特表 2022-532303 ＦＭＲＰ及び癌治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-14

(54)【発明の名称】ＦＭＲＰ及び癌治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/16 20060101AFI20220707BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220707BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220707BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220707BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220707BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220707BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20220707BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20220707BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220707BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20220707BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220707BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220707BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220707BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220707BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20220707BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20220707BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20220707BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220707BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20220707BHJP

【ＦＩ】

A61K38/16

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12Q1/02

C12Q1/6851 Z

A61P35/00

A61P35/04

A61K31/7088

A61K48/00

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K39/00 H

A61K35/12

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/13

C07K16/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021563161

(86)(22)【出願日】2020-05-06

(85)【翻訳文提出日】2021-12-17

(86)【国際出願番号】 EP2020062593

(87)【国際公開番号】W WO2020225309

(87)【国際公開日】2020-11-12

(31)【優先権主張番号】19172927.6

(32)【優先日】2019-05-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】512008613

【氏名又は名称】エコール ポリテクニーク フェデラル デ ローザンヌ （イーピーエフエル）

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(72)【発明者】

【氏名】ゼン チーチュン

(72)【発明者】

【氏名】ハナハン ダグラス

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QQ53

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QX02

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA44

4C084NA14

4C084ZB072

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC751

4C085AA03

4C085BB01

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB64

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、必要とする対象における原発癌及び／若しくは癌転移の治療並びに／又は予防のための、ｉ）ＦＭＲＰタンパク質、ｉｉ）ＦＭＲＰタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及び／若しくはｉｉｉ）ＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は免疫抑制活性を下方調節する組成物及び方法を提供する。
【選択図】図１Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

必要とする対象における癌及び／若しくは癌転移の治療並びに／又は予防に使用するための、ｉ）ＦＭＲＰタンパク質、ｉｉ）ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ及び／若しくはｉｉｉ）ＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は活性を調節する、使用するための薬剤。

【請求項2】

前記ＦＭＲＰタンパク質の発現及び／又は活性の調節が、前記ＦＭＲＰタンパク質とそのｍＲＮＡ標的及び／又は他のタンパク質との調節的な相互作用を含む請求項１に記載の薬剤。

【請求項3】

前記癌及び／又は癌転移が、免疫療法に対して本質的に抵抗性であるか、又は適応抵抗性を獲得している、請求項１又は請求項２に記載の使用するための薬剤。

【請求項4】

ＦＭＲＰをコードするＲＮＡの翻訳を阻害する請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の使用するための薬剤。

【請求項5】

ＦＭＲＰをコードするＦＭＲ１遺伝子の転写を阻害する請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の使用するための薬剤。

【請求項6】

前記薬剤が前記ＦＭＲＰの標的ｍＲＮＡ若しくはｍｉＲＮＡへの結合を阻害又は障害する請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の使用するための薬剤。

【請求項7】

前記薬剤が、化合物、ペプチド若しくはその類似体、抗体若しくは前記抗体の抗原結合フラグメント、抗体模倣物、又は核酸である請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の使用するための薬剤。

【請求項8】

前記核酸が、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲベースの機能喪失システム、ｅｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする核酸、又はこれらの組み合わせを含む群から選択される請求項７に記載の薬剤。

【請求項9】

請求項７に記載のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲベースの機能喪失システム、ｅｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする１種以上の核酸を含むプラスミド又はベクター。

【請求項10】

請求項９に記載のプラスミド若しくはベクター、又は請求項８に記載のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲベースの機能喪失システム、ｅｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする１種以上の核酸を含む宿主細胞。

【請求項11】

前記核酸が、前記ペプチド若しくはその類似体、抗体若しくは前記抗体の抗原結合フラグメント、又は抗体模倣物をコードする核酸を含む群から選択される請求項７に記載の薬剤。

【請求項12】

請求項１１に記載のペプチド若しくはその類似体、抗体若しくは前記抗体の抗原結合フラグメント、又は抗体模倣物をコードする１種以上の核酸を含むプラスミド又はベクター。

【請求項13】

医薬組成物であって、
ｉ）治療有効量の、ＦＭＲＰタンパク質、ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ及び／若しくはＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／若しくは活性を調節する薬剤、又は
ｉｉ）請求項９若しくは請求項１１に記載のプラスミド若しくはベクター、又は
ｉｉｉ）請求項１０若しくは請求項１２に記載の宿主細胞と、
薬学的に許容できる担体又は希釈剤と
を含む医薬組成物。

【請求項14】

必要とする対象における癌及び／若しくは癌転移の治療並びに／又は予防に使用するための請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

１種以上の抗癌療法をさらに含む請求項１３又は請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記１種以上の抗癌療法が、治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を含む請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、及びＣＴＬＡ－４阻害剤、又はこれらの組み合わせを含む群から選択される請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項18】

ＦＭＲＰに向けられた前記１種以上の抗癌療法が、治療有効量の、個別化されたネオアンチゲンカクテルを含む抗腫瘍ワクチン、又は抗腫瘍性免疫反応を強化する他の免疫刺激剤と組み合わせて含まれる請求項１５から請求項１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項19】

必要とする対象における癌及び／若しくは癌転移の治療方法並びに／又は予防方法であって、請求項１３から請求項１８のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む方法。

【請求項20】

ｉ）ＦＭＲＰタンパク質、ｉｉ）ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ及び／若しくはｉｉｉ）ＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は活性を調節する薬剤を特定する方法であって、ＦＭＲＰをコードする遺伝子をインビボ又はインビトロのアッセイに採用して前記薬剤を特定する工程を含む方法。

【請求項21】

ｉ）ＦＭＲＰタンパク質、ｉｉ）ｍＦＭＲＰをコードするＲＮＡ及び／若しくはｉｉｉ）ＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は活性を調節する薬剤を特定する方法であって、
（１）ＦＭＲＰを発現する試料を提供する工程と、
（２）前記生体試料を試験剤と接触させる工程と、
（３）ＦＭＲＰの発現及び／又は活性のレベルを決定する工程と、
（４）前記発現及び／又は活性のレベルを、前記試験剤を接触させていない対照試料と比較する工程と、
（５）前記ＦＭＲＰの発現及び／又は活性のレベルを低下させる試験剤を選択する工程と
を含む方法。

【請求項22】

前記ＦＭＲＰの発現及び／又は活性のレベルが、ＦＭＲＰによるその標的ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はタンパク質への結合を阻害する前記薬剤によって決定される請求項２１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、２０１９年５月７日に出願された欧州特許出願第１９１７２９２７．６号の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明の分野
本発明は、必要とする対象における癌及び／若しくは癌転移の治療並びに／又は予防のために、ｉ）ＦＭＲＰタンパク質（以下、「ＦＭＲＰ」）、ｉｉ）ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ、及び／若しくはｉｉｉ）ＦＭＲＰをコードするＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は活性を調節するための組成物並びに方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

免疫チェックポイント受容体の発見及びチェックポイントブロックに基づく免疫療法の開発は、一部の悪性腫瘍を治癒する可能性を高めたことから^１、癌の基礎研究及び臨床治療における最も注目すべき成功例の一つである。プログラム死－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１、ＰＤ－１）又はそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）等のＴ細胞共抑制性免疫チェックポイントを標的とした免疫調整剤は、様々な種類の悪性腫瘍の治療に承認されている^１。

【0004】

しかしながら、広範囲のヒトの癌の種類にわたって、様々な形態の癌を抱える患者全体では大きく変動する割合（４０～９０％）で、周知のＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４のブロックに基づく免疫療法の効果がほとんどないか又はまったくなく^２、特に膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の患者ではその傾向が顕著である^３、４。こうして、さらなる免疫療法戦略が依然として緊急に必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｈａｒｇａｄｏｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６２：２９－３９（２０１８）

【非特許文献2】Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ及びＨｅｌｌｍａｎ、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３７：４４３－４５５（２０２０年４月１３日）

【非特許文献3】Ｒｏｙａｌ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３３、８２８－８３３（２０１０）

【非特許文献4】Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．ら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６６、２４５５－２４６５（２０１２）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、必要とする対象における原発癌及び／若しくは癌転移の治療並びに／又は予防に使用するための、ｉ）ＦＭＲＰタンパク質、ｉｉ）ＦＭＲＰタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及び／若しくはｉｉｉ）ＦＭＲＰをコードするＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は免疫抑制活性を下方調節することができる薬剤（因子）を提供する。

【0007】

本発明のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする１種以上の核酸を含むプラスミド又はベクターも提供される。

【0008】

さらに、本発明のプラスミド若しくはベクター、又は本発明のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする１種以上の核酸を含む宿主細胞が提供される。

【0009】

本発明のペプチド若しくはその類似体、抗体若しくはその抗体の抗原結合フラグメント、又は抗体模倣物をコードする１種以上の核酸を含むプラスミド又はベクターも提供される。

【0010】

さらに、本発明のプラスミド若しくはベクター、又は本発明のペプチド若しくはその類似体、抗体若しくはその抗体の抗原結合フラグメント、若しくは抗体模倣物をコードする１種以上の核酸を含む宿主細胞が提供される。

【0011】

さらに、医薬組成物であって、
ｉ）治療有効量の、ＦＭＲＰタンパク質、ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ及び／若しくはＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／若しくは活性を調節することができる薬剤、又は
ｉｉ）本発明のプラスミド若しくはベクター、又は
ｉｉｉ）本発明の宿主細胞と、
薬学的に許容できる担体又は希釈剤と
を含む医薬組成物が提供される。

【0012】

さらに、本明細書に開示される薬剤を含む、選択的かつ効率的な分解のためにＦＭＲＰを標的とする医薬組成物であって、かかる薬剤がＥ３－ユビキチンリガーゼに化学的に結合されている医薬組成物が提供される。この薬剤は、ＦＭＲＰに強固に結合してＦＭＲＰ－薬剤複合体を形成し、一方、Ｅ３－ユビキチンリガーゼは、結合したタンパク質をプロテアソームに誘導して分解させる。

【0013】

必要とする対象における癌及び／若しくは癌転移の治療方法並びに／又は予防方法であって、本発明の薬剤をその対象に投与する工程を含む方法も提供される。

【0014】

必要とする対象における癌及び／若しくは癌転移の治療方法並びに／又は予防方法であって、本発明の医薬組成物をその対象に投与する工程を含む方法も提供される。

【0015】

特定の理論に拘束されることを望むものではないが、多くの腫瘍と同様のレベルのＦＭＲＰタンパク質を産生するようにＦＭＲ１遺伝子を（内因的に、若しくは遺伝子治療を介して）細胞若しくは組織において遺伝子操作的に上方制御すること、又はＦＭＲＰタンパク質若しくはＦＭＲ１ ｍＲＮＡを送達することは、病理学的な影響を伴うＣＤ８（細胞傷害性）Ｔ細胞の慢性的又はその他の不適切な浸潤がある１型糖尿病等の自己免疫疾患を改善する戦略となり得ると考えられる。同様に、幹細胞及び他の細胞の移植を伴う細胞治療の成功は、そのような細胞がＦＭＲＰを過剰に発現するように、安定的に（レンチウイルスの導入若しくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を介して）、又はＡＡＶを介して一過性に操作されていれば、強化される可能性がある。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスにおいて、全体的な生存期間を著しく延長し、腫瘍の成長及び転移を著しく障害する。マウスの正常膵臓、前悪性ＰａｎＩＮ病変、及びＦＶＢＮバックグラウンドのＰ４８－ｃｒｅ；ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋ ＰＤＡＣマウスモデルのＰＤＡＣ腫瘍組織におけるＦＭＲＰ発現の代表的な画像及び定量。各群ｎ＝３マウス。スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）Ｔ検定を用いた。スケールバー、１００μｍ。ヒトＰＤＡＣ組織マイクロアレイの免疫染色（図示せず）は、マウスＰＤＡＣにおける結果を裏付ける。

【図1B】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスにおいて、全体的な生存期間を著しく延長し、腫瘍の成長及び転移を著しく障害する。ＦＭＲＰタンパク質の異なるエピトープを認識する２種類のＦＭＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ（アブカム）、ａｂ１９１４１１；Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（セル・シグナリング）、４３１７ｓ）を用いたウエスタンブロッティングにより明らかにした、「野生型（ＷＴ）」マウスＰＤＡＣ細胞株（４３６１．１２）におけるＦＭＲＰの発現、及びＦＭＲＰをコードするマウスＦＭＲ１遺伝子を標的としたＣａｓ９／ＳｇＲＮＡベクターを一過性にトランスフェクションして作製した誘導体ＦＭＲＰ欠損細胞（「ＫＯ」）におけるＦＭＲＰの非発現。独立した３回の実験。

【図1C】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスにおいて、全体的な生存期間を著しく延長し、腫瘍の成長及び転移を著しく障害する。培養した４３６１．１２ ＷＴ２細胞及びＦＭＲＰ ＫＯ２細胞のコロニー形成。６ウェルプレートの１つのウェルに指示された数の癌細胞を播種した。１０日後に細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。独立した３回の実験。

【図1D】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスにおいて、全体的な生存期間を著しく延長し、腫瘍の成長及び転移を著しく障害する。インビボ肺転移アッセイの模式図。手短に言えば、２×１０^５個の細胞を、免疫適格性のＦＶＢＮマウス又は免疫不全ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウスの尾静脈に注射した。これにより、肺に癌細胞を播種する。マウスは週に２回モニターし、獣医学的なエンドポイントに達した時点で犠牲にした。

【図1E】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスにおいて、全体的な生存期間を著しく延長し、腫瘍の成長及び転移を著しく障害する。マウスＰＤＡＣ ＷＴ２細胞又はＦＭＲＰ ＫＯ２細胞を注射したシンジェニックの免疫適格性のＦＶＢｎマウスの全体的な生存期間、各群ｎ＝５マウス、カプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）テストを使用した。

【図1F】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスにおいて、全体的な生存期間を著しく延長し、腫瘍の成長及び転移を著しく障害する。マウスＰＤＡＣ ＷＴ２細胞又はＦＭＲＰ ＫＯ２細胞を注射したシンジェニックの免疫不全ＳＣＩＤ／Ｂｅｉｇｅマウスの全体的な生存期間、各群ｎ＝５マウス、カプラン・マイヤーテストを使用した。

【図1G】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスにおいて、全体的な生存期間を著しく延長し、腫瘍の成長及び転移を著しく障害する。ウエスタンブロット法により明らかにした、マウスＰＤＡＣ細胞株４３６１．１２ ＷＴ細胞におけるＦＭＲＰの発現、及び同じくマウスＦＭＲ１遺伝子を標的としたＣａｓ９／ＳｇＲＮＡベクターを一過性にトランスフェクションして作製した第２のＦＭＲＰ ＫＯ細胞株（ＫＯ８）におけるＦＭＲＰの非発現。独立した３回の実験。

【図1H】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスにおいて、全体的な生存期間を著しく延長し、腫瘍の成長及び転移を著しく障害する。インビボ皮下（ｓ．ｃ．）原発腫瘍成長モデルの模式図。手短に言えば、５×１０^５個の細胞をＦＶＢＮマウス又はＮＳＧマウスの皮下にｓ．ｃ．注射した。腫瘍を持つマウスを週に２回モニターし（観察し）、注射後２５日目にＷＴの腫瘍体積が１０００ｍｍ^３に達した時点で犠牲にした。

【図1I】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスにおいて、全体的な生存期間を著しく延長し、腫瘍の成長及び転移を著しく障害する。マウスＰＤＡＣ ＷＴ（２つの独立したクローンＷＴ２及びＷＴ３）又はＦＭＲＰ ＫＯ（２つの独立したクローンＫＯ２及びＫＯ８）細胞を注射したＦＶＢｎ（Ｉ）マウスの２８日目の腫瘍重量、各群ｎ＝４～１０マウス、対応のないＴ検定を用いた。

