特表 2022-532166 質量分析キャリブレータ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-13

(54)【発明の名称】質量分析キャリブレータ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20220706BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20220706BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

G01N27/62 D

G01N27/62 V

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021566482

(86)(22)【出願日】2020-04-29

(85)【翻訳文提出日】2022-01-11

(86)【国際出願番号】 GB2020051040

(87)【国際公開番号】W WO2020229794

(87)【国際公開日】2020-11-19

(31)【優先権主張番号】1906599.4

(32)【優先日】2019-05-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1910708.5

(32)【優先日】2019-07-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514212652

【氏名又は名称】ザ バインディング サイト グループ リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100197169

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 潤二

(72)【発明者】

【氏名】スティーブン ハーディング

(72)【発明者】

【氏名】グレッグ ウォーリス

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041DA04

2G041EA04

2G041EA12

2G041FA12

2G041HA01

2G041LA09

2G045AA40

2G045CA26

2G045DA36

(57)【要約】

本発明は、対象からのサンプル中のカッパまたはラムダ免疫グロブリン軽鎖の量を定量する方法であって、
ｉ．対象からのサンプルを用意することと、
ｉｉ．前記サンプルを所定量のラムダ軽鎖キャリブレータまたはカッパ軽鎖キャリブレータと混合して混合物を形成することと、
ｉｉｉ．前記混合物に対して質量分析を実行することと、ならびに
ｉｖ．
ａ）質量分析によって決定される前記混合物中のラムダ軽鎖の相対量を、質量分析によって決定される前記混合物中のキャリブレータカッパ軽鎖の相対量と比較することによって、前記サンプル中のラムダ軽鎖の量、および／または
ｂ）質量分析によって決定される前記混合物中のカッパ軽鎖の相対量を、質量分析、最も典型的にはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトロメトリーもしくは液体クロマトグラフィー－質量分析によって決定される前記混合物中のキャリブレータラムダ軽鎖の相対量と比較することによって、前記サンプル中のカッパ軽鎖の量
の一方または両方を定量することと、
を含む、方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象からのサンプル中のカッパまたはラムダ免疫グロブリン軽鎖の量を定量する方法であって、
ｉ．対象からのサンプルを用意することと、
ｉｉ．前記サンプルを所定量のラムダ軽鎖キャリブレータまたはカッパ軽鎖キャリブレータと混合して混合物を形成することと、
ｉｉｉ．前記混合物に対して質量分析を実行することと、ならびに
ｉｖ．
ａ）前記質量分析によって決定される前記混合物中のラムダ軽鎖の相対量を、質量分析によって決定される前記混合物中のキャリブレータカッパ軽鎖の相対量と比較することによって、前記サンプル中のラムダ軽鎖の量、および／または
ｂ）質量分析によって決定される前記混合物中のカッパ軽鎖の相対量を、質量分析、最も典型的にはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトロメトリーもしくは液体クロマトグラフィー－質量分析によって決定される前記混合物中のキャリブレータラムダ軽鎖の相対量と比較することによって、前記サンプル中のカッパ軽鎖の量
の一方または両方を定量することと、
を含む、方法。

【請求項2】

前記キャリブレータが、ポリクローナルラムダ軽鎖またはポリクローナルカッパ軽鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記キャリブレータが、モノクローナルカッパ軽鎖またはモノクローナルラムダ軽鎖である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記サンプル中の前記カッパまたはラムダ軽鎖免疫グロブリンが、１つ以上の免疫グロブリン重鎖に結合している、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

混合前の前記キャリブレータの前記ラムダ軽鎖またはカッパ軽鎖が、１つ以上の免疫グロブリン重鎖に結合している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記サンプル中の前記カッパまたはラムダ軽鎖が、遊離カッパまたはラムダ軽鎖である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記キャリブレータ中の前記ラムダ軽鎖またはカッパ軽鎖が、遊離軽鎖である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記キャリブレータ中の前記ラムダ軽鎖または前記キャリブレータ上の前記カッパ軽鎖が、質量調整される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記キャリブレータが、前記サンプル中のラムダ軽鎖もしくはカッパ軽鎖と比較して、１つ以上の追加のアミノ酸を有するか、またはポリエチレングリコールに結合している、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記混合物が、質量分析を実行する前に、少なくとも１つの精製工程において精製される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記サンプルまたは混合物が、免疫精製される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記サンプルまたは混合物が、抗重鎖クラス特異的抗体、抗総軽鎖タイプ特異的抗体、抗遊離軽鎖タイプ特異的抗体、もしくは抗重鎖クラス－軽鎖タイプ特異的抗体、またはその断片を使用して免疫精製される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記抗体が、抗ＩｇＧ特異的、抗ＩｇＡ特異的、抗ＩｇＤ特異的、抗ＩｇＭ特異的、または抗ＩｇＥ特異的である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記抗体が、抗総ラムダ特異的、抗総カッパ特異的、抗遊離ラムダ特異的、または抗遊離ラムダ特異的である、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記サンプルまたは混合物が、抗ヒト特異的抗体を使用して免疫精製される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記サンプルが、血液、血清、血漿、脳脊髄液および尿、より典型的には血液、血清または血漿から選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

