特表 2022-532462 脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-15

(54)【発明の名称】脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/10 20060101AFI20220708BHJP

   A61K 47/14 20060101ALI20220708BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20220708BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20220708BHJP

   A61K 47/30 20060101ALI20220708BHJP

   A61K 31/57 20060101ALI20220708BHJP

   A61K 31/337 20060101ALI20220708BHJP

   A61K 31/593 20060101ALI20220708BHJP

   A61K 31/122 20060101ALI20220708BHJP

   A61P 3/02 20060101ALI20220708BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220708BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20220708BHJP

【ＦＩ】

A61K9/10

A61K47/14

A61K47/12

A61P17/06

A61K47/30

A61K31/57

A61K31/337

A61K31/593

A61K31/122

A61P3/02 102

A61P35/00

A61K9/14

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021544790

(86)(22)【出願日】2020-02-02

(85)【翻訳文提出日】2021-09-30

(86)【国際出願番号】 IB2020050819

(87)【国際公開番号】W WO2020157729

(87)【国際公開日】2020-08-06

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ

２．Ｓｐａｎ

３．ＴＷＥＥＮ

４．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】521338802

【氏名又は名称】ナノブリッド イノベーションズ プライベート リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108833

【弁理士】

【氏名又は名称】早川 裕司

(74)【代理人】

【識別番号】100162156

【弁理士】

【氏名又は名称】村雨 圭介

(74)【代理人】

【識別番号】100201606

【弁理士】

【氏名又は名称】田岡 洋

(72)【発明者】

【氏名】チットカーラ ディーパック

(72)【発明者】

【氏名】プカル スディープ スデッシュ

(72)【発明者】

【氏名】シン アリハント クマル

(72)【発明者】

【氏名】ミッタル アニュパマ

(72)【発明者】

【氏名】シャルマ サウラブ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA16

4C076AA31

4C076AA94

4C076CC20

4C076CC23

4C076CC27

4C076DD41

4C076DD46

4C076EE01

4C076FF31

4C086AA01

4C086BA02

4C086DA10

4C086DA14

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA22

4C086MA41

4C086NA12

4C086ZA89

4C086ZB26

4C086ZC23

4C206AA01

4C206CB27

4C206MA03

4C206MA05

4C206MA61

4C206NA12

4C206ZC19

(57)【要約】

本発明は、疎水性薬物分子の脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子を提供する。詳細には、本発明は、固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーを含む、脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーを含む、脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子。

【請求項2】

固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーを含み、（ａ）コアが、固体脂質、液体脂質、及びポリマーの疎水性ブロックを含み、（ｂ）前記コアを取り囲むシェルが、ポリマーの親水性部分を含む、請求項１に記載の脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子。

【請求項3】

固体脂質、液体脂質、及び両親媒性ポリマーの疎水性ブロックの相互作用に起因して形成された疎水性コア内に、１つ以上の活性剤を捕捉する、請求項２に記載の脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子。

【請求項4】

固体脂質の液体脂質に対する比が、約１０：１～約１：１０の範囲である、請求項２に記載の脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子。

【請求項5】

固体脂質の両親媒性ポリマーに対する比が、約１０：１～約１：１０の範囲である、請求項２に記載の脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子。

【請求項6】

液体脂質の両親媒性ポリマーに対する比が、約１０：１～約１：１０の範囲である、請求項２に記載の脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子。

【請求項7】

少なくとも１つの界面活性剤を更に含む、請求項１又は２に記載の脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子。

【請求項8】

（ａ）固体脂質、液体脂質、及びポリマーの疎水性ブロックを含むコアと、
（ｂ）コア内に捕捉された活性分子と、
（ｃ）ポリマーの親水性部分を含むコアを取り囲むシェルと、
（ｄ）界面活性剤と
を含む、請求項７に記載の脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子。

【請求項9】

界面活性剤が、前記ナノ粒子を取り囲む水性相中に存在する、請求項８に記載の脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、疎水性薬物分子の脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子に関する。詳細には、本発明は、固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーを含む、脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子を提供する。

【背景技術】

【0002】

発見されて、医薬品、栄養補助薬及び化粧品に使用されている薬物分子の大部分は、本質的に疎水性であり、それにより、それらの送達に課題を課す。更に、これらは、それらの非特異的分布及びより高い用量要件に起因して、より低い効能及び高い毒性を呈する。この問題を克服するために、ナノ担体を使用する薬物送達が取り組まれており、これには、ポリマーの（ポリマーナノ粒子、ポリマーミセル及びポリマー－薬物結合体など）並びに非ポリマーの、すなわち脂質の、ナノ担体が挙げられる。これらのナノ系は、長期化された薬物放出プロファイル、破壊的バイオ環境からの活性成分の保護、より少ない副作用へと至らせるより少ない用量、活性部位への薬物の標的化、及び薬物動態パラメータの変更を含む、従来の送達系に勝る多くの利益を提供する。ポリマーナノ粒子及び非ポリマーナノ粒子の両方が、いくつかの利点を提供するが特定の欠点もまたこれらの系に伴うと、広範に報告されている。ポリマーナノ粒子は、狭いサイズ分布を有するより小さい粒径、表面上での可能な化学修飾、長期化された薬物放出及び安定性などの利点を付与する。しかし、同時に、これらは、薬物取り込みの低減、調製方法に関与する複数の工程、大量の有機溶媒の使用、スケーラビリティ、及び製造コストなどの欠点を伴う。非ポリマーナノ系としては、ナノ懸濁液、ナノ結晶、マイクロエマルジョン、固体脂質ナノ粒子（solid lipid nanoparticles、ＳＬＮ）、ナノ構造脂質担体（nanostructure lipid carriers、ＮＬＣ）、リポソーム、自己乳化型薬物送達系（self-emulsifying drug delivery systems、ＳＥＤＤＳ）、ニオソームなどが挙げられる。これらの種類の系は、製造コストが低く、封入効率が高く、関与する工程数が少なく、毒性の問題がないなどの利点を提供する。これらはまた、破裂放出、化学修飾のための機会の限定、不安定性及び高多分散指数、薬物分配、薬物排出などを含む制限も伴う。

【0003】

両方の系の有益性を得るために、脂質－ポリマーハイブリッドナノ系が開発されてきた。これらのより新しいクラスのナノ担体は、良好な薬物充填能力、より制御された薬物放出、改善された細胞取り込み及び生体適合性などの、ポリマーの及び脂質のナノ担体の両方の利点を組み合わせて、それらに伴う欠点を回避する。

【0004】

脂質－ポリマーハイブリッド（lipid-polymer hybrid、ＬＰＨ）ナノ粒子のこれらの特性は、化学療法薬、タンパク質、ペプチド、及びワクチンの送達におけるそれらの適用を促進する。

【0005】

米国特許出願公開第２０１３０３１５８３１（Ａ１）号は、ポリマーマトリックスによって更に被われた脂質の両親媒性層によって取り囲まれた水性コアを含むＰＬＧＡ－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ系ハイブリッド微粒子担体系を開示している。これらの粒子は、ｓｉＲＮＡ、ドキソルビシンのような抗がん薬物、及びセラノスティクスのための造影剤、の封入及び送達のために提案されている。このハイブリッド微粒子は、ジクロロメタン（dichloromethane、ＤＣＭ）を有機溶媒として使用することによって、エマルジョン溶媒蒸発によって調製された。

