特表 2022-532390 ｒＡＡＶベクターによる免疫寛容の誘導

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-14

(54)【発明の名称】ｒＡＡＶベクターによる免疫寛容の誘導

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/76 20150101AFI20220707BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20220707BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20220707BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20220707BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220707BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220707BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220707BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220707BHJP

【ＦＩ】

A61K35/76

C12N15/864 100Z

A61P21/04

A61P21/00

A61P43/00 121

A61K48/00

C12N15/12 ZNA

C12N15/11 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021568193

(86)(22)【出願日】2020-05-15

(85)【翻訳文提出日】2021-11-12

(86)【国際出願番号】 EP2020063733

(87)【国際公開番号】W WO2020229695

(87)【国際公開日】2020-11-19

(31)【優先権主張番号】19305623.1

(32)【優先日】2019-05-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520053762

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・パリ・シテ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＰＡＲＩＳ ＣＩＴＥ

(71)【出願人】

【識別番号】503197304

【氏名又は名称】ジェネトン

(71)【出願人】

【識別番号】506369944

【氏名又は名称】サントル ナスィオナル ド ラ ルシェルシュ スィアンティフィク

(71)【出願人】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(74)【代理人】

【識別番号】110000523

【氏名又は名称】アクシス国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】フェデリコ・ミンゴッツィ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン・ダブスト

(72)【発明者】

【氏名】ローラン・バルトロ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084AA13

4C084MA02

4C084MA16

4C084MA17

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA941

4C084ZA942

4C084ZC751

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA02

4C087MA16

4C087MA17

4C087MA66

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA94

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、２つの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせに関し、第１のものはキャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容に有用な目的の導入遺伝子をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含み、第２のものはキャプシドと、５’ＩＴＲ配列、目的の組織に特異的なプロモーター、第１のｒＡＡＶベクターのカセットに挿入された核酸配列に対応する核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含み、核酸配列は、目的の組織に向けて投与される。前記組み合わせは、コーディングされたタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導するのに使用でき、したがって、特に筋ジストロフィーを治療するための対象における薬物として使用できる。本発明はまた、対応する医薬組成物、キット、及び方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象における筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害の治療のために使用される、以下の組み合わせ：
ｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
ｉｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、筋肉特異的プロモーター、前記第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｉ）の免疫系寛容対象の前記タンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；
前記第１のｒＡＡＶは肝臓を標的とするために投与され、前記第２のｒＡＡＶは筋肉組織を標的とするために投与される、組み合わせ。

【請求項2】

前記免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする前記核酸配列が、細胞関連タンパク質産物をコーディングする、請求項１に記載の組み合わせ。

【請求項3】

前記細胞関連タンパク質産物が、細胞質ゾルにデリバリーされるタンパク質産物又は膜貫通タンパク質産物である、請求項２に記載の組み合わせ。

【請求項4】

前記免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする前記核酸配列が、Ｔ細胞又はＢ細胞によって認識されるエピトープを含むタンパク質産物をコーディングする、請求項１～３のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項5】

筋ジストロフィーの治療は、タンパク質産物に対する細胞性及び体液性免疫応答の発生を排除又は減弱することを含み、前記タンパク質産物が免疫系及び／又は筋肉におけるその発現に寛容されることを可能にし、より好ましくは、筋ジストロフィーの治療は、細胞傷害性ＣＤ８⁺Ｔ細胞寛容を誘導することを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項6】

前記対象は、前記免疫系寛容対象の前記タンパク質産物に対する既存の免疫を示す、請求項１～５のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項7】

前記第１のｒＡＡＶベクター（ｉ）の肝臓特異的プロモーターは、肝細胞特異的プロモーター（ｈＡＡＴ）である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項8】

前記第１及び第２のｒＡＡＶベクターのキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項9】

前記第１のｒＡＡＶベクターのキャプシドがＡＡＶ８キャプシドである、請求項８に記載の組み合わせ。

【請求項10】

前記免疫系寛容対象の前記タンパク質産物は、筋肉特異的タンパク質又は神経筋タンパク質である、請求項１～９のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項11】

前記免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする前記核酸配列は、以下の配列から選択されるペプチドをコーディングする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組み合わせ：マイクロジストロフィン構築物、エメリン、ラミンＡ／Ｃ、スペクトリンリピート内包、核エンベロープ１（ネスプリン１）、スペクトリンリピート内包、核エンベロープ２（ネスプリン２）、膜貫通タンパク質４３、トルシンＡ相互作用タンパク質１、ダブルホメオボックス４、染色体の柔軟ヒンジドメイン内包１の構造維持、ポリメラーゼＩと転写物放出因子（Ｍ）、ミオチリン、カベオリン３、ＨＳＰ－４０ホモログ、サブファミリーＢ、ナンバー６、デスミン、トランスポーチン３、異種核リボヌクレオプロテインＤ型、カルパイン３、ディスフェリン、ガンマサルコグリカン、アルファサルコグリカン、ベータサルコグリカン、デルタ－サルコグリカン、テレトニン、三者モチーフ内包３２、フクチン関連タンパク質、チチン、タンパク質－Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼ１、アノクタミン５、タンパク質－Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼ２、Ｏ－結合マンノースベータ１，２－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ジストログリカン１、プレクチン、デスミン、輸送タンパク質粒子複合体１１、ＧＤＰ－マンノースピロホスホリラーゼＢ、イソプレノイドシンターゼドメイン内包、酸性アルファ－グルコシダーゼプレプロタンパク質、ＬＩＭ及び老化細胞抗原様ドメイン２、血管心外膜物質、トルシンＡ相互作用タンパク質１、プロテインＯ－グルコシルトランスフェラーゼ１、ドリチルリン酸マンノシルトランスフェラーゼポリペプチド３、バロシン内包タンパク質、プレクチン。

【請求項12】

前記筋ジストロフィーがデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）であり、前記免疫系寛容対象の前記タンパク質産物がマイクロジストロフィン構築物である、請求項１１に記載の組み合わせ。

【請求項13】

前記第１のｒＡＡＶベクターが対象に静脈内投与され、前記第２のｒＡＡＶベクターが対象に筋肉内投与される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項14】

前記第１のｒＡＡＶベクターが、前記第２のｒＡＡＶベクターの前に、好ましくは１週間、さらにより好ましくは第２のｒＡＡＶベクターの１ヶ月前に投与される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組み合わせ。

【請求項15】

筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害、より好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用するための、請求項１～１４のいずれか１項に記載の第１の組換えｒＡＡＶベクター及び第２の組換えｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子治療の分野に関する。特に、本発明は、２つの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ、ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせに関し、第１のものはキャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象の有用な核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含み、第２のものはキャプシドと、５’ＩＴＲ配列、目的の組織に特異的なプロモーター、第１のｒＡＡＶベクターのカセットに挿入された核酸配列に対応する核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含み、核酸配列は、目的の組織に向けて投与される。前記組み合わせは、前記目的の組織にデリバリーされた前記核酸配列からコーディング及び翻訳されるタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導するのに使用でき、したがって、特に筋ジストロフィーを治療するための対象における薬物として使用できる。本発明はまた、前記核酸配列の拒絶のリスクを防止するための医薬組成物、キット、及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、末梢組織での遺伝子導入用途に広く使用されており、神経筋、眼、神経変性、血友病などの単一遺伝子起源の影響を治療するためのさまざまな治療用導入遺伝子を安全にデリバリーすることが証明されている。これらの遺伝子修復医学での用途は、目的の組織への定義された導入遺伝子の生着の成功に依存している。同種細胞及びＭＨＣ成分の導入を意味する古典的な組織生着手順と比較して、ｒＡＡＶ遺伝子導入は、ｒＡＡＶキャプシドの免疫原性、及び宿主免疫系による新たに発現した導入遺伝子のプロセシング及び認識に関連する特定の懸念をもたらす。主にヒトに遍在しているＡＡＶ血清型で観察される既存の抗キャプシド抗体反応は、治療の無効果性を損なう可能性があり、他のｒＡＡＶ血清型、操作されたキャプシド、及び免疫抑制手順の使用を促す。同様に重要なこととして、キャプシドに対する細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ、ＣＴＬ）の応答は、現在一過性の免疫抑制レジメンで取り扱われている重要な懸念を表すヒト肝臓臨床試験で遭遇された。

【0003】

抗キャプシド応答と並行して、新たに発現した導入遺伝子に対する免疫応答は、宿主の突然変異遺伝子型、注射経路、使用されるプロモーター、ｒＡＡＶの用量、及び注射される組織に存在する初期の炎症性と代謝性障害の状態など、受容者に固有の複数の要因に依存する。導入遺伝子に対する既存の免疫応答の発生もまた、挑戦的な問題になる。血友病Ｂ患者の場合、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）に対する既存の体液性応答が、タンパク質置換療法に関連してヒトで観察されている。動物実験はまた、特にＦＩＸ ＫＯ動物において、ＦＩＸ遺伝子導入に対する免疫応答を証明しており、ＦＩＸ導入遺伝子は免疫系によって外来抗原と見なされている。これは、導入遺伝子特異的Ｔ細胞の生成における宿主の遺伝的背景の重要な役割と、特定の導入遺伝子に対する免疫応答の定義に一致する複数の遺伝的要素を示している。一例として、細胞傷害性ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスでのヒトＦＩＸ遺伝子導入後に観察されたが、他のマウス系統では見られなかった。標的組織自体も遺伝子導入後の免疫応答の結果に影響を与える重要な要因であり、ｒＡＡＶ筋肉標的はモデル導入遺伝子を使用するとき高度に免疫原性であるだけでなく、単一遺伝子の筋肉障害を治療するための細胞関連導入遺伝子デリバリーも伴うことが知られている。注目すべきことに、ジストロフィンに対する既存の循環Ｔ細胞免疫の存在は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者のかなりの割合で観察され、おそらくＡＡＶベクターで筋肉内にデリバリーされた微小ジストロフィー導入遺伝子の免疫介在性拒絶をもたらし、導入遺伝子特異的免疫調節を促す。

【0004】

肝臓の寛容原性を利用して、肝臓でのアロＭＨＣ成分の発現により、同じアロＭＨＣ抗原を有する遺伝子導入植皮の生着が成功したことが報告されている。同様に、ｒＡＡＶを介した肝臓標的は、ヒトＦＩＸ導入遺伝子を使用した、又はさまざまな導入遺伝子とｒＡＡＶ血清型を使用した血友病マウスモデルで安全かつ効率的であることが証明された。肝臓でのｒＡＡＶ ＦＩＸ遺伝子導入は、ＦＩＸ導入遺伝子（体全体でアクセス可能な典型的な分泌タンパク質である。）に対して顕著な体液性又は細胞性応答を誘発せず、この寛容状態は、げっ歯類で二次ＦＩＸ免疫化後に保存された。さらに、最近のマウス研究は、ｒＡＡＶ ＦＩＸ肝臓標的が既存の抗導入遺伝子体液性免疫を無効化することができることを示した。導入遺伝子に対するＣＴＬ応答に関して、導入遺伝子特異的ＴＣＲ導入遺伝子ＣＤ８⁺Ｔ細胞の帰趨を制御する肝臓形質導入の能力は、Ｂｅｒｔｏｌｉｎｏのチームによって最初に解明され（Ｂｏｗｅｎら２００４）、一次Ｔ細胞の活性化部位が肝内寛容と免疫のバランスを決定することが示された。この結果は他のモデルで確認されている。形質導入された肝細胞の画分は、肝遺伝子導入後の免疫寛容を誘導するために重要であり、ＴＣＲ導入遺伝子ＣＤ８⁺Ｔ細胞の疲弊した表現型の獲得につながる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

肝臓から離れた複数の組織の形質導入が導入遺伝子に対する顕著な体液性及び細胞性免疫応答の生成につながるという事実を考慮すると、免疫寛容、特に細胞関連導入遺伝子に対するＣＤ８⁺及びＣＤ４⁺Ｔ細胞を含む体液性及び細胞性応答の免疫寛容を利用できる新しいベクター形質導入プロトコルが必要である。さらに、導入遺伝子に対する既存のＣＤ８⁺及びＣＤ４⁺Ｔ細胞免疫の悪影響を無効化し、導入遺伝子に向けられたＣＤ４⁺及びＣＤ８⁺メモリーＴ細胞（存在する場合）の再活性化を回避する必要がある。したがって、特にｒＡＡＶベクターに基づく代替及び／又は改善された方法は、複数の組織でデリバリーされる細胞関連導入遺伝子に対する有害な体液性及び細胞性免疫応答を回避するための遺伝子治療を成功させるために必要である。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、先行技術の不利な点を改善することを目的としている。特に、本発明は、タンパク質産物に対する免疫寛容を誘導する際の薬物として使用するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせを提案する。タンパク質産物は、対象における前記組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターのカセットに存在する核酸配列からコーディング及び翻訳される。