質量分析を実行する前に、前記サンプルまたは混合物を還元剤で処理することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記サンプル中のラムダ軽鎖の前記相対量と前記キャリブレータカッパ軽鎖の前記相対量との比、または前記サンプル中のカッパ軽鎖の前記相対量とキャリブレータラムダ軽鎖の前記相対量との比、ここで最も典型的には、前記サンプル軽鎖からのピークの面積と前記キャリブレータ軽鎖のピークの面積との比が使用されてもよい、を比較するか、または前記サンプルからのラムダもしくはカッパのピークの面積と、前記サンプルからの前記ラムダもしくはカッパの合計面積および前記キャリブレータカッパもしくはラムダのピークからの面積との比を比較することを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記キャリブレータカッパ軽鎖またはキャリブレータラムダ軽鎖が、質量分析によって前記サンプル中の同一の軽鎖タイプと区別でき、かつ、前記サンプル中の前記同一の軽鎖のタイプの量を定量するために、質量分析によって同定されるキャリブレータ軽鎖の量を使用する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記サンプル中のカッパ軽鎖とラムダ軽鎖との比が測定される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記対象が、Ｂ細胞増殖性疾患、好ましくは単クローン性免疫グロブリン血症を有する、請求項１～２０のいずれかに一項記載の方法。

【請求項22】

請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法によって得られる、サンプル中のカッパ軽鎖の量、またはサンプル中のラムダ軽鎖の量を示す第１の信号、およびラムダ軽鎖キャリブレータまたはカッパ軽鎖キャリブレータの量を示す第２の信号を受信し、前記２つの信号を所定の較正係数と比較して、前記サンプル中の前記カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖の量を示すように適合された機械可読媒体を含む、コンピュータ。

【請求項23】

（ｆ）抗ＩｇＧ特異的抗体および所定量のＩｇＧカッパまたはＩｇＧラムダ免疫グロブリン、
（ｇ）抗ＩｇＡ特異的抗体および所定量のＩｇＡカッパまたはＩｇＡラムダ免疫グロブリン、
（ｈ）抗ＩｇＭ特異的抗体および所定量のＩｇＭカッパまたはＩｇＭラムダ免疫グロブリン、
（ｉ）抗ＩｇＤ特異的抗体および所定量のＩｇＤカッパまたはＩｇＤラムダ免疫グロブリン、または
（ｊ）抗ＩｇＥ特異的抗体および所定量のＩｇＥカッパまたはＩｇＥラムダ免疫グロブリン
から選択される抗体を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、質量分析によるサンプル中の反対のラムダまたはカッパ軽鎖の定量を可能にするためのキャリブレータとしてのカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖の使用、およびかかるキャリブレータを含むキットに関する。

【背景技術】

【0002】

抗体分子（免疫グロブリンとしても知られている）は二重対称であり、通常、２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖から構成され、それぞれが可変領域および定常領域を含む。重鎖と軽鎖の可変領域が組み合わさって抗原結合部位を形成することにより、両鎖は抗体分子の抗原結合特異性に寄与する。抗体の基本的な四量体構造は、ジスルフィド結合によって共有結合した２本の重鎖を含む。そして、各重鎖はさらにジスルフィド結合を介して軽鎖に結合する。これにより、実質的に「Ｙ」字形の分子が生成される。

【0003】

重鎖は、抗体に見られる２種類の鎖のうちの大きい方であって、典型的な分子量は５０，０００～７７，０００Ｄａであり、これと比較すると軽鎖の分子量は小さい（２５，０００Ｄａ）。

【0004】

重鎖にはガンマ、アルファ、ミュー、デルタ、およびイプシロンという５つの主要なクラスがあり、それぞれＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの構成重鎖である。ＩｇＧは、正常なヒト血清の主要な免疫グロブリンであり、免疫グロブリンプール全体の７０～７５％を占めている。ＩｇＧは、二次免疫応答の主要な抗体であり、２本の重鎖と２本の軽鎖からなる単一の四量体を形成する。

【0005】

ＩｇＭは免疫グロブリンプールの約１０％を占めている。ＩｇＭ分子は、Ｊ鎖とともに、５つの基本的な四鎖構造からなる五量体を形成する。個々の重鎖の分子量は約６５，０００Ｄａであり、分子全体の分子量は約９７０，０００Ｄａである。ＩｇＭは主として血管内プールのみに存在し、主要な初期抗体である。

【0006】

ＩｇＡは、ヒト血清免疫グロブリンプールの１５～２０％に相当する。８０％を超えるＩｇＡがモノマーとして生じる。しかしながら、一部のＩｇＡ（分泌型ＩｇＡ）は二量体形態として存在する。

【0007】

ＩｇＤは、血漿免疫グロブリン全体の１％未満を占める。ＩｇＤは、成熟Ｂ細胞の表面膜上に見られる。

【0008】

ＩｇＥは、正常な血清中ではほとんど見られないが、好塩基球および肥満細胞の表面膜上に見られる。ＩｇＥは、喘息および花粉症などのアレルギー性疾患に関連している。

【0009】

５つの主要なクラスに加えて、ＩｇＧには４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）がある。さらに、ＩｇＡには２つのサブクラス（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）がある。

【0010】

軽鎖にはラムダ（λ）とカッパ（κ）の２種類がある。ヒトにおいて産生されるκ分子の量は、λ分子の約２倍であるが、これは一部の哺乳類ではかなり異なっている。各鎖は、単一のポリペプチド鎖に約２２０個のアミノ酸を含有し、このポリペプチド鎖が折りたたまれて１つの定常領域および１つの可変領域を形成する。形質細胞は、κ分子またはλ分子のいずれかとともに５つの重鎖タイプのうちの１つを生成する。通常、重鎖合成よりも約４０％過剰な遊離軽鎖が産生される。軽鎖分子が重鎖分子に結合していない場合、軽鎖分子は「遊離軽鎖分子」として知られている。κ軽鎖は通常、モノマーとして見られる。λ軽鎖は、二量体を形成する傾向がある。

