特表 2022-532249 インターロイキンタンパク質の類似体と組み合わせて癌を処置するための治療用組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-13

(54)【発明の名称】インターロイキンタンパク質の類似体と組み合わせて癌を処置するための治療用組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/24 20060101AFI20220706BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20220706BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20220706BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220706BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20220706BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220706BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20220706BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220706BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20220706BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220706BHJP

【ＦＩ】

C12N15/24

C07K14/54 ZNA

C07K16/00

C07K19/00

C12N15/62 Z

A61P35/00

A61P35/02

A61K45/00

A61K38/20

A61K39/395 N

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021568503

(86)(22)【出願日】2020-05-16

(85)【翻訳文提出日】2022-01-17

(86)【国際出願番号】 US2020033317

(87)【国際公開番号】W WO2020232427

(87)【国際公開日】2020-11-19

(31)【優先権主張番号】62/848,962

(32)【優先日】2019-05-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/848,975

(32)【優先日】2019-05-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521202743

【氏名又は名称】アーチ オンコロジー，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ブリン，ジェームス

(72)【発明者】

【氏名】マッキーン，ジョン

(72)【発明者】

【氏名】モナハン，ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】ストロール，ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】プーロ，ロビン

(72)【発明者】

【氏名】リチャーズ，ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ペレイラ，ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】アルマグロ，ジュアン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084AA17

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA41

4C084DA12

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA12

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZC751

4C085AA14

4C085AA21

4C085BB01

4C085BB11

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA76

4H045EA20

4H045GA26

(57)【要約】

インターロイキンタンパク質の類似体と組み合わせて、異なる機能プロファイルを有する抗ＣＤ４７ ｍＡｂ及び抗ＣＤ４７融合タンパク質、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞を投与することによって癌を処置するための組成物及び方法が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ．第１のポリペプチド鎖が、（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）の結合領域を含む第１のドメイン；及び（ｉｉ）第２の軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む、第１、及び第２のポリペプチド鎖；並びに
ｂ．（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの重鎖可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第１のドメイン；（ｉｉ）第２のドメイン、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）；及び（ｉｉｉ）ＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－１５タンパク質、又はそのバリアントを含む第３のドメインを含む、第２のポリペプチド鎖
を含む、ポリペプチド。

【請求項2】

ａ．第１のポリペプチド鎖が、（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）の結合領域を含む第１のドメイン；（ｉｉ）第２の軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）；及び（ｉｉｉ）ＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－１５タンパク質、又はそのバリアントを含む第３のドメインを含む、第１、及び第２のポリペプチド鎖；並びに
ｂ．（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの重鎖可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第１のドメイン；及び（ｉｉ）第２のドメイン、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）を含む、第２のポリペプチド鎖
を含む、ポリペプチド。

【請求項3】

ａ．第１のポリペプチド鎖が、（ｉ）ＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－１５タンパク質、又はそのバリアントを含む第１のドメイン；（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）の結合領域を含む第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）第３のドメイン、軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）；を含む、第１、及び第２のポリペプチド鎖；並びに
ｂ．（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの重鎖可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第１のドメイン；及び（ｉｉ）第２のドメイン、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）を含む、第２のポリペプチド鎖
を含む、ポリペプチド。

【請求項4】

ａ．第１のポリペプチド鎖が、（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）の結合領域を含む第１のドメイン；及び（ｉｉ）第２の軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む、第１、及び第２のポリペプチド鎖；並びに
ｂ．（ｉ）ＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－１５タンパク質、又はそのバリアントを含む第１のドメイン；（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの重鎖可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）第３のドメイン、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）を含む、第２のポリペプチド鎖
を含む、ポリペプチド。

【請求項5】

前記ＩＬ－７タンパク質又はそのバリアントが改変されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項6】

前記ＩＬ－７タンパク質又はそのバリアントが、ＩＬ－７受容体に結合して、細胞内のＩＬ－７シグナル伝達を活性化できる、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【請求項7】

前記ＩＬ－７タンパク質又はそのバリアントが、アミノ酸の置換を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【請求項8】

ＩＬ－７受容体の改変結合領域におけるアミノ酸置換が、アミノ酸位置１０、１１、１４、１９、８１、及び８５から選択されるアミノ酸位置の置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２に対して相対的である、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【請求項9】

アミノ酸位置１０でのアミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉ、Ｋ１０Ｍ、又はＫ１０Ｖである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【請求項10】

アミノ酸位置１０でのアミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【請求項11】

アミノ酸位置１１でのアミノ酸置換が、Ｑ１１Ｒである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【請求項12】

アミノ酸位置１４でのアミノ酸置換が、Ｓ１４Ｔである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【請求項13】

アミノ酸位置１９でのアミノ酸置換が、Ｓ１９Ｑである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【請求項14】

アミノ酸位置８１でのアミノ酸置換が、Ｋ８１Ｍ又はＫ８１Ｒである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【請求項15】

アミノ酸位置８５でのアミノ酸置換が、Ｇ８５Ｍである、請求項１～４のいずれか一項に記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリペプチドを対象に投与することを含む、前記対象の癌を処置する方法。

【請求項17】

前記癌が固形腫瘍を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記固形腫瘍が、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平上皮癌）、小細胞肺癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃（gastric）癌又は胃（stomach）癌、膵臓癌、神経膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、頭頸部癌、並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記癌が血液悪性腫瘍である、請求項１６のいずれかに記載の方法。

【請求項20】

前記血液悪性腫瘍が、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟部肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記血液悪性腫瘍がＴ細胞悪性腫瘍である、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記Ｔ細胞悪性腫瘍がＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記Ｔ細胞悪性腫瘍が非ホジキンリンパ腫である、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記癌が多発性骨髄腫である、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記癌がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項１９に記載の方法。

【請求項26】

前記対象がさらに抗癌剤を投与される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記抗癌剤がプロテアソーム阻害剤である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、及びカルフィルゾミブから選択される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記抗癌剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項２６に記載の方法。

【請求項30】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３、ＣＴＬＡ－４、又はそれらの任意の組み合わせの阻害剤である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記ポリペプチドが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病変内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外又は胸骨内に投与される、請求項１６に記載の方法。

【請求項33】

請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、それを必要とする対象の癌の処置における使用のための医薬組成物。

【請求項34】

治療有効量の
ａ）抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント；及び
ｂ）ＩＬ－７タンパク質
を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象の癌を処置するための方法。

【請求項35】

前記抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントが、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の組み合わせを含み、前記組み合わせが、
（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｉｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｖ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖；並びに
（ｖｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖
から選択される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ＩＬ－７タンパク質が、配列番号１（GenBankアクセッション番号P13232）から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

前記ＩＬ－７タンパク質が改変されている、請求項３４又は３５に記載の方法。

【請求項38】

前記ＩＬ－７タンパク質が融合タンパク質である、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記改変ＩＬ－７タンパク質が、ＩＬ－７受容体に結合して、細胞内のＩＬ－７シグナル伝達を活性化できる、請求項３７に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項40】

前記改変ＩＬ－７タンパク質が、アミノ酸の置換を含む、請求項３７に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項41】

前記改変ＩＬ－７タンパク質における前記アミノ酸置換が、アミノ酸位置１０、１１、１４、１９、８１、及び８５からなる群から選択されるアミノ酸位置の置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２に対して相対的である、請求項４０に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項42】

アミノ酸位置１０での前記アミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉ、Ｋ１０Ｍ、又はＫ１０Ｖである、請求項４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項43】

アミノ酸位置１０での前記アミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉである、請求項４２に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項44】

アミノ酸位置１１での前記アミノ酸置換が、Ｑ１１Ｒである、請求項４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項45】

アミノ酸位置１４での前記アミノ酸置換が、Ｓ１４Ｔである、請求項４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項46】

アミノ酸位置１９での前記アミノ酸置換が、Ｓ１９Ｑである、請求項４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項47】

アミノ酸位置８１での前記アミノ酸置換が、Ｋ８１Ｍ又はＫ８１Ｒである、請求項４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項48】

アミノ酸位置８５での前記アミノ酸置換が、Ｇ８５Ｍである、請求項４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項49】

前記融合タンパク質が異種部分を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項50】

前記異種部分が、前記ＩＬ－７タンパク質の半減期を延長する部分（「半減期延長部分」）である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記半減期延長部分が、免疫グロブリン又はその一部のＦｃ領域、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アミノ酸の長い非構造化親水性配列（ＸＴＥＮ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記半減期延長部分がＦｃドメインである、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記ＩＬ－７タンパク質が、約２０μｇ／ｋｇ～約６００μｇ／ｋｇの体重ベースの用量、又は約０．２５ｍｇ～約９ｍｇの固定用量で投与される、請求項３６～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記ＩＬ－７タンパク質が、約２０μｇ／ｋｇ、約６０μｇ／ｋｇ、約１２０μｇ／ｋｇ、約２４０μｇ／ｋｇ、約４８０μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、若しくは約１０ｍｇ／ｋｇの体重ベースの用量、又は約０．２５ｍｇ、約１ｍｇ、約３ｍｇ、約６ｍｇ、若しくは約９ｍｇの固定用量で投与される、請求項３６～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記ＩＬ－７タンパク質が、少なくとも週に１回、少なくとも週に２回、少なくとも週に３回、少なくとも週に４回、少なくとも月に１回、又は少なくとも月に２回の投与間隔で投与される、請求項３６～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ＩＬ－７タンパク質が、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントの後に投与される、請求項３６～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ＩＬ－７タンパク質が、抗ＣＤ４７抗体及びその抗原結合フラグメントの前に投与される、請求項３６～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記ＩＬ－７タンパク質が、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントと同時に投与される、請求項３６～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記癌が固形腫瘍を含む、請求項３４～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記固形腫瘍が、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平上皮癌）、小細胞肺癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃（gastric）癌又は胃（stomach）癌、膵臓癌、神経膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓又は腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、頭頸部癌、並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記癌が血液悪性腫瘍である、請求項３４～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記血液悪性腫瘍が、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟部肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記血液悪性腫瘍がＴ細胞悪性腫瘍である、請求項６１に記載の方法。

【請求項64】

前記Ｔ細胞悪性腫瘍がＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記Ｔ細胞悪性腫瘍が非ホジキンリンパ腫である、請求項６３に記載の方法。

【請求項66】

前記癌が多発性骨髄腫である、請求項６１に記載の方法。

【請求項67】

前記癌がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項６１に記載の方法。

【請求項68】

前記対象がさらに抗癌剤を投与される、請求項３４～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記抗癌剤がプロテアソーム阻害剤である、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、及びカルフィルゾミブから選択される、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記抗癌剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項６８に記載の方法。

【請求項72】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３、ＣＴＬＡ－４、又はそれらの任意の組み合わせの阻害剤である、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項７１に記載の方法。

【請求項74】

配列番号８～１６に示される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項75】

前記改変ＩＬ－７タンパク質が、ＩＬ－７受容体に結合して、細胞内のＩＬ－７シグナル伝達を活性化できる、請求項７４に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項76】

前記改変ＩＬ－７タンパク質における前記アミノ酸置換が、アミノ酸位置１０、１１、１４、１９、８１、及び８５からなる群から選択されるアミノ酸位置の置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２に対して相対的である、請求項７４又は７５に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項77】

アミノ酸位置１０での前記アミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉ、Ｋ１０Ｍ、又はＫ１０Ｖである、請求項７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項78】

アミノ酸位置１０での前記アミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉである、請求項７７に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項79】

アミノ酸位置１１での前記アミノ酸置換が、Ｑ１１Ｒである、請求項７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項80】

アミノ酸位置１４での前記アミノ酸置換が、Ｓ１４Ｔである、請求項７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項81】

アミノ酸位置１９での前記アミノ酸置換が、Ｓ１９Ｑである、請求項７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項82】

アミノ酸位置８１での前記アミノ酸置換が、Ｋ８１Ｍ又はＫ８１Ｒである、請求項７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項83】

アミノ酸位置８５での前記アミノ酸置換が、Ｇ８５Ｍである、請求項７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【請求項84】

請求項７７～８３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸構築物。

【請求項85】

前記改変ＩＬ－７タンパク質が、Ｃ末端ヒスチジンタグをさらに含む、請求項８４に記載の核酸構築物。

【請求項86】

ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を、請求項７７～８３のいずれか一項に記載のタンパク質と共に患者に投与することを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞の増殖及び持続性を改善する方法。

【請求項87】

ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞において内部シグナル伝達を開始する方法であって、
請求項７７～８３のいずれか一項に記載のタンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含み、
前記改変インターロイキンタンパク質がＩＬ－７受容体に結合し；
前記改変インターロイキンタンパク質の結合が、前記細胞内の内部シグナル伝達を開始する、方法。

【請求項88】

請求項７７～８３のいずれか一項に記載のタンパク質及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象の癌を処置する方法。

【請求項89】

前記改変ＩＬ－７タンパク質が、ＩＬ－７受容体に結合して、細胞内のＩＬ－７シグナル伝達を活性化できる、請求項８６～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ－ＮＫ細胞から選択される、請求項８６～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記改変インターロイキンタンパク質及び前記ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞が、薬剤と同時に投与される、請求項８６～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

配列番号３１～４５に示される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、改変ＩＬ－１５タンパク質。

【請求項93】

前記改変ＩＬ－１５タンパク質が、ＩＬ－１５受容体に結合して、細胞内のＩＬ－１５シグナル伝達を活性化できる、請求項９２に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項94】

前記改変ＩＬ－１５タンパク質における前記アミノ酸置換が、アミノ酸位置３、４、１１、７２、７９、及び１１２からなる群から選択されるアミノ酸位置の置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号３０に対して相対的である、請求項９２又は９３に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項95】

アミノ酸位置３での前記アミノ酸置換が、Ｖ３Ｉ、Ｖ３Ｍ、又はＶ３Ｒである、請求項９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項96】

アミノ酸位置４での前記アミノ酸置換が、Ｎ４Ｈである、請求項９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項97】

アミノ酸位置１１での前記アミノ酸置換が、Ｋ１１Ｌ、Ｋ１１Ｍ、又はＫ１１Ｒである、請求項９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項98】

アミノ酸位置７２での前記アミノ酸置換が、Ｎ７２Ｄ、Ｎ７２Ｒ又はＮ７２Ｙである、請求項９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項99】

アミノ酸位置７９での前記アミノ酸置換が、Ｎ７９Ｅ又はＮ７９Ｓである、請求項９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項100】

アミノ酸位置７９での前記アミノ酸置換が、Ｎ７９Ｓである、請求項９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項101】

アミノ酸位置１１２での前記アミノ酸置換が、Ｎ１１２Ｈ、Ｎ１１２Ｍ、又はＮ１１２Ｙである、請求項９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【請求項102】

請求項９５～１０１のいずれか一項に記載の改変インターロイキンタンパク質をコードする核酸構築物。

【請求項103】

前記改変ＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ末端ヒスチジンタグをさらに含む、請求項１０２に記載の核酸構築物。

【請求項104】

ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を、請求項９５～１０１のいずれか一項に記載の改変インターロイキンタンパク質と共に患者に投与することを含む、免疫エフェクター細胞、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞の増殖及び持続性を改善する方法。

【請求項105】

免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞において内部シグナル伝達を開始する方法であって、
請求項９５～１０１のいずれか一項に記載の改変インターロイキンタンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含み、
前記改変インターロイキンタンパク質がＩＬ－１５受容体に結合し；
前記改変インターロイキンタンパク質の結合が、前記細胞内の内部シグナル伝達を開始する、方法。

【請求項106】

請求項９５～１０１のいずれか一項に記載の改変インターロイキンタンパク質及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする前記対象の癌を処置する方法。

【請求項107】

前記改変ＩＬ－１５タンパク質が、ＩＬ－１５受容体に結合して、細胞内のＩＬ－１５シグナル伝達を活性化できる、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞エフェクター細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ－ＮＫ細胞から選択される、請求項１０４～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

前記改変インターロイキンタンパク質及び前記ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞が、薬剤と同時に投与される、請求項１０４～１０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

ＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－１５タンパク質、又はそれらのバリアントを含む配列に融合したヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリン可変領域、を含む、ポリペプチド。

【請求項111】

ヒトＣＤ４７に特異的な前記免疫グロブリン可変領域が、リンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）によって、ＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－１５タンパク質、又はそれらのバリアントを含む配列に融合した、請求項１１０に記載のポリペプチド。

【請求項112】

少なくとも１つのＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－１５タンパク質、又はＩＬ－１５バリアントに結合したヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリン可変領域、を含む、ポリペプチド。

【請求項113】

ヒトＣＤ４７に特異的な前記免疫グロブリン可変領域が、リンカーによって、ＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－１５タンパク質、又はＩＬ－１５バリアントに結合されている、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項114】

前記リンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８である、請求項１１３に記載のポリペプチド。

【請求項115】

前記免疫グロブリン可変領域が、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体又はそのフラグメントからのものである、請求項１１２～１１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[0001] この出願は、２０１９年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／８４８，９６２号、及び２０１９年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／８４８，９７５号の優先権の利益を主張し、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0002】

[0002] この開示は、一般的に、インターロイキンタンパク質の類似体と組み合わせて、異なる機能プロファイルを有する抗ＣＤ４７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び抗ＣＤ４７融合ｍＡｂ、又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞を使用する癌を処置する方法に関する。

【背景技術】

【0003】

[0003] ＣＤ４７の発現及び／又は活性は、多くの疾患及び障害に関係している。多くのヒトの癌はＣＤ４７の細胞表面発現をアップレギュレートし、最高レベルのＣＤ４７を発現する癌は、患者にとって最も高悪性度で最も致死的であるように思われる。ＣＤ４７発現の増加は、ＣＤ４７保有細胞の食作用を防ぐ阻害性受容体であるＳＩＲＰαを介してマクロファージに「私を食べるな」というシグナルを送ることにより、癌細胞を食細胞クリアランスから保護すると考えられている。

【0004】

[0004] Ｔ細胞は、抗原認識部分及びＴ細胞活性化ドメインで構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変することができる。ＣＡＲは、癌細胞で過剰発現している抗原を認識するように設計されている。ＣＡＲ－Ｔは、Ｂ細胞悪性腫瘍に対して非常に優れた臨床効果を示し、KYMRIAH（商標）（チサゲンレクロイセル、Novartis）及びYESCARTA（商標）（axicabtagene ciloleucel、Kite/Gilead）の２つの治療剤が最近ＦＤＡによって承認された。最近の開示はまた、ＣＡＲ－Ｔ治療の使用をＴ細胞悪性腫瘍にも拡大し、同種異系反応性なしに悪性腫瘍を処置するためにドナーからの事前に操作された細胞の「既製」使用を可能にすることにおいて有望であることを示した。

【0005】

[0005] ＩＬ－７は、Ｂ細胞及びＴ細胞の発達に重要なサイトカインである。ＩＬ－７は、骨髄及び胸腺の間質細胞からの分泌を含むがこれらに限定されない、多くの細胞型によって産生される造血成長因子である。ＩＬ－７は、多能性造血幹細胞のリンパ系前駆細胞への分化を刺激する。ＩＬ－７のＩＬ－７受容体との結合は、胸腺内でのＴ細胞の成長及び末梢での生存に重要なシグナルのカスケードをもたらす。

【0006】

[0006] ＩＬ－１５は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及びサイトカイン産生、並びにエフェクターメモリーＴ細胞の分化及びアポトーシスに対する感受性を誘導する。ＩＬ－１５Ｒαは、例えばリンパ球系細胞、樹状細胞（ＤＣ）、線維芽、上皮、肝臓、腸、及びその他の細胞によって、広く発現され、ＩＬ－１５β及びγ鎖を発現する細胞にトランスでＩＬ－１５を提示すると考えられている。

【0007】

[0007] ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＣＤ４７の発現及び／又は活性は、多くの疾患及び障害に関係している。したがって、様々な癌の予防及び処置を含む、ヒトのＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＣＤ４７に関連する疾患及び状態を処置するための治療用組成物及び方法の必要性が存在する。抗ＣＤ４７ ｍＡｂ及びインターロイキンタンパク質（すなわちＩＬ－７及びＩＬ－１５）の類似体を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の癌を処置するための治療的使用が本明細書に開示される。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞を含む免疫エフェクター細胞の増殖及び持続性を改善するための治療的使用、並びに免疫エフェクター細胞の集団、例えば、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞及びインターロイキンタンパク質（すなわち、ＩＬ－７及びＩＬ－１５）の類似体を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における癌を処置するための治療的使用も開示される。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

概要
[0008] 実施形態１．第１及び第２のポリペプチド鎖を含むポリペプチドであって、第１のポリペプチド鎖が、（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）の結合領域を含む第１のドメイン；及び（ｉｉ）第２の軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含み、第２のポリペプチド鎖が、（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの重鎖可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第１のドメイン；（ｉｉ）第２のドメイン、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）；及び（ｉｉｉ）ＩＬ－７タンパク質又はそのバリアントを含む第３のドメインを含む、ポリペプチド。

【0009】

[0009] 実施形態２．第１及び第２のポリペプチド鎖を含むポリペプチドであって、第１のポリペプチド鎖が、（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）の結合領域を含む第１のドメイン；（ｉｉ）第２の軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）；及び（ｉｉｉ）ＩＬ－７タンパク質又はそのバリアントを含む第３のドメインを含み、第２のポリペプチド鎖が、（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの重鎖可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第１のドメイン；及び（ｉｉ）第２のドメイン、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）を含む、ポリペプチド。

【0010】

[0010] 実施形態３．第１及び第２のポリペプチド鎖を含むポリペプチドであって、第１のポリペプチド鎖が、（ｉ）ＩＬ－７タンパク質又はそのバリアントを含む第１のドメイン；（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の結合領域を含む第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）第３のドメイン、軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）；を含み、第２のポリペプチド鎖が、（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの重鎖可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第１のドメイン；及び（ｉｉ）第２のドメイン、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）を含む、ポリペプチド。

【0011】

[0011] 実施形態４．第１及び第２のポリペプチド鎖を含むポリペプチドであって、第１のポリペプチド鎖が、（ｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）の結合領域を含む第１のドメイン；及び（ｉｉ）第２の軽鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含み、第２のポリペプチド鎖が、（ｉ）ＩＬ－７タンパク質又はそのバリアントを含む第１のドメイン；（ｉｉ）ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリンの重鎖可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）第３のドメイン、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）を含む、ポリペプチド。

【0012】

[0012] 実施形態５．ＩＬ－７タンパク質又はそのバリアントが改変されている、実施形態１～４のいずれかに記載のペプチド。

【0013】

[0013] 実施形態６．ＩＬ－７受容体に対する改変結合領域が、ＩＬ－７受容体に結合して、細胞内のＩＬ－７シグナル伝達を活性化できる、実施形態１～４のいずれかに記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【0014】

[0014] 実施形態７．ＩＬ－７受容体に対する改変結合領域が、アミノ酸置換を含む、実施形態１～４のいずれかに記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【0015】

[0015] 実施形態８．ＩＬ－７受容体に対する改変結合領域におけるアミノ酸置換が、アミノ酸位置１０、１１、１４、１９、８１、及び８５から選択されるアミノ酸位置の置換を含み、アミノ酸位置が、配列番号２に対して相対的である、実施形態１～４のいずれかに記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【0016】

[0016] 実施形態９．アミノ酸位置１０でのアミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉ、Ｋ１０Ｍ、又はＫ１０Ｖである、実施形態１～４のいずれかに記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【0017】

[0017] 実施形態１０．アミノ酸位置１０でのアミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉである、実施形態１～４のいずれかに記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【0018】

[0018] 実施形態１１．アミノ酸位置１１でのアミノ酸置換が、Ｑ１１Ｒである、実施形態１～４のいずれかに記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【0019】

[0019] 実施形態１２．アミノ酸位置１４でのアミノ酸置換が、Ｓ１４Ｔである、実施形態１～４のいずれかに記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【0020】

[0020] 実施形態１３．アミノ酸位置１９でのアミノ酸置換が、Ｓ１９Ｑである、実施形態１～４のいずれかに記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【0021】

[0021] 実施形態１４．アミノ酸位置８１でのアミノ酸置換が、Ｋ８１Ｍ又はＫ８１Ｒである、実施形態１～４のいずれかに記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【0022】

[0022] 実施形態１５．アミノ酸位置８５でのアミノ酸置換が、Ｇ８５Ｍである、実施形態１～４のいずれかに記載のＩＬ－７タンパク質又はそのバリアント。

【0023】

[0023] 実施形態１６．実施形態１～１５のいずれかのポリペプチドを対象に投与することを含む、対象の癌を処置する方法。

【0024】

[0024] 実施形態１７．癌が固形腫瘍を含む、実施形態１６に記載の方法。

【0025】

[0025] 実施形態１８．固形腫瘍が、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平上皮癌）、小細胞肺癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃（gastric）癌又は胃（stomach）癌、膵臓癌、神経膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓（kidney）又は腎（renal）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、頭頸部癌、並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態１７に記載の方法。

【0026】

[0026] 実施形態１９．癌が血液悪性腫瘍である、実施形態１８に記載の方法。

【0027】

[0027] 実施形態２０．血液悪性腫瘍が、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟部肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態１９に記載の方法。

【0028】

[0028] 実施形態２１．血液悪性腫瘍がＴ細胞悪性腫瘍である、実施形態１９に記載の方法。

【0029】

[0029] 実施形態２２．Ｔ細胞悪性腫瘍がＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である、実施形態２１に記載の方法。

【0030】

[0030] 実施形態２３．Ｔ細胞悪性腫瘍が非ホジキンリンパ腫である、実施形態２１に記載の方法。

【0031】

[0031] 実施形態２４．癌が多発性骨髄腫である、実施形態１６に記載の方法。

【0032】

[0032] 実施形態２５．癌がＢ細胞悪性腫瘍である、実施形態１６に記載の方法。

【0033】

[0033] 実施形態２６．対象がさらに抗癌剤を投与される、実施形態１～２５に記載の方法。

【0034】

[0034] 実施形態２７．抗癌剤がプロテアソーム阻害剤である、実施形態２６に記載の方法。

【0035】

[0035] 実施形態２８．プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、及びカルフィルゾミブから選択される、実施形態２７に記載の方法。

【0036】

[0036] 実施形態２９．抗癌剤が免疫チェックポイント阻害剤である、実施形態２６に記載の方法。

【0037】

[0037] 実施形態３０．免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３、ＣＴＬＡ－４、又はそれらの任意の組み合わせの阻害剤である、実施形態２９に記載の方法。

【0038】

[0038] 実施形態３１．免疫チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態２９に記載の方法。

【0039】

[0039] 実施形態３２．ポリペプチドが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病変内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外又は胸骨内に投与される、実施形態１６に記載の方法。

【0040】

[0040] 実施形態３３．実施形態１～４のいずれか１つのポリペプチドを含む、それを必要とする対象の癌の処置における使用のための医薬組成物。

【0041】

[0041] 実施形態３４．治療有効量の
ａ）抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメント；及び
ｂ）ＩＬ－７タンパク質
を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の癌を処置するためのＡ。

【0042】

[0042] 実施形態３５．抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントが、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の組み合わせを含み、組み合わせが、
（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｉｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖；
（ｖ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖；並びに
（ｖｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖
から選択される、実施形態３４に記載の方法。

【0043】

[0043] 実施形態３６．ＩＬ－７タンパク質が、配列番号１（GenBankアクセッション番号P13232）から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を有する、実施形態３４に記載の方法。

【0044】

[0044] 実施形態３７．ＩＬ－７タンパク質が改変されている、実施形態３４又は３５に記載の方法。

【0045】

[0045] 実施形態３８．ＩＬ－７タンパク質が融合タンパク質である、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の方法。

【0046】

[0046] 実施形態３９．改変ＩＬ－７タンパク質が、ＩＬ－７受容体に結合して、細胞内のＩＬ－７シグナル伝達を活性化できる、実施形態３７に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【0047】

[0047] 実施形態４０．改変ＩＬ－７タンパク質が、アミノ酸の置換を含む、実施形態３７に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0048】

[0048] 実施形態４１．改変ＩＬ－７タンパク質におけるアミノ酸置換が、アミノ酸位置１０、１１、１４、１９、８１、及び８５からなる群から選択されるアミノ酸位置の置換を含み、アミノ酸位置が、配列番号２に対して相対的である、実施形態４０に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0049】