【図1J】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスにおいて、全体的な生存期間を著しく延長し、腫瘍の成長及び転移を著しく障害する。マウスＰＤＡＣ ＷＴ（２つの独立したクローンＷＴ２及びＷＴ３）又はＦＭＲＰ ＫＯ（２つの独立したクローンＫＯ２及びＫＯ８）細胞を注射した免疫不全ＮＳＧマウスの２８日目の腫瘍重量、各群ｎ＝４～１０マウス、対応のないＴ検定を用いた。

【図2A】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、浸潤したＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔリンパ球の形で強い抗腫瘍性免疫反応を誘発する。マウスＰＤＡＣ ＷＴ細胞及びＫＯ細胞によって形成された原発腫瘍におけるＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔリンパ球の免疫化学的染色及び定量、スケールバー、１００μｍ、各群ｎ＝３マウス。

【図2B】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、浸潤したＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔリンパ球の形で強い抗腫瘍性免疫反応を誘発する。マウスＰＤＡＣ ＷＴ２細胞及びＫＯ２細胞によって形成された原発腫瘍におけるＣＤ４５＋免疫細胞のＩＦ染色及び定量、スケールバー、１００μｍ、各群ｎ＝３マウス。

【図2C】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、浸潤したＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔリンパ球の形で強い抗腫瘍性免疫反応を誘発する。ＦＡＣＳ分析を用いて、免疫適格性のマウスで成長したＰＤＡＣ ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯ腫瘍におけるＣＤ４５＋免疫細胞の頻度を測定した。各群ｎ＝４～５マウス、２回の独立した実験。対応のないＴ検定を用いた。

【図2D】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、浸潤したＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔリンパ球の形で強い抗腫瘍性免疫反応を誘発する。ＦＡＣＳ分析を用いて、免疫適格性のマウスで成長したＰＤＡＣ ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯ腫瘍におけるＣＤ３＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞の頻度を測定した。各群ｎ＝４～５マウス、２回の独立した実験。対応のないＴ検定を用いた。

【図2E】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、浸潤したＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔリンパ球の形で強い抗腫瘍性免疫反応を誘発する。ＦＡＣＳ分析を用いて、免疫適格性のマウスで成長したＰＤＡＣ ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯ腫瘍における活性化ＧＲＺｂ＋細胞の頻度を測定した。各群ｎ＝４～５マウス、２回の独立した実験。対応のないＴ検定を用いた。

【図2F】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、浸潤したＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔリンパ球の形で強い抗腫瘍性免疫反応を誘発する。ＦＡＣＳ分析を用いて、免疫適格性のマウスで成長したＰＤＡＣ ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯ腫瘍における活性化ＩＦＮγ＋の頻度を測定した。各群ｎ＝４～５マウス、２回の独立した実験。対応のないＴ検定を用いた。

【図2G】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、浸潤したＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔリンパ球の形で強い抗腫瘍性免疫反応を誘発する。ＦＡＣＳ分析を用いて、免疫適格性のマウスで成長したＰＤＡＣ ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯ腫瘍における活性化ＴＮＦα＋細胞の頻度を測定した。各群ｎ＝４～５マウス、２回の独立した実験。対応のないＴ検定を用いた。

【図2H】マウスＰＤＡＣ癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、浸潤したＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔリンパ球の形で強い抗腫瘍性免疫反応を誘発する。ＦＶＢＮバックグラウンドのＰ４８－ｃｒｅ；ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋ ＰＤＡＣマウスモデルのマウスＰＤＡＣ組織の中心部及び端（辺縁部）におけるＦＭＲＰ及びＣＤ８の発現を示す代表的な二重免疫染色画像。ｎ＝８マウスＰＤＡＣ試料。対応のあるＴ検定を用いた。スケールバー、１００μｍ。このデータは、ＦＭＲＰが、ＫＯ腫瘍で見られるＣＤ８ Ｔ細胞の流入を防いでいるという解釈を支持する（パネルＡ）。ヒトＰＤＡＣの組織マイクロアレイをＣＤ８及びＦＭＲＰについて免疫染色したところ（図示せず）、浸潤するＣＤ８ Ｔ細胞の密度とＦＭＲＰの発現との間に逆相関が示され、マウスＰＤＡＣでの結果と一致した。

【図3A】癌細胞におけるＦＭＲＰ ＫＯは、他の方法には抵抗性のＰＤＡＣ腫瘍を抗ＰＤ１抗体治療を含む免疫療法に対して感作する。ＦＭＲＰの欠失は、インビトロ又はインビボのマウスＰＤＡＣ細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現を抑制しない。マウスＰＤＡＣ ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯ細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現のＷＢ分析、独立した３回の実験。

【図3B】癌細胞におけるＦＭＲＰ ＫＯは、他の方法には抵抗性のＰＤＡＣ腫瘍を抗ＰＤ１抗体治療を含む免疫療法に対して感作する。ＦＭＲＰの欠失は、インビトロ又はインビボのマウスＰＤＡＣ細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現を抑制しない。マウスＰＤＡＣ ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯ細胞によって形成された腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１発現を検出するための免疫染色、スケールバー、１００μｍ、各群ｎ＝３マウス。

【図3C】癌細胞におけるＦＭＲＰ ＫＯは、他の方法には抵抗性のＰＤＡＣ腫瘍を抗ＰＤ１抗体治療を含む免疫療法に対して感作する。抗ＰＤ－１抗体療法（Ｉ．Ｐ．、マウス１匹あたり２００μｇ、週２回）を行わない場合と行った場合のＰＤＡＣ ＷＴ２及びＫＯ２腫瘍の成長曲線、いずれもＦＶＢｎマウスを使用。各群ｎ＝７～１１マウス、対応のないＴ検定を用いた。この結果は、このマウスＰＤＡＣ癌細胞株から発生したＰＤＡＣ腫瘍が、抗ＰＤ－１治療に対して感受性が低いことを示す。

【図3D】癌細胞におけるＦＭＲＰ ＫＯは、他の方法には抵抗性のＰＤＡＣ腫瘍を抗ＰＤ１抗体治療を含む免疫療法に対して感作する。抗ＰＤ－１抗体療法（Ｉ．Ｐ．、マウス１匹あたり２００μｇ、週２回）を行わない場合と行った場合のＰＤＡＣ ＷＴ２及びＫＯ２腫瘍の成長曲線、いずれもＦＶＢｎマウスを使用。各群ｎ＝７～１１マウス、対応のないＴ検定を用いた。大きく対照的に、ＦＭＲＰ ＫＯは、ＣＤ８ Ｔ細胞の流入増加と関連して、ＰＤＡＣ腫瘍の成長を著しく障害する（図１Ｇ～図１Ｉ、図２Ａ、及び図４Ｄに示すように）。このことは、ＦＭＲＰ阻害剤が、抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１療法に抵抗性の腫瘍において治療効果を有する可能性を示唆する。

【図4A】マウスＰＤＡＣにおいて、ＦＭＲＰをコードする遺伝子及びＲＮＡ Ａ ｔｏ Ｉ編集タンパク質ＡＤＡＲ１をコードする遺伝子を複合的に欠失させると、生存期間がさらに延長される。マウスＰＤＡＣ ４３６１．１２ ＷＴ２細胞での共免疫沈降実験で明らかになったように、ＦＭＲＰ及びＡＤＡＲ１はＰＤＡＣ癌細胞で相互作用する。ＦＭＲＰ及びＡＤＡＲ１は、ウサギ抗ＦＭＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１９１４１１）による免疫沈降の前と後に、全細胞溶解物のウエスタンブロットで可視化した。正常なｒＩｇＧ抗体を対照として用いた。３回の独立した３回の実験。

【図4B】マウスＰＤＡＣにおいて、ＦＭＲＰをコードする遺伝子及びＲＮＡ Ａ ｔｏ Ｉ編集タンパク質ＡＤＡＲ１をコードする遺伝子を複合的に欠失させると、生存期間がさらに延長される。ＦＭＲＰ－ＡＤＡＲ１相互作用は、逆共免疫沈降実験によっても検証された。ＦＭＲＰ及びＡＤＡＲ１は、マウス抗ＡＤＡＲ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（サンタクルーズ）、ｓｃ７３４０８）で免疫沈降する前と後に、全細胞溶解物のウエスタンブロットを免疫染色することで明らかになった。正常なｍＩｇＧ抗体を対照として用いた。独立した３回の実験。

【図4C】マウスＰＤＡＣにおいて、ＦＭＲＰをコードする遺伝子及びＲＮＡ Ａ ｔｏ Ｉ編集タンパク質ＡＤＡＲ１をコードする遺伝子を複合的に欠失させると、生存期間がさらに延長される。ＷＴ２、ＦＭＲＰ ＫＯ、ＡＤＡＲ１ ＫＯ及びＦＭＲＰ／ＡＤＡＲ１ダブルＫＯ細胞におけるＦＭＲＰ及びＡＤＡＲ１の発現をウエスタンブロット法で検証した。これらの細胞は、マウスのＦＭＲ１遺伝子及びＡＤＡＲ１遺伝子を標的としたＣａｓ９／ＳｇＲＮＡベクターを一過性にトランスフェクションして作製した。独立した３回の実験。

【図4D】マウスＰＤＡＣにおいて、ＦＭＲＰをコードする遺伝子及びＲＮＡ Ａ ｔｏ Ｉ編集タンパク質ＡＤＡＲ１をコードする遺伝子を複合的に欠失させると、生存期間がさらに延長される。ＷＴ２、ＦＭＲＰ ＫＯ、ＡＤＡＲ１ ＫＯ、及びＦＭＲＰ／ＡＤＡＲ１ダブルＫＯ細胞を注射したＦＶＢｎマウスの全体的な生存期間；カプラン・マイヤーテストを使用した。手短に言えば、５×１０^５個の細胞をＦＶＢＮマウスの脇腹にｓ．ｃ．注射した。マウスは週に２回モニターし、腫瘍体積が１０００ｍｍ^３に達した時点で犠牲にした。

【図5A】第２の腫瘍型である結腸癌の癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスで同様に腫瘍の成長を障害する。ＡＫＰ（ＡｐｃΔ／ Δ；Ｋｒａｓ^{Ｇ１２Ｄ／＋}；Ｔｒｐ５３Δ／ Δ；ＣＤＸ２ Ｃｒｅ ＥＲＴ２）又はＡＰＣ（ＡｐｃΔ／ Δ；ＣＤＸ２ Ｃｒｅ ＥＲＴ２）マウスモデルのマウスの正常結腸組織及び腺腫組織におけるＦＭＲＰ発現の免疫組織化学染色の代表的な画像及び定量。各群ｎ＝３マウス。スチューデントＴ検定を用いた。スケールバー、１００μｍ。ヒト結腸癌組織マイクロアレイの免疫染色（図示せず）は、マウスのデータを裏付ける。

【図5B】第２の腫瘍型である結腸癌の癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスで同様に腫瘍の成長を障害する。マウスＦＭＲ１遺伝子を標的としたＣａｓ９／ＳｇＲＮＡベクターを一過性にトランスフェクションして作製したＣＴ２６ ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯサブクローンにおけるＦＭＲＰの発現をウエスタンブロット法で検証した。ＣＴ２６細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、ＦＭＲＰタンパク質の異なるエピトープを認識する２種類の抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１９１４１１；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＳＴ、＃４３１７）を用いて検証された。独立した３回の実験。

【図5C】第２の腫瘍型である結腸癌の癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスで同様に腫瘍の成長を障害する。ＣＴ２６のＷＴ１７＃及びＫＯ１２＃細胞のコロニー形成アッセイ。６ウェルプレートの１つのウェルに１２５０個の癌細胞を播種した。１０日後に細胞を固定し、クリスタルバイオレットを用いて染色した。独立した３回の実験。

【図5D】第２の腫瘍型である結腸癌の癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスで同様に腫瘍の成長を障害する。インビボ皮下（ｓ．ｃ．）原発腫瘍成長モデルの模式図。手短に言えば、５×１０^５個の細胞を、免疫適格性のＢａｌｂ／ｃマウス又は免疫不全のＮＳＧマウスにｓ．ｃ．注射した。マウスを週に２回モニターし、注射後２５日目又は１８日目にＷＴの腫瘍体積が１０００ｍｍ^３に達した時点で犠牲にした。

【図5E】第２の腫瘍型である結腸癌の癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスで同様に腫瘍の成長を障害する。ｓ．ｃ．注射後２５日目までのＣＴ２６ ＷＴ１７＃又はＦＭＲＰ ＫＯ１２＃細胞を注射したＢａｌｂ／ｃマウスの腫瘍成長曲線、各群ｎ＝１０マウス、対応のないＴ検定を用いた。

【図5F】第２の腫瘍型である結腸癌の癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスで同様に腫瘍の成長を障害する。ＣＴ２６ ＷＴ１７＃又はＦＭＲＰ ＫＯ１２＃細胞を注射したＢａｌｂ／ｃマウスの２５日目の代表的な画像及び腫瘍重量、各群ｎ＝１０マウス、対応のないＴ検定を用いた。

【図5G】第２の腫瘍型である結腸癌の癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスで同様に腫瘍の成長を障害する。ＣＴ２６ ＷＴ１７＃又はＦＭＲＰ ＫＯ１２＃細胞によって形成された原発腫瘍におけるＣＤ８及びＦＭＲＰの免疫化学的染色、スケールバー、１００μｍ、各群ｎ＝３マウス（左パネル）；ＣＴ２６ ＷＴ１７＃又はＦＭＲＰ ＫＯ１２＃細胞によって形成された原発腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の定量（右パネル）；各群ｎ＝３マウス。スチューデントＴ検定を用いた。スケールバー、１００μｍ。

【図5H】第２の腫瘍型である結腸癌の癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスで同様に腫瘍の成長を障害する。ＣＴ２６ ＷＴ１２＃又はＦＭＲＰ ＫＯ１２＃細胞をｓ．ｃ．注射したＮＳＧマウスの注射後１４日目までの腫瘍成長曲線、各群ｎ＝５マウス、対応のないＴ検定を用いた。

【図5I】第２の腫瘍型である結腸癌の癌細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫不全ではなく免疫適格性であるマウスで同様に腫瘍の成長を障害する。ＣＴ２６ ＷＴ１７＃又はＦＭＲＰ ＫＯ１２＃細胞を注射したＮＳＧマウスの１４日目の代表的な画像及び腫瘍重量、各群ｎ＝５マウス、対応のないＴ検定を用いた。

【図6A】マウスメラノーマ細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫適格性のマウスにおける腫瘍の成長を著しく障害する。ＦＶＢＮバックグラウンドのｉＢＩＰ２（誘導性ＢＲＡＦ ＩＮＫ／ＡＲＦ ＰＴＥＮ）メラノーママウスモデルのマウス正常皮膚及びメラノーマ組織におけるＦＭＲＰ発現の免疫組織化学染色の代表的な画像並びに定量。正常皮膚群はｎ＝２マウス、ｉＢＩＰ２メラノーマ群はｎ＝４マウス。スチューデントＴ検定を用いた。スケールバー、１００μｍ。

【図6B】マウスメラノーマ細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫適格性のマウスにおける腫瘍の成長を著しく障害する。マウスＦＭＲ１遺伝子を標的としたＣａｓ９／ＳｇＲＮＡベクターを一過性にトランスフェクションして作製したＢ１６－ＯＶＡ ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯサブクローンにおけるＦＭＲＰの発現をウエスタンブロット法で検証した。独立した３回の実験。

【図6C】マウスメラノーマ細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫適格性のマウスにおける腫瘍の成長を著しく障害する。Ｂ１６－ＯＶＡ ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯ細胞のコロニー形成アッセイ。６ウェルプレートの１つのウェルに１２５０個の癌細胞を播種した。１０日後に細胞を固定し、クリスタルバイオレットを用いて染色した。独立した３回の実験。