【0011】

抗体産生細胞に関連する多くの増殖性疾患がある。

【0012】

多くのかかる増殖性疾患では、形質細胞が増殖して、同一の形質細胞の単クローン性腫瘍を形成する。これは、結果として同一の免疫グロブリンを大量に産生し、単クローン性免疫グロブリン血症として知られている。

【0013】

骨髄腫および原発性全身性アミロイドーシス（ＡＬアミロイドーシス）などの疾患は、英国における癌死の約１．５％および０．３％をそれぞれ占めている。多発性骨髄腫は、非ホジキンリンパ腫に次いで２番目に多い血液悪性腫瘍の形態である。白人人口における発生率は、年間百万人あたり約４０人である。従来、多発性骨髄腫の診断は、骨髄中の過剰なモノクローナル形質細胞、血清または尿中のモノクローナル免疫グロブリン、および高カルシウム血症、腎不全、貧血もしくは骨病変などの関連臓器または組織の障害の存在に基づいている。骨髄の正常な形質細胞含有量は約１％であるが、多発性骨髄腫では、含有量が通常１０％を超え、多くの場合には３０％を超えるが、９０％を超えることもある。

【0014】

ＡＬアミロイドーシスは、アミロイド沈着物としてのモノクローナル遊離軽鎖断片の蓄積を特徴とするタンパク質構造障害である。通常、これらの患者は心不全または腎不全を呈するが、末梢神経および他の臓器も関与している可能性がある。

【0015】

他にも、患者の血流、または実際には尿中のモノクローナル免疫グロブリンの存在によって同定できる多くの疾患がある。これらの疾患には、形質細胞腫および髄外性形質細胞腫（骨髄以外に生じ、あらゆる臓器において発生する可能性のある形質細胞腫瘍）が含まれる。存在する場合、モノクローナルタンパク質は通常ＩｇＡである。多発性骨髄腫の証拠の有無にかかわらず、多発性孤立性形質細胞腫が発生する可能性がある。ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症は、モノクローナルＩｇＭの産生に関連する悪性度の低いリンパ増殖性疾患である。米国では年間約１，５００件、英国では年間約３００件の新規症例がある。血清ＩｇＭの定量は、診断およびモニタリングの両方にとって重要である。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫は、英国でのすべての癌死の約２．６％を引き起こし、モノクローナル免疫グロブリンは、標準的な電気泳動法を使用して、約１０～１５％の患者の血清中で同定されている。初期の報告によると、モノクローナル遊離軽鎖は、６０～７０％の患者の尿中で検出できることが示されている。Ｂ細胞では、慢性リンパ性白血病のモノクローナルタンパク質が、遊離軽鎖イムノアッセイによって同定されている。

【0016】

さらに、いわゆるＭＧＵＳ状態が存在する。これらは、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症である。この用語は、多発性骨髄腫、ＡＬアミロイドーシス、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症などの証拠がない個体にモノクローナル完全免疫グロブリンが予期せず存在することを示す。ＭＧＵＳは、５０歳以上の人口の１％、７０歳以上の３％、および８０歳以上の最大１０％に見られる可能性がある。これらのほとんどはＩｇＧまたはＩｇＭに関連しているが、ＩｇＡに関連することや二クローン性であることはめったにない。ＭＧＵＳを有する人々の大半は無関係な疾患で死亡するが、ＭＧＵＳは悪性の単クローン性免疫グロブリン血症に変化する場合もある。

【0017】

上記で強調した疾患についての少なくとも一部の症例では、これら疾患はモノクローナル免疫グロブリンまたは遊離軽鎖の異常な濃度を示す。疾患が形質細胞の異常な複製を引き起こす場合、これにより、その「単クローン」が増殖して血液中に出現するので、その種類の細胞による免疫グロブリンの産生がしばしば増加する。

【0018】

免疫固定電気泳動では、免疫グロブリン分子に対する沈降抗体を使用する。これは試験の感度を向上させるが、沈降抗体の存在により、モノクローナル免疫グロブリンの定量には使用できない。また、免疫固定電気泳動は実行するのがかなり困難であり、解釈が難しい場合がある。キャピラリーゾーン電気泳動は、血清タンパク質分離のために多くの臨床検査室で使用されており、ほとんどのモノクローナル免疫グロブリンを検出することができる。しかしながら、免疫固定電気泳動と比較した場合、キャピラリーゾーン電気泳動はサンプルの５％でモノクローナルタンパク質を検出できない。これらのいわゆる「偽陰性」の結果には、低濃度のモノクローナルタンパク質が含まれる。

【0019】

血清血漿電気泳動（ＳＰＥ）は、０．５ｇ／Ｌ未満のタンパク質を同定するのが困難であり、かつ１０ｇ／Ｌ未満のタンパク質を定量するのが困難である代替手順である。

【0020】

総κおよびλアッセイが作製されている。しかしながら、総κおよび総λアッセイは、モノクローナル免疫グロブリン、遊離軽鎖、またはモノクローナル遊離軽鎖を検出するには感度が低すぎる。これは、かかるアッセイを妨げるポリクローナル結合軽鎖のバックグラウンド濃度が高いからである。

