(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-15
(54)【発明の名称】培養システムおよび培養食品の大量生産方法
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20220708BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20220708BHJP
C12M 3/06 20060101ALI20220708BHJP
A23L 13/00 20160101ALI20220708BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 A
C12M1/34 D
C12M3/06
A23L13/00 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021564385
(86)(22)【出願日】2020-04-30
(85)【翻訳文提出日】2021-12-01
(86)【国際出願番号】 IL2020050484
(87)【国際公開番号】W WO2020222239
(87)【国際公開日】2020-11-05
(31)【優先権主張番号】62/841,864
(32)【優先日】2019-05-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521193290
【氏名又は名称】アレフ ファームス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ラボン，ネタ
(72)【発明者】
【氏名】アビブ，モシェ
(72)【発明者】
【氏名】ロス，ヨアヴ
(72)【発明者】
【氏名】トビア，ディディエ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B042
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029BB11
4B029CC10
4B029DA01
4B029DA04
4B029DE08
4B029DF01
4B029DF05
4B029FA12
4B042AC10
4B042AD36
4B042AE03
4B042AP30
(57)【要約】
培養システムにおいて食用足場上で非ヒト動物付着細胞を増殖させることを含む、肉切り身または内臓の形態の培養肉などの培養食品を生産するためのシステムおよび方法を提供する。培養システムは、典型的には、非ヒト動物付着細胞に栄養を与えるように調整された制御された流速で培地を受け取る複数の細胞培養バイオリアクタを備える。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
培養食品を生産するための培養システムであって、ａ．少なくとも１つの三次元多孔質食用足場に播種された２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞をその中に含む１つ以上の細胞培養バイオリアクタと、
ｂ．制御された流速で前記１つ以上の細胞培養バイオリアクタに培地を送達するように構成された送達システムであって、前記流速が、前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場に播種された前記細胞に栄養を与えるように調整される、送達システムと、を備える、システム。
【請求項2】
前記制御された流速が、前記１つ以上の細胞培養バイオリアクタ内の気泡形成を防ぐように調整される、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記１つ以上の細胞培養バイオリアクタ内の培地を放射状に混合するための１つ以上のロッカーをさらに備える、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項4】
前記１つ以上の細胞培養バイオリアクタ内の温度を制御するための１つ以上の温度制御要素をさらに備える、請求項１～３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項5】
複数の細胞培養バイオリアクタであって、前記複数の細胞培養バイオリアクタのそれぞれが、制御された流速で前記送達システムを介して培地を別々に受け取る、複数の細胞培養バイオリアクタをさらに備える、請求項１～４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項6】
前記制御された流速が、プラグフロー方式で前記１つ以上の細胞培養バイオリアクタのそれぞれ内の前記培地の循環を可能にする、請求項１～５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項7】
液面、温度、ｐＨ、溶存酸素、１つ以上の栄養素の濃度、１つ以上の望ましくない化合物の濃度、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるパラメータを前記培地内で測定するための１つ以上のセンサをさらに備える、請求項１～６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項8】
前記１つ以上のセンサと動作可能に通信し、かつ前記少なくとも１つのパラメータの測定値を受信し、前記測定値に基づいて前記少なくとも１つのパラメータを調整するように構成された、制御ユニットをさらに備える、請求項７に記載のシステム。
【請求項9】
（ｉ）細胞増殖培地を前記バイオリアクタシステムに供給するための培地リザーバと、（ｉｉ）処理容器であって、培地を受け取ることと、液面、温度、ｐＨ、溶存酸素、１つ以上の栄養素の濃度、１つ以上の望ましくない化合物の濃度、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるパラメータを前記培地で測定することと、前記測定値に基づいて前記少なくとも１つのパラメータを調整することと、を行うように構成された、処理容器と、をさらに備え、
前記送達システムが、培地を前記１つ以上の細胞培養バイオリアクタから前記処理容器に循環させるようにさらに構成されている、請求項１～８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項10】
前記送達システムが、培地を前記処理容器から前記１つ以上の細胞培養バイオリアクタに循環させるようにさらに構成されている、請求項９に記載のシステム。
【請求項11】
前記培地から望ましくない化合物を除去するように構成された、透析器および透析液を有する透析システムをさらに備え、前記送達システムが、培地を前記１つ以上の細胞培養バイオリアクタまたは前記処理容器から前記透析システムに、およびそれに続いて前記処理容器に循環させるようにさらに構成されている、請求項１０に記載のシステム。
【請求項12】
前記透析液が、廃棄物として透析後に前記透析器から流出する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項13】
前記処理容器が、インペラと、前記少なくとも１つのパラメータを測定するための１つ以上のセンサと、栄養素の少なくとも１つ、望ましくない化合物を中和するための中和剤、および２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞を添加するように構成された１つ以上のポートと、熱交換器と、酸素供給器と、ｐＨ制御ユニットと、を備える、請求項９～１２のいずれか一項に記載のシステム
【請求項14】
温度、ｐＨ、溶存酸素、１つ以上の栄養素の濃度、１つ以上の望ましくない化合物の濃度、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるパラメータを前記培地内で測定するように構成された感知ユニットをさらに備える、請求項９～１３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項15】
前記少なくとも１つのパラメータの前記調整を制御するために、前記処理容器および任意選択で感知ユニットと動作可能に通信する制御ユニットをさらに備える、請求項９または１４に記載のシステム。
【請求項16】
前記制御ユニットが、さらに、前記細胞の増殖速度および／または増殖期に従って前記１つ以上の細胞培養バイオリアクタ内の前記培地の前記流速を制御するために、前記送達システムと動作可能に通信している、請求項１５に記載のシステム。
【請求項17】
前記制御ユニットが、さらに、前記細胞の前記増殖期に従って前記培地組成を制御するために、前記処理容器と動作可能に通信している、請求項１５または１６に記載のシステム。
【請求項18】
流加培養モードで動作している、請求項１に記載のシステム。
【請求項19】
前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場が、前記足場の乾燥重量に基づいて少なくとも１０重量％のタンパク質含有量を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項20】
前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場が、植物、真菌、または藻類由来のものである、請求項１９に記載のシステム。
【請求項21】
前記細胞培養バイオリアクタ内に置かれた前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場が無菌である、請求項２０に記載のシステム。
【請求項22】
前記２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞が、間質細胞、内皮細胞、脂肪細胞、筋細胞、肝細胞、心筋細胞、腎細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、神経細胞、線毛上皮細胞、腸細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞、それらの前駆細胞、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～２１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項23】
前記２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞が、結合組織細胞、筋細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞、脂肪細胞、内皮細胞、およびそれらの前駆細胞からなる群から選択される、請求項１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項24】
前記１つ以上のタイプの付着細胞が、単一の動物種に由来する、請求項１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項25】
前記１つ以上のタイプの付着細胞が、２つ以上の異なる種の動物由来のものである、請求項１～２３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項26】
前記動物が、有蹄動物、家禽、水生動物、無脊椎動物、および爬虫類からなる群から選択される種のものである、請求項２４または２５に記載のシステム。
【請求項27】
前記有蹄動物が、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、キリン、ラクダ、シカ、カバ、またはサイからなる群から選択される、請求項２６に記載のシステム。
【請求項28】
前記非ヒト動物付着細胞が、ウシ由来細胞である、請求項２７に記載のシステム。
【請求項29】
前記ウシ細胞が、多能性幹細胞（ｂＰＳＣ）である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項30】
前記ｂＰＳＣが、ウシ誘導多能性幹細胞（ｂｉＰＳＣ）およびウシ胚性幹細胞（ｂＥＳＣ）からなる群から選択される、請求項２９に記載のシステム。
【請求項31】
前記非ヒト動物付着細胞が、ウシ多能性幹細胞（ｂＰＳＣ）から分化した細胞を含む、請求項２９または３０に記載のシステム。
【請求項32】
前記食品が、培養肉である、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項33】
前記三次元多孔質食用足場が、非ヒト動物細胞を付着する増強された能力を有するように調整される、請求項１～３２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項34】
前記細胞培養バイオリアクタが、可撓性バッグである、請求項１～３３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項35】
前記細胞培養バイオリアクタが、単回使用のためのものである、請求項３４に記載のシステム。
【請求項36】
可撓性バッグの形態の前記細胞培養バイオリアクタが、前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場の挿入後、その密封を可能にするように構成されている、請求項３５に記載のシステム。
【請求項37】
可撓性バッグの形態の前記細胞培養バイオリアクタが、前記細胞の増殖後、その密封を可能にして、前記可撓性バッグ内に前記培養食品を含む包装食品を形成するように構成されている、請求項３５または３６に記載のシステム。
【請求項38】
前記送達システムが、１つ以上の蠕動ポンプを含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項39】
１つ以上のバブルトラップをさらに備える、請求項１～３８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項40】
培養食品を生産するための細胞培養バイオリアクタであって、前記細胞培養バイオリアクタが、可撓性バッグであって、前記バッグの内外への培地の流れを可能にする少なくとも１つの入口ポートおよび少なくとも１つの出口ポートを含む、可撓性バッグの形態であり、前記可撓性バッグの内面が、食品安全材料であり、前記バッグが、その中に少なくとも１つの三次元多孔質食用足場を含み、前記足場が、動物付着細胞に付着表面を提供することができる、細胞培養バイオリアクタ。
【請求項41】
