▶ ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハーの特許一覧
特表2022-531731コロナウイルススパイクタンパク質の改変されたＳ１サブユニット
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-08
(54)【発明の名称】コロナウイルススパイクタンパク質の改変されたＳ１サブユニット
(51)【国際特許分類】
C12N 15/50 20060101AFI20220701BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20220701BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20220701BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220701BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220701BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220701BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220701BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220701BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20220701BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220701BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220701BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220701BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20220701BHJP
【ＦＩ】
C12N15/50
C12N15/10 200Z
C07K14/165 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N7/01
A61P11/00
A61P31/14
A61P37/04
A61K39/215
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021566318
(86)(22)【出願日】2020-05-06
(85)【翻訳文提出日】2021-11-08
(86)【国際出願番号】 EP2020062526
(87)【国際公開番号】W WO2020229248
(87)【国際公開日】2020-11-19
(31)【優先権主張番号】19173821.0
(32)【優先日】2019-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】19212627.4
(32)【優先日】2019-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】505258715
【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー
【氏名又は名称原語表記】Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ ＧｍｂＨ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(72)【発明者】
【氏名】クレーマー－キュール アニカ
(72)【発明者】
【氏名】シュテファン トーマス ミン
(72)【発明者】
【氏名】フィリップ ハンス－クリスティアン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA26X
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA45
4C085AA03
4C085BA71
4C085CC08
4C085CC21
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明はとりわけ、アミノ酸２６７位のシステインへの突然変異を含む、組換えトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片に関する。さらに、本発明は、そのようなスパイクタンパク質を有するトリコロナウイルスを含む、免疫原性組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来であり、アミノ酸２６７位がシステインである、トリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【請求項2】
アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【請求項3】
トリコロナウイルスがＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）である、請求項１または２に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【請求項4】
アミノ酸２６７位のシステインが突然変異により導入されている、請求項１に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【請求項5】
アミノ酸２６７位のシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの前記突然変異が、トリコロナウイルスの拡張された細胞または組織指向性を導く、請求項１～４のいずれか１項に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【請求項6】
トリコロナウイルスが、ＤＦ－１（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｆｏｓｔｅｒ）、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ（ＰＢＳ－１２無血清）、ＢＨＫ２１（ベビーハムスター腎臓）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚性腎臓）、Ｖｅｒｏ（Ｖｅｒｄａ Ｒｅｎｏ）、ＭＡ１０４、ＲＫ１３（ウサギ腎臓）、ＬＭＨ（レグホンオス肝細胞癌）、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）、ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙウシ腎臓）、ＰＫ１５（ブタ腎臓）、ＰＫ２Ａ（ブタ腎臓）、ＳＦ９、ＳＦ２１およびＳＦ＋（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系において感染および／または複製する、請求項１～５のいずれか１項に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【請求項7】
配列番号１のアミノ酸配列が、スパイクタンパク質における位置番号付けを決定するのに使用される、請求項１～６のいずれか１項に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【請求項8】
アミノ酸２６７位がスパイクタンパク質のＳ１サブユニット内にある、請求項１～７のいずれか１項に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【請求項9】
スパイクタンパク質がＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株由来でない、請求項３～８のいずれか１項に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【請求項10】
スパイクタンパク質が、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｂｒａｚｉｌ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、Ｄｕｔｃｈ、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｅｏｒｇｉａ、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｉｏｗａ、Ｉｔａｌｙ－０２、ＪＭＫ、ＬＤＴ３、Ｍａｉｎｅ、Ｈ５２、Ｈ１２０、Ｍ４１、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＰＬ８４０８４、Ｑｕ、ＱＸ、Ｑ１、ＳＥ１７、バリアント２および４／９１からなるリストから選択される遺伝子型または血清型または株を有するＩＢＶ由来である、請求項３～９のいずれか１項に記載のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【請求項11】
ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片が、ＧＩ－２～２７、ＧＩＩ－１、ＧＩＩＩ－１、ＧＩＶ－１、ＧＶ－１、ＧＶＩ－１からなる遺伝子型のリストから選択される、請求項３～１０のいずれか１項に記載のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【請求項12】
ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示されるアミノ酸配列、またはこれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％もしくは９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはそれを含む、請求項３～１１のいずれか１項に記載のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【請求項13】
Ｓ１サブユニットの前記少なくとも一部が、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｂｒａｚｉｌ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、Ｄｕｔｃｈ、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｅｏｒｇｉａ、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｉｏｗａ、Ｉｔａｌｙ－０２、ＪＭＫ、ＬＤＴ３、Ｍａｉｎｅ、Ｈ５２、Ｈ１２０、Ｍ４１、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＰＬ８４０８４、Ｑｕ、ＱＸ、Ｑ１、ＳＥ１７、バリアント２および４／９１からなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択されるＩＢＶ由来である、請求項３～１２のいずれか１項に記載のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【請求項14】
限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスまたはＩＢＶが、胚含有鶏卵および／または初代ニワトリ腎臓細胞における感染および／または複製に限定される、請求項１および３～１３のいずれか１項に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか１項に記載のスパイクタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列。
【請求項16】
請求項１５に記載のヌクレオチド配列を含むプラスミド。
【請求項17】
請求項１６に記載のプラスミドを含む細胞。
【請求項18】
請求項１～１４のいずれか１項に記載のスパイクタンパク質またはその断片を含むウイルス粒子。
【請求項19】
請求項１～１４のいずれか１項に記載のスパイクタンパク質もしくはその断片を含むトリコロナウイルス、または請求項３～１４のいずれか１項に記載のスパイクタンパク質を含むＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）。
【請求項20】
トリコロナウイルスまたはＩＢＶが弱毒化されている、請求項１９に記載のトリコロナウイルスまたはＩＢＶ。
【請求項21】
－ 請求項１８に記載のウイルス粒子、または－ 請求項１９に記載のトリコロナウイルスもしくはＩＢＶ
を含む細胞。
【請求項22】
－ 請求項１～１４のいずれか１項に記載のスパイクタンパク質、または－ 請求項１８に記載のウイルス粒子、または
－ 請求項１９に記載のトリコロナウイルスもしくはＩＢＶ
を含む免疫原性組成物。
【請求項23】
請求項１～１４のいずれか１項に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、拡張された細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスの生成または製造のための方法。
【請求項24】
請求項１～１４のいずれか１項に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、細胞または組織培養物においてトリコロナウイルスを培養するための方法。
【請求項25】
コロナウイルススパイクタンパク質が、請求項３～１４のいずれか１項に記載のＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）スパイクタンパク質である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項26】
請求項２２に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む、そのような対象を免疫化するための方法。
【請求項27】
それを必要とする対象においてＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、治療有効量の請求項２２に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項28】
それを必要とする対象において、同じ種の免疫化されていない対照群の対象と比較して線毛運動障害を低減させる方法であって、治療有効量の請求項２２に記載の免疫原性組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
配列表
本出願は、37 C.F.R. 1.821 - 1.825による配列表を含む。本出願に添付の配列表は、これにより参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
本出願は、37 C.F.R. 1.821 - 1.825による配列表を含む。本出願に添付の配列表は、これにより参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
トリコロナウイルス感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）は、ニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）のプロトタイプのガンマコロナウイルスである。感染性気管支炎ウイルスは主として、ニワトリの上部呼吸器上皮に感染し、一般的には二次細菌病原体によって併発する呼吸器疾患を引き起こす（Cook et al. 2012. Avian Pathol. 41:239-250）。いくつかのＩＢＶ株はさらに、尿細管、卵管および消化管の一部にも発症し、これらの器官系における病理学的な病変および臨床徴候をもたらす。このウイルスは、市販および裏庭のニワトリの両方において世界的に存在する。ゲノムの変動性の高さにより、ＩＢＶは、広範の遺伝子型、血清型および保護型（ｐｒｏｔｅｃｔｏｔｙｐｅ）に区別される。ＩＢＶは、現在、家禽産業において最も経済的に関連のあるウイルス病原体であると考えられている。
【0003】
感染性気管支炎ウイルスは、２７．６ｋｂの一本鎖プラス鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープ型ウイルスである（Cavanagh 2007. Vet. Res. 38:281-297）。前記ウイルスゲノムの最初の３分の２は、大きなコード領域を含み（遺伝子１とも指定される）、これは、２つのオープンリーディングフレーム１ａおよび１ｂに分割され、これらは、ＲＮＡ複製、編集および転写に関与する少なくとも１５の非構造タンパク質をコードする。ウイルスゲノムの最後の３分の１は、構造タンパク質である、スパイクタンパク質（Ｓ、遺伝子２によりコードされる）、エンベロープタンパク質（Ｅ、遺伝子３ｃによりコードされる）、膜タンパク質（Ｍ、遺伝子４によりコードされる）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ、遺伝子６によりコードされる）をコードする。タンパク質Ｓ、ＥおよびＭは、ウイルスエンベロープの一部であり、一方、タンパク質Ｎは、ウイルスＲＮＡとともにリボヌクレオタンパク質コアを形成する。コロナウイルススパイクタンパク質は、宿主種の指向性を決定する（Kuo et al. 2000. J. Virol. 74:1393-1406）。これは、二量体または三量体の膜貫通タンパク質であり、タンパク質分解により２つのサブユニット、Ｓ１およびＳ２に切断される。グリコシル化Ｓ１ドメインは、スパイクタンパク質の「頭部」を形成し、宿主細胞表面上の２，３－結合シアル酸と相互作用する受容体結合ドメインを含む（Promkuntod et al. 2014. Virology. 448:26-32）。Ｓ２ドメインは、外部ドメインの残りの部分（「ストーク」）、膜貫通ドメインおよび細胞質に位置する内部ドメインを含む。
【0004】
現在まで広く使用されている生弱毒化ＩＢＶワクチン株Ｈ５２およびＨ１２０は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ＩＢＶ株を胚含有鶏卵において連続的に継代することにより、１９６０年代にオランダで開発された（Bijlenga et al. 2004; Avian Pathol. 33:550-557）。前記ワクチン株はまた、生成のために胚含有鶏卵内で培養しなければならない。今日において、ＩＢＶワクチン（不活化ワクチンおよび生ワクチンの両方）は、未だに胚含有鶏卵内で培養されており、これは厄介かつ高価である。
これまでのところ記載されている、唯一の細胞系適応ＩＢＶは、ＩＢＶ株Ｂｅａｕｄｅｔｔｅであり、これは、Ｖｅｒｏ細胞およびＢＨＫ細胞において効率的に複製する。Casais et al 2003 (J. Virol. 77; 9084-9089)は、拡張した細胞系指向性を他のＩＢＶ（Ｍ４１）に移行することが可能であった、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅスパイクの外部ドメイン配列を使用して組換えＩＢＶを作製することにより、ＢｅａｕｄｅｔｔｅのＳタンパク質が、細胞系指向性の決定因子であることを示している。国際公開第２０１１／００４１４６号は、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ由来のＳ２サブユニットが、拡張した組織指向性の原因となっていることを開示している。Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ由来のへパラン流酸結合部位である、Ｓ２サブユニット内の配列は、細胞系指向性の拡張の原因であることが特定されている。さらに、Bickerton et al 2018 (Journal of Virology 92 (19))は、８アミノ酸のＢｅａｕｄｅｔｔｅ特異的なモチーフを開示している。しかし、ＢｅａｕｄｅｔｔｅスパイクＳ２サブユニットを有する組換えＩＢＶは、ワクチンとしては適切ではない。Ellis et al 2018 (J. Virol. 92(23))は、Ｍ４１またはＱＸ由来の異種性Ｓ１サブユニットを、ＢｅａｕｄｅｔｔｅスパイクＳ２サブユニットと組み合わせて有するキメラスパイクを有する組換えＢｅａｕｄｅｔｔｅが、Ｓ１同種性暴露に対する十分な保護を付与するものではないことを記載している。また、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ野生型は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ血清型に属する他の認可ワクチンと同様に、同種性暴露に対する保護を提供しない（Hodgson et al 2004: J Virol 78:13804-13811またはGeilhausen et al 1973: Archiv fur die gesamte Virusforschung 40: 285-290）。
これまでのところ記載されている、唯一の細胞系適応ＩＢＶは、ＩＢＶ株Ｂｅａｕｄｅｔｔｅであり、これは、Ｖｅｒｏ細胞およびＢＨＫ細胞において効率的に複製する。Casais et al 2003 (J. Virol. 77; 9084-9089)は、拡張した細胞系指向性を他のＩＢＶ（Ｍ４１）に移行することが可能であった、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅスパイクの外部ドメイン配列を使用して組換えＩＢＶを作製することにより、ＢｅａｕｄｅｔｔｅのＳタンパク質が、細胞系指向性の決定因子であることを示している。国際公開第２０１１／００４１４６号は、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ由来のＳ２サブユニットが、拡張した組織指向性の原因となっていることを開示している。Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ由来のへパラン流酸結合部位である、Ｓ２サブユニット内の配列は、細胞系指向性の拡張の原因であることが特定されている。さらに、Bickerton et al 2018 (Journal of Virology 92 (19))は、８アミノ酸のＢｅａｕｄｅｔｔｅ特異的なモチーフを開示している。しかし、ＢｅａｕｄｅｔｔｅスパイクＳ２サブユニットを有する組換えＩＢＶは、ワクチンとしては適切ではない。Ellis et al 2018 (J. Virol. 92(23))は、Ｍ４１またはＱＸ由来の異種性Ｓ１サブユニットを、ＢｅａｕｄｅｔｔｅスパイクＳ２サブユニットと組み合わせて有するキメラスパイクを有する組換えＢｅａｕｄｅｔｔｅが、Ｓ１同種性暴露に対する十分な保護を付与するものではないことを記載している。また、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ野生型は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ血清型に属する他の認可ワクチンと同様に、同種性暴露に対する保護を提供しない（Hodgson et al 2004: J Virol 78:13804-13811またはGeilhausen et al 1973: Archiv fur die gesamte Virusforschung 40: 285-290）。
【0005】
Fang et al 2005 (Biochemical and Biophysical Reaearch Communication 336; pages 417 to 423)は、Ｖｅｒｏ細胞における増殖のためのＢｅａｕｄｅｔｔｅの適応は、４９のアミノ酸改変をもたらし、２６はスパイクタンパク質中に位置していたことを開示している。
合わせると、スパイクタンパク質を異種性Ｂｅａｕｄｅｔｔｅスパイクタンパク質に交換することにより、拡張された細胞または組織指向性を有するＩＢＶワクチンを提供することは、十分な有効性を提供するＩＢＶワクチンをもたらすものではなく、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅスパイク配列は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ血清型株の暴露に対する保護に限定されており、さらなる遺伝子型に対する交差保護は見られない。さらに、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅにおいて同定された、先行技術のモチーフおよび部位は、拡張された細胞培養または組織指向性および保護の有効性の両方を示すＩＢＶワクチンには移行されていない（指向性の拡張とワクチン有効性の間の相互参照は示されていない）。
結果として、ワクチン有効性に影響を及ぼすことなく、生成のための拡張された細胞または組織指向性を可能にする、ＩＢＶまたはＩＢＶワクチンに移行された、単一のアミノ酸または短いモチーフが必要とされている。
合わせると、スパイクタンパク質を異種性Ｂｅａｕｄｅｔｔｅスパイクタンパク質に交換することにより、拡張された細胞または組織指向性を有するＩＢＶワクチンを提供することは、十分な有効性を提供するＩＢＶワクチンをもたらすものではなく、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅスパイク配列は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ血清型株の暴露に対する保護に限定されており、さらなる遺伝子型に対する交差保護は見られない。さらに、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅにおいて同定された、先行技術のモチーフおよび部位は、拡張された細胞培養または組織指向性および保護の有効性の両方を示すＩＢＶワクチンには移行されていない（指向性の拡張とワクチン有効性の間の相互参照は示されていない）。
結果として、ワクチン有効性に影響を及ぼすことなく、生成のための拡張された細胞または組織指向性を可能にする、ＩＢＶまたはＩＢＶワクチンに移行された、単一のアミノ酸または短いモチーフが必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
本発明の態様を記載する前に、本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用されている、単数形形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに異ならない限り、複数の言及を含むことは理解されなければならない。したがって、「１の抗原（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ）」に対する言及は、複数の抗原を含み、「ウイルス（ｖｉｒｕｓ）」への言及は、１種または複数のウイルスおよび当技術分野の当業者に公知の等価物等に対する言及である。特に断らない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用してもよいが、好ましい方法、デバイスおよび材料はここに記載されている。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明と関連して使用する可能性のある、刊行物に報告されている細胞系、ベクターおよび方法論を記載する目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。本発明が、先行発明によるそのような記載に先立つ権利を有するものではないという承認であるとみなされるべきものは本明細書中に存在しない。
【0007】
組成物
本発明は、先行技術に固有の問題を解決し、当技術分野の状態に顕著な進歩を提供する。
一般的に、本発明は、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来であり、アミノ酸２６７位がシステインである、トリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片を提供する。
さらに、本発明は、アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片を提供する。
一般的に、本発明はまた、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、限定的な細胞または組織指向性を有するＩＢＶ由来であり、アミノ酸２６７位がシステインである、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片を提供する。
さらに、本発明は、アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片を提供する。
本発明は、先行技術に固有の問題を解決し、当技術分野の状態に顕著な進歩を提供する。
一般的に、本発明は、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来であり、アミノ酸２６７位がシステインである、トリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片を提供する。
さらに、本発明は、アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片を提供する。
一般的に、本発明はまた、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、限定的な細胞または組織指向性を有するＩＢＶ由来であり、アミノ酸２６７位がシステインである、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片を提供する。
さらに、本発明は、アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片を提供する。
【0008】
好都合なことに、試験データは、コロナウイルス株（例えば、Ｈ５２、ＱＸ ＳＰ２０１３－０１４７８およびＣＲ８８ ＩＢＶ株等の株）は、スパイクタンパク質内の単一の位置である、２６７位をシステインに改変した後に、拡張された細胞または組織指向性を有することを示している。
「コロナウイルス」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。一般的には、コロナウイルスは、ニドウイルス目、コロナウイルス科、コロナウイルス亜科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）のウイルスである。コロナウイルスは、エンベロープ型ウイルスであり、螺旋型の対称性のヌクレオカプシドを有する、一本鎖プラス鎖ＲＮＡを有する。「コロナウイルス」という用語は、感染性気管支炎ウイルスの全ての株、遺伝子型、保護型および血清型を含む。トリコロナウイルスの例は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）およびシチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ；シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）である。
「コロナウイルス」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。一般的には、コロナウイルスは、ニドウイルス目、コロナウイルス科、コロナウイルス亜科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）のウイルスである。コロナウイルスは、エンベロープ型ウイルスであり、螺旋型の対称性のヌクレオカプシドを有する、一本鎖プラス鎖ＲＮＡを有する。「コロナウイルス」という用語は、感染性気管支炎ウイルスの全ての株、遺伝子型、保護型および血清型を含む。トリコロナウイルスの例は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）およびシチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ；シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）である。
【0009】
「ＩＢＶ」という用語は、当技術分野の当業者に周知である感染性気管支炎ウイルスを指す。「ＩＢＶ」という用語は、感染性気管支炎ウイルスの全ての株、遺伝子型、保護型および血清型を含む。
「突然変異」という用語は、ウイルスＲＮＡコードタンパク質中の、前記コードタンパク質の変更をもたらす改変を含む。さらに、「突然変異」という用語は、一般的に、遺伝子操作された突然変異を含む。突然変異という用語は、置換（１つまたはいくつかのヌクレオチド／塩基対の置換）、欠失（１つ、いくつか、または全てのヌクレオチド／塩基対の除去）、および／または挿入（１つまたはいくつかのヌクレオチド／塩基対の付加）に関するが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、突然変異は、単一の突然変異であっても、またはいくつかの突然変異であってもよく、したがって、使用される「突然変異」という用語はしばしば、単一の突然変異およびいくつかの突然変異の両方に関する。しかし、突然変異という用語は、当技術分野の当業者に周知であり、当技術分野の当業者は、容易に突然変異を作製することができる。
「突然変異」という用語は、ウイルスＲＮＡコードタンパク質中の、前記コードタンパク質の変更をもたらす改変を含む。さらに、「突然変異」という用語は、一般的に、遺伝子操作された突然変異を含む。突然変異という用語は、置換（１つまたはいくつかのヌクレオチド／塩基対の置換）、欠失（１つ、いくつか、または全てのヌクレオチド／塩基対の除去）、および／または挿入（１つまたはいくつかのヌクレオチド／塩基対の付加）に関するが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、突然変異は、単一の突然変異であっても、またはいくつかの突然変異であってもよく、したがって、使用される「突然変異」という用語はしばしば、単一の突然変異およびいくつかの突然変異の両方に関する。しかし、突然変異という用語は、当技術分野の当業者に周知であり、当技術分野の当業者は、容易に突然変異を作製することができる。
【0010】
「スパイク」という用語は、当技術分野の当業者に周知の、トリコロナウイルスまたはＩＢＶの特定のタンパク質を指す。前記スパイクタンパク質は、抗体および保護免疫応答の主要な誘発因子である。さらに、スパイク（Ｓ）タンパク質は、宿主細胞上の細胞受容体に結合し、また、宿主細胞膜との、ウイルス－細胞膜融合を媒介することにより、トリコロナウイルスまたはＩＢＶの細胞侵入を促進する。さらに、これは、ウイルス株の組織および細胞指向性を決定する。
「タンパク質」、「アミノ酸」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用される。「タンパク質」という用語は、天然に存在するアミノ酸ならびにその誘導体から構成されるアミノ酸の配列を指す。天然に存在するアミノ酸は、当技術分野において周知であり、生化学の標準的な教科書に記載されている。アミノ酸配列内において、アミノ酸はペプチド結合により連結されている。さらに、アミノ酸配列の２つの末端は、カルボキシル末端（Ｃ末端）およびアミノ末端（Ｎ末端）と称する。「タンパク質」という用語は、本質的に精製されたタンパク質または、加えて他のタンパク質を含むタンパク質調製物を含む。さらに、前記用語はまた、タンパク質断片にも関する。さらに、これは、化学修飾されたタンパク質を含む。そのような修飾は、人工的な修飾であっても、または天然に存在する修飾、例えばリン酸化、グリコシル化、およびミリスチル化等であってもよい。
「タンパク質」、「アミノ酸」および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用される。「タンパク質」という用語は、天然に存在するアミノ酸ならびにその誘導体から構成されるアミノ酸の配列を指す。天然に存在するアミノ酸は、当技術分野において周知であり、生化学の標準的な教科書に記載されている。アミノ酸配列内において、アミノ酸はペプチド結合により連結されている。さらに、アミノ酸配列の２つの末端は、カルボキシル末端（Ｃ末端）およびアミノ末端（Ｎ末端）と称する。「タンパク質」という用語は、本質的に精製されたタンパク質または、加えて他のタンパク質を含むタンパク質調製物を含む。さらに、前記用語はまた、タンパク質断片にも関する。さらに、これは、化学修飾されたタンパク質を含む。そのような修飾は、人工的な修飾であっても、または天然に存在する修飾、例えばリン酸化、グリコシル化、およびミリスチル化等であってもよい。
【0011】
２６７位の突然変異
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の一態様では、アミノ酸２６７位におけるシステインは、突然変異により導入される。「導入された」という語句は、突然変異が遺伝子操作により（人工的に、例えば人の介入によって）導入されていることを意味する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、突然変異はアミノ酸置換、欠失または挿入である。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位における疎水性アミノ酸をシステインに突然変異させるか、またはアミノ酸２６７位におけるフェニルアラニンまたはロイシンをシステインに突然変異させる。
拡張された細胞または組織指向性
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位におけるシステインまたは、アミノ酸２６７位におけるシステインへの前記突然変異は、トリコロナウイルスまたはＩＢＶの拡張された細胞または組織指向性を導く。
「細胞または組織」という用語は、当技術分野の当業者には公知である。細胞という用語は、細胞系、例えば本明細書の他の箇所に列挙した細胞系ならびに初代細胞を含む。組織という用語は、本明細書の他の箇所に列挙するような、組織由来の細胞、例えば、肺または肝臓由来の初代ニワトリ胚細胞、または初代ニワトリ線維芽細胞を含む。前記用語は、生物の体外で培養されている細胞または組織（細胞）の増殖を含む。「培養」という用語は、当技術分野の当業者には公知の規定された培養条件外の細胞（例えば細胞系細胞または初代細胞または組織細胞）の増殖に関する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の一態様では、アミノ酸２６７位におけるシステインは、突然変異により導入される。「導入された」という語句は、突然変異が遺伝子操作により（人工的に、例えば人の介入によって）導入されていることを意味する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、突然変異はアミノ酸置換、欠失または挿入である。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位における疎水性アミノ酸をシステインに突然変異させるか、またはアミノ酸２６７位におけるフェニルアラニンまたはロイシンをシステインに突然変異させる。
拡張された細胞または組織指向性
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位におけるシステインまたは、アミノ酸２６７位におけるシステインへの前記突然変異は、トリコロナウイルスまたはＩＢＶの拡張された細胞または組織指向性を導く。
「細胞または組織」という用語は、当技術分野の当業者には公知である。細胞という用語は、細胞系、例えば本明細書の他の箇所に列挙した細胞系ならびに初代細胞を含む。組織という用語は、本明細書の他の箇所に列挙するような、組織由来の細胞、例えば、肺または肝臓由来の初代ニワトリ胚細胞、または初代ニワトリ線維芽細胞を含む。前記用語は、生物の体外で培養されている細胞または組織（細胞）の増殖を含む。「培養」という用語は、当技術分野の当業者には公知の規定された培養条件外の細胞（例えば細胞系細胞または初代細胞または組織細胞）の増殖に関する。
【0012】
「拡張された指向性」という用語は、本発明のトリコロナウイルスまたはＩＢＶが、細胞（例えば細胞系）または組織細胞（腎臓由来の初代ニワトリ胚細胞に加えて）中で増殖し得ることを意味している。対照的に、コロナウイルスワクチン（例えばＩＢＶワクチン）または非細胞培養適応野生型コロナウイルスまたはＩＢＶ’ｓ（細胞系適応ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株が記載されている）は、胚含有鶏卵または腎臓由来の初代ニワトリ胚細胞（適応後）でのみ増殖し得る。したがって、拡張された細胞または組織指向性を有する本発明のコロナウイルス（例えば、ＩＢＶ）は、腎臓由来の初代ニワトリ胚細胞以外の１種または複数の細胞系または組織細胞において感染および／または複製する能力を有する。好ましくは、拡張された細胞または組織指向性を有する本発明のコロナウイルス（例えばＩＢＶ）は、本明細書に列挙する１種または複数の細胞系において感染および／または複製する能力を有する。したがって、例えば、拡張された細胞または組織指向性を有するコロナウイルスまたはＩＢＶは、ＰＢＳ－１２ＳＦ、ＥＢ６６またはＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において感染および／または複製する能力を有する。
【0013】
「限定的な指向性」という用語は、トリコロナウイルスまたはＩＢＶが、もしあったとしても、腎臓由来の初代ニワトリ胚細胞上でのみ増殖できることを意味する。したがって、限定的な細胞または組織指向性を有するコロナウイルスまたはＩＢＶは、例えば、ＰＢＳ－１２ＳＦ、ＥＢ６６またはＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において、感染および／または複製する能力を持たない。
好都合なことに、試験データは、ＩＢＶ株、例示的にはＨ５２およびＣＲ８８等が、スパイクタンパク質中の単独の位置である、２６７位をシステインに改変した後、拡張された細胞または組織指向性を有することを示している。さらに、２６７位におけるシステインへの改変は遺伝的に安定であることが示されている。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは、肺または肝臓由来の初代ニワトリ胚細胞または初代ニワトリ線維芽細胞、ニワトリ胚線維芽細胞系、アヒル胚幹細胞系、ヒト胚性腎臓細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系、ウサギ腎臓細胞系、イヌ腎臓細胞系、ニワトリ肝臓細胞系、ウシ腎臓細胞系、ブタ腎臓細胞系および昆虫細胞系からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系または細胞において感染および／または複製している。
好都合なことに、試験データは、ＩＢＶ株、例示的にはＨ５２およびＣＲ８８等が、スパイクタンパク質中の単独の位置である、２６７位をシステインに改変した後、拡張された細胞または組織指向性を有することを示している。さらに、２６７位におけるシステインへの改変は遺伝的に安定であることが示されている。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは、肺または肝臓由来の初代ニワトリ胚細胞または初代ニワトリ線維芽細胞、ニワトリ胚線維芽細胞系、アヒル胚幹細胞系、ヒト胚性腎臓細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系、ウサギ腎臓細胞系、イヌ腎臓細胞系、ニワトリ肝臓細胞系、ウシ腎臓細胞系、ブタ腎臓細胞系および昆虫細胞系からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系または細胞において感染および／または複製している。
【0014】
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスは、ＤＦ－１（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｆｏｓｔｅｒ）、ＥＢ６６（アヒル胚幹細胞系）、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ（ＰＢＳ－１２無血清）、ＢＨＫ２１（ベビーハムスター腎臓）、ＨＥＫ ２９３Ｔ（ヒト胚性腎臓）、Ｖｅｒｏ（Ｖｅｒｄａ Ｒｅｎｏ）、ＭＡ１０４、ＲＫ１３（ウサギ腎臓）、ＬＭＨ（レグホンオス肝細胞癌）、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）、ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙウシ腎臓）、ＰＫ１５（ブタ腎臓）、ＰＫ２Ａ（ブタ腎臓）、ＳＦ９、ＳＦ２１およびＳＦ＋（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系において感染および／または複製している。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは、ＤＦ－１、ＥＢ６６、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、ＭＡ１０４およびＲＫ１３からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系において感染および／または複製している。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは、ＤＦ－１、ＥＢ６６、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、ＭＡ１０４およびＲＫ１３からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系において感染および／または複製している。
【0015】
好ましくは、ＩＢＶは、ＥＢ６６、ＰＢＳ－１２ＳＦまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞系において感染および／または複製している。
言及する全ての細胞系は、当技術分野の当業者には周知であり、市販されている、および／または公的に入手可能である。例示的にはＭＤＣＫ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４またはＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２８５で寄託されている。例示的には、ＤＦ－１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１２２０３で寄託されている）。例示的には、ＰＢＳ－１２ＳＦ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ－８５６５で寄託されているか、またはＲＲＩＤにＣＶＣＬ＿１Ｋ１７で寄託されている。例示的には、ＢＨＫ－２１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０で寄託されている。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、例示的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６で寄託されている。Ｖｅｒｏ細胞は、例示的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１で寄託されている。ＭＡ１０４および細胞は、例示的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２３７８で寄託されている。ＲＫ１３細胞は、例示的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３７で寄託されている。
言及する全ての細胞系は、当技術分野の当業者には周知であり、市販されている、および／または公的に入手可能である。例示的にはＭＤＣＫ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４またはＡＴＣＣ ＣＲＬ－２２８５で寄託されている。例示的には、ＤＦ－１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１２２０３で寄託されている）。例示的には、ＰＢＳ－１２ＳＦ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＰＴＡ－８５６５で寄託されているか、またはＲＲＩＤにＣＶＣＬ＿１Ｋ１７で寄託されている。例示的には、ＢＨＫ－２１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０で寄託されている。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、例示的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６で寄託されている。Ｖｅｒｏ細胞は、例示的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１で寄託されている。ＭＡ１０４および細胞は、例示的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２３７８で寄託されている。ＲＫ１３細胞は、例示的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに受託番号ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３７で寄託されている。
【0016】
アミノ酸２６７位の番号付け
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位の番号付けは、ＩＢＶ Ｈ５２、ＩＢＶ Ｈ１２０またはＭ４１のスパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を指す。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位の番号付けは、ＩＢＶ Ｈ５２のスパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を指す。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位の番号付けは、例示的には配列番号１に示すスパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を指す。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位の番号付けは、ＩＢＶ Ｈ５２、ＩＢＶ Ｈ１２０またはＭ４１のスパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を指す。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位の番号付けは、ＩＢＶ Ｈ５２のスパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を指す。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位の番号付けは、例示的には配列番号１に示すスパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を指す。
【0017】
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、配列番号１のアミノ酸配列は、スパイクタンパク質中の位置番号付けを決定するために使用される。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質のアミノ２６７位を決定するために、アミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列に整列させる。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、スパイクタンパク質のＳ１サブユニット内にある。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶ ＣＲ８８のスパイクタンパク質のアミノ酸２６９位に対応する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶ ＱＸのスパイク配列のアミノ酸２７０位に対応する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質のアミノ２６７位を決定するために、アミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列に整列させる。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、スパイクタンパク質のＳ１サブユニット内にある。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶ ＣＲ８８のスパイクタンパク質のアミノ酸２６９位に対応する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶ ＱＸのスパイク配列のアミノ酸２７０位に対応する。
【0018】
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶ Ｑ１のスパイク配列のアミノ酸２７１位に対応する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶバリアント２のスパイク配列のアミノ酸２７０位に対応する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶ Ｂｒａｚｉｌのスパイク配列のアミノ酸２７４位に対応する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶ Ａｒｋ９９のスパイク配列のアミノ酸２７４位に相当する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶバリアント２のスパイク配列のアミノ酸２７０位に対応する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶ Ｂｒａｚｉｌのスパイク配列のアミノ酸２７４位に対応する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位は、ＩＢＶ Ａｒｋ９９のスパイク配列のアミノ酸２７４位に相当する。
【0019】
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質は、以下からなる群から選択される次のアミノ酸の１つ以上を有する、
－ ２６４位がアスパラギンである、および／または
－ ２６５位がスレオニンである、および／または
－ ２６９位がロイシンである、および／または
－ ２７１位がアスパラギンである、および／または
－ ２７２位がフェニルアラニンである。
前記アミノ酸位置の番号付けは、例示的には配列番号１に示すスパイクタンパク質中のアミノ酸位置を指す。
スパイク
