特表 2022-532022 トップダウン抗体解析における背景低減

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-13

(54)【発明の名称】トップダウン抗体解析における背景低減

(51)【国際特許分類】

   H01J 49/00 20060101AFI20220706BHJP

   H01J 49/42 20060101ALI20220706BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20220706BHJP

【ＦＩ】

H01J49/00 540

H01J49/42 150

H01J49/42 700

G01N27/62 E

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021557838

(86)(22)【出願日】2020-05-13

(85)【翻訳文提出日】2021-09-28

(86)【国際出願番号】 IB2020054543

(87)【国際公開番号】W WO2020230063

(87)【国際公開日】2020-11-19

(31)【優先権主張番号】62/847,130

(32)【優先日】2019-05-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510075457

【氏名又は名称】ディーエイチ テクノロジーズ デベロップメント プライベート リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】馬場 崇

(72)【発明者】

【氏名】リューミン， パヴェル

【テーマコード（参考）】

2G041

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041DA02

2G041DA05

2G041DA09

2G041GA03

2G041GA08

2G041GA09

(57)【要約】

複数のイオンを少なくとも１つのインタクト抗体を含有するサンプルから発生させるためのイオン源を利用することを伴う、抗体のトップダウン解析を実施するための方法およびデバイスが、説明される。さらに、ＲＦ信号をそこに印加しながら、分解ＤＣ電圧の不在下、優先的に、約１，５００ｍ／ｚの低質量カットオフ値を上回るｍ／ｚ値を有する、前駆体イオンを、四重極ロッドセットからＥＣＤセルに伝送するように、該複数のイオンを四重極ロッドセットを通して伝送する。本方法およびデバイスはまた、ＥＣＤ反応をＥＣＤセル内において該前駆体イオン上に実施し、また、反応生成物をＥＣＤ反応から検出することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体のトップダウン解析を実施するための方法であって、
イオン源を利用し、複数のイオンを少なくとも１つのインタクト抗体を含有するサンプルから発生させることと、
約１，５００ｍ／ｚの低質量カットオフ値を上回るｍ／ｚ値を有する前駆体イオンを、四重極ロッドセットからＥＣＤセルに優先的に伝送するように、分解ＤＣ電圧の不在下で、ＲＦ信号を前記四重極ロッドセットに印加しながら、前記複数のイオンを前記四重極ロッドセットを通して伝送することと、
ＥＣＤ反応を前記ＥＣＤセル内において前記前駆体イオンに実施することと、
反応生成物を前記ＥＣＤ反応から検出することと
を含む、方法。

【請求項2】

前記四重極ロッドセットは、Ｑ１を三連四重極内に備える、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記低質量カットオフ値が約１，７００ｍ／ｚであるように、前記ＲＦ信号の振幅および周波数のうちの少なくとも１つを調節することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記低質量カットオフ値が約２，０００ｍ／ｚであるように、前記ＲＦ信号の振幅および周波数のうちの少なくとも１つを調節することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

前記低質量カットオフ値は、約１，７００ｍ／ｚである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項6】

前記低質量カットオフ値は、約２，０００ｍ／ｚである、請求項１または２に記載の方法。

【請求項7】

前記反応生成物の少なくとも一部は、前記低質量カットオフ値を下回るｍ／ｚを有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

ＥＣＤ反応を実施することは、前記前駆体イオンを前記ＥＣＤセルを通して伝送しながら、電子を前記ＥＣＤセルの中に導入することを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記前駆体イオンは、複数の電荷状態にある前記抗体のイオンを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

複数の電荷状態にある前記抗体の前記イオンは、約２，０００～約４，０００の範囲内の少なくとも２つのｍ／ｚを呈する、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

質量分析計システムであって、
複数のイオンをインタクト抗体を含有するサンプルから発生させるためのイオン源と、
中心長手方向軸に沿って延在する四重極ロッドセットであって、前記四重極ロッドセットは、前記複数のイオンを前記イオン源から入口端を通して受け取り、前記イオンの少なくとも一部を出口端を通して伝送するように構成され、前記四重極ロッドセットは、前記中心長手方向軸の周囲に、かつ前記中心長手方向軸と平行に配置される第１の対の伸長ロッドおよび第２の対の伸長ロッドを備える、四重極ロッドセットと、
前記四重極ロッドセットから伝送されるイオンを受け取るためのＥＣＤセルであって、前記ＥＣＤセルの中で、前記四重極ロッドセットから受け取られた前記イオンが、電子と反応させられ、生成イオンを前記ＥＣＤセルから発生させる、ＥＣＤセルと、
前記生成イオンを検出するための検出器と、
前記四重極ロッドセットに電気的に結合される電力システムであって、前記電力システムは、約１，５００ｍ／ｚの低質量カットオフ値未満のｍ／ｚ値を有するイオンが、前記四重極ロッドセットから前記ＥＣＤセルに伝送されることを実質的に防止するように、分解ＤＣ電圧の不在下で、ＲＦ信号を前記四重極ロッドセットに提供するように構成される、電力システムと
を備える、システム。

【請求項12】

前記四重極ロッドセットは、Ｑ１を備える、請求項１１に記載のシステム。

【請求項13】

前記四重極ロッドセットは、約１×１０^－４Ｔｏｒｒ未満の圧力に維持されるチャンバ内に格納される、請求項１１または１２に記載のシステム。

【請求項14】

前記電力システムは、分解ＤＣ電圧の不在下で、ＲＦ信号を前記四重極ロッドセットに提供し、約１，７００ｍ／ｚの低質量カットオフ値未満のｍ／ｚ値を有するイオンが、前記四重極ロッドセットから前記ＥＣＤセルに伝送されることを実質的に防止するように構成される、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項15】

前記電力システムは、分解ＤＣ電圧の不在下で、ＲＦ信号を前記四重極ロッドセットに提供し、約２，０００ｍ／ｚの低質量カットオフ値未満のｍ／ｚ値を有するイオンが、前記四重極ロッドセットから前記ＥＣＤセルに伝送されることを実質的に防止するように構成される、請求項１１～１３のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項16】