【図6D】マウスメラノーマ細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫適格性のマウスにおける腫瘍の成長を著しく障害する。Ｂ１６－ＯＶＡ ＷＴ又はＦＭＲＰ ＫＯ細胞をｓ．ｃ．注射したＣ５７Ｂ／６マウスの注射後１８日目までの腫瘍成長曲線、各群ｎ＝５～１０マウス、対応のないＴ検定を用いた。手短に言えば、５×１０^５個の細胞をＣ５７Ｂ／６マウスの脇腹にｓ．ｃ．注射した。マウスは週に２回モニターし、注射後１８日目にＷＴの腫瘍体積が１０００ｍｍ^３に達した時点で犠牲にした。

【図6E】マウスメラノーマ細胞におけるＦＭＲＰの欠失は、免疫適格性のマウスにおける腫瘍の成長を著しく障害する。１８日目に収集した、Ｂ１６－ＯＶＡ ＷＴ細胞又はＦＭＲＰ ＫＯ細胞を注射した免疫適格性のマウスの代表的な画像及び腫瘍重量、各群ｎ＝５～１０マウス。対応のないＴ検定を用いた。

【図7A】多段階膵神経内分泌腫瘍形成（ＰａｎＮＥＴ）の遺伝子操作されたＲＩＰ１－Ｔａｇ２（ＲＴ２）マウスモデルにおいて、初期の癌細胞におけるＦＭＲＰの特異的な欠失は、生存期間を有意に延長する。マウスの正常膵臓、ＰａｎＮＥＴ腫瘍、肝転移におけるＦＭＲＰ発現の免疫組織化学的染色の代表的な画像。各群ｎ＝３マウス。スケールバー、１００μｍ。

【図7B】多段階膵神経内分泌腫瘍形成（ＰａｎＮＥＴ）の遺伝子操作されたＲＩＰ１－Ｔａｇ２（ＲＴ２）マウスモデルにおいて、初期の癌細胞におけるＦＭＲＰの特異的な欠失は、生存期間を有意に延長する。雄のＲＴ２マウス及びＦＭＲＰ ＫＯ ＲＴ２マウスの全体的な生存期間、カプラン・マイヤーテストを使用した。ＰａｎＮＥＴの腫瘍形成を促進する腫瘍遺伝子ＳＶ４０を発現する膵島β細胞細胞においてＦＭＲＰをコードするＦＭＲ１遺伝子を特異的に欠失させた雄のＦＭＲＰ ＫＯ ＲＴ２マウスを、ＦＭＲ１ ｆｌｏｘｅｄマウスとＲｉｐ１－Ｔａｇ ２（ＲＴ２）及びＲＩＰ７－Ｃｒｅマウスを交配することにより作製した。ＦＭＲＰ ＫＯ ＲＴ２群はｎ＝１７、及びＲＴ２群はｎ＝１２。すべてのマウスは週に２回モニターし、獣医学的なエンドポイントに達した時点で犠牲にした。

【図8A】マウス乳癌組織におけるＦＭＲＰ発現の上昇。マウスの正常な乳腺脂肪体（ＭＦＰ）及び遺伝子操作されたＭＭＴＶ－ＰｙｍＴ乳癌マウスモデルのデノボ乳房腫瘍におけるＦＭＲＰ発現の代表的な画像及び定量。各群ｎ＝３マウス。スチューデントＴ検定を用いた。スケールバー、１００μｍ。

【図8B】マウス乳癌組織におけるＦＭＲＰ発現の上昇。マウスの正常な乳腺脂肪体（ＭＦＰ）及び遺伝子操作されたＣ３Ｔａｇトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）マウスモデルのデノボ乳房腫瘍におけるＦＭＲＰ発現の代表的な画像及び定量。正常ＭＦＰ群はｎ＝３マウス、及びＣ３Ｔａｇ乳癌群はｎ＝３マウス。スチューデントＴ検定を用いた。スケールバー、１００μｍ。ヒトのトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）組織マイクロアレイの免疫染色（図示せず）は、マウス乳癌における結果を裏付ける。

【図9A】マウスＰＤＡＣ細胞におけるｓｉＲＮＡによるＦＭＲＰの阻害。マウスＰＤＡＣ ４３６１．１２ ＷＴ２細胞及びＦＭＲＰ ＫＯ２細胞の移動（遊走）アッセイ。手短に言えば、Ｂｏｙｄｅｎチャンバ（膜の細孔径、８μｍ）の上段のウェルに、無血清ＤＭＥＭ培地５０μｌ中の５０００個の細胞を播種し、下段のチャンバにはＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地２００μｌを入れた。１８時間後、７０％ＥｔＯＨを含ませた綿棒を用いて、ウェル内に残った癌細胞を除去した。８μｍの孔を通ってメンブレンを移動した細胞を固定し、次いでクリスタルバイオレットで染色した。移動した細胞の数をカウントした。データは独立した３つのウェルから収集した。対応のないＴ検定を用いた。独立した３回の実験。

【図9B】マウスＰＤＡＣ細胞におけるｓｉＲＮＡによるＦＭＲＰの阻害。対照ｓｉＲＮＡ（すなわち、ｓｉＣｔｒｌ：ＵＡＡＧＧ ＣＵＡＵＧ ＡＡＧＡＧ ＡＵＡＣ（配列番号９））、並びにＦＭＲＰを標的としたｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＭＲＰ＃１：ＡＵＡＡＧ ＡＧＡＣＡ ＡＣＵＵＧ ＧＵＧＣ（配列番号１０）、及びｓｉＦＭＲＰ＃２：ＵＡＡＣＵＵＣＧＧＡＡＵＵＡＵＧＵＡＧ（配列番号１１））をトランスフェクトしたマウスＰＤＡＣ ４３６１．１２ ＷＴ２細胞におけるＦＭＲＰの発現をウエスタンブロット法で検証した。独立した３回の実験。

【図9C】マウスＰＤＡＣ細胞におけるｓｉＲＮＡによるＦＭＲＰの阻害。対照ｓｉＲＮＡ、及びＦＭＲＰを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたマウスＰＤＡＣ ４３６１．１２ ＷＴ２細胞の移動アッセイ；１ウェルあたり５０００細胞、１８時間。データは独立した３つのウェルから収集した。対応のないＴ検定を用いた。独立した３回の実験。

【図10A】ＦＲＥＴに基づくＦＭＲＰ阻害剤のハイスルースクリーニング（ＨＴＳ）。ＦＲＥＴに基づくＦＭＲＰ阻害剤のハイスルースクリーニング（ＨＴＳ）の模式図。ヒトＦＭＲＰタンパク質は、ヒトＨＥＫ２９３細胞で産生され、精製され、蛍光レポーターであるフルオレセインで生化学的に標識される。２）ｓｃ１ ＲＮＡ１をＣｙ３又はＢＨＱの蛍光消光剤分子で標識し、ｓｃ１がＦＭＲＰに結合したときにＦＩＴＣの励起性蛍光発光が消光されるようにする。３）ＦＭＲＰとｓｃ１の相互作用を阻害する能力を検証するために、消光された蛍光の放出を誘発する化合物を、さらに特性評価にかける。

【図10B】ＦＲＥＴに基づくＦＭＲＰ阻害剤のハイスルースクリーニング（ＨＴＳ）。哺乳類発現ＦＭＲＰ－Ｈｉｓタンパク質の精製プロファイル。ヒトＦＭＲＰタンパク質は、ヒトＨＥＫ２９３細胞で産生され、精製され、検証される。左のパネルは、各レーンに２μｇの総タンパク質を示すクーマシーブルー染色。右のパネルは、抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体を用いたＦＭＲＰ－Ｈｉｓタンパク質発現のウエスタンブロット。Ｍ．分子量マーカー。Ｍｅ．培養培地。ＦＴ．フロースルー（素通り画分）。Ｗ．洗浄液。Ｅ．溶出した画分（フラクション）。溶出した画分をプールし、バッファを交換して濃縮した。

【0017】

図１１は、ヒトの様々な種類の癌において、ＦＭＲＰが広くかつ非常に多く発現していることを示している（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１０２０８１－ＦＭＲ１／ｐａｔｈｏｌｏｇｙより転載）。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本明細書に記載される方法及び材料と類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施又は試験で使用することができるが、好適な方法及び材料が以下に記載されている。本明細書中で言及されるすべての公開公報、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体を援用したものとする。本明細書で論じられる公開公報及び出願は、本願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書中の記載には、本発明が、先行発明であるという理由からそのような刊行物に先行する権利がないということを認めるものと解釈されるものは何もない。加えて、それらの材料、方法及び例は、説明のためだけのものであり、限定することは意図されていない。

【0019】

矛盾する場合、定義を含めて本明細書が優先することになる。特段の記載がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の主題が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用する場合、本発明の理解を容易にするために、以下の定義が与えられる。

【0020】

用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（…を含む、備える）」は、ｉｎｃｌｕｄｅ／ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（…を含む、備える）の意味で一般に使用され、つまり１種以上の特徴又は構成要素の存在を許容する。

【0021】

本明細書及び請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈と明らかに矛盾する場合を除いて複数の指示対象を含む。

【0022】

本明細書で使用される場合、「少なくとも１つ（１種）」とは、「１つ（１種）以上」、「２つ（２種）以上」、「３つ（３種）以上」等を意味する。

【0023】

本明細書で使用する場合、用語「対象」／「必要とする対象」、又は「患者」／「必要とする患者」は当該技術分野で十分に認識されており、本明細書中では、イヌ、ネコ、ラット、マウス、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、最も好ましくはヒトを含む哺乳動物を指すために互換的に使用される。ある場合には、上記対象は、処置の必要がある対象又は疾患若しくは障害を抱える対象である。しかしながら、他の態様では、上記対象は、健康な対象であることができる。この用語は、特定の年齢も性別も表さない。従って、雄であろうと雌であろうと、成人及び新生の対象が包含されることが意図されている。好ましくは、対象はヒトである。最も好ましくは、癌及び／若しくは癌の転移に罹患しているヒト、又は癌及び／若しくは癌の転移に罹患するリスクのある可能性があるヒトである。

【0024】

用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、任意の種類のデオキシリボヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、．．．）若しくはリボヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、．．．）のポリマー、又はデオキシリボヌクレオチドポリマーとリボヌクレオチドポリマーとの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ）で、直鎖状若しくは環状の立体構造の、一本鎖若しくは二本鎖の形態のものを指す。これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的に解釈されるものではなく、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基、糖及び／又はリン酸部分が修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成の特異性を持つ。すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対形成する。

【0025】

用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、ウイルスベクター、又はプラスミド若しくは他のビヒクル等の核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）分子を指し、これらは本発明の１種以上の異種核酸配列を含有し、好ましくは、異なる宿主細胞間での移動（導入）のために設計される。用語「発現ベクター」、「遺伝子導入ベクター」及び「遺伝子治療ベクター」は、本発明の１種以上の核酸を、好ましくはプロモーターの制御下で細胞内に組み込んで発現させるのに有効な任意のベクターを指す。クローニングベクター又は発現ベクターは、プロモーターに加えて、例えば、調節要素及び／又は転写後調節要素等の追加要素を含んでいてもよい。

【0026】

用語「約」は、特に所定の量に関しては、±１０％の偏差を包含することを意味する。

【0027】

本発明者らは、膵神経内分泌癌及び腺管癌の浸潤性発育を促進する際のＦＭＲＰの役割に注目していたが^５、意外にも、インビボでの抗腫瘍性免疫を抑制する際のＦＭＲＰの予想外かつ前例のない役割を発見した。

【0028】

脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ｆｒａｇｉｌｅ Ｘ ｍｅｎｔａｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＦＭＲＰ）は、脳に高発現しているＲＮＡ結合タンパク質であり、シナプス（及び他の）タンパク質の特定のｍＲＮＡのサブセットに結合し、神経細胞内でのそれらの翻訳を制御している^６。ＦＭＲＰはシナプス機能に重要な役割を果たしているため、その発現が不足すると、遺伝性知的障害の最も一般的な形態であり、自閉症の主な原因の１つでもある脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）になる^７。この役割とは異なり、ＦＭＲＰの他の研究では、いくつかの種類の癌で発現していることが明らかになっており^８、９、癌細胞の生存、浸潤及び転移に関与しているとされている。本開示では、ＦＭＲＰという用語は、ＦＭＲＰアイソフォームも指す。

【0029】

本発明者らは、マウスの膵管腺癌細胞（ＰＤＡＣ）及び結腸癌細胞においてＦＭＲＰの発現を欠くと、全体的な生存期間が著しく延長され、シンジェニックの免疫適格性のマウスにおける腫瘍の成長が著しく障害されることを示した。

【0030】

本発明は、必要とする対象における癌及び／若しくは癌転移の治療並びに／又は予防に使用するための、ｉ）ＦＭＲＰタンパク質、ｉｉ）ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ及び／若しくはｉｉｉ）ＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は活性を調節することができる薬剤を提供する。

【0031】

好ましくは、ＦＭＲＰタンパク質の発現及び／又は活性の調節は、ＦＭＲＰタンパク質とそのｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ標的との（例えば、そのＲＮＡ結合ドメインを介した）調節的な相互作用、並びに／又は他のタンパク質との調節的な相互作用を含む。

【0032】

特定の実施形態では、調節は、ＦＭＲＰ ｍＲＮＡレベルの低下である。特定の実施形態では、調節は、ＦＭＲＰタンパク質のレベル及び／又は活性の低下である。特定の実施形態では、ＦＭＲＰ ｍＲＮＡ及びＦＭＲＰタンパク質の両方のレベルが低下する。そのような低下は、時間依存的又は用量依存的に生じてもよい。

【0033】

本明細書で使用される場合、「阻害」又は「低下」若しくは「低減」は、本発明の薬剤の不存在下での標的核酸レベル又は標的タンパク質レベルと比較した、本発明の薬剤の存在下での標的核酸レベル又は標的タンパク質レベルの低下を意味するために互換的に使用される。

【0034】

１つの態様では、本発明の薬剤は、ＦＭＲＰをコードするＲＮＡの翻訳を阻害する。

【0035】

別の態様では、本発明の薬剤は、ＦＭＲＰをコードするＤＮＡの転写を阻害する。

【0036】

さらなる態様では、当該薬剤は、ＦＭＲＰの標的ｍＲＮＡへの結合を阻害若しくは障害し、かつ／又は、当該薬剤は、ＦＭＲＰがその免疫抑制活性を伝達するときに介する相互作用タンパク質若しくは他の分子への結合を阻害若しくは障害する。

【0037】

好ましくは、治療すべき癌及び／又は癌転移は、免疫療法に対して抵抗性であり、癌腫、芽腫、肉腫、メラノーマ、リンパ腫、及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍を含む癌の非限定的な例から選択される。このような癌のより具体的な例としては、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌又は腎癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む明細胞癌肺癌、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮性扁平上皮細胞癌）、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、前立腺新生物、肝癌、膀胱癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）及び胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、消化管間質腫瘍、膵臓癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、莢膜細胞腫、男化腫瘍、ヘパトーマ、非ホジキンズリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成障害、骨髄増殖性障害、慢性骨髄性白血病、急性血液悪性腫瘍を含む血液悪性腫瘍、子宮内膜癌又は子宮体癌、子宮内膜症、子宮内膜間質肉腫、線維肉腫、絨毛癌、唾液腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、食道癌、肝細胞腫、肛門癌、陰茎癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、カポジ肉腫、肥満細胞肉腫、卵巣肉腫、子宮肉腫、メラノーマ（黒色腫）、悪性中皮腫、皮膚癌、シュワン腫、乏突起神経膠腫、神経芽細胞腫、神経外胚葉性腫瘍、横紋筋肉腫、骨原性肉腫、平滑筋肉腫、ユーイング肉腫、末梢性原始神経外胚葉性腫瘍、尿路系癌、甲状腺細胞癌、ウィルムス腫瘍、並びに母斑症に伴う血管の異常増殖、浮腫（脳腫瘍に伴う浮腫等）及びメイグス症候群等が挙げられる。

