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特表2022-532385血中のＶＣＡＭ－１及びα２－マクログロブリンの検出のためのアッセイ方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-14
(54)【発明の名称】血中のＶＣＡＭ－１及びα２－マクログロブリンの検出のためのアッセイ方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/542 20060101AFI20220707BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220707BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20220707BHJP
G01N 21/78 20060101ALI20220707BHJP
【ＦＩ】
G01N33/542 A
G01N33/53 D
G01N21/64 F
G01N21/78 C
G01N21/64 B
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021568146
(86)(22)【出願日】2020-05-14
(85)【翻訳文提出日】2021-11-12
(86)【国際出願番号】 US2020032973
(87)【国際公開番号】W WO2020232295
(87)【国際公開日】2020-11-19
(31)【優先権主張番号】62/848,713
(32)【優先日】2019-05-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521201757
【氏名又は名称】プロサイセデクス インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ホンユイ チェン
(72)【発明者】
【氏名】リーミン リョウ
(72)【発明者】
【氏名】ステファン ウェスティン
(72)【発明者】
【氏名】マイケル ヘイル
(72)【発明者】
【氏名】ラリー ミムズ
【テーマコード（参考）】
2G043
2G054
【Ｆターム（参考）】
2G043AA03
2G043BA16
2G043EA01
2G043FA03
2G043KA02
2G043KA03
2G054AA06
2G054AA07
2G054CE02
2G054EA03
2G054GB02
(57)【要約】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いる試料中のＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの存在又は量を検出することのためのアッセイ方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の血管細胞接着タンパク質１（ＶＣＡＭ－１）及びα２－マクログロブリン（Ａ２Ｍ）の存在又は量を検出することのための方法であって、前記方法は：前記試料をＶＣＡＭ－１への第一の結合エピトープを有する第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体に接触させることであって、ここで前記第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体が第一のドナーフルオロフォアにより標識されること；
前記試料をＶＣＡＭ－１への第二の結合エピトープを有する第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体と接触させることであって、ここで前記第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体が第一のアクセプターフルオロフォアにより標識されること；
前記試料とＡ２Ｍへの結合エピトープを有する抗Ａ２Ｍ抗体とを接触させることであって、ここで前記抗Ａ２Ｍ抗体が第二のドナーフルオロフォアにより標識されること；
前記試料を単離したＡ２Ｍタンパク質と接触させることであって、前記単離したＡ２Ｍタンパク質が第二のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを得るために十分な時間前記試料をインキュベートすること；そして
一以上の光源を用いて二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを有する前記試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と関連される少なくとも１つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここで前記第一及び第二のアクセプターフルオロフォアが異なる方法。
【請求項2】
試料中の血管細胞接着タンパク質１（ＶＣＡＭ－１）及びα２－マクログロブリン（Ａ２Ｍ）の存在又は量を検出することのためのアッセイ方法であって、前記方法は：前記試料とＶＣＡＭ－１への第一の結合エピトープを有する第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここで前記第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体がドナーフルオロフォアによって標識されること；
前記試料とＶＣＡＭ－１への第二の結合エピトープを有する第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここで前記第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体が第一のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
前記試料とＡ２Ｍへの結合エピトープを有する抗Ａ２Ｍ抗体とを接触させることであって、ここで前記抗Ａ２Ｍ抗体が第二のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
前記試料と単離したＡ２Ｍタンパク質とを接触させることであって、ここで前記単離したＡ２Ｍタンパク質が第二のドナーフルオロフォアによって標識されること；
二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを得るために十分な時間前記試料をインキュベートすること；そして
一以上の光源を用いて二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを有する前記試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と関連される少なくとも１つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここで前記第一及び第二のアクセプターフルオロフォアが異なる方法。
【請求項3】
前記第一及び第二のドナーフルオロフォアが同じであり、かつ前記試料が一つの光源を用いて励起される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記第一及び第二のドナーフルオロフォアが異なり、かつ前記試料が二つの異なる光源を用いて励起される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
前記ＦＲＥＴ発光シグナルが時間分解ＦＲＥＴ発光シグナルである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記試料が生物学的な試料である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記生物学的な試料が全血、尿、ふん便検体、血漿、及び血清からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記生物学的な試料が全血である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ドナーフルオロフォアがテルビウムクリプテートである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記アクセプターフルオロフォアがフルオレセイン様（緑色光域）、Ｃｙ５、ＤＹ－６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、及びフィコエリスリン（ＰＥ）からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記第一のアクセプターフルオロフォアがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８であって、かつ前記第二のアクセプターフルオロフォアがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記第一のアクセプターフルオロフォアがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８であって、かつ前記第二のアクセプターフルオロフォアがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記第一のアクセプターフルオロフォアがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６であって、かつ前記第二のアクセプターフルオロフォアがＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
追加のバイオマーカーの存在又は量を検出することをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
請求項１４に記載の方法であって：前記試料と前記追加のバイオマーカーへの第一の結合エピトープを有する追加の抗体とを接触させることであって、ここで前記追加の抗体が第三のドナーフルオロフォアによって標識されること；
前記試料と前記追加のバイオマーカーへの第二の結合エピトープを有するさらなる抗体とを接触させることであって、ここで前記さらなる抗体が第三のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
二重標識した追加のバイオマーカーを得るために十分な時間前記試料をインキュベートすること；そして
光源を用いて二重標識した追加のバイオマーカーを有する前記試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と関連される二つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここで前記第一の、第二の、及び第三のアクセプターフルオロフォアが異なる方法。
【請求項16】
前記光源が約３００ｎｍから約４００ｎｍの間の励起波長を提供する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記蛍光発光シグナルが約４５０ｎｍ～７００ｎｍの間である発光波長を発光する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
血中のＶＣＡＭ－１の濃度が約１００ｎｇ／ｍＬから約１５００ｎｇ／ｍＬである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
血中のＶＣＡＭ－１の通常の濃度が約１００ｎｇ／ｍＬから約５００ｎｇ／ｍＬである、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
血中のＶＣＡＭ－１の上昇した濃度が少なくとも約５５０ｎｇ／ｍＬを上回る、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
血中のＶＣＡＭ－１の上昇した濃度が少なくとも約６５０ｎｇ／ｍＬを上回る、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
血中のＡ２Ｍの濃度が約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
血中のＡ２Ｍの通常の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬである、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
血中のＡ２Ｍの上昇した濃度が少なくとも５．５ｍｇ／ｍＬを上回る、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
血中のＡ２Ｍの上昇した濃度が少なくとも６．５ｍｇ／ｍＬを上回る、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願への相互参照］
本出願は、２０１９年５月１６日に出願された米国仮出願第６２／８４８，７１３号の優先権を主張するものであり、全ての目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年５月１６日に出願された米国仮出願第６２／８４８，７１３号の優先権を主張するものであり、全ての目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
ある生物学的なアッセイは、二つのフルオロフォアを用いる時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ－ＦＲＥＴ）のメカニズムに依存する。生物学的な材料は典型的に自己蛍光する傾向があり、それらは時間分解ＦＲＥＴを利用することによって最小限に抑えられうる。ＴＲ－ＦＲＥＴは希土類元素、例えばランタニド系元素（例えば、ユウロピウム及びテルビウム）を利用し、それらは並外れた長い蛍光発光半減期を有する。これらのアッセイにおいて、二つのフルオロフォアがお互いに近接している場合に、エネルギーはドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアとの間で移動される。エネルギー源（例えばＵＶ光）によるドナー（例えばクリプテート）の励起は、二つのフルオロフォアが近接を示す際にアクセプターへのエネルギー移動を生み出す。次に、そのアクセプターはその特定の波長で発光する。ＴＲ－ＦＲＥＴを生じさせるために、ドナー分子の蛍光発光スペクトルはアクセプター発色団の吸収又は励起スペクトルと重複しなければならない。さらに、ドナー分子の蛍光寿命は、ＴＲ－ＦＲＥＴを生じることが可能な十分な期間でなければならない。
【0003】
クリプテートは様々なバイオアッセイの型に用いられうる。クリプテートはテルビウム又はユーロピウムのようなランタニド系元素がしっかりと埋め込まれる、又はキレートされる大環状分子を含む複合体である。このケージ様構造は、照射エネルギーを収集すること及びその収集したエネルギーをランタニドイオンに移動することのために有用である。そのランタニドイオンは特定の蛍光によりエネルギーを放出しうる。
【0004】
米国特許番号第６，４０６，２０９号は「Ｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄ－ｌａｎｔｈａｎｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ．」とタイトルを付けられた。この特許は、ランタニド系列の金属イオン及びサリチルアミジル基を含む錯化剤を含んでいる発光性のランタニド金属キレートに向けられる。この特許は参照によって本明細書に組み込まれる。
【0005】
米国特許番号第６，５１５，１１３号は、「Ｐａｔｈａｌａｍｉｄｅ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ．」とタイトルを付けられた。この特許は、ランタニド系列の金属イオン及びフタルアミジル基を含む錯化剤を含んでいる発光性のランタニド金属キレートに向けられる。この特許は参照によって本明細書に組み込まれる。
【0006】
ＷＯ２０１５１５７０５７は「大環状分子」とタイトルを付けられ、化合物及び治療的及び診断的な適用において用いられうる複合体に関する。この出願は、生体分子を標識するために有用なクリプテート分子を含む。この公開は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【0007】
ＷＯ２０１８１３０９８８は、優れた蛍光特性を有するクリプテート誘導体及びそのコンジュゲートを開示した。そのクリプテートは生物学的なアッセイ及び様々な分析物の検出及び同定に有用である。
【0008】
また、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ－１）、又は分化抗原群１０６（ＣＤ１０６）として既知の血管細胞接着タンパク質１は、ＶＣＡＭ－１遺伝子によりコードされているヒトにおけるタンパク質である。ＶＣＡＭ－１は細胞接着分子として機能する。α２－マクログロブリン（Ａ２Ｍ）は血中で見られる大きな（約７２０ｋＤａ）の血漿タンパク質である。Ａ２Ｍは主に抗タンパク分解酵素として作用し、かつ様々なタンパク質分解酵素を不活化することができる。例えば、それは、プラスミン及びカリクレインを阻害することによって繊維素溶解の阻害薬として作用する。それはトロンビンを阻害することによって凝集の阻害薬として機能する。さらに、Ａ２Ｍは時々、また、多数の成長因子及びサイトカイン、例えば血小板由来増殖因子、塩基性線維芽細胞成長因子、ＴＧＦ－β、インスリン、及びＩＬ－１βに結合するので、担体として作用する。ＶＣＡＭ－１又はＡ２Ｍの存在及び濃度レベルは典型的に酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定される。
【0009】
ＶＣＡＭ－１又はＡ２Ｍ固相サンドイッチＥＬＩＳＡは抗体ペアの間に結合される分析物の存在又は量を測定することを意図される。サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、試料を固定化した捕捉抗体に加える。二次（ディテクター）抗体を加えた後、基質溶液を用いて、酵素－抗体－標的複合体と反応させ、測定可能なシグナルを産生する。このシグナルの強度は試験試料中に存在する標的の濃度と比例する。
【0010】
前述のことを考慮して、当該分野で必要とされるものは、同時にＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの存在又は量を測定することができ、より高いスループットに加えて、柔軟性、信頼性、及び感度における増加を提供する均質なアッセイである。本開示はこれ及び他のニーズを提供する。
【発明の概要】
【0011】
一の側面において、本開示は、試料中のＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの存在又は量を検出することのためのアッセイ方法を提供し、その方法は：
その試料をＶＣＡＭ－１への第一の結合エピトープを有する第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体と接触させることであって、ここでその第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体は第一のドナーフルオロフォアにより標識されること；
その試料をＶＣＡＭ－１への第二の結合エピトープを有する第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体と接触させることであって、ここでその第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体は第一のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
その試料をＡ２Ｍへの結合エピトープを有する抗Ａ２Ｍ抗体と接触させることであって、ここでその抗Ａ２Ｍ抗体は第二のドナーフルオロフォアによって標識されること；
その試料を単離したＡ２Ｍタンパク質と接触させることであって、ここでその単離したＡ２Ｍタンパク質は第二のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
その試料を二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを得るために十分な時間インキュベートすること；そして
一以上の光源を用いて二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを有するその試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連した少なくとも一つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここで第一及び第二のアクセプターフルオロフォアが異なる。
その試料をＶＣＡＭ－１への第一の結合エピトープを有する第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体と接触させることであって、ここでその第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体は第一のドナーフルオロフォアにより標識されること；