【0021】

遊離κ軽鎖と、それとは別に遊離λ軽鎖を検出できる高感度アッセイが開発されている。この方法では、遊離κ軽鎖または遊離λ軽鎖のいずれかに向けられたポリクローナル抗体を使用する。かかる抗体を産生する可能性はまた、ＷＯ９７／１７３７２において、多数の異なる可能な特異性のうちの１つとして議論された。この文献は、動物を寛容化することにより、従来技術が産生し得るよりも特異的である所望の抗体を産生することを可能にする方法を開示している。遊離軽鎖アッセイでは、抗体を使用して遊離λまたは遊離κ軽鎖に結合する。遊離軽鎖の濃度は、ネフェロメトリー（比朧法）またはタービディメトリー（比濁法）によって決定される。これには、反応容器またはキュベット内の適切な抗体を含有する溶液に試験サンプルを添加することが含まれる。光線がキュベットを通過し、抗原抗体反応が進行すると、不溶性の免疫複合体が形成されるにつれて、キュベットを通過する光がますます散乱される。ネフェロメトリーでは、光散乱は入射光から離れた角度で光強度を測定することによってモニタリングされ、一方、タービディメトリーでは、光散乱は入射光線の強度の減少を測定することによってモニタリングされる。既知の抗原（すなわち、遊離κまたは遊離λ）濃度の一連のキャリブレータを最初にアッセイして、測定された光散乱対抗原濃度の較正曲線を作成する。

【0022】

このアッセイ形式は、遊離軽鎖濃度を首尾よく検出することが分かっている。さらに、この技術の感度は非常に高い。

【0023】

遊離軽鎖（ＦＬＣ）、重鎖もしくはサブクラス、または重鎖クラスもしくはサブクラスに結合した軽鎖タイプの量またはタイプの特徴付けは、多発性骨髄腫などのＢ細胞疾患、および腎症などの他の免疫介在性疾患を含む広範な疾患において重要である。

【0024】

ＷＯ２０１５／１５４０５２（その全体が本明細書に組み込まれる）は、質量分析（ＭＳ）を使用して、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、またはそれらの混合物を検出する方法を開示している。免疫グロブリン軽鎖、重鎖またはそれらの混合物を含むサンプルを、免疫精製し、質量分析に供して、サンプルの質量スペクトルを得る。これを使用して、患者からのサンプル中のモノクローナルタンパク質を検出することができる。また、これは、モノクローナル抗体におけるフィンガープリント、アイソタイプ、および同定ジスルフィド結合にも使用できる。

【0025】

ＭＳは、質量および電荷によってサンプル中の、例えば、ラムダ鎖およびカッパ鎖を分離するのに使用される。また、これは、例えば、還元剤を使用して重鎖と軽鎖とのジスルフィド結合を還元することによって、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖成分を検出するためにも使用できる。ＭＳは、ＷＯ２０１５／１３１１６９（その全体が本明細書に組み込まれる）にも記載されている。

【0026】

診断手順におけるサンプル中の免疫グロブリンの精製は通常、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＤ、抗ＩｇＥ、抗総カッパ、抗総ラムダ抗体、または抗遊離κもしくは抗遊離λ軽鎖抗体などの抗遊離軽鎖抗体などの抗全抗体を使用する。精製および検出プロセスが正しく実行されることを保証するために、キャリブレータを有することが重要である。

【0027】

ＷＯ２０１７／１４４９００は、検出されるべき分析物のより重いバージョンまたは検出されるべき分析物の単クローンのいずれかを利用するいくつかの対照を記載している。すなわち、例えば、ＩｇＡは、所定量のより重いＩｇＡカッパと比較して定量され得る。

【0028】

ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦなどのいくつかの質量分析法では、目的のタンパク質を質量分析標的上で結晶化させる。いかなる個々のタンパク質の結晶化の程度も、標的全体で異なる。さらに、個々のタンパク質の特性は、標的上での結晶化がタンパク質間で異なることを意味する。したがって、異なるタンパク質が異なる速度にて質量分析標的上で結晶化すると予想された。これは、マトリックスを質量分析によってサンプリングすると、異なる量の対照タンパク質および分析物が検出されることを意味する。

【0029】

さらに、それらのイオン化速度は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ用であれ、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）などの結晶化を必要としない他の技術用であれ、異なると予想された。質量分析には、標的分子のイオン化が必要である。イオン化は、個々のタンパク質の特性に依存する。したがって、異なるタンパク質は異なる様式でイオン化するので、検出される免疫グロブリンの量は一致しないと予想された。

【発明の概要】

【0030】

意外にも、本出願人は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖が実質的に一致した速度で結晶化およびイオン化し、それによりラムダまたはカッパ軽鎖の較正範囲が、マトリックス上で結晶化されるか、もしくは質量分析中にイオン化される他のカッパまたはラムダ軽鎖に比例することを発見した。

【0031】

これにより、ラムダ軽鎖をキャリブレータとして使用してサンプル中のカッパ軽鎖を定量するか、またはカッパ軽鎖をキャリブレータとして使用してラムダ軽鎖を定量することができる。

【0032】

本発明は、対象からのサンプル中のカッパまたはラムダ免疫グロブリン軽鎖の量を定量する方法であって、
ｉ．対象からのサンプルを用意することと、
ｉｉ．前記サンプルを所定量のラムダ軽鎖キャリブレータまたはカッパ軽鎖キャリブレータと混合して混合物を形成することと、
ｉｉｉ．前記混合物に対して質量分析を実行することと、ならびに
ｉｖ．
ａ．質量分析によって決定される前記混合物中のラムダ軽鎖の相対量を、質量分析によって決定される前記混合物中のキャリブレータカッパ軽鎖の相対量と比較することによって、前記サンプル中のラムダ軽鎖の量、および／または
ｂ．質量分析によって決定される前記混合物中のカッパ軽鎖の相対量を、質量分析によって決定される前記混合物中のキャリブレータラムダ軽鎖の相対量と比較することによって、前記サンプル中のカッパ軽鎖の量
の一方または両方を定量することと、
を含む、方法を提供する。