前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場が、前記足場の乾燥重量に基づいて少なくとも１０重量％のタンパク質含有量を含む、請求項４０に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項42】
前記可撓性バッグが、前記足場が前記バッグ内にある間、前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場上に細胞を播種することを可能にするように構成されている、請求項４０または４１に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項43】
前記可撓性バッグが、感光性材料を光への曝露から保護する材料、水蒸気および／または酸素に対して本質的に不透過性の材料、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される材料から構成されている、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項44】
前記バッグに挿入された前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場または複数の前記足場の総容積が、前記可撓性バッグの内部容積の約２０％～約９５％である、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項45】
単回使用のために構成された、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項46】
前記細胞培養バイオリアクタへの前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場の挿入後、前記バッグを密封することを可能にするように構成された、請求項４５に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項47】
前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場上での細胞の増殖および培養食品の生産後、前記バッグの密封を可能にし、前記バッグ内に前記培養食品を含む包装食品を形成するように構成された、請求項４５または４６に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項48】
前記バッグが、複数の層を含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項49】
前記内層が、食品安全ポリエチレンである、請求項４８に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項50】
前記バッグが、食品安全ポリエチレンの内層、ナイロン層、および任意選択で追加のポリエチレン層を有する、請求項４９に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項51】
前記培養食品が、培養肉である、請求項４０～５０のいずれか一項に記載の細胞培養バイオリアクタ。
【請求項52】
包装食品であって、ａ．食品安全材料の内面を有する密封された滅菌バッグと、
ｂ．前記バッグの内部容積全体を実質的に満たす、バッグ内の培養肉部分であって、少なくとも１つの三次元多孔質食用足場に付着した複数の非ヒト動物付着細胞タイプを含む細胞組織を含む、培養肉部分と、を含む、包装食品。
【請求項53】
前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場が、前記足場の乾燥重量に基づいて少なくとも１０重量％のタンパク質含有量を含む、請求項５２に記載の包装食物。
【請求項54】
前記バッグが、感光性材料を光への曝露から保護する材料、水蒸気および／または酸素に対して本質的に不透過性の材料、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される材料から構成されている、請求項５２または５３に記載の包装食物。
【請求項55】
前記食品安全材料が、細胞付着性ではない、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の包装食品。
【請求項56】
前記バッグが、複数の層を含む、請求項５２～５５のいずれか一項に記載の包装食品。
【請求項57】
前記バッグが、食品安全ポリエチレンの内層、ナイロン層、および任意選択で追加のポリエチレン層を含む、請求項５６に記載の包装食品。
【請求項58】
前記複数の動物付着細胞タイプが、間質細胞、内皮細胞、脂肪細胞、筋細胞、肝細胞、心筋細胞、腎細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、神経細胞、線毛上皮細胞、腸細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞、それらの前駆細胞、およびそれらの任意の組み合わせから選択される細胞を含む、請求項５２～５６のいずれか一項に記載の包装食品。
【請求項59】
商業規模で培養食品を生産するための方法であって、ａ．細胞増殖培地を含む細胞培養バイオリアクタ内に配置された少なくとも１つの足場に２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞を播種することであって、前記足場が三次元多孔質食用足場である、播種することと、
ｂ．制御された流速で細胞増殖培地を前記細胞培養バイオリアクタに送達し、前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場に播種された前記細胞に栄養を与えるように前記流速を調整することと、
ｃ．所望の組織塊が得られるまで前記細胞を増殖させ、それにより培養食品を得ることと、を含む、方法。
【請求項60】
細胞増殖培地を前記細胞培養バイオリアクタから処理容器および／または透析システムに循環させ、続いて前記細胞培養バイオリアクタに戻すことをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
１つ以上の栄養素の濃度が不十分になった場合に前記培地に栄養素を添加することをさらに含み、任意選択で、前記プロセスに沿って生成される望ましくない化合物を中和するための１つ以上の中和剤を添加することをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
培地が、前記処理容器内にある、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記少なくとも１つの三次元多孔質食用足場が、前記足場の乾燥重量に基づいて少なくとも１０重量％のタンパク質含有量を含む、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記制御された流速が、前記細胞培養バイオリアクタにおける前記足場からの細胞の剥離および／または気泡形成を防止するように調整される、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記流速が、細胞増殖速度および／または細胞増殖期に従って調整される、請求項５９～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記培地組成が、前記細胞増殖期に従って調整される、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞を播種するステップ（ｉ）が少なくとも１回繰り返される、請求項５９～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
前記細胞増殖培地をサンプリングし、前記増殖培地内のグルコースおよび／または乳糖分解酵素の濃度を測定することをさらに含む、請求項５９～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
グルコース取り込み率（ＧＵＲ）が実質的に一定になるまで前記細胞を増殖させる、請求項５９～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記細胞が５～１４日間増殖される、請求項５９～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
前記食品を水ベースの溶液で洗浄して前記増殖培地を除去することをさらに含む、請求項５９～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記細胞培養バイオリアクタが、単回使用のための可撓性バッグの形態である、請求項５９～７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
前記細胞が、前記所望の組織塊に到達した後に前記バッグを密封して包装食品を得ることをさらに含み、前記包装食品が、前記密封されたバッグおよび前記バッグ内の前記培養食品を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
請求項５９～７３のいずれか一項に記載の方法によって生産された少なくとも１つの三次元多孔質食用足場に付着した複数の非ヒト動物付着細胞タイプを含む細胞組織を含む培養食品。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、商業規模での培養食品、特に培養肉の生産、特に肉の切り身または内臓の形態の培養肉の製造に関する。
【背景技術】
【0002】
過去数十年の間に、動物ベースの肉に関連する環境上の危険や道徳的問題なしに、少なくとも肉と同等の食事体験と栄養価を提供する、人間が消費する食品への関心が高まっている。この関心は、食品業界と科学界の両方による培養肉（細胞ベースの肉、クリーンミート、栽培肉、屠殺のない肉とも呼ばれる）を生産するためのシステム、方法、および組成物の探索を促進する。
【0003】
培養肉製品の製造における課題には、大量の細胞の生産が含まれ、一度入手すると、目に見える外観、食感、風味、香りなど、消費者にアピールする感覚的品質を備えた製品を生産することが含まれる。さらなる課題は、人間の消費に適した肉製品を大量に製造するために、生産プロセスをスケールアップすることである。特に難題な使命は、サービングに適した肉部分を得るために融合または接続する必要がある別個の培養肉凝集体または層ではなく、サービングに適した肉部分を直接生産することである。
【0004】
大量の哺乳動物細胞を産生し、細胞を物質に付着させる試みは、例えば、治療用途および組織移植および臓器移植のための幹細胞を産生するために、製薬研究および産業で行われている。例えば、米国特許第６，９１１，２０１号および米国出願公開第２０１０／０２３３１３０号は、定常期プラグフローバイオリアクタを使用して未分化造血幹細胞を産生する方法を開示している。いくつかの実施形態では、方法は、未分化造血幹細胞または前駆細胞を、三次元間質細胞培養物がシートの形態の基質上に事前に確立されている定常期プラグフローバイオリアクタに播種することを含み、その基質は、生理学的に許容できる繊維の三次元ネットワークを形成する不織布繊維マトリックスを含む。国際（ＰＣＴ）出願公開第２００８／１５２６４０号は、造血幹細胞を含む三次元間質細胞培養物をレシピエントに移植する方法を開示している。
【0005】
米国特許第９，１２７，２４２号は、使い捨て、単一または複数の組織、器官、および移植片のバイオリアクタ、ならびに環境制御システムを開示している。いくつかの実施形態では、足場管上での血管移植片の増殖が開示されている。
【0006】
米国特許第９，９８７，３９４号は、補綴インプラントおよびバイオリアクタでそれを生産するための方法が開示している。補綴インプラントは、生体適合性の三次元足場と、骨芽細胞、破骨細胞、および内皮細胞、またはそれらの前駆細胞からなる群から選択される少なくとも２つの細胞タイプを含む。
【0007】
米国特許出願公開第２０１１／０２８７５０８号は、バイオリアクタ、およびそれらを使用して組織工学製品または培養細胞を生産する方法を開示している。より具体的には、細胞がその上にまたはその中に付着、カプセル化、または固定化された、粒子の最初の休止床が流体を上向きに通過させて拡張床を形成する、拡張床バイオリアクタに基づく組織および細胞培養法が開示されており、その拡張床において、流体は、粒子を分離するように作用し、すなわち、プラグフロー条件下で、細胞を培養して組織を形成するステップ中に粒子の相対位置を維持できるようにし、粒子と乱流または対流混合との衝突を減らすのに役立つ。
【0008】
国際（ＰＣＴ）出願公開第２０１３／０１６５４７号は、複数の少なくとも部分的に融合した層として形成された組換え肉製品を開示しており、各層は、非ヒト筋細胞を含む少なくとも部分的に融合した多細胞体を含み、組換え肉は食料品である。
【0009】
国際（ＰＣＴ）出願公開第２０１３／１１６４４６号は、管状器官の修復または置換のための管状の生体工学による平滑筋構造ならびに生体工学による組織を生成する方法を開示している。この方法は、平滑筋細胞を取得するステップと、筋細胞を培養して、方向性のある平滑筋細胞の平滑筋細胞構築物を形成するステップと、管状足場の周りに平滑筋細胞構築物を配置するステップと、平滑筋細胞構造が達成されるまで、増殖培地で構築物および足場を培養するステップと、を含むことができる。
【0010】
国際（ＰＣＴ）出願公開第２０１５／０３８９８８号は、バイオリアクタで使用して、食用の組換え肉製品を形成するために使用され得る細胞を培養するのに適した、マイクロキャリアビーズ、ミクロスフェア、マイクロスポンジなどの食用マイクロキャリアを開示している。
【0011】
国際（ＰＣＴ）出願公開第２０１８／０１１８０５号は、細胞を増殖させるためのバイオリアクタチャンバーと、細胞を介した灌流溶液の灌流のための灌流溶液をバイオリアクタチャンバーに送達する送達システムと、透析器、透析を実施するための透析液、および該透析液中のアンモニア含有量を低減するためのフィルター、ならびに灌流溶液を透析器に循環させ、透析液をフィルターに循環させるコントローラーを有する透析システムと、を備える、細胞増殖システムを開示している。
【0012】
国際（ＰＣＴ）出願公開第２０１８／１８９７３８号は、ハイブリッド食品の生産方法を開示している。この方法は、植物由来物質をある量の培養動物細胞と組み合わせて、ハイブリッド食品中の肉官能的および／または肉栄養特性を増強することを含み、動物細胞は組織を形成せず、動物細胞およびその物質の量は、ハイブリッド食品の３０％（ｗ／ｗ）未満である。
【0013】