【0007】

第１の態様では、本発明は、対象における筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害の治療のために使用される、以下の組み合わせに関する：
ｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
ｉｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、筋肉特異的プロモーター、前記第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｉ）の免疫系寛容対象の前記タンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；
前記第１のｒＡＡＶは肝臓を標的とするために投与され、前記第２のｒＡＡＶは筋肉組織を標的とするために投与される、組み合わせ。

【0008】

本発明の組み合わせは、細胞関連タンパク質産物、例えば、分泌されない、膜貫通タンパク質のような細胞質ゾル又は膜関連タンパク質に、免疫寛容を提供するのに特に適している。したがって、特定の態様では、本発明は、上記で公開された組み合わせに関するものであり、寛容されるタンパク質産物は、細胞関連タンパク質産物、例えば、膜貫通タンパク質のような細胞質ゾル又は膜関連タンパク質である。

【0009】

本発明者らが示すように、本発明による組み合わせは、免疫原性タンパク質に対する免疫寛容を提供するのに特に効果的である。次に、本発明の組み合わせの特定の実施形態において、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列は、Ｔ細胞又はＢ細胞によって認識されるエピトープを含むタンパク質産物をコーディングする。

【0010】

本発明の組み合わせは、体液性及び細胞性免疫応答の両方、特に筋ジストロフィーの治療に特に関心のあるＣＤ８⁺免疫応答を排除又は減弱することを可能にする。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、タンパク質産物に対する細胞性及び体液性免疫応答の発生を排除又は減弱することを含む筋ジストロフィーの治療に使用するための上記の組み合わせに関するものであり、それにより、前記タンパク質産物が免疫系及び／又は筋肉におけるその発現に寛容されることを可能にする。より特定の実施形態では、本発明は、細胞傷害性ＣＤ８⁺Ｔ細胞寛容を誘導することを含む筋ジストロフィーの治療に使用するための、上記のような組み合わせに関する。

【0011】

例示されるように、本発明の組み合わせを使用する筋肉肝臓二重形質導入は、本発明の組み合わせのタンパク質産物に対して免疫応答を示さない対象、又は組み合わせによって発現されるタンパク質産物に対して既存の免疫応答を示す対象の両方において免疫寛容を誘導することを可能にする。前記既存の応答は、例えば、対象が適用された以前の遺伝子置換療法に起因する可能性がある。したがって、特定の対象において、組み合わせは、免疫系寛容対象のタンパク質産物に対する既存の免疫を提示する対象に投与される。

【0012】

本発明に従って使用するための組み合わせの他の任意の態様において：
－第１のｒＡＡＶベクター（ｉ）の肝臓特異的プロモーターは肝細胞特異的プロモーター（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｏｒ、ｈＡＡＴ）である；
－第１及び第２のｒＡＡＶベクターのキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される；
－第１のｒＡＡＶベクターのキャプシドはＡＡＶ８キャプシドである；
－免疫系寛容対象のタンパク質産物は、筋肉特異的タンパク質又は神経筋タンパク質である；
－免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする前記核酸配列は、以下の配列から選択されるペプチドをコーディングする：マイクロジストロフィン構築物、エメリン、ラミンＡ／Ｃ、スペクトリンリピート内包、核エンベロープ１（ネスプリン１）、スペクトリンリピート内包、核エンベロープ２（ネスプリン２）、膜貫通タンパク質４３、トルシンＡ相互作用タンパク質１、ダブルホメオボックス４、染色体の柔軟ヒンジドメイン内包１の構造維持、ポリメラーゼＩと転写物放出因子（Ｍ）、ミオチリン、カベオリン３、ＨＳＰ－４０ホモログ、サブファミリーＢ、ナンバー６、デスミン、トランスポーチン３、異種核リボヌクレオプロテインＤ型、カルパイン３、ディスフェリン、ガンマサルコグリカン、アルファサルコグリカン、ベータサルコグリカン、デルタ－サルコグリカン、テレトニン、三者モチーフ内包３２、フクチン関連タンパク質、チチン、タンパク質－Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼ１、アノクタミン５、タンパク質－Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼ２、Ｏ－結合マンノースベータ１，２－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ジストログリカン１、プレクチン、デスミン、輸送タンパク質粒子複合体１１、ＧＤＰ－マンノースピロホスホリラーゼＢ、イソプレノイドシンターゼドメイン内包、酸性アルファ－グルコシダーゼプレプロタンパク質、ＬＩＭ及び老化細胞抗原様ドメイン２、血管心外膜物質、トルシンＡ相互作用タンパク質１、プロテインＯ－グルコシルトランスフェラーゼ１、ドリチルリン酸マンノシルトランスフェラーゼポリペプチド３、バロシン内包タンパク質、プレクチン。
－第１のｒＡＡＶベクターが静脈内投与され、第２のｒＡＡＶベクターが対象に筋肉内投与される；又は
－第１のｒＡＡＶベクターは、第２のｒＡＡＶベクターの前に、好ましくは１週間、さらにより好ましくは第２のｒＡＡＶベクターの１ヶ月前に投与される。

【0013】

本発明の特定の実施形態において、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、ＤＭＤ）の治療に使用するための、上記の実施形態のいずれかにおける組み合わせであり、免疫系寛容対象のタンパク質産物は、ミクロジストロフィン構築物である。

【0014】

本発明の別の目的は、筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害、より好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用するための、上記の実施形態のいずれかにおける本発明の組み合わせを含む医薬組成物である。

【0015】

別の態様では、本発明は、対象の目的の組織にデリバリーされた核酸配列からコーディング及び翻訳されるタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導する際の薬物として使用するための、以下を含む組み合わせに関する：
ｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容に有用な目的の核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクターであって、当該核酸配列は、肝臓に向けてデリバリーされるように投与される第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクター；及び
ｉｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、目的の組織に特異的プロモーター、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクターのカセットに挿入された核酸配列に対応する核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルスベクターであって、当該核酸配列は、目的の組織に向けて投与される第２の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。

【0016】

前記２つの組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、細胞関連タンパク質産物（好ましくは膜貫通タンパク質産物）をコーディングする核酸配列を含むカセットを含む。

【0017】

好ましい実施形態では、２つの組換えアデノ随伴ウイルスベクターのカセットに挿入された目的の核酸配列は、Ｔ細胞又はＢ細胞によって認識されるエピトープを含むタンパク質産物をコーディングする。あるいは、目的の核酸配列は、筋肉関連タンパク質、好ましくは膜タンパク質をコーディングする。別の実施形態において、目的の核酸配列は、筋肉特異的タンパク質又は神経筋タンパク質をコーディングし、好ましくは、目的の核酸配列は、マイクロジストロフィン構築物の配列をコーディングする。別の非限定的な好ましい実施形態では、第２のベクター（ｉｉ）における目的の組織に特異的なプロモーターは、筋肉特異的プロモーターである。

【0018】

有利には、本発明による２つの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせは、ＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＢリンパ球の事前の免疫化の後に対象に投与される。好ましくは、組み合わせは、前記核酸配列によってコーディングされるタンパク質産物に向けられたＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＢリンパ球の顕著なレベルの免疫化を示す対象に投与される。

【0019】

別の好ましい実施形態において、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクターのプロモーターは、肝臓特異的プロモーター、好ましくは肝細胞特異的プロモーター（ｈＡＡＴ）である。本発明による第１、第２、又は両方の組換えアデノ随伴ウイルスベクターのキャプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及び任意の組み合わせからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、肝臓に向けてデリバリーされる第１のｒＡＡＶのキャプシドは、ＡＡＶ８キャプシドである。

【0020】

好ましい実施形態では、本発明の組み合わせは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療するために使用するのに有用である。別の好ましい実施形態において、目的の核酸配列を含む第２の組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用するためのものである。

【0021】

好ましい実施形態では、組み合わせは、同時に又は連続して投与される。

【0022】

第２の態様では、本発明は、以下に記載されるような第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクター、並びに、キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、目的の組織に特異的なプロモーター、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクターのカセットに挿入された核酸配列に対応する核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む第２の組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含む医薬組成物に関し、核酸配列は、対象の前記目的の組織にデリバリーされる前記核酸配列に対する免疫寛容を誘導する際の薬物として使用するために、目的の組織に向けて投与される。

【0023】

好ましい実施形態において、医薬組成物は、同時に又は連続して投与される。別の実施形態では、医薬組成物は、２回又は３回、必要な回数だけ、及び／又は繰り返し投与することができる。有利には、医薬組成物は、静脈内又は筋肉内に投与される。

【0024】

より好ましい実施形態において、医薬組成物は、遺伝子治療において、好ましくは筋ジストロフィーにおいて、好ましくは単一遺伝子性筋障害において、より好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて有用である。あるいは、医薬組成物は、自己免疫応答によって標的とされるタンパク質をコーディングする前記核酸配列を使用して、自己免疫障害において有用である。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ｒＡＡＶ構築物。ｍＯＶＡ構築物は、Ｈ－２Ｋｂ遺伝子のリーダーペプチド（ＬＳ）と、それぞれＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩのエピトープ、ＯＶＡ２５７及びＯＶＡ３２３を含む完全長さＯＶＡ ｃＤＮＡと、Ｈ－２Ｄｂ膜貫通配列（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＴＭ）と、それに続くＳＴＯＰコドン及びポリＡ鎖（ｐｏｌｙ Ａ、ｐＡ）を含む。ｍＯＶＡ－ＧＦＰ構築物は、Ｈ－２Ｋｂ遺伝子のリーダーペプチド（ＬＳ）、完全長さＯＶＡ ｃＤＮＡ、Ｈ－２Ｄｂ膜貫通配列（ＴＭ）、及び完全長さＥＧＦＰｃＤＮＡを含む。筋肉標的構築物（Ａ）には、筋肉に強い親和性を持つｒＡＡＶ１にカプセル化するための筋肉特異的プロモーターＳＰｃ５－１２と２つのＩＴＲ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ、逆方向末端反復）配列が含まれる。肝臓標的構築物（Ｂ）には、肝臓に強い親和性を持つｒＡＡＶ８にカプセル化するための肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴと２つのＩＴＲ配列が含まれる。肝臓標的構築物（Ｃ）には、ｒＡＡＶ８にカプセル化するため肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴと２つのＩＴＲ配列、及び完全なｈＦＩＸ導入遺伝子カセットが含まれる。

【図2】筋肉の導入遺伝子特異的免疫寛容は、同時肝臓標的によって付与される。オスのＣ５７／Ｂｌ６マウスに、筋肉特異的ＳＰｃ５－１２プロモーターの下でｍＯＶＡをコーディングするｒＡＡＶ１の１０⁹ウイルスゲノム（ｖｉｒａｌ ｇｅｎｏｍｅ、ｖｇ）を左前脛骨筋に注射し、肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴの下でｍＯＶＡをコーディングする１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ８を静脈注射（ｉ．ｖ．）した。記載された実験条件は、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射（ｉ．ｍ．）に対応し、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡの筋肉注射とｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡの静脈注射の同時注射に対応する。１４日目と２８日目にリンパ球を血液から抽出し、Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー染色とサイトメトリーによってＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞を分析した。（Ａ）ｄ２８での代表的なドットプロット。（Ｂ）ＣＤ８⁺Ｔ細胞でゲートされた血中のＣＤ８⁺Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー⁺（テトラマー⁺）の頻度。（Ｃ）任意単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ、ＡＵ）における対照血清と比較した抗ＯＶＡ ＩｇＧの濃度。（Ｄ）記載された実験条件で２９日目に筋肉で実行されたＲＴ－ｑＰＣＲ。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、「筋肉注射＋静脈注射」のグループ内のＯＶＡ ＲＮＡ発現と比較して示される（材料と方法を参照）。各ドットは、個々の動物を表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝９マウス／グループ、３つの独立した実験からプール）。^**ｐ＜０．０１、^****ｐ＜０．０００１（マン・ホイットニー検定（Ｍａｎｎ－Ｗｉｔｈｎｅｙ ｔｅｓｔ））。

【図3】導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞寛容は、肝臓への形質導入の長時間後に筋肉で確立される。オスのＣ５７／Ｂｌ６マウスに２８日目又は７日目に１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡを静脈注射し、又は注射しなかった（対照群）。０日目に、マウスに１×１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡを左前脛骨筋に筋肉注射した。１４日目と２８日目に採血し、２９日目にマウスを安楽死させて注射した筋肉と肝臓を採取した。（Ａ）実験のタイムライン。（Ｂ）記載された３つの実験条件で２８日目に評価されたＣＤ８⁺Ｔ細胞でゲートされたＣＤ８⁺Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー⁺（テトラマー⁺）の頻度。（Ｃ）記載された３つの実験条件で２９日目に筋肉で実行されたＲＴ－ｑＰＣＲ。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、「筋肉注射＋静脈注射 ７日目」のグループ内のＯＶＡ ＲＮＡ発現と比較して示される。各ドットは、個々の動物を表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６マウス／グループ、２つの独立した実験からプール）。^**ｐ＜０．０１（マン・ホイットニー検定）。