[0049] 実施形態４２．アミノ酸位置１０でのアミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉ、Ｋ１０Ｍ、又はＫ１０Ｖである、実施形態４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0050】

[0050] 実施形態４３．アミノ酸位置１０でのアミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉである、実施形態４２に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0051】

[0051] 実施形態４４．アミノ酸位置１１でのアミノ酸置換が、Ｑ１１Ｒである、実施形態４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0052】

[0052] 実施形態４５．アミノ酸位置１４でのアミノ酸置換が、Ｓ１４Ｔである、実施形態４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0053】

[0053] 実施形態４６．アミノ酸位置１９でのアミノ酸置換が、Ｓ１９Ｑである、実施形態４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0054】

[0054] 実施形態４７．アミノ酸位置８１でのアミノ酸置換が、Ｋ８１Ｍ又はＫ８１Ｒである、実施形態４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0055】

[0055] 実施形態４８．アミノ酸位置８５でのアミノ酸置換が、Ｇ８５Ｍである、実施形態４１に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0056】

[0056] 実施形態４９．融合タンパク質が異種部分を含む、実施形態３８に記載の方法。

【0057】

[0057] 実施形態５０．異種部分が、ＩＬ－７タンパク質の半減期を延長する部分（「半減期延長部分」）である、実施形態４９に記載の方法。

【0058】

[0058] 実施形態５１．半減期延長部分が、免疫グロブリン又はその一部のＦｃ領域、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、Ｐｒｏ／Ａｌａ／Ｓｅｒ（ＰＡＳ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ポリエチレン（polyet9hylene）グリコール（ＰＥＧ）、アミノ酸の長い非構造化親水性配列（ＸＴＥＮ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合小分子、及びそれらの組み合わせから選択される、実施形態５０に記載の方法。

【0059】

[0059] 実施形態５２．半減期延長部分がＦｃドメインである、実施形態５１に記載の方法。

【0060】

[0060] 実施形態５３．ＩＬ－７タンパク質が、約２０μｇ／ｋｇ～約６００μｇ／ｋｇの体重ベースの用量、又は約０．２５ｍｇ～約９ｍｇの固定用量で投与される、実施形態３６～５２のいずれか１つに記載の方法。

【0061】

[0061] 実施形態５４．ＩＬ－７タンパク質が、約２０μｇ／ｋｇ、約６０μｇ／ｋｇ、約１２０μｇ／ｋｇ、約２４０μｇ／ｋｇ、約４８０μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、若しくは約１０ｍｇ／ｋｇの体重ベースの用量、又は約０．２５ｍｇ、約１ｍｇ、約３ｍｇ、約６ｍｇ、若しくは約９ｍｇの固定用量で投与される、実施形態３６～５３のいずれか１つに記載の方法。

【0062】

[0062] 実施形態５５．ＩＬ－７タンパク質が、少なくとも週に１回、少なくとも週に２回、少なくとも週に３回、少なくとも週に４回、少なくとも月に１回、又は少なくとも月に２回の投与間隔で投与される、実施形態３６～５４のいずれか１つに記載の方法。

【0063】

[0063] 実施形態５６．ＩＬ－７タンパク質が、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントの後に投与される、実施形態３６～５５のいずれか１つに記載の方法。

【0064】

[0064] 実施形態５７．ＩＬ－７タンパク質が、抗ＣＤ４７抗体及びその抗原結合フラグメントの前に投与される、実施形態３６～５６のいずれか１つに記載の方法。

【0065】

[0065] 実施形態５８．ＩＬ－７タンパク質が、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントと同時に投与される、実施形態３６～５７のいずれか１つに記載の方法。

【0066】

[0066] 実施形態５９．癌が固形腫瘍を含む、実施形態３４に記載の方法。

【0067】

[0067] 実施形態６０．固形腫瘍が、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平上皮癌）、小細胞肺癌を含む肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃（gastric）癌又は胃（stomach）癌、膵臓癌、神経膠芽腫、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓（kidney）又は腎（renal）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、頭頸部癌、並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態５９に記載の方法。

【0068】

[0068] 実施形態６１．癌が血液悪性腫瘍である、実施形態３４に記載の方法。

【0069】

[0069] 実施形態６２．血液悪性腫瘍が、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝癌、成人軟部肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態６１に記載の方法。

【0070】

[0070] 実施形態６３．血液悪性腫瘍がＴ細胞悪性腫瘍である、実施形態６１に記載の方法。

【0071】

[0071] 実施形態６４．Ｔ細胞悪性腫瘍がＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）である、実施形態６３に記載の方法。

【0072】

[0072] 実施形態６５．Ｔ細胞悪性腫瘍が非ホジキンリンパ腫である、実施形態６３に記載の方法。

【0073】

[0073] 実施形態６６．癌が多発性骨髄腫である、実施形態３４に記載の方法。

【0074】

[0074] 実施形態６７．癌がＢ細胞悪性腫瘍である、実施形態３４に記載の方法。

【0075】

[0075] 実施形態６８．対象がさらに抗癌剤を投与される、実施形態３４～６７のいずれか１つに記載の方法。

【0076】

[0076] 実施形態６９．抗癌剤がプロテアソーム阻害剤である、実施形態６８に記載の方法。

【0077】

[0077] 実施形態７０．プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、及びカルフィルゾミブから選択される、実施形態６９に記載の方法。

【0078】

[0078] 実施形態７１．抗癌剤が免疫チェックポイント阻害剤である、実施形態６８に記載の方法。

【0079】

[0079] 実施形態７２．免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、Ｔｉｍ－３、ＣＴＬＡ－４、又はそれらの任意の組み合わせの阻害剤である、実施形態７１に記載の方法。

【0080】

[0080] 実施形態７３．免疫チェックポイント阻害剤が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ、又はそれらの任意の組み合わせである、実施形態７１に記載の方法。

【0081】

[0081] 実施形態７４．配列番号８～１６を含む少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、改変ＩＬ－７タンパク質。

【0082】

[0082] 実施形態７５．改変ＩＬ－７タンパク質が、ＩＬ－７受容体に結合して、細胞内のＩＬ－７シグナル伝達を活性化できる、実施形態７４に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【0083】

[0083] 実施形態７６．改変ＩＬ－７タンパク質におけるアミノ酸置換が、アミノ酸位置１０、１１、１４、１９、８１、及び８５からなる群から選択されるアミノ酸位置の置換を含み、アミノ酸位置が、配列番号２に対して相対的である、実施形態７４又は７５のいずれか１つに記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【0084】

[0084] 実施形態７７．アミノ酸位置１０でのアミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉ、Ｋ１０Ｍ、又はＫ１０Ｖである、実施形態７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【0085】

[0085] 実施形態７８．アミノ酸位置１０でのアミノ酸置換が、Ｋ１０Ｉである、実施形態７７に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【0086】

[0086] 実施形態７９．アミノ酸位置１１でのアミノ酸置換が、Ｑ１１Ｒである、実施形態７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【0087】

[0087] 実施形態８０．アミノ酸位置１４でのアミノ酸置換が、Ｓ１４Ｔである、実施形態７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【0088】

[0088] 実施形態８１．アミノ酸位置１９でのアミノ酸置換が、Ｓ１９Ｑである、実施形態７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【0089】

[0089] 実施形態８２．アミノ酸位置８１でのアミノ酸置換が、Ｋ８１Ｍ又はＫ８１Ｒである、実施形態７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【0090】

[0090] 実施形態８３．アミノ酸位置８５でのアミノ酸置換が、Ｇ８５Ｍである、実施形態７６に記載の改変ＩＬ－７タンパク質。

【0091】

[0091] 実施形態８４．実施形態７７～８３のいずれか１つのタンパク質をコードする核酸構築物。

【0092】

[0092] 実施形態８５．改変ＩＬ－７タンパク質が、Ｃ末端ヒスチジンタグをさらに含む、実施形態８４に記載の核酸構築物。

【0093】

[0093] 実施形態８６．ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を、実施形態７７～８３のいずれか１つに記載のタンパク質と共に患者に投与することを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞の増殖及び持続性を改善する方法。

【0094】

実施形態８７．ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞において内部シグナル伝達を開始する方法であって、
実施形態７７～８３のいずれか１つに記載のタンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含み、
改変インターロイキンタンパク質がＩＬ－７受容体に結合し；
改変インターロイキンタンパク質の結合が、細胞内の内部シグナル伝達を開始する、方法。

【0095】

[0094] 実施形態８８．実施形態７７～８３のいずれか１つに記載のタンパク質及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の癌を処置する方法。

【0096】

[0095] 実施形態８９．改変ＩＬ－７タンパク質が、ＩＬ－７受容体に結合して、細胞内のＩＬ－７シグナル伝達を活性化できる、実施形態８６～８８のいずれか１つに記載の方法。

【0097】

[0096] 実施形態９０．ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ－ＮＫ細胞から選択される、実施形態８６～８９のいずれか１つに記載の方法。

【0098】

[0097] 実施形態９１．改変インターロイキンタンパク質及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞が、薬剤と同時に投与される、請求項８６～９０のいずれか一項に記載の方法。

【0099】

[0098] 実施形態９２．配列番号３１～４５を含む少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、改変ＩＬ－１５タンパク質。

【0100】

[0099] 実施形態９３．改変ＩＬ－１５タンパク質が、ＩＬ－１５受容体に結合して、細胞内のＩＬ－１５シグナル伝達を活性化できる、実施形態９２に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0101】

[0100] 実施形態９４．改変ＩＬ－１５タンパク質におけるアミノ酸置換が、アミノ酸位置３、４、１１、７２、７９、及び１１２からなる群から選択されるアミノ酸位置の置換を含み、アミノ酸位置が、配列番号３０に対して相対的である、実施形態９２又は９３のいずれか１つに記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0102】

[0101] 実施形態９５．アミノ酸位置３でのアミノ酸置換が、Ｖ３Ｉ、Ｖ３Ｍ、又はＶ３Ｒである、実施形態９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0103】

[0102] 実施形態９６．アミノ酸位置４でのアミノ酸置換が、Ｎ４Ｈである、実施形態９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0104】

[0103] 実施形態９７．アミノ酸位置１１でのアミノ酸置換が、Ｋ１１Ｌ、Ｋ１１Ｍ、又はＫ１１Ｒである、実施形態９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0105】

[0104] 実施形態９８．アミノ酸位置７２でのアミノ酸置換が、Ｎ７２Ｄ、Ｎ７２Ｒ又はＮ７２Ｙである、実施形態９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0106】

[0105] 実施形態９９．アミノ酸位置７９でのアミノ酸置換が、Ｎ７９Ｅ又はＮ７９Ｓである、実施形態９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0107】

[0106] 実施形態１００．アミノ酸位置７９でのアミノ酸置換が、Ｎ７９Ｓである、実施形態９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0108】

[0107] 実施形態１０１．アミノ酸位置１１２でのアミノ酸置換が、Ｎ１１２Ｈ、Ｎ１１２Ｍ、又はＮ１１２Ｙである、実施形態９４に記載の改変インターロイキンタンパク質。

【0109】

[0108] 実施形態１０２．実施形態９５～１０１のいずれか１つに記載の改変インターロイキンタンパク質をコードする核酸構築物。

【0110】

[0109] 実施形態１０３．改変ＩＬ－１５タンパク質が、Ｎ末端ヒスチジンタグをさらに含む、実施形態１０２に記載の核酸構築物。

【0111】

[0110] 実施形態１０４．ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を、実施形態９５～１０１のいずれか１つに記載の改変インターロイキンタンパク質と共に患者に投与することを含む、免疫エフェクター細胞、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞の増殖及び持続性を改善する方法。

【0112】

[0111] 実施形態１０５．免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞において内部シグナル伝達を開始する方法であって、
実施形態９５～１０１のいずれか１つに記載の改変インターロイキンタンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含み、
改変インターロイキンタンパク質がＩＬ－１５受容体に結合し；
改変インターロイキンタンパク質の結合が、細胞内の内部シグナル伝達を開始する、方法。

【0113】

[0112] 実施形態１０６．実施形態９５～１０１のいずれか１つに記載の改変インターロイキンタンパク質及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の癌を処置する方法。

【0114】

[0113] 実施形態１０７．改変ＩＬ－１５タンパク質が、ＩＬ－１５受容体に結合して、細胞内のＩＬ－１５シグナル伝達を活性化できる、実施形態１０４～１０６のいずれか１つに記載の方法。

【0115】

[0114] 実施形態１０８．ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞エフェクター細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ－ＮＫ細胞から選択される、実施形態１０４～１０７のいずれか１つに記載の方法。

【0116】

[0115] 実施形態１０９．改変インターロイキンタンパク質及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞が、薬剤と同時に投与される、実施形態１０４～１０８のいずれか１つに記載の方法。

【0117】

[0116] 実施形態１１０．少なくとも１つのＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－１５タンパク質、又はＩＬ－１５バリアントに結合したヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリン可変領域を含む、ポリペプチド。

【0118】

[0117] 実施形態１１１．ヒトＣＤ４７に特異的な免疫グロブリン可変領域が、リンカーによって、ＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－１５タンパク質、又はＩＬ－１５バリアントに結合されている、実施形態１１０に記載のポリペプチド。

【0119】

[0118] 実施形態１１２．前記リンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎ＝０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８である、実施形態１２３に記載のポリペプチド。

【0120】

[0119] 実施形態１１３．前記免疫グロブリン可変領域が特異的であるのが、抗ＣＤ４７モノクローナル抗体又はそのフラグメントである、実施形態１１０～実施形態１１３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
[0120]

【0121】

図面の簡単な説明
[0121] 本開示の上記及び他の態様、特徴、及び利点は、添付の図面と併せて理解される以下の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。これらは全て例示としてのみ与えられ、本開示を限定するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0122】

【図1】[0122]Ｃｏｓ－７細胞におけるＩＬ－７Ｒα及びＩＬ－２Ｒγの共発現を示す。上段：１日目のＩＬ－７Ｒα陽性細胞（左）、ＩＬ－２Ｒγ陽性細胞（中央）、ＩＬ－７Ｒα／ＩＬ２Ｒγ二重陽性細胞（右）；中段：２日目のＩＬ－７Ｒα陽性細胞（左）、ＩＬ－２Ｒγ陽性細胞（中央）、ＩＬ－７Ｒα／ＩＬ２Ｒγ二重陽性細胞（右）；下段：３日目のＩＬ－７Ｒα陽性細胞（左）、ＩＬ－２Ｒγ陽性細胞（中央）、ＩＬ－７Ｒα／ＩＬ２Ｒγ二重陽性細胞（右）。

【図2】[0123]ＩＬ－７誘導性ｐＳＴＡＴ５末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）シグナル伝達を示す。

【図3】[0124]自社で調製したＩＬ－７及び市販のＩＬ－７のＩＬ－７Ｒαへの結合のＴＲ－ＦＲＥＴ結果を示す。左上：自社調製ＩＬ－７；左下：市販ＩＬ－７；右：市販ＩＬ－７と自社調製ＩＬ－７の比較。

【図4】[0125]ＷＴと比較した、ＩＬ－７変異体Ｓ１のＩＬ－７Ｒαへの結合を示す。

【図5】[0126]γサブユニットを有する又は有しないＩＬ－７ＲαへのＩＬ－７結合のＴＲ－ＦＲＥＴ結果を示す。左上：γを有しないＩＬ－７；左下：γを有するＩＬ－７；右：γサブユニットを有する又は有しない場合のＩＬ－７の比較。

【図6】[0127]Ｃｏｓ－７細胞におけるＩＬ－７Ｒα及びＩＬ－２Ｒγの共発現を示す。上段：１日目のＩＬ－７Ｒα陽性細胞（左）、ＩＬ－２Ｒγ陽性細胞（中央）、ＩＬ－７Ｒα／ＩＬ２Ｒγ二重陽性細胞（右）；中段：２日目のＩＬ－７Ｒα陽性細胞（左）、ＩＬ－２Ｒγ陽性細胞（中央）、ＩＬ－７Ｒα／ＩＬ２Ｒγ二重陽性細胞（右）；下段：３日目のＩＬ－７Ｒα陽性細胞（左）、ＩＬ－２Ｒγ陽性細胞（中央）、ＩＬ－７Ｒα／ＩＬ２Ｒγ二重陽性細胞（右）。

【図7】[0128]ＩＬ－１５ ｐＳＴＡＴ５末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）シグナル伝達を示す。

【図8】[0129]ヒトＰＢＭＣを使用したｐＳＴＡＴ５アッセイにおけるＷＴ ＩＬ－１５ ＳＥＣ精製画分６の活性を示す。

【図9】[0130]ＩＬ－１５変異体Ｍ２（Ｎ７２Ｒ）のコンフルエンスサイトカイン活性の曲線例を示す。左側はＩＬ－１５ Ｍ２ロット１１－２０－１８、Ｎ＝１、単位ｐｇ／ｍＬを示し、右側はＩＬ－１５ Ｍ２ロット１１－２０－１８、Ｎ＝２、単位ｐｇ／ｍＬを示す。

【図10】[0131]ＩＬ－１５変異体Ｍ５（Ｎ７９Ｓ）のコンフルエンスサイトカイン活性の曲線例を示す。左側はＩＬ－１５ Ｍ５ロット１１－２０－１８、Ｎ＝１、単位ｐｇ／ｍＬを示し、右側はＩＬ－１５ Ｍ５ロット１１－２０－１８、Ｎ＝２、単位ｐｇ／ｍＬを示す。

【図11】[0132]自社で調製したＩＬ－１５及び市販のＩＬ－１５のＩＬ－１５Ｒβへの結合のＴＲ－ＦＲＥＴ結果を示す。左上：自社調製ＩＬ－１５；左下：市販ＩＬ－１５；右：市販ＩＬ－１５と自社調製ＩＬ－１５の比較。

【図12】[0133]野生型ＩＬ－１５及びＩＬ－１５変異体Ｍ２及びＭ５のＩＬ－１５Ｒβへの結合を示す。左上：ＩＬ－１５変異体Ｍ２；左下：ＷＴ ＩＬ－１５；右：ＩＬ－１５変異体Ｍ５。

【図13】[0134]γサブユニットを有する又は有しない、自社で調整したＩＬ－１５のＩＬ－１５Ｒβへの結合のＴＲ－ＦＲＥＴ結果を示す。左上：γを有しないＩＬ－１５；左下：γを有するＩＬ－１５；右：γサブユニットを有する又は有しない場合のＩＬ－１５の比較。

【図14】[0135]ＩＬ－１５Ｒβ及びγ受容体のＭ－０７ｅ膜抽出物のウエスタンブロットを示す。

【図15A】[0136]抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質の模式図を示す。

【図15B】[0137]抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質の模式図を示す。

【図15C】[0138]抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質の模式図を示す。

【図15D】[0139]抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質の模式図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0123】

詳細な説明
[0140] 別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。一般に、細胞及び組織培養、分子生物学、並びに本明細書に記載のタンパク質及びオリゴ又はポリヌクレオチドの化学及びハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、及びそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。

【0124】

[0141] 改変インターロイキン－７（ＩＬ－７）タンパク質が本明細書に開示される。

【0125】

[0142] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７タンパク質は、以下の表７に記載のアミノ酸置換を含む。

【0126】

[0143] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７タンパク質におけるアミノ酸置換は、アミノ酸位置１０、１１、１４、１９、８１、及び８５から選択されるアミノ酸位置における置換を含み、アミノ酸位置は、配列番号２に対して相対的である。

【0127】

[0144] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１０でのアミノ酸置換は、Ｋ１０Ｉ、Ｋ１０Ｍ、又はＫ１０Ｖである。

【0128】

[0145] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１１でのアミノ酸置換は、Ｑ１１Ｒである。

【0129】

[0146] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１４でのアミノ酸置換は、Ｓ１４Ｔである。

【0130】

[0147] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１９でのアミノ酸置換は、Ｓ１９Ｑである。

【0131】

[0148] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置８１でのアミノ酸置換は、Ｋ８１Ｍ又はＫ８１Ｒである。

【0132】

[0149] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置８５でのアミノ酸置換は、Ｇ８５Ｍである。

【0133】

[0150] いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の改変ＩＬ－７タンパク質をコードする核酸構築物を提供する。

【0134】

[0151] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７タンパク質は、Ｃ末端ヒスチジンタグをさらに含む。

【0135】

[0152] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７タンパク質は、ＩＬ－７受容体に結合して、細胞におけるＩＬ－７シグナル伝達を活性化することができ、ＩＬ－７受容体は、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞を含むがこれらに限定されない、様々な細胞型で発現する。

【0136】

[0153] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７タンパク質のＩＬ－７受容体への結合は、細胞の増殖又は活性化をもたらす。

【0137】

[0154] 改変インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質が本明細書に開示される。

【0138】

[0155] いくつかの実施形態において、改変インターロイキン（ＩＬ）タンパク質は、以下の表７に記載のアミノ酸置換を含む。

【0139】

[0156] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－１５サブユニットにおけるアミノ酸置換は、アミノ酸位置３、４、１１、７２、７９、及び１１２からなる群から選択されるアミノ酸位置の置換を含み、アミノ酸位置は、配列番号３０に対して相対的である。

【0140】

[0157] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３でのアミノ酸置換は、Ｖ３Ｉ、Ｖ３Ｍ、又はＶ３Ｒである。

【0141】

[0158] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置４でのアミノ酸置換は、Ｎ４Ｈである。

【0142】

[0159] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１１でのアミノ酸置換は、Ｋ１１Ｌ、Ｋ１１Ｍ、又はＫ１１Ｒである。

【0143】

[0160] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置７２でのアミノ酸置換は、Ｎ７２Ｄ、Ｎ７２Ｒ又はＮ７２Ｙである。

【0144】

[0161] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置７９でのアミノ酸置換は、Ｎ７９Ｅ又はＮ７９Ｓである。

【0145】

[0162] いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１１２でのアミノ酸置換は、Ｎ１１２Ｈ、Ｎ１１２Ｍ、又はＮ１１２Ｙである。

【0146】

[0163] いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の改変インターロイキンタンパク質をコードする核酸構築物を提供する。

【0147】

[0164] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－１５タンパク質は、Ｎ末端ヒスチジンタグをさらに含む。

【0148】

[0165] いくつかの実施形態において、改変されたＩＬ－１５タンパク質は、ＩＬ－１５受容体に結合して、細胞内のＩＬ－１５シグナル伝達を活性化できる。

【0149】

[0166] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－１５タンパク質のＩＬ－１５受容体への結合は、細胞の増殖又は活性化をもたらし、ＩＬ－７受容体は、樹状細胞、単球、及び上皮細胞に発現される。

【0150】

[0167] いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の改変ＩＬ－７タンパク質又は改変ＩＬ－１５とともに、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞の増殖及び持続性を改善する方法を提供する。

【0151】

[0168] いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の改変ＩＬ－７タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞において内部シグナル伝達を開始する方法を提供し、改変ＩＬ－７タンパク質は、ＩＬ－７受容体に結合し；改変ＩＬ－７タンパク質の結合は、細胞内の内部シグナル伝達を開始する。

【0152】

[0169] いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の改変ＩＬ－１５タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞において内部シグナル伝達を開始する方法を提供し、改変ＩＬ－１５タンパク質は、ＩＬ－１５受容体に結合し；改変ＩＬ－１５タンパク質の結合は、細胞内の内部シグナル伝達を開始する。

【0153】

[0170] いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の改変ＩＬ－７タンパク質又は改変ＩＬ－１５タンパク質とともに、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を、それを必要とする患者に投与することを含む、対象の癌を処置する方法を提供する。

【0154】

[0171] いくつかの実施形態において、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ－ＮＫ細胞から選択される。

【0155】

[0172] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７タンパク質及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞が、薬剤と同時に投与される。

【0156】

[0173] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７タンパク質及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞は、抗体、すなわち、抗ＣＤ４７抗体と共に投与される。

【0157】

[0174] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－１５タンパク質及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞が、薬剤と同時に投与される。

【0158】

[0175] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７タンパク質及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞は、抗体、すなわち、抗ＣＤ４７抗体と共に投与される。

【0159】

[0176] 疾患の処置のための免疫エフェクター細胞の集団、例えば、ＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞、ＩＬ－７タンパク質又はＩＬ－１５タンパク質などのインターロイキンタンパク質を含む、組み合わせ治療、キット、及び組み合わせ治療に向けられた方法も本明細書に開示される。

【0160】

[0177] いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－７バリアント、又はその類似体は、そのような免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は他のＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞の増殖を刺激するためにインビボで養子細胞移植治療を受けている患者に投与され得る。

【0161】

[0178] いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質、ＩＬ－１５バリアント、又はその類似体は、そのような免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞又は他のＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞の増殖を刺激するためにインビボで養子細胞移植治療を受けている患者に投与され得る。

【0162】

[0179] いくつかの実施形態において、疾患は、過剰増殖性の疾患又は障害、例えば、癌であり得る。癌は、血液悪性腫瘍又は固形腫瘍であり得る。血液悪性腫瘍は、多発性骨髄腫及び／又はＴ細胞悪性腫瘍であり得る。Ｔ細胞悪性腫瘍は、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）及び／又は非ホジキンリンパ腫であり得る。固形腫瘍又は血液悪性腫瘍。固形腫瘍は、子宮頸癌、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫、又は肺癌であり得る。

【0163】

[0180] いくつかの実施形態において、本開示は、ＩＬ－７タンパク質、ＩＬ－７バリアント、又はそれらの類似体と組み合わせた使用のためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞の集団を含むキットを含み、キットは、本明細書に開示される任意の方法による説明書をさらに含む。

【0164】

ＩＬ－７及びＩＬ－７類似体
[0181] 改変／変異体インターロイキン－７（ＩＬ－７）タンパク質が本明細書に開示される。そのような改変ＩＬ－７タンパク質はまた、ＩＬ－７タンパク質がＩＬ－７の１つ以上の生物学的活性例えば、ＩＬ－７Ｒに結合することができること、例えば、初期のＴ細胞の発達を誘導すること、Ｔ細胞の恒常性を促進すること、を含む限り、本明細書において、変異体ＩＬ－７タンパク質（例えば、ＩＬ－７バリアント、ＩＬ－７機能的フラグメント、ＩＬ－７誘導体、又はそれらの任意の組み合わせ、例えば、融合タンパク質、キメラタンパク質など）と呼ばれる。El Kassar and Gress.J Immunotoxicol.2010 Mar; 7(1):1-7を参照。

【0165】

[0182] 抗ＣＤ４７抗体と天然及び／又は改変ＩＬ－７タンパク質との組み合わせ、及び組み合わせにおける使用が、本明細書に開示される。

【0166】

[0183] 免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ－ＮＫ細胞などのＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞と、天然及び／又は改変ＩＬ－７タンパク質との組み合わせ及び組み合わせにおける使用も本明細書に開示される。このような組み合わせは、養子細胞移植治療を受けている患者のＣＡＲ－Ｔ細胞及び他のＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞の増殖を刺激する。

【0167】

[0184] ＩＬ－７は、胸腺間質性リンホポエチン（ＴＳＬＰ）（Ziegler and Liu, 2006）と共有される２本の鎖ＩＬ－７Ｒα（ＣＤ１２７）と、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－９、及びＩＬ－２１の共通γ鎖（γｃ、ＣＤ１３２）とから構成される受容体に結合する。γｃは大半の造血細胞で発現する一方、ＩＬ－７Ｒαはリンパ系細胞でほぼ独占的に発現する。その受容体に結合した後、ＩＬ－７は２つの異なる経路：それぞれ分化及び生存率に関与する、Ｊａｋ－Ｓｔａｔ（ヤヌスキナーゼ－シグナル伝達物質及び転写活性化因子）及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、を介してシグナルを伝達する。抗ＩＬ－７中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を投与されたマウス；Grabstein et al., 1993）、ＩＬ－７－／－（von Freeden-Jeffry et al., 1995）、ＩＬ－７Ｒα－／－（Peschon et al., 1994；Maki et al., 1996）、γｃ－／－（Malissen et al., 1997）、及びＪａｋ３－／－マウス（Park et al., 1995）で観察されるように、ＩＬ－７シグナル伝達の不存在は、胸腺細胞性の低下に関与する。ＩＬ－７シグナル伝達の不存在下では、マウスはＴ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞を欠く。ＩＬ－７α－／－マウス（Peschon et al., 1994）は、ＩＬ－７－／－マウス（von Freeden-Jeffry et al., 1995）と同様であるが、より重症の表現型を示す。これは、ＴＳＬＰシグナル伝達がＩＬ－７α－／－マウスでも抑制されているからである可能性がある。ＩＬ－７は、γδ細胞（Maki et al., 1996）及びＮＫ－Ｔ細胞（Boesteanu et al., 1997）の発達に必要である。