国際（ＰＣＴ）出願公開第２０１８／２２７０１６号は、細胞培養食品を生産するためのシステムおよび方法を開示している。培養食品には、寿司グレードの魚肉、魚のすり身、フォアグラ、その他のタイプの食品が含まれる。食品を生産するために様々な細胞タイプが利用されており、筋肉、脂肪、および／または肝臓細胞を含むことができる。培養食品は、毒素やその他の望ましくない化学物質にさらされることなく、病原体のない培養条件で増殖される。
【0014】
国際（ＰＣＴ）出願公開第２０１９／０１６７９５号は、三次元多孔質足場および複数のタイプの細胞（その筋芽細胞またはその前駆細胞、少なくとも１つのタイプの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞、および内皮細胞またはそれらの前駆細胞を含む）をインキュベートすることと、筋芽細胞の筋管への分化を誘導することと、を含む、食用組成物を生産する方法を開示している。
【0015】
バイオリアクタ内の食用足場上で動物細胞を増殖させて、足場および細胞から形成された組織を含む食品を生産することにより、培養肉などの培養食品を生産することはどこにも開示または示唆されていない。
【0016】
培養肉などの培養食品を商業規模で生産し、費用効果が高く、迅速かつ簡単に培養肉製品を製造するためのシステムおよび方法が必要である。
【発明の概要】
【0017】
本発明は、培養食品、特に培養肉を商業規模で生産するためのシステムおよび方法を提供する。
【0018】
本発明のシステムおよび方法は、少なくとも１つの細胞培養バイオリアクタ、典型的には複数の細胞培養バイオリアクタを備える培養システムにおいて、少なくとも１つの足場上で非ヒト動物由来の付着細胞を増殖させることを含む。本発明のシステムは、有利には、複数の細胞培養バイオリアクタへの明確な培地の制御された流れを提供することができ、培地は、足場への細胞付着を妨げずに、足場上で増殖する細胞を供給する。本発明によれば、流速および培地組成は、好ましくは、細胞の増殖速度および／または増殖期に適合される。典型的には、培養システムは、均一な流速で複数の細胞培養バイオリアクタに培地を送達するが、別個の細胞培養バイオリアクタの流速の調整もまた、本発明のシステムによって可能になる。
【0019】
本発明による培養食品は、少なくとも１つの三次元の多孔質の食用足場と、足場に播種された動物細胞から足場上および足場内に形成された組織とを含む。有利には、かつ培養肉を生産するためのこれまでに記載された方法とは対照的に、本発明のシステムおよび方法は、サービングに適した肉部分を生産するために接続する必要がある別個の凝集体または小片ではなく、肉部分を生産する。さらに、本発明のシステムは、容易に包装され、無菌の培養食品の生産を可能にする。
【0020】
一態様によれば、本発明は、培養食品を生産するための培養システムであって、
（ａ）少なくとも１つの三次元多孔質食用足場に播種された２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞をその中に含む１つ以上の細胞培養バイオリアクタと、
（ｂ）制御された流速で１つ以上の細胞培養バイオリアクタに培地を送達するように構成された送達システムであって、流速が、少なくとも１つの三次元多孔質食用足場に播種された細胞に栄養を与えるように調整される、送達システムと、を備える、培養システムを提供する。
（ａ）少なくとも１つの三次元多孔質食用足場に播種された２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞をその中に含む１つ以上の細胞培養バイオリアクタと、
（ｂ）制御された流速で１つ以上の細胞培養バイオリアクタに培地を送達するように構成された送達システムであって、流速が、少なくとも１つの三次元多孔質食用足場に播種された細胞に栄養を与えるように調整される、送達システムと、を備える、培養システムを提供する。
【0021】
特定の実施形態によれば、制御された流速は、１つ以上の細胞培養バイオリアクタにおける気泡形成を防ぐように調整される。
【0022】
いくつかの実施形態によれば、制御された流速は、プラグフロー方式でバイオリアクタ内の培地の循環を可能にする。
【0023】
いくつかの実施形態では、システムは、１つ以上の細胞培養バイオリアクタにおいて培地を放射状に混合するための１つ以上のロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）をさらに備える。特定の理論または作用メカニズムに拘束されることを望まないが、放射状混合は、細胞の播種および足場表面への付着時に足場上に細胞を効果的に分布させて、細胞増殖を促進することに、および培養食品の生産に寄与する。
【0024】
いくつかの実施形態では、システムは、該１つ以上の細胞培養バイオリアクタ内の温度を制御するための１つ以上の温度制御要素をさらに備える。いくつかの実施形態では、システムは、該１つ以上の細胞培養バイオリアクタ内の温度を制御するための、１つ以上の細胞培養バイオリアクタの周りに１つ以上の加熱要素を備える。
【0025】
いくつかの実施形態では、システムは、複数の細胞培養バイオリアクタを備える。これらの実施形態によれば、送達システムは、制御された流速で別々に複数の細胞培養バイオリアクタのそれぞれに培地を送達するように構成されている。複数の細胞培養バイオリアクタへの制御された流速での均一な培地の送達は、本発明の培養システムの重要な利点であり、費用効果が高く、再現性のある培養食品の大規模生産を提供する。培地組成は、細胞増殖期に有利に適合させることができる。特定の実施形態によれば、培地組成は、細胞増殖期をサポートするように適合されている。いくつかの実施形態によれば、培地組成は、細胞分化期をサポートするように適合されている。さらなる実施形態によれば、培地組成は、細胞定常増殖期をサポートするように適合されている。
【0026】
特定の実施形態によれば、制御された流速は、プラグフロー方式で複数の細胞培養バイオリアクタのそれぞれ内で培地の循環を可能にする。
【0027】
いくつかの実施形態では、複数の細胞培養バイオリアクタのそれぞれは、ロッカーに別々に取り付けられている。いくつかの実施形態によれば、複数の細胞培養バイオリアクタのそれぞれは、温度制御要素によって別々に制御される。いくつかの特定の実施形態では、複数の細胞培養バイオリアクタのそれぞれは、ロッカーに別々に取り付けられ、加熱要素によって包まれている。
【0028】
いくつかの実施形態では、システムは、液面、温度、ｐＨ、溶存酸素、１つ以上の栄養素の濃度、および１つ以上の望ましくない化合物の濃度からなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを培地内で測定するための１つ以上のセンサをさらに備える。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態によれば、望ましくない化合物は、アンモニア、乳酸、酢酸などからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0029】
いくつかの実施形態では、システムは、１つ以上のセンサと動作可能に通信し、かつ少なくとも１つのパラメータの測定値を受信し、測定値に基づいて該少なくとも１つのパラメータを調整するように構成された、制御ユニットをさらに備える。
【0030】
いくつかの実施形態では、システムは、
（ｉ）細胞増殖培地を培養システムに供給するための培地リザーバと、
（ｉｉ）処理容器であって、培地を受け取り、液面、温度、ｐＨ、溶存酸素、１つ以上の栄養素の濃度、および１つ以上の望ましくない化合物の濃度からなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを培地で測定することと、測定値に基づいて少なくとも１つのパラメータを調整することと、を行うように構成された、処理容器と、をさらに備え、送達システムが、培地を１つ以上の細胞培養バイオリアクタから処理容器に循環させるようにさらに構成されている。
（ｉ）細胞増殖培地を培養システムに供給するための培地リザーバと、
（ｉｉ）処理容器であって、培地を受け取り、液面、温度、ｐＨ、溶存酸素、１つ以上の栄養素の濃度、および１つ以上の望ましくない化合物の濃度からなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを培地で測定することと、測定値に基づいて少なくとも１つのパラメータを調整することと、を行うように構成された、処理容器と、をさらに備え、送達システムが、培地を１つ以上の細胞培養バイオリアクタから処理容器に循環させるようにさらに構成されている。
【0031】
特定の実施形態によれば、送達システムは、培地を処理容器から１つ以上の細胞培養バイオリアクタに循環させるようにさらに構成されている。
【0032】
特定の実施形態によれば、システムは、培地から望ましくない化合物を除去するように構成された、透析器および透析液を有する透析システムをさらに備え、送達システムが、培地を１つ以上の細胞培養バイオリアクタまたは処理容器から透析システムに、およびそれに続いて該処理容器に循環させるようにさらに構成されている。
【0033】
いくつかの実施形態では、システムは、透析液が廃棄物として透析に続いて透析器から流出する透析システムを備える。
【0034】
いくつかの実施形態では、処理容器は、インペラと、少なくとも１つのパラメータを測定するための１つ以上のセンサと、栄養素の少なくとも１つ、望ましくない化合物を中和するための中和剤、および２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞を添加するように構成された１つ以上のポートと、熱交換器と、酸素供給器と、ｐＨ制御ユニットと、を備える。
【0035】
いくつかの実施形態では、システムは、温度、ｐＨ、溶存酸素、１つ以上の栄養素の濃度、および１つ以上の望ましくない化合物の濃度からなる群から選択される少なくとも１つのパラメータを培地内で測定するように構成された感知ユニットをさらに備える。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0036】
特定の例示的な実施形態によれば、感知ユニットは、温度、ｐＨ、溶存酸素、１つ以上の栄養素、および１つ以上の望ましくない化合物を含むパラメータの組み合わせを培地内で測定するように構成されている。
【0037】
いくつかの実施形態では、システムは、少なくとも１つのパラメータの調整を制御するために、処理容器および任意選択で感知ユニットと動作可能に通信する制御ユニットをさらに備える。いくつかの実施形態によれば、制御ユニットは、培地温度を制御するために処理容器と動作可能に通信している。いくつかの実施形態では、処理容器内の培地温度は、細胞培養バイオリアクタの温度とほぼ同じになるように調整される。
【0038】
いくつかの実施形態では、制御ユニットは、培養システム内の培地の流速および組成を制御するために、送達システムとさらに動作可能に通信している。特定の実施形態によれば、流速は、細胞の増殖速度および／または増殖期に従って制御される。特定の実施形態によれば、制御ユニットは、細胞の増殖期に従って培地組成を制御するために、処理容器とさらに動作可能に通信している。
【0039】
いくつかの実施形態では、システムは、プラグフロー方式で培地を１つ以上の細胞培養バイオリアクタに送達するように動作される。これらの実施形態によれば、プラグフローレートは、細胞の増殖速度に適合される。
【0040】
いくつかの実施形態では、システムは、流加回分モードで動作している。
【0041】
特定の実施形態によれば、食用足場は、足場の乾燥重量に基づいて少なくとも１０重量％のタンパク質含有量を含む。いくつかの実施形態によれば、食用足場は、足場の乾燥重量に基づいて、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、または少なくとも４０重量％のタンパク質含有量を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、食用足場は、植物、真菌、または藻類起源のものである。
【0043】
いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタ内に置かれた食用足場は無菌である。
【0044】
２つ以上のタイプの動物付着細胞は、所望の肉製品の生産を可能にするように選択される。特定の実施形態によれば、所望の肉製品は、肉の切り身、肉の部分、または内臓を模倣する細胞の組み合わせを含む。特定の実施形態によれば、内臓は、肝臓、腎臓、心臓、膵臓、胸腺、脳、舌、および胃からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0045】
特定の実施形態によれば、２つ以上のタイプの動物付着細胞は、間質細胞、内皮細胞、脂肪細胞、筋細胞、肝細胞、心筋細胞、腎細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、神経細胞、線毛上皮細胞、腸細胞、それらの前駆細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態によれば、２つ以上のタイプの動物付着細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞およびその前駆細胞をさらに含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、２つ以上のタイプの動物付着細胞は、筋細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞、脂肪細胞、内皮細胞、それらの前駆細胞、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0047】
特定の実施形態によれば、システムは、単一の動物種起源からの細胞を含む。いくつかの実施形態では、システムは、動物起源の複数の異なる種からの細胞を含む。特定の実施形態によれば、動物は、有蹄動物、家禽、水生動物、無脊椎動物、および爬虫類からなる群から選択される種のものである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0048】
特定の実施形態によれば、有蹄動物は、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、キリン、ラクダ、シカ、カバ、またはサイからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、有蹄動物は、ウシである。特定の例示的な実施形態によれば、ウシは、乳牛である。
