特表 2022-532783 向上した異種移植生存及び／又は耐性のための１つ以上の改変遺伝子を有する細胞、組織、器官、及び／又は動物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-19

(54)【発明の名称】向上した異種移植生存及び／又は耐性のための１つ以上の改変遺伝子を有する細胞、組織、器官、及び／又は動物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/85 20060101AFI20220711BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220711BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20220711BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20220711BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220711BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20220711BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20220711BHJP

【ＦＩ】

C12N15/85 Z

C12N5/10 ZNA

A01K67/027

C12N15/12

C12N15/11 Z

C12N15/54

C12N15/53

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021568652

(86)(22)【出願日】2020-05-15

(85)【翻訳文提出日】2022-01-13

(86)【国際出願番号】 CN2020090440

(87)【国際公開番号】W WO2020228810

(87)【国際公開日】2020-11-19

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/087310

(32)【優先日】2019-05-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/087314

(32)【優先日】2019-05-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/112038

(32)【優先日】2019-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/112039

(32)【優先日】2019-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519375457

【氏名又は名称】イージェネシス，インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】521500155

【氏名又は名称】ハンチョウ キハン バイオテクノロジー カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ルハン

(72)【発明者】

【氏名】ガオ，ヤンビン

(72)【発明者】

【氏名】グエル，マーク

(72)【発明者】

【氏名】カン，イーナン

(72)【発明者】

【氏名】チン，ウェニング

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

(57)【要約】

向上した異種移植生存及び／又は耐性のための１つ以上の改変遺伝子を有する細胞、組織、器官、及び／又は動物、並びに細胞、組織、器官、及び／又は動物を生産及び使用する方法が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、免疫調節物質導入遺伝子、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも２つのタイプの複数の導入遺伝子を含む、単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項2】

複数の導入遺伝子を含む単離された細胞、組織、器官、又は動物であって、前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの炎症応答導入遺伝子、少なくとも１つの免疫応答導入遺伝子、及び少なくとも１つの免疫調節物質導入遺伝子を含む、単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項3】

前記炎症応答導入遺伝子は、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１）、分化のクラスター４７（ＣＤ４７）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項4】

前記免疫応答導入遺伝子は、ヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項5】

前記免疫調節物質導入遺伝子は、プログラムデスリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項6】

前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの凝固応答導入遺伝子をさらに含む、請求項１又は２に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項7】

前記凝固応答導入遺伝子は、分化のクラスター３９（ＣＤ３９）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項8】

前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの補体応答導入遺伝子をさらに含む、請求項１又は２に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項9】

前記補体応答導入遺伝子は、ヒト膜補因子タンパク質（ｈＣＤ４６）、ヒト補体崩壊促進因子（ｈＣＤ５５）、ヒトＭＡＣ－阻害剤因子（ｈＣＤ５９）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項10】

補体応答導入遺伝子、凝固応答導入遺伝子、炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、及び免疫調節物質導入遺伝子からなる群からそれぞれ独立して選択される６個以上の導入遺伝子を含む、単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項11】

前記単離された細胞、組織、器官、又は動物は、９、１０、１１、又は１２個の導入遺伝子を含む、請求項１０に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項12】

前記補体応答導入遺伝子は、ヒト膜補因子タンパク質（ｈＣＤ４６）、ヒト補体崩壊促進因子（ｈＣＤ５５）、ヒトＭＡＣ－阻害剤因子（ｈＣＤ５９）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項13】

前記凝固応答導入遺伝子は、分化のクラスター３９（ＣＤ３９）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項14】

前記炎症応答導入遺伝子は、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１）、分化のクラスター４７（ＣＤ４７）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項15】

前記免疫応答導入遺伝子は、ヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項16】

前記免疫調節物質導入遺伝子は、プログラムデスリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項17】

前記６個以上の導入遺伝子は、ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１からなる群から選択される、請求項１０～１６のいずれか一項に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項18】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＨＯ－１、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、及びＰＤ－Ｌ１導入遺伝子又はＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＨＯ－１、Ａ２０、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、及びＣＤ４７導入遺伝子を含む、請求項１７に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項19】

図１７～２０、３１、又は４７～４９の１つにおけるベクターを含む、請求項１８に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項20】

前記少なくとも６個の導入遺伝子は、単一の遺伝子座から発現される、請求項１０～１９のいずれか一項に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項21】

前記少なくとも６個の導入遺伝子は、臨床的に有効なレベルで発現される、請求項１０～２０のいずれか一項に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項22】

遺伝子改変されているフォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子をさらに含む、請求項１０～２１のいずれか一項に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項23】

前記改変ｖＷＦ遺伝子は、ヒト化されている、請求項２２に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項24】

アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）の欠失、破壊、又は不活性化をさらに含む、請求項１０～２３のいずれか一項に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項25】

１つ以上の炭水化物抗原遺伝子の欠失、破壊、又は不活性化をさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項26】

前記１つ以上の炭水化物抗原遺伝子は、糖タンパク質α－ガラクトシルトランスフェラーゼ１（ＧＧＴＡ）、β１，４ Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）からなる群から選択される、請求項２５に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項27】

前記単離された細胞、組織、器官、又は対象は、ブタ細胞、ブタ組織、ブタ器官、豚又はその子孫である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項28】

前記単離された細胞、組織、器官、又は動物は、ＰＥＲＶ非含有ブタ細胞、ＰＥＲＶ非含有ブタ組織、又はＰＥＲＶ非含有ブタである、請求項２７に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項29】

前記器官は腎臓又は肝臓である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項30】

炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、免疫調節物質導入遺伝子、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも２つのタイプの複数の導入遺伝子を含むベクター。

【請求項31】

複数の導入遺伝子を含むベクターであって、前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの炎症応答導入遺伝子、少なくとも１つの免疫応答導入遺伝子、及び少なくとも１つの免疫調節物質導入遺伝子を含む、ベクター。

【請求項32】

前記炎症応答導入遺伝子は、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１）、分化のクラスター４７（ＣＤ４７）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３０又は３１に記載のベクター。

【請求項33】

前記炎症応答導入遺伝子の少なくとも一部の発現は、組織特異的プロモーター、遍在性プロモーター、又はそれらの任意の組合せによって駆動される、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項34】

前記組織特異的プロモーターは内皮特異的プロモーターである、請求項３３に記載のベクター。

【請求項35】

前記免疫応答導入遺伝子は、ヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３０又は３１に記載のベクター。

【請求項36】

前記免疫応答導入遺伝子の少なくとも一部の発現は、遍在性プロモーターによって駆動される、請求項３０、３１、又は３５に記載のベクター。

【請求項37】

前記免疫調節物質導入遺伝子は、プログラムデスリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３０又は３１に記載のベクター。

【請求項38】

前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの凝固応答導入遺伝子をさらに含む、請求項３０又は３１に記載のベクター。

【請求項39】

前記凝固応答導入遺伝子は、分化のクラスター３９（ＣＤ３９）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３８に記載のベクター。

【請求項40】

前記凝固応答導入遺伝子の少なくとも一部の発現は、組織特異的プロモーターによって駆動される、請求項３８又は３９に記載のベクター。

【請求項41】

前記組織特異的プロモーターは、内皮特異的プロモーターである、請求項４０に記載のベクター。

【請求項42】

前記内皮特異的プロモーターは、低発現内皮特異的プロモーターである、請求項４１に記載のベクター。

【請求項43】

前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの補体応答導入遺伝子をさらに含む、請求項３０又は３１に記載のベクター。

【請求項44】

前記補体応答導入遺伝子は、ヒト膜補因子タンパク質（ｈＣＤ４６）、ヒト補体崩壊促進因子（ｈＣＤ５５）、ヒトＭＡＣ－阻害剤因子（ｈＣＤ５９）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４３に記載のベクター。

【請求項45】

前記補体応答導入遺伝子の少なくとも一部の発現は、遍在性プロモーターによって駆動される、請求項４３又は４４に記載のベクター。

【請求項46】

補体応答導入遺伝子、凝固応答導入遺伝子、炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、及び免疫調節物質導入遺伝子からなる群からそれぞれ独立して選択される６個以上の導入遺伝子を含むベクター。

【請求項47】

前記ベクターは、９、１０、１１、又は１２個の導入遺伝子を含む、請求項４６に記載のベクター。

【請求項48】

前記補体応答導入遺伝子は、ヒト膜補因子タンパク質（ｈＣＤ４６）、ヒト補体崩壊促進因子（ｈＣＤ５５）、ヒトＭＡＣ－阻害剤因子（ｈＣＤ５９）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４６に記載のベクター。

【請求項49】

前記補体応答導入遺伝子の少なくとも一部の発現は、遍在性プロモーターによって駆動される、請求項４６～４８のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項50】

前記凝固応答導入遺伝子は、分化のクラスター３９（ＣＤ３９）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４６に記載のベクター。

【請求項51】

前記凝固応答導入遺伝子の少なくとも一部の発現は、組織特異的プロモーターによって駆動される、請求項４３～５０のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項52】

前記組織特異的プロモーターは、内皮特異的プロモーターである、請求項５１に記載のベクター。

【請求項53】

前記内皮特異的プロモーターは、低発現内皮特異的プロモーターである、請求項５２に記載のベクター。

【請求項54】

前記炎症応答導入遺伝子は、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１）、分化のクラスター４７（ＣＤ４７）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４６に記載のベクター。

【請求項55】

前記炎症応答導入遺伝子の少なくとも一部の発現は、組織特異的プロモーター、遍在性プロモーター、又はそれらの任意の組合せによって駆動される、請求項４６～５４のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項56】

前記組織特異的プロモーターは、内皮特異的プロモーターである、請求項５５に記載のベクター。

【請求項57】

前記免疫応答導入遺伝子は、ヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４６に記載のベクター。

【請求項58】

前記免疫応答導入遺伝子の少なくとも一部の発現は、遍在性プロモーターによって駆動される、請求項４６～５７のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項59】

前記免疫調節物質導入遺伝子は、プログラムデスリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４６に記載のベクター。

【請求項60】

前記６個以上の導入遺伝子は、ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１からなる群から選択される、請求項４６～５９のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項61】

前記ベクターは、ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＨＯ－１、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、及びＰＤ－Ｌ１導入遺伝子又はＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＨＯ－１、Ａ２０、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、及びＣＤ４７導入遺伝子を含む請求項６０に記載のベクター。

【請求項62】

図１７～２０、３１、又は４７～４９の１つにおけるベクターを含む、請求項６１に記載のベクター。

【請求項63】

前記少なくとも６個の導入遺伝子は、単一の遺伝子座から発現される、請求項４６～６２のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項64】

請求項１～２９のいずれか一項に記載の単離された細胞、組織、又は動物の作製方法。

【請求項65】

転位を介した単一コピーポリシストロン性導入遺伝子組込み、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を介した一／二対立遺伝子部位特異的組込み、ゲノム置換、内因性遺伝子ヒト化、又はそれらの任意の組合せを含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

豚のものではない血液に暴露された際に、減少した肝臓損傷及び／又は安定な凝固を有する遺伝子導入豚肝臓であって、
前記減少した肝臓損傷は、胆汁産生、１つ以上の代謝酵素、及び１つ以上の血清電解質の１つ以上のレベルを決定することによって評価され、及び
前記安定な凝固は、プロトロンビン時間（ＰＴ）及び国際標準化比（ＰＴ－ＮＩＲ）、フィブリノーゲンレベル（ＦＩＢ）、並びにより低い活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の１つ以上のレベルを決定することによって評価される、遺伝子導入豚肝臓。

【請求項67】

前記代謝酵素は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びアルブミン（ＡＬＢ）からなる群から選択される、請求項６６に記載の遺伝子導入豚肝臓。

【請求項68】

前記血清電解質は、カリウム（Ｋ）及び／又はナトリウム（Ｎａ）である、請求項６６又は６７に記載の遺伝子導入豚肝臓。

【請求項69】

（ａ）炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、免疫調節物質導入遺伝子、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも２つのタイプの複数の導入遺伝子を含み、
（ｂ）異種指向性ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）ビリオンの産生が実質的にない、
単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項70】

（ａ）複数の導入遺伝子を含み、前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの炎症応答導入遺伝子、少なくとも１つの免疫応答導入遺伝子、及び少なくとも１つの免疫調節物質導入遺伝子を含み、
（ｂ）異種指向性ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）ビリオンの産生が実質的にない、
単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項71】

前記ブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物は、ＰＥＲＶポリメラーゼ（ｐｏｌ）の酵素活性が実質的にない、請求項６９又は７０に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項72】

前記ブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物は、機能的全長ＰＥＲＶ ｐｏｌタンパク質の発現が実質的にない、請求項６９又は７０に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項73】

ゲノムＰＥＲＶ ｐｏｌコピーのコード配列の少なくとも約９７％が破壊されている、請求項６９又は７０に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項74】

ゲノムＰＥＲＶ ｐｏｌコピーの実質的に全部のコード配列が破壊されている、請求項６９又は７０に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項75】

ゲノムＰＥＲＶ ｐｏｌコピーから転写されたＰＥＲＶ ｐｏｌ ｍＲＮＡの少なくとも約９７％のコード配列が破壊されている、請求項６９又は７０に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項76】

破壊は、前記ＰＥＲＶ ｐｏｌ コード配列の少なくとも１つのヌクレオチド位置での少なくとも１つのフレームシフト挿入／欠失（インデル）を含む、請求項７３～７５のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項77】

前記ブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物は、機能的ＰＥＲＶ ｇａｇ及び／又はｅｎｖタンパク質を発現する、請求項６９～７６のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項78】

前記ブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物は、ＰＥＲＶ ｇａｇ及び／又はｅｎｖ遺伝子の実質的に全部のゲノムコピーの無傷コード配列を含む、請求項６９～７７のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項79】

前記ブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト細胞への低下したＰＥＲＶ感染力を示す、請求項６９～７８のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項80】

前記ブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物は、野生型ブタ細胞と比較して少なくとも２００倍低い、ヒト細胞へのＰＥＲＶ感染力を示す、請求項７９に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項81】

前記ブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物は、ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子又はｍＲＮＡを標的とするゲノム改変を欠く、ブタの単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物と比較して、ヒト細胞への低下したＰＥＲＶ感染力を示す、請求項７９又は８０に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項82】

ＰＥＲＶ感染力は、前記ブタの単離された細胞、組織、器官、若しくは動物、又はその外科的外植片をヒト細胞と共培養することによって確認される、請求項７９～８１のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項83】

ＰＥＲＶ感染力は、前記ブタ動物由来の細胞外液をヒト細胞と共培養することによって確認される、ブタ動物である請求項７９～８１のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項84】

ＰＥＲＶ感染力は、前記共培養後に、ＰＥＲＶゲノム配列又は抗原の存在について、前記ヒト細胞をシーケンシング、ＰＣＲ、又はイムノアッセイにより分析することによって、少なくとも部分的に確認される、請求項８２又は８３に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項85】

前記ＰＥＲＶは、ＰＥＲＶ－Ａ、ＰＥＲＶ－Ｂ、ＰＥＲＶ－Ａ／Ｃ、又はその組換え変異体である、請求項６９～８４のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項86】

前記炎症応答導入遺伝子は、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１）、分化のクラスター４７（ＣＤ４７）、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６９～８５のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項87】

前記免疫応答導入遺伝子は、ヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６９～８６のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項88】

前記免疫調節物質導入遺伝子は、プログラムデスリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６９～８７のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項89】

前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの凝固応答導入遺伝子をさらに含む、請求項６９～８８のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項90】

前記凝固応答導入遺伝子は、分化のクラスター３９（ＣＤ３９）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８９に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項91】

前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの補体応答導入遺伝子をさらに含む、請求項６９～９０のいずれか一項に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項92】

前記補体応答導入遺伝子は、ヒト膜補因子タンパク質（ｈＣＤ４６）、ヒト補体崩壊促進因子（ｈＣＤ５５）、ヒトＭＡＣ－阻害剤因子（ｈＣＤ５９）、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項９１に記載のブタの単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項93】

前記単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物は、前記導入遺伝子のゲノム組込みを含む、請求項６９～９２のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項94】

前記単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物は、前記導入遺伝子の生殖系列伝達可能なゲノム組込みを含む、請求項９３に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項95】

前記ブタ細胞、組織、器官、又は動物は、前記導入遺伝子から転写された検出可能なレベルのｍＲＮＡを発現する、請求項６９～９４のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項96】

前記ブタ細胞、組織、器官、又は動物は、前記導入遺伝子から翻訳された検出可能なレベルのタンパク質を発現する、請求項６９～９５のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項97】

前記ブタ細胞、組織、器官、又は動物は、前記導入遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳された、治療的に有効なレベルのタンパク質を発現する、請求項６９～９５のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項98】

（ａ）補体応答導入遺伝子、凝固応答導入遺伝子、炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、及び免疫調節物質導入遺伝子からなる群からそれぞれ独立して選択される６個以上の導入遺伝子を含み、
（ｂ）異種指向性ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）ビリオンの産生が実質的にない、
単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項99】

前記単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物は、前記導入遺伝子の９、１０、１１、又は１２個を含む、請求項９８に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項100】

