特表2022-532075 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ アストラゼネカ　アクチボラグの特許一覧

特表2022-532075ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡを送達するために脂質ナノ粒子を使用する方法、及びこの脂質ナノ粒子を含む医薬組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1
2
3
4
5
6
7
8A
8B

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-13

(54)【発明の名称】ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡを送達するために脂質ナノ粒子を使用する方法、及びこの脂質ナノ粒子を含む医薬組成物

(51)【国際特許分類】

A61K 48/00 20060101AFI20220706BHJP

A61P 17/02 20060101ALI20220706BHJP

A61K 9/14 20060101ALI20220706BHJP

A61K 47/24 20060101ALI20220706BHJP

A61K 47/28 20060101ALI20220706BHJP

A61K 47/32 20060101ALI20220706BHJP

A61K 47/18 20060101ALI20220706BHJP

A61K 38/18 20060101ALI20220706BHJP

A61K 9/127 20060101ALI20220706BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20220706BHJP

C12N 15/88 20060101ALI20220706BHJP

A61P 3/10 20060101ALN20220706BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61P17/02

A61K9/14

A61K47/24

A61K47/28

A61K47/32

A61K47/18

A61K38/18

A61K9/127

A61P43/00 111

C12N15/88 Z ZNA

A61P3/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021565885

(86)(22)【出願日】2020-05-08

(85)【翻訳文提出日】2021-12-22

(86)【国際出願番号】 US2020032241

(87)【国際公開番号】W WO2020227690

(87)【国際公開日】2020-11-12

(31)【優先権主張番号】62/845,184

(32)【優先日】2019-05-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】300022641

【氏名又は名称】アストラゼネカアクチボラグ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱明子

(72)【発明者】

【氏名】ハンソン，ケニー・ミーケル

(72)【発明者】

【氏名】ボグベルグ，マリア

(72)【発明者】

【氏名】ベルゲンヘム，ニルス

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4C076AA19

4C076AA31

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC19

4C076DD09

4C076DD50

4C076DD59

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE23

4C076FF16

4C076FF31

4C076FF34

4C076FF36

4C076FF43

4C076FF63

4C084AA13

4C084BA44

4C084DB57

4C084MA24

4C084MA41

4C084MA66

4C084NA03

4C084NA05

4C084NA11

4C084NA12

4C084NA13

4C084ZA891

4C084ZA892

4C084ZC021

4C084ZC022

(57)【要約】

本開示は、脂質成分とＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子に関する。本開示の態様は、さらに、対象における創傷治癒を向上させるための、脂質成分とＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子の使用に関する。本開示のいくつかの態様は、脂質成分と改変ＲＮＡとを含むナノ粒子の局所投与に関する。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）を含む脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含むナノ粒子。

【請求項2】

前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子。

【請求項3】

前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１又は２に記載のナノ粒子。

【請求項4】

前記リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ＤｉｅｔｈｅｒＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミサクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ＬｙｓｏＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びこれらの混合物からなる群から選択され；
前記構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α－トコフェロール、及びこれらの混合物からなる群から選択され；
並びに／又は
前記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール）、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコ－ル－２０００）、及びこれらの混合物からなる群から選択される、
請求項２又は３に記載のナノ粒子。

【請求項5】

前記脂質成分は、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＤＭＧ－ＰＥＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のナノ粒子。

【請求項6】

前記脂質中のイオン化可能な窒素原子と、前記ＲＮＡ中のリン酸基の数との比（Ｎ：Ｐ比）は、約２：１～約３０：１である、請求項１～５のいずれか一項に記載のナノ粒子。

【請求項7】

前記Ｎ：Ｐ比は、約３：１である、請求項６に記載のナノ粒子。

【請求項8】

前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約５：１～約１００：１である、請求項１～７のいずれか一項に記載のナノ粒子。

【請求項9】

前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１である、請求項８に記載のナノ粒子。

【請求項10】

前記ナノ粒子は、平均直径が約５０ｎｍ～約１００ｎｍである、請求項１～９のいずれか一項に記載のナノ粒子。

【請求項11】

前記ナノ粒子は、平均直径が約７０ｎｍ～約９０ｎｍである、請求項１～９のいずれか一項に記載のナノ粒子。

【請求項12】

前記ナノ粒子は、平均直径が約７０ｎｍ～約８５ｎｍである、請求項１１に記載のナノ粒子。

【請求項13】

（ａ）（ｉ）ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）を含む脂質成分と、（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡとを含む少なくとも１種のナノ粒子、
及び
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む医薬組成物。

【請求項14】

前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

【請求項17】

前記脂質成分は、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＤＭＧ－ＰＥＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記脂質中のイオン化可能な窒素原子と、前記ＲＮＡ中のリン酸基の数との比（Ｎ：Ｐ比）は、約２：１～約３０：１である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記Ｎ：Ｐ比は、約３：１である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約５：１～約１００：１である、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項21】

前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１である、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記ナノ粒子は、平均直径が約５０ｎｍ～約１００ｎｍである、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項23】

前記ナノ粒子は、平均直径が約７０ｎｍ～約９０ｎｍである、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項24】

前記ナノ粒子は、平均直径が約７０ｎｍ～約８５ｎｍである、請求項２３に記載の医薬組成物。

【請求項25】

前記薬学的に許容される賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの混合物から選択される、請求項１３～２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項26】

創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項１３～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。

【請求項27】

前記投与により、前記対象の血漿中か又は組織中において、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドが産生される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドは、前記対象への前記ナノ粒子又は医薬組成物の投与後５又は６時間以内に、前記血漿中及び／又は組織中で検出される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記投与により、前記対象中において、約１ｐｇ／ｍｇ超の前記ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドが産生される、請求項２７又は２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ナノ粒子又は前記医薬組成物を皮内投与する、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ナノ粒子又は前記医薬組成物を、創傷に局所的に投与する、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記ナノ粒子を、対象の体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの改変ＲＮＡを送達するのに十分な投薬量レベルで投与する、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記投与により、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドの産生が、前記対象へのクエン酸生理食塩水緩衝液中の前記改変ＲＮＡの投与と比較した場合に約１～約１００倍増加する、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記対象は、糖尿病に罹患している、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記創傷は、手術創、熱傷、擦過傷、皮膚生検部位、慢性創傷、損傷、移植創、糖尿病性創傷、糖尿病性潰瘍、褥瘡、床ずれ、及びこれらの組み合わせである、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

血管新生を誘導する方法であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項１３～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。

【請求項37】

血管形成を誘導する方法であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項１３～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。

【請求項38】

毛細血管及び／又は細動脈密度を増加させる方法であって、請求項１～１２のいずれか一項に記載のナノ粒子又は請求項１３～２５のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。

【請求項39】

創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法であって、
（ｉ）脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含むナノ粒子又はその医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象の創傷に局所的に投与することを含む方法。

【請求項40】

前記脂質成分は、下記の構造

【化1】

を有する化合物を含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記脂質成分は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレートを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項42】

創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法であって、
（ｉ）下記の構造

【化2】

を有する化合物を含む脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含むナノ粒子又はその医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象の創傷に局所的に投与することを含む方法。

【請求項43】

創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法であって、
（ｉ）ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレートを含む脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含むナノ粒子又はその医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象の創傷に局所的に投与することを含む方法。

【請求項44】

前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記脂質成分は、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＤＭＧ－ＰＥＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項３９～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記脂質中のイオン化可能な窒素原子と、前記ＲＮＡ中のリン酸基の数との比（Ｎ：Ｐ比）は、約３：１である、請求項３９～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１である、請求項３９～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤であって、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの混合物から選択される賦形剤を含む、請求項３９～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記投与により、前記対象の血漿中か又は組織中において、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドが産生される、請求項３９～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記投与により、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドの産生が、前記対象へのクエン酸生理食塩水緩衝液中の前記改変ＲＮＡの投与と比較した場合に増加する、請求項３９～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記対象は、糖尿病に罹患している、請求項３９～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記創傷は、手術創、熱傷、擦過傷、皮膚生検部位、慢性創傷、損傷、移植創、糖尿病性創傷、糖尿病性潰瘍、褥瘡、床ずれ、及びこれらの組み合わせである、請求項３９～５１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１．配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、且つ全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年５月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は、０９９６３＿６０１６－０００００＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは１１，３９６バイトである。

【0002】

２．分野
本開示は、脂質成分と、ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子に関する。本開示の態様は、さらに、対象における創傷治癒を向上させるための、脂質成分と、ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子の使用に関する。

【背景技術】

【0003】

３．背景
血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）経路は、創傷治癒過程（例えば、損傷を受けた組織の血行再建、血管透過性を向上させること、及び新しい血管の形成（血管形成））における中心的役割を果たす。対象における創傷治癒を向上させること等の治療効果の可能性のためにＶＥＧＦ－Ａ経路を増強するための薬剤を送達することは、難しいままである。

【0004】

標的組織におけるＶＥＧＦ－Ａタンパク質を増大させるための臨床的に扱いやすい手法を可能にするための、多くの多様な方法が試みられている。しかしながら、これらの手法はそれぞれ、重大な欠点を有する。例えば、全身的ＶＥＧＦ－Ａタンパク質送達は、重大な低血圧をもたらす可能性があり、且つＶＥＧＦ－Ａは急速に分解される。ウイルスカプセル化及びネイキッドＶＥＧＦ－ＡＤＮＡプラスミドは、タンパク質発現の時間的制御が限定的であり、且つインビボ発現の効率は、非常に様々であり得、且つ非用量依存性であり得る。結果として、これらの制約が、治療薬としてＶＥＧＦ－Ａレベルを増強する適用可能性を制限している。