【0006】

米国特許出願公開第２００８０１０２１２７（Ａ１）号は、ポリマー（ＰＬＧＡ／ＰＣＬ）及び脂質（トリステアリン、トリパルミチン、ステアリン酸グリセリン、コレステロール、パルミチン酸トコフェロールなどのような）及び多量の界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、ＴＰＧＳ、プルロニック、ＰＶＡ）を使用して調製されたハイブリッドナノ粒子を開示している。この発明では、ハイブリッドナノ系は、ナノ沈降及びエマルジョン溶媒蒸発法によって作製される。米国特許出願公開第２０１００２０３１４２（Ａ１）号は、ＰＥＧ化又は非ＰＥＧ化ポリマー及び両親媒性脂質を含む脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子の使用を開示している。ここで、両親媒性脂質は、ナノ粒子の表面を被覆してシェルを形成し、ポリマーがコアを形成する。使用される脂質は、親水性部分及び疎水性部分（リン脂質）の両方から構成される。ここで、ハイブリッドナノ粒子は、エマルジョン溶媒蒸発の方法と同様の方法によって調製された。

【0007】

ＣＮ１０７４１２１９１Ａは、薬物を含有する中央の水性コアを封入するシェルを形成する、ポリマー及びカチオン性脂質の使用を開示している。国際公開第２０１７１５８０９３（Ａ１）号は、ハイブリッド系を作製するためのリピドイド（第二級及び第三級アミンを含有する脂質）及びＰＬＧＡポリマーの使用を開示している。

【0008】

国際公開第２０１３０３３５１３（Ａ１）号は、ポリマー（外側の親水性部分を伴う疎水性コアを形成する）、並びにコア形成被膜の外側表面に会合するリン脂質から構成されるハイブリッド系の使用を開示している。ここで、発明者らは、ハイブリッドナノ粒子の調製のためのナノ沈降法を使用した。

【0009】

米国特許出願公開第２０１４０００５２６９（Ａ１）号は、パーキンソン病を治療するために、難溶解性薬物レボドパの送達のためのポリマーマトリックス内に組み込まれたポリマー－脂質ナノ粒子を開示している。ここで、ポリマー－脂質ナノ粒子は、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００及び／又はキトサンなどの少なくとも１つのポリマーと、レシチンなどの少なくとも１つのリン脂質とを含む。それはまた、例えばＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ１００及びカルボキシメチルセルロースナトリウム等の、少なくとも２つの架橋カチオン性ポリマー及びアニオン性ポリマーから形成されるポリマーマトリックスも含む。

【0010】

より良好な安定性を有する疎水性活性分子の高度に効率的な捕捉、破裂放出を最小限に抑えつつ長期化された薬物放出、低／最小の毒性を有する生体適合性賦形剤を使用して調製される単純かつスケーラブルなプロセス、及び薬物漏出防止、薬物分配及び薬物排出効果の防止、を有する、新規な脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子を提供する必要性は未だ満たされていない。

【発明の概要】

【0011】

本発明は、ポリマー、固体脂質、液体脂質及び界面活性剤を含むハイブリッド系を提供する。この脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子は、様々な疎水性分子を送達するためのプラットフォームとして機能することができる。提案されている系の最も重要な利点は、それが、プラットフォーム技術として機能することができることであり、異なる疎水性薬物分子が、選択されたクラスの賦形剤（固体及び液体脂質、ポリマー、並びに界面活性剤）から構成されるマトリックスに充填され得る。

【0012】

本発明はまた、商業的なレベルまでスケーラブルであり、工業用途に容易に適合され得るプロセスを使用する、脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子の調製方法を開示する。

【0013】

本発明による脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子は、疎水性脂質（固体脂質及び液体脂質）と両親媒性ポリマーマトリックスとを含み、両親媒性コポリマーの疎水性ブロック及び脂質が、コアを形成し、一方で、ポリマーの親水性ブロックが、モノリシック脂質－ポリマーハイブリッド（lipid-polymer hybrid、ＬＰＨ）ナノ粒子を形成するナノ粒子の周囲に親水性シェルを形成する。更に、粒子は、生体適合性界面活性剤を使用して安定化される。本発明の目的のために、疎水性薬物が粒子のコア内に捕捉される。本発明のＬＰＨナノ粒子の成分のこの特定の構造的配置に起因して、長期化された薬物放出プロファイルを有する、より良好な薬物充填及び封入効率が得られる。粒子のコアは空間的に異なる成分から構成されるため、固体脂質ナノ粒子に見られるような薬物排出効果がない。更に、親水性表面の存在に起因して、これらの粒子は、局所的に使用されたときに優れた皮膚保持特性により、より良好な有効性を示すことができ、非経口経路によって投与されたときに、ステルス効果によって身体内の薬物の増加された循環時間を示すことができた。

【図面の簡単な説明】

【0014】

本開示の多くの態様は、以下の図面を参照してより良く理解することができる。図面中の構成要素は必ずしも縮尺どおりではなく、その代わりに本開示の原理を明確に説明することを強調している。

【図1】プローブ超音波装置を使用して調製したＣＰ充填ＬＰＨナノ粒子（バッチ５）の粒径分布。

【図2】Ａ）未希釈のＣＰ充填ＬＰＨナノ粒子（バッチ５）、及びＢ）１００×希釈したＣＰ充填ＬＰＨナノ粒子（バッチ５）、並びにＣ）高圧ホモジナイザによって調製したプロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子の粒径分布。

【図3】遊離プロピオン酸クロベタゾール（clobetasol propionate、ＣＰ）、遊離プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）を含有するゲル、高圧ホモジナイザを使用して調製したバッチ１及び５のプロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＰ ＬＰＨ ＮＰ）を含有するゲルのｉｎ－ｖｉｔｒｏ薬物放出研究。

【図4】遊離プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）、遊離プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）を含有するゲル、プロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＰ ＬＰＨ ＮＰ）を含有するゲル、２～８℃及び室温で３か月及び６か月保管したプロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＰ ＬＰＨ ＮＰ）を含有するゲルのｉｎ－ｖｉｔｒｏ薬物放出研究。

【図5】遊離ドセタキセル（ＤＴＸ）、及びプローブ超音波装置を使用して調製したＤＴＸ充填ＬＰＨナノ粒子（ＤＴＸ ＬＰＨ ＮＰ）のｉｎ－ｖｉｔｒｏ薬物放出研究。

【図6】Ａ）遊離プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）及びプロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子（ＤＴＸ ＬＰＨ ＮＰ）、Ｂ）ＨａＣａＴ細胞中の遊離コレカルシフェロール（cholecalciferol、ＣＶＤ）及びコレカルシフェロール充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＶＤ ＬＰＨ ＮＰ）、並びにＣ）４Ｔ１乳がん細胞における遊離ドセタキセル（docetaxel、ＤＴＸ）及びドセタキセル充填ＬＰＨナノ粒子（ＤＴＸ ＬＰＨ ＮＰ）のｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞毒性。

【図7】スイスアルビノマウスのイミキモド誘発乾癬モデルにおいて、Ａ）プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）ゲル、Ｂ）コレカルシフェロール（ＣＶＤ）ゲル、及びＣ）コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）ゲルで処置した動物における、開発された臨床の乾癬面積及び重症度指数（Psoriasis Area and Severity Index、ＰＡＳＩ）に基づく乾癬炎症の程度を示す累積スコア。