【0049】
いくつかの実施形態では、動物付着細胞は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞、筋細胞、脂肪細胞、内皮細胞、それらの前駆細胞、およびそれらの組み合わせから選択されるウシ由来細胞を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0050】
いくつかの実施形態では、ウシ由来細胞は、ウシ多能性幹細胞（ｂＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、ｂＰＳＣは、非胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、ｂＰＳＣは、ウシ誘導ＰＳＣ（ｂｉＰＳＣ）である。
【0051】
いくつかの実施形態では、ウシ由来細胞は、ウシ多能性幹細胞（ｂＰＳＣ）から分化した細胞である。
【0052】
いくつかの実施形態では、培養食品は、培養肉である。
【0053】
いくつかの実施形態では、足場は、非ヒト動物細胞を付着させる増強された能力を有するように調整される。
【0054】
いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタは、該細胞培養バイオリアクタの内外への培地の流れを可能にする少なくとも入口ポートおよび出口ポートを有する。
【0055】
いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタは、可撓性バッグである。これらの実施形態によれば、バッグは、該バッグの内外への培地の流れを可能にする少なくとも入口ポートおよび出口ポートを含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタは、単回使用のためのものである。
【0057】
特定の実施形態によれば、可撓性バッグの形態の細胞培養バイオリアクタは、少なくとも１つの足場の挿入後、その密封を可能にするように構成されている。
【0058】
いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタの内部容積は、無菌である。
【0059】
特定の実施形態によれば、細胞培養バイオリアクタの内面は、食品安全材料で作られている。特定の実施形態によれば、バイオリアクタの内面は、細胞付着能力が最小限であるか全くない材料で作られている。いくつかの実施形態によれば、細胞培養バイオリアクタは、感光性材料を光への曝露から保護する材料、水蒸気および／または酸素に対して本質的に不浸透性の材料、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される材料から作られている。
【0060】
いくつかの実施形態では、可撓性バッグの形態の細胞培養バイオリアクタは、細胞の増殖後、その密封を可能にして、可撓性バッグ内に培養食品を含む包装食品を形成するように構成されている。
【0061】
可撓性バッグは、単層または多層で作ることができる。特定の実施形態によれば、可撓性バッグの内層は、食品安全材料のものである。いくつかの実施形態によれば、内層は、細胞付着能力が最小であるか全くない材料で作られている。特定の例示的な実施形態によれば、可撓性バッグは、食品安全材料の内層を含むラミネートから作られている。特定の実施形態によれば、ラミネートは、水蒸気および／または酸素に対して本質的に不浸透性である少なくとも１つの層をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、ラミネートは、感光性材料を光への曝露から保護する少なくとも１つの層を含む。いくつかの実施形態によれば、ラミネートは、可撓性バッグに支持および強度を提供する少なくとも１つの層を含む。
【0062】
いくつかの実施形態では、可撓性バッグは、食品安全ポリエチレンの内層、ナイロン層、および任意選択で少なくとも１つの追加のポリエチレン層を含む。いくつかの実施形態では、可撓性バッグは、感光性材料を光への曝露から保護する層をさらに含む。
【0063】
特定の実施形態によれば、細胞培養バイオリアクタの容量は、約１リットル～約５００リットルである。特定の実施形態によれば、容量は、約２リットル～４００リットル、約３リットル～３００リットル、または約３リットル～２００リットルである。特定の例示的な実施形態によれば、組織培養バイオリアクタの容量は、約３リットル、約５０リットル、および約２００リットルから選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の例示的な実施形態によれば、細胞培養バイオリアクタは、本明細書に記載の容量を有する可撓性バッグである。
【0064】
いくつかの実施形態では、送達システムは、１つ以上の蠕動ポンプを含む。
【0065】
いくつかの実施形態では、システムは、１つ以上のバブルトラップをさらに含む。
【0066】
別の態様によれば、本発明は、培養食品を生産するための細胞培養バイオリアクタを提供し、細胞培養バイオリアクタは、食品安全材料の内面を有し、バッグの内外への培地の流れを可能にする少なくとも入口ポートおよび出口ポートを備える可撓性バッグの形態であり、バッグは、その中に少なくとも１つの三次元多孔質食用足場を含む。
【0067】
特定の実施形態によれば、食用足場は、足場の乾燥重量に基づいて少なくとも１０重量％のタンパク質含有量を含む。
【0068】
いくつかの実施形態では、バッグは、足場がバッグ内にある間、足場上に細胞を播種することを可能にするように構成されている。
【0069】
いくつかの実施形態によれば、バッグに挿入された単一の裸の足場または複数の裸の足場の総容積は、可撓性バッグの容積の約２０％～約９５％である。裸の足場の容積は、それに付着した細胞／組織の容積を含まないことを明確に理解されたい。いくつかの実施形態によれば、単一の裸の足場または複数の裸の足場の総容積は、可撓性バッグの容積の約３０％～約９５％、約４０％～約９５％、または約４０％～約８０％である。
【0070】
特定の実施形態によれば、少なくとも１つの三次元多孔質食用足場および可撓性バッグの内部容積は、無菌である。
【0071】
いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタは、単回使用のためのものである。
【0072】
特定の実施形態によれば、細胞培養バイオリアクタは、細胞培養バイオリアクタへの少なくとも１つの足場の挿入後、バッグの密封を可能にするように構成されている。
【0073】
いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタは、少なくとも１つの足場上での細胞の増殖および培養食品の生産後、バッグの密封を可能にし、バッグ内に培養食品を含む包装食品を形成するように構成されている。
【0074】
いくつかの実施形態では、培養食品は、培養肉である。
【0075】
いくつかの実施形態では、バッグは、複数の層を含む。これらの実施形態によれば、内層は、食品安全材料で作られている。
【0076】
いくつかの実施形態では、バッグは、食品安全ポリエチレンの内層を有する。
【0077】
いくつかの実施形態では、バッグは、食品安全ポリエチレンの内層、ナイロン層、および任意選択で追加のポリエチレン層を有する。
【0078】
いくつかの実施形態では、バッグは、感光性材料を光への曝露から保護する層を有する。
【0079】
いくつかの実施形態では、バッグは、水蒸気および／または酸素に対して本質的に不浸透性の層を有する。
【0080】
さらなる態様によれば、本発明は、
食品安全材料の内面を備える密封された滅菌バッグと、
該バッグの内部容積全体を実質的に満たす、バッグ内の培養肉部分であって、少なくとも１つの食用三次元多孔質足場に付着した複数の動物付着細胞タイプを含む細胞組織を含む、培養肉部分と、を含む包装食品を提供する。
食品安全材料の内面を備える密封された滅菌バッグと、
該バッグの内部容積全体を実質的に満たす、バッグ内の培養肉部分であって、少なくとも１つの食用三次元多孔質足場に付着した複数の動物付着細胞タイプを含む細胞組織を含む、培養肉部分と、を含む包装食品を提供する。
【0081】
特定の実施形態によれば、三次元多孔質食用足場は、足場の乾燥重量に基づいて少なくとも１０重量％のタンパク質含有量を含む。いくつかの実施形態によれば、三次元多孔質食用足場は、足場の乾燥重量に基づいて、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、または少なくとも４０重量％のタンパク質含有量を含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、バッグは、複数の層を含む。これらの実施形態によれば、内層は、食品安全材料であり、食品安全材料は細胞に付着しない。
【0083】
特定の実施形態によれば、バッグは、食品安全ポリエチレンの内層を含む。
【0084】
いくつかの実施形態では、バッグは、食品安全ポリエチレンの内層、ナイロン層、および任意選択で追加のポリエチレン層を含む。
【0085】
いくつかの実施形態では、バッグは、感光性材料を光への曝露から保護する層をさらに含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、バッグは、水蒸気および／または酸素に対して本質的に不浸透性の層を含む。いくつかの実施形態では、複数の動物付着細胞タイプは、間質細胞、内皮細胞、脂肪細胞、筋細胞、肝細胞、心筋細胞、腎細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、神経細胞、線毛上皮細胞、腸細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞、それらの前駆細胞、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0087】
いくつかの実施形態では、複数の動物付着細胞タイプは、結合組織細胞、筋細胞、脂肪細胞、および内皮細胞から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0088】
特定の実施形態によれば、細胞は、ウシ、家禽、水生動物、無脊椎動物、および爬虫類からなる群から選択される非ヒト動物のものである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の例示的な実施形態によれば、非ヒト動物細胞は、ウシ細胞である。
【0089】
特定の実施形態によれば、培養肉部分は、無菌である。
【0090】
さらなる態様によれば、本発明は、
（ｉ）細胞増殖培地を含む細胞培養バイオリアクタ内に配置された少なくとも１つの足場に２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞を播種することであって、少なくとも１つの足場が三次元多孔質食用足場である、播種することと、
（ｉｉ）制御された流速で細胞増殖培地を細胞培養バイオリアクタに送達し、少なくとも１つの足場に播種された細胞に栄養を与えるように流速を調整することと、
（ｉｉｉ）所望の組織塊が得られるまで細胞を増殖させ、それにより培養食品を得ることと、を含む、商業規模で培養食品を生産するための方法を提供する。
（ｉ）細胞増殖培地を含む細胞培養バイオリアクタ内に配置された少なくとも１つの足場に２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞を播種することであって、少なくとも１つの足場が三次元多孔質食用足場である、播種することと、
（ｉｉ）制御された流速で細胞増殖培地を細胞培養バイオリアクタに送達し、少なくとも１つの足場に播種された細胞に栄養を与えるように流速を調整することと、
（ｉｉｉ）所望の組織塊が得られるまで細胞を増殖させ、それにより培養食品を得ることと、を含む、商業規模で培養食品を生産するための方法を提供する。
【0091】
特定の実施形態によれば、この方法は、細胞増殖培地を細胞培養バイオリアクタから処理容器および／または透析システムに循環させ、続いて細胞培養バイオリアクタに戻すことをさらに含む。
【0092】
特定の実施形態によれば、この方法は、１つ以上の栄養素の濃度が不十分になった場合に培地に栄養素を添加すること、および任意選択で、プロセスに沿って生成される望ましくない化合物を中和するための１つ以上の中和剤を添加することをさらに含む。特定の実施形態によれば、１つ以上の栄養素および／または中和は、処理容器内にある培地に添加される。
【0093】
特定の実施形態によれば、播種は、単一細胞のものである。他の実施形態によれば、播種は、細胞凝集体のものである。
【0094】
特定の実施形態によれば、この方法は、細胞を播種した後、細胞培養バイオリアクタを放射状に回転させて、細胞を足場に付着させることをさらに含む。
【0095】
特定の実施形態によれば、制御された流速は、細胞培養バイオリアクタにおける該足場からの細胞の剥離および／または気泡形成を防ぐように調整される。
【0096】
特定の実施形態によれば、制御された流速は、細胞を必要な細胞期で維持するように調整される。特定の実施形態によれば、細胞期は、細胞増殖、細胞分化、および細胞定常増殖期からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0097】
特定の実施形態によれば、播種ステップ（ｉ）は、培養食品を生産する間、少なくとも１回繰り返される。
【0098】
特定の実施形態によれば、三次元多孔質食用足場は、足場の乾燥重量に基づいて少なくとも１０重量％のタンパク質含有量を含む。いくつかの実施形態によれば、三次元多孔質食用足場は、足場の乾燥重量に基づいて、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、または少なくとも４０重量％のタンパク質含有量を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0099】
特定の実施形態によれば、流速は、細胞増殖速度および／または細胞増殖期に従って調整される。いくつかの実施形態によれば、培地組成は、細胞増殖期に調整される。特定の実施形態によれば、増殖期は、細胞増殖、細胞分化、および細胞定常増殖からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0100】