【0005】

別の最近の発展は、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質をコードする治療用ＲＮＡを送達することである。しかしながら、天然のＲＮＡの細胞への送達は、そうしたＲＮＡ分子の相対的不安定性及び低細胞透過性に起因して、難しい可能性がある。また、天然のＲＮＡは、免疫活性化を誘発する可能性があり（例えば、Ｋａｃｚｍａｒｅｋｅｔａｌ．，“ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆＲＮＡｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｆｒｏｍｃｏｎｃｅｐｔｔｏｃｌｉｎｉｃａｌｒｅａｌｉｔｙ，”ＧｅｎｏｍｅＭｅｄ．，２０１７，９：６０を参照されたい）、これにより、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質を標的組織に送達するための天然のＲＮＡの使用が制限される。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従って、ＶＥＧＦ－Ａタンパク質をコードするＲＮＡの有効な且つ安全な送達を可能にする組成物の必要性が、依然として存在する。加えて、対象における創傷治癒を向上させること等の治療効果の可能性のためにＶＥＧＦ－Ａ経路を増強するための代替方法の必要性が、依然として存在する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

４．概要
本開示は、脂質成分と、ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子に関する。本開示の態様は、さらに、対象における創傷治癒を向上させるための、脂質成分と、ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡとを含むナノ粒子の使用に関する。

【0008】

本開示のある種の実施形態を、下記の段落にまとめて示す。このリストは、例示的に過ぎず、この開示により提供される実施形態の全てを網羅しているわけではない。いくつかの態様では、本開示は、下記の実施形態に関する。

【0009】

１．
（ｉ）ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）を含む脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含むナノ粒子。

【0010】

２．前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態１に記載のナノ粒子。

【0011】

３．前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態１又は２に記載のナノ粒子。

【0012】

４．前記リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ＤｉｅｔｈｅｒＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミサクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ＬｙｓｏＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びこれらの混合物からなる群から選択され；
前記構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α－トコフェロール、及びこれらの混合物からなる群から選択され；
並びに／又は
前記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール）、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコ－ル－２０００）、及びこれらの混合物からなる群から選択される、
実施形態２又は３に記載のナノ粒子。

【0013】

５．前記脂質成分は、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＤＭＧ－ＰＥＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態１～４のいずれか一つに記載のナノ粒子。

【0014】

６．前記脂質中のイオン化可能な窒素原子と、前記ＲＮＡ中のリン酸基の数との比（Ｎ：Ｐ比）は、約２：１～約３０：１である、実施形態１～５のいずれか一つに記載のナノ粒子。

【0015】

７．前記Ｎ：Ｐ比は、約３：１である、実施形態６に記載のナノ粒子。

【0016】

８．前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約５：１～約１００：１である、実施形態１～７のいずれか一つに記載のナノ粒子。

【0017】

９．前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１である、実施形態８に記載のナノ粒子。

【0018】

１０．前記ナノ粒子は、平均直径が約５０ｎｍ～約１００ｎｍである、実施形態１～９のいずれか一つに記載のナノ粒子。

【0019】

１１．前記ナノ粒子は、平均直径が約７０ｎｍ～約９０ｎｍである、実施形態１～９のいずれか一項に記載のナノ粒子。

【0020】

１２．前記ナノ粒子は、平均直径が約７０ｎｍ～約８５ｎｍである、実施形態１１に記載のナノ粒子。

【0021】

１３．
（ａ）（ｉ）ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）を含む脂質成分と、（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡとを含む少なくとも１種のナノ粒子、
及び
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤
を含む医薬組成物。

【0022】

１４．前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態１３に記載の医薬組成物。

【0023】

１５．前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態１３又は１４に記載の医薬組成物。

【0024】

１６．前記リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ＤｉｅｔｈｅｒＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミサクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ＬｙｓｏＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びこれらの混合物からなる群から選択され；
前記構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、α－トコフェロール、及びこれらの混合物からなる群から選択され；並びに／又は
前記ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール）、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコ－ル－２０００）、及びこれらの混合物からなる群から選択される、実施形態１４又は１５に記載の医薬組成物。

【0025】

１７．前記脂質成分は、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＤＭＧ－ＰＥＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態１３～１６のいずれか一つに記載の医薬組成物。

【0026】

１８．前記脂質中のイオン化可能な窒素原子と、前記ＲＮＡ中のリン酸基の数との比（Ｎ：Ｐ比）は、約２：１～約３０：１である、実施形態１３～１７のいずれか一つに記載の医薬組成物。

【0027】

１９．前記Ｎ：Ｐ比は、約３：１である、実施形態１８に記載の医薬組成物。

【0028】

２０．前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約５：１～約１００：１である、実施形態１３～１９のいずれか一つに記載の医薬組成物。

【0029】

２１．前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１である、実施形態２０に記載の医薬組成物。

【0030】

２２．前記ナノ粒子は、平均直径が約５０ｎｍ～約１００ｎｍである、実施形態１３～２１のいずれか一つに記載の医薬組成物。

【0031】

２３．前記ナノ粒子は、平均直径が約７０ｎｍ～約９０ｎｍである、実施形態１３～２１のいずれか一つに記載の医薬組成物。

【0032】

２４．前記ナノ粒子は、平均直径が約７０ｎｍ～約８５ｎｍである、実施形態２３に記載の医薬組成物。

【0033】

２５．前記薬学的に許容される賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの混合物から選択される、実施形態１３～２４のいずれか一つに記載の医薬組成物。

【0034】

２６．創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法であって、実施形態１～１２のいずれか一つに記載のナノ粒子又は実施形態１３～２５のいずれか一つに記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。

【0035】

２７．前記投与により、前記対象の血漿中か又は組織中において、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドが産生される、実施形態２６に記載の方法。

【0036】

２８．前記ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドは、前記対象への前記ナノ粒子又は医薬組成物の投与後５又は６時間以内に、前記血漿中及び／又は組織中で検出される、実施形態２７に記載の方法。

【0037】

２９．前記投与により、前記対象中において、約１ｐｇ／ｍｇ超の前記ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドが産生される、実施形態２７又は２８に記載の方法。

【0038】

３０．前記ナノ粒子又は前記医薬組成物を皮内投与する、実施形態２６～２９のいずれか一つに記載の方法。

【0039】

３１．前記ナノ粒子又は前記医薬組成物を、創傷に局所的に投与する、実施形態２６～２９のいずれか一つに記載の方法。

【0040】

３２．前記ナノ粒子を、対象の体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの改変ＲＮＡを送達するのに十分な投薬量レベルで投与する、実施形態２６～３１のいずれか一つに記載の方法。

【0041】

３３．前記投与により、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドの産生が、前記対象へのクエン酸生理食塩水緩衝液中の前記改変ＲＮＡの投与と比較した場合に約１～約１００倍増加する、実施形態２６～３２のいずれか一つに記載の方法。

【0042】

３４．前記対象は、糖尿病に罹患している、実施形態２６～３３のいずれか一つに記載の方法。

【0043】

３５．前記創傷は、手術創、熱傷、擦過傷、皮膚生検部位、慢性創傷、損傷（例えば、外傷性損傷の創傷）、移植創、糖尿病性創傷、糖尿病性潰瘍（例えば、糖尿病性足部潰瘍）、褥瘡、床ずれ、及びこれらの組み合わせである、実施形態２６～３４のいずれか一つに記載の方法。

【0044】

３６．血管新生を誘導する方法であって、実施形態１～１２のいずれか一つに記載のナノ粒子又は実施形態１３～２５のいずれか一つに記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。

【0045】

３７．血管形成を誘導する方法であって、実施形態１～１２のいずれか一つに記載のナノ粒子又は実施形態１３～２５のいずれか一つに記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。

【0046】

３８．毛細血管及び／又は細動脈密度を増加させる方法であって、実施形態１～１２のいずれか一つに記載のナノ粒子又は実施形態１３～２５のいずれか一つに記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。

【0047】

３９．創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法であって、
（ｉ）脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含むナノ粒子又はその医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象の創傷に局所的に投与することを含む方法。

【0048】

４０．前記脂質成分は、下記の構造

【化1】

を有する化合物を含む、請求項３９に記載の方法。

【0049】

４１．前記脂質成分は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレートを含む、請求項３９に記載の方法。

【0050】

４２．創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法であって、
（ｉ）下記の構造

【化2】

【0051】

４３．創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法であって、
（ｉ）ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレートを含む脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含むナノ粒子又はその医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象の創傷に局所的に投与することを含む方法。

【0052】

４４．前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態３９～４３のいずれか一つに記載の方法。

【0053】

４５．前記脂質成分は、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＤＭＧ－ＰＥＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態３９～４４のいずれか一つに記載の方法。

【0054】

４６．前記脂質中のイオン化可能な窒素原子と、前記ＲＮＡ中のリン酸基の数との比（Ｎ：Ｐ比）は、約３：１である、実施形態３９～４５のいずれか一つに記載の方法。

【0055】

４７．前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１である、実施形態３９～４６のいずれか一つに記載の方法。

【0056】

４８．前記医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤であって、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの混合物から選択される賦形剤を含む、実施形態３９～４７のいずれか一つに記載の方法。

【0057】

４９．前記投与により、前記対象の血漿中か又は組織中において、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドが産生される、実施形態３９～４８のいずれか一つに記載の方法。