【図8】プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）含有ゲルで処置した動物の耳の皮膚（Ear skin、ＥＳ）及び背中の皮膚の組織病理学的（Ｈ＆Ｅ染色）評価。倍率４０×。 赤色矢印：表皮、普通の緑色矢印：真皮、黒矢印：角質層、黄色矢印：炎症性細胞の浸潤、青色矢印：毛管増殖、橙色の矢印：表皮過形成。

【図9】コレカルシフェロールゲル（ＣＶＤ）含有ゲルで処置した動物の耳の皮膚（ＥＳ）及び背中の皮膚の組織の組織病理学的（Ｈ＆Ｅ染色）評価。倍率４０×。 赤色矢印：表皮、普通の緑色矢印：真皮、黒矢印：角質層、黄色矢印：炎症性細胞の浸潤、青色矢印：毛管増殖、橙色の矢印：表皮過形成、白色矢印：不全角化、蛍光の緑色矢印：角質増殖、空色矢印：マンロー微細膿瘍、ピンク色矢印：コゴイ海綿状膿疱。

【図10】コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）含有ゲルで処置した動物の耳の皮膚（ＥＳ）及び背中の皮膚の組織病理学的（Ｈ＆Ｅ染色）評価。倍率４０×。 赤色矢印：表皮、普通の緑色矢印：真皮、黒矢印：角質層、黄色矢印：炎症性細胞の浸潤、青色矢印：毛管増殖、橙色の矢印：表皮過形成、白色矢印：不全角化、蛍光の緑色矢印：角質増殖。

【図11】プロピオン酸クロベタゾール製剤の局所適用後の、残りの皮膚（remaining skin、ＲＳ）、すなわち生存表皮及び真皮中のプロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）の定量化。

【発明を実施するための形態】

【0015】

驚くべきことに、固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーの組み合わせを使用すると、ポリマーの親水性セグメントからなる親水性シェルによって被われた、脂質とポリマーの疎水性セグメントとを含む疎水性コアを有する、特定の構造化ＬＰＨナノ粒子がもたらされたことが判明した。この成分の配置は、高い薬物充填能力、改善された捕捉効率、長期化された薬物放出を示し、破裂効果を示さない、安定したＬＰＨナノ粒子をもたらした。更なる製造プロセスは、高圧ホモジナイザを使用して容易に拡大することができる。

【0016】

本明細書で使用するとき、「ナノ粒子」は、一般にナノスケール及びマイクロスケール粒子の両方を指し、特に断りがない場合は、用語「粒子」と概ね同義である。

【0017】

また、本明細書に列挙される任意の数値は、低い値から高い値までの全ての値、すなわち、列挙された最低値と最高値との間の数値の全ての可能な組み合わせは、本出願において明示的に記載されるものと見なされるべきであることも理解される。例えば、濃度範囲又は有益な効果範囲が１％～５０％と記載される場合、２％～４０％、１０％～３０％、又は１％～３％などの値が本明細書に明示的に列挙されることが意図される。これらは、具体的に意図されるものの例に過ぎない。

【0018】

本発明による脂質－ポリマーハイブリッド（ＬＰＨ）ナノ粒子は、両親媒性ポリマーの親水性部分によって取り囲まれた、固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーの疎水性セグメントから構成される疎水性コアを含む。

【0019】

本発明による脂質－ポリマーハイブリッド（ＬＰＨ）ナノ粒子は、固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーを含む。

【0020】

一実施形態では、本発明は、固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーがモノリシック型ハイブリッドナノ粒子を形成し、ポリマーの疎水性ブロックが固体脂質及び液体脂質の両方と相互作用して疎水性コアを形成し、ポリマーの親水性部分がそれ自体を疎水性コアの外側に配置する、ＬＰＨを記載する。

【0021】

別の実施形態では、本発明によるＬＰＨナノ粒子は、固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーを含み、（ａ）コアは、固体脂質、液体脂質、及びポリマーの疎水性ブロックを含み、（ｂ）コアを取り囲むシェルは、ポリマーの親水性部分を含む。

【0022】

別の態様によると、本発明によるＬＰＨナノ粒子は、固体脂質、液体脂質、両親媒性ポリマー及び界面活性剤を含む。

【0023】

別の態様によると、本発明によるＬＰＨナノ粒子は、少なくとも１つの固体脂質、少なくとも１つの液体脂質、少なくとも１つの両親媒性ポリマー及び少なくとも１つの界面活性剤を含む。

【0024】

別の実施形態によると、ＬＰＨナノ粒子は、１０～５００ｎｍのｚ平均直径を有する。ナノメートルサイズにより、この記載した系は、粒子凝集又は閉塞を伴わずに体循環に投与することができ、より高い細胞内取り込みを呈することができ、粘膜下層を貫通することができ、経口生物学的利用能の増加を呈することができ、選択的な標的化、改善された有効性、及び減少した用量要件を実証することができる。局所適用では、それらはより深い皮膚浸透を示し、したがって、活性成分の改善された有効性を呈し、最小限の体内吸収を伴うより長い持続時間にわたって皮膚層内に保持される。

【0025】

本発明の目的のために、少なくとも１つの固体脂質は、グリセリド（例えばパルミトステアリン酸グリセリル（Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標））、モノステアリン酸グリセリル（ＧＭＳ）、ベヘン酸グリセリル（Ｃｏｍｐｔｒｉｔｏｌ ＡＴＯ ８８８、（登録商標））、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（登録商標）など、ワックス（Ａｐｉｆｉｌ（登録商標））、脂肪酸（ステアリン酸、パルミチン酸など）、ステロール（コレステロール及びその誘導体など）、胆汁酸及びその塩（コール酸、デオキシコール酸など、及びそれらの好適な誘導体）、又はこれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。

【0026】

本発明の目的のために、固体脂質は、ナノ粒子の約１重量％～約５０重量％、好ましくは約１５重量％～約４５重量％、より好ましくは約２０重量％～約４０重量％、最も好ましくは約２５重量％～約３５重量％の範囲で存在する。

【0027】

本発明の目的のために、少なくとも１つの液体脂質は、不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、飽和及び不飽和脂肪族アミン並びにアルコール、又はこれらの組み合わせの、エステル及びグリセリド形態又は遊離形態から選択されるが、これらに限定されない。

【0028】

本発明の目的のために、不飽和脂肪酸は、リノール酸及びオレイン酸から選択されるが、これらに限定されない。本発明の目的のために、飽和脂肪酸は、カプリン酸、カプリル酸及びカプロン酸から選択されるが、これらに限定されない。本発明の目的のために、飽和及び不飽和脂肪族アミン並びにアルコールは、オレイルアミン、リノレイルアミン及びセチルアルコールから選択されるが、これらに限定されない。飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸のエステル及びグリセリドとしては、Ｃａｐｍｕｌ（登録商標）、Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標）、Ｃａｐｔｅｘ（登録商標）、Ｐｅｃｅｏｌ（商標）、Ｍａｉｓｉｎｅ（登録商標）ＣＣ、又はこれらの組み合わせが挙げられる。