【0033】

前記質量分析は通常、ＬＣ－ＭＳまたはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析である。

【0034】

カッパ軽鎖の量は、サンプル中のポリクローナルカッパ軽鎖またはモノクローナルカッパ軽鎖の量でもよい。ラムダ軽鎖の量は、サンプル中のポリクローナルラムダ軽鎖の量またはモノクローナルラムダ軽鎖の量でもよい。この量は、サンプル中のポリクローナルラムダまたはカッパ軽鎖の濃度でもよい。

【0035】

サンプル中のカッパまたは軽鎖は、１つ以上の免疫グロブリン重鎖に結合していてもよい。

【0036】

サンプルと混合する前のキャリブレータのラムダ軽鎖またはカッパ軽鎖は、１つ以上の免疫グロブリン重鎖に結合していてもよい。

【0037】

すなわち、カッパまたはラムダ軽鎖は、例えば、ＩｇＧカッパ、ＩｇＧラムダ、ＩｇＡラムダ、ＩｇＡカッパ、ＩｇＭラムダ、ＩｇＭカッパ、ＩｇＤラムダ、ＩｇＤカッパ、ＩｇＥラムダまたはＩｇＥカッパとして提供されてもよい。

【0038】

あるいは、サンプル中のカッパまたはラムダ軽鎖は、遊離カッパまたはラムダ軽鎖でもよい。キャリブレータラムダまたは軽鎖は、遊離軽鎖でもよい。後者の場合、これらは、抗重鎖クラス抗体を用いた免疫沈降工程の後に添加してもよい。

【0039】

キャリブレータのラムダまたはカッパ軽鎖はモノクローナルでもよい。あるいは、それらはポリクローナル抗体に由来していてもよい。ポリクローナル抗体が特に好ましい。これは、異なるモノクローナル抗体間でイオン化または結晶化方法に多少のばらつきがあると予想されるためである。ポリクローナル抗体を使用すると、個々のモノクローナルキャリブレータを使用するノイズが減少し、本発明の方法に対する整合性がより高くなることが予想される。

【0040】

キャリブレータ中のラムダ軽鎖またはキャリブレータ中のカッパ軽鎖は、質量調整されても、されなくてもよい。それらの分子量または電荷を増減させて、分析物の質量分析読み出しのピークを、サンプル中の同等のカッパまたはラムダ軽鎖と比較して変更してもよい。例えば、ＷＯ２０１７／１４４９００は、抗体を同位体標識すること、または抗体に１つ以上のアミノ酸を添加することを含む、キャリブレータラムダもしくはキャリブレータカッパ軽鎖の分子量または電荷を変更するいくつかの方法を記載している。また、モノクローナル抗体は、例えば、サンプルの軽鎖とは軽鎖質量が異なる場合に選択してもよい。

【0041】

英国のＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから商品名ＳＩＬｕ（商標）Ｌｉｔｅモノクローナル抗体として販売されているものなど、多くのモノクローナル抗体が市販されている。これらとしては、例えば、ＳＩＬｕ（商標）Ｌｉｔｅ安定同位体ユニバーサルモノクローナル抗体および非同位体標識モノクローナル抗体が挙げられる。

【0042】

キャリブレータ抗体は、Ｎ－ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）またはマレイミド（例えば、３．４ｋＤａのマレイミドＰＥＧ）などのタンパク質反応性基を介して、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で質量調整されてもよい。好ましい質量調整剤は、ペンタフルオロフェニルポリエチレングリコール（ＰＦＰ－ＰＥＧ）であり、これは、免疫グロブリン軽鎖の質量調整剤として特に有用であることが本出願人によって見出されている。別の好ましい質量調整剤は、ヌクレオチド結合部位に結合したインドール酪酸誘導体を使用することである。かかる調整剤は、ＰＥＧ鎖に対して異なる長さ、例えば最大２０ｋＤａの質量で市販されている。

【0043】

キャリブレータカッパ軽鎖またはキャリブレータラムダ軽鎖が質量分析によってサンプル中の同一の軽鎖タイプと区別できる場合、質量分析によって同定されるキャリブレータ軽鎖の量を使用して、サンプル中の同一の軽鎖タイプの量を定量してもよい。すなわち、ラムダキャリブレータ軽鎖を使用して、サンプル中のカッパ軽鎖だけでなく、サンプル中のラムダ軽鎖も定量してよく、カッパ軽鎖を使用して、サンプル中のラムダ軽鎖だけでなく、サンプル中のカッパ軽鎖も決定してもよい。単一のモノクローナル軽鎖キャリブレータまたは複数の質量が異なるものを使用して、観察されたｍ／ｚを区別することができることにより、これらは区別可能であってもよい。

【0044】

通常、混合物は、質量分析を実行する前に、少なくとも１つの精製工程で精製される。キャリブレータを混合物と共に有することにより、これは、サンプルの精製またはその他の操作中のサンプル免疫グロブリンの損失を考慮するための内部キャリブレータまたは「内部参照キャリブレータ」として機能する。