前記補体応答導入遺伝子は、ヒト膜補因子タンパク質（ｈＣＤ４６）、ヒト補体崩壊促進因子（ｈＣＤ５５）、ヒトＭＡＣ－阻害剤因子（ｈＣＤ５９）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９８又は９９に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項101】

前記補体応答導入遺伝子の少なくとも一部の転写は、遍在性プロモーターの転写制御下にある、請求項１００に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項102】

前記凝固応答導入遺伝子は、分化のクラスター３９（ＣＤ３９）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９８～１０１のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項103】

前記凝固応答導入遺伝子の少なくとも一部の転写は、組織特異的プロモーターの転写制御下にある、請求項９８～１０２のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項104】

前記組織特異的プロモーターは内皮特異的プロモーターである、請求項１０３に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項105】

前記内皮特異的プロモーターは、低発現内皮特異的プロモーターである、請求項１０４に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項106】

前記炎症応答導入遺伝子は、ＴＮＦα誘導タンパク質３（Ａ２０）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１）、分化のクラスター４７（ＣＤ４７）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９８～１０５のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項107】

前記炎症応答導入遺伝子の少なくとも一部の転写は、組織特異的プロモーター、遍在性プロモーター、又はそれらの任意の組合せによって駆動される、請求項９８～１０６のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項108】

前記組織特異的プロモーターは内皮特異的プロモーターである、請求項１０７に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項109】

前記免疫応答導入遺伝子は、ヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９８～１０８のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項110】

前記免疫応答導入遺伝子の少なくとも一部の発現は、遍在性プロモーターによって駆動される、請求項９８～１０９のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項111】

前記免疫調節物質導入遺伝子は、プログラムデスリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項９８～１１０のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項112】

前記６個以上の導入遺伝子は、ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１からなる群から選択される、請求項９８～１１１のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項113】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＨＯ－１、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、及びＰＤ－Ｌ１導入遺伝子又はＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６、ＨＯ－１、Ａ２０、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、及びＣＤ４７導入遺伝子を含む、請求項９８～１１２のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項114】

前記導入遺伝子は、単一の遺伝子座から発現される、請求項９８～１１３のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項115】

前記導入遺伝子は、３つ以下のシストロンに転写される、請求項９８～１１４のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項116】

シストロンは、少なくとも３つの異なる導入遺伝子のコード配列を含み、前記少なくとも３つの異なる導入遺伝子は、ブタテッショウウイルス２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドのコード配列によって分離される、請求項１１５に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項117】

１つ以上の異種性炭水化物抗原産生遺伝子の欠失、破壊、又は不活性化をさらに含む、請求項６９～１１６のいずれか一項に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項118】

前記１つ以上の異種性炭水化物抗原産生遺伝子は、糖タンパク質α－ガラクトシルトランスフェラーゼ１（ＧＧＴＡ）、β１，４ Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）からなる群から選択される、請求項１１７に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項119】

ＧＧＴＡの２コピー、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２の４コピー、又はＣＭＡＨの２コピー、又はそれらの任意の組合せにおける欠失、破壊、又は不活性化を含む、請求項１１８に記載の単離された細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項120】

（ａ）補体応答導入遺伝子、凝固応答導入遺伝子、炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、及び免疫調節物質導入遺伝子からなる群からそれぞれ独立して選択される６個以上の導入遺伝子を含み、
（ｂ）異種指向性ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）ビリオンの産生が実質的になく、
（ｃ）ＧＧＴＡの２コピー、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２の４コピー、又はＣＭＡＨの２コピー、又はそれらの任意の組合せにおける欠失、破壊、又は不活性化を含む、
単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項121】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト血液又はその画分に暴露された際に、ヒト抗体への低下した結合を示す、請求項６９～１２０のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項122】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト血液又はその画分に暴露された際に、ヒト抗体への少なくとも約５倍低下した結合を示す、請求項１２１に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項123】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト血液又はその画分に暴露された際に、ヒト抗体への少なくとも約１０倍低下した結合を示す、請求項１２１に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項124】

前記抗体はＩｇＭ抗体である、請求項１２１～１２３のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項125】

前記抗体はＩｇＧ抗体である、請求項１２１～１２３のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項126】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト血液に暴露された際に、低下したナチュラルキラー（ＮＫ）細胞毒性を示す、請求項６９～１２５のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項127】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト血液に暴露された際に、少なくとも約２０％低いナチュラルキラー（ＮＫ）細胞毒性を示す、請求項１２６に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項128】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト血液由来の補体に暴露された際に、低下した補体毒性を示す、請求項６９～１２７のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項129】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト血液由来の補体に暴露された際に、少なくとも約５倍低い補体毒性を示す、請求項１２８に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項130】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト血液に暴露された際に、減少したＴＡＴ複合体形成を示す、請求項６９～１２９のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項131】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト血液に暴露された際に、少なくとも約３倍減少したＴＡＴ複合体形成を示す、請求項１３０に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項132】

前記細胞、組織、器官、又は動物は、ヒト血液に暴露された際に、少なくとも約１０倍減少したＴＡＴ複合体形成を示す、請求項１３０に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項133】

白血球、血小板、単球、好中球、好酸球、又はそれらの任意の組合せの正常な血球数を示す、動物である、請求項６９～１３２のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項134】

血清アルカリホスファターゼレベル、アスパルテームアミノアシルトランスフェラーゼレベル、アラニンアミノトランスフェラーゼレベル、ＡＬＴ／ＡＳＴレベル、コレステロール、総ビリルビン、トリグリセリド、又はアルブミン／グロブリンレベル、又はそれらの任意の組合せによって評価された場合に正常な肝臓機能を示す、動物である、請求項６９～１３３のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項135】

血清クレアチンキナーゼレベル、クレアチンキナーゼ－ＭＢレベル、乳酸デヒドロゲナーゼレベル、又はそれらの任意の組合せによって評価された場合に正常な心臓機能を示す、動物である、請求項６９～１３４のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項136】

血清クレアチニンレベル、尿素レベル、又はそれらの組合せによって評価された場合に正常な腎臓機能を示す、動物である、請求項６９～１３５のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項137】

トロンビン時間、プロトロンビンレベル、又はそれらの組合せによって評価された場合に正常な凝固機能を示す、動物である、請求項６９～１３６のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【請求項138】

（ａ）α－ガラクトシルトランスフェラーゼ１（ＧＧＴＡ）、β１，４ Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）、若しくはシチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、若しくはそれらの組合せを含む１つ以上の異種性炭水化物抗原産生遺伝子の欠失、破壊、若しくは不活性化；
（ｂ）前記導入遺伝子；
（ｃ）異種指向性ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）ビリオンの産生の非存在；又は
（ｄ）それらの任意の組合せ；
を子孫動物に伝達することが可能であり、（ａ）～（ｄ）は、正常なメンデル遺伝によって伝達される、動物である、請求項６９～１３７のいずれか一項に記載の単離されたブタ細胞、組織、器官、又は動物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
[0001] 本出願は２０１９年５月１６日出願のＰＣＴ／ＣＮ１９／８７３１０号、２０１９年５月１６日出願のＰＣＴ／ＣＮ１９／８７３１４号、２０１９年１０月１８日出願のＰＣＴ／ＣＮ１９／１１２０３８号、及び２０１９年１０月１８日出願のＰＣＴ／ＣＮ１９／１１２０３９号の開示の全体を、全目的のために組み込むものである。

【0002】

配列表に対する相互参照
[0002] 電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピューター可読形式（ファイル名：EGEN_037_00WO_SeqList_ST25.txt、記録された日付：２０２０年５月１４日、ファイルサイズ１８９キロバイト）。

【背景技術】

【0003】

背景
[0003] 移植のためのヒト器官及び組織の不足は、過去数十年にわたって増加しており、最も有意な未だ対処されていない医療ニーズの１つである。異種移植は、慢性器官不全を有する患者に対して、ほぼ無限の移植器官供給を提供する可能性がある。器官の大きさと生理機能の類似性は、分子不適合を排除するための遺伝子工学と相まって、ブタを腎異種移植片の選択肢とする。前臨床試験は、ブタ腎異種移植片がヒト以外の霊長類レシピエントにおいて数週間から数ヶ月間生命を維持することを実証した（Higginbotham 2015、Iwase 2015b）。しかしながら、ブタとヒトの間の進化的距離の結果として、ブタ器官は、（ｉ）超急性拒絶反応、（ｉｉ）無秩序な血栓調節と白血球動員を伴うＩＩ型内皮細胞（ＥＣ）活性化からなる急性体液性拒絶反応、（ｉｉｉ）血小板消費とＥＣ活性化を伴う血管内血栓症、フィブリン沈着、及び血栓調節の欠如に起因する血栓症からなる血栓性微小血管症、並びに（ｉｖ）慢性血管障害を含む多くの形態でヒト免疫系による拒絶を誘発する。これらの有害事象は、少なくとも部分的には、特に補体、凝固、炎症、及び免疫応答系に関与する遺伝子に関して、ドナーとレシピエントとの間の分子不適合によるものである。異種器官（例えば、ブタ）の臨床使用は、これらの免疫学的不適合により妨げられており、これまでのところ、これは臨床的異種移植におけるブタ細胞、組織、及び血管柄付豚器官の使用を妨げてきた。

【0004】

[0004] 過去２０年間に、ブタとヒトの種間不和合性を減少させるいくつかの遺伝子改変が同定されている。しかしながら、以前に同定されたこれらの遺伝子改変は、長期の異種移植片生存を達成していない。さらに、大規模なゲノム工学の技術的限界により、これらの改変を１つの動物に統合することが妨げられている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

概要
[0005] 異種移植に使用するため、及び関連した方法を開発するために、遺伝子改変の新規な組合せを有するブタ細胞、組織、器官、及び／又はブタ動物を開発する必要がある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

[0006] したがって、本開示は、向上した免疫学的適合性をもたらす遺伝子改変を含む細胞、組織、器官、及び動物、並びにこれらの細胞、組織、器官、及び動物の作製に使用するためのベクター及び方法、並びに異種移植におけるこれらの細胞、組織、器官、及び動物の使用を提供する。特定の実施形態では、向上した免疫学的適合性を生じさせる遺伝子改変は、１つ以上の補体応答遺伝子（本明細書では互換的に補体毒性遺伝子と称される）、凝固応答遺伝子（本明細書では互換的に凝固遺伝子と称される）、炎症応答遺伝子（本明細書では互換的にアポトーシス／炎症遺伝子と称される）、免疫応答遺伝子（本明細書では互換的に細胞毒性遺伝子と称される）、及び／又は免疫調節物質遺伝子を含む。

【0007】

[0007] いくつかの態様では、本開示は、炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、免疫調節物質導入遺伝子、又はそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも２つのタイプの複数の導入遺伝子を含む、単離された細胞、組織、器官、及び動物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、複数の導入遺伝子を含む単離された細胞、組織、器官、又は動物を提供し、前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの炎症応答導入遺伝子、少なくとも１つの免疫応答導入遺伝子、及び少なくとも１つの免疫調節物質導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記複数の導入遺伝子は、炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、免疫調節物質導入遺伝子、又はそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも３つの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、炎症応答導入遺伝子は、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３（Ａ２０）、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１又はＨＭＯＸ１）、分化のクラスター（Cluster of Differentiation）４７（ＣＤ４７）、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫応答導入遺伝子は、ヒト白血球抗原－Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫調節物質導入遺伝子は、プログラムデスリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記複数の導入遺伝子は、さらに少なくとも１つの凝固応答導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、凝固応答導入遺伝子は、分化のクラスター３９（ＣＤ３９）、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ、ＴＢＭ、又はＴＭ）、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記複数の導入遺伝子は、さらに少なくとも１つの補体応答導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、補体応答導入遺伝子は、ヒト膜補因子タンパク質（ｈＣＤ４６又は単にＣＤ４６）；ヒト補体崩壊促進因子（ｈＣＤ５５又は単にＣＤ５５）、ヒトＭＡＣ－阻害剤因子（ｈＣＤ５９又は単にＣＤ５９）、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0008】

[0008] 一態様において、本開示は、補体応答導入遺伝子（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９）；凝固応答導入遺伝子（例えば、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ又はＴＢＭ、ＴＦＰＩ）；炎症応答導入遺伝子（例えば、Ａ２０、ＨＯ－１、ＣＤ４７）；免疫応答導入遺伝子（例えば、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ）；及び／又は免疫調節物質導入遺伝子（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ）からなる群からそれぞれ独立して選択される１つ以上の導入遺伝子を含む、単離された細胞、組織、器官、及び動物を提供する。特定の実施形態では、細胞、組織、器官、又は動物は、他の遺伝子カテゴリーからの１つ以上の追加の導入遺伝子をさらに含むことができる。

【0009】

[0009] 特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、及びｈＣＤ５９からなる群から選択される１つ以上の補体応答導入遺伝子を含む。これらの実施形態のいくつかでは、補体応答導入遺伝子の１つ以上の発現は、遍在性プロモーターによって駆動される。

【0010】

[0010] 特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、及びＴＦＰＩからなる群から選択される１つ以上の凝固応答導入遺伝子を含む。これらの実施形態のいくつかでは、凝固応答導入遺伝子の１つ以上の発現は、組織特異的プロモーターによって駆動される。これらの実施形態の特定のものでは、組織特異的プロモーターは、内皮特異的プロモーターであり、これらの実施形態の特定のものでは、内皮特異的プロモーターは、低発現内皮特異的プロモーターである。

【0011】

[0011] 特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、Ａ２０、ＨＯ－１、及びＣＤ４７からなる群から選択される１つ以上の炎症応答導入遺伝子を含む。これらの実施形態のいくつかでは、炎症応答導入遺伝子の１つ以上の発現は、遍在性プロモーター、内皮特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーター、又はそれらの任意の組合せによって駆動される。

【0012】

[0012] 特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、ＨＬＡ－Ｅ及びＢ２Ｍからなる群から選択される１つ以上の免疫応答導入遺伝子を含む。これらの実施形態のいくつかでは、免疫応答導入遺伝子の１つ以上の発現は、遍在性プロモーターによって駆動される。

【0013】

[0013] 特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、又は両方を含むがこれらに限定されない１つ以上の免疫調節物質導入遺伝子を含む。

【0014】

[0014] 細胞、組織、器官、又は動物における臨床的に有効なレベルでのこれらの導入遺伝子の少なくとも６個の発現は、向上した免疫学適合性をもたらす。したがって、特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、６個以上の導入遺伝子、例えば、補体応答、凝固応答、炎症応答、免疫遺伝子、及び免疫調節物質導入遺伝子からなる群から選択される６、７、８、９、１０、１１、又は１２個の導入遺伝子を含む。これらの実施形態の特定のものでは、細胞、組織、器官、又は動物は、各カテゴリーからの少なくとも１つの導入遺伝子を含むことができる。他の実施形態では、導入遺伝子の特定のカテゴリーは除外され得る。特定の実施形態では、補体応答、凝固応答、炎症応答、免疫応答、及び／又は免疫調節物質導入遺伝子は、全て、検出可能な及び／又は臨床的に有効なレベルで同時に発現され得る。他の実施形態では、導入遺伝子の特定のサブセットのみが、特定の時点で又は特定のシグナルに応答して、臨床的に有効なレベルで発現され得る。これらの実施形態では、導入遺伝子の１つ以上の発現は、特定の時点で検出可能な及び／又は臨床的に有効なレベル未満に低下し得る。

【0015】

[0015] 特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、導入遺伝子ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、及びＴＦＰＩを含む。

【0016】

[0016] 特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、導入遺伝子ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、及びＴＦＰＩを含む。

【0017】

[0017] 特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、導入遺伝子ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１を含む。

【0018】

[0018] 本明細書に参照されるタンパク質又は遺伝子は、以下の表によるものであり得る。配列は、参照により組み込まれる。

【0019】

【表1】

【0020】

【表2】

【0021】

[0019] 特定の実施形態では、本明細書に開示する単離された細胞、組織、器官、及び動物は、補体応答遺伝子、凝固応答遺伝子、炎症応答遺伝子、免疫応答遺伝子、及び／又は、免疫調節物質遺伝子に対する１つ以上の改変をさらに含む。例えば、細胞、組織、器官、又は動物がブタである特定の実施形態では、細胞、組織、器官、又は動物は、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）遺伝子の変更（ある場合に、遺伝子のヒト化をもたらす変更を含む）を含むことができる。

【0022】

[0020] 特定の実施形態では、本明細書に開示する細胞、組織、器官、及び動物は、遺伝子の他のカテゴリーに対する１つ以上の改変をさらに含む。これらの改変には、例えば、遺伝子の全部若しくは一部の欠失又は切除（即ち、ノックアウト）、又は任意の他の不活性化、破壊、若しくは変更が含まれ得る。例えば、特定の実施形態では、細胞、組織、器官、及び動物は、アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）のノックアウト、不活性化、又は破壊を含むことができる。特定の実施形態では、細胞、組織、器官、及び動物は、低下した炭水化物抗原応答を示すように遺伝子改変され得る。例えば、細胞、組織、器官、又は動物は、１つ以上の炭水化物抗原産生遺伝子（例えば、糖タンパク質α－ガラクトシルトランスフェラーゼ１（ＧＧＴＡ）、β１，４ Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ））のノックアウト、不活性化、又は破壊を含むことができる。