前記ＲＦ信号の振幅を増加させ、前記低質量カットオフ値を増加させるように構成されるコントローラをさらに備える、請求項１１～１５のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項17】

前記生成イオンの少なくとも一部は、前記低質量カットオフ値を下回るｍ／ｚを有する、請求項１１～１６のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項18】

前記インタクト抗体は、約２，０００～約４，０００の範囲内のｍ／ｚを有する、請求項１１～１７のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項19】

電子を前記ＥＣＤセルの中に導入するための電子源をさらに備える、請求項１１～１８のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項20】

前記ＲＦ信号の振幅は、約０．１ｋＶ_ｐ－ｐ～約１０ｋＶ_ｐ－ｐの範囲内である、請求項１１～１９のいずれか１項に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１９年５月１３日に出願された米国仮出願第６２／８４７，１３０号の優先権の利益を主張し、その内容全体が、参照することによって本明細書に援用される。

【0002】

本発明は、インタクト抗体の質量の質量分析解析において電子捕捉解離（ＥＣＤ）を利用する方法および装置に関する。

【背景技術】

【0003】

質量分析法（ＭＳ）は、定量的および定質的用途の両方を有する試験物質の元素組成を決定するための解析技法である。例えば、ＭＳは、未知の化合物を同定するために、および／またはその断片化を観察することによって特定の化合物の構造を決定するために使用されることができる。最近、ＭＳは、ペプチドおよびタンパク質を特性評価および同定することにおけるＭＳ方略の速度、特異性、および感度に起因して、プロテオミクスにおいてますます重要な役割を果たしている。

【0004】

ＭＳベースのプロテオミクスにおいてタンパク質を特性評価することにおける１つの方略は、ペプチド断片をＭＳ解析（ＭＳ^１）またはタンデムＭＳ／ＭＳ解析（ＭＳ^２）に曝すことに先立って、着目タンパク質が（例えば、トリプシン、ＬｙｓＣ等を介した）酵素消化および１回以上の分離（例えば、多次元ＬＣ）を被る「ボトムアップ」アプローチである。「ボトムアップ」ＭＳ^２ワークフローでは、衝突誘発解離（ＣＩＤ）が、従来、第１のＭＳ段階において選択された前駆体ペプチド断片を生成イオン断片にさらに解離させるために利用されている。前駆体ペプチドイオンのアミノ酸配列が、次いで、生成イオン断片の質量から推測されることができる。ＣＩＤでは、イオン化された前駆体イオンと不活性中性ガスおよび／または窒素分子との間のエネルギー衝突が、バックボーンアミド結合を振動させ、最終的に、それを解離（開裂）させ、それによって、ｂ型（Ｎ末端）およびｙ型（Ｃ末端）生成イオンをもたらす。（例えば、タンパク質中の既知の配列またはゲノムデータベースを参照することによって）生成イオンペプチドのうちのいくつかを同定することによって、元のタンパク質が、決定されることができる。しかしながら、ＣＩＤ反応は、概して、最弱ペプチドアミド結合においてのみ生じるため、ペプチドバックボーンに沿った不完全な断片化は、ペプチド配列の完全な再構成を困難にし得る。プロテオミクスにおけるＣＩＤの使用に対する別の重要な限界は、解離の間の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の損失である。多くの場合ペプチドバックボーンに弱く結合のみされるＰＴＭ（例えば、リン酸化官能基または硫酸化官能基）は、断片化の間、ペプチドから剥奪され、それによって、ＭＳ^２スペクトルにおけるＰＴＭの検出および特性評価を妨げる。

【0005】

上記に説明される「ボトムアップ」アプローチとは対照的に、代替のＭＳベースのプロテオミクス方略は、代わりにインタクトタンパク質が例えばイオン間相互作用を利用して質量分析計内で解離を受ける「トップダウン」解析を利用する。従来のＣＩＤは、概して、解離させる部位が少なすぎて、完全な情報を提供し、インタクトタンパク質のアミノ酸配列全体を特性評価することができないが、イオン間相互作用は、ペプチドバックボーンのより完全な断片化に起因して、インタクトタンパク質の「トップダウン」配列決定のために効果的であり得る。しかしながら、「トップダウン」アプローチの１つのあり得る障害物は、イオン化に続く種々の多価前駆体の質量の広い分布、およびＭＳ^２スペクトルの複雑性である。さらに、実世界の用途は、複雑な未知のサンプルを伴い、これは、ＭＳ^２スペクトルの解析におけるさらなる曖昧性を追加し得る。

【0006】

故に、トップダウンアプローチを利用する抗体の質量分析解析のための改良された方法および装置に対するニーズが依然として存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

本教示の種々の側面によると、抗体のトップダウンＭＳベースの解析を実施するための方法およびシステムが、本明細書において提供される。ある側面では、方法は、イオン源を利用し、複数のイオンを少なくとも１つのインタクト抗体を含有するサンプルから発生させることと、約１，５００ｍ／ｚの低質量カットオフ値を上回るｍ／ｚ値を有する前駆体イオンを、四重極ロッドセットからＥＣＤセルに優先的に伝送するように、分解ＤＣ電圧の不在下で、ＲＦ信号を四重極ロッドセットに印加しながら、複数のイオンを四重極ロッドセットを通して伝送することとを含む。ＥＣＤ反応が、次いで、ＥＣＤセル内で前駆体イオンに実施され、ＥＣＤ反応からの反応生成物が、検出される。種々の実装では、四重極ロッドセットは、Ｑ１を三連四重極内に備える。ある側面では、ＲＦ信号の振幅および／または周波数は、低質量カットオフ値が約１，７００ｍ／ｚであるように調節される。代替として、ＲＦ信号の振幅および／または周波数が、低質量カットオフ値が約２，０００ｍ／ｚであるように調節される。いくつかの側面では、反応生成物の少なくとも一部は、低質量カットオフ値を下回るｍ／ｚを有する。