本発明のシステムは、有利には、細胞増殖および培養食品の形成を通して培地組成を監視することを可能にする。本発明は、細胞培養培地内のグルコース濃度の減少および／または乳酸濃度の増加が、細胞増殖速度を反映する信頼できるパラメータであることを示している。特定の実施形態によれば、グルコースおよび／または乳酸の濃度は、本発明のシステムの感知ユニットによって測定される。他の実施形態によれば、グルコースおよび／または乳酸の濃度は、細胞培養バイオリアクタからその開口部のうちの１つを介して得られたサンプルにおいて測定される。
【0101】
特定の実施形態によれば、この方法は、細胞増殖培地をサンプリングすることと、該増殖培地内のグルコースおよび／または乳糖分解酵素の濃度を測定することと、をさらに含む。特定の実施形態によれば、サンプリングは、少なくとも１回繰り返される。いくつかの現行の例示的な実施形態によれば、サンプリングは、毎日実行される。
【0102】
特定の実施形態によれば、細胞は、所望の培養食品を形成するための塊に達するまで増殖される。
【0103】
いくつかの実施形態では、細胞は、グルコース取り込み率（ＧＵＲ）が実質的に一定になるまで増殖される。
【0104】
いくつかの実施形態では、細胞は、５～１４日間増殖される。
【0105】
いくつかの実施形態では、この方法は、食品を水ベースの溶液内で洗浄して増殖培地を除去することをさらに含む。
【0106】
特定の実施形態によれば、少なくとも１つの足場、細胞、および増殖培地を含む細胞培養バイオリアクタの内部容積は、プロセス全体を通して無菌に保たれる。
【0107】
いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタは、単回使用のための可撓性バッグの形態である。
【0108】
いくつかの実施形態では、この方法は、細胞が定常期に達した後にバッグを密封して包装食品を得ることをさらに含み、包装食品は、密封されたバッグおよび該バッグ内の培養食品を含む。
【0109】
特定の例示的な実施形態によれば、密封は、真空を使用して、バッグ内の残留培地または洗浄溶液およびすべてのガスを除去することを含む。
【0110】
別の態様によれば、本発明は、本発明の方法によって生産された、少なくとも１つの三次元多孔質足場に付着した複数の非ヒト動物付着細胞タイプを含む細胞組織を含む培養食品を提供する。
【0111】
特定の実施形態によれば、三次元多孔質食用足場は、足場の乾燥重量に基づいて少なくとも１０重量％のタンパク質含有量を含む。いくつかの実施形態によれば、三次元多孔質食用足場は、足場の乾燥重量に基づいて、少なくとも２０重量％、少なくとも３０重量％、または少なくとも４０重量％のタンパク質含有量を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0112】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の記載、実施例、および図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0113】
【図1】本発明のいくつかの実施形態による、培養食品を生産するための培養システムを示す。
【図2】本発明の追加の実施形態による、培養食品を生産するための培養システムを示す。
【図3】本発明のいくつかの実施形態による、培養肉の一部を生産するための生産プロセスのフローチャートを示す。
【図4】本発明のいくつかの実施形態による可撓性バッグバイオリアクタを示す。
【図5】可撓性バッグバイオリアクタ内の植物ベースの足場上／内で増殖した細胞が、播種後２５０時間生存可能であることを実証する。矢印は、培地内のグルコース濃度が４ｇ／Ｌを下回った時点でのグルコース添加を示す。
【図6】本発明のいくつかの実施形態による、細胞バイオリアクタ内の足場上の筋前駆細胞および線維芽細胞という２つの細胞タイプの存在を実証する。増殖プロセスの最後に、足場の様々な領域から採取したサンプルを均一化し、全ＲＮＡを抽出して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換した。Ｐａｘ７（筋前駆細胞のマーカ）および１型コラーゲン（線維芽細胞のマーカ）をコード化する遺伝子のＲＴ－ＰＣＲ増幅を行った。Ｌａｎｅ１およびＬａｎｅ４：それぞれ、無細胞足場から得られたサンプルにおける、Ｐａｘ７および１型コラーゲンの増幅のＲＴ－ＰＣＲ産物。Ｌａｎｅ２およびＬａｎｅ５：それぞれ、筋前駆細胞および線維芽細胞を播種した足場の端から得られたサンプルにおける、Ｐａｘ７および１型コラーゲンの増幅のＲＴ－ＰＣＲ産物。Ｌａｎｅ３およびＬａｎｅ６：それぞれ、筋前駆細胞および線維芽細胞を播種した足場の反対側の端から得られたサンプルにおける、Ｐａｘ７および１型コラーゲンの増幅のＲＴ－ＰＣＲ産物。
【発明を実施するための形態】
【0114】
本発明は、培養食品、特に培養肉の大規模生産のための培養システムおよび方法を提供する。
【0115】
本発明の培養システムは、流速制御培養システム（連続管状培養システムとも呼ばれる）であり、そのシステムでは、培地は、１つ以上の細胞培養バイオリアクタに、細胞培養バイオリアクタ内に置かれた少なくとも１つの三次元多孔質食用足場内でおよびその上で細胞増殖を維持するように設定された速度で、均一な培地を提供するという制御された方法でシステムを通って流れる。制御された流速は、有利には、足場上／内で増殖する細胞を供給し、動物の体の筋肉量の増殖を模倣することができる流れを提供する。本発明によれば、流速は、好ましくは、細胞の増殖速度および／または増殖期に適合される。いくつかの実施形態によれば、制御された流速は、プラグフローである。
【0116】
本発明による培養食品は、少なくとも１つの食用足場と、非ヒト動物細胞から足場上に形成された組織とを含む。したがって、足場は、細胞／組織から分離されるのではなく、屠殺された肉の切り身を模倣する最終食品の一部を形成する。本発明は、肉切り身または肉部分の形態の培養肉製品の大規模製造のためのシステムおよび方法を初めて開示する。本発明の培養肉切り身は、培養肉ハンバーガ、ナゲット、ソーセージ、またはパティとは異なる、培養細胞から形成された肉様組織を含む。
【0117】
「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」という用語およびそれらの変化形は、「含むが、それに限定されない」ことを意味する。
【0118】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を示さない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物」または「少なくとも１種の化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【0119】
本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、ある範囲の説明は、すべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示された部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、および６を有すると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【0120】
本明細書で使用される「約」という用語は、数値指定の＋１０％または－１０％の数値指定の変動を指す。
【0121】
それに由来する細胞に関する「動物」および「非ヒト動物」という用語は、本明細書では互換的に使用され、非ヒト動物の細胞のみを指す。
【0122】
ここで、本発明のいくつかの実施形態による、培養食品を生産するための培養システム１００を示す図１を参照する。培養システム１００は、培地リザーバ１３０、処理容器１４０、複数の細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅ、感知ユニット１５０、および透析システム１６０を備え、これらはすべて、培養システム内で培地を循環させる送達システム１２０を介して接続される。
【0123】
培養システム１００は、並列に配置された複数の細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅを備える。図１に示される実施形態における細胞培養バイオリアクタは、可撓性バッグの形態である。各バッグは、バッグ内の培地を放射状に混合するためにロッカーに別々に取り付けられ、例えば、バッグ内の温度を制御するための加熱ブランケット（図示せず）によって包まれた温度制御要素によって別々に制御される。バッグ内で維持される温度は、足場に播種される細胞のタイプに応じて選択される。各バッグは、さらに圧力制御下にある。圧力は典型的には、少なくとも１つの排気システム（図示せず）によって制御される。各バッグは、その中に、非ヒト動物細胞を付着させることができる少なくとも１つの食用足場１１２を含む。いくつかの実施形態では、足場は、細胞培養バイオリアクタに配置される前に細胞が播種される。他の実施形態では、足場が細胞培養バイオリアクタ内にある間に、細胞が足場に播種される。図示の実施形態では、各バッグは、その中に単一の足場を含む。他の実施形態では、各バッグは、２つ以上の足場を含み得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の足場が存在する場合、各足場は、その上に形成された組織とともに、別個のまたは単一の培養食品を構成する。
【0124】
送達システム１２０は、制御された流速で、例えば、プラグフロー方式で、細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅのそれぞれに均一な培地を送達するように構成されている。送達システム１２０は、複数の蠕動ポンプ１２２ａ～１２２ｅを備え、各ポンプは、足場からの細胞剥離および／または気泡形成を防ぎながら細胞増殖を可能にするためにバイオリアクタ内の培地の循環を可能にする速度で培地を細胞培養－バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅのうちの１つに送達する。特定の実施形態では、バイオリアクタ内の培地の循環は、プラグフロー方式である。細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅのそれぞれは、均一な培地を別々に受け取り、細胞増殖を可能にする制御された流速で送達システム１２０によってすべての細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅに送達される。特定の実施形態では、制御された流速は、プラグフロー方式で複数の細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅのそれぞれ内で培地の循環を可能にする。ポンプ１２２ａ～１２２ｅは、流速を制御および調整して、所望の培地循環を提供し、足場からの細胞の剥離および／または気泡形成を防止する、制御ユニット（図示せず）と動作可能に通信している。いくつかの好ましい実施形態では、流速は、足場上の細胞の増殖期および／または増殖速度に従ってさらに調整される。ポンプ１２２ａ～１２２ｅのそれぞれが、該細胞培養バイオリアクタの近位端または遠位端にある細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅのそれぞれに培地を送達できることを明確に理解されたい。細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅの近位端と遠位端との間の変更は、該培養バイオリアクタのそれぞれを回転させることによって、細胞培養バイオリアクタの近位端と遠位端との間のポンプ１２２ａ～１２２ｅ（図示せず）のそれぞれの接続を回転させることによって、または二方向ポンプを使用して制御ユニット（図示せず）により流れの方向を制御することによって、達成することができる。
【0125】
培地の流速は、細胞培養バイオリアクタのそれぞれに到達し、バイオリアクタ内の１つ以上の足場に播種されて付着した細胞に栄養を与えるように調整される。流速は典型的には、細胞増殖速度に従って、特に細胞増殖期、細胞分化期、および細胞定常期を含む細胞増殖期に従って調整される。特定の実施形態によれば、流速は、細胞分化につながる剪断力を形成するように調整される。
【0126】
細胞培養バイオリアクタ内のプラグフローは、培地がバイオリアクタに入るときに、層流ではなく乱流を生成することによって得ることができる。流れが十分に乱流である場合、バイオリアクタの壁によって引き起こされる層流のサブレイヤは、それが無視できるようなその直径（δｓ＜＜Ｄ）に関連して非常に薄い。
【0127】
乱流の発生は、レイノルズ数を使用して予測することができる。ラウンドカットのバイオリアクタの場合、レイノルズ数が２，３００未満の場合、流れは層流になり、４０００を超える場合、流れは乱流になる（２，３００～４，０００のレイノルズ数は通過数である）。
【0128】
パイプまたはチューブ（本発明による管状バイオリアクタなど）内の流れの場合、レイノルズ数（「Ｒｅ」）は一般に次のように定義される。
Ｒｅ＝（ρυＤＨ）／μ＝（ｕＤＨ）／ν＝（ＱＤＨ）／νＡ
Ｑ＝容積流速（ｍ３／ｓ）
ＤＨ＝パイプまたはチューブの内径（ｍ）
ν＝動粘度（ν＝μ／ρ）（ｍ２／ｓ）
Ａ＝パイプの断面積（ｍ２）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
μ＝流体の動粘度（Ｐａ・ｓ＝Ｎ・ｓ／ｍ２＝ｋｇ／（ｍ・ｓ））
ρ＝流体の密度（ｋｇ／ｍ３）
Ｒｅ＝（ρυＤＨ）／μ＝（ｕＤＨ）／ν＝（ＱＤＨ）／νＡ
Ｑ＝容積流速（ｍ３／ｓ）
ＤＨ＝パイプまたはチューブの内径（ｍ）
ν＝動粘度（ν＝μ／ρ）（ｍ２／ｓ）
Ａ＝パイプの断面積（ｍ２）
ｕ＝流体の平均速度（ｍ／ｓ）
μ＝流体の動粘度（Ｐａ・ｓ＝Ｎ・ｓ／ｍ２＝ｋｇ／（ｍ・ｓ））
ρ＝流体の密度（ｋｇ／ｍ３）
【0129】
代替的に、または追加的に、細胞培養バイオリアクタ内のプラグフローは、フローラインに適切なミキサ（静的または動的）を追加することによって得られ得る。
【0130】
培地リザーバ１３０は、細胞増殖培地を培養システムに供給する。培地リザーバ１３０は、培養システム内の液面に基づいて培地リザーバから培養システムへの培地の流れを制御するように構成されたレベルポンプ１３２を介して培養システムに接続されている。
【0131】