【0058】

５０．前記投与により、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドの産生が、前記対象へのクエン酸生理食塩水緩衝液中の前記改変ＲＮＡの投与と比較した場合に増加する、実施形態請求項３９～４９のいずれか一つに記載の方法。

【0059】

５１．前記対象は、糖尿病に罹患している、実施形態３９～５０のいずれか一つに記載の方法。

【0060】

５２．前記創傷は、手術創、熱傷、擦過傷、皮膚生検部位、慢性創傷、損傷（例えば、外傷性損傷の創傷）、移植創、糖尿病性創傷、糖尿病性潰瘍（例えば、糖尿病性足部潰瘍）、褥瘡、床ずれ、及びこれらの組み合わせである、実施形態３９～５１のいずれか一つに記載の方法。

【0061】

５３．創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法での使用のための実施形態１～１２のいずれか一つに記載のナノ粒子又は実施形態１３～２５のいずれか一つに記載の医薬組成物であって、前記方法は、前記ナノ粒子又は医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0062】

５４．前記投与により、前記対象の血漿中か又は組織中において、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドが産生される、実施形態５３に記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0063】

５５．前記ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドは、前記対象への前記ナノ粒子又は医薬組成物の投与後５又は６時間以内に、前記血漿中及び／又は組織中で検出される、実施形態５４に記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0064】

５６．前記投与により、前記対象中において、約１ｐｇ／ｍｇ超の前記ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドが産生される、実施形態５４又は５５に記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0065】

５７．前記ナノ粒子又は前記医薬組成物を皮内投与する、実施形態５３～５６のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0066】

５８．前記ナノ粒子又は前記医薬組成物を、創傷に局所的に投与する、実施形態５３～５６のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0067】

５９．前記ナノ粒子を、対象の体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの改変ＲＮＡを送達するのに十分な投薬量レベルで投与する、実施形態５３～５８のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0068】

６０．前記投与により、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドの産生が、前記対象へのクエン酸生理食塩水緩衝液中の前記改変ＲＮＡの投与と比較した場合に約１～約１００倍増加する、実施形態５３～５９のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0069】

６１．前記対象は、糖尿病に罹患している、実施形態５３～６０のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0070】

６２．前記創傷は、手術創、熱傷、擦過傷、皮膚生検部位、慢性創傷、損傷（例えば、外傷性損傷の創傷）、移植創、糖尿病性創傷、糖尿病性潰瘍（例えば、糖尿病性足部潰瘍）、褥瘡、床ずれ、及びこれらの組み合わせである、実施形態５３～６１のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0071】

６３．血管新生を誘導する方法での使用のための実施形態１～１２のいずれか一つに記載のナノ粒子又は実施形態１３～２５のいずれか一つに記載の医薬組成物。

【0072】

６４．血管形成を誘導する方法での使用のための実施形態１～１２のいずれか一つに記載のナノ粒子又は実施形態１３～２５のいずれか一つに記載の医薬組成物。

【0073】

６５．毛細血管及び／又は細動脈密度を増加させる方法の使用のための実施形態１～１２のいずれか一つに記載のナノ粒子又は実施形態１３～２５のいずれか一つに記載の医薬組成物。

【0074】

６６．創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法での使用のためのナノ粒子又はその医薬組成物であって、前記方法は、前記ナノ粒子又は医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象の創傷に局所的に投与することを含み、前記ナノ粒子又はその医薬組成物は、
（ｉ）脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含む、使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0075】

６７．前記脂質成分は、下記の構造

【化3】

を有する化合物を含む、請求項６６に記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0076】

６８．前記脂質成分は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレートを含む、請求項６６に記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0077】

６９．創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法での使用のためのナノ粒子又はその医薬組成物であって、前記方法は、前記ナノ粒子又は医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象の創傷に局所的に投与することを含み、前記ナノ粒子又はその医薬組成物は、
（ｉ）下記の構造

【化4】

を有する化合物を含む脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含む、使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0078】

７０．創傷治癒を促進する及び／又は向上させる方法での使用のためのナノ粒子又はその医薬組成物であって、前記方法は、前記ナノ粒子又は医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象の創傷に局所的に投与することを含み、前記ナノ粒子又はその医薬組成物は、
（ｉ）ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレートを含む脂質成分と、
（ｉｉ）配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする、配列番号１及び３～５のいずれか１つを含む改変ＲＮＡと
を含む、使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0079】

７１．前記脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態６６～７０のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0080】

７２．前記脂質成分は、ＤＳＰＣであるリン脂質、コレステロールである構造脂質、及び／又はＤＭＧ－ＰＥＧであるＰＥＧ脂質をさらに含む、実施形態６６～７１のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0081】

７３．前記脂質中のイオン化可能な窒素原子と、前記ＲＮＡ中のリン酸基の数との比（Ｎ：Ｐ比）は、約３：１である、実施形態６６～７２のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0082】

７４．前記脂質成分と前記改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１である、実施形態６６～７３のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0083】

７５．前記医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤であって、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの混合物から選択される賦形剤を含む、実施形態６６～７４のいずれか一つに記載の使用のための医薬組成物。

【0084】

７６．前記投与により、前記対象の血漿中か又は組織中において、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドが産生される、実施形態６６～７５のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0085】

７７．前記投与により、配列番号２のＶＥＧＦ－Ａポリペプチドの産生が、前記対象へのクエン酸生理食塩水緩衝液中の前記改変ＲＮＡの投与と比較した場合に増加する、実施形態請求項６６～７６のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0086】

７８．前記対象は、糖尿病に罹患している、実施形態請求項６６～７７のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

【0087】

７９．前記創傷は、手術創、熱傷、擦過傷、皮膚生検部位、慢性創傷、損傷（例えば、外傷性損傷の創傷）、移植創、糖尿病性創傷、糖尿病性潰瘍（例えば、糖尿病性足部潰瘍）、褥瘡、床ずれ、及びこれらの組み合わせである、実施形態６６～７８のいずれか一つに記載の使用のためのナノ粒子又は医薬組成物。

当業者は、下記で説明されている図面が例示目的にすぎないことを理解するであろう。これらの図面は、本教示の範囲を制限することが決して意図されていない。

【図面の簡単な説明】

【0088】

【図1】実施例で使用される脂質化合物（化合物Ａ）を示す。

【図2】改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡ構築物の構造の図（図２Ａ）、及び代表的なＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡの配列（配列番号１、図２Ｂ）。

【図3】脂質化合物ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）を示す。

【図4】マウスにおける改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡの皮内注射後の創傷治癒の評価に関する試験タイムライン。

【図5】創傷治癒への、ＭＣ３と配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡ（ｍＲＮＡＶＥＧＦ３μｇＭＣ３）、ＭＣ３と配合された非翻訳性ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡ（ｍＲＮＡＶＥＧＦＮＴ（３μｇ）ＭＣ３）、及び生理食塩水／クエン酸組成物の皮内投与（注射）の効果。

【図6】マウスにおける改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡの局所投与後の創傷治癒の評価に関する試験タイムライン。

【図7】創傷治癒への、ＭＣと配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡ（ｍＲＮＡＶＥＧＦ（３μｇ）ＭＣ３）、及び生理食塩水／クエン酸組成物の局所投与の効果。

【図8A】化合物Ａと配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡの局所投与、生理食塩水／クエン酸に配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡの局所投与、ＭＣ３と配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡの局所投与、及びＭＣ３と配合された改変ＶＥＧＦ－Ａの皮内（単回注射）投与の５～６時間後での、ブタ組織中でのヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ－Ａ）タンパク質発現。

【図8B】ブタ皮膚での創傷の写真であり、描かれている円形は、局所投与の部位を示す。

【発明を実施するための形態】

【0089】

６．詳細な説明
本開示で参照された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0090】

前述の説明及び付随する図面で示されている教示の利益を有する、本明細書に記述されている本開示の多くの改変及び他の実施形態は、この開示が属する分野の当業者に思い浮かぶであろう。従って、本開示は、開示されている具体的実施形態に限定されるべきではないこと、且つ改変及び他の実施形態が、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されていることを理解しなければならない。本明細書では特定の用語が用いられるが、これらは、一般的な及び説明的な意味でのみ使用され、限定の目的では使用されない。

【0091】

単位、接頭辞、及び記号は、それらのＳＩ承認形で表示され得る。別途示されない限り、それぞれ、核酸は、５’から３’の方向に左から右に書かれており；アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向に左から右に書かれている。数値範囲は、この範囲を定義する数字を含む。本明細書の値の範囲の記述は、単に、この範囲内にあるそれぞれ別の値を個々に言及する簡便表記方法としての役割を果たすことが意図されているに過ぎない。別途本明細書で示されない限り、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書では、アミノ酸は、一般に知られている３文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨されている１文字記号のいずれかにより言及され得る。ヌクレオチドは、同様に、一般に受け入れられている１文字コードで言及され得る。

【0092】

６．１．定義
別途具体的に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。別途言及しない限り、本明細書で用いられるか又は企図される技術は、当業者に公知の標準的方法論である。本開示の実施は、別途示されない限り、当技術分野の技術内である、微生物学、組織培養、分子生物学、化学、生化学、及び組換えＤＮＡ技術の従来の技術を用いることとなる。材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定的ではない。下記のものは、例示の目的で示され、本開示の範囲を限定することは意図されていない。