【0168】

[0185] いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質は、配列番号８～１６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質は、配列番号８～１６の配列に対し、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の、又はそれを超える、配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0169】

[0186] いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質は、改変ＩＬ－７又はそのフラグメントを含み、改変ＩＬ－７又はフラグメントは、野生型ＩＬ－７の１つ以上の生物学的活性を保持する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質は、ヒト、ラット、マウス、サル、ウシ、又はヒツジに由来し得る。

【0170】

[0187] いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ－７は、配列番号１（Genbankアクセッション番号P13232）によって表されるアミノ酸配列を有し得る。

【0171】

[0188] いくつかの実施形態において、本開示は、アミノ酸置換を含む改変インターロイキン（ＩＬ）タンパク質を提供する。「改変ＩＬ－７」などの「改変インターロイキン」は、本明細書において、変異体ＩＬ－７などの変異体インターロイキンと呼ばれることもあり、改変又は変異体インターロイキンタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。改変又は変異体インターロイキンタンパク質は、改変インターロイキンが細胞内のシグナル伝達経路を活性化するように、天然の非改変インターロイキンタンパク質の活性を保持する。

【0172】

[0189] 本明細書に記載されるように、本開示に従って有用なアミノ酸置換は、任意のアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７は、単一のアミノ酸置換を有し得るか、又は２つ、３つ、４つ、又はそれを超える数のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態において、特定のアミノ酸は、同様の特性を有する別のアミノ酸に置換され得る、すなわち、極性アミノ酸は、別の極性アミノ酸に置換され、又は非極性アミノ酸は、別の非極性アミノ酸に置換され得る。いくつかの実施形態において、本開示に有用なアミノ酸置換は、表７に示される置換であり得る。

【0173】

[0190] いくつかの実施形態において、改変され得るか、又は変異が導入され得るインターロイキンタンパク質は、例えば、ＩＬ－７であり得る。いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７タンパク質は、ＩＬタンパク質の天然の受容体に結合することができてもよい。例えば、本明細書に記載の改変ＩＬ－７タンパク質は、天然のＩＬ－７受容体に結合して、細胞内のＩＬ－７シグナル伝達を活性化し得る。

【0174】

[0191] いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改変ＩＬ－７におけるアミノ酸置換は、アミノ酸位置１０、１１、１４、１９、８１、及び８５からなる群から選択されるアミノ酸位置における置換を含み得、アミノ酸位置は、配列番号２に対して相対的である。例えば、いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１０でのアミノ酸置換は、Ｋ１０Ｉ、Ｋ１０Ｍ、又はＫ１０Ｖであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１１でのアミノ酸置換は、Ｑ１１Ｒであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１４でのアミノ酸置換は、Ｓ１４Ｔであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１９でのアミノ酸置換は、Ｓ１９Ｑであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置８１でのアミノ酸置換は、Ｋ８１Ｍ又はＫ８１Ｒであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置８５でのアミノ酸置換は、Ｇ８５Ｍであり得る。

【0175】

[0192] いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改変ＩＬ－７は、天然ＩＬ－７と同様又は実質的に同様の活性又は機能を保持する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改変ＩＬ－７は、細胞において内部シグナル伝達を開始することができる。いくつかの実施形態において、細胞における内部シグナル伝達は、細胞の増殖又は活性化をもたらす。

【0176】

[0193] 本発明によると、本明細書に記載されるような改変ＩＬ－７をコードする核酸も提供される。そのような核酸は、細菌（すなわち、大腸菌（E. coli）細胞）又は真核生物宿主細胞（すなわち、哺乳動物細胞）などの任意の適切な宿主に導入され、複製され、発現され得る。改変ＩＬ－７をコードする核酸は、宿主細胞における産生のためにベクターで提供され得る。そのようなベクターは、宿主細胞における発現及び複製に適切に必要な任意の要素を有し得る。そのような要素、及びそれらの使用のための方法は、当技術分野で周知であり、利用可能である。

【0177】

[0194] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７タンパク質は、タンパク質タグの添加によってさらに改変され得る。タンパク質のタグ付け及び関連する方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－７は、Ｃ末端又はＮ末端のいずれか、又は両方に、ヒスチジンタグを含むように操作され得る。例えば、本明細書に記載の改変ＩＬ－７タンパク質は、Ｃ末端ヒスチジンタグを有するように改変され得る。

【0178】

[0195] いくつかの実施形態において、ＩＬ－７又はそのバリアントは、特定のアミノ酸位置における変異を含み得る。いくつかの実施形態において、変異体ＩＬ－７は、アミノ酸位置１０、１１、１４、１９、８１、及び８５の１つ以上にアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態において、変異体ＩＬ－７は、アミノ酸位置１０、１１、１４、１９、８１、及び８５の２つ以上にアミノ酸置換を有し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＩＬ－７バリアント又は変異体は、表７に記載のアミノ酸置換を有し得る。

【0179】

[0196] いくつかの実施形態において、ＩＬ－７は、ＩＬ－７の生物学的活性を有するポリペプチド及び１～１０個のアミノ酸からなるオリゴペプチドを含む構造を有し得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－７は、配列番号８～１６から選択されるアミノ酸配列を有し得る。さらに、ＩＬ－７タンパク質は、配列番号８～１６のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、及び少なくとも約９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0180】

[0197] いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質は、ＩＬ－７タンパク質をコードする核酸分子によってコードされる。核酸分子は、配列番号８～１６から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするもの、又はそれらの配列に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の相同性を有するものであり得る。核酸分子は、配列番号８～１６から選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれらの配列に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の相同性を有するものを含み得る。核酸分子は、シグナル配列又はリーダー配列をさらに含み得る。

【0181】

[0198] いくつかの実施形態において、中央の疎水性領域は、４～１２の疎水性残基を含み、これは、未成熟ポリペプチドの転座中に膜脂質二重層を介してシグナル配列を固定化する。開始後、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼとして知られる細胞酵素によってＥＲの内腔内で頻繁に切断される可能性がある。特に、シグナル配列は、組織プラスミノーゲン活性化（ｔＰａ）の分泌シグナル配列、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ＨＳＶ ｇＤ）のシグナル配列、又は成長ホルモンであり得る。好ましくは、哺乳動物などを含む高等真核細胞で使用される分泌シグナル配列が使用され得る。さらに、いくつかの実施形態において、分泌シグナル配列として、野生型ＩＬ－７に含まれるシグナル配列を使用してもよく、又は宿主細胞において高い発現頻度を有するコドンで置換した後に使用してもよい。

【0182】

[0199] 本開示に有用なＩＬ－７タンパク質は、いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターによってコードされ得る。発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Invitrogen, Carlsbad）又はそのバリアントであり得る。発現ベクターは、哺乳動物細胞における標的遺伝子の連続転写を促進するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及び転写後のＲＮＡの安定状態を増加させるためのウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル配列を含み得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ＲｃＣＭＶの改変形態であるｐＡＤ１５である。

【0183】

[0200] 本開示に有用なＩＬ－７タンパク質は、いくつかの実施形態において、発現ベクターを含む宿主細胞によって発現され得る。ＤＮＡ配列の形質導入又はトランスフェクションによる、標的タンパク質の発現及び／又は分泌のために適切な宿主細胞を使用することができる。

【0184】

[0201] いくつかの実施形態において、使用される適切な宿主細胞の例は、不死ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト羊膜液由来細胞（Ｃａｐ Ｔ細胞）又はＣＯＳ細胞を含み得る。

【0185】

[0202] いくつかの実施形態において、本開示に有用なＩＬ－７タンパク質は、発現ベクターによって形質転換された細胞を培養すること、及び培養物又は培養プロセスから得られた細胞からＩＬ－７タンパク質を回収することによって作製することができる。

【0186】

[0203] いくつかの実施形態において、本開示に有用なＩＬ－７タンパク質は、培地又は細胞抽出物から精製され得る。例えば、組換えタンパク質が分泌された培地の上清を得た後、上清を、商業市場で入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外ろ過ユニットで濃縮され得る。次に、濃縮物は、当技術分野で公知の方法によって精製され得る。例えば、精製は、プロテインＡに結合したマトリックスを使用して実施され得る。

【0187】

[0204] いくつかの実施形態において、本開示に有用なＩＬ－７タンパク質は、ＩＬ－７の活性又はその同様の活性を有するポリペプチドのＮ末端への、メチオニン、グリシン、セリン又はそれらの組み合わせからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列のリンカーを含むことによって調製することができる。

【0188】

[0205] リンカーがペプチドリンカーである場合、いくつかの実施形態において、結合は任意の連結領域で発生し得る。それらは、当技術分野で公知の架橋剤を使用して結合することができる。いくつかの実施形態において、架橋剤の例は、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、４－アジドサリチル酸などのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル；３，３’－ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）などのジスクシンイミジルエステルを含むイミドエステル、及びビス－Ｎマレイミド－１，８－オクタンなどの二官能性マレイミドを含み得るが、これらに限定されない。

【0189】

[0206] さらに、いくつかの実施形態において、リンカーは、アルブミンリンカーであり得る。

【0190】

[0207] リンカーが化学結合によって形成される場合、化学結合は、ジスルフィド結合、ジアミン結合、スルフィド－アミン結合、カルボキシ－アミン結合、エステル結合、及び共有結合であり得る。

【0191】

[0208] 上記の調製方法は、不均質な配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＩＬ－７タンパク質と連結するステップをさらに含み得る。特に、不均質な配列からなるポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその一部、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣＴＰ、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ、ＨＥＳ、アルブミン結合小分子、及びそれらの組み合わせから選択される任意の１つであり得る。

【0192】

[0209] ＩＬ－７タンパク質は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせて投与され得る。

【0193】

[0210] ＩＬ－７タンパク質は、免疫エフェクター細胞、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞、特に、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の増殖又は生存を促進するために投与され得る。

【0194】

[0211] 本開示に有用なＩＬ－７タンパク質は、いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体をさらに含む。薬学的に許容される担体は、患者への送達に適した任意の非毒性物質であり得る。担体は、蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス、又は不活性固体であり得る。さらに、任意の薬学的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）もその中に含まれ得る。

【0195】

[0212] さらに、ＩＬ－７タンパク質を含有する医薬組成物は、様々な方法によって対象に投与され得る。また、ＩＬ－７タンパク質及び抗ＣＤ４７モノクローナル抗体並びにその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物は、様々な方法によって対象に投与され得る。例えば、組成物は、非経口的に、例えば、皮下、筋肉内、又は静脈内、例えば、筋肉内に投与され得る。組成物は、従来の滅菌方法によって滅菌され得る。組成物は、薬学的に許容される補助物質、及びｐＨ調整などの生理学的状態の調節に必要なアジュバント、毒性調整剤、及びそれらの類似体を含み得る。具体的な例は、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み得る。製剤に含まれるＩＬ－７タンパク質の濃度は、大きく異なり得る。例えば、ＩＬ－７タンパク質の濃度は、体重に応じて、約０．５％未満、一般的には、又は少なくとも、約１％から１５％～２０％であり得る。濃度は、選択された特定の投与方法、流体量、粘度などに基づいて選択され得る。

【0196】

[0213] 本方法は、治療有効量のＩＬ－７タンパク質を抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせて、対象疾患に関連する、又は関連しない健康状態を有する、それを必要とする対象に投与することを含む。対象は哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。

【0197】

[0214] 組成物は適切な経路で投与され得る。組成物は、適切な手段を介した直接投与（例えば、注射、移植、又は組織領域への局所投与により局所的に）又はシステム（例えば、非経口又は経口）によって提供され得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質は、静脈内、皮下、眼内、腹腔内、筋肉内、経口、直腸内、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内、脳室内、髄腔内、大槽内（intracistenally）、嚢内、鼻腔内、又はエアロゾル投与で投与することができる。他の実施形態では、組成物は、体液の水性懸濁液若しくは生理学的に許容される懸濁液又はその溶液の一部を含むように製剤化される。したがって、生理学的に許容される担体又は輸送体を組成物に添加し、患者に送達することができ、これは、患者の電解質及び／又は体積バランスに悪影響を及ぼさない。したがって、生理学的に許容される担体又は輸送体は、生理食塩水であり得る。抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントは、注射又は注入によって、典型的には静脈内に投与される。

【0198】

[0215] 所望のタンパク質の機能を再構成又は補完するために、特定の細胞において融合タンパク質を発現することができる発現ベクターが、任意の生物学的に有効な担体とともに投与され得る。これは、所望のタンパク質又はＩＬ－７融合タンパク質をコードする遺伝子をインビボで細胞に効率的に送達することができる任意の製剤又は組成物であり得る。

【0199】

[0216] 改変ＩＬ－７又はＩＬ－７融合タンパク質の単位用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。一実施形態において、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントとの組み合わせ治療で使用される治療有効量のＩＬ－７タンパク質は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。別の実施形態において、ヒトに対する治療有効量のタンパク質は、０．０２ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、例えば、２０μｇ／ｋｇ～６００μｇ／ｋｇ、例えば、６０μｇ／ｋｇ～６００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質の治療有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態において、ＩＬ－７タンパク質の治療有効量は、約２０μｇ／ｋｇ、約６０μｇ／ｋｇ、約１２０μｇ／ｋｇ、約２４０μｇ／ｋｇ、約４８０μｇ／ｋｇ、又は約６００μｇ／ｋｇである。他の実施形態において、ＩＬ－７タンパク質の治療有効量は、約０．２５ｍｇ、約１ｍｇ、約３ｍｇ、約６ｍｇ、又は約９ｍｇのほぼ固定用量である。他の実施形態において、ＩＬ－７タンパク質の治療有効量は、固定用量である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質の治療有効量は、約０．２５ｍｇ～約９ｍｇ、例えば、約０．２５ｍｇ、約１ｍｇ、約３ｍｇ、約６ｍｇ、又は約９ｍｇである。いくつかの実施形態において、治療有効量は、処置の対象となる疾患及び有害効果の存在に応じて変化し得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質の投与は、定期的なボーラス注射又は外部リザーバー（例えば、静脈内バッグ）によって、又は内部からの連続的な静脈内、皮下、又は腹腔内投与（例えば、生体腐食性インプラント）によって実施され得る。

【0200】

[0217] 特定の実施形態において、ＩＬ－７タンパク質は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、又は少なくとも１０週間の投与間隔で投与される。

【0201】

[0218] 他の実施形態において、ＩＬ－７タンパク質は、反復投与することができる。他の実施形態において、ＩＬ－７タンパク質は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、又は少なくとも１０回投与される。

【0202】

[0219] 特定の実施形態において、ＩＬ－７タンパク質は、例えば、約３ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌのＩＬ－７タンパク質、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約５ｗ／ｖ％のスクロース、約１～２ｗ／ｖ％のソルビトール又はマンニトール、及び約０．０５ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８０又はｐＨ約５．０のポロキサマーで製剤化することができる。

【0203】

[0220] [0158] いくつかの実施形態において、ＩＬ－７タンパク質及び抗ＣＤ４７抗体、又はそれらの抗原結合フラグメントは、予防又は処置される疾患に対して予防又は処置効果を有する他の薬剤又は生理学的に活性な物質と組み合わせて投与することができ、又は他の薬剤と組み合わせて組み合わせ調製物に製剤化してもよく、例えば、造血成長因子、サイトカイン、抗原、及びアジュバントなどの免疫刺激剤と組み合わせて投与してもよい。造血成長因子は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、又はＦｌｔ－３リガンドであり得る。サイトカインは、γインターフェロン、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＲＡＮＴＥＳ、又はＢ７－１であり得る。

【0204】

ＩＬ－１５及びＩＬ－１５類似体
[0221] 改変／変異体インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）タンパク質が本明細書に開示される。そのような改変ＩＬ－１５タンパク質はまた、ＩＬ－１５タンパク質がＩＬ－１５の１つ以上の生物学的活性、例えば、ＩＬ－１５Ｒに結合することができること、例えば、初期のＴ細胞の成長を誘導すること、Ｔ細胞の恒常性を促進すること、を含む限り、本明細書において、変異体ＩＬ－１５タンパク質（例えば、ＩＬ－１５バリアント、ＩＬ－１５変異体、ＩＬ－１５機能的フラグメント、ＩＬ－１５誘導体、又はそれらの任意の組み合わせ、例えば、融合タンパク質、キメラタンパク質など）と呼ばれる。

【0205】

[0222] 抗ＣＤ４７抗体と天然及び／又は改変ＩＬ－７タンパク質との組み合わせ、及び組み合わせにおける使用が、本明細書に開示される。

【0206】

[0223] 免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ－ＮＫ細胞などのＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞と、天然及び／又は改変ＩＬ－１５タンパク質との組み合わせ及び組み合わせにおける使用も本明細書に開示される。このような組み合わせは、養子細胞移植治療を受けている患者のＣＡＲ－Ｔ細胞及び他のＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞の増殖を刺激する。

【0207】

[0224] いくつかの実施形態において、本開示は、アミノ酸置換を含む改変インターロイキン（ＩＬ）タンパク質を提供する。「改変ＩＬ－１５」などの「改変インターロイキン」は、本明細書において、変異体ＩＬ－１５などの変異体インターロイキンと呼ばれることもあり、改変又は変異体インターロイキンタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る。改変又は変異体インターロイキンタンパク質は、改変インターロイキンが細胞内のシグナル伝達経路を活性化するように、天然の非改変インターロイキンタンパク質の活性を保持する。

【0208】

[0225] 本明細書に記載されるように、本開示に従って有用なアミノ酸置換は、任意のアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－１５は、単一のアミノ酸置換を有し得るか、又は２つ、３つ、４つ、又はそれを超える数のアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態において、特定のアミノ酸は、同様の特性を有する別のアミノ酸に置換され得る、すなわち、極性アミノ酸は、別の極性アミノ酸に置換され、又は非極性アミノ酸は、別の非極性アミノ酸に置換され得る。いくつかの実施形態において、本開示に有用なアミノ酸置換は、表７に示される置換であり得る。

【0209】

[0226] ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５Ｒα鎖、ＩＬ－１５Ｒβ鎖（ＣＤ１２２）、及びＩＬ－７Ｒと共有される共通γ鎖で構成される受容体に結合する。スシドメインと呼ばれるさらなる領域を有するＩＬ－１５Ｒα鎖の異常な構造のために、ＩＬ－１５Ｒαは、他の全てのサイトカイン受容体と比較して、ＩＬ－１５に対して特に高い親和性を有する。スシドメイン受容体（ＩＬ－１５Ｒα）に対する作用は、ＳＴＡＴ－３、ＳＴＡＴ－５、及びＳＴＡＴ－６核因子をリン酸化するＪａｋ１及びＪａｋ３キナーゼを介して細胞に伝達され、いくらかのマイトジェン活性化キナーゼ（ＭＡＰＫ）の助けとともに、細胞核におけるＩＬ－１５依存性遺伝子の転写を促進する。

【0210】

[0227] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－１５タンパク質は、ＩＬタンパク質の天然の受容体に結合することができる可能性がある。例えば、本明細書に記載の改変ＩＬ－１５タンパク質は、天然のＩＬ－１５受容体に結合して、細胞内のＩＬ－１５シグナル伝達を活性化し得る。

【0211】

[0228] ＩＬ－１５は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及びサイトカイン産生、並びにエフェクターメモリーＴ細胞の分化及びアポトーシスに対する感受性を誘導する。ＩＬ－１５Ｒαは、例えばリンパ球系細胞、樹状細胞（ＤＣ）、線維芽、上皮、肝臓、腸、及びその他の細胞によって、広く発現され、ＩＬ－１５β及びγ鎖を発現する細胞にトランスでＩＬ－１５を提示すると考えられている。

【0212】

[0229] いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改変ＩＬ－１５は、天然ＩＬ－１５と同様又は実質的に同様の活性又は機能を保持する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改変ＩＬ－１５は、細胞において内部シグナル伝達を開始することができる。いくつかの実施形態において、細胞における内部シグナル伝達は、細胞の増殖又は活性化をもたらす。

【0213】

[0230] いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、配列番号３１～４５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、配列番号１７～３１の配列に対し、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％の、又はそれを超える、配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0214】

[0231] いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、改変ＩＬ－１５又はそのフラグメントを含み、改変ＩＬ－１５又はフラグメントは、野生型ＩＬ－１５の１つ以上の生物学的活性を保持する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、ヒト、ラット、マウス、サル、ウシ、又はヒツジに由来し得る。

【0215】

[0232] いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ－１５は、配列番号２９（Genbankアクセッション番号P40933）によって表されるアミノ酸配列を有し得る。

【0216】

[0233] 本発明によると、本明細書に記載されるような改変ＩＬ－１５をコードする核酸も提供される。そのような核酸は、細菌（すなわち、大腸菌（E. coli）細胞）又は真核生物宿主細胞（すなわち、哺乳動物細胞）などの任意の適切な宿主に導入され、複製され、発現され得る。改変ＩＬ－１５をコードする核酸は、宿主細胞における産生のためにベクターで提供され得る。そのようなベクターは、宿主細胞における発現及び複製に適切に必要な任意の要素を有し得る。そのような要素、及びそれらの使用のための方法は、当技術分野で周知であり、利用可能である。

【0217】

[0234] いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－１５タンパク質は、タンパク質タグの添加によってさらに改変され得る。タンパク質のタグ付け及び関連する方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態において、改変ＩＬ－１５は、Ｃ末端又はＮ末端のいずれか、又は両方に、ヒスチジンタグを含むように操作され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改変ＩＬ－１５タンパク質は、Ｎ末端ヒスチジンタグを有するように改変され得る。

【0218】

[0235] いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５又はそのバリアントは、特定のアミノ酸位置における変異を含み得る。いくつかの実施形態において、変異体ＩＬ－１５は、アミノ酸位置３、４、１１、７２、７９、及び１１２の１つ以上にアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態において、変異体ＩＬ－１５は、アミノ酸位置３、４、１１、７２、７９、及び１１２の２つ以上にアミノ酸置換を有し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５バリアント又は変異体は、表７に記載のアミノ酸置換を有し得る。

【0219】

[0236] いくつかの実施形態において、本明細書に記載の改変ＩＬ－１５におけるアミノ酸置換は、アミノ酸位置３、４、１１、７２、７９、及び１１２からなる群から選択されるアミノ酸位置における置換を含み得、アミノ酸位置は、配列番号３０に対して相対的である。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３でのアミノ酸置換は、Ｖ３Ｉ、Ｖ３Ｍ、又はＶ３Ｒであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置４でのアミノ酸置換は、Ｎ４Ｈであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１１でのアミノ酸置換は、Ｋ１１Ｌ、Ｋ１１Ｍ、又はＫ１１Ｒであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置７２でのアミノ酸置換は、Ｎ７２Ｄ、Ｎ７２Ｒ又はＮ７２Ｙであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置７９でのアミノ酸置換は、Ｎ７９Ｅ又はＮ７９Ｓであり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１１２でのアミノ酸置換は、Ｎ１１２Ｈ、Ｎ１１２Ｍ、又はＮ１１２Ｙである。当業者は、本開示に従って有益であり得るアミノ酸置換を同定することができるであろう。

【0220】

[0237] いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５の生物学的活性を有するポリペプチド及び１～１０個のアミノ酸からなるオリゴペプチドを含む構造を有し得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５は、配列番号３１～４５から選択されるアミノ酸配列を有し得る。さらに、ＩＬ－１５タンパク質は、配列番号３１～４５のアミノ酸配列に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、及び少なくとも約９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0221】

[0238] いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、ＩＬ－１５タンパク質をコードする核酸分子によってコードされる。核酸分子は、配列番号３１～４５から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするもの、又はそれらの配列に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の相同性を有するものであり得る。核酸分子は、配列番号３１～４５から選択されるポリヌクレオチド配列、又はそれらの配列に対し、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の相同性を有するものを含み得る。核酸分子は、シグナル配列又はリーダー配列をさらに含み得る。

【0222】

[0239] いくつかの実施形態において、中央の疎水性領域は、４～１２の疎水性残基を含み、これは、未成熟ポリペプチドの転座中に膜脂質二重層を介してシグナル配列を固定化する。開始後、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼとして知られる細胞酵素によってＥＲの内腔内で頻繁に遮断される可能性がある。特に、シグナル配列は、組織プラスミノーゲン活性化（ｔＰａ）の分泌シグナル配列、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ＨＳＶ ｇＤ）のシグナル配列、又は成長ホルモンであり得る。好ましくは、哺乳動物などを含む高等真核細胞で使用される分泌シグナル配列が使用され得る。さらに、いくつかの実施形態において、分泌シグナル配列として、野生型ＩＬ－１５に含まれるシグナル配列を使用してもよく、又は宿主細胞において高い発現頻度を有するコドンで置換した後に使用してもよい。

【0223】

[0240] 本開示に有用なＩＬ－１５タンパク質は、いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターによってコードされ得る。発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Invitrogen, Carlsbad）又はそのバリアントであり得る。発現ベクターは、哺乳動物細胞における標的遺伝子の連続転写を促進するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、及び転写後のＲＮＡの安定状態を増加させるためのウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル配列を含み得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ＲｃＣＭＶの改変形態であるｐＡＤ１５である。

【0224】

[0241] 本開示に有用なＩＬ－１５タンパク質は、いくつかの実施形態において、発現ベクターを含む宿主細胞によって発現され得る。ＤＮＡ配列の形質導入又はトランスフェクションによる、標的タンパク質の発現及び／又は分泌のために適切な宿主細胞を使用することができる。

【0225】

[0242] いくつかの実施形態において、使用される適切な宿主細胞の例は、不死ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト羊膜液由来細胞（Ｃａｐ Ｔ細胞）又はＣＯＳ細胞を含み得る。

【0226】

[0243] いくつかの実施形態において、本開示に有用なＩＬ－１５タンパク質は、発現ベクターによって形質転換された細胞を培養すること、及び培養物又は培養プロセスから得られた細胞からＩＬ－１５タンパク質を回収することによって作製することができる。

【0227】

[0244] いくつかの実施形態において、本開示に有用なＩＬ－１５タンパク質は、培地又は細胞抽出物から精製され得る。例えば、組換えタンパク質が分泌された培地の上清を得た後、上清を、商業市場で入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon限外ろ過ユニットで濃縮され得る。次に、濃縮物は、当技術分野で公知の方法によって精製され得る。例えば、精製は、プロテインＡに結合したマトリックスを使用して実施され得る。

【0228】

[0245] いくつかの実施形態において、本開示に有用なＩＬ－１５タンパク質は、メチオニン、グリシン、又はそれらの組み合わせからなる１～１０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列のオリゴペプチドを、ＩＬ－１５の活性又はその同様の活性を有するポリペプチドのＮ末端に連結することを含むことによって調製することができる。

【0229】

[0246] リンカーがペプチドリンカーである場合、いくつかの実施形態において、結合は任意の連結領域で発生し得る。それらは、当技術分野で公知の架橋剤を使用して結合することができる。いくつかの実施形態において、架橋剤の例は、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン、グルタルアルデヒド、４－アジドサリチル酸などのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル；３，３’－ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）などのジスクシンイミジルエステルを含むイミドエステル、及びビス－Ｎマレイミド－１，８－オクタンなどの二官能性マレイミドを含み得るが、これらに限定されない。

【0230】

[0247] さらに、いくつかの実施形態において、リンカーは、アルブミンリンカーであり得る。

【0231】

[0248] リンカーが化学結合によって形成される場合、化学結合は、ジスルフィド結合、ジアミン結合、スルフィド－アミン結合、カルボキシ－アミン結合、エステル結合、及び共有結合であり得る。

【0232】

[0249] 上記の調製方法は、不均質な配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをＩＬ－１５タンパク質と連結するステップをさらに含み得る。特に、不均質な配列からなるポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域又はその一部、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣＴＰ、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ、ＨＥＳ、アルブミン結合小分子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される任意の１つであり得る。