【0029】

本発明の目的のために、液体脂質は、ナノ粒子の約１重量％～約５０重量％、好ましくは約１５重量％～約４５重量％、より好ましくは約２０重量％～約４０重量％、最も好ましくは約２５重量％～約３５重量％の範囲で存在する。

【0030】

本発明の目的のために、固体脂質の液体脂質に対する比は、約１０：１～約１：１０、約９：１～約１：９、約１：８～約８：１、約１：７～約７：１、約１：６～約６：１、約１：５～約５：１、約１：４～約４：１、約１：３～約３：１、約１：２～約２：１、又は約１：１の範囲である。

【0031】

本発明の目的のために、両親媒性ポリマーは、親水性部分及び疎水性部分の両方を有する任意の天然又は合成の、生分解性又は非生分解性のポリマーから選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ポリマーマトリックスとしては、ポリ（エチレングリコール）（poly（ethylene glycol）、ＰＥＧ）、ポリ（アクリル酸）、ポリメチルオキサゾリン、ポリイソプレン、ポリ（４－ビニルピリジン）、ポリ（４－ビニルピリジナムメチルヨウ化物）を含むがこれらに限定されない親水性ポリマー、並びにポリ（アスパラギン酸）（poly（aspartic acid）、ＰＡＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコール酸）（poly（lactide-co-glycolic acid）、ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（poly（caprolactone）、ＰＣＬ）、及びポリ（乳酸）（poly（lactic acid）、ＰＬＡ）、ポリスチレン、ポリ（２－シンナモイルエチルメタクリレート）、ポリジメチルシロキサン、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリ（エチルエチレン）、ポリ（プロピレンスルフェート）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（フマル酸／セバシン酸）、ポリホスファゼンのようなポリエステルのようなものであるが、これらに限定されない、親水性ポリマーと異なる疎水性コア、若しくはこれらの組み合わせ、から構成される、ジブロック、トリブロック、マルチブロック又はグラフトポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態によると、両親媒性ポリマーはｍＰＥＧ－ＰＬＡであり、ｍＰＥＧ分子量は約５００～約２００００Ｄａの範囲であり、ＰＬＡ分子量は約２０００～約２００００Ｄａの範囲である。

【0032】

本発明の目的のために、両親媒性ポリマーは、ナノ粒子の約１重量％～約５０重量％、好ましくは約１５重量％～約４５重量％、より好ましくは約２０重量％～約４０重量％、最も好ましくは約２５重量％～約３５重量％の範囲の量で存在する。

【0033】

本発明の目的のために、固体脂質の両親媒性ポリマーに対する比は、約１０：１～約１：１０、約９：１～約１：９、約１：８～約８：１、約１：７～約７：１、約１：６～約６：１、約１：５～約５：１、約１：４～約４：１、約１：３～約３：１、約１：２～約２：１、又は約１：１の範囲である。

【0034】

本発明の目的のために、液体脂質の両親媒性ポリマーに対する比は、約１０：１～約１：１０、約９：１～約１：９、約１：８～約８：１、約１：７～約７：１、約１：６～約６：１、約１：５～約５：１、約１：４～約４：１、約１：３～約３：１、約１：２～約２：１、又は約１：１の範囲である。

【0035】

別の態様によると、本発明によるＬＰＨナノ粒子は、固体脂質、液体脂質、及び両親媒性ポリマーの疎水性ブロックの相互作用に起因して形成された疎水性コア内に、１つ以上の活性剤を捕捉している。

【0036】

本発明の目的のために、少なくとも１つの界面活性剤は、ＨＬＢ範囲５未満か１５超から選択されるが、Ｓｐａｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５、又はこれらの組み合わせに限定されない。これらは、その表面上への吸着によって脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子の安定化を助け、粒子の凝集を防止し、したがってコロイド安定性を高める。

【0037】

本発明の目的のために、少なくとも１つの界面活性剤は、約０．５ｗ／ｖ％～約１０ｗ／ｖ％の範囲の量で存在する。

【0038】

本発明の目的のために、ナノ粒子は、内因性分子又はそれらの類似体、抗酸化剤、抗生物質、抗新生物剤、ステロイド性ホルモン、性ホルモン、ペプチド、非ステロイド性抗炎症薬（non-steroidal anti-inflammatory drug、ＮＳＡＩＤ）、抗真菌薬、抗ウイルス薬、ノイラミニダーゼ阻害剤、オピオイド作動薬又は拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、抗血管新生薬、診断化合物、及びワクチン又は生物学的物質などの薬学的に活性な化合物を封入している。

【0039】

内因性分子又はそれらの類似体、抗酸化剤、抗生物質、抗新生物剤、ステロイド性ホルモン、性ホルモン、ペプチド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗真菌薬、抗ウイルス薬、ノイラミニダーゼ阻害剤、オピオイド作動薬又は拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、抗血管新生薬、診断化合物、及びワクチン又は生物学的物質のような、様々な薬学的に活性な薬物は、この提案された脂質ポリマーハイブリッドナノ粒子中に充填され得る。

【0040】

ステロイド性ホルモンは、コルチコステロイド性ホルモン（ヒドロコルチゾン、プロゲステロン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、フッ素化コルチコステロイド）、同化ステロイド（レタボリル、ネロボリル、アンドロステノロン、アンドロステノン、ナンドロロール）、生理学的に同等のホルモン（例えば、ビタミンＤ）誘導体、又はこれらの組み合わせから選択することができる。

【0041】

抗新生物剤は、抗がん抗生物質（ミトマイシン、ダウノビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、エピルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、バルルビシン）、トポイソメラーゼ阻害剤（イリノテカン、トポテカン）、植物アルカロイド及びそれらの誘導体（ドセタキセル、エトポシド、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カンプトテシン、ビンデシン）、アロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）、代謝拮抗物質（ゲンシタビン、ペメトレキセド、メトトレキセート、クラドリビン、クロファラビン、ラルチトレキセド、フルダラビン、フルオロウラシル、チオグアニン、カペシタビン、メルカプトプリン、シタラビン）から選択することができる。

【0042】

様々な追加の薬物は、抗ヒスタミン剤（セチリジン、ロラタジン、アステミゾール、テルフェナジンなど）、ロイコトリエン受容体拮抗薬（ザフィルルーカスト及びモンテルカスト）、５－ＬＯＸ阻害剤（ジロートン）、非ステロイド性抗炎症薬（イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェンなど）、酸化防止剤（コエンザイムＱ１０、アスタキサンチン、リコペン、ケルセチン、５－アルファリポ酸など）、カルシニューリン阻害剤（タクロリムス又はピメクロリムス）、脱ピグメンティング剤（モノベンゾン、メキノール又はヒドロキノン）、アルファ作動薬（ブリモニジン、オキシメタゾリン又はキシロメタゾリン）、抗生物質（ドキソルビシン、レボフロキサシン、リファンピシン、アジトロマイシン）、抗真菌剤（ケトコナゾール及びジフルカン）、抗寄生虫物質（ペルメトリン、リンダン、マナチオン又は安息香酸ベンジル、サルフィラム、カルバリル、クロタミトン及びフェノトリン、アルベンダゾール、チアベンダゾール）、抗ウイルス薬（ポドフィラム樹脂及びポドフィロトキシン、アシクロビルなど）、皮膚がん用薬物（シスプラチン、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン、トポテカン、及びエトポシド、ダカルバジン、パクリタキセル、ビンブラスチン）などの異なるカテゴリーから充填され得る。