【図4】導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞寛容は、事前の免疫化にもかかわらず、筋肉で発生する。オスのＣ５７／Ｂｌ６マウスは、０日目に尾部ベース注射によってＩＦＡ（ＯＶＡ／ＩＦＡ）に乳化されたＯＶＡで免疫化し、又は免疫化しなかった後、１４日目に示されたｒＡＡＶを注射した。２８日目に採血し、２９日目にマウスを安楽死させて脾臓と注射した筋肉を採取した。ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡの筋肉注射及びｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡの静脈注射は図２に示すように実行された。ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射は、Ｔ細胞集団の分析を改善するために１０¹⁰ｖｇで実行された。脾臓からリンパ球を抽出して、Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー染色を行った。（Ａ）脾臓のＣＤ８⁺Ｔ細胞にゲートされたＣＤ８⁺Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー⁺（テトラマー⁺）の頻度。（Ｂ）任意単位（ＡＵ）における対照血清と比較した抗ＯＶＡ ＩｇＧの量。（Ｃ）記載された４つの実験条件で２９日目に筋肉で実行されたＲＴ－ｑＰＣＲ。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、免疫化されていない「筋肉注射＋静脈注射」のグループ内のＯＶＡ ＲＮＡ発現と比較して示される。各ドットは、個々の動物を表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝９マウス／グループ、３つの独立した実験からプール）。^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１、^****ｐ＜０．０００１（マン・ホイットニー検定）。

【図5】残存ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、事前の免疫化と寛容誘導の後にＰＤ－１^hi表現型を示す。オスのＣ５７／Ｂｌ６マウスは、ＩＦＡに乳化されたＯＶＡ又はＯＶＡ２５７（ＯＶＡ／ＩＦＡ又はＯＶＡ２５７／ＩＦＡ）で免疫化され、又は免疫化されずに、図４に説明されているように注射された（１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ１－ｍＯＶＡ筋肉注射及びｒＡＡＶ８－ｍＯＶＡ静脈注射）。（Ａ）脾臓のＣＤ８⁺ＣＤ４４^hiＴ細胞にゲートされたＣＤ８⁺Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー⁺（テトラマー⁺）及びＰＤ－１⁺Ｔ細胞の代表的なドットプロットを、記載された４つの実験条件で２８日目に評価した。（Ｂ）脾臓のＣＤ８⁺ＣＤ４４^hiＴ細胞にゲートされたＣＤ８⁺Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー⁺（テトラマー⁺）Ｔ細胞の頻度を、記載されている６つの実験条件で２８日目に評価した。（Ｃ）ＯＶＡ／ＩＦＡ又はＯＶＡ２５７／ＩＦＡ免疫化後にＣＤ８⁺ＣＤ４４⁺テトラマー⁺Ｔ細胞でゲートされたＰＤ－１（上のパネル）、ＣＤ４４（中央のパネル）及びＣＤ８（下のパネル）の発現レベルのＭＦＩ。各ドットは、個々の動物を表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６マウス／グループ、２つの独立した実験からプール）。^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１（マン・ホイットニー検定）。

【図6】残存ＯＶＡ特異的ＰＤ－１^hiＣＤ８⁺Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生の欠如。図５に示す実験から、ＩＦＡに乳化したＯＶＡ又はＯＶＡ２５７（ＯＶＡ／ＩＦＡ又はＯＶＡ２５７／ＩＦＡ）で免疫化され、又は免疫化されなかったオスＣ５７／Ｂｌ６マウスの脾細胞は、ＯＶＡ２５７ペプチドでインヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で４時間刺激され、細胞内染色のために処理された。（Ａ）ＯＶＡ２５７ペプチドによるインヴィトロ刺激後のＣＤ８⁺Ｔ細胞集団でゲートされたＰＤ－１⁺及びＩＦＮγ⁺脾細胞の代表的なドットプロット。（Ｂ）ＯＶＡ２５７ペプチドによるインヴィトロ刺激後の脾臓のＣＤ８⁺Ｔ細胞にゲートされたＩＮＦγ⁺産生細胞の頻度。（Ｃ）記載された４つの実験条件で、２９日目に筋肉で実行されたＲＴ－ｑＰＣＲ。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、免疫化されていない「筋肉注射＋静脈注射」のグループ内のＯＶＡ ＲＮＡ発現と比較して示される。各ドットは、個々の動物を表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６マウス／グループ、２つの独立した実験からプール）。^**ｐ＜０．０１、ｎｓ ｐ＞０．０５（マン・ホイットニー検定）。

【図7】導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞寛容は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞免疫化にもかかわらず確立される。オスのＣ５７／Ｂｌ６マウスは、ＩＦＡに乳化されたＯＶＡ３２３ペプチド（ＭＨＣＩＩエピトープ）（ＯＶＡ３２３／ＩＦＡ）で免疫化され、又は免疫化されずに、図４に説明されているように注射された（１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ１－ｍＯＶＡ筋肉注射及びｒＡＡＶ８－ｍＯＶＡ静脈注射）。脾臓からリンパ球を抽出して、ＣＤ８⁺Ｔ細胞Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー及び細胞内ＩＮＦγの染色を行った。（Ａ）脾臓のＣＤ４⁺ＣＤ４４^hiＴ細胞でゲートされたＩＮＦγ⁺の頻度。（Ｂ）任意単位（ＡＵ）における対照血清と比較した抗ＯＶＡ ＩｇＧの量。（Ｃ）脾臓のＣＤ８⁺ＣＤ４４^hiＴ細胞でゲートされたＣＤ８⁺Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー⁺（テトラマー⁺）の頻度。（Ｄ）記載された４つの実験条件で２９日目に筋肉で実行されたＲＴ－ｑＰＣＲ。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、免疫化されていない「筋肉注射＋静脈注射」のグループ内のＯＶＡ ＲＮＡ発現と比較して示される。各ドットは、個々の動物を表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６～９マウス／グループ、２つ～３つの独立した実験からプール）。ｎｓ ｐ＞０．０５、^**ｐ＜０．０１、^****ｐ＜０．０００１（マン・ホイットニー検定）。

【図8】異種の導入遺伝子の筋肉注射及び静脈注射後の寛容の欠如。オスのＣ５７／Ｂｌ６マウスに、筋肉特異的Ｓｐｃ５１２プロモーターの下でｍＯＶＡをコーディングするｒＡＡＶ１の１０⁹ウイルスゲノム（ｖｇ）を左前脛骨筋に筋肉注射し、肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴの下でｈＦＩＸをコーディングする１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ８を静脈注射した。リンパ球は、サイトメトリーによってＣＤ８⁺Ｔ細胞のＯＶＡ特異的テトラマー染色を分析するために、１４日目と２８日目に血液から、２９日目に肝臓から抽出した。（Ａ）血中の２８日目での代表的なドットプロット。（Ｂ）ＣＤ８⁺Ｔ細胞でゲートされた血中のＣＤ８⁺Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー⁺（テトラマー⁺）の頻度。（Ｃ）任意単位（ＡＵ）における対照血清と比較した抗ＯＶＡ ＩｇＧの量。（Ｄ）記載された実験条件で２９日目に筋肉で実行されたＲＴ－ｑＰＣＲ。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、「ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射及びｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射」のグループ内のＯＶＡ ＲＮＡ発現と比較して示される。各ドットは、個々の動物を表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝９マウス／グループ、３つの独立した実験からプール）。ｎｓ ｐ＞０．０５（マン・ホイットニー検定）。

【図9】追加のＣＤ４エピトープを有するｍＯＶＡ－ＧＦＰ導入遺伝子の筋肉及び肝臓への形質導入による寛容の誘導。１２匹のオスのＣ５７／Ｂｌ６マウスは、０日目にＭＨＣＩＩＧＦＰエピトープで免疫化され、又は免疫化されずに、１４日目に、筋肉特異的なＳｐｃ５１２プロモーターの下でｍＯＶＡ／ＧＦＰをコーディングする２．５×１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ１を筋肉注射し、肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴの下でｍＯＶＡ／ＧＦＰをコーディングする１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ８を静脈注射した。脾臓及び注射された筋肉を収集するために、２９日目にマウスを安楽死させた。脾臓からリンパ球を抽出して、ＣＤ８⁺Ｔ細胞でＫｂ／ＯＶＡ２５７テトラマーの染色を行い、ＣＤ４⁺Ｔ細胞で細胞内ＩＮＦγの染色を行った。（Ａ）実験のタイムライン。（Ｂ）記載された２つの実験条件（下のパネル）における、代表的なドットプロット（上のパネル）、及び２８日目でのＣＤ８⁺Ｔ細胞におけるＣＤ８⁺Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー⁺（テトラマー⁺）（左軸）の頻度と筋肉におけるＯＶＡ ＲＮＡの発現（右軸、下のパネル）。（Ｃ）記載された２つの実験条件（下のパネル）の２８日目における、ＣＤ４⁺ＣＤ４４^hiＩＮＦγ⁺Ｔ細胞の代表的なドットプロット（上のパネル）、脾臓のＣＤ４⁺ＣＤ４４^hiＴ細胞でゲートされたＩＮＦγ⁺の頻度（左軸）、及び任意単位における対照血清と比較した血中抗ＯＶＡ ＩｇＧの量（ＡＵ、右軸、下のパネル）。各ドットは個々の動物を表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３マウス／グループ）。

【図10】ｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ肝臓デリバリー及び異種ｍＯＶＡ－ＧＦＰ筋肉デリバリーによる持続的免疫寛容の誘導。オスのＣ５７／Ｂｌ６マウスに２８日目又は７日目に１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡを静脈注射し、又は注射しなかった（対照群）。０日目に、マウスに２．５×１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ－ＧＦＰを左前脛骨筋に筋肉注射した。１４日目と２８日目に採血し、２９日目にマウスを安楽死させて注射した筋肉と肝臓を採取した。（Ａ）実験のタイムライン。（Ｂ）記載された３つの実験条件（下のパネル）で２８日目におけるＣＤ８⁺Ｔ細胞（下のパネル）でゲートされたＣＤ８⁺Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー⁺（テトラマー⁺）の血中の代表的なドットプロット（上のパネル）と頻度。（Ｃ）「ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ－ＧＦＰ筋肉注射及びｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射 ７日目」と比較した、２９日目に筋肉でのＯＶＡ ＲＮＡ発現を定量化するためのＲＴ－ｑＰＣＲ。各ドットは、個々の動物を表し、平均±ＳＥＭ（ｎ＝６マウス／グループ、２つの独立した実験からプール）。^**ｐ＜０．０１（マン・ホイットニー検定）。

【図11】ｍＯＶＡ－ＧＦＰ導入遺伝子の筋肉肝臓二重形質導入後の筋肉における局所炎症の欠如。筋肉特異的ＳＰｃ５－１２プロモーターの下でｍＯＶＡ－ＧＦＰをコーディングするｒＡＡＶ１の１０¹⁰ウイルスゲノム（ｖｇ）を左前脛骨筋に注射し、さらに肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴの下でｍＯＶＡ－ＧＦＰをコーディングする１×１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ８を静脈注射し（Ｂ）又はしなかった（Ａ）マウスの筋肉切片の代表的な免疫染色画像。ｍＯＶＡ－ＧＦＰ：ｍＯＶＡ－ＧＦＰ導入遺伝子を発現する筋線維のＧＦＰラベル。ＭＣＨＩＩ：細胞のＭＨＣＩＩラベル；ＤＡＰＩ：核免疫染色。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明者らは、特異的Ｔ細胞応答を解読するのによく適合した高度に免疫原性のＯＶＡ導入遺伝子を使用し、驚くべきことに、筋肉肝臓におけるｒＡＡＶの二重形質導入が、ｒＡＡＶ筋肉形質導入によって生成される抗導入遺伝子ＣＤ８⁺Ｔ細胞及び体液性応答の両方に対して持続的寛容を付与することを発見した。重要なことに、ＣＤ８⁺及びＣＤ４⁺Ｔ細胞を含む免疫前物質の存在下では、この寛容誘導は、導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の部分的欠失及び疲弊の誘導を通じて機能することが示されている。したがって、本発明者らは、肝臓のｒＡＡＶ形質導入が、導入遺伝子に対する既存の免疫応答に関係なく、筋肉形質導入後に誘発される導入遺伝子特異的Ｔ細胞レパートリー全体に免疫寛容を付与することを発見した。

【0027】

ｒＡＡＶベクターの投与後の免疫反応を治療及び予防するために、本発明は、対象の目的の組織にデリバリーされた核酸配列からコーディング及び翻訳されるタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導する際の薬物として使用するための、以下を含む２つの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせを提供する：
ｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容に有用な目的の核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、当該核酸配列は、肝臓に向けてデリバリーされるように投与される第１のｒＡＡＶベクター；及び
ｉｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、目的の組織に特異的プロモーター、第１のｒＡＡＶベクターのカセットに挿入された核酸配列に対応する核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、当該核酸配列は、目的の組織に向けて投与される第２のｒＡＡＶベクター。