処理容器１４０は、培地を受け取り、温度、ｐＨ、溶存酸素、培地内の１つ以上の栄養素の濃度、および１つ以上の望ましくない化合物を調整するように構成されている。処理容器１４０は、栄養添加ポート１４２、熱交換器１４４、酸素供給器１４６、およびｐＨ制御ユニット１４８を備える。いくつかの実施形態では、処理容器は、前述のパラメータ、すなわち、温度、ｐＨ、溶存酸素、１つ以上の栄養素の濃度、および培地内の１つ以上の望ましくない化合物を測定するためのセンサ（図示せず）をさらに備える。図１に示される実施形態などの他の実施形態では、培養システムは、培地内の前述のパラメータを測定するように構成された別個の感知ユニット１５０を備える。いくつかの実施形態では、感知ユニットおよび処理容器と動作可能に通信している制御ユニット（図示せず）が、測定値に基づいて必要に応じてパラメータの調整を制御する。処理容器１４０はさらに、液面を測定し、その測定値に基づいて必要に応じて液面を調整するように構成されている。
【0132】
透析システム１６０は、培地からアンモニアおよび乳酸などの望ましくない化合物を除去するように構成されている。透析システム１６０は、透析器１６２、新鮮な透析液リザーバ１６４、および使用された透析液リザーバ１６６を備える。
【0133】
図示の実施形態では、送達システム１２０は、培地を、細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅから透析システムに、続いて処理容器に、または透析が必要ない場合は直接処理容器に循環させる。透析システムへの、または直接処理容器に戻す培地の流れは、三方弁１２４によって制御される。他の実施形態では、透析システムは含まれず、培地は、処理容器と細胞培養バイオリアクタとの間で循環される。
【0134】
透析器１６２は、リザーバ１６４から新鮮な透析液と、透析する必要がある細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅからの使用済み培地とを受け取り、細胞の増殖を妨げる可能性のある望ましくない化合物を除去する。使用済み培地および新鮮な透析液の透析器１６２への流れは、それぞれポンプ１６８ａおよび１６８ｂを介して制御される。図示の実施形態では、透析後、透析された培地は処理容器１４０に流れ、使用された透析液はリザーバ１６６に流れ、その後廃棄物として廃棄される。
【0135】
培養システム１００は、培養システムの動作中に細胞培養バイオリアクタ内で気泡が形成されるのを防ぐために、気泡トラップ１７０ａ、１７０ｂをさらに備える。培養システム１００は、サンプリングポイント１７２をさらに含み得る。
【0136】
いくつかの実施形態では、培養システム１００を使用する培養食品の生産は、次のステップを含む。
【0137】
細胞の播種：非ヒト動物付着細胞を付着することができる少なくとも１つの食用足場をその中に含む細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅのそれぞれは、ロッカーに取り付けられる。各細胞培養バイオリアクタは、培地が細胞培養バイオリアクタの容積の５％～８０％を満たすまで、ポンプ１２２ａ～１２２ｅを介して細胞増殖培地で満たされる。次に、ポンプ１２２ａ～１２２ｅが遮断され、細胞培養バイオリアクタ内にある間、細胞が足場に播種される。あるいは、細胞は、処理容器１４０内で播種され、送達システム１２０を介して細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅのそれぞれに送達される。細胞は、単一細胞または細胞凝集体として播種することができる。各細胞培養バイオリアクタは、ロッカーによって放射状に回転し、細胞を浮遊状態に維持して、足場全体への分布と付着を増強する。細胞の播種は、一度実行することもでき、連続した播種ステップで実行することもできる。特定の実施形態によれば、第１の播種は、培養バイオリアクタが培地に入れられた直後で、足場に細胞がない、培養プロセスの開始時に行われる。連続的な播種ステップは、細胞が足場に付着した後の培養プロセス中のその後の任意のタインで実行することができる。特定の実施形態では、足場が細胞培養バイオリアクタ内に置かれる前に、細胞が少なくとも１つの足場に播種される。これらの実施形態によれば、少なくとも１つの播種された足場を含む細胞培養バイオリアクタのそれぞれは、培地が細胞培養バイオリアクタの容積の５％～８０％を満たすまで、ポンプ１２２ａ～１２２ｅを介して細胞増殖培地で満たされる。
【0138】
培養：細胞付着後、典型的には播種後６～２４時間で、ポンプ１２２ａ～１２２ｅが作動し、培養システム内の細胞増殖培地の循環が始まる。培地は、制御された流速で、例えば、プラグフローで、細胞培養バイオリアクタ１１０ａ～１１０ｅのそれぞれに送達される。培養システムの動作中、各細胞培養バイオリアクタでの足場からの細胞の剥離および／または気泡形成を防ぐために、流速が調整される。培養システムの動作中、温度、ｐＨ、溶存酸素、１つ以上の栄養素の濃度、および任意選択で１つ以上の望ましくない化合物の濃度が培地内で監視される。必要に応じて、これらのパラメータのうちの１つ以上が、処理容器内で調整される。例えば、特定の栄養素の濃度が不十分になった場合、その栄養素は、処理容器１４０の栄養素添加ポート１４２を介して培養システムに供給される。いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタから流れる培地は、培地からアンモニアなどの望ましくない化合物を除去するために、透析システムに送達される。続いて、培地は、処理容器（および再び細胞培養バイオリアクタ）に送達される。他の実施形態では、培地は、細胞培養バイオリアクタから処理容器に（および続いて細胞培養バイオリアクタに）直接流れる。細胞は、細胞が定常期および／または所望の塊に到達し、細胞および足場から形成された組織を含む培養食品を形成するまで、細胞培養バイオリアクタ内で増殖される。いくつかの実施形態では、細胞は、グルコース取り込み率（ＧＵＲ）が実質的に一定になるまで増殖される。いくつかの実施形態では、細胞は、５～２１日間増殖される。培養が完了すると、得られた食品を水ベースの溶液、例えば、生理食塩水内で洗浄して増殖培地を除去し、任意選択で培養食品に添加物、例えば、そのビタミン含有量を増加させる添加物ならびに／またはその外観および／もしくは味に影響を与える添加物を添加してもよい。
【0139】
ここで、本発明のいくつかの実施形態による、培養食品を生産するための培養システム２００を示す図２を参照する。培養システム２００は、複数の細胞培養バイオリアクタを取り付けるための複数のトレイ２１０ａ～２１０ｂを備える。各トレイは、各細胞培養バイオリアクタの配管系を置くために、各端部に開口部２１２を有する。培養システム２００は、力の伝達およびロッキング速度制御のためのベアリングハウス２１４をさらに備える。培養システム２００は、配管系を介して細胞培養バイオリアクタに接続され、制御された流速で細胞培養バイオリアクタに培地を送達するためのポンプ２２２ａ～２２２ｂをさらに備える。培養システム２００は、培地を受け取り、温度、ｐＨ、溶存酸素、培地内の１つ以上の栄養素の濃度、および任意選択で１つ以上の望ましくない化合物の濃度を調整するように構成された処理容器２４０をさらに備える。培養システム２００は、ｐＨを調整するためのベースポンプ２８２、複数の成分、培地内の望ましくない化合物を中和するための栄養素および／または薬剤を添加するように構成されたポンプ２８４ａ～２８４ｃ、および培地レベルポンプ２８６を備える制御ユニット２８０をさらに備える。制御ユニット２８０は、培養システムの動作中に必要に応じて、ｐＨを制御し、培地に栄養素を供給し、培地レベルを維持するために、配管系（図示せず）を介して処理容器２４０に接続される。制御ユニット２８０および処理容器２４０は、ＣＯ２、Ｏ２および／または空気を制御し、培地に供給するための、ＣＯ２、Ｏ２、および空気のガスマニホールド２９０を介してさらに接続される。図２に示すシステムでは、処理容器は、温度、ｐＨなどを測定するための電極／センサを備える。
【0140】
細胞培養バイオリアクタ
本発明による細胞培養バイオリアクタは、細胞が播種された１つ以上の足場を収容し、足場上および／または足場内で細胞を増殖させて培養食品を形成するように構成された滅菌容器である。いくつかの実施形態では、細胞培養容器は、可撓性の管状バッグである。いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタは使い捨てである。細胞培養バイオリアクタは、細胞培養バイオリアクタの内外への培地の流れを可能にするために、少なくとも入口ポートおよび出口ポートを備える。いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタは、足場が細胞培養バイオリアクタの内部にある間に、足場上に細胞を播種することを可能にするように構成されている。
本発明による細胞培養バイオリアクタは、細胞が播種された１つ以上の足場を収容し、足場上および／または足場内で細胞を増殖させて培養食品を形成するように構成された滅菌容器である。いくつかの実施形態では、細胞培養容器は、可撓性の管状バッグである。いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタは使い捨てである。細胞培養バイオリアクタは、細胞培養バイオリアクタの内外への培地の流れを可能にするために、少なくとも入口ポートおよび出口ポートを備える。いくつかの実施形態では、細胞培養バイオリアクタは、足場が細胞培養バイオリアクタの内部にある間に、足場上に細胞を播種することを可能にするように構成されている。
【0141】
いくつかの実施形態では、可撓性バッグの形態の細胞培養バイオリアクタ。細胞培養バイオリアクタとしての使用に適した可撓性バッグを形成するのに適した材料は、当技術分野で知られており、食品産業で必要とされる抽出物および浸出物の所望の強度、可撓性、および基準をバッグに提供することができる。
【0142】
特定の実施形態によれば、可撓性バッグの形態の細胞培養バイオリアクタは、食品安全材料から作られている。いくつかの実施形態によれば、食品安全材料は、細胞付着の能力が最小であるか、または全くないことによってさらに特徴付けられる。他の実施形態では、可撓性バッグの形態の細胞培養バイオリアクタは、食品安全材料の内層を含むラミネートから作られる。食品安全材料の例は、食品安全ポリエチレンである。いくつかの実施形態では、本発明による細胞培養バッグのラミネートは、ナイロン層などの支持および強度を提供する層をさらに含む。いくつかの実施形態では、ラミネートは、ポリエチレンの内層および少なくとも１つの外側ナイロン層を含む。いくつかの実施形態では、ラミネートは、ポリエチレンの内層、ナイロン層、および少なくとも１つの追加のポリエチレン層を含む。いくつかの実施形態では、ラミネートは、感光性材料を光への曝露から保護する少なくとも１つの層、例えば、アルミニウム層などの不透明な材料から作られた層を含む。特定の実施形態によれば、ラミネートは、水蒸気および／または酸素に対して本質的に不浸透性の少なくとも層を含む。
【0143】
ここで、培養食品を得るために細胞培養バイオリアクタ内に配置された１つ以上の足場上に２つ以上のタイプの動物付着細胞を播種するための可撓性バッグ４００の形態の培養バイオリアクタを示す図４を参照する。可撓性バッグ４００は、可撓性バッグ４００の対向する短い面４２０ａ～４２０ｂに位置する２つの端部ポート４１０ａ～４１０ｂを有する細長いバッグとして構成され、例えば、ポート４１０ａは、送達システム（例えば、図１の送達システム１２０）を介して培地リザーバ（例えば、図１の培地リザーバ１３０）から培地を受け取るように構成された入口ポートであり、ポート４１０ｂは、例えば、図１の送達システム１２０を介して処理容器（例えば、図１の処理容器１４０）に培地を送達するように構成されている。可撓性バッグ４００は、１つ以上の足場上に２つ以上のタイプの動物付着細胞を播種するため、および任意選択で、細胞増殖中のａｙ時間に可撓性バッグ４００を用いて培養培地をサンプリングするための１つ以上の開口部４３０ａ～４３０ｂをさらに備える。細長い面４４０ａまたは４４０ｂは、バッグが培養システムに取り付けられる前に、少なくとも１つの足場が可撓性バッグ４００に挿入された後にのみ溶接され得る。本発明による細胞培養バイオリアクタの容積は、その使用目的、例えば、そこで生産される培養食品のパッケージを形成することを意図するか、または食品を増殖させるための容器として使用し、その後、食品がバイオリアクタから収穫されることを意図するかによって異なり得る。容量は、例えば、１リットル～最大２００リットルの範囲であり得る。
【0144】
いくつかの実施形態では、可撓性バッグの形態の細胞培養バイオリアクタは、その生産後に培養食品のパッケージを形成する。これらの実施形態によれば、細胞は、所望の増殖が達成され、足場および細胞を含む培養食品が形成されるまで、細胞培養バッグ内の足場上／内で増殖される。次に、バッグを密封し、培養システムから切り離して、バッグ内に培養食品を含み、バッグの内部容積全体を実質的に満たす包装食品を得る。いくつかの実施形態によれば、バッグは、真空密封されている。いくつかの実施形態によれば、残りの培地が除去された後に、および任意選択で食品が洗浄され、洗浄溶液が除去された後に、バッグは密封される。特定の実施形態によれば、洗浄溶液は、水ベースの溶液である。
【0145】
増殖プロセスが無菌であるため、得られる包装食品は無菌であり、したがって、新鮮な肉などの従来の新鮮な製品よりもはるかに長い貯蔵寿命を有する。さらに、得られた食品は無菌であるため、冷却を必要とせずに出荷し、関与するコストを大幅に削減し得る。
【0146】
足場
本明細書で使用される場合、「足場」という用語は、細胞の密着／付着および増殖に適した表面を提供する材料を含む三次元構造を指す。足場はさらに機械的安定性および支持を提供し得る。足場は、増殖する細胞の集団がとる三次元の形状または形態に影響を与えるかまたは範囲を定めるように、特定の形状または形態であり得る。
本明細書で使用される場合、「足場」という用語は、細胞の密着／付着および増殖に適した表面を提供する材料を含む三次元構造を指す。足場はさらに機械的安定性および支持を提供し得る。足場は、増殖する細胞の集団がとる三次元の形状または形態に影響を与えるかまたは範囲を定めるように、特定の形状または形態であり得る。
【0147】
本発明による足場は、人間の消費に適した食用材料から作られた三次元多孔質基質である。いくつかの実施形態では、足場材料は、少なくとも１０％のタンパク質（ｗ／ｗ－乾燥重量）、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％のタンパク質（ｗ／ｗ－乾燥重量）を含有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、足場は、植物、フーガ、または藻類起源のものである。いくつかの実施形態では、足場は、植物または真菌起源のものである。