【0043】

本発明の別の実施形態によると、ナノ粒子は、１～１０の範囲のｌｏｇ Ｐを有する１つ以上の薬学的に活性な化合物を封入している。例えば、Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ（ｌｏｇ Ｐ：１．４４）、５－アルファリポ酸（ｌｏｇ Ｐ：２．１）、ドセタキセル三水和物（ｌｏｇ Ｐ：２．９２）、プロピオン酸クロベタゾール（ｌｏｇ Ｐ：３．４９）、コレカルシフェロール（ｌｏｇ Ｐ：７．５）、コエンザイムＱ１０（ｌｏｇ Ｐ：１０）。

【0044】

いくつかの実施形態では、粒子表面は、小分子（葉酸、ガラクトースを含むがこれらに限定されない）、ペプチド（ＲＧＤ、ＴＡＴを含むがこれらに限定されない）又はタンパク質（トランスフェリンを含むが、これに限定されない）、又は造影剤が挙げられるがこれらに限定されない標的リガンドを、両親媒性ポリマーの親水性セグメントに付着させることによって修飾され得る。

【0045】

本発明は、ナノ粒子が疎水性脂質及び両親媒性ポリマーマトリックスを含む、ＬＰＨナノ粒子薬物送達ビヒクルを提供する。

【0046】

一実施形態では、ＬＰＨナノ粒子薬物送達系は、（ａ）固体脂質及び液体脂質を含む疎水性脂質と、（ｂ）両親媒性ポリマーマトリックスと、を含む。

【0047】

別の実施形態によると、本発明によるＬＰＨナノ粒子は、少なくとも約５０％以上の薬物封入効率を有する。好ましい実施形態によると、本発明によるＬＰＨナノ粒子は、約５０％～約１００％の範囲の薬物封入効率を有する。

【0048】

好ましい実施形態によると、本発明によるＬＰＨナノ粒子は、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の薬物封入効率を有する。

【0049】

別の実施形態によると、ＬＰＨナノ粒子薬物送達系は、
（ａ）固体脂質及び液体脂質を含む疎水性コアと、
（ｂ）両親媒性ポリマーであって、疎水性部分が、固体脂質及び液体脂質と疎水性コアを形成し、及び親水性部分が、中央の疎水性コアの外側に配置されて親水性シェルを形成する、両親媒性ポリマーと
を含む。

【0050】

本発明は、ナノ粒子が、固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーを含み、（ａ）コアが、固体脂質、液体脂質、及びポリマーの疎水性ブロックを含み、（ｂ）コアを取り囲むシェルが、ポリマーの親水性部分を含む、ＬＰＨナノ粒子薬物送達ビヒクルを提供する。

【0051】

別の実施形態によると、ＬＰＨナノ粒子薬物送達ビヒクルは、
（ａ）固体脂質、液体脂質、及びポリマーの疎水性ブロックを含むコアと、
（ｂ）コア内に捕捉された活性分子と、
（ｃ）ポリマーの親水性部分を含む、コアを取り囲むシェルと
を含む。

【0052】

別の実施形態によると、ＬＰＨナノ粒子薬物送達ビヒクルは、
（ａ）固体脂質、液体脂質、及びポリマーの疎水性ブロックを含むコアと、
（ｂ）コア内に捕捉された活性分子と、
（ｃ）ポリマーの親水性部分を含む、コアを取り囲むシェルと、
（ｄ）界面活性剤と
を含む。

【0053】

別の実施形態によると、ＬＰＨナノ粒子薬物送達ビヒクルは、
（ａ）固体脂質、液体脂質、及びポリマーの疎水性ブロックを含むコアと、
（ｂ）コア内に捕捉された活性分子と、
（ｃ）ポリマーの親水性部分を含む、コアを取り囲むシェルと、
（ｄ）ナノ粒子を取り囲む水性相中に存在する界面活性剤と
を含む。

【0054】

別の実施形態によると、ＬＰＨナノ粒子薬物送達ビヒクルは、本質的に、
（ａ）固体脂質、液体脂質、及びポリマーの疎水性ブロックを含むコアと、
（ｂ）コア内に捕捉された活性分子と、
（ｃ）ポリマーの親水性部分を含む、コアを取り囲むシェルと
（ｄ）ナノ粒子を取り囲む水性相中に存在する界面活性剤と
からなる。

【0055】

本発明の別の実施形態によると、ＬＰＨナノ粒子は、薬物又は薬学的に活性な成分を、固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーと共に最小量のクロロホルムに溶解することによって調製され、これは、わずかな加温後に加熱してクロロホルムを除去し、均質のマトリックスの形成をもたらすことによる。形成されたマトリックスを加熱するか又は加熱せずに、水性界面活性剤溶液を添加し、混合する。この水性脂質分散液は、１℃～７０℃の温度範囲に維持され、サイズ低減技術（超音波処理又は均質化）が施され、その後、熱いナノ粒子分散液を即時冷却してＬＰＨナノ粒子を得た。

【0056】

本発明の別の実施形態によると、薬物又は薬学的に活性な成分を、固体脂質、液体脂質及び両親媒性ポリマーと共に含有するマトリックスを、室温で加工し、水性界面活性剤溶液を固体マトリックスを含有するバイアル瓶に室温で移し、プローブ超音波処理を施してナノ粒子を得る。使用した界面活性剤は、Ｓｐａｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ８０及びＳｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５のように、ＨＬＢ範囲５未満か１５超を伴っていた。

【0057】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の１つ以上の活性剤を含む粒子（又は複数の粒子を含む組成物）を対象に投与することによって、障害を治療する方法を特徴とし、１つ以上の活性剤は、障害を治療するのに有効である。本発明はまた、障害の治療における１つ以上の活性剤を含む本明細書に記載の粒子の使用を特徴とし、１つ以上の活性剤は、障害を治療するのに有効である。更に、この粒子は、塗布用のゲル、クリーム、又は軟膏担体に組み込まれ得る。更に、この粒子は、経口、非経口、鼻、局所、経皮又は眼の経路によって患者に投与され得る。

【実施例】

【0058】

本発明は、以下の非限定的な実施例によって更に例示され、開示される。

【0059】

［実施例１］プローブ超音波処理法によるプロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＰ ＬＰＨ ＮＰ）
プロピオン酸クロベタゾールを、様々な固体脂質（ステアリン酸、モノステアリン酸グリセリル、コンプリトール、プレシロール、コレステロール又はコール酸）、液体脂質（オレイン酸、リノール酸、ミグリオール、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ Ｃ８又はＣａｐｔｅｘ３５５）、両親媒性ポリマー（ｍＰＥＧ－ＰＬＡ）、及び界面活性剤（Ｓｐａｎ ８０、Ｔｗｅｅｎ ８０又はＳｏｌｕｔｏｌ ＨＳ １５）と組み合わせることによって、表１と同様にバッチを調製した。薬物（４ｍｇ）、固体脂質（６０ｍｇ）、液体脂質（６０ｍｇ）、ポリマー（６０ｍｇ）及び界面活性剤（１．５ｗ／ｖ％）を取り入れることによって、２．１７％理論薬物充填（Theoretical Drug Loading、ＴＤＬ）にてバッチを実施した。