その試料をＶＣＡＭ－１への第二の結合エピトープを有する第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体と接触させることであって、ここでその第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体は第一のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
その試料をＡ２Ｍへの結合エピトープを有する抗Ａ２Ｍ抗体と接触させることであって、ここでその抗Ａ２Ｍ抗体は第二のドナーフルオロフォアによって標識されること；
その試料を単離したＡ２Ｍタンパク質と接触させることであって、ここでその単離したＡ２Ｍタンパク質は第二のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
その試料を二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを得るために十分な時間インキュベートすること；そして
一以上の光源を用いて二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを有するその試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連した少なくとも一つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここで第一及び第二のアクセプターフルオロフォアが異なる。
【0012】
別の側面において、本開示は、試料中のＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの存在又は量を検出することのためのアッセイ方法を提供し、その方法は：
その試料とＶＣＡＭ－１への第一の結合エピトープを有する第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体は第一のドナーフルオロフォアによって標識されること；
その試料とＶＣＡＭ－１への第二の結合エピトープを有する第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体が第一のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
その試料とＡ２Ｍへ結合するエピトープを有する抗Ａ２Ｍ抗体とを接触させることであって、ここでその抗Ａ２Ｍ抗体は第二のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
その試料と単離したＡ２Ｍタンパク質とを接触させることであって、ここでその単離したＡ２Ｍタンパク質は第二のドナーフルオロフォアによって標識されること；
その試料を二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを得るために十分な時間インキュベートすること；そして
一以上の光源を用いて二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを有する試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連した少なくとも１つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここで前記第一及び第二のアクセプターフルオロフォアが異なる。
その試料とＶＣＡＭ－１への第一の結合エピトープを有する第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体は第一のドナーフルオロフォアによって標識されること；
その試料とＶＣＡＭ－１への第二の結合エピトープを有する第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体が第一のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
その試料とＡ２Ｍへ結合するエピトープを有する抗Ａ２Ｍ抗体とを接触させることであって、ここでその抗Ａ２Ｍ抗体は第二のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
その試料と単離したＡ２Ｍタンパク質とを接触させることであって、ここでその単離したＡ２Ｍタンパク質は第二のドナーフルオロフォアによって標識されること；
その試料を二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを得るために十分な時間インキュベートすること；そして
一以上の光源を用いて二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを有する試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連した少なくとも１つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここで前記第一及び第二のアクセプターフルオロフォアが異なる。
【0013】
本開示の第二の側面のある態様において、その第一及び第二のドナーフルオロフォアが同じであり、かつその試料が一つの光源を用いて励起される。他の態様において、第一及び第二のドナーフルオロフォアが異なり、かつその試料が二つの異なる光源を用いて励起される。
【0014】
ある態様において、そのＦＲＥＴ発光シグナルは時間分解ＦＲＥＴ発光シグナルである。
【0015】
ある態様において、その試料は生物学的な試料（例えば、全血、尿、ふん便検体、血漿、又は血清）である。特定の態様において、その生物学的な試料は全血である。
【0016】
ある態様において、そのドナーフルオロフォアはテルビウムクリプテートである。
【0017】
ある態様において、そのアクセプターフルオロフォアは、フルオレセイン様（緑色光域）、Ｃｙ５、ＤＹ－６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、及びフィコエリスリン（ＰＥ）からなる群より選択される。
【0018】
ある態様において、その第一のアクセプターフルオロフォアはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８であり、かつその第二のアクセプターフルオロフォアはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６である。ある態様において、その第一のアクセプターフルオロフォアはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８であり、かつその第二のアクセプターフルオロフォアはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７である。ある態様において、その第一のアクセプターフルオロフォアはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６であり、かつその第二のアクセプターフルオロフォアはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７である。
【0019】
ある態様において、本明細書に記載される方法は、さらに、追加のバイオマーカーの存在又は量を検出することを含む。追加のバイオマーカーを検出するために、その方法は、 その試料とその追加のバイオマーカーへの第一の結合エピトープを有する追加の抗体とを接触させることであって、ここでその追加の抗体は第三のドナーフルオロフォアによって標識されること；
その試料とその追加のバイオマーカーへの第二の結合エピトープを有するさらなる抗体とを接触させることであって、ここでそのさらなる抗体は第三のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
その試料を二重標識した追加のバイオマーカーを得るために十分な時間インキュベートすること；そして
光源を用いて二重標識した追加のバイオマーカーを有する試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と関連した二つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここでその第一、第二、及び第三のアクセプターフルオロフォアが異なる。
その試料とその追加のバイオマーカーへの第二の結合エピトープを有するさらなる抗体とを接触させることであって、ここでそのさらなる抗体は第三のアクセプターフルオロフォアによって標識されること；
その試料を二重標識した追加のバイオマーカーを得るために十分な時間インキュベートすること；そして
光源を用いて二重標識した追加のバイオマーカーを有する試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）と関連した二つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここでその第一、第二、及び第三のアクセプターフルオロフォアが異なる。
【0020】
ある態様においてその光源は約３００ｎｍ～約４００ｎｍの励起波長を提供する。ある態様において、その蛍光発光シグナルは約４５０ｎｍ～７００ｎｍの間である発光波長を発光する。
【0021】
ある態様において、血中のＶＣＡＭ－１の濃度は約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５００ｎｇ／ｍＬである。ある態様において、血中のＶＣＡＭ－１の通常の濃度は約１００ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬである。ある態様において、血中のＶＣＡＭ－１の上昇した濃度は、少なくとも５５０ｎｇ／ｍＬを上回る。ある態様において、血中のＶＣＡＭ－１の上昇した濃度は少なくとも６５０ｎｇ／ｍＬを上回る。
【0022】
ある態様において、血中のＡ２Ｍの濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬである。ある態様において、血中のＡ２Ｍの通常の濃度は約１ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬである。ある態様において、血中のＡ２Ｍの上昇した濃度は少なくとも５．５ｍｇ／ｍＬを上回る。ある態様において、血中のＡ２Ｍの上昇した濃度は少なくとも６．５ｍｇ／ｍＬを上回る。
【0023】
これらの及び他の側面、目的並びに態様は、以下の詳細な記載及び図によって書かれるものより明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】本開示の一の態様を例示する。
【0025】
【図2A-2B】本開示の方法を用いるＶＣＡＭ－１について作成される標準曲線を示す。
【0026】
【図2C-2D】本開示の方法を用いるＶＣＡＭ－１について作成される標準曲線を示す。
【0027】
【図2E-2F】本開示の方法を用いるＡ２Ｍについて作成される標準曲線を示す。
【0028】
【図2G】本開示の方法を用いるＡ２Ｍについて作成される標準曲線を示す。
【0029】
【図2H-2I】本開示の方法を用いるマルチプレックスアッセイ時のＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍについて作成される標準曲線を示す。
【0030】
【0031】
【図3】本開示のドナーフルオロフォアの一の態様を示す。
【0032】
【図4】本開示のアクセプターフルオロフォアの一の態様を示す。
【0033】
【図5】本開示の一の態様におけるドナー及びアクセプターフルオロフォアの波長を示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本明細書で用いられるように、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」という用語は、一の要素による側面を含むのみであり、一以上の側面を含まない。
【0035】
数値的な値を修飾するために本明細書で用いられるように「約」という用語は、その値の周辺の決定される範囲を示す。「Ｘ」が値の場合に、「約Ｘ」は、０．９Ｘ～１．１Ｘ、及びより好ましくは、０．９５Ｘ～１．０５Ｘの値を示すと考えられる。「約Ｘ」への任意の参照は、少なくとも値Ｘ、０．９５Ｘ、０．９６Ｘ、０．９７Ｘ、０．９８Ｘ、０．９９Ｘ、１，０１Ｘ、１．０２Ｘ、１．０３Ｘ、１．０４Ｘ、及び１．０５Ｘを示す。それゆえ、「約Ｘ」は、例えば、「０．９８Ｘ」の請求の範囲の限界について書かれる記載の支援を教示し、かつ提供することを意図される。
【0036】
修飾語句「約」は、数的な範囲の開始を記載することを適用し、範囲の両端を適用する。それゆえ、「約５００～８５０ｎｍ」は、「約５００ｎｍ～約８５０ｎｍ」と同等である。「約」が一セットの値の第一の値を記載することを適用する場合に、それはそのセットにおける、全ての値を適用する。すなわち、「約５８０、７００、又は８５０ｎｍ」は、「約５８０ｎｍ、約７００ｎｍ、又は約８５０ｎｍ」と等しい。
【0037】
本明細書で用いられるように「活性化したアシル」は、－Ｃ（Ｏ）－ＬＧ基を含む。「脱離基」又は「ＬＧ」は、求核性アシル置換によって置換されやすい基である（すなわち、－Ｃ（Ｏ）－ＬＧのカルボニルへの求核付加後の脱離基の排除）。代表的な脱離基は、ハロ、シアノ、アジド、カルボン酸誘導体、例えばｔ－ブチルカルボキシ、及び炭酸塩誘導体例えばｉ－ＢｕＯＣ（Ｏ）Ｏ－を含む。また、活性化したアシル基は、本明細書で定義されるような活性化したエステル又は、無水物（好ましくは環状）若しくは混合した無水物－ＯＣ（Ｏ）Ｒa若しくは－ＯＣ（ＮＲa）ＮＨＲb（好ましくは環状）を形成するためにカルボジイミドにより活性化したカルボキシル酸でありうる（式中、Ｒa及びＲbはＣ1－Ｃ6ペルフルオロアルキル、Ｃ1－Ｃ6アルコキシ、シクロヘキシル、３－ジメチルアミノプロピル、又はＮ－モルホリノエチルからなる基より独立して選択されるメンバーである）。
【0038】
本明細書で用いられるように「活性化したエステル」は、エチルエステル基よりも求核付加による置換及び排除されやすいカルボキシル基の誘導体（例えば、ＮＨＳエステル、スルホ－ＮＨＳエステル、ＰＡＭエステル、又はハロフェニルエステル）を含む。活性化したエステルの代表的なカルボニル置換基は、スクシンイミジルオキシ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙ）（－ＯＣ4Ｈ4ＮＯ2）、スルホスクシンイミジルオキシ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙ）（－ＯＣ4Ｈ3ＮＯ2ＳＯ3Ｈ）、－１－オキシベンゾトリアゾリル（－ＯＣ6Ｈ4Ｎ3）；４－スルホ－２，３，５，６－テトラフルオロフェニル；又は電子吸引置換基、例えばニトロ、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、又はそれらの組み合わせ（例えば、ペンタフルオロフェニルオキシ、又は２，３，５，６－テトラフルオロフェニルオキシ）によって一以上の回数任意に置換されるアリールオキシ基を含む。好ましい活性化したエステルは、スクシンイミジルオキシ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙ）、スルホスクシンイミジルオキシ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙ）、及び２，３，５，６－テトラフルオロフェニルオキシエステルを含む。
【0039】
「ＦＲＥＴパートナー」は、クリプテートのようなドナー蛍光化合物、及びＡｌｅｘａ６４７のようなアクセプター化合物からなるフルオロフォアのパートナーを意味し、それらはお互いに近接し、そしてそれらがドナー蛍光化合物の励起波長で励起される場合に、これらの化合物はＦＲＥＴシグナルを発行する。二つの蛍光化合物がＦＲＥＴパートナーであるために、そのドナー蛍光化合物の発光スペクトルは、アクセプター化合物の励起波長に部分的に重複しなければならないことが既知である。その好ましいＦＲＥＴパートナー対は、Ｒ０値（フェルスター距離、エネルギー移動が５０％効率である距離）が３０Å以上であるそれらである。
【0040】
「ＦＲＥＴシグナル」は、ドナーフルオロフォア化合物とアクセプター化合物との間のＦＲＥＴの代表的な任意の測定可能なシグナルを意味する。ＦＲＥＴシグナルはそれゆえ、ドナー蛍光化合物又は（アクセプター化合物が蛍光性である場合に）アクセプター化合物の発光の強度の又は寿命の変動でありうる。
【0041】
ＶＣＡＭ－１（血管細胞接着タンパク質１、ＣＤ１０６、ＩＮＣＡＭ－１１０）は、サイトカイン活性化した内皮により発現した細胞表面のシアロ糖タンパク質を意味する。ＶＣＡＭ－１は、白血球移動、白血球－内皮細胞接着及びシグナル伝達の制御を含む、いくつかの機能を有し、かつ、いくつかの炎症性疾患に関与する。ＶＣＡＭ－１は非白血球性及び白血球性細胞にわたり分布される。ＶＣＡＭ－１は、接着分子のＩｇスーパーファミリーのメンバーであり、サイトカイン刺激した血管内皮細胞において高レベルで発現され、そして刺激されない内皮細胞で最小のレベルで発現される。また、ＶＣＡＭ－１はリンパ節の濾胞及び濾胞内樹状細胞、筋芽細胞、及びいくつかのマクロファージに存在する。受入番号Ｐ１９３２０の、ＶＣＡＭ－１＿ＨＵＭＡＮはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である。ＶＣＡＭ－１は７３９アミノ酸及び８１，２７６Ｄａの分子量を有する。このアイソフォームは「標準的な」配列として選択されている。
【0042】
Ａ２Ｍ（α２－マクログロブリン）は、血中で見られる血漿タンパク質を意味し、抗タンパク分解酵素として主に作用し、かつ様々なタンパク質分解酵素を不活化することができる。例えば、それはプラスミン及びカリクレインを阻害することによって繊維素溶解の阻害薬として機能する。それは、トロンビンを阻害することによって凝固の阻害薬として機能する。さらに、Ａ２Ｍは時々、また多数の成長因子及びサイトカイン、例えば血小板由来増殖因子、塩基性線維芽細胞成長因子、ＴＧＦ－β、インスリン、及びＩＬ－１βと結合するので、担体タンパク質として作用する。Ａ２Ｍは主に肝臓により産生され、かつまたマクロファージ、線維芽細胞、及び副腎皮質細胞により局所的に合成される。ヒトにおいて、それはＡ２Ｍ遺伝子によりコードされる。受入番号Ｐ０１０２３の、Ａ２Ｍ＿ＨＵＭＡＮはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。Ａ２Ｍは１４７４アミノ酸及び約７２０ｋＤａの分子量を有する。
【0043】
ＩＩ．態様
本出願は、均質な液相時間分解ＦＲＥＴアッセイ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）を提供し、全血のような生物学的な試料中のＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの存在又はレベルを検出する。他のマーカーレベルと共に、ＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍは肝臓疾患における繊維症、例えばＮＡＳＨ、Ｃ型肝炎及びＢ型肝炎の決定における助けとして用いられうる。フェルスター共鳴エネルギー移動又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は励起した状態におけるドナー分子が、二つの分子が近接される、典型的に１０ｎｍ未満、例えば＜９ｎｍ、＜８ｎｍ、＜７ｎｍ、＜６ｎｍ、＜５ｎｍ、＜４ｎｍ、＜３ｎｍ、＜２ｎｍ、又は＜１ｎｍ未満の場合に、その励起エネルギーをアクセプターフルオロフォアへの双極子－双極子カップリングを通じて移動するプロセスである。特定の波長での励起で、ドナーにより吸収されるエネルギーはアクセプターへと移動され、順番にエネルギーを発光する。アクセプターフルオロフォアから発光される光のレベルはドナーアクセプター複合体形成の度合いに比例する。
本出願は、均質な液相時間分解ＦＲＥＴアッセイ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）を提供し、全血のような生物学的な試料中のＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの存在又はレベルを検出する。他のマーカーレベルと共に、ＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍは肝臓疾患における繊維症、例えばＮＡＳＨ、Ｃ型肝炎及びＢ型肝炎の決定における助けとして用いられうる。フェルスター共鳴エネルギー移動又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は励起した状態におけるドナー分子が、二つの分子が近接される、典型的に１０ｎｍ未満、例えば＜９ｎｍ、＜８ｎｍ、＜７ｎｍ、＜６ｎｍ、＜５ｎｍ、＜４ｎｍ、＜３ｎｍ、＜２ｎｍ、又は＜１ｎｍ未満の場合に、その励起エネルギーをアクセプターフルオロフォアへの双極子－双極子カップリングを通じて移動するプロセスである。特定の波長での励起で、ドナーにより吸収されるエネルギーはアクセプターへと移動され、順番にエネルギーを発光する。アクセプターフルオロフォアから発光される光のレベルはドナーアクセプター複合体形成の度合いに比例する。