【0023】

[0021] 特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、導入遺伝子ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、及びＴＦＰＩを含み、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、及びＣＭＡＨのノックアウト、不活性化、又は破壊をさらに含む。特定の実施形態では、単離された細胞、組織、器官、及び動物は、導入遺伝子ＣＤ５９及びＢ２Ｍをさらに含み、それらの実施形態の特定のものでは、単離された細胞、組織、器官、及び動物は、導入遺伝子Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１をさらに含む。特定の実施形態では、これらの細胞、組織、器官、及び動物は、低下した炭水化物抗原応答、並びに向上した凝固、補体、炎症性、及び／又は免疫応答を含む、向上した免疫学的適合性を示す。

【0024】

[0022] いくつかの実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物は、ブタ、即ち、ブタ細胞、ブタ組織、ブタ器官、若しくは豚又はその子孫である。これらの実施形態の特定のものでは、細胞、組織、器官、又は動物は、ブタ内因性レトロウイルスを含まない（「ＰＥＲＶ非含有」）。これらの実施形態の特定のものでは、「ＰＥＲＶ非含有」細胞、組織、器官、又は動物は、異種指向性ＰＥＲＶビリオンを生成しない。これらの実施形態の特定のものでは、「ＰＥＲＶ非含有」細胞、組織、器官、又は動物は、ＰＥＲＶビリオンを生成しない。これらの実施形態の特定のものでは、「ＰＥＲＶ非含有」細胞、組織、器官、又は動物は、感染性ＰＥＲＶビリオンを生成しない。これらの実施形態の特定のものでは、ＰＥＲＶ非含有細胞、組織、器官、及び動物は、導入遺伝子ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、及びＴＦＰＩを含み、場合により、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、及び／又はＣＭＡＨのノックアウト、不活性化、又は破壊をさらに含む。他の実施形態では、ＰＥＲＶ非含有細胞、組織、器官、及び動物は、導入遺伝子ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、及びＴＦＰＩを含み、場合により、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、及び／又はＣＭＡＨのノックアウト、不活性化、又は破壊をさらに含む。さらに他の実施形態では、ＰＥＲＶ非含有細胞、組織、器官、及び動物は、導入遺伝子ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１を含み、場合により、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、又はＣＭＡＨのノックアウト、不活性化、又は破壊をさらに含む。

【0025】

[0023] 本明細書に提供される単離された細胞及び組織の特定の実施形態では、細胞又は組織は、腎臓又は肝臓の細胞又は組織である。本明細書に提供される単離された器官の特定の実施形態では、器官は、腎臓又は肝臓である。

【0026】

[0024] 別の態様では、本開示は、炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、免疫調節物質導入遺伝子、又はそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも２つのタイプの複数の導入遺伝子を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、前記複数の導入遺伝子は、炎症応答導入遺伝子、免疫応答導入遺伝子、免疫調節物質導入遺伝子、又はそれらの組合せからなる群から選択される３つのタイプを含む。いくつかの態様では、本開示は、複数の導入遺伝子を含むベクターを提供し、前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの炎症応答導入遺伝子、少なくとも１つの免疫応答導入遺伝子、及び少なくとも１つの免疫調節物質導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、炎症応答導入遺伝子は、Ａ２０、ＨＯ－１、ＣＤ４７、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫応答導入遺伝子は、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫調節物質導入遺伝子は、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの凝固応答導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、凝固応答導入遺伝子は、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、及びそれらの組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記複数の導入遺伝子は、少なくとも１つの補体応答導入遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、補体応答導入遺伝子は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0027】

[0025] 他の態様では、本開示は、本明細書に提供される細胞、組織、器官、又は動物を生産するために、細胞、組織、器官、又は動物を遺伝子改変するのに使用されるベクター（例えば、１つ以上の補体応答、凝固応答、炎症応答、免疫応答、及び／又は免疫調節物質導入遺伝子を挿入する（即ち、ノックインする）ためのベクターを含む）を提供する。これらの実施形態の特定のものでは、ベクターは、導入遺伝子の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、又は１２個を含む。これらの実施形態のいくつかでは、導入遺伝子の少なくとも６個は、単一の遺伝子座から発現される。細胞、組織、器官、又は動物を生産するために、本明細書に提供される細胞、組織、器官、又は動物を遺伝子改変するのに使用される他の構成要素（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はエンドヌクレアーゼなどのＣＲＩＳＰＲベースの編集構成要素を含む）も、本明細書に提供される。

【0028】

[0026] 特定の実施形態では、本明細書に提供されるベクターは、導入遺伝子ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、及びＴＦＰＩを含む。これらの実施形態の特定のものでは、ベクターは、導入遺伝子ＣＤ５９及びＢ２Ｍをさらに含む。これらの実施形態の特定のものでは、ベクターは、導入遺伝子Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１をさらに含み、これらの実施形態の特定のものでは、ベクターは、図１７～２０、３１、又は４８～５０に示す構成要素を含む。特定の実施形態では、ベクターは、配列番号２１２～２１４のいずれかに示す配列を含む。

【0029】

[0027] 特定の実施形態では、本明細書に提供される単離された細胞、組織、器官、及び動物の作製方法も本明細書に提供される。これらの実施形態の特定のものでは、方法は、本明細書に提供されるベクターの１つ以上を導入することを含む。したがって、特定の実施形態では、本明細書に提供される細胞、組織、器官、及び動物は、本明細書に開示するベクターの１つ以上を含む。

【0030】

[0028] いくつかの実施形態では、本明細書に開示及び記載される方法は、転位を介した単一コピーポリシストロン性導入遺伝子組込み、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を介した一／二対立遺伝子部位特異的組込み、ゲノム置換、内因性遺伝子ヒト化、又はそれらの任意の組合せを含む。

【0031】

[0029] 作製される細胞、組織、器官、及び動物がブタである、本明細書に提供される方法の特定の実施形態では、方法は、１つ以上のＰＥＲＶ遺伝子、例えばＰＥＲＶ ｐｏｌをノックアウト又は別様に破壊若しくは不活性化することをさらに含み、これらの実施形態の特定のものでは、得られたブタ細胞、組織、器官、又は動物は、ＰＥＲＶを含まない。

【0032】

[0030] 別の態様では、本開示は、豚のものではない血液に曝露された際に、減少した肝臓損傷及び／又は安定な凝固を有する遺伝子導入豚肝臓を提供し、ここで減少した肝臓損傷は、胆汁産生、１つ以上の代謝酵素、及び／又は１つ以上の血清電解質のレベルを決定することにより評価され、安定な凝固は、プロトロンビン時間（ＰＴ）及び国際標準化比（ＰＴ－ＮＩＲ）、フィブリノーゲンレベル（ＦＩＢ）、及び／又はより低い活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）のレベルを決定することにより評価される。いくつかの実施形態では、代謝酵素は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びアルブミン（ＡＬＢ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、血清電解質は、カリウム（Ｋ）及び／又はナトリウム（Ｎａ）である。

【0033】

[0031] いくつかの実施形態では、本明細書に開示及び記載される遺伝子導入豚肝臓は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びアルブミン（ＡＬＢ）からなる群から選択される天然代謝酵素を含む。

【図面の簡単な説明】

【0034】

図面の簡単な説明

【図1A】[0032]補体因子３ノックアウト（「Ｃ３－ＫＯ」）豚の遺伝子型決定の結果を示すチャートである。導入された欠失のサイズを示す。

【図1B】[0032]補体因子３ノックアウト（「Ｃ３－ＫＯ」）豚の遺伝子型決定の結果を示すチャートである。インデルの位置を示す。

【図1C】[0032]補体因子３ノックアウト（「Ｃ３－ＫＯ」）豚の遺伝子型決定の結果を示すチャートである。生成されたインデル（配列番号２５３～２８９）の配列を列挙する。

【図2】[0033]ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３遺伝子を含む遺伝子座がｌｏｘＰ部位に隣接している、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（「ＭＨＣクラスＩ」）置換戦略を描写するスキームのブロック図である。

【図3A】[0034]主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩノックアウト（「ＭＨＣＩＩ－ＫＯ」）豚遺伝子型、特にＭＨＣＩＩ遺伝子ＤＱＡの遺伝子型決定の結果を示すチャートである。アンプリコンの位置１２６及び１２７に１ｂｐの２つの挿入を有する位置及びサイズ及びインデルを示す。

【図3B】[0034]主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩノックアウト（「ＭＨＣＩＩ－ＫＯ」）豚遺伝子型、特にＭＨＣＩＩ遺伝子ＤＱＡの遺伝子型決定の結果を示すチャートである。挿入の１つの位置を示す。

【図4A】[0035]別のＭＨＣクラスＩＩ－ＫＯ豚遺伝子型、特にＭＨＣＩＩ遺伝子ＤＲＡの遺伝子型決定の結果を示すチャートである。アンプリコンの位置１０６及び１０７に１ｂｐの２つの挿入を有する位置及びサイズ及びインデルを示す。

【図4B】[0035]別のＭＨＣクラスＩＩ－ＫＯ豚遺伝子型、特にＭＨＣＩＩ遺伝子ＤＲＡの遺伝子型決定の結果を示すチャートである。挿入の１つ（配列番号２９０～３２７）の位置を示す。

【図5】[0036]ＭＨＣＩＩ－ＫＯ豚（「Ｈ３－９Ｐ０１」）及び野生型（「ＷＴ」）豚の蛍光補助細胞選別（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す６つのチャートを含む。

【図6】[0037]ＭＨＣＩＩ－ＫＯ表現型に関連する１つ以上の表現型を描写する一連の画像である。

【図7】[0038]ＰＤ－Ｌ１遺伝子を変更するためのスキームを示す一連のブロック図である。

【図8】[0039]２つのアンプリコンを用いてｑＰＣＲにより測定したＰＤ－Ｌ１の発現を示すチャートである。

【図9】[0040]ブタ（配列番号３２９）及びヒト（配列番号３２８）ｖＷＦタンパク質のアラインメントを示す配列表である。Ａ１ドメインはボックス中で強調されているが、隣接領域中の潜在的なグリコシル化部位はダッシュで標識されている。ｐｖＷＦにおいて削除されたヒト特異的残基は、水平線で標識されている。ヒト化されたＡ１及び隣接領域は、半分の括弧で標識されている。

【図10】[0041]ｐｖＷＦ及び２つのｓｇＲＮＡ（配列番号５及び６）を標的とする相同組換え修復（「ＨＤＲ」）ベクターの設計を示す。

【図11】[0042]ＳｐｈＩ及びＢｓｐＥＩ消化によるＨＤＲのスクリーニング結果を示す。

【図12A】[0043]ｖＷＦが標的化された（配列番号３３０～３３３）図１１から得られた二対立遺伝子ＨＤＲクローンのシーケンシング結果を示す。両方のシーケンシング結果のクロマトグラフィーを、オーバーラップする配列の１つのラインを用いて説明する。ヒト化Ａ１及び隣接領域は、半分の括弧で標識される。

【図12B】[0043]ｖＷＦが標的化された（配列番号３３０～３３３）図１１から得られた二対立遺伝子ＨＤＲクローンのシーケンシング結果を示す。両方のシーケンシング結果のクロマトグラフィーを、オーバーラップする配列の１つのラインを用いて説明する。ヒト化Ａ１及び隣接領域は、半分の括弧で標識される。

【図13】[0044]剪断応力によって誘導され、ＷＴ（ブタＡ１ドメイン）又はＨＤＲ標的化（ヒトＡ１ドメイン）豚から単離された血小板について光透過によってモニターされた種特異的血小板凝集応答を示すグラフである。

【図14】[0045]ブタＭＨＣクラスＩ遺伝子座の概略図である。全ての古典的ＭＨＣＩ遺伝子は色分けされている。ＭＨＣＩ遺伝子のＵＴＲのすぐ隣にある独特の隣接領域を緑の括弧で標識する。これらの領域から選択された４つの高度に活性なｓｇＲＮＡ（配列番号１～４）も示される。

【図15】[0046]図１４のｓｇＲＮＡを用いて誘導されたＭＨＣＩ古典的クラスターの断片的欠失を示す。図１５Ａは、ｓｇＲＮＡトランスフェクト細胞の集団におけるＭＨＣＩ ５’、３’及び５’－３’欠失接合部の独特の領域にわたるＰＣＲアンプリコンを示す。図１５Ｂは、５’－３’接合ＰＣＲがＴＯＰＯクローニングされ、シーケンシング結果がＭＨＣ５’＿ｓｇ１及びＭＨＣ３’＿ｓｇ２によって生成された予想されるＭＨＣＩ ５’－３’接合部に整列されたことを示す（配列番号３３５～３４３）。

【図16】[0047]ブタ特異的ＳＬＡ－１抗体を用いたＭＨＣＩ陰性細胞の濃縮を示す。

【図17】[0048]本明細書に開示及び記載される実施形態による、複数の導入遺伝子（例えば、ヒト化導入遺伝子）を発現するための導入遺伝子発現ベクターを示す。ペイロード５（Ｐｉｇ ２．１）：１２個の導入遺伝子、遍在性発現。

【図18】[0049]本明細書に開示及び記載される実施形態による、複数の導入遺伝子（例えば、ヒト化導入遺伝子）を発現するための導入遺伝子発現ベクターを示す。ペイロード９（Ｐｉｇ ２．２）：１２の導入遺伝子、内皮特異性。

【図19】[0050]本明細書に開示及び記載される実施形態による、複数の導入遺伝子（例えば、ヒト化導入遺伝子）を発現するための導入遺伝子発現ベクターを示す。ペイロード１０（Ｐｉｇ ２．３）：１２の導入遺伝子、内皮／島特異性。

【図20】[0051]本明細書に開示及び記載される実施形態による、複数の導入遺伝子（例えば、ヒト化導入遺伝子）を発現するための導入遺伝子発現ベクターを示す。ペイロード１０－Ｅｘｏ（Ｐｉｇ ２．４）：１２の導入遺伝子、内皮／島特異性、膵外分泌腺切除を有する。

【図21】[0052]本明細書に記載される遺伝子操作されたソースドナー豚の系統を示す概略図である。

【図22】[0053]ヒト組織との増強された適合性を有する遺伝子操作された豚線維芽細胞が、ヒト抗体に対する有意に減少した結合親和性を示すことを示す。

【図23】[0054]本明細書に記載される遺伝子操作された豚初代線維芽細胞又は内皮細胞からの組織特異的ｍＲＮＡ発現を示す。図２３Ａは、分子クローニング技術を用いて組み立てられた遺伝子導入構築物の概略図である。ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９カセットを、遍在性ＥＦ１αプロモーターの制御下に配置し、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、及びＣＤ４７カセットを、遍在性ＣＡＧプロモーターの制御下に配置し、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＨＯ－１カセットを、島特異的ＮｅｕｒｏＤプロモーターの制御下に配置し、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、及びＣＤ３９カセットを、内皮特異的ＩＣＡＭ２プロモーターの制御下に配置した。遺伝子導入構築物をブタ初代線維芽細胞（図２３Ｂ）又は不死化ブタ大動脈内皮細胞株（ＰＥＣ－Ａ）（図２３Ｃ）に電気穿孔し、ｍＲＮＡ発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって決定した。

【図24】[0055]Ｐｉｇ ２．０（「３ＫＯ＋１２ＴＧ」）脾臓及び線維芽細胞における導入遺伝子タンパク質発現を示す。

【図25】[0056]ヒト細胞との適合性が増強された遺伝子操作された豚線維芽細胞が、有意に低いレベルの補体媒介細胞死を示したことを示す。

【図26】[0057]図２６は、ヒトＨＬＡ－Ｅを発現するように遺伝子操作された豚線維芽細胞がＮＫ媒介溶解に対する感受性の低下を示すことを示す。

【図27】[0058]ＧＧＴＡＫＯ＋ＣＤ５５ＫＩ豚に由来する内皮細胞がトロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ（ＴＡＴ）複合体の形成の減少を示すことを示す。

【図28】[0059]４－７匹の豚から分離され、ヒト血液で潅流された肝臓が野生型（ＷＴ）肝臓と比較して、増加した胆汁産生を有することを示す。

【図29】[0060]４－７匹の豚から分離され、ヒト血液で潅流された肝臓がＷＴ肝臓と比較して、肝臓損傷及び血清電解質レベルのマーカーによって評価されるように、改善された肝臓機能を有することを示す。

【図30】[0061]４－７匹の豚から分離され、ヒト血液で潅流された肝臓がＷＴ肝臓と比較して改善された凝固を有することを示す。

【図31】[0062]本明細書に開示及び記載される実施形態による導入遺伝子発現ベクターを示す。ペイロード１３（Ｐｉｇ ２．５）：１０個の導入遺伝子、バイシストロン性。