【0008】

いくつかの実装では、ＥＣＤ反応を実施することは、前駆体イオンをＥＣＤセルを通して伝送しながら、電子をＥＣＤセルの中に導入することを含む。

【0009】

ある側面では、複数の前駆体抗体イオンは、複数の電荷状態を備える。例えば、ある側面では、複数の前駆体抗体イオンは、抗体の同一種の抗体であるが、約２，０００～約４，０００の範囲内の少なくとも２つの異なるｍ／ｚを呈する抗体を備え得る。

【0010】

本教示の種々の側面では、質量分析計システムが提供され、システムは、複数のイオンをインタクト抗体を含有するサンプルから発生させるためのイオン源と、中心長手方向軸に沿って延在する四重極ロッドセットであって、四重極ロッドセットは、複数のイオンをイオン源から入口端を通して受け取り、イオンの少なくとも一部を出口端を通して伝送するように構成され、四重極ロッドセットは、中心長手方向軸の周囲に、かつ中心長手方向軸と平行に配置される第１の対の伸長ロッドおよび第２の対の伸長ロッドを備える、四重極ロッドセットと、四重極ロッドセットから伝送されるイオンを受け取るためのＥＣＤセルであって、ＥＣＤセルの中で、四重極ロッドセットから受け取られたイオンが、電子と反応させられ、生成イオンをＥＣＤセルから発生させる、ＥＣＤセルと、生成イオンを検出するための検出器とを備える。四重極ロッドセットに電気的に結合される電力システムは、約１，５００ｍ／ｚの低質量カットオフ値未満のｍ／ｚ値を有するイオンが、四重極ロッドセットからＥＣＤセルに伝送されることを実質的に防止するように、分解ＤＣ電圧の不在下で、ＲＦ信号を四重極ロッドセットに提供するように構成される。いくつかの実装では、低質量カットオフ値は、１，５００ｍ／ｚより高いことがある。例えば、いくつかの実装では、電力システムは、分解ＤＣ電圧の不在下で、ＲＦ信号を四重極ロッドセットに提供し、約１，７００ｍ／ｚの低質量カットオフ値未満のｍ／ｚ値を有するイオンが、四重極ロッドセットからＥＣＤセルに伝送されることを実質的に防止するように構成される。他の実装では、電力システムは、分解ＤＣ電圧の不在下で、ＲＦ信号を四重極ロッドセットに提供し、約２，０００ｍ／ｚの低質量カットオフ値未満のｍ／ｚ値を有するイオンが、四重極ロッドセットからＥＣＤセルに伝送されることを実質的に防止するように構成される。加えて、システムは、低質量カットオフ値を調節するためのコントローラを備えることができる。例えば、コントローラは、いくつかの実施形態では、ＲＦ信号の振幅を増加させ、低質量カットオフ値を増加させるように構成される。種々の実装では、ＲＦ信号の振幅は、約０．１ｋＶ_ｐ－ｐ～約１０ｋＶ_ｐ－ｐの範囲内である。

【0011】

いくつかの実装では、四重極ロッドセットは、Ｑ１を備える。加えて、いくつかの側面では、四重極ロッドセットは、約１×１０^－４Ｔｏｒｒ未満の圧力に維持されるチャンバ内に格納される。電子源が、電子をＥＣＤセルの中に導入するためのシステム内に含まれる。

【0012】

種々の側面では、インタクト抗体は、約２，０００～約４，０００の範囲内のｍ／ｚを有し得る。加えて、生成イオンの少なくとも一部は、いくつかの実装では、低質量カットオフ値を下回るｍ／ｚを有する。

【0013】

上記に説明される特徴の各々が、説明される具体的実施形態に対して種々の方法で対合および／もしくは組み合わせられ、ならびに／または除去され、本教示の範囲内であると見なされるべきである代替実施形態をもたらし得る。

【0014】

本出願人の教示のこれらおよび他の特徴が、本明細書に記載される。

【図面の簡単な説明】

【0015】

本発明の前述および他の目的および利点は、付随の図面を参照して、以下のさらなる説明からより完全に理解されるであろう。当業者は、下記に説明される図面が例証目的のためだけのものであることを理解するであろう。図面は、本出願人の教示の範囲をいかようにも限定することを意図するものではない。

【0016】

【図1】図１は、本出願人の教示の種々の側面による例示的ＥＣＤ質量分析計システムを図式的に描写する。

【0017】

【図2】図２は、本教示の種々の側面による図１のシステムにおける使用のために好適なある例示的四重極を図式的に描写する。

【0018】

【図3】図３は、本教示の種々の側面によるＲＦ専用モードで動作する図２の例示的四重極を図式的に描写する。

【0019】

【図4】図４は、本教示の種々の側面による抗体のＥＣＤベースのトップダウン解析を実施するためのある例示的方法のフローチャートを描写する。

【0020】

【図5】図５Ａ－Ｃは、本教示に従って解析されるべき抗体を含有するサンプルの例示的質量スペクトルを描写する。

【発明を実施するための形態】

【0021】

明確にするために、以下の議論は、省略することが便宜的または適切である場合は常に、ある具体的詳細を省略しながら、本出願人の教示の実施形態の種々の側面を詳述することを理解されたい。例えば、代替実施形態における同様または類似の特徴の議論は、幾分、簡約され得る。周知の考えまたは概念もまた、簡潔にするために、さらにより詳細に議論されない場合がある。当業者は、本出願人の教示のいくつかの実施形態が全ての実装において実施形態の完全な理解を提供するためだけに本明細書に記載される具体的に説明される詳細のある部分を要求しない場合があることを認識するであろう。同様に、説明される実施形態は本開示の範囲から逸脱することなく共通の一般的知識に従って改変または変動を被り得ることが明白であろう。実施形態の以下の詳細な説明は、いかようにも、本出願人の教示の範囲を限定するものと見なされるべきではない。本明細書で使用される場合、用語「約」および「実質的に等しい」は、例えば、実世界における測定または取扱手順を通して、これらの手順における不注意による過誤を通して、組成または試薬の製造、源または純度における差異を通して、および同等物を通して生じ得る数量の変動を指す。典型的には、本明細書で使用される場合、用語「約」および「実質的に」は、述べられる値の１／１０、例えば、±１０％、述べられる値のより大きいまたはより小さい値または範囲を意味する。例えば、約３０％または３０％に実質的に等しい濃度値は、２７％～３３％の濃度を意味することができる。用語はまた、変動が先行技術によって実践される公知の値を包含しない限り、均等物であると当業者によって認識されるそのような変動を指す。