本発明は、また、上述のスパイクタンパク質またはその断片を提供し、ここで、スパイクタンパク質またはその断片は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）、シチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ；シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ腸内コロナウイルス（ＦＥＣＶ）、感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣｏＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ＰＨＥＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）からなる群から選択される。したがって、本発明はまた、コロナウイルススパイクタンパク質またはその断片を提供し、ここで、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、限定的な細胞または組織指向性を有するコロナウイルス由来であり、アミノ酸２６７位はシステインであり、スパイクタンパク質は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）、シチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ；シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ腸内コロナウイルス（ＦＥＣＶ）、感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣｏＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ＰＨＥＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）からなる群から選択される。さらに、本発明はまた、アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片を提供し、ここで、スパイクタンパク質は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）、シチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ、シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ腸内コロナウイルス（ＦＥＣＶ）、感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣｏＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ＰＨＥＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）からなる群から選択される。
－ ２６４位がアスパラギンである、および／または
－ ２６５位がスレオニンである、および／または
－ ２６９位がロイシンである、および／または
－ ２７１位がアスパラギンである、および／または
－ ２７２位がフェニルアラニンである。
前記アミノ酸位置の番号付けは、例示的には配列番号１に示すスパイクタンパク質中のアミノ酸位置を指す。
スパイク
本発明は、また、上述のスパイクタンパク質またはその断片を提供し、ここで、スパイクタンパク質またはその断片は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）、シチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ；シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ腸内コロナウイルス（ＦＥＣＶ）、感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣｏＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ＰＨＥＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）からなる群から選択される。したがって、本発明はまた、コロナウイルススパイクタンパク質またはその断片を提供し、ここで、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、限定的な細胞または組織指向性を有するコロナウイルス由来であり、アミノ酸２６７位はシステインであり、スパイクタンパク質は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）、シチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ；シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ腸内コロナウイルス（ＦＥＣＶ）、感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣｏＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ＰＨＥＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）からなる群から選択される。さらに、本発明はまた、アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片を提供し、ここで、スパイクタンパク質は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）、シチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ、シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ腸内コロナウイルス（ＦＥＣＶ）、感染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣｏＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ブタ赤血球凝集脳脊髄炎ウイルス（ＰＨＥＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ）、イヌ呼吸器コロナウイルス（ＣＲＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）からなる群から選択される。
【0020】
本発明によるトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）およびシチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ、シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）からなる群から選択される。
【0021】
本発明によるトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスは、ＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）である。
ＩＢＶ株は、血清型および遺伝子型によって分類し得る。血清型分類は、中和抗体によるウイルスの処置を伴い、遺伝子型分類は、一般的に、Ｓ１（スパイク）タンパク質の配列を試験することを伴う。しかし、異なるＩＢＶ株は、当技術分野の当業者には周知である。感染性気管支炎ウイルスは、最初に１９３０年代に米国で発見された。
同定された第１のＩＢＶ血清型は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓであり、１９５６年に異なるＩＢＶ血清型が発見されるまで、唯一の血清型であり続けた。現在、ＡｒｋａｎｓａｓおよびＤｅｌａｗａｒｅを含むいくつかのさらなる血清型が、最初に同定されたＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ型に加えて、米国で同定されている。今日では、ＩＢＶ Ｍａｓｓウイルスは、世界の多くの国で同定し得る。
ＩＢＶ株は、血清型および遺伝子型によって分類し得る。血清型分類は、中和抗体によるウイルスの処置を伴い、遺伝子型分類は、一般的に、Ｓ１（スパイク）タンパク質の配列を試験することを伴う。しかし、異なるＩＢＶ株は、当技術分野の当業者には周知である。感染性気管支炎ウイルスは、最初に１９３０年代に米国で発見された。
同定された第１のＩＢＶ血清型は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓであり、１９５６年に異なるＩＢＶ血清型が発見されるまで、唯一の血清型であり続けた。現在、ＡｒｋａｎｓａｓおよびＤｅｌａｗａｒｅを含むいくつかのさらなる血清型が、最初に同定されたＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ型に加えて、米国で同定されている。今日では、ＩＢＶ Ｍａｓｓウイルスは、世界の多くの国で同定し得る。
【0022】
ＩＢＶ株Ｂｅａｕｄｅｔｔｅは、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ型のものであり、ニワトリ胚において少なくとも１５０継代後に得られた。ＩＢＶ株Ｂｅａｕｄｅｔｔｅは、元々ＢｅａｕｄｅｔｔｅおよびＨｕｄｓｏｎにより単離され（J. Am. Vet. Med. A. 90, 51-60, 1937）、ニワトリ胚において継代した。Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ以外の、他のＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ型ＩＢＶ株は、Ｈ１２０、Ｈ５２およびＭ４１である。Ｈ１２０株は、胚含有鶏卵において１２０回継代された。
ＩＢＶ ＱＸは、元々中国で単離されたＩＢＶの毒性フィールド単離物として記載されている。しかしながら、前記ウイルスは、欧州にまで広がり、西欧、主にオランダにおいて、また、ドイツ、フランス、ベルギー、デンマークおよび英国においても同定された。さらに、ＱＸ遺伝子型または血清型は、アジアおよびアフリカのいくつかの国で記載されている。
ＩＢＶ ＱＸは、元々中国で単離されたＩＢＶの毒性フィールド単離物として記載されている。しかしながら、前記ウイルスは、欧州にまで広がり、西欧、主にオランダにおいて、また、ドイツ、フランス、ベルギー、デンマークおよび英国においても同定された。さらに、ＱＸ遺伝子型または血清型は、アジアおよびアフリカのいくつかの国で記載されている。
【0023】
「Ｉｔａｌｉｅｎ－０２」または「Ｉｔａｌｙ－０２」と指定された株は、イタリアにおいて１９９０年代に単離された。これらの単離物の１つの配列解析は、２００２年に公開された（ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴ、番号ＡＪ４５７１３７）。しかし、研究により、このＩｔａｌｉｅｎ－０２株は、欧州において広がっていること、およびＩＢＶバリアント株４／９１とは異なって、英国、スペイン、フランスおよびオランダの最も主要な遺伝子型の１つになっていることが示された。
１９９６年以来、Ｑ１とも称する、新しい感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）遺伝子型が、中国において広がっており、２０１１年にイタリアで初めて報告された。Ｑ１は、死亡率、腎臓病変および前胃炎（ｐｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉｔｉｓ）の増加と関連している。
さらに、株Ｄ２７４、Ｂ１６４８／Ｄ８８８０、Ｄ１４６６、Ｖ１３９７およびＡｒｋａｎｓａｓが同様に欧州において同定された。
１９９６年以来、Ｑ１とも称する、新しい感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）遺伝子型が、中国において広がっており、２０１１年にイタリアで初めて報告された。Ｑ１は、死亡率、腎臓病変および前胃炎（ｐｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉｔｉｓ）の増加と関連している。
さらに、株Ｄ２７４、Ｂ１６４８／Ｄ８８８０、Ｄ１４６６、Ｖ１３９７およびＡｒｋａｎｓａｓが同様に欧州において同定された。
【0024】
任意のＩＢＶ株をどこで入手するかは、当技術分野の当業者の一般的な知識の範囲内である。ＩＢＶ株は、市販で購入しても、科学的な機関から入手しても、または相補的ＤＮＡとして合成的に合成してもよく、これは、ＩＢＶ株が、配列決定されており、配列は公開されており、したがって利用可能であるためである。さらに、ＩＢＶ株は、フィールドから単離してもよい。ＩＢＶ株を単離し、ＩＢＶ株を特徴付ける方法は、当技術分野の当業者に周知である。Valter Leonardo de Quadros 2011 (Dissertation, Das Infektiose Bronchitis Virus (IBV): Molekularbiologische Untersuchungen zur Diagnostik und zum Vorkommen sowie zur Pathogenitat des Genotyps IBV QX in spezifisch pathogenfreien (SPF) Broilern, Freie Universitat Berlin)、Worthington et al. 2009 (Avian Pathology 37(3), 247-257)、Liu et al. 2009 (Virus Genes 38: 56-65)、Dolz et al. 2006 (Avian Pathology 35 (2): 77-85)、Farsang et al. 2002 (Avian Pathology 31: 229-236)およびFeng et al. 2014 (Virus Genes 49: 292-303)は、異なるＩＢＶ株を単離し、区別する方法を記載している。
ＩＢＶ株は、典型的に、スパイクタンパク質のＳ１サブユニットのコード配列によって区別される（Valastro et al. 2016. Infect Genet Evol. 39:349-364）が、その完全なヌクレオチド配列または特定のタンパク質、例えばスパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質または膜（Ｍ）糖タンパク質によっても区別され得る。スパイクタンパク質は、ＩＢＶの宿主指向性および抗原性を決定するため、ＩＢＶ遺伝子型は、スパイクタンパク質のサブユニット１のコード配列により分類される。あるいは、ＩＢＶ株は、その血清型により区別し得る。血清型分類は、血清型特異的な抗体使用する、ウイルスの血清学的なアッセイを伴う。
ＩＢＶ株は、典型的に、スパイクタンパク質のＳ１サブユニットのコード配列によって区別される（Valastro et al. 2016. Infect Genet Evol. 39:349-364）が、その完全なヌクレオチド配列または特定のタンパク質、例えばスパイクタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質または膜（Ｍ）糖タンパク質によっても区別され得る。スパイクタンパク質は、ＩＢＶの宿主指向性および抗原性を決定するため、ＩＢＶ遺伝子型は、スパイクタンパク質のサブユニット１のコード配列により分類される。あるいは、ＩＢＶ株は、その血清型により区別し得る。血清型分類は、血清型特異的な抗体使用する、ウイルスの血清学的なアッセイを伴う。
【0025】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の他の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、次からなるリストから選択される遺伝子型または血清型または株のＩＢＶ由来である：Ａｒｋａｎｓａｓ（例えば、Ａｒｋａｎｓａｓ９９）、Ｂｒａｚｉｌ（例えば、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３、ＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（例えば、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ１７３４／０４、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９９）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ（例えば、Ｄｅｌａｗａｒｅ９８）、Ｄｕｔｃｈ（例えば、Ｄ２０７、Ｄ２１２、Ｄ２７４、Ｄ３１２８、Ｄ３８９６、Ｄ８８８０、Ｄ１４６６）、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｅｏｒｇｉａ（例えば、Ｇｅｏｒｇｉａ ＧＡ－０７、ＧＡ－０８、ＧＡ－１２、ＧＡ－１３）、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｉｏｗａ（例えば、Ｉｏｗａ９７およびＩｏｗａ６９）、Ｉｔａｌｙ０２）、ＪＭＫ、ＬＤＴ３、Ｍａｉｎｅ（例えば、Ｍａｉｎｅ２０９）、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（例えば、Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈ１２０：Ｂｅａｕｄｅｔｔｅを除く）、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（例えば、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１２２０／９８、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｗｏｌｇ／９８）、ＰＬ８４０８４、Ｑｕ（例えば、Ｑｕ－ｍｖ）、ＱＸ（例えば、ＧＢ３４１／９６）、Ｑ１、ＳＥ１７、バリアント２（例えば、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６）および４／９１（７９３Ｂ、ＣＲ８８）。
【0026】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株由来ではない。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ｉｔａｌｙ０２、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＬＤＴ３、ＰＬ８４０８４、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
「非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ」という語句は、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅを除くことと同等に使用される。したがって、「Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）」という語句は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株、例えば、Ｍ４１、Ｈ５２およびＨ１２０に由来するスパイクタンパク質またはその断片は含まれるが、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株由来のスパイクタンパク質またはその断片は除かれることを意味する。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ｉｔａｌｙ０２、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＬＤＴ３、ＰＬ８４０８４、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
「非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ」という語句は、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅを除くことと同等に使用される。したがって、「Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）」という語句は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株、例えば、Ｍ４１、Ｈ５２およびＨ１２０に由来するスパイクタンパク質またはその断片は含まれるが、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株由来のスパイクタンパク質またはその断片は除かれることを意味する。
【0027】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ａｒｋａｎｓａｓ、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）および４／９１からなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株は、Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｓｐａｉｎ／９８／３０８、ＩＢＭＡ５－１、ＳＤ／９７／０１、Ｓｐａｉｎ／９６／３３４およびＭ４１－Ｍ２１８８３からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、４／９１株は、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）および４／９１からなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株は、Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｓｐａｉｎ／９８／３０８、ＩＢＭＡ５－１、ＳＤ／９７／０１、Ｓｐａｉｎ／９６／３３４およびＭ４１－Ｍ２１８８３からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、４／９１株は、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される。
【0028】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＱＸ株は、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３、ＳＰ２０１３－０１４７０、ＳＰ２０１３－０１４１７１、ＳＰ２０１３－０１４７８およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｑ１株は、ＣＫ／ＣＨ／ＬＤＬ／９８Ｉ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＳＤ／０８－１０、Ｊ２、Ｑ１、ＡＲ０８ＥＲ２２、ＡＲ０８ＢＡ２１、１２．１８５、１２．１２４、１２．２１６およびＣｈｉｌｅ－２９５－１０からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｉｔａｌｙ０２株は、Ｓｐａｉｎ／９９／３１６、Ｉｔａｌｙ－０２、ＵＫ－Ｌ６３３－０４、Ｉｔ－４９７－０２、Ｓｐａｉｎ／０５／８６６、Ｓｐａｉｎ／０４／２２１、Ｓｐａｉｎ／００／３３７、Ｓｐａｉｎ／１５５／０９およびＳｐａｉｎ／０３／０８からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｑ１株は、ＣＫ／ＣＨ／ＬＤＬ／９８Ｉ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＳＤ／０８－１０、Ｊ２、Ｑ１、ＡＲ０８ＥＲ２２、ＡＲ０８ＢＡ２１、１２．１８５、１２．１２４、１２．２１６およびＣｈｉｌｅ－２９５－１０からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｉｔａｌｙ０２株は、Ｓｐａｉｎ／９９／３１６、Ｉｔａｌｙ－０２、ＵＫ－Ｌ６３３－０４、Ｉｔ－４９７－０２、Ｓｐａｉｎ／０５／８６６、Ｓｐａｉｎ／０４／２２１、Ｓｐａｉｎ／００／３３７、Ｓｐａｉｎ／１５５／０９およびＳｐａｉｎ／０３／０８からなるリストから選択される。
【0029】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ａｒｋａｎｓａｓ株は、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、バリアント２株は、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６、Ｅｇ／ＣＬＥＶＢ－２／ＩＢＶ／０１２、Ｄ１３４４／２／４／１０＿ＥＧ、ＴＲ８およびＩＢ ＶＡＲ２－０６からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｂｒａｚｉｌ株は、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３およびＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、ＱＸまたは４／９１遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、バリアント２株は、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６、Ｅｇ／ＣＬＥＶＢ－２／ＩＢＶ／０１２、Ｄ１３４４／２／４／１０＿ＥＧ、ＴＲ８およびＩＢ ＶＡＲ２－０６からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｂｒａｚｉｌ株は、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３およびＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、ＱＸまたは４／９１遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
【0030】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、ＱＸ遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、４／９１遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶ株は、Ｈ５２、Ｈ１２０、ＱＸ ＳＰ２０１３－０１４７８またはＣＲ８８である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示す配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、ＱＸ遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、４／９１遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶ株は、Ｈ５２、Ｈ１２０、ＱＸ ＳＰ２０１３－０１４７８またはＣＲ８８である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示す配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
【0031】
「同一性」または「配列同一性」という用語は、当技術分野では公知であり、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間、すなわち参照配列と、参照配列と比較される所与の配列との間の関係を指す。配列同一性は、そのような配列のストリング間の一致によって決定される、最高の配列類似度が得られるように、配列を最適に整列した後、所与の配列を参照配列と比較することによって決定される。そのような整列時に、配列同一性は、位置ごとに確認され、例えば、その位置において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である場合、配列は「同一」である。そのような位置同一性の総数を、次いで参照配列中のヌクレオチドまたは残基の総数で割り、％配列同一性を得る。配列同一性は、公知の方法、非限定的にはComputational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988)、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)、Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)、Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されているものを含む方法によって容易に算出することができ、前記文献の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験配列間の一致が最も大きくなるように設計されている。配列同一性を決定するための方法は、所与の配列間の配列同一性を決定する、公的に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。そのようなプログラムの例としては、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の入手源（BLAST Manual、Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894、Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)、これらの教示は参照により本明細書に組み込まれる）から公的に利用可能である。これらのプログラムは、所与の配列および参照配列の間の、最高レベルの配列同一性を得るために、デフォルトのギャップ重みを使用して最適に配列を整列する。例示として、参照ヌクレオチド配列に対して、例えば少なくとも、８５％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、所与のポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり、１５まで、好ましくは１０まで、さらにより好ましくは５までの点突然変異を含んでいてよいことを除いては、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％、好ましくは９０％、よりさらに好ましくは９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、参照配列中の１５％まで、好ましくは１０％、さらにより好ましくは５％のヌクレオチドは、欠失されているか、または他のヌクレオチドに置換されていても、または参照配列中の全ヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、さらにより好ましくは５％の数のヌクレオチドが、参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端位置、またはこれらの末端位置の間の他の箇所において、参照配列のヌクレオチド間に個々に、または参照配列内の１つまたは複数の連続的な基のいずれかにおいて、散在して生じ得る。同様に、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば８５％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％の配列同一性を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、所与のポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸当たり、１５まで、好ましくは１０まで、さらにより好ましくは５までのアミノ酸変更を含んでいてよいことを除いては、前記ポリペプチドの所与のアミノ酸配列が参照配列に同一であることを意図している。言い換えれば、参照アミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るためには、参照配列の１５％まで、好ましくは１０％まで、さらにより好ましくは５％までのアミノ酸残基を欠失するか、または他のアミノ酸で置換してもよく、または、参照配列中のアミノ酸残基の総数の１５％まで、好ましくは１０％まで、さらにより好ましくは５％までの数のアミノ酸を参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間の他の箇所において、参照配列の残基間に個々に、または参照配列内の１つまたは複数の連続的な基のいずれかにおいて、散在して生じ得る。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的なアミノ酸置換により異なる。しかし、保存的な置換は、配列同一性を決定する際に一致として含まれない。
【0032】
「同一性」、「配列同一性」および「パーセント同一性」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列または２つ核酸配列のパーセント同一性を決定するためには、配列は最適な比較目的のために整列される（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸または核酸の配列にギャップを導入してもよい）ことがここで定義される。対応するアミノ酸またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸またはヌクレオチド残基を次いで比較する。第１の配列におけるある位置が、第２の配列の対応する位置と同一のアミノ酸またはヌクレオチド残基により占められている場合、前記分子はその位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一の位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数（すなわち重複している位置）ｘ１００）である。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。
【0033】
配列比較は、比較されている２つの配列全体にわたって、または２つの配列の断片にわたって行ってよい。典型的には、比較は、比較されている２つの配列の全長にわたって行ってよい。しかし、配列同一性は、例えば、２０、５０、１００またはそれ以上の連続的なアミノ酸残基の領域にわたって行ってよい。
当業者は、２つの配列間の相同性を決定するために、異なるコンピュータープログラムが利用可能であることに気づくであろう。例えば、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成し得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸または核酸配列の間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズム（http://www.accelrys.com/products/gcg/において利用可能）を使用して決定される。当業者は、これらの異なるパラメーター全てが僅かに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性は、異なるアルゴリズムを用いた場合に有意に変わることはないことを理解するであろう。
当業者は、２つの配列間の相同性を決定するために、異なるコンピュータープログラムが利用可能であることに気づくであろう。例えば、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成し得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸または核酸配列の間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５または６の長さ重みを使用して、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズム（http://www.accelrys.com/products/gcg/において利用可能）を使用して決定される。当業者は、これらの異なるパラメーター全てが僅かに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性は、異なるアルゴリズムを用いた場合に有意に変わることはないことを理解するであろう。
【0034】
本発明のタンパク質配列または核酸配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公開データベースに対する検索を行うための「クエリー配列」としてさらに使用し得る。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同のアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行い得る。比較目的のためのギャップ化整列を得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されているように利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際、各プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターを使用し得る。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/においてＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照されたい。
【0035】
本明細書で使用される場合、「配列番号Ｘの配列に同一」という用語は、それぞれ「配列番号Ｘの長さにわたって配列番号Ｘの配列に対して同一」であるという用語、または「配列番号Ｘの全長にわたって配列番号Ｘの配列に同一」であるという用語と等価であることは特に理解される。この文脈において、「Ｘ」は、「配列番号Ｘ」が、本明細書中に言及する配列番号のいずれかを表すようになっている、１～８４から選択される任意の整数である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号２に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号２に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
【0036】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号３に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号４に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号４に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号５に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
【0037】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号６に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号７に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号８もしくは７７に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号７に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、配列番号８もしくは７７に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはこれを含む。
【0038】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片は、ＧＩ－２～２７、ＧＩＩ－１、ＧＩＩＩ－１、ＧＩＶ－１、ＧＶ－１、ＧＶＩ－１からなる遺伝子型のリストから選択される。
Valastro et al 2016 (Infection, Genetics and Evolution 39; 349-364)は、ＩＢＶ株の割り当てについての系列命名法と組み合わせた系統発生学ベースの分類システムを記載している。６の遺伝子型（ＧＩ～ＧＶＩ）は、共に３２の異なるウイルス系列を含むように定義される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片はＧＩ－１遺伝子型由来ではない。ＧＩ－１遺伝子型は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ遺伝子型／血清型に関連している。
本発明によるトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来の前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）およびシチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ、シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）からなる群から選択される。
Valastro et al 2016 (Infection, Genetics and Evolution 39; 349-364)は、ＩＢＶ株の割り当てについての系列命名法と組み合わせた系統発生学ベースの分類システムを記載している。６の遺伝子型（ＧＩ～ＧＶＩ）は、共に３２の異なるウイルス系列を含むように定義される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片はＧＩ－１遺伝子型由来ではない。ＧＩ－１遺伝子型は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ遺伝子型／血清型に関連している。
本発明によるトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来の前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）およびシチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ、シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）からなる群から選択される。
【0039】
本発明によるトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来の前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、ＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、Ａｒｋａｎｓａｓ（例えば、Ａｒｋａｎｓａｓ９９）、Ｂｒａｚｉｌ（例えば、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３、ＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（例えば、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ１７３４／０４、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９９）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ（例えば、Ｄｅｌａｗａｒｅ９８）、Ｄｕｔｃｈ（例えば、Ｄ２０７、Ｄ２１２、Ｄ２７４、Ｄ３１２８、Ｄ３８９６、Ｄ８８８０、Ｄ１４６６）、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｅｏｒｇｉａ（例えば、ＧｅｏｒｇｉａＧＡ－０７、ＧＡ－０８、ＧＡ－１２、ＧＡ－１３）、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｉｏｗａ（例えば、Ｉｏｗａ９７およびＩｏｗａ６９）、Ｉｔａｌｙ０２、ＪＭＫ、ＬＤＴ３、Ｍａｉｎｅ（例えば、Ｍａｉｎｅ２０９）、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（例えば、Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈ１２０；Ｂｅａｕｄｅｔｔｅを除く）、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（例えば、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１２２０／９８、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｗｏｌｇ／９８）、ＰＬ８４０８４、Ｑｕ（例えば、Ｑｕ－ｍｖ）、ＱＸ（例えば、ＧＢ３４１／９６）、Ｑ１、ＳＥ１７、バリアント２（例えば、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６）および４／９１（７９３Ｂ、ＣＲ８８）からなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、Ａｒｋａｎｓａｓ（例えば、Ａｒｋａｎｓａｓ９９）、Ｂｒａｚｉｌ（例えば、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３、ＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（例えば、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ１７３４／０４、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９９）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ（例えば、Ｄｅｌａｗａｒｅ９８）、Ｄｕｔｃｈ（例えば、Ｄ２０７、Ｄ２１２、Ｄ２７４、Ｄ３１２８、Ｄ３８９６、Ｄ８８８０、Ｄ１４６６）、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｅｏｒｇｉａ（例えば、ＧｅｏｒｇｉａＧＡ－０７、ＧＡ－０８、ＧＡ－１２、ＧＡ－１３）、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｉｏｗａ（例えば、Ｉｏｗａ９７およびＩｏｗａ６９）、Ｉｔａｌｙ０２、ＪＭＫ、ＬＤＴ３、Ｍａｉｎｅ（例えば、Ｍａｉｎｅ２０９）、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（例えば、Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈ１２０；Ｂｅａｕｄｅｔｔｅを除く）、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（例えば、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１２２０／９８、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｗｏｌｇ／９８）、ＰＬ８４０８４、Ｑｕ（例えば、Ｑｕ－ｍｖ）、ＱＸ（例えば、ＧＢ３４１／９６）、Ｑ１、ＳＥ１７、バリアント２（例えば、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６）および４／９１（７９３Ｂ、ＣＲ８８）からなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
【0040】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ｉｔａｌｙ０２、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＬＤＴ３、ＰＬ８４０８４、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ａｒｋａｎｓａｓ、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ａｒｋａｎｓａｓ、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
【0041】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株は、Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｓｐａｉｎ／９８／３０８、ＩＢＭＡ５－１、ＳＤ／９７／０１、Ｓｐａｉｎ／９６／３３４およびＭ４１－Ｍ２１８８３からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、４／９１株は、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化、およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＱＸ株は、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｑ１株は、ＣＫ／ＣＨ／ＬＤＬ／９８Ｉ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＳＤ／０８－１０、Ｊ２、Ｑ１、ＡＲ０８ＥＲ２２、ＡＲ０８ＢＡ２１およびＣｈｉｌｅ－２９５－１０からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、４／９１株は、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化、およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、ＱＸ株は、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｑ１株は、ＣＫ／ＣＨ／ＬＤＬ／９８Ｉ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＳＤ／０８－１０、Ｊ２、Ｑ１、ＡＲ０８ＥＲ２２、ＡＲ０８ＢＡ２１およびＣｈｉｌｅ－２９５－１０からなるリストから選択される。
【0042】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｉｔａｌｙ０２株は、Ｓｐａｉｎ／９９／３１６、Ｉｔａｌｙ－０２、ＵＫ－Ｌ６３３－０４、Ｉｔ－４９７－０２、Ｓｐａｉｎ／０５／８６６、Ｓｐａｉｎ／０４／２２１、Ｓｐａｉｎ／００／３３７、Ｓｐａｉｎ／１５５／０９およびＳｐａｉｎ／０３／０８からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ａｒｋａｎｓａｓ株は、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ａｒｋａｎｓａｓ株は、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される。
【0043】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、バリアント２株は、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６、Ｅｇ／ＣＬＥＶＢ－２／ＩＢＶ／０１２、Ｄ１３４４／２／４／１０＿ＥＧ、ＴＲ８およびＩＢ ＶＡＲ２－０６からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｂｒａｚｉｌ株は、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３およびＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、ＱＸおよび４／９１からなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）ＩＢＶ遺伝子型または血清型由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、ＱＸ ＩＢＶ遺伝子型または血清型由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｂｒａｚｉｌ株は、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３およびＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、ＱＸおよび４／９１からなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（非Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）ＩＢＶ遺伝子型または血清型由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、ＱＸ ＩＢＶ遺伝子型または血清型由来である。
【0044】
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、４／９１ ＩＢＶ遺伝子型または血清型由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、ＩＢＶ株Ｈ１２０、Ｈ５２、ＱＸ ＳＰ２０１３－０１４７８またはＣＲ８８由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、ＩＢＶ株Ｈ１２０またはＨ５２由来である。
本発明によるトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスまたはＩＢＶのＳ１サブユニット配列由来の少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または５００の連続的なアミノ酸であるか、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、ＩＢＶ株Ｈ１２０、Ｈ５２、ＱＸ ＳＰ２０１３－０１４７８またはＣＲ８８由来である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、ＩＢＶ株Ｈ１２０またはＨ５２由来である。
本発明によるトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスまたはＩＢＶのＳ１サブユニット配列由来の少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または５００の連続的なアミノ酸であるか、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列である。
【0045】