【0060】

プロピオン酸クロベタゾール（４ｍｇ）、固体脂質（Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ ５、６０ｍｇ）、液体脂質（リノール酸、６０ｍｇ）及びポリマー（メトキシポリエチレングリコール－ｃｏ－ポリ乳酸（methoxypolyethyleneglycol-co-polylactic acid、ｍＰＥＧ－ＰＬＡ）コポリマー、６０ｍｇ）を５ｍｌガラスバイアル瓶に入れた。これに、クロロホルム（０．４ｍｌ）を添加し、４０℃に加温して透明な溶液を得た。次いで、クロロホルムを７０℃で３０分間加熱して除去し、均一なマトリックスを形成した。Ｔｗｅｅｎ ８０（１．５ｗ／ｖ％、３ｍｌ）を含有する水溶液をマトリックスに添加し、プローブ超音波処理装置を用いて２５％振幅で４分間超音波処理した。ナノ分散液を５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、捕捉されていないＣＰ及び大きい粒子を除去した。ナノ粒子を含有する上清を回収し、粒径及びサイズ分布を分析し、並びにＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用してゼータ電位を分析し、並びにＨＰＬＣを使用して分散液中の薬物含有量を分析した。得られた結果を表２に示す。図１は、ＣＰ充填ＬＰＨナノ粒子の粒径分布を示す。

【0061】

【表1】

【0062】

これらのバッチから、高圧均等化技術によりスケールアップするために、バッチ番号１及び５を更に選択した。この選択は、粒径、ＰＤＩのデータ、粒径分布グラフの形状、及び封入効率％に基づかせた。

【0063】

［実施例２］高圧均質化法によるプロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＰ ＬＰＨ ＮＰ）
プロピオン酸クロベタゾール（１０７ｍｇ）、固体脂質（ＧＭＳ又はＰｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ ５、１６００ｍｇ）、液体脂質（オレイン酸又はリノール酸、１６００ｍｇ）及びポリマー（メトキシポリエチレングリコール－ｃｏ－ポリ乳酸コポリマー（ｍＰＥＧ－ＰＬＡ）、１６００ｍｇ）を１００ｍｌビーカーに入れた。これに、クロロホルム（７ｍｌ）を添加し、４０℃に加温して透明な溶液を得た。次いで、クロロホルムを７０℃で３時間加熱して除去し、均一なマトリックスを形成した。Ｔｗｅｅｎ ８０（１．５ｗ／ｖ％、５０ｍｌ）を含有する水溶液をマトリックスに添加し、３０，０００ｒｐｍで５分間、高剪断均質化を施し、粗分散液を得た。Ｔｗｅｅｎ ８０（１．５ｗ／ｖ％、３０ｍｌ）を使用して、高圧ホモジナイザ（high-pressure homogenizer、ＨＰＨ）のリザーバ及びコネクタ中に存在する水を置き換えた。次いで、粗分散液をＨＰＨのリザーバに添加し、１０００バールの圧力で５分間均質化した。均質化中の温度を監視し、４５℃未満に維持した。ナノ分散液（７０ｍｌ）をプロセスの終わりに回収し、直ちに氷浴で冷却し、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、捕捉されていない薬物及び大きな粒子を除去した。ナノ粒子を含有する上清を回収し、粒径及びサイズ分布を分析し、並びにＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用してゼータ電位を分析し、並びにＨＰＬＣを使用して分散液中の薬物含有量を分析した。得られた結果を表２に示す。図２は、高圧ホモジナイザを使用して調製したバッチ５のＣＰ充填ＬＰＨナノ粒子の粒径分布グラフを示す。

【0064】

【表2】

【0065】

［実施例３］ドセタキセル（ＤＴＸ）、コレカルシフェロール（ＣＶＤ）又はコエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）充填ＬＰＨナノ粒子の調製
ドセタキセル三水和物、又はコエンザイムＱ１０（２０ｍｇ）、固体脂質（Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ ５、１８０ｍｇ）、液体脂質（リノール酸、１８０ｍｇ）及びメトキシポリエチレングリコール－ｃｏ－ポリ乳酸コポリマー（ｍＰＥＧ－ＰＬＡ）（１８０ｍｇ）を丸底フラスコ（round-bottomed flask）に入れた。これに、クロロホルム（０．８ｍｌ）を添加し、４０℃に加温して透明な溶液を得た。次いで、クロロホルムを６０℃で３０分間加熱して除去して、均一なフィルムを形成した。６０℃に加熱したＴｗｅｅｎ ８０（１．５ｗ／ｖ％、１０ｍｌ）を含有する水溶液を、６０℃のＲＢＦ中の溶融脂質に添加した。脂質材料の水性懸濁液を１５ｍｌのバイアル瓶に移し、温度を６０℃に維持したプローブ超音波装置を用いて２０％振幅で２分間超音波処理した。ナノ分散液を氷浴中で直ちに冷却し、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、捕捉されていないＤＴＸ及び大きな粒子を除去した。ナノ粒子を含有する上清を回収し、粒径及びサイズ分布を分析し、並びにＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用してゼータ電位を分析し、並びにＨＰＬＣを使用して分散液中の薬物含有量を分析した。ＣＶＤ ＬＰＨ ＮＰを調製するためのプロセスは、ＤＴＸ／ＣｏＱ１０と同様であるが、最終処方すなわちＣＶＤ ７ｍｇ、Ｐｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）ＡＴＯ ５（９０ｍｇ）、メトキシポリエチレングリコール－ｃｏ－ポリ乳酸コポリマー（ｍＰＥＧ－ＰＬＡ）（９０ｍｇ）及びリノール酸（９０ｍｇ）に関して異なった。得られた結果を表３に示す。

【0066】

【表3】

【0067】

［実施例４］プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）、コレカルシフェロール（ＣＶＤ）又はコエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）充填ＬＰＨナノ粒子を含有するゲルの調製
プロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子含有ゲル（約０．０５ｗ／ｗ％のプロピオン酸クロベタゾール、１００ｇ）、コレカルシフェロール充填ＬＰＨナノ粒子含有ゲル（約０．００５ｗ／ｗ％及び０．００２５ｗ／ｗ％のＣＶＤ、１００ｇ）、又はコエンザイムＱ１０充填ＬＰＨナノ粒子含有ゲル（約０．０６ｗ／ｗ％及び０．０３ｗ／ｗ％のＣｏＱ１０、１００ｇ）を、０．７５ｗ／ｖ％カルボポール９７４Ｐを使用して調製した。これらの３種の異なるゲルを調製するために、カルボポール９７４Ｐ（０．７５ｇ）を別々に３つの別個のビーカーに入れ、続いて精製水（１０ｍｌ）を添加し、水和のために一晩維持した。プロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子分散液（約０．０５ｇ及び０．０２５ｇのプロピオン酸クロベタゾール）、ＣＶＤ充填ＬＰＨナノ粒子分散液（約０．００５ｇ及び０．００２５ｇのＣＶＤ）及びＣｏＱ１０充填ＬＰＨナノ粒子分散液（約０．０６ｇ及び０．０３ｇのＣｏＱ１０）を水和カルボポール９７４Ｐに添加し、ガラスロッドを用いて均一に混合した。プロピレングリコール（１３ｇ）、メチルパラベン（０．３ｇ）及びプロピルパラベン（０．３ｇ）を上記混合物に加え、視覚的均一性が得られるまでガラスロッドを使用して激しく撹拌した。精製水を添加して重量を９５ｇにし、１Ｍ ＮａＯＨを使用して混合物のｐＨを６．８に調整してゲルを得た。次いで、精製水を添加して重量を１００ｇにし、十分に撹拌して均一なゲルを得た。