【0044】
生物学的な材料は、典型的に自己蛍光する傾向があり、それらは時間分解蛍光測定（ＴＲＦ）を利用することによって最小化されうる。ＴＲＦは、希土類元素、例えばランタニド系元素（例えば、ユウロピウム及びテルビウム）を利用し、それらは並外れて長い蛍光発光半減期を有する。時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ－ＦＲＥＴ）はＴＲＦ及びＦＲＥＴの特性を併せ持ち、それらは特に生物学的な試料を分析する際に都合が良い。一の抗ＶＣＡＭ－１抗体はドナーフルオロフォアにより標識され、かつ第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体はアクセプターフルオロフォアにより標識され、かつ抗Ａ２Ｍ抗体はドナーフルオロフォア（又はアクセプターフルオロフォア）により標識され、かつ単離したＡ２Ｍタンパク質はアクセプターフルオロフォア（又はドナーフルオロフォア）によって標識され、ここで、その二つのアクセプターフルオロフォアは異なる。ＴＲ－ＦＲＥＴは、試料中のＶＣＡＭ－１の存在において生じかつ試料中のＡ２Ｍの存在は、分離したＡ２Ｍタンパク質と結合する抗Ａ２Ｍ抗体と関連したＴＲ－ＦＲＥＴシグナルを破壊するだろう（図１）。
【0045】
生物学的なプロセスを研究することのためのＦＲＥＴ現象の使用は、ＦＲＥＴパートナーの対の各メンバーがお互いに相互作用しうる化合物と結合されうること意味し、そしてそれゆえＦＲＥＴパートナーをお互いに近接させる。光への曝露で、ＦＲＥＴパートナーはＦＲＥＴシグナルを産生するだろう。本開示に従う方法において、エネルギードナー及びエネルギーアクセプターは、それぞれ異なる抗ＶＣＡＭ－１抗体に結合される。エネルギードナー又はエネルギーアクセプターは抗Ａ２Ｍ抗体と結合される。さらに、エネルギードナー又はエネルギーアクセプターは単離したＡ２Ｍタンパク質に結合に結合される。例えば、ＶＣＡＭ－１の二つのエピトープに結合する二つの抗ＶＣＡＭ－１抗体、及びＡ２Ｍのエピトープに結合する抗Ａ２Ｍ抗体が用いられうる。二つのＦＲＥＴパートナー間のエネルギー移動は分析物へのそれぞれの結合することに依存する。フェルスター又は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、その励起状態におけるドナーフルオロフォアが非放射的にその励起エネルギーを近傍のアクセプターフルオロフォアへと移動する物理学的な現象であり、それによってそのアクセプターに特定の蛍光を発光させる。
【0046】
そのように、ある側面において、本開示は、試料中のＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの存在又は量を検出するためのアッセイ方法を提供し、その方法は：
その試料とＶＣＡＭ－１への第一の結合エピトープを有する第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体が第一のドナーフルオロフォアによって標識化されること；
その試料とＶＣＡＭ－１への第二の結合エピトープを有する第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体が第一のアクセプターフルオロフォアによって標識化されること；
その試料と、Ａ２Ｍへの結合エピトープを有する抗Ａ２Ｍ抗体とを接触させ、ここでそのＡ２Ｍ抗体は第二のドナーフルオロフォアによって標識されること；
その試料と、単離したＡ２Ｍタンパク質とを接触させることであって、ここでその単離したタンパク質を第二のアクセプターフルオロフォアにより標識すること；
二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを得るために十分な時間その試料をインキュベートすること；そして
一以上の光源を用いて二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを有する試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連した少なくとも１つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここでその第一及び第二のアクセプターフルオロフォアは異なる。
その試料とＶＣＡＭ－１への第一の結合エピトープを有する第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体が第一のドナーフルオロフォアによって標識化されること；
その試料とＶＣＡＭ－１への第二の結合エピトープを有する第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体が第一のアクセプターフルオロフォアによって標識化されること；
その試料と、Ａ２Ｍへの結合エピトープを有する抗Ａ２Ｍ抗体とを接触させ、ここでそのＡ２Ｍ抗体は第二のドナーフルオロフォアによって標識されること；
その試料と、単離したＡ２Ｍタンパク質とを接触させることであって、ここでその単離したタンパク質を第二のアクセプターフルオロフォアにより標識すること；
二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを得るために十分な時間その試料をインキュベートすること；そして
一以上の光源を用いて二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを有する試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連した少なくとも１つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここでその第一及び第二のアクセプターフルオロフォアは異なる。
【0047】
別の側面において、本開示は、試料中のＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの存在又は量を検出するためのアッセイ方法を提供し、その方法は、
その試料とＶＣＡＭ－１への第一の結合エピトープを有する第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第一のＶＣＡＭ－１抗体は第一のドナーフルオロフォアにより標識されること；
その試料とＶＣＡＭ－１への第二の結合エピトープを有する第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体は第一のアクセプターフルオロフォアにより標識されること；
その試料とＡ２Ｍへの結合エピトープを有する抗Ａ２Ｍ抗体とを接触させることであって、ここで抗Ａ２Ｍ抗体は第二のアクセプターフルオロフォアにより標識されること；
その試料と単離したＡ２Ｍタンパク質とを接触させることであって、ここでその単離したＡ２Ｍタンパク質は第二のドナーフルオロフォアにより標識されること；
その試料を二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを得るために十分な時間インキュベートすること；そして
二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを有する試料を一以上の光源を用いて励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連した少なくとも１つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここでその第一及び第二のアクセプターフルオロフォアは異なる。
その試料とＶＣＡＭ－１への第一の結合エピトープを有する第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第一のＶＣＡＭ－１抗体は第一のドナーフルオロフォアにより標識されること；
その試料とＶＣＡＭ－１への第二の結合エピトープを有する第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体とを接触させることであって、ここでその第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体は第一のアクセプターフルオロフォアにより標識されること；
その試料とＡ２Ｍへの結合エピトープを有する抗Ａ２Ｍ抗体とを接触させることであって、ここで抗Ａ２Ｍ抗体は第二のアクセプターフルオロフォアにより標識されること；
その試料と単離したＡ２Ｍタンパク質とを接触させることであって、ここでその単離したＡ２Ｍタンパク質は第二のドナーフルオロフォアにより標識されること；
その試料を二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを得るために十分な時間インキュベートすること；そして
二重標識したＶＣＡＭ－１及び標識したＡ２Ｍを有する試料を一以上の光源を用いて励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連した少なくとも１つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここでその第一及び第二のアクセプターフルオロフォアは異なる。
【0048】
ある態様において、その第一及び第二のドナーフルオロフォアが同じかつその試料が一つの光源を用いて励起される、本開示のこの側面の他の態様において、その第一及び第二のフルオロフォアが異なり、かつその試料が二つの異なる光源を用いて励起される。
【0049】
本開示のこの側面において、ドナーフルオロフォアに標識された一つのもの及びアクセプターフルオロフォアにより標識された一つのものである、二つの抗ＶＣＡＭ－１抗体を用いた。二つの抗ＶＣＡＭ－１抗体は、ＶＣＡＭ－１の二つの異なるエピトープに結合する。また、ドナーフルオロフォア（又はアクセプターフルオロフォア）により標識される抗Ａ２Ｍ抗体及びアクセプターフルオロフォア（又はドナーフルオロフォア）によって標識される単離したＡ２Ｍタンパク質を用いる。ＶＣＡＭ－１上の二つの異なるエピトープに結合する二つの抗ＶＣＡＭ－１抗体は、第一のドナーフルオロフォア及び第一のアクセプターフルオロフォアをお互いに近接させる。その抗Ａ２Ｍ抗体及びその単離したＡ２Ｍタンパク質は、第二のドナーフルオロフォア及び第二のアクセプターフルオロフォアをお互いに近接させる。その励起状態におけるドナーフルオロフォアは、励起エネルギーをアクセプターフルオロフォアへと移動し、そのアクセプターフルオロフォアに特定の蛍光を発光させる。ある態様において、その二つのアクセプターフルオロフォアは異なり、異なる波長で蛍光を発光する。それゆえ、試料中のＶＣＡＭ－１及びその蛍光発光シグナルの消失は、試料中のＡ２Ｍの存在又は濃度に比例する。
【0050】
上記の開示の二つの側面のある態様において、本明細書で記載される方法は、追加のバイオマーカーの存在又は量を検出することを含む。追加のバイオマーカーを検出するために、その方法は：
その試料とその追加のバイオマーカーへの第一の結合エピトープを有する追加の抗体とを接触させることであって、ここでその追加の抗体は第三のドナーフルオロフォアにより標識されること；
その試料とその追加のバイオマーカーへの第二の結合エピトープを有するさらなる抗体とを接触させることであって、ここでそのさらなる抗体は第三のアクセプターフルオロフォアにより標識されること；
その試料を二重標識した追加のバイオマーカーを得るために十分な時間インキュベートすること；そして
光源を用いて二重標識した追加のバイオマーカーを有する試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連した二つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここでその第一、第二、及び第三のアクセプターフルオロフォアが異なる。
その試料とその追加のバイオマーカーへの第一の結合エピトープを有する追加の抗体とを接触させることであって、ここでその追加の抗体は第三のドナーフルオロフォアにより標識されること；
その試料とその追加のバイオマーカーへの第二の結合エピトープを有するさらなる抗体とを接触させることであって、ここでそのさらなる抗体は第三のアクセプターフルオロフォアにより標識されること；
その試料を二重標識した追加のバイオマーカーを得るために十分な時間インキュベートすること；そして
光源を用いて二重標識した追加のバイオマーカーを有する試料を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関連した二つの蛍光発光シグナルを検出することを含み、
ここでその第一、第二、及び第三のアクセプターフルオロフォアが異なる。
【0051】
ある態様において、その第一のアクセプターフルオロフォアはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８であり、第二のアクセプターフルオロフォアはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６であり、かつ第三のアクセプターフルオロフォアはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７である。
【0052】
ＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍに加えて、本明細書で記載される方法を用いて検出されうる追加のバイオマーカーは、Ｍ６５（ＣＫ１８フルレングス）、ＩＣＡＭ－１、ｅセレクチン、シンデカン１（ＣＤ１３８）、アディポネクチン、キチナーゼ－３様１（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ３－ｌｉｋｅ １）（ＹＫＬ４０）、ＡＣＹ１、オステオポンチン、ＧＤＦ１５、カテプシンＤ，Ｍ３０（ＣＫ１８フラグメント）、ＡＮＧＰＴＬ４、ＦＧＦ２１、ＴＨＢＳ２、ＭＭＰ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＨＡ（ヒアルロン酸）、ＩＰ１０、ＶＡＰ１、ＭＣＰ１、ＩＬ２Ｒα、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＦＡＢＰ１、ＩＬ６、アンジオポエチン１、コラーゲン ＩＶ－α１、ＦＧＦ１９、ＶＥＧＦ、ガレクチン１、ガレクチン３、ＭＭＰ１、ＭＭＰ９、ハプトグロビン、ＴＩＭＰ１、レジスチン、ガレクチン３ＢＰ、ｅ－カドヘリン、ＡｐｏＡ１、ガレクチン９、ＨＢＥＧＦ、及びＭＭＰ３からなる群より選択されうる。ある態様において、追加のバイオマーカーは、ＡＮＧＰＴＬ４、ＦＧＦ２１、ＴＨＢＳ２、ＭＭＰ２、ＡＮＧＰＴＬ３、又はＨＡ（ヒアルロン酸）である。ある態様において、追加のバイオマーカーは、ＩＰ１０、ＶＡＰ１、ＭＣＰ１、ＩＬ２Ｒα、ＥＭＭＰＲＩＮ、又はＦＡＢＰ１である。ある態様において、追加のバイオマーカーは、ＩＬ６、アンジオポエチン１、コラーゲン ＩＶ－α１、ＦＧＦ１９、ＶＥＧＦ、又はガレクチン１である。ある態様において、追加のバイオマーカーは、ガレクチン３、ＭＭＰ１、ＭＭＰ９、ハプトグロビン、ＴＩＭＰ１、又はレジスチンである。ある態様において、その追加のバイオマーカーは、ガレクチン３ＢＰ、ｅ－カドヘリン、ＡｐｏＡ１、ガレクチン９、ＨＢＥＧＦ、又はＭＭＰ３である。
【0053】
ある側面において、ＦＲＥＴアッセイは時間分解ＦＲＥＴアッセイである。その蛍光発光シグナル又は測定されるＦＲＥＴシグナルは研究される生物学的な現象と直接的に相関される。実際に、ドナー蛍光化合物とアクセプター蛍光化合物との間のエネルギー移動のレベルは、これらの化合物間の距離の逆数の６乗に比例する。当業者により一般的に用いられるドナー／アクセプター対について、その（５０％の移動効率に対応する）距離Ｒｏは、１、５、１０、２０又は３０ナノメートルのオーダーである。
【0054】
ある側面において、試料は生物学的な試料である。適当な生物学的な試料は、これらに限定されないが、全血、尿、ふん便検体、血漿又は血清を含む。好ましい側面において、その生物学的試料は全血である。
【0055】
ある側面において、そのＦＲＥＴエネルギードナー化合物は、クリプテート、例えばランタニドクリプテートである。
【0056】
ある側面において、そのクリプテートは、約３００ｎｍ～約４００ｎｍ、例えば約３２５ｎｍ～約３７５ｎｍの間の吸光波長を有する。ある側面において、図５に示されるように、クリプテート染色剤（図５におけるＬｕｍｉ４－Ｔｂ）は約４９０ｎｍ、約５４８ｎｍ、約５８７ｎｍ、及び６２１ｎｍの４つの蛍光発光ピークを有する。それゆえ、ドナーとして、そのクリプテートは、フルオレセイン様（緑色光域）及びＣｙ５、又はＤＹ－６４７様（赤色光域）のアクセプター（例えば、図５における緑色のアクセプター、ＮＩＲアクセプター、又はオレンジ色のアクセプター）に適合して、ＴＲ－ＦＲＥＴ試験を実施する。
【0057】
ある側面において、アクセプター発光波長でのフラッシュ励起と蛍光の測定との間の時間遅延の導入は、短寿命の蛍光から長寿命の蛍光を区別し、シグナル対ノイズ比を高めることを可能にする。
【0058】
ＦＲＥＴドナーとしてのクリプテート
ある側面において、Ｃｉｓｂｉｏ ｂｉｏａｓｓａｙｓにより市販されている、ルミフォール（Ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）からのテルビウムクリプテート分子「Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ」は、クリプテートドナーとして用いられる。以下の式を有するテルビウムクリプテート「Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ」は、この場合、例えばＮＨＳエステル：
において、反応基により抗体と結合されうる。
活性化したエステル（ＮＨＳエステル）は、抗体上で一級アミンと反応することができ、安定的なアミド結合を作る。クリプテート上のマレイミド及び抗体上のチオールは、共に反応し、そしてチオエーテルを作る。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応し、アルキルアミン及びチオエーテルをそれぞれ作る。抗体に結合されうる反応基を提供する任意の誘導体は、本明細書で利用されうる。例えば、ある態様において、抗ＶＣＡＭ－１抗体又は抗Ａ２Ｍ抗体を用いる際に、そのクリプテート上のマレイミドは、抗体上のチオールと反応しうる。
ある側面において、Ｃｉｓｂｉｏ ｂｉｏａｓｓａｙｓにより市販されている、ルミフォール（Ｌｕｍｉｐｈｏｒｅ）からのテルビウムクリプテート分子「Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ」は、クリプテートドナーとして用いられる。以下の式を有するテルビウムクリプテート「Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ」は、この場合、例えばＮＨＳエステル：
【化1】
活性化したエステル（ＮＨＳエステル）は、抗体上で一級アミンと反応することができ、安定的なアミド結合を作る。クリプテート上のマレイミド及び抗体上のチオールは、共に反応し、そしてチオエーテルを作る。ハロゲン化アルキルは、アミン及びチオールと反応し、アルキルアミン及びチオエーテルをそれぞれ作る。抗体に結合されうる反応基を提供する任意の誘導体は、本明細書で利用されうる。例えば、ある態様において、抗ＶＣＡＭ－１抗体又は抗Ａ２Ｍ抗体を用いる際に、そのクリプテート上のマレイミドは、抗体上のチオールと反応しうる。
【0059】
ある他の側面において、「大員環」とタイトルを付けられた「ＷＯ２０１５１５７０５７」において開示されるクリプテートは、本開示における使用のために適当である。本出願は、生体分子を標識することに有用なクリプテート分子を含む。本明細書で開示されるように、あるクリプテートは構造を有する：
【化2】
【0060】
ある他の側面において、本開示において有用なテルビウムクリプテートは以下に示される：
【化3】
【0061】
ある側面において、本発明に有用であるクリプテートは、２０１８年７月１９日に公開されたＷＯ２０１８／１３０９８８において開示されている。その明細書で開示されるように、式Ｉの化合物は、本開示のＦＲＥＴドナーとして有用である：
（式中、破線がある場合に、Ｒ及びＲ1は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、一以上のハロゲン原子によって任意に置換されるアルキル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、若しくはアルキルカルボニルアルコキシからなる群よりそれぞれ独立して選択されるか又は、一方でＲ及びＲ1は破線が無い場合に、任意に置換されるシクロプロピル基を形成するために結合する；
Ｒ2及びＲ3は、水素、ハロゲン、ＳＯ3Ｈ、－ＳＯ2－Ｘからなる群よりそれぞれ独立して選択されるメンバーであり、式中Ｘはハロゲン、任意に置換したアルキル、任意に置換したアリール、任意に置換したアルケニル、任意に置換したアルキニル、任意に置換したシクロアルキル、又は生体分子に結合されうる活性化した基であり、式中、その活性化した基は、ハロゲン、活性化したエステル、活性化したアシル、任意に置換したアルキルスルホネートエステル、任意に置換したアリールスルホネートエステル、アミノ、ホルミル、グリシジル、ハロ、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナート、イソチオアナト、マレイミジル、メルカプト、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、環状無水物、アルコキシアルキル、水可溶化基、又はＬからなる群より選択されるメンバーである；