【0028】

定義
本明細書で意図されるように、「含む」という用語は、「備える」又は「有する」の意味を有する。すなわち、対象が１つ又は複数の要素を「含む」場合、上記以外の要素も対象に含まれ得る。対照的に、対象が１つ又は複数の要素「からなる」と書かれる場合、対象には、言及されている要素以外の要素を含めることはできない。

【0029】

本発明によれば、「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、遺伝子治療で治療できる疾患に罹患している、又は罹患する可能性が高い哺乳動物を指す。対象は好ましくはヒトである。

【0030】

疾患又は病状の「治療」とは、患者の健康状態を改善することを目的としたあらゆる行為を指す。「治療」には、以下が含まれるが、これらに限定されない：１つ又は複数の症状又は病状の緩和又は改善、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（例えば、患者の寛解の維持）、疾患の予防又は疾患の拡大の予防、疾患の進行の先延ばし又は遅延、疾患状態の改善又は緩和、疾患の再発の抑制、及び寛解（部分的又は全体的を問わず）。治療には、治癒、緩和、又は予防効果が含まれ得る。「予防的」という用語は、特定の病状の重症度又は発症を軽減すると見なすことができる。「予防的」はまた、以前に特定の病状と診断された患者におけるその病状の再発を防ぐことを含む。「療法」はまた、既存の病状の重症度を軽減又は遅延させ得る。治療の望ましい効果には、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。緩和は、疾患又は病状の徴候又は症状が現れる前、及びそれらが現れた後に起こり得る。したがって、「治療」は、疾患又は望ましくない病状の「予防」を含み得る。

【0031】

第１及び第２のｒＡＡＶベクターの本発明の組み合わせに関する場合の「組み合わせ」、「組み合わせ治療」又は「組み合わせ療法」という用語は、前記第１及び第２のｒＡＡＶベクターの同時投与に得られる生物学的効果（例えば免疫寛容及び／又は治療用ペプチド若しくはタンパク質の発現の改善）を引き起こすために対象に同時投与する治療を指す。本発明による組み合わせ療法において、前記第１及び第２のｒＡＡＶベクターは、同時に、一緒に、又は別々に、又は連続して投与され得る。また、それらは異なるルート及びプロトコルを介して投与され得る。例えば、ベクターの一方は静脈内に投与され得、他方は筋肉内に投与され得る。それらは、同じ経路及びプロトコル（例えば、両方とも静脈内）を介して投与することができる。また、第１及び第２のｒＡＡＶベクターは一緒に処方され得るが、別々に処方されてもよい。

【0032】

本明細書で使用される場合、「障害」又は「疾患」という用語は、遺伝的又は発達上のエラー、感染、毒、栄養不足若しくは不均衡、毒性、又は不利な環境要因の影響から生じる、身体の正常に機能しない器官、部分、構造、又は系統を指す。好ましくは、これらの用語は、健康障害又は疾患（例えば、正常な身体的又は精神的機能を害する病気）を指す。より好ましくは、障害という用語は、動物及び／又はヒトに影響を与える免疫及び／又は炎症性疾患を指す。

【0033】

本明細書で使用される「免疫疾患」又は「自己免疫疾患」という用語は、対象自身の細胞、組織及び／又は臓器に対する対象の免疫学的反応によって引き起こされる細胞、組織及び／又は臓器の損傷を特徴とする対象の病状を指す。

【0034】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
「組換えアデノ随伴ウイルス」又は「ｒＡＡＶ」は、ヌクレオチド配列の交換を使用して、細胞内のＤＮＡ配列の挿入、削除、又は置換を可能にする。他の遺伝子編集方法とは異なり、これは二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすことなく達成され、代わりに内因性の相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ＨＲ）を刺激する。その非病原性のため、生きている患者の遺伝子治療にも適している。特に、ｒＡＡＶゲノムは、長さが約４．７キロベースのポジティブ又はネガティブセンスの一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）で構成されている。これらの一本鎖ＤＮＡウイルスベクターは、高い形質導入率を持ち、ゲノムに二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすことなく、内因性ＨＲを刺激するという独特の特性を持っている。ｒＡＡＶは、遺伝子治療、などの眼疾患での使用に特に適しており、例えばＬＵＸＴＵＲＮＡ（商標）（ｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ－ｒｚｙｌ；Ｓｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州フィラデルフィア）があり、これは、二対立遺伝子ＲＰＥ６５突然変異関連網膜ジストロフィーの治療のためにＲＰＥ６５遺伝子の正常なコピーを網膜細胞にデリバリーする。ｒＡＡＶベクターを使用し、２０１２年１１月にヨーロッパで承認された遺伝子治療のもう１つの例は、Ａｌｉｐｏｇｅｎｅ ｔｉｐａｒｖｏｖｅｃ（商品名ＧＬＹＢＥＲＡ（商標）で販売）である。この遺伝子治療は、重度の膵炎を引き起こす可能性のあるまれな遺伝性疾患であるリポタンパク質リパーゼ欠損症（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ、ＬＰＬＤ）を改善するように設計されている。アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＡＶ１）ウイルスベクターは、ヒトリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子の完全なコピーを筋肉細胞にデリバリーする。注射の後には、ウイルスに対する免疫反応を防ぐための免疫抑制療法が後続する。

【0035】

本発明はまた、対象の目的の組織にデリバリーされた核酸配列からコーディング及び翻訳されるタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導する際の薬物として使用するための、以下を含む２つの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせの使用に関する：
ｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容に有用な目的の核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、当該核酸配列は、肝臓に向けてデリバリーされるように投与される第１のｒＡＡＶベクター；及び
ｉｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、目的の組織に特異的プロモーター、第１のｒＡＡＶベクターのカセットに挿入された核酸配列に対応する核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターであって、当該核酸配列は、目的の組織に向けて投与される第２のｒＡＡＶベクター。

【0036】

本発明の特定の実施形態は、第１又は第２のｒＡＡＶベクターのいずれかによってコーディングされるタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導するのに使用される、以下の組み合わせに関する：
ｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
ｉｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、筋肉特異的プロモーター、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクターの免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；
前記第１のｒＡＡＶは肝臓を標的とするために投与され、前記第２のｒＡＡＶは筋肉組織を標的とするために投与される、組み合わせ。

【0037】

本発明の別の特定の実施形態は、第１又は第２のｒＡＡＶベクターのいずれかによってコーディングされるタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導するのに使用される、以下の組み合わせに関する：
ｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
ｉｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、筋肉特異的プロモーター、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクターの免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；
前記第１のｒＡＡＶは肝臓を標的とするために投与され、前記第２のｒＡＡＶは筋肉組織を標的とするために投与される、組み合わせ。

【0038】

特定の実施形態において、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに挿入されたカセットは、細胞関連タンパク質産物をコーディングする核酸配列を含む。「細胞関連タンパク質産物」とは、本発明において、リーダー配列の非存在下でタンパク質を細胞質ゾルにデリバリーするために、膜貫通ドメインを介して、又はデフォルトでタンパク質を膜に固定することを可能にする特定の配列を指す。好ましくは、カセットに挿入された目的の核酸配列は、膜貫通タンパク質産物をコーディングする。

【0039】

好ましい実施形態において、本発明は、２つの組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせに関し、カセットに挿入された目的の核酸配列は、Ｔ細胞又はＢ細胞によって認識されるエピトープを含むタンパク質産物をコーディングする。「核酸配列」又は「導入遺伝子」とは、本発明において、疾患の治療のための治療作用を有する、目的であると考えられる核酸の配列を指す。好ましくは、目的の核酸配列は療法的に有効である。好ましくは、導入遺伝子は、治療用（ポリ）ペプチド又は治療用タンパク質をコーディングし、本明細書では、「治療用タンパク質産物」、「タンパク質産物」又は「免疫系寛容対象のタンパク質産物」を指す。前記タンパク質産物は、置換によって、又は対象における欠陥タンパク質の活性を補充することによって、細胞内の欠陥活性を治癒するのに特に効果的である。

【0040】

特定の実施形態では、第１のｒＡＡＶベクターに挿入されたカセットは、治療用タンパク質の免疫原性部分のみをコーディングする核酸配列を含み、この部分は、Ｔ細胞又はＢ細胞のいずれかによって認識されるエピトープを含み、免疫反応に悪影響（例えば、導入遺伝子の拒絶及び／又は治療用タンパク質産物の低発現）を及ぼす。その場合、第１のｒＡＡＶベクターによって発現されるタンパク質産物は、その全長又は活性部分のいずれにおいても、細胞の欠陥のある活動を置換又は補充することによって、治療用タンパク質の生物学的活性を示さず、対象の免疫系に対してのみ活性を示す可能性がある。

【0041】

別の特定の実施形態では、第１のｒＡＡＶベクターに挿入されたカセットは、タンパク質産物（これは、細胞の欠陥のある活動を置換又は補充することによって、病気の治療に治療的に効果的である。）をコーディングする核酸配列を含み、より具体的には、タンパク質産物は、当技術分野で説明又は知られているように、その全長において活性タンパク質に対応する。

【0042】

さらに特定の実施形態では、第１のｒＡＡＶベクターによってコーディングされるタンパク質産物は、治療用タンパク質の免疫原性部分、すなわち、Ｔ細胞又はＢ細胞のいずれかによって認識され、有害な免疫反応の原因であるエピトープを含む部分のみである一方で、第２のｒＡＡＶベクターによって発現されるタンパク質産物は、対象の欠陥タンパク質の活性を置換又は補充することによって疾患を治癒することを可能にするタンパク質産物に対応する。第２のｒＡＡＶによって発現される前記タンパク質産物は、当技術分野で知られているように、その全長にわたって活性タンパク質であり得る。

【0043】

別の特定の実施形態では、第２のｒＡＡＶベクターのカセットは、タンパク質産物をコーディングする配列に融合される膜貫通ヌクレオチド配列を含み、これにより、形質導入された細胞で発現された場合、タンパク質産物は、膜貫通ドメインを介して形質導入された細胞の表面に維持される。

【0044】

本発明の文脈で使用するための治療用（ポリ）ペプチド及びタンパク質は、以下を含むが、これらに限定されない：ジストロフィンの人工形態を表すマイクロジストロフィン、エメリン、ラミンＡ／Ｃ、スペクトリンリピート内包、核エンベロープ１（ネスプリン１）、スペクトリンリピート内包、核エンベロープ２（ネスプリン２）、膜貫通タンパク質４３、トルシンＡ相互作用タンパク質１、ダブルホメオボックス４、染色体の柔軟ヒンジドメイン内包１の構造維持、ポリメラーゼＩと転写物放出因子（Ｍ）、ミオチリン、カベオリン３、ＨＳＰ－４０ホモログ、サブファミリーＢ、ナンバー６、デスミン、トランスポーチン３、異種核リボヌクレオプロテインＤ型、カルパイン３、ディスフェリン、ガンマサルコグリカン、アルファサルコグリカン、ベータサルコグリカン、デルタ－サルコグリカン、テレトニン、三者モチーフ内包３２、フクチン関連タンパク質、チチン、タンパク質－Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼ１、アノクタミン５、タンパク質－Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼ２、Ｏ－結合マンノースベータ１，２－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ジストログリカン１、プレクチン、デスミン、輸送タンパク質粒子複合体１１、ＧＤＰ－マンノースピロホスホリラーゼＢ、イソプレノイドシンターゼドメイン内包、酸性アルファ－グルコシダーゼプレプロタンパク質、ＬＩＭ及び老化細胞抗原様ドメイン２、血管心外膜物質、トルシンＡ相互作用タンパク質１、プロテインＯ－グルコシルトランスフェラーゼ１、ドリチルリン酸マンノシルトランスフェラーゼポリペプチド３、バロシン内包タンパク質、プレクチン。

【0045】

本発明の組み合わせは、免疫寛容が求められるタンパク質産物に対する細胞性及び体液性免疫応答の発生を排除又は減弱するのに特に効果的である。より具体的には、この組み合わせは、導入遺伝子によってコーディングされるタンパク質産物に対する既存の体液性及びＣＤ８⁺Ｔ細胞免疫にもかかわらず、ＣＤ８⁺Ｔ細胞免疫寛容を可能にする。

【0046】

したがって、特定の実施形態では、本発明は、対象においてｒＡＡＶベクターのカセットによってコーディングされるタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導する際に使用するための、上記で開示された第１のｒＡＡＶ及び第２のｒＡＡＶベクターの組み合わせに関し、ここで、免疫寛容を誘導することは、免疫寛容が求められるタンパク質産物（例えば、治療用タンパク質製品）に対する細胞性及び体液性免疫応答の発生を排除又は減弱することを含む。別の特定の実施形態では、本発明は、対象においてｒＡＡＶベクターのカセットによってコーディングされるタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導する際に使用するための、上記で開示された第１のｒＡＡＶ及び第２のｒＡＡＶベクターの組み合わせに関し、ここで、免疫寛容の誘導には、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の免疫寛容を可能にすることが含れる。別の特定の実施形態では、本発明は、対象においてｒＡＡＶベクターのカセットによってコーディングされるタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導する際に使用するための、上記で開示された第１のｒＡＡＶ及び第２のｒＡＡＶベクターの組み合わせに関し、ここで、対象は、前記タンパク質産物に対する既存の免疫を有する。