【0068】

［実施例５］ＬＰＨナノ粒子からのプロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）及びドセタキセル（ＤＴＸ）のｉｎ－ｖｉｔｒｏ薬物放出
薬物充填ＬＰＨナノ粒子を含有する新たに調製したゲルからのプロピオン酸クロベタゾールのｉｎ－ｖｉｔｒｏ薬物放出試験を、２～８℃及び室温（ＲＴ）で３か月間及び６か月間保存した薬物充填ＬＰＨナノ粒子を含有するゲルと比較した。

【0069】

プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）及びドセタキセル（ＤＴＸ）ＬＰＨナノ粒子の放出試験を、以下の組成の媒体を使用して透析バッグ（ＳｎａｋｅＳｋｉｎ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｔｕｂｉｎｇ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で実施した。
ＣＰの場合：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）１０００ｍｌ中、ラウリル硫酸ナトリウム－１０ｇ、アジ化ナトリウム－２ｇ、エタノール－２０ｍｌ
ＤＴＸの場合：リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）１０００ｍｌ中、Ｔｗｅｅｎ ８０－１０ｇ、アジ化ナトリウム－２ｇ、エタノール－２０ｍｌ

【0070】

プロピオン酸クロベタゾール遊離薬物（遊離ＣＰ）、遊離プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）を含有するゲル、プロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＰ ＬＰＨ ＮＰ）を含有するゲル、安定性試料すなわち２～８℃及び室温（ＲＴ）でそれぞれ３か月間及び６か月間保管した薬物充填ＬＰＨ ＮＰを含有するゲル、遊離ドセタキセル及びＤＴＸ ＬＰＨナノ粒子（ＤＴＸ ＬＰＨ ＮＰ）を含有している透析用バッグを３０ｍｌの放出媒体に入れ、３７℃でインキュベータに保持した。試料を、時点０．２５、０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４及び１６８時間後に採取した。

【0071】

新たに調製したＬＰＨナノ粒子を含有するゲル、及び安定性試料からのＣＰの放出プロファイルを、図３及び図４にそれぞれ示す。ＬＰＨナノ粒子からのＤＴＸの放出プロファイルを図５に示す。破裂効果が全くない持続的放出を、全ての放出プロファイルにおいて観察した。

【0072】

更に、安定性試料のｉｎ－ｖｉｔｒｏ薬物放出プロファイルは、破裂放出のない新たに調製したＣＰ ＬＰＨナノ粒子を含有するゲルの薬物放出プロファイルと同様であることが判明した。

【0073】

［実施例６］プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、コレカルシフェロール（ＣＶＤ）充填ＬＰＨナノ粒子のｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ
プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）及びコレカルシフェロール（ＣＶＤ）について、ＨａＣａＴ細胞におけるＭＴＴアッセイを用いてｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを実施したが、ドセタキセルについては、４Ｔ１乳がん細胞（マウス乳腺癌腫細胞株）におけるＭＴＴアッセイを用いてｉｎ－ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを実施した。簡潔に述べると、５×１０^３細胞／ウェルを、９６ウェル培養プレートに播種し、２４時間付着させた（３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベート）。プロピオン酸クロベタゾールの場合、１～１００μＭの範囲内の遊離薬物（遊離ＣＰ）又は薬物充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＰ ＬＰＨ ＮＰ）で４８時間、細胞を処理した。ＣＶＤの場合、１～５００ｎＭの範囲内の遊離薬物（遊離ＣＶＤ）又は薬物充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＶＤ ＬＰＨ ＮＰ）で４８時間、細胞を処理した。ＤＴＸの場合、１～１０００ｎＭの範囲内の遊離薬物（遊離ＤＴＸ）又は薬物充填ＬＰＨナノ粒子（ＤＴＸ ＬＰＨ ＮＰ）で４８時間、細胞を処理した。

【0074】

ＤＭＳＯ及びブランクナノ粒子を対照として使用した。４８時間後、培養培地を除去し、プレートを滅菌ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。細胞を２０μＬのＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍＬ）で処理し、１００μＬの無血清培養培地を有する各ウェルに添加し、暗所条件において４時間処理した。４時間後、培地をプレートから除去し、ホルマザン結晶を分子グレードのＤＭＳＯに溶解した。吸光度を、５６０ｎｍ及び参照波長である６３０ｎｍで記録した。細胞阻害百分率は、未処理細胞との比較で決定した。
細胞阻害％＝（ＯＤ試料ウェル／ＯＤ対照ウェル）×１００

【0075】

図６Ａ及びＢに示すように、ＨａＣａＴ細胞の増殖は、遊離薬物と比較して、プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）又はコレカルシフェロール（ＣＶＤ）充填ＬＰＨナノ粒子とのインキュベーション時に有意に減少した。同様の方法で、ドセタキセル充填ＬＰＨナノ粒子（ＤＴＸ ＬＰＨ ＮＰ）について、遊離ＤＴＸ（図６Ｃ）と比較して、４Ｔ１乳がん細胞に対する著しく高い細胞毒性を観察した。

【0076】

［実施例７］スイスアルビノマウスのイミキモド誘発乾癬モデルにおける、プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）、コレカルシフェロール（ＣＶＤ）又はコエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）充填ＬＰＨナノ粒子を含有するゲルのｉｎ ｖｉｖｏ有効性評価
スイスアルビノマウス（８～１２週齢）に市販のＩＭＱクリーム（５％）６２．５ｍｇの局所投与を施し、それを連続５日間、剃毛した背中及び右耳に適用し、活性化合物３．１２５ｍｇの毎日の投与と解釈した。動物を以下の群に分けた：陰性対照、陽性対照、市販のＣＰゲル（０．０５ｗ／ｗ％と当量のＣＰを含有するＣｌｏｂｅｔａｍｏｓ（登録商標））、ＣＶＤ（０．００５ｗ／ｗ％）、ＣｏＱ１０（０．０６％）を含有するプレーンなゲル、及びプレーンなゲルの用量と同様の用量にあるそれぞれの薬剤、プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）、コレカルシフェロール（ＣＶＤ）又はコエンザイムＱ１０（すなわち、ＣＰの場合は０．０５％、ＣＶＤの場合は０．００５％、ＣｏＱ１０の場合は０．０６％）で充填したＬＰＨナノ粒子（ＬＰＨ ＮＰ）を含有するゲル、並びにプレーンなゲルの用量の半分の用量にあるそれぞれの薬剤、プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）、コレカルシフェロール（ＣＶＤ）又はコエンザイムＱ１０（すなわち、ＣＰの場合は０．０２５％、ＣＶＤの場合は０．００２５％、及びＣｏＱ１０の場合は０．０３％）で充填したＬＰＨナノ粒子（ＬＰＨ ＮＰ）を含有するゲル。陰性対照マウスは、任意の治療なしに放置した。陽性対照マウスは、乾癬様皮膚状態を誘発するためにのみＩＭＱ処置を受けた。動物を、１日１回、検量４０ｍｇ／ｃｍ^２の製品で処置した。治療の有効性は、臨床の乾癬面積及び重症度指数（ＰＡＳＩ）に基づいて開発された客観的スコアリングシステムによって決定した。累積スコアリング（紅斑＋落剥＋肥厚）を０～１２の尺度で行い、炎症の程度を示した。耳（右及び左の両方）の厚さを、マイクロメートルを使用して測定した。ここで、左耳は対照として扱った。背中の皮膚の厚さを、バーニアーキャリパーを使用して測定した。右耳及び背中の皮膚の厚さの増加は、乾癬の程度を示した。研究の最後に動物を犠牲にし、動物の背中の皮膚及び右耳を組織学的に検査した。