Ｒ4は、それぞれ独立して水素、Ｃ1－Ｃ6アルキルであるか又は、一方でＲ4基の３がなく、そしてその結果の酸化物がランタニドカチオンとキレートされる；かつ
Ｑ1～Ｑ4はそれぞれ独立して、炭素又は窒素の群から選択されるメンバーである）。
【化4】
Ｒ2及びＲ3は、水素、ハロゲン、ＳＯ3Ｈ、－ＳＯ2－Ｘからなる群よりそれぞれ独立して選択されるメンバーであり、式中Ｘはハロゲン、任意に置換したアルキル、任意に置換したアリール、任意に置換したアルケニル、任意に置換したアルキニル、任意に置換したシクロアルキル、又は生体分子に結合されうる活性化した基であり、式中、その活性化した基は、ハロゲン、活性化したエステル、活性化したアシル、任意に置換したアルキルスルホネートエステル、任意に置換したアリールスルホネートエステル、アミノ、ホルミル、グリシジル、ハロ、ハロアセトアミジル、ハロアルキル、ヒドラジニル、イミドエステル、イソシアナート、イソチオアナト、マレイミジル、メルカプト、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミド、スルホナト、アルコキシカルボニルアルキル、環状無水物、アルコキシアルキル、水可溶化基、又はＬからなる群より選択されるメンバーである；
Ｒ4は、それぞれ独立して水素、Ｃ1－Ｃ6アルキルであるか又は、一方でＲ4基の３がなく、そしてその結果の酸化物がランタニドカチオンとキレートされる；かつ
Ｑ1～Ｑ4はそれぞれ独立して、炭素又は窒素の群から選択されるメンバーである）。
【0062】
ＦＲＥＴアクセプター
ＦＲＥＴシグナルを検出するために、ＦＲＥＴアクセプターを必要とする。そのＦＲＥＴアクセプターは、ＦＲＥＴドナーの発光波長と重なる励起波長を有する。本開示において、アクセプターの二つのＦＲＥＴシグナルは、試料中（例えば患者の血中）に存在するＶＣＡＭ－１の濃度レベルに比例する一つのＦＲＥＴシグナルによって検出され、そして他のＦＲＥＴシグナルは、試料中（例えば患者の血中）に存在するＡ２Ｍの濃度レベルに反比例する。既知の量のキャリブレータ―、すなわち標準曲線（図２Ａ～２Ｄ）は、ＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの濃度レベルを補間するために用いられうる。上記のように、抗ＶＣＡＭ－１又は抗Ａ２Ｍ抗体が用いられる際に、そのクリプテートドナー（図３）は抗体を標識するために用いられうる。Ｌｕｍｉ４－Ｔｂは、４９０、５５０及び６２０ｎｍの３つのスペクトル的に異なるピークを有し、それらはエネルギー移動のために用いられうる（図５）。続いて、第一のアクセプターは（第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体により結合されるＶＣＡＭ－１上のエピトープからＶＣＡＭ－１上の異なるエピトープに結合しうる）抗ＶＣＡＭ－１抗体を標識するために用いられうる。第二のアクセプターを抗Ａ２Ｍ抗体を標識するために用いうる。本開示において、その第一のアクセプター及び第二のアクセプターは異なり、かつ異なる発光波長で二つの蛍光発光シグナルを発光する。用いられうるアクセプター分子は、これらに限定されないが、フルオレセイン様（緑色光域）、Ｃｙ５、ＤＹ－６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（図４）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、及びフィコエリスリン（ＰＥ）を含む。ドナー及びアクセプターフルオロフォアは、抗体上の一級アミンを用いて結合されうる。
ＦＲＥＴシグナルを検出するために、ＦＲＥＴアクセプターを必要とする。そのＦＲＥＴアクセプターは、ＦＲＥＴドナーの発光波長と重なる励起波長を有する。本開示において、アクセプターの二つのＦＲＥＴシグナルは、試料中（例えば患者の血中）に存在するＶＣＡＭ－１の濃度レベルに比例する一つのＦＲＥＴシグナルによって検出され、そして他のＦＲＥＴシグナルは、試料中（例えば患者の血中）に存在するＡ２Ｍの濃度レベルに反比例する。既知の量のキャリブレータ―、すなわち標準曲線（図２Ａ～２Ｄ）は、ＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの濃度レベルを補間するために用いられうる。上記のように、抗ＶＣＡＭ－１又は抗Ａ２Ｍ抗体が用いられる際に、そのクリプテートドナー（図３）は抗体を標識するために用いられうる。Ｌｕｍｉ４－Ｔｂは、４９０、５５０及び６２０ｎｍの３つのスペクトル的に異なるピークを有し、それらはエネルギー移動のために用いられうる（図５）。続いて、第一のアクセプターは（第一の抗ＶＣＡＭ－１抗体により結合されるＶＣＡＭ－１上のエピトープからＶＣＡＭ－１上の異なるエピトープに結合しうる）抗ＶＣＡＭ－１抗体を標識するために用いられうる。第二のアクセプターを抗Ａ２Ｍ抗体を標識するために用いうる。本開示において、その第一のアクセプター及び第二のアクセプターは異なり、かつ異なる発光波長で二つの蛍光発光シグナルを発光する。用いられうるアクセプター分子は、これらに限定されないが、フルオレセイン様（緑色光域）、Ｃｙ５、ＤＹ－６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７（図４）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、及びフィコエリスリン（ＰＥ）を含む。ドナー及びアクセプターフルオロフォアは、抗体上の一級アミンを用いて結合されうる。
【0063】
他のアクセプターは、これらに限定されないが、シアニン誘導体、Ｄ２、ＣＹ５、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、カルボピロニン（ｃａｒｂｏｐｙｒｏｎｉｎｅ）、オキサジン及びそのアナログ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ フルオロフォア、クリスタル・バイオレット、ペリレンビスイミドフルオロフォア（ｐｅｒｙｌｅｎｅ ｂｉｓｉｍｉｄｅ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、スクアラインフルオロフォア、ボロンジピロメテン誘導体（ｂｏｒｏｎ ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、ＮＢＤ（ニトロベンゾオキサジアゾール（ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｚａｄｉａｚｏｌｅ））及びその誘導体、ＤＡＢＣＹＬ（４，（（４－（ジメチルアミノ）フェノール）アゾ）安息香酸）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）及びフィコエトリエン（ＰＥ）を含む。
【0064】
ある側面において、蛍光は、波長、強度、寿命及び偏光により特徴づけられうる。
【0065】
抗体
一の側面において、ヒト抗ＶＣＡＭ－１／ＣＤ１０６抗体（例えば、モノクローナルマウスＩｇＧ１ Ｃｌｏｎｅ＃ＨＡＥ－２Ｚ由来、かつ、ヒトＶＣＡＭ－１／ＣＤ１０６に特異的であることが示されているカタログ＃ＭＡＢ８０９（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ））はドナーフルオロフォア（例えばクリプテート）に結合するために用いることができ、異なるヒト抗ＶＣＡＭ－１／ＣＤ１０６抗体（例えば、モノクローナルマウスＩｇＧ１ Ｃｌｏｎｅ＃１．Ｇ１１Ｂ１由来のカタログ＃ＭＡ５－１６４２９（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））は、アクセプターフルオロフォアに結合されうる、又は反対である。他の商用の抗ＶＣＡＭ－１抗体は、当該分野で利用可能である。ヒト抗Ａ２Ｍ抗体（例えば、モノクローナルマウスＩｇＧ１ Ｃｌｏｎｅ＃３１２７４８５由来かつヒトＡ２Ｍについて特異的であることを示されるカタログ＃１０Ｃ－ＣＲ２００５Ｍ１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ））は、ドナーフルオロフォア（例えば、クリプテート）に結合するために用いることができ、かつ単離したＡ２Ｍタンパク質（例えば、ヒト血漿由来の、カタログ＃ａｂ７７９３５（Ａｂｃａｍ））はアクセプターフルオロフォアに結合するために用いられうる、又は反対である。他の商用の抗Ａ２Ｍ抗体は、当該分野で利用可能である。
一の側面において、ヒト抗ＶＣＡＭ－１／ＣＤ１０６抗体（例えば、モノクローナルマウスＩｇＧ１ Ｃｌｏｎｅ＃ＨＡＥ－２Ｚ由来、かつ、ヒトＶＣＡＭ－１／ＣＤ１０６に特異的であることが示されているカタログ＃ＭＡＢ８０９（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ））はドナーフルオロフォア（例えばクリプテート）に結合するために用いることができ、異なるヒト抗ＶＣＡＭ－１／ＣＤ１０６抗体（例えば、モノクローナルマウスＩｇＧ１ Ｃｌｏｎｅ＃１．Ｇ１１Ｂ１由来のカタログ＃ＭＡ５－１６４２９（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））は、アクセプターフルオロフォアに結合されうる、又は反対である。他の商用の抗ＶＣＡＭ－１抗体は、当該分野で利用可能である。ヒト抗Ａ２Ｍ抗体（例えば、モノクローナルマウスＩｇＧ１ Ｃｌｏｎｅ＃３１２７４８５由来かつヒトＡ２Ｍについて特異的であることを示されるカタログ＃１０Ｃ－ＣＲ２００５Ｍ１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ））は、ドナーフルオロフォア（例えば、クリプテート）に結合するために用いることができ、かつ単離したＡ２Ｍタンパク質（例えば、ヒト血漿由来の、カタログ＃ａｂ７７９３５（Ａｂｃａｍ））はアクセプターフルオロフォアに結合するために用いられうる、又は反対である。他の商用の抗Ａ２Ｍ抗体は、当該分野で利用可能である。
【0066】
ＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの存在又はレベルを検出することのための本明細書の方法は、組織試料、血液、生検、血清、血漿、唾液、尿、又はふん便検体を含む、様々な試料を用いうる。
【0067】
抗体の産生
まだ商用利用されていない抗体の産生及び分泌は、いくつかの方法において達成されうる。例えば、一の方法は当該分野で既知のタンパク質発現及び精製方法を用いて関心のあるポリペプチド（すなわち抗原）を発現する及び／又は精製することであり、一方で別の方法は、当該分野で既知の固相ペプチド合成法を用いて関心のあるポリペプチドを合成することである。例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｍｕｒｒａｙ Ｐ． Ｄｅｕｔｃｈｅｒ， ｅｄ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． １８２ （１９９０）； Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｇｒｅｇ Ｂ． Ｆｉｅｌｄｓ， ｅｄ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． ２８９ （１９９７）； Ｋｉｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｒｎ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， ３８：１１９２－９９ （１９９０）； Ｍｏｓｔａｆａｖｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， １：２５５－６０， （１９９５）； ａｎｄ Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｒｎ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， ４４：１３２６－３１ （１９９６）参照。その精製した又は合成したポリペプチドは、続いて例えば、マウス又はウサギに注射することができ、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を産生する。当業者は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｅｄｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されるように、多くの手順が抗体の産生に利用可能であることを認識するだろう。また、当業者は、抗体を真似る結合フラグメント又はＦａｂフラグメントが様々な手順により遺伝情報から調製されうることを理解するだろう（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ， Ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ （１９９５）； ａｎｄ Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９：３９１４－３９２０（１９９２）参照）。
まだ商用利用されていない抗体の産生及び分泌は、いくつかの方法において達成されうる。例えば、一の方法は当該分野で既知のタンパク質発現及び精製方法を用いて関心のあるポリペプチド（すなわち抗原）を発現する及び／又は精製することであり、一方で別の方法は、当該分野で既知の固相ペプチド合成法を用いて関心のあるポリペプチドを合成することである。例えば、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｍｕｒｒａｙ Ｐ． Ｄｅｕｔｃｈｅｒ， ｅｄ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． １８２ （１９９０）； Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｇｒｅｇ Ｂ． Ｆｉｅｌｄｓ， ｅｄ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， Ｖｏｌ． ２８９ （１９９７）； Ｋｉｓｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｒｎ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， ３８：１１９２－９９ （１９９０）； Ｍｏｓｔａｆａｖｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， １：２５５－６０， （１９９５）； ａｎｄ Ｆｕｊｉｗａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｒｎ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， ４４：１３２６－３１ （１９９６）参照。その精製した又は合成したポリペプチドは、続いて例えば、マウス又はウサギに注射することができ、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を産生する。当業者は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ｅｄｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載されるように、多くの手順が抗体の産生に利用可能であることを認識するだろう。また、当業者は、抗体を真似る結合フラグメント又はＦａｂフラグメントが様々な手順により遺伝情報から調製されうることを理解するだろう（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ， Ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ （１９９５）； ａｎｄ Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４９：３９１４－３９２０（１９９２）参照）。
【0068】
加えて、多数の出版物は、選択される標的抗原へ結合することのためのポリペプチドのライブラリーの産生及びスクリーンするファージディスプレイ技術の使用を報告している（例えば、Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３７８－６３８２ （１９９０）； Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：４０４－４０６ （１９９０）； Ｓｃｏｔｔ ｅｔａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：３８６－３８８ （１９９０）；及びＬａｄｎｅｒ ｅｔａｌ．，米国特許番号第５，５７１，６９８号参照）。ファージディスプレイ法の基本概念は、ファージＤＮＡによりコードされるポリペプチドと標的抗原との間の物理的結合の定着である。この物理的結合は、ファージ粒子によって提供され、それはポリペプチドをコードするファージゲノムを包含するカプシドの一部としてのポリペプチドを示す。ポリペプチドとそれらの遺伝的な材料との間の物理的結合の定着は、異なるポリペプチドを支持する極めて多くのファージの同時に行うマススクリーニングを可能にする。標的抗原への親和性を有するポリペプチドを提示するファージは、標的抗原に結合し、そしてこれらのファージは標的抗原をスクリーニングする親和性に富んでいる。これらのファージから提示されるポリペプチドの同定は、それらのそれぞれのゲノムから決定されうる。これらの方法を用いて、所望される標的抗原のための結合親和性を有するものとして同定されるポリペプチドは、続いて慣習の手法によりバルク中で合成されうる（例えば米国特許番号第６，０５７，０９８号参照）。
【0069】
これらの方法により産生される抗体は、続いて関心のある精製されるポリペプチド抗原によって親和性及び特異性について第一のスクリーニングにより、必要があれば結合することから除外されることが所望される他のポリペプチド抗原によって抗体の親和性及び特異性への結果と比較することによって、選択される。このスクリーニング手順は、マイクロタイタープレートの別々のウェル内の精製したポリペプチド抗原の固定化を含みうる。潜在的な抗体又は抗体の群を含んでいる溶液は、続いて、対応のマイクロタイターウェル内に加えられ、そして約３０分間～２時間インキュベートされる。そのマイクロタイターウェルを続いて洗浄し、そして標識した二次抗体（例えば、採取した抗体がマウス抗体である場合に、アルカリホスファターゼに結合した抗マウス抗体）はウェルに添加され、約３０分間インキュベートされ、そして続いて洗浄される。基質をウェルに添加すると、固定化したポリペプチド抗原が存在する場合に、呈色反応が現れるだろう。
【0070】
そのように同定される抗体は、続いてさらに親和性及び特異性について分析されうる。標的タンパク質（ＶＣＡＭ－１及び／又はＡ２Ｍ）のためのイムノアッセイの開発において、その精製した標的タンパク質は、選択されている抗体を用いるそのイムノアッセイの感度及び特異度を判断するためのスタンダードとして働く。様々な抗体の結合親和性が異なりうる。例えば、ある抗体の組み合わせはお互いに立体的に干渉しうる。抗体のアッセイ性能はその抗体の絶対的な親和性及び特異性より重要な測定でありうる。
【0071】
当業者は、多くの手法が抗体を産生すること又はフラグメントを結合すること、並びに関心のある様々なポリペプチドについて親和性及び特性についてスクリーニング及び選択することにおいて取られうることを認識するが、これらの手法が本発明の請求の範囲内を変えないことを認識するだろう。
【0072】
Ａ．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関心のあるポリペプチド及びアジュバントの多数回の皮下の（ｓｃ）又は、腹腔内の（ｉｐ）注射によって動物に発現させることが好ましい。関心のあるポリペプチドを、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイクログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターのような、免疫化する種において免疫原性のあるタンパク質担体に、二官能性物質又は誘導体化剤を用いて結合させるために有用でありうる。二官能性物質又は誘導体化剤の限定されない例は、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する結合）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、及びＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを含む（式中、Ｒ及びＲ1は異なるアルキル基である）。
