020005967
(87)【国際公開番号】W WO2020226419
(87)【国際公開日】2020-11-12
(31)【優先権主張番号】10-2019-0053080
(32)【優先日】2019-05-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510271129
【氏名又は名称】ケアジェン カンパニー，リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＥＧＥＮ ＣＯ．，ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002620
【氏名又は名称】特許業務法人大谷特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チョン ヨンジ
(72)【発明者】
【氏名】キム ウンミ
(72)【発明者】
【氏名】リ ウンジ
(72)【発明者】
【氏名】キム ミンウン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C083
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076AA12
4C076AA14
4C076AA24
4C076BB31
4C076CC18
4C076CC26
4C076CC29
4C083AC841
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4H045AA10
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4H045FA50
4H045FA67
(57)【要約】
本発明は、トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）とペプチドが化学的に結合された構造を有するトロロックス－ペプチド結合体に関し、トロロックス－ペプチド結合体は、５α－還元酵素（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の活性を非常に効果的に抑制するだけでなく、毛乳頭細胞および角質細胞の死滅を抑制し、成長を促進するとともに抗酸化効果を有するところ、脱毛を防止または予防するとともに毛髪の生成を顕著に促進させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）とペプチドが化学的に結合された構造を有する、トロロックス－ペプチド結合体。
【請求項2】
前記ペプチドは、ペプチド結合によりアミノ酸が互いに結合されてなる直鎖状の分子である、請求項１に記載のトロロックス－ペプチド結合体。
【請求項3】
前記ペプチドは、５個～３０個のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のトロロックス－ペプチド結合体。
【請求項4】
前記ペプチドは、親水性を示すことができる側鎖（ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ）を含むアミノ酸の割合が５０％～１００％であり、および前記ペプチドは、疎水性を示すことができる側鎖を含むアミノ酸の割合が０％～５０％である、請求項１に記載のトロロックス－ペプチド結合体。
【請求項5】
前記親水性を示すことができる側鎖を含むアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、グリジン（Ｇｌｙ）、およびプロリン（Ｐｒｏ）からなる群から選択され、前記疎水性を示すことができる側鎖を含むアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群から選択される、請求項４に記載のトロロックス－ペプチド結合体。
【請求項6】
前記ペプチドは、配列番号１～配列番号３のうち何れか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のトロロックス－ペプチド結合体。
【請求項7】
前記配列番号１のアミノ酸配列を含むトロロックス－ペプチド結合体は、ＢＭＰ２細胞シグナル伝達を抑制させる、請求項６に記載のトロロックス－ペプチド結合体。
【請求項8】
前記配列番号２のアミノ酸配列を含むトロロックス－ペプチド結合体は、ＷＮＴ細胞シグナル伝達を活性化させる、請求項６に記載のトロロックス－ペプチド結合体。
【請求項9】
前記配列番号３のアミノ酸配列を含むトロロックス－ペプチド結合体は、ＫＧＦ細胞シグナル伝達を活性化させる、請求項６に記載のトロロックス－ペプチド結合体。
【請求項10】
請求項１に記載のトロロックス－ペプチド結合体を有効成分として含む、脱毛防止および発毛促進用の薬学的組成物。
【請求項11】
請求項１に記載のトロロックス－ペプチド結合体を有効成分として含む、脱毛防止および発毛促進用の化粧料組成物。
【請求項12】
前記化粧料組成物は、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダー、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゾルゲル、エマルジョン、オイル、ワックス、およびエアロゾルからなる群から選択されるいずれか１つの剤形である、請求項１１に記載の化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）とペプチドが化学的に結合された構造を有するトロロックス－ペプチド結合体およびその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
毛嚢は、哺乳動物の皮膚に存在する独特の器官であって、始原表皮の下部が成長してより深い皮膚層に伸びた器官である。毛嚢の基部には小嚢または真皮乳頭細胞として知られている細胞のプラグが存在し、真皮乳頭細胞は毛嚢の正常な循環および毛幹の成長に必須である。毛髪中でも特に頭皮上に隆起している幹である毛幹は、ケラチンフィラメントおよびフィラメント凝集タンパク質で充填された、固く密着した上皮細胞で製造されたスレッド形状の構造からなっている。
【0003】
ヒトの毛髪の周期は、毛髪を成長させる成長期（ａｎａｇｅｎ）、成長を終え、毛球部が縮小する時期である退行期（ｃａｔａｇｅｎ）、毛乳頭が活動を止め、毛髪を頭皮に留まらせる時期である休止期（ｔａｌｏｇｅｎ）、および毛乳頭が活動を始めるか、または新しい毛髪を発生させ、古い毛髪の脱毛を誘導する時期である発生期に分けられる。前記成長期は、毛髪が成長する期間であって、毛髪が毛球から毛包へ出ようとする毛髪生成ステップ、および硬いケラチンが毛嚢内で作られるステップに再び細分化することができ、この時期で、毛髪は、退行期になるまで持続的に成長し続ける。前記退行期は、成長が終わり、毛髪の形態を維持しつつ代謝過程が遅くなる時期であって、この時期ではケラチンが作られない。退行期に該当する毛髪は全体毛髪のうち１％を占め、細胞分裂は停止している状態に該当する。前記休止期は、毛乳頭が萎縮し、毛嚢が次第に縮み、毛根が上に押し上げられて抜ける時期に該当する。