【0233】

[0250] ＩＬ－１５タンパク質は、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせて投与され得る。

【0234】

[0251] ＩＬ－１５タンパク質は、免疫エフェクター細胞、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞、特に、操作されたＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ－ＮＫ細胞の増殖又は生存を促進するために投与され得る。

【0235】

[0252] 本開示に有用なＩＬ－１５タンパク質は、いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体をさらに含む。薬学的に許容される担体は、患者への送達に適した任意の非毒性物質であり得る。担体は、蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス、又は不活性固体であり得る。さらに、任意の薬学的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）もその中に含まれ得る。

【0236】

[0253] さらに、ＩＬ－１５タンパク質を含有する医薬組成物は、様々な方法によって対象に投与され得る。また、ＩＬ－１５タンパク質及び抗ＣＤ４７モノクローナル抗体並びにその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物は、様々な方法によって対象に投与され得る。例えば、組成物は、非経口的に、例えば、皮下、筋肉内、又は静脈内、例えば、筋肉内に投与され得る。組成物は、従来の滅菌方法によって滅菌され得る。組成物は、薬学的に許容される補助物質、及びｐＨ調整などの生理学的状態の調節に必要なアジュバント、毒性調整剤、及びそれらの類似体を含み得る。具体的な例は、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み得る。製剤に含まれるＩＬ－１５タンパク質の濃度は、大きく異なり得る。例えば、ＩＬ－１５タンパク質の濃度は、体重に応じて、約０．５％未満、一般的には、又は少なくとも、約１％から１５％～２０％であり得る。濃度は、選択された特定の投与方法、流体量、粘度などに基づいて選択され得る。

【0237】

[0254] 本方法は、治療有効量のＩＬ－１５タンパク質を抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせて、対象疾患に関連する、又は関連しない健康状態を有する、それを必要とする対象に投与することを含む。対象は哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。

【0238】

[0255] 組成物は適切な経路で投与され得る。組成物は、適切な手段を介した直接投与（例えば、注射、移植、又は組織領域への局所投与により局所的に）又はシステム（例えば、非経口又は経口）によって提供され得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、静脈内、皮下、眼内、腹腔内、筋肉内、経口、直腸内、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内、脳室内、髄腔内、大槽内（intracistenally）、嚢内、鼻腔内、又はエアロゾル投与で投与することができる。他の実施形態では、組成物は、体液の水性懸濁液若しくは生理学的に許容される可能な懸濁液又はその溶液の一部を含むように製剤化される。したがって、生理学的に許容される担体又は輸送体を組成物に添加し、患者に送達することができ、これは、患者の電解質及び／又は体積バランスに悪影響を及ぼさない。したがって、生理学的に許容される担体又は輸送体は、生理食塩水であり得る。抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントは、注射又は注入によって、典型的には静脈内に投与される。

【0239】

[0256] 所望のタンパク質の機能を再構成又は補完するために、特定の細胞において融合タンパク質を発現することができる発現ベクターが、任意の生物学的に有効な担体とともに投与され得る。これは、所望のタンパク質又はＩＬ－１５融合タンパク質をコードする遺伝子をインビボで細胞に効率的に送達することができる任意の製剤又は組成物であり得る。

【0240】

[0257] 改変ＩＬ－１５又はＩＬ－１５融合タンパク質の単位用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。一実施形態において、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントとの組み合わせ治療で使用される治療有効量のＩＬ－１５タンパク質は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～２ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。別の実施形態において、ヒトに対する治療有効量のタンパク質は、０．０２ｍｇ／ｋｇ～１ｍｇ／ｋｇ、例えば、２０μｇ／ｋｇ～６００μｇ／ｋｇ、例えば、６０μｇ／ｋｇ～６００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質の治療有効量は、約１０ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質の治療有効量は、約２０μｇ／ｋｇ、約６０μｇ／ｋｇ、約１２０μｇ／ｋｇ、約２４０μｇ／ｋｇ、約４８０μｇ／ｋｇ、又は約６００μｇ／ｋｇである。他の実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質の治療有効量は、約０．２５ｍｇ、約１ｍｇ、約３ｍｇ、約６ｍｇ、又は約９ｍｇのほぼ固定用量である。他の実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質治療有効量は、固定用量である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質の治療有効量は、約０．２５ｍｇ～約９ｍｇ、例えば、約０．２５ｍｇ、約１ｍｇ、約３ｍｇ、約６ｍｇ、又は約９ｍｇである。いくつかの実施形態において、治療有効量は、処置の対象となる疾患及び有害効果の存在に応じて変化し得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質の投与は、定期的なボーラス注射又は外部リザーバー（例えば、静脈内バッグ）によって、又は内部からの連続的な静脈内、皮下、又は腹腔内投与（例えば、生体腐食性インプラント）によって実施され得る。

【0241】

[0258] 特定の実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、又は少なくとも１０週間の投与間隔で投与される。

【0242】

[0259] 他の実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、反復投与することができる。他の実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、又は少なくとも１０回投与される。

【0243】

[0260] 特定の実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質は、例えば、約３ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌのＩＬ－１５タンパク質、約２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約５ｗ／ｖ％のスクロース、約１～２ｗ／ｖ％のソルビトール又はマンニトール、及び約０．０５ｗ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８０又はｐＨ約５．０のポロキサマーで製剤化することができる。

【0244】

[0261] いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５タンパク質及び抗ＣＤ４７抗体、又はそれらの抗原結合フラグメントは、予防又は処置される疾患に対して予防又は処置効果を有する他の薬剤又は生理学的に活性な物質と組み合わせて投与することができ、又は他の薬剤と組み合わせて組み合わせ調製物に製剤化してもよく、例えば、造血成長因子、サイトカイン、抗原、及びアジュバントなどの免疫刺激剤と組み合わせて投与してもよい。造血成長因子は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、又はＦｌｔ－３リガンドであり得る。サイトカインは、γインターフェロン、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＲＡＮＴＥＳ、又はＢ７－１であり得る。

【0245】

ＣＤ４７抗体
[0262] 多くのヒトの癌はＣＤ４７の細胞表面発現をアップレギュレートし、最高レベルのＣＤ４７を発現する癌は、患者にとって最も高悪性度で最も致死的であるように思われる。ＣＤ４７発現の増加は、ＣＤ４７保有細胞の食作用を防ぐ阻害性受容体であるＳＩＲＰαを介してマクロファージに「私を食べるな」というシグナルを送ることにより、癌細胞を食細胞クリアランスから保護すると考えられている（Oldenborg et al.Science 288:2051-2054, 2000；Jaiswal et al.(2009) Cell 138(2):271-85l；Chao et al.(2010) Science Translational Medicine 2(63):63ra94）。したがって、多くの癌によるＣＤ４７発現の増加は、マクロファージ及び樹状細胞による食細胞クリアランスを遅くする「利己」の隠れ蓑を提供する。

【0246】

[0263] ＣＤ４７を遮断し、ＳＩＲＰαへの結合を防ぐ抗体は、マウス（異種移植）腫瘍モデルにおいてヒト腫瘍で有効性を示している。この特性を示すこのようなブロッキング抗ＣＤ４７ｍＡｂは、腫瘍の負担を軽減することができるマクロファージによる癌細胞の食作用を増加させ（Majeti et al.(2009) Cell 138 (2):286-99；US 9,045,541；Willingham et al.(2012) Proc Natl Acad.Sci.USA 109(17):6662-6667；Xiao et al.(2015) Cancer Letters 360:302-309；Chao et al.(2012) Cell 142:699-713；Kim et al.(2012) Leukemia 26:2538-2545）、最終的には腫瘍に対する適応免疫応答の生成につながり得る（Tseng et al.(2013) Proc Natl Acad.Sci.USA 110 (27):11103-11108；Soto-Pantoja et al.(2014) Cancer Res.74 (23):6771-6783；Liu et al.(2015) Nat.Med.21 (10):1209-1215）。

【0247】

[0264] しかし、抗ＣＤ４７ ｍＡｂが、癌の処置にまだ利用されていない形質転換細胞を攻撃できるメカニズムが存在する。複数のグループが、特定の抗ヒトＣＤ４７ｍＡｂがヒト腫瘍細胞の細胞死を誘導することを示している。抗ＣＤ４７ｍＡｂ Ａｄ２２は、複数のヒト腫瘍細胞株の細胞死を誘導する（Pettersen et al.J. Immuno.166:4931-4942, 2001；Lamy et al.J. Biol.Chem.278:23915-23921, 2003）。ＡＤ２２は、初期のホスファチジルセリン曝露及びミトコンドリア膜電位の低下を伴う急速なミトコンドリア機能障害及び急速な細胞死を示すことが示された（Lamy et al.J. Biol.Chem.278:23915-23921, 2003）。抗ＣＤ４７ｍＡｂ ＭＡＢＬ－２及びそのフラグメントは、ヒト白血病細胞株の細胞死を誘導するが、インビトロで正常細胞を誘導せず、インビボ異種移植モデルで抗腫瘍効果を示した。（Uno et al.(2007) Oncol.Rep. 17 (5):1189-94）。抗ヒトＣＤ４７ｍＡｂ １Ｆ７は、ヒトＴ細胞白血病（Manna and Frazier (2003) J. Immunol.170:3544-53）及びいくつかの乳癌（Manna and Frazier (2004) Cancer Research 64 (3):1026-36）の細胞死を誘導する。１Ｆ７は、補体の作用又はＮＫ細胞、Ｔ細胞、又はマクロファージによる細胞性死滅の作用なしに、ＣＤ４７保有腫瘍細胞を死滅させる。代わりに、抗ＣＤ４７ ｍＡｂ １Ｆ７は、ミトコンドリアへの直接ＣＤ４７依存性攻撃を伴う非アポトーシスメカニズムを介して作用し、それらの膜電位を放電し、細胞のＡＴＰ生成能力を破壊して急速な細胞死をもたらす。抗ＣＤ４７ｍＡｂ １Ｆ７もＳＩＲＰαのＣＤ４７への結合を遮断すること（Rebres et al et al.J. Cellular Physiol.205:182-193, 2005）は注目に値し、したがって、これは２つのメカニズム：（１）直接腫瘍毒性、及び（２）癌細胞の食作用惹起、を介して作用することができる。両方の機能を達成できる単一のｍＡｂは、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαの結合のみを遮断するｍＡｂよりも優れている場合がある。

【0248】

[0265] 本開示は、改変／変異体ＩＬ－７又は改変／変異ＩＬ－１５タンパク質と組み合わせた、当技術分野で公知の抗ＣＤ４７ｍＡｂ、及び米国特許第１０，２３９，９４５号及び米国特許出願公開第２０１８０１４２０１９号に記載されるような特徴的な機能プロファイルを有する抗ＣＤ４７ｍＡｂを含む。本明細書に記載されるこれらの抗ＣＤ４７ｍＡｂは、１）ＣＤ４７の１つ以上の種のホモログとの交差反応性を示す；２）ＣＤ４７とそのリガンドＳＩＲＰαの間の相互作用を遮断する；３）ヒト腫瘍細胞の食作用を増加させる；４）感受性の高いヒト腫瘍細胞の死を誘導する；５）ヒト腫瘍細胞の細胞死を誘発しない；６）ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）への結合が減少している；７）ｈＲＢＣへの検出可能な結合を有しない；８）ｈＲＢＣの凝集を減少させる；９）ｈＲＢＣの検出可能な凝集を引き起こさない；１０）一酸化窒素（ＮＯ）経路のＴＳＰ１阻害を逆転させる、及び／又は１１）ＮＯ経路のＴＳＰ１阻害を逆転させない、から選択される特性の１つ以上の異なる組み合わせを有する。

【0249】

[0266] 別の実施形態において、抗ＣＤ４７抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の組み合わせを含むものであり、組み合わせは、以下から選択される。
[0267] （ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖；
[0268] （ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖；
[0269] （ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖；
[0270] （ｉｖ）配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖；
[0271] （ｖ）配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖；並びに
[0272] （ｖｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖

【0250】

[0273] >Vx9humH12全長ＨＣ
[0274]

【化1】

【0251】

[0275] >Vx9humH14全長重鎖
[0276]

【化2】

【0252】

[0277] >Vx9humH15全長重鎖
[0278]

【化3】

【0253】

[0279] >Vx9humH16全長重鎖
[0280]

【化4】

【0254】

[0281] >Vx9humL02全長軽鎖
[0282]

【化5】

【0255】

[0283] >Vx9humL07全長軽鎖
[0284]

【化6】

【0256】

抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質
[0285] 本明細書に開示される抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質は、それぞれヒトカッパ又は任意のヒトＦｃ Ｉｇ定常ドメインと組み合わされた、ヒト重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。抗体軽鎖又は抗体重鎖のＣ又はＮ末端のいずれかにあるグリシン－セリンリンカー（Ｇ４Ｓ）_ｎは、ＩＬ－７（野生型又は変異体）を抗体ポリペプチドに連結するように設計された。これらの融合構築物は、分泌シグナルを組み込むように設計され、哺乳動物の発現システムにクローン化され、抗体融合タンパク質を生成するためにＣＨＯ細胞にトランスフェクトされた。タンパク質バリアントが発現され、培地に分泌され、プロテインＡレジンを使用して精製された。

【0257】

[0286] ヒト化マウスのモデルは、抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質の有効性を決定するために利用することができる。このヒト化マウスモデルは、ヒトＣＤ４７及びヒトＳＩＲＰを発現するため、ＳＩＲＰ／ＣＤ４７系は抗ＣＤ４７抗体によって遮断される。このヒト化マウスモデルは同系モデルであり、腫瘍の有効性に対するＩＬ－７の寄与の評価を可能にするインタクトな免疫系が存在する。

【0258】

[0287] 二重ヒト化マウスモデルであるＢ－ｈＳＩＲＰα／ｈＣＤ４７では、ＳＩＲＰα及びＣＤ４７のヒト細胞外ドメインによってそれぞれのマウス対応物が置換される。ホモ接合性のＢ－ｈＳＩＲＰα／ｈＣＤ４７マウスはヒト化を発現するが、野生型マウスのＳＩＲＰα及びＣＤ４７は発現しない。これらのマウスを使用すると、適応免疫応答の役割の評価とともに、ヒト特異的ＣＤ４７ｍＡｂの評価が可能になる。腫瘍モデルの例は、ＭＣ３８結腸癌細胞でヒトＣＤ４７を発現するＭＣ３８－ｈＣＤ４７細胞株であり得る。試験中、抗ヒトＣＤ４７及び抗ヒトＳＩＲＰα抗体は、Ｂ－ｈＳＩＲＰα／ｈＣＤ４７マウスにおけるＭＣ３８－ｈＣＤ４７腫瘍増殖の制御に有効であった。

【0259】

[0288] 別の例において、マウスにヒト免疫系を移植することができる。これにより、異種移植腫瘍の移植が可能になり得、抗腫瘍効果に対するＡＯ－１７６及びＩＬ－７の寄与が評価される。

【0260】

[0289] ＮＳＧマウスは、骨髄破壊処置後、適格な供給源からのヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋幹細胞を使用した養子移入によってヒト化される。ＣＤ３４＋幹細胞は、免疫不全ＮＳＧマウス内に生着するヒト免疫細胞に発達する。臍帯血由来の造血幹細胞（ＨＳＣ）を移植したモデルは、多系統の移植を発達させ、強力なＴ細胞成熟及びＴ細胞依存性炎症反応を示す。

【0261】

[0290] 最後に、試験でマウス特異的ｃｄ４７－ＩＬ７融合を利用できる同系モデルを開発することができる。

【0262】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞
[0291] 本明細書に開示されるのは、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ－ＮＫ細胞などのＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞を伴う改変／変異体ＩＬ－７又は改変／変異体ＩＬ－１５タンパク質、及びＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞と組み合わせた使用が本明細書に提供される。次のセクションでは、改変／変異体ＩＬ－７及びＩＬ－１５タンパク質で使用されるＣＡＲ保有免疫エフェクター細胞の例を説明する。

【0263】

[0292] ＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞である。本明細書で使用される「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という句は、抗原が細胞外ドメインに結合すると特殊な機能を実行するように細胞に指示する細胞内ドメインに結合した抗原特異的細胞外ドメインを有する組換え融合タンパク質を指す。「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、及び「キメラ免疫受容体」という用語はそれぞれ、本明細書において「キメラ抗原受容体」という用語と互換可能に使用され得る。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣに依存しない抗原に結合し、細胞内ドメインを介して活性化シグナルを伝達する能力によって、他の抗原結合剤と区別される。ＣＡＲの細胞外及び細胞内の部分については、以下でより詳しく説明する。

【0264】

[0293] キメラ抗原受容体の抗原特異的細胞外ドメインは、抗原、典型的には悪性腫瘍の表面発現抗原を認識し、特異的に結合する。抗原特異的細胞外ドメインは、例えば、約０．１ｐＭ～約１０Ｍ、好ましくは約０．１ｐＭ～約１Ｍ、より好ましくは約０．１ｐＭ～約１００ｎＭの間の親和性定数又は相互作用の親和性（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合する場合に、抗原に特異的に結合する。相互作用の親和性を決定するための方法は、当技術分野で公知である。本開示のＣＡＲにおける使用に適した抗原特異的細胞外ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであり得、その多種多様なものが当技術分野で公知である。本開示のＣＡＲにおける使用に適した抗原特異的細胞外ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであり得、その多種多様なものが当技術分野で公知である。いくつかの場合において、抗原結合ドメインは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の抗体ベースの認識ドメイン（ｃＡｂ ＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）及びそのヒト化バージョン、ｌｇＮＡＲ ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びそのヒト化バージョン、ｓｄＡｂ ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）及び「ラクダ化」抗体可変ドメインは、使用に適している。いくつかの場合において、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、Ｖ．アルファ．Ｖ．ベータを含む単鎖２ドメインＴＣＲ）などのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメインも使用に適している。

【0265】

[0294] 適切な抗原には、Ｔ細胞に特異的な抗原及び／又はＴ細胞に特異的でない抗原が含まれ得る。１つの好ましい実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞のキメラ抗原受容体によって特異的に結合される抗原、及びＣＡＲ－Ｔ細胞が欠損している抗原は、悪性Ｔ細胞上に発現される抗原であり、より好ましくは、非悪性Ｔ細胞と比較して悪性Ｔ細胞で過剰発現している抗原である。「悪性Ｔ細胞」は、Ｔ細胞悪性腫瘍に由来するＴ細胞である。「Ｔ細胞悪性腫瘍」という用語は、Ｔ細胞前駆細胞、成熟Ｔ細胞、又はナチュラルキラー細胞に由来する悪性腫瘍の広範で高度に不均質なグループを指す。Ｔ細胞悪性腫瘍の非限定的な例には、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）白血病、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ－１＋）成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、並びに血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、ＡＬＫ陽性未分化大細胞リンパ腫、及びＡＬＫ陰性未分化大細胞リンパ腫を含むがこれらに限定されない、様々な末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）が含まれる。

【0266】

[0295] 適切なＣＡＲ抗原はまた、多発性骨髄腫細胞、すなわち、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９などの悪性形質細胞の表面に見られる抗原を含み得る。

【0267】

[0296] 或いは、ＣＡＲは、多発性骨髄腫の処置のためにＢＣＭＡ及びＴＡＣＩの両方を効果的に同時標的化する、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩのリガンドであるＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分を発現するように設計され得る。

【0268】

[0297] 例えば、非限定的な例として、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ３８、及びＣＤ１９は、悪性Ｔ細胞上で発現される抗原であり得る。いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ２に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３εに特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ４に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ５に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。さらにいくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ７に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。さらにいくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＲＡＣに特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。さらにいくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＴＣＲβに特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。さらにいくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＣＭＡに特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。さらにいくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＳ１に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。さらにいくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ３８に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。さらにいくつかの実施形態において、本開示のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＤ１９に特異的に結合するキメラ抗原受容体の細胞外ドメインを含む。

【0269】

[0298] 本開示のキメラ抗原受容体はまた、抗原特異的細胞外ドメインに抗原が結合すると、Ｔ細胞に細胞内シグナルを提供する細胞内ドメインを含む。本開示のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体が発現されるＴ細胞のエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与している。

【0270】

[0299] 「細胞内ドメイン」という用語は、抗原が細胞外ドメインに結合するとエフェクター機能シグナルを伝達し、Ｔ細胞に特殊な機能を実行するように指示するＣＡＲの部分を指す。適切な細胞内ドメインの非限定的な例には、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖又はそのホモログ（例えば、イータ、デルタ、ガンマ、又はイプシロン）のいずれか、ＭＢ １鎖、８２９、ＦｃＲＩＩＩ、ＦｃＲＩ、並びにＣＤ３．ゼータ．及びＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ ＢＢ、ＤＡＰ－１ ０、ＯＸ４０などのシグナル伝達分子の組み合わせ、並びにそれらの組み合わせ、並びに他の同様の分子及びフラグメントが含まれる。ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩなどの活性化タンパク質のファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分が使用され得る。通常、細胞内ドメイン全体が使用されるが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用できる範囲で、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、そのような短縮部分をインタクトな鎖の代わりに使用することができる。したがって、細胞内ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。典型的には、抗原特異的細胞外ドメインは、膜貫通ドメインによってキメラ抗原受容体の細胞内ドメインに連結されている。膜貫通ドメインは細胞膜を横断し、ＣＡＲをＴ細胞表面に固定し、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに接続して、Ｔ細胞表面でのＣＡＲの発現に影響を与える。キメラ抗原受容体はまた、１つ以上の共刺激ドメイン及び／又は１つ以上のスペーサーをさらに含み得る。共刺激ドメインは、インビボでのサイトカイン産生、増殖、細胞毒性、及び／又は持続性を増強する共刺激タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。「ペプチドヒンジ」は、抗原特異的な細胞外ドメインを膜貫通ドメインに結合する。膜貫通ドメインは、共刺激ドメインに融合され、任意選択により、共刺激ドメインは、第２の共刺激ドメインに融合され、共刺激ドメインは、ＣＤ３ζに限定されないシグナル伝達ドメインに融合される。例えば、抗原特異的細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、及びタンデムＣＡＲの場合は複数のｓｃＦｖの間にスペーサードメインを含めると、抗原結合ドメインの柔軟性に影響を与え、それにより、ＣＡＲ機能に影響を与え得る。適切な膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びスペーサーが当技術分野で公知である。同様の方法で、他のモノＣＡＲ－Ｔ細胞が構築され得る。

【0271】

[0300] 本開示に包含されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１つ以上の抗原を欠いており、したがって、フラトリサイド耐性である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の１つ以上の抗原は、キメラ抗原受容体がもはや１つ以上の改変抗原に特異的に結合しないように改変される。例えば、キメラ抗原受容体によって認識される１つ以上の抗原のエピトープは、１つ以上のアミノ酸変化（例えば、置換又は欠失）によって改変され得るか、又はエピトープは、抗原から欠失され得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原の発現は、Ｔ細胞において、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又はそれを超えて減少する。タンパク質の発現を減少させるための方法は当技術分野で公知であり、タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを改変又は置換することが含まれるが、これらに限定されない。さらにいくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、例えば、１つ以上の抗原をコードする遺伝子の欠失又は破壊によって、１つ以上の抗原が発現されないように改変される。上記の各実施形態において、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体が特異的に結合する１つ又は好ましくは全ての抗原を欠損している可能性がある。１つ以上の抗原を欠損するようにＴ細胞を遺伝子改変するための方法は、当技術分野で公知である。例示的な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９遺伝子編集は、１つ以上の抗原を欠損するようにＴ細胞を改変するために使用することができる。

【0272】

[0301] 本開示に包含されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）－ＣＤ３複合体の一部を欠失させた結果として、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達をさらに欠損している可能性がある。様々な実施形態において、本明細書に開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞における内因性ＴＣＲシグナル伝達を排除又は抑制することが望ましい場合がある。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞の内因性ＴＣＲシグナル伝達を減少させ、又は排除すると、同種異系Ｔ細胞を使用してＣＡＲ－Ｔ細胞を産生する場合、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防又は低減し得る。内因性ＴＣＲシグナル伝達を排除又は抑制するための方法は当技術分野で公知であり、ＴＣＲ－ＣＤ３受容体複合体、例えば、ＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）、ＴＣＲ受容体ベータ鎖（ＴＲＢＣ）、ＣＤ３．イプシロン、ＣＤ３．ガンマ、ＣＤ３．デルタ、及び／又はＣＤ３．ガンマ、の一部を欠失させることを含むがこれに限定されない。ＴＣＲ受容体複合体の一部が欠失すると、ＴＣＲを介したシグナル伝達が遮断され、重篤なＧｖＨＤを誘発することなく、ＣＡＲ－Ｔ細胞の供給源として同種異系Ｔ細胞を安全に使用できるようになり得る。

【0273】

[0302] 或いは、又はさらに、本開示に包含されるＣＡＲ－Ｔ細胞は、１つ以上の自殺遺伝子をさらに含み得る。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」は、活性化されるとＣＡＲ－Ｔ細胞の死をもたらす、当技術分野で公知の標準的な方法によってＣＡＲ－Ｔ細胞に導入される核酸配列を指す。自殺遺伝子は、必要に応じて、インビボでのＣＡＲ－Ｔ細胞の効果的な追跡及び排除を促進し得る。自殺遺伝子を活性化することによる死滅の促進は、当技術分野で公知の方法によって行われ得る。当技術分野で公知の適切な自殺遺伝子治療システムには、様々な単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）／ガンシクロビル（ＧＣＶ）自殺遺伝子治療システム又は誘導性カスパーゼ９タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。例示的な実施形態において、自殺遺伝子は、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ自殺遺伝子である。

【0274】

[0303] ゲノム編集されたデュアルＣＡＲ－Ｔ細胞、すなわちＣＤ２^＊ＣＤ３ｅ－ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＣＤ３εは、商業的に合成された抗ＣＤ２単鎖可変フラグメントを、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代ＣＡＲバックボーンを含むレンチウイルスベクターにクローニングすること、及び商業的に合成された抗ＣＤ３ｅ単鎖可変を、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する追加の第３世代ＣＡＲバックボーンを含む同じレンチウイルスベクターにクローニングして、２つのＣＡＲ構築物が同じベクターから発現されるプラスミドを得ることによって産生され得る。

【0275】

[0304] いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合するデュアルキメラ抗原受容体（ｄＣＡＲ）、すなわち、単一のレンチウイルス構築物から発現された２つのＣＡＲを含む、操作されたＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＴＲＡＣを欠損している（例えば、ＣＤ５^＊ＴＲＡＣ－ｄＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＲＡＣ細胞）。非限定的な例において、ＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が改変されたＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないような、Ｔ細胞によって発現されるＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の改変、（ｂ）ＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれを超えて減少するような、Ｔ細胞の改変、（ｃ）ＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）が発現されない（例えば、ＣＤ５及び／又はＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失又は破壊によって）ような、Ｔ細胞の改変に起因する。さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、ＣＤ５^＊ＴＲＡＣ－ＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＲＡＣ細胞で発現される自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ｅＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合された改変ヒト単純ヘルペスウイルス－１－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする。

【0276】

[0305] 第２の実施形態において、本開示は、ＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合するｄＣＡＲを損なう操作されたＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＴＲＡＣを欠損している（例えば、ＣＤ７^＊ＴＲＡＣ－ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＲＡＣ細胞）。非限定的な例において、ＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が改変されたＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないような、Ｔ細胞によって発現されるＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の改変、（ｂ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれを超えて減少するような、Ｔ細胞の改変、（ｃ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）が発現されない（例えば、ＣＤ７及び／又はＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失又は破壊によって）ような、Ｔ細胞の改変に起因する。さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、ＣＤ７^＊ＴＲＡＣ－ｄＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＲＡＣ細胞で発現される自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ｅＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合された改変ヒト単純ヘルペスウイルス－１－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする。