【0047】

連続して投与される場合、本発明による組み合わせでの第１及び第２のｒＡＡＶベクターの投与間の時間間隔は、導入遺伝子によってコーディングされるタンパク質産物に対する免疫寛容が少なくとも維持されるか、又は最適になるべきである。

【0048】

本発明者らは、免疫寛容が求められる導入遺伝子を最初に肝臓投与した長時間後に免疫寛容を発見した。したがって、本発明の組み合わせにおいて、第１のｒＡＡＶベクターは、第２のｒＡＡＶベクターの前に、好ましくは１週間、さらにより好ましくは第２のｒＡＡＶベクターの１ヶ月前に投与される。

【0049】

有利には、核酸配列又は導入遺伝子は、Ｔ細胞又はＢ細胞によって認識されるエピトープを含むタンパク質産物をコーディングする。このエピトープは、対象によって認識され、特定の免疫応答を開始することができ、これは、遺伝子導入操作及び前記核酸配列によってコーディングされる導入遺伝子の治療的発現レベルの回復にとって有害である。

【0050】

本発明の文脈において、本発明者らは、驚くべきことに、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせが、ＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＢリンパ球の以前の免疫化の状態を有した対象に投与され得ることを見出した。本発明のこの態様は、導入遺伝子に対する既存の免疫に遭遇する臨床状況に特に適している。まれなエクソンスキッピングイベント、遺伝子変異の逆転、又は以前に投与されたタンパク質置換療法に対する既存の免疫を発達させたために欠陥タンパク質の発現が自発的に部分的に回復した患者は、導入遺伝子に対するそのような既存の免疫を発生させ得る。より好ましい実施形態において、組み合わせは、前記核酸配列によってコーディングされるタンパク質産物に対してＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＢリンパ球の顕著なレベルの免疫化を示す対象に投与される。本発明によれば、対象が、前記核酸配列からコーディング及び翻訳されたタンパク質産物に対して以前の免疫化状態を有していた場合に、組み合わせを投与することができる。好ましくは、組み合わせは、前記核酸配列からコーディング及び翻訳されたタンパク質産物に対する以前の免疫化状態が、前記タンパク質産物に特異的なＣＤ４、ＣＤ８及び／又はＢリンパ球の存在をもたらす対象に投与することができる。

【0051】

好ましい実施形態において、カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせは、リーダーペプチドをさらに含む。リーダーペプチドは、第１のｒＡＡＶ又は第２のｒＡＡＶのみ、あるいは両方のｒＡＡＶに挿入できる。本発明の文脈において、リーダーペプチドは、転写又は翻訳の減衰、ｍＲＮＡの転写又は翻訳を調節するメカニズムに関与する、細菌のリーダーＲＮＡ配列から翻訳されるのに特に適した短いペプチドである。

【0052】

好ましい実施形態において、本発明による組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせは、第１のｒＡＡＶベクターにおいて、肝細胞特異的プロモーター（ｈＡＡＴ）である肝臓特異的プロモーターを含む。肝細胞特異的プロモーター（ｈＡＡＴ）は、特に肝臓、より具体的には遺伝子治療における肝細胞を標的とするように適合されている。

【0053】

本発明の別の実施形態において、第１及び／又は第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びそれらの任意の組み合わせからなる群から独立して選択されるキャプシドを含む。上記のグループで選択されたキャプシドは、組み合わせの第１及び第２のｒＡＡＶベクターにおいて同じであり得るか、又は、本発明の組み合わせの各第１、第２のｒＡＡＶベクターのキャプシドが異なる。例えば、限定的ではないが、第１のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシドを含み、第２のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９又はＡＡＶ２キャプシドを含む。別の例では、第１のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９キャプシドを含み、第２のｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１又はＡＡＶ９又はＡＡＶ２キャプシドを含む。

【0054】

アデノ随伴ウイルスのキャプシドは、直径約２５ｎｍの二十面体を形成する。それは、構造タンパク質ＶＰ１（ウイルスタンパク質（ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）１）、ＶＰ２、ＶＰ３で構成され、１：１：１０の比率で組み立てられている。ＶＡＡ変異体の屈性は、主にＶＰタンパク質のループドメインによって決定される。アデノ随伴ウイルスが標的細胞に侵入するメカニズムは、血清型によって異なる。一般に、アデノ随伴ウイルス感染は、細胞受容体への付着から始まり、二次受容体を介したエンドサイトーシスによる内在化が続く。エンドソーム及び細胞質の輸送に続いて、ウイルスは脱キャップされ、核内にそのＤＮＡを放出する。

【0055】

現在、ＡＡＶのキャプシドである１１の血清型が同定されており、最もよく特徴付けられ、最も一般的に使用されているのはＡＡＶ２である。これらの血清型は、その向性又は感染する細胞の種類が異なるため、ＡＡＶは特定の細胞型を優先的に形質導入するための非常に有用なシステムになっている。以下の表は、ＡＡＶ血清型の向性の要約を示しており、特定の臓器の形質導入に最適な血清型を示している。

【0056】

【表1】

【0057】

本発明の文脈において、キャプシドは、好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９キャプシドからなる群から選択される。筋ジストロフィーを治療する状況で免疫寛容を誘導することを検討する場合、キャプシドは、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９からなる群からより好ましくは選択され、さらにより好ましくは、キャプシドはＡＡＶ８キャプシドである。

【0058】

実験のセクションに示されているように、筋肉において、本発明による組み合わせによってもたらされるタンパク質産物に対する細胞性及び体液性免疫応答の排除又は減弱は、免疫寛容が誘導されない場合に観察される筋肉組織の局所炎症をなくす結果となる。さらに、形質導入された細胞におけるタンパク質産物の発現の改善が観察される。これらの特徴により、本発明の組み合わせは筋ジストロフィーの治療のために特に好適になる。

【0059】

したがって、本発明の特定の実施形態は、対象における筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害の治療のために使用される、以下の組み合わせに関する：
ｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
ｉｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、筋肉特異的プロモーター、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクターの免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；
第１のｒＡＡＶは肝臓を標的とするために投与され、第２のｒＡＡＶは筋肉組織を標的とするために投与される、組み合わせ。

【0060】

また、本発明のより具体的な実施形態は、対象における筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害の治療のために使用される、以下の組み合わせに関する：
ｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
ｉｉ．キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、筋肉特異的プロモーター、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクターの免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；
第１のｒＡＡＶは肝臓を標的とするために投与され、第２のｒＡＡＶは筋肉組織を標的とするために投与される、組み合わせ。

【0061】

したがって、特定の実施形態では、本発明は、筋ジストロフィーの治療のために使用される、上記で開示された第１のｒＡＡＶ及び第２のｒＡＡＶベクターの組み合わせに関し、ここで、筋ジストロフィーの治療は、免疫寛容が求められているタンパク質産物に対する細胞性及び体液性免疫応答の発生を排除又は減弱することを含み、前記タンパク質産物が免疫系及び／又は対象の筋肉におけるその発現によって許容されることを可能にする。別の特定の実施形態において、筋ジストロフィーを治療することは、対象におけるタンパク質産物に対するＣＤ８⁺Ｔ細胞免疫寛容を可能にすることを含む。より好ましい実施形態において、本発明は、上記のような第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターと、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターとの組み合わせに関し、ここで、目的の核酸配列は、筋肉関連タンパク質、好ましくは膜タンパク質をコーディングする。

【0062】

より具体的には、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、筋肉特異的プロモーター、第１のｒＡＡＶベクターのカセットに挿入された核酸配列に対応する核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含み、ここで、核酸配列は、対象において前記核酸配列からコーディング及び翻訳されたタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導する薬物として使用するために、筋肉に投与される。

【0063】

別の実施形態では、目的の核酸配列は、筋肉特異的タンパク質又は神経筋タンパク質をコーディングする。

【0064】

本発明の特定の実施形態において、組み合わせは、２つのｒＡＡＶベクターにおいて、以下からなる群から選択された配列をコーディングする核酸配列を含む：マイクロジストロフィン構築物、エメリン、ラミンＡ／Ｃ、スペクトリンリピート内包、核エンベロープ１（ネスプリン１）、スペクトリンリピート内包、核エンベロープ２（ネスプリン２）、膜貫通タンパク質４３、トルシンＡ相互作用タンパク質１、ダブルホメオボックス４、染色体の柔軟ヒンジドメイン内包１の構造維持、ポリメラーゼＩと転写物放出因子（Ｍ）、ミオチリン、カベオリン３、ＨＳＰ－４０ホモログ、サブファミリーＢ、ナンバー６、デスミン、トランスポーチン３、異種核リボヌクレオプロテインＤ型、カルパイン３、ディスフェリン、ガンマサルコグリカン、アルファサルコグリカン、ベータサルコグリカン、デルタ－サルコグリカン、テレトニン、三者モチーフ内包３２、フクチン関連タンパク質、チチン、タンパク質－Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼ１、アノクタミン５、タンパク質－Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼ２、Ｏ－結合マンノースベータ１，２－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ジストログリカン１、プレクチン、デスミン、輸送タンパク質粒子複合体１１、ＧＤＰ－マンノースピロホスホリラーゼＢ、イソプレノイドシンターゼドメイン内包、酸性アルファ－グルコシダーゼプレプロタンパク質、ＬＩＭ及び老化細胞抗原様ドメイン２、血管心外膜物質、トルシンＡ相互作用タンパク質１、プロテインＯ－グルコシルトランスフェラーゼ１、ドリチルリン酸マンノシルトランスフェラーゼポリペプチド３、バロシン内包タンパク質、プレクチン。

【0065】

より好ましくは、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター及び第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの組み合わせが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療のために使用される。

【0066】

代替の実施形態によれば、本発明は、キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター及び目的の組織に特異的な第２のプロモーター、免疫系寛容に有用な目的の核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに関し、ここで、核酸配列は、対象の前記目的の組織にデリバリーされた前記核酸配列からコーディング及び翻訳されたタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導する際の薬物として使用するために、肝臓及び目的の組織に向けてデリバリーされるように投与される。

【0067】

医薬組成物
別の側面において、本発明は、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、並びに、キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、目的の組織に特異的なプロモーター、第１のｒＡＡＶベクターのカセットに挿入された核酸配列に対応する核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む医薬組成物に関し、ここで、核酸配列は、対象の前記対象組織にデリバリーされる前記核酸配列に対する免疫寛容を誘導する際の薬物として使用するために、対象の組織に向けて投与される。

【0068】

上記の第１のｒＡＡＶは、キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容に有用な目的の核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、ｒＡＡＶであり、ここで、核酸配列は肝臓にデリバリーされるために投与される。免疫系寛容に有用な目的の核酸配列は、薬物として有用な目的の導入遺伝子に対応し、治療的に有効である。目的の導入遺伝子とは、本発明において、前記導入遺伝子の任意の産物を指す。本発明の文脈において、目的の導入遺伝子の産物は、薬物として有用であり、治療的にも有効である。

【0069】

本発明の医薬組成物は、治療的に活性であり、対象の疾患の治療に有用である目的の導入遺伝子を含む、肝臓にデリバリーされる第１のｒＡＡＶと、第１のｒＡＡＶベクターのカセットに挿入された核酸配列に対応し、目的の組織、例えば筋肉にデリバリーされるのに有用である導入遺伝子を含む第２のｒＡＡＶに関する。

【0070】

好ましい実施形態において、第１及び第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、同時に又は連続して、好ましくは同時に投与される。

【0071】

本発明の特定の態様では、医薬組成物は、２回又は３回、必要な回数だけ、及び／又は繰り返し投与することができる。好ましい実施形態では、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）投与の後に、第１のｒＡＡＶベクターのカセットに挿入された核酸配列に対応し、目的の組織、例えば筋肉にデリバリーされるのに有用である導入遺伝子を含む、異なる血清型のｒＡＡＶを使用した第３のアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）投与が続く。このプロセスは、非交差反応性血清型を持つｒＡＡＶで数回繰り返すことができる。

【0072】

本発明の好ましい実施形態において、医薬組成物は、静脈内又は筋肉内に投与される。もちろん、疾患に応じて、例えば眼内注射などの他の投与方式に従って組成物を投与することは可能である。

【0073】

本発明によれば、医薬組成物は、遺伝子治療、好ましくは単一遺伝子障害の遺伝子治療で使用するのに特に適している。複数遺伝子療法の治療が実行可能である可能性があるが、本発明による医薬組成物は、筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害、より好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィーで使用するように特に適合されている。別の実施形態では、医薬組成物は、自己反応性Ｂ及びＴリンパ球によって標的とされるタンパク質をコーディングする導入遺伝子を含むｒＡＡＶベクターを使用して、自己免疫障害を治療するのに有用である。