【0004】
かかる毛髪は、個体が生命を維持するのに必須の器官ではないが、健康の状態を示す尺度でありながらも外見を決める身体の重要な一部分である。よって、毛髪の多い一般人にとっては、日常的な脱毛が当然の身体的活動として感じられるが、脱毛が進行中の人々にとっては、憂鬱さ、恥ずかしさ、社会的孤立などにより、精神健康および生活の質に深刻な影響を与え得る要因に該当する。
【0005】
最近、脱毛に影響を与える要因としては、気候、光、または熱による露出などの環境的要因と、激しいストレス、疾病、出産、ホルモン分泌および変化、薬物の服用、栄養状態などの内的要因が挙げられる。しかし、現在に至るまで脱毛に関する明確な原因は明らかになっておらず、最近になって食生活の変化または社会環境などによるストレスの増加などにより脱毛で悩む人々が増加しており、その年齢も下がりつつあり、女性の脱毛人口も増加している傾向である。
【0006】
脱毛メカニズムに関与する主なホルモンとして５－α還元酵素（５－α ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が挙げられる。前記５－α還元酵素は、男性ホルモン（ａｎｄｒｏｇｅｎ）の一種であるテストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）をＤＨＴ（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）に変換させ、このように生成されたＤＨＴは、毛髪の成長期を短くし、休止期を長くするだけでなく、毛嚢細胞の死滅を誘導する細胞シグナル伝達に関与して毛嚢細胞を死滅させると報告されている。
【0007】
そこで、脱毛の原因を治癒するために、メルク社は、５－α還元酵素の活性を抑制することでＤＨＴの生成を抑制するフィナステリドを開発して市販中である（ＵＳ ５５４７９５７ Ａ）。前記フィナステリドは、服用しやすく、効能に非常に優れるが、それを製造するのに用いられる試薬が高価であるかまたは毒性が存在して製造原価に負担を与え得る。特に、付随的に生成される生成物の除去が容易ではないため、最終生成物の純度が低下し得るし、水分により活性が阻害されやすい試薬や活性誘導体を用いなければならないため、大量生産が難しいという問題が存在する。この他にも角質細胞または血管内皮の成長を促進させるか、またはＢＭＰに属するタンパク質の活性を抑制させることで、毛髪生成が促進されるようにする研究が進まれている（ＫＲ ２０１６－００２３２２４ Ａ）。しかし、成長因子を有効成分として含む治療剤は、効能に非常に優れる反面、自然型の成長因子を得るために追加工程および時間が要され、また、精製過程において大腸菌由来の汚染源を除去するための複雑な精製過程が要されるだけでなく、分子量が大きいため、毛髪の保護膜を容易に飛び越えることができないという問題が存在する。
【0008】
したがって、上記のような問題を解決するための多くの研究が行われて脱毛を防止および治療するための発毛剤が提示されたが、既存の発毛剤は、脱毛を防止するとともに発毛を促進する機能を有することができないため、実質的に脱毛治療および発毛促進に大きな効果を示すことができない状態である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、脱毛抑制または発毛促進効果に非常に優れたトロロックス－ペプチド結合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
前記目的を達成するために、本発明の一側面は、トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）とペプチドが化学的に結合された構造を有するトロロックス－ペプチド結合体を提供することにある。
【0011】
さらに、本発明の他の側面は、トロロックス－ペプチド結合体を有効成分として含む薬学的組成物および化粧料組成物を提供することにある。
【発明の効果】
【0012】
本発明によると、トロロックス－ペプチド結合体は、５α－還元酵素（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の活性を非常に効果的に抑制するだけでなく、毛乳頭細胞および角質細胞の死滅を抑制し成長を促進するとともに抗酸化効果を有するところ、脱毛を防止または予防するとともに毛髪の生成を顕著に促進させることができる。
【0013】
但し、本発明の効果は上記で言及した効果に制限されず、言及していないまた他の効果は下記の記載から当業者に明らかに理解できるものである。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本発明の配列番号１のペプチドとトロロックスの結合体（配列１の結合体）に対するＭＡＳＳ分析データを示したものである。
【図2】本発明の配列番号２のペプチドとトロロックスの結合体（配列２の結合体）に対するＭＡＳＳ分析データを示したものである。
【図3】本発明の配列番号３のペプチドとトロロックスの結合体（配列３の結合体）に対するＭＡＳＳ分析データを示したものである。
【0015】
【図4】ＨＦＤＰＣ（ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌ）の細胞増殖促進効果を確認したグラフを示したものである。
【0016】
【図5】ヒトケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）であるＨａＣａＴの細胞増殖促進効果を確認したグラフを示したものである。
【0017】
【図6】ＨＦＤＰＣにおいて細胞内ＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）の阻害効果を確認したグラフを示したものである。
【図7】ＨＦＤＰＣにおいて細胞内ＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）の阻害効果を確認したグラフを示したものである。
【図8】ＨＦＤＰＣにおいて細胞内ＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）の阻害効果を確認したグラフを示したものである。
【0018】
【図9】ＨＦＤＰＣにおいて５α－還元酵素の活性抑制によるＤＫＫ－１タンパク質発現阻害効果をウェスタンブロット分析により確認した結果を示したものである。
【0019】
【図10】ＨＦＤＰＣにおいて細胞死滅と関連したタンパク質の発現変化をウェスタンブロット分析により確認した結果を示したものである。
【0020】
【図11】ＨＨＧＭＣ（ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｇｅｒｍｉｎａｌ ｍａｔｒｉｘ ｃｅｌｌ）においてＭＳＸ２遺伝子の発現変化をＰＣＲにより確認した結果を示したものである。
【0021】