【0022】

種々の側面では、インタクト抗体のＥＣＤベースのトップダウン解析を可能にするようにイオンを解析するための方法およびシステムが、本明細書に提供される。ＭＳベースのプロテオミクスの従来の方法は、干渉種および異なる電荷状態の多価前駆体イオンの存在に起因して、繁雑なおよび／または不正確なデータをもたらし得るが、本教示は、ＥＣＤの高解離効率を利用して、抗体イオンに関する完全な配列を発生させながら、あまり繁雑ではない質量スペクトルをもたらし得る。下記に詳細に議論されるように、本明細書に開示される方法およびシステムの種々の側面は、選択的に、低質量カットオフ値（ＬＭＣＯ）を下回るｍ／ｚを呈するイオンがＥＣＤセルに進入することを防止し、その電荷状態に関係なく、インタクト抗体から形成されるイオンの伝送を可能にする。

【0023】

本明細書に説明されるシステム、デバイス、および方法は、描写されるものより少ない、より多い、または異なる構成要素を伴う多くの異なる質量分析計システムと併用され得るが、本教示に従った使用のためのある例示的質量分析計システム１００が、図１に図式的に図示される。図１に描写される例示的実施形態に示されるように、質量分析計システム１００は、概して、複数の前駆体イオンをそこから発生させるように、１つ以上の着目抗体を含有するかまたは含有すると疑われるサンプルをイオン化するためのサンプルイオン源１０２と、イオン源１０２から発生させられたイオンを受け取り、次いで発生させられたイオンの一部をＥＣＤ反応セル１１０に伝送するための四重極ロッドセット１０４とを備える。ＥＣＤセル１１０は、相互作用領域を含み、その中で、前駆体カチオンが、前駆体イオンを検出器１４０によって検出される複数の生成イオンに解離させるように、電子源１０６によって発生させられた電子と相互作用する。図１に示されるように、例示的質量分析計システム１００は、加えて、ＲＦ、ＡＣ、および／またはＤＣ成分を有する電位を種々の構成要素の電極に印加し、協調方で、および／または種々の異なる動作モードのために、質量分析計システム１００の要素を構成するように、コントローラ１０８によって制御される１つ以上の電力供給源（例えば、ＤＣ電力供給源１０５およびＲＦ電力供給源１０７）を含む。下記に詳細に議論されるように、本教示の例示的実装では、四重極ロッドセット１０４に印加される電気信号は、好ましくは、ＬＭＣＯを上回るｍ／ｚ値（例えば、約１，５００ｍ／ｚ）を有するそれらの前駆体イオンをＥＣＤセル１１０に伝送するように、設定および／または調節される。特定の実装では、ある振幅および周波数を呈するＲＦ信号が、四重極ロッドセットの種々のロッドに、これらのロッドへのＤＣ分解電圧の不在下で印加され、振幅および周波数は、ＬＭＣＯを下回るｍ／ｚ値を有するイオンが下流要素の中に伝送されることを実質的に防止し、それによって、ＥＣＤセル１１０内の抗体前駆体イオンの反応に続く生成イオンの検出によって発生させられたＭＳ^２スペクトルの後続の解析および／または解釈にこれらの低ｍ／ｚイオンが干渉することを排除するように選択される。

【0024】

イオン源１０２は、種々の構成を有し得るが、概して、サンプル中に含有される抗体からイオン（例えば、カチオン）を発生させるように構成される。ある実装では、本教示に従った使用のための好適なサンプル源は、サンプル（例えば、着目抗体を含有するかまたは含有すると疑われる溶液）を含有し、かつ／または１つ以上の導管、チャネル、管類、パイプ、キャピラリー管等を通して液体サンプルをイオン源１０２に伝送するように、例えば、流体結合を介して、サンプルをイオン源１０２に導入するように構成される。非限定的な例として、サンプル源は、解析されるべきサンプルのリザーバ、またはサンプルが注入される入力ポートを備える。いくつかの側面では、例えば、サンプル源は、サンプルをイオン源１０２の中に持続的に流動させるための注入ポンプ（例えば、シリンジポンプ）を備える。代替として、また、非限定的な例として、解析されるべき液体サンプルは、オンライン液体クロマトグラフカラムからの溶離液の形態にあるが、いくつかの側面では、１つ以上のサンプル調製ステップ（例えば、多次元ＬＣ分離、電気泳動、ジスルフィド結合還元等）は、オフラインで実施され得る。

【0025】

本教示のいくつかの例示的側面では、イオン源１０２は、サンプル源と直接または間接的に流体連通する導管を含み、導管は、少なくとも部分的にイオン化チャンバの中に延在する出口端で終端する。液体サンプルが出口端からイオン化チャンバの中に（例えば、複数の微小液滴として）放出されると、微小液滴中に含有される抗体（および他の干渉検体）は、イオン源１０２によってイオン化される（すなわち、荷電させられる）。液滴中の液体（例えば、溶媒）が蒸発すると、イオンは、解放され、四重極ロッドセット１０４およびＥＣＤセル１１０への伝送のための開口に向かって、かつそれを通って引き込まれる。当技術分野において公知であり、かつ本明細書の教示に従って修正されるいくつかの異なるデバイスが、イオン源１０２として利用され得ることを理解されたい。非限定的な例として、イオン源１０２は、エレクトロスプレーイオン化デバイス、ネブライザ支援エレクトロスプレーデバイス、化学イオン化デバイス、ネブライザ支援粉末化デバイス、光イオン化デバイス、レーザイオン化デバイス、サーモスプレーイオン化デバイス、超音波スプレーイオン化デバイスであり得る。