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、本明細書に記載のトリコロナウイルスまたはＩＢＶのＳ１サブユニット配列由来の少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または５００の連続的なアミノ酸であるか、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列である。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するＩＢＶ由来の前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示すアミノ酸配列の、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または５００の連続的なアミノ酸、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を有する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するコロナウイルスまたはＩＢＶは、胚含有鶏卵および／または初代ニワトリ腎臓細胞における感染および／または複製に限定されている。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するコロナウイルスまたはＩＢＶは、ＥＢ６６細胞において感染および／または複製していない。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するコロナウイルスまたはＩＢＶは、ＰＢＳ－１２ＳＦおよび／またはＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において感染および／または複製していない。
本発明によるＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するＩＢＶ由来の前記Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示すアミノ酸配列の、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または５００の連続的なアミノ酸、またはそれに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列を有する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するコロナウイルスまたはＩＢＶは、胚含有鶏卵および／または初代ニワトリ腎臓細胞における感染および／または複製に限定されている。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するコロナウイルスまたはＩＢＶは、ＥＢ６６細胞において感染および／または複製していない。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、限定的な細胞または組織指向性を有するコロナウイルスまたはＩＢＶは、ＰＢＳ－１２ＳＦおよび／またはＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において感染および／または複製していない。
【0046】
断片
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片は、少なくとも５００、７５０、１０００または１０７７アミノ酸の長さを有する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片は、少なくとも１０００アミノ酸の長さを有する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片は、Ｎ末端から少なくとも５００、７５０、１０００または１０７５アミノ酸の長さを有する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片は、少なくとも５００、７５０、１０００または１０７７アミノ酸の長さを有する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片は、少なくとも１０００アミノ酸の長さを有する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片は、Ｎ末端から少なくとも５００、７５０、１０００または１０７５アミノ酸の長さを有する。
【0047】
「Ｎ末端」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。Ｎ末端はまた、アミノ末端、ＮＨ２末端、Ｎ末末端またはアミン末端とも称する。タンパク質がメッセンジャーＲＮＡから翻訳される際、Ｎ末端からＣ末端へと作製される。したがって、Ｎ末端は、前記アミン基（－ＮＨ２）を含むアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の開始部である。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片は、スパイクタンパク質の外部ドメインである。
「外部ドメイン」という用語は当技術分野の当業者には周知である。スパイクタンパク質は、異なる機能性部分、シグナル配列、外部ドメイン、膜貫通ドメインおよび内部ドメインを（Ｎ末端からＣ末端へと）含む。したがって、シグナル配列の切断後、スパイクタンパク質のＮ末端は、外部ドメインから開始する。ＩＢＶスパイク外部ドメインは、約１０７５アミノ酸の長さを有し、ＩＢＶ株によって数アミノ酸の長さが異なる。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片は、スパイクタンパク質の外部ドメインである。
「外部ドメイン」という用語は当技術分野の当業者には周知である。スパイクタンパク質は、異なる機能性部分、シグナル配列、外部ドメイン、膜貫通ドメインおよび内部ドメインを（Ｎ末端からＣ末端へと）含む。したがって、シグナル配列の切断後、スパイクタンパク質のＮ末端は、外部ドメインから開始する。ＩＢＶスパイク外部ドメインは、約１０７５アミノ酸の長さを有し、ＩＢＶ株によって数アミノ酸の長さが異なる。
【0048】
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位におけるシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異は、遺伝学的に安定である。好都合なことに、アミノ酸２６７位におけるシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異は、遺伝学的に安定であり、経時的に（継代を超えて）安定のままであることが試験データにより示されている。
「遺伝学的に安定」という用語は、アミノ酸２６７位におけるシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異が、経時的に（継代を超えて）安定のままであることを意味する。好ましくは、アミノ酸２６７位における前記システインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異は、本発明による前記トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質を有するＩＢＶの細胞培養または組織培養中における少なくとも３継代後、より好ましくは少なくとも６継代後、さらにより好ましくは少なくとも９継代後、さらにより好ましくは少なくとも１２継代後、最も好ましくは１５継代後に依然として存在している。
「遺伝学的に安定」という用語は、アミノ酸２６７位におけるシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異が、経時的に（継代を超えて）安定のままであることを意味する。好ましくは、アミノ酸２６７位における前記システインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異は、本発明による前記トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質を有するＩＢＶの細胞培養または組織培養中における少なくとも３継代後、より好ましくは少なくとも６継代後、さらにより好ましくは少なくとも９継代後、さらにより好ましくは少なくとも１２継代後、最も好ましくは１５継代後に依然として存在している。
【0049】
ヌクレオチド配列およびプラスミド
さらに、本発明は、本明細書に記載のスパイクタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のヌクレオチドを含むプラスミドを提供する。
「核酸」または「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子または誘導体を含むポリヌクレオチドを指す。前記用語は、一本鎖ならびに二本鎖のポリヌクレオチドを包含する。本発明の核酸は、単離されたポリヌクレオチド（すなわち、天然の環境から単離された）および遺伝子改変された形態を包含する。さらに、天然に存在する修飾ポリヌクレオチド、例えばグリコシル化またはメチル化されたポリヌクレオチド、または人工的に修飾されたポリヌクレオチド、例えばビオチン化されたポリヌクレオチドを含む化学修飾ポリヌクレオチドも含まれる。さらに、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換可能であり、任意の核酸を指す。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語はまた、５種の生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の核酸塩基を有するヌクレオチドから構成される核酸も特に含む。
「プラスミド」という用語は、細菌宿主細胞内で細菌染色体とは独立して複製する細胞質ＤＮＡを指す。本発明の特定の態様では、「プラスミド」および／または「移入プラスミド」および／または「ドナープラスミド」という用語は、例えば組換えウイルスまたはウイルスベクターに挿入するための発現カセットの構築のために有用な組換えＤＮＡ技術のエレメントを指す。別の特定の態様では、「プラスミド」という用語は、ＤＮＡワクチン接種目的に有用なプラスミドを特定するために使用し得る。
さらに、本発明は、本明細書に記載のスパイクタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のヌクレオチドを含むプラスミドを提供する。
「核酸」または「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子または誘導体を含むポリヌクレオチドを指す。前記用語は、一本鎖ならびに二本鎖のポリヌクレオチドを包含する。本発明の核酸は、単離されたポリヌクレオチド（すなわち、天然の環境から単離された）および遺伝子改変された形態を包含する。さらに、天然に存在する修飾ポリヌクレオチド、例えばグリコシル化またはメチル化されたポリヌクレオチド、または人工的に修飾されたポリヌクレオチド、例えばビオチン化されたポリヌクレオチドを含む化学修飾ポリヌクレオチドも含まれる。さらに、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換可能であり、任意の核酸を指す。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語はまた、５種の生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の核酸塩基を有するヌクレオチドから構成される核酸も特に含む。
「プラスミド」という用語は、細菌宿主細胞内で細菌染色体とは独立して複製する細胞質ＤＮＡを指す。本発明の特定の態様では、「プラスミド」および／または「移入プラスミド」および／または「ドナープラスミド」という用語は、例えば組換えウイルスまたはウイルスベクターに挿入するための発現カセットの構築のために有用な組換えＤＮＡ技術のエレメントを指す。別の特定の態様では、「プラスミド」という用語は、ＤＮＡワクチン接種目的に有用なプラスミドを特定するために使用し得る。
【0050】
細胞
さらに、本発明は、本明細書に記載のプラスミドを含む細胞を提供する。前記細胞は、真核生物または原核生物の細胞であってよい。
ウイルス粒子、トリコロナウイルスおよびＩＢＶ
さらに、本発明は、本明細書に記載のスパイクタンパク質またはその断片を含むウイルス粒子を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のスパイクタンパク質またはその断片を含む、トリコロナウイルスを提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のスパイクタンパク質を含むＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）を提供する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶの別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは弱毒化されている。
「弱毒化」という用語は、野生型単離物と比較して、病原性が低下している、病原体を指す。本発明において、弱毒化ＩＢＶは、ＩＢＶ感染の臨床徴候を引き起こさないが、標的動物において免疫応答を誘発することができるように、毒性が低下しているものであるが、弱毒化ＩＢＶに感染した動物において、非弱毒化ＩＢＶに感染しており、弱毒化ウイルスの投与を受けていない動物の「対照群」と比較して、発生率または重症度において臨床徴候が低減していることを意味していてもよい。本文脈において、「低減する／低減した」という用語は、上で定義する非弱毒化ＩＢＶに感染した対照群と比較した、少なくとも１０％、好ましくは２５％、さらにより好ましくは５０％。さらにより好ましくは６０％、さらにより好ましくは７０％、さらにより好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、および最も好ましくは１００％の低減を意味する。したがって、弱毒化ＩＢＶ株は、改変生ＩＢＶを含む免疫原性組成物への組み込みに適切なものである。
さらに、本発明は、本明細書に記載のプラスミドを含む細胞を提供する。前記細胞は、真核生物または原核生物の細胞であってよい。
ウイルス粒子、トリコロナウイルスおよびＩＢＶ
さらに、本発明は、本明細書に記載のスパイクタンパク質またはその断片を含むウイルス粒子を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のスパイクタンパク質またはその断片を含む、トリコロナウイルスを提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のスパイクタンパク質を含むＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）を提供する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶの別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは弱毒化されている。
「弱毒化」という用語は、野生型単離物と比較して、病原性が低下している、病原体を指す。本発明において、弱毒化ＩＢＶは、ＩＢＶ感染の臨床徴候を引き起こさないが、標的動物において免疫応答を誘発することができるように、毒性が低下しているものであるが、弱毒化ＩＢＶに感染した動物において、非弱毒化ＩＢＶに感染しており、弱毒化ウイルスの投与を受けていない動物の「対照群」と比較して、発生率または重症度において臨床徴候が低減していることを意味していてもよい。本文脈において、「低減する／低減した」という用語は、上で定義する非弱毒化ＩＢＶに感染した対照群と比較した、少なくとも１０％、好ましくは２５％、さらにより好ましくは５０％。さらにより好ましくは６０％、さらにより好ましくは７０％、さらにより好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、および最も好ましくは１００％の低減を意味する。したがって、弱毒化ＩＢＶ株は、改変生ＩＢＶを含む免疫原性組成物への組み込みに適切なものである。
【0051】
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶの別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは不活化されている。
任意の慣用的な不活化方法を、本発明の目的のために使用してもよい。したがって、不活化は、当技術分野の当業者に公知の化学的および／または物理的な処理によって行ってもよい。好ましい不活化方法は、環状化二元エチレンイミン（ＢＥＩ）の添加を含み、これは、２－アミノエチルブロミド臭化水素酸塩（ＢＥＡ）の溶液の添加を含み、これが二元エチレンイミンへと環状化されている。好ましいさらなる化学的な不活化剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、デオキシコール酸ナトリウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、β－プロピオラクトン、チメロサール、フェノールおよびホルムアルデヒド（ホルマリン）が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、不活化はまた、中和ステップを含んでいてもよい。好ましい中和剤は、チオ硫酸ナトリウム、および亜硫酸水素ナトリウム等を含むが、これらに限定されない。
任意の慣用的な不活化方法を、本発明の目的のために使用してもよい。したがって、不活化は、当技術分野の当業者に公知の化学的および／または物理的な処理によって行ってもよい。好ましい不活化方法は、環状化二元エチレンイミン（ＢＥＩ）の添加を含み、これは、２－アミノエチルブロミド臭化水素酸塩（ＢＥＡ）の溶液の添加を含み、これが二元エチレンイミンへと環状化されている。好ましいさらなる化学的な不活化剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、デオキシコール酸ナトリウム、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、β－プロピオラクトン、チメロサール、フェノールおよびホルムアルデヒド（ホルマリン）が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、不活化はまた、中和ステップを含んでいてもよい。好ましい中和剤は、チオ硫酸ナトリウム、および亜硫酸水素ナトリウム等を含むが、これらに限定されない。
【0052】
好ましいホルマリン不活化条件としては、約０．０２％（ｖ／ｖ）～２．０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約０．１％（ｖ／ｖ）～１．０％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約０．１５％（ｖ／ｖ）～０．８％（ｖ／ｖ）、さらにより好ましくは約０．１６％（ｖ／ｖ）～０．６％（ｖ／ｖ）、および最も好ましくは約０．２％（ｖ／ｖ）～０．４％（ｖ／ｖ）のホルマリン濃度が挙げられる。インキュベーション時間は、ＩＢＶの抵抗性に依存する。一般的に、不活動プロセスを、適当な培養系において、ＩＢＶの増殖が全く検出されなくなるまで行う。
好ましくは、本発明の不活化ＩＢＶは、好ましくは本明細書中で上述した濃度を用いて、ホルマリン不活化されている。
好ましくは、本発明の不活化ＩＢＶは、好ましくは本明細書中で上述した濃度を用いて、ホルマリン不活化されている。
【0053】
本発明の不活化ＩＢＶは、公知の技術、例えばNature, 1974, 252, 252-254 or Journal of Immunology, 1978, 120, 1109-13に記載されている技術を使用してリポソームに組み込み得る。本発明の別の実施形態では、本発明の不活化ＩＢＶは、適切な生物学的化合物、例えばポリサッカライド、ペプチド、またはタンパク質等、またはその組合せにコンジュゲートされていてもよい。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶの別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは、遺伝子操作されている。
「遺伝子操作されている」という用語は、「逆遺伝学」アプローチを使用して突然変異させたトリコロナウイルスまたはＩＢＶを指す。好ましくは、本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶは、遺伝子操作されている。逆遺伝学技術は、合成組換えウイルス性ＲＮＡの調製を伴う。しかし、「逆遺伝学」技術は、当技術分野の当業者には周知である。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶの別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは組換え体である。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶの別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは、遺伝子操作されている。
「遺伝子操作されている」という用語は、「逆遺伝学」アプローチを使用して突然変異させたトリコロナウイルスまたはＩＢＶを指す。好ましくは、本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶは、遺伝子操作されている。逆遺伝学技術は、合成組換えウイルス性ＲＮＡの調製を伴う。しかし、「逆遺伝学」技術は、当技術分野の当業者には周知である。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶの別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは組換え体である。
【0054】
本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、対応するＲＮＡゲノム（またはＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはタンパク質）に天然には存在しない任意の改変を有するＲＮＡゲノム（またはＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはタンパク質）に関する。例えば、ＲＮＡゲノム（またはＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはタンパク質）は、例えば人の介入によって人工的に導入された、挿入、欠失、逆位、再配置または点突然変異を含む場合に、「組換え」とみなされる。したがって、ＲＮＡゲノム配列（またはＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはタンパク質）は、天然で関連している配列（またはＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはタンパク質）の全てまたは一部と関連していない。ウイルスと関連して使用される「組換え」という用語は、ウイルスゲノムの人工的な操作により生成されるウイルスを意味する。「組換えウイルス」という用語は、遺伝子改変されたウイルスを包含する。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶの別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶはキメラである。
「キメラ」という用語は、他のコロナウイルスまたはＩＢＶ由来の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むトリコロナウイルスまたはＩＢＶを指す。好ましくは、前記用語は、他のＩＢＶ株由来の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むＩＢＶウイルスを指す。
本発明によるトリコロナウイルスまたはＩＢＶの別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶはキメラである。
「キメラ」という用語は、他のコロナウイルスまたはＩＢＶ由来の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むトリコロナウイルスまたはＩＢＶを指す。好ましくは、前記用語は、他のＩＢＶ株由来の１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むＩＢＶウイルスを指す。
【0055】
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶは以下からなるリストから選択される遺伝子型または血清型または株を有するＩＢＶ由来である。Ａｒｋａｎｓａｓ（例えば、Ａｒｋａｎｓａｓ９９）、Ｂｒａｚｉｌ（例えば、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３、ＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（例えば、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ１７３４／０４、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９９）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ（例えば、Ｄｅｌａｗａｒｅ９８）、Ｄｕｔｃｈ（例えばＤ２０７、Ｄ２１２、Ｄ２７４、Ｄ３１２８、Ｄ３８９６、Ｄ８８８０、Ｄ１４６６）、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｅｏｒｇｉａ（例えば、Ｇｅｏｒｇｉａ ＧＡ－０７、ＧＡ－０８、ＧＡ－１２、ＧＡ－１３）、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｉｏｗａ（例えば、Ｉｏｗａ９７およびＩｏｗａ６９）、Ｉｔａｌｙ０２、ＪＭＫ、ＬＤＴ３、Ｍａｉｎｅ（例えば、Ｍａｉｎｅ２０９）、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈ１２０、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（例えば、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１２２０／９８、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｗｏｌｇ／９８）、ＰＬ８４０８４、Ｑｕ（例えば、Ｑｕ－ｍｖ）、ＱＸ（例えば、ＧＢ３４１／９６）、Ｑ１、ＳＥ１７、バリアント２（例えば、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６）および４／９１（７９３Ｂ、ＣＲ８８）。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶは、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ｉｔａｌｙ０２、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＬＤＴ３、ＰＬ８４０８４、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶは、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ｉｔａｌｙ０２、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＬＤＴ３、ＰＬ８４０８４、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択される。
【0056】
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶは、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ａｒｋａｎｓａｓ、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株は、Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｓｐａｉｎ／９８／３０８、ＩＢＭＡ５－１、ＳＤ／９７／０１、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ、Ｓｐａｉｎ／９６／３３４およびＭ４１－Ｍ２１８８３からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、４／９１株は、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＱＸ株は、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株は、Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｓｐａｉｎ／９８／３０８、ＩＢＭＡ５－１、ＳＤ／９７／０１、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ、Ｓｐａｉｎ／９６／３３４およびＭ４１－Ｍ２１８８３からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、４／９１株は、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＱＸ株は、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される。
【0057】
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、Ｑ１株は、ＣＫ／ＣＨ／ＬＤＬ／９８Ｉ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＳＤ／０８－１０、Ｊ２、Ｑ１、ＡＲ０８ＥＲ２２、ＡＲ０８ＢＡ２１およびＣｈｉｌｅ－２９５－１０からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、Ｉｔａｌｙ０２株は、Ｓｐａｉｎ／９９／３１６、Ｉｔａｌｙ－０２、ＵＫ－Ｌ６３３－０４、Ｉｔ－４９７－０２、Ｓｐａｉｎ／０５／８６６、Ｓｐａｉｎ／０４／２２１、Ｓｐａｉｎ／００／３３７、Ｓｐａｉｎ／１５５／０９およびＳｐａｉｎ／０３／０８からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、Ａｒｋａｎｓａｓ株は、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、バリアント２株は、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６、Ｅｇ／ＣＬＥＶＢ－２／ＩＢＶ／０１２、Ｄ１３４４／２／４／１０＿ＥＧ、ＴＲ８およびＩＢ ＶＡＲ２－０６からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、Ｉｔａｌｙ０２株は、Ｓｐａｉｎ／９９／３１６、Ｉｔａｌｙ－０２、ＵＫ－Ｌ６３３－０４、Ｉｔ－４９７－０２、Ｓｐａｉｎ／０５／８６６、Ｓｐａｉｎ／０４／２２１、Ｓｐａｉｎ／００／３３７、Ｓｐａｉｎ／１５５／０９およびＳｐａｉｎ／０３／０８からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、Ａｒｋａｎｓａｓ株は、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、バリアント２株は、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６、Ｅｇ／ＣＬＥＶＢ－２／ＩＢＶ／０１２、Ｄ１３４４／２／４／１０＿ＥＧ、ＴＲ８およびＩＢ ＶＡＲ２－０６からなるリストから選択される。
【0058】
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、Ｂｒａｚｉｌ株は、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３およびＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４からなるリストから選択される。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓまたは４／９１遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、４／９１遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶ株は、Ｈ１２０、Ｈ５２またはＣＲ８８である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶ株はＨ１２０またはＨ５２である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、これを含むＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片を有する。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓまたは４／９１遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、４／９１遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶ株は、Ｈ１２０、Ｈ５２またはＣＲ８８である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶ株はＨ１２０またはＨ５２である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示すアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％または９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、これを含むＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片を有する。
【0059】
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶは、拡張された細胞または組織指向性を有する。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶは、本明細書に記載の少なくとも１種の細胞系または細胞において感染および／または複製している。好ましくは、前記ＩＢＶは、本明細書に記載の少なくとも１種の細胞系において感染および／または複製している。
さらに、本発明は、
－本明細書に記載のウイルス粒子または
－本明細書に記載のトリコロナウイルスまたはＩＢＶ
を含む細胞を提供する。
本発明による細胞の別の特定の態様では、細胞は、初代ニワトリ胚細胞、ニワトリ胚線維芽細胞系、アヒル胚幹細胞系、ヒト胚性腎臓細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系、ウサギ腎臓細胞系、イヌ腎臓細胞系、ニワトリ肝臓細胞系、ウシ腎臓細胞系、ブタ腎臓細胞系および昆虫細胞系からなるリストから選択される細胞系または細胞である。
本発明によるＩＢＶの別の特定の態様では、ＩＢＶは、本明細書に記載の少なくとも１種の細胞系または細胞において感染および／または複製している。好ましくは、前記ＩＢＶは、本明細書に記載の少なくとも１種の細胞系において感染および／または複製している。
さらに、本発明は、
－本明細書に記載のウイルス粒子または
－本明細書に記載のトリコロナウイルスまたはＩＢＶ
を含む細胞を提供する。
本発明による細胞の別の特定の態様では、細胞は、初代ニワトリ胚細胞、ニワトリ胚線維芽細胞系、アヒル胚幹細胞系、ヒト胚性腎臓細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系、ウサギ腎臓細胞系、イヌ腎臓細胞系、ニワトリ肝臓細胞系、ウシ腎臓細胞系、ブタ腎臓細胞系および昆虫細胞系からなるリストから選択される細胞系または細胞である。
【0060】
本発明による細胞の別の特定の態様では、細胞は、ＤＦ－１（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｆｏｓｔｅｒ）、ＥＢ６６（アヒル胚幹細胞系）、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ（ＰＢＳ－１２無血清）、ＢＨＫ２１（ベビーハムスター腎臓）、ＨＥＫ ２９３Ｔ（ヒト胚性腎臓）、Ｖｅｒｏ（Ｖｅｒｄａ Ｒｅｎｏ）、ＭＡ１０４、ＲＫ１３（ウサギ腎臓）、ＬＭＨ（レグホンオス肝細胞癌）、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）、ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙウシ腎臓）、ＰＫ１５（ブタ腎臓）、ＰＫ２Ａ（ブタ腎臓）、ＳＦ９、ＳＦ２１およびＳＦ＋（スポドプテラ・フルギペルダ）から選択される細胞系である。
本発明による細胞の別の特定の態様では、細胞は、ＤＦ－１、ＥＢ６６、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、ＭＡ１０４およびＲＫ１３からなるリストから選択される細胞系である。
本発明による細胞の別の特定の態様では、初代ニワトリ胚細胞は、線維芽細胞または、肝臓もしくは肺組織に由来する細胞である。
さらに、本発明は、免疫原性組成物であって、
－本明細書に記載のスパイクタンパク質、または
－本明細書に記載のウイルス粒子、または
－本明細書に記載のトリコロナウイルスまたはＩＢＶを含む、組成物を提供する。
本発明による細胞の別の特定の態様では、細胞は、ＤＦ－１、ＥＢ６６、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ、ＢＨＫ、ＨＥＫ ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、ＭＡ１０４およびＲＫ１３からなるリストから選択される細胞系である。
本発明による細胞の別の特定の態様では、初代ニワトリ胚細胞は、線維芽細胞または、肝臓もしくは肺組織に由来する細胞である。
さらに、本発明は、免疫原性組成物であって、
－本明細書に記載のスパイクタンパク質、または
－本明細書に記載のウイルス粒子、または
－本明細書に記載のトリコロナウイルスまたはＩＢＶを含む、組成物を提供する。
【0061】
したがって、本発明はまた、トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片を含む、トリコロナウイルスまたはＩＢＶを含む免疫原性組成物を提供し、ここで、Ｓ１サブユニットの少なくとも一部は、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスまたはＩＢＶ由来であり、アミノ酸２６７位はシステインである。さらに、本発明はまた、アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片を含むトリコロナウイルスまたはＩＢＶを含む免疫原性組成物を提供する。さらに、配列番号１のアミノ酸配列はスパイクタンパク質中の位置番号付けを決定するために使用される。好ましくは、スパイクタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と整列される。
さらに、本発明は、
－本明細書に記載のスパイクタンパク質、または
－本明細書に記載のウイルス粒子、または
－本明細書に記載のコロナウイルスまたはＩＢＶ
を含む、ワクチンを提供する。
さらに、本発明は、
－本明細書に記載のスパイクタンパク質、または
－本明細書に記載のウイルス粒子、または
－本明細書に記載のコロナウイルスまたはＩＢＶ
を含む、ワクチンを提供する。
【0062】
さらに、本発明は、拡張された細胞または組織指向性を有する改変生ワクチンであって、
－本明細書に記載のスパイクタンパク質、または
－本明細書に記載のウイルス粒子、または
－本明細書に記載のコロナウイルスまたはＩＢＶ
を含む、ワクチンを提供する。
「免疫原性組成物」という用語は、前記免疫原性組成物を投与する宿主において、免疫学的応答を誘発する、少なくとも１種の抗原を含む組成物を指す。そのような免疫学的応答は、本発明の免疫原性組成物に対する細胞性および／または抗体媒介性免疫応答であってもよい。好ましくは、免疫原性組成物は、免疫応答を誘発し、より好ましくは、ＩＢＶ感染の臨床兆候の１種または複数に対して保護免疫を付与する。宿主は、「対象」とも記載される。好ましくは、本明細書で記載または言及される宿主または対象は、トリまたは家禽である。
通常、「免疫学的応答」は、次の効果の１種または複数を含むがこれらに限定されない、本発明の免疫原性組成物に含まれる抗原に特異的に対する、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞障害性Ｔ細胞および／またはガンマデルタＴ細胞の生成または活性化。好ましくは、宿主は保護的な免疫学的応答または治療的応答のいずれかを示すであろう。
－本明細書に記載のスパイクタンパク質、または
－本明細書に記載のウイルス粒子、または
－本明細書に記載のコロナウイルスまたはＩＢＶ
を含む、ワクチンを提供する。
「免疫原性組成物」という用語は、前記免疫原性組成物を投与する宿主において、免疫学的応答を誘発する、少なくとも１種の抗原を含む組成物を指す。そのような免疫学的応答は、本発明の免疫原性組成物に対する細胞性および／または抗体媒介性免疫応答であってもよい。好ましくは、免疫原性組成物は、免疫応答を誘発し、より好ましくは、ＩＢＶ感染の臨床兆候の１種または複数に対して保護免疫を付与する。宿主は、「対象」とも記載される。好ましくは、本明細書で記載または言及される宿主または対象は、トリまたは家禽である。
通常、「免疫学的応答」は、次の効果の１種または複数を含むがこれらに限定されない、本発明の免疫原性組成物に含まれる抗原に特異的に対する、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞障害性Ｔ細胞および／またはガンマデルタＴ細胞の生成または活性化。好ましくは、宿主は保護的な免疫学的応答または治療的応答のいずれかを示すであろう。
【0063】
「保護的な免疫学的応答」または「保護免疫」は、感染した宿主が通常示す臨床徴候の低減または欠損、より迅速な回復時間および／または感染力期間の低下、または感染した宿主の組織または体液または排泄物中の病原体力価の低下のいずれかによって表されるであろう。
宿主が、新しい感染に対する耐性が増強され、および／または疾患の臨床重度が低減するように保護的な免疫学的応答を示す場合、免疫原性組成物は「ワクチン」と記載される。
「改変生」または「弱毒化」という用語は本明細書において互換的に使用される。
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、薬学的に許容される担体を含む。
「薬学的に許容される担体」という用語は、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、安定剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延化剤、アジュバント、免疫刺激物質およびその組合せを含む。
「希釈剤」は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、およびグリセロール等を含んでいてもよい。等張剤は、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含んでいてもよい。安定剤は、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩を含む。
宿主が、新しい感染に対する耐性が増強され、および／または疾患の臨床重度が低減するように保護的な免疫学的応答を示す場合、免疫原性組成物は「ワクチン」と記載される。
「改変生」または「弱毒化」という用語は本明細書において互換的に使用される。
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、薬学的に許容される担体を含む。
「薬学的に許容される担体」という用語は、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、安定剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延化剤、アジュバント、免疫刺激物質およびその組合せを含む。
「希釈剤」は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、およびグリセロール等を含んでいてもよい。等張剤は、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含んでいてもよい。安定剤は、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩を含む。
【0064】
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝食塩水である。
好ましくは、免疫原性組成物は、スクロースゼラチン安定剤をさらに含む。
好ましくは、薬学的に許容される担体は、キトサンである。
キトサンは、甲殻類（例えば、エビ、カニ）、昆虫および他の無脊椎動物のキチン由来の天然の脱アセチル化ポリサッカライドである。近年、Rauw et al. 2009 (Vet Immunol Immunop 134:249-258)により、キトサンが生ニューカッスル病ワクチンの細胞性免疫応答を亢進したこと、ならびにその保護効果を促進したことが示されている。さらに、Wang et al., 2012 (Arch Virol (2012) 157:1451-1461)により、生弱毒化インフルエンザワクチンにおいて使用するためのアジュバントとしての、キトサンの潜在的な能力を明らかにする結果が示されている。
好ましくは、免疫原性組成物は、スクロースゼラチン安定剤をさらに含む。
好ましくは、薬学的に許容される担体は、キトサンである。
キトサンは、甲殻類（例えば、エビ、カニ）、昆虫および他の無脊椎動物のキチン由来の天然の脱アセチル化ポリサッカライドである。近年、Rauw et al. 2009 (Vet Immunol Immunop 134:249-258)により、キトサンが生ニューカッスル病ワクチンの細胞性免疫応答を亢進したこと、ならびにその保護効果を促進したことが示されている。さらに、Wang et al., 2012 (Arch Virol (2012) 157:1451-1461)により、生弱毒化インフルエンザワクチンにおいて使用するためのアジュバントとしての、キトサンの潜在的な能力を明らかにする結果が示されている。
【0065】
好ましくは、免疫原性組成物は、１種または複数の他の免疫調節剤、例えばインターロイキン、インターフェロンまたは他のサイトカインをさらに含んでいてもよい。本発明の文脈において有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は、当業者により容易に決定し得る。
【0066】
いくつかの態様では、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含む。本明細書で使用される場合、「アジュバント」は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばＱｕｉｌ Ａ、ＱＳ－２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、ＧＰＩ－０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ），油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンを含む。前記エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィン油（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅａ ｔｙｐｅ）、イソプレノイド油、例えばスクアランまたはスクアレン、アルケン、特にイソブテンまたはデセンの多量体化から生じる油、酸または直鎖アルキル基を含むアルコールのエステル、より具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ－（カプリル酸／カプリン酸）、グリセリルトリ－（カプリル酸／カプリン酸）またはジオレイン酸プロピレングリコール、分枝脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステルをベースとしていてもよい。油は、乳化剤とともに使用され、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特に必要に応じてエトキシル化されている、ソルビタンのエステル、マンニドのエステル（例えば、オレイン酸無水マンニトール）、グリコールのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸のエステル、およびポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にＰｌｕｒｏｎｉｃ製品、特にＬ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.)、JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)およびTodd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)を参照されたい。例示的なアジュバントは、“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の第１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョンおよび同文献の第１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。
【0067】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよびマレイン酸無水物およびアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。好都合なアジュバント化合物は、特に糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルと架橋している、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当技術分野の当業者はまた、少なくとも３つの、好ましくは８つ以下のヒドロキシル基を有する、少なくとも３つのヒドロキシル基の水素原子が、少なくとも２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族基により置換されている、ポリヒドロキシル化化合物と架橋しているそのようなアクリルポリマーを記載している、米国特許第２，９０９，４６２号も参照し得る。好ましい基は、２～４つの炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和基は、それ自体が他の置換基、例えばメチルを含んでいてもよい。Ｃａｒｂｏｐｏｌ（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）の名称で販売されている製品は特に適当である。それらは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールと架橋している。とりわけ、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐが言及され得る。最も好ましいのは、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７１Ｐの使用である。マレイン酸無水物とアルケニル誘導体とのコポリマーの中には、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）が含まれ、これはマレイン酸無水物およびエチレンのコポリマーである。これらのポリマーを水中に溶解することにより、免疫原性、免疫学的またはワクチン組成物自体が組み込まれるアジュバント溶液を得るために、好ましくは生理学的なｐＨに中和される酸性溶液がもたらされる。
【0068】
さらに適当なアジュバントは、とりわけ、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）、モノホスホリル脂質Ａ、アブリジン脂質－アミンアジュバント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたは他の方法）、コレラ毒素、ＩＭＳ１３１４またはムラミルジペプチドまたは天然に存在する、または組換えのサイトカインまたはそのアナログまたは内在性サイトカイン放出の刺激物質を含むが、これらに限定されない。
アジュバントは、用量当たり約１００μｇ～約１０ｍｇの量、好ましくは用量当たり約１００μｇ～約１０ｍｇの量、より好ましくは用量当たり約５００μｇ～約５ｍｇの量、よりさらに好ましくは用量当たり約７５０μｇ～約２．５ｍｇの量、最も好ましくは用量当たり約１ｍｇの量で添加し得ることが予期される。あるいは、アジュバントは、最終産物の約０．０１～５０体積％の濃度、好ましくは約２体積％～３０体積％の濃度、より好ましくは約５体積％～２５体積％の濃度、さらにより好ましくは約７体積％～２２体積％の濃度、最も好ましくは１０体積％～２０体積％の濃度であってよい。
アジュバントは、用量当たり約１００μｇ～約１０ｍｇの量、好ましくは用量当たり約１００μｇ～約１０ｍｇの量、より好ましくは用量当たり約５００μｇ～約５ｍｇの量、よりさらに好ましくは用量当たり約７５０μｇ～約２．５ｍｇの量、最も好ましくは用量当たり約１ｍｇの量で添加し得ることが予期される。あるいは、アジュバントは、最終産物の約０．０１～５０体積％の濃度、好ましくは約２体積％～３０体積％の濃度、より好ましくは約５体積％～２５体積％の濃度、さらにより好ましくは約７体積％～２２体積％の濃度、最も好ましくは１０体積％～２０体積％の濃度であってよい。
【0069】
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、必要としている対象においてＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候の処置および／または予防に有効である。「処置および／または予防」、「臨床徴候」および「必要としている」という用語は他の箇所で定義されている。
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、前記免疫原性組成物またはワクチンは、単回用量の投与用に製剤化される。
単回用量についての体積は本明細書中の他の箇所で定義されている。
本発明の免疫原性組成物の単回投与は、そのような免疫原性組成物またはワクチンのそのような単回投与後に有効であることがさらに示されている。
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、皮下、筋肉内、経口、卵内（ｉｎ ｏｖｏ）、スプレー、飲料水または点眼剤により投与される。
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり１～１０ｌｏｇ10ＥＩＤ５０のＩＢＶを含む。
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、前記免疫原性組成物またはワクチンは、単回用量の投与用に製剤化される。
単回用量についての体積は本明細書中の他の箇所で定義されている。
本発明の免疫原性組成物の単回投与は、そのような免疫原性組成物またはワクチンのそのような単回投与後に有効であることがさらに示されている。
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、皮下、筋肉内、経口、卵内（ｉｎ ｏｖｏ）、スプレー、飲料水または点眼剤により投与される。