【0277】

[0306] 第３の実施形態において、本開示は、ＣＤ２及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合するｄＣＡＲを損なう操作されたＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＴＲＡＣを欠損している（例えば、ＣＤ２^＊ＴＲＡＣ－ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＴＲＡＣ細胞）。非限定的な例において、ＣＤ２及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が改変されたＣＤ２及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないような、Ｔ細胞によって発現されるＣＤ２及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の改変、（ｂ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれを超えて減少するような、Ｔ細胞の改変、（ｃ）ＣＤ２及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）が発現されない（例えば、ＣＤ２及び／又はＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失又は破壊によって）ような、Ｔ細胞の改変に起因する。さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、ＣＤ２^＊ＴＲＡＣ－ｄＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＴＲＡＣ細胞で発現される自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ｅＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合された改変ヒト単純ヘルペスウイルス－１－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする。

【0278】

[0307] 同様の方法で、他のデュアルＣＡＲ－Ｔ細胞が構築され得る。

【0279】

[0308] タンデムＣＡＲ－Ｔ細胞（同等に、ｔＣＡＲ－Ｔ）は、異なる標的に対する親和性を有する２つの異なる抗原認識ドメインを含む単一のキメラ抗原ポリペプチドを有するＴ細胞であり、抗原認識ドメインは、ペプチドリンカーを介して連結され、共通の共刺激ドメインを共有しており、いずれかの抗原認識ドメインの結合は、共通の共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインを介してシグナル伝達する。

【0280】

[0309] いくつかの実施形態において、本開示は、ＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合するタンデムキメラ抗原受容体（ｔＣＡＲ）、すなわち、単一の細胞内ドメインを共有する２つのｓｃＦｖを含む操作されたＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＴＲＡＣを欠損している（例えば、ＣＤ５^＊ＴＲＡＣ－ｔＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＲＡＣ細胞）。非限定的な例において、ＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が改変されたＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないような、Ｔ細胞によって発現されるＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の改変、（ｂ）ＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれを超えて減少するような、Ｔ細胞の改変、（ｃ）ＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）が発現されない（例えば、ＣＤ５及び／又はＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失又は破壊によって）ような、Ｔ細胞の改変に起因する。さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、ＣＤ５^＊ＴＲＡＣ－ｔＣＡＲＴΔＣＤ５ΔＴＲＡＣ細胞で発現される自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ｅＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合された改変ヒト単純ヘルペスウイルス－１－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする。

【0281】

[0310] 第２の実施形態において、本開示は、ＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合するｔＣＡＲを損なう操作されたＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ７及びＴＲＡＣを欠損している（例えば、ＣＤ７^＊ＴＲＡＣ－ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＲＡＣ細胞）。非限定的な例において、ＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が改変されたＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないような、Ｔ細胞によって発現されるＣＤ５及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の改変、（ｂ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれを超えて減少するような、Ｔ細胞の改変、（ｃ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）が発現されない（例えば、ＣＤ７及び／又はＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失又は破壊によって）ような、Ｔ細胞の改変に起因する。さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、ＣＤ７^＊ＴＲＡＣ－ｔＣＡＲＴΔＣＤ７ΔＴＲＡＣ細胞で発現される自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ｅＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合された改変ヒト単純ヘルペスウイルス－１－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする。

【0282】

[0311] 第３の実施形態において、本開示は、ＣＤ２及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）に特異的に結合するｔＣＡＲを損なう操作されたＴ細胞を提供し、Ｔ細胞は、ＣＤ２及びＴＲＡＣを欠損している（例えば、ＣＤ２^＊ＴＲＡＣ－ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＴＲＡＣ細胞）。非限定的な例において、ＣＤ２及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が改変されたＣＤ２及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）にもはや特異的に結合しないような、Ｔ細胞によって発現されるＣＤ２及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の改変、（ｂ）ＣＤ７及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）の発現が、Ｔ細胞で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれを超えて減少するような、Ｔ細胞の改変、（ｃ）ＣＤ２及びＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）が発現されない（例えば、ＣＤ２及び／又はＴＣＲ受容体アルファ鎖（ＴＲＡＣ）をコードする遺伝子の欠失又は破壊によって）ような、Ｔ細胞の改変に起因する。さらなる実施形態において、Ｔ細胞は、自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、ＣＤ２^＊ＴＲＡＣ－ｔＣＡＲＴΔＣＤ２ΔＴＲＡＣ細胞で発現される自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ｅＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合された改変ヒト単純ヘルペスウイルス－１－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする。

【0283】

[0312] 同様の方法で、他のタンデムＣＡＲ－Ｔ細胞が構築され得る。

【0284】

[0313] 特定の実施形態において、本開示は、ＣＤ７に特異的に結合する単一のＣＡＲを含む、操作されたｉＮＫＴ細胞を提供し、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ７を欠損している（例えば、ＣＤ７－ｉＮＫＴ－ＣＡＲΔＣＤ７細胞）。非限定的な例において、ＣＤ７の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が改変されたＣＤ７にもはや特異的に結合しないような、ｉＮＫＴ細胞によって発現されるＣＤ７の改変、（ｂ）ＣＤ７の発現が、ｉＮＫＴ細胞で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれを超えて減少するような、ｉＮＫＴ細胞の改変、（ｃ）ＣＤ７が発現されない（例えば、ＣＤ７をコードする遺伝子の欠失又は破壊によって）ような、ｉＮＫＴ細胞の改変に起因する。さらなる実施形態において、ｉＮＫＴ細胞は、自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、ＣＤ７－ｉＮＫＴ－ＣＡＲΔＣＤ７細胞で発現される自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合された改変ヒト単純ヘルペスウイルス－１－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする。

【0285】

[0314] ＣＤ７特異的ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞のＣＡＲは、商業的に合成された抗ＣＤ７単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をＣＤ２８及び４－１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代ＣＡＲバックボーンにクローニングすることによって生成され得る。細胞外ｈＣＤ３４ドメインをＰ２Ａペプチドの後に追加して、ウイルス形質導入後のＣＡＲの検出と、抗ｈＣＤ３４磁気ビーズを用いた精製との両方を可能にし得る。ＣＡＲを他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なものにするために同様の方法に従うことができる。

【0286】

[0315] 同様の方法で、他のモノＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞が構築され得る。

【0287】

[0316] 特定の実施形態において、本開示は、デュアルＣＡＲ（ｄＣＡＲ）、すなわち、ＣＤ７及びＣＤ２に特異的に結合する単一のレンチウイルス構築物から発現される２つのＣＡＲを含む、操作されたｉＮＫＴ細胞を提供し、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ２が欠損している（例えば、ＣＤ７ｘＣＤ２－ｉＮＫＴ－ｄＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞）。非限定的な例において、ＣＤ７及びＣＤ２の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が改変されたＣＤ７又はＣＤ２にもはや特異的に結合しないような、ｉＮＫＴ細胞によって発現されるＣＤ７及びＣＤ２の改変、（ｂ）ＣＤ７及びＣＤ２の発現が、ｉＮＫＴ細胞で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれを超えて減少するような、ｉＮＫＴ細胞の改変、（ｃ）ＣＤ７及びＣＤ２が発現されない（例えば、ＣＤ７及び／又はＣＤ２をコードする遺伝子の欠失又は破壊によって）ような、ｉＮＫＴ細胞の改変に起因する。さらなる実施形態において、ｉＮＫＴ細胞は、自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、ＣＤ７^＊ＣＤ２－ｉＮＫＴ－ｄＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞で発現される自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合された改変ヒト単純ヘルペスウイルス－１－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする。同様の方法で、他のデュアルＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞が構築され得る。

【0288】

[0317] 特定の実施形態において、本開示は、タンデムＣＡＲ（ｔＣＡＲ）、すなわち、ＣＤ７及びＣＤ２に特異的に結合する単一の細胞内ドメインを共有する２つのｓｃＦｖを含む、操作されたｉＮＫＴ細胞を提供し、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ７及びＣＤ２が欠損している（例えば、ＣＤ７ｘＣＤ２－ｉＮＫＴ－ｔＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞）。非限定的な例において、ＣＤ７及びＣＤ２の欠損は、（ａ）キメラ抗原受容体が改変されたＣＤ７又はＣＤ２にもはや特異的に結合しないような、ｉＮＫＴ細胞によって発現されるＣＤ７及びＣＤ２の改変、（ｂ）ＣＤ７及びＣＤ２の発現が、ｉＮＫＴ細胞で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又はそれを超えて減少するような、ｉＮＫＴ細胞の改変、（ｃ）ＣＤ７及びＣＤ２が発現されない（例えば、ＣＤ７及び／又はＣＤ２をコードする遺伝子の欠失又は破壊によって）ような、ｉＮＫＴ細胞の改変に起因する。さらなる実施形態において、ｉＮＫＴ細胞は、自殺遺伝子を含む。非限定的な例では、ＣＤ７^＊ＣＤ２－ｉＮＫＴ－ｔＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２細胞で発現される自殺遺伝子は、ヒトＣＤ３４ｃＤＮＡの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにインフレームで融合された改変ヒト単純ヘルペスウイルス－１－チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子をコードする。

【0289】

[0318] ゲノム編集されたタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞、すなわちＣＤ７^＊ＣＤ２－ｉＮＫＴ－ｔＣＡＲΔＣＤ７ΔＣＤ２、のｔＣＡＲは、商業的に合成された抗ＣＤ７単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及び抗ＣＤ２単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を、ＣＤ２８及び４－１ＢＢ内部シグナル伝達ドメインを有する第３世代ＣＡＲバックボーンにクローニングすることによって生成され得る。細胞外ｈＣＤ３４ドメインをＰ２Ａペプチドの後に追加して、ウイルス形質導入後のＣＡＲの検出と、抗ｈＣＤ３４磁気ビーズを用いた精製との両方を可能にし得る。ＣＡＲを他の悪性Ｔ細胞抗原に特異的なものにするために同様の方法に従うことができる。

【0290】

[0319] 同様の方法で、他のタンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲが構築され得る。

【0291】

[0320] ＣＡＲは、国際公開第２０１８０２７０３６号Ａ１に開示されているように設計され得、任意選択により、当業者に公知のバリエーションが使用される。レンチウイルスベクター及び細胞株を入手し、そこに開示されているように、並びに当技術分野で公知の方法及び商業的供給源からの方法によって、設計、検証、及び合成されたＲＮＡを導くことができる。

【0292】

[0321] 操作されたＣＡＲは、レトロウイルスを使用してＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞、又はＮＫ細胞に導入され得、レトロウイルスは、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を標的細胞ゲノムに効率的且つ安定的に組み込む。当技術分野で公知の他の方法には、レンチウイルス形質導入、トランスポゾンベースのシステム、直接ＲＮＡトランスフェクション、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ Ｏｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１ ０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６などの適切なＣａｓタンパク質を使用した、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型システム）が含まれるが、これらに限定されない。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）も使用され得る。例えば、Shearer RF and Saunders DN, “Experimental design for stable genetic manipulation in mammalian cell lines: lentivirus and alternatives,” Genes Cells 2015 Jan;20(1):1-10を参照されたい。

【0293】

定義
[0322] 本明細書で使用される場合、以下の用語は示された意味を有する。他の定義は、明細書全体を通して行われ得る。

【0294】

[0323] 値の範囲が開示され、「ｎ１から…ｎ２まで」又は「ｎ１…及びｎ２の間」という表記が使用される場合であって、ｎ１及びｎ２が数値である場合、別段の指定がない限り、この表記はその数値自体及びそれらの間の範囲を含むことを意図している。この範囲は、端の値を含むその間の整数又は連続値であり得る。例として、「２～６個の炭素」の範囲は、２つ、３つ、４つ、５つ、及び６つの炭素を含むことを意図している。これは、炭素が整数単位であるためである。例として、「１～３μＭ（マイクロモル濃度）」の範囲を比較する。これは、１μＭ、３μＭ、及び任意の数の有効数字間の全て（例えば、１．２５５μＭ、２．１μＭ、２．９９９９μＭなど）を含むことが意図される。

【0295】

[0324] 本明細書で使用される場合、「約」という用語は、それが修飾する数値を形容することを意図しており、そのような値を誤差の範囲内の変数として示す。データのチャート又は表で与えられる平均値に対する標準偏差などの、特定の許容誤差が記載されていない場合、「約」という用語は、有効数字を考慮して、記載された値を包含する範囲、及びその数値に切り上げ又は切り捨てることによって含まれる範囲を意味すると理解されるべきである。

【0296】

[0325] 本明細書で使用される場合、「ＣＤ４７」、「インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）」、「卵巣癌抗原ＯＡ３」、「Ｒｈ関連抗原」及び「ＭＥＲＧ」という用語は同義であり、互換可能に使用され得る。

【0297】

[0326] 「抗ＣＤ４７抗体」という用語は、治療剤としての使用を目的とし、治療剤として有用であるために必要な結合親和性を有する、本開示の抗体を指す。

【0298】

[0327] 本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。「特異的に結合する」又は「免疫反応する」とは、抗体が所望の抗原の１つ以上の抗原決定基と反応し、他のポリペプチドと反応しないか又ははるかに低い親和性（Ｋｄ＞１０^－６）で結合することを意味する。抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント、及び片腕抗体が含まれるが、これらに限定されない。

【0299】

[0328] 本明細書で使用される場合、本抗体化合物に適用される「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、例えば、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む、単一のコピー又はクローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法に由来するものではない。本開示のｍＡｂは、好ましくは、均質又は実質的に均質な集団に存在する。完全なｍＡｂには、２つの重鎖及び２つの軽鎖が含まれる。

【0300】

[0329] 「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。

【0301】

[0330] 本明細書に開示される場合、「抗体化合物」は、ｍＡｂ及びその抗原結合フラグメントを指す。本開示による同様の機能特性を示すさらなる抗体化合物は、従来の方法によって生成することができる。例えば、マウスをヒトＣＤ４７又はそのフラグメントで免疫し、得られた抗体を回収及び精製することができ、それらが本明細書に開示される抗体化合物と同様／同一の結合及び機能特性を有するかどうかの決定は、当技術分野で公知の方法によって評価することができる。抗原結合フラグメントは、従来の方法でも調製できる。抗体及び抗原結合フラグメントを産生及び精製するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, Chapters 5-8 and 15に見出すことができる。

【0302】

[0331] 本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」、「Ｆｃフラグメント」、又は「Ｆｃ」という用語は、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ_２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ_３）を含むが、重鎖及び軽鎖の可変領域並びに軽鎖定常領域（ＣＬ_１）を含まず、重鎖定常領域のヒンジ領域をさらに含み得るタンパク質を指す。ハイブリッドＦｃ又はそのハイブリッドＦｃフラグメントは、「ｈＦｃ」又は「ｈｙＦｃ」と呼ばれ得る。コンセプト。

【0303】

[0332] 本明細書で使用される場合、「ヒト化された」及び／又は「ヒト化」という用語は、本明細書に開示されるマウスモノクローナル抗体ＣＤＲのヒトフレームワーク（ＦＲ）及び定常領域への移植を指す。これらの用語には、様々な抗体特性を改善するための、Kashmiri et al.(2005) Methods 36(1):25-34及びHou et al.(2008) J. Biochem.144(1):115-120に開示される方法による、マウスＣＤＲ及びヒトＦＲへの可能なさらなる改変も包含される。

【0304】

[0333] 本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、本開示による結合及び機能特性を有し、非ヒト抗体に由来する実質的にヒト又は完全にヒトの周辺ＣＤＲであるＦＲ及び定常領域を有する、本明細書に開示される抗ＣＤ４７抗体化合物を含む、ｍＡｂ及びその抗原結合フラグメントを指す。

【0305】

[0334] 本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、原発性悪性細胞又は腫瘍（例えば、細胞が元の悪性腫瘍又は腫瘍の部位以外の対象の体内の部位に移動していないもの）及び二次性悪性細胞又は腫瘍（例えば、転移、元の腫瘍の部位とは異なる二次部位への悪性細胞又は腫瘍細胞の移動から生じるもの）を含む。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、骨髄腫、及び白血病が含まれるが、これらに限定されない。

【0306】

[0335] これらの癌又は悪性腫瘍のより具体的な例を以下に示し、急性小児期リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性病変、肛門癌、神経膠星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂及び尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳神経膠星状細胞腫、大脳神経膠星状細胞腫、子宮頸癌、小児期（原発性）肝細胞癌、小児期（原発性）肝臓癌、小児期急性リンパ芽球性白血病、小児期急性骨髄性白血病、小児期脳幹膠腫、小児期小脳神経膠星状細胞腫、小児期大脳神経膠星状細胞腫、小児期頭蓋外胚細胞腫瘍、小児期ホジキン病、小児期ホジキンリンパ腫、小児期視床下部及び視覚路膠腫、小児期リンパ芽球性白血病、小児期髄芽細胞腫、小児期非ホジキンリンパ腫、小児期松果体及びテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児期原発性肝臓癌、小児期横紋筋肉腫、小児期軟部組織肉腫、小児期視覚路及び視床下部膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、膵外分泌部癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸類癌、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、ヘアリーセル白血病、頭頚部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸管癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌、膵島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽細胞腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在原発性扁平頸部癌、転移原発性扁平頸部癌、転移性扁平頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞性新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在原発性転移扁平頸部癌、口咽頭癌、骨－／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞種、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉及び松果腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、睾丸癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、移行性腎盂及び尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路及び視床下部膠腫、外陰癌、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、並びに上記で列挙した臓器系に位置する任意の他の過剰増殖性疾患が含まれる。

【0307】

[0336] 「組み合わせ治療」という用語は、本開示に記載される治療的状態又は障害を処置するための２つ以上の治療剤の投与を意味する。このような投与は、有効成分の比率が固定された単一のカプセル、又は各有効成分についての複数の別個のカプセルなどの、実質的に同時の方法でのこれらの治療剤の同時投与を含む。さらに、そのような投与はまた、連続的な方法での各タイプの治療剤の使用を包含する。いずれの場合も、処置レジメンは、本明細書に記載の状態又は障害を処置する際に、薬剤の組み合わせの有益な効果を提供するであろう。

【0308】

[0337] 本明細書で使用される場合、「組成物」という用語は、１つ以上の治療的に許容される担体との免疫治療用細胞集団の組み合わせを指す。

【0309】

[0338] 本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、「障害」、「症候群」、及び「状態」（病状の場合のように）という用語と、これらは全て、正常な機能を損なうヒト又は動物の体又はその一部の異常な状態を反映しており、典型的には、兆候及び症状を識別することによって現れ、ヒト又は動物の生活の時間又は質の低下を引き起こすという点において、一般に同義であることが意図され、互換可能に使用される。

【0310】

[0339] 「エフェクター機能」という用語は、分化した細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、又はサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。ナイーブ、メモリー、又はメモリータイプのＴ細胞におけるエフェクター機能には、抗原依存性増殖も含まれ得る。

【0311】

[0340] 本明細書で使用される「フラトリサイド」という用語は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞、又はＮＫ－ＣＡＲ細胞が、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞、又はＮＫ－ＣＡＲ細胞の標的と同じキメラ抗原受容体を含む、別のＣＡＲ－Ｔ細胞、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞、又はＮＫ－ＣＡＲ細胞の標的となるか、又はそれらによって死滅される場合に起こるプロセスを意味する。これは、標的細胞が、両方の細胞のキメラ抗原受容体によって特異的に認識される抗原を発現するためである。キメラ抗原受容体が特異的に結合する抗原が欠損しているキメラ抗原受容体を含むＣＡＲ－Ｔ細胞、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞、又はＮＫ－ＣＡＲ細胞は、「フラトリサイド耐性」である。

【0312】

[0341] 本明細書で使用される場合、ＩＬ－１５タンパク質の「遺伝子発現」又は「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、及びタンパク質産物、又は抗体、若しくはその抗体フラグメントの分泌を指すと理解される。

【0313】

[0342] 本明細書で使用される場合、ＩＬ－１５タンパク質の「遺伝子発現」又は「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、及びタンパク質産物、又は抗体、若しくはその抗体フラグメントの分泌を指すと理解される。

【0314】

[0343] 本明細書で使用される場合、「ゲノム編集された」という用語は、遺伝子が付加、欠失、又は機能しないように改変されていることを意味する。したがって、特定の実施形態において、「遺伝子編集されたＴ細胞」又は「遺伝子編集されたＴ細胞、ＮＫ細胞、又はｉＮＫＴ細胞」は、少なくとも１つの抗原を認識するＣＡＲなどの遺伝子が付加され；及び／又はＣＡＲによって認識される抗原に対する遺伝子などの遺伝子が欠失した、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又はｉＮＫＴ細胞である。

【0315】

[0344] 本明細書で使用される「健常ドナー」は、血液悪性腫瘍（例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍）を有しないものである。

【0316】

[0345] 本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターを導入することができる原核細胞及び／又は真核細胞を指す。

【0317】

[0346] 本明細書で使用される場合、「過剰増殖性疾患」及び「過剰増殖性障害」という用語は、全ての形質転換細胞及び組織並びに全ての癌性細胞及び組織を含む、悪性又は良性であるかどうかにかかわらず、全ての腫瘍性細胞の成長及び増殖を指す。過剰増殖性の疾患又は障害には、前癌性病変、異常な細胞増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍、及び「癌」が含まれるが、これらに限定されない。過剰増殖性疾患、障害、及び／又は状態のさらなる例には、良性又は悪性であるかどうかにかかわらず、体の任意の組織、系、又は器官に位置する新生物が含まれるが、これらに限定されない。

【0318】

[0347] 「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、Ｔ細胞などの特定のタイプの免疫系細胞、及び一部の癌細胞によって作製される特定のタンパク質を遮断するタイプの薬剤を指す。

【0319】

[0348] 本明細書で使用される場合、「免疫エフェクター細胞」という用語は、腫瘍細胞の破壊に活動的に関与する、例えば、抗腫瘍活性を有する、細胞である。これらの細胞には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞毒性Ｔ細胞、及びメモリーＴ細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【0320】

[0349] 「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）保有免疫エフェクター細胞」という用語は、キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞である。これらの細胞には、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ保有ｉＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ）、又はＣＡＲ保有ＮＫ細胞（ＮＫ－ＣＡＲ）が含まれ得るが、これらに限定されない。

【0321】

[0350] 「ＣＡＲ－Ｔ細胞」という用語は、キメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を意味する。

【0322】

[0351] 「デュアルＣＡＲ－Ｔ細胞」（同等に、ｄＣＡＲ－Ｔ）は、同じエフェクター細胞内で発現される異なる標的抗原に親和性を有する２つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞であり、各ＣＡＲは独立して機能する。ＣＡＲは、単一のポリヌクレオチド配列又は複数のポリヌクレオチド配列から発現され得る。

【0323】

[0352] タンデム「ＣＡＲ－Ｔ細胞」（同等に、ｔＣＡＲ－Ｔ）は、異なる標的に対する親和性を有する２つの異なる抗原認識ドメインを含む単一のキメラ抗原ポリペプチドを有するＣＡＲ－Ｔ細胞であり、抗原認識ドメインは、ペプチドリンカーを介して連結され、共通の共刺激ドメインを共有しており、いずれかの抗原認識ドメインの結合は、共通の共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインを介してシグナル伝達する。

【0324】

[0353] 「ＣＡＲ－ｉＮＫＴ細胞」（同等に、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ）という用語は、キメラ抗原受容体を発現するｉＮＫＴ細胞を意味する。

【0325】

[0354] 「デュアルｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞」（同等に、ｉＮＫＴ－ｄＣＡＲ）は、同じエフェクター細胞内で発現される異なる標的抗原に親和性を有する２つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞であり、各ＣＡＲは独立して機能する。ＣＡＲは、単一のポリヌクレオチド配列又は複数のポリヌクレオチド配列から発現され得る。

【0326】

[0355] 「タンデムｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞」（同等に、ｉＮＫＴ－ｔＣＡＲ）は、異なる標的に対する親和性を有する２つの異なる抗原認識ドメインを含む単一のキメラ抗原ポリペプチドを有するｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞であり、抗原認識ドメインは、ペプチドリンカーを介して連結され、共通の共刺激ドメインを共有しており、いずれかの抗原認識ドメインの結合は、共通の共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインを介してシグナル伝達する。

【0327】

[0356] 「ＣＡＲ－ＮＫ細胞」（同等に、ＮＫ－ＣＡＲ）という用語は、キメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞を意味する。

【0328】

[0357] 「デュアルＮＫ－ＣＡＲ細胞」（同等に、ＮＫ－ｄＣＡＲ）は、同じエフェクター細胞内で発現される異なる標的抗原に親和性を有する２つの異なるキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するＮＫ－ＣＡＲ細胞であり、各ＣＡＲは独立して機能する。ＣＡＲは、単一のポリヌクレオチド配列又は複数のポリヌクレオチド配列から発現され得る。

【0329】

[0358] 「タンデムＮＫ－ＣＡＲ細胞」（同等に、ＮＫ－ｔＣＡＲ）は、異なる標的に対する親和性を有する２つの異なる抗原認識ドメインを含む単一のキメラ抗原ポリペプチドを有するＮＫ－ＣＡＲ細胞であり、抗原認識ドメインは、ペプチドリンカーを介して連結され、共通の共刺激ドメインを共有しており、いずれかの抗原認識ドメインの結合は、共通の共刺激ドメイン及びシグナル伝達ドメインを介してシグナル伝達する。

【0330】

[0359] 本明細書で使用される場合、「悪性腫瘍」という用語は、非良性腫瘍又は癌を指す。

【0331】

[0360] 「悪性Ｔ細胞」という用語は、Ｔ細胞悪性腫瘍に由来するＴ細胞を指す。「Ｔ細胞悪性腫瘍」という用語は、Ｔ細胞前駆細胞、成熟Ｔ細胞、又はナチュラルキラー細胞に由来する悪性腫瘍の広範で不均質なグループを指す。Ｔ細胞悪性腫瘍の非限定的な例には、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）白血病、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型陽性（ＨＴＬＶ－１＋）成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ－ＰＬＬ）、並びに血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）、ＡＬＫ陽性未分化大細胞リンパ腫、及びＡＬＫ陰性未分化大細胞リンパ腫を含むがこれらに限定されない、様々な末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）が含まれる。

【0332】

[0361] 本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、ＩＬ－７又はＩＬ－１５と同じ又は同様の配列及び活性を有するポリペプチド又はタンパク質を指す。本明細書で使用される場合、「改変ＩＬ－７」はまた、「変異体ＩＬ－７」と互換可能に使用され得る。本明細書で使用される場合、「改変ＩＬ－１５」はまた、「変異体ＩＬ－１５」と互換可能に使用され得る。

【0333】

[0362] 本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、霊長類などの哺乳動物を含む、本発明による組成物による処置を提供することができる生物を表す。開示された処置の方法から利益を得ることができる哺乳動物種には、ヒト；類人猿；チンパンジー；オランウータン；サル；イヌ及びネコなどの飼育動物；ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジなどの家畜が含まれるが、これらに限定されない。

【0334】

[0363] 「患者」という用語は、一般に「対象」という用語と同義であり、ヒトを含む全ての哺乳動物を含む。

【0335】

[0364] 特に明記しない限り、「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、互換可能な概念として使用され得る。

【0336】

[0365] 本明細書で使用される場合、「シグナル配列」又は同等に「シグナルペプチド」という用語は、生物学的に活性な分子薬物及び融合タンパク質の分泌を指示するフラグメントを指し、これは宿主細胞で翻訳された後に切断される。本明細書で使用されるシグナル配列は、小胞体（ＥＲ）膜を貫通するタンパク質の動きを開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。有用なシグナル配列には、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Gillies et al., J. Immunol.Meth.1989. 125:191-202）、抗体重鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Sakano et al., Nature, 1980.286:676-683）、及び当技術分野で公知の他のシグナル配列（例えば、Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984.12:5145-5164を参照）が含まれる。シグナルペプチドの特徴は当技術分野で周知であり、シグナルペプチドは、従来１６～３０のアミノ酸を有するが、それらはより多い、又はより少ない数のアミノ酸残基を含み得る。従来のシグナルペプチドは、基本的なＮ末端領域の３つの領域、中央の疎水性領域、及びより極性の高いＣ末端領域で構成されている。

【0337】

[0366] 「治療的に許容される」という用語は、患者の組織と接触した過度の毒性、刺激、及びアレルギー反応のない使用に適しており、合理的な利益／リスク比に釣り合っている、及び／又はそれらの意図された使用に有効である物質を指す。

【0338】

[0369] 本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、疾患又は状態を処置又は改善することができるか、そうでなければ意図された治療効果を生み出すことができる量を指す。