【0026】

図１の実装に示されるように、システム１００は、ＥＣＤセル１１０を含み、その中で、四重極ロッドセット１０４によって伝送された前駆体イオンは、ＥＣＤ反応を受け得る。ＥＣＤ反応は、通常、多価プロトン化分子Ｍが自由電子と相互作用して奇数の電子を有するラジカル種を形成することを伴う
［Ｍ＋ｎＨ］^ｎ＋＋ｅ^－→［Ｍ＋ｎＨ］^{（ｎ－１）＋・}→ＥＣＤ断片
電子を前駆体抗体カチオンの不完全な分子軌道に添加することは、結合エネルギーを解放し、これは、当技術分野において公知のように、解離閾値を超えるほど十分である場合、電子受容体イオンの断片化を引き起こす。前駆体イオンがＥＣＤセル１１０内で反応させられると、断片または生成イオンは、検出器１１０によるＥＣＤ生成イオンの検出に先立って、さらなる解析のために１つ以上の質量解析器に輸送され得る。例として、ＥＣＤセル１１０と検出器１４０との間に配置される質量解析器は、任意の好適な質量分析計モジュールを備えることができ、質量分析計モジュールは、例えばそこからの生成イオンを走査するために、限定ではないが、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析法モジュール、四重極質量分析法モジュール、線形イオントラップ（ＬＩＴ）モジュール、および同等物を含む。非限定的な例として、ＥＣＤ反応は、「Ｉｎｌｉｎｅ Ｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ」と題されたＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４１９１８２１号に説明されるＥＣＤデバイス内で実施され得、その教示は、参照することによってその全体として援用される。ＥＣＤ反応のために電子をＥＣＤセル１１０に提供する必要性と一貫して、システム１００は、加えて、電子源１０６を含む。当業者は、イオン間反応のために電子を提供するための質量分析計システムにおける使用のために好適であり、かつ本教示に従って修正される任意の電子源が、システム１００において利用され得ることを理解するであろう。非限定的な例として、電子は、フィラメント（例えば、タングステン、トリウム入タングステン、およびその他）、またはＹ_２Ｏ_３カソード等の別の電子エミッタによって発生させられ得る。ある例示的動作では、１～３Ａの電流が、電子源を加熱するために印加されることができ、これは、電子を発生させるように、１～１０Ｗの熱電力を生成する。電子源１０６は、いくつかの側面では、加えて、磁場発生器（例えば、示されない永久ネオジム磁石または電磁石）と関連付けられ、ＥＣＤセル１１０内の電子の経路および冷却機構（例えば、ヒートシンク、能動冷却）を制御し、磁石が存在する場合、磁石の温度を、永久磁石の磁化が喪失されるそのキューリー温度を下回るように維持し得ることを理解されたい。磁石を冷却する他の公知の方法もまた、利用され得る。

【0027】

示されるように、システム１００は、ＥＣＤセル１１０から伝送される前駆体および／または生成イオンを検出するために有効な検出器１４０（例えば、飛行時間質量解析器、イオントラップ質量解析器、Ｆａｒａｄａｙカップ、または他のイオン電流測定デバイス）を含む。検出されたイオンデータは、メモリ内に記憶され、コンピュータまたはコンピュータソフトウェアによって解析され得る。

【0028】

当業者によって理解されるように、システム１００は、加えて、さらなるイオン処理、操作、および／または質量解析のために、四重極ロッドセット１０４およびＥＣＤセル１１０の上流または下流に配置される任意の数の付加的質量解析器要素またはイオン光学要素を含み得る。例として、イオンは、１つ以上の付加的差動圧送真空段階（例えば、約２．３Ｔｏｒｒの圧力に維持される第１の段階、約６ｍＴｏｒｒの圧力に維持される第２の段階、および約１０^－５Ｔｏｒｒの圧力に維持される第３の段階であって、第３のセルは、検出器１４０を含有し、２つ以上の四重極質量解析器は、その間に位置するＥＣＤセル１１０を有する）を通して移送され得る。例えば、一実施形態では、四重極ロッドセット１０４は、Ｑ１（約１×１０^－４Ｔｏｒｒ未満の圧力に維持される）を表し、ＥＣＤセル１１０は、Ｑ－ｑ－Ｑ三連四重極質量分析計内のＱ２を表す、またはそれに取って代わる（例えば、Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．の「Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｒａｄｉｏ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ」（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，Ａｕｇ．１；７６（１５）：４２６３－６）、および「Ｉｎｌｉｎｅ Ｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ」と題されたＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４１９１８２１号参照（ＥＣＤデバイスを説明するこれらの例示的参考文献の各々の教示は、参照することによってその全体として援用される））。

【0029】

示されるように、描写されるシステム１００は、加えて、システム１００の動作を制御するようにシステム１００の要素のうちの１つ以上のものに動作可能に結合されるコントローラ１０８を含む。例として、コントローラ１０８は、情報を処理するためのプロセッサと、質量スペクトルデータを記憶するためのデータ記憶装置と、実行されるべき命令とを含み得る。下記に詳細に議論されるように、概して当技術分野において公知であり、かつ本教示に従って修正されるように、コントローラ１０８は、例として、サンプルイオン源１０２によるイオンの発生および電子源１０６による電子の発生を制御し、かつ／または、四重極ロッドセット１０４およびＥＣＤセル１１０の中へのイオンの移動およびそれらを通したイオンの移動をそれらの電極への１つ以上のＲＦ／ＤＣ電圧の印加を介して制御し得る。コントローラ１０８が単一構成要素として描写されるが、（ローカルまたは遠隔かどうかにかかわらず）１つ以上のコントローラが本明細書に説明される方法のいずれかに従って質量分析計システム１００を動作させるように構成され得ることを理解されたい。加えて、いくつかの実装では、コントローラ１０８は、ディスプレイ（例えば、情報をコンピュータユーザに表示するための陰極線管（ＣＲＴ）または液晶ディスプレイ（ＬＣＤ））等の出力デバイス、ならびに／または、情報およびコマンド選択物をプロセッサに通信するための英数字キーおよび他のキーおよび／またはカーソル制御を含む入力デバイスと動作可能に関連付けられ得る。本教示のある実装と一貫して、コントローラ１０８は、１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行し、１つ以上の命令は、例えば、データ記憶装置内に含有されるか、または記憶デバイス（例えば、ディスク）等の別のコンピュータ可読媒体からメモリの中に読み取られる。１つ以上のコントローラ（単数または複数）は、ハードウェアまたはソフトウェアの形態をとり得、例えば、コントローラ１０８は、質量分析計システム１００を本明細書に説明される別のものとして動作させるように実行される、コンピュータ内に記憶されたコンピュータプログラムを有する好適にプログラムされたコンピュータの形態をとり得るが、本教示の実装は、ハードウェア回路とソフトウェアとの任意の具体的組み合わせに限定されない。例えば、コントローラ１０８と関連付けられる種々のソフトウェアモジュールが、プログラマブル命令を実行し、図４を参照して下記に説明される例示的方法を実施し得る。