【0093】

いくつかの実施形態では、本明細書（これに、特許請求の範囲全体が組み込まれる）に記述されている数値パラメータは、概数であり、この概数は、特定の実施形態により得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る。いくつかの実施形態では、この数値パラメータは、報告された有効桁数に照らして且つ通常の丸め技術を適用することにより、解釈されるべきである。本開示の広範にわたるいくつかの実施形態を記述する数値範囲及びパラメータは概数であるにもかかわらず、具体的な例で記述される数値は、可能な限り正確に報告されている。本開示のいくつかの実施形態で示される数値は、それぞれの試験測定で見られる標準偏差に必然的に起因する、いくらかの誤差を含む場合がある。本明細書の値の範囲の記述は、単に、範囲内にあるそれぞれ別の値を個々に言及する簡便表記方法としての役割を果たすことが意図されているに過ぎない。別途本明細書で示されない限り、それぞれ個々の値は、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されていたかのように本明細書に組み込まれる。

【0094】

便宜のために、本出願全体（明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲を含む）において用いられるある種の用語を、ここに集める。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0095】

いくつかの実施形態では、本開示のある種の実施形態を説明し且つ特許請求するために使用される成分、特性、例えば分子量、反応条件、及び結果等の量を表す数は、場合によっては、用語「約」によって修飾されるものと理解するべきである。当業者は、修飾する値に照らして、用語「約」の意味を理解するであろう。いくつかの実施形態では、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために用いられている装置又は方法に関する平均値の標準偏差を含むことを示すために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書（これに、特許請求の範囲全体が組み込まれる）に記述されている数値パラメータは、概数であり、この概数は、特定の実施形態により得られることが求められる所望される特性に応じて変動し得る。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数に照らして且つ通常の丸め技術を適用することにより、解釈されるべきである。本開示の広範にわたるいくつかの実施形態を記述する数値範囲及びパラメータは概数であるにもかかわらず、具体的な例において記述される数値は、可能な限り正確に報告されている。本開示のいくつかの実施形態で示される数値は、それぞれの試験測定で見られる標準偏差に必然的に起因する、いくらかの誤差を含む場合がある。

【0096】

本明細書で使用される場合、用語「投与すること」は、所望される部位又は組織位置でのナノ粒子及び／又は組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路による、ナノ粒子、及び／又は少なくとも１種のナノ粒子を含む医薬組成物の、哺乳類組織又は対象への配置を指す。いくつかの実施形態では、脂質成分と改変ＲＮＡとを含むナノ粒子を、皮内経路（例えば、注射による皮内経路）を介して投与し得る。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡにより発現されるタンパク質の少なくとも一部は、皮内投与を介して、所望される標的組織又は標的細胞の位置に局在化されている。いくつかの実施形態では、脂質成分と改変ＲＮＡとを含むナノ粒子を、局所投与又は局所適用により投与し得る。いくつかの実施形態では、脂質成分と改変ＲＮＡとを含むナノ粒子を、創傷への局所投与又は局所適用により投与し得る。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡにより発現されるタンパク質の少なくとも一部は、局所投与を介して、所望される標的組織又は標的細胞の位置に局在化されている。いくつかの実施形態では、皮内投与を介して投与された改変ＲＮＡに起因するタンパク質発現により、この改変ＲＮＡを投与しなかった場合の治癒と比較して、創傷の治癒が改善される。いくつかの実施形態では、局所投与を介して投与された改変ＲＮＡに起因するタンパク質発現により、この改変ＲＮＡを投与しなかった場合の治癒と比較して、創傷の治癒が改善される。

【0097】

用語「医薬組成物」は、治療上活性な成分と、当技術分野で通常である薬学的に許容される担体又は賦形剤等の担体又は賦形剤とを含む混合物を指す。例えば、医薬組成物は、本明細書で使用される場合、通常は、脂質成分、本開示に係る改変ＲＮＡ、及び適切な賦形剤を少なくとも含む。

【0098】

用語「化合物」には、表された構造の全ての同位体及び異性体が含まれる。「同位体」は、原子番号は同一であるが核内の異なる中性子数に起因して質量数が異なる原子を指す。例えば、水素の同位体として、トリチウム及び重水素が挙げられる。さらに、本開示の化合物、塩、又は複合体を、通例の方法により、溶媒又は水分子と組み合わせて調製して溶媒和物及び水和物を形成し得る。「異性体」は、化合物のあらゆる幾何異性体、互変異性体、双性イオン、立体異性体、鏡像異性体、又はジアステレオマーを意味する。化合物は、１つ又は複数のキラル中心及び／又は二重結合を含み得、そのため、二重結合異性体又はジアステレオマー等の立体異性体として存在し得る。本開示は、本明細書で説明されている化合物のありとあらゆる異性体（例えば、立体異性体的に（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃａｌｌｙ）純粋な形態、並びに鏡像異性体及び立体異性体混合物（例えばラセミ体））を包含する。化合物の鏡像異性体及び立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ）混合物、並びにこれらをその構成要素の鏡像異性体又は立体異性体に分割する手段は、当技術分野で公知である。

【0099】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、制約のない連結動詞である。これらの動詞の内の１つ又は複数のあらゆる形態又は時制も制約がなく、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「～を含めて（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」も制約がない。例えば、１つ又は複数のステップ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「を有する（ｈａｓ）」、又は「が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」いずれかの方法は、これらの１つ又は複数のステップのみを有することに限定されず、他の列挙されていないステップも包含し得る。同様に、１つ又は複数の特徴「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「を有する（ｈａｓ）」、又は「が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」いずれかの組成物は、これらの１つ又は複数の特徴のみを有することに限定されず、他の列挙されていない特徴も包含し得る。ある種の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例、又は例示的な言葉（例えば「等」）の使用は、本明細書では、本開示をより明らかにすることが意図されているにすぎず、別途特許請求されている本開示の範囲に対する限定を与えるものではない。本明細書中の言葉は、本開示の実施に不可欠であるものとしてのいずれかの特許請求されてない要素を示すと解釈されるべきではない。

【0100】

用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ）」は、特許請求されている発明の「基本の及び新規の特性に実質的に影響を及ぼさない」追加の材料又はステップの存在を可能にする。

【0101】

用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」は、実施形態の説明において列挙されていないあらゆる要素を除外する、本明細書で説明されている組成物、方法、及びこれらのそれぞれの構成要素を指す。

【0102】

用語「送達すること（ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ）」は、実体を目的部位に提供することを意味する。例えば、治療薬を対象に送達することは、改変ＲＮＡを含む少なくとも１種のナノ粒子を含む医薬組成物を、（例えば皮内経路又は局所経路により）対象に投与することを含み得る。少なくとも１種のナノ粒子を含む医薬組成物の哺乳類組織又は対象への投与は、皮内投与（例えば皮内注射）を介して、１つ又は複数の細胞と、この医薬組成物とを接触させることを含み得る。少なくとも１種のナノ粒子を含む医薬組成物の哺乳類組織又は対象への投与は、局所投与又は局所適用を介して、１つ又は複数の細胞と、この医薬組成物とを接触させることを含み得る。

【0103】

用語「疾患」又は「障害」は、本明細書では互換的に使用され、身体若しくはいくつかの器官の状態の任意の変化、機能の実行の中断若しくは妨害、及び／又は悩んでいる人若しくは人と接触するものに、不快、機能障害、苦痛、又はさらには死亡等の症状を引き起こすことを指す。疾患又は障害はまた、不健康（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ）、病的状態（ａｉｌｉｎｇ）、慢性的な軽い病気（ａｉｌｍｅｎｔ）、慢性病（ｍａｌａｄｙ）、不調（ｓｉｃｋｎｅｓｓ）、疾病（ｉｌｌｎｅｓｓ）、愁訴（ｃｏｍｐｌａｉｎｔ）、体調不良（ｉｎｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）、又は病気（ａｆｆｅｃｔｉｏｎ）に関連し得る。

【0104】

用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、疾患若しくは障害の少なくとも１つ若しくは複数の症状を軽減させるのに十分か又は所望される効果を提供するのに十分な、治療薬（例えば改変ＲＮＡ）又は医薬組成物の量を指す。例えば、有効量は、創傷治癒と関連する症状又は臨床マーカーの治療的に有意な低下を誘導する量であり得る。

【0105】

本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、下記の事象の内の１つ又は複数を指す：（１）（例えば転写による）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生；（２）（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／又は３’末端プロセシングによる）ＲＮＡ転写物のプロセシング；（３）ＲＮＡのポリペプチド又はタンパク質への翻訳；並びに（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。

【0106】

本明細書で使用される場合、用語「脂質成分」は、１種又は複数種の脂質を含むナノ粒子の構成成分である。例えば、脂質成分は、１種又は複数種のカチオン性の／イオン化可能な脂質、ＰＥＧ化された脂質、構造脂質、又は他の脂質（例えばリン脂質）を含み得る。一実施形態では、脂質成分は、化合物Ａを含む（図１）。一実施形態では、脂質成分は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）を含む。

【0107】

本明細書で使用される場合、用語「改変ＲＮＡ」は、アデノシン（Ａ）（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－３，４－ジオール）、グアノシン（Ｇ）（２－アミノ－９－［３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－２－イル］－３Ｈ－プリン－６－オン）、シチジン（Ｃ）（４－アミノ－１－［３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－オン）、及びウリジン（Ｕ）（１－［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－２－イル］ピリミジン－２，４－ジオン）と比較して、若しくはＲＮＡ分子内のＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、及びＵＭＰと比較して、１つ、２つ、若しくは２つよりも多いヌクレオシド改変を含むＲＮＡ分子、又はその一部を指す。ヌクレオシド改変の非限定的な例は、本明細書内の他の場所で提供される。特許請求されている特定のＲＮＡのヌクレオチド配列が、天然に存在するＲＮＡ分子の配列と他の点で同一である場合には、改変ＲＮＡは、天然の対応物中に存在するものとは異なる少なくとも１つの改変を有するＲＮＡ分子であると理解される。この相違は、ヌクレオシド／ヌクレオチドに対する化学変化、又は配列内のこの変化の位置であり得る。一実施形態では、改変ＲＮＡは、改変メッセンジャーＲＮＡ（又は「改変ｍＲＮＡ」）である。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡには、改変されてＮ１－メチル－シュードＵＭＰが形成される少なくとも１つのＵＭＰが含まれる。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡ中の全てのＵＭＰは、Ｎ１－メチル－シュードＵＭＰに置き換えられている。