【0045】

サンプルを処理して、例えば、質量分析技術を妨害する可能性のある成分を除去してもよい。例えば、サンプルを遠心分離、濾過、またはクロマトグラフィー技術に供して、１つ以上の細胞または組織断片などから干渉成分を除去してもよい。例えば、全血サンプルは、従来の凝固技術を使用して処理し、赤血球と白血球および血小板を除去することができる。例えば、血漿サンプルは、アセトニトリル、ＫＯＨ、ＮａＯＨなどの従来の試薬を使用して血清タンパク質を沈殿させ、その後、必要に応じてサンプルを遠心分離することができる。例えば、免疫グロブリンは、標準的な方法を使用して、サンプルから単離するか、またはサンプルを濃縮することができる。かかる方法としては、例えば、サンプルから１つ以上の非免疫グロブリン汚染物質を除去することが含まれる。あるいは、免疫精製、遠心分離、濾過、水濾過、透析、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、プロテインＡ／Ｇアフィニティークロマトグラフィー、アフィニティー精製、沈殿、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動または化学的分別を使用して、サンプルを濃縮または精製することができる。

【0046】

通常、キャリブレータは、それら精製技術のうちの少なくとも１つの前に、内部参照キャリブレータとしてサンプルに添加される。すなわち、キャリブレータは、例えば上述の方法によって、サンプル内の免疫グロブリンの精製または濃縮を受ける前に、対象の分析物サンプル内に含まれる。つまり、典型的には、分析物の検出に使用される質量分析法に加えて、ＬＣ－ＭＳ、エレクトロスプレー質量分析、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ、またはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳなどの技術が使用される前である。これをサンプル内に組み込むことの利点は、キャリブレータ分析物がサンプルの精製プロセスを通じて内部参照キャリブレータとして機能することである。既知量のキャリブレータまたは断片をサンプルに添加し、これを、精製工程が成功したことを確認するため、または対象サンプル中の分析物の精製中に問題が発生した場所を特定するためにも使用できる陽性内部参照キャリブレータとして使用できる。内部参照キャリブレータを使用することにより、このアッセイを定量アッセイとすることができる。

【0047】

サンプルまたは混合物を、免疫精製してもよい。通常、免疫精製工程の前に、サンプルをキャリブレータと混合して、混合物を形成する。キャリブレータは、免疫精製工程後に添加してもよい。

【0048】

免疫精製工程は、抗重鎖クラス特異的抗体、抗総軽鎖タイプ特異的抗体、抗遊離軽鎖タイプ特異的抗体、もしくは抗重鎖クラス軽鎖タイプ特異的抗体、またはその断片のうちの１つ以上を利用してもよい。かかる抗体は、一般に当技術分野で知られている。

【0049】

抗体は、重鎖サブクラス特異的、または軽鎖特異的、または重鎖クラス－軽鎖タイプ特異的であってもよい。

【0050】

抗重鎖クラス－軽タイプ鎖特異的または重鎖サブクラス－軽鎖タイプ特異的抗体は、英国バーミンガムのＴｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄから商品名Ｈｅｖｙｌｉｔｅ（商標）として市販されている。かかる重鎖クラス－軽鎖タイプ特異的抗体としては、例えば、ＩｇＧカッパ特異的抗体およびＩｇＧラムダ特異的抗体が挙げられる。

【0051】

抗体または断片は、抗ＩｇＧ特異的、抗ＩｇＡ特異的、抗ＩｇＤ特異的、抗ＩｇＭ特異的、抗ＩｇＥ特異的でもよい。

【0052】

抗総ラムダ特異的、抗総カッパ特異的、抗遊離ラムダ特異的または抗遊離カッパ特異的抗体を使用してもよい。キャリブレータは、かかる免疫精製の後に添加してもよい。

【0053】

抗体は、抗ヒト特異的抗体でもよい。

【0054】

サンプルは、血液、血清、血漿、脳脊髄液または尿、より典型的には血液、血清または血漿などの生物学的サンプルでもよい。

【0055】

サンプルは、低ガンマグロブリン血症または高ガンマグロブリン血症を示す対象からのものでもよい。対象は、単クローン性免疫グロブリン血症などの抗体産生細胞に関連する増殖性疾患を有していてもよい。これら疾患としては、骨髄腫および原発性全身性アミロイドーシス、形質細胞腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、およびＭＧＵＳが挙げられる。

【0056】

質量分析を実行する前に、サンプルを還元剤で処理してもよい。これは、サンプル内の軽鎖、実際には通常はキャリブレータ、が免疫グロブリンに結合している場合に特に有用である。還元剤を使用すると、軽鎖が重鎖から分断され、質量分析によって軽鎖を別個に検出できる。

【0057】

分断は、ＤＴＴ（２，３ジヒドロキシブタン－１，４ジチオール）、ＤＴＥ（２，３ジヒドロキシブタム－１，４ジチオール）、チオグリコール酸塩、システイン、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、硫化物、二硫化物、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、２－メルカプトエタノール、およびそれらの塩形態などの還元剤で総免疫グロブリンを処理することによって達成できる。いくつかの実施形態において、還元工程を高温、例えば、約３０℃～約６５℃の範囲、例えば約５５℃で実行して、タンパク質を変性させる。

【0058】

分断工程は通常、サンプル中の免疫グロブリンの免疫精製もしくは他の濃縮の後に、またはサンプルの免疫精製後の溶出工程の一部として実行される。

【0059】

免疫精製に使用される抗体は、完全な抗体またはそれらの断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）^２断片、または単鎖抗体でもよい。

【0060】

抗体または断片が軽鎖および重鎖、またはかかる鎖の断片を含む場合、それらは、免疫精製に使用される抗体または断片によるサンプルの汚染を低減するために、架橋されてもよい。かかる抗体を架橋する方法は、ＷＯ２０１７／１４４９００（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。