【図32A】[0063]ペイロード９ドナー豚から分離された腎臓を移植した宿主サルが安定した血清クレアチニンレベルを示すことを示す。

【図32B】[0063]ペイロード１０ドナー豚から分離された腎臓を移植した宿主サルが安定した血清クレアチニンレベルを示すことを示す。

【図33A】[0064]ペイロード９ドナー豚から分離した腎臓を移植した宿主サルにおけるヘマトクリットレベルを示す。

【図33B】[0064]ペイロード１０ドナー豚から分離した腎臓を移植した宿主サルにおけるヘマトクリットレベルを示す。

【図34A】[0065]ペイロード９ドナー豚から分離した腎臓を移植した宿主サルにおける血小板数を示す。

【図34B】[0065]ペイロード１０ドナー豚から分離した腎臓を移植した宿主サルにおける血小板数を示す。

【図35A】[0066]ペイロード９ドナー豚から分離した腎臓を移植した宿主サルにおける白血球（ＷＢＣ）数の変動を示す。

【図35B】[0066]ペイロード１０ドナー豚から分離した腎臓を移植した宿主サルにおける白血球（ＷＢＣ）数の変動を示す。

【図36】[0067]補体及び細胞毒性遺伝子がペイロード９及びペイロード１０豚から収集されたサンプルにおいて発現されることを示す、ＲＮＡｓｅｑ発現データを示す。

【図37】[0068]ペイロード５、ペイロード９、及びペイロード１０豚から収集されたサンプルにおいて発現された補体及び細胞毒性タンパク質を示すＦＡＣＳデータを示す。

【図38A】[0069]豚からヒヒへの同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）後の臨床検査を示す。

【図38B】[0069]豚からヒヒへの同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）後の臨床検査を示す。

【図38C】[0069]豚からヒヒへの同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）後の臨床検査を示す。

【図38D】[0069]豚からヒヒへの同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）後の臨床検査を示す。

【図38E】[0069]豚からヒヒへの同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）後の臨床検査を示す。

【図38F】[0069]豚からヒヒへの同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）後の臨床検査を示す。

【図38G】[0069]豚からヒヒへの同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）後の臨床検査を示す。

【図38H】[0069]豚からヒヒへの同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）後の臨床検査を示す。

【図38I】[0069]豚からヒヒへの同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）後の臨床検査を示す。

【図39A】[0070]ＯＬＴｘ由来のＨ＋Ｅ染色肝臓サンプルの代表的な画像である。

【図39B】[0070]ＯＬＴｘ由来のＨ＋Ｅ染色肝臓サンプルの代表的な画像である。

【図39C】[0070]ＯＬＴｘ由来のＨ＋Ｅ染色肝臓サンプルの代表的な画像である。

【図39D】[0070]ＯＬＴｘ由来のＨ＋Ｅ染色肝臓サンプルの代表的な画像である。

【図39E】[0070]ＯＬＴｘ由来のＨ＋Ｅ染色肝臓サンプルの代表的な画像である。

【図39F】[0070]ＯＬＴｘ由来のＨ＋Ｅ染色肝臓サンプルの代表的な画像である。

【図40A】[0071]遺伝子組換え豚肝臓のヒト全血によるｅｘ ｖｉｖｏ異種潅流後の臨床検査を示す。

【図40B】[0071]遺伝子組換え豚肝臓のヒト全血によるｅｘ ｖｉｖｏ異種潅流後の臨床検査を示す。

【図40C】[0071]遺伝子組換え豚肝臓のヒト全血によるｅｘ ｖｉｖｏ異種潅流後の臨床検査を示す。

【図40D】[0071]遺伝子組換え豚肝臓のヒト全血によるｅｘ ｖｉｖｏ異種潅流後の臨床検査を示す。

【図40E】[0071]遺伝子組換え豚肝臓のヒト全血によるｅｘ ｖｉｖｏ異種潅流後の臨床検査を示す。

【図41A】[0072]異種潅流豚肝臓のＨ＋Ｅ染色の代表的な画像である。

【図41B】[0072]異種潅流豚肝臓のＨ＋Ｅ染色の代表的な画像である。

【図41C】[0072]異種潅流豚肝臓のＨ＋Ｅ染色の代表的な画像である。

【図41D】[0072]異種潅流豚肝臓のＨ＋Ｅ染色の代表的な画像である。

【図41E】[0072]異種潅流豚肝臓のＨ＋Ｅ染色の代表的な画像である。

【図41F】[0072]異種潅流豚肝臓のＨ＋Ｅ染色の代表的な画像である。

【図41G】[0072]異種潅流豚肝臓のＨ＋Ｅ染色の代表的な画像である。

【図41H】[0072]異種潅流豚肝臓のＨ＋Ｅ染色の代表的な画像である。

【図42】[0073]ＧａｌＴＫＯ．ｈＣＤ５５肺と比較して、ヒト血液で潅流された「未処置」Ｐｉｇ ２．０（「３ＫＯ＋１２ＴＧ」）肺において、肺血管抵抗（ＰＶＲ）上昇が有意に減弱され、遅延されたことを示す。

【図43A】[0074]ヒトＴ細胞へのヒト血清のパネルの結合を示し、高ＰＲＡ血清は、低ＰＲＡよりもヒト細胞を染色する可能性が高い。

【図43B】[0074]ブタＴ細胞へのヒト血清のパネルの結合を示す。低ＰＲＡ患者及び高ＰＲＡ患者の両方由来の血清は、ブタ標的に対する高いレベルの結合を示す。

【図43C】[0074]ヒトＢ細胞へのヒト血清のパネルの結合を示し、高ＰＲＡ血清は、低ＰＲＡよりもヒト細胞を染色する可能性が高い。

【図43D】[0074]ブタＢ細胞へのヒト血清のパネルの結合を示す。低ＰＲＡ患者及び高ＰＲＡ患者の両方由来の血清は、ブタ標的に対する高いレベルの結合を示す。

【図44】[0075]高ＰＲＡヒト血清のパネルが野生型細胞（ＷＴ ｐＡＥＣ）と比較して、遺伝子改変ブタ大動脈内皮細胞（Ｐｉｇ ２．０（「３ＫＯ＋１２ＴＧ」）ｐＡＥＣ）への有意に低いレベルの結合を示すことを示す。Ｐｉｇ ２．０細胞は、ａＧａｌ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、及びＳｄａを欠いている。

【図45A】[0076]様々な時点で、腎臓異種移植レシピエント動物から採取した血清によるＰｉｇ ２．０（「３ＫＯ＋１２ＴＧ」）ｐＡＥＣの染色を示す。移植後に採取した血清サンプルは、結合レベルの低下、特に肝臓異種移植後の結合レベルの低下を示す。

【図45B】[0076]様々な時点で、心臓異種移植レシピエント動物から採取した血清によるＰｉｇ ２．０（「３ＫＯ＋１２ＴＧ」）ｐＡＥＣの染色を示す。移植後に採取した血清サンプルは、結合レベルの低下、特に肝臓異種移植後の結合レベルの低下を示す。

【図45C】[0076]様々な時点で、肝臓異種移植レシピエント動物から採取した血清によるＰｉｇ ２．０（「３ＫＯ＋１２ＴＧ」）ｐＡＥＣの染色を示す。移植後に採取した血清サンプルは、結合レベルの低下、特に肝臓異種移植後の結合レベルの低下を示す。

【図46A】[0077]ヒト血清の野生型（ＷＴ）及びＰｉｇ ２．０（「３ＫＯ＋１２ＴＧ」）ｐＡＥＣへの結合を、ＩｄｅＳ処理の前後で示す。ＩｄｅＳは、ヒト及びカニクイザルのＩｇＧ結合を効果的に減少させる一方で、無傷のＩｇＭの結合には影響を及ぼさない。

【図46B】[0077]ヒト血清のｐＡＥＣへの結合を、ＩｄｅＳ処理の前後で示す。ＩｄｅＳは、ヒト及びカニクイザルのＩｇＧ結合を効果的に減少させる一方で、無傷のＩｇＭの結合には影響を及ぼさない。

【図46C】[0077]カニクイザル血清のｐＡＥＣへの結合を、ＩｄｅＳ処理の前後で示す。ＩｄｅＳは、ヒト及びカニクイザルのＩｇＧ結合を効果的に減少させる一方で、無傷のＩｇＭの結合には影響を及ぼさない。

【図47】[0078]本明細書に開示及び記載される実施形態（配列番号３４４及び３４５）による導入遺伝子発現ベクターを示す。ペイロード１２Ｆ：１２個の導入遺伝子。

【図48】[0079]本明細書に開示及び記載される実施形態による導入遺伝子発現ベクターを示す。ペイロード１２Ｇ：１２個の導入遺伝子。

【図49】[0080]本明細書に開示及び記載される実施形態による導入遺伝子発現ベクターを示す。ペイロード１３Ａ：１０個の導入遺伝子。

【図50】[0081]補体及び細胞毒性遺伝子の発現を実証するＲＮＡｓｅｑの結果を示す。

【図51A】[0082]ＣＲＩＳＰＲ遺伝子ノックアウト及びＰｉｇｇｙＢａｃ組込みのためのスキームを示す。ＧＧＴＡ１遺伝子の２コピー、ＣＭＡＨ遺伝子の２コピー及びＢ４ＧＡＬＮＴ２遺伝子の４コピーを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて３ＫＯを作製し、Ｐｉｇ ２．０におけるＰＥＲＶのコピー（「３ＫＯ＋９ＴＧ」）を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いてＰＥＲＶ－ＫＯ細胞を作製した。ＰｉｇｇｙＢａｃ媒介ランダム組込みを用いて、９個の導入遺伝子を豚ゲノムに挿入した。導入遺伝子は３カセットで発現し、各カセットはブタ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチドによって連結した３遺伝子を発現した。

【図51B】[0083]ＧＧＴＡ１（配列番号３４６～３４８）、ＣＭＡＨ（配列番号３４９～３５１）、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２（配列番号３５２～３５６）ノックアウトのシーケンシングの結果を示す。全ゲノム配列解析は、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）とＰｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）では、ｉ）ＧＧＴＡ１遺伝子は１つの対立遺伝子に－１０ｂｐ欠失と別の遺伝子に導入遺伝子ベクター挿入を有し、ｉｉ）ＣＭＡＨ遺伝子は１つの対立遺伝子に－３９１ｂｐ欠失と別の対立遺伝子に２ｂｐ（ＡＡ）挿入を有し、ｉｉｉ）Ｂ４ＧＡＬＮＴ２はＢ４ＧＡＬＮＴ２遺伝子の４つの対立遺伝子のそれぞれに－１３、－１４、－１３、－１４を有することを明らかにした。全ての改変はｇＲＮＡ標的部位で起こり、このことは、改変が使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオンターゲット活性によって媒介されることを示す。

【図51C】[0084]ＰＥＲＶノックアウトのシーケンシング分析の結果を示す。Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）（約２，０００Ｘ）及び３．０（約２０，０００Ｘ）についての生の読み取りを、概略的なＰＥＲＶ遺伝子構造の下に示す。読み取りは、それらの配列組成によってグループ化され、それらのカバレッジに比例して示される。カバレージトラックにおける赤、青、緑及びオレンジの垂直線は、それぞれ、参照対立遺伝子からＴ、Ｃ、Ａ、Ｇへの単一ヌクレオチド変化を表す。

【図51D】[0085]９ＴＧ組込みのＰＣＲ分析を示す。Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及びＰｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）の導入遺伝子組込みは、ＰＣＲによりゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）レベルで検証されている。ＰＣＲゲル画像は、Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０胎児線維芽細胞由来のｇＤＮＡにおける９個のヒト導入遺伝子の存在を示すが、ＷＴ豚胎児線維芽細胞及びＮＴＣ（ｇＤＮＡの添加なし）群は陰性対照の役割を果たす。

【図51E】[0086]Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及び３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）細胞についての正常核型を示す。Ｐｉｇ ２．０（Ａ）及びＰｉｇ ３．０（Ｂ）線維芽細胞をギムザ染色に基づくＧバンド法を用いて核型分析した。ＳｍａｒｔＴｙｐｅソフトウエアを用いて中期スプレッドを分析した。Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０の両方は、正常な［３６＋ＸＹ］核型を示す。

【図52A】[0087]９個の導入遺伝子の発現のヒートマップを示す。導入遺伝子発現は、ＨＵＶＥＣ内皮、ＰＵＶＥＣ内皮、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）ＰＵＶＥＣ内皮、Ｐｉｇ ２．０耳線維芽細胞及びＰｉｇ３．０胎児線維芽細胞におけるＲＮＡ－Ｓｅｑにより測定した。各行は１つの導入遺伝子を表し、各列は１つのサンプルを表す。発現レベルは、低－中－高を表すために青－黄－赤でコード化されて着色される。各サンプルについての組織タイプ及びペイロード情報は、カラーバーとしてヒートマップの上部にラベル付けされる。

【図52B】[0088]ＦＡＣＳによる３ＫＯ及び９ＴＧ発現の分析を示す。Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及びＰｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）の遺伝子改変（ＫＯ及びＴＧ）は、ＦＡＣＳによってタンパク質レベルで検証されている。Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣは、ｈＣＤ３９（ヒト内因性よりも高い）及びｈＴＨＢＤ（ヒト内因性よりも低い）を除いて、一般的にヒト内因性（ＨＵＶＥＣ）と同等のＴＧ発現レベルを示す。

【図52C】[0089]３ＫＯ及び９ＴＧ発現の免疫蛍光分析を示す。Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及びＰｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）の遺伝子改変（ＫＯ及びＴＧ）は、免疫蛍光法（ＩＦ）により腎臓凍結切片のタンパク質レベルで検証されている。

【図53A】[0090]Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及び３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）細胞へのヒト抗体の結合を示す。Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣは、それらのＷＴ対応物と比較して、ヒトＩｇＧ及びＩｇＭへの抗体結合を実質的に減弱させる。プールしたヒト血清のＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣ（陽性対照）への抗体結合を、それぞれＦＡＣＳによって測定した。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図53B】[0091]ＷＴ豚、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）、Ｐｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及びＨＵＶＥＣ細胞に対する補体毒性を示す。Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣは、ＨＵＶＥＣと比較して同等の抗体依存性補体毒性を示し、これはＷＴ ＰＵＶＥＣと比較して有意に低い。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝４）を示す。

【図53C】[0092]ＷＴ豚、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）、Ｐｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及びＨＵＶＥＣ細胞に対するＮＫ媒介細胞毒性を示す。Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣは、それらのＷＴ対応物と比較して有意に低いＮＫ媒介細胞毒性を明らかにする。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。

【図53D】[0093]ヒトマクロファージによるＰｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及び３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）脾細胞の食作用を示す。Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０の脾細胞は、ヒトマクロファージ細胞株による食作用の低下を示す。ＣＦＳＥ標識Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０脾細胞（標的細胞、Ｔ）を、ＣＤ１１ｂ標識ヒトマクロファージ細胞株（エフェクター細胞、Ｅ）とそれぞれ３７℃で４時間インキュベートした。２つの異なるＥ：Ｔ比、１：１及び１：５を行った。ＣＦＳＥで標識した標的の食作用をＦＡＣＳで測定した。ＦＡＣＳでは、非食作用性マクロファージの領域が左上四分円（Ｑ１）に、食作用性マクロファージの領域が右上四分円（Ｑ２）に示されている。食作用活性は、Ｑ２／（Ｑ１＋Ｑ２）×１００％として計算した。

【図53E】[0094]ＷＴ豚、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）、Ｐｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及びＨＵＶＥＣ細胞によるトロンビン－アンチトロンビン（ＴＡＴ）形成のレベルを示す。Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣは、示された時間のヒト全血とのインキュベーション時に、ＨＵＶＥＣと同等の、ＷＴ ＰＵＶＥＣよりも有意に低い、非常に低いレベルのトロンビン－アンチトロンビン（ＴＡＴ）形成を媒介する。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝４）を示す。

【図53F】[0095]ＣＤ３９導入遺伝子のＡＤＰａｓｅ活性を示す。Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及びＰｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）ＰＵＶＥＣは、ＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣと比較して有意に高いＣＤ３９ ＡＤＰａｓｅ生化学活性を示す。（Ａ）ヒト導入遺伝子ＣＤ３９ ｍＲＮＡは、Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０において内因性ＣＤ３９よりも高発現している。（Ｂ）ＦＡＣＳは、Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０がＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣよりも高いヒトＣＤ３９タンパク質発現を有することを明らかにした。（Ｃ）Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０ＰＵＶＥＣは、ＡＤＰとともにインキュベートした場合のリン酸濃度によって測定されるように、ＣＤ３９の有意に高いＡＤＰａｓｅ生化学活性を有する。より高いＣＤ３９ ＡＤＰａｓｅ生化学活性は、Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０におけるそのより高いＣＤ３９タンパク質発現レベルと一致する。エラーバーは標準偏差（ｎ＝６）を示す。

【図53G】[0096]３．０細胞におけるＴＦＰＩ機能を示す。活性化Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）及びＰｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）ＰＵＶＥＣは、細胞表面にヒトＴＦＰＩを発現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣと比較して、ヒトＸａへの有意に高い結合能を示す。（Ａ）ＲＮＡ‐Ｓｅｑは、Ｐｉｇ ２．０ ＰＵＶＥＣがＨＵＶＥＣにおいてその内因性レベルよりも多くのヒトＴＦＰＩを発現し、ＷＴ ＰＵＶＥＣにおいてブタＴＦＰＩレベルを発現することを明らかにした（ｎ＝２）。（Ｂ）活性化Ｐｉｇ ２．０ＰＵＶＥＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣと比較して有意に高いＸａ結合能を示す。左パネル：標準曲線は、ヒト組換えＴＦＰＩ（ｒＴＦＰＩ）タンパク質の濃度と非結合Ｘａレベルとの間の線形回帰を測定する。右パネル：左の標準曲線を用いて非結合Ｘａレベルから予測されたｔＴＦＰＩレベルは、ＰＭＡ活性化の有無にかかわらず、Ｐｉｇ ２．０ＥＣ、ＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣにおけるＴＦＰＩ Ｘａ結合能を測定する。ＰＭＡ（１μＭ）：ＰＵＶＥＣとＨＵＶＥＣはＰＭＡにより６時間活性化され、これはｈＴＦＰＩのサイトゾルから細胞膜への移行を導いた。エラーバーは標準偏差（ｎ＝４）を示す。