【0339】

[0370] 「治療上有効」という用語は、疾患又は障害の処置又は臨床評価項目の効果に使用される有効成分の量を限定することを意図している。

【0340】

[0371] 本明細書に記載されるように、治療有効量の開示された組成物の投与は、例えば、十分な量の開示されたインターロイキン、抗ＣＤ４７抗体又はそのフラグメント、ＣＤ４７－ＩＬ－７融合抗体、及び／又はＣＡＲ－Ｔ細胞の単回注射などの、単回投与によって、そのような処置を受けている患者に治療上の利益を提供するために、達成され得る。或いは、状況によっては、そのような組成物の投与を監督する医師によって決定され得るように、比較的短い期間又は比較的長い期間にわたり、組成物の複数の又は連続的な投与を提供することが望ましい場合がある。

【0341】

[0372] 本明細書で使用される場合、「部分（moiety）」という用語は、物が分割されるか又は分割され得る２つの部分のそれぞれ、又は部分（part）又は部分（portion）、特により小さいシェア、又は大きい分子の異なる部分を指す。

【0342】

[0373] 本明細書で使用される場合、「形質導入された」、「形質転換された」、及び「トランスフェクトされた」という用語は、当技術分野で公知の技術を使用した細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を指す。

【0343】

[0374] 本明細書で使用される場合、「腫瘍」又は「腫瘍組織」という用語は、過剰な細胞分裂に起因する異常な組織の塊を指す。腫瘍又は腫瘍組織は「腫瘍細胞」を含み、これは異常な成長特性を有し、有用な生体機能を有しない腫瘍性細胞である。腫瘍、腫瘍組織及び腫瘍細胞は、良性又は悪性であり得る。腫瘍又は腫瘍組織はまた、「腫瘍関連非腫瘍細胞」、例えば、腫瘍又は腫瘍組織に供給するために血管を形成する血管細胞を含み得る。非腫瘍細胞は、腫瘍細胞によって複製及び発達するように誘導され得、例えば、腫瘍又は腫瘍組織における血管新生の誘導である。

【0344】

[0375] 本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞に導入されて再結合され、宿主細胞のゲノムに挿入されるか、又はエピソームとして自発的に複製され得るヌクレオチド配列を含む核酸手段として理解される。ベクターは、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、及びそれらの類似体を含み得る。ウイルスベクターの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが含まれ得るが、これらに限定されない。

【実施例】

【0345】

実施例
[0376] 本開示の実施形態の例は、以下の実施例に提供される。以下の実施例は、例示としてのみ提示されるものであり、本開示を使用するにあたり当業者を補助するためのものである。実施例は、決して開示の範囲を制限することを意図したものではない。

【0346】

実施例１－ＩＬ－７構築物の設計
[0377] 以下の実施例の目的は、ヒトＩＬ－７の点変異体を生成し、構造的／機能的に特徴づけることであった。

【0347】

[0378] 以下に記載されるように、９つのＩＬ－７変異体（表１）が生成され、それらの活性が試験され、市販のものと自社で生成したものの両方の野生型（ＷＴ）ＩＬ－７と比較された。

【0348】

[0379] ＩＬ－７構築物は、ＩＬ－７／ＩＬ－７Ｒα結晶構造に対して設計され、Ｃ末端タグを含むように設計された。ＩＬ－７野生型又は変異体の遺伝子配列は、開始コドンの前のＮ末端にＮｃｏＩ部位を有するGenScriptによってカスタム合成された。Ｃ末端では、ＴＥＶ（タバコエッチ病ウイルス）プロテアーゼ切断部位ＥＮＬＹＦＱＧ及び６ｘＨｉｓ配列が、終止コドン及びＸｈｏＩ部位の前に追加された。次に、GenScriptによる標準的な分子生物学の手順を使用して、配列を発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）－ＴＥＶにクローニングした。Rosetta2（ＤＥ３）Singles Competent細胞（Millipore Sigma、71400）での形質転換及び小規模発現は、製造元提供のプロトコルを使用して実行された。この発現系は、本明細書に開示されるＩＬ－７及びＩＬ－７変異体を産生するために使用され得る。

【0349】

[0380] ＩＬ－７変異体Ｓ１～Ｓ５を発現させ、変異体Ｓ１及びＳ５から精製タンパク質を得た。ＩＬ－７変異体Ｓ６～Ｓ９について、発現は小規模誘導で確認され、これは、タンパク質精製用の材料を生成するためにスケールアップすることができる。ＩＬ－７の商業的供給源（GenScript）からのタンパク質は、ＣＨＯ細胞で産生された。

【0350】

[0381] 以下の表は、以下に記載のアッセイにおける発現された変異体及びそれらの活性の概要である。

【0351】

【表1】

【0352】

実施例２－大腸菌（E. coli）におけるＩＬ－７変異体の産生
[0383] ９つのＩＬ－７変異体が同定され、合成のために選択された。

【0353】

[0384] 大腸菌（E. coli）でのＩＬ－７発現は、２ｍＬのＩＰＴＧ誘導培養を使用した小規模培養で最初に実証された。培養物をペレット化し、２００μｌのBugBusterマスターミックスバッファーを使用して溶解した。溶解後の不溶性部分を５０μｌのＬＤＳサンプルバッファー及び１０μｌの還元剤と合わせた。次に、ＩＬ－７変異体の発現を、溶解用の２００μＬのBugBusterマスターミックスバッファー及び５０μＬのＬＤＳサンプルバッファー及び溶解後の不溶性部分用の１０μＬの還元剤を使用した、１－Ｌ ＩＰＴＧ誘導培養からの１ｍＬの培養物を使用したスケールアップ培養で試験した。次に、タンパク質精製のために細胞ペレットを準備した。

【0354】

実施例３－事前に最適化されたＩＬ－７のスケールアップ発現
[0385] 新鮮な形質転換プレートから、単一の大腸菌（E. coli）コロニーを適切な抗生物質を含む１００ｍｌのＴＢ（Terrific broth）に接種し、培養物を、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩、振とうインキュベーターに入れた。翌朝、培養物を４Ｌフラスコ内の９００ｍｌの新鮮なＴＢに加え、６００ｎｍでの吸光度（Ａ_６００）が０．６～０．８に達するまで３７℃で増殖させた。次に、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を最終濃度が０．５ｍＭになるように添加し、インキュベーションを３～５時間継続した。９，０００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離することにより細胞を回収した。上清を廃棄し、精製前にペレットを－８０℃に保った。この発現系は、本明細書に開示される他のＩＬ－７変異体を産生するために使用され得る。

【0355】

実施例４－ヒトＩＬ－７のＥｘｐｉＣＨＯ発現
[0386] ExpiCHO発現システムキット（ThermoFisher #A29133）を使用して、ヒトＩＬ－７タンパク質を発現させた。ExpiCHO-S細胞の１つのバイアルを解凍し、３０ｍｌの予熱したＥｘｐｉＣＨＯ発現培地を含む１２５ｍｌのベントキャップシェーカーフラスコに加えた。細胞を、振とう速度１３０ｒｐｍ（１９ｍｍの振とう直径）のオービタルシェーカープラットフォーム上、相対湿度が８０％以上、ＣＯ_２が８％の３７°Ｃのインキュベーター内で、３日間インキュベートした。細胞密度及び生存率をモニターし、３日目又は４日目に４×１０^６～６×１０^６生細胞／ｍｌに達したときに細胞を継代培養した。３回の継代培養後、トランスフェクション前に細胞を３×１０^６～４×１０^６細胞／ｍｌに分割した（－１日目）。トランスフェクションの日（０日目）に、細胞の密度は７×１０^６～１×１０^７生細胞／ｍｌに達し、生存率は９５～９９％であった。細胞を、予め温めておいた新鮮なExpiCHO（商標）発現培地で最終密度６×１０^６生細胞／ｍＬに希釈し、フラスコを穏やかに回転させて細胞を混合した。ExpiFectamine（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を調製するために、１ｍｇ／ｍｌのＩＬ－７発現プラスミド８０μｌを１．５ｍｌの滅菌マイクロフュージチューブ内の４ｍｌのOptiPRO培地に添加し、転倒混和した。６４０μｌのExpiFectamineＣＨＯ試薬を別の滅菌マイクロフュージチューブ内の７．３６ｍｌのOptiPRO培地に添加し、転倒混和した。次に、４ｍｌの希釈したExpiFectamineＣＨＯ試薬を希釈したＩＬ－７に加え、転倒混和した。ExpiFectamineＣＨＯ試薬／プラスミドＤＮＡ複合体を室温で１～５分間インキュベートした後、２ｍｌの複合体をゆっくりと振とうフラスコに移し、移す間、フラスコを穏やかに回した。フラスコを、振とう速度１３０ｒｐｍのオービタルシェーカープラットフォーム上、相対湿度が８０％以上、ＣＯ_２が８％の３７℃のインキュベーターに戻した。トランスフェクションの翌日（１日目）に、ExpiFectamine（商標）ＣＨＯエンハンサー及びExpiCHO（商標）フィードを直ちに事前混合し、標準プロトコルのためにフラスコに加えた。添加中、フラスコを穏やかに回し、次に、振とう速度１３０ｒｐｍのオービタルシェーカープラットフォーム上、相対湿度が８０％以上、ＣＯ_２が８％の３７℃のインキュベーターに戻した。細胞を８～１０日間培養し、細胞の生存率をモニターしたところ、生存率はタンパク質の回収時に７５％を超えていた。回収のために、細胞培養上清を冷蔵遠心分離機で、４０００～５０００ｘｇで３０分間遠心分離し、次に上清を０．２２μｍフィルターでろ過した。上清を精製のために送り、発現をクーマシーブルー染色及びウエスタンブロットによって決定した。この発現系は、本明細書に開示される他のＩＬ－７変異体を産生するために使用され得る。ExpiCHO発現システムでＩＬ－７の発現が実証されたが、ＩＬ－７タンパク質は精製及び試験されていない。本明細書に開示される全てのＩＬ－７変異体構築物は、大腸菌（E. coli）系で産生及び精製され、例えば、ＰＳＴＡＴ、増殖、及び結合アッセイで試験された。

【0356】

実施例５－ＣＯＳ７細胞の一過性トランスフェクション
[0387] １．０×１０^４のＣＯＳ７サル腎細胞を、トランスフェクションの１８～２４時間前に、９６ウェルプレートのウェルあたり１０％のウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、３０ｍｇ／ｍｌのグルタミン、及び５０ｍＭの２－メルカプトエタノール（完全培地）を含有する、体積１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地でプレーティングした。トランスフェクションの日、細胞は約７５％コンフルエントであった。ＩＬ－７受容体αサブユニット及びγサブユニットの一過性コトランスフェクションのために、９０ｍＬの無血清ＭＥＭ培地を９６ウェルＶ底プレートのウェルに添加した。５００ｎｇのＩＬ－７受容体α発現プラスミド（Genscript）及び５００ｎｇのＩＬ－７受容体γ発現プラスミド（Genscript）を培地に添加し、混合した。６：１のViaFectトランスフェクション試薬（Promega #E4981）：ＤＮＡ分配の場合、６．０μＬのViaFectを加えて合計１００μＬの体積にし、直ちに混合した。ViaFect：ＤＮＡ混合物を室温で５～２０分間インキュベートした後、ウェルあたり１０μｌのViaFect：ＤＮＡ混合物を、増殖培地に１００μＬの細胞を含有する９６ウェルプレートに加えた。プレートをピペッティングにより穏やかに混合し、２４～７２時間インキュベーターに戻した。同時トランスフェクション効率は、フローサイトメトリー及びウエスタンブロットによってモニターされた。

【0357】

実施例６－結合アッセイのためのＣｏｓ－７細胞におけるＩＬ－７Ｒα及びＩＬ－２Ｒγの過剰発現
[0388] トランスフェクションの最適化を実施し、トランスフェクション効率を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で検証した。最適化パラメーターには、使用するプラスミドの量、プラスミドとトランスフェクション試薬の比率、及びタンパク質発現の時間経過が含まれた。

【0358】

[0389] ViaFectトランスフェクション試薬（Promega #4981）を使用して最適化を行った。トランスフェクションViaFect試薬対ＤＮＡの比率は６：１であった。９６ウェルプレートのウェルあたり５０ｎｇのＤＮＡを、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－２Ｒγ、又はＩＬ－２Ｒβの単一トランスフェクションに使用し、（１）１２．５ｎｇ＋１２．５ｎｇ；（２）２５ｎｇ＋２５ｎｇ；（３）５０ｎｇ＋５０ｎｇのＤＮＡを、ＩＬ－７Ｒα／ＩＬ－２Ｒγ又はＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－２Ｒγのコトランスフェクション実験に使用した。ＦＡＣＳモニタリングは、トランスフェクションの１、２、及び３日後に実施された。図１に示すように、Ｃｏｓ－７細胞におけるＩＬ－７Ｒα及びＩＬ－２Ｒγの共発現は、２２％～２７％の二重陽性細胞を産生した。

【0359】

実施例７－ＩＬ－７バリアントのリフォールディング及び精製
[0390] 約３Ｌの振とうフラスコ培養物からのＨｉｓ６タグ付きＩＬ－７を含有する凍結大腸菌（E. coli）細胞ペーストを解凍し、組織ホモジナイザーを使用して、溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に１５～２０ｍＬ／ｇ細胞ペレットの比率で懸濁した。細胞を懸濁した後、１ＭのＭｇＣｌ_２ストックから１ｍＭのＭｇＣｌ_２を添加し、５００ユニットのBenzonase（商標）（Sigma E1014）を添加した。細胞溶解は、１５～２０，０００ｐｓｉで、２回のパスでAvestin C3装置を使用して実行された。溶解物を１２，０００ｘｇで３０～５０分間、室温で遠心分離した。上清をデカントして廃棄した。細胞の破片及び封入体ペレットを水で洗浄して、より密度の高い封入体ペレットから最上層を除去した。

【0360】

[0391] 組織ホモジナイザーを使用して、ペレットを１５０～２００ｍＬの６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＤＴＴに懸濁した。この可溶化タンパク質溶液に、Ｎｉ^＋＋アガロース（GoldBio H-350）を十分に添加して、１ｍＬの沈降床体積を生成した。Ｎｉ^＋＋アガロースへのバッチ結合のために、タンパク質をロッキングプラットフォームに一晩置いた。翌朝、アガロースビーズを１０００ｘｇで１５分間ペレット化した。上清を廃棄し、ビーズを直径１．５ｃｍの点滴カラム（Pierce #89898）に注いだ。ビーズは、１５～２０ｍＬのバッファーを使用して、８Ｍの尿素、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴで洗浄した。ＩＬ－７タンパク質は、３．５ｍＬの８Ｍ尿素バッファー＋２００ｍＭイミダゾール（GoldBio I-902）を使用してカラムから溶出した。溶離液中のタンパク質濃度は、４．３０のＥ１％を使用してＵＶ吸光度スペクトルからＡ_２８０で計算された。この総タンパク質の値を使用して、リフォールディングバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５Ｍアルギニン－ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０９ｍＭ酸化型グルタチオン、ｐＨ９．０、４℃）の体積を計算して、０．１ｍｇ／ｍＬのＩＬ－７タンパク質濃度を得た。Ｎｉ^＋＋アガロースプールを、急速に撹拌されているリフォールディングバッファーにゆっくりと加えた。溶液をペーパータオルで覆い、４℃で６５～９０時間置いた。完了したリフォールド反応は、５ｋＤ又は１０ｋＤのカットオフスピン濃縮器（Vivacell 100又はAmicon Ultracel）を使用して４～９ｍＬに濃縮した。濃縮したタンパク質を、平衡化したSuperdex 75サイズ排除カラム（１．６ｃｍ×９０ｃｍ）に適用し、Ｃａ^＋＋、Ｍｇ^＋＋を含まないダルベッコＰＢＳで、１ｍＬ／ｍｉｎで実行した。２ｍＬの画分を収集した。ＩＬ－７のピークは、ＵＶ吸光度検出器によって識別され、典型的には、１０５ｍｌの溶出量に集中していた。このプールは、Ａ_２８０の吸光度で測定して１～２ｍｇ／ｍＬに濃縮され、４℃で保存された。これらの方法は、本明細書に開示される他のＩＬ－７変異体を精製するために使用され得る。

【0361】

実施例８－細胞機能分析
[0392] ＩＬ－７変異体のＪＡＫ１，３／ＳＴＡＴ５シグナル伝達を評価した。特に、ｐＳＴＡＴ５リン酸化は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む研究対象の細胞株で評価された。さらに、２Ｅ８細胞におけるＩＬ－７の増殖試験を実施した（以下に説明）。

【0362】

[0393] ＪＡＫ１，３／ＳＴＡＴ５シグナル伝達を評価するためのプロトコルは、次のとおりであり、上記のとおりである。

【0363】

[0394] 凍結したＰＢＭＣを素早く解凍し、アッセイ培地で細胞を１０ｍＬに希釈し、１２５ｘｇで５分間ペレット化する。

【0364】

[0395] 細胞をアッセイ培地に再懸濁し、９６ウェルプレート（ウェルあたり約２００，０００細胞）のｖ底プレートに１３５μｌ／ウェルでプレーティングする。

【0365】

[0396] サイトカインを調製している間、細胞プレートを３７℃で置く。

【0366】

[0397] 氷上で、ＩＬ－７構築物を希釈する。ＩＬ－７には５０，０００ｐｇ／ｍＬの最終希釈液を使用した。１：３希釈で、サイトカイン対照なしで１１ポイントの曲線を使用した。

【0367】

[0398] １５μＬのサイトカイン希釈液を細胞に加える。３７℃のインキュベーター内の振とう器に１０分間置く。

【0368】

[0399] １０分後、５分間の遠心分離によって、合計１５分間、細胞をペレット化する。培地を吸引し、７５μＬの冷ＭＳＤ溶解バッファーで細胞を溶解し、４℃のシェーカーに３０分間置く。

【0369】

[0400] 溶解の完了後、ｐＳＴＡＴ５のＭＤＳプロトコルに従って、未希釈の溶解物を分析に使用する。

【0370】

[0401] アッセイ読み取り：MSD Multi-Spot Assay System／Phospho-STAT5a,b（Tyr694）
[0402] 対照／プレート、ＩＬ－７：
R&D SystemsのｒｈＩＬ－７、２回実行
自社のｒｈＩＬ－７ ＷＴ、２回実行
上記のプロトコルを使用して生成されたデータの要約が図２及び表２に提供される。商業的供給源から得られた野生型ＩＬ－７及び大腸菌（E. coli）で自社産生した野生型ＩＬ－７は全て、２４～１１０ｐｇ／ｍＬの範囲のＥＣ_５０値で濃度的に経路活性化の読み取りとしてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導した。

【0371】

【表2】

【0372】

実施例９－細胞増殖アッセイ
[0403] ２つの異なる試薬（ＣＣＫ－８及びAlamar Blue）を試験して、ＩＬ－７刺激に応答したマウス２Ｅ８細胞の増殖をアッセイするための最適な条件を決定した。２つのアッセイの感度に基づいて、さらにアッセイを発展させるためにAlamar Blue試薬が選択され、ＩＬ－７アッセイに使用された。

【0373】

[0404] マウスＩＬ－７（ｍＩＬ－７）とヒトＩＬ－７（ｈＩＬ－７）を比較した１２ポイントＩＬ－７用量反応につき、２Ｅ８細胞におけるAlamar Blue増殖アッセイの細胞増殖プロトコルは、次のとおりであり、以下でさらに説明する。
１．２Ｅ８細胞を３回洗浄（ＤＰＢＳ）し、ＩＬ－７を含有しない１００μＬの培地中、９６ウェルプレートに１×１０^５細胞／ｍＬでプレーティングする。最も内側の６０個のウェルのみが使用され、エッジ効果を最小限に抑えるために、外側のウェルには２００μＬのＤＰＢＳが充填された。
２．１００μＬのｍＩＬ－７又はｈＩＬ－７を反復添加して、０．０００６～１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度とする。
３．７２時間のインキュベーション後、２５μＬ／ウェルのAlamar Blue溶液を加え、プレートを３７℃でインキュベートする。
４．２０時間後に蛍光（５３０ｅｘ／５９０ｅｍ）を読み取る。

【0374】

[0405] Alamar Blue増殖アッセイは、ＩＬ－７の以下の調製物に応じて２Ｅ８細胞の増殖を評価するために行われた。（１）R&D Systems組換えヒトＩＬ－７（大腸菌（E. coli）由来）；（２）Stemcell Technologies組換えヒトＩＬ－７（大腸菌（E. coli）由来）；（３）Miltenyi Biotec組換えヒトＩＬ－７（大腸菌（E. coli）由来）；（４）GenScript組換えヒトＩＬ－７、Ｈｉｓ（ＣＨＯ発現）；及び（５）自社組換えヒトＩＬ－７、ＷＴ、Ｈｉｓ（大腸菌（E. coli）由来）。R&D Systems組換えヒトＩＬ－７（大腸菌（E. coli）由来）調製物のＥＣ_５０は０．２７０ｐｇ／ｍＬであり；Stemcell Technologies組換えヒトＩＬ－７（大腸菌（E. coli）由来）調製物のＥＣ_５０は０．２２０ｐｇ／ｍＬであり；Miltenyi Biotec組換えヒトＩＬ－７（大腸菌（E. coli）由来）調製物のＥＣ_５０は０．３４３ｐｇ／ｍＬであり；GenScript組換えヒトＩＬ－７、Ｈｉｓ（ＣＨＯ発現）調製物のＥＣ_５０は０．４８６ｐｇ／ｍＬであり；（５）自社組換えヒトＩＬ－７、ＷＴ、Ｈｉｓ（大腸菌（E. coli）由来）調製物のＥＣ_５０は０．９７６ｐｇ／ｍＬであった。

【0375】

実施例１０－ＩＬ－７ ２Ｅ８細胞増殖アッセイ
[0406] このアッセイは、ＩＬ－７依存性の未成熟Ｂリンパ球マウス細胞株２Ｅ８の増殖を刺激するＩＬ－７の能力に基づいている。２Ｅ８細胞（ATCC TIB-239）をＤＰＢＳ（Corning #21-031-CV）で３回洗浄し、白色の平底９６ウェルプレート（Costar # 3917）に１００μＬのアッセイ培地（０．０５ｍＭの２－メルカプトエタノールを補充した１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム及び２０％ウシ胎児血清を含有するように調整された４ｍＭのＬ－グルタミンを含むIscoveの改変ダルベッコ培地）中、プレートの最も内側の６０ウェルのみを使用し、１００，０００細胞／ウェルでプレーティングし、蒸発に関連するエッジ効果の問題を低減するために、残りのウェルに２００μＬのＤＢＰＳを充填した。次に、ＩＬ－７を１００μＬの２Ｘワーキングストック（０．０００６～１００ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度を与えるために、ＩＬ－７対照なしを含む１２ポイントまでのアッセイ培地で３倍希釈系列として調製した）として添加した。３７℃で７２時間インキュベートした後、ウェルごとに２５μＬのAlamar Blue試薬（ThermoFisher # DAL1025）を添加し、３７℃でさらに２０時間インキュベートした。次に、LJL Analystを使用して蛍光（５３０ｅｘ／５９０ｅｍ）を測定し、Grafitソフトウェアを使用してＥＣ_５０を決定した。

【0376】

[0407] 自社で産生したＩＬ－７の結合を、市販のＩＬ－７の結合と比較した。サンプルを個別に分析した場合、最初の分析では同等の変換係数は生成されなかった。１つの分析からのデータは、２つの異なるＫｄ値につきパラメーターを有することによって結合された。「Ｋｄベンダー」パラメーターは約４倍高く、これは、ｒＩＬ－７がベンダーｒＩＬ－７の活性の４倍強力であることを示唆していた。

【0377】

実施例１１－ＴＲ－ＦＲＥＴリガンド－受容体結合アッセイ
[0408] ＩＬ－７結合親和性は、組換えＩＬ－７及びＩＬ－７受容体－アルファ（ＩＬ－７Ｒα）の濃度範囲でＴＲ－ＦＲＥＴ蛍光シグナルを測定することによって決定された。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．０５％ＢＳＡ及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ－２０のバッファー中、１６０ｎＭ ＴＲ－ＦＲＥＴアクセプター結合α６－ｈｉｓ ＩｇＧ（Perkin Elmer # TRF0105-M）、８０ｎＭ ＴＲ－ＦＲＥＴドナー結合ストレプトアビジン（Perkin Elmer # AD0062）、組換え６－ｈｉｓタグ付きＩＬ－７野生型又は変異体バリアント（最大１６０ｎＭの濃度）、及び組換えビオチンタグ付きＩＬ－７Ｒα（Acrobiosystems # IL-7-H82F8）（最大８０ｎＭの濃度）の４ｘストックを作製する。試験する各サンプルについて、５μＬのα６－ｈｉｓＩｇＧ結合アクセプターの４ｘストックを、５μＬのＩＬ－７の４ｘワーキングストックと混合する。これとは別に、各サンプルについて、ストレプトアビジンに結合した５μＬの４ｘＴＲ－ＦＲＥＴドナーを、ビオチンに結合した５μＬの組換えＩＬ－７Ｒαの４ｘワーキングストックと混合する。混合物を室温で３０分間インキュベートし、その間、１０μＬのα６－ｈｉｓ結合アクセプター／ＩＬ－７混合物を３８４ウェルの浅い黒色ProxiPlate（Perkin Elmer # 6008260）の指定されたウェルに分配し、覆って光を遮断した。３０分間のインキュベーション後、１０μＬのストレプトアビジン結合ドナー／ＩＬ－７Ｒα混合物を、指定濃度のＩＬ－７＋アクセプターを含有する指定のウェルに入れた。プレートを直ちに７５０ｒｐｍで３０秒間回転させ、直ちにPHERAstarプレートリーダー（BMG Labtech）に入れて、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを読み取った。次の３０分間連続して、ドナーシグナル（３３７ｎＭ励起／６２０ｎＭ発光）及びアクセプターシグナル（３３７ｎｍ励起／６５５ｎｍ発光）の蛍光を読み取る。ＴＲ－ＦＲＥＴ結合シグナルは、ドナーシグナルに対するアクセプターシグナルの比率を取り、１０，０００を掛けることによって決定される。平衡は、蛍光活性が減衰し始める前の読み取り値がプラトーになる時点で定義される。次に、平衡値は、グラフ作成プログラムGraFit（Erithacus Software）を使用して、単一部位結合を仮定した標準平衡方程式に適合する。

【数1】

【0378】

[0409] 図３に示すように、分析における「自社」ＩＬ－７のＫ_ｄは５．４４ｎＭであり、これは以前の分析で見られたもの（６．６ｎＭ）と同等である。自社ＩＬ－７の活性は、１０倍過剰のタグなしＩＬ－７（R&D biosystems製）と部分的に競合する。しかし、ベンダーの活性は完全に競合している。結合の測定に使用されるBiolegendsＩＬ－７と同様に、自社で産生したＩＬ－７は非標識ＩＬ－７よりも強力である可能性がある。

【0379】

[0410] さらに、ＩＬ－７変異体Ｓ１をＩＬ－７Ｒαへの結合について試験し、ＷＴと比較した。ＷＴ及びＩＬ－７変異体Ｓ１のＫｄ値は、それぞれ２０．２ｎＭ及び３４．８ｎＭであった（図４）。Ｓ１変異体は受容体に対する親和性が低いようであり、適合はそれほどクリーンに見えない。注目すべきことに、この分析はα受容体のみが存在する状態で行われた。受容体γに効果があるかどうかを確認するには、この受容体鎖を使用して分析を実施する必要がある。２０倍過剰の非標識ＩＬ－７による完全な競合は観察されなかった。

【0380】

実施例１２－受容体γを有する又は有しないＩＬ－７ＲαへのＩＬ－７の結合
[0411] 自社で調整したｒＩＬ－７の結合を、市販のＩＬ－７の結合と比較した。２セットの条件を比較した：（１）（＋）２０ｎＭ受容体γがある場合、及び（２）（－）受容体γがない場合。図５に示されるように、γ受容体の存在下で見かけの親和性の５倍の増加が見られた。γ受容体なしで測定されたＫ_ｄは１２．１３ｎＭであり、以前の分析（６ｎＭ）よりも高かった。γ受容体の存在下での親和性の増加が予想された。データを適合させるために使用されたモデルは、γ及びβが１つの結合ユニットとして機能する、より単純化された結合モデルを仮定していた。