【0038】

通常、本発明の薬剤は、化合物、ペプチド若しくはその類似体、核酸、抗体、その抗体の抗原結合フラグメント又は抗体模倣物である。好ましくは、当該薬剤は、細胞質におけるＦＭＲＰの優勢な細胞内局在を考慮して、癌細胞の細胞内区画にアクセスすることができる。

【0039】

本明細書で使用する場合、「化学剤又は化合物」は、その化学組成並びに生体組織及び生物への影響によって変化をもたらす化合物である。化学剤は、低分子阻害剤（ＳＭＩ）、核酸、例えばｓｉＲＮＡ、又はペプチドであってもよい。実施形態では、化合物は、好ましくは、非ペプチジル分子である。最も好ましくは、この非ペプチジル分子は、本発明の核酸配列によってコードされるペプチドの選択的な細胞内タンパク質分解を誘導する。選択的な細胞内タンパク質分解を誘導する化合物の例は、タンパク質分解誘導キメラ分子（ＰＲＯＴＡＣ）タンパク質分解剤及びプロテアソームの上流又は上にある脱ユビキチン化酵素の低分子化学調節剤（因子）を含む。当該技術分野で公知のように、ＰＲＯＴＡＣ（Ａｃｔｉｖｅ Ｄｅｇｒａｄｅｒｓとしても知られている）は、特定の不要なタンパク質を除去することができる２つの活性ドメインとリンカーとからなるヘテロ二官能性小分子である。

【0040】

ＦＭＲＰを阻害し、その結果、遺伝子ノックアウトによって明らかになった本発明を再現する物質の組成物は、当業者にとって公知である多くの技術及び方法論を用いて発見し、検証することができる。以下は、抗癌剤の治療的開発の可能性を持つＦＭＲＰ阻害剤を特定するために使用できるアプローチのスペクトルの例示である。

【0041】

上記薬剤がペプチドである場合には、上記薬剤は、好ましくは、癌細胞におけるペプチドの蓄積を増加させる薬剤と結合される。このような薬剤は、例えば、治療薬と結合されたトランスフェリンの膜トランスフェリン受容体媒介エンドサイトーシス等の受容体媒介エンドサイトーシスを誘導する化合物（Ｑｉａｎ Ｚ．Ｍ．ら、「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５６１、２００２）であることができ、又は、例えばデカン酸、ミリスチン酸及びステアリン酸等の脂肪酸の群から選択することができる細胞膜透過性担体であることができ、これらは、プロテインキナーゼＣ（Ｉｏａｎｎｉｄｅｓ Ｃ．Ｇ．ら、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＩＬ－２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ｊｕｒｋａｔ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ」、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３１、２４２、１９９０）及びタンパク質チロシンホスファターゼ（Ｋｏｌｅ Ｈ．Ｋ．ら、「Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、１４３０２、１９９６）のペプチド阻害剤の細胞内送達にすでに使用されており、若しくは、ペプチドの中から選択することができる細胞膜透過性担体であることができる。好ましくは、細胞膜透過性の担体が用いられる。より好ましくは、細胞膜透過性担体ペプチドが使用される。

【0042】

細胞膜透過性担体がペプチドである場合、それは、好ましくは、正電荷アミノ酸リッチペプチドである。

【0043】

好ましくは、そのような正電荷アミノ酸リッチペプチドは、アルギニンリッチペプチドである。Ｆｕｔａｋｉら（Ｆｕｔａｋｉ Ｓ．ら、「Ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎ－ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６、５８３６、２００１）において、細胞膜透過性担体ペプチド中のアルギニン残基の数は、内部移行（内在化）の方法に大きな影響を与え、内部移行のための最適なアルギニン残基の数があるようであり、好ましくは６個を超えるアルギニンを含み、より好ましくは９個のアルギニン（Ｒ９）を含むことが示されている。

【0044】

上記ペプチドは、スペーサー（例えば、２つのグリシン残基）によって細胞膜透過性担体に結合されていてもよい。細胞膜透過性担体は、当業者が判断して任意のものを用いることができる。この場合、細胞膜透過性担体は、好ましくはペプチドである。

【0045】

通常、アルギニンリッチペプチドは、ＨＩＶ－ＴＡＴ ４８－５７ペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号１４）、ＦＨＶ－コート（ｃｏａｔ） ３５－４９ペプチド（ＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ；配列番号１５）、ＨＴＬＶ－ＩＩ Ｒｅｘ ４－１６ペプチド（ＴＲＲＱＲＴＲＲＡＲＲＮＲ；配列番号１６）及びＢＭＶ ｇａｇ ７－２５ペプチド（ＫＭＴＲＡＱＲＲＡＡＡＲＲＮＲＷＴＡＲ）（配列番号１７）を含む非限定的な群から選択される。

【0046】

未変性の（ネイティブな）ペプチド（Ｌ体）の固有の問題は、天然のプロテアーゼによる分解であるため、本発明のペプチド、及び細胞膜透過性ペプチドは、ペプチドのＤ体及び／又は「レトロインベルソ異性体」を含むように調製されてもよい。この場合、本発明のペプチド並びに細胞膜透過性ペプチドのフラグメント及びバリアントのレトロインベルソ異性体が調製される。

【0047】

当該薬剤が核酸である場合、その薬剤は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｅｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、修飾されたＡＳＯ）をコードする核酸、又はこれらの組み合わせを含む群から選択される。

【0048】

当該薬剤が核酸である場合、当該薬剤は、ホスホロアミダイト化学又はＨ－ホスホネート化学等の任意の適切な当該技術分野で認識された方法によって調製することができ、これは手動で又は自動合成機によって実施することができる。本発明の核酸ベースの薬剤は、その標的にハイブリダイズする能力を損なうことなく、多くの方法で修飾されてもよい（例えば、Ａｇｒａｗａｌ及びＧａｉｔ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、（２０１９） ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３９／９７８１７８８０１５７１４参照）。

【0049】

当該薬剤がｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｅｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はアンチセンス化合物である実施形態では、当該薬剤はヒトＦＭＲＰ核酸に標的化される。ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列としては、限定されないが、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００１１８５０７５．１（配列番号１として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００１１８５０７６．１（配列番号２として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００１１８５０８１．２（配列番号３として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００１１８５０８２．２（配列番号４として本明細書に組み込まれる）、及びＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００２０２４．６（配列番号５として本明細書に組み込まれる）が挙げられる。

【0050】

マウスＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列としては、限定されないが、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００１２９０４２４．１（配列番号６として本明細書に組み込まれる）、ＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００１３７４７１９．１（配列番号７として本明細書に組み込まれる）、及びＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＮＭ＿００８０３１．３（配列番号８として本明細書に組み込まれる）が挙げられる。

【0051】

用語「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」及び「ＭｉＲ」は互換性があり、遺伝子発現を制御することができる内因性又は人工の非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して機能すると考えられている。このようなマイクロＲＮＡを設計することは、当業者の技術の範囲内である。

【0052】

用語「ｓｉＲＮＡ」及び「低分子干渉ＲＮＡ」は互換性があり、ＲＮＡ干渉を誘導することができる一本鎖又は二本鎖のＲＮＡ分子を指す。ｓｉＲＮＡ分子は通常、１８～３０塩基対の長さの二本鎖領域を持っている。このようなｓｉＲＮＡの設計は、当業者の技術の範囲内である。

【0053】

用語「ｐｉＲＮＡ」及び「Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ」は互換性があり、遺伝子サイレンシングに関与する低分子ＲＮＡのクラスを指す。ｐｉＲＮＡ分子は、通常、２６～３１ヌクレオチドの長さである。このようなＰｉＲＮＡを設計することは、当業者の技術の範囲内である。

【0054】

修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の例としては、ＧａｐｍｅＲが挙げられる。本明細書で使用する場合、ＧａｐｍｅＲは、ＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘導するのに十分な長さのデオキシヌクレオチドモノマーの中央ブロックを含むキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドである。通常、本発明のＧａｐｍｅＲは、ＦＭＲＰをコードする１種以上のｍＲＮＡ又は標的ｍＲＮＡに対して向けられる。このようなＧａｐｍｅＲの設計は、当業者の技術の範囲内である。

【0055】

用語「ｓｇＲＮＡ」及び「ガイドＲＮＡ」は互換性があり、関心のある標的ＤＮＡ領域を認識し、編集のためにエンドヌクレアーゼをそこに導く特定のＲＮＡ配列を指す。ｇＲＮＡは通常、標的ＤＮＡに相補的な１７～２０ヌクレオチドの配列であるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓヌクレアーゼの結合スカフォールドとして機能するｔｒａｃｒ ＲＮＡの２つの部分から構成されている。

【0056】

本発明の標的ＤＮＡを認識するのに有効である限り、任意の適切な操作されたｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを採用することができる。このようなｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの設計は、当業者の技術の範囲内である。ｓｇＲＮＡは、例えば、ＦＭＲ１のＤＮＡを認識するように導かれることができ、例えば、５’－ＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＡ－３’（配列番号１２）及び５’－ＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＧ－３（配列番号１３）、又はこれらの組み合わせを含む群から選択されるｓｇＲＮＡであることができる。

【0057】

用語「ｓｎＲＮＡ」及び「小核ＲＮＡ」は互換性があり、ＲＮＡスプライシング及び転写因子の制御を含む様々なプロセスに関与する低分子ＲＮＡのクラスを指す。核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）のサブクラスも含まれる。この用語は、ｓｎＲＮＡのアンチセンス誘導体等の人工的なｓｎＲＮＡを含むことも意図されている。このようなｓｎＲＮＡの設計は、当業者の技術の範囲内である。

【0058】

それゆえ、特に、本発明は、ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ又は標的ｍＲＮＡを標的とする、長さが約１８～約３０ヌクレオチドの短い二本鎖ＲＮＡを含む単離されたｓｉＲＮＡを提供する。用語「単離され（た）」は、人為的な介入によって自然の状態から変更又は取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物の中に自然に存在するｓｉＲＮＡは「単離され」ていないが、合成ｓｉＲＮＡや、自然状態の共存物質から部分的又は完全に分離されたｓｉＲＮＡは「単離され」ている。単離されたｓｉＲＮＡは、実質的に精製された形で存在することができ、又は、例えば、ｓｉＲＮＡが送達された細胞のような非天然の環境で存在することができる。本発明のｓｉＲＮＡは、部分的に精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、又は組換え的に産生されたＲＮＡ、並びに１つ以上のヌクレオチドの追加、欠失、置換及び／又は変更によって天然に存在するＲＮＡとは異なる改変されたＲＮＡを含むことができる。このような改変には、ｓｉＲＮＡの末端（一方若しくは両方）又はｓｉＲＮＡの１つ以上の内部ヌクレオチド等への非ヌクレオチド物質の付加を含むことができ、これにはｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性を持たせる改変が含まれる。

【0059】

本発明のｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖は、３’オーバーハングを含むこともできる。「３’オーバーハング」は、ＲＮＡ鎖の３’末端から延びる少なくとも１つの対になっていないヌクレオチドを指す。従って、１つの態様では、本発明のｓｉＲＮＡは、長さ１～約６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを含む）、好ましくは長さ１～約５ヌクレオチド、より好ましくは長さ１～約４ヌクレオチド、特に好ましくは長さ約１～約２ヌクレオチドの少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。

【0060】

上記ｓｉＲＮＡ分子の両鎖が３’オーバーハングを含む場合、それらのオーバーハングの長さは各鎖で同じであってもよいし異なっていてもよい。最も好ましい実施形態では、３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両鎖に存在し、長さが２ヌクレオチドである。本発明のｓｉＲＮＡの安定性を高めるために、３’オーバーハングを分解に対して安定化させることもできる。１つの実施形態では、オーバーハングは、アデノシンヌクレオチド又はグアノシンヌクレオチド等のプリンヌクレオチドを含むことによって安定化される。

【0061】

あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば、３’オーバーハングの中のウリジンヌクレオチドを２’－デオキシチミジンで置換することは許容され、ＲＮＡｉ分解の効率に影響を与えない。特に、２’－デオキシチミジンに２’の水酸基がないことで、組織培養培地中での３’オーバーハングのヌクレアーゼ耐性が著しく向上する。

【0062】

本発明のｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列（ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡを含む）のいずれかにおいて、約１８～３０、好ましくは１９～２５の連続したヌクレオチドの任意のストレッチ（広がり、ｓｔｒｅｔｃｈ）を標的とすることができる。ｓｉＲＮＡの標的配列を選択する技術は、当該技術分野で周知である。従って、本発明のｓｉＲＮＡのセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ中の約１８～約３０ヌクレオチドの任意の連続したストレッチと同一のヌクレオチド配列を含む。

【0063】

本発明のｓｉＲＮＡは、当業者にとって公知である多くの技術を用いて得ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、当該技術分野で公知の方法を用いて、化学的に合成できるし、又は組換え的に産生することができる。好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡは、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイト及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学的に合成される。ｓｉＲＮＡは、２つの別々の相補的なＲＮＡ分子として、又は２つの相補的な領域を有する単一のＲＮＡ分子として合成することができる。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の市販業者としては、Ｐｒｏｌｉｇｏ（プロリゴ）（ハンブルグ、ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ダーマコン・リサーチ）（ラファイエット（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）、コロラド州、米国）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ピアス・ケミカル）（Ｐｅｒｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ペルビオ・サイエンス）の一部、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州、米国）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（グレン・リサーチ）（スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）、バージニア州、米国）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（ケムジーンズ）（アッシュランド（Ａｓｈｌａｎｄ）、マサチューセッツ州、米国）、Ｑｉａｇｅｎ（キアゲン）（ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）、及びＣｒｕａｃｈｅｍ（クルアケム）（グラスゴー、英国）が挙げられる。

【0064】

あるいは、任意の適切なプロモーターを用いて、組換えの円形又は線形のＤＮＡプラスミドからｓｉＲＮＡを発現させることもできる。プラスミドから本発明のｓｉＲＮＡを発現させるのに適したプロモーターとしては、例えば、Ｕ６又はＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技術の範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、特定の組織又は特定の細胞内環境でｓｉＲＮＡを発現させるための誘導性又は調節性のプロモーターも含むことができる。組換えプラスミドから発現されるｓｉＲＮＡは、標準的な技術によって培養細胞発現系から単離されるか、又は神経細胞で細胞内に発現させることができる。

【0065】

本発明のｓｉＲＮＡは、組換えウイルスベクターから神経細胞内で発現させることもできる。この組換えウイルスベクターは、本発明のｓｉＲＮＡをコードする配列と、ｓｉＲＮＡ配列を発現させるための任意の適切なプロモーターとを含む。適切なプロモーターとしては、例えば、Ｕ６又はＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列及びサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は、当業者の技術の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターは、脳内（例えば、海馬神経細胞）、前立腺等でｓｉＲＮＡを発現させるための誘導性又は調節性のプロモーターも含むことができる。

【0066】

１つの実施形態では、本発明の１種以上のｓｉＲＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモ・サイエンティフィック）のヒトＦＭＲＰ（Ｓ５３１７、Ｓ５３１６）を標的とするｓｉＲＮＡを含む非限定的な群から選択される。