【図54A】[0097]Ｐｉｇ １．０及び２．０豚（３ＫＯ＋９ＴＧ）の正常な表現型を示す。Ｐｉｇ １．０及びＰｉｇ ２．０は、ＷＴ豚と比較して、全血球数（Ａ）に関して同様の病態生理を示す。Ｐｉｇ １．０、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ豚のサンプル番号は、それぞれ１８、１６及び２１である。「ｎｏ ｓｉｇ」はスチューデントのｔ検定により、Ｐｉｇ １．０、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ群の間に統計的有意性がないことを示す。

【図54B】[0097]Ｐｉｇ １．０及び２．０豚（３ＫＯ＋９ＴＧ）の正常な表現型を示す。Ｐｉｇ １．０及びＰｉｇ ２．０は、ＷＴ豚と比較して、肝臓（Ｂ）に関して同様の病態生理を示す。Ｐｉｇ １．０、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ豚のサンプル番号は、それぞれ１８、１６及び２１である。「ｎｏ ｓｉｇ」はスチューデントのｔ検定により、Ｐｉｇ １．０、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ群の間に統計的有意性がないことを示す。

【図54C】[0097]Ｐｉｇ １．０及び２．０豚（３ＫＯ＋９ＴＧ）の正常な表現型を示す。Ｐｉｇ １．０及びＰｉｇ ２．０は、ＷＴ豚と比較して、心臓（Ｃ）に関して同様の病態生理を示す。Ｐｉｇ １．０、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ豚のサンプル番号は、それぞれ１８、１６及び２１である。「ｎｏ ｓｉｇ」はスチューデントのｔ検定により、Ｐｉｇ １．０、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ群の間に統計的有意性がないことを示す。

【図54D】[0097]Ｐｉｇ １．０及び２．０豚（３ＫＯ＋９ＴＧ）の正常な表現型を示す。Ｐｉｇ １．０及びＰｉｇ ２．０は、ＷＴ豚と比較して、腎臓機能（Ｄ）に関して同様の病態生理を示す。Ｐｉｇ １．０、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ豚のサンプル番号は、それぞれ１８、１６及び２１である。「ｎｏ ｓｉｇ」はスチューデントのｔ検定により、Ｐｉｇ １．０、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ群の間に統計的有意性がないことを示す。

【図54E】[0097]Ｐｉｇ １．０及び２．０豚（３ＫＯ＋９ＴＧ）の正常な表現型を示す。Ｐｉｇ １．０及びＰｉｇ ２．０は、ＷＴ豚と比較して、凝固機能（Ｅ）に関して同様の病態生理を示す。Ｐｉｇ １．０、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ豚のサンプル番号は、それぞれ１８、１６及び２１である。「ｎｏ ｓｉｇ」はスチューデントのｔ検定により、Ｐｉｇ １．０、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ群の間に統計的有意性がないことを示す。

【図55】[0098]ＰＥＲＶ－ＫＯのメンデル遺伝を示す。ＰＥＲＶ－ＫＯの遺伝子改変は、自然交配生産中にメンデル遺伝学に従って受け継がれる可能性がある。ｘ軸は、挿入の合計から欠失の合計を引いたものとして計算されたシフトされた塩基の総数を表す。ｙ軸は、読み取りのパーセントを表す。赤色及び緑色は、それぞれフレームシフトを示すか、又は示さない。１頭のＰｉｇ １．０豚が野生型Ｂａｍａ豚と交配し、１１頭の子豚を生んだ。子孫子豚１頭の肝臓、腎臓、心臓組織を、親の線維芽細胞とともにハイスループットＤＮＡシーケンシングにより分析して、ＰＥＲＶ－ＫＯ改変の遺伝を評価した。Ｐｉｇ １．０は、ノックアウトされるべきＰＥＲＶコピーの１００％を有しており、一方、ＷＴ豚は、ＷＴ長と同じサイズで約８０％のＰＥＲＶコピーを有している（挿入－欠失＝０）。注目すべきことに、ＷＴサンプル中の一部のＰＥＲＶコピーは機能していないか、又はＫＯを保有している可能性がある。対照的に、子孫豚の肝臓、腎臓及び心臓は、ノックアウトを保有する約５０％のみのＰＥＲＶコピーを有する。このパターンは組織間で類似しており、ＰＥＲＶ－ＫＯの改変は異なる組織間でメンデル遺伝学に従って安定して受け継がれることを示している。

【図56A】[0099]繁殖を通じた９ＴＧ構築物及び３ＫＯのメンデル遺伝を示す。Ｐｉｇ ２．０のこの反復の遺伝子改変（３ＫＯ及び９ＴＧ）は、ゲノムＤＮＡ（Ａ）、ｍＲＮＡ（Ｂ）及びタンパク質レベル（Ｃ）で検証されているように、自然交配生産を通してメンデル遺伝学に従って次世代に伝達することができる。本発明者らは、ＷＴ豚９頭をＰｉｇ ２．０と、３ＫＯ豚１１頭をＰｉｇ ２．０とそれぞれ交配し、Ｆ１子孫における３ＫＯ及び９ＴＧの存在を検出した。（Ａ）９ＴＧについては、Ｐｉｇ ２．０ｘＷＴ豚及びＰｉｇ ２．０ｘ３ＫＯ豚の子孫の約半数がゲノム中に導入遺伝子を保有している。ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ及びＢ４ＧＡＬＮＴ２については、Ｐｉｇ ２．０ Ｘ ＷＴ豚の子孫は全てヘテロ接合体ノックアウトであり、Ｐｉｇ ２．０ Ｘ ３ＫＯ豚の子孫は全てホモ接合体ノックアウトである。注目すべきことに、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２は、その高度に相同な偽遺伝子が含まれているため、４つの対立遺伝子を有するものとして解析された。

【図56B】[0099]繁殖を通じた９ＴＧ構築物及び３ＫＯのメンデル遺伝を示す。Ｐｉｇ ２．０のこの反復の遺伝子改変（３ＫＯ及び９ＴＧ）は、ゲノムＤＮＡ（Ａ）、ｍＲＮＡ（Ｂ）及びタンパク質レベル（Ｃ）で検証されているように、自然交配生産を通してメンデル遺伝学に従って次世代に伝達することができる。本発明者らは、ＷＴ豚９頭をＰｉｇ ２．０と、３ＫＯ豚１１頭をＰｉｇ ２．０とそれぞれ交配し、Ｆ１子孫における３ＫＯ及び９ＴＧの存在を検出した。（Ｂ）Ｐｉｇ ２．０ Ｘ ３ＫＯ豚の子孫の約半数（５／１１）が、そのｍＲＮＡ転写物中の９ＴＧに相当するｍＲＮＡを保有している。

【図56C】[0099]繁殖を通じた９ＴＧ構築物及び３ＫＯのメンデル遺伝を示す。Ｐｉｇ ２．０のこの反復の遺伝子改変（３ＫＯ及び９ＴＧ）は、ゲノムＤＮＡ（Ａ）、ｍＲＮＡ（Ｂ）及びタンパク質レベル（Ｃ）で検証されているように、自然交配生産を通してメンデル遺伝学に従って次世代に伝達することができる。本発明者らは、ＷＴ豚９頭をＰｉｇ ２．０と、３ＫＯ豚１１頭をＰｉｇ ２．０とそれぞれ交配し、Ｆ１子孫における３ＫＯ及び９ＴＧの存在を検出した。（Ｃ）ＦＡＣＳ分析により、Ｐｉｇ ２．０ Ｘ ３ＫＯ及びＰｉｇ ２．０ Ｘ ＷＴ豚の３ＫＯ及び９ＴＧの遺伝が、細胞表面グリカンの減少若しくは欠如、又はヒトタンパク質の存在として検証された。

【発明を実施するための形態】

【0035】

詳細な説明
Ｉ． 定義
[0100] 本明細書で使用される用語「豚（pig）」、「豚（swine）」及び「ブタ（porcine）」は、飼育豚、イノシシ（Sus scrofa）種の様々な品種に関するもの全てを互換的に指す。

【0036】

[0101] 用語「生物学的に活性な」は、タンパク質又はポリペプチドの断片又は誘導体を指すのに使用される場合、断片又は誘導体が、参照全長タンパク質又はポリペプチドの測定可能な及び／又は検出可能な少なくとも１つの生物学的活性を保持することを意味する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質の生物学的に活性な断片又は誘導体は、本明細書で時々、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも称されるｇＲＮＡに結合し、ガイドＲＮＡと複合体化した際に標的ＤＮＡ配列に結合し、及び／又は１つ以上のＤＮＡ鎖を切断することが可能であり得る。

【0037】

[0102] 用語「処置」、「処置している」、「軽減」などは、疾患、傷害又は障害の文脈において使用される場合、本明細書では一般に所望の薬理的及び／又は生理的効果を得ることを意味するように使用され、処置されている状態の１つ以上の症状の重症度を改善、軽減、及び／又は低減することを指すのにも使用され得る。効果は、疾患、状態若しくはその症状の開始また再発を完全に若しくは部分的に遅延させる点で予防的であり得、及び／又は、疾患又は状態、及び／又は疾患若しくは状態に起因し得る有害作用を部分的に又は完全に治癒する点で治療的であり得る。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患又は状態の任意の処置を包含し、（ａ）疾患若しくは状態に罹りやすい可能性があるが、未だそれを有すると診断されていない対象が、疾患若しくは状態が生じることを防ぐこと；（ｂ）疾患若しくは状態を阻害すること（例えば、その発生を阻止すること）；又は（ｃ）疾患若しくは状態を緩和すること（例えば、疾患又は状態の退行を引き起こし、１つ以上の症状の改善を提供すること）を含む。

【0038】

[0103] 用語「同時に」は、本明細書では、別の事象と同時に、例えば、別の事象の発生と比較した場合に、数秒以内、数ミリ秒以内、数マイクロ秒以内、又はそれ未満に起こる事象を指すのに使用される。

【0039】

[0104] 用語「ノックアウト」（「ＫＯ」）又は「ノッキングアウト」は、本明細書では、豚又は他の動物における、又は豚若しくは他の動物における任意の細胞における遺伝子の欠失、非活性化若しくは消失、又は欠損遺伝子を指すのに使用される。本明細書で使用されるＫＯは、遺伝子又はその一部の欠失、非活性化、若しくは消失を行う方法、又はそれらを行ったことも指し得る。

【0040】

[0105] 用語「ノックイン」（「ＫＩ」又は「ノッキングイン」は、本明細書では、豚又は他の動物における、又は豚若しくは他の動物における任意の細胞における遺伝子のヌクレオチドの追加、置換、又は変異を指すのに使用される。本明細書で使用されるＫＩは、遺伝子又はその一部のヌクレオチドの追加、置換、若しくは変異を行う方法、又はそれらを行ったことも指し得る。

【0041】

ＩＩ． 細胞、組織、器官、及び動物
[0106] ブタ異種移植片は、ヒトの器官のサイズ及び生理学に広く適合し、米国の一般集団に倫理的に受け入れられる。しかしながら、異種移植されたブタ組織は、以下を含む移植片拒絶に至る複雑な一連の事象を誘発する：豚抗原に対する予め形成された抗体の存在による超急性拒絶反応、補体の活性化及び凝固性亢進、並びに分子不適合による自然及び適応免疫応答の亢進。本開示は、異種移植の現在の欠点に対処するために遺伝子工学的アプローチを用いる。

【0042】

[0107] 特に、自然及び適応免疫機能を含む多くの免疫学的及び機能的課題が存在する。補体及び凝固を介した機能不全は、ドナーのブタ組織とヒトの生理機能との間の分子不適合により生じ、急性異種移植片不全につながる。α－１，３－ガラクトシル－ガラクトース（αＧａｌ）エピトープに対する予め形成された抗体は、補体の活性化を介して超急性移植片拒絶反応を開始させる。糖タンパク質α－ガラクトシルトランスフェラーゼ１遺伝子（ＧＧＴＡ１）の遺伝的不活性化は、この急速な移植片破壊を減少させることができる。ヒト補体制御タンパク質（ｈＣＲＰ）ＣＤ４６（膜補因子タンパク質）、ＣＤ５５（補体崩壊促進因子）、及びＣＤ５９（ＭＡＣ阻害タンパク質）の遺伝子の過剰発現を介して防護がさらに向上する。

【0043】

[0108] ほとんどの非Ｇａｌ異種抗体は、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロラーゼ（ＣＭＡＨ）遺伝子によって合成されるシアル酸Ｎ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を認識する。この遺伝子は、ヒトでは不活性であり、そのため、ブタＮｅｕ５Ｇｃはヒトで免疫原性を示す。したがって、異種移植における臨床的成功のためには、ブタＣＭＡＨを不活性化しなければならない可能性が高い。補体制御因子の発現とＧＧＴＡ１（ＧＴＫＯ）のノックアウトは、超急性拒絶反応を減少させるが、これらの遺伝子改変は、急性血管型拒絶反応（ＡＶＲ）に影響しない。

【0044】

[0109] 血栓性微小血管症及び全身性消費性凝固障害を含む凝固機能障害は、主として豚と非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の間の凝固系の分子不適合によるＧＴＫＯ及びｈＣＲＰの過剰発現でも持続している。

【0045】

[0110] 他者による安全な異種移植のための遺伝子導入豚の作製の試みにもかかわらず、これらの遺伝子導入豚は、構築能力の制約及び導入遺伝子間の転写干渉のため、限られた数の導入遺伝子しか保有していなかった。これらの方法は、異種移植片の不適合性を克服するには不十分であることが判明した。例えば、米国特許出願公開第２０１８／０２４９６８８号は、導入遺伝子の異なる組合せを有するマルチシストロン性発現ベクターを利用した。重要なことに、これらのマルチシストロン性ベクターは、４つの導入遺伝子のみからなり、αＧａｌのＫＯ（ＧＴＫＯ）を含む６個の遺伝子改変を有する豚の作製に用いられた。本開示では、ＫＯ、ＫＩ、及びゲノム置換戦略の組合せが利用される。単一遺伝子座から６個を超える導入遺伝子を発現するＰＥＲＶ非含有豚が初めて生産されている。

【0046】

[0111] 本明細書に記載及び開示された実施例は、ブタ補体因子がＫＯ’ｄであり得ること、並びに１つ以上の改変ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の不活性化、適応免疫に基づく拒絶反応を減少させるためのＰＤ－Ｌ１のＫＩ、血小板凝集を調節するための改変ブタｖＷＦ、及びブタＭＨＣクラスＩ遺伝子の欠失を有する生存豚を作製できることを実証する。これらの実施例は、同じ豚内でより多くの遺伝子改変を達成するためのプラットフォームを提供した。この研究から、ブタ細胞を６個を超える導入遺伝子で遺伝子改変して、免疫学的に適合する細胞、組織、器官、豚、及び子孫を生産した。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いて、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２を含む複数の遺伝子を機能的にノックアウトして、ヒトの予め形成された抗豚抗体によって認識されるグリカンを除去した。さらに、９個又は１２個のいずれかのヒト導入遺伝子を、豚ゲノム中の単一のマルチ導入遺伝子カセットに組み込んだ。具体的には、ブタゲノムへの９個の導入遺伝子ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＴＨＢＤ、及びＴＦＰＩ、又は１２個の導入遺伝子（ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１）のＰｉｇｇｙＢＡＣを介したランダム組込みと結合した３つの主要な異種性炭水化物抗原産生遺伝子（「３ＫＯ」；ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２及びＣＭＡＨ）を破壊するために、ＣＲＩＳＰＲを介した非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を利用して豚を作製した。さらなる進展は、ＰＥＲＶ非含有バックグラウンドで３ＫＯ及び９Ｔ又は１２ＴＧの改変を有するソースドナー豚を用いることである。そこから、ソースドナー豚はまた、中でも、ｖＷＦ遺伝子のヒト化、並びにアシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）及び内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の欠失又は破壊を含む、さらなる遺伝子改変を保有するように遺伝子操作されるであろう。

【0047】

[0112] 本開示は、複数の改変遺伝子を有する細胞、組織、器官、及び動物、並びにそれらを作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞、組織、器官は、動物から得られ、又は動物である。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、非ヒト哺乳動物、例えば、ウマ、霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、又はネコである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ブタである。

【0048】

[0113] 本開示に従う遺伝子の改変は、ドナーとレシピエントとの間の分子適合性を改善し、超急性拒絶反応、急性体液性拒絶反応、血栓性微小血管症、及び慢性脈管障害を含む有害事象を低減する役割を果たす。例えば、超急性拒絶反応は、非常に短い期間で、典型的には移植後数分～数時間以内に生じ、補体及び移植片内皮細胞を活性化し、これは次いでうっ血をもたらす凝固促進性の変化を生じ、最終的に移植された器官の破壊をもたらす予め形成された抗体から生じる。特定の実施形態では、細胞、組織、器官、及び動物は、低下した超急性拒絶反応を生じる。