【0074】

方法
別の側面では、本発明は、本発明による第１のｒＡＡＶを投与するステップを含む、目的の導入遺伝子の拒絶を防止するための方法、又は目的の導入遺伝子を保護するための方法であって、以下の実験部分に記載される方法に関し、ここで、ｒＡＡＶへの目的の核酸は、目的の導入遺伝子に対応する核酸である。

【0075】

一実施形態では、本発明による方法は、対象においてタンパク質産物に対する免疫寛容を誘導するための方法に関する。前記方法は、以下のステップを含み：
－キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを、対象に投与すること、及び
－キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、筋肉特異的プロモーター、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクターの免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを、対象に投与すること、
それにより、第１及び／又は第２のｒＡＶＶベクターによってコーディングされる免疫系寛容対象のタンパク質産物の拒絶の予防又は低下を可能にする。前記方法は、筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子型筋障害、さらにより好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療において特に好適である。

【0076】

一実施形態では、本発明の方法において、免疫寛容及び／又は目的の導入遺伝子によってコーディングされる寛容対象のタンパク質の発現を改善するために、ｒＡＡＶベクターのそれぞれを対象に繰り返し投与することができる。

【0077】

また、特定の実施形態では、この方法は、寛容対象のタンパク質の所望の免疫寛容及び／又は発現を得るために、上記の第１のｒＡＡＶの対象への反復投与を含む。さらに特定の実施形態では、このｒＡＡＶは、対象に１回、２回、又は３回も投与される。

【0078】

別の特定の実施形態では、この方法は、寛容対象のタンパク質の所望の免疫寛容及び／又は発現を得るために、上記のように第２のｒＡＡＶの対象への反復投与を含む。さらに特定の実施形態では、このｒＡＡＶは、対象に１回、２回、又は３回も投与される。

【0079】

別の特定の実施形態において、上記の第１及び第２のｒＡＡＶの投与は、例えば、第２のｒＡＡＶの投与時に肝臓において所望の免疫寛容誘導を得るために、時間的に分離され、それにより、免疫寛容の誘導が求められている導入遺伝子によってコーディングされるタンパク質に対する免疫寛容につき、第２のｒＡＡＶの投与の効果を最適化する。驚くべきことに、この方法は、前記目的の導入遺伝子による事前の免疫化の後に投与されるように特に適合されている。

【0080】

特定の実施形態では、本発明の方法は、寛容対象のタンパク質産物に対する既存の免疫の存在を試験又は検出するステップをさらに含む。前記検出は、例えば、免疫寛容が求められている導入遺伝子によってコーディングされるタンパク質に対する抗体又は反応性免疫細胞の存在を対象において検出するために、当業者に周知の任意の免疫学的方法を使用することによって容易に実行することができる。このステップは、上記の２つのｒＡＡＶベクターの投与ステップの前に実行できる。これは、例えば、各ｒＡＡＶベクターの投与回数又は治療期間を決定する際に、治療を対象に適合させるために好適であり得る。このステップは、例えば、対象における免疫寛容の誘導を評価するために、上記の２つのｒＡＡＶベクターの投与ステップの後に適用することもできる。

【0081】

本発明の治療方法及び使用のためのキット
本発明はまた、本発明の治療的使用、方法又は組成物のいずれかを実施するのに適したキットに関する。

【0082】

したがって、本発明のさらなる目的は、以下を含むキットである：
－キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
－キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、筋肉特異的プロモーター、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｉ）の免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。

【0083】

特定の実施形態では、前記キットは以下を含む：
－キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第１の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
－キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、筋肉特異的プロモーター、第１の組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｉ）の免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、第２の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。

【0084】

別の特定の実施形態では、前記キットは、寛容対象のタンパク質産物（前記第１及び第２のｒＡＡＶのそれぞれによってデリバリーされる核酸配列からコーディング及び翻訳される）に対する免疫寛容を誘導する際に前記第１及び第２のｒＡＡＶのそれぞれを使用するための説明書をさらに含む。

【0085】

より特定の実施形態では、前記キットは、対象の筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害を治療するための、寛容対象のタンパク質産物（前記第１及び第２のｒＡＡＶのそれぞれによってデリバリーされる核酸配列からコーディング及び翻訳される）に対する免疫寛容を誘導する際に前記及び第２のｒＡＡＶのそれぞれについての説明書をさらに含む。より具体的には、さらなる実施形態では、対象はデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を患っている。これに関して、本発明によるキットにおいて、前記第１のｒＡＡＶ及び第２のｒＡＡＶは、本発明のｒＡＡＶベクター、治療方法又は使用、及び医薬組成物について上記した特徴のいずれかを含む。

【0086】

上記で開示したように、本発明による治療用途又は方法において、第１及び第２のｒＡＡＶは、長い又は短い時間間隔で、同じ製剤で又は別々に対象に投与することができる。また、本発明はまた、本発明の使用又は方法の枠内で、肝臓の形質導入に適したキット及び筋肉の形質導入に適した別のキットに関する。

【0087】

よりさらなる実施形態では、本発明は、以下を含むキットに関する：
－キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
－寛容対象のタンパク質産物（前記ｒＡＡＶによってデリバリーされる核酸配列からコーディング及び翻訳される）に対する免疫寛容を誘導する際の前記ｒＡＡＶの使用に関する説明書、より具体的には、対象の肝臓における標的化及び形質導入のための、さらにより具体的には、対象における筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害を治療するための説明書。

【0088】

別のさらなる実施形態では、本発明は、以下を含むキットに関する：
－キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
－寛容対象のタンパク質産物（前記ｒＡＡＶによってデリバリーされる核酸配列からコーディング及び翻訳される）に対する免疫寛容を誘導する際の前記ｒＡＡＶの使用に関する説明書、より具体的には、対象の骨格筋における標的化及び形質導入のための、さらにより具体的には、対象における筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害を治療するための説明書。

【0089】

別のさらなる実施形態では、本発明は、以下を含むキットに関する：
－キャプシドと、５’ＩＴＲ配列、肝臓特異的プロモーター、免疫系寛容対象のタンパク質産物をコーディングする核酸配列、膜貫通配列、ポリＡ鎖を含むカセットとを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター；及び
－寛容対象のタンパク質産物（前記ｒＡＡＶによってデリバリーされる核酸配列からコーディング及び翻訳される）に対する免疫寛容を誘導する際の前記ｒＡＡＶの使用に関する説明書、より具体的には、対象の骨格筋における標的化及び形質導入のための、さらにより具体的には、対象における筋ジストロフィー、好ましくは単一遺伝子性筋障害を治療するための説明書。

【0090】

本発明の組み合わせの肝臓特異的プロモーターを含むｒＡＡＶ及び筋肉特異的プロモーターを含むｒＡＡＶが対象に連続して投与される場合、肝臓又は筋肉標的化のいずれかに専用のキットの使用は特に好適であり、さまざまな経路で投与するとさらに好適である。２つの別々のキットのさらなる目的は、例えば、筋肉を標的とする第２のｒＡＡＶベクターを投与する前に、望ましい肝臓特異的免疫寛容を得るために、肝臓の標的化と筋肉の標的化の間に時間間隔が適用される場合、さらに第１のＡＡＶの反復投与が適用される場合にある。また、筋肉特異的プロモーターを伴うｒＡＡＶの反復投与を適用して、例えば、寛容対象のタンパク質産物の望ましい免疫寛容及び／又は筋細胞による発現を得ることができる。

【0091】

本発明によるキットにおいて、肝臓又は筋肉特異的プロモーターのいずれかを有するｒＡＡＶベクターのそれぞれは、例えば、投与経路又は前記ｒＡＡＶベクターのそれぞれの投与回数に応じて、単位剤形である。有利なことに、前記キットは、寛容対象のペプチドの望ましい免疫寛容を得るために適切な数の単位剤形を含むことができる。

【0092】

特定の実施形態では、本発明によるキットは、例えば、適切な免疫寛容及び／又は効果的な治療を誘発するための治療プロトコル（例えば、第１及び第２のｒＡＡＶベクターのそれぞれの用量又は投与回数を適応させること）を決定するために、ｒＡＡＶベクターにコーディングされたタンパク質産物に対する既存の免疫を試験又は検出するための手段をさらに含む。

【0093】

本発明のさらなる態様及び利点は、以下の実施例に開示されるが、これらは例示と見なされるべきである。

【実施例】

【0094】

材料と方法
マウス及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）注射
６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊオスマウスは、ＪＡＮＶＩＥＲ ＬＡＢＳから購入し、特定病原体除去条件下で動物施設に収容し、フランス及びヨーロッパの指令に従って取り扱った。筋肉注射では、マウスをイソフルランで麻酔し、２５μＬのＰＢＳで希釈した指定用量のｒＡＡＶベクターを、３０ＧＲＮハミルトンシリンジを使用して左前脛骨筋に注射した。静脈注射では、ＰＢＳで希釈された２００μＬの示されたｒＡＡＶベクターを、０．５ｍＬのインスリンＭｙｊｅｃｔｏｒ Ｕ－１００シリンジ（ＴＥＲＵＭＯ）を使用して尾静脈に注射した。

【0095】

プラスミド構築及び組換えＡＡＶベクターの産生
ｍＯＶＡ１９ ｃＤＮＡを、ＰＣＲによってｐＳＭＤ２ｒＡＡＶ１又はｒＡＡＶ８プラスミドのＳＰｃ５－１２筋肉特異的プロモーター又はｈＡＡＴ肝細胞特異的プロモーターとポリＡシグナルの間に挿入し、それぞれ、筋肉を標的とするｒＡＡＶ１／ＳＰｃ５－１２－ｍＯＶＡ（ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ）又は肝臓を標的とするｒＡＡＶ８／ｈＡＡＴ－ｍＯＶＡ（ｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ）を作成した。あるいは、ＧＦＰタンパク質の完全長さｃＤＮＡ配列をｍＯＶＡｃＤＮＡの膜貫通ドメインに融合させて、ｍＯＶＡ－ＧＦＰ配列を作成し、上記のように、ｒＡＡＶ１／ＳＰｃ５－１２－ｍＯＶＡ－ＧＦＰ（ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ－ＧＦＰ）及びｒＡＡＶ８／ｈＡＡＴ－ｍＯＶＡ－ＧＦＰ（ｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ－ＧＦＰ）を作成した。この試験で使用されたすべてのＡＡＶベクターは、アデノウイルスを含まない一過性トランスフェクション法を使用して生成され、前述のように精製された（Ｖｉｄａｌら、２０１８）。ＡＡＶベクターストックの力価は、リアルタイムｑＰＣＲを使用して決定され、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、続いてＳＹＰＲＯＲｕｂｙタンパク質ゲル染色及びバンドデンシトメトリーによって確認された。

【0096】

ＯＶＡｍＲＮＡの定量化
Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ ｐｌｕｓキット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＬＧＥＬ、デューレン、ドイツ）を使用して、各臓器の２０個の１２μｍ凍結切片から全ＲＮＡを抽出した。ＯＶＡｍＲＮＡの定量化のために、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して１００ｎｇのトータルＲＮＡを逆転写した。次に、４μＬのＲＴ－ＰＣＲ産物は、Ｏｖａ－Ｆ（５’－ＡＡＧＣＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＡ－３’）、Ｏｖａ－Ｒ（５’－ＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＣＣＣＴＡＡ－３’）、β－アクチン－Ｆ（５’－ＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴ－３’）、及びβ－アクチン－Ｒ（５’－ＴＴＴＴＣＡＣＧＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＧＧ－３’）プライマーを使用して、リアルタイムＰＣＲ増幅にかけた。すべての反応混合物は、ＱｕａｎｔｉＦＡｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキットの説明書（ＱＵＩＡＧＥＮ、ドイツ）に従って作成し、前述の５３のように、ＯＶＡプライマーを５００ｎｍｏｌ／Ｌで、β－アクチンプライマーを４００ｎｍｏｌ／Ｌで使用した。各サンプルのＯＶＡｍＲＮＡの絶対量は、ΔΔＣｔ式を使用して計算及び正規化された：１／（２＾（－（Ｃｔβａｃｔｉｎ－ＣｔＯＶＡ）サンプル－（Ｃｔβａｃｔｉｎ－ＣｔＯＶＡ）参照）。この式で使用される参照は、各実験で定義された二重注射「ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射及びｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射」グループの平均ΔＣｔ値である。