【0108】

本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」は、１種又は複数種の脂質と、１種又は複数種の治療薬とを含む粒子である。ナノ粒子は、典型的には、およそ数マイクロメートル又はそれよりも小さいサイズであり、脂質二重層を含み得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、動的光散乱により測定された場合には、平均直径（例えば流体力学的直径）が約５０ｎｍ～約１００ｎｍであり、例えば、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、又は約７０ｎｍ～約８５ｎｍである（ＮＩＳＴＳｐｅｃｉａｌＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ１２００－６，“ＭｅａｓｕｒｉｎｇｔｈｅＳｉｚｅｏｆＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎＡｑｕｅｏｕｓＭｅｄｉａＵｓｉｎｇＢａｔｃｈＭｏｄｅＤｙｎａｍｉｃＬｉｇｈｔＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ”を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、平均流体力学的直径が約７１ｎｍ、７２ｎｍ、７３ｎｍ、７４ｎｍ、７５ｎｍ、７６ｎｍ、７７ｎｍ、７８ｎｍ、７９ｎｍ、８０ｎｍ、８１ｎｍ、８２ｎｍ、８３ｎｍ、８４ｎｍ、８５ｎｍ、８６ｎｍ、８７ｎｍ、８８ｎｍ、８９ｎｍ、又は９０ｎｍである。いくつかの実施形態では、治療薬は、改変ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、図１に示す化合物Ａと、改変ＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）と、改変ＲＮＡとを含む。

【0109】

本明細書で使用される場合、「多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎｉｎｄｅｘ）（ｐＤＩ）」は、ナノ粒子状試料中のナノ粒子径の分布の尺度である（ＮＩＳＴＳｐｅｃｉａｌＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ１２００－６，“ＭｅａｓｕｒｉｎｇｔｈｅＳｉｚｅｏｆＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎＡｑｕｅｏｕｓＭｅｄｉａＵｓｉｎｇＢａｔｃｈＭｏｄｅＤｙｎａｍｉｃＬｉｇｈｔＳｃａｔｔｅｒｉｎｇ”を参照されたい）。いくつかの実施形態では、多分散性指数は、約０．０１～約０．２０であり、例えば、約０．０３～約０．１０、約０．０４～約０．０８、例えば、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、又は０．２０である。

【0110】

本明細書で使用される場合、「Ｎ：Ｐ比」は、例えば、脂質成分と改変ＲＮＡとを含むナノ粒子における、脂質中の（生理学的ｐＨ範囲で）イオン化可能な窒素原子と、ＲＮＡ中のリン酸基とのモル比である。

【0111】

本明細書で使用される場合、用語「核酸」には、その最も広い意味では、ホスホジエステル結合を介して連結されたヌクレオチドのポリマーを含むあらゆる化合物及び／又は物質が含まれる。これらのポリマーは、サイズに応じてオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと称されることが多い。用語「ポリヌクレオチド配列」及び「ヌクレオチド配列」はまた、本明細書では互換的に使用される。

【0112】

本明細書で使用される場合、「ＰＥＧ脂質」又は「ＰＥＧ化脂質」は、ポリエチレングリコール成分を含む脂質を指す。

【0113】

語句「薬学的に許容される」は、本明細書では、妥当なベネフィット／リスク比で、過剰な毒性、刺激性、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴うことなくヒト及び動物の組織との接触での使用に適した、適切な医学的判断の範囲内である化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために用いられる。薬物承認機関（例えば、ＥＭＡ、ＵＳ－ＦＤＡ）は指針を提供しており、薬学的に許容される化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を承認する。例は、薬局方に列挙されている。

【0114】

語句「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書では、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの混合物から選択される、薬学的に許容される材料を指すために用いられる。いくつかの実施形態では、溶媒は、水性溶媒である。

【0115】

本明細書で使用される場合、「リン脂質」は、リン酸部分と、不飽和脂肪酸鎖等の１本又は複数本の炭素鎖とを含む脂質である。リン脂質は、１つ又は複数の多重（例えば、二重又は三重）結合（例えば、１つ又は複数の不飽和）を含み得る。特定のリン脂質は、膜への融合を容易にし得る。例えば、カチオン性のリン脂質は、膜（例えば、細胞膜又は細胞内膜）の負の電荷を持つ１つ又は複数のリン脂質と相互作用し得る。膜へのリン脂質の融合は、脂質含有組成物の１種又は複数種の要素を膜に通過させて、例えば、１種又は複数種の要素の細胞への送達を可能にし得る。

【0116】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合にはペプチド結合により共に連結されているアミノ酸残基（天然又は非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用される場合、あらゆるサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドは、単一分子であってもよいし、二量体、三量体、又は四量体等の多分子複合体でもあってもよい。これらはまた、抗体又はインスリン等の単鎖又は多連鎖のポリペプチドも含み得、且つ会合され得るか又は連結され得る。最も一般的には、多連鎖ポリペプチド中にはジスルフィド結合が見られる。用語ポリペプチドはまた、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学的類似体である、アミノ酸ポリマーにも当てはまり得る。

【0117】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、２０種のアミノ酸の内のいずれかから本質的になるポリマーである。「ポリペプチド」は、比較的大きいポリペプチドに関して使用されることが多いが、「ペプチド」は、小さいポリペプチドに関して使用されることが多く、これらの用語の使用法は、当技術分野で重なり合っており、且つ多様である。用語「ペプチド」、「タンパク質」、及び「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用されることがある。

【0118】

用語「対象」は、本明細書で説明されている方法及び組成物による処置（例えば予防的処置）が提供される動物（例えばヒト）を指す。ヒト対象等の特定の動物に対して特異的である状態又は病状の処置の場合には、用語「対象」は、この特定の動物を指す。

【0119】

用語「組織」は、ある種の特別な機能を共に実施する、同様に特化された細胞の群又は層を指す。

【0120】

本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」、又は「処置すること」は、疾患若しくは障害又はその少なくとも１種の認識可能な症状の回復又は消失を指す。いくつかの実施形態では、「治療」又は「治療すること」は、必ずしも患者によって認識可能とは限らない少なくとも１種の測定可能な物理的パラメータの回復又は消失を指す。
本開示は、本明細書で説明されている特定の方法論、プロトコル、及び試薬等に限定されず、従って変わり得ることを理解するべきである。
本明細書で使用されている用語法は、特定の実施形態を説明する目的のためだけであり、本開示の範囲を限定することは意図されておらず、本開示は、もっぱら特許請求の範囲により定義される。

【0121】

６．２．脂質成分
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、化合物Ａを含む脂質成分を含む（図１）。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）を含む脂質成分を含む。追加の化合物は、全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０４９２４５Ａ２号パンフレットに開示されている（例えば、国際公開第２０１７／０４９２４５Ａ２号パンフレット中の化合物１－１４７を参照されたい）。脂質成分は、リン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質等の様々な他の脂質も含み得る。

【0122】

リン脂質
ナノ粒子の脂質成分は、１種又は複数種のリン脂質（例えば、１種又は複数種の（ポリ）不飽和脂質）を含み得る。リン脂質は、１つ又は複数の脂質二重層へと組み立てられ得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分と１つ又は複数の脂肪酸部分とを含み得る。

【0123】

これらの組成物及び方法で有用なリン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ｌ，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ＤｉｅｔｈｅｒＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミサクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ＬｙｓｏＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＥ１６．０ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。いくつかの実施形態では、脂質成分は、ＤＳＰＣを含む。いくつかの実施形態では、脂質成分は、ＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態では、脂質成分は、ＤＳＰＣとＤＯＰＥとの両方を含む。

【0124】

構造脂質
ナノ粒子の脂質成分は、１種又は複数種の構造脂質を含み得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、α－トコフェロール、及びこれらの混合物から選択され得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロール及び副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾン）、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、脂質成分は、コレステロールを含む。

【0125】

ＰＥＧ脂質
ナノ粒子の脂質成分は、１種又は複数種のＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質を含み得る。そのような脂質は、代わりにＰＥＧ化脂質と称され得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びこれらの混合物からなる非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＤＭＧ－ＰＥＧ（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングルコール）、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能）、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００）、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、又はＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。いくつかの実施形態では、脂質成分は、ＤＭＧ－ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、脂質成分は、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含む。

【0126】

６．３．ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡ
インビトロ、インビボ、インサイチュ、又はエクスビボにかかわらず、核酸（例えばリボ核酸（ＲＮＡ））を細胞内に送達し得ること、例えば、核酸の細胞内翻訳及びコードされた目的のポリペプチドの産生を引き起こし得ることは、治療法、診断法、試薬の分野において及び生物学的アッセイにとって非常に興味深い。