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり１～１０ｌｏｇ10ＥＩＤ５０のＩＢＶを含む。
【0070】
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり２～５ｌｏｇ10ＥＩＤ５０のＩＢＶを含む。
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり２～４ｌｏｇ10ＥＩＤ５０のＩＢＶを含む。
製造、培養および改変方法
さらに、本発明は、本明細書に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、トリコロナウイルスの細胞または組織指向性を変更する方法を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、トリコロナウイルスの細胞または組織指向性を拡張する方法を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、拡張された細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスの生成または製造方法を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、細胞または組織培養においてトリコロナウイルスを培養する方法を提供する。
さらに、本発明は、前記トリコロナウイルスのスパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を改変することを含む、トリコロナウイルスを改変する方法を提供する。
本発明による免疫原性組成物またはワクチンの別の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり２～４ｌｏｇ10ＥＩＤ５０のＩＢＶを含む。
製造、培養および改変方法
さらに、本発明は、本明細書に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、トリコロナウイルスの細胞または組織指向性を変更する方法を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、トリコロナウイルスの細胞または組織指向性を拡張する方法を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、拡張された細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスの生成または製造方法を提供する。
さらに、本発明は、本明細書に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、細胞または組織培養においてトリコロナウイルスを培養する方法を提供する。
さらに、本発明は、前記トリコロナウイルスのスパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を改変することを含む、トリコロナウイルスを改変する方法を提供する。
【0071】
さらに、本発明は、トリコロナウイルススパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を突然変異させる方法であって、
ａ） トリコロナウイルススパイクヌクレオチドまたはタンパク質配列を供給すること、
ｂ） 参照配列との整列により、スパイクタンパク質における２６７位を同定すること、
ｃ） ステップｂ）のスパイクタンパク質の２６７位をシステインに突然変異させること、
ｄ） ステップｃ）の突然変異スパイクタンパク質を得ること
を含む、方法を提供する。
さらに、本発明は、トリコロナウイルスのトリコロナウイルススパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を突然変異させる方法であって、
ａ） トリコロナウイルスを供給すること、
ｂ） 参照配列との整列によって、スパイクタンパク質における２６７位を同定すること、
ｃ） ステップｂ）のスパイクタンパク質の２６７位をシステインに突然変異させること、
ｄ） ステップｃ）の突然変異トリコロナウイルスを得ること、
を含む、方法を提供する。
ａ） トリコロナウイルススパイクヌクレオチドまたはタンパク質配列を供給すること、
ｂ） 参照配列との整列により、スパイクタンパク質における２６７位を同定すること、
ｃ） ステップｂ）のスパイクタンパク質の２６７位をシステインに突然変異させること、
ｄ） ステップｃ）の突然変異スパイクタンパク質を得ること
を含む、方法を提供する。
さらに、本発明は、トリコロナウイルスのトリコロナウイルススパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を突然変異させる方法であって、
ａ） トリコロナウイルスを供給すること、
ｂ） 参照配列との整列によって、スパイクタンパク質における２６７位を同定すること、
ｃ） ステップｂ）のスパイクタンパク質の２６７位をシステインに突然変異させること、
ｄ） ステップｃ）の突然変異トリコロナウイルスを得ること、
を含む、方法を提供する。
【0072】
「得る」という用語は、前記スパイクタンパク質またはその断片の回収、単離、精製および／または製剤化（例えば、仕上げ、不活化および／または混合）を含む。「回収」という用語は、改変スパイクタンパク質を有する前記トリコロナウイルスまたはＩＢＶをトランスフェクション、または感染した細胞または細胞系から収集または回収することを指す。当技術分野で公知の任意の慣用的な方法、例えば任意の分離方法を使用してもよい。当技術分野で周知の方法は、遠心分離または濾過、例えば特定の孔径を有する半透性膜を用いた濾過を含む。「単離」という用語は、改変スパイクタンパク質を有する前記トリコロナウイルスまたはＩＢＶの単離ステップを含む。トランスフェクションまたは感染した細胞または細胞系からの単離方法は、当技術分野の当業者には公知である。これらの方法は、物理学的および／または化学的な方法を含み、凍結融解サイクル、超音波での処理等が含まれるがこれらに限定されない。前記改変スパイクタンパク質を有する前記トリコロナウイルスまたはＩＢＶの単離物からの「精製」の方法は、当技術分野の当業者には公知であり、例えば、Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angel, eds., IRL Press at Oxford University Press)に記載されている方法による。それらの方法としては、遠心分離および／または濾過、沈殿化、サイズ排除（ゲル濾過）クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー共有結合クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー等による分離が含まれるが、これらに限定されない。ベクターは、精製された純粋な形態、または他の細胞性物質または培養培地等を含まないか、もしくは実質的に含まずに得ることができる。前記単離および／または精製の後、抗原は少なくとも８０％、好ましくは８０％～９０％、より好ましくは９０％～９７％、最も好ましくは９７％～混入物を全く含まない完全な純粋形態までの純度を示す。
【0073】
さらなる態様によれば、本明細書中で使用される「得る」は、また、最終製剤化プロセスの一部として、さらなる仕上げステップ、例えば緩衝剤の添加、不活化、および中和ステップ等を含んでいてもよい。
本発明による方法の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、アミノ酸２６７位においてシステインを有する。
本発明による方法の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位におけるシステインは突然変異によって導入されている。
本発明による方法の別の特定の態様では、前記突然変異は、置換、欠失または挿入である。
本発明による方法の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位において、フェニルアラニンまたはロイシンはシステインに改変または突然変異されている。
本発明による方法の別の特定の態様では、スパイクタンパク質またはその断片は、アミノ酸２６７位においてシステインを有する。
本発明による方法の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位におけるシステインは突然変異によって導入されている。
本発明による方法の別の特定の態様では、前記突然変異は、置換、欠失または挿入である。
本発明による方法の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位において、フェニルアラニンまたはロイシンはシステインに改変または突然変異されている。
【0074】
本発明による方法の別の特定の態様では、トリコロナウイルスは、本明細書に記載のＩＢＶである。
したがって、本発明は、本明細書に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、ＩＢＶの細胞または組織指向性を変更する方法を提供する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、ＩＢＶの細胞または組織指向性を拡張する方法を提供する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、拡張された細胞または組織指向性を有するＩＢＶの生成または製造の方法を提供する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、細胞または組織培養においてＩＢＶを培養する方法を提供する。
したがって、本発明は、前記ＩＢＶのスパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を改変することを含む、ＩＢＶを改変する方法を提供する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、ＩＢＶの細胞または組織指向性を変更する方法を提供する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、ＩＢＶの細胞または組織指向性を拡張する方法を提供する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、拡張された細胞または組織指向性を有するＩＢＶの生成または製造の方法を提供する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、細胞または組織培養においてＩＢＶを培養する方法を提供する。
したがって、本発明は、前記ＩＢＶのスパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を改変することを含む、ＩＢＶを改変する方法を提供する。
【0075】
したがって、本発明は、ＩＢＶスパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を突然変異させる方法であって、
ａ） ＩＢＶスパイクヌクレオチドまたはタンパク質配列を供給すること、
ｂ） スパイクタンパク質の２６７位を参照配列との整列により同定すること、
ｃ） ステップｂ）のスパイクタンパク質の２６７位をシステインに突然変異させること、
ｄ） ステップｃ）の突然変異スパイクタンパク質を得ることを含む、
方法を提供する。
したがって、本発明は、ＩＢＶのＩＢＶスパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を突然変異させる方法であって、
ａ） ＩＢＶを供給し、
ｂ） スパイクタンパク質の２６７位を参照配列との整列により特定すること、
ｃ） ステップｂ）のスパイクタンパク質の２６７位をシステインに突然変異させること、
ｄ） ステップｃ）の突然変異ＩＢＶを得ることを含む、
方法を提供する。
ａ） ＩＢＶスパイクヌクレオチドまたはタンパク質配列を供給すること、
ｂ） スパイクタンパク質の２６７位を参照配列との整列により同定すること、
ｃ） ステップｂ）のスパイクタンパク質の２６７位をシステインに突然変異させること、
ｄ） ステップｃ）の突然変異スパイクタンパク質を得ることを含む、
方法を提供する。
したがって、本発明は、ＩＢＶのＩＢＶスパイクタンパク質のアミノ酸２６７位を突然変異させる方法であって、
ａ） ＩＢＶを供給し、
ｂ） スパイクタンパク質の２６７位を参照配列との整列により特定すること、
ｃ） ステップｂ）のスパイクタンパク質の２６７位をシステインに突然変異させること、
ｄ） ステップｃ）の突然変異ＩＢＶを得ることを含む、
方法を提供する。
【0076】
本発明による方法の別の特定の態様では、コロナウイルススパイクタンパク質は、本明細書に記載のＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）スパイクタンパク質である。
本発明による方法の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位におけるシステイン、またはアミノ酸２６７位におけるシステインへの前記突然変異は、拡張された細胞または組織指向性を導く。
本発明による方法の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは、本明細書に記載の細胞系または細胞において感染および／または複製している。
本発明による方法の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位の番号付けは本明細書に記載するように行われる。
キット
組成物は、所望により、活性成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサーデバイスで提示され得る。前記パックは、例えば、金属またはプラスチックホイルを含んでいてよく、例えばブリスターパックであり得る。前記パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のため、好ましくは対象、特に家禽への投与のための使用説明書を伴っていてもよい。そのような容器は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を管理する政府機関により規定された形態の、注意書を伴っていてもよく、前記注意書は、投与のための製造、使用または販売の、機関による承認を反映している。
本発明は、本明細書に記載するウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンを含むキットを提供する。
本発明によるキットの一の特定の態様では、キットは、トリ疾患の処置および／または予防のための使用説明書、または家禽の疾患の処置および／または予防のための使用説明書、またはＩＢの処置および／または予防のための使用説明書をさらに含む。
本発明によるキットの一の特定の態様では、キットは、ワクチンを前記動物に投与することができるディスペンサーをさらに含む。
本発明による方法の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位におけるシステイン、またはアミノ酸２６７位におけるシステインへの前記突然変異は、拡張された細胞または組織指向性を導く。
本発明による方法の別の特定の態様では、トリコロナウイルスまたはＩＢＶは、本明細書に記載の細胞系または細胞において感染および／または複製している。
本発明による方法の別の特定の態様では、アミノ酸２６７位の番号付けは本明細書に記載するように行われる。
キット
組成物は、所望により、活性成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサーデバイスで提示され得る。前記パックは、例えば、金属またはプラスチックホイルを含んでいてよく、例えばブリスターパックであり得る。前記パックまたはディスペンサーデバイスは、投与のため、好ましくは対象、特に家禽への投与のための使用説明書を伴っていてもよい。そのような容器は、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を管理する政府機関により規定された形態の、注意書を伴っていてもよく、前記注意書は、投与のための製造、使用または販売の、機関による承認を反映している。
本発明は、本明細書に記載するウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンを含むキットを提供する。
本発明によるキットの一の特定の態様では、キットは、トリ疾患の処置および／または予防のための使用説明書、または家禽の疾患の処置および／または予防のための使用説明書、またはＩＢの処置および／または予防のための使用説明書をさらに含む。
本発明によるキットの一の特定の態様では、キットは、ワクチンを前記動物に投与することができるディスペンサーをさらに含む。
【0077】
処置方法
さらに、本発明は、対象を免疫化する方法であって、そのような対象に本明細書に記載する免疫原性組成物を投与することを含む、方法を提供する。
「免疫化」という用語は、免疫化する対象への免疫原性組成物の投与により、そのような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫学的応答を引き起こすことによる、活性免疫化に関する。
好ましくは、免疫化は、群における特定のトリコロナウイルスまたはＩＢＶ感染の発生率の低下または、特定のトリコロナウイルスまたはＩＢＶ感染により引き起こされるか、またはそれに伴う臨床徴候の重症度の低減をもたらす。
さらに、本発明は、対象を免疫化する方法であって、そのような対象に本明細書に記載する免疫原性組成物を投与することを含む、方法を提供する。
「免疫化」という用語は、免疫化する対象への免疫原性組成物の投与により、そのような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫学的応答を引き起こすことによる、活性免疫化に関する。
好ましくは、免疫化は、群における特定のトリコロナウイルスまたはＩＢＶ感染の発生率の低下または、特定のトリコロナウイルスまたはＩＢＶ感染により引き起こされるか、またはそれに伴う臨床徴候の重症度の低減をもたらす。
【0078】
さらに、本明細書に記載する免疫原性組成物を用いて、必要としている対象を免疫化することにより、トリコロナウイルスまたはＩＢＶ感染による対象の感染の防止がもたらされる。よりさらに好ましくは、免疫化は、ＩＢＶ感染に対する、有効な長期間持続性の免疫学的応答をもたらす。前記期間は、１カ月超、好ましくは２カ月超、好ましくは３カ月超、より好ましくは４カ月超、より好ましくは５カ月超、より好ましくは６カ月超持続することは理解されるであろう。免疫化が免疫化した全ての対象において有効ではない場合があることは理解されるべきである。しかし、前記用語は、群の対象の有意な割合が有効に免疫化されていることは必要としている。
【0079】
好ましくは、この文脈において、対象の群は、トリコロナウイルスまたはＩＢＶ感染により通常引き起こされるか、またはそれに伴う臨床徴候を通常、すなわち免疫化なしでは発症させることが予測される。群の対象が有効に免疫化されているかどうかは、当技術分野の当業者により、容易に決定し得る。好ましくは、所与の群の対象の少なくとも３３％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは１００％における臨床徴候が、発生率または重症度において、免疫化されていないか、または本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物により免疫化されているかのいずれかであり、次いで特定のトリコロナウイルスまたはＩＢＶにより感染されている対象と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは１００％低下している場合に、免疫化は有効であるとする。
さらに、本発明は、必要としている対象において、ＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載する免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、方法を提供する。
実施例に示すように、本明細書に提供する免疫原性組成物またはワクチンは、対象において、ＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候を処置または防止する上で有効であることが証明されている。したがって、試験データは、アミノ酸２６７位におけるアミノ酸のシステインへの改変は、ワクチンの有効性に対して全く影響を及ぼさないことを示している。
さらに、本発明は、必要としている対象において、ＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載する免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む、方法を提供する。
実施例に示すように、本明細書に提供する免疫原性組成物またはワクチンは、対象において、ＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候を処置または防止する上で有効であることが証明されている。したがって、試験データは、アミノ酸２６７位におけるアミノ酸のシステインへの改変は、ワクチンの有効性に対して全く影響を及ぼさないことを示している。
【0080】
「処置または防止する」という用語は、群における特定のＩＢＶ感染の発生率を低下させること、または特定のＩＢＶ感染により引き起こされるか、またはそれに伴う臨床徴候の重症度の低減を指す。したがって、「処置または防止する」という用語はまた、有効量の、本明細書に提供する免疫原性組成物の投与を受けた対象群において、そのような免疫原性組成物の投与を受けていない対照群と比較して、特定のＩＢＶに感染した、群における対象の数の減少（＝特定のＩＢＶ感染の発生率の低下）、または通常、ＩＢＶ感染に伴うか、またはそれにより引き起こされる臨床徴候の重症度の低減、または特定のＩＢＶによる感染後のウイルス脱落の減少、または特定のＩＢＶによる感染後の産卵鶏の産卵低下の防止または低減を指す。
「処置または防止する」は、一般的に、有効量の本発明の免疫原性組成物を、そのような処置／予防から利益を得るであろう、必要としている対象、または対象の群に投与することを伴う。「処置」という用語は、対象または群の少なくともいくらかの対象が、そのようなＩＢＶに感染しており、そのような対象がすでに、そのようなＩＢＶ感染により引き起こされるか、またはそれに伴う何らかの臨床徴候を示している際の、有効量の免疫原性組成物の投与を指す。「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」という用語は、そのような対象がＩＢＶに感染するよりも前に、またはそのような少なくとも対象または、対象群の対象がいずれも、そのようなＩＢＶによる感染により引き起こされるか、またはそれに伴う臨床徴候をいずれも全く示さない場合の、対象への投与を指す。「予防」および「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」という用語は本出願において互換的に使用される。
「処置または防止する」は、一般的に、有効量の本発明の免疫原性組成物を、そのような処置／予防から利益を得るであろう、必要としている対象、または対象の群に投与することを伴う。「処置」という用語は、対象または群の少なくともいくらかの対象が、そのようなＩＢＶに感染しており、そのような対象がすでに、そのようなＩＢＶ感染により引き起こされるか、またはそれに伴う何らかの臨床徴候を示している際の、有効量の免疫原性組成物の投与を指す。「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」という用語は、そのような対象がＩＢＶに感染するよりも前に、またはそのような少なくとも対象または、対象群の対象がいずれも、そのようなＩＢＶによる感染により引き起こされるか、またはそれに伴う臨床徴候をいずれも全く示さない場合の、対象への投与を指す。「予防」および「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」という用語は本出願において互換的に使用される。
【0081】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は。対象において免疫応答を引き起こすか、または引き起こすことができる、抗原の量を指すが、これに限定されない。そのような有効量は、群における特定のＩＢＶ感染の発生率を低下させるか、または特定のＩＢＶ感染の臨床徴候の重症度を低減することができる。
好ましくは、処置されていないか、本発明よりも前に利用可能であった免疫原性組成物により処置されたが、次いで特定のＩＢＶに感染している対象と比較して、臨床徴候は、発生率または重症度において、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも１００％低減している。
好ましくは、処置されていないか、本発明よりも前に利用可能であった免疫原性組成物により処置されたが、次いで特定のＩＢＶに感染している対象と比較して、臨床徴候は、発生率または重症度において、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、さらにより好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは少なくとも１００％低減している。
【0082】
本明細書で使用される場合、「臨床徴候」という用語は、ＩＢＶからの対象の感染の兆候を指す。感染の臨床徴候は、選択した病原体に依存する。そのような臨床徴候の例としては、呼吸促迫、腎炎、卵管炎、異常産卵、羽毛の逆立ち、抑欝、成長速度の低下、および食欲低下が挙げられるが、これらに限定されない。呼吸促迫の徴候は、息切れ、咳、くしゃみ、気管ラ音、鼻汁および眼漏、気管病変および気管における線毛運動障害を含む呼吸器徴候を含む。腎炎の徴候は、腎臓病変および水性下痢を含む。異常産卵の徴候は、産卵減少、卵のサイズの低下、殻の劣化、内部の卵の品質の低下、アルブミンが薄い卵および卵管中の線毛運動障害を含む。しかし、臨床徴候は、生体動物から直接観察可能である臨床徴候も含むが、これに限定されるものではない。生体動物から直接観察可能である臨床徴候の例としては、鼻汁および眼漏、咳、息切れ、くしゃみ、気管ラ音、羽毛の逆立ち、結膜炎、体重減少、成長速度の低下、食欲低下、脱水、水性下痢、跛行、嗜眠、消耗および不始末等が挙げられる。
好ましくは、処置した対象においては、処置されていないか、または本発明より前に利用可能であった免疫原性組成物により処置されているかのいずれかであるが、次いで特定のＩＢＶに感染した対象と比較して、発生率または重症度において低減した臨床徴候は、線毛運動障害の低減、ラ音の低減、産卵低下の低減、腎臓病変の低減、水性下痢の低減、体重減少の低減、ウイルス負荷量の低下、ウイルス脱落の低下またはそれらの組合せを指す。
好ましくは、処置した対象においては、処置されていないか、または本発明より前に利用可能であった免疫原性組成物により処置されているかのいずれかであるが、次いで特定のＩＢＶに感染した対象と比較して、発生率または重症度において低減した臨床徴候は、線毛運動障害の低減、ラ音の低減、産卵低下の低減、腎臓病変の低減、水性下痢の低減、体重減少の低減、ウイルス負荷量の低下、ウイルス脱落の低下またはそれらの組合せを指す。
【0083】
本明細書で使用される場合、「必要としている」または「必要の」という用語は、投与／処置が、本発明による免疫原性組成物の投与を受ける対象の、健康または臨床徴候の増強もしくは改善、または健康に対する他の任意の正の薬効を伴っていることを意味する。
さらに、本発明は、必要としている対象において、同一種の非免疫化対照群と比較して、線毛運動障害を低減する方法であって、前記対象に、治療有効量の本明細書に記載する免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、方法を提供する。
実施例に示すように、本明細書に提供する免疫原性組成物またはワクチンは、線毛運動障害を低減するのに有効であることが証明されている。
「線毛運動障害」という用語は、気管における線毛の運動の減少を指す。したがって、線毛運動障害は、線毛の運動のための気管輪の内部裏打ちを調べることにより決定し得る。気管における線毛の運動を決定する方法は、当技術分野の当業者の一般的な知識の範囲内である。
好ましくは、線毛の運動は、同一種の非免疫化対照群と比較して、暴露または感染の１０日後、より好ましくは暴露または感染の５日後、より好ましくは暴露または感染の４日後、より好ましくは暴露または感染の３日後、および最も好ましくはＩＢＶによる暴露または感染の１または２日後から減少しない。
さらに、本発明は、必要としている対象において、同一種の非免疫化対照群と比較して、線毛運動障害を低減する方法であって、前記対象に、治療有効量の本明細書に記載する免疫原性組成物またはワクチンを投与することを含む、方法を提供する。
実施例に示すように、本明細書に提供する免疫原性組成物またはワクチンは、線毛運動障害を低減するのに有効であることが証明されている。
「線毛運動障害」という用語は、気管における線毛の運動の減少を指す。したがって、線毛運動障害は、線毛の運動のための気管輪の内部裏打ちを調べることにより決定し得る。気管における線毛の運動を決定する方法は、当技術分野の当業者の一般的な知識の範囲内である。
好ましくは、線毛の運動は、同一種の非免疫化対照群と比較して、暴露または感染の１０日後、より好ましくは暴露または感染の５日後、より好ましくは暴露または感染の４日後、より好ましくは暴露または感染の３日後、および最も好ましくはＩＢＶによる暴露または感染の１または２日後から減少しない。
【0084】
「線毛運動障害の低減」という用語は、線毛運動障害が、同一種の非免疫化対照群の対象と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは１００％低減していることを意味する。線毛運動障害の低減を測定する方法は、当技術分野の当業者の一般的な知識の範囲内である。
さらに、本発明は、対象を免疫化する方法で使用するための、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを提供し、前記方法は、治療有効量の前記免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む。
さらに、本発明は、必要としている対象において、ＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法において使用するための、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを提供し、前記方法は、治療有効量の前記免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む。
さらに、本発明は、対象を免疫化する方法で使用するための、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを提供し、前記方法は、治療有効量の前記免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む。
さらに、本発明は、必要としている対象において、ＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法において使用するための、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを提供し、前記方法は、治療有効量の前記免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む。
【0085】
さらに、本発明は、必要としている対象において、同一種の非免疫化対照群の対象と比較して、線毛運動障害を低減するための方法において使用するための、本明細書に記載の免疫原性組成物またはワクチンを提供し、前記方法は、治療有効量の前記免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与することを含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記対象はトリである。
「トリ」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。「トリ」という用語は、家禽を含む全ての鳥を包含する。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記対象は家禽である。
「家禽」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。「家禽」という用語は、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、ホロホロチョウ、ガチョウおよびアヒルを含む。さらに、「ニワトリ」という用語は、ブロイラー、産卵鶏、および両方についてのブリーダーとも称する、生殖ストックを含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記対象は、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラまたはキジから選択される。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記対象はトリである。
「トリ」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。「トリ」という用語は、家禽を含む全ての鳥を包含する。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記対象は家禽である。
「家禽」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。「家禽」という用語は、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、ホロホロチョウ、ガチョウおよびアヒルを含む。さらに、「ニワトリ」という用語は、ブロイラー、産卵鶏、および両方についてのブリーダーとも称する、生殖ストックを含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記対象は、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラまたはキジから選択される。
【0086】
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記対象はニワトリである。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは１回投与される。
単回用量は１回のみ投与されることは理解されている。実施例に示すように、本明細書で提供する免疫原性組成物は、必要としている対象に対する単回用量の投与後に、有効であることが証明されている。
家禽当たりの用量体積は、ワクチン接種の経路および家禽の年齢に依存する。
典型的には、点眼ワクチンは、任意の年齢において、用量当たり１～１００μｌの体積で投与される。好ましくは、点眼ワクチンについての単回用量は、約５μｌ～７０μｌ、より好ましくは約２０μｌ～５０μｌの総体積を有し、単回用量２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌまたは５０μｌが好ましい。最も好ましくは、点眼ワクチンについての単回用量は、約３０μｌ～５０μｌの総体積を有し、単回用量３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌまたは５０μｌが好ましい。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは１回投与される。
単回用量は１回のみ投与されることは理解されている。実施例に示すように、本明細書で提供する免疫原性組成物は、必要としている対象に対する単回用量の投与後に、有効であることが証明されている。
家禽当たりの用量体積は、ワクチン接種の経路および家禽の年齢に依存する。
典型的には、点眼ワクチンは、任意の年齢において、用量当たり１～１００μｌの体積で投与される。好ましくは、点眼ワクチンについての単回用量は、約５μｌ～７０μｌ、より好ましくは約２０μｌ～５０μｌの総体積を有し、単回用量２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌまたは５０μｌが好ましい。最も好ましくは、点眼ワクチンについての単回用量は、約３０μｌ～５０μｌの総体積を有し、単回用量３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌまたは５０μｌが好ましい。
【0087】
スプレーワクチンは、日齢家禽については、２５～１０００μｌの体積に用量を含んでいてもよい。好ましくは、スプレーワクチンについての単回用量は、約５０μｌ～５０００μｌ、より好ましくは約７５μｌ～２０００μｌ、より好ましくは約１００μｌ～１０００μｌ、さらにより好ましくは約２００μｌ～９００μｌ、さらにより好ましくは約３００μｌ～８００μｌ、およびさらにより好ましくは約４００μｌ～７００μｌの総体積を有し、単回用量４００μｌ、４２５μｌ、４５０μｌ、４７５μｌ、５００μｌ、５２５μｌ、５５０μｌ、５７５μｌ、６００μｌ、６２５μｌ、６５０μｌ、６７５μｌまたは７００μｌが好ましい。最も好ましい単回容量は、４００μｌ、４５０μｌ ５００μｌ、５５０μｌ、６００μｌ、６５０μｌまたは７００μｌの総体積を有する。
卵内ワクチン接種のためのワクチンは、５０～１００μｌ、好ましくは５０μｌの体積中に用量を含んでいてもよい。好ましくは、卵内ワクチンについての単回容量は、約１０μｌ～２５０μｌ、より好ましくは約１５μｌ～２００μｌ、さらにより好ましくは約２０μｌ～１５０μｌ、さらにより好ましくは約３０μｌ～１００μｌ、さらにより好ましくは約３０μｌ～７５μｌの総体積を有し、単回用量３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌまたは７５μｌが好ましい。最も好ましい単回容量は、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌまたは６０μｌの総体積を有する。
卵内ワクチン接種のためのワクチンは、５０～１００μｌ、好ましくは５０μｌの体積中に用量を含んでいてもよい。好ましくは、卵内ワクチンについての単回容量は、約１０μｌ～２５０μｌ、より好ましくは約１５μｌ～２００μｌ、さらにより好ましくは約２０μｌ～１５０μｌ、さらにより好ましくは約３０μｌ～１００μｌ、さらにより好ましくは約３０μｌ～７５μｌの総体積を有し、単回用量３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌまたは７５μｌが好ましい。最も好ましい単回容量は、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌまたは６０μｌの総体積を有する。
【0088】
筋肉内または皮下ワクチン接種のためのワクチンまたは、飲料水ワクチンの一用量は、３０μｌ～１０００μｌの体積に用量を含んでいてもよい。好ましくは、単回容量は、約３０μｌ～１０００μｌ、より好ましくは約５０μｌ～５００μｌ、より好ましくは約７５μｌ～２５０μｌ、およびさらにより好ましくは約１００μｌ～２００μｌの総体積を有しており、単回用量１００μｌ、１１０μｌ、１２０μｌ、１２５μｌ、１３０μｌ、１３５μｌ、１４０μｌ、１４５μｌ、１５０μｌ、１６０μｌ、１７０μｌ、１７５μｌ、１８０μｌ、１９０μｌ、１５５μｌまたは２００μｌが最も好ましい。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは２回以上投与される。
しかしながら、免疫原性組成物は、２回以上投与されてもよいが、１回目の投与は、２回目（追加免疫）の投与に先立って投与される。
２回投与レジメンの好ましい態様では、免疫原性組成物の１回目および２回目の投与は、共に同量で投与される。好ましくは、各投与は、上で特定した好ましい量である。１回目および２回目の投与レジメンに加えて、代替的な実施形態はさらなる後続の投与を含む。例えば、３回目、４回目または５回目の投与をこれらの態様で行ってもよい。好ましくは、後続の３回目、４回目、および５回目の投与レジメンは、１回目の投与と同じ用量で投与され、投与間の時間フレームは、上記の１回目と２回目の投与間のタイミングと一致している。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは２回以上投与される。
しかしながら、免疫原性組成物は、２回以上投与されてもよいが、１回目の投与は、２回目（追加免疫）の投与に先立って投与される。
２回投与レジメンの好ましい態様では、免疫原性組成物の１回目および２回目の投与は、共に同量で投与される。好ましくは、各投与は、上で特定した好ましい量である。１回目および２回目の投与レジメンに加えて、代替的な実施形態はさらなる後続の投与を含む。例えば、３回目、４回目または５回目の投与をこれらの態様で行ってもよい。好ましくは、後続の３回目、４回目、および５回目の投与レジメンは、１回目の投与と同じ用量で投与され、投与間の時間フレームは、上記の１回目と２回目の投与間のタイミングと一致している。
【0089】
好ましくは、ワクチンの１回目の投与は、下記の方法により、最初の３週齢内、より好ましくは１週齢内、最も好ましくは１日齢で行う。２回目の投与は、最初の２０週齢内、好ましくは１６～１８週齢内、より好ましくは６～１２週齢内に行ってよい。例示的には、最初の（１回目）ワクチン接種は、１～１０日齢において行い、２回目のワクチン接種（追加免疫）は、生ワクチンまたは不活化ワクチンを用いて、６～１２または１６～１８週齢において行う。より好ましくは、最初の（１回目）ワクチン接種は、１日齢において行い、２回目のワクチン接種（追加免疫）は、生ワクチンまたは不活化ワクチンを用いて、６～１２または１６～１８週齢において行う。
卵内ワクチン接種を用いる場合、好ましくは、１回目の投与は、胚が１５～１９日齢、好ましくは１７、１８または１９日齢、最も好ましくは１８日齢である際に行う。２回目の投与は、最初の３週齢、好ましくは最初の１０日齢内に行ってもよい。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記免疫原性組成物またはワクチンは、皮下、筋肉内、経口、卵内、スプレー、飲料水または点眼剤によって投与される。
卵内ワクチン接種を用いる場合、好ましくは、１回目の投与は、胚が１５～１９日齢、好ましくは１７、１８または１９日齢、最も好ましくは１８日齢である際に行う。２回目の投与は、最初の３週齢、好ましくは最初の１０日齢内に行ってもよい。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記免疫原性組成物またはワクチンは、皮下、筋肉内、経口、卵内、スプレー、飲料水または点眼剤によって投与される。
【0090】
免疫原性組成物は、好ましくは、局所または全身に投与される。慣用的に使用される適切な投与経路は、経口または非経口投与、例えば鼻腔内、静脈内、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、皮下ならびに吸入、卵内、スプレー、飲料水、または点眼剤によるものである。しかし、化合物の性質および作用機構に応じて、免疫原性組成物は、他の経路によっても投与し得る。例えば、そのような他の経路としては、皮内、静脈内、血管内、動脈内、腹腔内、髄腔内、気管内、皮内、心臓内、小葉内（ｉｎｔｒａｌｏｂａｌｌｙ）、葉内、髄質内、肺内、直腸内、および膣内が挙げられる。しかし、最も好ましくは、免疫原性組成物は、皮下、筋肉内、経口、卵内で、スプレー、飲料水または点眼剤によって投与される。
生ＩＢＶワクチンは、好ましくは、個々に点眼剤、鼻腔内、筋肉内または皮下投与される。
より好ましくは、大量適用方法、例えば飲料水およびエアロゾルスプレーワクチンが使用される。また、以下にさらに記載するような胚ワクチン（卵内ワクチンとも称する）としてのワクチンの使用も好ましい。
例えば、ブロイラー、特に高レベルのＭＤＡを有するブロイラーは、１日齢、または１～３週齢でワクチン接種してもよい。産卵ストックまたは生殖ストックは、最初に１～１０日齢にワクチン接種し、７～１２または１６～１８週齢において前記ワクチンにより追加免疫を行ってもよい。
生ＩＢＶワクチンは、好ましくは、個々に点眼剤、鼻腔内、筋肉内または皮下投与される。
より好ましくは、大量適用方法、例えば飲料水およびエアロゾルスプレーワクチンが使用される。また、以下にさらに記載するような胚ワクチン（卵内ワクチンとも称する）としてのワクチンの使用も好ましい。
例えば、ブロイラー、特に高レベルのＭＤＡを有するブロイラーは、１日齢、または１～３週齢でワクチン接種してもよい。産卵ストックまたは生殖ストックは、最初に１～１０日齢にワクチン接種し、７～１２または１６～１８週齢において前記ワクチンにより追加免疫を行ってもよい。
【0091】
卵内投与
上記に概説するように、本発明はまた、卵内経路を介して安全に投与することができ、同時に保護免疫応答を誘発することができる、ＩＢＶワクチンを提供する。卵内投与は、当技術分野の当業者には周知されており、当技術分野の当業者は、容易に卵内投与を行うことができる。ワクチンの卵内投与は、卵内に含まれている状態での、ワクチンのトリ胚への投与を伴う（卵内ワクチン接種についての概説については、Ricks et al., Advances in Vet. Med. 495-515, 1999を参照のこと）。ワクチンは、当技術分野で記載されている（Sharma; Am. J. Vet. Res. 45 1619-1623,1984）ように、卵の任意の適切なコンパートメント（例えば、尿膜液、卵黄嚢、羊膜、気室または胚中）に投与し得る。好ましくは、ワクチンは殻（気室）膜または絨毛尿膜の下方に投与される。
好ましくは、ワクチンは胚形成の最終段階、一般的にはインキュベーション期間の最後の四半期、好ましくは孵化の３～４日前に胚含有卵に注射される。好ましくは、投与は、胚が１５～１９日齢、好ましくは１７日、１８日または１９日齢、最も好ましくは１８日齢にある際に行われる。次いで、ワクチン接種した胚含有卵を孵化のためにインキュベーターに移す。卵内投与のプロセスは、先行技術に記載されているように、ロボット注射プロセスを用いて自動化してもよい。
上記に概説するように、本発明はまた、卵内経路を介して安全に投与することができ、同時に保護免疫応答を誘発することができる、ＩＢＶワクチンを提供する。卵内投与は、当技術分野の当業者には周知されており、当技術分野の当業者は、容易に卵内投与を行うことができる。ワクチンの卵内投与は、卵内に含まれている状態での、ワクチンのトリ胚への投与を伴う（卵内ワクチン接種についての概説については、Ricks et al., Advances in Vet. Med. 495-515, 1999を参照のこと）。ワクチンは、当技術分野で記載されている（Sharma; Am. J. Vet. Res. 45 1619-1623,1984）ように、卵の任意の適切なコンパートメント（例えば、尿膜液、卵黄嚢、羊膜、気室または胚中）に投与し得る。好ましくは、ワクチンは殻（気室）膜または絨毛尿膜の下方に投与される。
好ましくは、ワクチンは胚形成の最終段階、一般的にはインキュベーション期間の最後の四半期、好ましくは孵化の３～４日前に胚含有卵に注射される。好ましくは、投与は、胚が１５～１９日齢、好ましくは１７日、１８日または１９日齢、最も好ましくは１８日齢にある際に行われる。次いで、ワクチン接種した胚含有卵を孵化のためにインキュベーターに移す。卵内投与のプロセスは、先行技術に記載されているように、ロボット注射プロセスを用いて自動化してもよい。
【0092】
一般的に、家禽の孵化後ワクチン接種のための慣用的なワクチンは、卵内ワクチン接種には使用することができないが、これは、後期胚は、試験したほとんどのワクチンウイルスに対して高度に感染しやすいためである。しかし、国際特許出願である、国際公開第０１／６４２４４号は、非常に低い用量で適用するのであれば、ＩＢＶワクチンを卵内投与に使用し得ることを記載している。さらに、Wakenell et al. 1986（Am. J. Vet. Res., 47 933-938）は、組織培養中でＩＢワクチンウイルスを継代することによって、ウイルスが胚に対して非病原性になったことを記載している。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは点眼剤を介して投与される。
典型的には、孵化後投与用の生ワクチンは、用量当たり１０1～１０8ＥＩＤ50（５０％卵感染用量）の濃度、好ましくは用量当たり１０2～１０5ＥＩＤ50の濃度、より好ましくは単位用量当たり１０2～１０4ＥＩＤ50の濃度、さらにより好ましくは、用量当たり１０2～１０3ＥＩＤ50の濃度の弱毒化ＩＢＶを含む。
卵内投与用の生ワクチンは、典型的には、１０2～１０7ＥＩＤ50／胚、好ましくは１０2～１０3ＥＩＤ50／胚の量の弱毒化ＩＢＶを、５０～１００μｌ、好ましくは５０μｌの体積中に含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは点眼剤を介して投与される。
典型的には、孵化後投与用の生ワクチンは、用量当たり１０1～１０8ＥＩＤ50（５０％卵感染用量）の濃度、好ましくは用量当たり１０2～１０5ＥＩＤ50の濃度、より好ましくは単位用量当たり１０2～１０4ＥＩＤ50の濃度、さらにより好ましくは、用量当たり１０2～１０3ＥＩＤ50の濃度の弱毒化ＩＢＶを含む。
卵内投与用の生ワクチンは、典型的には、１０2～１０7ＥＩＤ50／胚、好ましくは１０2～１０3ＥＩＤ50／胚の量の弱毒化ＩＢＶを、５０～１００μｌ、好ましくは５０μｌの体積中に含む。
【0093】
好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、本発明のＩＢＶを、用量当たり約１～約１０ｌｏｇ10ＥＩＤ（卵感染用量）50／ｍｌの量で、好ましくは用量当たり約２～約８ｌｏｇ10ＥＩＤ50の量で、好ましくは用量当たり約２～約７ｌｏｇ10ＥＩＤ50の量で、より好ましくは用量当たり約２～約６ｌｏｇ10ＥＩＤ50の量で、さらにより好ましくは用量当たり約２～約５ｌｏｇ10ＥＩＤ50の量で、さらにより好ましくは用量当たり約２～約４ｌｏｇ10ＥＩＤ50の量で、最も好ましくは用量当たり約２～約３ｌｏｇ10ＥＩＤ50の量で含む。より好ましくは、本発明の免疫原性組成物は、本発明のＩＢＶを、用量当たり約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５またはｌｏｇ10ＥＩＤ50の量で含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり１～１０ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり２～５ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり２～４ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり１～１０ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり２～５ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、用量当たり２～４ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む。
【0094】
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、１週齢以内、最初の３日齢以内、最初の２日齢以内、または最初の１日齢以内に投与される。
好ましくは、免疫化される対象は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日齢である。より好ましくは、前記免疫化される対象は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日齢である。最も好ましくは、前記免疫化される対象は、１、２、３、４、５、６または７日齢である。
しかし、数日齢の対象のワクチン接種後、家禽の免疫系がＩＢＶ感染に対する免疫性を構築するには数日間を要することは、理解されるべきである。したがって、好ましくは、対象は誕生の最初の２４時間以内に免疫化される。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、１日齢以内に対象に投与される。実施例に示されるように、本明細書に提供する免疫原性組成物は、１日齢の家禽に投与した場合に安全であり、かつ有効であることが証明されている。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記結果は、同一種の非処置対照群の対象と比較して、線毛運動障害の防止または低減、ラ音の防止または低減、産卵低下の防止または低減、腎臓病変の防止または低減、水性下痢の防止または低減、体重減少の防止または低減、ウイルス負荷の低下、ウイルス脱落の減少、またはその組合せからなる群から選択される有効性パラメーターの改善をもたらす。
好ましくは、免疫化される対象は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１日齢である。より好ましくは、前記免疫化される対象は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日齢である。最も好ましくは、前記免疫化される対象は、１、２、３、４、５、６または７日齢である。
しかし、数日齢の対象のワクチン接種後、家禽の免疫系がＩＢＶ感染に対する免疫性を構築するには数日間を要することは、理解されるべきである。したがって、好ましくは、対象は誕生の最初の２４時間以内に免疫化される。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、免疫原性組成物またはワクチンは、１日齢以内に対象に投与される。実施例に示されるように、本明細書に提供する免疫原性組成物は、１日齢の家禽に投与した場合に安全であり、かつ有効であることが証明されている。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、前記結果は、同一種の非処置対照群の対象と比較して、線毛運動障害の防止または低減、ラ音の防止または低減、産卵低下の防止または低減、腎臓病変の防止または低減、水性下痢の防止または低減、体重減少の防止または低減、ウイルス負荷の低下、ウイルス脱落の減少、またはその組合せからなる群から選択される有効性パラメーターの改善をもたらす。
【0095】
「処置および／または予防」という用語は、他の箇所で定義されており、「予防（ｐｒｈｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」および「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は本出願において互換的に使用される。さらに「脱落」という用語も他の箇所で定義されている。
「低減すること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」、「低減した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」または「低下（ｌｏｗｅｒ）」という用語は、有効性パラメーター（線毛運動障害、ラ音、産卵低下、腎臓病変、水性下痢、体重減少、ウイルス負荷、ウイルス脱落）が、同一種の非免疫化対照群の対象と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは１００％低減することを意味する。有効性パラメーターの改善を測定する方法は、当技術分野の当業者の一般的な知識の範囲内である。