【0097】

リンパ球の分離
末梢血リンパ球の単離のために、赤血球は、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅバッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた低張ショックによって排除された。脾臓細胞を単離するために、脾臓を１×ＰＢＳの０．１％ＨＳＡにおいて手動で粉砕した。肝臓からリンパ球を分離するために、肝臓を収集し、１×ＰＢＳの０．１％ＨＳＡにおいて手動で粉砕し、４ｍＬの１×ＰＢＳの０．１％ＨＳＡにおいて再懸濁し、細胞の破片を除去するために４℃で２分間３０ｇで回転させた。上清を３００ｇで４℃で５分間回転させた。細胞ペレットを室温で４０％パーコール（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）に再懸濁した。次に、室温の７０％パーコール溶液２ｍＬを４０％細胞懸濁液の下に加えた。パーコール勾配を１３００ｇで２０分間、室温で中断せずに遠心分離した。上部脂肪層を除去し、界面細胞バンドを収集した。

【0098】

フローサイトメトリー分析
テトラマー染色については、Ｇｈｅｎａｓｓｉａ Ａら（２０１７）又はＧｒｏｓｓ ＤＡら（２０１９）によって以前に説明された方法に従った。簡単に説明すると、細胞懸濁液を最初にｉＴＡｇテトラマー／ＰＥ－Ｈ－２ Ｋｂ ＯＶＡ（Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ、ナンテール、フランス）と室温で３０分間培養し、次に抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）で４℃で１０分間ブロックし、続いて、ＢＶ４２１又はＡＰＣ抗ＣＤ８α（５３－６．７）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＢＶ４２１抗ＰＤ－１（２９Ｆ．１Ａ１２）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＣＤ４（ＲＭ４－５）の組み合わせを使用して、４℃で１５分間膜染色した。

【0099】

細胞内染色では、細胞懸濁液を最初に抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）で４℃で１０分間ブロックし、続いて、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４４（ＩＭ７）、Ｖ５００抗ＣＤ４（ＲＭ４－５）、ＰＥ－Ｃｙ７抗ＣＤ８α（５３－６．７）及びＢＶ４２１抗ＰＤ－１（２９Ｆ．１Ａ１２）の組み合わせを使用して４℃で１５分間膜染色した。次に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ固定／透過処理（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、製造元の指示に従って細胞を固定し、透過処理した。次に、透過処理した細胞を抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（２．４Ｇ２、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）で４℃で１５分間ブロックし、続いて、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ透過処理バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＰＥ抗Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ－１６ａ）及びＡＰＣ抗－ＩＦＮγ（ＸＭＧ１．２）を使用して、４℃で３０分間細胞内染色を行った。

【0100】

どちらの場合も、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定近赤外線死細胞染色キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して死細胞を除外した。ＬＳＲ－ＩＩ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターでデータを収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してさらに分析した。特に明記しない限り、すべての抗体はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。

【0101】

筋肉セクションのＩＨＣ分析
オスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、筋肉特異的ＳＰｃ５－１２プロモーター下でｍＯＶＡ－ＧＦＰをコーディングするｒＡＡＶ１の１０¹⁰のウイルスゲノム（ｖｇ）を左前脛骨筋に注射し、同時に肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴの下でｍＯＶＡ－ＧＦＰをコーディングする１×１０¹⁰ｖｇのｒＡＡＶ８を静脈注射し、又はしなかった。１４日目に死亡させた後、筋肉の凍結切片を調製し、緑色で示されたＧＦＰ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識ヤギ抗ラット抗体（Ａｂｃａｍ）によって検出されたＭＡｂ抗マウスＭＨＣクラスＩＩ Ｍ５／１１４（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）を使用した赤の主要組織適合遺伝子クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子、及び青の核のＤＡＰＩに染色した。代表的なセクションは、４０倍の対物レンズと２００μｍ×２００μｍのフィールドサイズを備えたライカＳＰ８共焦点イメージングステーションで記録された。

【0102】

抗ＯＶＡ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、炭酸緩衝液ｐＨ９．５中のＯＶＡタンパク質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の１０μｇ／ｍｌ希釈液のウェルあたり５０μｌで一晩コーティングした。次に、プレートを１×ＰＢＳの０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ブロッキングバッファー：１×ＰＢＳの２％ＢＳＡで室温で２時間ブロックし、３回洗浄した。実験血清、及び不完全フロイントアジュバントに乳化したＯＶＡタンパク質で免疫したマウスの参照血清の段階希釈液をブロッキングバッファーで調製し、９６ウェルプレートで３７℃で１時間培養した。次に、プレートを２回洗浄し、結合した抗ＯＶＡ ＩｇＧを、ブロッキングバッファーで１／４０００に希釈した１００μＬのビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｅｕｒｏｂｉｏ、レ・ジュリス、フランス）とともに培養した。次にプレートを２回洗浄し、ブロッキングバッファーで１／４０００に希釈した１００μＬ／ウェルのＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈペルオキシダーゼアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｅｕｒｏｂｉｏ、レ・ジュリス、フランス）と室温で３０分間培養し、再度３回洗浄した。最後に、抗ＯＶＡ ＩｇＧは、ＴＭＢ基質試薬セット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で明らかにされた。５０μＬ／ウェルのＨ２ＳＯ４ ２Ｎで３～５分後に反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。抗体レベルは、検量線の直線範囲を考慮して、同じ光学密度に対応する参照血清希釈に対するサンプル希釈の比率として表される。

【0103】

統計分析
すべてのデータは平均±ＳＥＭとして示される。すべての統計分析について、マン・ホイットニー検定が実行された。データは、ｐ値が＜０．０５、すなわち^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１、^***ｐ＜０．００１、及び^****ｐ＜０．０００１である場合に有意であると見なされ、ｐ値が＞０．０５の場合に有意ではない（ｎｓ）。

【0104】

結果
導入遺伝子特異的免疫寛容は、筋肉肝臓二重形質導入によって確立される。
ｒＡＡＶ肝臓形質導入が筋肉導入遺伝子生着に対する免疫寛容を促進することを確立するために、発明者らは、筋肉におけるｒＡＡＶ遺伝子導入後に高度に免疫原性であると報告されている膜形態のオーバルブミン（ｍＯＶＡ）をコーディングするモデル導入遺伝子を選択する。そのために、２つのベクターが設計された：筋肉特異的プロモーターＳＰｃ５－１２の下でｍＯＶＡをコーディングする筋肉向性ｒＡＡＶ１ベクターと肝臓特異的プロモーターｈＡＡＴの下で同じｍＯＶＡ導入遺伝子をコーディングする肝臓向性ｒＡＡＶ８ベクター（図２）。予想通り、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡベクターの筋肉注射（ｉｍ）は、注射後ｄ１４とｄ２８に血中の強力な抗ＯＶＡ ＣＤ８⁺Ｋｂ／ＯＶＡ２５７テトラマー⁺（テトラマー⁺）Ｔ細胞応答を誘導し（図２Ａ－２Ｂ）、ｄ２９までに筋肉のＯＶＡ発現が大幅に減少する（図２Ｄ）。これは、免疫関連の導入遺伝子拒絶を示す。注目すべきことに、肝臓リンパ球集団の分析は、血液と比較して抗ＯＶＡ ＣＤ８⁺Ｔ細胞の割合が高いことを証明した。これは、活性化ＣＤ８⁺Ｔ細胞が抗原認識とは無関係に肝臓に蓄積できることを示す以前の報告と一致する結果である。これらの導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は、ＯＶＡに対する体液性応答に関連している（図２Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋標的が導入遺伝子拒絶に関連する細胞性及び体液性応答を誘発したことを示している。

【0105】

並行して、導入遺伝子の免疫応答と拒絶を軽減する肝臓向性ｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡベクターの能力を評価し、１０¹⁰のｖｇｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡの尾静脈静脈注射（ｉｖ）が、ｄ１４及びｄ２８における血中の抗ＯＶＡテトラマー⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答も抗ＯＶＡ抗体応答も誘導しないことを発見した（図示せず）。肝臓のｍＯＶＡ発現は、これらの条件下でＲＴ－ｑＰＣＲによって確認され（図示せず）、導入遺伝子に対する細胞性及び体液性応答の欠如に応じた導入遺伝子産物の長期受容性が証明された。次に、それぞれ筋向性ｒＡＡＶ１及び肝臓向性ｒＡＡＶ８ベクターの筋肉注射及び静脈注射を同時に使用して、ｄ１４とｄ２８における血液（図２Ａ－２Ｂ）及びｄ２９の肝臓リンパ球集団（図Ｓ２）には抗ＯＶＡ ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答は見られず、ＯＶＡ抗体反応も見られなかった（図２Ｃ）。導入遺伝子発現の維持は、免疫拒絶の欠如を証明する筋肉（図２Ｄ）と肝臓（データは図示せず）の両方で効果的であった。次に、この抑制の特異性を評価し、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡを注射して筋肉を標的にすると同時に、無関係なｒＡＡＶ８／ｈＡＡＴ－ｈＦＩＸを注射して肝臓を標的にし、筋肉注射のみのｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ注射条件と同様にＯＶＡに対する細胞性及び体液性応答を証明した（図８Ａ－Ｃ）。ここで、筋肉と肝臓に異なる導入遺伝子が存在すると、筋肉のｍＯＶＡ導入遺伝子が完全に拒絶され（図８Ｄ）、肝臓のｈＦＩＸ導入遺伝子が完全に受け入れられた（図示せず）。この結果は、寛容誘導プロセスが筋肉と肝臓で同じ導入遺伝子の二重発現を必要とすることを示している。注目すべきことに、筋肉肝臓二重形質導入プロトコルでは、ｒＡＡＶ１及びｒＡＡＶ８キャプシドに対する体液性応答の低下は観察されなかった（データは図示せず）。また、血液循環から肝臓へのｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ漏出の最終的な寛容効果を評価し、静脈注射ルートを使用したｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡの注射は、筋肉形質導入に対する免疫保護を与えることができないことを発見した（データは図示せず）。これは、実際のｒＡＡＶ８／ｈＡＡＴ－ｍＯＶＡ肝臓標的が導入遺伝子特異的寛容を促進するために必須であることを示している。これらの結果を補完するために、ｍＯＶＡ－ＧＦＰ構築物をコーディングするｒＡＡＶベクターの第２のセットを設計した。ここで、完全長さｅＧＦＰタンパク質はｍＯＶＡの膜貫通部分の後に融合され（図１）、筋肉導入遺伝子の生着を達成するために、同じ導入遺伝子の筋肉－肝臓の二重発現について同様の要件を発見した（図９）。注目すべきことに、ｍＯＶＡ－ＧＦＰ構築物はＭＨＣクラスＩＩエピトープを含み、これにより、検出可能なＩＦＮγ産生ＣＤ４⁺Ｔ細胞が誘導され、対応するＧＦＰペプチドで最初にプライミングされたマウスのＯＶＡ特異的抗体応答が増強される（図９Ｃ）。結論として、ｒＡＡＶベクターによる筋肉と肝臓の二重標的は、導入遺伝子に対する細胞性及び体液性免疫応答の発生を排除し、筋肉での導入遺伝子の発現を可能にするのに役立つ。

【0106】

次に、この導入遺伝子特異的寛容の持続可能性と堅牢性を調査し、ｄ７又はｄ２８でマウスにｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡの筋肉注射を試す前に、静脈注射ルートを介してｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡベクターを注射した（図３Ａ）。どちらの場合も、体液性（データは図示せず）が検出されず、及び限られた細胞性応答（図３Ｂ）が検出され、ＯＶＡ発現はｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡの筋肉注射のみのコントロールと比較して筋肉で有意に維持された（図３Ｃ）。ｍＯＶＡに対するこの末梢性寛容の堅牢性を評価するために、ｄ７又はｄ２８のマウスの第２のセットにｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ－ＧＦＰの筋肉注射を試した（図１０Ａ）。これは、ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答をプライミングできるＧＦＰ配列内に免疫反応性ＭＨＣクラスＩＩエピトープを持っている（図９Ｃ）。前と同様、体液性（データは図示せず）が検出されず、及び限られた細胞性応答（図１０Ｂ）が検出され、筋肉におけるＯＶＡ－ＧＦＰ発現は持続した（図１０Ｃ）。したがって、肝臓導入遺伝子の発現に関連するこの免疫寛容は、追加のＭＨＣ ＩＩエピトープを含む筋肉導入遺伝子を使用した場合でも、堅牢で長寿命であるように見える。

【0107】

ｍＯＶＡ－ＧＦＰ導入遺伝子の筋肉肝臓二重形質導入後の筋肉における強力な寛容誘導及び局所炎症の欠如。
導入遺伝子の発現レベルと筋肉の局所炎症のレベルを視覚化するために、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ－ＧＦＰを注射して筋肉を標的とし、同時又は異時にｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ－ＧＦＰを注射して肝臓を標的とし、ＭＨＣ ＩＩ陽性細胞及び核染色の存在を介したＧＦＰ染色及び炎症細胞の局所的誘引を証明した。高レベルの炎症細胞は、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ－ＧＦＰ筋肉注射のみの条件でＯＶＡ－ＧＦＰ陽性筋線維に近接して検出され（図１１Ａ）、一方で、筋線維は、筋肉ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ－ＧＦＰ及び肝臓ｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ－ＧＦＰの二重注射条件では、炎症細胞なしでｍＯＶＡ－ＧＦＰに対して集中的かつ完全に明確である（図１１Ｂ）。したがって、図８の結果と合わせて、これらの結果は、同じ導入遺伝子の二重発現が筋肉と肝臓で達成される場合、筋肉肝臓二重形質導入が、筋肉におけるｍＯＶＡ－ＧＦＰ導入遺伝子の完全かつ強力な免疫寛容につながることを示している。