【0127】

天然に存在するＲＮＡは、下記の４種の基本的なリボヌクレオチド：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、及びＧＴＰから合成されているが、転写後に改変されたヌクレオチドを含み得る。さらに、ＲＮＡでは、約１００種の異なるヌクレオシド改変が特定されている（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．，ＴｈｅＲＮＡＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎＤａｔａｂａｓｅ：１９９９ｕｐｄａｔｅ，ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ，（１９９９）２７：１９６－１９７）。

【0128】

本開示によれば、これらのＲＮＡは、当技術分野の他のＲＮＡ分子の欠点（例えば、投与時の自然免疫応答及び急速分解を活性化する）を回避するためのものとして改変されることが好ましい。従って、これらのポリヌクレオチドは、改変ＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、対象への投与時の自然免疫応答を回避する。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡの半減期は、非改変ＲＮＡと比較して延長されている。

【0129】

好ましい実施形態では、ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。本明細書で使用される場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、目的のポリペプチドをコードしており且つインビトロ、インビボ、インサイチュ、又はエクスビボで翻訳されて、このコードされた目的のポリペプチドを産生する能力があるあらゆるポリヌクレオチドを指す。

【0130】

図２Ａに示すように、従来、ｍＲＮＡ分子の基本構成要素として、コード領域、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、５’キャップ、及びポリＡテールが少なくとも挙げられる。この野生型モジュール構造の構築に関して、本開示は、モジュールの組織化を維持するがポリヌクレオチドに有用な特性（例えば、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的誘発の欠如）を付与する１つ又は複数の構造的な及び／又は化学的な改変又は変更を含むポリヌクレオチド又は一次ＲＮＡ構築物を提供することにより、従来のｍＲＮＡ分子の機能性の範囲を拡大する。

【0131】

改変ＲＮＡとして、標準的なＲＮＡヌクレオチド鎖に対する任意の有用な改変が挙げられ得、例えば、糖、核酸塩基（例えば、ピリミジン核酸塩基の原子を、任意選択的に置換されたアミノ、任意選択的に置換されたチオール、任意選択的に置換されたアルキル（例えば、メチル若しくはエチル）、又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）と置き換えるか又は置換することによる、核酸塩基の１つ又は複数の改変）、又はヌクレオシド間結合（例えば、ホスホジエステル骨格に対する１つ若しくは複数の改変）が挙げられ得る。

【0132】

非限定的な例として、いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡとして、例えば、改変されてＮ１－メチル－シュード－ＵＭＰが形成される少なくとも１つのウリジン一リン酸（ＵＭＰ）が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、Ｎ１－メチル－シュード－ＵＭＰは、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９．９％、及び１００％という、配列中のＵＭＰの割合で、ＵＭＰの代わりに存在する。いくつかの実施形態では、全てのＵＭＰが、Ｎ１－メチル－シュード－ＵＭＰに置き換えられている。

【0133】

いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、５’ジグアノシンキャップ等の５’キャップに対する改変を含む。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、コード領域に対する改変を含む。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、５’ＵＴＲに対する改変を含む。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、３’ＵＴＲに対する改変を含む。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、ポリ（Ａ）テールに対する改変を含む。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、コード領域、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はポリ（Ａ）テールに対する改変の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、アルカリホスファターゼで任意選択的に処理され得る。

【0134】

いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、一般に創傷治癒の調節において中心的役割を果たす血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチド（ＶＥＧＦタンパク質の大きなファミリーのいずれか１つ）をコードする。ＶＥＧＦの役割として、一酸化窒素（ＮＯ）シグナル伝達、発生上での及び出生後の血管形成、腫瘍血管形成、動脈形成、内皮複製、並びに多能性心血管前駆細胞のための細胞運命スイッチの活性化も挙げられる。

【0135】

ある特定のＶＥＧＦ遺伝子に関して１種又は複数種のバリアント又はアイソフォームが存在し得ることが、当業者により理解されるだろう。本開示に係るＶＥＧＦ－Ａポリペプチドの非限定的な例を、表１に列挙する。表１で開示されている配列が隣接領域の可能性を含むことが、当業者により理解されるだろう。これらは、オープンリーディングフレームの５’（上流）又は３’（下流）のいずれかに対して各ヌクレオチド配列中にコードされている。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド参照配列を教示することにより、明確に及び具体的に開示されている。１種又は複数種の利用可能なデータベース又はアルゴリズムを利用することにより、５’隣接領域及び３’隣接領域をさらに特徴付けることも可能である。データベースは、ＮＣＢＩ配列の隣接領域に含まれる特徴に注釈を施しており、これらは当技術分野で利用可能である。

【0136】

【表1-1】

【0137】

【表1-2】

【0138】

【表1-3】

【0139】

ＶＥＧＦ－Ａポリペプチド（例えばヒトＶＥＧＦ－Ａポリペプチド）をコードするＲＮＡ分子を、表１に列挙されたＶＥＧＦ－ＡｍＲＮＡアイソフォームに従って設計し得ることが、当業者に理解されるだろう。当業者は、一般に、残りのＶＥＧＦファミリーメンバーの複数のアイソフォームを熟知している。

【0140】

一実施形態では、本開示は、ＶＥＧＦ－Ａポリペプチド（例えば配列番号２）をコードする改変ＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードし、この改変ＲＮＡは、配列番号１及び３～５の内のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、又はこれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、又はこれらの任意の組み合わせは、１つ又は複数の改変ヌクレオチドを含み得る。

【0141】

いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡは、図２Ｂに示される構造を有し得、この構造は、配列番号１である。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ－Ａポリペプチドをコードする改変ＲＮＡは、配列番号３～５の内のいずれか１つの配列を有し得る。

【0142】

６．４．脂質成分と改変ＲＮＡとを含む組成物
いくつかの実施形態は、脂質成分と改変ＲＮＡとを含むナノ粒子に関する。

【0143】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、化合物Ａ（図１）を含み得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、本明細書で開示されているリン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ、及びこれらの混合物を含み得る。脂質成分の要素は、特定の比率で提供され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、化合物Ａ、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、総モル％が１００％を超えないという条件で、約３０モル％～約６０モル％の化合物Ａ、約０モル％～約３０モル％のリン脂質、約１８．５モル％～約４８．５モル％の構造脂質、及び約０モル％～約１０モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、約３５モル％～約５５モル％の化合物Ａ、約５モル％～約２５モル％のリン脂質、約３０モル％～約４０モル％の構造脂質、及び約０モル％～約１０モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質成分は、約５０モル％の化合物Ａ、約１０モル％のリン脂質、約３８．５モル％の構造脂質、及び約１．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧであり得る。

【0144】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）（図３）を含み得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、本明細書で開示されているリン脂質、構造脂質、及び／又はＰＥＧ脂質をさらに含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ（例えばＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）、及びこれらの混合物を含み得る。

【0145】

脂質成分の要素は、特定の比率で提供され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、総モル％が１００％を超えないという条件で、約３０モル％～約６０モル％のＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、約０モル％～約３０モル％のリン脂質、約１８．５モル％～約４８．５モル％の構造脂質、及び約０モル％～約１０モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の脂質成分は、約３５モル％～約５５モル％のＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、約５モル％～約２５モル％のリン脂質、約３０モル％～約４０モル％の構造脂質、及び約０モル％～約１０モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質成分は、約５０モル％のＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、約１０モル％のリン脂質、約３８．５モル％の構造脂質、及び約１．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。いくつかの実施形態では、構造脂質は、コレステロールであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧ（例えばＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）であり得る。

【0146】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子の改変ＲＮＡ成分は、本明細書で開示されているＶＥＧＦ－Ａポリペプチド（例えば配列番号２）をコードする改変ＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の改変ＲＮＡ成分は、配列番号１及び３～５の内のいずれか１つを含む改変ＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の改変ＲＮＡ成分は、配列番号３を含む改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の改変ＲＮＡ成分は、配列番号４を含む改変ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡは、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、又はこれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ（Ａ）テール、又はこれらの任意の組み合わせは、１つ又は複数の改変ヌクレオチドを含み得る。

【0147】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子中の脂質成分と改変ＲＮＡとの相対量は、変動し得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子中の脂質成分と改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約５：１～約１００：１であり得、例えば、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、及び１００：１であり得る。例えば、脂質成分と改変ＲＮＡとのｗｔ／ｗｔ比は、約５：１～約４０：１であり得る。いくつかの実施形態では、ｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１～約２０：１である。いくつかの実施形態では、ｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１である。いくつかの実施形態では、ｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１である。いくつかの実施形態では、ｗｔ／ｗｔ比は、約１０．２５：１である。

【0148】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子中の脂質成分と改変ＲＮＡとの相対量は、特定のＮ：Ｐ比により提供され得る。組成物のＮ：Ｐ比は、１又は複数の脂質中の窒素原子と、ＲＮＡ中のリン酸基の数とのモル比を指す。一般に、より小さいＮ：Ｐ比が好ましい。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約３０：１であり得、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１４：１、１６：１、１８：１、２０：１、２２：１、２４：１、２６：１、２８：１、又は３０：１であり得る。いくつかの実施形態では、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約８：１であり得る。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約３．０：１、約３．５：１、約４．０：１、約４．５：１、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１、又は約７．０：１であり得る。いくつかの実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約４：１であり得る。いくつかの実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約３：１であり得る。