【0381】

[0412] 表３及び図５は、ＩＬ－７受容体結合効率の概要を提供する。

【0382】

【表3】

【0383】

[0413] 出願に引用されている米国又は外国の全ての参考文献、特許又は出願は、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が生じた場合、本明細書に文字通り開示された資料が優先される。

【0384】

[0414] 前述の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用法及び条件に適合させるために様々な変更及び修正を行うことができる。

【0385】

実施例１３－ＩＬ－１５構築物の設計
[0415] 以下の実施例の目的は、ヒトＩＬ－１５の点変異体を生成し、構造的／機能的に特徴づけることであった。

【0386】

[0416] 以下に記載されるように、１５個のＩＬ－１５変異体（表４）が生成され、それらの活性が試験され、市販のものと自社で生成したものの両方の野生型（ＷＴ）ＩＬ－１５と比較された。

【0387】

[0417] ＩＬ－１５構築物は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５Ｒβ／γｃ結晶構造に対して設計され、Ｎ末端タグを有するよう設計された。ＩＬ－１５野生型又は変異体の遺伝子配列は、Ｎ末端にＮｄｅＩ部位、Ｃ末端にＸｈｏＩ部位を有するGenScriptによってカスタム合成された。次に、GenScriptによる標準的な分子生物学の手順を使用して、配列を発現ベクターｐＥＴ－２８ａ（＋）－ＴＥＶにクローニングし、ＩＬ－１５は６ｘＨｉｓタグ及びＮ末端ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を有していた。OneShot（商標）BL21Star（商標）（DE3）Chemically Competent E. coli（ThermoFisher Scientific、C601003）での形質転換及び小規模発現は、製造元提供のプロトコルを使用して実行した。この発現系は、本明細書に開示されるＩＬ－１５及びＩＬ－１５変異体を産生するために使用され得る。

【0388】

[0418] ＩＬ－１５Ｒαの親和性はすでに非常に高かったため、変異体はＩＬ－１５Ｒβ及び／又はγ_ｃ界面にあった。変異Ｍ３及びＭ４については、それぞれ回収率が低いか、又は回収されなかったが、他の変異体は精製され、０．６５～３．１ｍｇの範囲で回収された。

【0389】

[0419] 以下の表は、以下に記載のアッセイにおける発現された変異体及びそれらの活性の概要である。

【0390】

【表4】

【0391】

実施例１４－大腸菌（E. coli）におけるＩＬ－１５変異体の産生
[0421] １５個のＩＬ－１５変異体が同定され、合成のために選択された。

【0392】

[0422] ＩＬ－１５変異体Ｍ６～Ｍ１５の場合、大腸菌（E. coli）中のＩＬ－１５発現は、２００μＬのBugBusterマスターミックスバッファー及び３５μＬのＬＤＳサンプルバッファー及び溶解後の不溶性部分用の５μｌの還元剤と共に使用した、１ｍＬのＩＰＴＧ誘導培養からのペレットを使用した小規模培養で実証された。次に、ＩＬ－１５変異体の発現を、溶解用の２００μｌのBugBusterマスターミックスバッファー及び４５μｌのＬＤＳサンプルバッファー及び溶解後の不溶性部分用の５μｌの還元剤を使用した、１ｍＬのＩＰＴＧ誘導培養からのペレットを使用したスケールアップ培養で試験した。

【0393】

実施例１５－事前に最適化されたＩＬ－１５のスケールアップ発現
[0423] 新鮮な形質転換プレートから、単一の大腸菌（E. coli）コロニーを適切な抗生物質を含む１００ｍｌのＴＢ（Terrific broth）に接種し、培養物を、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩、振とうインキュベーターに入れた。翌朝、培養物を４Ｌフラスコ内の９００ｍｌの新鮮なＴＢに加え、６００ｎｍでの吸光度（Ａ_６００）が０．６～０．８に達するまで３７℃で増殖させた。次に、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を最終濃度が０．５ｍＭになるように添加し、インキュベーションを３～５時間継続した。９，０００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離することにより細胞を回収した。上清を廃棄し、精製前にペレットを－８０℃に保った。この発現系は、本明細書に開示される他のＩＬ－１５変異体を産生するために使用され得る。

【0394】

実施例１６－ヒトＩＬ－１５のＥｘｐｉＣＨＯ発現
[0424] ExpiCHO発現システムキット（ThermoFisher #A29133）を使用して、ヒトＩＬ－１５タンパク質（ＩＬ－１５ ＷＴ（自社Ｈｉｓ_６））を発現させた。ExpiCHO-S細胞の１つのバイアルを解凍し、３０ｍｌの予熱したＥｘｐｉＣＨＯ発現培地を含む１２５ｍｌのベントキャップシェーカーフラスコに加えた。細胞を、振とう速度１３０ｒｐｍ（１９ｍｍの振とう直径）のオービタルシェーカープラットフォーム上、相対湿度が８０％以上、ＣＯ_２が８％の３７°Ｃのインキュベーター内で、３日間インキュベートした。細胞密度及び生存率をモニターし、３日目又は４日目に４×１０^６～６×１０^６生細胞／ｍｌに達したときに細胞を継代培養した。３回の継代培養後、トランスフェクション前に細胞を３×１０^６～４×１０^６細胞／ｍｌに分割した（－１日目）。トランスフェクションの日（０日目）に、細胞の密度は７×１０^６～１×１０^７生細胞／ｍｌに達し、生存率は９５～９９％であった。細胞を、予め温めておいた新鮮なExpiCHO（商標）発現培地で最終密度６×１０^６生細胞／ｍＬに希釈し、フラスコを穏やかに回転させて細胞を混合した。ExpiFectamine（商標）ＣＨＯ／プラスミドＤＮＡ複合体を調製するために、１ｍｇ／ｍｌのＩＬ－１５発現プラスミド（Genscript、pcDNA3.4 TOPOベクター）８０μｌを１．５ｍｌの滅菌マイクロフュージチューブ内の４ｍｌのOptiPRO培地に添加し、転倒混和した。６４０μｌのExpiFectamineＣＨＯ試薬を別の滅菌マイクロフュージチューブ内の７．３６ｍｌのOptiPRO培地に添加し、転倒混和した。次に、４ｍｌの希釈したExpiFectamineＣＨＯ試薬を希釈したＩＬ－１５に加え、転倒混和した。ExpiFectamineＣＨＯ試薬／プラスミドＤＮＡ複合体を室温で１～５分間インキュベートした後、２ｍｌの複合体をゆっくりと振とうフラスコに移し、移す間、フラスコを穏やかに回した。フラスコを、振とう速度１３０ｒｐｍのオービタルシェーカープラットフォーム上、相対湿度が８０％以上、ＣＯ_２が８％の３７℃のインキュベーターに戻した。トランスフェクションの翌日（１日目）に、ExpiFectamine（商標）ＣＨＯエンハンサー及びExpiCHO（商標）フィードを直ちに事前混合し、標準プロトコルのためにフラスコに加えた。添加中、フラスコを穏やかに回し、次に、振とう速度１３０ｒｐｍのオービタルシェーカープラットフォーム上、相対湿度が８０％以上、ＣＯ_２が８％の３７℃のインキュベーターに戻した。細胞を８～１０日間培養し、細胞の生存率をモニターしたところ、生存率はタンパク質の回収時に７５％を超えていた。回収のために、細胞培養上清を冷蔵遠心分離機で、４０００～５０００ｘｇで３０分間遠心分離し、次に上清を０．２２μｍフィルターでろ過した。上清を精製のために送り、発現をクーマシーブルー染色及びウエスタンブロットによって決定した。ExpiCHO発現システムでＩＬ－１５の発現が実証されたが、ＩＬ－１５タンパク質は精製及び試験されていない。本明細書に開示される全てのＩＬ－１５変異体構築物は、大腸菌（E. coli）系で産生及び精製され、例えば、ＰＳＴＡＴ、増殖、及び結合アッセイで試験された。

【0395】

実施例１７－チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるＩＬ－１５の産生
[0425] 特定のタンパク質を合成する場合、パートナー構築物のグリコシル化及び正しいジスルフィド結合の形成が重要になり得、これは、哺乳動物の発現システム（ＣＨＯ）で同定された変異体を発現させる必要もある。ExpiCHO（商標）発現システム（ThermoFisher）を使用して、ＣＨＯの変異体タンパク質の評価を行った。トランスフェクトされたサンプルには、ＷＴ ＩＬ－１５（GenScript）、及びExpiCHO（商標）発現システムに付属の対照（抗体発現陽性対照ベクター）が含まれていた。

【0396】

[0426] このために選択されたプロトコルは、選択された発現システムで使用するための標準プロトコルであり、各サイトカインを３つの別々のフラスコで培養する必要があった。合計７つのサンプルについて、追加の抗体対照も含まれている。アッセイは、２５０ｍＬフラスコ内で、およそ３５ｍＬの容量で１０日間実施し、８、９、及び１０日目に回収した。

【0397】

[0427] 分析用にタンパク質を回収するために、サンプルを４０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離した。上清をろ過して４℃で保存し、ペレットを廃棄した。

【0398】

[0428] 合成用に選択されたサンプルには、８日目に回収されたＷＴＩＬ－１５（GenScript）；９日目に回収されたＷＴＩＬ－１５（GenScript）；及び１０日目に回収されたＷＴＩＬ－１５（GenScript）が含まれていた。ウエスタンブロット分析は、＋抗体対照とともに８日目からのサンプルでも実施された。ExpiCHO（商標）培地中のサンプルでＩＬ－７の良好な発現が確認された。８日目に回収された培養物はより明るいバンドを示し、したがって、ＣＨＯ細胞でより多く発現した。ＩＬ－１５のバンド強度は低かったが、ＩＬ－１５の発現も確認され、サイズは予想より大きかった。この発現系及び分析プロトコルは、本明細書に開示される他のＩＬ－１５変異体を産生するために使用され得る。

【0399】

実施例１８－ＣＯＳ－７細胞の一過性トランスフェクション
[0429] １．０×１０^４のＣＯＳ７サル腎細胞を、トランスフェクションの１８～２４時間前に、９６ウェルプレートのウェルあたり１０％のウシ胎児血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、３０ｍｇ／ｍｌのグルタミン、及び５０ｍＭの２－メルカプトエタノール（完全培地）を含有する、体積１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地でプレーティングした。トランスフェクションの日、細胞は約７５％コンフルエントであった。ＩＬ－１５受容体βサブユニット及びγサブユニットの一過性コトランスフェクションのために、９０ｍＬの無血清ＭＥＭ培地を９６ウェルＶ底プレートのウェルに添加した。５００ｎｇのＩＬ－１５受容体β発現プラスミド（Genscript）及び５００ｎｇのＩＬ－１５受容体γ発現プラスミド（Genscript）を培地に添加し、混合した。６：１のViaFectトランスフェクション試薬（Promega #E4981）：ＤＮＡ分配の場合、６．０μＬのViaFectを加えて合計１００μＬの体積にし、直ちに混合した。ViaFect：ＤＮＡ混合物を室温で５～２０分間インキュベートした後、ウェルあたり１０μｌのViaFect：ＤＮＡ混合物を、増殖培地に１００μＬの細胞を含有する９６ウェルプレートに加えた。プレートをピペッティングにより穏やかに混合し、２４～７２時間インキュベーターに戻した。同時トランスフェクション効率は、フローサイトメトリー及びウエスタンブロットによってモニターされた。

【0400】

実施例１９－結合アッセイのためのＣｏｓ－７細胞におけるＩＬ－Ｒα及びＩＬ－２Ｒγの過剰発現
[0430] トランスフェクションの最適化を実施し、トランスフェクション効率を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）で検証した。最適化パラメーターには、使用するプラスミドの量、プラスミドとトランスフェクション試薬の比率、及びタンパク質発現の時間経過が含まれた。

【0401】

[0431] ViaFectトランスフェクション試薬（Promega #4981）を使用して最適化を行った。トランスフェクションViaFect試薬対ＤＮＡの比率は６：１であった。９６ウェルプレートのウェルあたり５０ｎｇのＤＮＡを、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－２Ｒγ、又はＩＬ－２Ｒβの単一トランスフェクションに使用し、（１）１２．５ｎｇ＋１２．５ｎｇ；（２）２５ｎｇ＋２５ｎｇ；（３）５０ｎｇ＋５０ｎｇのＤＮＡを、ＩＬ－７Ｒα／ＩＬ－２Ｒγ又はＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－２Ｒγのコトランスフェクション実験に使用した。ＦＡＣＳモニタリングは、トランスフェクションの１、２、及び３日後に実施された。図６に示すように、Ｃｏｓ－７細胞におけるＩＬ－７Ｒα及びＩＬ－２Ｒγの共発現は、２２％～２７％の二重陽性細胞を産生した。

【0402】

実施例２０－ＩＬ－１５バリアントのリフォールディング及び精製
[0432] 約３Ｌの振とうフラスコ培養物からのＨｉｓ６タグ付きＩＬ－１５を含有する凍結大腸菌（E. coli）細胞ペーストを解凍し、組織ホモジナイザーを使用して、溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に１５～２０ｍＬ／ｇ細胞ペレットの比率で懸濁した。細胞を懸濁した後、１ＭのＭｇＣｌ_２ストックから１ｍＭのＭｇＣｌ_２を添加し、５００ユニットのBenzonase（商標）（Sigma E1014）を添加した。細胞溶解は、１５～２０，０００ｐｓｉで、２回のパスでAvestin C3装置を使用して実行された。溶解物を１２，０００ｘｇで３０～５０分間、室温で遠心分離した。上清をデカントして廃棄した。細胞の破片及び封入体ペレットを水で洗浄して、より密度の高い封入体ペレットから最上層を除去した。

【0403】

[0433] 組織ホモジナイザーを使用して、ペレットを１５０～２００ｍＬの６Ｍグアニジン－ＨＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、５ｍＭのＤＴＴに懸濁した。この可溶化タンパク質溶液に、Ｎｉ^＋＋アガロース（GoldBio H-350）を十分に添加して、１ｍＬの沈降床体積を生成した。Ｎｉ^＋＋アガロースへのバッチ結合のために、タンパク質をロッキングプラットフォームに一晩置いた。翌朝、アガロースビーズを１０００ｘｇで１５分間ペレット化した。上清を廃棄し、ビーズを直径１．５ｃｍの点滴カラム（Pierce #89898）に注いだ。ビーズは、１５～２０ｍＬのバッファーを使用して、８Ｍの尿素、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＤＴＴで洗浄した。ＩＬ－１５タンパク質は、３．５ｍＬの８Ｍ尿素バッファー＋２００ｍＭイミダゾール（GoldBio I-902）を使用してカラムから溶出した。溶離液中のタンパク質濃度は、５．７７のＥ１％を使用してＵＶ吸光度スペクトルからＡ_２８０で計算された。この総タンパク質の値を使用して、リフォールディングバッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．５Ｍグリシン、１ｍＭ酸化型グルタチオン、１０ｍＭ還元型グルタチオン、ｐＨ８．０、４℃）の体積を計算して、０．１ｍｇ／ｍＬのＩＬ－１５タンパク質濃度を得た。Ｎｉ^＋＋アガロースプールを、急速に撹拌されているリフォールディングバッファーにゆっくりと加えた。溶液をペーパータオルで覆い、４℃で６５～９０時間置いた。完了したリフォールド反応は、５ｋＤ又は１０ｋＤのカットオフスピン濃縮器（Vivacell 100又はAmicon Ultracel）を使用して４～９ｍＬに濃縮した。濃縮したタンパク質を、平衡化したSuperdex 75サイズ排除カラム（１．６ｃｍ×９０ｃｍ）に適用し、Ｃａ^＋＋、Ｍｇ^＋＋を含まないダルベッコＰＢＳで、１ｍＬ／ｍｉｎで実行した。２ｍＬの画分を収集した。ＩＬ－１５のピークは、ＵＶ吸光度検出器によって識別され、典型的には、１０５ｍｌの溶出量に集中していた。このプールは、Ａ_２８０の吸光度で測定して１～２ｍｇ／ｍＬに濃縮され、４℃で保存された。これらの方法は、本明細書に開示される他のＩＬ－１５変異体を精製するために使用され得る。

【0404】

実施例２１－ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ｐＳＴＡＴ５（Ｔｙｒ６９４）アッセイにおけるＩＬ－１５及びそれらの変異体の活性
[0434] ヒト末梢血単核細胞（自社生成）を、１３５μＬの培地（１０％熱不活化血清及び４７μＭの２－メルカプトエタノール及び１０μＭのＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０）中、１７５，０００細胞／ウェルでＶ底９６ウェルプレートにプレーティングした。サイトカイン曲線を作成する間、細胞プレートを３７℃のインキュベーターに置いた。サイトカインは、前述の冷ＲＰＭＩ培地を使用して９６ウェルプレートで段階希釈した。ＩＬ－１５（又は変異体）サンプルは、１００，０００ ｐｇ／ｍＬから開始して、１：３希釈、１１ｐｔ＋ゼロサイトカイン（未刺激）に段階希釈した。ｈＰＢＭＣの刺激は、３７℃で振とうしながら、ウェルあたり１５μＬの希釈サイトカインを使用して１０分間実施した。「未刺激」と呼ばれるウェルは、１５μＬの培地のみを受けた。プレートを直ちにプレートシールで密封し、細胞を４００×ｇで５分間ペレット化した。マルチチャンネルアスピレーターを使用して、ウェルから培地を除去した。７５μＬの冷ＭＳＤで調製した溶解バッファーを直ちにウェルに加えた。プレートを４℃で少なくとも３０分間、振とうしながら置いた。ＭＳＤキットの指示（カタログ番号K150IGD）に従って、ｐＳＴＡＴ５を検出した。データを表４に示す。

【0405】

実施例２２－細胞機能分析
[0435] ＩＬ－１５変異体のＪＡＫ１，３／ＳＴＡＴ５シグナル伝達を評価した。特に、ｐＳＴＡＴ５リン酸化は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む研究対象の細胞株で評価された。

【0406】

[0436] ＪＡＫ１，３／ＳＴＡＴ５シグナル伝達を評価するためのプロトコルは、次のとおりであり、上記のとおりである。
１．凍結したＰＢＭＣを素早く解凍し、アッセイ培地で細胞を１０ｍＬに希釈し、１２５ｘｇで５分間ペレット化する。
２．細胞をアッセイ培地に再懸濁し、９６ウェルプレート（ウェルあたり約２００，０００細胞）のｖ底プレートに１３５μｌ／ウェルでプレーティングする。
３．サイトカインを調製している間、細胞プレートを３７℃で置く。
４．氷上で、ＩＬ－１５構築物を希釈する。ＩＬ－１５には１００，０００ｐｇ／ｍＬの最終希釈液を使用した。１：３希釈で、サイトカイン対照なしで１１ポイントの曲線を使用した。
５．１５μＬのサイトカイン希釈液を細胞に加える。３７℃のインキュベーター内の振とう器に１０分間置く。
６．１０分後、５分間の遠心分離によって、合計１５分間、細胞をペレット化する。培地を吸引し、７５μＬの冷ＭＳＤ溶解バッファーで細胞を溶解し、４℃のシェーカーに３０分間置く。
７．溶解の完了後、ｐＳＴＡＴ５のＭＤＳプロトコルに従って、未希釈の溶解物を分析に使用する。
８．アッセイ読み取り：MSD Multi-Spot Assay System／Phospho-STAT5a,b（Tyr694）
９．対照／プレート、ＩＬ－１５：
R&D SystemsのｒｈＩＬ－１５、２回実行
自社のｒｈＩＬ－１５ ＷＴ、２回実行

【0407】

[0437] 上記のプロトコルを使用して生成されたデータの要約が表４及び図７に提供される。ＷＴ ＩＬ－１５ ＳＥＣ精製画分６は、図８に示されるように、ヒトＰＢＭＣにおけるｐＳＴＡＴ５アッセイにおいて活性を示した。さらに、Ｍ２（Ｎ７２Ｒ）及びＭ５（Ｎ７９Ｓ）のサイトカイン活性の例示的な曲線が、それぞれ図９及び図１０、並びに以下の表５に提供されている。商業的供給源から得られた野生型ＩＬ－１５及び大腸菌（E. coli）で自社産生した野生型及び様々な点変異体のＩＬ－１５は全て、７６～８３６ｐｇ／ｍＬの範囲のＥＣ_５０値で濃度的に経路活性化の読み取りとしてＳＴＡＴ５リン酸化を誘導した。

【0408】

【表5】

【0409】

実施例２３－細胞増殖アッセイ
[0439] ２つの異なる試薬（ＣＣＫ－８及びAlamar Blue）を試験して、ＩＬ－１５刺激に応答したマウス２Ｅ８細胞の増殖をアッセイするための最適な条件を決定した。２つのアッセイの感度に基づいて、Ｍ－０７ｅ細胞でさらにアッセイを発展させるためにAlamar Blue試薬が選択された。組換えヒトＩＬ－１５に応答したＭ－０７ｅ細胞の増殖を以下に説明する。

【0410】

[0440] マウスＩＬ－１５（ｍＩＬ－１５）とヒトＩＬ－１５（ｈＩＬ－１５）を比較した１２ポイントＩＬ－１５用量反応につき、Ｍ－０７ｅ細胞におけるAlamar Blue増殖アッセイの細胞増殖プロトコルは、次のとおりであり、以下でさらに説明する。
５．Ｍ－０７ｅ細胞を適切な培地（例えば、ＤＰＢＳ）で３回洗浄し、ＩＬ－１５を含有しない１００μＬの培地中、９６ウェルプレートに１×１０^５細胞／ｍＬでプレーティングする。最も内側の６０個のウェルのみが使用され、エッジ効果を最小限に抑えるために、外側のウェルには２００μＬのＤＰＢＳが充填されている。
６．１００μＬのｍＩＬ－１５又はｈＩＬ－１５を反復添加して、０．０００６～１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度とする。
７．７２時間のインキュベーション後、２５μＬ／ウェルのAlamar Blue溶液を加え、プレートを３７℃でインキュベートする。
８．２０時間後に蛍光（５３０ｅｘ／５９０ｅｍ）を読み取る。

【0411】

実施例２４－組換えヒトＩＬ－１５に応答したＭ－０７ｅ細胞の増殖
[0441] 組換えヒトＩＬ－１５の活性は、Ｍ－０７ｅヒト急性巨核芽球性白血病細胞を使用した増殖アッセイで測定された。Ｍ－０７ｅ細胞（DSMZ カタログ番号ACC104）は、ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン（Ｐ／Ｓ／Ｇ）及び組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（R&D Systems カタログ番号215-GM-010）を１０ｎｇ／ｍｌで添加したＲＰＭＩ １６４０＋１０％熱不活化ＦＢＳで増殖及び継代培養した。増殖アッセイでは、細胞を１５０ｘｇで５分間遠心分離して、ＧＭ－ＣＳＦを含有する増殖培地を除去した。ＲＰＭＩ １６４０＋１０％熱不活化ＦＢＳ及びＰ／Ｓ／Ｇ（アッセイ培地）を含有する培地で細胞を３回洗浄した後、アッセイ培地で４時間サイトカインを飢餓させた。４時間の終わりに、細胞を９６ウェル平底プレートに４５，０００細胞／ウェルで１５０μＬのアッセイ培地にプレーティングし、組換えヒトＩＬ－１５（野生型又は様々な変異体）を、アッセイ培地中、５０μＬの４ｘワーキングストック溶液として添加した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターに７２時間入れた。７２時間の終わりに、細胞を４００ｘｇで５分間遠心分離し、１００μＬの培地を除去した。細胞を１００μＬのCellTiter-Glow（商標）試薬（Promegaカタログ番号G7570）で５分間溶解した。次に、プレートを室温で５～１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化した。５０μＬの溶解物を不透明壁の９６ウェルプレートに移し、プレートリーダーを使用して発光を記録した。データを表４に示す。

【0412】

実施例２５－ＩＬ－１５ ＴＲ－ＦＲＥＴリガンド－受容体結合アッセイ
[0442] ＩＬ－１５結合親和性は、組換えＩＬ－１５及びＩＬ－２受容体－β（ＩＬ－２Ｒβ）の濃度範囲でＴＲ－ＦＲＥＴ蛍光シグナルを測定することによって決定される。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋０．０５％ＢＳＡ及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ－２０のバッファー中、２００ｎＭ ＴＲ－ＦＲＥＴアクセプター結合α６－ｈｉｓ ＩｇＧ（Perkin Elmer # TRF0105-M）、１００ｎＭ ＴＲ－ＦＲＥＴドナー結合α－ヒトＩｇＧ（Perkin Elmer # AD0074）、組換え６－ｈｉｓタグ付きＩＬ－１５野生型又は変異体バリアント（最大２００ｎＭの濃度）、及び組換えＦｃタグ付きＩＬ－２Ｒβ（Sino Biologicals # 10696-H02H）（最大１００ｎＭの濃度）の５ｘストックを作製する。試験する各サンプルについて、４μＬのα６－ｈｉｓＩｇＧ結合アクセプターの５ｘストックを、４μＬのＩＬ－１５の５ｘワーキングストックと混合する。これとは別に、各サンプルについて、α－ヒトＩｇＧに結合した４μＬの５ｘＴＲ－ＦＲＥＴドナーを、Ｆｃドメインに結合した４μＬの組換えＩＬ－２Ｒβの５ｘワーキングストックと混合する。混合物を室温で３０分間インキュベートする。インキュベーション中に、３μｇ／ｍｌ Ｆｃブロック（BD Pharmingen # 564220）の５ｘストックを調製する。３０分間のインキュベーション後、４μＬの５ｘＦｃブロックをＩＬ－２Ｒβ／α－ヒトＩｇＧの各サンプルに加え、室温でさらに１５分間インキュベートする。インキュベーション中、８μＬのα６－ｈｉｓ結合アクセプター／ＩＬ－１５ミックスは、３８４ウェルの浅い黒色ProxiPlate（Perkin Elmer # 6008260）の指定されたウェルに分配される。１５分間のインキュベーション後、１２μＬのα－ヒトＩｇＧ結合ドナー／ＩＬ－２Ｒβ／Ｆｃブロック混合物を、適切な濃度のＩＬ－１５＋アクセプターを含有する指定のウェルに入れる。プレートを直ちに７５０ｒｐｍで３０秒間回転させ、直ちにPHERAstarプレートリーダー（BMG Labtech）に入れて、ＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを読み取る。次の３０分間連続して、ドナーシグナル（３３７ｎＭ励起／６２０ｎＭ発光）及びアクセプターシグナル（３３７ｎｍ励起／６５５ｎｍ発光）の蛍光を読み取る。ＴＲ－ＦＲＥＴ結合シグナルは、ドナーシグナルに対するアクセプターシグナルの比率を取り、１０，０００を掛けることによって決定される。平衡は、蛍光活性が減衰し始める前の読み取り値がプラトーになる時点で定義される。次に、平衡値は、グラフ作成プログラムGraFit（Erithacus Software）を使用して、単一部位結合を仮定した標準平衡方程式に適合する。

【数2】

【0413】

[0443] 変異体ＩＬ－１５タンパク質のＩＬ－１５Ｒβへの結合は、ＴＲ－ＦＲＥＴ（上記）を使用して評価した。同じアッセイで市販ＩＬ－１５と自社ＩＬ－１５を直接比較すると、商業的供給元（Sino Biologicals；ベンダーＩＬ－１５）から入手した組換えＩＬ－１５は、自社産生の組換えＩＬ－１５と同じ活性を有することがわかった。図１１に示すように、「変換係数」は、アッセイが測定するもの（ＴＲ－ＦＲＥＴ比）とリガンド：受容体複合体の濃度との間の線形関係を示す。この実験では、２つのサンプルセットは、独立して分析した場合、ほぼ同等の変換係数を有していた。結合活性の最も直接的な測定値はＫｄであり、２つのサンプルは互いに２０％以内のＫｄ値を示した（１０．３ｎＭ対１２．４ｎＭ）。また、活性は１２．５倍過剰のタグなしＩＬ－１５と競合していることにも注目した。