【0067】

１つの実施形態では、本発明の１種以上のｓｉＲＮＡは、ｓｉＦＭＲＰ＃１：ＡＵＡＡＧ ＡＧＡＣＡ ＡＣＵＵＧ ＧＵＧＣ（配列番号１０）及びｓｉＦＭＲＰ＃２：ＵＡＡＣＵＵＣＧＧＡＡＵＵＡＵＧＵＡＧ（配列番号１１）からなる非限定的な群から選択される。

【0068】

本発明の薬剤は、抗体、その抗体の抗原結合フラグメント、又は抗体模倣物から選択されてもよい。好ましくは、当該薬剤が抗体、その抗体の抗原結合フラグメント、又は抗体模倣物である場合、当該薬剤が癌細胞内に送達されうるように、当該薬剤は、抗体、その抗体の抗原結合フラグメント、若しくは抗体模倣物をコードする１種以上の核酸を含むプラスミド又はベクターの形態にあり、その場合、ＦＭＲＰは細胞質及び核に局在する。

【0069】

本明細書で使用する場合、「抗体」は、特定の抗原決定基又はエピトープと反応するタンパク質分子であり、構造的特性に基づいて１つ又は５つの異なるクラスに属する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ。抗体は、ポリクローナル抗体（例えば、ポリクローナル血清）又はモノクローナル抗体であってもよく、その例としては、限定はされないが、完全に組み立てられた抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント、及びキメラ抗体、ヒト化抗体が挙げられるが、ただし、これらの分子は依然として生物学的に活性であり、かつ依然として本発明の少なくとも１種のペプチドに結合する必要がある。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。同じく好ましくは、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４又はこれらの組み合わせを含む群から選択される。最も好ましくは、モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ、又はこれらの組み合わせを含む群から選択される。

【0070】

典型的な抗体は、２本の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖と２本のＩｇ軽鎖から構成されている。いくつかの異なるタイプの重鎖が存在し、抗体のクラス又はアイソタイプを定めている。これらの重鎖のタイプは、異なる動物間で異なる。すべての重鎖は一連の免疫グロブリンドメインを含み、通常、抗原を結合するのに重要な１つの可変（ＶＨ）ドメインといくつかの定常（ＣＨ）ドメインを持つ。各軽鎖は、２つの連なった（タンデムな）免疫グロブリンドメイン、すなわち、１つの定常（ＣＬ）ドメインと、抗原結合に重要な１つの可変ドメイン（ＶＬ）から構成されている。

【0071】

抗体の産生のために、様々な宿主動物が、ＦＭＲＰ遺伝子産物、又はその一部（組換えタンパク質中のＦＭＲＰ遺伝子産物の一部が挙げられるがこれに限定されない）を注入することによって免疫されてもよい。このような宿主動物としては、いくつかの例としてウサギ、マウス及びラットが挙げられてもよいが、これらに限定されない。免疫学的反応を高めるために、宿主種に応じて様々なアジュバントを使用してもよく、その例としては、フロイント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌、ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）、及びコリネバクテリウム・パルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）等の潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。

【0072】

モノクローナル抗体は、培養中の連続した細胞株による抗体分子の産生を可能にする任意の技術を用いて調製されてよい。これらには、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５－４９７によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２、Ｃｏｔｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８０：２０２６－２０３０）、並びにＥＢＶ－ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、１９８５、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７－９６頁）が含まれるが、これらに限定されない。加えて、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子の遺伝子と適切な生物活性を有するヒト抗体分子の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の作製のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１－６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４－６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２－４５４）を使用することができる。あるいは、一本鎖抗体の製造について記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）を、結合パートナーの１つに特異的な一本鎖抗体を製造するために適応させることができる。

【0073】

本発明の抗体の修飾語として使用されるときの用語「単離され（た）」は、抗体が人の手によって作られたものであるか、又は、完全に若しくは少なくとも部分的に、自然に発生するインビボ環境から分離されていることを意味する。一般に、単離された抗体は、自然界で通常会合する１種以上の材料、例えば１種以上のタンパク質を実質的に含まない。用語「単離された」は、抗体の代替的な物理的形態、例えば、マルチマー／オリゴマー、修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、脂質化）若しくは誘導体化された形態、又は人の手によって生産された宿主細胞で発現された形態を除外するものではない。

【0074】

「単離された」抗体は、自然界で通常会合する物質のほとんど又はすべてを含まないとき、「実質的に純粋な」又は「精製された」抗体でもあることができる。従って、実質的に純粋又は精製されてもいる単離された抗体は、数百万の他の配列の中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド、例えば、抗体ライブラリの抗体又はゲノムライブラリ又はｃＤＮＡライブラリの核酸を含まない。

【0075】

特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成されてもよい。「抗原結合フラグメント」は、完全長の抗体の一部を含む。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、ダイアボディ、ミノボディ、ナノボディ、線形抗体（Ｚａｐａｔａら（１９９５） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７－１０６２）、一本鎖の抗体分子、並びに抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が挙げられる。

【0076】

このようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって生成することができ、Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成することができる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを構築して（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５－１２８１）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に特定することができる。

【0077】

好ましくは、上記抗体又は上記抗体の抗原結合フラグメントは、細胞内に浸透するように操作されているか、又は遺伝子治療スタイルのアプローチを用いて細胞内で直接発現される。後者は、細胞内で産生され、同じ細胞内で抗原（ＦＭＲＰタンパク質、ＦＭＲをコードするｍＲＮＡ等．．．）と結合する細胞内抗体であり、イントラボディ（細胞内発現抗体）とも呼ばれることがある。

【0078】

本発明はまた、好ましくはプラスミド又はベクターの形態の遺伝子導入ベクターであって、本発明のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｅｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ペプチド又はその類似体、抗体若しくはその抗体の抗原結合フラグメント、又は類似の細胞内抗体模倣物、及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする１種以上の核酸を含むベクターも企図している。本明細書で使用する場合、「ベクター」は、核酸配列を標的細胞に移すことができるものである（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状担体、及びリポソーム）。

【0079】

適切なベクターとしては、ＳＶ４０及び公知の細菌プラスミドの誘導体、例えば、大腸菌プラスミドｃｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４等のプラスミド；ファージＤＮＡ、例えば、ファージＸの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、並びに他のファージＤＮＡ、例えばＭｌ ３及び糸状一本鎖ファージＤＮＡ等；２μプラスミド又はその誘導体等の酵母プラスミド；昆虫細胞又は哺乳類細胞に有用なベクター等の真核細胞に有用なベクター；ファージＤＮＡ又は他の発現制御配列を採用するように改変されたプラスミド等、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター；等が挙げられる。

【0080】

インビトロ又はインビボで細胞に核酸を送達するために、様々なウイルスベクターが使用される。非限定的な例は、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス等をベースにしたベクターである。原則として、これらのすべてが、本発明のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｅｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする発現可能な核酸分子を含む発現カセットを送達するのに適している。

【0081】

あるいは、本発明の遺伝子導入ベクター、好ましくはウイルスベクターは、ｉ）ＦＭＲ１遺伝子の制御配列又はＦＭＲＰ ｍＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ配列を標的とする少なくとも１種のｓｇＲＮＡ、又はｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ、並びにｉｉ）及びＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ等の構造誘導型エンドヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲベースの機能喪失システムを送達するために与えられる。本発明の標的ＤＮＡを特異的に結合するのに有効である限り、任意の適切な天然由来、又は人工的なＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを採用することができ、それはＣａｓ９、Ｃｐｆ１、及びＦＥＮ－１を含む非限定的な群から選択されてもよい。好ましくは、上記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。

【0082】

好ましい態様では、上記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター又はバキュロウイルスベクター、最も好ましくはアデノウイルス／アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであるが、他の送達手段又はビヒクルが知られている（例えば、酵母系、マイクロベシクル、遺伝子銃／ベクターを金ナノ粒子に付着させる手段等）が提供されており、いくつかの態様では、ウイルスベクター又はプラスミドベクターの１種以上が、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃を介して送達されてもよい。より好ましくは、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びレンチウイルスを含む群から選択される。レンチウイルスは、第１世代、第２世代、第３世代のものがある。

【0083】

本発明では、本発明のプラスミド若しくはベクター、又は本発明のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｅｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲベースの機能喪失システム及び／若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする１種以上の核酸を含む宿主細胞も企図されている。この宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であることができ、好ましくは、宿主細胞は真核細胞であり、最も好ましくは、宿主細胞は哺乳類細胞である。本発明の宿主細胞は、例えばエクソソーム及びマイクロベシクル等、当業者にとって公知である多くの技術を用いて、本発明のプラスミド又はベクターを癌細胞（複数可）に送達することができる。

【0084】

本明細書では、医薬組成物であって、
ｉ）治療有効量の、本明細書に記載されるＦＭＲＰタンパク質、ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ及び／若しくはＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／若しくは活性を調節する薬剤、又はｉｉ）本発明のプラスミド若しくはベクター、又はｉｉｉ）本発明の宿主細胞と、
薬学的に許容できる担体又は希釈剤と
を含む医薬組成物も提供する。

【0085】

本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法で製造されてもよく、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖剤製造（ｄｒａｇｅｅ－ｍａｋｉｎｇ）、微粒子化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥のプロセスによって製造することができる。適切な製剤化は、選択した投与経路に依存する。本願の化合物の製剤化及び投与に関する技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルベニア州、最新版で見出されてもよい。

【0086】

本発明の任意の薬剤は、それ自体で、又は適切な担体若しくは賦形剤（複数種可）と混合される医薬組成物で、ＦＭＲＰ活性が不十分、異常、若しくは過剰であることを特徴とする障害を含む様々な障害を治療又は改善するための治療上有効な用量で、ヒトの患者を含む動物に投与することができる。

【0087】

いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、必要とする対象における癌及び／若しくは癌転移の治療並びに／又は予防に有用である。

【0088】

本明細書で使用される用語「治療有効量」は、健全な医学的判断の範囲内で、治療すべき症状及び／又は状態を有意に良い方向に変更するのに十分な高さでありながら、重篤な副作用を回避するのに十分な低さである（合理的なリスク／効果比である）、ＦＭＲＰタンパク質、ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ及び／若しくはＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は活性を調節する薬剤の量を意味する。

【0089】

ＦＭＲＰタンパク質、ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ及び／若しくはＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は活性を調節する薬剤の治療有効量は、患者の種類、種、年齢、体重、性別及び病状、治療すべき症状の重症度、投与経路、患者の腎機能及び肝機能等の様々な要因に応じて選択される。当業者であれば、癌及び／又は癌の転移の進行を予防、対抗、又は阻止するために必要な当該薬剤の有効量を容易に決定し、処方することができる。

【0090】

「薬学的に許容できる担体又は希釈剤」は、一般に安全で、非毒性で、望ましい医薬組成物を調製するのに有用な担体又は希釈剤を意味し、ヒトの医薬用途に許容できる担体又は希釈剤が含まれる。

【0091】

このような薬学的に許容できる担体は、水及び油等の無菌の液体であることができ、これらの油には、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等の石油、動物、植物又は合成由来のものが含まれる。水は、当該医薬組成物を静脈内に投与する場合に好ましい担体である。生理食塩水、並びにブドウ糖及びグリセロールの水溶液も、特に注射液の場合には、液体の担体として採用することができる。

【0092】

薬学的に許容できる賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。

【0093】

当該医薬組成物は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸の塩等、１種以上の医薬的に許容できる塩をさらに含有していてもよい。加えて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル又はゲル化材料、香料、着色料、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤等の補助物質も当該医薬組成物中に存在してもよい。加えて、とりわけ剤形が再構成可能な形態である場合には、防腐剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、アンチケーキング剤、充填剤、キレート剤、コーティング剤、化学的安定剤等の１種以上の他の従来の医薬成分も存在してもよい。適当な例示的成分としては、大結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容できる賦形剤の徹底的な議論は、参照により本明細書に組み込まれるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、ニュージャージー州、１９９１）で入手可能である。

【0094】

いくつかの実施形態では、本発明は、ＦＭＲＰをコードする核酸及びその相同体、類似体、及び欠失体、並びに化合物、ペプチド若しくはその類似体、抗体若しくはその抗体の抗原結合フラグメント、抗体模倣物、又は核酸を含むがこれらに限定されない、ＦＭＲＰ遺伝子発現又はＦＭＲＰ遺伝子産物の活性を調節する薬剤の特定、製造、並びに使用、並びにそのような化合物の医薬製剤及び投与経路に関する。

【0095】

ＦＭＲＰトランスフェクタントを用いたアッセイは、ＦＭＲＰ遺伝子の発現を調節する薬剤を成功裏に特定するために用いることができる。また、ＦＭＲＰ遺伝子産物の活性に関するアッセイも記載されている。

【0096】

本発明はまた、ＦＭＲＰ転写産物に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子産物に対する抗体（フラグメント及び模倣物）、ＦＭＲＰを安定的に発現するように操作された細胞株、ペプチド、ポリヌクレオチド、及び小有機分子を含む化合物をスクリーニングして、ＦＭＲＰ遺伝子産物の発現又は活性を阻害するものを特定するためのアッセイ、並びにそのような化合物を用いて、ＦＭＲＰ活性によって特徴づけられる疾患を治療する方法を含む。

【0097】

ヒトＦＭＲＰタンパク質は、ヒトＦＭＲＰの作用機序に関するインビトロの研究、特に薬物スクリーニングによって特定されるＦＭＲＰに選択的な阻害剤の作用機序に関する更なる研究、あるいは既存の薬剤の、又は他の手段で特定されてもよい阻害剤の作用機序の研究に有用であろう。精製されたヒトＦＭＲＰタンパク質は、Ｘ線結晶学に適した結晶の製造にも有用であろう。このような結晶は、分子構造に基づいて薬物を合理的に設計するために極めて有益であろう。

【0098】

本発明は、ＦＭＲＰの安定性及び／又は活性を調節する薬剤をスクリーニングするためのインビトロシステムを提供する。アッセイは、生体内の特定の血清レベルの薬剤の影響をより近似する生きた哺乳類細胞に対して、又は培養細胞株から調製したミクロソーム抽出物に対して行うことができる。ミクロソーム抽出物を用いた研究では、直接的な相互作用をより厳密に決定できる可能性がある。

【0099】

従って、本発明は、ＦＭＲＰを選択的に阻害する薬剤の相対的な阻害活性を評価する方法も提供する。このアッセイは、例えば、ＦＭＲＰを発現するトランスジェニック（遺伝子導入の）細胞株又はそのミクロソーム抽出物を、適切な培養培地又は緩衝液中で予め選択された量の薬剤と接触させる工程と、混合物にアラキドン酸を添加する工程と、上記細胞株又は上記ミクロソーム抽出物による、ＦＭＲＰの合成レベル又はＦＭＲＰタンパク質の活性のレベルを、上記薬剤の不存在下での対照細胞株又はミクロソーム抽出物の一部と比較して測定する工程とを含む。

【0100】

いくつかの実施形態では、本発明は、細胞におけるＦＭＲＰ活性を阻害する薬剤の能力を決定する方法であって、
（１）第１の予め選択された量の上記薬剤を、培養培地中の細胞に添加する工程であって、この細胞はＦＭＲＰを発現するＤＮＡ配列を含む工程と、
（２）上記細胞によるＦＭＲＰ活性のレベルを測定する工程と、
（３）上記レベルを、上記薬剤の不存在下での細胞株によるＦＭＲＰ活性のレベルと比較する工程と
を含む方法を提供する。

【0101】

いくつかの実施形態では、上記細胞は、トランスジェニック細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、トランスジェニック細胞株である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック細胞又はトランスジェニック細胞株は、ＦＭＲＰを発現する、染色体に組み込まれた組換えＤＮＡ配列を含む細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、自己のＦＭＲＰ活性を発現しない。