【図12】ＨａＣａＴにおいてケラチン－１４遺伝子の発現変化をＰＣＲにより確認した結果を示したものである。
【0022】
【図13】ＨＦＤＰＣ細胞においてＢＭＰ－２関連細胞シグナル伝達タンパク質であるＰ－ｓｍａｄ１／５／８の発現阻害効果をウェスタンブロット分析により確認した結果を示したものである。
【0023】
【図14】ＨＦＤＰＣ細胞においてＷＮＴ関連細胞シグナル伝達タンパク質であるβ－カテニンが核内に位置する程度をウェスタンブロット分析により確認した結果を示したものである。
【0024】
【図15】ＨＦＤＰＣ細胞においてＫＧＦ関連細胞シグナル伝達タンパク質であるｐ－Ｅｒｋ１／２およびｐ－Ａｋｔの発現増加効果をウェスタンブロット分析により確認した結果を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本発明について詳しく説明する。
【0026】
１．トロロックス－ペプチド結合体
【0027】
本発明の一側面は、トロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）－ペプチド結合体を提供する。
【0028】
本発明の前記トロロックスは、６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸であって、下記化学式１で表される構造を有する。
【0029】
［化学式１］
【0030】
【化1】
【0031】
本発明の前記結合体は、トロロックスとペプチドが化学的に結合された構造を有する。
【0032】
上記のようにトロロックスにペプチドが結合されることで、水に対する溶解度が低いトロロックスの水に対する溶解度を顕著に高めることができるだけでなく、５α－還元酵素（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の活性を非常に効果的に抑制し、毛乳頭細胞および角質細胞の死滅を抑制し成長を促進するところ、脱毛を防止または予防するとともに毛髪の生成を促進するという効果を与えることができる。
【0033】
前記ペプチドは、ペプチド結合によりアミノ酸が互いに結合されてなる直鎖状の分子を意味する。前記ペプチドの作製は、本技術分野で公知の通常の生物学的または化学的合成方法により達成できるものであり、一例として固相合成技術（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）のような方法により達成することができる。
【0034】
前記ペプチドは、５個～３０個、好ましくは８個～２０個、より好ましくは１０個～１５個のアミノ酸からなってもよい。ペプチドをなすアミノ酸の個数が５個未満である場合には、トロロックスの水に対する溶解度を顕著に高めることができず、ペプチドをなすアミノ酸の個数が３０個超過である場合には、ペプチドの大きさが過度に大きいため、目的とする薬理効果を果たすための吸収を低下させるという問題が発生し得る。
【0035】
前記ペプチドは、親水性を示すことができる側鎖（ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ）を有するアミノ酸の割合が５０％～１００％、例えば、８０％～１００％であってもよく、前記ペプチドは、疎水性を示すことができる側鎖を有するアミノ酸の割合が０％～５０％、例えば、０％～２０％であってもよい。親水性を示すことができる側鎖を有するアミノ酸の割合が前記範囲から脱する場合には、トロロックスの水に対する溶解度が顕著に高くなるという効果を発揮することができない。
【0036】
前記親水性を示すことができる側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、グリジン（Ｇｌｙ）、およびプロリン（Ｐｒｏ）からなる群から選択され、前記疎水性を示すことができる側鎖を有するアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、およびトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群から選択されてもよい。
【0037】
前記ペプチドは、ペプチド結合により少なくとも５０％以上の親水性を示すことができる側鎖を有したアミノ酸が互いに結合されてなるものであって、水溶性ペプチドであってもよい。
【0038】
前記ペプチドは、配列番号１～配列番号３のうち何れか１つのアミノ酸配列を含む。
【0039】
前記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは、脱毛誘発に関与する遺伝子ＤＫＫ１、ＢＭＰ４、およびＴＧＦ－βの発現を抑制して脱毛を防止することができる。
【0040】
前記配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドは、毛髪の周期を促す成長因子と類似した機能を有するペプチドであって、前記ペプチドによりβ－カテニンの核転座が誘導されることで最終的に有毛細胞が新たに成長できるようにするだけでなく、男性ホルモンによるジヒドロテストステロン（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ、ＤＨＴ）の機能を低下させて脱毛を防止するのに寄与することができる。
【0041】
前記配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、新規血管形成を誘導して丈夫で太い毛髪を維持することで、脱毛を防止するのに寄与することができる。
【0042】
本発明の前記トロロックス－ペプチド結合体は、トロロックスとペプチドが結合されることで、ペプチドが有する、発揮される固有の脱毛防止および発毛促進機能を維持するだけでなく、さらには、トロロックスまたはペプチドを単独で用いた場合に比べて、顕著に向上した脱毛防止および発毛促進効果を有することができる。
【0043】
前記配列番号１～配列番号３のアミノ酸は、前記ペプチドがトロロックスに結合されて水に対する水溶性を増加させるのに影響を及ぼさない範囲内で、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換、またはこれらの組み合わせにより、異なる配列を有するアミノ酸の変異体または断片であってもよく、場合によっては、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化（ｓｕｌｆａｔｉｏｎ）、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、メチル化（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｏｎ）などにより変形されてもよい。また、前記配列番号１～配列番号３のアミノ酸は、前記配列番号１～配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドおよびその変異体またはその活性断片を含む。
【0044】