【0148】
いくつかの実施形態では、植物／真菌／藻類ベースの三次元多孔質食用足場は、植物、真菌、または藻類タンパク質を含み、任意選択で植物、真菌、または藻類多糖と組み合わせられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0149】
いくつかの実施形態では、足場は、少なくとも１つの植物多糖を任意選択で含む少なくとも１つの植物タンパク質を含み、植物は、小麦、大豆、ベニバナ、トウモロコシ、ピーナッツ、エンドウ豆、ヒマワリ、ヒヨコマメ、綿、ココナッツ、菜種、ジャガイモ、およびゴマからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0150】
タンパク質および任意選択で多糖類は、種子、葉、根、蒸気、塊茎、球根などを含む、同じものを含んだ任意の植物部分から得ることができ、いくつかの実施形態では、そこから得られる抽出物の一部を形成する。いくつかの実施形態では、抽出物は、乾燥重量ベースで、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、足場は、純粋な植物タンパク質を含む。
【0151】
いくつかの実施形態では、足場はフーガ起源のものである。いくつかの実施形態では、足場材料は、食用真菌、典型的にはマクロ真菌から得られる。菌糸体、菌糸、および子実体（子実体）を含む、食用真菌のどの部分でも使用することができる。いくつかの実施形態では、足場材料は、アガリクスビスポラス（一般的なキノコ、ポートベローマッシュルーム）、プルロタスオストリータス（ヒラタケ）、モルケラエスキュレンタ（モレル）、およびシャンテレル属のキノコからなる群から選択される食用キノコから得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0152】
いくつかの実施形態では、植物または真菌または藻類に由来するタンパク質または多糖は、ビルディングブロックの長鎖を含む。長鎖タンパク質／多糖類は、足場に繊維状のテクスチャを提供する。植物または真菌タンパク質は、当技術分野で知られており、例えば、ＷＯ２０１９／０１６７９５に記載されているように、任意の方法によって三次元多孔質足場にテクスチャ化することができる。
【0153】
本発明による足場は、その相互接続する細孔構造および機械的特性のために、細胞の増殖を支持する。足場の多孔質構造は、細胞が足場の深さに入り込み、分散が足場を均一に覆うことを可能にするために不可欠である。さらに、相互接続された細孔は、足場への液体の流れを可能にし、細胞の栄養を約束する。
【0154】
初期の細胞播種密度は、足場内で最適な細胞増殖を可能にしながら効率的でなければならない。播種される細胞の数は、足場材料の多孔性とその液体吸収能力にさらに依存する。足場が吸収できる量が多いほど、播種できる細胞の数が多くなる。いくつかの実施形態では、足場のグラム当たりの細胞数（乾燥重量）は、２×１０６～５０×１０６個の細胞の範囲である。さらに、足場の多孔性および足場繊維の内部組織化は、足場内および足場上の細胞の保持に寄与する。細胞を一度播種することもでき、培養期間中の連続的な播種ステップを行うこともできる。
【0155】
使用前に、足場は、典型的には滅菌されている。滅菌は、例えば、ガンマ線照射により、オートクレーブにより、アルコールでの洗浄により、またはエチレンオキシド（ＥｔＯ）ガス処理により行うことができる。
【0156】
いくつかの実施形態では、足場は、組織状タンパク質および非組織状タンパク質から選択され、任意選択で、多糖をさらに含む。いくつかの実施形態では、組織状タンパク質は、組織状大豆タンパク質である。
【0157】
いくつかの実施形態では、足場は、２０～１，０００マイクロメートルの範囲の平均直径を有する細孔を含む。
【0158】
いくつかの実施形態では、多孔質足場の平均孔径は、２０マイクロメートル（μｍ）～１０００μｍ、２０μｍ～９００μｍ、２０μｍ～８００μｍ、２０μｍ～７００μｍ、２０μｍ～６００μｍ、２０μｍ～５００μｍ、２０μｍ～４００μｍ、２０μｍ～３００μｍ、２０μｍ～２００μｍ、２０μｍ～１００μｍ、５０μｍ～１０００μｍ、５０μｍ～９００μｍ、５０μｍ～８００μｍ、５０μｍ～７００μｍ、５０μｍ～６００μｍ、５０μｍ～５００μｍ、５０μｍ～４００μｍ、５０μｍ～３００μｍ、５０μｍ～２００μｍ、５０μｍ～１００μｍ、１００μｍ～１０００μｍ、１００μｍ～９００μｍ、１００μｍ～８００μｍ、１００μｍ～７００μｍ、１００μｍ～６００μｍ、１００μｍ～５００μｍ、１００μｍ～４００μｍ、１００μｍ～３００μｍ、１００μｍ～２００μｍ、５００μｍ～１０００μｍ、５００μｍ～９００μｍ、５００μｍ～８００μｍ、５００μｍ～７００μｍ、または５００μｍ～６００μｍの範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0159】
いくつかの実施形態では、複数の細胞の適用範囲％は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９９％である。「適用範囲％」という用語は、培養プロセス全体を通して細胞と接触している多孔質足場の面積または体積を指す。いくつかの実施形態では、複数の細胞の適用範囲％は、５～２０％、１５～３０％、２５～４０％、３５～５０％、４５～６０％、５５～７０％、６５～８０％、７５～９０％、８５～１００％、またはそれらの間の任意の範囲である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0160】
細胞の播種および／または培養は、増殖培地の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、増殖培地は、増殖因子、小分子、生物活性剤、栄養素、アミノ酸、抗生物質化合物、抗炎症化合物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【0161】
いくつかの実施形態では、足場は、組織状タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、組織状タンパク質は、組織状植物性タンパク質である。いくつかの実施形態では、組織状タンパク質は、組織状大豆タンパク質（例えば、ＴＳＰ）である。タンパク質に関して本明細書で使用される場合、「テクスチャ」という用語は、様々なサイズ、形状、および構成に容易に形成することができ、水に分散できない個々の細胞の剛直な塊または柔軟な塊を指す。
【0162】
本発明の足場を形成する際に使用するのに適した粒子状組織状タンパク質材料は、乾燥重量ベースで４０％～１００％のタンパク質、およびタンパク質源材料または追加の補助材料に関連する０％～６０％の材料からなることができる。補助材料の例は、炭水化物、ビタミン、フレーバ、着色料などである。
【0163】
組織状粒子状タンパク質材料を形成するためにテクスチャ化することができる適切な未組織状タンパク質は、様々な供給源から入手可能である。例えば、そのようなタンパク質の供給源は、植物性タンパク質および特定の真菌性タンパク質である。適切な植物性タンパク質源の例は、大豆、ベニバナ種子、トウモロコシ、ピーナッツ、小麦、小麦グルテン、エンドウ豆、ヒマワリ種子、ヒヨコマメ、綿実、ココナッツ、菜種、ゴマ、葉タンパク質、グルテンなどである。酵母などの単細胞微生物のタンパク質も使用することができる。
【0164】
一般に、タンパク質源が植物性タンパク質である場合、使用前のタンパク質は比較的純粋な形で置かれる。したがって、例えば、タンパク質源が大豆である場合、大豆をヘキサンなどで溶媒抽出して、そこから油を除去することができる。得られた無油大豆材料には、約５０％のタンパク質が含まれている。
【0165】
大豆材料は、炭水化物を除去し、より高レベルのタンパク質を含む製品、例えば、約７０％のタンパク質を含む大豆タンパク質濃縮物または約９０％以上のタンパク質を含む大豆タンパク質分離物を得るために既知の方法で処理することができる。ＷＯ２０１９／０１６７９５に記載されているように、大豆材料、濃縮物、単離物、および他の食用タンパク質含有材料を適切な組織状粒子状タンパク質材料に変換するために、様々なプロセスを使用することができる。
【0166】
いくつかの実施形態では、足場は、細胞の付着を増強するように調整される。
【0167】
いくつかの実施形態では、足場へのそれらの付着を改善するために、細胞の播種中に熱可逆性凝固剤を使用することができる。いくつかの実施形態では、播種は、
（ａ）複数の非ヒト動物付着細胞タイプを含む播種培地を足場および熱可逆性凝固剤とインキュベートすることであって、インキュベーション条件が、培地の凝固を可能にし、それにより足場および細胞を含む、本質的に半固体または固体の播種培地を形成することである、インキュベートすることと、
（ｂ）本質的に半固体または固体の播種培地を、該培地が液化することを可能にする条件下でインキュベートすることと、を含み得る。
（ａ）複数の非ヒト動物付着細胞タイプを含む播種培地を足場および熱可逆性凝固剤とインキュベートすることであって、インキュベーション条件が、培地の凝固を可能にし、それにより足場および細胞を含む、本質的に半固体または固体の播種培地を形成することである、インキュベートすることと、
（ｂ）本質的に半固体または固体の播種培地を、該培地が液化することを可能にする条件下でインキュベートすることと、を含み得る。
【0168】
いくつかの実施形態では、播種が細胞培養バイオリアクタで行われる場合、本発明のシステムは、培地の凝固を可能にするための冷却システムをさらに備える。
【0169】
特定の実施形態によれば、細胞培養バイオリアクタが培養食品の生産後、その包装を形成する可撓性バッグの形態である場合、バッグに挿入された単一の足場の容積または複数の足場の総容積は、バッグの内部容積の２０％～約９９％である。特定の実施形態によれば、足場または複数の足場の容積は、バッグの内部容積の約２０％～約９５％、９６％、９７％、または９８％である。いくつかの実施形態では、足場または複数の足場の容積は、バッグの内部容積の約２０％～約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％である。いくつかの実施形態では、足場または複数の足場の容積は、バッグの内部容積の約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、または５０％～約９５％である。いくつかの実施形態によれば、足場または複数の足場の容積は、バッグの内部容積の約４０％～約８０％である。
【0170】
細胞
本発明によれば、２つ以上のタイプの動物付着細胞が各足場に播種される。本発明による細胞は、非ヒト動物、非遺伝子改変、付着細胞である。
本発明によれば、２つ以上のタイプの動物付着細胞が各足場に播種される。本発明による細胞は、非ヒト動物、非遺伝子改変、付着細胞である。
【0171】
培養肉を生産するために、生産される肉部分の所望のタイプに従って、２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞が選択される。生産された肉部分は、屠殺された肉の切り身、内臓、または特定の料理の準備のために設計されたものを模倣することができる。
【0172】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物付着細胞は、筋細胞（肉切り身）；肝細胞（肝臓）；心筋細胞（心臓）；腎細胞（腎臓）；リンパ系および上皮細胞（胸腺および膵臓でできたスイートブレッド）、神経細胞およびニューロン細胞（脳）；線毛上皮（舌）と胃細胞（胃袋）を含む、所望の最終肉製品による少なくとも１つの細胞タイプとともに、間質細胞および／または内皮細胞および／または脂肪細胞を含む。
【0173】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物付着細胞は、筋細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞、脂肪細胞、内皮細胞、およびそれらの前駆細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、２つ以上のタイプの非ヒト動物付着細胞は、筋細胞またはその前駆細胞、ならびにＥＣＭ－分泌細胞、脂肪細胞、内皮細胞、およびそれらの前駆細胞からなる群から選択される少なくとも１つの追加のタイプを含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物付着細胞は、筋細胞またはその前駆細胞、ＥＣＭ－分泌細胞またはその前駆細胞、脂肪細胞またはその前駆細胞、ならびに内皮細胞またはその前駆細胞を含む。
【0174】
特定の実施形態によれば、非ヒト動物は、有蹄動物、家禽、水生動物、無脊椎動物、および爬虫類からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0175】
特定の実施形態によれば、有蹄動物は、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、キリン、ラクダ、シカ、カバ、またはサイからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、有蹄動物は、ウシである。特定の例示的な実施形態によれば、ウシは、乳牛である。
【0176】
いくつかの実施形態では、本発明の教示に従って足場に播種される非ヒト動物由来の付着細胞は、多能性幹細胞を含む。特定の実施形態によれば、播種される非ヒト動物由来の付着細胞は、ウシ由来の多能性幹細胞（ｂＰＳＣ）を含む。特定の実施形態によれば、ｂＰＳＣは、ウシ胚性幹細胞である。特定の実施形態によれば、ｂＰＳＣは、ウシ誘導多能性幹細胞（ｂｉＰＳＣ）である。播種されたウシ由来の付着細胞は、所望の細胞タイプへの分化を可能にする条件下で増殖される。いくつかの特定の実施形態では、播種された多能性ウシ由来細胞は、筋細胞、ＥＣＭ－分泌細胞、脂肪細胞、および／または内皮細胞に分化する。
【0177】
いくつかの実施形態では、本発明の教示に従って足場に播種される非ヒト動物由来の付着細胞は、分化した細胞を含む。