【0102】

いくつかの実施形態では、上記細胞は、腫瘍形成及び悪性進行の過程で、免疫攻撃に対する抵抗性を獲得するようにＦＭＲＰの発現を著しく上方制御（増加）させたヒト又はマウスの癌細胞である。

【0103】

いくつかの実施形態では、上記ＦＭＲＰは、哺乳類ＦＭＲＰ、好ましくはヒトＦＭＰＲである。

【0104】

いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰの発現及び／又は活性のレベルは、ＦＭＲＰによるその標的ＲＮＡへの結合を阻害する薬剤によって決定される。

【0105】

いくつかの実施形態では、本発明は、ｉ）ＦＭＲＰタンパク質、ｉｉ）ＦＭＲＰをコードするｍＲＮＡ、及び／若しくはｉｉｉ）ＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は活性を調節する薬剤を特定する方法であって、
（１）ＦＭＲＰを発現する試料を提供する工程と、
（２）上記生体試料を試験剤と接触させる工程と、
（３）ＦＭＲＰの発現及び／又は活性のレベルを決定する工程と、
（４）上記発現及び／又は活性のレベルを、上記試験剤を接触させていない対照試料と比較する工程と、
（５）上記ＦＭＲＰの発現及び／又は活性のレベルを低下させる試験剤を選択する工程と
を含む方法を提供する。

【0106】

いくつかの実施形態では、上記試料は、自然に高レベルの内因性ＦＭＲＰを発現する細胞である。いくつかの実施形態では、試料は、ＦＭＲＰを発現するように操作された細胞である。

【0107】

いくつかの実施形態では、上記細胞は、トランスジェニック細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、トランスジェニック細胞株である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック細胞又はトランスジェニック細胞株は、ＦＭＲＰを発現する、染色体に組み込まれた組換えＤＮＡ配列を含む細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、自己のＦＭＲＰ活性を発現しない。

【0108】

いくつかの実施形態では、上記細胞は、腫瘍形成及び悪性進行の過程で、免疫攻撃に対する抵抗性を獲得するようにＦＭＲＰの発現を著しく上方制御させたヒト又はマウスの癌細胞である。

【0109】

いくつかの実施形態では、上記ＦＭＲＰは、哺乳類ＦＭＲＰ、好ましくはヒトＦＭＰＲである。

【0110】

いくつかの実施形態では、ＦＭＲＰの発現及び／又は活性のレベルは、ＦＭＲＰによるその標的ＲＮＡへの結合を阻害する薬剤によって決定される。

【0111】

スクリーニングで特定された薬剤は、ＦＭＲＰの発現及び／又は活性を選択的に調節する能力を示す。これらの薬剤には、ＦＭＲＰをコードする核酸並びにその相同体、類似体及び欠失体、並びに化合物、ペプチド若しくはその類似体、抗体若しくはその抗体の抗原結合フラグメント、抗体模倣物、又は核酸が含まれるが、これらに限定されない。

【0112】

ＦＭＲＰ遺伝子をコードする本発明のＤＮＡ、又はその相同体、類似体、若しくはフラグメントは、本発明に従って、ＦＭＲＰの遺伝子型又はＦＭＲＰの発現の表現型である病状を診断するために使用されてもよい。

【0113】

あるいは、本発明の医薬組成物は、抗癌療法の複数の成分のうちの１つをさらに含む。好ましくは、この抗癌療法は、治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を含む。好ましくは、この免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、及びＣＴＬＡ－４阻害剤、又はこれらの組み合わせを含む群から選択される。代替的に、又は追加的に、この１種以上の抗癌療法は、本明細書に記載されているように、化学療法剤、又は複数の異なる化学療法剤のカクテルである。

【0114】

本明細書で使用する場合、「ＰＤ－１阻害剤」は、Ｔ細胞上のＰＤ－１受容体と、腫瘍細胞上に存在するそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との結合を妨害又はブロックする任意の薬剤を意味する。ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１のそのリガンドへの結合を妨害、阻害、又はブロックする抗体又はそのフラグメントであってもよい。ＰＤ－１阻害剤は、低分子又はその他の薬剤であってもよい。ＰＤ－１阻害剤の非限定的な例は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ＢＭＳ ９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ ＢＧＢ－１０８及びｍＤＸ－４００及びＭＥＤＩ４７３６を含む。

【0115】

ＰＤ－Ｌ１阻害剤の非限定的な例は、ＭＥＤＩ－０６８０、ＲＧ－７４４６、デュルバルマブ、ＫＹ－１００３、ＫＤ－０３３、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ、ＴＳＲ－０４２、ＡＬＮ－ＰＤＬ、ＳＴＩ－Ａ１０１４及びＢＭＳ－９３６５５９を含む群から選択される。

【0116】

本明細書で使用される場合、「ＣＴＬＡ－４阻害剤」は、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ又はブロッカー、例えばイピリムマブ、トレメリムマブ及びアバタセプト等のＣＴＬＡ－４を妨害又はブロックする任意の薬剤を意味する。

【0117】

別の態様では、上記ＦＭＲＰに向けられた抗癌療法は、治療有効量の、個別化されたネオアンチゲンカクテルを含む抗腫瘍ワクチン、又は抗腫瘍性免疫反応を強化する他の免疫刺激剤と組み合わせて含まれる。

【0118】

本発明はさらに、必要とする対象における癌及び／若しくは癌転移の治療方法並びに／又は予防方法であって、本発明の医薬組成物を、単独で、又は１種以上の抗癌療法と組み合わせて、上記対象に投与する工程を含む方法を提供する。最も好ましくは、上記抗癌療法は、治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を含む。好ましくは、この免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、及びＣＴＬＡ－４阻害剤、又はこれらの組み合わせを含む群から選択される。代替的に、又は追加的に、この抗癌療法は、本明細書に記載されている化学療法剤、又は複数の異なる化学療法剤のカクテルである。

【0119】

本発明の医薬組成物とＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害剤との組み合わせは、任意の順序で、又は同時に投与されてもよいことが理解されるであろう。選択された態様では、当該医薬組成物及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４は、以前に他の抗癌剤による治療を受けた患者に投与される。特定の他の態様では、当該医薬組成物及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害剤は、実質的に同時に又は同時に投与される。例えば、対象は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害剤による治療過程を受けている間に、本発明の医薬組成物を与えられてもよい。加えて、対象は、他の形態の癌治療、例えば化学療法を既に受けているか、又は同時に受けている可能性があることが企図されている。特定の態様では、本発明の医薬組成物は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害剤による治療の１年以内に投与される。特定の代替的な態様では、本発明の医薬組成物は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害剤及び／又は追加の抗癌療法による任意の治療の１０ヶ月、８ヶ月、６ヶ月、４ヶ月、又は２ヶ月以内に投与される。特定の他の態様では、本発明の医薬組成物は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害剤及び／又は追加の抗癌剤若しくは抗癌療法による任意の治療の４週間、３週間、２週間、又は１週間以内に投与される。いくつかの態様では、本発明の医薬組成物は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害剤及び／又は追加の抗癌療法若しくは抗癌剤を用いた任意の治療の５日、４日、３日、２日、又は１日以内に投与される。本発明の医薬組成物と、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害剤及び／又は追加の抗癌剤若しくは抗癌療法とが、数時間又は数分以内に（すなわち、実質的に同時に）対象に投与されてもよいことがさらに理解されるであろう。

【0120】

実施形態では、本発明の薬剤は、Ｔ細胞（及びＮＫ細胞）の殺傷活性及び豊富さを持続させるか、又は、ＦＭＲＰを阻害する効果を補完する限りにおいて骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）及び免疫抑制性マクロファージ等の他の障壁を破壊する、他の免疫調節剤と組み合わせることができよう。

【0121】

いくつかの実施形態では、本発明の薬剤は、ＡＤＡＲ１阻害剤を組み合わせることができよう。免疫抑制性のＲＮＡ編集酵素であるＡＤＡＲ１のノックアウト（すなわち、遺伝的阻害）は、ＦＭＲＰのノックアウトも有するダブルＫＯ腫瘍における全体的な生存期間の延長において、組み合わせ的な利点を有する。

【0122】

本発明の医薬組成物及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害と組み合わせて投与されてもよい抗癌剤には、化学療法剤が含まれる。従って、いくつかの態様では、上記方法又は治療は、本発明の医薬組成物及びＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害剤と、化学療法剤又は複数の異なる化学療法剤のカクテルとの併用投与を含む。本発明の医薬組成物による治療は、これらの他の治療法の投与に先立って、それと同時に、又はそれ以降に行うことができる。本発明が企図する化学療法剤には、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、タキソール（ＴＡＸＯＬ）、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン及びカルボプラチン等、当該技術分野で知られており、市販されている化学物質又は薬物が含まれる。複合的な投与（併用投与）としては、単一の医薬処方物での同時投与若しくは別々の製剤での同時投与、又は連続投与を挙げることができ、この連続投与は、いずれの順序でもよいが、一般にはすべての活性剤が同時にその生物学的活性を発揮できるような時間内に投与される。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは、製造者の指示に従って、又は当業者が経験的に決定して使用することができる。

【0123】

本発明で有用な化学療法剤としては、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）等のアルキル化剤；ブスルファン、インプレスルファン及びピポスルファン等のアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）等のアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールメラミン等のエチレンイミン類及びメチルメラミン類；クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノボエンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード類；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等のニトロソウレア類；アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｓ）類、アクチノマイシン、オースラマイシン（アントラマイシン、ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エゾルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン等の抗生物質；メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）等の代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ等のピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗副腎ホルモン類（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌｓ）；フロリン酸等の葉酸補充剤（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトラキサート（エダトレキサート、ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルニシン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ；ラゾキサン；シゾフラン（シゾフィラン）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（タキソール）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ブリストル・マイヤーズスクイブ・オンコロジー）、プリンストン（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ）、ニュージャージー州）及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（タキソテール）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ（ローヌ・プーラン・ローラー）、アントニー（Ａｎｔｏｎｙ）、フランス）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチン等の白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＯＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸、又は誘導体も含まれるが、これらに限定されない。化学療法剤には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害する作用を有する抗ホルモン剤も含まれ、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤である４（５）－イミダゾール類、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ（ファレストン））等の抗エストロゲン剤、並びにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド及びゴセレリン等の抗アンドロゲン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸又は誘導体が挙げられる。

【0124】

特定の態様では、上記治療剤はキナーゼ阻害剤である。特定の態様では、このキナーゼ阻害剤は、マルチターゲットの受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。キナーゼ阻害剤としては、スニチニブ、パゾパニブ、クリゾチニブ、ダサチニブが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、第２の抗癌剤はスニチニブである。

【0125】

特定の態様では、上記治療剤は、哺乳類のラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）の阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤としては、テムシロリムス、シロリムス、デフォロリムス、エベロリムスが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、第２の抗癌剤はエベロリムスである。

【0126】

特定の態様では、上記治療剤はソマトスタチン類似体である。ソマトスタチン類似体は、ソマトスタチンに対する特異的で高親和性の膜受容体との相互作用を通じて作用する。ソマトスタチン類似体としては、オクトレオチド、ソマチュリン、及びＲＣ１６０（オクタスタチン（ｏｃｔａｓｔａｔｉｎ））が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、第２の抗癌剤はオクトレオチドである。

【0127】

特定の態様では、上記化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（例えば、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ）の作用を妨害する化学療法剤である。トポイソメラーゼ阻害剤としては、塩酸ドキソルビシン、クエン酸ダウノルビシン、塩酸ミトキサントロン、アクチノマイシン０、エトポシド、塩酸トポテカン、テニポシド（ＶＭ－２６）、及びイリノテカンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、第２の抗癌剤はイリノテカンである。

【0128】

特定の態様では、上記化学療法剤はアルキル化剤である。特定の態様では、化学療法剤はテモゾロミドである。

【0129】

特定の態様では、上記化学療法剤は、代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、正常な生化学反応に必要な代謝物と類似した構造を持ちながら、細胞分裂等の細胞の１つ以上の正常な機能を妨害するほど異なる構造を持つ化学物質である。代謝拮抗剤としては、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサートナトリウム、ラリトレキセド（ラルチトレキセド、ｒａｌｉｔｒｅｘｅｄ）、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、ＴＨＩＯＧＵＡＮＩＮＥ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（グラクソ・スミスクライン））、５－アザシチジン、６－メルカプトプリン、アザチオプリン、６－チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、及びクラドリビン、並びにこれらのいずれかのものの薬学的に許容できる塩、酸、又は誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、第２の抗癌剤はゲムシタビンである。特定の態様では、治療すべき腫瘍は膵神経内分泌腫瘍であり、第２の抗癌剤は代謝拮抗剤（例えば、ゲムシタビン）である。

【0130】

特定の態様では、上記化学療法剤は有糸分裂阻害剤であり、これにはチューブリンを結合する薬剤が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な例として、この薬剤はタキサンを含む。特定の態様では、この薬剤は、パクリタキセル若しくはドセタキセル、又はパクリタキセル若しくはドセタキセルの薬学的に許容できる塩、酸、若しくは誘導体を含む。特定の態様では、この薬剤は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、アルブミン結合パクリタキセル（例えば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（アブラキサン））、ＤＨＡ－パクリタキセル、又はＰＧ－パクリタキセルである。特定の代替的な態様では、有糸分裂阻害剤は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、若しくはビンデシン等のビンカアルカロイド、又はその薬学的に許容できる塩、酸、若しくは誘導体を含む。いくつかの態様では、上記有糸分裂阻害剤は、Ｅｇ５キネシンの阻害剤、又はＡｕｒｏｒａ Ａ若しくはＰｌｋ１等の分裂期キナーゼの阻害剤である。

【0131】

特定の態様では、当該治療は、本発明の医薬組成物と、本明細書に記載のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＣＴＬＡ－４阻害剤と、放射線療法との併用投与を伴う。本発明の医薬組成物による治療は、放射線療法の投与に先立って、それと同時に、又はそれ以降に行うことができる。そのような放射線療法の任意の投与スケジュールは、当業者によって決定されるように使用することができる。

【0132】

本発明の他の態様では、本発明の医薬組成物は、徐放性製剤、又は徐放性デバイスを用いて投与される製剤である。そのようなデバイスは当該技術分野で周知であり、例えば、経皮パッチ、及び非徐放性医薬組成物で徐放効果を達成するために様々な用量で連続的な定常状態で経時的に薬物送達を提供することができる小型の埋め込み型のポンプが挙げられる。

【0133】

本発明の他の態様では、本発明の医薬組成物は、上記患者が放射線療法を受ける前、受ける間及び／又は受けた後に投与される。

【0134】

「放射線療法」は、腫瘍を縮小し、癌細胞を死滅させるための高エネルギー放射線の使用を指す。放射線療法の例としては、外部放射線療法及び内部放射線療法（ブラキセラピーとも呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0135】

外部放射線療法は最も一般的なもので、通常、直接又は間接的な電離放射線のビームを腫瘍又は癌の部位に向けることを伴う。放射線のビーム、光子、コバルト、又は粒子線による治療は、腫瘍又は癌の部位に集中して行われるが、正常で健康な組織の被爆を避けることはほぼ不可能である。外部放射線療法用のエネルギー源は、直接的又は間接的な電離放射線（例えば、Ｘ線、ガンマ線、粒子線又はこれらの組み合わせ）を含む群から選択されまる。

【0136】

内部放射線療法は、ビーズ、ワイヤー、ペレット、カプセル等の放射線放出源を、腫瘍部位又はその近傍の体内に埋め込むことを伴う。内部放射線療法用のエネルギー源は、ヨウ素（ヨウ素１２５又はヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、インジウム、リン酸塩又はコバルトの放射性同位体、及びこれらの組み合わせを含む放射性同位体の群から選択される。このようなインプラント（埋め込み物）は、治療後に取り外すこともできるし、体内に放置することもできる。内部放射線療法の種類としては、組織内及び洞内ブラキセラピー（高線量率、低線量率、パルス線量率）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0137】