前記実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドとは、前記配列番号１のアミノ酸配列と、それぞれ７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。
【0045】
前記ペプチドは、化学的安定性、強化された薬理特性（半減期、吸収性、力価、効能など）、変更された特異性（例えば、広範囲な生物学的活性スペクトル）、減少した抗原性を付与するために、前記ペプチドのＮ－末端またはＣ－末端にアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの保護基がさらに結合されてもよい。
【0046】
前記ペプチドの化学的安定性は、生体内タンパク質切断酵素の攻撃からペプチドを保護するインビボでの安定性だけでなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）のような意味も全て含む。
【0047】
２．トロロックス－ペプチド結合体を有効成分として含む脱毛防止および発毛促進用の組成物
【0048】
本発明の他の側面は、トロロックス－ペプチド結合体を有効成分として含む脱毛防止および発毛促進用の組成物を提供する。
【0049】
本発明の前記組成物は、前記「１．トロロックス－ペプチド結合体」項目で説明したトロロックス－ペプチド結合体を有効成分として含んでおり、脱毛防止および発毛促進の用途として使用可能であり、これについては前記「１．トロロックス－ペプチド結合体」項目の説明を援用し、以下では脱毛防止および発毛促進用の組成物の特有の構成についてのみ説明することにする。
【0050】
前記「脱毛防止」は、毛髪が抜けたり減少したりするのを抑制することを含む意味であり、「発毛促進」は、毛髪の生長を促進することを意味する。
【0051】
前記組成物は、薬学的組成物または化粧料組成物の形態で提供されてもよいが、これに制限されるものではない。
【0052】
前記薬学的組成物は、コロイド懸濁液、粉末、食塩水、脂質、リポソーム、ミクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、またはナノ球状粒子などのような薬学的に許容可能な担体により輸送されてもよい。これらは、輸送手段と複合体を形成するかまたは関わってもよく、脂質、リポソーム、微粒子、金、ナノ粒子、ポリマー、縮合反応剤、多糖類、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、吸着増進物質、または脂肪酸のような当業界で公知の輸送システムを用いて生体内輸送されてもよい。
【0053】
前記トロロックス－ペプチド結合体において、薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるスレッド、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含んでよい。
【0054】
前記薬学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでよい。
【0055】
前記薬学的組成物は、目的とする方法に応じて経口投与または非経口投与（例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、または局所に適用）されてもよく、投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路、および時間に応じて異なるが、当業者により適宜選択されてもよい。
【0056】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素およびその他の医学分野で周知の要素に応じて決定されてもよい。前記薬学的組成物は、個別治療剤として投与されるかまたは他の脱毛治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤と同時に、別に、または順次に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。前記要素を全て考慮して、副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定できるものである。
【0057】
前記薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、状態、体重、体内への活性成分の吸収度、不活性率、排泄速度、疾病の種類、併用する薬物に応じて異なり得るし、投与経路、脱毛の重症度、性別、体重、年齢などに応じて増減してもよく、例えば、前記薬学的組成物を１日当たり、患者の体重１ｋｇ当たり約０．０００１μｇ～５００ｍｇ、好ましくは０．０１μｇ～１００ｍｇで投与してもよい。
【0058】
前記化粧料組成物は、本技術分野で通常製造される任意の剤形に製造されてもよく、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、およびスプレーなどに剤形化されてもよいが、これに制限されるものではない。
【0059】
前記化粧料組成物は、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダー、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゲルなどのように、溶液、ゾルゲル、エマルジョン、オイル、ワックス、エアロゾルなどの多様な形態に製造されてもよいが、これに制限されるものではない。
【0060】
前記化粧料組成物の剤形の形態がペースト、クリーム、またはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などが用いられてもよい。
【0061】
前記化粧料組成物の剤形の形態がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが用いられてもよく、特にスプレーの場合には、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン、またはジメチルエーテルのようなプロペラントが含まれてもよいが、これに制限されるものではない。
【0062】
前記化粧料組成物の剤形の形態が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤、または乳濁化剤が用いられてもよく、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルなどが用いられてもよい。
【0063】
前記化粧料組成物の剤形の形態が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノール、またはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチルソルビトールエステル、およびポリオキシエチレンソルビタンエステルなどのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、またはトラガカントなどが用いられてもよい。