「低減すること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」、「低減した（ｒｅｄｕｃｅｄ）」、「低減（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」または「低下（ｌｏｗｅｒ）」という用語は、有効性パラメーター（線毛運動障害、ラ音、産卵低下、腎臓病変、水性下痢、体重減少、ウイルス負荷、ウイルス脱落）が、同一種の非免疫化対照群の対象と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、および最も好ましくは１００％低減することを意味する。有効性パラメーターの改善を測定する方法は、当技術分野の当業者の一般的な知識の範囲内である。
【0096】
「ウイルス負荷」または「ウイルス力価」という用語は、活性ウイルス感染の重症度の尺度であり、当技術分野の当業者に公知の方法により決定し得る。「ウイルス力価」という用語は、ウイルス製剤の体積当たりの感染ユニットの尺度である。ウイルス力価は、生物学的手段のエンドポイントであり、並行して行われた試験の特定の割合が効果を有する希釈と定義されている（Reed and Muench, 1938）。決定は、ウイルスタンパク質に結合する抗体のようなウイルスタンパク質の検出、およびＲＴ－ＰＣＲのような増幅方法によるウイルスＲＮＡのさらなる検出、あるいはそれらの検出に基づくものであってよい。核酸増幅方法による血漿中のウイルス粒子関連ウイルスＲＮＡのモニタリングは、レトロウイルス疾患の状態および進行を評価し、そして、予防および治療介入の効果を評価するためのパラメーターとして広く使用されている。例示的には、ウイルス負荷またはウイルス力価は、発症体液におけるウイルスの生存量、例えば血漿１ｍＬ当たりのＲＮＡコピー数を評価することにより算出し得る。
【0097】
「線毛運動障害」という用語は、当技術分野の当業者に周知である。気管の表面は、固有上皮細胞に被覆されており、前記細胞は、線毛と称する無数の運動性毛髪様構造に裏打ちされている。「線毛運動障害」という用語は、線毛の減少または損失および／または線毛活性の損失または部分的な損失を含む。線毛運動障害は、当技術分野の当業者によって、さらなる面倒なく決定し得る。
「ラ音」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。しかし、「ラ音」という用語は、気管ラ音を包含し、気管支から発する音を指す。ラ音は、容易に当技術分野の当業者により決定し得る。
「産卵低下」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。「産卵低下」という用語は、卵産生の減少を含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、処置または防止は、同一種の非処置対照群の対象と比較して、線毛運動障害の防止または低減をもたらす。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、処置または防止は、同一種の非処置対照群の対象と比較して、腎臓病変の防止または低減をもたらす。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、処置または防止は、同一種の非処置対照群の対象と比較して、産卵低下の防止または低減をもたらす。
本発明はさらに、治療的使用のための、本明細書に記載のウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンを提供する。
「ラ音」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。しかし、「ラ音」という用語は、気管ラ音を包含し、気管支から発する音を指す。ラ音は、容易に当技術分野の当業者により決定し得る。
「産卵低下」という用語は、当技術分野の当業者には周知である。「産卵低下」という用語は、卵産生の減少を含む。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、処置または防止は、同一種の非処置対照群の対象と比較して、線毛運動障害の防止または低減をもたらす。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、処置または防止は、同一種の非処置対照群の対象と比較して、腎臓病変の防止または低減をもたらす。
本発明による方法または使用の一の特定の態様では、処置または防止は、同一種の非処置対照群の対象と比較して、産卵低下の防止または低減をもたらす。
本発明はさらに、治療的使用のための、本明細書に記載のウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンを提供する。
【0098】
本発明はさらに、免疫原またはワクチンとして使用するための、本明細書に記載のウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンを提供する。
本発明はさらに、医薬として使用するための、本明細書に記載のウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンを提供する。
本発明はさらに、医薬の製造のための、本明細書に記載のウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンの使用を提供する。
本発明はさらに、対象におけるＩＢＶ感染の処置および／または防止のための、本明細書に記載のウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンの使用を提供する。
本発明はさらに、医薬として使用するための、本明細書に記載のウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンを提供する。
本発明はさらに、医薬の製造のための、本明細書に記載のウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンの使用を提供する。
本発明はさらに、対象におけるＩＢＶ感染の処置および／または防止のための、本明細書に記載のウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンの使用を提供する。
【0099】
条項
以下の条項も、本明細書において記載される。
１．Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来であり、アミノ酸２６７位がシステインである、トリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
２．アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
３．Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、限定的な細胞または組織指向性を有するＩＢＶ由来であり、アミノ酸２６７位がシステインである、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
４．アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
突然変異２６７
５．アミノ酸２６７位のシステインが突然変異により導入される、条項１または３のトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
６．突然変異がアミノ酸置換、欠失または挿入である、条項２、４または５のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
以下の条項も、本明細書において記載される。
１．Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来であり、アミノ酸２６７位がシステインである、トリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
２．アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
３．Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、限定的な細胞または組織指向性を有するＩＢＶ由来であり、アミノ酸２６７位がシステインである、ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
４．アミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異を含む、組換えＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
突然変異２６７
５．アミノ酸２６７位のシステインが突然変異により導入される、条項１または３のトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
６．突然変異がアミノ酸置換、欠失または挿入である、条項２、４または５のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
【0100】
７．アミノ酸２６７位の疎水性アミノ酸がシステインに突然変異される、またはアミノ酸２６７位のフェニルアラニンもしくはロイシンがシステインに突然変異される、条項２および４～６のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
拡張された細胞または組織指向性
８．アミノ酸２６７位のシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの前記突然変異が、トリコロナウイルスまたはＩＢＶの拡張された細胞または組織指向性に導く、条項１～７のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
９．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが、肺もしくは肝臓由来の初代ニワトリ胚細胞、または初代ニワトリ線維芽細胞、ニワトリ胚性線維芽細胞系、アヒル胚性幹細胞系、ヒト胚性腎臓細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系、ウサギ腎臓細胞系、イヌ腎臓細胞系、ニワトリ肝臓細胞系、ウシ腎臓細胞系、ブタ腎臓細胞系および昆虫細胞系からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系または細胞において感染および／または複製する、条項１～８のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
拡張された細胞または組織指向性
８．アミノ酸２６７位のシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの前記突然変異が、トリコロナウイルスまたはＩＢＶの拡張された細胞または組織指向性に導く、条項１～７のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
９．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが、肺もしくは肝臓由来の初代ニワトリ胚細胞、または初代ニワトリ線維芽細胞、ニワトリ胚性線維芽細胞系、アヒル胚性幹細胞系、ヒト胚性腎臓細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系、ウサギ腎臓細胞系、イヌ腎臓細胞系、ニワトリ肝臓細胞系、ウシ腎臓細胞系、ブタ腎臓細胞系および昆虫細胞系からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系または細胞において感染および／または複製する、条項１～８のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
【0101】
１０．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが、ＤＦ－１（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｆｏｓｔｅｒ）、ＥＢ６６（アヒル胚性幹細胞系）、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ（ＰＢＳ－１２無血清）、ＢＨＫ２１（ベビーハムスター腎臓）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚性腎臓）、Ｖｅｒｏ（Ｖｅｒｄａ Ｒｅｎｏ）、ＭＡ１０４、ＲＫ１３（ウサギ腎臓）、ＬＭＨ（レグホンオス肝細胞癌）、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）、ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙウシ腎臓）、ＰＫ１５（ブタ腎臓）、ＰＫ２Ａ（ブタ腎臓）、ＳＦ９、ＳＦ２１およびＳＦ＋（スポドプテラ・フルギペルダ）からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系において感染および／または複製する、条項１～９のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
１１．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが、ＤＦ－１、ＥＢ６６、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、ＭＡ１０４およびＲＫ１３からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系において感染および／または複製する、条項１～１０のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
アミノ酸２６７位の番号付け
１２．アミノ酸２６７位の番号付けが、ＩＢＶ Ｈ５２、ＩＢＶ Ｈ１２０またはＭ４１のスパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を指す、条項１～１１のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
１１．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが、ＤＦ－１、ＥＢ６６、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、ＭＡ１０４およびＲＫ１３からなるリストから選択される少なくとも１種の細胞系において感染および／または複製する、条項１～１０のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
アミノ酸２６７位の番号付け
１２．アミノ酸２６７位の番号付けが、ＩＢＶ Ｈ５２、ＩＢＶ Ｈ１２０またはＭ４１のスパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を指す、条項１～１１のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
【0102】
１３．アミノ酸２６７位の番号付けが、ＩＢＶ Ｈ５２のスパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を指す、条項１～１２のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
１４．アミノ酸２６７位の番号付けが、配列番号１に例示的に与えられるスパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を指す、条項１～１２のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
１５．配列番号１のアミノ酸配列が、スパイクタンパク質における位置番号付けを決定するのに使用される、条項１～１２のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
１６．スパイクタンパク質におけるアミノ２６７位を決定するために、アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列に対して整列される、条項１～１２のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
１７．アミノ酸２６７位がスパイクタンパク質のＳ１サブユニット内にある、条項１～１６のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
１４．アミノ酸２６７位の番号付けが、配列番号１に例示的に与えられるスパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を指す、条項１～１２のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
１５．配列番号１のアミノ酸配列が、スパイクタンパク質における位置番号付けを決定するのに使用される、条項１～１２のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
１６．スパイクタンパク質におけるアミノ２６７位を決定するために、アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列に対して整列される、条項１～１２のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
１７．アミノ酸２６７位がスパイクタンパク質のＳ１サブユニット内にある、条項１～１６のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
【0103】
１８．スパイクタンパク質が、以下の
－ ２６４がアスパラギンであり、かつ／または
－ ２６５がスレオニンであり、かつ／または
－ ２６９がロイシンであり、かつ／または
－ ２７１がアスパラギンであり、かつ／または
－ ２７２がフェニルアラニンである、
からなる群から選択されるアミノ酸のうち１種または複数を有する、条項１～１７のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
スパイク
１９．トリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片が、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）およびシチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ、シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）からなる群から選択される、条項１および２および５～１８のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
－ ２６４がアスパラギンであり、かつ／または
－ ２６５がスレオニンであり、かつ／または
－ ２６９がロイシンであり、かつ／または
－ ２７１がアスパラギンであり、かつ／または
－ ２７２がフェニルアラニンである、
からなる群から選択されるアミノ酸のうち１種または複数を有する、条項１～１７のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
スパイク
１９．トリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片が、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）およびシチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ、シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）からなる群から選択される、条項１および２および５～１８のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【0104】
２０．トリコロナウイルスがＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）である、条項１および２および５～１９のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
２１．スパイクタンパク質が、Ａｒｋａｎｓａｓ（Ａｒｋａｎｓａｓ９９など）、Ｂｒａｚｉｌ（ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３、ＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４など）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ１７３４／０４、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９９など）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ（Ｄｅｌａｗａｒｅ９８など）、Ｄｕｔｃｈ（Ｄ２０７、Ｄ２１２、Ｄ２７４、Ｄ３１２８、Ｄ３８９６、Ｄ８８８０、Ｄ１４６６など）、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｅｏｒｇｉａ（Ｇｅｏｒｇｉａ ＧＡ－０７、ＧＡ－０８、ＧＡ－１２、ＧＡ－１３など）、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｉｏｗａ（Ｉｏｗａ９７およびＩｏｗａ６９など）、Ｉｔａｌｙ０２、ＪＭＫ、ＬＤＴ３、Ｍａｉｎｅ（Ｍａｉｎｅ２０９など）、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈ１２０など、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅを除く）、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１２２０／９８、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｗｏｌｇ／９８など）、ＰＬ８４０８４、Ｑｕ（Ｑｕ－ｍｖなど）、ＱＸ（ＧＢ３４１／９６など）、Ｑ１、ＳＥ１７、バリアント２（ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６など）および４／９１（７９３Ｂ、ＣＲ８８）からなるリストから選択される遺伝子型または血清型または株を有するＩＢＶ由来である、条項３～２０のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２１．スパイクタンパク質が、Ａｒｋａｎｓａｓ（Ａｒｋａｎｓａｓ９９など）、Ｂｒａｚｉｌ（ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３、ＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４など）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ１７３４／０４、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９９など）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ（Ｄｅｌａｗａｒｅ９８など）、Ｄｕｔｃｈ（Ｄ２０７、Ｄ２１２、Ｄ２７４、Ｄ３１２８、Ｄ３８９６、Ｄ８８８０、Ｄ１４６６など）、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｅｏｒｇｉａ（Ｇｅｏｒｇｉａ ＧＡ－０７、ＧＡ－０８、ＧＡ－１２、ＧＡ－１３など）、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｉｏｗａ（Ｉｏｗａ９７およびＩｏｗａ６９など）、Ｉｔａｌｙ０２、ＪＭＫ、ＬＤＴ３、Ｍａｉｎｅ（Ｍａｉｎｅ２０９など）、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈ１２０など、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅを除く）、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１２２０／９８、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｗｏｌｇ／９８など）、ＰＬ８４０８４、Ｑｕ（Ｑｕ－ｍｖなど）、ＱＸ（ＧＢ３４１／９６など）、Ｑ１、ＳＥ１７、バリアント２（ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６など）および４／９１（７９３Ｂ、ＣＲ８８）からなるリストから選択される遺伝子型または血清型または株を有するＩＢＶ由来である、条項３～２０のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0105】
２２．スパイクタンパク質がＢｅａｕｄｅｔｔｅ株由来でない、条項３～２１のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２３．スパイクタンパク質またはその断片が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ｉｔａｌｙ０２、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＬＤＴ３、ＰＬ８４０８４、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３～２２のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２４．スパイクタンパク質またはその断片が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ａｒｋａｎｓａｓ、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３～２３のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２５．スパイクタンパク質またはその断片が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）および４／９１からなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３～２４のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２３．スパイクタンパク質またはその断片が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ｉｔａｌｙ０２、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＬＤＴ３、ＰＬ８４０８４、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３～２２のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２４．スパイクタンパク質またはその断片が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ａｒｋａｎｓａｓ、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３～２３のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２５．スパイクタンパク質またはその断片が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）および４／９１からなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３～２４のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0106】
２６．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株が、Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｓｐａｉｎ／９８／３０８、ＩＢＭＡ５－１、ＳＤ／９７／０１、Ｓｐａｉｎ／９６／３３４およびＭ４１－Ｍ２１８８３からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２７．４／９１株が、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２８．ＱＸ株が、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３、ＳＰ２０１３－０１４７０、ＳＰ２０１３－０１４１７１、ＳＰ２０１３－０１４７８およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２７．４／９１株が、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
２８．ＱＸ株が、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３、ＳＰ２０１３－０１４７０、ＳＰ２０１３－０１４１７１、ＳＰ２０１３－０１４７８およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0107】
２９．Ｑ１株が、ＣＫ／ＣＨ／ＬＤＬ／９８Ｉ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＳＤ／０８－１０、Ｊ２、Ｑ１、ＡＲ０８ＥＲ２２、ＡＲ０８ＢＡ２１、１２．１８５、１２．１２４、１２．２１６およびＣｈｉｌｅ－２９５－１０からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３０．Ａｒｋａｎｓａｓ株が、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３１．Ｉｔａｌｙ０２株が、Ｓｐａｉｎ／９９／３１６、Ｉｔａｌｙ－０２、ＵＫ－Ｌ６３３－０４、Ｉｔ－４９７－０２、Ｓｐａｉｎ／０５／８６６、Ｓｐａｉｎ／０４／２２１、Ｓｐａｉｎ／００／３３７、Ｓｐａｉｎ／１５５／０９およびＳｐａｉｎ／０３／０８を含むリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３２．バリアント２株が、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６、Ｅｇ／ＣＬＥＶＢ－２／ＩＢＶ／０１２、Ｄ１３４４／２／４／１０＿ＥＧ、ＴＲ８およびＩＢ ＶＡＲ２－０６からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３０．Ａｒｋａｎｓａｓ株が、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３１．Ｉｔａｌｙ０２株が、Ｓｐａｉｎ／９９／３１６、Ｉｔａｌｙ－０２、ＵＫ－Ｌ６３３－０４、Ｉｔ－４９７－０２、Ｓｐａｉｎ／０５／８６６、Ｓｐａｉｎ／０４／２２１、Ｓｐａｉｎ／００／３３７、Ｓｐａｉｎ／１５５／０９およびＳｐａｉｎ／０３／０８を含むリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３２．バリアント２株が、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６、Ｅｇ／ＣＬＥＶＢ－２／ＩＢＶ／０１２、Ｄ１３４４／２／４／１０＿ＥＧ、ＴＲ８およびＩＢ ＶＡＲ２－０６からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0108】
３３．Ｂｒａｚｉｌ株が、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３、およびＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４からなるリストから選択される、条項２４のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３４．スパイクタンパク質またはその断片が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）、４／９１またはＱＸ遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である、条項３～２４のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３５．ＩＢＶ株が、Ｈ５２、Ｈ１２０、ＱＸ ＳＰ２０１３－０１４７８またはＣＲ８８である、条項３～２４のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３６．ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示されるアミノ酸配列、またはこれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％もしくは９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはそれを含む、条項３～３５のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３４．スパイクタンパク質またはその断片が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）、４／９１またはＱＸ遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である、条項３～２４のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３５．ＩＢＶ株が、Ｈ５２、Ｈ１２０、ＱＸ ＳＰ２０１３－０１４７８またはＣＲ８８である、条項３～２４のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３６．ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示されるアミノ酸配列、またはこれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％もしくは９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはそれを含む、条項３～３５のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0109】
３７．ＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片が、ＧＩ－２～２７、ＧＩＩ－１、ＧＩＩＩ－１、ＧＩＶ－１、ＧＶ－１、ＧＶＩ－１からなる遺伝子型のリストから選択される、条項３～３６のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３８．スパイクタンパク質またはその断片がＧＩ－１遺伝子型由来でない、条項３～３７のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３９．限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来のＳ１サブユニットの前記少なくとも一部が、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）およびシチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ、シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）からなる群から選択される、条項１および５～３８のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
４０．限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来のＳ１サブユニットの前記少なくとも一部が、ＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）由来である、条項１および５～３８のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
３８．スパイクタンパク質またはその断片がＧＩ－１遺伝子型由来でない、条項３～３７のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
３９．限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来のＳ１サブユニットの前記少なくとも一部が、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ホロホロチョウコロナウイルス（ＧｆＣｏＶ）およびシチメンチョウコロナウイルス（ＴＣｏＶ、シチメンチョウ腸炎ウイルスおよびブルーコム病ウイルス）からなる群から選択される、条項１および５～３８のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
４０．限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルス由来のＳ１サブユニットの前記少なくとも一部が、ＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）由来である、条項１および５～３８のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
【0110】
４１．Ｓ１サブユニットの前記少なくとも一部が、Ａｒｋａｎｓａｓ（Ａｒｋａｎｓａｓ９９など）、Ｂｒａｚｉｌ（ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３、ＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４など）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ１７３４／０４、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９９など）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ（Ｄｅｌａｗａｒｅ９８など）、Ｄｕｔｃｈ（Ｄ２０７、Ｄ２１２、Ｄ２７４、Ｄ３１２８、Ｄ３８９６、Ｄ８８８０、Ｄ１４６６など）、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｅｏｒｇｉａ（Ｇｅｏｒｇｉａ ＧＡ－０７、ＧＡ－０８、ＧＡ－１２、ＧＡ－１３など）、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｉｏｗａ（Ｉｏｗａ９７およびＩｏｗａ６９など）、Ｉｔａｌｙ０２、ＪＭＫ、ＬＤＴ３、Ｍａｉｎｅ（Ｍａｉｎｅ２０９など）、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈ１２０など、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅを除く）、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１２２０／９８、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｗｏｌｇ／９８など）、ＰＬ８４０８４、Ｑｕ（Ｑｕ－ｍｖなど）、ＱＸ（ＧＢ３４１／９６など）、Ｑ１、ＳＥ１７、バリアント２（ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６など）および４／９１（７９３Ｂ、ＣＲ８８）からなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３および５～４０のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0111】
４２．Ｓ１サブユニットの前記少なくとも一部が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ｉｔａｌｙ０２、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＬＤＴ３、ＰＬ８４０８４、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型または株のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３および５～４１のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
４３．Ｓ１サブユニットの前記少なくとも一部が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ａｒｋａｎｓａｓ、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３および５～４１のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
４３．Ｓ１サブユニットの前記少なくとも一部が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ａｒｋａｎｓａｓ、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３および５～４１のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0112】
４４．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株が、Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｓｐａｉｎ／９８／３０８、ＩＢＭＡ５－１、ＳＤ／９７／０１、Ｓｐａｉｎ／９６／３３４およびＭ４１－Ｍ２１８８３からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
４５．４／９１株が、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
４６．ＱＸ株が、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
４５．４／９１株が、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
４６．ＱＸ株が、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0113】
４７．Ｑ１株が、ＣＫ／ＣＨ／ＬＤＬ／９８Ｉ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＳＤ／０８－１０、Ｊ２、Ｑ１、ＡＲ０８ＥＲ２２、ＡＲ０８ＢＡ２１およびＣｈｉｌｅ－２９５－１０からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
４８．Ａｒｋａｎｓａｓ株が、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
４８．Ａｒｋａｎｓａｓ株が、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0114】
４９．バリアント２株が、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６、Ｅｇ／ＣＬＥＶＢ－２／ＩＢＶ／０１２、Ｄ１３４４／２／４／１０＿ＥＧ、ＴＲ８およびＩＢ ＶＡＲ２－０６からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
５０．Ｂｒａｚｉｌ株が、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３およびＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
５１．Ｓ１サブユニットの前記少なくとも一部が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）、ＱＸおよび４／９１からなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３および５～４３のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
５２．Ｓ１サブユニットの前記少なくとも一部が、ＩＢＶ株Ｈ１２０、Ｈ５２、ＱＸ ＳＰ２０１３－０１４７８またはＣＲ８８由来である、条項３および５～４３のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
５０．Ｂｒａｚｉｌ株が、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３およびＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４からなるリストから選択される、条項４３のＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
５１．Ｓ１サブユニットの前記少なくとも一部が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｂｅａｕｄｅｔｔｅでない）、ＱＸおよび４／９１からなる遺伝子型または血清型のリストから選択されるＩＢＶ由来である、条項３および５～４３のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
５２．Ｓ１サブユニットの前記少なくとも一部が、ＩＢＶ株Ｈ１２０、Ｈ５２、ＱＸ ＳＰ２０１３－０１４７８またはＣＲ８８由来である、条項３および５～４３のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0115】
５３．Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスまたはＩＢＶのＳ１サブユニット配列、またはこれらに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列由来の少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００もしくは５００個の連続するアミノ酸である、条項１および３および５～５２のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片。
５４．Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、条項３６～５０のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶのＳ１サブユニット配列、またはこれらに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列由来の少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００もしくは５００個の連続するアミノ酸である、条項１および３および５～５２のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
５５．限定的な細胞または組織指向性を有するＩＢＶ由来のＳ１サブユニットの前記少なくとも一部が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示されるアミノ酸配列、またはこれらに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列の少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００もしくは５００個の連続するアミノ酸を有する、条項３および５～５２のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
５４．Ｓ１サブユニットの少なくとも一部が、条項３６～５０のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶのＳ１サブユニット配列、またはこれらに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列由来の少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００もしくは５００個の連続するアミノ酸である、条項１および３および５～５２のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
５５．限定的な細胞または組織指向性を有するＩＢＶ由来のＳ１サブユニットの前記少なくとも一部が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示されるアミノ酸配列、またはこれらに対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する配列の少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００もしくは５００個の連続するアミノ酸を有する、条項３および５～５２のいずれか１つのＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片。
【0116】
５６．限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスまたはＩＢＶが、胚含有鶏卵および／または初代ニワトリ腎臓細胞における感染および／または複製に限定される、条項１および３および５～５５のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
５７．限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスまたはＩＢＶが、ＥＢ６６細胞においては感染および／または複製しない、条項１および３および５～５６のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
５８．限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスまたはＩＢＶが、ＰＢＳ－１２および／またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞においては感染および／または複製しない、条項１および３および５～５６のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
断片
５９．トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片が、少なくとも５００、７５０、１０００または１０７７アミノ酸の長さを有する、条項１～５８のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
５７．限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスまたはＩＢＶが、ＥＢ６６細胞においては感染および／または複製しない、条項１および３および５～５６のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
５８．限定的な細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスまたはＩＢＶが、ＰＢＳ－１２および／またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞においては感染および／または複製しない、条項１および３および５～５６のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
断片
５９．トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片が、少なくとも５００、７５０、１０００または１０７７アミノ酸の長さを有する、条項１～５８のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
【0117】
６０．トリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質の断片が、少なくとも１０００アミノ酸の長さを有する、条項１～５９のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質またはそれらの断片。
６１．アミノ酸２６７位のシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異が遺伝的に安定である、条項１～６０のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質。
６２．条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列。
６３．条項６２のヌクレオチド配列を含むプラスミド。
６４．条項６３のプラスミドを含む細胞。
６５．条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質またはその断片を含むウイルス粒子。
６６．条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質またはその断片を含むトリコロナウイルス。
６１．アミノ酸２６７位のシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの突然変異が遺伝的に安定である、条項１～６０のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶスパイクタンパク質。
６２．条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列。
６３．条項６２のヌクレオチド配列を含むプラスミド。
６４．条項６３のプラスミドを含む細胞。
６５．条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質またはその断片を含むウイルス粒子。
６６．条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質またはその断片を含むトリコロナウイルス。
【0118】
６７．条項３～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質を含むＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）。
６８．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが弱毒化されている、条項６６または６７のトリコロナウイルスまたはＩＢＶ。
６９．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが遺伝子操作されている、条項６６～６８のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶ。
７０．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが組換え体である、条項６６～６９のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶ。