【0030】

上記留意されるように、例示的質量分析計システム１００は、１つ以上の電力供給源を含み、1つ以上の電力供給源は、ＲＦ、ＡＣ、および／またはＤＣ成分を有する電位を種々の構成要素の電極に印加して、協調方式で、かつ／または本明細書で別様に議論されるような種々の異なる動作モードのために、質量分析計システム１００の要素を構成するように、コントローラ１０８によって制御される。ここで図２を参照すると、例示的四重極ロッドセット１０４は、入口端（例えば、イオン源側）から出口端（例えば、ＥＣＤセル側）まで延在する中心長手方向軸（Ｚ）の周囲においてそれと平行に配置される４つのロッド１０４ａ－ｄを含む。ロッド１０４ａ－ｄは、中心軸（Ｚ）から等距離に配置される円筒形形状（すなわち、図２に示されるように、半径ｒの円形断面）を有するロッドを備え、ロッド１０４ａ－ｄの各々は、相互にサイズおよび形状が均等である。ロッド１０４ａ－ｄの各々と中心軸（Ｚ）との間の最小距離は、各一次ロッド１０４ａ－ｄの最内表面が、２ｒ_０の最小距離だけ中心長手方向軸（Ｚ）を横断してそのロッド対内の他のロッドの最内表面から分離されるような距離ｒ_０によって定義される。いくつかの例示的実装では、ロッドセット１０４のｒ_０は、約３ｍｍ～約１０ｍｍの範囲内である。ロッド１０４ａ－ｄは円筒形として描写されるが、ロッド１０４ａ－ｄの断面形状、サイズ、および／または相対的間隔は当技術分野において公知のように変動させられ得ることを理解されたい。例えば、いくつかの側面では、ロッド１０４ａ－ｄは、方程式ｘ^２－ｙ^２＝ｒ_０ ^２（式中、ｒ_０（場半径）は、四重極場を発生させるための電極間の内接円の半径である）に従った半径方向内部双曲線面を呈し得る。

【0031】

ロッド１０４ａ－ｄは、１つ以上の電気信号が単独でまたは組み合わせて各ロッド１０４ａ－ｄに印加されることができるように、導電性（すなわち、それらは、金属または合金等の任意の伝導性材料から作製されることができる）であって、（図１の１つ以上の電力供給源１０５、１０７を備える）電力システムに結合されることができる。特に、ロッド１０４ａ－ｄは、概して、２つの対のロッド（例えば、ロッド１０４ａおよび１０４ｃを備える第１の対と、ロッド１０４ｂおよび１０４ｄを備える第２の対）を備え、各対のロッドは、中心軸（Ｚ）の対向する側に配置され、それらに対して同じ電気信号が印加され得る。例えば、図２に図示されるようないくつかの側面では、電力システムは、同じ電位を第１の対のロッド１０４ａ、ｃに印加するように第１の対のロッド１０４ａ、ｃに電気的に結合される電力供給源１０６ａと、異なる電気信号を第２の対のロッド１０４ｂ、ｄに印加するために第２の対のロッド１０４ｂ、ｄに電気的に結合される電力供給源１０６ｂとを備えることができる。図２に示されるように、いくつかの実装では、例示的電力システムは、［Ｕ－ＶｃｏｓΩｔ］の電位を第１の対のロッド１０４ａ、ｃに印加することができ、式中、Ｕは、ＤＣ電気信号の大きさであり、Ｖは、ＡＣまたはＲＦ信号のゼロからピークまでの振幅であり、Ωは、ＡＣまたはＲＦ信号の周波数であり、ｔは、時間である）。同様に、例示的電力システムは、－［Ｕ－ＶｃｏｓΩｔ］の電位を第２の対のロッド１０４ｂ、ｄに印加することができる。この例示的構成では、第１の対のロッド１０４ａ、ｃおよび第２の対のロッド１０４ｂ、ｄに印加される電気信号は、ＤＣ信号の極性（すなわち、Ｕの符号）が異なる一方、電気信号のＲＦ部分は、相互に１８０°位相がずれ得る。したがって、いくつかの側面では、四重極ロッドセット１０４が、ＤＣ／ＲＦ比の好適な選択肢によって選択されたｍ／ｚ範囲のイオンを選択的に伝送し得る四重極質量フィルタと見なされ得ることが、当業者によって理解されるであろう。例えば、４つの一次ロッド１０４ａ－ｄに印加されるＤＣ電気信号のみ（すなわち、±Ｕ）を検討すると、図２に示されるような四重極ロッドセット１０４の中に注入されるカチオンは、第１の対の電極１０４ａ、ｃへの正のＤＣ電圧の印加に基づいて、Ｘ－Ｚ平面における（中心軸Ｚに向かう）安定化力を被り得る一方、カチオンは、第２の対の電極１０４ｂ、ｄへの負のＤＣ電圧の印加に基づいて、Ｙ－Ｚ平面における不安定化力を被り得る。ＲＦ信号の効果のみを検討すると、カチオンは、ロッド対に印加されるＲＦ信号が経時的に変化するにつれて、連続して種々のロッド対１０４ａ、ｃおよび１０４ｂ、ｄによって誘引および反発され得る。低ｍ／ｚのカチオンは、場の交流成分により容易に追従することが可能であるため、低ｍ／ｚカチオンは、それらがロッド１０４ａ－ｄのうちの１つに遭遇し、放出されるまで、よりＲＦ信号と同相に留まり、エネルギーを場から得て、ますます大きい振幅で発振する傾向にあり得る。ここで、組み合わせられたＤＣとＲＦ信号の効果を検討すると、Ｘ－Ｚ平面における場は、高ｍ／ｚのイオンのみが第１の対の電極１０４ａ、ｃに衝打せずに四重極の他端に伝送される点で、ハイパス質量フィルタとして機能し得ることを理解されたい。他方では、Ｙ－Ｚ平面において、高ｍ／ｚのカチオンは、負のＤＣ電圧の発散／誘引効果のため、不安定となるが、より低いｍ／ｚの一部のイオンは、カチオンの逸脱が増加するときは常にＲＦ成分の振幅が軌道を補正するように設定される場合、ＲＦ成分によって安定化され得る。したがって、Ｙ－Ｚ平面における場は、より低いｍ／ｚのイオンのみが第２の対のロッド１０４ｂ、ｄに衝打せずに四重極ロッドセット１０４の他端に伝送される点で、ローパス質量フィルタとして機能すると言え得る。