【0064】
前記化粧料組成物の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられてもよい。
【0065】
前記化粧料組成物の剤形がヘアシャンプーである場合には、本発明のトロロックス－ペプチド結合体に、増粘剤、界面活性剤、粘度調節剤、保湿剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、エッセンシャルオイルなどのように、シャンプーを組成するためのベース成分が混合されてもよい。前記増粘剤としてはＣＤＥが用いられてもよく、前記界面活性剤としてはアニオン界面活性剤であるＬＥＳ、および両性界面活性剤であるココベタインが用いられてもよく、前記粘度調節剤としてはポリクオタニウムが用いられてもよく、前記保湿剤としてはグリセリンが用いられてもよく、前記ｐＨ調節剤としてはクエン酸、水酸化ナトリウムが用いられてもよい。前記防腐剤としてはグレープフルーツ抽出物などが用いられてもよく、この他にもシダーウッド、ペパーミント、ローズマリーなどのエッセンシャルオイル、およびシルクアミノ酸、ペンタノール、ビタミンＥが添加されてもよい。
【0066】
前記化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分として本発明の前記トロロックス－ペプチド結合体と担体成分の他に、化粧料組成物に通常用いられる成分、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、および香料のような通常の補助剤などをさらに含んでもよいが、これに制限されるものではない。
【0067】
【0068】
以下、本発明を実施例および実験例により詳しく説明する。
【0069】
但し、下記の実施例および実験例は本発明を具体的に例示するものであって、本発明の内容が下記の実施例および実験例によって限定されるものではない。
【0070】
【0071】
［製造例１］
【0072】
ペプチドの合成
【0073】
［１－１］配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドの合成
【0074】
７００ｍｇのクロロトリチルクロリド樹脂（ｃｈｌｏｒｏ ｔｒｉｔｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ樹脂、Ｎｏｖａ ｂｉｏｃｈｅｍ [００６４] Ｃａｔ Ｎｏ．０１－６４－００２１）を反応容器に入れ、前記反応容器に１０ｍｌの塩化メチレン（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を入れて３分間撹拌した。その次、溶媒を除去し、１０ｍｌのジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を入れ、３分間さらに撹拌した後に溶媒を除去した。前記反応容器に１０ｍｌのジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）を入れ、２００ｍｍｏｌｅのＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）および４００ｍｍｏｌｅのジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を入れた後、１時間撹拌して反応を誘導した。前記反応物を洗浄した後、２：１の割合で混合されたメタノールおよびジイソプロピルエチルアミンを入れて１０分間反応させ、１：１の割合で混合されたジクロロメタンおよびジメチルホルムアミドを過量投入して再度洗浄した。その次、溶媒を除去し、１０ｍｌのジメチルホルムアミドを入れて３分間撹拌し、溶媒を除去した。その次、脱保護反応のために、１０ｍｌの脱保護溶液（２０％のピペリジン／ジメチルホルムアミド）を前記反応容器に入れ、常温で１０分間撹拌した後に溶媒を除去する過程を総２回行った。その後、溶媒を除去し、前記反応物をそれぞれ３分間ジメチルホルムアミドで２回、塩化メチレンで２回、ジメチルホルムアミドで１回洗浄してＣｙｓ（ｔｒｔ）－ＣＴＬ樹脂を製造した。
【0075】
新しい反応容器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、２００ｍｍｏｌｅのＦｍｏｃ－Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）、２００ｍｍｏｌｅのＨＯＢｔ（ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）、および２００ｍｍｏｌｅのＢｏｐ（ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌｏｘｙｔｒｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を入れた後に撹拌した。前記反応容器に４００ｍｍｏｌｅのジイソプロピルエチルアミンを２回にわたって分けて入れた後、固体状態の反応物が全て溶解されるまで少なくとも５分以上撹拌した。その次、前記溶液をＣｙｓ（ｔｒｔ）－ＣＴＬ樹脂が含まれた前記反応容器に入れ、常温で１時間撹拌した後、溶媒を全て除去し、ジメチルホルムアミドで５分ずつ３回洗浄し、カイザーテスト（ｋａｉｓｅｒ ｔｅｓｔ、ｎｉｈｙｄｒｉｎ ｔｅｓｔ）により、前記反応物の反応程度を点検した。その次、前記反応物を前記Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＣＴＬ樹脂の製造過程で行われた脱保護反応を行い、Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＣＴＬ樹脂を製造した。前記樹脂は、ジメチルホルムアミドおよび塩化メチレンで十分に洗浄し、カイザーテストにより反応程度を点検した。
【0076】
その次、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（ｔｒｔ）、およびＦｍｏｃ－Ａｒｇ（ｐｂｆ）の順に、前記Ｈｉｓ（ｔｒｔ）－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＣＴＬ樹脂と連鎖反応を行った。その後、脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後によく洗浄し、Ｆｍｏｃ－保護基を除去した。前記脱保護された樹脂と、無水酢酸、ジイソプロピルエチルアミン、およびＨＯＢｔを１時間反応させてアセチル化反応を行った。その次、ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、およびメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥させた後、Ｐ２Ｏ５下で真空に減圧して完全に乾燥させた。