【0077】

図７に示すように、陽性対照の累積スコアは第１日から著しく増加し始め、第５日まで漸進的に増加した。データから、市販のＣＰゲル、ＣＶＤのプレーンなゲル及びＣｏＱ１０のプレーンなゲル、プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）、コレカルシフェロール（ＣＶＤ）又はコエンザイムＱ１０充填ＬＰＨナノ粒子を含有するＬＰＨナノ粒子充填ゲルを全用量及び半用量で含有する試験群との両方が、乾癬を治療することができることが観察され得る。薬物充填ＬＰＨナノ粒子含有ゲルで処置した試験群は、市販の製剤又はプレーンなゲル（すなわち、ナノ粒子を含まない遊離薬物）と比較して、改善された有効性を示した（図５Ａ～５Ｃ）。更なる組織病理学的研究（右耳及び背中の皮膚の両方）は、ＬＰＨナノ粒子系に組み込むことによる、プロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）、コレカルシフェロール（ＣＶＤ）又はコエンザイムＱ１０の有効性の顕著な改善を示した（図８、９及び１０）。

【0078】

［実施例８］より深い皮膚層（生存表皮及び真皮）中の薬物の量を決定するＥｘ－ｖｉｖｏ研究
ｅｘ－ｖｉｖｏ皮膚透過試験を、接触表面積１ｃｍ^２を有するフランツ型拡散セルを使用して、スイスアルビノマウスの乾癬皮膚において実施した。剃毛したマウスの皮膚を、クランプによってしっかりと保持したドナー区画とレセプタ区画との間に装着した。レセプタ区画を、ラウリル硫酸ナトリウム（１ｗ／ｖ％）及びエタノール（２ｖ／ｖ％）を含有するＰＢＳ（５ｍｌ、ｐＨ７．４）で満たした。

【0079】

ドナー区画には、市販のプロピオン酸クロベタゾール（ＣＰ）ゲル（Ｃｌｏｂｅｍｏｓ（登録商標））又はプロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子ゲル（プロピオン酸クロベタゾール２５μｇと当量）を入れ、続いて３７±１℃で８００ｒｐｍの撹拌速度で２４時間インキュベートした。２４時間後、レセプタ区画からアリコートを回収し、皮膚試料をフランツ型拡散セルから外し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、続いて空気乾燥した。テープ剥離には１９ｍｍのＳｃｏｔｃｈ（３Ｍ、ＵＳＡ）セロファンテープを使用した。第１の剥離テープは、それが、吸収されていない薬物を含有しているとして廃棄した。角質層（ＳＣ）層の除去のために、１５のストリップを、テープの全面積が利用されるようにして剥離した。皮膚試料から角質層を除去した後、残りの皮膚をメタノールに浸し、皮膚のより深い層（すなわち、生存表皮及び真皮）から薬物を完全に抽出するために１時間超音波処理した。試料を、開発されたバイオ分析ＲＰ－ＨＰＬＣ法によって分析した。分析は、ＰＤＡ検出器を備えた、島津製作所のＨＰＬＣシステムで実施した。クロマトグラフ分離を、１ｍＬ／分の流速で流れるアセトニトリル：水（６０：４０）からなる移動相を有するＩｎｅｒｔｓｉｌ－Ｃ１８ ＯＤＳカラム（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）上で実施した。ドセタキセル（ＤＴＸ）を内部標準として使用した。注入量は６０μＬであり、ＣＰ及びＤＴＸの保持時間は、それぞれ１３．２９分及び７．７４分であることが判明した。

【0080】

結果を図１１に示す。この研究は、より深い真皮層（ＲＳ）、すなわち生存表皮及び真皮に浸透した薬物の量に関する情報を与える。図１１から、市販の製剤の場合、薬物のほとんどが皮膚のより深い層を浸透しなかったのに対し、ナノ粒子充填ゲルの場合、市販のＣＰゲル（１ｃｍ^２当たり５．８％の薬物）と比較して、より深い層への薬物の浸透が著しく高かった（１ｃｍ^２当たり７１．４７％の薬物）ことを観察することができる。

【0081】

［実施例９］ＩＭＱ誘発乾癬マウスへの局所適用時の、クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子を含有するゲルからのプロピオン酸クロベタゾールの薬物動態（体内吸収）を決定する
ＩＭＱ誘発乾癬スイスアルビノマウス（２５～３０ｇ）を２つの群（ｎ＝６）、市販製剤処置群と試験群とに分けた。市販製剤処置群の動物をＣｌｏｂｅｔａｍｏｓ（登録商標）（０．０５ｗ／ｗ％と当量のプロピオン酸クロベタゾール）で処置し、試験群の動物を、プロピオン酸クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＰ ＬＰＨ ＮＰ）含有ゲル（０．０５ｗ／ｗ％と当量のプロピオン酸クロベタゾール）で処置した。動物から、特定の時点（すなわち、０．５時間、１時間、３時間、６時間、１２時間、及び２４時間）の血液（１００μＬ）を採取し、貯蔵し、６５００ＲＰＭで１５分間、更に遠心分離して血漿を単離した。血漿試料を、開発されたバイオ分析法を使用して逆相ＨＰＬＣによって分析し、全身循環に達した薬物の量を決定した。分析は、ＰＤＡ検出器を備えた、島津製作所のＨＰＬＣシステムで実施した。クロマトグラフ分離を、１ｍＬ／分の流速で流れるアセトニトリル：水（５５：４５）からなる移動相を有するＩｎｅｒｔｓｉｌ－Ｃ１８ ＯＤＳカラム（５μｍ、４．６×２５０ｍｍ）で実施した。ドセタキセル（ＤＴＸ）を内部標準として使用した。注入量は６０μＬであり、ＣＰ及びＤＴＸの保持時間は、それぞれ２０．６分及び１０．４分であることが判明した。

【0082】

結果は、Ｃｌｏｂｅｔａｍｏｓ（登録商標）で処置した市販群の場合、局所適用後３０分～６時間で、血漿中で検出される定量化可能な濃度の薬物が存在したことを示した。クロベタゾール充填ＬＰＨナノ粒子（ＣＰ ＬＰＨ ＮＰ）を含有するゲルで処置した試験群では、４日間にわたって、血漿中で検出される定量化可能な濃度の薬物は存在しなかった（表４）。ＣＰ ＬＰＨナノ粒子は、体内送達なしで、特定の皮膚保持能力と共に持続的に薬物を徐放するので、Ｃｌｏｂｅｔａｍｏｓ（登録商標）には該当しない、薬物に伴う全身的な副作用が低減されると結論付けることができる。

【0083】

【表4】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【国際調査報告】