【0032】

四重極ロッドセット１０４に印加される電気信号のＲＦ／ＤＣ比の好適な選択肢によって、Ｘ－Ｚ平面およびＹ－Ｚ平面における上記に説明される２つの効果はともに、以下のパラメータの例示的差込図のＭａｔｈｉｅｕ安定化図に描写されるように、個々の原子質量を分解することが可能な質量フィルタを提供する。

【数1】

【数2】

式中、ｅは、電子上の電荷であり、Ｕは、ＤＣ電圧の振幅であり、Ｖは、印加されるゼロからピークまでのＲＦ電圧であり、ｍは、イオンの質量であり、ｒ_０は、ロッド１０４ａ－ｄ間の有効半径であり、Ωは、印加されるＲＦ周波数である。パラメータａは、ＤＣ電圧Ｕに比例し、パラメータｑは、ＲＦ電圧Ｖに比例し、Ｍａｔｈｉｅｕ安定化図中の安定境界においてｑ＝０．９０８であることに留意されたい。

【0033】

上記に留意されるように、例示的質量分析計システム１００は、１つ以上の電力供給源を含み、電力供給源は、ＲＦ、ＡＣ、および／またはＤＣ成分を有する電位を種々の構成要素の電極に印加し、協調方式で、かつ／または本明細書に別様に議論されるような種々の異なる動作モードのために、質量分析計システム１００の要素を構成するように、コントローラ１０８によって制御される。図２は、ＤＣ信号（すなわち、±Ｕ）およびＲＦ信号（すなわち、±［Ｕ－ＶｃｏｓΩｔ］）の両方が、質量フィルタ実装の間、（例えば、ＵおよびＶを勾配させることによって）四重極ロッドセット１０４のロッド１０４ａ－ｄに印加されることを描写するが、本教示は、ＬＭＣＯを確立する周期およびＬＭＣＯｍ／ｚを上回るイオンの優先的伝送の間、電気信号がＤＣ分解電圧を伴わずに四重極ロッドセット１０４の種々のロッドに印加されるシステムおよび方法を提供する。ここで図３を参照すると、四重極ロッドセット１０４は、ＬＭＣＯを上回るｍ／ｚを有するそれらのイオンが本明細書に別様に議論されるようなさらなる処理のためにＥＣＤセル１１０に優先的に伝送されるようなＲＦ専用構成で示される。すなわち、図３に描写されるように、ＤＣ信号（Ｕ）は、方程式（１）からのパラメータがゼロになるように、０Ｖに設定される。ピーク間振幅（Ｖ）および周波数（Ω）を呈するＲＦ専用信号が種々のロッド１０４ａ－ｄに印加されるこれらの条件下では、質量走査線は、ｑ_ｍａｘ＝０．９０８以下において安定する四重極ロッドセット１０４に進入するイオンが、ＥＣＤ１１０に選択的に伝送されるように、図３の差込図のＭａｔｈｉｅｕ安定化図に示されるように水平になる。換言すると、上記の方程式（２）を並べ替え、０．９０８をｑに代入することによって、以下の公式に従うｍ／ｅ_ＬＭＣＯは、四重極ロッドセット１０４によって伝送されるイオンの最低質量／電荷比を表す。

【数3】

【0034】

本教示の種々の側面による四重極ロッドセット１０４に印加されるＲＦ振幅（Ｖ）および周波数（Ω）の好適な選択肢によって、ＬＭＣＯは、低ｍ／ｚイオンが下流要素の中に伝送されることを実質的に防止し、それによって、ＥＣＤセル１１０内のより高いｍ／ｚ抗体前駆体イオンの反応に続く生成イオンの検出によって発生させられるスペクトルの後続解析および／または解釈への干渉を排除するように設定および／または調節されることができる。いくつかの側面では、例えば、ＲＦ信号の振幅および周波数は、１，５００を上回るか、１，７００を上回るか、または２，０００を上回るｍ／ｚを呈するイオンが四重極ロッドセット１０４によって選択的に伝送され得るように設定され得る。ＶとΩの例示的組み合わせは、約０．１ｋＶ_ｐ－ｐ～約１０ｋＶ_ｐ－ｐの範囲内のＲＦ振幅、および／または約０．８ＭＨｚ～約３ＭＨｚの範囲内のＲＦ周波数を含み、値は、例えば、例として、上記の方程式（３）に従って、四重極の有効場半径および所望のＬＭＣＯに基づいて選択される。約１，５００ｍ／ｚに等しいＬＭＣＯを取得するための１つの例示的実装では、場半径（ｒ_０）は、０．４ｍｍであり得、ＲＦ振幅は、６．４ｋＶであり得、ＲＦ周波数は、約１．２ＭＨｚであり得る。本教示によるＲＦ振幅のためのそのような値は、四重極イオントラップが、従来的に、（例えば、図２に示されるような）狭帯域通過の質量フィルタモードで動作するものを実質的に上回り得ることが、当業者によって理解されるであろう。