【0049】

[0114] いくつかの実施形態では、本開示は、複数の改変遺伝子を有する１つ以上の細胞、組織、器官、又は動物を提供する。いくつかの実施形態では、細胞、組織、器官、又は動物は、複数の遺伝子が追加、欠失、不活性化、破壊されている、その一部が切除されている、又は遺伝子配列が変更されているように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、細胞、組織、器官、又は動物は、改変された５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、改変された５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０遺伝子は、単一の遺伝子座から発現する。いくつかの実施形態では、改変された５、１０、又は１２遺伝子は、単一の遺伝子座から発現する。いくつかの実施形態では、改変された１２遺伝子は、単一の遺伝子座から発現する。いくつかの実施形態では、細胞、組織、器官、又は動物は、改変された２０を超える、１５を超える、１０を超える、５を超える、３を超える、又は２遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、細胞、組織、器官、又は動物は、改変された１０を超える、５を超える、３を超える、２を超える、又は１を超える遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、細胞、組織、器官、又は動物は、改変遺伝子の１コピーを有し、他の実施形態では、細胞、組織、器官、又は動物は、１つ以上の改変遺伝子の１を超えるコピー、例えば、改変遺伝子の２を超える、３を超える、４を超える、５を超える、６を超える、７を超える、８を超える、９を超える、１０を超える、１５を超える、２０を超える、２５を超える、３０を超える、３５を超える、４０を超える、５０を超える、６０を超える、７０を超える、８０を超える、９０を超える、又は１００を超えるコピーを有する。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の改変遺伝子の１００コピー～約１コピー、９０コピー～約１コピー、８０コピー～約１コピー、約７０コピー～約１コピー、６０コピー～約１コピー、約５０コピー～約１コピー、約４０コピー～約１コピー、約３０コピー～約１コピー、約２０コピー～約５コピー、約１５コピー～約１０コピー、又は約５コピー～約１コピーを有する。

【0050】

[0115] いくつかの実施形態では、本開示は、改変遺伝子の１つ以上の複数のコピーを有する１つ以上の細胞、組織、器官、又は動物を提供する。例えば、細胞、組織、器官、又は動物は、改変遺伝子の１つ以上の２、３、４、５、６、７、８、９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、又はそれを超えて有し得る。

【0051】

[0116] いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、体細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、生後細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、成体細胞（例えば、成体耳線維芽細胞）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、胎性／胚細胞（例えば、胚割球）である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、生殖系列細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、卵母細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、初代細胞株からの細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は：上皮細胞、肝臓細胞、顆粒膜細胞、脂肪細胞からなる群から選択される。特定の実施形態では、１つ以上の細胞は、線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、雌胎性線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏである。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、単一の細胞である。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、細胞コロニーのメンバーである。

【0052】

[0117] いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞は、ブタ細胞である。起源とし又は由来するブタ細胞品種の非限定的な例は、以下の豚品種のいずれかを含む：アメリカン・ランドレース（American Landrace）、アメリカン・ヨークシャー（American Yorkshire）、アクサイ・ブラック・パイド（Aksai Black Pied）、アンゲルン・サドルバック（Angeln saddleback）、アパラチアンイングリッシュ（Appalachian English）、アラパワ・アイランド（Arapawa Island）、オークランド・アイランド（Auckland Island）、オーストラリアン・ヨークシャー（Australian Yorkshire）、バビカンプン（Babi Kampung）、バ・スーエン（Ba Xuyen）、バンツ（Bantu）、バスク（Basque）、バズナ（Bazna）、北京黒豚（Beijing Black）、ベラルーシ・ブラック・パイド（Belarus Black Pied）、ベルギー・ランドレース（Belgian Landrace）、ベンガリ・ブラウン・シャナイ（Bengali Brown Shannaj）、ベントハイム・ブラック・パイド（Bentheim Black Pied）、バークシャー（Berkshire）、ビサロ（Bisaro）、バングル（Bangur）、ブラック・スラボニアン（Black Slavonian）、ブラック・カナリアン（Black Canarian）、ブレイトボ（Breitovo）、ブリティッシュ・ランドレース（British Landrace)、ブリティッシュ・ロップ（British Lop）、ブリティッシュ・サドルバック（British Saddleback）、ブルガリアン・ホワイト（Bulgarian White）、キャンボロー（Cambrough）、カントニーズ（Cantonese）、セルティック（Celtic）、チャト・ムルシアノ（Chato Murciano）、チェスター・ホワイト（Chester White）、チェンマイ・ブラックピッグ（Chiangmai Blackpig）、チョクトー・ホッグ（Choctaw Hog）、クレオール（Creole）、チェコ改良白豚（Czech Improved White）、ダニッシュ・ランドレース（Danish Landrace）、ダニッシュ・プロテスト（Danish Protest）、ダーマンシ・パイド（Dermantsi Pied）、リ・ヤン（Li Yan）、デュロック（Duroc）、ダッチ・ランドレース（Dutch Landrace）、イースト・ランドレース（East Landrace）、イースト・バルカン（East Balkan）、エセックス（Essex）、エストニアン・ベーコン（Estonian Bacon）、フェンジン（Fengjing）、フィニッシュ・ランドレース（Finnish Landrace）、フォレスト・マウンテン（Forest Mountain）、フレンチ・ランドレース（French Landrace）、ガスコン（Gascon）、ジャーマン・ランドレース（German Landrace）、グロスター・シャー・オールドスポット（Gloucestershire Old Spots）、ゲッティンゲン・ミニピッグ（Gottingen minipig）、グリス（Grice）、ギニア・ホッグ（Guinea Hog）、ハンプシャー（Hampshire）、ハンテ（Hante）、ヘレフォード（Hereford）、ヘズオ（Hezuo）、ホーガン・ホッグ（Hogan Hog）、ハンチントン・ブラック・ホッグ（Huntington Black Hog）、イベリアン（Iberian）、イタリアン・ランドレース（Italian Landrace）、ジャパニーズ・ランドレース（Japanese Landrace）、チェジュ・ブラック（Jeju Black）、金華（Jinhua）、カヘティアン（Kakhetian）、ケレ（Kele）、ケメロボ（Kemerovo）、コリアン・ネイティブ（Korean Native）、クルスコポリエ（Krskopolje）、クネクネ（Kunekune）、ラムコム（Lamcombe）、ラージ・ブラック（Large Black）、ラージ・ブラック・ホワイト（Large Black-White）、ラージ・ホワイト（Large White）、ラトビアン・ホワイト（Latvian White）、レイコマ（Leicoma）、リトアニアン・ネイティブ（Lithuanian Native）、リトアニアン・ホワイト（Lithuanian White）、リンカーンシャー・カーリー・コート（Lincolnshire Curly-Coated）、リブニー（Livny）、マルハド・デ・アルコバカ（Malhado de Alcobaca）、マンガリッツァ（Mangalitsa）、メイシャン（Meishan）、ミドル・ホワイト（Middle White）、ミンジュー（Minzhu）、ミノカワ・ブタ（Minokawa Buta）、モン・カイ（Mong Cai）、モラ・ロマグノラ（Mora Romagnola）、モウラ（Moura）、ムコタ（Mukota）、ミュールフット（Mulefoot）、ムロム（Murom）、ミルロッド（Myrhorod）、ネロデイ・ネブロディ（Nero dei Nebrodi）、ネイジャン（Neijiang）、ニュー・ジーランド（New Zealand）、寧郷（Ningxiang）、ノース・コーカシアン（North Caucasian）、ノース・シベリアン（North Siberian）、ノルウェー・ランドレース（Norwegian Landrace）、ノルウェー・ヨークシャー（Norwegian Yorkshire）、オサバウ島（Ossabaw Island）、オックスフォードサンディー及びブラック（Oxford Sandy and Black）、パクチョン（Pakchong）５、フィリピン・ネイティブ（Philippine Native）、ピエトレン（Pietrain）、ポーランド・チャイナ（Poland China）、レッド・ワトル（Red Wattle）、サドルバック（Saddleback）、セミレチェンスク（Semirechensk）、シベリアン・ブラック・パイド（Siberian Black Pied）、スモール・ブラック（Small Black）、スモール・ホワイト（Small White）、スポット（Spots）、スラバヤ・バビ（Surabaya Babi）、スワビアン・ホール（Swabian-Hall）、スェーディッシュ・ランドレース（Swedish Landrace）、スワロー・ビリーフ・マンガリッツァ（Swallow Belied Mangalitza）、タイフ（Taihu）豚、タムワース（Tamworth）、ツオク・ニュー（Thuoc Nhieu）、チベタン（Tibetan）、トウキョウ（Tokyo）－Ｘ、チビルスク（Tsivilsk）、トゥロポリェ（Turopolje）、ウクライニアン・スポッテッド・ステッペ（Ukrainian Spotted Steppe）、ウクライニアン・ホワイト・ステッペ（Ukrainian White Steppe）、ウルツム（Urzhum）、ベトナミーズ・ポットベリイー（Vietnamese Potbelly）、ウェルシュ（Welsh）、ウェセックス・サドルバック（Wessex Saddleback）、ウエスト・フレンチ・ホワイト（West French White）、ウィンズニヤー（Windsnyer）、ウツィシャム（Wuzhishanm）、ヤナン（Yanan）、ヨークシャー（Yorkshire）及びヨークシャー・ブルー及びホワイト（Yorkshire Blue and White）。いくつかの実施形態では、ブタ細胞は、ヨークシャー（Yorkshire）及びユカタン（Yucatan）ブタ細胞である。

【0053】

[0118] いくつかの実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の遺伝子が、その一部の追加、欠失、不活性化、破壊、切除により改変されており、又は遺伝子配列の一部が変更されているように遺伝子改変されている。

【0054】

[0119] いくつかの実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の遺伝子を不活性化する１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の変異を有する１つ以上の遺伝子の発現の低下又は排除をもたらす１つ以上の変異又はエピジェネティック変化を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子は、細胞、組織、器官又は動物中に存在する核酸を遺伝子改変することによって不活性化される。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子の不活性化は、アッセイによって確認される。いくつかの実施形態では、アッセイは、感染力アッセイ、逆転写酵素ＰＣＲアッセイ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、リアルタイムＰＣＲ、又はジャンクションＰＣＲマッピングアッセイである。

【0055】

特定の遺伝子型
[0120] 細胞、組織、器官及び動物が、ヒト臨床使用に安全且つ有効であることを保証するために、本開示の細胞、組織、器官、及び動物（例えば、ドナー豚）は、それらをヒトにおいて適合性にする、向上した補体（即ち、補体毒性）、凝固、炎症性（即ち、アポトーシス／炎症）、免疫（即ち、細胞毒性）、及び／又は免疫調節系を有するように遺伝子操作される。ノックアウト（ＫＯ）、ノックイン（ＫＩ）（或いは、本明細書では導入遺伝子（ＴＧ）と称される）、及び／又はゲノム置換戦略の新規な組合せは、向上した補体、凝固、炎症性、免疫、及び／又は免疫調節系を提供する。

【0056】

[0121] 例えば遺伝的ＫＯによって、主要な異種性炭水化物抗原の発現を欠く細胞、組織、器官及び動物は、異種移植中の体液性拒絶反応を低下させ又は排除する。主要な異種性炭水化物抗原のうちの３つは、グリコシルトランスフェラーゼ／グリコシルヒドロラーゼＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２によって産生されるものを含む。これらの遺伝子の機能喪失の目的は、予め形成された抗豚抗体の、ブタ移植片の内皮への結合を低下させ及び／又は排除することである。

【0057】

[0122] １つ以上のゲノム遺伝子座、例えばＡＡＶＳ１などのセーフハーバーゲノム遺伝子座への重要な補体、凝固、炎症性、免疫、及び／又は免疫調節因子の挿入は、ヒト補体システム、及びナチュラルキラー（ＮＫ）、マクロファージ、及びＴ細胞機能の調節を助けるであろう。非限定的な例には、ヒト補体カスケードを阻害するためのＫＩによるｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、及びｈＣＤ５９の過剰発現；例えば、ブタｖＷＦ配列のＡ１ドメイン及び／又は隣接領域のヒト化による、無秩序な血小板隔離及び血栓性微小血管症を予防するためのｖＷＦのヒト化；ヒトＮＫ細胞の細胞毒性に対する保護及びブタ細胞のヒト化を提供するためのＢ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴのＫＩ；並びに免疫抑制剤、免疫調節物質、及び／又は抗凝固剤として機能するためのＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０のＫＩが含まれる。

【0058】

[0123] いくつかの実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の遺伝子が、その一部の追加、欠失、不活性化、破壊、切除により改変されており、又は遺伝子配列の一部が変更されているように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、本開示は、複数の改変遺伝子を有する単離された細胞、組織、器官、又は動物を提供する。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、α １，３、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＧＴＡ）、β－１，４－Ｎ－アセチル－ガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）、シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、ＨＯ－１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、主要組織適合性複合体、クラスＩ、Ｅ単鎖三量体（ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ）、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７、豚白血球抗原１（ＳＬＡ－１）、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、ｖＷＦ、Ｂ２Ｍ、ＤＱＡ、ＤＲＡ、及びＣＤ４７の１つ以上を含む。

【0059】

[0124] いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ、又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、及び／又はＣＭＡＨは、遺伝的にＫＯである。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、ＨＯ－１、又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、及び／又はＨＯ－１は、遺伝的にＫＩである。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４７、又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及び／又はＣＤ４７は、遺伝的にＫＩである。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、Ｂ２Ｍ、又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＤＱＡ及び／又はＤＲＡである。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＰＤ－Ｌ１、外来性ｖＷＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ－ＤＮ、及び又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＴＢＭ、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７、又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＴＢＭ、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、及び／又はＣＤ４７は、遺伝的にＫＩである。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子ＤＱＡ及びＤＲＡ、内因性ｖＷＦ、ＣＤ９、アシアロ糖タンパク質受容体、少なくとも１つの補体阻害剤遺伝子（例えば、Ｃ３、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９）、及びそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６、ＣＤ５５及び／又はＣＤ５９は、遺伝的にＫＩである。

【0060】

[0125] 一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、ＣＤ４７、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、又はそれらの任意の組合せを含む導入遺伝子発現ベクターで遺伝子改変されている。一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、ＣＤ４７、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９のそれぞれを含む導入遺伝子発現ベクターで遺伝子改変されている。導入遺伝子発現ベクターの一実施形態は、図１７に示される。一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、例えば遺伝的ＫＯによって、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ、又はそれらの任意の組合せの発現が低下されているか、又は発現がないように、さらに遺伝子改変されている。

【0061】

[0126] 一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、ＣＤ４７、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＨＯ－１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、又はそれらの任意の組合せを含む導入遺伝子発現ベクターで遺伝子改変されている。一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、ＣＤ４７、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＨＯ－１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９のそれぞれを含む導入遺伝子発現ベクターで遺伝子改変されている。導入遺伝子発現ベクターの一実施形態は、図１８に示される。一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、例えば遺伝的ＫＯによって、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ、又はそれらの任意の組合せの発現が低下されているか、又は発現がないように、さらに遺伝子改変されている。

【0062】

[0127] 一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＯ－１、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ａ２０、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、又はそれらの任意の組合せを含む導入遺伝子発現ベクターで遺伝子改変されている。一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＯ－１、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、Ａ２０、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９のそれぞれを含む導入遺伝子発現ベクターで遺伝子改変されている。導入遺伝子発現ベクターの一実施形態は、図１９に示される。一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、例えば遺伝的ＫＯによって、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ、又はそれらの任意の組合せの発現が低下されているか、又は発現がないように、さらに遺伝子改変されている。

【0063】

[0128] 一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、Ａ２０、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、ＨＯ－１、２ｘＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質の融合物）、ｈＣａｓｐａｓｅ８、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、ＣＤ４７、又はそれらの任意の組合せを含む導入遺伝子発現ベクターで遺伝子改変されている。一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、Ａ２０、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＣＤ３９、ＨＯ－１、２ｘＦＫＢＰ、ｈＣａｓｐａｓｅ８、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ ＳＣＴ、及びＣＤ４７のそれぞれを含む導入遺伝子発現ベクターで遺伝子改変されている。導入遺伝子発現ベクターの一実施形態は、図２０に示される。一実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、ＧＧＴＡ、Ｂ４ＧａｌＮＴ２、ＣＭＡＨ、又はそれらの任意の組合せの発現が低下されているか、又は例えば遺伝的ＫＯによって、発現がないように、さらに遺伝子改変されている。

【0064】

[0129] 本開示の細胞、組織、器官又は動物は、任意の方法によって遺伝子改変され得る。本明細書に開示及び記載されるノックアウト（ＫＯ）、ノックイン（ＫＩ）、及び／又はゲノム置換戦略のための適切な方法の非限定的な例は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、又は他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅエンドヌクレアーゼ、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター及びヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、発現ベクター、トランスポゾンシステム（例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ）、又はそれらの任意の組合せを使用するＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子改変を含む。