【0414】

[0444] ＩＬ－１５変異体Ｍ２（Ｎ７２Ｒ）及びＭ５（Ｎ７２Ｓ）は、ＩＬ－２Ｒβへの結合について試験し、ＷＴと比較した。ＷＴ Ｋｄは０．９５ｎＭであると決定された一方、変異体Ｍ２及びＭ５のＫｄ値は、それぞれ３１．３６ｎＭ及び２．６３ｎＭであった（図１２）。これらのデータは、変異体Ｍ５がＷＴ ＩＬ－１５と同じ親和性を有する一方、変異体Ｍ２はＷＴよりも約３倍弱いことを示唆している。注目すべきことに、結合親和性が弱いか、又はタンパク質の安定性が低いかを区別することはできない。注目すべきことに、これはβ受容体のみが存在する状態で行われた。

【0415】

[0445] Ｍ５変異体（Ｎ７９Ｓ）は、完全に無害な陽性対照であることが意図された。Ｎ７９Ｓ変異はグリコシル化部位を除去するため、大腸菌（E. coli）はＣＨＯで産生されるタンパク質と同一のタンパク質を産生できる。これは、サイトカインのグリコシル化が、結果として生じるタンパク質の活性に影響を与えないためである。Ｍ５はＷＴ構築物とほぼ同等であるようであり、これは設計仮説をサポートする。グリコシル化は、分子量（ＭＷ）を増加させて排出を減少させるのに役立ち得るが、この分野ではさらなる研究が必要である。

【0416】

[0446] Ｍ２（Ｎ７２Ｒ）変異体は、約１％のＷＴ活性として報告されたが、予測では、この変異体はＷＴと同等であるはずであることが示された。Ｎ７２Ｒ変異は、ＷＴ構築物とほぼ同等の効力があるようである。しかし、変異体を試験するための実行では、特に上部で、完全な曲線は示されなかった。Ｎ７２Ｒ変異体は、最高用量で完全応答を示すようである（部分アゴニストとは対照的に、より低活性）。報告された変異体は、本発明とは異なり、融合構築物であった。

【0417】

[0447] 試験した他の３つの変異体（Ｎ７２Ｙ、Ｎ７９Ｅ）は、Ｎｉカラムへの結合が不十分で、回復も不十分であったが、発現は良好に見えた。Ｎ７２Ｄ変異体は、Altor Bioscienceの「スーパーアゴニスト」変異である（Zhu et al., J Immunol 183:3598-3607, 2009；Liu et al., J Biol Chem 291:23869-91, 2016）。

【0418】

実施例２６－受容体γを有する又は有しないＩＬ－１５ＲβへのＩＬ－１５の結合
[0448] 受容体γに効果があるかどうかを確認するために、自社で調製したｒＩＬ－１５を使用して２セットの条件を比較した。試験した２つの条件は、（１）（＋）２０ｎＭ受容体γがある場合、及び（２）（－）受容体γがない場合である。図１３に示されるように、γ受容体の存在下で見かけの親和性の８倍の増加が見られた。γ受容体なしで測定されたＫ_ｄは２８．５ｎＭであり、以前の分析（１０ｎＭ）よりも高かった。γ受容体の存在下での親和性の増加が予想された。データへの適合は望ましいほど強くはなく、これらの結果を検証するにはさらなる調査が必要である。最高の受容体濃度での適合は、低濃度よりもロバストではないようである。データを適合させるために使用されたモデルは、γ及びβが１つの結合ユニットとして機能する、より単純化された結合モデルを仮定している。

【0419】

[0449] 表６は、ＩＬ－１５受容体結合効率の概要を提供する。

【0420】

【表6】

【0421】

実施例２７－ＩＬ－１５－^１２５Ｉ標識受容体－リガンド結合アッセイ
[0451] ＩＬ－１５結合は、ＩＬ－２Ｒβ受容体を含有する膜抽出物への結合において^１２５Ｉ標識ＩＬ－１５と競合する非標識組換えＩＬ－１５（ｗｔ又は変異体）の能力を定量化することによって決定される。膜抽出物は、１．０×１０^６～１．５×１０^６細胞／ｍｌの密度に増殖した細胞株Ｍ－０７ｅ（DSMZ # ACC 104）から得られる。Mem-PER（商標）Plusタンパク質抽出キット（Thermo Fisher Scientific # 89842）を使用して、約７．５×１０^６個の総細胞を抽出のために沈降させる。総タンパク質濃度は、Pierce（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Thermo Fisher Scientific # 23225）を使用して決定される。試験する各ウェルについて、１．５μｇのＭ－０７ｅ膜抽出物を、０．２５ｍｇのＷＧＥＰＶＴ ＳＰＡビーズ（Perkin Elmer # RPNQ0001）とともに４℃で最終容量２０μＬｘ実験ウェル数（過剰容量はＰＢＳ ｐＨ７．４＋０．１％ＢＳＡ）で、４時間～一晩インキュベートする。インキュベーション後、膜結合ビーズを１ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄し、最終容量の実験ウェル数ｘ５０μＬのＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁する。９６ウェル白色OptiPlates（Perkin Elmer # 6005290）に、プレート上の指定ウェルに４倍の指定濃度でＰＢＳ／ＢＳＡ中の２５μＬの非標識ＩＬ－１５を添加する。次に、２５μＬの^１２５Ｉ標識ＩＬ－１５（ＩＬ－１５は、Sino Biological # 10360-H07E；^１２５Ｉ標識は、Perkin Elmer # CusReag1）を３．６ｎＭ（５ｎＣｉ／μｌ）の４倍濃度で各ウェルに添加する。結合を開始するために、膜に結合した５０μＬのビーズを各ウェルに加え、ピペッティングで混合する。室温で２時間インキュベートした後、プレートを７５０ｒｐｍで５分間回転させる。次に、^１２５Ｉ標識ＩＬ－１５の結合を、TopCountシンチレーションカウンター（Hewlatt Packard）で測定する。結合親和性は、４パラメーターＩＣ_５０カーブフィッティング方程式を使用してＩＬ－１５組換えタンパク質バリアントのＩＣ_５０値を決定するために、カーブフィッティンググラフ作成プログラムGraFit（Erithacus Software）を使用して決定された。

【数3】

【0422】

[0452] 前述のプロトコル及びそのバリアントは、ＩＬ－１５及びその変異体の競合的受容体結合を評価するために使用され得る。一部のＩＬ－１５変異体は、野生型と同等以上の親和性で受容体に結合すると予想される。

【0423】

[0453] 図１４は、Ｍ－０７ｅ膜抽出物のウエスタンブロットを示す。Ｍ－０７ｅは、ＩＬ－１５に応答する細胞株である。この細胞株は、ＩＬ－１５の^１２５Ｉ標識結合のための受容体の優れた供給源である。受容体のβ及びγサブユニットの両方を試験し、同じブロットを再プローブした。図に示すように、予想されるサイズの組換えバンドが両方の画像で見られる。α－γ抗体の画像はバンドを示さないようであったが、α－βプローブは予想されるＭＷで淡いバンドを示した。最も低い組換えタンパク質バンドは、５０ｆｍｏｌのタンパク質を表す。^１２５Ｉを使用すると、２００ｆｍｏｌ／ｍｇの低さで検出できるはずである。受容体タンパク質の列にあるものより１０倍小さい淡いバンドは、依然として１０００ｆｍｏｌ／ｍｇを表すはずである。受容体の濃度が低いにもかかわらず、^１２５Ｉ結合がアッセイで検出するには十分である可能性がある。

【0424】

[0454]
実施例２８－開示されるアミノ酸配列

【0425】

【表7】

【0426】

【表8】

【0427】

【表9】

【0428】

【表10】

【0429】

【表11】

【0430】

【表12】

【0431】

実施例３０－抗ＣＤ４７融合タンパク質
[0456] 本明細書に開示される融合ポリペプチドは、それぞれヒトカッパ又は任意のヒトＦｃ ＩｇＧ定常ドメインと組み合わされた、ヒト重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。抗体軽鎖又は抗体重鎖のＣ又はＮ末端のいずれかにあるグリシン－セリンリンカー（Ｇ４Ｓ）ｎは、ＩＬ－７（野生型又は変異体）を抗体ポリペプチドに結合するように設計された。これらの融合構築物は、分泌シグナルを組み込むように設計され、哺乳動物の発現システムにクローン化され、抗体融合タンパク質を生成するためにＣＨＯ細胞にトランスフェクトされる。タンパク質バリアントが発現され、培地に分泌され、プロテインＡレジンを使用して精製された。

【0432】

[0457] 抗ＣＤ４７融合タンパク質の一部は、第１のポリペプチド重鎖及び第２のポリペプチド軽鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第１のドメイン、重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）、及び（ｉｉ）重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）のＣ末端に融合した改変／変異体ＩＬ－７又は改変／変異体ＩＬ－１５配列を含み；第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）の結合領域及び（ｉｉ）軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。

【0433】

[0458] 抗ＣＤ４７融合タンパク質の一部は、第１のポリペプチド重鎖及び第２のポリペプチド軽鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第１のドメイン、及び重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）を含み、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）の結合領域、軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）、及び重鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）のＣ末端に融合した改変／変異体ＩＬ－７又は改変／変異体ＩＬ－１５配列を含む。

【0434】

[0459] 抗ＣＤ４７融合タンパク質の一部は、第１のポリペプチド重鎖及び第２のポリペプチド軽鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域を含む第１のドメイン、及び重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）を含み、第２のポリペプチドは、軽鎖可変ドメインの結合領域のＮ末端に融合した改変／変異体ＩＬ－７又は改変／変異体ＩＬ－１５配列、及び軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。

【0435】

[0460] 抗ＣＤ４７融合タンパク質の一部は、第１のポリペプチド重鎖及び第２のポリペプチド軽鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）の結合領域のＮ末端に融合した改変／変異体ＩＬ－７又は改変／変異体ＩＬ－１５配列、及び重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）を含み、第２のポリペプチドは、免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）の結合領域及び軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）を含む。

【0436】

[0461] 一実施形態において、改変／変異体ＩＬ－７配列及び抗ＣＤ４７融合タンパク質のＶ_Ｈ又はＣ_Ｈドメインは、ＧＧＧＧＳの反復配列を有する短いリンカーによって分離され得、短いリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎとして表すことができ、ｎの値は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０である。リンカーは、各結合ドメイン間の立体障害を最小限に抑えるのに十分な長さである必要がある。いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシン及び／又はセリンである。

【0437】

[0462] 別の実施形態において、改変／変異体ＩＬ－１５配列及び抗ＣＤ４７融合タンパク質のＶ_Ｈ又はＣ_Ｈドメインは、ＧＧＧＧＳの反復配列を有する短いリンカーによって分離され得、短いリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎとして表すことができ、ｎの値は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０である。リンカーは、各結合ドメイン間の立体障害を最小限に抑えるのに十分な長さである必要がある。いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシン及び／又はセリンである。

【0438】

[0463] 第１の重鎖融合ポリペプチド及び第２の軽鎖融合ポリペプチドを含む抗ＣＤ４７融合タンパク質は、本明細書に記載され、限定されない当技術分野で公知の方法を使用して、表７に開示されている改変／変異体ＩＬ－７又は改変／変異体ＩＬ－１５配列により構築することができる。

【0439】

実施例３１－抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質は組換えヒトＣＤ４７に結合する
[0464] 細胞上に発現するヒトＣＤ４７への抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質、抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質及び抗ＣＤ４７ｍＡｂの結合をインビトロで測定する。組換えＣＤ４７へのインビトロ結合では、Ｈｉｓ－ＣＤ４７（AcroBiosystems）を４℃で一晩、高結合マイクロタイタープレートに吸収させる。ウェルは洗浄され、ブロックされ、増加する濃度の抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質、抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質、抗ＣＤ４７抗体（対照）、又は対照ＩｇＧ抗体（対照）は、１時間にわたりウェルに添加される。ウェルを洗浄し、次に、ＨＲＰ標識二次抗体と１時間インキュベートした後、洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加して成長させる。

【0440】

抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質は、濃度依存的に、抗ＣＤ４７抗体（対照）と同様の親和性でＨｉｓ－ＣＤ４７に結合すると予想される。陰性対照ＩｇＧ抗体は、Ｈｉｓ－ＣＤ４７に結合しないと予想される。

【0441】

表７に開示されるように、改変／変異体ＩＬ－１５で構築された抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質は、濃度依存的に、抗ＣＤ４７抗体及び実施例３０に記載の抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質と同様の親和性でＨｉｓ－ＣＤ４７に結合することが予想される。

【0442】

実施例３２－抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質はＴ細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化を活性化する
抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質がインビトロでのＰＢＭＣ由来Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５活性に及ぼす効果を評価するために、フローサイトメトリーを使用した以下の方法が採用される。

【0443】

ヒト－ＰＢＭＣは、ヒト末梢血の白血球アフェレーシスによって得られ、１０％ウシ胎児血清（BioWest；カタログ番号S01520）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Corning、カタログ番号30-001-CI）を含むＲＰＭＩ（Corning、カタログ番号10-104-CV）の組織培養グレードフラスコで、３７℃で一晩培養される。インビトロｐＳＴＡＴ５刺激アッセイでは、２００μＬのＲＰＭＩ培地あたり１～３×１０^５のＰＢＭＣを、９６ウェルの組織培養処理プレートにウェルごとにプレーティングする。融合タンパク質の１１倍段階希釈系列（０．０４～３０μｇ／ｍＬ）をＰＢＭＣ培養物に添加し、３７℃で１５分間インキュベートする。細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、Fix Buffer 1（BD Phosflow、カタログ番号557870）で固定する。ＰＢＭＣを染色バッファー（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）で２回洗浄し、Perm Buffer III（BD Phosflow、カタログ番号558050）で透過処理した。細胞を染色バッファーで２回洗浄し、Brilliant-blue 515結合抗ヒトＣＤ３抗体（BD Biosciences、カタログ番号564465）及び抗ｐＳＴＡＴ５－ＰＥ（BD Biosciences、カタログ番号562077）で染色し、Attune NxTフローサイトメーター（Life Technologies）を使用したフローサイトメトリーにより、ｐＳＴＡＴ５陽性のＣＤ３陽性Ｔ細胞の割合を分析する。

【0444】

抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質は、濃度依存的にＴ細胞のＳＴＡＴ５のリン酸化を増加させると予想される。

【0445】

改変／変異体ＩＬ－７で構築された抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質、表７に開示されるように改変／変異体ＩＬ－１５で構築された抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質、抗ＣＤ４７ｍＡｂとＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はそれらの改変／変異体バリアントとの組み合わせは、濃度依存的にＴ細胞のＳＴＡＴ５のリン酸化を増加させることが予想される。

【0446】

実施例３３－抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質によるヒトＴ細胞におけるｐＳＴＡＴ５のトランス活性化
腫瘍細胞に結合した後の、インビトロでのＰＢＭＣ由来Ｔ細胞のｐＳＴＡＴ５活性に対するＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質の能力を評価するために、フローサイトメトリーを使用した以下の方法が採用される。

【0447】

ヒトＣＤ４７を過剰発現するＯＶ１０－３１５卵巣腫瘍細胞を９６ウェルプレートに一晩プレーティングする。ヒト－ＰＢＭＣは、ヒト末梢血の白血球アフェレーシスによって得られ、１０％ウシ胎児血清（BioWest；カタログ番号S01520）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Corning、カタログ番号30-001-CI）を含むＲＰＭＩ（Corning、カタログ番号10-104-CV）の組織培養グレードフラスコで、３７℃で一晩培養される。抗ＣＤ４７－ＩＬ－７又は抗ＣＤ４７－ＩＬ１５融合タンパク質の濃度を上げながら、ＯＶ１０－３１５細胞と１時間インキュベートする。１％ＦＢＳ含有するＰＢＳで６回洗浄して未結合のタンパク質を全て除去した後、２００μＬのＲＰＭＩ培地あたり１～３×１０^５ＰＢＭＣをウェルごとにプレーティングし、３７℃で１５分間インキュベートする。細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、Fix Buffer 1（BD Phosflow、カタログ番号557870）で固定する。ＰＢＭＣを染色バッファー（ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ）で２回洗浄し、Perm Buffer III（BD Phosflow、カタログ番号558050）で透過処理する。細胞を染色バッファーで２回洗浄し、Brilliant-blue 515結合抗ヒトＣＤ３抗体（BD Biosciences、カタログ番号564465）及び抗ｐＳＴＡＴ５－ＰＥ（BD Biosciences、カタログ番号562077）で染色し、Attune NxTフローサイトメーター（Life Technologies）を使用したフローサイトメトリーにより、ｐＳＴＡＴ５陽性のＣＤ３陽性Ｔ細胞の割合を分析する。

【0448】

融合タンパク質は、ＣＤ４７発現腫瘍細胞に濃度依存的に結合した後、Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ５のリン酸化を増加させると予想される。

【0449】

表７に開示されているような、それぞれ改変／変異体ＩＬ－７又は改変／変異体ＩＬ－１５、及び抗ＣＤ４７ｍＡｂとＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はそれらの改変／変異体バリアントとの組み合わせで構築される抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質は、濃度依存的に腫瘍細胞に結合した後、Ｔ細胞のＳＴＡＴ５のリン酸化を増加させることが予想される。

【0450】

実施例３４－Ｔ細胞の生存率における抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質の補助
抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質がインビトロでのＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の生存率に及ぼす効果を評価するために、フローサイトメトリーを使用した以下の方法が採用される。

【0451】

ヒト－ＰＢＭＣは、ヒト末梢血の白血球アフェレーシスによって得られ、１０％ウシ胎児血清（BioWest；カタログ番号S01520）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Corning、カタログ番号30-001-CI）を含むＲＰＭＩ（Corning、カタログ番号10-104-CV）の組織培養グレードフラスコで、３７℃で一晩培養される。インビトロ増殖アッセイでは、２００μＬのＲＰＭＩ培地あたり１×１０^５のＰＢＭＣを、９６ウェルの組織培養処理プレートにウェルごとにプレーティングする。抗ＣＤ４７－ＩＬ－７又は抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質の１１倍段階希釈系列（０．０４～３０μｇ／ｍＬ）をＰＢＭＣ培養物に添加し、３７℃で４日間インキュベートする。培養完了前に、細胞を５－エチニル－２－デオキシウリジン（ＥｄＵ、Invitrogen、カタログ番号C10634）とともに２４時間インキュベートする。ＥｄＵは、Alexafluor 647ピコリルアジド試薬を使用して検出され、Brilliant-blue 515結合抗ｈＣＤ３抗体（BD Biosciences、カタログ番号564465）で染色され、Attune NxTフローサイトメーター（Life Technologies）を使用したフローサイトメトリーによって分析される。

【0452】

抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質は、ＥｄＵインキュベーション期間中にＤＮＡが合成された細胞の核における蛍光シグナルの蓄積に寄与し、生存率及び増殖の増加を示すことが予想される。

【0453】

表７に開示されているような、それぞれ改変／変異体ＩＬ－７又は改変／変異体ＩＬ－１５、及び抗ＣＤ４７ｍＡｂとＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はそれらの改変／変異体バリアントとの組み合わせで構築される抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質は、ＥｄＵインキュベーション期間中にＤＮＡが合成された細胞の核における蛍光シグナルの蓄積に寄与し、生存率及び増殖の増加を示すことが予想される。

【0454】

実施例３５－Ｔ細胞の生存率における抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質の補助によるトランス活性化
腫瘍細胞に結合した後の、インビトロでのＰＢＭＣ由来Ｔ細胞の生存率に対する抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質の能力を評価するために、フローサイトメトリーを使用した以下の方法が採用される。

【0455】

ヒトＣＤ４７を過剰発現する、照射又は化学的に処理されたＯＶ１０－３１５卵巣腫瘍細胞を９６ウェルプレートに一晩プレーティングする。ヒト－ＰＢＭＣは、ヒト末梢血の白血球アフェレーシスによって得られ、１０％ウシ胎児血清（BioWest；カタログ番号S01520）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Corning、カタログ番号30-001-CI）を含むＲＰＭＩ（Corning、カタログ番号10-104-CV）の組織培養グレードフラスコで、３７℃で一晩培養される。抗ＣＤ４７－ＩＬ－７又は抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質の濃度を上げながら、ＯＶ１０－３１５細胞と１時間インキュベートする。１％ＦＢＳ含有するＰＢＳで６回洗浄して未結合のタンパク質を全て除去した後、２００μＬのＲＰＭＩ培地あたり１×１０^５ＰＢＭＣをウェルごとにプレーティングし、３７℃で４日間インキュベートする。培養完了前に、細胞をＥｄＵ（Invitrogen、カタログ番号C10634）とともに２４時間インキュベートする。ＥｄＵｕは、Alexafluor 647ピコリルアジド試薬を使用して検出され、Brilliant-blue 515結合抗ヒトＣＤ３抗体（BD Biosciences、カタログ番号564465）で染色され、Attune NxTフローサイトメーター（Life Technologies）を使用したフローサイトメトリーによって分析される。

【0456】

抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質は、ＥｄＵインキュベーション期間中にＤＮＡが合成された細胞の核における蛍光シグナルの蓄積に寄与し、生存率及び増殖の増加を示すことが予想される。

【0457】

表７に開示されているような、それぞれ改変／変異体ＩＬ－７又は改変／変異体ＩＬ－１５、及び抗ＣＤ４７ｍＡｂとＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はそれらの改変／変異体バリアントとの組み合わせで構築される抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質は、ＥｄＵインキュベーション期間中にＤＮＡが合成された細胞の核における蛍光シグナルの蓄積に寄与し、生存率及び増殖の増加を示すことが予想される。

【0458】

実施例３６－ヒト化ＮＳＧマウスのＯＶ９０卵巣異種移植モデルにおける抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質の抗腫瘍活性
ヒト化ＮＳＧマウスのＯＶ９０卵巣異種移植モデルにおける、抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７＿ＩＬ－１５融合タンパク質の抗腫瘍特性、並びに抗ＣＤ４７ ｍＡｂとＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はそれらの改変／変異体バリアントとの組み合わせが評価される。

【0459】

ＮＳＧマウスは、骨髄破壊処置後、適格な供給源からのヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋幹細胞を使用した養子移入によってヒト化される。ＣＤ３４＋幹細胞は、免疫不全ＮＳＧマウス内に生着するヒト免疫細胞に発達する。

【0460】

臍帯血由来の造血幹細胞（ＨＳＣ）を移植したモデルは、多系統の移植を発達させ、強力なＴ細胞成熟及びＴ細胞依存性炎症反応を示す。

【0461】

ヒト化雌性ＮＳＧマウス（NOD-Cg-PrkdcscidI12rgtm1Wjl/SzJ、Jackson Laboratories）の右脇腹に、５×１０^６個のＯＶ９０卵巣癌細胞（ＡＴＣＣ）の懸濁液を含有する０．１ｍＬの３０％ＲＰＭＩ／７０％Matrigel（商標）（BD Biosciences；Bedford, MA）混合物を皮下移植する。デジタルノギスは、腫瘍の幅及び長さの直径を測定するために使用される。腫瘍体積は、次の式を使用して計算される：腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（ａ×ｂ^２／２）（式中、「ｂ」は最小直径であり、「ａ」は最大直径である）。５０～１００ｍｍ^３の触知可能な腫瘍体積を有するマウスは、マウス１０匹／グループにランダム化される。マウスは、適切なレジメン、すなわち、腹腔内注射（ＩＰ）による週５日、合計６週間（ＱＤ５ｘ６）、又は静脈内注射（ＩＶ）による週１回、合計６週間によって、１）ヒトＩｇＧ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）；２）選択された抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質（１０ｍｇ／ｋｇ）；３）選択された抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質（１０ｍｇ／ｋｇ）；４）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ；５）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－７；６）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－１５；７）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－７改変／変異体バリアント；及び８）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－１５改変／変異体バリアントで処置される。

【0462】

平均腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、次の式を使用して計算される。腫瘍収縮（ＴＳ）を示すマウスは、ＴＧＩ計算から除外される。

【数4】

【0463】

腫瘍体積の有意差は、テューキーの多重比較検定で、独立二元配置分散分析を使用して確認される。

【0464】

対照グループを除いて、全ての処置グループ：１）ヒトＩｇＧ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）；２）選択された抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質（１０ｍｇ／ｋｇ）；３）選択された抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質（１０ｍｇ／ｋｇ）；４）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ；５）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－７；６）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－１５；７）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－７改変／変異体バリアント；及び８）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－１５改変／変異体バリアントは、ＯＶ９０ヒト卵巣異種移植モデルにおいて、１日１０ｍｇ／ｋｇの投与量で統計的に有意な腫瘍増殖の阻害をもたらすことが予想される。

【0465】

実施例３７－ヒト化ＮＳＧマウスのＳＮＵ－１胃癌異種移植モデルにおける抗ＣＤ４７－ＩＬ－７及び抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質の抗腫瘍活性
ＮＳＧマウスのＳＮＵ－１胃癌異種移植モデルにおける、抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質の抗腫瘍特性、並びに抗ＣＤ４７ ｍＡｂとＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はそれらの改変／変異体バリアントとの組み合わせが評価される。

【0466】

ＮＳＧマウスは、骨髄破壊処置後、適格な供給源からのヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋幹細胞を使用した養子移入によってヒト化される。ＣＤ３４＋幹細胞は、免疫不全ＮＳＧマウス内に生着するヒト免疫細胞に発達する。

【0467】

臍帯血由来の造血幹細胞（ＨＳＣ）を移植したモデルは、多系統の移植を発達させ、強力なＴ細胞成熟及びＴ細胞依存性炎症反応を示す。

【0468】

ヒト化雌性ＮＳＧマウス（NOD-Cg-PrkdcscidI12rgtm1Wjl/SzJ、Jackson Laboratories）の右脇腹に、５×１０^６個のＳＮＵ－１胃癌細胞（ＡＴＣＣ）の懸濁液を含有する０．１ｍＬの３０％ＲＰＭＩ／７０％Matrigel（商標）（BD Biosciences；Bedford, MA）混合物を皮下接種する。接種から８日後、デジタルノギスを使用して腫瘍の幅及び長さの直径を測定する。腫瘍体積は、次の式を使用して計算される：腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（ａ×ｂ^２／２）（式中、「ｂ」は最小直径であり、「ａ」は最大直径である）。５０～１００ｍｍ^３の触知可能な腫瘍体積を有するマウスは、マウス１０匹／グループにランダム化される。マウスは、適切なレジメン、すなわち、腹腔内注射（ＩＰ）による週５日、合計６週間（ＱＤ５ｘ６）、又は静脈内注射（ＩＶ）による週１回、合計６週間によって、１）ヒトＩｇＧ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）；２）選択された抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質（１０ｍｇ／ｋｇ）；３）選択された抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質（１０ｍｇ／ｋｇ）；４）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ；５）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－７；６）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－１５；７）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－７改変／変異体バリアント；及び８）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－１５改変／変異体バリアントで処置される。

【0469】

平均腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、次の式を使用して計算される。腫瘍収縮（ＴＳ）を示すマウスは、ＴＧＩ計算から除外される。

【数5】

【0470】

腫瘍体積の有意差は、テューキーの多重比較検定で、独立二元配置分散分析を使用して確認される。

【0471】

[012] 対照グループを除いて、全ての処置グループ：１）ヒトＩｇＧ対照（１０ｍｇ／ｋｇ）；２）選択された抗ＣＤ４７－ＩＬ－７融合タンパク質（１０ｍｇ／ｋｇ）；３）選択された抗ＣＤ４７－ＩＬ－１５融合タンパク質（１０ｍｇ／ｋｇ）；４）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ；５）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－７；６）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－１５；７）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－７改変／変異体バリアント；及び８）抗ＣＤ４７ ｍＡｂ＋ＩＬ－１５改変／変異体バリアントは、ＳＮＵ－１腫瘍増殖阻害をもたらし、インビボでの抗腫瘍効果を示すことが予想される。

【0472】

出願に引用されている米国又は外国の全ての参考文献、特許又は出願は、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が生じた場合、本明細書に文字通り開示された資料が優先される。

【0473】

前述の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、その精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用法及び条件に適合させるために様々な変更及び修正を行うことができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【配列表】

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【国際調査報告】