【0077】
前記乾燥された反応物に３０ｍｌの脱漏溶液（トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、ＴＦＡ）９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％）を入れた後、常温で２時間撹拌して反応させた。前記反応が完了した樹脂をフィルタを用いて濾過した後、少量のトリフルオロ酢酸で洗浄し、洗浄液を母液と混合した。前記混合溶液を減圧し、全体体積が半分程度残るように蒸留した後、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈殿を誘導し、遠心分離機を用いて沈殿物を得た後、冷たいエーテルを用いて２回洗浄した。その次、母液を除去し、窒素下で十分に乾燥し、精製前のＮＨ２－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－Ｔｈｒ－Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－Ｃｙｓ－ＯＨペプチジル樹脂（配列番号２）を０．６５ｇ合成した（収率：９２．６％）。分子量測定器を用いて、前記配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドの分子量を測定した結果、その分子量が１２８７．１Ｄａ（理論値：１２８６．５Ｄａ）に該当することを確認した。
【0078】
［１－２］配列番号１および配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドの合成
【0079】
前記［１－１］の合成方法と同様の方法を用いて、配列番号１および配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチドを合成した。この際、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ、およびＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）の順に前記ＣＴＬ樹脂と連鎖反応を行って配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを合成し、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、およびＦｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）の順に前記ＣＴＬ樹脂と連鎖反応を行った後にアセチル化して配列番号３のアミノ酸配列を含むペプチジル樹脂を合成した。
【0080】
【表1】
【0081】
［製造例２］トロロックス－ペプチド結合体の製造
【0082】
ペプチド反応器に１ｍｏｌｅのペプチジル樹脂および１０ｍｌの１－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）を入れ、２７０ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）の１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（１－ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ、１－ＨＯＢｔ）および７５９ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－Ｏ－（１Ｈ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ）ｕｒｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＨＢＴＵ）を添加し、３０分間反応させた。その次、前記反応物に３８８ｍｇ（３．０ｅｑｕｉｖ．）のＮ，Ｎ’－ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ，Ｎ’－Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、ＤＩＥＡ）および５００ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）のトロロックス（ｔｒｏｌｏｘ）を添加し、常温で７２時間反応させた後に濾過した。その次、前記濾過物および切断溶液（ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を常温で２時間反応させ、レジンおよび保護基を除去した。最後に、１０ｍｌのジエチルエーテルを入れて結晶化させ、トロロックス－ペプチド結合体（すなわち、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチドとトロロックスの結合体）を製造した。トロロックス－ペプチド結合体を製造するための反応式は、下記反応式１のとおりである。
【0083】
［反応式１］
【0084】
【化2】
【0085】
生成された３種のトロロックス－ペプチド結合体に対するＭＡＳＳ分析データをそれぞれ図１～図３に示した。前記ＭＡＳＳ分析データにおいて、それぞれ、分子量１５５０．７Ｄａ、１４８７．６２Ｄａ、および１４２３．６Ｄａに該当する配列１～配列３のトロロックス－ペプチド結合体が合成されたことを明らかに確認することができる。
【0086】
［実施例１］
【0087】
増殖促進効果の確認
【0088】
ＨＦＤＰＣ（ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｄｅｒｍａｌ ｐａｐｉｌｌａ ｃｅｌｌ）およびヒトケラチノサイト（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）であるＨａＣａＴを９６ウェルプレートの各ウェルに２×１０３個ずつ分注し、一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養した。前記培養された細胞の培養液を無血清培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）に取り替えた後、０．５μＭ、５μＭ、または５０μＭのトロロックス－ペプチド結合体をそれぞれ処理し、３日間さらに培養した。その次、細胞の増殖を確認するために、４ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）をウェルにそれぞれ１００μｌずつ入れ、４時間反応させて生成されたホルマザンをＤＭＳＯを処理して溶かした後、マイクロプレートリーダーを用いて５６０ｎｍにおいて吸光度を測定した。この際、陽性対照群としては、ＨＦＤＰＣおよびＨａＣａＴ細胞の増殖を促進すると知られている成長因子である１μＭのＩＧＦ－１またはＥＧＦを用い、比較群としては、本発明のトロロックス－ペプチド結合体と同一含量のトロロックスおよび配列番号１～配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド単独化合物を用いた。