ポリクローナル抗体は、関心のあるポリペプチド及びアジュバントの多数回の皮下の（ｓｃ）又は、腹腔内の（ｉｐ）注射によって動物に発現させることが好ましい。関心のあるポリペプチドを、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイクログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターのような、免疫化する種において免疫原性のあるタンパク質担体に、二官能性物質又は誘導体化剤を用いて結合させるために有用でありうる。二官能性物質又は誘導体化剤の限定されない例は、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する結合）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、及びＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲを含む（式中、Ｒ及びＲ1は異なるアルキル基である）。
【0073】
例えば、（ウサギについて）１００μｇ又は（マウスについて）５μｇの抗原又はコンジュゲートと３倍容量のフロイント完全アジュバントとの組み合わせること及び複数箇所で皮内に溶液を注射することによって関心のあるポリペプチド又は免疫原性コンジュゲート又はその誘導体に対して動物を免疫化する。１ヵ月後、フロイント不完全アジュバント中のポリペプチド又はコンジュゲートを元々の量の約１／５～１／１０を、複数箇所で皮内注射によりブーストをかける。７～１４日後、その動物を出血させ、そしてその血清を抗体タイターについてアッセイした。動物は典型的に、タイターがプラトーになるまでブーストされた。好ましくは、その動物は同じポリペプチドのコンジュゲートによってブーストされるが、異なる免疫原性のタンパク質への結合及び／又は異なる架橋試薬が用いられうる。また、コンジュゲートは、融合タンパク質として組換え細胞培養において作製されうる。場合によっては、凝集剤、例えば硫酸アルミニウムを用いることができ、免疫反応を促進する。
【0074】
Ｂ．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は一般的に実質的に同種の抗体の集団から入手され、すなわち、少量において存在しうるありうる天然に生じる変異を除いて、その集団を含んでいる個々の抗体が同一である。それゆえ、「モノクローナル」という修飾語句は、別々の抗体の混合物でない抗体の性質を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により、又は当業者に既知の任意の組換えＤＮＡ法（米国特許番号第４，８１６，５６７号参照）により記載されるハイブリドーマ法を用いて作製されうる。
モノクローナル抗体は一般的に実質的に同種の抗体の集団から入手され、すなわち、少量において存在しうるありうる天然に生じる変異を除いて、その集団を含んでいる個々の抗体が同一である。それゆえ、「モノクローナル」という修飾語句は、別々の抗体の混合物でない抗体の性質を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により、又は当業者に既知の任意の組換えＤＮＡ法（米国特許番号第４，８１６，５６７号参照）により記載されるハイブリドーマ法を用いて作製されうる。
【0075】
ハイブリドーマ法において、マウス又は他の適当な宿主動物（例えばハムスター）は上記のように免疫化され、免疫化のために用いられる関心のあるポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生する又は産生することが可能であるリンパ球を生じる。一方で、リンパ球はｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫化される。その免疫化したリンパ球は続いて適当な融剤、例えばポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ．５９－１０３（１９８６）参照）。それゆえ調製するハイブリドーマ細胞を、融合していない、親の骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する好ましくは一以上の基質を含む適当な培養培地に播種し、増殖する。例えば、その親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠失している場合に、そのハイブリドーマ細胞の培養培地は、典型的にヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、それはＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻害する。
【0076】
好ましい骨髄腫細胞は、選択される抗体産生細胞により、効率的に融合し、抗体の安定的な高いレベルの産生を支持し、かつ／又はＨＡＴ培地のような培地に感受性があるそれらである。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのそのような好ましい骨髄腫細胞株の例は、これらに限定されないが、マウス骨髄腫株、例えばＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍（Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＰ－２又はＸ６３－Ａｇ８－６５３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤより利用可能）、並びにヒト骨髄腫細胞、又はマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株（例えばＫｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；及びＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．５１－６３（１９８７）参照）より由来したそれらを含む。
【0077】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地は関心のあるポリペプチドに対して向けられるモノクローナル抗体の産生のためにアッセイされうる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により又はｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により決定される。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャードプロットを用いて決定されうる。
【0078】
所望される特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後に、そのクローンは限界希釈法によってサブクローン化することができ、そして標準的な方法により増殖する（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５９－１０３（１９８６）参照）。この目的のための適当な培養培地は、例えば、Ｄ－ＭＥＭ又はＲＰＭＩ－１６４０培地である。加えて、そのハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖されうる。そのサブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、慣習の抗体産生手順、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーにより、培養培地、腹水腫瘍、又は血清から分離されうる。
【0079】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離することができ、慣習の手順（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）を用いてシークエンシングされる。そのハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましいソースとして寄与する。一旦単離されると、そのＤＮＡを発現ベクター内に組み込むことができ、それらは続いて、他に抗体を産生しない、宿主細胞内、例えばＥ．Ｃｏｌｉ細胞、ｓｉｍｉａｎ ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞にトランスフェクションされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を誘導する。例えば、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＩｍｍｕｎｏＬ，５：２５６－２６２（１９９３）；ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，１３０：１５１－１８８（１９９２）参照。また、そのＤＮＡは、例えばヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインについてのコード配列を、同種のマウス配列に置換することによって（米国特許番号第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））又は非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって修飾される。
【0080】
さらなる態様において、モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２４８：５５２－５５４（１９９０）；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）において記載される技術を用いて産生される抗体ファージライブラリーより単離されうる。チェーンシャッフリング（Ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）による（ｎＭ範囲の）高親和性のヒトモノクローナル抗体の産生は、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９－７８３（１９９２）において記載されている。とても大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてコンビナトリアル感染（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の使用及びｉｎ ｖｉｖｏ組換えは、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１：２２６５－２２６６（１９９３）において記載されている。それゆえ、これらの技術は、モノクローナル抗体の産生のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法の実行可能な代替案である。
【0081】
ヒト化への代替として、ヒト抗体を産生しうる。ある態様において、免疫化で、内因性の免疫グロブリン産生の存在なしにヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製しうる。例えば、キメラにおける重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子の抗体のホモ接合性の欠失及びｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ変異マウスが、内因性の抗体産生の完全な阻害をもたらすことを記載している。そのようなｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ変異マウスにおけるヒトｇｅｒｍ－ｌｉｎｅ免疫グロブリン遺伝子配列の移動は、抗原チャレンジで、ヒト抗体の産生をもたらすだろう。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５－２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，７：３３（１９９３）；並びに米国特許番号第５，５９１，６６９号，第５，５８９，３６９号及び第５，５４５，８０７号参照。
【0082】
一方で、ファージディスプレイ技術（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５３（１９９０））を、免疫化していないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体及び抗体フラグメントを産生するために用いうる。本技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄのような、繊維状ファージのメジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子内にインフレームでクローン化し、そしてファージ粒子の表面上の機能的な抗体フラグメントとして提示した。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、また、抗体の機能的な性質に基づく選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。それゆえ、そのファージはＢ細胞のいくつかの特性をまねる。ファージディスプレイは、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：５６４－５７１（１９９３）において記載されるように、様々な型において実施されうる。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかのソースはファージディスプレイのために用いられうる。例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）参照。免疫化してないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、そしてＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１－５９７（１９９１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１２：７２５－７３４（１９９３）；及び、米国特許番号第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号において記載される技術に本質的に従い、（自己抗体を含む）多様な配列の抗原への抗体を単離しうる。
【0083】
場合によっては、ヒト抗体を、例えば米国特許番号第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号において記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏの活性化したＢ細胞によって産生しうる。
【0084】
Ｃ．抗体フラグメント
抗体フラグメントの産生のための様々な技術が開発されている。伝統的に、これらのフラグメントは未処理の抗体のタンパク分解を介して由来された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．，２４：１０７－１１７（１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））。しかしながら、これらのフラグメントは、現在組換え宿主細胞を用いて直接的に産生されうる。例えば、その抗体フラグメントは、上記の抗体ファージライブラリーから分離されうる。一方で、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントはＥ．Ｃｏｌｉ細胞から直接的に回収することができ、化学的に結合し、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを形成した（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３－１６７（１９９２）参照）。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを組換え宿主細胞培養から直接的に単離しうる。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に明らかであるだろう。他の態様において、選択した抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。例えばＰＣＴ Ｐｕｂｌｃｉａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ９３／１６１８５；及び米国特許番号第５，５７１，８９４号及び５，５８７，４５８号参照。また、その抗体フラグメントは、例えば米国特許番号第５，６４１，８７０号に記載されるように線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）でありうる。そのような線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）フラグメントは、単一特異的な又は二重特異的でありうる。
抗体フラグメントの産生のための様々な技術が開発されている。伝統的に、これらのフラグメントは未処理の抗体のタンパク分解を介して由来された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈ．，２４：１０７－１１７（１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））。しかしながら、これらのフラグメントは、現在組換え宿主細胞を用いて直接的に産生されうる。例えば、その抗体フラグメントは、上記の抗体ファージライブラリーから分離されうる。一方で、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントはＥ．Ｃｏｌｉ細胞から直接的に回収することができ、化学的に結合し、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを形成した（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３－１６７（１９９２）参照）。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを組換え宿主細胞培養から直接的に単離しうる。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に明らかであるだろう。他の態様において、選択した抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。例えばＰＣＴ Ｐｕｂｌｃｉａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ ９３／１６１８５；及び米国特許番号第５，５７１，８９４号及び５，５８７，４５８号参照。また、その抗体フラグメントは、例えば米国特許番号第５，６４１，８７０号に記載されるように線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）でありうる。そのような線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）フラグメントは、単一特異的な又は二重特異的でありうる。
【0085】
Ｄ．抗体精製
組換え技術を用いる場合に、抗体は、単離した宿主細胞内、宿主細胞の細胞周辺腔で産生され、又は直接的に宿主細胞から培地内に分泌されうる。抗体が細胞内に産生される場合に、その微粒子のデブリは、例えば、遠心分離又は限外ろ過により、第一に除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈ．，１０：１６３－１６７（１９９２）は、Ｅ．Ｃｏｌｉの細胞周辺腔内に分泌される抗体を単離することのための手順を記載している。簡潔に、細胞ペーストは酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）内で約３０分間解凍した。細胞デブリを遠心分離によって除去した。抗体が培地内に分泌される場合に、そのような発現システムからの上清は、商用利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｕｎｉｔを用いて、一般的に濃縮される。いずれの上述のステップにおいてもＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害薬を、タンパク分解を阻害するために含むことができ、そして、偶発的な混入物質の増殖を阻害するために抗生物質が含まれうる。