現在、あまり一般的ではない形態の内部放射線療法は、放射性同位体の生物学なキャリアを伴う。例えば、放射性物質と結合した腫瘍特異的な抗体を患者に投与する放射線免疫療法がある。この抗体は腫瘍抗原と結合し、これにより放射線量を関連組織に効果的に投与する。

【0138】

放射線療法を行う方法は、当業者にとって周知である。

【0139】

本発明の医薬組成物は、経口で、非経口で、舌下に、経皮で、直腸に、経粘膜で、局所に、吸入により、口腔内投与により、胸腔内に、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、皮下に、筋肉内に、鼻腔内に、腫瘍内に、髄腔内に、及び関節内に、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない異なる経路で対象に投与されてもよい。ヒトでの使用の場合、当該組成物は、ヒトの通常の使用方法に従って、適切に許容できる製剤として投与されてもよい。当業者であれば、特定の患者に最も適した投与法や投与経路を容易に決定するであろう。本発明の組成物は、従来のシリンジ、ニードルレス注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎｓ）」、又はエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「ハイドロダイナミック法」、若しくは超音波等の他の物理的方法によって投与されてもよい。

【0140】

本発明の医薬組成物はまた、インビボエレクトロポレーションを伴う及び伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）、リポソーム媒介、ナノ粒子促進の組換えベクター、例えば本明細書に記載された組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス及び組換えアデノウイルス随伴ウイルスを含むいくつかの技術によって患者に送達されてもよい。当該組成物は、静脈内注射してもよいし、脳又は筋肉に局所的に注入してもよいし、例えば、筋肉、脳、肝臓、前立腺、乳房、腎臓（複数可）、造血系等の関心のある組織にエレクトロポレーションしてもよい。

【0141】

本発明の薬剤及び／又は医薬組成物は、ｉ）ＦＭＲＰタンパク質、ｉｉ）ＦＭＲＰタンパク質をコードするｍＲＮＡ、及び／若しくはｉｉｉ）ＦＭＲＰをコードするＦＭＲ１遺伝子の発現並びに／又は免疫抑制活性を調節することが有益である任意の方法で使用されてもよい。

【0142】

当業者であれば、本明細書に記載されている本発明は、具体的に記載されているもの以外の変形及び変更が可能であることを理解するであろう。本発明は、その精神又は本質的な特性から逸脱しない範囲で、そのようなすべての変形及び変更を含むことを理解されたい。また、本発明は、本明細書で言及又は示されているすべての工程、特徴、組成物及び化合物を、個別に又はまとめて、また、上記工程又は特徴の任意及びすべての組み合わせ又は任意の２つ以上を含む。それゆえ、本開示は、例示されたすべての態様において、制限的ではないと考えられ、本発明の範囲は、添付の請求項によって示され、趣旨及び均等の範囲内に入るすべての変更は、本発明に包含されることが意図される。本明細書中には様々な文献が引用されており、それらの各文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。上述の説明は、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。

【実施例】

【0143】

実施例１
材料及び方法
Ｃｒｉｓｐｅｒ編集腫瘍細胞株の作製
マウスＰＤＡＣ ４３６１．１２細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ＦＭＲ１遺伝子を細胞内でノックアウトした。２種類のＣａｓ９及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の発現プラスミドで細胞を一過性にトランスフェクトし、ブラストサイジンで５日間選択（セレクション）した。ＦＭＲＰをノックアウトするためのこの一過性のＣＲＩＳＰＲ戦略は、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡのゲノムへの安定した統合によって媒介される潜在的な非特異的効果を防ぐ。ＦＭＲ１に使用したガイド配列は、５’－ＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＡ－３’（配列番号１２）又は５’－ＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＣＧ－３’（配列番号１３）である。細胞はブラストサイジンを含まない９６ウェルプレートに単細胞でプレーティングした。ＦＭＲＰタンパク質の欠失について、免疫ブロット法によりノックアウトクローンを選択した。得られたＦＭＲＰ ＫＯ細胞はブラストサイジンへの感受性を保ち、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがこれらの細胞で一過性にしか発現していないことを示した。２つの独立したＫＯクローンとＷＴクローン（Ｃａｓ９ベクターと空のＳｇＲＮＡベクターでトランスフェクトしたもの）を示したとおりに分析した。

【0144】

動物実験
動物を用いたすべての実験は、ヴォー州（Ｃａｎｔｏｎ ｄｅ Ｖａｕｄ）の地方動物実験委員会によって承認されたプロトコル（ライセンス番号３２１４）に従って行った。ＦＶＢｎ、Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７Ｂ／６、ＮＳＧ又はＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウスを８週齢で使用した。肺転移アッセイでは、２００μｌ ＰＢＳに懸濁した２×１０^５個のマウスＰＤＡＣ ＷＴ又はＦＭＲＰ ＫＯ細胞を、マウスの側部尾静脈に注射した。原発腫瘍成長アッセイでは、１００μｌのＰＢＳに懸濁した５×１０^５個の細胞をマウスの皮下に注射した。

【0145】

フローサイトメトリーによる腫瘍浸潤リンパ球の解析
フローサイトメトリーは、ＢＤ ＬＳＲＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて行い、結果はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ（ツリースター））を用いて解析した。初代腫瘍細胞懸濁液は、染色の前にマウスＦｃブロック（抗ＣＤ１６／ＣＤ３２；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（バイオレジェンド）、＃１０１３１２）でブロックした。蛍光色素を結合した抗マウスＣＤ４５（クローン３０Ｆ－１１）、ＣＤ３ｅ（クローン１４５－２Ｃ１１）、ＣＤ８ａ（クローン５３－６．７）、グランザイムＢ（クローンＮＧＺＢ）、ＴＮＦａ（ＭＰ６－ＸＴ２２）及びＩＦＮｇ（クローンＸＭＧ１．２）抗体を製造業者のプロトコルに従って使用した。死細胞の染色にはＢｌｕｅ ＵＶを用いた。細胞内サイトカインの発現を解析するため、ｓ．ｃ．腫瘍を有するマウスは、犠牲にする６時間前に２５０μｇのタンパク質輸送阻害剤ブレフェルジンＡ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ビーディー・バイオサイエンシーズ））、＃５５５０２９）をＩ．Ｐ．注射した。その後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ（シグマ）、Ｂ６５４２－２５ＭＧ）を用いて細胞内サイトカインの染色を行った。

【0146】

免疫組織化学染色及び免疫蛍光染色
採取したマウス組織は、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した後、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ（ライカ））で切片にした。抗原賦活化は、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）を用いて９５℃の水浴中で２０分間、又はトリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ＝８．０）を用いて９５℃の水浴中で１０分間行った。一次抗体は４℃で一晩インキュベートした。免疫組織化学（ＩＨＣ）染色では、二次抗体（ＩｍｍＰＲＥＳＳ ＨＲＰ試薬キット、抗ウサギＭＰ－７４０１及び抗ラットＭＰ－７４４４）を室温で４５分間インキュベートし、最後にペルオキシダーゼ基質ＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ）、Ｄ５６３７－１Ｇ）を用いて室温で同じ時間（最大１０分間）、可視化した。染色した組織切片をマイヤーヘマトキシリンで対比染色した。免疫蛍光（ＩＦ）染色では、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、５６８、６４７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック））を室温で４５分間インキュベートした。画像は、Ｌｅｉｃａ ＤＭ５５００Ｂ及びＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００正立共焦点顕微鏡で取得し、Ｉｍａｇｅ Ｊで解析した。使用した抗体は以下の通りである：ＦＭＲＰ、Ａｂｃａｍ（アブカム）、ａｂ１９１４１１；マウスＣＤ８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１４－０８０８－８２。

【0147】

統計解析
統計解析にはＰｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（グラフパッド・ソフトウェア））を用いて行った。特段の記載がない限り、対応のない（対になっていない、ｎｏｎ－ｐａｉｒｅｄ）実験ではスチューデントのｔ検定を用いた（両側検定）。ガウス分布に従わない対応のある（ｐａｉｒｅｄ）実験にはウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）の符号付順位和検定（両側）を行った。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。値は平均±ＳＥＭである。

【0148】

結果
最近の研究で、ＦＭＲＰがＮＭＤＡＲシグナル伝達の下流のエフェクターとして作用し、膵臓癌の浸潤性発育を促進することが明らかになった^１６。本発明者らはさらに、ヒト（データは示さず）及びマウスのＰＤＡＣ組織でＦＭＲＰの発現が上昇していることを確認した（図１Ａ）。

【0149】

腫瘍の進行におけるＦＭＲＰの役割をさらに調べるために、本発明者らはＣｒｉｓｐｅｒ／Ｃａｓ９システム^１０を用いて、ＦｖＢｎバックグラウンドのＰ４８－ｃｒｅ；ＬＳＬ－Ｋｒａｓ^Ｇ１２Ｄ；Ｐ５３^{Ｒ１７２Ｈ／＋}ＰＤＡＣマウスモデルからの単細胞由来の細胞株である、マウスの膵臓腺癌（ＰＤＡＣ）細胞株４３６１．１２でＦＭＲＰをノックアウトした（図１Ｂ）。重要なのは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡを安定的にゲノムに組み込むことで生じる潜在的な非特異的影響や免疫原性を回避するために、ＦＭＲＰをノックアウトするための一過性のＣｒｉｓｐｅｒ戦略を実施したことである。

【0150】

インビトロの機能アッセイでは、ＷＴとＦＭＲＰ ＫＯのＰＤＡＣ細胞との間でコロニー形成能力に有意差はないことが示された（図１Ｃ）。転移におけるＦＭＲＰの役割の可能性を考慮して、本発明者らは、まず、ＷＴ及びＦＭＲＰ ＫＯ細胞を免疫適格性のＦＶＢｎマウスの尾静脈に注射し、標準的なインビボ肺転移アッセイを行った（図１Ｄ）。驚くべきことに、ＦＭＲＰ－ＫＯ２細胞を注射した５匹のマウスのうち２匹は、注射後１２０日間生存したが、ＦＭＲＰ－ＷＴ細胞を注射した５匹のマウスは、注射後２５日以前にすべて死亡した（図１Ｅ）。免疫不全ＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウスで同様のインビボ肺転移アッセイを行ったところ、これら２つの群の間で全体的な生存期間にこれほど大きな差はなく（図１Ｆ）、ＦＭＲＰ－ＫＯ腫瘍を持つマウスで観察された生存の向上には適応免疫系が関与していることがわかった。次に、本発明者らは、癌細胞を皮下注射して形成した原発腫瘍モデルを使用することにした（図１Ｈ）。ＦＭＲＰ－ＫＯ細胞をＦＶＢｎマウスに皮下注射すると、ＦＭＲＰ－ＫＯ細胞の腫瘍成長は、ＦＭＲＰ－ＷＴ細胞に比べて著しく障害されたが、その細胞を免疫不全のＮＳＧマウスに皮下注射すると、両群間で腫瘍重量に有意な変化は見られなかった（図１Ｉ及び図１Ｊ）ことから、インビボでの抗腫瘍性免疫の調節にＦＭＲＰが関与している可能性がさらに示唆された。

【0151】

重要なことは、ＷＴの癌細胞及びＦＭＲＰ－ＫＯの癌細胞から形成された腫瘍をＩＨＣで染色したところ、ＫＯの腫瘍では多数のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が浸潤していることが明らかになったことである。非常に対照的に、ＷＴ腫瘍にはＣＤ８＋Ｔ細胞はほとんど存在していなかった（図２Ａ）。ＦＭＲＰ ＫＯ腫瘍では、ＣＤ４５＋免疫細胞の数もＷＴ腫瘍に比べて増加していた（図２Ｂ）。これと整合して、ＷＴ腫瘍及びＦＭＲＰ－ＫＯ腫瘍からの初代培養細胞懸濁液のＦＡＣＳ分析により、ＷＴ腫瘍と比較してＫＯ腫瘍ではＣＤ４５＋免疫細胞、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＧＲＺｂ＋、ＩＦＮγ＋、ＴＮＦ＋ Ｔ細胞の数が劇的に増加していることがさらに示され（図２Ｃ～図２Ｇ）、インビボでの抗腫瘍性免疫の抑制におけるＦＭＲＰの役割をさらに裏付けた。さらに、マウスＰＤＡＣ組織におけるＦＭＲＰ及びＣＤ８の二重ＩＨＣ染色を行ったところ、ＣＤ８ Ｔ細胞はＦＭＲＰを発現している腫瘍の中心部でほとんど検出されないことが判明した（図２Ｈ）。ヒトのＰＤＡＣ試料においても、ＦＭＲＰの発現とＣＤ８ Ｔ細胞の浸潤との間に有意な逆相関があることが判明した。

【0152】

癌細胞においてＦＭＲＰを欠失させることで、免疫チェックポイントタンパク質の発現が変化し、抗腫瘍性免疫反応が引き起こされるか否かを検討した。ＦＭＲＰによって抑制された抗腫瘍性免疫が、確立されたＴ細胞共抑制性のＰＤ－１又はおそらくは、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達に依存しているのであれば、ＦＭＲＰ－ＫＯ腫瘍細胞において、ＰＤ－１リガンドであるＰＤ－Ｌ１／ＣＤ２７４及びＰＤ－Ｌ２／ＰＤＣＤ１ＬＧ２、又はＣＴＬＡ－４リガンドであるＢ７／Ｂ７－１／ＣＤ８０及びＣＤ８６の下方制御が予想された。しかしながら、ＷＢ分析及びＩＨＣ染色により、インビトロ及びインビボでＷＴ細胞とＦＭＲＰ ＫＯ細胞とを比較したところ、ＰＤ－Ｌ１の発現は変化しないことが示され（図３Ａ～図３Ｂ）、ＰＤＬ２、ＣＤ８６及びＣＤ８０はいずれもほとんど検出されなかった（データは示さず）。このことは、このＰＤＡＣ癌細胞株におけるＦＭＲＰを介した免疫抵抗性の基本的なメカニズムには、ＰＤ－１やＣＴＬＡ－４の免疫チェックポイントリガンドの抑制は関与していないことを示す。

【0153】

加えて、免疫適格性のＦＶＢｎマウスで形成されたＷＴの腫瘍に対して抗ＰＤ１抗体を用いた前臨床試験も行ったところ、ＷＴのＰＤＡＣ腫瘍は抗ＰＤ１療法に反応しないことが明らかになり、ヒトＰＤＡＣ患者における抗ＰＤ１治療への無反応性を再現していることがわかった（図３Ｃ）。このように抗ＰＤ１チェックポイント免疫療法に対する治療抵抗性があるにもかかわらず、ＦＭＲＰをＫＯした誘導体ＰＤＡＣ腫瘍細胞は、インビボでの腫瘍成長を顕著に障害し（図１）、これはＣＤ８ Ｔ細胞の流入と関連している（図２）。この結果は、チェックポイント阻害剤が効かないＰＤＡＣ及び他の腫瘍の治療において、ＦＭＲＰ阻害剤が新たな免疫療法戦略として利用できることを示唆している。興味深いことに、ＦＭＲＰノックアウト腫瘍においてＰＤ１抗体治療を行うと、腫瘍の成長がさらに抑制される。これは、抗ＰＤ１抗体とＦＭＲＰノックアウトを組み合わせることで、生存期間の延長に組み合わせ的な利益があることを示している（図３Ｄ）。