【0149】

脂質ナノ粒子を、当技術分野で公知の方法を使用して調製し得る（例えば、Ｂｅｌｌｉｖｅａｕｅｔａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｈｉｇｈｌｙｐｏｔｅｎｔｌｉｍｉｔ－ｓｉｚｅｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｉｎｖｉｖｏｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｓｉＲＮＡ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，２０１２，１（８）：ｅ３７；Ｚｈｉｇａｌｔｓｅｖｅｔａｌ．，Ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｌｉｍｉｔｓｉｚｅｌｉｐｉｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｙｓｔｅｍｓｗｉｔｈａｑｕｅｏｕｓａｎｄｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｃｏｒｅｓｕｓｉｎｇｍｉｌｌｉｓｅｃｏｎｄｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｍｉｘｉｎｇ，”Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１２，２８（７）：３６３３－３６４０を参照されたい）。

【0150】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得、本明細書で使用される場合、この賦形剤として下記が挙げられるが、これらに限定されない：所望される特定の剤形に適合された、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、及び同類のもの。賦形剤として下記も挙げられ得るが、これらに限定されない：ポリマー、コア－シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びこれらの組み合わせ。医薬組成物を形成するための様々な賦形剤、及びこの組成物を調製するための技術は、当技術分野で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２２^ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＥｄｉｔｅｄｂｙＡｌｌｅｎ，ＬｏｙｄＶ．，Ｊｒ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、任意の望ましくない生物学的影響をもたらすか又は別の方式で医薬組成物の任意の他の成分と有害な方式で相互作用することにより、物質又はその誘導体と適合しない可能性がある場合を除いて、本開示の範囲内であると考えることができる。

【0151】

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、薬学的に有効な量の脂質成分及び改変ＲＮＡを含み得、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、コア－シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの混合物から選択される。いくつかの実施形態では、溶媒は、水性溶媒である。いくつかの実施形態では、溶媒は、非水性溶媒である。

【0152】

本開示はまた、本明細書で開示されている脂質成分及び改変ＲＮＡを含む１種又は複数種の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書で開示されている複数種の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、溶媒、分散媒、希釈剤、分散、懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、保存剤、コア－シェルナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、及びこれらの混合物から選択される。いくつかの実施形態では、溶媒は、水性溶媒である。いくつかの実施形態では、溶媒は、非水性溶媒である。

【0153】

６．５．対象における創傷治癒の向上
ＶＥＧＦ－Ａ経路は、損傷を受けた組織の血行再建、血管透過性の向上、及び新しい血管の形成を含む創傷治癒過程における中心的役割を果たす。不完全な創傷治癒過程に起因する疾患に罹患している対象を治療することが、本開示の目標である。

【0154】

いくつかの実施形態では、本開示に係るナノ粒子を、血管構造に影響を及ぼす疾患に罹患している対象に投与する。血管構造は、最も一般的には、穿通性の外傷、熱傷、又は手術により損傷される。糖尿病は、創傷治癒の多数の要素を損ない、糖尿病性の創傷治癒を有する患者は一般に、血管機能障害が原因で、血流が変化している。従って、糖尿病性潰瘍等の皮膚潰瘍を有する患者は、通常、創傷治癒が低下しているか、又は遅延している。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているナノ粒子を、糖尿病に罹患している対象に投与する。本開示の文脈では、創傷は、例えば、手術創、熱傷、擦過傷、皮膚生検部位、慢性創傷、損傷（例えば、外傷性損傷の創傷）、移植創、糖尿病性創傷、糖尿病性潰瘍（例えば、糖尿病性足部潰瘍）、褥瘡、床ずれ、及びこれらの組み合わせであり得る。

【0155】

いくつかの実施形態では、脂質成分と改変ＲＮＡ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５）とを含むナノ粒子を使用して、哺乳類組織又は対象における創傷治癒を向上させ得る。

【0156】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているナノ粒子を使用して、哺乳類組織又は対象における血管新生を誘導し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているナノ粒子を使用して、哺乳類組織又は対象における血管形成を誘導し得る。

【0157】

さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているナノ粒子を使用して、外傷又は手術による血管損傷を処置し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているナノ粒子を使用して、皮膚移植及び組織移植を必要とする疾患を処置し得る。

【0158】

本開示の他の態様は、それを必要とする対象へのナノ粒子の投与に関する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているナノ粒子を、哺乳類組織又は対象の創傷治癒を向上させるために、皮内経路を介して投与される。

【0159】

ある種の実施形態では、本明細書で開示されているナノ粒子を、所望される治療効果を得るために、１日当たり対象の体重当たり約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇ～約２５ｍｇ／ｋｇの改変ＲＮＡを送達するのに十分な投薬量レベルで、１日１回又は複数回投与し得る。

【0160】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているナノ粒子を、単回投与で対象に投与する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているナノ粒子を、固定投薬量での複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回以上）の投与で、対象に投与する。この段落内のそれぞれの実施形態では、「複数回投与」を、互いに、短い（１～５分）、中程度の（６～３０分）、又は長い（３０分超、数時間、さらには数日）時間間隔だけ離し得る。

【0161】

ナノ粒子を、疾患、障害、及び／又は状態を処置するのに有効な任意の投薬量の投与を使用して、対象に投与し得る。必要とされる正確な投薬量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、個別の製剤、その投与様式、その活性様式、及び同類のものに応じて、対象毎に変わり得る。しかしながら、組成物の１日当たりの総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定され得ることが理解されよう。任意の特定の患者にとっての具体的な薬学的に有効な用量レベルは、疾患の重症度、用いられる具体的な組成物、患者の年齢、体重、全身の健康、性別、及び食事、投与時刻、投与経路（例えば、皮内又は局所）、治療の期間、並びに医療分野で公知の同様の因子等の様々な要因に応じて決まるだろう。

【0162】

請求項リスト中の請求項は全て、追加の実施形態として、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0163】

７．実施例
実施例１
ナノ粒子及びクエン酸生理食塩水組成物の調製
化合物Ａ脂質ナノ粒子（化合物Ａ－ＬＮＰ）：化合物Ａ、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＮＯＦＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）から、エタノール中の脂質のストック溶液を調製した。この脂質を、１２．５ｍＭの総脂質濃度までエタノール９９．５％に混合した。この組成は、５０：１０：３８．５：１．５％モルの比の化合物Ａ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００であった。ＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５）を解凍し、最終配合物における１１：１の総脂質：ｍＲＮＡ重量比（電荷比窒素：リン酸塩（Ｎ：Ｐ）＝３）に相当する濃度にて、酢酸ナトリウム緩衝液及びＨｙＣｌｏｎｅ水で６．２５ｍＭまで希釈した。希釈後の最終配合物は、下記の通りであった。

【0164】

【表2】

【0165】

脂質を含むエタノール溶液と、改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡの水溶液とをマイクロ流体デバイスで素早く混合し、それに続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での透析を行うことにより、化合物Ａ－ＬＮＰ組成物を調製した。簡潔に説明すると、改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡ溶液と脂質溶液とを、シリンジポンプにより制御される２つのシリンジを使用して、水とエタノール３：１の体積比及び１２～１４ｍＬ／分の流速で、マイクロ流体混合デバイス（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＮａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ））に注入した。化合物Ａ－ＬＮＰ組成物を、１０ＫＤカットオフを有する膜を使用してＰＢＳ緩衝液に対して一晩透析することにより、エタノールを除去した。化合物Ａ－ＬＮＰ組成物を、粒径（６３ｎｍ）、多分散性指数（０．１０）、及び封入（９６％）により特徴付けた。化合物Ａ－ＬＮＰ組成物を、ＰＢＳ及び濾過滅菌により、０．０６ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。化合物Ａ－ＬＮＰ組成物を、冷蔵保存した。ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ）を使用する動的光散乱により、化合物Ａ－ＬＮＰのサイズ及び多分散性を決定し、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイを使用して、化合物Ａ－ＬＮＰ製剤中のｍＲＮＡの封入及び濃度を決定した。

【0166】

ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ脂質ナノ粒子（ＭＣ３－ＬＮＰ）：ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＡｎｇｅｗＣｈｅｍＩｎｔＥｄＥｎｇｌ，２０１２，５１（３４），ｐ．８５２９－３３で説明されているように合成した）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、及び１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＮＯＦＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）から、エタノール中の脂質のストック溶液を調製した。この脂質を、１２．５ｍＭの総脂質濃度までエタノール９９．５％に混合した。この組成は、５０：１０：３８．５：１．５％モルの比のＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００であった。ＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡ（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５）を解凍し、最終配合物における１０．２５：１の総脂質：ｍＲＮＡ重量比（電荷比窒素：リン酸塩（Ｎ：Ｐ）＝３）に相当する濃度にて、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）及びＨｙＣｌｏｎｅ水で６．２５ｍＭまで希釈した。希釈後の最終配合物は、下記の通りであった。

【0167】

【表3】

【0168】

ＭＣ３－脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物：脂質を含むエタノール溶液と、ＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡの水溶液とをマイクロ流体デバイスで素早く混合し、それに続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での透析を行うことにより、ＬＮＰ組成物を調製した。簡潔に説明すると、ＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡ溶液と脂質溶液とを、シリンジポンプにより制御される２つのシリンジを使用して、水とエタノール３：１の体積比及び１２～１４ｍＬ／分の流速で、マイクロ流体混合デバイス（ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）（ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＮａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ））に注入した。マイクロ流体混合後、ＭＣ３－ＬＮＰを、１０ｋの分子量カットオフを有するＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｇ２透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に対して一晩透析した。