【0065】

[0130] 本開示の細胞、組織、器官又は動物は、ＰＥＲＶを含まないようにさらに改変され得る。本開示の細胞、組織、器官又は動物は、それらのゲノムから機能的に削除されたＰＥＲＶコピーを有するようにさらに改変され得る。本開示の細胞、組織、器官又は動物は、それらのゲノムにおいて機能的に不活性化されたＰＥＲＶコピーを有するようにさらに改変され得る。ＰＥＲＶは、ブタ細胞、組織、又は器官がヒトレシピエントに移植されるべき場合、リスク因子に相当する。ＰＥＲＶは、正常な豚細胞から放出され、感染性である。ＰＥＲＶ－Ａ及びＰＥＲＶ－Ｂは、数種、中でもヒトの細胞に感染するポリトロピックウイルスであり（例えばそれらは、異種指向性である）；一方ＰＥＲＶ－Ｃは、豚細胞のみに感染するエコトロピックウイルスである。機能的に削除されたＰＥＲＶコピーの非限定的な方法は、両方ともそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Niu 2017及びＷＩＰＯ公開番号国際公開第２０１８／１９５４０２号に開示及び記載されている。いくつかの実施形態では、豚は、ＰＥＲＶ－Ａ、ＰＥＲＶ－Ｂ、又はＰＥＲＶ－Ｃ（又はそれらの任意の組合せ）非含有であるように遺伝子操作される。

【0066】

[0131] いくつかの実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物の追加の遺伝子は、その一部の追加、欠失、不活性化、破壊、切除により改変され、又は遺伝子配列の一部が変更されている。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、以下の遺伝子の１つ以上の欠失を含み：ＭＨＣ－Ｉ遺伝子ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子ＤＱＡ及びＤＲＡ、内因性ｖＷＦ、ＣＤ９、アシアロ糖タンパク質受容体、及びＣ３、且つ以下の導入遺伝子の１つ以上を発現している：ＰＤ－Ｌ１、外来性ｖＷＦ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、Ｂ２Ｍ、及びＣＩＩＴＡ－ＤＮ。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、以下の遺伝子の１つ以上の欠失を含み：αガラクトシルトランスフェラーゼ１、β１，４ Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、及びシチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ、且つ以下の導入遺伝子の１つ以上を発現している：ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４７、ＨＯ－１、Ａ２０、ＴＮＦＲ１－Ｉｇ、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＥＰＣＲ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－Ｉｇ、ＣＤ７３、ＳＯＤ３、ＣＸＣＬ１２、ＦａｓＬ、ＣＸＣＲ３、ＣＤ３９Ｌ１、ＧＬＰ－１Ｒ、Ｍ３Ｒ、ＩＬ３５、ＩＬ１２Ａ及びＥＢ１３。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４７、ＨＯ－１、Ａ２０、ＴＮＦＲ１－Ｉｇ、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＥＰＣＲ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－Ｉｇ、ＣＤ７３、ＳＯＤ３、ＣＸＣＬ１２、ＦａｓＬ、ＣＸＣＲ３、ＣＤ３９Ｌ１、ＧＬＰ－１Ｒ、Ｍ３Ｒ、ＩＬ３５、ＩＬ１２Ａ及びＥＢ１３である。

【0067】

[0132] いくつかの実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の遺伝子が、その一部の追加、欠失、不活性化、破壊、切除によって改変されており、遺伝子配列の一部が変更されており、又は導入遺伝子若しくはその一部を導入するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の改変遺伝子を有する単離された細胞、組織、器官、又は動物を提供する。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子である。いくつかの実施形態では、改変ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、以下のＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、及びＢ２Ｍの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及び／又はＳＬＡ－３である。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、Ｂ２Ｍである。いくつかの実施形態では、改変ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、以下のＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３、及びＢ２Ｍの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、改変Ｂ２Ｍ、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及び／又はＳＬＡ－３遺伝子、及び／又はその一部は、ヒトＨＬＡ－Ｅ遺伝子、ヒトＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ヒトＢ２Ｍ遺伝子、及び／又はヒト（ドミナントネガティブ突然変異体クラスＩＩトランス活性化因子）ＣＩＩＴＡ－ＤＮ遺伝子、及び／又はその一部で置換される。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、条件的に及び／又は誘導性に改変されている。いくつかの実施形態では、条件的プロモーター及び／又は誘導性プロモーターは、１つ以上の改変遺伝子を条件的に及び／又は誘導性に改変するために使用される。いくつかの実施形態では、単離された細胞、組織、器官、又は動物は、Ｂ２Ｍ、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、又はＳＬＡ－３遺伝子、又はそれらの任意の組合せを条件的に変更し、条件的に変更された遺伝子をヒトＨＬＡ－Ｅ遺伝子、ヒトＨＬＡ－Ｇ遺伝子、ヒトＢ２Ｍ遺伝子、及び／又はヒトＣＩＩＴＡ－ＤＮ遺伝子の少なくとも一部で置換することを含む。

【0068】

[0133] いくつかの実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の遺伝子が、その一部の追加、欠失、不活性化、破壊、切除によって改変されており、遺伝子配列の一部が変更されており、又は導入遺伝子若しくはその一部を導入するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の改変遺伝子を有する単離された細胞、組織、器官、又は動物を提供する。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子である。いくつかの実施形態では、改変ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、ＤＲＱ、ＤＲＡ、又はそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、ＤＲＱ及び／又はＤＲＡは、その一部の追加、欠失、不活性化、破壊、切除により改変され、遺伝子配列の一部が変更されている。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、条件的に及び／又は誘導性に改変されている。いくつかの実施形態では、条件的プロモーター及び／又は誘導性プロモーターは、１つ以上の改変遺伝子を条件的に及び／又は誘導性に改変するために使用される。いくつかの実施形態では、単離された細胞、組織、器官、又は動物は、ＤＲＱ及び／又はＤＲＡ遺伝子、又はそれらの任意の組合せを条件的に変更することを含む。

【0069】

[0134] いくつかの実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の遺伝子が、その一部の追加、欠失、不活性化、破壊、切除によって改変されており、遺伝子配列の一部が変更されており、又は導入遺伝子若しくはその一部を導入するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、本開示は、改変ｖＷＦ遺伝子を有する単離された細胞、組織、器官、又は動物を提供する。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ｖＷＦ遺伝子及びｖＷＦ関連遺伝子である。いくつかの実施形態では、改変ｖＷＦ遺伝子、及び／又はその一部は、ヒトｖＷＦ遺伝子及び／又はその一部で置換される。いくつかの実施形態では、改変ｖＷＦ遺伝子、改変ｖＷＦ関連遺伝子、及び／又はその一部は、ヒトｖＷＦ遺伝子、１つ以上のヒトｖＷＦ関連遺伝子、及び／又はその一部で置換される。いくつかの実施形態では、改変ｖＷＦ遺伝子及び／又はｖＷＦ関連遺伝子は、条件的に及び／又は誘導性に改変されている。いくつかの実施形態では、条件的プロモーター及び／又は誘導性プロモーターは、１つ以上の改変遺伝子を条件的に及び／又は誘導性に改変するために使用される。いくつかの実施形態では、単離された細胞、組織、器官、又は動物は、ｖＷＦ、ｖＷＦ関連遺伝子、その一部、又はそれらの任意の組合せを条件的に変更し、条件的に変更された遺伝子をヒトｖＷＦ遺伝子、ヒトｖＷＦ遺伝子の少なくとも一部、１つ以上の他のヒトｖＷＦ関連遺伝子、１つ以上のヒトｖＷＦ関連遺伝子の少なくとも一部、又はそれらの任意の組合せで置換することを含む。いくつかの実施形態では、ｖＷＦ遺伝子は、内因性ブタゲノムにおいてＨＤＲ置換を開始し、ヒト配列で置換されるべき領域の付近を切断するように設計されたｇＲＮＡを使用して改変される。適切なｇＲＮＡの非限定的な例は、配列番号５～１５７のいずれかの１つ以上である。

【0070】

[0135] いくつかの実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の遺伝子が、その一部の追加、欠失、不活性化、破壊、切除によって改変されているか、遺伝子配列の一部が変更されているか、又は導入遺伝子若しくはその一部を導入するように、遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の外来性遺伝子、又はその一部、例えば導入遺伝子を、細胞、組織、器官、又は動物に導入することによって遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の改変遺伝子を有する単離された細胞、組織、器官、又は動物を提供する。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、プログラム死遺伝子である。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＰＤ－Ｌ１である。いくつかの実施形態では、細胞、組織、器官、又は動物は、外来性ＰＤ－Ｌ１遺伝子、又はその一部、例えば導入遺伝子を発現するように改変されている。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、条件的に及び／又は誘導性に改変されている。いくつかの実施形態では、条件的プロモーター及び／又は誘導性プロモーターは、１つ以上の改変遺伝子を条件的に及び／又は誘導性に改変するために使用される。いくつかの実施形態では、単離された細胞、組織、器官、又は動物は、ＰＤ－Ｌ１を条件的に変更することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、配列番号２１１に記載される配列、又はその任意の変異体若しくは一部を含む。

【0071】

[0136] いくつかの実施形態では、本開示の細胞、組織、器官又は動物は、１つ以上の遺伝子が、その一部の追加、欠失、不活性化、破壊、切除によって改変されており、遺伝子配列の一部が変更されており、又は導入遺伝子若しくはその一部を導入するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の改変遺伝子を有する単離された細胞、組織、器官、又は動物を提供する。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、補体遺伝子である。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、Ｃ３である。いくつかの実施形態では、Ｃ３は、その一部の追加、欠失、不活性化、破壊、切除により改変され、遺伝子配列の一部が変更されている。いくつかの実施形態では、改変Ｃ３遺伝子及び／又は補体関連遺伝子は、条件的に及び／又は誘導性に改変されている。いくつかの実施形態では、条件的プロモーター及び／又は誘導性プロモーターは、１つ以上の改変遺伝子を条件的に及び／又は誘導性に改変するために使用される。いくつかの実施形態では、単離された細胞、組織、器官、又は動物は、Ｃ３、補体関連遺伝子、その一部、又はそれらの任意の組合せを条件的に変更することを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ３遺伝子は、ｇＲＮＡを用いて改変される。適切なｇＲＮＡの非限定的な例は、配列番号１５８～２１０の任意の１つ以上を含む。

【0072】

[0137] いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、Ｃ３のノックアウトである。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＰＤ－Ｌ１のノックインである。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ブタｖＷＦのヒト化ｖＷＦである。いくつかの実施形態では、改変遺伝子は、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３条件的ノックインである。

【0073】

[0138] いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞、組織又は器官に対する、宿主による免疫応答は、誘発されず、又は実質的に誘発されない。

【0074】

[0139] いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示する細胞のいずれかから得られる核酸を提供する。いくつかの実施形態では、細胞中の核酸は、細胞中の１つ以上の遺伝子が変更され、又は細胞のゲノムが別様に改変されるように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、遺伝子、又はその一部は、当技術分野で既知の及び／又は本明細書に開示する遺伝子改変システムのいずれかを用いて遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変システムは、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、及び／又はＣＲＩＳＰＲベースのシステムである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変システムは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変システムは、クラスＩＩ、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変システムは、クラスＩＩ、タイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステムである。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞中の１つ以上の遺伝子又はその一部が不活性化されるように遺伝子改変され、また細胞は、細胞（又は細胞からクローン化／誘導された組織若しくは器官）がヒトに移植された場合に免疫応答を誘導するであろう１つ以上の遺伝子又はその一部の発現が低下するように、さらに遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のヒト遺伝子、又はその一部の発現が増加するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のヒト化遺伝子、又はその一部の発現が増加するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞中の１つ以上の遺伝子又はその一部が不活性化するように遺伝子改変され、また細胞は、細胞（又は細胞からクローン化／誘導された組織若しくは器官）がヒトに移植された場合に免疫応答を抑制するであろう１つ以上の遺伝子の発現が増加するように、さらに遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞中の１つ以上の遺伝子又はその一部が不活性化するように遺伝子改変され、また細胞は、細胞（又は細胞からクローン化／誘導された組織若しくは器官）がヒトに移植された場合に免疫応答を誘導するであろう１つ以上の遺伝子の発現が低下するようにさらに遺伝子改変され、また細胞は、細胞（又は細胞からクローン化／誘導された組織若しくは器官）がヒトに移植された場合に免疫応答を抑制するであろう１つ以上の遺伝子の発現が増加するように、さらに遺伝子改変される。

【0075】

[0140] いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子改変細胞からクローン化された胚を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変核酸は、遺伝子改変細胞から抽出され、異なる細胞中にクローン化される。例えば、体細胞核移植では、遺伝子改変細胞からの遺伝子改変核酸は、脱核卵母細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、卵母細胞は、極体の付近での部分的な帯状切開と、次いで解剖領域で細胞質を押し出すこととによって脱核することができる。いくつかの実施形態では、鋭い斜角の先端を有する注入ピペットを使用して、第２減数分裂で停止した脱核卵母細胞中に遺伝子改変細胞を注入する。第２減数分裂で停止した卵母細胞は、度々「卵」と称される。いくつかの実施形態では、胚は、卵母細胞を融合及び活性化することによって生成される。そのような胚は、本明細書では、「遺伝子改変胚」と称され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子改変胚は、レシピエント雌豚の輸卵管に移動される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変胚は、活性化から２０～２４時間後にレシピエント雌豚の輸卵管に移動される。例えば、Cibelli 1998及び米国特許第６，５４８，７４１号を参照されたい。いくつかの実施形態では、レシピエント雌は、遺伝子改変胚の移動から約２０～２１日後に妊娠に関してチェックされる。

【0076】

[0141] いくつかの実施形態では、遺伝子改変胚は、生後遺伝子改変動物に成長する。いくつかの実施形態では、生後遺伝子改変動物は、新生児遺伝子改変動物である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変豚は、若年遺伝子改変動物である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、成体遺伝子改変動物（例えば、５～６か月齢を超える）である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、雌遺伝子改変動物である。いくつかの実施形態では、動物は、雄遺伝子改変動物である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、非遺伝子改変動物と交配される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、別の遺伝子改変動物と交配される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変豚は、活性なウイルスが低下した又は該ウイルスを有さない別の遺伝子改変動物と交配される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、第２の遺伝子改変動物からの細胞、組織又は器官が、ヒトに移植された場合に免疫応答を誘導する可能性が低いように遺伝子改変されている、第２の遺伝子改変動物と交配される。

【0077】

[0142] いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、１つ以上の改変遺伝子を有し、妊娠後少なくとも１か月、少なくとも６か月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年、同じ又は同様のレベルの改変遺伝子の発現又は不活性化を維持する動物である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変動物は、遺伝子改変豚として、非ウイルス不活性化代理からの分娩後でさえも、又は施設／空間に他の非ウイルス不活性化動物といた後も、１つ以上の改変遺伝子を有する遺伝子改変された状態に留まる。

【0078】

[0143] いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される生後遺伝子改変豚のいずれかから得られた細胞、組織、又は器官を提供する。いくつかの実施形態では、細胞、組織、又は器官は、肝臓、腎臓、肺、心臓、膵臓、筋肉、血液、及び骨からなる群から選択される。特定の実施形態では、器官は、肝臓、腎臓、肺又は心臓である。いくつかの実施形態では、生後遺伝子改変豚からの細胞は：膵臓膵島、肺上皮細胞、心臓性筋肉細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、非実質肝臓細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢内皮細胞、胆管上皮細胞、胆管内皮細胞、肝血管上皮細胞、肝血管内皮細胞、類洞細胞、脈絡叢細胞、線維芽細胞、セルトリ細胞、神経細胞、幹細胞、及び副腎クロム親和性細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変器官、組織又は細胞は、それらの天然環境から分離されている（即ち、内部でそれらが成長した豚から分離されている）。いくつかの実施形態では、天然環境からの分離は、天然環境からの全体的な物理的分離、例えば、遺伝子改変ドナー動物からの除去、及び遺伝子改変器官、組織又は細胞の、それらが直接接触している隣接細胞との関連性の変更（例えば、解離により）を意味する。

【0079】

ＩＩＩ． 細胞、組織、器官、又は動物の作製方法
[0144] 本開示は、本明細書に開示する１つ以上の改変遺伝子を有する細胞、組織、器官、又は動物のいずれかの作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示する細胞のいずれかにおいて、１つ以上の遺伝子又はその一部を不活性化、欠失、又は別様に破壊する方法を提供し、該方法は、遺伝子に特異的な遺伝子編集薬剤を細胞に投与することを含み、ここで薬剤は、遺伝子の転写及び／又は翻訳を妨害する。いくつかの実施形態では、薬剤は、遺伝子の開始コドンを標的とし、遺伝子の転写を阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤は、遺伝子中のエクソンを標的とし、薬剤は、遺伝子においてフレームシフト変異を誘導する。いくつかの実施形態では、薬剤は、不活性化変異を遺伝子に導入する。いくつかの実施形態では、薬剤は、遺伝子の転写を阻止する。

【0080】

[0145] いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の遺伝子又はその一部をｉｎ ｖｉｖｏで変更する方法を提供し、該方法は、遺伝子に特異的な遺伝子編集薬剤を細胞に投与することを含み、ここで薬剤は例えば、遺伝子をヒト化し又は遺伝子の天然（例えば、野生型）配列を別様に変更することによって、遺伝子の配列を変更する。