【0035】

ここで図４を参照すると、本教示の種々の側面による図１の質量分析計システムを動作させるための例示的方法４００が、描写される。ステップ４０１に示されるように、方法４００は、抗体を含有するサンプルをイオン源１０４に送達し、それによって、サンプル中の分子がイオン化されることから開始し得る。（抗体を含む）サンプル中の分子がイオン化されると、これらのイオンは、ステップ４０２に示されるように、例えば、１つ以上のイオンレンズ、質量解析器、および／または差動圧送真空段階（例えば、Ｑ_０またはＱ_ｊｅｔ）を通して四重極ロッドセット１０４に伝送される。イオンが四重極ロッドセット１０４の中に、およびそれを通って伝送されるにつれて、種々のロッド１０４ａ－ｄは、図３に示されるようにＲＦ信号がそこに印加され、それによって、ＲＦ振幅（Ｖ）と周波数（Ω）の組み合わせが、このＲＦ信号と関連付けられるＬＭＣＯを下回るイオンを不安定化および放出させる一方、（比較的高いｍ／ｚ抗体イオンを含む）ＬＭＣＯを上回るそれらのイオンがＥＣＤセルの中に伝送されることを可能にする（ステップ４０３）。本教示によると、四重極ロッドセット１０４をこのＲＦ専用モードで動作させることは、抗体イオンが異なる電荷状態を呈する場合であっても（例えば、一方の分子が単一荷電され他方が二重荷電される同一種の抗体）、ＥＣＤセル１１０への着目抗体のイオンの伝送を可能にし得ることを理解されたい。ステップ４０４では、ＥＣＤセル１１０に伝送されるこれらの前駆体抗体イオンは、次いで、（例えば、ステップ４０５において、ＥＣＤセル１１０内で捕獲されまたはそれを通して伝送される電子との相互作用を介して）ＥＣＤ反応を受け、それによって、生成イオンの形成をもたらす。ステップ４０６では、ＥＣＤ生成イオンは、次いで、ＥＣＤ生成イオンスペクトルを発生させるように、検出器１１０によって検出され、これは、当技術分野において公知のもののように解析され、「トップダウン」解析において抗体構造を再構築することができる。

【0036】

本出願人の教示は、本教示を実証するために提供されるが本教示を限定しない以下の実施例および図５Ａ－Ｃに提示されるデータを参照して、さらにより完全に理解され得る。本明細書の下記に説明されるように、開示される方法およびシステムは、低質量カットオフ値（ＬＭＣＯ）を下回るｍ／ｚを呈するイオンが下流ＥＣＤセルに伝送されることを選択的に防止する。

【実施例】

【0037】

ＮＩＳＴから取得されたヒト化モノクローナルＩｇＧ抗体（ＮＩＳＴ－ｍＡｂ）を含むサンプルが、調製された。サンプルは、脱塩、および脱塩ＬＣカラム（水）を利用したＬＣ分離、次いで、「Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｂｒａｎｃｈｅｄ Ｒａｄｉｏ－Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｉｏｎ Ｔｒａｐ」（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８７（１）において発行：７８５－７９２）と題された論文（参照することによってその全体として援用される）に説明されるように、ＥＣＤセルを含むように修正された研究グレード四重極ＴＯＦシステム（ＳＣＩＥＸ）を使用して、エレクトロスプレーイオン化および質量分析法に曝された。ＥＣＤセルは、質量分析計システムのＱ１とＱ２との間に配設された。典型的電子ビーム照射時間は、１０ｍｓであり、電子ビーム強度は、適切な解離効率を取得するように調整された。ＴＯＦ－ＭＳの質量分解能は、３５，０００～４７，０００であり、これは、断片の同位体パターンを最大Ｚ～３０＋まで分解した。図５Ａは、イオン化されたサンプルから発生させられたスペクトルを描写し、ＲＦ振幅は、４００Ｖ_ｐ－ｐにおいて、実質的に全てのイオンがそれを通して伝送されることを可能にするように選択されている。図５Ａのスペクトルは、５００未満のｍ／ｚを呈するイオンに関する有意な信号、および約ｍ／ｚ１，５２０におけるいくつかの有意なピークを含む。ここで図５Ｂを参照すると、四重極ロッドセットに印加されるＲＦ信号の振幅が、５ｋＶ_ｐ－ｐまで増加され（分解ＤＣ電圧が０Ｖに設定され）、Ｑ１によって伝送されたイオンが、再び検出された（ＥＣＤ反応は、実施されなかった）。図５Ａおよび図５Ｂを比較することによって観察されるように、ＲＦ信号の振幅を増加させることによって、Ｑ１は、約１，７００未満のｍ／ｚを呈するそれらのイオンの伝送を防止した。図７は、図５Ｂの条件下でＱ１から伝送された前駆体イオンにおいてＥＣＤを実施するときに検出されたイオンを描写する。約２，０００未満のｍ／ｚを呈する低強度ピークは、ＥＣＤに続く生成イオン断片を表す。図５Ａおよび５Ｃを比較すると、それらの図５Ｃにおいて観察される生成イオンピークの多くが、低ｍ／ｚイオンが本教示に従って除去されていない場合、不明瞭にされ、それによって、抗体のトップダウン解析をより困難にするであろうことが理解されるであろう。

【0038】

当業者は、本明細書に説明される実施形態および実践の多くの均等物を把握するか、またはルーチンにすぎない実験を使用してそれを確認することが可能であろう。例として、種々の構成要素の寸法および種々の構成要素に印加される特定の電気信号に関する明示的値（例えば、振幅、周波数等）は、単に例示であり、本教示の範囲を限定することを意図するものではない。故に、本発明は、本明細書に開示される実施形態に限定されず、法律下で許容されるものと同程度に広義に解釈されるべきである以下の請求項から理解されるべきであることを理解されたい。

【0039】

本明細書で使用される見出しは、編成目的のみのためのものであって、限定として解釈されるべきではない。本出願人の教示は、種々の実施形態に関連して説明されるが、本出願人の教示がそのような実施形態に限定されることを意図するものではない。対照的に、本出願人の教示は、当業者によって理解されるように、種々の代替、修正、および均等物を包含する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】