【0169】

ＭＣ３－ＬＮＰ組成物を、粒径（７７～８５ｎｍ）、ＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡ濃度（０．０７６～０．１ｍｇ／ｍＬ）、多分散性指数（０．０４～０．０８）、及び封入（９６～９８％）により特徴付けた。ＭＣ３－ＬＮＰ組成物を、ＰＢＳ及び濾過滅菌により、０．０７５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。ＭＣ３－ＬＮＰ組成物を、冷蔵保存した。ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ（ＭａｌｖｅｒｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＬｔｄ）を使用する動的光散乱により、ＭＣ３－ＬＮＰのサイズ及び多分散性を決定し、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイを使用して、ＭＣ３－ＬＮＰ製剤中のｍＲＮＡの封入及び濃度を決定した。

【0170】

クエン酸生理食塩水組成物：解凍した改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡ溶液を、ＨｙＣｌｏｎｅ水及び濃縮された緩衝液で、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム及び１３０ｍＭの塩化ナトリウムの最終濃度（ｐＨ６．５）まで希釈することにより、クエン酸生理食塩水組成物を調製した。

【0171】

実施例２
マウスにおけるヒトＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡの皮内注射後の創傷治癒の評価
改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡとＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡとを含むＭＣ３脂質ナノ粒子組成物を、配列番号４の配列を有するＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡにより、実施例１と同様に調製した。

【0172】

非翻訳性（ＮＴ）改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡとＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡとを含む別のＭＣ３脂質ナノ粒子組成物を、配列番号６の配列を有するＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡにより、実施例１と同様に調製した。

【0173】

雄のｄｂ／ｄｂマウスを使用した。このマウスは、ＩＩ型糖尿病の樹立されたモデルであり、野生型マウスと比較した場合に創傷治癒障害を有する。

【0174】

図４は、本試験の手術手順、処置、及び観察時点のタイムラインを示す。グルコース及び体重を、試験開始前１週間及び終了時に測定した。マウスを、手術１週間前に測定した空腹時（４時間）血糖値に従って無作為化した。マウスを、手術を施す前にイソフルランで麻酔した。バリカン及び除毛クリームを使用してマウスの背中の毛を除去することにより、手術手順を開始した。１０ｍｍ生検パンチにより印を作り、次いでこれを切り取ることにより、各マウスの背中に１つの創傷を作った。この創傷をテガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）透明包帯材で覆って、この創傷を保護した。このマウスに自己接着性の弾性包帯を巻いて創傷領域を覆い、鎮痛剤（０．０８ｍｇ／ｍｌのＴａｍｇｅｓｉｃ）を、このマウスの体重に従って０．０５～０．１ｍｇ／ｋｇの投薬量で注射した。

【0175】

マウスを、下記の３つの処置群に分離した：（ａ）クエン酸／生理食塩水溶液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び１３０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．５））（ｎ＝７）、（ｂ）ｍＲＮＡＶＥＧＦＮＴ３μｇＭＣ３（ＭＣ３ＬＮＰと配合された非翻訳性ＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡ）（ｎ＝７）、並びに（ｃ）ｍＲＮＡＶＥＧＦ３μｇＭＣ３（ＭＣ３ＬＮＰと配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡ）（ｎ＝７）。処置溶液を、３日目に、単回用量として創傷の周りに４回（各１０μｌ）皮内注射した（合計４０μｌ）（図４）。

【0176】

最大１７日にわたり、全ての創傷が治癒されるまで３日毎又は４日毎に創傷を調べた。検査後に、テガダームを取り外して交換した。創傷から一定距離で、Ｃａｎｏｎカメラで創傷を撮影した。創傷面積を、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用して創傷の縁をなぞることにより決定し、次いで、ベースライン面積のパーセント面積として算出した。対応のない両側ｔ検定で統計学的評価を行い、ｐ値＜０．０５は有意であるとみなした。

【0177】

表４及び図５の結果で示されるように、ＭＣ３と配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡ３μｇを含む脂質ナノ粒子組成物の皮内注射により、開放創面積のパーセントの減少により実証されるように、ＭＣ３と配合された非翻訳性ＶＥＧＦ－Ａ３μｇを含む脂質ナノ粒子組成物、又はクエン酸生理食塩水と比較した場合に創傷治癒が有意に向上した。

【0178】

【表4】

【0179】

実施例３
マウスにおけるヒトＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡの局所適用後の創傷治癒の評価
改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡとＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡとを含むＭＣ３脂質ナノ粒子組成物を、配列番号４の配列を有するＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡにより、実施例１と同様に調製した。
雄のｄｂ／ｄｂマウスを使用した。このマウスは、ＩＩ型糖尿病の樹立されたモデルであり、野生型マウスと比較した場合に創傷治癒障害を有する。

【0180】

図６は、本試験の手術手順、処置、及び観察時点のタイムラインを示す。グルコース及び体重を、試験開始前１週間及び終了時に測定した。マウスを、手術１週間前に測定した空腹時（４時間）血糖値に従って無作為化した。マウスを、手術を施す前にイソフルランで麻酔した。バリカン及び除毛クリームを使用してマウスの背中の毛を除去することにより、手術手順を開始した。１０ｍｍ生検パンチにより印を作り、次いでこれを切り取ることにより、各マウスの背中に１つの創傷を作った。この創傷をテガダーム透明包帯材で覆って、この創傷を保護した。このマウスに自己接着性の弾性包帯を巻いて創傷領域を覆い、鎮痛剤（０．０８ｍｇ／ｍｌのＴａｍｇｅｓｉｃ）を、このマウスの体重に従って０．０５～０．１ｍｇ／ｋｇの投薬量で注射した。

【0181】

マウスを、下記の２つの処置群に分離した：（ａ）クエン酸／生理食塩水溶液（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、及び１３０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．５））（ｎ＝５）、（ｂ）ｍＲＮＡＶＥＧＦ３μｇＭＣ３（ｎ＝５）。処置溶液を、０日目及び３日目に、テガダームを通して挿入した針を介した局所適用により投与した（図６）。

【0182】

【0183】

表５及び図７の結果で示されるように、ＭＣ３と配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡ３μｇを含む脂質ナノ粒子組成物の局所適用により、開放創面積のパーセントの減少により実証されるように、生理食塩水クエン酸の適用と比較した場合に創傷治癒が有意に向上した。

【0184】

【表5】

【0185】

実施例４
ブタ皮膚におけるヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ－Ａ）タンパク質の定量
クエン酸生理食塩水組成物、及びＶＥＧＦ－Ｆ改変ＲＮＡと、化合物Ａ又はＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）のいずれかとを含むナノ粒子組成物を、実施例１と同様に調製した。クエン酸生理食塩水組成物、化合物Ａナノ粒子組成物、及びＭＣ３ナノ粒子組成物を全て、配列番号４の配列を有するＶＥＧＦ－Ａ改変ＲＮＡと共に調製した。

【0186】

創傷調製：Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎミニブタの皮膚の角質層を、メスの刃で取り出し、表皮の残りを、Ｃｏｔｅｃｈミニグラインダを使用して取り出した。

【0187】

改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡとＭＣ３とを含むナノ粒子組成物の局所投与：ＭＣ３ナノ粒子製剤中のｍＲＮＡ３μｇを含む４０μｌを、ブタの皮膚から取り出した表皮の３箇所に塗布した。この組織を、塗布後５～６時間で取り出し、液体窒素中でスナップ凍結し、分析を実施するまで－８０℃で保存した。この手順を、４匹のブタで繰り返した。

【0188】

改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡとＭＣ３とを含むナノ粒子組成物の皮内注射：ＭＣ３ナノ粒子製剤中のｍＲＮＡ３μｇを含む４０μｌを、ブタの皮膚から取り出した表皮の３箇所への（インスリンシリンジを使用する）皮内注射により投与した。この組織を、適用後５～６時間で取り出し、液体窒素中でスナップ凍結し、分析を実施するまで－８０℃で保存した。この手順を、４匹のブタで繰り返した。

【0189】

ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡと化合物Ａとを含むナノ粒子組成物の局所投与：化合物Ａナノ粒子製剤中のｍＲＮＡ３μｇを含む５０μｌを、ブタの皮膚から取り出した表皮の３箇所に塗布した。この組織を、塗布後５時間で取り出し、液体窒素中でスナップ凍結し、分析を実施するまで－８０℃で保存した。この手順を、５匹のブタで繰り返した。

【0190】

クエン酸／生理食塩水（コントロール）の局所投与：クエン酸／生理食塩水製剤中のｍＲＮＡ１００μｇを含む５０μｌを、ブタの皮膚から取り出した表皮の３箇所に塗布した。この組織を、塗布後５時間で取り出し、液体窒素中でスナップ凍結し、分析を実施するまで－８０℃で保存した。この手順を、３匹のブタで繰り返した。

【0191】

各組織サンプルを、ＥＬＩＳＡを使用して、ヒトＶＥＧＦ－Ａタンパク質の発現に関して分析し、結果を表６にまとめた（図８Ａ～Ｂ）。

【0192】

【表6】

【0193】

図８Ａは、ＭＣ３ＬＮＰに配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡによる局所適用処置及び単回注射処置の５～６時間後のブタ組織におけるヒトＶＥＧＦ－Ａタンパク質（ｈＶＥＧＦ－Ａ）の産生と、化合物ＡＬＮＰと配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡによる局所適用処置の５時間後のブタ組織におけるｈＶＥＧＦ－Ａタンパク質の産生とを示す。クエン酸生理食塩水組成物による処置では、ｈＶＥＧＦ－Ａタンパク質は産生されなかった。図８Ｂは、ブタ皮膚での創傷を示し、描かれている円形は、ＭＣ３に配合された改変ＶＥＧＦ－ＡＲＮＡによる局所処置部位を示す。

【0194】

８．配列表
８．１．配列番号１：ＶＥＧＦ－Ａをコードする改変ＲＮＡ

【化5】