７１．トリコロナウイルスまたはＩＢＶがキメラである、条項６６～７０のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶ。
６８．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが弱毒化されている、条項６６または６７のトリコロナウイルスまたはＩＢＶ。
６９．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが遺伝子操作されている、条項６６～６８のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶ。
７０．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが組換え体である、条項６６～６９のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶ。
７１．トリコロナウイルスまたはＩＢＶがキメラである、条項６６～７０のいずれか１つのトリコロナウイルスまたはＩＢＶ。
【0119】
７２．ＩＢＶが、Ａｒｋａｎｓａｓ（Ａｒｋａｎｓａｓ９９など）、Ｂｒａｚｉｌ（ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３、ＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４など）、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ１７３４／０４、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ９９など）、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、Ｄｅｌａｗａｒｅ（Ｄｅｌａｗａｒｅ９８など）、Ｄｕｔｃｈ（Ｄ２０７、Ｄ２１２、Ｄ２７４、Ｄ３１２８、Ｄ３８９６、Ｄ８８８０、Ｄ１４６６など）、Ｆｌｏｒｉｄａ、Ｇｅｏｒｇｉａ（Ｇｅｏｒｇｉａ ＧＡ－０７、ＧＡ－０８、ＧＡ－１２、ＧＡ－１３など）、Ｇｒａｙ、Ｈｏｌｔｅ、Ｉｏｗａ（Ｉｏｗａ９７およびＩｏｗａ６９など）、Ｉｔａｌｙ０２、ＪＭＫ、ＬＤＴ３、Ｍａｉｎｅ（Ｍａｉｎｅ２０９など）、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ（Ｍ４１、Ｈ５２、Ｈ１２０、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ）、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１２２０／９８、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｗｏｌｇ／９８など）、ＰＬ８４０８４、Ｑｕ（Ｑｕ－ｍｖなど）、ＱＸ（ＧＢ３４１／９６など）、Ｑ１、ＳＥ１７、バリアント２（ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６など）および４／９１（７９３Ｂ、ＣＲ８８）からなる株のリストから選択される遺伝子型を有するＩＢＶ由来である、条項６７～７１のいずれか１つのＩＢＶ。
７３．ＩＢＶが、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ｉｔａｌｙ０２、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＬＤＴ３、ＰＬ８４０８４、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択される、条項６７～７２のいずれか１つのＩＢＶ。
７３．ＩＢＶが、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ｉｔａｌｙ０２、Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｃｏｎｎｅｔｉｃｕｔ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＬＤＴ３、ＰＬ８４０８４、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択される、条項６７～７２のいずれか１つのＩＢＶ。
【0120】
７４．ＩＢＶが、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、４／９１、ＱＸ、Ｑ１、Ａｒｋａｎｓａｓ、バリアント２およびＢｒａｚｉｌからなる遺伝子型または血清型のリストから選択される、条項６７～７３のいずれか１つのＩＢＶ。
７５．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株が、Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｓｐａｉｎ／９８／３０８、ＩＢＭＡ５－１、ＳＤ／９７／０１、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ、Ｓｐａｉｎ／９６／３３４およびＭ４１－Ｍ２１８８３からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
７６．４／９１株が、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
７７．ＱＸ株が、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
７５．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ株が、Ｈ１２０、Ｈ５２、Ｓｐａｉｎ／９８／３０８、ＩＢＭＡ５－１、ＳＤ／９７／０１、Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ、Ｓｐａｉｎ／９６／３３４およびＭ４１－Ｍ２１８８３からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
７６．４／９１株が、Ｓｐａｉｎ／９８／３２８、Ｓｐａｉｎ／９２／３５、ＩＲ－３６５４－ＶＭ、ＦＲ－ＣＲ８８０６１－８８、ＦＲ－８５１３１－８５、ＵＫ－１２３３－９５、ＵＫ／３／９１、Ｓｐａｉｎ／００／３３６、ＵＫ／７／９１、４／９１－病原性、４／９１弱毒化およびＩＢ４－９１からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
７７．ＱＸ株が、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｔ－０５、ＦＲ－Ｌ１４５０Ｌ－０５、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｔ－０４、ＮＬ－Ｌ１４４９Ｋ－０４、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／１７０／０９、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／７９／０８、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＳＰ／２４８／０９、ＨＢＮ、ＩＢＶＱＸ、ＬＸ４、ＢＪＱ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＧＤ／０３およびＧＢ３４１／９６からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
【0121】
７８．Ｑ１株が、ＣＫ／ＣＨ／ＬＤＬ／９８Ｉ、ＣＫ／ＣＨ／ＬＳＤ／０８－１０、Ｊ２、Ｑ１、ＡＲ０８ＥＲ２２、ＡＲ０８ＢＡ２１およびＣｈｉｌｅ－２９５－１０からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
７９．Ｉｔａｌｙ０２株が、Ｓｐａｉｎ／９９／３１６、Ｉｔａｌｙ－０２、ＵＫ－Ｌ６３３－０４、Ｉｔ－４９７－０２、Ｓｐａｉｎ／０５／８６６、Ｓｐａｉｎ／０４／２２１、Ｓｐａｉｎ／００／３３７、Ｓｐａｉｎ／１５５／０９およびＳｐａｉｎ／０３／０８からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
８０．Ａｒｋａｎｓａｓ株が、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
８１．バリアント２株が、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６、Ｅｇ／ＣＬＥＶＢ－２／ＩＢＶ／０１２、Ｄ１３４４／２／４／１０＿ＥＧ、ＴＲ８およびＩＢ ＶＡＲ２－０６からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
８２．Ｂｒａｚｉｌ株が、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３およびＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
８３．スパイクタンパク質またはその断片が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓまたは４／９１遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である、条項６７～７４のいずれか１つのＩＢＶ。
７９．Ｉｔａｌｙ０２株が、Ｓｐａｉｎ／９９／３１６、Ｉｔａｌｙ－０２、ＵＫ－Ｌ６３３－０４、Ｉｔ－４９７－０２、Ｓｐａｉｎ／０５／８６６、Ｓｐａｉｎ／０４／２２１、Ｓｐａｉｎ／００／３３７、Ｓｐａｉｎ／１５５／０９およびＳｐａｉｎ／０３／０８からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
８０．Ａｒｋａｎｓａｓ株が、Ａｒｋ９９、ＡｒｋＧＡ、ＡｒｋＤＰＩ、ＡＬ／５３６４／００、ＡＲＫＤＰＩ１１、ＡＬ／０８０３／０１、ＡＬ／７１４９／００、ＡｒｋＤＰＩ１０１、ＡＬ／１２２１／０１、ＡＬ／１７９３／０１およびＡＬ／４６１４／９８からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
８１．バリアント２株が、ＩＳ／１４９４／０６、ＩＢＶ／Ｃｋ／ＥＧ／ＣＵ／４／２０１４、ガンマＣｏＶ／Ｃｋ／Ｐｏｌａｎｄ／Ｇ０５２／２０１６、Ｅｇ／ＣＬＥＶＢ－２／ＩＢＶ／０１２、Ｄ１３４４／２／４／１０＿ＥＧ、ＴＲ８およびＩＢ ＶＡＲ２－０６からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
８２．Ｂｒａｚｉｌ株が、ＢＲ－１、ＢＲ－２、２３／２０１３およびＩＢＶ／Ｂｒａｓｉｌ／３５１／１９８４からなるリストから選択される、条項７４のＩＢＶ。
８３．スパイクタンパク質またはその断片が、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓまたは４／９１遺伝子型または血清型のＩＢＶ由来である、条項６７～７４のいずれか１つのＩＢＶ。
【0122】
８４．ＩＢＶ株がＨ１２０、Ｈ５２またはＣＲ８８である、条項６７～７４のいずれか１つのＩＢＶ。
８５．ＩＢＶが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示されるアミノ酸配列、またはこれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％もしくは９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはそれを含むＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片を有する、条項６７～８４のいずれか１つのＩＢＶ。
８６．ＩＢＶが拡張された細胞または組織指向性を有する、条項６７～８５のいずれか１つのＩＢＶ。
８７．ＩＢＶが、条項９～１１のいずれか１つの少なくとも１種の細胞系または細胞において感染および／または複製する、条項６７～８６のいずれか１つのＩＢＶ。
８８．
－ 条項６５のウイルス粒子、または
－ 条項６６～８７のいずれか１つのトリコロナウイルスもしくはＩＢＶ
を含む細胞。
８５．ＩＢＶが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、７７に示されるアミノ酸配列、またはこれらに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％もしくは９９．９９％の配列同一性を有する配列からなるか、またはそれを含むＩＢＶスパイクタンパク質またはその断片を有する、条項６７～８４のいずれか１つのＩＢＶ。
８６．ＩＢＶが拡張された細胞または組織指向性を有する、条項６７～８５のいずれか１つのＩＢＶ。
８７．ＩＢＶが、条項９～１１のいずれか１つの少なくとも１種の細胞系または細胞において感染および／または複製する、条項６７～８６のいずれか１つのＩＢＶ。
８８．
－ 条項６５のウイルス粒子、または
－ 条項６６～８７のいずれか１つのトリコロナウイルスもしくはＩＢＶ
を含む細胞。
【0123】
８９．細胞が、初代ニワトリ胚細胞、ニワトリ胚性線維芽細胞系、アヒル胚性幹細胞系、ヒト胚性腎臓細胞系、ベビーハムスター腎臓細胞系、アフリカミドリザル腎臓細胞系、ウサギ腎臓細胞系、イヌ腎臓細胞系、ニワトリ肝臓細胞系、ウシ腎臓細胞系、ブタ腎臓細胞系および昆虫細胞系からなるリストから選択される細胞系または細胞である、条項８８の細胞。
９０．細胞が、ＤＦ－１（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｆｏｓｔｅｒ）、ＥＢ６６（アヒル胚性幹細胞系）、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ（ＰＢＳ－１２無血清）、ＢＨＫ２１（ベビーハムスター腎臓）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚性腎臓）、Ｖｅｒｏ（Ｖｅｒｄａ Ｒｅｎｏ）、ＭＡ１０４、ＲＫ１３（ウサギ腎臓）、ＬＭＨ（レグホンオス肝細胞癌）、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）、ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙウシ腎臓）、ＰＫ１５（ブタ腎臓）、ＰＫ２Ａ（ブタ腎臓）、ＳＦ９、ＳＦ２１およびＳＦ＋（スポドプテラ・フルギペルダ）からなるリストから選択される細胞系である、条項８８または８９の細胞。
９１．細胞が、ＤＦ－１、ＥＢ６６、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、ＭＡ１０４およびＲＫ１３からなるリストから選択される細胞系である、条項８８または８９の細胞。
９０．細胞が、ＤＦ－１（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｆｏｓｔｅｒ）、ＥＢ６６（アヒル胚性幹細胞系）、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ（ＰＢＳ－１２無血清）、ＢＨＫ２１（ベビーハムスター腎臓）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚性腎臓）、Ｖｅｒｏ（Ｖｅｒｄａ Ｒｅｎｏ）、ＭＡ１０４、ＲＫ１３（ウサギ腎臓）、ＬＭＨ（レグホンオス肝細胞癌）、ＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙイヌ腎臓）、ＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ－Ｄａｒｂｙウシ腎臓）、ＰＫ１５（ブタ腎臓）、ＰＫ２Ａ（ブタ腎臓）、ＳＦ９、ＳＦ２１およびＳＦ＋（スポドプテラ・フルギペルダ）からなるリストから選択される細胞系である、条項８８または８９の細胞。
９１．細胞が、ＤＦ－１、ＥＢ６６、ＰＢＳ－１２、ＰＢＳ－１２ＳＦ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｖｅｒｏ、ＭＡ１０４およびＲＫ１３からなるリストから選択される細胞系である、条項８８または８９の細胞。
【0124】
９２．初代ニワトリ胚細胞が、線維芽細胞、または肝臓もしくは肺組織由来の細胞である、条項８９の細胞。
９３．
－ 条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質、または
－ 条項６５のウイルス粒子、または
－ 条項６６～８７のいずれか１つのトリコロナウイルスもしくはＩＢＶ
を含む免疫原性組成物。
９４．
－ 条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質、または
－ 条項６５のウイルス粒子、または
－ 条項６６～８７のいずれか１つのコロナウイルスもしくはＩＢＶ
を含むワクチン。
９５．
－ 条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質、または
－ 条項６５のウイルス粒子、または
－ 条項６６～８７のいずれか１つのコロナウイルスもしくはＩＢＶ
を含む、拡張された細胞または組織指向性を有する改変された生ワクチン。
９３．
－ 条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質、または
－ 条項６５のウイルス粒子、または
－ 条項６６～８７のいずれか１つのトリコロナウイルスもしくはＩＢＶ
を含む免疫原性組成物。
９４．
－ 条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質、または
－ 条項６５のウイルス粒子、または
－ 条項６６～８７のいずれか１つのコロナウイルスもしくはＩＢＶ
を含むワクチン。
９５．
－ 条項１～６１のいずれか１つのスパイクタンパク質、または
－ 条項６５のウイルス粒子、または
－ 条項６６～８７のいずれか１つのコロナウイルスもしくはＩＢＶ
を含む、拡張された細胞または組織指向性を有する改変された生ワクチン。
【0125】
９６．免疫原性組成物またはワクチンが、薬学的に許容される担体を含む、条項９３～９５のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
９７．薬学的に許容される担体がリン酸緩衝食塩水である、条項９６の免疫原性組成物またはワクチン。
９８．免疫原性組成物またはワクチンが、それを必要とする対象においてＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候の処置および／または予防に有効である、条項９３～９７のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
９９．免疫原性組成物またはワクチンが、１～１０ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項９３～９８のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
１００．免疫原性組成物またはワクチンが、２～５ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項９３～９９のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
１０１．免疫原性組成物またはワクチンが、２～４ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項９３～１００のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
９７．薬学的に許容される担体がリン酸緩衝食塩水である、条項９６の免疫原性組成物またはワクチン。
９８．免疫原性組成物またはワクチンが、それを必要とする対象においてＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候の処置および／または予防に有効である、条項９３～９７のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
９９．免疫原性組成物またはワクチンが、１～１０ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項９３～９８のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
１００．免疫原性組成物またはワクチンが、２～５ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項９３～９９のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
１０１．免疫原性組成物またはワクチンが、２～４ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項９３～１００のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
【0126】
１０２．条項１～６１のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、トリコロナウイルスの細胞または組織指向性を変化させるための方法。
１０３．条項１～６１のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、トリコロナウイルスの細胞または組織指向性を拡張させるための方法。
１０４．条項１～６１のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、拡張された細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスの生成または製造のための方法。
１０５．条項１～６１のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、細胞または組織培養物においてトリコロナウイルスを培養するための方法。
１０６．前記トリコロナウイルスのスパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を改変するステップを含む、トリコロナウイルスを改変するための方法。
１０３．条項１～６１のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、トリコロナウイルスの細胞または組織指向性を拡張させるための方法。
１０４．条項１～６１のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、拡張された細胞または組織指向性を有するトリコロナウイルスの生成または製造のための方法。
１０５．条項１～６１のいずれか１つのトリコロナウイルススパイクタンパク質またはその断片の使用を含む、細胞または組織培養物においてトリコロナウイルスを培養するための方法。
１０６．前記トリコロナウイルスのスパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を改変するステップを含む、トリコロナウイルスを改変するための方法。
【0127】
１０７．
ａ）トリコロナウイルススパイクヌクレオチドまたはタンパク質配列を用意するステップ、
ｂ）参照配列との整列化により、スパイクタンパク質における２６７位を特定するステップ、
ｃ）ステップｂ）のスパイクタンパク質の２６７位をシステインに突然変異させるステップ、
ｄ）ステップｃ）の突然変異されたスパイクタンパク質を得るステップ
を含む、トリコロナウイルススパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を突然変異させるための方法。
１０８．スパイクタンパク質またはその断片がアミノ酸２６７位にシステインを有する、条項１０２～１０６のいずれか１つの方法。
１０９．アミノ酸２６７位のシステインが突然変異により導入される、条項１０６～１０８のいずれか１つの方法。
１１０．突然変異がアミノ酸置換、欠失または挿入である、条項１０９の方法。
１１１．フェニルアラニンまたはロイシンが、２６７位のアミノ酸においてシステインに改変または突然変異される、条項１０６～１１１のいずれか１つの方法。
１１２．トリコロナウイルスが、条項６７～８７のいずれか１つのＩＢＶである、条項１０２～１１１のいずれか１つの方法。
ａ）トリコロナウイルススパイクヌクレオチドまたはタンパク質配列を用意するステップ、
ｂ）参照配列との整列化により、スパイクタンパク質における２６７位を特定するステップ、
ｃ）ステップｂ）のスパイクタンパク質の２６７位をシステインに突然変異させるステップ、
ｄ）ステップｃ）の突然変異されたスパイクタンパク質を得るステップ
を含む、トリコロナウイルススパイクタンパク質におけるアミノ酸２６７位を突然変異させるための方法。
１０８．スパイクタンパク質またはその断片がアミノ酸２６７位にシステインを有する、条項１０２～１０６のいずれか１つの方法。
１０９．アミノ酸２６７位のシステインが突然変異により導入される、条項１０６～１０８のいずれか１つの方法。
１１０．突然変異がアミノ酸置換、欠失または挿入である、条項１０９の方法。
１１１．フェニルアラニンまたはロイシンが、２６７位のアミノ酸においてシステインに改変または突然変異される、条項１０６～１１１のいずれか１つの方法。
１１２．トリコロナウイルスが、条項６７～８７のいずれか１つのＩＢＶである、条項１０２～１１１のいずれか１つの方法。
【0128】
１１３．コロナウイルススパイクタンパク質が、条項３～６１のいずれか１つのＩＢＶ（感染性気管支炎ウイルス）スパイクタンパク質である、条項１０２～１１２のいずれか１つの方法。
１１４．アミノ酸２６７位のシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの前記突然変異が、拡張された細胞または組織指向性に導く、条項１０２～１１３のいずれか１つの方法。
１１５．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが、条項９～１１のいずれか１つの少なくとも１種の細胞系または細胞において感染および／または複製する、条項１０２～１１４のいずれか１つの方法。
１１６．アミノ酸２６７位の番号付けが、条項１２～１８のいずれか１つに従って行われる、条項１０６～１１５のいずれか１つの方法。
キット条項
１１７．条項６５～８８および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンを含むキット。
１１４．アミノ酸２６７位のシステインまたはアミノ酸２６７位におけるシステインへの前記突然変異が、拡張された細胞または組織指向性に導く、条項１０２～１１３のいずれか１つの方法。
１１５．トリコロナウイルスまたはＩＢＶが、条項９～１１のいずれか１つの少なくとも１種の細胞系または細胞において感染および／または複製する、条項１０２～１１４のいずれか１つの方法。
１１６．アミノ酸２６７位の番号付けが、条項１２～１８のいずれか１つに従って行われる、条項１０６～１１５のいずれか１つの方法。
キット条項
１１７．条項６５～８８および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンを含むキット。
【0129】
１１８．キットが、トリの疾患の処置および／もしくは予防のための使用説明書、または家禽類の疾患の処置および／もしくは予防のための使用説明書、またはＩＢの処置および／もしくは予防のための使用説明書をさらに含む、条項１１７のキット。
１１９．キットが、前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサーをさらに含む、条項１１７または１１８のキット。
処置方法条項
１２０．条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、そのような対象を免疫化するための方法。
１２１．それを必要とする対象においてＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、治療有効量の条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、方法。
１２２．それを必要とする対象において、同じ種の免疫化されていない対照群の対象と比較して線毛運動障害を低減させる方法であって、治療有効量の条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、方法。
１２３．対象を免疫化するための方法であって、治療有効量の前記免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、方法において使用するための、条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
１１９．キットが、前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサーをさらに含む、条項１１７または１１８のキット。
処置方法条項
１２０．条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、そのような対象を免疫化するための方法。
１２１．それを必要とする対象においてＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、治療有効量の条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、方法。
１２２．それを必要とする対象において、同じ種の免疫化されていない対照群の対象と比較して線毛運動障害を低減させる方法であって、治療有効量の条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、方法。
１２３．対象を免疫化するための方法であって、治療有効量の前記免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、方法において使用するための、条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
【0130】
１２４．それを必要とする対象においてＩＢＶにより引き起こされる臨床徴候を処置または防止する方法であって、治療有効量の前記免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、方法において使用するための、条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
１２５．それを必要とする対象において、同じ種の免疫化されていない対照群の対象と比較して線毛運動障害を低減させる方法であって、治療有効量の前記免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、方法において使用するための、条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
１２６．前記対象がトリである、条項１２０～１２５のいずれか１つの方法または使用。
１２７．前記対象が家禽類である、条項１２０～１２６のいずれか１つの方法または使用。
１２８．前記対象が、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、またはキジからなるリストから選択される、条項１２０～１２７のいずれか１つの方法または使用。
１２９．前記対象がニワトリである、条項１２０～１２８のいずれか１つの方法または使用。
１２５．それを必要とする対象において、同じ種の免疫化されていない対照群の対象と比較して線毛運動障害を低減させる方法であって、治療有効量の前記免疫原性組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含む、方法において使用するための、条項９３～１０１のいずれか１つの免疫原性組成物またはワクチン。
１２６．前記対象がトリである、条項１２０～１２５のいずれか１つの方法または使用。
１２７．前記対象が家禽類である、条項１２０～１２６のいずれか１つの方法または使用。
１２８．前記対象が、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、またはキジからなるリストから選択される、条項１２０～１２７のいずれか１つの方法または使用。
１２９．前記対象がニワトリである、条項１２０～１２８のいずれか１つの方法または使用。
【0131】
１３０．免疫原性組成物またはワクチンが１回投与される、条項１２０～１２９のいずれか１つの方法または使用。
１３１．免疫原性組成物またはワクチンが２回以上の用量で投与される、条項１２０～１２９のいずれか１つの方法または使用。
１３２．前記免疫原性組成物またはワクチンが、皮下に、筋肉内に、経口で、卵内に、噴霧により、飲料水により、または点眼により投与される、条項１２０～１３１のいずれか１つの方法または使用。
１３３．前記免疫原性組成物またはワクチンが点眼により投与される、条項１２０～１３２のいずれか１つの方法または使用。
１３４．免疫原性組成物またはワクチンが、用量１回あたり１～１０ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項１２０～１３３のいずれか１つの方法または使用。
１３５．免疫原性組成物またはワクチンが、用量１回あたり２～５ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項１２０～１３４のいずれか１つの方法または使用。
１３６．免疫原性組成物またはワクチンが、用量１回あたり２～４ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項１２０～１３５のいずれか１つの方法または使用。
１３１．免疫原性組成物またはワクチンが２回以上の用量で投与される、条項１２０～１２９のいずれか１つの方法または使用。
１３２．前記免疫原性組成物またはワクチンが、皮下に、筋肉内に、経口で、卵内に、噴霧により、飲料水により、または点眼により投与される、条項１２０～１３１のいずれか１つの方法または使用。
１３３．前記免疫原性組成物またはワクチンが点眼により投与される、条項１２０～１３２のいずれか１つの方法または使用。
１３４．免疫原性組成物またはワクチンが、用量１回あたり１～１０ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項１２０～１３３のいずれか１つの方法または使用。
１３５．免疫原性組成物またはワクチンが、用量１回あたり２～５ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項１２０～１３４のいずれか１つの方法または使用。
１３６．免疫原性組成物またはワクチンが、用量１回あたり２～４ｌｏｇ10ＥＩＤ50のＩＢＶを含む、条項１２０～１３５のいずれか１つの方法または使用。
【0132】
１３７．免疫原性組成物またはワクチンが、生後１週齢以内、生後３日齢以内、生後２日齢以内、または生後１日齢以内に対象に投与される、条項１２０～１３６のいずれか１つの方法または使用。
１３８．免疫原性組成物またはワクチンが、生後１日齢以内に対象に投与される、条項１２０～１３７のいずれか１つの方法または使用。
１３９．前記方法が、同じ種の処置されていない対照群の対象と比較して、線毛運動障害の防止もしくは低減、ラ音の防止もしくは低減、産卵低下の防止もしくは低減、腎臓病変の防止もしくは低減、水様性下痢の防止もしくは低減、体重減少の防止もしくは低減、ウイルス量の低下、ウイルス排出の低減またはそれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメーターの改善をもたらす、条項１２０～１３８のいずれか１つの方法または使用。
１４０．処置または防止が、同じ種の処置されていない対照群の対象と比較して、線毛運動障害の防止または低減をもたらす、条項１２０～１３９のいずれか１つの方法または使用。
１３８．免疫原性組成物またはワクチンが、生後１日齢以内に対象に投与される、条項１２０～１３７のいずれか１つの方法または使用。
１３９．前記方法が、同じ種の処置されていない対照群の対象と比較して、線毛運動障害の防止もしくは低減、ラ音の防止もしくは低減、産卵低下の防止もしくは低減、腎臓病変の防止もしくは低減、水様性下痢の防止もしくは低減、体重減少の防止もしくは低減、ウイルス量の低下、ウイルス排出の低減またはそれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメーターの改善をもたらす、条項１２０～１３８のいずれか１つの方法または使用。
１４０．処置または防止が、同じ種の処置されていない対照群の対象と比較して、線毛運動障害の防止または低減をもたらす、条項１２０～１３９のいずれか１つの方法または使用。
【0133】
１４１．処置または防止が、同じ種の処置されていない対照群の対象と比較して、腎臓病変の防止または低減をもたらす、条項１２０～１４０のいずれか１つの方法または使用。
１４２．処置または防止が、同じ種の処置されていない対照群の対象と比較して、産卵低下の防止または低減をもたらす、条項１２０～１４１のいずれか１つの方法または使用。
１４３．治療での使用のための、条項６５～８７および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチン。
１４４．免疫原またはワクチンとしての使用のための、条項６５～８７および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチン。
１４５．医薬としての使用のための、条項６５～８７および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチン。
１４６．医薬の製造のための、条項６５～８７および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンの使用。
１４７．対象におけるＩＢＶ感染の処置および／または予防のための、条項６５～８７および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンの使用。
１４２．処置または防止が、同じ種の処置されていない対照群の対象と比較して、産卵低下の防止または低減をもたらす、条項１２０～１４１のいずれか１つの方法または使用。
１４３．治療での使用のための、条項６５～８７および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチン。
１４４．免疫原またはワクチンとしての使用のための、条項６５～８７および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチン。
１４５．医薬としての使用のための、条項６５～８７および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチン。
１４６．医薬の製造のための、条項６５～８７および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンの使用。
１４７．対象におけるＩＢＶ感染の処置および／または予防のための、条項６５～８７および９３～１０１のいずれか１つのウイルス粒子、トリコロナウイルス、ＩＢＶ、免疫原性組成物またはワクチンの使用。
【図面の簡単な説明】
【0134】
【図1】ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルス負荷の検出により評価される、Ｈ５２ ｒＩＢＶ野生型ウイルスと比較したＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの卵中動態。データポイントは、各タイムポイントの５つの試料の平均を表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図2】Ｅｂ６６（登録商標）細胞におけるＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの継代。ＲＴ－ｑＰＣＲ ＣＴ値は、各継代の感染（ｔ＝０）および回収（ｔ＝７２）のタイムポイントにおいて決定する。Ｐ１～Ｐ５は、以前の継代のウイルスストックの１／１０希釈による感染によって作製する。Ｐ６およびＰ７は、以前の継代の１／１０００希釈の接種により作製する。試験は、１回目の継代については、ＭＯＩ０．００１で繰り返し、類似の結果が得られる。
【図3】ＥＢ６６（登録商標）細胞におけるＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの複製動態。細胞にウイルスの３回目のＥＢ６６（登録商標）－増殖継代からのＴＣＩＤ５０力価に基づいて、ＭＯＩ０．００１でｒＩＢＶを感染させる。核酸は、０、８、２４、４８および７２ｈｐｉにおいて単離し、ＩＢＶ－特異的なＲＴ－ｑＰＣＲにより解析する。各データポイントは、３回の独立した試験の平均ｃｔ値を表す。エラーバーは、平均標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図4】ＥＢ６６（登録商標）細胞におけるＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの複製動態。タイムポイント０、８、２４、４８および７２ｈｐｉにおける試料を、ＴＣＩＤ５０滴定により解析する。１回の実験結果を示す。
【図5】Ｍ４１暴露に対するＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃによる保護についての線毛運動障害スコア付けの概略。１匹の動物の１０の輪についての１０の個々のスコアの合計を算出し、グラフ中の１つの点により表す。最大線毛運動障害は、スコア４０に相当し、線毛運動障害なしをスコア０で表す。平均および有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍおよび通常の一元配置分散分析試験を用いて算出する（ｐ＜０．０００１）。
【図6】Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの有効性試験についての暴露後７日間の腎臓組織のＲＴ－ｑＰＣＲ結果の概略。各個体の鳥を１つのドットで示す。
【図7】免疫蛍光分析により決定するＰＢＳ－１２ＳＦ細胞におけるＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの複製。３回の独立した試験の１回を示す。
【図8】上清からの核酸抽出およびそれに続くＲＴ－ｑＰＣＲ解析により決定する、ＰＢＳ－１２ＳＦ細胞におけるＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの複製。２回の独立した試験の１回を示す。
【図9】免疫蛍光分析により決定するＨＥＫ ２９３Ｔ 細胞におけるＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの複製。３回の独立した試験の１回を示す。
【図10】ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルス負荷の検出により評価される、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ野生型ウイルスと比較したＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃの卵中動態。データポイントは、各タイムポイントの５つの試料の平均を表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図11】Ｅｂ６６（登録商標）細胞におけるＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃの継代。ＲＴ－ｑＰＣＲ ＣＴ値は、各継代の感染（ｔ＝０）および回収（ｔ＝７２）のタイムポイントにおいて決定する。ＣＲ８８ ｒＩＢＶ野生型は、陰性対照として含める。Ｐ２、Ｐ５およびＰ８についてのＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃデータを示す。同一の継代試験に含まれているＣＲ８８ ｒＩＢＶは、継代が１回少なく、最初の継代（Ｐ１）および最後の継代（Ｐ７）である。各継代は、前の継代の１／１００希釈を感染させることにより作製する。
【図12】ＥＢ６６（登録商標）細胞におけるＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃの複製動態。細胞は、ウイルスの３回目のＥＢ６６（登録商標）－増殖継代からのＴＣＩＤ50力価に基づいてＭＯＩ０．００１で、ｒＩＢＶを感染させる。０、８、２４、４８および７２ｈｐｉで核酸を単離し、ＩＢＶ－特異的なＲＴ－ｑＰＣＲにより分析する。各データポイントは、３回の独立した試験の平均ｃｔ値を表す。エラーバーは、平均標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図13】ＥＢ６６（登録商標）細胞におけるＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃの複製動態。タイムポイント０、８、２４、４８および７２ｈｐｉにおける試料をＴＣＩＤ５０滴定により解析する。１回の試験の結果を示す。
【図14】７９３Ｂ暴露に対するＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃ による保護についての線毛運動障害スコア付けの概略。１匹の動物の１０の輪についての１０の個々のスコアの合計を算出し、グラフ中の１つの点により表す。最大線毛運動障害は、スコア４０に相当し、線毛運動障害なしをスコア０で表す。平均および有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍおよび通常の一元配置分散分析試験を用いて算出する（＊ｐ＜０．０２、＊＊ｐ＜０．００７）。
【図15】ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃの有効性試験についての暴露後７日間の腎臓組織のＲＴ－ｑＰＣＲ結果の概略。各個体の鳥を１つの点で示す。
【図16】ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルス負荷の検出により評価される、ＩＢＶ ＱＸ、Ｈ５２ ｒＩＢＶおよびＣＲ８８ ｒＩＢＶと比較したＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの卵中動態。データポイントは、各タイムポイントの５つの試料の平均を表す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図17】Ｅｂ６６（登録商標）細胞におけるＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの継代。ＲＴ－ｑＰＣＲ ＣＴ値は、各継代の感染（ｔ＝０）および回収（ｔ＝７２）のタイムポイントにおいて決定する。
【図18】Ｅｂ６６（登録商標）細胞におけるＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの継代。ＲＴ－ｑＰＣＲ ＣＴ値は、各継代の感染（ｔ＝０）および回収（ｔ＝７２）のタイムポイントにおいて決定する。
【図19】ＥＢ６６（登録商標）細胞におけるＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの複製動態。細胞は、ウイルスの３回目のＥＢ６６（登録商標）－増殖継代からのＴＣＩＤ50力価に基づいてＭＯＩ０．００１で、ｒＩＢＶを感染させる。０、８、２４および４８ｈｐｉで核酸を単離し、ＩＢＶ－特異的なＲＴ－ｑＰＣＲにより解析する。各データポイントは、それぞれ３つ組で行った、３回の独立した試験の平均ｃｔ値を表す。エラーバーは、平均標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【図20】Ｄ３８８ ＱＸ暴露に対するＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃによる保護についての線毛運動障害スコア付けの概略。１匹の動物の１０の輪についての１０の個々のスコアの合計を算出し、グラフ中の１つの点により表す。最大線毛運動障害は、スコア４０に相当し、線毛運動障害なしをスコア０で表す。平均および有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍおよび通常の一元配置分散分析試験を用いて算出する（＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図21】ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの有効性試験についての暴露後７日間の腎臓組織のＲＴ－ｑＰＣＲ結果の概略。各個体の鳥を１つの点で示す。
【発明を実施するための形態】
【0135】
配列概略
配列番号１ ＩＢＶ Ｈ５２スパイクタンパク質
配列番号２ Ｆ２６７Ｃ突然変異を有するＩＢＶ Ｈ５２スパイクタンパク質
配列番号３ Ｌ２６９Ｃ突然変異を有するＩＢＶ ＣＲ８８スパイクタンパク質
配列番号４ Ｌ２７０Ｃ突然変異を有するＩＢＶ ＱＸスパイクタンパク質
配列番号５ Ｌ２７１Ｃ突然変異を有するＩＢＶ Ｑ１スパイクタンパク質
配列番号６ Ｌ２７０Ｃ突然変異を有するＩＢＶバリアント２スパイクタンパク質
配列番号７ Ｌ２７４Ｃ突然変異を有するＩＢＶ ＢＲ－Ｉスパイクタンパク質
配列番号８ Ｌ２７４Ｃ突然変異を有するＩＢＶ Ａｒｋスパイクタンパク質
配列番号９ ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶドナープラスミド
配列番号１０ ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃドナープラスミド
配列番号１１ ＩＢＶ ＣＲ８８スパイク配列
配列番号１２ ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｍＩＢＶドナープラスミド
配列番号１３ ｐＧＥＭ－Ｔ ＩＢＶ ＣＲ８８スパイクプラスミド
配列番号１４ ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃドナープラスミド
配列番号１５ Ｌ２６９Ｃ突然変異を有するｐＧＥＭ－Ｔ ＩＢＶ ＣＲ８８スパイク
配列番号１６～６４ プライマー
配列番号６５ ＩＢＶ ＱＸスパイクタンパク質
配列番号６６ ｐＧＥＭ－Ｔ ＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃプラスミド
配列番号６７ ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶドナープラスミド
配列番号６８ ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃドナープラスミド
配列番号６９ ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃドナープラスミド
配列番号７０～７５ プライマー
配列番号７６ ＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩスパイクタンパク質
配列番号７７ Ｌ２７４Ｃ突然変異を有するＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩスパイクタンパク質
配列番号７８ ｐＵＣ５７－ｓ ＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｌ２７４Ｃ
配列番号７９ ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃドナープラスミド
配列番号８０～８４ プライマー
配列番号１ ＩＢＶ Ｈ５２スパイクタンパク質
配列番号２ Ｆ２６７Ｃ突然変異を有するＩＢＶ Ｈ５２スパイクタンパク質
配列番号３ Ｌ２６９Ｃ突然変異を有するＩＢＶ ＣＲ８８スパイクタンパク質
配列番号４ Ｌ２７０Ｃ突然変異を有するＩＢＶ ＱＸスパイクタンパク質
配列番号５ Ｌ２７１Ｃ突然変異を有するＩＢＶ Ｑ１スパイクタンパク質
配列番号６ Ｌ２７０Ｃ突然変異を有するＩＢＶバリアント２スパイクタンパク質
配列番号７ Ｌ２７４Ｃ突然変異を有するＩＢＶ ＢＲ－Ｉスパイクタンパク質
配列番号８ Ｌ２７４Ｃ突然変異を有するＩＢＶ Ａｒｋスパイクタンパク質
配列番号９ ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶドナープラスミド
配列番号１０ ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃドナープラスミド
配列番号１１ ＩＢＶ ＣＲ８８スパイク配列
配列番号１２ ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｍＩＢＶドナープラスミド
配列番号１３ ｐＧＥＭ－Ｔ ＩＢＶ ＣＲ８８スパイクプラスミド
配列番号１４ ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃドナープラスミド
配列番号１５ Ｌ２６９Ｃ突然変異を有するｐＧＥＭ－Ｔ ＩＢＶ ＣＲ８８スパイク
配列番号１６～６４ プライマー
配列番号６５ ＩＢＶ ＱＸスパイクタンパク質
配列番号６６ ｐＧＥＭ－Ｔ ＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃプラスミド
配列番号６７ ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶドナープラスミド
配列番号６８ ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃドナープラスミド
配列番号６９ ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃドナープラスミド
配列番号７０～７５ プライマー
配列番号７６ ＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩスパイクタンパク質
配列番号７７ Ｌ２７４Ｃ突然変異を有するＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩスパイクタンパク質
配列番号７８ ｐＵＣ５７－ｓ ＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｌ２７４Ｃ
配列番号７９ ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃドナープラスミド
配列番号８０～８４ プライマー
【実施例】
【0136】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を示す。これらの実施例は、例示に過ぎず、本発明の範囲または根底の原理を限定するものではないことは理解される。
（実施例１）
スパイクタンパク質のアミノ酸２６７位がシステインに突然変異されている組換えＩＢＶ Ｈ５２の作製
組換えＩＢＶの作製のために、van Beurden et al. (Virol J. 2017;14(1):109)に記載されている標的化ＲＮＡ組換えの方法を適用する。
（実施例１）
スパイクタンパク質のアミノ酸２６７位がシステインに突然変異されている組換えＩＢＶ Ｈ５２の作製
組換えＩＢＶの作製のために、van Beurden et al. (Virol J. 2017;14(1):109)に記載されている標的化ＲＮＡ組換えの方法を適用する。
【0137】
ドナープラスミド構築