組換え技術を用いる場合に、抗体は、単離した宿主細胞内、宿主細胞の細胞周辺腔で産生され、又は直接的に宿主細胞から培地内に分泌されうる。抗体が細胞内に産生される場合に、その微粒子のデブリは、例えば、遠心分離又は限外ろ過により、第一に除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈ．，１０：１６３－１６７（１９９２）は、Ｅ．Ｃｏｌｉの細胞周辺腔内に分泌される抗体を単離することのための手順を記載している。簡潔に、細胞ペーストは酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）内で約３０分間解凍した。細胞デブリを遠心分離によって除去した。抗体が培地内に分泌される場合に、そのような発現システムからの上清は、商用利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｕｎｉｔを用いて、一般的に濃縮される。いずれの上述のステップにおいてもＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害薬を、タンパク分解を阻害するために含むことができ、そして、偶発的な混入物質の増殖を阻害するために抗生物質が含まれうる。
【0086】
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを用いて精製されうる。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、任意の抗体内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために用いられうる（例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，６２：１－１３（１９８３）参照）。プロテインＧは全てのマウスのアイソタイプ及びヒトγ３のために推奨される（例えば、Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，５：１５６７－１５７５（１９８６））。アフィニティリガンドが結合されるマトリックスはほとんどの場合は、アガロースであるが、他のマトリックスは利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば多孔性ガラス粉体（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースによってもたらされうるよりもより早い流速及びより短い処理時間を可能にする。その抗体がＣＨ３ドメインを含む場合に、そのＢａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ；Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）は精製のために有用である。また、タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラムの分画、エタノール沈殿、シリカの逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂のクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマト分画、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿は、回収される抗体に依存して利用可能である。
【0087】
任意の前精製ステップ後に、関心のある抗体及び混入物質を含む混合物は、約２．５～４．５の間のｐＨで溶出バッファーを用いて、低ｐＨの疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけられ、好ましくは低塩濃度で実施されうる（例えば約０～０．２５Ｍの塩）。
【0088】
Ｅ．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープについて結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体は全長の抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重標識抗体）として調製されうる。
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープについて結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体は全長の抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重標識抗体）として調製されうる。
【0089】
二重特異性抗体を作製することのための方法は、当該分野で既知である。全長の二重標識抗体の伝統的な産生は、二つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づき、ここでその二つの鎖は異なる特異性を有する（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７－５３９（１９８３）参照）。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の任意組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、ただ一つが正しい二重特異性構造を有する１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生する。正しい分子の精製はアフィニティークロマトグラフィーを用いて実施される。同様の手順はＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５－３６５９（１９９１）に記載されている。
【0090】
異なるアプローチに従い、所望される結合特異性（抗体－抗原結合部）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。その融合物は好ましくは免疫グロブリン重鎖定常ドメイン内であり、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも１つの部分を含んでいる。少なくとも１つの融合物内に存在する軽鎖結合のために必要とされる部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物をコードするＤＮＡ及び、所望されれば、その免疫グロブリン軽鎖は、別々の発現ベクター内に挿入され、そして適当な宿主組織内でコトランスフェクトされる。これは、構造内で同じでない比率の３つのポリペプチド鎖が用いられる場合に、３つのポリペプチドフラグメントのお互いの位置を調製することにおける大きな柔軟性を提供し、最適な収率を提供する。しかしながら、等しい比率における２つ又は３つ全てのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合に、又はその比率が特に重要でない場合に、一の発現ベクター内に２又は３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【0091】
このアプローチの一の態様において、二重特異性抗体は、一つのアーム内に第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他のアーム内に第二の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖－軽鎖を含む。この非対称構造は、所望しない免疫グロブリン鎖結合から、所望される二重特異性化合物の分離を促進し、二重特異性分子の半分の免疫グロブリン軽鎖のみの存在が、分離の容易な方法について提供する。例えば、ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＷＯ９４／０４６９０及びＳｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：２１０（１９８６）参照。
【0092】
米国特許番号第５，７３１，１６８号において記載される別のアプローチに従い、対の抗体分子間の界面を操作することができ、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合を最大化した。その好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一つの部分を含む。この方法において、第一の抗体分子の界面からの一以上の小さなアミノ酸側鎖はより大きな側鎖によって置換される（例えば、チロシン、又はトリプトファン）。より大きな側鎖への同一又は同様のサイズの代わりの「空洞」が、より大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）に置き換えることによって、第二の抗体分子の界面に作られる。これは、他の所望されない最終産物、例えばホモダイマーよりもヘテロダイマーの収率を増加させることについて提供する。
【0093】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一つは、アビジンに、他のものはビオチンに結合されうる。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の慣習の架橋方法を用いて作製されうる。適当な架橋剤及び技術は当該分野で周知であり、そして例えば、米国特許番号第４，６７６，９８０号において開示されている。
【0094】
また、抗体フラグメントからの二重特異性抗体を産生することのための適当な技術は当該技術分野で既知である。例えば、二重特異性抗体は化学結合を用いて調製されうる。場合によっては、二重特異性抗体は、未処理の抗体をタンパク質分解活性的に開裂し、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを産生する手順によって産生されうる（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤である、亜ヒ酸ナトリウムの存在下において還元され、周辺のジチオールを安定させ、そして分子間のジスルフィド形成を防ぐ。産生されるＦａｂ’フラグメントは続いて、チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’－ＴＮＢ誘導体の一つは、続いて、Ｆａｂ’－チオールへとメルカプトエチルアミンによる還元によって再変換され、そして他のＦａｂ’－ＴＮＢ誘導体の等モル量によって混合され、二重特異性抗体を形成する。
【0095】
ある態様において、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントは、Ｅ．Ｃｏｌｉより直接的に回収され、そして化学的に結合し、二重特異性抗体を形成する。例えば、十分にヒト化した二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）2分子は、Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７－２２５（１９９２）において記載される方法によって産生されうる。各Ｆａｂ’ｓフラグメントを、Ｅ．Ｃｏｌｉより別々に分泌し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで方向性のある化学結合（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）にかけ、二重特異性抗体を形成する。
【0096】
また、組換え細胞培養物からの直接的な二重特異性抗体フラグメントを作製する及び単離するための様々な技術が記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて作製されている。例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７－１５５３（１９９２）参照。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ’ｓ部位に連結した。その抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元し、モノマーを形成させ、そして続いて再酸化し、抗体ヘテロダイマーを形成させた。また、この方法は、抗体ホモダイマーの産生のために利用されうる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）により記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製することのための代わりのメカニズムを提供した。そのフラグメントは、短すぎるために同じ鎖上の二つのドメイン間の対形成ができないリンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。従って、一つのフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬ及びＶＨドメインによってペアを強制され、それによって二つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメントを作製するための別の戦略は、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）に記載されている。
【0097】
また、二以上の結合値を有する抗体が考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製しうる。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ，，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：６０（１９９１）参照。
【0098】
ＩＩＩ．血管細胞接着タンパク質１（ＶＣＡＭ－１）
ＶＣＡＭ－１は、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球の血管内皮への接着を促進する膜貫通型細胞接着タンパク質である。サイトカインによる血管内皮細胞におけるＶＣＡＭ－１のアップレギュレーションは、（例えば腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）及びインターロイキン－１（ＩＬ－１）への反応において、）増加した遺伝子転写の結果として生じる。ＶＣＡＭ－１は血管細胞接着分子１遺伝子（ＶＣＡＭ－１；Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ：７４１２）によりコードされ、そして転写の選択的スプライシング後に産生され（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０７８（バリアント１）又はＮＭ＿０８０６８２（バリアント２））、そして前駆ポリペプチドスプライスアイソフォーム（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ ００１０６９（アイソフォームａ）又はＮＰ＿５４２４１３（アイソフォームｂ））を処理する。
ＶＣＡＭ－１は、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球の血管内皮への接着を促進する膜貫通型細胞接着タンパク質である。サイトカインによる血管内皮細胞におけるＶＣＡＭ－１のアップレギュレーションは、（例えば腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα）及びインターロイキン－１（ＩＬ－１）への反応において、）増加した遺伝子転写の結果として生じる。ＶＣＡＭ－１は血管細胞接着分子１遺伝子（ＶＣＡＭ－１；Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ：７４１２）によりコードされ、そして転写の選択的スプライシング後に産生され（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０７８（バリアント１）又はＮＭ＿０８０６８２（バリアント２））、そして前駆ポリペプチドスプライスアイソフォーム（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ ００１０６９（アイソフォームａ）又はＮＰ＿５４２４１３（アイソフォームｂ））を処理する。
【0099】
ヒトＶＣＡＭ－１ポリペプチド配列はＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０６９に記述されている。ヒトＶＣＡＭ－１ ｍＲＮＡ（コード）配列は、例えばＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１０７８に記載されている。当業者は、ＶＣＡＭ－１がＶＣＡＭ－１、Ｖ－ＣＡＭ１、ＩＮＣＡＭ－１００、ＣＤ抗原１０６、分化抗原群１０６、及びＣＤ１０６として既知であることを理解するだろう。
【0100】
ある側面において、本明細書に記載される方法は、ＶＣＡＭ－１を測定するかつ／又は検出するために用いられる。ある側面において、ＶＣＡＭ－１の濃度又はレベルは測定される。ある側面において、ＶＣＡＭ－１が測定される生物学的試料は、全血である。
【0101】
ある側面において、ＶＣＡＭ－１の濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬ～約１５００ｎｇ／ｍＬである。ある側面において、ＶＣＡＭ－１の濃度は、約１００ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４１０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ、４３０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、４６０ｎｇ／ｍＬ、４７０ｎｇ／ｍＬ、４８０ｎｇ／ｍＬ、４９０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、５１０ｎｇ／ｍＬ、５２０ｎｇ／ｍＬ、５３０ｎｇ／ｍＬ、５４０ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、５６０ｎｇ／ｍＬ、５７０ｎｇ／ｍＬ、５８０ｎｇ／ｍＬ、５９０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、６１０ｎｇ／ｍＬ、６２０ｎｇ／ｍＬ、６３０ｎｇ／ｍＬ、６４０ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、６６０ｎｇ／ｍＬ、６７０ｎｇ／ｍＬ、６８０ｎｇ／ｍＬ、６９０ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７１０ｎｇ／ｍＬ、７２０ｎｇ／ｍＬ、７３０ｎｇ／ｍＬ、７４０ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、７６０ｎｇ／ｍＬ、７７０ｎｇ／ｍＬ、７８０ｎｇ／ｍＬ、７９０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８１０ｎｇ／ｍＬ、８２０ｎｇ／ｍＬ、８３０ｎｇ／ｍＬ、８４０ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、８６０ｎｇ／ｍＬ、８７０ｎｇ／ｍＬ、８８０ｎｇ／ｍＬ、８９０ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９１０ｎｇ／ｍＬ、９２０ｎｇ／ｍＬ、９３０ｎｇ／ｍＬ、９４０ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、９６０ｎｇ／ｍＬ、９７０ｎｇ／ｍＬ、９８０ｎｇ／ｍＬ、９９０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１０１０ｎｇ／ｍＬ、１０２０ｎｇ／ｍＬ、１０３０ｎｇ／ｍＬ、１０４０ｎｇ／ｍＬ、１０５０ｎｇ／ｍＬ、１０６０ｎｇ／ｍＬ、１０７０ｎｇ／ｍＬ、１０８０ｎｇ／ｍＬ、１０９０ｎｇ／ｍＬ、１１００ｎｇ／ｍＬ、１１１０ｎｇ／ｍＬ、１１２０ｎｇ／ｍＬ、１１３０ｎｇ／ｍＬ、１１４０ｎｇ／ｍＬ、１１５０ｎｇ／ｍＬ、１１６０ｎｇ／ｍＬ、１１７０ｎｇ／ｍＬ、１１８０ｎｇ／ｍＬ、１１９０ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１２１０ｎｇ／ｍＬ、１２２０ｎｇ／ｍＬ、１２３０ｎｇ／ｍＬ、１２４０ｎｇ／ｍＬ、１２５０ｎｇ／ｍＬ、１２６０ｎｇ／ｍＬ、１２７０ｎｇ／ｍＬ、１２８０ｎｇ／ｍＬ、１２９０ｎｇ／ｍＬ、１３００ｎｇ／ｍＬ、１３１０ｎｇ／ｍＬ、１３２０ｎｇ／ｍＬ、１３３０ｎｇ／ｍＬ、１３４０ｎｇ／ｍＬ、１３５０ｎｇ／ｍＬ、１３６０ｎｇ／ｍＬ、１３７０ｎｇ／ｍＬ、１３８０ｎｇ／ｍＬ、１３９０ｎｇ／ｍＬ、１４００ｎｇ／ｍＬ、１４１０ｎｇ／ｍＬ、１４２０ｎｇ／ｍＬ、１４３０ｎｇ／ｍＬ、１４４０ｎｇ／ｍＬ、１４５０ｎｇ／ｍＬ、１４６０ｎｇ／ｍＬ、１４７０ｎｇ／ｍＬ、１４８０ｎｇ／ｍＬ、１４９０ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬである。
【0102】