【0154】

最近の研究では、Ａ－ｔｏ－Ｉ ＲＮＡ超編集（ｓｕｐｅｒ－ｅｄｉｔｉｎｇ）を媒介するＲＮＡ結合タンパク質であるＡＤＡＲ１が、免疫チェックポニット遮断に対する抵抗性を促進することが示されている^２３。興味深いことに、別の研究では、ＦＭＲＰも、ＡＤＡＲ１と物理的に相互作用することで、神経細胞におけるＲＮＡ超編集を制御することが示されている。マウスＰＤＡＣ細胞におけるＦＭＲＰとＡＤＡＲ１との強い相互作用は、共免疫沈降法（ｃｏ－ＩＰ）及び逆ｃｏ－ＩＰによって確認された（図４Ａ～図４Ｂ）。ＦＭＲＰ及びＡＤＡＲ１のダブルＫＯの組み合わせが、さらにより強力な抗腫瘍性免疫反応を誘発するか否かを調べるために、ＡＤＡＲ１シングルＫＯ及びＦＭＲＰ／ＡＤＡＲ１ダブルＫＯのＰＤＡＣ細胞を、ＦＭＲ１及びＡＤＡＲ１遺伝子を標的としたＣａｓ９／ｓｇＲＮＡベクターの一過性のトランスフェクションを用いて作製し（図４Ｃ）、シンジェニックマウスに注射した。興味深いことに、ＦＭＲＰ及びＡＤＡＲ１を組み合わせてＫＯすると、ＦＭＲＰ単独ＫＯ及びＡＤＡＲ１単独ＫＯの群に比べて、全体的な生存期間が有意に延長した（図４Ｄ）。これは、癌免疫療法においてＦＭＲＰ及びＡＤＡＲ１を組み合わせて標的とすることの臨床応用を支持する。

【0155】

他の種類の癌における抗腫瘍性免疫の抑制におけるＦＭＲＰの潜在的な役割をより広く探るために、マウスの結腸組織（図５Ａ）、メラノーマ組織（図６Ａ）、膵神経内分泌腫瘍（ＰＮＥＴ）及び肝転移（図７Ａ）、乳癌組織（図８Ａ）において、対応する正常組織と比較して、劇的に増加したＦＭＲＰの発現を検出した。ヒトのデータは、マウスのデータと一致している（示さず）。同様に、マウスの結腸癌細胞（図６Ｂ）及びメラノーマ細胞（図７Ｂ）におけるＦＭＲＰ ＫＯは、インビトロでのコロニー形成（増殖能力及び生存能力を反映する）を大きく障害することはない。しかしながら、ＦＭＲＰ ＫＯは、免疫不全マウスではないシンジェニックマウスにおいて結腸腫瘍の成長を著しく障害した（図６Ｄ～図６Ｉ、図７Ｄ～図７Ｅ）。ＣＤ８ Ｔ細胞数の増加は、ＦＭＲＰ ＫＯの結腸腫瘍でのみ見られ、ＷＴの腫瘍では見られなかった（図６Ｇ）。ＦＭＲＰは、ＲＩＰ１－Ｔａｇ２（ＲＴ２）ＰａｎＮＥＴマウスモデルで発生したＰａｎＮＥＴ腫瘍においても、ＲＩＰ－７ ｃｒｅマウスとＲＴ２マウス及びＦＭＲ１－ｆｌｏｘｅｄマウスとの交配によりノックアウトされた。重要なことに、ＦＭＲＰ ＫＯ ＲＴ２マウスは、ＷＴ ＲＴ２マウスに比べて生存期間が有意に延長しており、ＰＮＥＴ腫瘍の進行の促進にＦＭＲＰが関与していることが強く裏付けられた。

【0156】

ヒトの腫瘍におけるＦＭＲＰの発現に関する追加の調査では、致死性の固形腫瘍の主要な形態のすべてを含む、幅広い種類の癌患者の３０～１００％において、有意な上方制御が明らかになった（例えば、図１１を参照）。

【0157】

実施例２
ＦＭＲＰのエフェクター機能に関与する相互作用を阻害するために、オリゴヌクレオチド及びペプチドを用いて、ＦＭＲＰのＲＮＡ結合部位を直接標的とする
ＦＭＲＰのＲＧＧ及びＫＨ２ ＲＮＡ結合ドメインは、複数の研究で（例えば、Ｖａｓｉｌｙｅｖ、２０１５；Ｄａｒｎｅｌｌ、２００５）、ＦＭＲＰの機能的な活性に関与していると示唆されており、これらの相互作用に関する構造的な知識に基づいて、豊富な競合分子を送達することによってＦＭＲＡ－ＲＮＡ相互作用を阻害することができる。当該方法の１つの変形例では、それぞれＲＧＧ／ＫＨ２ドメインに結合するｓｃ１／ｋｃ ＲＮＡからのコア配列を表すＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドが合成されるであろう。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの半減期とその結合親和性の両方を高めることを目的として、ロックされた核酸（ロックド核酸、ＬＮＡ）技術が上記合成に含まれうる。第２の変形例では、ＦＭＲＰのＲＧＧドメイン及びＫＨ２ドメインにまたがるポリペプチドが合成され、試験されるであろう。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、ポリペプチドリンカーによって結合される。いずれの変形例においても、候補は、ＦＭＲＰを発現する培養癌細胞に送達することによって最初に試験されて、以前に記載され（Ｌｉ及びＨａｎａｈａｎ、２０１３；Ｌｉ、Ｚｅｎｇら、２０１８）、図９に示されているＢｏｙｄｅｎチャンバアッセイで侵襲性が障害されているかどうかをスコアリングされるであろう。候補化合物は、本願に記載されているようなＦＭＲＰを発現する癌細胞で構成された腫瘍に接種され、ＦＭＲＰの発現によって本来ならば排除されるＣＤ８ Ｔ細胞の結果的な浸潤が評価されるであろう。この方法の変形例では、候補オリゴヌクレオチドの腫瘍への取り込みを増加させるためにトランスフェクションエンハンサーを用いることになろう。

【0158】

実施例３
ｓｉＲＮＡによるＦＭＲＰの治療的抑制
ますますよく検証されている治療戦略には、疾患に関与するタンパク質の産生を抑制するために、ｍＲＮＡに結合して、その組織へのｍＲＮＡの翻訳を不安定化又はブロックするｓｉＲＮＡの送達が含まれる（Ｓｅｌｖａｍ、２０１７）。この方法では、ｓｉＲＮＡは、ＦＭＲ１ ｍＲＮＡ（ＦＭＲＰをコードする）に結合して阻害するように設計され、ＣＤ８ Ｔ細胞を欠くＦＭＲＰ腫瘍への送達によってアッセイされる。本願の他の箇所に記載されている遺伝子ノックアウト腫瘍をベンチマークとして、そのような細胞の浸潤がスコアリングされる。このようなインビボ試験の前に、候補ｓｉＲＮＡ（すなわち、ｓｉＣｔｒｌ：ＵＡＡＧＧ ＣＵＡＵＧ ＡＡＧＡＧ ＡＵＡＣ（配列番号９）；ｓｉＦＭＲＰ＃１：ＡＵＡＡＧ ＡＧＡＣＡ ＡＣＵＵＧ ＧＵＧＣ（配列番号１０）；及びｓｉＦＭＲＰ＃２：ＵＡＡＣＵＵＣＧＧＡＡＵＵＡＵＧＵＡＧ（配列番号１１））が癌細胞浸潤アッセイで試験され、その場合のＦＭＲ１ ｍＲＮＡに対する原型ｓｉＲＮＡの阻害能力を図９に図示する。いくつかの実施形態では、ＦＭＲ１に対するｓｉＲＮＡは、例えば、安定性及び活性を高めるための化学修飾（Ｈａｓｓｌｅｒ、２０１８）、並びに／又は腫瘍内の癌細胞への核酸の送達を高めるための「トランスフェクション」試薬の使用による追加の改良を含むことができよう。

【0159】

実施例４
ＦＭＲＰ上の重要な相互作用部位に結合する小分子を特定するための高スループットの生化学的スクリーニング方法の説明
ＦＭＲＰの相互作用の１つのよく説明される様式は、ＦＭＲＰタンパク質上のＲＧＧと呼ばれるドメインに結合するＧ４構造モチーフを含む選択されたｍＲＮＡの組を制御することを伴う。このＧ４構造モチーフが結合すると、標的となるｍＲＮＡの翻訳が変化する。ＦＭＲＰのＲＧＤドメインにはｓｃ１と呼ばれるＲＮＡが強固に結合しており、ＦＭＲＰが標的ｍＲＮＡに結合する際のプロトタイプとして広く用いられている。そのため、ｓｃ１ ＲＮＡとＦＭＲＰとの結合を阻害する化合物は、ａ）ＦＭＲＰのｍＲＮＡへの結合を伴う翻訳制御機構の阻害剤、及びｂ）新たに発見されたＦＭＲＰの免疫抑制活性にＲＧＧドメイン以外のＦＭＲＰの他の作用機序が関与している場合には、必ずしもＦＭＲＰの全ての機能を阻害しないＲＧＧ部位への強固な結合剤、を意味すると考えられる。

【0160】

ＦＭＲＰの第２の相互作用の様式は、ＫＨ２ ＲＮＡ結合ドメインを介した高親和性ＲＮＡ標的への結合を伴う（Ｄａｒｎｅｌｌら、２００５）。これまでの研究で、「キッシング複合体（ｋｉｓｓｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ、ｋｃ）ＲＮＡ」と呼ばれている、構造的で配列特異的な特徴を持つ一連のＲＮＡが特定されている。例えば、ｋｃ２ ＲＮＡは、約１００ｎＭの最大半数濃度（ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）でポリリボソームからＦＭＲＰを追い出すことができる。ヒトやマウスの研究では、ＫＨ２に単一のミスセンス変異があると、ＦＭＲＰのポリソームへの結合が抑止され、脆弱Ｘ症候群の重篤な形態を引き起こすことが示されている。ｋｃＲＮＡのＦＭＲＰへの結合を阻害する化合物は、ＦＭＲＰのポリソーム会合を阻害し、機能を無効にすることができよう。そのような化合物は、本明細書に開示されるような薬剤でありうる。いくつかの実施形態では、その薬剤は、ｋｃＲＮＡのＦＭＲＰへの結合を阻害する合成核酸である。いくつかの実施形態では、合成核酸は、ＦＭＲＰの機能を阻害するように作用する他の種類の小分子阻害剤をスクリーニングして特定するためのベンチマークとして使用することができよう。

【0161】

ＲＮＡ結合タンパク質の阻害剤を特定するために当該技術分野で知られている任意の適切なアッセイを使用して、ＦＭＲＰとその特徴的な標的ｍＲＮＡとの結合を妨害する小分子について化合物ライブラリをスクリーニングすることができる（例えば、Ｒｏｏｓら、２０１６を参照）。読み出しには、結合時に、上記タンパク質に共有結合したフルオロフォアの蛍光消光を解除する化合物の特定が含まれ、そのフルオロフォアの発光は、解除されなければ、蛍光消光剤を運ぶように改変された結合した標的ＲＮＡ分子によってブロックされている。ＦＭＲＰに適用する場合、この方法は以下のように行われ、図１０に模式的に示されている。

【0162】

例えば、１）ヒトＦＭＲＰタンパク質をヒトＨＥＫ２９３細胞で産生し、精製し、蛍光レポーターであるフルオレセインで生化学的に標識する。２）ｓｃ１ ＲＮＡを蛍光消光剤分子、例えばＣｙ３又はＢＨＱで標識し、ｓｃ１がＦＭＲＰに結合したときに、ＦＩＴＣの励起性蛍光発光が消光されるようにする。３）ＦＩＴＣ－ＦＭＲＰ及びｓｃ１－Ｃｙ３／ＢＣＧを合わせて３８４ウェルのマイクロウェルに分注した後、大規模な化合物ライブラリから化合物を各ウェルに添加する。このアッセイはＨＴＰスクリーニング施設で行うのが最適であり、ロボットがタンパク質／ＲＮＡの複合体を含むマイクロウェルを準備し、コード化された化合物を各ウェルに添加し、蛍光発光を読み取る。４）消光された蛍光の解除を誘起した化合物は、さらに特性評価を行い、ＦＭＲＰとｓｃ１との相互作用を阻害する能力を検証する。５）次いで、そのような「リード」は、さらに特性評価を行い、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）測定及びバイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（フォルテ・バイオ）－ＯｃｔｅｔのＢＬＩ）を用いて、結合親和性と速度論的パラメータを明らかにする。新たに特定された化合物は、さらに、生化学的な、構造的な、細胞ベースのアッセイ及び腫瘍モデルによって、その化合物がＦＭＲＰの機能を阻害し、かつ／又は機能阻害にかかわらずＦＭＲＰタンパク質に強固に結合するのかが確認される。強固な結合剤は、その化合物が機能阻害剤そのものであると証明されたか否かにかかわらず、ＦＭＲＰタンパク質を選択的に分解するように設計されたタンパク質分解分子の構成要素となる可能性がある。

【0163】

実施例５
ＦＭＲＰ／ＦＭＲ１の発現を阻害する化合物の特定
内因性ＦＭＲＰタンパク質及びｍＲＮＡを高レベルで発現している癌細胞に、ＧＦＰを駆動するＦＭＲＰプロモーターと、ＲＦＰを駆動するユビキタスプロモーターを導入する。細胞ベースのＨＴＰスクリーニングを実施し、緑色蛍光（ＦＭＲＰの転写）を抑制し、赤色蛍光（細胞の生存率）を抑制しない化合物をスコアリングする。ＦＭＲ１転写の真の阻害剤は、レポーター遺伝子だけでなく、ＦＭＲ１自体も抑制するはずであるので、最初のヒット化合物は、内因的に発現したＦＭＲＰを免疫染色することでフィルタリングされる。変形例は、ＦＭＲＰとＧＦＰとから構成される融合遺伝子を駆動するＦＭＲＰプロモーターを持つ細胞株を操作することであり、それは、翻訳阻害剤及びタンパク質安定性阻害剤のスコアリングも行うことができる。転写阻害剤を特定するためのＨＴＰ細胞ベースのスクリーニングの方法論は、成功裏に適用されつつある（例えば、Ｚｈａｎｇ、２０１８；Ｖｕｏｎｇ、２０１６を参照）。

【0164】

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２１． Ｚｈａｎｇ Ｈら、Ｉｓｓａ ＪＪ． ２０１８ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＤＫ９ Ｒｅａｃｔｉｖａｔｅｓ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｓｉｌｅｎｃｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ． Ｃｅｌｌ １７５（５）：１２４４－１２５８．ｅ２６． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１８．０９．０５１． ＰＭＩＤ：３０４５４６４５
２２． Ｖｕｏｎｇ Ｗ、Ｔｅｗ ＢＹ、Ｌｉｔｔｌｅ ＧＨ、Ｆｒｅｎｋｅｌ Ｂ、Ｊｏｎｅｓ ＪＯ．（２０１６）． Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ａｎｄｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ＲＵＮＸ２ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ． ３５９（２）：２５６－２６１． ｄｏｉ：１０．１１２４／ｊｐｅｔ．１１６．２３４５６７．． ＰＭＩＤ：２７５５４６７７
２３． Ｉｓｈｉｚｕｋａら、Ｌｏｓｓ ｏｆ ＡＤＡＲ１ ｉｎ ｔｕｍｏｕｒｓ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ． Ｎａｔｕｒｅ． ２０１９ Ｊａｎ；５６５（７７３７）：４３－４８． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１８－０７６８－９． Ｅｐｕｂ ２０１８年１２月１７日． ＰＭＩＤ：３０５５９３８０
２４． Ｔｒａｎら、Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ａｕｔｉｓｔｉｃ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０１９年１月；２２（１）：２５－３６． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９３－０１８－０２８７－ｘ． Ｅｐｕｂ ２０１８年１２月１７日． ＰＭＩＤ：３０５５９４７０

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【配列表】

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【国際調査報告】