【0061】

本発明の方法は、質量分析によって同定されるサンプル中のラムダ軽鎖の相対量とキャリブレータカッパ軽鎖の相対量との比、またはサンプル中のカッパ軽鎖の相対量とキャリブレータラムダ軽鎖の相対量との比を比較して、サンプル中のラムダ軽鎖もしくはカッパ軽鎖の量を計算できるようにすることを含んでもよい。サンプル軽鎖とキャリブレータ軽鎖との相対ピーク高さ（ピーク強度）の比を使用してもよい。あるいは、サンプル軽鎖からのピークの面積（ピーク面積）と、キャリブレータ軽鎖のピークの面積との比を使用してもよい。本出願人はまた、サンプルからのラムダまたはカッパのピークの面積と、サンプルからのラムダまたはカッパの合計面積およびキャリブレータカッパまたはラムダピークからの面積との比を比較することによって、精度が改善されることを見出した。

【0062】

サンプルとキャリブレータとの相対比は、既知量の軽鎖を使用した質量分析法により、カッパ軽鎖対ラムダ軽鎖の量のキャリブレータ曲線を作成することによって同定されてもよい。

【0063】

サンプル中のカッパ軽鎖とラムダ軽鎖との比を決定してもよい。

【0064】

本発明はまた、サンプル中のカッパ軽鎖の量、またはサンプル中のラムダ軽鎖の量を示す第１の信号、および本発明による方法によって得られるラムダ軽鎖キャリブレータまたはカッパ軽鎖キャリブレータの量を示す第２の信号を受信し、２つの信号を所定の較正係数と比較して、サンプル中のカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖の量を示すように適合された機械可読媒体を含むコンピュータを提供する。較正係数は、較正曲線を使用して事前に取得してもよい。

【0065】

本発明の使用のためのキットは、
（ａ）抗ＩｇＧ特異的抗体および所定量のＩｇＧカッパまたはＩｇＧラムダ免疫グロブリン、
（ｂ）抗ＩｇＡ特異的抗体および所定量のＩｇＡカッパまたはＩｇＡラムダ免疫グロブリン、
（ｃ）抗ＩｇＭ特異的抗体および所定量のＩｇＭカッパまたはＩｇＭラムダ免疫グロブリン、
（ｄ）抗ＩｇＤ特異的抗体および所定量のＩｇＤカッパまたはＩｇＤラムダ免疫グロブリン、または
（ｅ）抗ＩｇＥ特異的抗体および所定量のＩｇＥカッパまたはＩｇＥラムダ免疫グロブリン、
のうちの１つ以上を含む。

【0066】

本発明のキットおよび方法はまた、標準的なヒト血清、例えば、ＤＡ４７０Ｋの使用またはキットにおけるその存在を含み得る。これは、ＥＲＭ標準ＤＡ４７０Ｋに基づいて作成された標準化ヒト血清であり、キャリブラントとして使用してもよい。これは、アルファ２マクログロブリン、アルファ１酸性糖タンパク質、アルファ１アンチトリプシン、アルブミン、ベータ２ミクログロブリン、補体タンパク質Ｃ３ｃおよびＣ４、ハプトグロブリン、免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、トランスフェリンおよびトランスサイレチンの混合物を含む。

【0067】

本発明はまた、サンプル中の重鎖の量を定量する方法であって、対象からのサンプルを用意することと、抗総カッパまたは抗総ラムダ抗体で免疫精製することによって前記サンプルから免疫グロブリンを単離することと、質量分析を実行し、質量分析によって決定される前記サンプル中のＩｇＧの量を定量する前に、ＩｇＭ重鎖をキャリブレータとして添加することと、を含む、方法を提供する。

【0068】

この場合、抗体はラムダまたはカッパ軽鎖に結合した重鎖を精製する。ＩｇＭは、グリコシル化されていてｍ／ｚ値が異なるためにキャリブレータとして使用できるという理由で、キャリブレータとして使用され得る。

【0069】

この方法の質量分析および他の構成要素は、上記の通りであってもよい。

【0070】

ここで、本発明を、以下の図面のみを参照して例として説明する。

【図面の簡単な説明】

【0071】

【図1A】図１Ａは、ＩｇＧカッパ多発性骨髄腫の患者からのサンプルの同じＭＡＬＤＩ質量スペクトル上に、内部参照（キャリブレータ）として添加したＳｉＬｕＬｉｔｅ ＩｇＧ１ラムダを示す。図１Ｂは、キャリブレータとサンプルとのＭＡＬＤＩピーク強度比と、ＩｇＧ１カッパ濃度との関係を示す。

【図1B】同上。

【図2A】図２Ａは、ＩｇＧラムダ多発性骨髄腫の患者からのサンプルの同じＭＡＬＤＩ質量スペクトル上に、内部参照（キャリブレータ）として添加したＳｉＬｕＬｉｔｅ ＩｇＧ４カッパを示す。図２Ｂは、キャリブレータとサンプルとのＭＡＬＤＩピーク強度比と、ＩｇＧ１ラムダ濃度との関係を示す。

【図2B】同上。

【図3】図３は、免疫沈降およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析の前に一緒に混合した等量の精製ポリクローナルＩｇＧカッパおよびＩｇＧラムダについてのピーク面積比を示す。