ｐＵＣ５７－ｓ ＩＢＶ－５－１ｂ－Ｓ－ＳＩＲ－３Ｔドナープラスミドは、以降本明細書においてｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶドナープラスミド（配列番号９）と称し、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃ（配列番号１０）と称する、Ｈ５２スパイク（配列番号１）Ｓ１サブユニットのアミノ酸２６７位がフェニルアラニンからシステインに突然変異しているＨ５２スパイク（配列番号２）を有するＨ５２ ｒＩＢＶドナープラスミドの構築の鋳型として使用する。野生型配列の突然変異は、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を、プライマーＰＯ１９４２およびＰＯ１９４３（表１）を用いて、キットプロトコールに従って、アニーリング温度５８℃および伸長時間５分３０秒で使用することにより達成される。陽性クローンは、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩ制限消化および、プライマーＰＯ６１８およびＰＯ６３３（表１）を用いてＳａｎｇｅｒ配列決定により流すことによって特定する。その後、スパイクおよびドナー領域配列の統合性を、表１の配列番号１９～配列番号４０のプライマーを用いた配列決定により確認する。
ｐＵＣ５７－ｓ ＩＢＶ－５－１ｂ－Ｓ－ＳＩＲ－３Ｔドナープラスミドは、以降本明細書においてｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶドナープラスミド（配列番号９）と称し、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃ（配列番号１０）と称する、Ｈ５２スパイク（配列番号１）Ｓ１サブユニットのアミノ酸２６７位がフェニルアラニンからシステインに突然変異しているＨ５２スパイク（配列番号２）を有するＨ５２ ｒＩＢＶドナープラスミドの構築の鋳型として使用する。野生型配列の突然変異は、Ｑ５（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を、プライマーＰＯ１９４２およびＰＯ１９４３（表１）を用いて、キットプロトコールに従って、アニーリング温度５８℃および伸長時間５分３０秒で使用することにより達成される。陽性クローンは、ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩ制限消化および、プライマーＰＯ６１８およびＰＯ６３３（表１）を用いてＳａｎｇｅｒ配列決定により流すことによって特定する。その後、スパイクおよびドナー領域配列の統合性を、表１の配列番号１９～配列番号４０のプライマーを用いた配列決定により確認する。
【0138】
【表1】
【0139】
標的化ＲＮＡ組換えおよび組換えＩＢＶのレスキュー
Ｈ５２マウス化（ｍ）ＩＢＶヘルパーウイルスおよび組換えＩＢＶは、van Beurden et al. (Virol J. 2017;14(1):109)に記載されているように作製する。簡潔には、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの作製のために、ＬＲ７細胞をＨ５２ ｍＩＢＶによって感染させ、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ Ｓ Ｆ２６７Ｃ ドナープラスミド（配列番号１０）から作製したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物により電気穿孔し、次いで８日齢の胚含有ＳＰＦ鶏卵（ＶＡＬＯ ＢｉｏＭｅｄｉａ）に注射する。８日間までのインキュベーション後、全ての卵の尿膜腔液を、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるＲＮＡ単離後に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、組換えＩＢＶのレスキューについて個別に解析する。Ｈ５２ ＩＢＶ １ａｂおよびＨ５２ ＩＢＶ Ｓスパイクに結合するプライマーＰＯ１３２３およびＰＯ１３２４（表２）を、組換えＩＢＶをｍＩＢＶから区別するのに使用する。陽性試料を、プライマーＰＯ６１８およびＰＯ６３３（表２）を用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎおよび同一のプライマーを用いたＳａｎｇｅｒ配列決定を使用することによって、意図するスパイクＦ２６７Ｃ突然変異の存在を確認するためにさらに解析する。最高希釈のＬＲ７細胞を接種した卵の陽性尿膜腔液を、８日齢のＳＰＦ卵におけるエンドポイント希釈のために使用する。核酸単離および試料解析は、上述のように行う。同一の手法を、２回目のエンドポイント希釈に適用する。その後、１つの陽性試験尿膜腔液を１０日齢の胚含有ＳＰＦ鶏卵における増殖のために使用する。尿膜腔液を、１ｘＰＢＳ中で１：１０００に希釈し、卵当たり１００μｌを注射し、これを次いで３７．５℃および湿度６０％でインキュベーションする。尿膜腔液を接種後、４８時間において回収し、プールしてデブリを除き、－８０℃において保存する。
Ｈ５２マウス化（ｍ）ＩＢＶヘルパーウイルスおよび組換えＩＢＶは、van Beurden et al. (Virol J. 2017;14(1):109)に記載されているように作製する。簡潔には、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの作製のために、ＬＲ７細胞をＨ５２ ｍＩＢＶによって感染させ、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ Ｓ Ｆ２６７Ｃ ドナープラスミド（配列番号１０）から作製したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物により電気穿孔し、次いで８日齢の胚含有ＳＰＦ鶏卵（ＶＡＬＯ ＢｉｏＭｅｄｉａ）に注射する。８日間までのインキュベーション後、全ての卵の尿膜腔液を、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるＲＮＡ単離後に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、組換えＩＢＶのレスキューについて個別に解析する。Ｈ５２ ＩＢＶ １ａｂおよびＨ５２ ＩＢＶ Ｓスパイクに結合するプライマーＰＯ１３２３およびＰＯ１３２４（表２）を、組換えＩＢＶをｍＩＢＶから区別するのに使用する。陽性試料を、プライマーＰＯ６１８およびＰＯ６３３（表２）を用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎおよび同一のプライマーを用いたＳａｎｇｅｒ配列決定を使用することによって、意図するスパイクＦ２６７Ｃ突然変異の存在を確認するためにさらに解析する。最高希釈のＬＲ７細胞を接種した卵の陽性尿膜腔液を、８日齢のＳＰＦ卵におけるエンドポイント希釈のために使用する。核酸単離および試料解析は、上述のように行う。同一の手法を、２回目のエンドポイント希釈に適用する。その後、１つの陽性試験尿膜腔液を１０日齢の胚含有ＳＰＦ鶏卵における増殖のために使用する。尿膜腔液を、１ｘＰＢＳ中で１：１０００に希釈し、卵当たり１００μｌを注射し、これを次いで３７．５℃および湿度６０％でインキュベーションする。尿膜腔液を接種後、４８時間において回収し、プールしてデブリを除き、－８０℃において保存する。
【0140】
【表2】
【0141】
組換えＩＢＶのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび卵中特徴付け
胚感染用量５０％（ＥＩＤ50）の決定
ウイルスストックのアリコートを融解し、１ｘＰＢＳ中に１０倍希釈し、希釈ごとに５つの８日齢胚含有鶏卵の尿膜腔に１００μｌを接種することにより、５０％胚感染用量（ＥＩＤ50）を決定する。卵を３６．５℃、湿度６０％で、接種後７日間までインキュベーションする。２４時間後に死亡胚を有する卵を試験から除く。接種後７日目において死亡胚を有する他の卵は全て陽性とみなす。生存胚を有する卵は全て接種後７日目において、底部から光を当て（ｃａｎｄｌｅｄ）、矮小化を特定し、これを陽性とみなす。ＥＩＤ50／ｍｌを、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ（Am J Epidemiol, 1938; 27(3):493-497）の式を用いて算出する。
胚感染用量５０％（ＥＩＤ50）の決定
ウイルスストックのアリコートを融解し、１ｘＰＢＳ中に１０倍希釈し、希釈ごとに５つの８日齢胚含有鶏卵の尿膜腔に１００μｌを接種することにより、５０％胚感染用量（ＥＩＤ50）を決定する。卵を３６．５℃、湿度６０％で、接種後７日間までインキュベーションする。２４時間後に死亡胚を有する卵を試験から除く。接種後７日目において死亡胚を有する他の卵は全て陽性とみなす。生存胚を有する卵は全て接種後７日目において、底部から光を当て（ｃａｎｄｌｅｄ）、矮小化を特定し、これを陽性とみなす。ＥＩＤ50／ｍｌを、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ（Am J Epidemiol, 1938; 27(3):493-497）の式を用いて算出する。
【0142】
組織培養感染用量５０％（ＴＣＩＤ50）
Ｅｂ６６（登録商標）細胞生存率を、ゲートを６～１３μｍに設定して、ＢｉｏＲａｄ ＴＣ２０およびトリパンブルーを用いて分析した。９６ウェル当たり、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＥＢｘ（商標）ＧＲＯ－Ｉ無血清培地＋２．５ｍＭ Ｌ－グルタミン中の２ｘ１０6個の生存Ｅｂ６６（登録商標）細胞／ｍｌを接種の１日前に播種し、３７℃および７．５％ＣＯ2においてインキュベーションする。Ｅｂ６６（登録商標）細胞培地におけるウイルスの１０倍の連続希釈を行い、希釈ごとに１００μｌ（希釈ごとに少なくとも４反復）を、培養培地を除いた後に、Ｅｂ６６（登録商標）細胞に添加する。尿膜腔液を感染のために使用する場合は、希釈前に０．４５μｍのポアサイズを通過させる。感染細胞を７２時間インキュベーションした後、免疫蛍光染色により、陽性ウェルを特定する。培地を全てのウェルから吸引し、これを次いで１ｘＰＢＳで洗浄した後、細胞固定のためにウェル当たり１００μｌのエタノールを室温で１０分間添加した後、細胞を風乾させる。細胞を１ｘＰＢＳ中に１：２５０に希釈した、初代ニワトリ抗ＩＢＶ Ｍａｓｓ血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）１００μｌとともに、室温で４５分間インキュベーションする。一次抗体を除いた後、各ウェルを１ｘＰＢＳで３回洗浄する。二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ヤギ抗ニワトリＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１ｘＰＢＳ中１：５００希釈）１００μｌを添加し、暗所で４５分間、室温にてインキュベーションする。二次抗体を除いた後、各ウェルを１ｘＰＢＳで３回洗浄し、最後の洗浄液を細胞上に残す。陽性のウェルを蛍光顕微鏡により特定して記録し、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ（Am J Epidemiol,1938; 27(3):493-497）の式を用いてＴＣＩＤ50／ｍｌを算出する。
Ｅｂ６６（登録商標）細胞生存率を、ゲートを６～１３μｍに設定して、ＢｉｏＲａｄ ＴＣ２０およびトリパンブルーを用いて分析した。９６ウェル当たり、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＥＢｘ（商標）ＧＲＯ－Ｉ無血清培地＋２．５ｍＭ Ｌ－グルタミン中の２ｘ１０6個の生存Ｅｂ６６（登録商標）細胞／ｍｌを接種の１日前に播種し、３７℃および７．５％ＣＯ2においてインキュベーションする。Ｅｂ６６（登録商標）細胞培地におけるウイルスの１０倍の連続希釈を行い、希釈ごとに１００μｌ（希釈ごとに少なくとも４反復）を、培養培地を除いた後に、Ｅｂ６６（登録商標）細胞に添加する。尿膜腔液を感染のために使用する場合は、希釈前に０．４５μｍのポアサイズを通過させる。感染細胞を７２時間インキュベーションした後、免疫蛍光染色により、陽性ウェルを特定する。培地を全てのウェルから吸引し、これを次いで１ｘＰＢＳで洗浄した後、細胞固定のためにウェル当たり１００μｌのエタノールを室温で１０分間添加した後、細胞を風乾させる。細胞を１ｘＰＢＳ中に１：２５０に希釈した、初代ニワトリ抗ＩＢＶ Ｍａｓｓ血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）１００μｌとともに、室温で４５分間インキュベーションする。一次抗体を除いた後、各ウェルを１ｘＰＢＳで３回洗浄する。二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ ヤギ抗ニワトリＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１ｘＰＢＳ中１：５００希釈）１００μｌを添加し、暗所で４５分間、室温にてインキュベーションする。二次抗体を除いた後、各ウェルを１ｘＰＢＳで３回洗浄し、最後の洗浄液を細胞上に残す。陽性のウェルを蛍光顕微鏡により特定して記録し、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ（Am J Epidemiol,1938; 27(3):493-497）の式を用いてＴＣＩＤ50／ｍｌを算出する。
【0143】
卵中複製動態
８日齢の胚含有鶏卵に、１０2ＥＩＤ50のｒＩＢＶおよびそれぞれの対照を接種する。卵をインキュベーションの０、８、２４、３４、４８および７２時間後に、１日１回光を当て、胚死亡率を記録する。試料およびタイムポイントごとに、５つの事前選択した卵を除き、少なくとも２時間４℃に移す。次いで、尿膜腔液を回収し、－８０℃で保存する。解析のために、試料を融解し、ＣａおよびＭｇを含まない１ｘＰＢＳ中で１：１０に希釈し、核酸をＨａｍｉｌｔｏｎ Ｓｔａｒｌｅｔピペットロボットを使用して、担体を添加して、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出する。抽出した核酸をCallison et al. (J Virol Methods. 2006;138(1-2):60-5)から適用させたプロトコールを使用してＩＢＶ ＲＮＡの相対量について、ＲＴ－ｑＰＣＲにより解析する。簡潔には、同一のプライマーおよびプローブを使用して、熱プロファイルを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＡＢＩ（商標）７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の使用に適用させる。全ての核酸試料を、参照としてＩＢＶ Ｈ５２の１０倍希釈系列を使用して３つ組で分析する。
８日齢の胚含有鶏卵に、１０2ＥＩＤ50のｒＩＢＶおよびそれぞれの対照を接種する。卵をインキュベーションの０、８、２４、３４、４８および７２時間後に、１日１回光を当て、胚死亡率を記録する。試料およびタイムポイントごとに、５つの事前選択した卵を除き、少なくとも２時間４℃に移す。次いで、尿膜腔液を回収し、－８０℃で保存する。解析のために、試料を融解し、ＣａおよびＭｇを含まない１ｘＰＢＳ中で１：１０に希釈し、核酸をＨａｍｉｌｔｏｎ Ｓｔａｒｌｅｔピペットロボットを使用して、担体を添加して、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出する。抽出した核酸をCallison et al. (J Virol Methods. 2006;138(1-2):60-5)から適用させたプロトコールを使用してＩＢＶ ＲＮＡの相対量について、ＲＴ－ｑＰＣＲにより解析する。簡潔には、同一のプライマーおよびプローブを使用して、熱プロファイルを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＡＢＩ（商標）７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の使用に適用させる。全ての核酸試料を、参照としてＩＢＶ Ｈ５２の１０倍希釈系列を使用して３つ組で分析する。
【0144】
類似の卵中複製動態がＨ５２ ｒＩＢＶ野生型およびＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて観察される（図１）。これは、スパイクの２６７位におけるフェニルアラニンのシステインへの突然変異が、野生型ｒＩＢＶと比較して、突然変異ｒＩＢＶの卵中複製効率について不利益がないことを示している。
Ｅｂ６６（登録商標）細胞におけるｒＩＢＶの継代
Ｅｂ６６（登録商標）細胞は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＥＢｘ（商標）ＧＲＯ－Ｉ無血清培地＋２．５ｍＭ Ｌ－グルタミン中、４ｘ１０5細胞／ｍｌの密度で、総体積５ｍｌでＴ２５フラスコ中に播種し、ｒＩＢＶおよび対照を感染させる。培養物は、７２時間、３７℃、７．５％ＣＯ2で、１００ｒｐｍで振盪させながらインキュベーションする。培養物を回収し、－８０℃で保存する。１、２、５、６および７回目の継代について、ウイルス複製をＲＴ－ｑＰＣＲにより評価する。このために、懸濁液２５０μｌを接種（タイムポイント０時間）および回収（タイムポイント７２時間）の直後に、核酸単離のために取り除く。核酸は、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて単離する。ＲＴ－ｑＰＣＲは、上述のように行う。
Ｅｂ６６（登録商標）細胞におけるｒＩＢＶの継代
Ｅｂ６６（登録商標）細胞は、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＥＢｘ（商標）ＧＲＯ－Ｉ無血清培地＋２．５ｍＭ Ｌ－グルタミン中、４ｘ１０5細胞／ｍｌの密度で、総体積５ｍｌでＴ２５フラスコ中に播種し、ｒＩＢＶおよび対照を感染させる。培養物は、７２時間、３７℃、７．５％ＣＯ2で、１００ｒｐｍで振盪させながらインキュベーションする。培養物を回収し、－８０℃で保存する。１、２、５、６および７回目の継代について、ウイルス複製をＲＴ－ｑＰＣＲにより評価する。このために、懸濁液２５０μｌを接種（タイムポイント０時間）および回収（タイムポイント７２時間）の直後に、核酸単離のために取り除く。核酸は、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて単離する。ＲＴ－ｑＰＣＲは、上述のように行う。
【0145】
Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃが細胞中で複製できるかどうかを分析するために、Ｅｂ６６（登録商標）細胞に、尿膜腔液ストックの１／１０希釈を接種する。ウイルスの増殖は、１回目および以後の継代における７２時間後のｃｔ値の低下により検出する。次の継代のためにウイルスを希釈するため、ｃｔ値は、接種物の回収時に測定したｃｔ値と比較して上昇しており、その後、ウイルス複製により７２時間の培養の間に再び低下する。複製は、接種を前の継代の１／１０００希釈で行う、より後の継代である６回目および７回目においてよりさらに顕著になる（図２）。結果は、７回の継代にわたる、Ｅｂ６６（登録商標）細胞におけるＨ５２ ｒＩＢＶ Ｆ２６７Ｃの複製を明確に示している。したがって、ＩＢＶが、７回の継代後に、拡張された細胞培養／組織指向性を未だに有することから、２６７位におけるシステインへの改変が遺伝学的に安定であることは、明らかである。
さらに、尿膜腔液ストック（１０6.33ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０7.22ＥＩＤ50／ｍｌ）およびＥｂ６６（登録商標）継代Ｐ１（１０4.67ＴＣＩＤ50／ｍｌ）、Ｐ５（１０5.33ＴＣＩＤ50／ｍｌ）およびＰ７（１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０5.84ＥＩＤ50／ｍｌ）についての感染力価を決定する。Ｅｂ６６（登録商標）継代プロセス間のＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの効率的な複製およびＳＰＦ卵中における感染力の維持が確認されている。したがって、Ｆ２６７Ｃ突然変異は、卵中の複製能を妨げることなく細胞系における複製を可能にしている。
さらに、尿膜腔液ストック（１０6.33ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０7.22ＥＩＤ50／ｍｌ）およびＥｂ６６（登録商標）継代Ｐ１（１０4.67ＴＣＩＤ50／ｍｌ）、Ｐ５（１０5.33ＴＣＩＤ50／ｍｌ）およびＰ７（１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０5.84ＥＩＤ50／ｍｌ）についての感染力価を決定する。Ｅｂ６６（登録商標）継代プロセス間のＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃの効率的な複製およびＳＰＦ卵中における感染力の維持が確認されている。したがって、Ｆ２６７Ｃ突然変異は、卵中の複製能を妨げることなく細胞系における複製を可能にしている。
【0146】
Ｅｂ６６（登録商標）細胞複製動態
Ｅｂ６６（登録商標）細胞から回収した３回目の継代物を使用して、Ｅｂ６６（登録商標）細胞における複製動態を行う。Ｅｂ６６（登録商標）細胞を、継代について記載するように播種およびインキュベーションし、ＴＣＩＤ50力価に基づいてＭＯＩ０．００１で感染させる。試料を、接種直後ならびに８、２４、４８および７２ｈｐｉ（感染後時間）に採取する。試料を継代試験について記載されているようにウイルスＲＮＡ含有量について分析する（図３）。さらに、試料を、ＴＣＩＤ50アッセイにより、その感染力について分析する（図４）。効率的な複製を両方の方法を使用して検出し、複製のプラトー相は、感染後４８時間の早さで到達する。結果的に、Ｅｂ６６（登録商標）細胞における複製サイクルは、胚含有鶏卵におけるものと同等に効率的である
Ｅｂ６６（登録商標）細胞から回収した３回目の継代物を使用して、Ｅｂ６６（登録商標）細胞における複製動態を行う。Ｅｂ６６（登録商標）細胞を、継代について記載するように播種およびインキュベーションし、ＴＣＩＤ50力価に基づいてＭＯＩ０．００１で感染させる。試料を、接種直後ならびに８、２４、４８および７２ｈｐｉ（感染後時間）に採取する。試料を継代試験について記載されているようにウイルスＲＮＡ含有量について分析する（図３）。さらに、試料を、ＴＣＩＤ50アッセイにより、その感染力について分析する（図４）。効率的な複製を両方の方法を使用して検出し、複製のプラトー相は、感染後４８時間の早さで到達する。結果的に、Ｅｂ６６（登録商標）細胞における複製サイクルは、胚含有鶏卵におけるものと同等に効率的である
【0147】
ワクチン有効性の決定
受精ＳＰＦ卵を、９９．７°Ｆおよび湿度５０％で、卵設定器中で、１時間ごとに１回回転させて、１８時間インキュベーションする。インキュベーション１８日目において、卵に光を当て、受精卵を孵化場に移し、９９°Ｆおよび湿度７０％で孵化までインキュベーションする。臨床徴候および変形を示さないヒヨコを無作為的に各処置群に割り当て、別個のアイソレーターに移す。３羽のヒヨコは厳密な陰性対照（ＳＮＣ）群として機能し、５匹のヒヨコを暴露対照（ＣＣ）群に、Ｅｂ６６（登録商標）－適応組換えＩＢＶでワクチン接種した後、暴露される群に少なくとも１０羽を登録する。動物は、アニマルウェルフェア推奨のために、現地および国家の要求にしたがった収容条件で維持する。照明レジメンは、１日当たり１６時間の照明に調整する。餌および水は自由に供給する。アイソレーターに移した後、ヒヨコ（１日齢）を、点眼剤（総体積５０μｌ、片眼当たり２５μｌ）により、ヒヨコ当たり１０3 ＥＩＤ50を用いてワクチン接種し、一方、ＳＮＣおよびＣＣ群は、未処置のままである。ワクチン接種後２１日目において、ＣＣ群およびワクチン接種群のヒヨコを点眼剤（総体積５０μｌ、片眼当たり２５μｌ）により、ヒヨコ当たり同種の暴露株１０3～１０4 ＥＩＤ50を用いて暴露させる。暴露後７日目において、全てのヒヨコを安楽死させ、腎臓を取り除き、ＩＢＶ－特異的ＲＴ－ｑＰＣＲ分析のために、ＲＮＡｌａｔｅｒ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で、４℃で保存する。さらに、気管を取り除き、暖かい細胞培養培地を含む５０ｍｌチューブに移す。その後、気管から結合組織を除き、細胞培養培地を流す。気管を切片厚さ０．６～０．８ｍｍに設定したＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーを用いて気管輪に切断する。気管当たり、上部３つの輪、中央部４つの輪および下部の３つの輪を、光学顕微鏡により線毛運動について分析し、線毛運動障害についてスコア付けする（表３参照）。輪は、内部輪の５０％より多くが活発な線毛運動を示す場合、正常として記録する（スコア２以下）。輪は、線毛の５０％未満が運動している場合、陽性として記録する（スコア３および４）。動物は、１０の輪のうち９以上が正常な線毛活性を示す場合に保護されているとみなす。
受精ＳＰＦ卵を、９９．７°Ｆおよび湿度５０％で、卵設定器中で、１時間ごとに１回回転させて、１８時間インキュベーションする。インキュベーション１８日目において、卵に光を当て、受精卵を孵化場に移し、９９°Ｆおよび湿度７０％で孵化までインキュベーションする。臨床徴候および変形を示さないヒヨコを無作為的に各処置群に割り当て、別個のアイソレーターに移す。３羽のヒヨコは厳密な陰性対照（ＳＮＣ）群として機能し、５匹のヒヨコを暴露対照（ＣＣ）群に、Ｅｂ６６（登録商標）－適応組換えＩＢＶでワクチン接種した後、暴露される群に少なくとも１０羽を登録する。動物は、アニマルウェルフェア推奨のために、現地および国家の要求にしたがった収容条件で維持する。照明レジメンは、１日当たり１６時間の照明に調整する。餌および水は自由に供給する。アイソレーターに移した後、ヒヨコ（１日齢）を、点眼剤（総体積５０μｌ、片眼当たり２５μｌ）により、ヒヨコ当たり１０3 ＥＩＤ50を用いてワクチン接種し、一方、ＳＮＣおよびＣＣ群は、未処置のままである。ワクチン接種後２１日目において、ＣＣ群およびワクチン接種群のヒヨコを点眼剤（総体積５０μｌ、片眼当たり２５μｌ）により、ヒヨコ当たり同種の暴露株１０3～１０4 ＥＩＤ50を用いて暴露させる。暴露後７日目において、全てのヒヨコを安楽死させ、腎臓を取り除き、ＩＢＶ－特異的ＲＴ－ｑＰＣＲ分析のために、ＲＮＡｌａｔｅｒ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中で、４℃で保存する。さらに、気管を取り除き、暖かい細胞培養培地を含む５０ｍｌチューブに移す。その後、気管から結合組織を除き、細胞培養培地を流す。気管を切片厚さ０．６～０．８ｍｍに設定したＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーを用いて気管輪に切断する。気管当たり、上部３つの輪、中央部４つの輪および下部の３つの輪を、光学顕微鏡により線毛運動について分析し、線毛運動障害についてスコア付けする（表３参照）。輪は、内部輪の５０％より多くが活発な線毛運動を示す場合、正常として記録する（スコア２以下）。輪は、線毛の５０％未満が運動している場合、陽性として記録する（スコア３および４）。動物は、１０の輪のうち９以上が正常な線毛活性を示す場合に保護されているとみなす。
【0148】
ＩＢＶ特異的ＲＴ－ｑＰＣＲ分析のために、腎臓組織片を室温に加温し、別個に２ｍｌ Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓチューブに移し、これをそれぞれ培地およびＰＢＳで充填する。腎臓をＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）組織ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を、１ｘ２０秒、６８００ｒｐｍで使用して均質化する。後鼻孔ワブ（ｗａｂ）を２ｍｌ １ｘＰＢＳ中に溶出する。核酸をＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して溶出物２００μｌおよび組織均質物からそれぞれ単離する。ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用する以外は、卵中動態について上述するように行う。
【0149】
【表3】
【0150】
試験の目的は、Ｅｂ６６（登録商標）細胞中で８回継代した、細胞培養適応したＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃが、病原性Ｍ４１株による暴露に対する保護を付与することができることを示すことである。全てのニワトリを、臨床徴候について毎日観察し、ワクチン接種または暴露後に記録されている臨床徴候はない。１日齢におけるＨ５２ ｒＩＢＶおよびＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃによるワクチン接種のための逆滴定により、それぞれ、１０3.2ＥＩＤ50／動物および１０2.87ＥＩＤ50／動物（標的１０3ＥＩＤ50／動物）の力価、およびワクチン接種後２１日目におけるＩＢＶ Ｍ４１による暴露についての１０3 ＥＩＤ50／動物（標的１０3ＥＩＤ50／動物）の力価が決定される。線毛運動障害は、表３に記載するように、スコア付けされ、結果は図５に示す。
各動物についての１０の個々のスコアの合計の平均線毛運動障害値および保護率を表４に概略する。厳密な陰性対照の全ての動物は、全て正常な線毛運動（１００％保護）を示し、一方、暴露対照群の動物は全て線毛運動障害について陽性である（０％保護）。対照的に、Ｈ５２ ｒＩＢＶによりワクチン接種した動物の９３％は保護されており、Ｅｂ６６（登録商標）－継代Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃによりワクチン接種した動物も同等に保護されている。
各動物についての１０の個々のスコアの合計の平均線毛運動障害値および保護率を表４に概略する。厳密な陰性対照の全ての動物は、全て正常な線毛運動（１００％保護）を示し、一方、暴露対照群の動物は全て線毛運動障害について陽性である（０％保護）。対照的に、Ｈ５２ ｒＩＢＶによりワクチン接種した動物の９３％は保護されており、Ｅｂ６６（登録商標）－継代Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃによりワクチン接種した動物も同等に保護されている。
【0151】
【表4】
さらに、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃによりワクチン接種した動物の腎臓におけるウイルス負荷は、Ｈ５２ ｒＩＢＶと同等に、Ｍ４１暴露対照と比較して効率的に減少している（図６）。まとめると、Ｅｂ６６（登録商標）細胞中で増殖したＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃは、病原性Ｍ４１暴露に対して、Ｈ５２ ｒＩＢＶ野生型と同程度に効率的に保護を行う。さらに、２６７位におけるシステインへの改変は、遺伝学的に安定である。
【0152】
ｒＩＢＶによるＰＢＳ－１２ＳＦ細胞の感染
ＰＢＳ－１２ＳＦ細胞への感染能を、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃおよび陰性対照としてのＨ５２ ｒＩＢＶの尿膜腔液ストックについて解析する。ＰＢＳ－１２ＳＦ細胞を、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋１０％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地中で、次の日に８０～９０％コンフルエントに達成するように、１２ウェルプレート中に播種する。細胞を３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションする。感染前に、尿膜腔液ウイルスストックを０．４５μｍポアサイズのフィルターを通過させる。ＰＢＳ－１２ＳＦ細胞に、ウェル当たり、１０5.74ＥＩＤ50の各ウイルスを４時間、３７℃および５％ＣＯ2で感染させた後、上清を除いて新鮮な培地をさらなるインキュベーションのために添加する。７２時間後、上清を除き、細胞を１ｘＰＢＳにより洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５０μｌを添加して細胞を剥離させる。細胞を上清中で懸濁し、８０～９０％コンフルエントのＰＢＳ－１２ＳＦ細胞（Ｐ２）を含むＴ２５フラスコに移し、これを７２時間インキュベーションする。再び上清および細胞を回収し、８０～９０％コンフルエントのＰＢＳ－１２ＳＦ細胞を含むＴ７５フラスコに移し、これを７２時間インキュベーションする（Ｐ３）。上清を回収する。細胞をトリプシン処理によって剥離し、新鮮な培地中で１：３の比率で１２ウェルプレート中に播種し、次の日までインキュベーションする。培地を吸引し、細胞を１ｘＰＢＳにより洗浄し、氷冷１００％エタノールを用いて固定し、風乾させる。次いで、細胞を１ｘＰＢＳにより再水和した後、初代ニワトリ抗ＩＢＶ Ｍａｓｓ血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を１：２００の希釈で添加し、室温で４５分間インキュベーションする。抗体を除いた後、細胞を洗浄し、二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１ｘＰＢＳ中１：５００希釈）を暗所、室温で４５分間添加する。最後に、細胞を１ｘＰＢＳにより３回洗浄し、蛍光顕微鏡により解析する（図７）。感染細胞は、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについては検出される一方、Ｈ５２ ｒＩＢＶ野生型により感染した細胞および非感染陰性対照は、予期される通り陰性のままである。さらに、継代１回目、２回目および３回目のそれぞれの後に、上述のように核酸抽出およびＲＴ－ｑＰＣＲのために上清２５０μｌを保存する。継代プロセスにわたるｃｔ値（ウイルスの複製および増殖に相当する）の連続的な低下がＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについては観察できるが、Ｈ５２ ｒＩＢＶ野生型についてのｃｔ値は予期される通り上昇する（図８）。
ＰＢＳ－１２ＳＦ細胞への感染能を、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃおよび陰性対照としてのＨ５２ ｒＩＢＶの尿膜腔液ストックについて解析する。ＰＢＳ－１２ＳＦ細胞を、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋１０％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地中で、次の日に８０～９０％コンフルエントに達成するように、１２ウェルプレート中に播種する。細胞を３７℃および５％ＣＯ２でインキュベーションする。感染前に、尿膜腔液ウイルスストックを０．４５μｍポアサイズのフィルターを通過させる。ＰＢＳ－１２ＳＦ細胞に、ウェル当たり、１０5.74ＥＩＤ50の各ウイルスを４時間、３７℃および５％ＣＯ2で感染させた後、上清を除いて新鮮な培地をさらなるインキュベーションのために添加する。７２時間後、上清を除き、細胞を１ｘＰＢＳにより洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５０μｌを添加して細胞を剥離させる。細胞を上清中で懸濁し、８０～９０％コンフルエントのＰＢＳ－１２ＳＦ細胞（Ｐ２）を含むＴ２５フラスコに移し、これを７２時間インキュベーションする。再び上清および細胞を回収し、８０～９０％コンフルエントのＰＢＳ－１２ＳＦ細胞を含むＴ７５フラスコに移し、これを７２時間インキュベーションする（Ｐ３）。上清を回収する。細胞をトリプシン処理によって剥離し、新鮮な培地中で１：３の比率で１２ウェルプレート中に播種し、次の日までインキュベーションする。培地を吸引し、細胞を１ｘＰＢＳにより洗浄し、氷冷１００％エタノールを用いて固定し、風乾させる。次いで、細胞を１ｘＰＢＳにより再水和した後、初代ニワトリ抗ＩＢＶ Ｍａｓｓ血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を１：２００の希釈で添加し、室温で４５分間インキュベーションする。抗体を除いた後、細胞を洗浄し、二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１ｘＰＢＳ中１：５００希釈）を暗所、室温で４５分間添加する。最後に、細胞を１ｘＰＢＳにより３回洗浄し、蛍光顕微鏡により解析する（図７）。感染細胞は、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについては検出される一方、Ｈ５２ ｒＩＢＶ野生型により感染した細胞および非感染陰性対照は、予期される通り陰性のままである。さらに、継代１回目、２回目および３回目のそれぞれの後に、上述のように核酸抽出およびＲＴ－ｑＰＣＲのために上清２５０μｌを保存する。継代プロセスにわたるｃｔ値（ウイルスの複製および増殖に相当する）の連続的な低下がＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについては観察できるが、Ｈ５２ ｒＩＢＶ野生型についてのｃｔ値は予期される通り上昇する（図８）。
【0153】
まとめると、これらのデータは、Ｈ５２スパイクの２６７位におけるフェニルアラニンのシステインへの単一突然変異は、ウイルスをＰＢＳ１２－ＳＦ細胞中で複製可能にするものであり、一方、Ｈ５２野生型ウイルスはこの能力を欠いている。
【0154】
ｒＩＢＶによるＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の感染
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞への感染能を、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃおよび陰性対照としてのＨ５２ ｒＩＢＶの尿膜腔液ストックについて解析する。２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）＋１０％ＦＣＳ（ＳＡＦＣ）＋Ｌ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ）＋１％Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ）培地中で、次の日に８０～９０％コンフルエントに達成するように、１２ウェルプレート中に播種する。細胞を３７℃および５％ＣＯ2でインキュベーションする。感染前に、尿膜腔液ウイルスストックを０．４５μｍポアサイズのフィルターを通過させる。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をウェル当たり約１０6 ＥＩＤ50の各ウイルスを感染させる。７２時間後、上清を除き、細胞を１ｘＰＢＳにより洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５０μｌを添加して細胞を剥離させる。細胞を上清中で懸濁し、８０～９０％コンフルエントのＨＥＫ ２９３Ｔ細胞および新鮮な培地５ｍｌを含むＴ２５フラスコに移し、これを７２時間インキュベーションする（Ｐ２）。再び上清および細胞を回収し、８０～９０％コンフルエントのＨＥＫ ２９３Ｔ細胞および新鮮な培地１０ｍｌを含むＴ７５フラスコに移し、これを７２時間インキュベーションする（Ｐ３）。上清を回収する。細胞をトリプシン処理によって剥離し、新鮮な培地中で１：３の比率で１２ウェルプレート中に播種し、次の日までインキュベーションする。培地を吸引し、細胞を１ｘＰＢＳにより洗浄し、氷冷１００％エタノールを用いて固定し、風乾させる。次いで、細胞を１ｘＰＢＳにより再水和した後、初代ニワトリ抗ＩＢＶ Ｍａｓｓ血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を１：２００の希釈で添加し、室温で４５分間インキュベーションする。抗体を除いた後、細胞を洗浄し、二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１ｘＰＢＳ中１：５００希釈）を暗所、室温で４５分間添加する。最後に、細胞を１ｘＰＢＳにより３回洗浄し、蛍光顕微鏡により解析する（図９）。感染細胞は、陽性対照ならびにＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについては検出される一方、Ｈ５２ ｒＩＢＶ野生型により感染した細胞および非感染陰性対照は、予期される通り陰性のままである。
ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞への感染能を、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃおよび陰性対照としてのＨ５２ ｒＩＢＶの尿膜腔液ストックについて解析する。２９３Ｔ細胞を、ＤＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）＋１０％ＦＣＳ（ＳＡＦＣ）＋Ｌ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ）＋１％Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ）培地中で、次の日に８０～９０％コンフルエントに達成するように、１２ウェルプレート中に播種する。細胞を３７℃および５％ＣＯ2でインキュベーションする。感染前に、尿膜腔液ウイルスストックを０．４５μｍポアサイズのフィルターを通過させる。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をウェル当たり約１０6 ＥＩＤ50の各ウイルスを感染させる。７２時間後、上清を除き、細胞を１ｘＰＢＳにより洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５０μｌを添加して細胞を剥離させる。細胞を上清中で懸濁し、８０～９０％コンフルエントのＨＥＫ ２９３Ｔ細胞および新鮮な培地５ｍｌを含むＴ２５フラスコに移し、これを７２時間インキュベーションする（Ｐ２）。再び上清および細胞を回収し、８０～９０％コンフルエントのＨＥＫ ２９３Ｔ細胞および新鮮な培地１０ｍｌを含むＴ７５フラスコに移し、これを７２時間インキュベーションする（Ｐ３）。上清を回収する。細胞をトリプシン処理によって剥離し、新鮮な培地中で１：３の比率で１２ウェルプレート中に播種し、次の日までインキュベーションする。培地を吸引し、細胞を１ｘＰＢＳにより洗浄し、氷冷１００％エタノールを用いて固定し、風乾させる。次いで、細胞を１ｘＰＢＳにより再水和した後、初代ニワトリ抗ＩＢＶ Ｍａｓｓ血清（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）を１：２００の希釈で添加し、室温で４５分間インキュベーションする。抗体を除いた後、細胞を洗浄し、二次Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１ｘＰＢＳ中１：５００希釈）を暗所、室温で４５分間添加する。最後に、細胞を１ｘＰＢＳにより３回洗浄し、蛍光顕微鏡により解析する（図９）。感染細胞は、陽性対照ならびにＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについては検出される一方、Ｈ５２ ｒＩＢＶ野生型により感染した細胞および非感染陰性対照は、予期される通り陰性のままである。
【0155】
まとめると、これらのデータは、Ｈ５２スパイクの２６７位におけるフェニルアラニンのシステインへの単一突然変異は、ウイルスをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞中で複製可能にするものであり、一方、Ｈ５２野生型ウイルスはこの能力を欠いている。
結論実施例１：前記データは、ＩＢＶのスパイク配列の２６７位（番号付けについての参照配列は配列番号１である）におけるシステインへの突然変異は、拡張された細胞培養および組織指向性をもたらすものであることを示している。スパイクタンパク質にＦ２６７Ｃ突然変異を有するＨ５２組換えＩＢＶは、異なる細胞系、例えばＥＢ６６、ＰＢＳ－１２ＳＦおよびＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において効率的に培養することができる。前記ＩＢＶは、他の細胞系においても同様に培養できることが想定される。さらに、前記突然変異は、ウイルスの卵中複製に対して影響を及ぼさず、かつ卵中およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複製動態は同等である。最終的に、ワクチンの有効性は、細胞系における継代の後においても維持されており、卵中培養を必要とせずに、代わりに細胞系を使用するＩＢＶワクチンの開発が成功する基礎となっている。
結論実施例１：前記データは、ＩＢＶのスパイク配列の２６７位（番号付けについての参照配列は配列番号１である）におけるシステインへの突然変異は、拡張された細胞培養および組織指向性をもたらすものであることを示している。スパイクタンパク質にＦ２６７Ｃ突然変異を有するＨ５２組換えＩＢＶは、異なる細胞系、例えばＥＢ６６、ＰＢＳ－１２ＳＦおよびＨＥＫ ２９３Ｔ細胞において効率的に培養することができる。前記ＩＢＶは、他の細胞系においても同様に培養できることが想定される。さらに、前記突然変異は、ウイルスの卵中複製に対して影響を及ぼさず、かつ卵中およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける複製動態は同等である。最終的に、ワクチンの有効性は、細胞系における継代の後においても維持されており、卵中培養を必要とせずに、代わりに細胞系を使用するＩＢＶワクチンの開発が成功する基礎となっている。
【0156】
（実施例２）
スパイクタンパク質のアミノ酸２６９位がシステインに突然変異している組換えＩＢＶ ＣＲ８８の作製
ＩＢＶスパイクの２６７位におけるシステインへの変化が、他の遺伝子型または血清型にも適応し得るかどうかを決定するために、ＣＲ８８ ＩＢＶ株のスパイクアミノ酸配列（配列番号１１）を、Ｈ５２スパイクアミノ酸配列（配列番号１）と整列させ、ＩＢＶ ＣＲ８８スパイクについて、Ｈ５２スパイクのアミノ酸２６７位に対応する位置を決定し、これはＣＲ８８スパイクの２６９位のロイシンと決定された。
ＩＢＶ ＣＲ８８マウス化ドナープラスミドの構築
ＣＲ８８マウス化（ｍ）ＩＢＶドナープラスミドを作製するために、ドナー配列を、市販の業者により合成し、ＣＲ８８ゲノムの５’ＵＴＲの４９７塩基を、１ａｂ領域（７５２塩基）およびＣＲ８８ ＩＢＶスパイクをコードする最初の７２塩基の３’部分に融合し、ＭＨＶスパイク外部ドメインの３７５３塩基が続き、ＣＲ８８ ＩＢＶスパイクの末端の２１０塩基が続き、以降の配列はゲノムの３’末端まで続く。さらに、ＳａｃＩ制限部位およびＴ７プロモーターの配列をドナー領域の５’末端に、ならびに１００ｘｐｏｌｙＡ配列、３’末端における線状化のためのＮｏｔ Ｉ制限部位を続けてそれぞれ付加する。アセンブリした配列の５６３４位におけるＡからＣへのサイレント突然変異をＸｈｏＩ制限部位を作製するために導入する。合成した配列をｐＵＣ５７－ｓｉｍｐｌｅに挿入し、ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｍＩＢＶドナープラスミド（配列番号１２）を得る。
スパイクタンパク質のアミノ酸２６９位がシステインに突然変異している組換えＩＢＶ ＣＲ８８の作製
ＩＢＶスパイクの２６７位におけるシステインへの変化が、他の遺伝子型または血清型にも適応し得るかどうかを決定するために、ＣＲ８８ ＩＢＶ株のスパイクアミノ酸配列（配列番号１１）を、Ｈ５２スパイクアミノ酸配列（配列番号１）と整列させ、ＩＢＶ ＣＲ８８スパイクについて、Ｈ５２スパイクのアミノ酸２６７位に対応する位置を決定し、これはＣＲ８８スパイクの２６９位のロイシンと決定された。
ＩＢＶ ＣＲ８８マウス化ドナープラスミドの構築
ＣＲ８８マウス化（ｍ）ＩＢＶドナープラスミドを作製するために、ドナー配列を、市販の業者により合成し、ＣＲ８８ゲノムの５’ＵＴＲの４９７塩基を、１ａｂ領域（７５２塩基）およびＣＲ８８ ＩＢＶスパイクをコードする最初の７２塩基の３’部分に融合し、ＭＨＶスパイク外部ドメインの３７５３塩基が続き、ＣＲ８８ ＩＢＶスパイクの末端の２１０塩基が続き、以降の配列はゲノムの３’末端まで続く。さらに、ＳａｃＩ制限部位およびＴ７プロモーターの配列をドナー領域の５’末端に、ならびに１００ｘｐｏｌｙＡ配列、３’末端における線状化のためのＮｏｔ Ｉ制限部位を続けてそれぞれ付加する。アセンブリした配列の５６３４位におけるＡからＣへのサイレント突然変異をＸｈｏＩ制限部位を作製するために導入する。合成した配列をｐＵＣ５７－ｓｉｍｐｌｅに挿入し、ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｍＩＢＶドナープラスミド（配列番号１２）を得る。
【0157】
ＣＲ８８ ｍＩＢＶのレスキュー
ＣＲ８８ ｍＩＢＶは、いくつかの変更により、Ｈ５２ ｍＩＢＶ（van Beurden et al. Virol J. 2017;14(1):109）と同様にレスキューされ、ウイルス尿膜腔液ストックを、超遠心分離により濃縮した後、電気穿孔のためにウイルスＲＮＡを単離する。ウイルス尿膜腔液１８ｍｌをＴＮＥ（Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ）緩衝剤中の２ｍｌ ２０％スクロースクッションを通し、５０，０００ｘｇで２時間遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットをＴＮＥ緩衝剤１５０μｌに再懸濁した後、ＱＩＡａｍｐ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によりＲＮＡを単離する。さらに、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）をＢＨＫ細胞の代わりに、電気穿孔（２パルス ２５０Ｖ／３００μＦ、１０秒中断）に使用し、１．２５％ＤＭＳＯを電気穿孔混合物に添加する。
ドナープラスミド構築
隣接配列を有するＣＲ８８スパイク核酸配列を、市販の業者により合成し、ｐＧＥＭ－Ｔ（配列番号１３）中にクローニングする。これをＩＢＶ ＣＲ８８スパイク（配列番号１１）のアミノ酸２６９位におけるロイシンをシステイン（配列番号３）に変化させるための、部位特異的突然変異誘発のための鋳型として使用する。このために、製造者のプロトコールにしたがって、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＭｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および対応するオンラインツールにより設計したプライマーＰＯ１８８６（表５）を使用する。陽性クローンを、制限消化により特定し、プライマーＰＯ６１８およびＰＯ１４１０（表５）を用いたＳａｎｇｅｒ配列決定により、所望の突然変異の存在について解析する。ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃドナープラスミド（配列番号１４）の作製のために、突然変異ＣＲ８８スパイク配列（配列番号１５）を含むｐＧＥＭ－Ｔ ＣＲ８８ Ｓ Ｌ２６９ＣプラスミドをＰａｃＩ、ＸｈｏＩおよび ＰｖｕＩにより消化する。スパイクに相当するバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製する。さらに、ＣＲ８８ ｍＩＢＶドナープラスミド（配列番号１２）をＰａｃＩ、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩにより消化し、ドナープラスミド骨格を得る。最高の分子量を有するバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製する。精製したスパイクインサートおよびＣＲ８８ドナープラスミド骨格をＴ４ ＤＮＡライゲース（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して１６℃で一晩ライゲーションする。ライゲーション混合物により、ＮＥＢ ５－αコンピテント大腸菌（ＮＥＢ）を熱ショックにより形質転換する。ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の後、陽性クローンを制限消化により特定し、プライマーＰＯ６１８、ＰＯ１０１４（表５）を用いるＳａｎｇｅｒ配列決定により標的化した突然変異について特徴付けを行う。
ＣＲ８８ ｍＩＢＶは、いくつかの変更により、Ｈ５２ ｍＩＢＶ（van Beurden et al. Virol J. 2017;14(1):109）と同様にレスキューされ、ウイルス尿膜腔液ストックを、超遠心分離により濃縮した後、電気穿孔のためにウイルスＲＮＡを単離する。ウイルス尿膜腔液１８ｍｌをＴＮＥ（Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ）緩衝剤中の２ｍｌ ２０％スクロースクッションを通し、５０，０００ｘｇで２時間遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットをＴＮＥ緩衝剤１５０μｌに再懸濁した後、ＱＩＡａｍｐ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によりＲＮＡを単離する。さらに、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）をＢＨＫ細胞の代わりに、電気穿孔（２パルス ２５０Ｖ／３００μＦ、１０秒中断）に使用し、１．２５％ＤＭＳＯを電気穿孔混合物に添加する。
ドナープラスミド構築
隣接配列を有するＣＲ８８スパイク核酸配列を、市販の業者により合成し、ｐＧＥＭ－Ｔ（配列番号１３）中にクローニングする。これをＩＢＶ ＣＲ８８スパイク（配列番号１１）のアミノ酸２６９位におけるロイシンをシステイン（配列番号３）に変化させるための、部位特異的突然変異誘発のための鋳型として使用する。このために、製造者のプロトコールにしたがって、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＭｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および対応するオンラインツールにより設計したプライマーＰＯ１８８６（表５）を使用する。陽性クローンを、制限消化により特定し、プライマーＰＯ６１８およびＰＯ１４１０（表５）を用いたＳａｎｇｅｒ配列決定により、所望の突然変異の存在について解析する。ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃドナープラスミド（配列番号１４）の作製のために、突然変異ＣＲ８８スパイク配列（配列番号１５）を含むｐＧＥＭ－Ｔ ＣＲ８８ Ｓ Ｌ２６９ＣプラスミドをＰａｃＩ、ＸｈｏＩおよび ＰｖｕＩにより消化する。スパイクに相当するバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製する。さらに、ＣＲ８８ ｍＩＢＶドナープラスミド（配列番号１２）をＰａｃＩ、ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩにより消化し、ドナープラスミド骨格を得る。最高の分子量を有するバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製する。精製したスパイクインサートおよびＣＲ８８ドナープラスミド骨格をＴ４ ＤＮＡライゲース（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して１６℃で一晩ライゲーションする。ライゲーション混合物により、ＮＥＢ ５－αコンピテント大腸菌（ＮＥＢ）を熱ショックにより形質転換する。ＧｅｎｅＪＥＴ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の後、陽性クローンを制限消化により特定し、プライマーＰＯ６１８、ＰＯ１０１４（表５）を用いるＳａｎｇｅｒ配列決定により標的化した突然変異について特徴付けを行う。