【0178】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物細胞は、多能性幹細胞、例えば、ウシ由来の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を分化させることによって得られる。これらの実施形態によれば、培養肉を生産するためのプロセスは、細胞が足場に播種され、本発明の培養システムでインキュベートされる前に実行される拡大および分化ステップを含む。いくつかの実施形態では、プロセスは、（ａ）拡大培地を有する細胞培養容器にＰＳＣを播種するステップであって、拡大培地が、時間の経過に伴って増殖する均一な凝集体を形成するための増殖因子の組み合わせを含む無血清の液体培地である、播種するステップと；（ｂ）ＥＣＭ－分泌細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、および内皮細胞に分化するために、ＰＳＣを４つの細胞培養容器に分割するステップと；（ｃ）本発明による少なくとも１つの足場上に少なくとも２つのタイプの分化細胞を播種し、本明細書に記載の培養システムで細胞を増殖させるステップと、を含む。
【0179】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物細胞は、筋細胞、脂肪細胞、間質細胞、線維芽細胞、周皮細胞、内皮細胞、およびそれらの前駆細胞からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0180】
いくつかの実施形態では、複数の細胞タイプは、筋芽細胞および／またはその前駆細胞、ならびに少なくとも１つのタイプの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞を含む。
【0181】
いくつかの実施形態では、複数の細胞タイプは、筋芽細胞および／またはその前駆細胞、ならびに内皮細胞および／またはその前駆細胞を含む。
【0182】
いくつかの実施形態では、複数の細胞タイプは、筋芽細胞および／またはその前駆細胞、少なくとも１つのタイプの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）－分泌細胞および／またはその前駆細胞、ならびにその内皮細胞および／または前駆細胞を含む。
【0183】
いくつかの実施形態では、筋芽細胞の前駆細胞は、衛星細胞である。
【0184】
いくつかの実施形態では、ＥＣＭ－分泌細胞は、間質細胞、線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、およびそれらの前駆細胞からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの特定の実施形態では、ＥＣＭ－分泌細胞は、線維芽細胞、線維芽細胞の前駆細胞、またはそれらの組み合わせである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0185】
いくつかの実施形態では、内皮細胞は、骨格微小血管内皮細胞、大動脈平滑筋細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0186】
いくつかの実施形態では、複数の細胞タイプは、筋芽細胞、ＥＣＭ－分泌細胞、および内皮細胞を含む。
【0187】
追加の実施形態では、複数の細胞タイプは、衛星細胞、ＥＣＭ－分泌細胞、および内皮細胞を含む。
【0188】
いくつかの実施形態では、筋芽細胞および／またはその前駆細胞とＥＣＭ－分泌細胞との比は、約１０：１～約１：１０である。
【0189】
いくつかの実施形態では、ＥＣＭ－分泌細胞と内皮細胞との比は、約１：１～約１：１０である。
【0190】
いくつかの実施形態では、衛星細胞とＥＣＭ－分泌細胞と内皮細胞の比は、約１０：１：１～約２：１：１０である。
【0191】
いくつかの実施形態では、衛星細胞とＥＣＭ－分泌細胞との比は、約１：５～３：５である。
【0192】
いくつかの実施形態では、最終製品中の様々な細胞タイプ間の比率は以下の通りである：５５％～９８％の筋芽細胞、２％～１０％の間質細胞、０％～２５％の脂肪細胞、０％～１０％の内皮細胞。
【0193】
本発明に従って使用される播種培地および増殖培地は、非ヒト動物細胞の生存率、増殖、および任意選択で分化を維持するのに適していることが当技術分野で知られているものである。特定の例示的な実施形態によれば、Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（Ｒｏｃｋ）の阻害剤は、細胞生存および全体的な細胞増殖効率を増強するために適切な時期に添加される。
【0194】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、少なくとも１つの天然着色剤、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、鉄、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるサプリメントで増強された非ヒト動物細胞のための無血清、動物由来成分を含まない液体培地であり、サプリメントは、細胞に赤褐色を与えるのに十分な量のものである。いくつかの実施形態では、増殖培地は、約３５０～約７００ｎｍの複数の波長での吸光度を有することを特徴とする。いくつかの実施形態では、増殖培地は、酵母エキス、細菌抽出物、またはそれらの組み合わせをさらに含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0195】
いくつかの実施形態では、天然着色剤は、少なくとも１つの非哺乳動物生物、少なくとも１つのカロテノイド、少なくとも１つのベタレイン、およびそれらの任意の組み合わせから得られる抽出物からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0196】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、葉酸、亜鉛、セレン、ビタミンＤ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０、少なくとも１つの不飽和脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサプリメントをさらに含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0197】
いくつかの実施形態では、ビタミンＤは、ビタミンＤ３およびビタミンＤ２からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【0198】
いくつかの実施形態では、不飽和脂肪酸は、オメガ３脂肪酸、オメガ６脂肪酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【0199】
いくつかの実施形態では、増殖培地は、培養細胞の汚染を防止する少なくとも１つの抗菌ペプチド（ＡＭＰ）をさらに含む。
【0200】
複数の非ヒト動物細胞タイプを含む細胞培養物は、当技術分野で知られている任意の方法によって生産され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ウシ細胞である。ウシ細胞が最適かつ効率的な条件で増殖した後、それらは本明細書に記載されるように培養肉部分の生産に使用される。培養肉部分は、少なくとも１つの３Ｄ足場上で共培養で増殖した細胞（２つ以上のタイプ）の組み合わせである。最初に、細胞は、３Ｄ足場に単一の細胞または凝集体として、典型的には細胞タイプ間の設定された比率で播種される。１つ以上の足場および細胞は、本明細書に記載されるように、最終食品（例えば、培養肉部分）を構成する。
【0201】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形および修正を容易に考案することができる。
【実施例】
【0202】
実施例１：培養肉部分の生産
プロセスフロー図を図３に示す。
プロセスフロー図を図３に示す。
【0203】
ウシＰＳＣから分化したウシ由来のＥＣＭ－分泌細胞、筋芽細胞、脂肪細胞、および内皮細胞の前駆細胞が得られる。分化した細胞を、本発明による細胞培養バイオリアクタ内で少なくとも４０重量％（乾燥重量）のタンパク質含有量を有する足場に播種し、本明細書に記載の培養システムで１０～１４日間増殖させる。培養肉の一部が形成される。
【0204】
部分的に分化した細胞は、４つのタイプの細胞間で設定された比率で、特定の連続した方法で足場に接種される。生産プロセスの開始時に、新鮮な培地（動物成分を含まない）がシステムに接種され、それは、特定の増殖因子および小分子を含有する。細胞培養バイオリアクタの様々なパラメータを慎重に監視および調整して、細胞の生存率を最適なレベルに維持する。細胞培養バイオリアクタの温度（３８．６℃±０．５℃）およびｐＨ（６．７～７．２±０．１）が維持される。細胞培養バイオリアクタの毎日のサンプルが収集され、細胞数（生存可能および合計）、培地組成（グルコース、アンモニア、乳酸、浸透圧）について分析される。グルコース取り込み率（ＧＵＲ）が５０～５００グラム／日の最大レベルに達すると、プロセスが終了し、培養肉の一部が収穫される。
【0205】
実施例２：本発明の細胞培養バイオリアクタとしての可撓性バッグにおける細胞増殖
２Ｌ滅菌バッグを設計および製造した。バッグは、優れた抽出性と浸出性プロファイル、水蒸気と酸素のバリア、および流体の完全性（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＣＡにより製造された）を提供する、５層のポリオレフィン系のＴｅｐｏＦｌｅｘ（登録商標）の、動物成分を含まないフィルムで構成した。バッグは、ガンマ線照射（２５～４０ｋＧｙ）によって滅菌した。
２Ｌ滅菌バッグを設計および製造した。バッグは、優れた抽出性と浸出性プロファイル、水蒸気と酸素のバリア、および流体の完全性（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＣＡにより製造された）を提供する、５層のポリオレフィン系のＴｅｐｏＦｌｅｘ（登録商標）の、動物成分を含まないフィルムで構成した。バッグは、ガンマ線照射（２５～４０ｋＧｙ）によって滅菌した。
【0206】
概念実証実験は、７０ｍＬの増殖培地のスケールで、約１６．５ｍＬの容積を持つ単一の植物ベースの足場、および細胞培養バイオリアクタとしての単回使用バッグを使用して実行した。
【0207】
足場を含む７０ｍＬのバッグに、２５ｍＬの容量の増殖培地内の３２５×１０６個のウシ線維芽細胞および筋芽細胞を接種した。バッグのヘッドスペースを空気で満たし、バッグを２ｃｐｍの速度で揺らし、３８．５℃の温度で１０°の角度に位置付けた。１時間後、さらに４５ｍｌの培地を添加した。播種効率の分析のために、接種の２時間後に上清を表すサンプルを採取した。バッグを、さらに３８．５℃の温度および５％ＣＯ２で、静的にインキュベートした。測定されたグルコースレベルが４グラム／リットルを下回ったら、増殖培地全体をリフレッシュした。
【0208】
播種した３２５×１０６個の細胞のうち、５１．３×１０６個のみを、２時間後に上清中に放置した。これらの結果は、細胞の８４％が足場に付着したことを示している。
【0209】
時間の経過に伴う足場上／足場内の細胞の増殖を、培地内のグルコースおよび乳酸レベルを分析することによって追った。細胞増殖は、培地内のグルコース濃度の低下（細胞によるグルコース取り込みを示す）および乳糖分解酵素濃度の増加（細胞の代謝活性を示す）によって特徴付けられる。図５に示されているように、足場上／足場内で増殖した細胞は、グルコースを消費し、乳酸を産生し、これは、細胞が、調べた最初の２５０時間に沿って生存していることを示す。
【0210】
実施例３：細胞培養バイオリアクタ内の足場での２つのタイプの細胞の増殖
増殖期間の終わりに足場に播種された線維芽細胞および筋芽細胞の存在を調べて、培養システムが２つ以上のタイプの細胞の増殖をサポートできることを確実にした。ＰＣＲアシスタント検出を使用した。筋前駆細胞マーカであるＰａｘ７および線維芽細胞マーカである１型コラーゲンの遺伝子発現をテストした。足場の両端に由来する足場サンプル（重量＝１５０ｍｇ）を収集して均一化し、ＥＺ ＲＮＡキット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を使用してＲＮＡ抽出を行った。播種された細胞のない裸の足場は、ネガティブコントロールとして機能した。図６に示すように、Ｐａｘ７とＣｏｌｌａｇｅｎ１は、播種された足場の両端で発現した。予想通り、これらのマーカは、細胞のない裸の足場から得られたサンプルでは検出されなかった。これらのデータは、足場に播種されたウシ筋前駆細胞と線維芽細胞の両方が、足場に付着し、同時に増殖したことを示す。さらに、細胞が足場の両端に存在することを示すことにより、細胞が足場の全領域に分布していることが実証されている。
増殖期間の終わりに足場に播種された線維芽細胞および筋芽細胞の存在を調べて、培養システムが２つ以上のタイプの細胞の増殖をサポートできることを確実にした。ＰＣＲアシスタント検出を使用した。筋前駆細胞マーカであるＰａｘ７および線維芽細胞マーカである１型コラーゲンの遺伝子発現をテストした。足場の両端に由来する足場サンプル（重量＝１５０ｍｇ）を収集して均一化し、ＥＺ ＲＮＡキット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を使用してＲＮＡ抽出を行った。播種された細胞のない裸の足場は、ネガティブコントロールとして機能した。図６に示すように、Ｐａｘ７とＣｏｌｌａｇｅｎ１は、播種された足場の両端で発現した。予想通り、これらのマーカは、細胞のない裸の足場から得られたサンプルでは検出されなかった。これらのデータは、足場に播種されたウシ筋前駆細胞と線維芽細胞の両方が、足場に付着し、同時に増殖したことを示す。さらに、細胞が足場の両端に存在することを示すことにより、細胞が足場の全領域に分布していることが実証されている。
【0211】
前述の特定の実施形態の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、他の人は、現在の知識を適用することによって、過度の実験なしに、および一般的な概念から逸脱することなく、かかる特定の実施形態の様々な用途に容易に修正および／または適合することができ、したがって、かかる適合および修正は、本開示の実施形態の均等物の意味および範囲内で理解されるべきであり、そのように意図されている。本明細書で使用される表現または用語は、説明を目的としたものであり、限定を目的としたものではないことを理解されたい。様々な本開示の機能を実施するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態をとることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】