【図4A】図４Ａは、ＩｇＡ１カッパ多発性骨髄腫の患者からのサンプルの同じＭＡＬＤＩ質量スペクトル上に、内部参照（キャリブレータ）として添加した精製モノクローナルＩｇＡラムダを示す。図４Ｂは、キャリブレータとサンプルとのＭＡＬＤＩピーク強度比と、ＩｇＡ１カッパ濃度との関係を示す。

【図4B】同上。

【図5】図５は、分析物としてのポリクローナルＩｇＧラムダと混合したポリクローナルＩｇＧカッパ（キャリブレータ）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦピーク面積比との関係を示す。

【図6】図６は、分析物としての０～２ｇ／Ｌの範囲のモノクローナルＳｉＬｕＬｉｔｅ ＩｇＧラムダと共に、キャリブレータとしてポリクローナルＩｇＧカッパを使用することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0072】

これらの例のそれぞれでは、内部参照（またはキャリブレータ）タンパク質を、固定濃度で、異なる濃度の分析物に添加する。各サンプルを、ポリクローナル抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＡでコーティングした常磁性ビーズを用いた基質特異的免疫沈降に供した。重鎖から軽鎖を分離した後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計を使用して軽鎖の質量スペクトルを取得した。各組み合わせについて、ピークシグナル強度またはピーク面積のいずれかを決定し、これを分析物（サンプル）の濃度に対してプロットした。

【0073】

市販の質量定義されたＳｉＬｕ（商標）Ｌｉｔｅ ＩｇＧ１ Ｌａｍｂｄａを内部参照として使用し、Ｇ１Ｋ１３ Ｍスパイク（ＩｇＧ１カッパ）をサンプルとして使用した。２つの軽鎖ｍ／ｚピークは、質量スペクトル上で互いに明確に分離しており（図１Ａ）、ピーク強度比とモノクローナルタンパク質サンプルの濃度の間に強い相関関係が観察された（図１Ｂ）。ここで、ピーク強度比とは、参照キャリブレータ－材料のラムダ軽鎖のピーク強度と、サンプル中のＩｇＧカッパモノクローナルタンパク質からのカッパ軽鎖のピーク強度との比である。同様に、Ｓｉｇｍａから市販されているＳｉＬｕ（商標）Ｌｉｔｅ ＩｇＧ４ Ｋａｐｐａを内部参照キャリブレータとして使用し、分析物サンプルはＧ１Ｌ０８ Ｍスパイク（ＩｇＧ１ラムダ）であり、非常に類似した結果が得られた（図２ＡおよびＢ）。これらの結果は、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかのモノクローナルＩｇＧが、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによって反対の軽鎖の別のモノクローナルＩｇＧに対するキャリブレータとして使用できることを示している。

【0074】

カッパ軽鎖とラムダ軽鎖の間で強度ピーク面積が一定であるかどうかを試験するために、等量の精製ポリクローナルＩｇＧカッパとポリクローナルＩｇＧラムダを混合して希釈した。次に、希釈したサンプルを、ビーズに固定化した抗ＩｇＧ抗体を使用して免疫沈降させ、還元して、カッパおよびラムダ軽鎖をＩｇＧ重鎖から分離した後、ＭＡＬＤＩターゲットプレート上にスポットした。次に、プレートを質量分析に供し、カッパおよびラムダ軽鎖についてポリクローナル軽鎖ピーク面積を決定し、濃度の関数としてプロットした（以下の表および図３）。結果は、ピーク面積（カッパ対ラムダ）比が１０倍の濃度範囲（７．４４～０．７４ｇ／Ｌ）全体で一定であり、イオン化またはビーズ上の抗ＩｇＧ抗体への異なる結合によって明らかな影響を受けないことを示している。

【0075】

【表1】

【0076】

効果が重鎖クラス特異的ではないことを実証するために、モノクローナルＩｇＡ１カッパ抗体を内部参照として使用し、ＩｇＡラムダをサンプルとして使用した。また、２つの軽鎖ｍ／ｚピークは、質量スペクトル上で互いに明確に分離しており（図４Ａ）、ピーク強度比とモノクローナルタンパク質サンプルの濃度との間に強い相関関係が観察された（図４Ｂ）。これは、ラムダまたはカッパをキャリブレータとして使用できることが重鎖クラス特異的ではないことを示している。

【0077】

図５には、反対のポリクローナル軽鎖の内部参照としてポリクローナル軽鎖を使用することが示されている。この例では、キャリブレータまたは内部参照としてポリクローナルＩｇＧカッパを使用し、分析物としてポリＩｇＧラムダを使用した。９．９～０．２ｇ／Ｌのサンプル濃度範囲でキャリブレータおよびサンプルについて得られたピーク面積比を下の表に示し、図５にプロットする。

【0078】

【表2】

【0079】

図６は、分析物としてのモノクローナル軽鎖のキャリブレータとしてポリクローナル軽鎖を使用できることを確認する。精製ポリクローナルＩｇＧカッパを０．５ｇ／Ｌの内部参照として使用し、２．０～０．１ｇ／Ｌの範囲でＳｉＬｕＬｉｔｅ ＩｇＧラムダモノクローナルタンパク質と混合した。キャリブレータとサンプルについて得られたピーク面積比を下の表に示し、図６ではサンプル濃度に対してプロットする。
これらの例は、免疫グロブリンカッパまたはラムダ含有分子のさまざまな組み合わせを、ＭＡＬＤ－ＴＯＦ ＭＳにおける反対の軽鎖の他の免疫グロブリンに対する内部参照またはキャリブレータ分子として使用できることを示している。この有用性は、モノクローナルタンパク質およびポリクローナルタンパク質のいずれにも有効である。

【0080】

【表3】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】