【0158】
標的化ＲＮＡ組換えおよび組換えＩＢＶのレスキュー
ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃのレスキューのために、ＬＲ７細胞にＣＲ８８ ｍＩＢＶを感染させ、ＮｏｔＩ線状化ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ Ｓ Ｌ２６９Ｃドナープラスミドから作製したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を用いて電気穿孔し、次いで８日齢の胚含有ＳＰＦ鶏卵（ＶＡＬＯ ＢｉｏＭｅｄｉａ）に注射する。８日までのインキュベーションの後、全ての卵の尿膜腔液を、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるＲＮＡ単離後に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、組換えＩＢＶのレスキューについて個別に分析する。ＣＲ８８ ＩＢＶ １ａｂおよびＣＲ８８ ＩＢＶ Ｓスパイクに結合するプライマーＰＯ１７２８およびＰＯ１７２９（表５）を、組換えＩＢＶをｍＩＢＶから区別するのに使用する。最高希釈のＬＲ７細胞を接種した卵の陽性尿膜腔液を８日齢胚含有ＳＰＦ卵のエンドポイント希釈に使用する。核酸単離は、上述のように行う。試料は、Callison et al. (J Virol Methods. 2006;138(1-2):60-5)から適応させたプロトコールにしたがって、ＲＴ－ｑＰＣＲにより解析する。簡潔には、同一のプライマーおよびプローブを使用して、熱プロファイルを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓまたはＡＢＩ７９００ ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の使用に適用させる。その後、高希釈の１つの陽性試験尿膜腔液を８日齢胚含有ＳＰＦ鶏卵における増殖のために使用する。尿膜腔液を、１ｘＰＢＳ中で１：１００に希釈し、卵当たり１００μｌを注射し、これを次いで３７．５℃および湿度６０％でインキュベーションする。尿膜腔液を接種後４８時間において回収し、デブリを除き、－８０℃において保存する。
ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃのレスキューのために、ＬＲ７細胞にＣＲ８８ ｍＩＢＶを感染させ、ＮｏｔＩ線状化ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ Ｓ Ｌ２６９Ｃドナープラスミドから作製したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物を用いて電気穿孔し、次いで８日齢の胚含有ＳＰＦ鶏卵（ＶＡＬＯ ＢｉｏＭｅｄｉａ）に注射する。８日までのインキュベーションの後、全ての卵の尿膜腔液を、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるＲＮＡ単離後に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、組換えＩＢＶのレスキューについて個別に分析する。ＣＲ８８ ＩＢＶ １ａｂおよびＣＲ８８ ＩＢＶ Ｓスパイクに結合するプライマーＰＯ１７２８およびＰＯ１７２９（表５）を、組換えＩＢＶをｍＩＢＶから区別するのに使用する。最高希釈のＬＲ７細胞を接種した卵の陽性尿膜腔液を８日齢胚含有ＳＰＦ卵のエンドポイント希釈に使用する。核酸単離は、上述のように行う。試料は、Callison et al. (J Virol Methods. 2006;138(1-2):60-5)から適応させたプロトコールにしたがって、ＲＴ－ｑＰＣＲにより解析する。簡潔には、同一のプライマーおよびプローブを使用して、熱プロファイルを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓまたはＡＢＩ７９００ ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の使用に適用させる。その後、高希釈の１つの陽性試験尿膜腔液を８日齢胚含有ＳＰＦ鶏卵における増殖のために使用する。尿膜腔液を、１ｘＰＢＳ中で１：１００に希釈し、卵当たり１００μｌを注射し、これを次いで３７．５℃および湿度６０％でインキュベーションする。尿膜腔液を接種後４８時間において回収し、デブリを除き、－８０℃において保存する。
【0159】
【表5】
【0160】
組換えＩＢＶのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび卵中特徴付け
ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃについての胚感染用量５０％（ＥＩＤ50）および組織培養感染用量５０％（ＴＣＩＤ50）をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載するように決定する。さらに、卵中およびｉｎ ｖｉｔｒｏ複製動態および継代をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載するように行った。
類似の卵中複製動態が、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ野生型およびＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃについて観察される（図１０）。これは、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ野生型について示されているように、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃのスパイクにおけるシステイン突然変異が、野生型ｒＩＢＶ ＣＲ８８と比較して、突然変異ｒＩＢＶ卵中複製について不利益がないことを示している。
ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃについての胚感染用量５０％（ＥＩＤ50）および組織培養感染用量５０％（ＴＣＩＤ50）をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載するように決定する。さらに、卵中およびｉｎ ｖｉｔｒｏ複製動態および継代をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載するように行った。
類似の卵中複製動態が、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ野生型およびＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃについて観察される（図１０）。これは、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ野生型について示されているように、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃのスパイクにおけるシステイン突然変異が、野生型ｒＩＢＶ ＣＲ８８と比較して、突然変異ｒＩＢＶ卵中複製について不利益がないことを示している。
【0161】
ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃが細胞中で複製できるかどうかを分析するために、Ｅｂ６６（登録商標）細胞に、尿膜腔液ストックの１／１００希釈を接種する。ウイルスの増殖は、１回目および以後の継代における７２時間後のｃｔ値の低下により検出する。次の継代のためにウイルスを希釈するため、ｃｔ値は、接種物の回収時に測定したｃｔ値と比較して上昇しており、その後、ウイルス複製により７２時間の培養の間に再び低下する。ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃの複製は、感染直後の０時間のタイムポイントと比較して、７２時間のタイムポイントについて、ｃｔ値を低下させることにより、継代プロセスにわたって明確に可視化できる。対照的に、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ野生型陰性対照のｃｔ値は、解析した継代および継代プロセス中の最初の接種物の希釈においてこのウイルスが複製しないことが確認されている（図１１）。結果は、７回の継代にわたる、Ｅｂ６６（登録商標）細胞におけるＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｌ２６９Ｃの複製を明確に示しており、一方野生型ウイルスは複製することができず、これによりスパイクにおけるＬ２６９Ｃ突然変異が拡張された細胞または組織指向性に重要であることが強調されている。ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃについての効率的な複製もまた、ＲＴ－ｑＰＣＲ（図１２）およびＥｂ６６（登録商標）細胞における複製動態試験におけるＴＣＩＤ50決定（図１３）により検出される。
【0162】
さらに、尿膜腔液ストック（１０3ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０8ＥＩＤ50／ｍｌ）およびＥｂ６６（登録商標）継代Ｐ１（１０3.5ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０5.84ＥＩＤ50／ｍｌ）、Ｐ５（１０5.3ＴＣＩＤ50／ｍｌ）およびＰ８（１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０6ＥＩＤ50／ｍｌ）についての感染力価を決定する。Ｅｂ６６（登録商標）継代プロセス間のＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃの効率的な複製およびＳＰＦ卵中における感染力の維持が確認されている。したがって、Ｌ２６９Ｃ突然変異は、卵中の複製能を妨げることなく細胞系において複製を可能にしている。
【0163】
ワクチン有効性の決定
ＩＢＶ ７９３Ｂによる暴露に対するＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃの有効性についての試験を、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６９Ｃについて上述されているように行う。試験の目的は、Ｅｂ６６（登録商標）細胞中で１回継代した、細胞培養適応したＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃが、病原性７９３Ｂ株に対する保護を付与することができることを示すことである。全てのニワトリを、臨床徴候について毎日観察し、ワクチン接種または暴露後に記録されている臨床徴候はない。１日齢におけるＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃによるワクチン接種のための逆滴定により、それぞれ、１０3.6ＥＩＤ50／動物（標的１０3ＥＩＤ50／動物）の力価、およびワクチン接種後２１日目におけるＩＢＶ ７９３Ｂによる暴露についての１０4.1ＥＩＤ50／動物（標的１０4ＥＩＤ50／動物）の力価が決定される。線毛運動障害は、表３に記載するように、スコア付けされ、結果は図１４に示し、表６に概略する。厳密な陰性対照の全ての動物は、正常な線毛運動を示し、一方、暴露対照群の動物の５匹のうち４匹は、線毛運動障害について陽性である。対照的に、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃによりワクチン接種した動物の８０％は保護されている。
ＩＢＶ ７９３Ｂによる暴露に対するＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃの有効性についての試験を、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６９Ｃについて上述されているように行う。試験の目的は、Ｅｂ６６（登録商標）細胞中で１回継代した、細胞培養適応したＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃが、病原性７９３Ｂ株に対する保護を付与することができることを示すことである。全てのニワトリを、臨床徴候について毎日観察し、ワクチン接種または暴露後に記録されている臨床徴候はない。１日齢におけるＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃによるワクチン接種のための逆滴定により、それぞれ、１０3.6ＥＩＤ50／動物（標的１０3ＥＩＤ50／動物）の力価、およびワクチン接種後２１日目におけるＩＢＶ ７９３Ｂによる暴露についての１０4.1ＥＩＤ50／動物（標的１０4ＥＩＤ50／動物）の力価が決定される。線毛運動障害は、表３に記載するように、スコア付けされ、結果は図１４に示し、表６に概略する。厳密な陰性対照の全ての動物は、正常な線毛運動を示し、一方、暴露対照群の動物の５匹のうち４匹は、線毛運動障害について陽性である。対照的に、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃによりワクチン接種した動物の８０％は保護されている。
【0164】
【表6】
【0165】
さらに、ウイルスＲＮＡ負荷は、暴露対照と比較してＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃによりワクチン接種した動物の腎臓において有意に低下している（図１５）。まとめると、Ｅｂ６６（登録商標）細胞において増殖したＣＲ８８ ｒＩＢＶ Ｓ Ｌ２６９Ｃは、病原性７９３Ｂ暴露に対して効率的に保護する。スパイク突然変異Ｌ２６９Ｃは、細胞における増殖に対してウイルスを適応させるが、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性は維持されている。
結論実施例２：前記データは、また、ＣＲ８８スパイク配列の２６９位に対応するスパイクの２６７位（番号付けについての参照配列は配列番号１である）におけるシステインへの突然変異は、組換えＩＢＶ ＣＲ８８における拡張された細胞または組織指向性をもたらすものであることを示している。さらに、前記突然変異は、ウイルスの卵中複製に対して影響を及ぼさない。最終的に、ワクチン有効性は、細胞系における継代の後においても維持されており、卵中培養を必要とせずに、代わりに細胞系を使用してＩＢＶワクチンの開発が成功する基礎となっている。
結論実施例２：前記データは、また、ＣＲ８８スパイク配列の２６９位に対応するスパイクの２６７位（番号付けについての参照配列は配列番号１である）におけるシステインへの突然変異は、組換えＩＢＶ ＣＲ８８における拡張された細胞または組織指向性をもたらすものであることを示している。さらに、前記突然変異は、ウイルスの卵中複製に対して影響を及ぼさない。最終的に、ワクチン有効性は、細胞系における継代の後においても維持されており、卵中培養を必要とせずに、代わりに細胞系を使用してＩＢＶワクチンの開発が成功する基礎となっている。
【0166】
（実施例３）
スパイクタンパク質のアミノ酸２７０がシステインに突然変異されているＱＸスパイク遺伝子により、ＣＲ８８またはＨ５２スパイク遺伝子が置換されているキメラ組換えＩＢＶ ＣＲ８８またはＨ５２の作製
細胞培養指向性を達成するためのスパイクの２６７位におけるシステインへの変化をさらなるＩＢＶ遺伝子型に移入し得るかどうかをさらに詳述するため、ＱＸスパイクアミノ酸（配列番号６５）配列をＨ５２スパイクアミノ酸（配列番号１）に整列し、ＩＢＶ ＱＸスパイクについて、Ｈ５２スパイクのアミノ酸２６７位に相当する位置を決定し、これは、ＱＸスパイクの２７０位におけるロイシンと決定された。
スパイクタンパク質のアミノ酸２７０がシステインに突然変異されているＱＸスパイク遺伝子により、ＣＲ８８またはＨ５２スパイク遺伝子が置換されているキメラ組換えＩＢＶ ＣＲ８８またはＨ５２の作製
細胞培養指向性を達成するためのスパイクの２６７位におけるシステインへの変化をさらなるＩＢＶ遺伝子型に移入し得るかどうかをさらに詳述するため、ＱＸスパイクアミノ酸（配列番号６５）配列をＨ５２スパイクアミノ酸（配列番号１）に整列し、ＩＢＶ ＱＸスパイクについて、Ｈ５２スパイクのアミノ酸２６７位に相当する位置を決定し、これは、ＱＸスパイクの２７０位におけるロイシンと決定された。
【0167】
アミノ酸２７０位におけるシステインへの突然変異を有するＱＸスパイクの細胞への感染能を解析するために、ＣＲ８８スパイクまたはＨ５２スパイクをそれぞれコードする配列が、スパイクタンパク質の２７０位においてシステインを有するＱＸスパイクをコードする配列に置換されている（配列番号４）組換えＩＢＶ ＣＲ８８および組換えＩＢＶ Ｈ５２を作製する。このために、Ｈ５２ ｍＩＢＶ およびＣＲ８８ ｍＩＢＶの構築およびレスキューのステップを実施例１および２に記載しているように行う。
ＱＸスパイク遺伝子のクローニングおよび突然変異
ＱＸスパイク配列をプライマーＰＯ１３６７およびＰＯ１３４７（表７）を使用したワンステップＲＴ－ＰＣＲ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）を使用して、ＩＢＶ ＱＸウイルスＲＮＡから増幅し、ｐＧＥＭ－Ｔ ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してクローニングする。これは、ＮＥＢａｓｅＣｈａｎｇｅｒを用いて設計したプライマーＰＯ２１６３およびＰＯ２１６４（表７）を使用した部位特異的突然変異誘発のための鋳型として機能し、プラスミドｐＧＥＭ－Ｔ ＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃ（配列番号６６）を作製する。所望の突然変異を保有するプラスミドを有するクローンを特定するために、陽性制限消化を行った後に、突然変異に隣接する領域に位置するプライマーＰＯ１３９８およびＰＯ６３３を用いたＳａｎｇｅｒ配列決定を行う（表７）。
ＱＸスパイク遺伝子のクローニングおよび突然変異
ＱＸスパイク配列をプライマーＰＯ１３６７およびＰＯ１３４７（表７）を使用したワンステップＲＴ－ＰＣＲ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）を使用して、ＩＢＶ ＱＸウイルスＲＮＡから増幅し、ｐＧＥＭ－Ｔ ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してクローニングする。これは、ＮＥＢａｓｅＣｈａｎｇｅｒを用いて設計したプライマーＰＯ２１６３およびＰＯ２１６４（表７）を使用した部位特異的突然変異誘発のための鋳型として機能し、プラスミドｐＧＥＭ－Ｔ ＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃ（配列番号６６）を作製する。所望の突然変異を保有するプラスミドを有するクローンを特定するために、陽性制限消化を行った後に、突然変異に隣接する領域に位置するプライマーＰＯ１３９８およびＰＯ６３３を用いたＳａｎｇｅｒ配列決定を行う（表７）。
【0168】
【表7】
【0169】
ドナープラスミド構築
ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃドナープラスミド（配列番号６９）を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）およびプライマー設計用のオンラインツールを使用して構築する。このために、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶドナープラスミド（配列番号９）を、プラスミドを線状化し、Ｈ５２スパイクおよび隣接配列を取り除くために、Ｈ５２スパイクコード配列に近接した制限部位ＥｃｏＲＶ、ＰｍｌＩおよびＢｌｐＩを使用して消化する。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、Ｈ５２スパイクコード配列を含まないｐＵＣ５７－ｓ ＩＢＶ Ｈ５２骨格に相当するバンドを精製する。ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃ核酸コード配列および隣接する５’および３’ＩＢＶ Ｈ５２配列をＱ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ、プライマーについては表８を参照）を使用する３回の別個のＰＣＲ反応において増幅する。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、キットプロトコールにしたがってＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙに使用し、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃ（配列番号６９）ドナープラスミドを作製する。
ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃドナープラスミド（配列番号６９）を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）およびプライマー設計用のオンラインツールを使用して構築する。このために、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶドナープラスミド（配列番号９）を、プラスミドを線状化し、Ｈ５２スパイクおよび隣接配列を取り除くために、Ｈ５２スパイクコード配列に近接した制限部位ＥｃｏＲＶ、ＰｍｌＩおよびＢｌｐＩを使用して消化する。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、Ｈ５２スパイクコード配列を含まないｐＵＣ５７－ｓ ＩＢＶ Ｈ５２骨格に相当するバンドを精製する。ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃ核酸コード配列および隣接する５’および３’ＩＢＶ Ｈ５２配列をＱ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ、プライマーについては表８を参照）を使用する３回の別個のＰＣＲ反応において増幅する。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、キットプロトコールにしたがってＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙに使用し、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃ（配列番号６９）ドナープラスミドを作製する。
【0170】
ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃドナープラスミド（配列番号６８）を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）およびプライマー設計用のオンラインツールを使用して構築する。２つのＰＣＲ断片を作製し、１つは、鋳型としてｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ（配列番号６７）を使用してＣＲ８８骨格について、１つはＱ５ ＰＣＲのための鋳型として、ｐＧＥＭ－Ｔ ＩＢＶ ＣＲ８８ Ｓ Ｌ２７０Ｃ（配列番号６６）を使用して突然変異ＱＸスパイクＬ２７０Ｃについて表８のプライマーを使用して作製する。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製した後、キットプロトコールにしたがってＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙに使用し、ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃドナープラスミド（配列番号６８）を作製する。
【0171】
【表8】
【0172】
ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃのアセンブリの成功は、それぞれＮｈｅＩおよびＮｏｔＩまたはＥｃｏＲＶ、ＢｌｐＩおよびＰｍｌＩによるプラスミド制限消化によって特定し、表９のプライマーによる配列決定により特徴付ける。
【表9】
【0173】
標的化ＲＮＡ組換えおよび組換えＩＢＶのレスキュー
ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃのレスキューのために、ＬＲ７細胞をそれぞれＣＲ８８ ｍＩＢＶまたはＨ５２ ｍＩＢＶによって感染させ、それぞれＮｏｔＩまたはＭｓｓＩ線状化ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣまたはｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃドナープラスミドから作製したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物により電気穿孔し、次いで８日齢の胚含有ＳＰＦ鶏卵（ＶＡＬＯ ＢｉｏＭｅｄｉａ）に注射する。８日間までのインキュベーション後、いくつかの卵の尿膜腔液を、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるＲＮＡ単離後に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、組換えＩＢＶのレスキューについて個別に分析する。ＱＸスパイク配列に結合するプライマーＰＯ１３９８およびＰＯ６３３（表７）を、組換えウイルスを特定するのに使用する。最高希釈のＬＲ７細胞を接種した卵の陽性尿膜腔液（胚性死または陽性ＲＴ－ＰＣＲ結果により定義される）を８日齢胚含有ＳＰＦ卵のエンドポイント希釈に使用する。核酸単離は、上述のように行う。試料は、Callison et al. (J Virol Methods. 2006;138(1-2):60-5)から適応させたプロトコールにしたがって、ＲＴ－ｑＰＣＲにより解析する。簡潔には、同一のプライマーおよびプローブを使用して、熱プロファイルを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓまたはＡＢＩ７９００ ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の使用に適用させる。その後、好ましくは高希釈の１つの陽性試験尿膜腔液を８日齢胚含有ＳＰＦ鶏卵における増殖のために使用する。尿膜腔液を、１ｘＰＢＳ 中で１：１００に希釈し、卵当たり１００μｌを注射し、これを次いで３７．５℃および湿度６０％でインキュベーションする。尿膜腔液を接種後、４８時間において回収し、デブリを除き、－８０℃において保存する。
ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃのレスキューのために、ＬＲ７細胞をそれぞれＣＲ８８ ｍＩＢＶまたはＨ５２ ｍＩＢＶによって感染させ、それぞれＮｏｔＩまたはＭｓｓＩ線状化ｐＵＣ５７－ｓ ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣまたはｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃドナープラスミドから作製したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物により電気穿孔し、次いで８日齢の胚含有ＳＰＦ鶏卵（ＶＡＬＯ ＢｉｏＭｅｄｉａ）に注射する。８日間までのインキュベーション後、いくつかの卵の尿膜腔液を、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるＲＮＡ単離後に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、組換えＩＢＶのレスキューについて個別に分析する。ＱＸスパイク配列に結合するプライマーＰＯ１３９８およびＰＯ６３３（表７）を、組換えウイルスを特定するのに使用する。最高希釈のＬＲ７細胞を接種した卵の陽性尿膜腔液（胚性死または陽性ＲＴ－ＰＣＲ結果により定義される）を８日齢胚含有ＳＰＦ卵のエンドポイント希釈に使用する。核酸単離は、上述のように行う。試料は、Callison et al. (J Virol Methods. 2006;138(1-2):60-5)から適応させたプロトコールにしたがって、ＲＴ－ｑＰＣＲにより解析する。簡潔には、同一のプライマーおよびプローブを使用して、熱プロファイルを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓまたはＡＢＩ７９００ ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の使用に適用させる。その後、好ましくは高希釈の１つの陽性試験尿膜腔液を８日齢胚含有ＳＰＦ鶏卵における増殖のために使用する。尿膜腔液を、１ｘＰＢＳ 中で１：１００に希釈し、卵当たり１００μｌを注射し、これを次いで３７．５℃および湿度６０％でインキュベーションする。尿膜腔液を接種後、４８時間において回収し、デブリを除き、－８０℃において保存する。
【0174】
組換えＩＢＶのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび卵中特徴付け
ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃについての胚感染用量５０％（ＥＩＤ５０）および組織培養感染用量５０％（ＴＣＩＤ５０）をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載されているように決定する。さらに、卵中およびｉｎ ｖｉｔｒｏ複製動態および継代をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載されているように行った。
ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃについての胚感染用量５０％（ＥＩＤ５０）および組織培養感染用量５０％（ＴＣＩＤ５０）をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載されているように決定する。さらに、卵中およびｉｎ ｖｉｔｒｏ複製動態および継代をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載されているように行った。
【0175】
４８時間後、卵中複製動態においてわずかに異なる類似のピークｃｔ値が、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃについて観察される（図１６）。ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＣ Ｌ２７０Ｃは、ＣＲ８８ ｒＩＢＶおよびＩＢＶ ＱＸ野生型と非常に類似した複製をするが、Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ ｓ Ｌ２７０Ｃは、Ｈ５２ ｒＩＢＶにより類似した複製をする。これは、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃのスパイクにおけるシステイン突然変異が、他のｒＩＢＶおよび野生型ＩＢＶと比較して、突然変異ｒＩＢＶの卵中複製効率について不利益がないことを示している。
【0176】
ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃが細胞中で複製できるかどうかを分析するために、ＥＢ６６（登録商標）細胞に、尿膜腔液ストックの１／１００希釈を接種する。ウイルスの増殖は、ウイルスＲＮＡの単離および続くＲＴ－ｑＰＣＲ解析により解析する。ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの複製は、感染直後の０時間のタイムポイントと比較して、７２時間のタイムポイントについて、平均ｃｔ値を低下させることにより、継代プロセスにわたって明確に可視化できる（図１７および図１８）。次の継代のためにウイルスを希釈するため、ｃｔ値は、接種物の回収時に測定したｃｔ値と比較して上昇しており、その後、ウイルス複製により７２時間の培養の間に再び低下する。ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃについての効率的な複製はまた、Ｅｂ６６（登録商標）細胞における複製動態試験において、ＲＴ－ｑＰＣＲにより検出される（図１９）。両方のウイルスは、４８時間後に、ピークＣＴ値を有する類似の複製パターンを示す。
【0177】
さらに、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの尿膜腔液ストック（１０8ＥＩＤ50／ｍｌ）およびＥｂ６６（登録商標）継代Ｐ２（１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０8.17ＥＩＤ50／ｍｌ）、Ｐ６（１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０7.83ＥＩＤ50／ｍｌ）およびＰ９（１０6ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０8.5ＥＩＤ50／ｍｌ）についての感染力価を決定する。さらに、Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの尿膜腔液ストック（１０8ＥＩＤ50／ｍｌ）およびＥｂ６６（登録商標）継代Ｐ３（１０4.5ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０8.13ＥＩＤ50／ｍｌ）およびＰ６（１０5.5ＴＣＩＤ50／ｍｌ、１０8.13ＥＩＤ50／ｍｌ）についての感染力価を決定する。Ｅｂ６６（登録商標）継代プロセス間のＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの効率的な複製およびＳＰＦ卵中における感染力の維持が確認されている。したがって、Ｌ２７０Ｃ突然変異は、卵中の複製能を妨げることなく細胞系において複製を可能にしている。
【0178】
ワクチン有効性の決定
ＩＢＶ Ｄ３８８ ＱＸによる暴露に対するＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの有効性についての試験を、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６９Ｃについて上述されているように行う。試験の目的は、ＥＢ６６（登録商標）細胞中で６回継代した、細胞培養適応したＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃが、病原性Ｄ３８８ ＱＸ株に対する保護を付与することができることを示すことである。全てのニワトリを、臨床徴候について毎日観察する。ワクチン接種または暴露後に記録されている臨床徴候はない。１日齢におけるＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃによるワクチン接種のための逆滴定により、それぞれ、１０4.2ＥＩＤ50／動物および１０3.3ＥＩＤ50／動物（標的１０3ＥＩＤ50／動物）の力価、および、ワクチン接種後２１日目におけるＩＢＶ Ｄ３８８ ＱＸによる暴露についての１０3.5ＥＩＤ50／動物（標的１０3ＥＩＤ50／動物）の力価が決定される。線毛運動障害は、表３に記載するように、スコア付けされ、結果は図２０に示し、表６に概略する。厳密な陰性対照の全ての動物は、正常な線毛運動を示し、一方、暴露対照群の動物は全て、線毛運動障害について陽性である。対照的に、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣまたはＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃによりワクチン接種した動物の７８％および９１％が保護されている。
ＩＢＶ Ｄ３８８ ＱＸによる暴露に対するＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃの有効性についての試験を、Ｈ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６９Ｃについて上述されているように行う。試験の目的は、ＥＢ６６（登録商標）細胞中で６回継代した、細胞培養適応したＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃが、病原性Ｄ３８８ ＱＸ株に対する保護を付与することができることを示すことである。全てのニワトリを、臨床徴候について毎日観察する。ワクチン接種または暴露後に記録されている臨床徴候はない。１日齢におけるＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃによるワクチン接種のための逆滴定により、それぞれ、１０4.2ＥＩＤ50／動物および１０3.3ＥＩＤ50／動物（標的１０3ＥＩＤ50／動物）の力価、および、ワクチン接種後２１日目におけるＩＢＶ Ｄ３８８ ＱＸによる暴露についての１０3.5ＥＩＤ50／動物（標的１０3ＥＩＤ50／動物）の力価が決定される。線毛運動障害は、表３に記載するように、スコア付けされ、結果は図２０に示し、表６に概略する。厳密な陰性対照の全ての動物は、正常な線毛運動を示し、一方、暴露対照群の動物は全て、線毛運動障害について陽性である。対照的に、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣまたはＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃによりワクチン接種した動物の７８％および９１％が保護されている。
【0179】
【表10】
【0180】
さらに、ウイルスＲＮＡ負荷は、暴露対照動物と比較してＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣまたはＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｌ２７０Ｃによりワクチン接種した動物の腎臓において有意に低下している（図２１）。まとめると、ＥＢ６６（登録商標）細胞において増殖したＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃは、病原性Ｄ３８８ ＱＸ暴露に対して効率的に保護する。スパイク突然変異Ｌ２７０Ｃは、細胞における増殖に対してウイルスを適応させるが、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性は維持されている。
結論実施例３：前記データは、また、ＩＢＶ ＱＸスパイクの２７０位に対応するスパイクの２６７位（番号付けについての参照配列は配列番号１である）におけるシステインへの突然変異は、拡張された細胞または組織指向性をもたらすものであることを示している。さらに、システイン突然変異を有するスパイクの組織培養指向性は、同種の遺伝的背景に限定されておらず、これはＱＸ Ｌ２７０ＣスパイクがＣＲ８８およびＨ５２遺伝的背景に挿入されており、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃが、細胞中において効率的に複製し、病原性ＩＢＶ Ｄ３８８ ＱＸ暴露に対して効率的に保護するためである。
結論実施例３：前記データは、また、ＩＢＶ ＱＸスパイクの２７０位に対応するスパイクの２６７位（番号付けについての参照配列は配列番号１である）におけるシステインへの突然変異は、拡張された細胞または組織指向性をもたらすものであることを示している。さらに、システイン突然変異を有するスパイクの組織培養指向性は、同種の遺伝的背景に限定されておらず、これはＱＸ Ｌ２７０ＣスパイクがＣＲ８８およびＨ５２遺伝的背景に挿入されており、ＣＲ８８ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０ＣおよびＨ５２ ｒＩＢＶ ＱＸ Ｓ Ｌ２７０Ｃが、細胞中において効率的に複製し、病原性ＩＢＶ Ｄ３８８ ＱＸ暴露に対して効率的に保護するためである。
【0181】
（実施例４）
スパイクタンパク質のアミノ酸２７４がシステインに突然変異されているＡＲＫＤＰＩスパイク外部ドメインコード配列により、Ｈ５２スパイク外部ドメインコード配列が置換されているキメラ組換えＩＢＶ Ｈ５２の作製
細胞培養指向性を達成するためのスパイクの２６７位におけるシステインへの変化をさらなるＩＢＶ遺伝子型に移行し得るかどうかをさらに詳述するため、ＡｒｋＤＰＩスパイクアミノ酸（配列番号７６）配列をＨ５２スパイクアミノ酸配列（配列番号１）に整列し、ＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩスパイクについて、Ｈ５２スパイクのアミノ酸２６７位に相当する位置を決定し、これは、ＡｒｋＤＰＩスパイクの２７４位におけるロイシンと決定された。
アミノ酸２７４位におけるシステインへの突然変異を有するＡｒｋＤＰＩスパイクの細胞への感染能を解析するために、Ｈ５２スパイクをコードする配列が、ＡｒｋＤＰＩスパイクタンパク質の２７４位においてシステインを有するＡｒｋＤＰＩスパイクをコードする配列に置換されている（配列番号７７）組換えＩＢＶ Ｈ５２を作製する。このために、Ｈ５２ ｍＩＢＶの構築およびレスキューのステップを実施例１に記載されているように行う。
スパイクタンパク質のアミノ酸２７４がシステインに突然変異されているＡＲＫＤＰＩスパイク外部ドメインコード配列により、Ｈ５２スパイク外部ドメインコード配列が置換されているキメラ組換えＩＢＶ Ｈ５２の作製
細胞培養指向性を達成するためのスパイクの２６７位におけるシステインへの変化をさらなるＩＢＶ遺伝子型に移行し得るかどうかをさらに詳述するため、ＡｒｋＤＰＩスパイクアミノ酸（配列番号７６）配列をＨ５２スパイクアミノ酸配列（配列番号１）に整列し、ＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩスパイクについて、Ｈ５２スパイクのアミノ酸２６７位に相当する位置を決定し、これは、ＡｒｋＤＰＩスパイクの２７４位におけるロイシンと決定された。
アミノ酸２７４位におけるシステインへの突然変異を有するＡｒｋＤＰＩスパイクの細胞への感染能を解析するために、Ｈ５２スパイクをコードする配列が、ＡｒｋＤＰＩスパイクタンパク質の２７４位においてシステインを有するＡｒｋＤＰＩスパイクをコードする配列に置換されている（配列番号７７）組換えＩＢＶ Ｈ５２を作製する。このために、Ｈ５２ ｍＩＢＶの構築およびレスキューのステップを実施例１に記載されているように行う。
【0182】
ドナープラスミド構築
ｐＵＣ５７－ｓ ＡｒｋＤＰＩスパイクＬ２７４Ｃプラスミド（配列番号７８）を、市販の業者により合成する。ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃドナープラスミド（配列番号７９）を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）およびプライマー設計用のオンラインツールを使用して構築する。このために、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶドナープラスミド（配列番号９）を、プラスミドを線状化し、Ｈ５２スパイクおよび隣接配列を取り除くために、Ｈ５２スパイクコード配列に近接した制限部位ＥｃｏＲＶ、ＰｍｌＩおよびＢｌｐＩを使用して消化する。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、Ｈ５２スパイクコード配列を含まないｐＵＣ５７－ｓ ＩＢＶ Ｈ５２骨格に相当するバンドを精製する。ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃ核酸コード配列および隣接する５’および３’ＩＢＶ Ｈ５２配列をＱ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ、プライマーについては表１１を参照）を使用する３回の別個のＰＣＲ反応において増幅する。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、キットプロトコールにしたがってＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙに使用し、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃ（配列番号７９）ドナープラスミドを作製する。
ｐＵＣ５７－ｓ ＡｒｋＤＰＩスパイクＬ２７４Ｃプラスミド（配列番号７８）を、市販の業者により合成する。ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃドナープラスミド（配列番号７９）を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）およびプライマー設計用のオンラインツールを使用して構築する。このために、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶドナープラスミド（配列番号９）を、プラスミドを線状化し、Ｈ５２スパイクおよび隣接配列を取り除くために、Ｈ５２スパイクコード配列に近接した制限部位ＥｃｏＲＶ、ＰｍｌＩおよびＢｌｐＩを使用して消化する。ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、Ｈ５２スパイクコード配列を含まないｐＵＣ５７－ｓ ＩＢＶ Ｈ５２骨格に相当するバンドを精製する。ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃ核酸コード配列および隣接する５’および３’ＩＢＶ Ｈ５２配列をＱ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ、プライマーについては表１１を参照）を使用する３回の別個のＰＣＲ反応において増幅する。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、キットプロトコールにしたがってＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を使用してＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙに使用し、ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃ（配列番号７９）ドナープラスミドを作製する。
【0183】
【表11】
ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃのアセンブリの成功は、ＢｌｐＩおよびＸｈｏＩによるプラスミド制限消化により特定する。
【0184】
標的化ＲＮＡ組換えおよび組換えＩＢＶのレスキュー
Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃのレスキューのために、ＬＲ７細胞をＨ５２ ｍＩＢＶによって感染させ、ＭｓｓＩ線状化ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃドナープラスミドから作製したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物により電気穿孔し、次いで８日齢の胚含有ＳＰＦ鶏卵（ＶＡＬＯ ＢｉｏＭｅｄｉａ）に注射する。８日までのインキュベーション後、いくつかの卵の尿膜腔液を、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるＲＮＡ単離後に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、組換えＩＢＶのレスキューについて個別に分析した。ＡｒｋＤＰＩスパイク配列に結合するプライマーＰＯ１３１７およびＰＯ６３３（表１２）を、組換えウイルスのレスキューを特定するのに使用する。最高希釈のＬＲ７細胞を接種した卵の陽性尿膜腔液（胚性死または陽性ＲＴ－ＰＣＲ結果により定義される）を８日齢胚含有ＳＰＦ卵のエンドポイント希釈に使用する。核酸単離は、上述のように行う。試料は、Callison et al. (J Virol Methods. 2006;138(1-2):60-5)から適応させたプロトコールにしたがって、ＲＴ－ｑＰＣＲにより解析する。簡潔には、同一のプライマーおよびプローブを使用して、熱プロファイルを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓまたはＡＢＩ７９００ ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の使用に適用させる。その後、好ましくは高希釈の１つの陽性試験尿膜腔液を８日齢胚含有ＳＰＦ鶏卵における増殖のために使用する。尿膜腔液を、１ｘＰＢＳ中で１：１００に希釈し、卵当たり１００μｌを注射し、これを次いで３７．５℃および湿度６０％でインキュベーションする。尿膜腔液を接種後、４８時間において回収し、デブリを除き、－８０℃において保存する。
Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃのレスキューのために、ＬＲ７細胞をＨ５２ ｍＩＢＶによって感染させ、ＭｓｓＩ線状化ｐＵＣ５７－ｓ Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃドナープラスミドから作製したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物により電気穿孔し、次いで８日齢の胚含有ＳＰＦ鶏卵（ＶＡＬＯ ＢｉｏＭｅｄｉａ）に注射する。８日までのインキュベーション後、いくつかの卵の尿膜腔液を、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｃｏｒｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）Ｄｕｏ Ｐｒｉｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるＲＮＡ単離後に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、組換えＩＢＶのレスキューについて個別に分析した。ＡｒｋＤＰＩスパイク配列に結合するプライマーＰＯ１３１７およびＰＯ６３３（表１２）を、組換えウイルスのレスキューを特定するのに使用する。最高希釈のＬＲ７細胞を接種した卵の陽性尿膜腔液（胚性死または陽性ＲＴ－ＰＣＲ結果により定義される）を８日齢胚含有ＳＰＦ卵のエンドポイント希釈に使用する。核酸単離は、上述のように行う。試料は、Callison et al. (J Virol Methods. 2006;138(1-2):60-5)から適応させたプロトコールにしたがって、ＲＴ－ｑＰＣＲにより解析する。簡潔には、同一のプライマーおよびプローブを使用して、熱プロファイルを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １－Ｓｔｅｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓまたはＡＢＩ７９００ ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の使用に適用させる。その後、好ましくは高希釈の１つの陽性試験尿膜腔液を８日齢胚含有ＳＰＦ鶏卵における増殖のために使用する。尿膜腔液を、１ｘＰＢＳ中で１：１００に希釈し、卵当たり１００μｌを注射し、これを次いで３７．５℃および湿度６０％でインキュベーションする。尿膜腔液を接種後、４８時間において回収し、デブリを除き、－８０℃において保存する。
【0185】
【表12】
【0186】
組換えＩＢＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴付け
Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃについての胚感染用量５０％（ＥＩＤ５０）および組織培養感染用量５０％（ＴＣＩＤ５０）をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載されているように決定する。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製動態および継代をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載されているように行う。
Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃが細胞中で複製できるかどうかを分析するために、ＥＢ６６（登録商標）細胞に、１回目の継代の尿膜腔液ストックの１／１０希釈および以後の継代の１／１０または１／１００希釈を接種する。ウイルスの増殖は、ウイルスＲＮＡの単離および続くＲＴ－ｑＰＣＲ解析により解析する。Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃの複製は、感染直後の０時間のタイムポイント（２１．０９）と比較して、７２時間のタイムポイント（１１．５９）について、平均ｃｔ値を低下させることにより、３回の継代後に明確に可視化できる。
Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃについての胚感染用量５０％（ＥＩＤ５０）および組織培養感染用量５０％（ＴＣＩＤ５０）をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載されているように決定する。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製動態および継代をＨ５２ ｒＩＢＶ Ｓ Ｆ２６７Ｃについて記載されているように行う。
Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃが細胞中で複製できるかどうかを分析するために、ＥＢ６６（登録商標）細胞に、１回目の継代の尿膜腔液ストックの１／１０希釈および以後の継代の１／１０または１／１００希釈を接種する。ウイルスの増殖は、ウイルスＲＮＡの単離および続くＲＴ－ｑＰＣＲ解析により解析する。Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃの複製は、感染直後の０時間のタイムポイント（２１．０９）と比較して、７２時間のタイムポイント（１１．５９）について、平均ｃｔ値を低下させることにより、３回の継代後に明確に可視化できる。
【0187】
結論実施例４：前記データは、また、ＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩスパイクの２７４位に対応するスパイクの２６７位（番号付けについての参照配列は配列番号１である）におけるシステインへの突然変異は、拡張された細胞または組織指向性をもたらすものであることを示している。さらに、システイン突然変異を有するスパイクの組織培養指向性は、同種の遺伝的背景に限定されておらず、これはＡｒｋＤＰＩ Ｌ２７４Ｃスパイク外部ドメインがＨ５２遺伝的背景に挿入されており、Ｈ５２ ｒＩＢＶ ＡｒｋＤＰＩ Ｓ Ｅｃｔｏ Ｌ２７４Ｃが、細胞中において効率的に複製するためである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】
【国際調査報告】