【0108】

既存の免疫の存在下での免疫寛容及び疲弊したＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の誘導。
筋肉肝臓二重形質導入が筋肉導入遺伝子の生着を可能にすることを確立したので、導入遺伝子産物に対する既存の免疫応答が導入遺伝子特異的寛容の誘導を損なうかどうかを評価した。そのために、マウスは、ｄ０で不完全フロイントアジュバント（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ、ＩＦＡ）に乳化されたＯＶＡタンパク質で事前免疫化され、又は免疫化されずに、１４日目に、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡの単一の筋肉注射、又はｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射とｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射の二重注射をした。予想通り、ＯＶＡ／ＩＦＡ免疫はｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射後にモニターされた体液性抗ＯＶＡ応答をプライミングするのに特に効果的であった（図４Ｂ）。重要なことに、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射とｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射の二重注射により、ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答と体液性応答が非常に低レベルに低下し（図４Ａ－Ｂ）、既存の免疫の発生にもかかわらず、筋肉での長期ＯＶＡ発現が保証されることがわかった（図４Ｃ）。したがって、筋肉肝臓二重形質導入によって付与される導入遺伝子特異的寛容は、導入遺伝子産物に対する既存の抗体応答だけでなく、出現及び記憶ＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方を無効化する。

【0109】

上に示したように、筋肉肝臓二重形質導入は、宿主に存在する既存の導入遺伝子特異的免疫に関連する有害反応を防ぐことができる。これらの条件下で、最初にＯＶＡ／ＩＦＡでプライミングされ、ｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射を受けたマウスの脾臓に、導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の残存部分が存在することがわかった（データは図示せず）。ＯＶＡ／ＩＦＡの事前免疫化は導入遺伝子の筋肉発現を損なうことはなかったため（図４Ｃ）、ＯＶＡ／ＩＦＡ又はＯＶＡ２５７ペプチド／ＩＦＡ免疫化とそれに続く筋肉肝臓二重形質導入後に存在する残存ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の表現型を分析した（図５）。ＯＶＡ２５７ペプチド／ＩＦＡ注入条件を使用して、ＣＤ４⁺Ｔ細胞及びＢ細胞のプライミングとは無関係に導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の帰趨を視覚化した。これらの後半の２つの事前免疫条件では、筋肉肝臓二重形質導入により、ｒＡＡＶの筋肉単一形質導入と比較してＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の量が大幅に減少し、両方の場合にＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の残存部分が存在した（図５Ａ－Ｂ）。興味深いことに、これらの残存ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、筋肉形質導入のみの後に生成されたもの（図５Ｃ）と比較して、高レベルのＰＤ－１（図５Ａ－５Ｃ）及びわずかに高レベルのＣＤ４４及びＣＤ８を発現することがわかった。これは、ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺エフェクターＴ細胞が疲弊したＣＤ８⁺Ｔ細胞に変換される可能性を高める。

【0110】

これらの残存ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の機能的能力を定性するために、ＰＤ－１表面発現と組み合わせたＭＨＣ Ｉ制限ＯＶＡ２５７ペプチド刺激に応答してＩＮＦγを産生する能力を試験した（図６）。細胞内染色によって証明されるように、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射による筋肉のみの形質導入は主に、ＩＮＦγ産生が高くＰＤ－１表面発現が低いＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞を生成した。一方、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射とｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射の筋肉肝臓二重形質導入は主に、ＩＮＦγ産生能力を持たないの残存ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞を生成した（図６Ａ）。定量化すると、ＯＶＡ／ＩＦＡとＯＶＡ２５７／ＩＦＡの両方の事前免疫条件では、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射とｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射の同時注射の後、ＩＮＦγの産生は観察されなかった（図６Ｂ）。その結果、筋肉肝臓二重形質導入後に観察された高レベルのＰＤ－１を発現する残存ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞（図５）は、ＩＮＦγ産生能を欠き、通常は疲弊したＣＤ８⁺Ｔ細胞に対応する。さらに、ＯＶＡ筋導入遺伝子の生着は、事前免疫とは無関係に、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射とｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射の二重注射後に効果的であった（図６Ｃ）。これらの結果は、ＯＶＡ／ＩＦＡ及びＯＶＡ２５７ペプチド／ＩＦＡによって誘導される既存のＣＤ８⁺Ｔ細胞免疫が存在する場合でも、筋肉肝臓二重形質導入は、典型的に疲弊した表現型を示すＣＤ８⁺Ｔ細胞の生成を部分的に表現するメカニズムを介して、筋肉のＯＶＡ発現を保護するのに十分であることを示している。

【0111】

導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞寛容は、既存のＣＤ４⁺Ｔ細胞応答にかかわらず確立される。
最後に、ジストロフィンに対する既存のＣＤ４⁺Ｔ細胞応答がＤＭＤ患者２４、２５で観察されているため、既存のＯＶＡ特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答が筋肉肝臓二重標的後に達成される導入遺伝子特異的寛容のレベルに影響を与える可能性があるかどうか疑問に思った。そのために、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡの筋肉注射、又はｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射とｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射の二重注射の前に、マウスを最初にＭＨＣクラス ＩＩ制限ＯＶＡ３２３エピトープで免疫化した。予想通り、ＯＶＡ３２３免疫は、ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡの単一の筋肉注射（図７Ａ）及び抗ＯＶＡ体液性応答（図７Ｂ）の後に生成された活性化ＣＤ４⁺ＣＤ４４^hiＴ細胞におけるＩＮＦγ産生を有意にプライミングすることを発見した。ｒＡＡＶ１／ｍＯＶＡ筋肉注射とｒＡＡＶ８／ｍＯＶＡ静脈注射の二重注射をしたマウスでは、ＩＮＦγ産生は、これらの条件下で観察されたＯＶＡ２５７テトラマー⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞及び体液性応答の欠如に応じて（図７Ｂ－Ｃ）、筋肉のＯＶＡ発現（図７Ｄ）を損なうことなく、活性化ＣＤ４⁺ＣＤ４４^hiＴ細胞（図７Ａ）で等しく検出された。全体として、ＯＶＡ３２３免疫化は、筋肉注射のみの後に抗体産生を促進するのに効果的であったが（図７Ｂ）、筋肉注射と静脈注射の二重注射は、体液性及び細胞性ＣＤ８⁺Ｔの制御にオペラントであり、導入遺伝子に対するＣＤ４⁺Ｔ細胞応答ではなく、これは筋肉のＯＶＡ発現を保護するのに十分であった。結果は、既存のＣＤ４⁺Ｔ細胞応答にもかかわらず、筋肉肝臓二重形質導入後も持続した導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞寛容が確立されていることを示している。

【0112】

結論
筋肉の適用に対する導入遺伝子特異的寛容の誘導に対する同時の筋肉及び肝臓の形質導入の影響を扱った先行研究はなく、これらの状況下で既存の免疫が筋肉導入遺伝子の生着に有害であるかどうかを扱った研究はない。

【0113】

驚くべきことに、本発明者らは、筋肉及び肝細胞の二重ＯＶＡ発現が、肝臓、血液、及び脾臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の完全な欠如をもたらすことを発見した。さらに、本発明者らは、ｒＡＡＶ１／ＳＰｃ５－１２－ｍＯＶＡ筋肉特異的ベクターを単一筋肉注射した後、肝臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の蓄積を観察した。これは、局所抗原発現とは無関係に肝臓で発生する活性化ＣＤ８⁺Ｔ細胞の一過性の蓄積を反映している。

【0114】

これらの結果は、筋肉形質導入によって生成された活性化ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞が、ＯＶＡ抗原との二次同族相互作用が起こり得る肝臓組織へのアクセスを獲得し、ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の廃棄及び／又は機能的不活性化をもたらすことを示している。実際、ＣＤ８⁺Ｔ細胞は、自殺細胞内細胞貫入と呼ばれるメカニズムで肝細胞による直接的な捕捉と内在化による抗原認識に続いて、肝臓に配置されることが示されている。

【0115】

筋肉肝臓ｒＡＡＶ二重標的の文脈での結果は、導入遺伝子に関する宿主免疫系の初期状態に応じて、内因性ＣＤ８⁺Ｔ細胞の２つの結果を示している。マウスが導入遺伝子にナイーブである場合、導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞は試験されたすべての組織に存在しない。導入遺伝子に対する既存の免疫を誘導するためにマウスをプライミングすると、発明者らは、脾臓におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞が大幅に減少し、ＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の残りの部分が高レベルのＰＤ－１を発現し、ＣＤ４４の発現がいくらか高くなることを観察した。これは、疲弊したＣＤ８⁺Ｔ細胞に見られる特徴であるが、それらの状態を明確に示すには不十分である。これらのＯＶＡ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の機能を試験したところ、発明者らは、これらのＰＤ－１^hiＣＤ８⁺Ｔ細胞が抗原刺激に応答してＩＦＮγを産生しないことを発見した。これは、筋肉における持続的な導入遺伝子の発現と相関し、疲弊したＣＤ８⁺Ｔ細胞の状態を支持する結果である。

【0116】

さらに、結果はここで、宿主の抗原提示細胞による定義された筋肉導入遺伝子のプロセシングがＣＤ８⁺Ｔ細胞応答につながることを示している。これは、既存の免疫の存在下でも、肝細胞で発現した宿主ＭＨＣクラスＩ導入遺伝子複合体の認識後に寛容される。

【0117】

導入遺伝子に対する体液性応答を監視して、本研究は筋肉関連導入遺伝子にも拡張される。導入遺伝子に対する体液性応答は、筋肉肝臓二重形質導入後に劇的に減少したが、それにもかかわらず、ＯＶＡタンパク質で事前免疫された受容者において寛容誘導後に抗ＯＶＡ抗体の限界レベルが検出された、ＯＶＡ２５７ペプチドでは検出されなかった。

【0118】

抗ＯＶＡ抗体産生に対するＯＶＡ特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の可能性を評価して、本発明者らは、ＭＨＣクラスＩＩ制限ＯＶＡエピトープＯＶＡ３２３ペプチドによる事前免疫がＣＤ４⁺Ｔ細胞をプライミングするのに効果的であり、ｒＡＡＶ／ｍＯＶＡ筋転移後の抗ＯＶＡ抗体産生を増強することを観察し、導入遺伝子に対する体液性免疫におけるＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の役割を確認した。

【0119】

ＯＶＡ３２３ペプチド免疫化後に生成された導入遺伝子特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞の帰趨を調査したところ、筋肉肝臓二重形質導入により、検出可能な抗ＯＶＡ３２３ＩＦＮγ産生ＣＤ４⁺Ｔ細胞が得られたが、抗ＯＶＡ抗体応答のレベルはほとんど検出されなかった。したがって、導入遺伝子に対する既存の免疫に遭遇する臨床状況にとって非常に興味深いことに、抗ＯＶＡ ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の存在がＣＤ８⁺Ｔ細胞の誘導及び体液性耐性を損なうことはなかった。この結果は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の質的変化、及びＦＩＸへの肝臓ベースの寛容誘導がＣＤ４⁺Ｔ細胞コンパートメントに伝達可能な寛容原性特性を与えるという事実と比較し得る。ここで、モデル導入遺伝子システムは、複数の状況で既存の免疫応答を打ち消す肝臓ベースの寛容誘導の有効性を総括することを可能にした。既存の体液性応答と、ＣＤ８⁺及びＣＤ４⁺Ｔ細胞応答の両方が、筋肉肝臓二重形質導入遺伝子発現によって影響を受けることが発見され、導入遺伝子特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞は保持及び／又は枯渇と疲弊し、導入遺伝子特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞は存在したままであるが、抗体産生を促進することはできなかった。これらのＣＤ４⁺Ｔ細胞は、多発性硬化症モデルで証明されているように、おそらくＦｏｘｐ３⁺Ｔｒｅｇ細胞への変換を受けることができる細胞のプールを形成している。

【0120】

治療用導入遺伝子に対する筋肉の免疫応答を克服することは、筋ジストロフィーの治療において重要である。筋肉の単一遺伝子障害は、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者において、組織の炎症を引き起こす可能性がある。収縮によって誘発される損傷は、自然免疫を刺激し、慢性的な筋肉の炎症を促進し、治療用導入遺伝子に対する有害な免疫応答を悪化させる可能性のある細胞質内容物を放出させる。本明細書では、筋肉と肝臓での導入遺伝子の同時デリバリーは、既存の免疫による有害な免疫応答の対処に関連している。

【0121】

参考文献
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【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】