【0089】
その結果、図４および図５に示されたように、ＨＦＤＰＣおよびＨａＣａＴ細胞にトロロックス－ペプチド結合体を処理した場合、何れもその細胞増殖が増加することが確認され、かかる細胞増殖が増加するという効果は、処理されるトロロックス－ペプチド結合体の濃度が大きくなるほど、さらに増加することが確認された。特に、ＨａＣａＴに５０μＭのトロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体を処理した場合には、陽性対照群であるＥＧＦくらい、細胞増殖が顕著に増加することが確認された。これに対し、比較群として用いられたトロロックス化合物は、細胞増殖効果がほぼ現れず、配列番号１～配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチド化合物は、細胞増殖効果が微弱であるか、または同一含量のトロロックス－ペプチド結合体よりも低い細胞増殖効果を示した。
【0090】
上記のような結果から、トロロックス－ペプチド結合体を処理する場合、ＨＦＤＰＣおよびＨａＣａＴ細胞の増殖を促進することで、毛髪成長促進効果が発揮可能であることが分かる。
【0091】
［実施例２］
【0092】
細胞内（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）ＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）阻害効果の確認
【0093】
ＨＦＤＰＣを６ウェルプレートの各ウェルに３×１０５個ずつ分注し、一晩培養した。前記培養された細胞に５０ｍＪのＵＶＢを照射し、前記細胞の培養液を無血清培地に取り替えた後、５μＭまたは５０μＭのトロロックス－ペプチド結合体をそれぞれ処理し、２４時間さらに培養した。その次、細胞内ＲＯＳの濃度を測定するために、ＤＣＦＨ－ＤＡ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）を処理し、３０分間反応させた後に細胞を回収し、ＦＡＣＳを用いて平均ＦＬ１値の変化を確認した。この際、陽性対照群として、細胞内ＲＯＳ阻害効果があると知られている５ｍＭのＮＡＣ（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｌ－ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を用いた。
【0094】
【0095】
上記のような結果から、トロロックス－ペプチド結合体を処理する場合、細胞内ＲＯＳが阻害され、毛乳頭細胞内の酸化的ストレスを顕著に減少させることで、脱毛防止効果が発揮可能であることが分かる。
【0096】
［実施例３］
【0097】
ＤＫＫ１タンパク質発現抑制効果の確認
【0098】
５α－還元酵素（５α－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）によりテストステロン（ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）から生成されたＤＨＴ（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）は、脱毛を誘発するタンパク質であるＤＫＫ１の発現が増加するように誘導すると知られている。そこで、前記トロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体によりＤＫＫ１の発現が抑制されるか否かを確認した。
【0099】
ＨＦＤＰＣを６ウェルプレートの各ウェルに３×１０５個ずつ分注し、一晩培養した。前記培養された細胞の培養液を無血清培地に取り替えた後、５μＭまたは５０μＭのトロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体、５α－還元酵素が含まれているマウス肝抽出物、およびテストステロンを処理し、２４時間さらに培養した。その次、ＤＫＫ－１タンパク質に特異的な抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）でウェスタンブロットを行ってタンパク質の発現様相を確認した。
【0100】
その結果、図９に示されたように、テストステロンおよびマウス肝抽出物の処理によりＤＫＫ１タンパク質の発現が増加し、トロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体が処理された場合、上記のように増加したＤＫＫ１タンパク質の発現が減少したことが確認された。
【0101】
上記のような結果から、トロロックス－ペプチド結合体は、５α－還元酵素の活性を抑制させてＤＨＴの生成が抑制されるようにすることで、窮極的に脱毛を誘発するＤＫＫ１タンパク質の発現が非常に効果的に抑制可能であることが分かる。
【0102】
［実施例４］
【0103】
細胞死滅関連タンパク質の発現変化の確認
【0104】
ＨＦＤＰＣを６ウェルプレートの各ウェルに３×１０５個ずつ分注し、一晩培養した。前記培養された細胞の培養液を無血清培地に取り替えた後、５０μＭのトロロックス、５０μＭのトロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体、または５０μＭのトロロックス－ペプチド（配列番号３）結合体をそれぞれ処理し、２４時間さらに培養した。その次、Ｂｃｌ－２およびＢａｘタンパク質に特異的な抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）でウェスタンブロットを行い、タンパク質の発現変化を確認した。
【0105】
その結果、図１０に示されたように、トロロックスのみを処理した場合には、Ｂｃｌ－２の発現に変化がなく、Ｂａｘの発現が増加したことが確認された。その反面、トロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体およびトロロックス－ペプチド（配列番号３）結合体を処理した場合には、Ｂｃｌ－２の発現が増加し、Ｂａｘの発現が顕著に減少することが確認された。
【0106】
上記のような結果から、トロロックス単独で用いられる場合には、細胞死滅を誘導することができないが、前記トロロックスにペプチドが結合される場合には、細胞死滅と関連したタンパク質の発現変化を誘導することで、細胞死滅を誘導可能であることが分かる。
【0107】
［実施例５］
【0108】
ＭＳＸ２遺伝子の発現増加可否の確認
【0109】
ＨＨＧＭＣ（ｈｕｍａｎ ｈａｉｒ ｇｅｒｍｉｎａｌ ｍａｔｒｉｘ ｃｅｌｌ）において、前記トロロックス－ペプチド結合体により、毛嚢発達、毛髪周期の制御、および毛幹の分化に関与するＭＳＸ２遺伝子の発現が変化するか否かを確認した。
【0110】