ある側面において、ＶＣＡＭ－１の通常のコントロール濃度又は参照値は、約１００～約５００ｎｇ／ｍＬである。ある側面において、ＶＣＡＭ－１の量は、約１００ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、１２０ｎｇ／ｍＬ、１３０ｎｇ／ｍＬ、１４０ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１６０ｎｇ／ｍＬ、１７０ｎｇ／ｍＬ、１８０ｎｇ／ｍＬ、１９０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２１０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬ、２３０ｎｇ／ｍＬ、２４０ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、２６０ｎｇ／ｍＬ、２７０ｎｇ／ｍＬ、２８０ｎｇ／ｍＬ、２９０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３１０ｎｇ／ｍＬ、３２０ｎｇ／ｍＬ、３３０ｎｇ／ｍＬ、３４０ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、３６０ｎｇ／ｍＬ、３７０ｎｇ／ｍＬ、３８０ｎｇ／ｍＬ、３９０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４１０ｎｇ／ｍＬ、４２０ｎｇ／ｍＬ、４３０ｎｇ／ｍＬ、４４０ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、４６０ｎｇ／ｍＬ、４７０ｎｇ／ｍＬ、４８０ｎｇ／ｍＬ、４９０ｎｇ／ｍＬ、又は５００ｎｇ／ｍＬである。
【0103】
ある側面において、生物学的な試料におけるＶＣＡＭ－１の濃度は、通常のコントロール濃度のＶＣＡＭ－１よりも少なくとも１０％～約６０％高い場合に上昇されたとみなされる。ある側面において、生物学的な試料のＶＣＡＭ－１の濃度は、通常のコントロール濃度のＶＣＡＭ－１よりも少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、及び／又は６０％高い場合に上昇されたとみなされる。ある側面において、生物学的な試料におけるＶＣＡＭ－１の濃度は、少なくとも５５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも５６０ｎｇ／ｍＬ、５７０ｎｇ／ｍＬ、５８０ｎｇ／ｍＬ、５９０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、６１０ｎｇ／ｍＬ、６２０ｎｇ／ｍＬ、６３０ｎｇ／ｍＬ、６４０ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、６６０ｎｇ／ｍＬ、６７０ｎｇ／ｍＬ、６８０ｎｇ／ｍＬ、６９０ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７１０ｎｇ／ｍＬ、７２０ｎｇ／ｍＬ、７３０ｎｇ／ｍＬ、７４０ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、７６０ｎｇ／ｍＬ、７７０ｎｇ／ｍＬ、７８０ｎｇ／ｍＬ、７９０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８１０ｎｇ／ｍＬ、８２０ｎｇ／ｍＬ、８３０ｎｇ／ｍＬ、８４０ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、８６０ｎｇ／ｍＬ、８７０ｎｇ／ｍＬ、８８０ｎｇ／ｍＬ、８９０ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９１０ｎｇ／ｍＬ、９２０ｎｇ／ｍＬ、９３０ｎｇ／ｍＬ、９４０ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、９６０ｎｇ／ｍＬ、９７０ｎｇ／ｍＬ、９８０ｎｇ／ｍＬ、９９０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１０１０ｎｇ／ｍＬ、１０２０ｎｇ／ｍＬ、１０３０ｎｇ／ｍＬ、１０４０ｎｇ／ｍＬ、１０５０ｎｇ／ｍＬ、１０６０ｎｇ／ｍＬ、１０７０ｎｇ／ｍＬ、１０８０ｎｇ／ｍＬ、１０９０ｎｇ／ｍＬ、１１００ｎｇ／ｍＬ、１１１０ｎｇ／ｍＬ、１１２０ｎｇ／ｍＬ、１１３０ｎｇ／ｍＬ、１１４０ｎｇ／ｍＬ、１１５０ｎｇ／ｍＬ、１１６０ｎｇ／ｍＬ、１１７０ｎｇ／ｍＬ、１１８０ｎｇ／ｍＬ、１１９０ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１２１０ｎｇ／ｍＬ、１２２０ｎｇ／ｍＬ、１２３０ｎｇ／ｍＬ、１２４０ｎｇ／ｍＬ、１２５０ｎｇ／ｍＬ、１２６０ｎｇ／ｍＬ、１２７０ｎｇ／ｍＬ、１２８０ｎｇ／ｍＬ、１２９０ｎｇ／ｍＬ、１３００ｎｇ／ｍＬ、１３１０ｎｇ／ｍＬ、１３２０ｎｇ／ｍＬ、１３３０ｎｇ／ｍＬ、１３４０ｎｇ／ｍＬ、１３５０ｎｇ／ｍＬ、１３６０ｎｇ／ｍＬ、１３７０ｎｇ／ｍＬ、１３８０ｎｇ／ｍＬ、１３９０ｎｇ／ｍＬ、１４００ｎｇ／ｍＬ、１４１０ｎｇ／ｍＬ、１４２０ｎｇ／ｍＬ、１４３０ｎｇ／ｍＬ、１４４０ｎｇ／ｍＬ、１４５０ｎｇ／ｍＬ、１４６０ｎｇ／ｍＬ、１４７０ｎｇ／ｍＬ、１４８０ｎｇ／ｍＬ、１４９０ｎｇ／ｍＬ、又は１５００ｎｇ／ｍＬ）である場合に上昇されたとみなされる。
【0104】
ある態様において、その生物学的な試料におけるＶＣＡＭ－１濃度は、少なくとも６５０ｎｇ／ｍＬ～１５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、６６０ｎｇ／ｍＬ、６７０ｎｇ／ｍＬ、６８０ｎｇ／ｍＬ、６９０ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７１０ｎｇ／ｍＬ、７２０ｎｇ／ｍＬ、７３０ｎｇ／ｍＬ、７４０ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、７６０ｎｇ／ｍＬ、７７０ｎｇ／ｍＬ、７８０ｎｇ／ｍＬ、７９０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８１０ｎｇ／ｍＬ、８２０ｎｇ／ｍＬ、８３０ｎｇ／ｍＬ、８４０ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、８６０ｎｇ／ｍＬ、８７０ｎｇ／ｍＬ、８８０ｎｇ／ｍＬ、８９０ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９１０ｎｇ／ｍＬ、９２０ｎｇ／ｍＬ、９３０ｎｇ／ｍＬ、９４０ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、９６０ｎｇ／ｍＬ、９７０ｎｇ／ｍＬ、９８０ｎｇ／ｍＬ、９９０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１０１０ｎｇ／ｍＬ、１０２０ｎｇ／ｍＬ、１０３０ｎｇ／ｍＬ、１０４０ｎｇ／ｍＬ、１０５０ｎｇ／ｍＬ、１０６０ｎｇ／ｍＬ、１０７０ｎｇ／ｍＬ、１０８０ｎｇ／ｍＬ、１０９０ｎｇ／ｍＬ、１１００ｎｇ／ｍＬ、１１１０ｎｇ／ｍＬ、１１２０ｎｇ／ｍＬ、１１３０ｎｇ／ｍＬ、１１４０ｎｇ／ｍＬ、１１５０ｎｇ／ｍＬ、１１６０ｎｇ／ｍＬ、１１７０ｎｇ／ｍＬ、１１８０ｎｇ／ｍＬ、１１９０ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ、１２１０ｎｇ／ｍＬ、１２２０ｎｇ／ｍＬ、１２３０ｎｇ／ｍＬ、１２４０ｎｇ／ｍＬ、１２５０ｎｇ／ｍＬ、１２６０ｎｇ／ｍＬ、１２７０ｎｇ／ｍＬ、１２８０ｎｇ／ｍＬ、１２９０ｎｇ／ｍＬ、１３００ｎｇ／ｍＬ、１３１０ｎｇ／ｍＬ、１３２０ｎｇ／ｍＬ、１３３０ｎｇ／ｍＬ、１３４０ｎｇ／ｍＬ、１３５０ｎｇ／ｍＬ、１３６０ｎｇ／ｍＬ、１３７０ｎｇ／ｍＬ、１３８０ｎｇ／ｍＬ、１３９０ｎｇ／ｍＬ、１４００ｎｇ／ｍＬ、１４１０ｎｇ／ｍＬ、１４２０ｎｇ／ｍＬ、１４３０ｎｇ／ｍＬ、１４４０ｎｇ／ｍＬ、１４５０ｎｇ／ｍＬ、１４６０ｎｇ／ｍＬ、１４７０ｎｇ／ｍＬ、１４８０ｎｇ／ｍＬ、１４９０ｎｇ／ｍＬ、又は１５００ｎｇ／ｍＬ）である場合に上昇されたとみなされる。
【0105】
ある態様において、生物学的な試料におけるＶＣＡＭ－１の濃度は、それが６５０ｎｇ／ｍＬ～１５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、６５０ｎｇ／ｍＬ～１４００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ～１３００ｎｇ、６５０ｎｇ／ｍＬ～１２００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ～１１００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ～９００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ～８００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ～７００ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ～１５００ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ～１５００ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ～１５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ～１５００ｎｇ／ｍＬ、１１００ｎｇ／ｍＬ～１５００ｎｇ／ｍＬ、１２００ｎｇ／ｍＬ～１５００ｎｇ／ｍＬ、１３００ｎｇ／ｍＬ～１５００ｎｇ／ｍＬ、又は１４００ｎｇ／ｍＬ～１５００ｎｇ／ｍＬ）である場合に上昇したとみなされる。
【0106】
ある側面において、本明細書の方法は、対象から収集した血液中に含まれるＶＣＡＭ－１の量を測定すること；及びその対象がＶＣＡＭ－１の量が上昇されるか又は参照値よりも高い場合にＮＡＳＨにより影響を受けるか又は影響を受ける可能性があることを決定することによって、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）との間を区別するために用いられる。
【0107】
ある側面において、本明細書の方法は、対象から収集した血液中に含まれるＶＣＡＭ－１の量を測定すること；及びＶＣＡＭ－１の量が上昇されるか又は参照値よりも高い場合に、対象が肝繊維症の症状を有する又は有しうることを決定することによって、肝繊維症のような繊維症の存在を決定するために用いられうる。
【0108】
ある側面において、本明細書の方法は、ＶＣＡＭ－１の量が参照値よりも高い場合に対象から収集した血液中に含まれるＶＣＡＭ－１の量を測定することによって、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の症状の進行の程度を決定するために用いられうる。
【0109】
ある側面において、本明細書の方法は、ＶＣＡＭ－１のレベルを監視することによって、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨの症状の進行の程度を決定するために用いられうる。
【0110】
α２－マクログロブリン（Ａ２Ｍ）
Ａ２Ｍは、抗タンパク分解酵素として主に作用し、かつ様々なタンパク質分解酵素を不活化できる血中に見られる血漿タンパク質である。例えば、プラスミン及びカリクレインを阻害することによって繊維素溶解の阻害薬として機能する。それは、トロンビンを阻害することによって凝固の阻害薬として働く。さらに、Ａ２Ｍは、また多数の成長因子及びサイトカイン、例えば血小板由来増殖因子、塩基性線維芽細胞成長因子、ＴＧＦ－β、インスリン、及びＩＬ－１βと結合するので、時々、担体タンパク質として作用する。Ａ２Ｍは主に肝臓により産生され、かつまた、マクロファージ、線維芽細胞、及び副腎皮質細胞により局所的に合成される。ヒトにおいて、それはＡ２Ｍ遺伝子によりコードされる。Ａ２Ｍ＿ＨＵＭＡＮ、受入番号Ｐ０１０２３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。Ａ２Ｍは１４７４アミノ酸及び約７２０ｋＤａの分子量を有する。ヒトＡ２Ｍ ｍＲＮＡ（コード）配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号ＮＭ＿０００１４．５において記載される。当業者は、また、Ａ２ＭがＡ２ＭＤ、ＣＰＡＭＤ５、ＦＷＰ００７、Ｓ８６３－７、又はトランスクプレインとして既知であることを理解するだろう。
Ａ２Ｍは、抗タンパク分解酵素として主に作用し、かつ様々なタンパク質分解酵素を不活化できる血中に見られる血漿タンパク質である。例えば、プラスミン及びカリクレインを阻害することによって繊維素溶解の阻害薬として機能する。それは、トロンビンを阻害することによって凝固の阻害薬として働く。さらに、Ａ２Ｍは、また多数の成長因子及びサイトカイン、例えば血小板由来増殖因子、塩基性線維芽細胞成長因子、ＴＧＦ－β、インスリン、及びＩＬ－１βと結合するので、時々、担体タンパク質として作用する。Ａ２Ｍは主に肝臓により産生され、かつまた、マクロファージ、線維芽細胞、及び副腎皮質細胞により局所的に合成される。ヒトにおいて、それはＡ２Ｍ遺伝子によりコードされる。Ａ２Ｍ＿ＨＵＭＡＮ、受入番号Ｐ０１０２３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。Ａ２Ｍは１４７４アミノ酸及び約７２０ｋＤａの分子量を有する。ヒトＡ２Ｍ ｍＲＮＡ（コード）配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号ＮＭ＿０００１４．５において記載される。当業者は、また、Ａ２ＭがＡ２ＭＤ、ＣＰＡＭＤ５、ＦＷＰ００７、Ｓ８６３－７、又はトランスクプレインとして既知であることを理解するだろう。
【0111】
ある側面において本明細書に記載される方法は、Ａ２Ｍを測定する及び／又は検出するために用いられる。ある側面において、Ａ２Ｍの濃度又はレベルは測定される。ある側面において、Ａ２Ｍが測定される生物学的な試料は全血である。
【0112】
ある側面において、Ａ２Ｍの濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬである。ある態様において、Ａ２Ｍの濃度は、約０．０９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．１１ｍｇ／ｍＬ、０．１２ｍｇ／ｍＬ、０．１４ｍｇ／ｍＬ、０．１６ｍｇ／ｍＬ、０．１８ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、２．２ｍｇ／ｍＬ、２．４ｍｇ／ｍＬ、２．６ｍｇ／ｍＬ、２．８ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、３．２ｍｇ／ｍＬ、３．４ｍｇ／ｍＬ、３．６ｍｇ／ｍＬ、３．８ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、４．２ｍｇ／ｍＬ、４．４ｍｇ／ｍＬ、４．６ｍｇ／ｍＬ、４．８ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、５．２ｍｇ／ｍＬ、５．４ｍｇ／ｍＬ、５．６ｍｇ／ｍＬ、５．８ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、６．２ｍｇ／ｍＬ、６．４ｍｇ／ｍＬ、６．６ｍｇ／ｍＬ、６．８ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、７．２ｍｇ／ｍＬ、７．４ｍｇ／ｍＬ、７．６ｍｇ／ｍＬ、７．８ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、８．２ｍｇ／ｍＬ、８．４ｍｇ／ｍＬ、８．６ｍｇ／ｍＬ、８．８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、９．２ｍｇ／ｍＬ、９．４ｍｇ／ｍＬ、９．６ｍｇ／ｍＬ、９．８ｍｇ／ｍＬ、又は１０ｍｇ／ｍＬである。
【0113】
ある側面において、Ａ２Ｍの通常のコントロール濃度又は参照値は、約１ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬである。ある態様において、Ａ２Ｍの通常のコントロール濃度は、約０．９ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、１．１ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、２．２ｍｇ／ｍＬ、２．４ｍｇ／ｍＬ、２．６ｍｇ／ｍＬ、２．８ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、３．２ｍｇ／ｍＬ、３．４ｍｇ／ｍＬ、３．６ｍｇ／ｍＬ、３．８ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、４．２ｍｇ／ｍＬ、４．４ｍｇ／ｍＬ、４．６ｍｇ／ｍＬ、４．８ｍｇ／ｍＬ、又は５ｍｇ／ｍＬである。
【0114】
ある側面において、生物学的な試料におけるＡ２Ｍの濃度は、Ａ２Ｍの通常のコントロール濃度よりも少なくとも１０％～約６０％高い場合に上昇したとみなされる。ある側面において、その生物学的な試料において、Ａ２Ｍの濃度は、Ａ２Ｍの通常のコントロール濃度よりも少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％及び／又は６０％である場合に上昇したとみなされる。ある側面において、生物学的な試料のＡ２Ｍの濃度は、少なくとも５．５ｍｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも５．６ｍｇ／ｍＬ、５．７ｍｇ／ｍＬ、５．８ｍｇ／ｍＬ、５．９ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、６．５ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、９．５ｍｇ／ｍＬ、又は１０ｍｇ／ｍＬ）である場合に上昇したとみなされる。ある態様において、生物学的な試料におけるＡ２Ｍの濃度は、少なくとも６．５ｍｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも６．６ｍｇ／ｍＬ、６．７ｍｇ／ｍＬ、６．８ｍｇ／ｍＬ、６．９ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、７．５ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、８．５ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、９．５ｍｇ／ｍＬ、又は１０ｍｇ／ｍＬ）である場合に上昇したとみなされる。
【0115】
ある側面において、本明細書の方法は、対象から収集した血液中に含まれるＡ２Ｍの量を測定すること；及びその対象がＡ２Ｍの量が上昇されるか又は参照値よりも高い場合にＮＡＳＨにより影響を受けるか又は影響を受ける可能性があることを決定することによって、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）との間を区別するために用いられる。
【0116】
ある側面において、本明細書の方法は、対象から収集した血液中に含まれるＡ２Ｍの量を測定すること；及び対照がＡ２Ｍの量が上昇されるか又は参照値よりも高い場合に、肝繊維症の症状を有する又は有しうることを決定することによって、肝繊維症のような繊維症の存在を決定するために用いられうる。
【0117】
ある側面において、本明細書の方法は、Ａ２Ｍの量が参照値よりも高い場合に対象から収集した血液中に含まれるＡ２Ｍの量を測定することによって、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の症状の進行の程度を決定するために用いられうる。
【0118】
ある側面において、本明細書の方法は、Ａ２Ｍのレベルを監視することによって、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨの症状の進行の程度を決定するために用いられうる。
【0119】
Ｖ．装置
様々な計器及び装置は本開示における使用のために適当である。多くの分光光度計は蛍光を測定する可能性を有する。蛍光は、ある波長での光エネルギーの分子吸収であり、そのほぼ瞬時に別の、より長い波長で再発光する。いくつかの分子蛍光は天然的に、かつ他のものは、蛍光を発するために修飾されうる。
様々な計器及び装置は本開示における使用のために適当である。多くの分光光度計は蛍光を測定する可能性を有する。蛍光は、ある波長での光エネルギーの分子吸収であり、そのほぼ瞬時に別の、より長い波長で再発光する。いくつかの分子蛍光は天然的に、かつ他のものは、蛍光を発するために修飾されうる。
【0120】
蛍光分光光度計又は蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）、蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）、又は蛍光分光計は、キセノン閃光電球のような光源による照明後、異なる波長で試料から発光される蛍光を測定する。蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）は、（それらの波長がことなる）異なる有色の蛍光シグナル、例えば、緑色及び青色、又は紫外及び青色のチャネルを測定するための異なるチャネルを有しうる。ある側面において、適当な装置は、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）試験を実施するための能力を含む。
【0121】
適当な蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）は、キュベット、キャピラリ、ペトリ皿、及びマイクロプレートを含む、異なる方法において試料を保ちうる。本明細書で記載されるアッセイは、任意のこれらの型の装置で実施されうる。ある側面において、その装置は、任意のマイクロプレートリーダーを有し、最大３８４ウェルプレートにおいて発光のスキャンを可能にしている。試料を保つ使用のために適当な他のモデルは、適所に表面張力を有する。
【0122】
時間分解蛍光（ＴＲＦ）測定は、蛍光強度測定と類似している。しかしながら、一つの違いは、励起／測定プロセスのタイミングである。蛍光強度を測定する場合に、その励起及び発光プロセスは、同時である：試料によって発光される光は、励起が行われている間に測定される。発光システムは検出器に到達する前に励起光を除くことで非常に効率的であるにもかかわらず、発光の量と比較して励起光の量は、蛍光強度測定が上昇したバックグラウンドシグナルを示すようである。本開示は、この問題点への解決を提供する。時間分解ＦＲＥＴは、最も標準的な蛍光染色剤（例えばフルオレセイン）が、励起後数ナノ秒において発光するのに対して、励起後（数ミリ秒において測定される）長期間にわたって発光する性質を有する特定の蛍光分子の使用に依存する。結果として、パルス光源（例えばキセノン閃光電球又はパルスレーザー）を用いてランタニドクリプテートを励起し、そして励起パルス後に測定することが可能である。
【0123】
抗体に結合したドナー及びアクセプター蛍光化合物が、共に近づくと、エネルギー移動がドナー化合物からアクセプター化合物へともたらされ、ドナー化合物により発光される蛍光シグナルの減少及びアクセプター化合物により発光されるシグナルの増加をもたらし、かつ反対も同様である。異なるパートナーとの間の相互作用を含む生物学的な現象の大部分を、それゆえ、問題になっている生物学的な現象に依存して、より長い、又はより短い距離である化合物と結合した２つの蛍光化合物間のＦＲＥＴにおける変化を測定することによって研究することができるだろう。
【0124】
ＦＲＥＴシグナルは、異なる方法において測定されうる：ドナー単独により、アクセプター単独により、若しくはドナー及びアクセプターにより発光される蛍光の測定、又はＦＲＥＴの結果としてのアクセプターによる培地中の発光される偏光における変動の測定。また、一つは、ドナーの寿命の変動を観察することによってＦＲＥＴの測定を含むことができ、それは、（特にプレートリーダのような単純な機器上で）希土類元素複合物のように長い蛍光寿命を有するドナーを用いることによって促進される。さらに、そのＦＲＥＴシグナルは、正確な瞬間で、又は通常の間隔で測定することができ、その変化を時間にわたって研究することができ、そしてそれによって、研究される生物学的なプロセスの反応速度論を調査しうる。
【0125】
ある側面において、２０１９年２月１４日に出願されたＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５１２１３において開示される装置を用いた。それは、参照によって本明細書に取り込まれる。その出願におけるその開示は、最小限の使用者の操作若しくは関与又は全くない使用者の操作若しくは関与により試料の吸光及び蛍光を測定するために診療現場において使用されうる分析装置に一般的に関する。例えば、診断分析にかけられる血液試料の蛍光及び吸光の両方を定量化するために便利でありうる。ある分析的なワークフローにおいて、血液試料のヘマトクリット値は、吸光アッセイにより定量化されうる。一方でＦＲＥＴアッセイにおけるそのシグナル強度は、血液試料の他の成分に関係する情報を提供しうる。
【0126】
ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５１２１３において開示される一の装置は、試料からの発光、及び試料による透過照明光の吸光度を検出するために有用であり、励起波長を有する発光を発光するために調節される第一の光源を含む。その装置はさらに、透過照射光により試料を透過照射するための第二の光源を含む。その装置はさらに、励起光を検出するために調節された第一の光検出器、及び発光及び透過照射光を検出するために調節された第二の光検出器を含む。その装置は、さらに（１）少なくとも一部の励起光を反射することによってその試料を落射照射するために、（２）第一の光検出器に少なくとも一部の励起光を送るために、（３）第二の光検出器に少なくとも一部の発光を送るために、（４）少なくとも一部の透過照射光を第二の光検出器へと送るために調節されたダイクロイックミラーを含む。
【0127】
本開示における使用のための一の適当なキュベットは、２０１９年２月１４日に出願された、ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０５１２１５に開示されている。提供されるキュベットの一つは、開いたチャンバー上部を有する内部チャンバーが含まれる中空体を含む。そのキュベットは、内壁、外壁、開いた上ぶた、及び開いた下ぶたを有する下段の蓋をさらに含む。少なくとも下段の蓋の一部は開いたチャンバー上部に近接した内部チャンバー内に適合するために調節される。下段の蓋は、内壁に連結される一以上の（例えば二以上の）容器を含み、ここで、その容器のそれぞれは開いた容器の上面を有する。ある側面において、その下段の蓋は、二以上のそのような容器を含む。その下段の蓋は中空体に結合される安全な方法をさらに含む。そのキュベットは、さらに少なくとも一部の上段の蓋が開いた上蓋に近接する下段の蓋内に適合するために調節される上段の蓋を含む。
【実施例】
【0128】
本実施例は、ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイにおけるＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの存在及び量を検出するための本開示の方法を例示する。図１に示されるように、ＶＣＡＭ－１は、ドナーフルオロフォアにより標識される抗ＶＣＡＭ－１抗体（ＭＡＢ－１）及び、アクセプターフルオロフォア（ＮＩＲアクセプター）により標識される抗ＶＣＡＭ－１抗体（ＭＡＢ－２）に結合する。アクセプターフルオロフォア（緑色アクセプター）によって標識される単離したＡ２Ｍタンパク質は、ドナーフルオロフォアによって標識される抗Ａ２Ｍ抗体（ＭＡＢ）に結合する。そのＶＣＡＭ－１分析物は、患者からの試料（例えば全血試料）内にあり、そして両方の抗ＶＣＡＭ－１抗体に同時に結合し、ＦＲＥＴシグナルをもたらす。患者からの試料（すなわち全血試料）中のＡ２Ｍ分析物は、抗Ａ２Ｍ抗体に結合することについて、単離したＡ２Ｍタンパク質と競合し、それゆえ、ドナーフルオロフォアによって標識される抗Ａ２Ｍ抗体及びアクセプターフルオロフォアによって標識される単離したＡ２Ｍタンパク質からのＦＲＥＴシグナルを邪魔する。
【0129】
一の抗ＶＣＡＭ－１抗体はドナーフルオロフォアによって標識され、第二の抗ＶＣＡＭ－１抗体はアクセプターフルオロフォアによって標識され、そして抗Ａ２Ｍ抗体がドナーフルオロフォアによって標識され、そして、単離したＡ２Ｍタンパク質がアクセプターフルオロフォアによって標識され、ここで、二つのアクセプターフルオロフォアが異なる場合に、試料中、ＴＲ－ＦＲＥＴはＶＣＡＭ－１の存在下で生じることができ、そしてＦＲＥＴシグナルは、Ａ２Ｍの存在下で消失するだろう（図１）。抗ＶＣＡＭ－１抗体のアクセプターフルオロフォアのＦＲＥＴシグナルの増加は、既知の量のＶＣＡＭ－１キャリブレータから補間されるように、患者の血液中に存在するＶＣＡＭ－１のレベルに比例する（図２Ａ－２Ｄ）。以下の表１は、図２Ｃに対応する数値的なデータを示し、かつ以下の表２は、図２Ｄに対応する数値的なデータを示す。抗Ａ２Ｍ抗体又は単離したＡ２Ｍタンパク質のアクセプターフルオロフォアのＦＲＥＴシグナルは、既知の量のＡ２Ｍキャリブレータから補間されるように、患者の血中に存在するＡ２Ｍのレベルと反比例する（図２Ｅ－２Ｇ）。以下の表３は、図２Ｇの対応する平均の数値的なデータを示し、それらは４回の繰り返しを含む。
【0130】
【表1】
【0131】
【表2】
【0132】
【表3】
【0133】
また、マルチプレックスアッセイを実施して、全血においてＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍについて同時に標準曲線を作成した（図２Ｈ及び２Ｉ）。３つの分かれたキャリブレーションカーブを準備した：１）ＶＣＡＭ－１のみ、２）Ａ２Ｍのみ、３）ＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの組み合わせ。ＶＣＡＭ－１及びＡ２Ｍの両方の濃度は、個々のキャリブレーションカーブと組み合わせた曲線との間で一定に保たれた。全ての３つのキャリブレーションカーブは、５～３０分間試験された。以下の表４は、図２Ｈに対応する数値的なデータを示し、かつ表５は図２Ｉに対応する数値的なデータを示す。
【0134】
【表4】
【0135】
【表5】
【0136】
図２Ｊ及び２Ｋは、Ａ２Ｍ及びＶＣＡＭ－１がマルチプレックス化される場合に例示され、その結果はシングルプレックスアッセイに適合する。図２Ｊは、マルチプレックス化したＶＣＡＭ－１がシングルプレックスのＶＣＡＭ－１の結果に重複することを示し、一方でＡ２Ｍ結果は用量反応を示さない。同様に、図２Ｋは、マルチプレックスのＡ２Ｍ結果がシングルプレックスのＡ２Ｍ結果と重複することを示し、一方でＶＣＡＭ－１は用量反応を示さない。以下の表６は、図２Ｊ及び２Ｋに対応する数値的なデータを示す。
【0137】
【表6】
【0138】
Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ（また、Ｔｂ－Ｈ２２ＴＲＥＮＩＡＭ－５ＬＩＯ－ＮＨＳとも呼ばれる，図３）であるドナーフルオロフォアは、抗ＶＣＡＭ－１抗体、抗Ａ２Ｍ抗体、又は単離したＡ２Ｍタンパク質を標識するために用いられうる。Ｌｕｍｉ４－Ｔｂは、４９０、５５０、及び６２０ｎｍの３つの光学的に異なるピークを有し、それらはエネルギー移動のために用いられうる（図５）。用いられうるアクセプターフルオロフォアは、これらに限定されないが含む：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（図５）。ドナー及びアクセプターフルオロフォアは抗体上の一級アミンを用いて抗体に調製されうる。
【0139】
ヒトＶＣＡＭ－１（受入番号Ｐ１９３２０）の配列を以下に示す：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
ＭＰＧＫＭＶＶＩＬＧＡＳＮＩＬＷＩＭＦＡＡＳＱＡＦＫＩＥＴＴＰＥＳＲＹＬＡＱＩＧＤＳＶＳＬＴＣＳＴＴＧＣＥＳＰＦＦＳＷＲＴＱＩＤＳＰＬＮＧＫＶＴＮＥＧＴＴＳＴＬＴＭＮＰＶＳＦＧＮＥＨＳＹＬＣＴＡＴＣＥＳＲＫＬＥＫＧＩＱＶＥＩＹＳＦＰＫＤＰＥＩＨＬＳＧＰＬＥＡＧＫＰＩＴＶＫＣＳＶＡＤＶＹＰＦＤＲＬＥＩＤＬＬＫＧＤＨＬＭＫＳＱＥＦＬＥＤＡＤＲＫＳＬＥＴＫＳＬＥＶＴＦＴＰＶＩＥＤＩＧＫＶＬＶＣＲＡＫＬＨＩＤＥＭＤＳＶＰＴＶＲＱＡＶＫＥＬＱＶＹＩＳＰＫＮＴＶＩＳＶＮＰＳＴＫＬＱＥＧＧＳＶＴＭＴＣＳＳＥＧＬＰＡＰＥＩＦＷＳＫＫＬＤＮＧＮＬＱＨＬＳＧＮＡＴＬＴＬＩＡＭＲＭＥＤＳＧＩＹＶＣＥＧＶＮＬＩＧＫＮＲＫＥＶＥＬＩＶＱＥＫＰＦＴＶＥＩＳＰＧＰＲＩＡＡＱＩＧＤＳＶＭＬＴＣＳＶＭＧＣＥＳＰＳＦＳＷＲＴＱＩＤＳＰＬＳＧＫＶＲＳＥＧＴＮＳＴＬＴＬＳＰＶＳＦＥＮＥＨＳＹＬＣＴＶＴＣＧＨＫＫＬＥＫＧＩＱＶＥＬＹＳＦＰＲＤＰＥＩＥＭＳＧＧＬＶＮＧＳＳＶＴＶＳＣＫＶＰＳＶＹＰＬＤＲＬＥＩＥＬＬＫＧＥＴＩＬＥＮＩＥＦＬＥＤＴＤＭＫＳＬＥＮＫＳＬＥＭＴＦＩＰＴＩＥＤＴＧＫＡＬＶＣＱＡＫＬＨＩＤＤＭＥＦＥＰＫＱＲＱＳＴＱＴＬＹＶＮＶＡＰＲＤＴＴＶＬＶＳＰＳＳＩＬＥＥＧＳＳＶＮＭＴＣＬＳＱＧＦＰＡＰＫＩＬＷＳＲＱＬＰＮＧＥＬＱＰＬＳＥＮＡＴＬＴＬＩＳＴＫＭＥＤＳＧＶＹＬＣＥＧＩＮＱＡＧＲＳＲＫＥＶＥＬＩＩＱＶＴＰＫＤＩＫＬＴＡＦＰＳＥＳＶＫＥＧＤＴＶＩＩＳＣＴＣＧＮＶＰＥＴＷＩＩＬＫＫＫＡＥＴＧＤＴＶＬＫＳＩＤＧＡＹＴＩＲＫＡＱＬＫＤＡＧＶＹＥＣＥＳＫＮＫＶＧＳＱＬＲＳＬＴＬＤＶＱＧＲＥＮＮＫＤＹＦＳＰＥＬＬＶＬＹＦＡＳＳＬＩＩＰＡＩＧＭＩＩＹＦＡＲＫＡＮＭＫＧＳＹＳＬＶＥＡＱＫＳＫＶ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：
ＭＰＧＫＭＶＶＩＬＧＡＳＮＩＬＷＩＭＦＡＡＳＱＡＦＫＩＥＴＴＰＥＳＲＹＬＡＱＩＧＤＳＶＳＬＴＣＳＴＴＧＣＥＳＰＦＦＳＷＲＴＱＩＤＳＰＬＮＧＫＶＴＮＥＧＴＴＳＴＬＴＭＮＰＶＳＦＧＮＥＨＳＹＬＣＴＡＴＣＥＳＲＫＬＥＫＧＩＱＶＥＩＹＳＦＰＫＤＰＥＩＨＬＳＧＰＬＥＡＧＫＰＩＴＶＫＣＳＶＡＤＶＹＰＦＤＲＬＥＩＤＬＬＫＧＤＨＬＭＫＳＱＥＦＬＥＤＡＤＲＫＳＬＥＴＫＳＬＥＶＴＦＴＰＶＩＥＤＩＧＫＶＬＶＣＲＡＫＬＨＩＤＥＭＤＳＶＰＴＶＲＱＡＶＫＥＬＱＶＹＩＳＰＫＮＴＶＩＳＶＮＰＳＴＫＬＱＥＧＧＳＶＴＭＴＣＳＳＥＧＬＰＡＰＥＩＦＷＳＫＫＬＤＮＧＮＬＱＨＬＳＧＮＡＴＬＴＬＩＡＭＲＭＥＤＳＧＩＹＶＣＥＧＶＮＬＩＧＫＮＲＫＥＶＥＬＩＶＱＥＫＰＦＴＶＥＩＳＰＧＰＲＩＡＡＱＩＧＤＳＶＭＬＴＣＳＶＭＧＣＥＳＰＳＦＳＷＲＴＱＩＤＳＰＬＳＧＫＶＲＳＥＧＴＮＳＴＬＴＬＳＰＶＳＦＥＮＥＨＳＹＬＣＴＶＴＣＧＨＫＫＬＥＫＧＩＱＶＥＬＹＳＦＰＲＤＰＥＩＥＭＳＧＧＬＶＮＧＳＳＶＴＶＳＣＫＶＰＳＶＹＰＬＤＲＬＥＩＥＬＬＫＧＥＴＩＬＥＮＩＥＦＬＥＤＴＤＭＫＳＬＥＮＫＳＬＥＭＴＦＩＰＴＩＥＤＴＧＫＡＬＶＣＱＡＫＬＨＩＤＤＭＥＦＥＰＫＱＲＱＳＴＱＴＬＹＶＮＶＡＰＲＤＴＴＶＬＶＳＰＳＳＩＬＥＥＧＳＳＶＮＭＴＣＬＳＱＧＦＰＡＰＫＩＬＷＳＲＱＬＰＮＧＥＬＱＰＬＳＥＮＡＴＬＴＬＩＳＴＫＭＥＤＳＧＶＹＬＣＥＧＩＮＱＡＧＲＳＲＫＥＶＥＬＩＩＱＶＴＰＫＤＩＫＬＴＡＦＰＳＥＳＶＫＥＧＤＴＶＩＩＳＣＴＣＧＮＶＰＥＴＷＩＩＬＫＫＫＡＥＴＧＤＴＶＬＫＳＩＤＧＡＹＴＩＲＫＡＱＬＫＤＡＧＶＹＥＣＥＳＫＮＫＶＧＳＱＬＲＳＬＴＬＤＶＱＧＲＥＮＮＫＤＹＦＳＰＥＬＬＶＬＹＦＡＳＳＬＩＩＰＡＩＧＭＩＩＹＦＡＲＫＡＮＭＫＧＳＹＳＬＶＥＡＱＫＳＫＶ
【0140】
ヒトＡ２Ｍ（受入番号Ｐ０１０２３）の配列を以下に示す：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
ＭＧＫＮＫＬＬＨＰＳＬＶＬＬＬＬＶＬＬＰＴＤＡＳＶＳＧＫＰＱＹＭＶＬＶＰＳＬＬＨＴＥＴＴＥＫＧＣＶＬＬＳＹＬＮＥＴＶＴＶＳＡＳＬＥＳＶＲＧＮＲＳＬＦＴＤＬＥＡＥＮＤＶＬＨＣＶＡＦＡＶＰＫＳＳＳＮＥＥＶＭＦＬＴＶＱＶＫＧＰＴＱＥＦＫＫＲＴＴＶＭＶＫＮＥＤＳＬＶＦＶＱＴＤＫＳＩＹＫＰＧＱＴＶＫＦＲＶＶＳＭＤＥＮＦＨＰＬＮＥＬＩＰＬＶＹＩＱＤＰＫＧＮＲＩＡＱＷＱＳＦＱＬＥＧＧＬＫＱＦＳＦＰＬＳＳＥＰＦＱＧＳＹＫＶＶＶＱＫＫＳＧＧＲＴＥＨＰＦＴＶＥＥＦＶＬＰＫＦＥＶＱＶＴＶＰＫＩＩＴＩＬＥＥＥＭＮＶＳＶＣＧＬＹＴＹＧＫＰＶＰＧＨＶＴＶＳＩＣＲＫＹＳＤＡＳＤＣＨＧＥＤＳＱＡＦＣＥＫＦＳＧＱＬＮＳＨＧＣＦＹＱＱＶＫＴＫＶＦＱＬＫＲＫＥＹＥＭＫＬＨＴＥＡＱＩＱＥＥＧＴＶＶＥＬＴＧＲＱＳＳＥＩＴＲＴＩＴＫＬＳＦＶＫＶＤＳＨＦＲＱＧＩＰＦＦＧＱＶＲＬＶＤＧＫＧＶＰＩＰＮＫＶＩＦＩＲＧＮＥＡＮＹＹＳＮＡＴＴＤＥＨＧＬＶＱＦＳＩＮＴＴＮＶＭＧＴＳＬＴＶＲＶＮＹＫＤＲＳＰＣＹＧＹＱＷＶＳＥＥＨＥＥＡＨＨＴＡＹＬＶＦＳＰＳＫＳＦＶＨＬＥＰＭＳＨＥＬＰＣＧＨＴＱＴＶＱＡＨＹＩＬＮＧＧＴＬＬＧＬＫＫＬＳＦＹＹＬＩＭＡＫＧＧＩＶＲＴＧＴＨＧＬＬＶＫＱＥＤＭＫＧＨＦＳＩＳＩＰＶＫＳＤＩＡＰＶＡＲＬＬＩＹＡＶＬＰＴＧＤＶＩＧＤＳＡＫＹＤＶＥＮＣＬＡＮＫＶＤＬＳＦＳＰＳＱＳＬＰＡＳＨＡＨＬＲＶＴＡＡＰＱＳＶＣＡＬＲＡＶＤＱＳＶＬＬＭＫＰＤＡＥＬＳＡＳＳＶＹＮＬＬＰＥＫＤＬＴＧＦＰＧＰＬＮＤＱＤＮＥＤＣＩＮＲＨＮＶＹＩＮＧＩＴＹＴＰＶＳＳＴＮＥＫＤＭＹＳＦＬＥＤＭＧＬＫＡＦＴＮＳＫＩＲＫＰＫＭＣＰＱＬＱＱＹＥＭＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴＥＴＶＲＫＹＦＰＥＴＷＩＷＤＬＶＶＶＮＳＡＧＶＡＥＶＧＶＴＶＰＤＴＩＴＥＷＫＡＧＡＦＣＬＳＥＤＡＧＬＧＩＳＳＴＡＳＬＲＡＦＱＰＦＦＶＥＬＴＭＰＹＳＶＩＲＧＥＡＦＴＬＫＡＴＶＬＮＹＬＰＫＣＩＲＶＳＶＱＬＥＡＳＰＡＦＬＡＶＰＶＥＫＥＱＡＰＨＣＩＣＡＮＧＲＱＴＶＳＷＡＶＴＰＫＳＬＧＮＶＮＦＴＶＳＡＥＡＬＥＳＱＥＬＣＧＴＥＶＰＳＶＰＥＨＧＲＫＤＴＶＩＫＰＬＬＶＥＰＥＧＬＥＫＥＴＴＦＮＳＬＬＣＰＳＧＧＥＶＳＥＥＬＳＬＫＬＰＰＮＶＶＥＥＳＡＲＡＳＶＳＶＬＧＤＩＬＧＳＡＭＱＮＴＱＮＬＬＱＭＰＹＧＣＧＥＱＮＭＶＬＦＡＰＮＩＹＶＬＤＹＬＮＥＴＱＱＬＴＰＥＩＫＳＫＡＩＧＹＬＮＴＧＹＱＲＱＬＮＹＫＨＹＤＧＳＹＳＴＦＧＥＲＹＧＲＮＱＧＮＴＷＬＴＡＦＶＬＫＴＦＡＱＡＲＡＹＩＦＩＤＥＡＨＩＴＱＡＬＩＷＬＳＱＲＱＫＤＮＧＣＦＲＳＳＧＳＬＬＮＮＡＩＫＧＧＶＥＤＥＶＴＬＳＡＹＩＴＩＡＬＬＥＩＰＬＴＶＴＨＰＶＶＲＮＡＬＦＣＬＥＳＡＷＫＴＡＱＥＧＤＨＧＳＨＶＹＴＫＡＬＬＡＹＡＦＡＬＡＧＮＱＤＫＲＫＥＶＬＫＳＬＮＥＥＡＶＫＫＤＮＳＶＨＷＥＲＰＱＫＰＫＡＰＶＧＨＦＹＥＰＱＡＰＳＡＥＶＥＭＴＳＹＶＬＬＡＹＬＴＡＱＰＡＰＴＳＥＤＬＴＳＡＴＮＩＶＫＷＩＴＫＱＱＮＡＱＧＧＦＳＳＴＱＤＴＶＶＡＬＨＡＬＳＫＹＧＡＡＴＦＴＲＴＧＫＡＡＱＶＴＩＱＳＳＧＴＦＳＳＫＦＱＶＤＮＮＮＲＬＬＬＱＱＶＳＬＰＥＬＰＧＥＹＳＭＫＶＴＧＥＧＣＶＹＬＱＴＳＬＫＹＮＩＬＰＥＫＥＥＦＰＦＡＬＧＶＱＴＬＰＱＴＣＤＥＰＫＡＨＴＳＦＱＩＳＬＳＶＳＹＴＧＳＲＳＡＳＮＭＡＩＶＤＶＫＭＶＳＧＦＩＰＬＫＰＴＶＫＭＬＥＲＳＮＨＶＳＲＴＥＶＳＳＮＨＶＬＩＹＬＤＫＶＳＮＱＴＬＳＬＦＦＴＶＬＱＤＶＰＶＲＤＬＫＰＡＩＶＫＶＹＤＹＹＥＴＤＥＦＡＩＡＥＹＮＡＰＣＳＫＤＬＧＮＡ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２：
ＭＧＫＮＫＬＬＨＰＳＬＶＬＬＬＬＶＬＬＰＴＤＡＳＶＳＧＫＰＱＹＭＶＬＶＰＳＬＬＨＴＥＴＴＥＫＧＣＶＬＬＳＹＬＮＥＴＶＴＶＳＡＳＬＥＳＶＲＧＮＲＳＬＦＴＤＬＥＡＥＮＤＶＬＨＣＶＡＦＡＶＰＫＳＳＳＮＥＥＶＭＦＬＴＶＱＶＫＧＰＴＱＥＦＫＫＲＴＴＶＭＶＫＮＥＤＳＬＶＦＶＱＴＤＫＳＩＹＫＰＧＱＴＶＫＦＲＶＶＳＭＤＥＮＦＨＰＬＮＥＬＩＰＬＶＹＩＱＤＰＫＧＮＲＩＡＱＷＱＳＦＱＬＥＧＧＬＫＱＦＳＦＰＬＳＳＥＰＦＱＧＳＹＫＶＶＶＱＫＫＳＧＧＲＴＥＨＰＦＴＶＥＥＦＶＬＰＫＦＥＶＱＶＴＶＰＫＩＩＴＩＬＥＥＥＭＮＶＳＶＣＧＬＹＴＹＧＫＰＶＰＧＨＶＴＶＳＩＣＲＫＹＳＤＡＳＤＣＨＧＥＤＳＱＡＦＣＥＫＦＳＧＱＬＮＳＨＧＣＦＹＱＱＶＫＴＫＶＦＱＬＫＲＫＥＹＥＭＫＬＨＴＥＡＱＩＱＥＥＧＴＶＶＥＬＴＧＲＱＳＳＥＩＴＲＴＩＴＫＬＳＦＶＫＶＤＳＨＦＲＱＧＩＰＦＦＧＱＶＲＬＶＤＧＫＧＶＰＩＰＮＫＶＩＦＩＲＧＮＥＡＮＹＹＳＮＡＴＴＤＥＨＧＬＶＱＦＳＩＮＴＴＮＶＭＧＴＳＬＴＶＲＶＮＹＫＤＲＳＰＣＹＧＹＱＷＶＳＥＥＨＥＥＡＨＨＴＡＹＬＶＦＳＰＳＫＳＦＶＨＬＥＰＭＳＨＥＬＰＣＧＨＴＱＴＶＱＡＨＹＩＬＮＧＧＴＬＬＧＬＫＫＬＳＦＹＹＬＩＭＡＫＧＧＩＶＲＴＧＴＨＧＬＬＶＫＱＥＤＭＫＧＨＦＳＩＳＩＰＶＫＳＤＩＡＰＶＡＲＬＬＩＹＡＶＬＰＴＧＤＶＩＧＤＳＡＫＹＤＶＥＮＣＬＡＮＫＶＤＬＳＦＳＰＳＱＳＬＰＡＳＨＡＨＬＲＶＴＡＡＰＱＳＶＣＡＬＲＡＶＤＱＳＶＬＬＭＫＰＤＡＥＬＳＡＳＳＶＹＮＬＬＰＥＫＤＬＴＧＦＰＧＰＬＮＤＱＤＮＥＤＣＩＮＲＨＮＶＹＩＮＧＩＴＹＴＰＶＳＳＴＮＥＫＤＭＹＳＦＬＥＤＭＧＬＫＡＦＴＮＳＫＩＲＫＰＫＭＣＰＱＬＱＱＹＥＭＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴＥＴＶＲＫＹＦＰＥＴＷＩＷＤＬＶＶＶＮＳＡＧＶＡＥＶＧＶＴＶＰＤＴＩＴＥＷＫＡＧＡＦＣＬＳＥＤＡＧＬＧＩＳＳＴＡＳＬＲＡＦＱＰＦＦＶＥＬＴＭＰＹＳＶＩＲＧＥＡＦＴＬＫＡＴＶＬＮＹＬＰＫＣＩＲＶＳＶＱＬＥＡＳＰＡＦＬＡＶＰＶＥＫＥＱＡＰＨＣＩＣＡＮＧＲＱＴＶＳＷＡＶＴＰＫＳＬＧＮＶＮＦＴＶＳＡＥＡＬＥＳＱＥＬＣＧＴＥＶＰＳＶＰＥＨＧＲＫＤＴＶＩＫＰＬＬＶＥＰＥＧＬＥＫＥＴＴＦＮＳＬＬＣＰＳＧＧＥＶＳＥＥＬＳＬＫＬＰＰＮＶＶＥＥＳＡＲＡＳＶＳＶＬＧＤＩＬＧＳＡＭＱＮＴＱＮＬＬＱＭＰＹＧＣＧＥＱＮＭＶＬＦＡＰＮＩＹＶＬＤＹＬＮＥＴＱＱＬＴＰＥＩＫＳＫＡＩＧＹＬＮＴＧＹＱＲＱＬＮＹＫＨＹＤＧＳＹＳＴＦＧＥＲＹＧＲＮＱＧＮＴＷＬＴＡＦＶＬＫＴＦＡＱＡＲＡＹＩＦＩＤＥＡＨＩＴＱＡＬＩＷＬＳＱＲＱＫＤＮＧＣＦＲＳＳＧＳＬＬＮＮＡＩＫＧＧＶＥＤＥＶＴＬＳＡＹＩＴＩＡＬＬＥＩＰＬＴＶＴＨＰＶＶＲＮＡＬＦＣＬＥＳＡＷＫＴＡＱＥＧＤＨＧＳＨＶＹＴＫＡＬＬＡＹＡＦＡＬＡＧＮＱＤＫＲＫＥＶＬＫＳＬＮＥＥＡＶＫＫＤＮＳＶＨＷＥＲＰＱＫＰＫＡＰＶＧＨＦＹＥＰＱＡＰＳＡＥＶＥＭＴＳＹＶＬＬＡＹＬＴＡＱＰＡＰＴＳＥＤＬＴＳＡＴＮＩＶＫＷＩＴＫＱＱＮＡＱＧＧＦＳＳＴＱＤＴＶＶＡＬＨＡＬＳＫＹＧＡＡＴＦＴＲＴＧＫＡＡＱＶＴＩＱＳＳＧＴＦＳＳＫＦＱＶＤＮＮＮＲＬＬＬＱＱＶＳＬＰＥＬＰＧＥＹＳＭＫＶＴＧＥＧＣＶＹＬＱＴＳＬＫＹＮＩＬＰＥＫＥＥＦＰＦＡＬＧＶＱＴＬＰＱＴＣＤＥＰＫＡＨＴＳＦＱＩＳＬＳＶＳＹＴＧＳＲＳＡＳＮＭＡＩＶＤＶＫＭＶＳＧＦＩＰＬＫＰＴＶＫＭＬＥＲＳＮＨＶＳＲＴＥＶＳＳＮＨＶＬＩＹＬＤＫＶＳＮＱＴＬＳＬＦＦＴＶＬＱＤＶＰＶＲＤＬＫＰＡＩＶＫＶＹＤＹＹＥＴＤＥＦＡＩＡＥＹＮＡＰＣＳＫＤＬＧＮＡ
【図1】
【図2A-2B】
【図2C-2D】
【図2E-2F】
【図2G】
【図2H-2I】
【図2J-2K】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】