ＨＨＧＭＣを６ウェルプレートの各ウェルに３×１０５個ずつ分注し、一晩培養した。前記培養された細胞の培養液を０．５％のウシ胎児血清が含まれた培地に取り替えた後、５μＭまたは５０μＭのトロロックス－ペプチド（配列番号１）結合体、トロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体、またはトロロックス－ペプチド（配列番号３）結合体をそれぞれ処理し、２４時間さらに培養した。その次、前記細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｔｒｏｎ、韓国）を用いて定量した後、同一量の全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。前記合成されたｃＤＮＡを鋳型とし、下記表２のプライマーを用いてＭＳＸ２遺伝子に対するＰＣＲ反応を行った。その後、前記ＰＣＲ産物を５％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動させ、ＭＳＸ２遺伝子の発現程度を比較した。
【0111】
【表2】
【0112】
その結果、図１１に示されたように、トロロックス－ペプチド結合体を処理する場合、ＭＳＸ２遺伝子の発現が増加することが確認された。上記のような結果から、前記トロロックス－ペプチド結合体により、毛嚢発達、毛髪周期の制御、および毛幹の分化に関与するＭＳＸ２遺伝子の発現が増加することで、脱毛を防止可能であることが分かる。
【0113】
［実施例６］
【0114】
ケラチン－１４遺伝子の発現増加の確認
【0115】
ＨａＣａＴ細胞を６ウェルプレートの各ウェルに５×１０５個ずつ分注し、一晩培養した。前記培養された細胞の培養液を無血清培地に取り替えた後、５μＭまたは５０μＭのトロロックス－ペプチド（配列番号１）結合体、トロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体、またはトロロックス－ペプチド（配列番号３）結合体をそれぞれ処理し、２４時間さらに培養した。その次、前記［実施例５］と同様の過程により、ケラチン－１４遺伝子の発現程度を比較した。
【0116】
【表3】
【0117】
その結果、図１２に示されたように、トロロックス－ペプチド結合体を処理する場合、ケラチン－１４遺伝子の発現が増加することが確認された。かかるケラチン－１４遺伝子の発現が増加するという効果は、処理されるトロロックス－ペプチド結合体の濃度が大きくなるほど、さらに増加することが確認された。上記のような結果から、前記トロロックス－ペプチド結合体によりケラチン－１４遺伝子の発現が増加することで、発毛を促進可能であることが分かる。
【0118】
［実施例７］
【0119】
細胞シグナル伝達効果の確認
【0120】
毛嚢周期を調節するシグナル伝達は、Ｗｎｔ、Ｓｈｈ、またはＢＭＰなどが存在すると報告されている。よって、前記トロロックス－ペプチド結合体がどのような細胞シグナル伝達に関与することで、脱毛抑制（または防止）または発毛促進効果を発揮するかを確認した。
【0121】
ＨＦＤＰＣを６ウェルプレートの各ウェルに３×１０５個ずつ分注し、一晩培養した。前記培養された細胞の培養液を無血清培地に取り替えた後、以下の実験を行った。
【0122】
［７－１］ＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）２細胞シグナル伝達抑制効果
【0123】
前記ＨＦＤＰＣ細胞に５０ｎｇ／μｌのＢＭＰ－２、および５μＭまたは５０μＭのトロロックス－ペプチド（配列番号１）結合体を処理し、１５分間さらに培養した。その次、ＢＭＰ２細胞シグナル伝達により発現が調節される下流タンパク質であるＰ－ｓｍａｄ１／５／８タンパク質に特異的な抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）でウェスタンブロットを行い、タンパク質の発現変化を確認した。
【0124】
その結果、図１３に示されたように、５０μＭのトロロックス－ペプチド（配列番号１）結合体を処理した場合、ＢＭＰ２の処理により増加したＰ－ｓｍａｄ１／５／８のタンパク質発現レベルが減少したことが確認された。
【0125】
上記のような結果から、前記トロロックス－ペプチド（配列番号１）結合体により、脱毛を誘導するＢＭＰ２細胞シグナル伝達が抑制されることで、効果的に脱毛を抑制または予防可能であることが分かる。
【0126】
［７－２］トロロックス－ペプチド結合体の細胞シグナル伝達効果
【0127】
前記ＨＦＤＰＣ細胞に５μＭまたは５０μＭのトロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体を処理し、３０分間さらに培養した。その次、前記細胞を回収し、核に存在するタンパク質を分画して抽出した後、β－カテニンタンパク質に特異的な抗体（ｓａｎｔａｃｒｕｚ、米国）でウェスタンブロットを行い、タンパク質の発現変化を確認した。
【0128】
その結果、図１４に示されたように、トロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体を処理した場合、核内に存在するβ－カテニンの量が顕著に増加することが確認された。
【0129】
上記のような結果から、トロロックス－ペプチド（配列番号２）結合体により、Ｗｎｔ細胞シグナル伝達が活性化されることで、発毛促進効果が発揮可能であることが分かる。
【0130】
［７－３］トロロックス－ペプチド（配列番号３）結合体の細胞シグナル伝達効果
【0131】
前記ＨＦＤＰＣ細胞に５μＭまたは５０μＭのトロロックス－ペプチド（配列番号３）結合体を処理し、１５分間さらに培養した。その次、前記細胞を回収し、核に存在するタンパク質を分画して抽出した後、ｐ－Ｅｒｋ１／２およびｐ－Ａｋｔタンパク質に特異的な抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、米国）でウェスタンブロットを行い、タンパク質の発現変化を確認した。
【0132】
その結果、図１５に示されたように、トロロックス－ペプチド（配列番号３）結合体を処理した場合、Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔのリン酸化が顕著に増加することが確認された。かかるリン酸化の増加効果は、処理されるトロロックス－ペプチド結合体の濃度が大きくなるほど、さらに増加することが確認された。
【0133】
上記のような結果から、トロロックス－ペプチド（配列番号３）結合体は、Ｅｒｋ１／２およびＡｋｔのリン酸化と関連しているＫＧＦ細胞シグナル伝達を活性化させることで、発毛促進が効果的に誘導可能であることが分かる。
【0134】
以上、本発明は記載された実施例に対してのみ詳細に説明されたが、本発明の技術思想の範囲内で多様な変形および修正が可能であることは当業者にとって明らかであり、かかる変形および修正が添付の請求範囲に属することはいうまでもない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】