【0081】

[0146] いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の遺伝子又はその一部、例えば導入遺伝子（例えば、非天然遺伝子）を発現する方法を提供し、該方法は、導入遺伝子に特異的な遺伝子編集薬剤を細胞に投与することを含み、ここで薬剤は、導入遺伝子の配列を導入する。いくつかの実施形態では、薬剤は、核酸配列、例えばプラスミド、ベクターなどである。いくつかの実施形態では、核酸配列は、１つ以上の核酸配列、例えばプロモーター、導入遺伝子、及び／又は追加の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列又はその一部は、１つ以上の種及び／又は１つ以上の供給源に由来する。いくつかの実施形態では、種は、遺伝子改変細胞、組織、又は器官を受容するであろう種である。いくつかの実施形態では、種は、ヒトである。他の実施形態では、種は、非ヒト、例えば哺乳動物、動物、細菌、及び／又はウイルスである。

【0082】

[0147] いくつかの実施形態では、本明細書に開示する薬剤のいずれも、ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるヌクレアーゼ及び／又はニッカーゼ及び／又はＲＮＡ若しくはＤＮＡ分子の１つ以上をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド薬剤は、１つ以上の細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが１つ以上の細胞によって一過性に発現されるように、１つ以上の細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが１つ以上の細胞によって安定的に発現されるように、１つ以上の細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、それが細胞ゲノムに安定的に組み込まれるような方法で導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の転位因子と共に導入される。いくつかの実施形態では、転位因子は、トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、転位因子は、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、転位因子は、誘導性である。いくつかの実施形態では、転位因子は、ドキシサイクリン誘導性である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、選択マーカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、ピューロマイシン耐性マーカーである。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）である。

【0083】

[0148] いくつかの実施形態では、薬剤は、細胞中のＤＮＡを標的とするのに使用されるヌクレアーゼ又はニッカーゼである。いくつかの実施形態では、薬剤は、遺伝子を特異的に標的とし、該遺伝子の発現を抑制する。いくつかの実施形態では、薬剤は、転写リプレッサードメインを含む。いくつかの実施形態では、転写リプレッサードメインは、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）である。

【0084】

[0149] いくつかの実施形態では、薬剤は、任意のプログラム可能ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、薬剤は、天然ホーミングメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＴＡＬＥＮベースの薬剤、ＺＦＮベースの薬剤、又はＣＲＩＳＰＲベースの薬剤、又は任意の生物学的に活性な断片、融合物、誘導体又はそれらの組合せである。ＣＲＩＳＰＲベースの薬剤には、例えば、例えばＣａｓ９及びＣｐｆ１の様々な種変異体を含む、クラスＩＩタイプＩＩ及びタイプＶシステムが含まれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、デアミナーゼ又はデアミナーゼをコードする核酸である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＡＬＥＮベースの薬剤、ＺＦＮベースの薬剤、及び／又はＣＲＩＳＰＲベースの薬剤を安定的に及び／又は一過性に発現するように遺伝子操作される。

【0085】

[0150]
ＩＶ． 処置の方法
[0151] いくつかの実施形態では、本明細書に開示する遺伝子改変細胞、組織又は器官のいずれも、遺伝子改変細胞として異なる種の対象の処置に使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載される遺伝子改変細胞、組織又は器官のいずれかを、それを必要とする対象に移植する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類である。

【0086】

[0152] いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法のいずれかに使用するための遺伝子改変器官は、遺伝子改変豚の心臓、肺、肝臓、眼、下垂体、甲状腺、副甲状腺、食道、胸腺、副腎、虫垂、膀胱、胆嚢、小腸、大腸、小腸、腎臓、膵臓、脾臓、胃、皮膚、及び／又は前立腺から選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法のいずれかに使用するための遺伝子改変組織は、遺伝子改変豚の軟骨（例えば、食道軟骨、膝の軟骨、耳の軟骨、鼻の軟骨）、筋肉、例えば非限定的に平滑筋及び心筋（例えば、心臓弁）、腱、靱帯、骨（例えば、骨髄）、角膜、中耳並びに静脈から選択され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法のいずれかに使用するための遺伝子改変細胞は、血液細胞、皮膚濾胞、毛包、及び／又は幹細胞を含む。器官又は組織の任意の部分（例えば、角膜などの眼の部分）を、本開示の組成物の投与に使用することができる。

【0087】

[0153] いくつかの実施形態では、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、又は脾臓は、（ａ）ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２の欠失又は破壊；（ｂ）豚ゲノムの単一のマルチ導入遺伝子カセットから発現されるＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ３９、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、及びＨＯ導入遺伝子（例えばヒト又はそのヒト化コピー）の追加；並びに（ｃ）全ＰＥＲＶコピーの機能的欠失を含むように遺伝子改変されている豚から分離される。いくつかの実施形態では、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、又は脾臓は、（ａ）ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２の機能的破壊；（ｂ）豚ゲノムの単一のマルチ導入遺伝子カセットから発現されるＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ３９、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、及びＨＯ導入遺伝子（例えばそのヒト化コピー）の追加；並びに（ｃ）全ＰＥＲＶコピーの機能的不活性化を含むように遺伝子改変されている豚から分離される。特定の実施形態では、豚は、ヒト化ｖＷＦ、ＡＳＧＲ１の欠失、及び／又はＢ２Ｍ遺伝子の欠失を有するようにさらに遺伝子改変されている。

【0088】

[0154] いくつかの実施形態では、異種移植された器官（例えば、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓）は、ヒト又は非ヒト霊長類に異種移植された後、約３００日を超える、約１年を超える、約１．５年を超える、約２年を超える、約２．５年を超える、約３年を超える、約３．５年を超える、約４年を超える、約４．５年を超える、約５年を超える、約５．５年を超える、約６年を超える、約６．５年を超える、約７年を超える、約７．５年を超える、約８年を超える、約８．５年を超える、約９年、約９．５年を超える、又は約１０年を超える持続的機能を示す。

【0089】

[0155] いくつかの実施形態では、本開示は、損傷した、欠損した又は存在しない器官、組織又は細胞機能をもたらす疾患、障害又は傷害を有する対象の処置を提供する。いくつかの実施形態では、対象は、対象の１つ以上の細胞、組織又は器官の損傷をもたらす傷害又は外傷（例えば、自動車事故）を患っている。いくつかの実施形態では、対象は、火又は酸によるやけどを患っている。いくつかの実施形態では、対象は、損傷した、欠損した又は存在しない器官、組織又は細胞機能をもたらす疾患又は障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫性疾患を患っている。いくつかの実施形態では、疾患は：心臓疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、拡張型心筋症、重度の冠動脈疾患、瘢痕化した心臓組織、心臓の先天性欠損、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病、肝炎、のう胞性線維症、肝硬変、腎不全、ループス、強皮症、ＩｇＡ腎症、多のう胞性腎臓疾患、心筋梗塞、肺気腫、慢性気管支炎、閉塞性細気管支炎、肺高血圧症、先天性横隔膜ヘルニア、先天性サーファクタントタンパク質Ｂ欠乏症、及び先天性のう胞性気腫性肺疾患、原発性胆汁性胆管炎、硬化性胆管炎、胆道閉鎖症、アルコール依存、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、及び／又はα－１アンチトリプシン欠乏症からなる群から選択される。

【0090】

[0156] いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子改変細胞、組織及び／又は器官のいずれも、遺伝子改変ドナーから分離され、非ドナー対象宿主に投与される。この文脈で使用される「投与する」又は「投与」は、導入する、適用する、注入する、インプラントする、移植（graft）する、抱合する、及び移植（transplant）する、を含むがこれらに限定されない。本開示によれば、遺伝子改変細胞、組織及び／又は器官は、本開示の器官、組織、細胞又は組成物の所望の部位への局在化をもたらす方法又は経路によって投与され得る。本開示の器官、組織、細胞又は組成物は、細胞の少なくとも一部が生存した状態に留まる、対象内の所望の位置への細胞の送達をもたらす、任意の適切な経路によって対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％（別個に投与されたか、又は組織若しくは器官の一部として投与されたかにかかわらず）は、対象への投与後に生存した状態に留まる。本開示の器官、組織、細胞又は組成物の投与方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、細胞、組織及び／又は器官は、宿主内に移植される。いくつかの実施形態では、細胞、組織及び／又は器官は、宿主内に注入される。いくつかの実施形態では、細胞、組織及び／又は器官は、宿主の表面（例えば、骨又は皮膚）上に移植（graft）される。

【0091】

[0157] いくつかの実施形態では、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２の欠失又は破壊；豚ゲノムの単一のマルチ導入遺伝子カセットからのＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＨＢＤ、及びＴＦＰＩ、並びに場合によりＣＤ５９、Ｂ２Ｍ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１の１つ以上の発現；を全ＰＥＲＶコピーの欠失とともに有するように遺伝子改変されている、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、又は脾臓は、宿主内に移植される。いくつかの実施形態では、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２の欠失；豚ゲノムの単一のマルチ導入遺伝子カセットからのＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ３９、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＨＢＤ及びＴＦＰＩ、並びに場合によりＣＤ５９、Ｂ２Ｍ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１の１つ以上の発現；並びに全ＰＥＲＶコピーの機能的不活性化を有するように遺伝子改変されている、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、又は脾臓は、宿主内に移植される。いくつかの実施形態では、移植された心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、又はその一部は、生存し、約１日間、約１週間、約２週間、約３週間、約１か月間、約２ヵ月間、約３ヵ月間、約４ヵ月間、約５ヵ月間、約６ヵ月間、約９ヵ月間、約１年間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、又はそれを超えて機能性である。

【0092】

[0158] いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞、組織又は器官を、遺伝子改変細胞、組織又は器官が投与されている宿主の免疫系から保護する必要があるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞、組織又は器官は、マトリクス又はコーティング（例えば、ゼラチン）とともに投与されて、遺伝子改変細胞、組織又は器官を、宿主からの免疫応答から保護する。いくつかの実施形態では、マトリクス又はコーティングは、生分解性マトリクス又はコーティングである。いくつかの実施形態では、マトリクス又はコーティングは、天然である。他の実施形態では、マトリクス又はコーティングは、合成である。

【0093】

[0159] いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞、組織又は器官は、免疫抑制化合物とともに投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制化合物は、小分子、ペプチド、抗体、及び／又は核酸（例えば、アンチセンス又はｓｉＲＮＡ分子）である。いくつかの実施形態では、免疫抑制化合物は、小分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、ステロイド、ｍＴＯＲ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、抗増殖薬剤又はＩＭＤＨ阻害剤である。いくつかの実施形態では、小分子は、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド、プレドニゾロン）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）、ＩＭＤＨ阻害剤（アザチオプリン、レフルノミド、ミコフェノレート）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミスラマイシン）及びメトトレキサート、又はその塩若しくは誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫抑制化合物は：ＣＴＬＡ４、抗ｂ７抗体、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムロモナブからなる群から選択されるポリペプチドである。

【0094】

[0160] いくつかの実施形態では、対象に投与されるべき遺伝子改変細胞、組織又は器官は、それらが、対象において免疫応答を誘導する可能性が低いように、さらに遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細胞、組織又は器官は、それらが機能性免疫賦活性分子を発現しないように、さらに遺伝子改変されている。

【0095】

[0161] 以下の実施例は、本開示を説明するために提供され、単に説明を目的とするものであり、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0096】

実施例
[0162] 本開示は、ここで一般的に記載されているが、本開示の特定の態様及び実施形態を単に説明することを目的として含まれ、本開示を限定することを意図するものではない以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。例えば、本明細書に開示する特定の構築物及び実験設計は、適切な機能を検証するための例示的なツール及び方法を表す。したがって、開示される特定の構築物及び実験プランのいずれも、本開示の範囲内で置換できることがすぐに明らかとなるであろう。

【0097】

実施例１：補体系を阻害するためのブタ補体成分３（Ｃ３）のノックアウト
[0163] Ｃ３の高度に保存された領域を選択し、Ｃ３ドメインを標的とする２つのｓｇＲＮＡを設計した。２つのｇＲＮＡ配列の配列は、ＴＣＴＣＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＧＴＴＧ（配列番号１５８）及びＧＧＡＧＧＣＣＣＡＣＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧ（配列番号１５９）である。Ｃ３ ｓｇＲＮＡを、ＧＧＴＡ ｓｇＲＮＡ（ＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴＧＴＣＡＡ（配列番号２１０））プラスミド及びｃａｓ９プラスミドと一緒に、ネオントランスフェクションマシン及び試薬を用いてブタ胎児線維芽細胞に一時的にトランスフェクトした。Ｃ３を欠く細胞（「Ｃ３－ＫＯ」）を、ＧＧＴＡ抗体カウンター選択法を用いて選択して、Ｃ３－ＫＯ細胞を共濃縮し、次いで、これを単一細胞選別し、遺伝子型決定して、ディープシーケンシングを用いてＣ３標的をノックダウンする効率を決定した。

【0098】

[0164] スクリーニングした１５６クローンのうち、１０８クローンは二対立遺伝子Ｃ３－ＫＯであった。二対立遺伝子Ｃ３－ＫＯ細胞のノックダウン効率は６９％であった。得られたＣ３－ＫＯ細胞株を用いて、体細胞核移植法を用いて豚を作製した。Ｃ３－ＫＯ豚は６３日間生存し、肝臓及び肺の感染により死亡した。図１Ａ～Ｃに示すように、Ｃ３－ＫＯ豚は１００％のＮＨＥＪノックアウトであった。図１Ａは、Ｃ３に導入された欠失のサイズを示し、図１Ｂはインデルの位置を示し、図１Ｃは、Ｃ３－ＫＯ豚において生成されたインデルの配列を示す。

【0099】

[0165] 記載したＣ３－ＫＯ豚は、いかなる機能的Ｃ３タンパク質も産生しなかったであろうことが予想される。機能的Ｃ３タンパク質が欠如しているため、Ｃ３－ＫＯ豚の補体系が活性化されず、それによってＣ３－ＫＯ豚の自然免疫系が低下すると考えられる。さらに、Ｃ３－ＫＯ豚は、野生型豚と比較して細菌及び／又はウイルス感染を起こしやすい可能性があると予想される。さらに、Ｃ３－ＫＯ豚の細胞、組織、及び／又は器官のヒトへの異種移植は、ヒトの補体系を活性化することは予想されない。したがって、これはＣ３－ＫＯ豚異種移植片に対するヒト自然免疫応答を最小限に抑える筈である。

【0100】

実施例２：１つ以上の改変ＭＨＣクラスＩ遺伝子を有する豚
[0166] 豚のＭＨＣ主要クラスＩ対立遺伝子を、ヒトＭＨＣマイナークラスＩ対立遺伝子（「ＭＨＣ－Ｉ豚」）と条件的に置換した。これを行うために、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３遺伝子を含む豚のゲノムの領域を、ヒトマイナー対立遺伝子ＨＬＡ－Ｅの改変バージョンで置換した。

【0101】

[0167] 図２は、ＭＨＣクラスＩ置換戦略のスキームを示す：ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３遺伝子を含む遺伝子座は、ｌｏｘＰ部位に隣接していた。Ｃｒｅで処理した後、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３を切除し、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、Ｂ２Ｍ、及びＣＩＩＴＡ－ＤＮ遺伝子の様々な組合せなどのヒトＨＬＡ－Ｅで置換した。ＭＨＣ－Ｉ豚は生存可能であり、重度の免疫不全状態であった。したがって、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３遺伝子を普遍的にヒト遺伝子で置換するのではなく、条件的ノックアウトを使用し、細胞、組織、及び／又は器官を回収する前に、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３遺伝子をヒトＨＬＡ－Ｅ及び他のヒト遺伝子で置換した。

【0102】

[0168] 豚のＭＨＣ Ｉ領域を、長い読み取り技術を用いてシーケンシングした。ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３遺伝子を捕捉するためのプローブを設計し、ＭＨＣ－Ｉ遺伝子領域を捕捉するために使用した。ＭＨＣ－Ｉ遺伝子領域を正確に決定するために、ＰａｃＢｉｏシーケンシングと１０Ｘシーケンシングを用いた。ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、ＳＬＡ－３の構成を図９に示す。ＭＨＣ－Ｉ領域に隣接するｌｏｘＰ部位を有する２つのカセットを設計した。カセット１はプロモーター、ｌｏｘＰ部位、及び選択剤（即ち、ピューロマイシン）を含む。カセット２は、第２のマーカー（ＧＦＰ）、ｌｏｘＰ部位、及びＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ－ＤＮを含む遺伝子のプロモーターを含まないカセットを含む。

【0103】

[0169] カセット１及び２を、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ戦略（New England BioLabs）を用いて個々の成分から合成し、挿入部位に対応する８００ｂｐ相同配列に隣接させた。２つの連続したＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９ラウンドを用いて、両方の部位を挿入した^１７。ピューロマイシン選択及びＧＦＰ ＦＡＣＳ選別を用いてクローンを単離し、ジャンクションＰＣＲを用いて挿入を検証した。

【0104】

[0170] 細胞にＣｒｅリコンビナーゼをトランスフェクトし、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を誘導した。単一細胞選別を行い、選別した細胞を接合ＰＣＲを用いてスクリーニングして、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３をヒトＭＨＣ－１で二対立遺伝子置換した細胞を単離した。

【0105】

[0171] ｉｎ ｖｉｖｏ Ｃｒｅ切除のために、代替カセット１が設計されており、組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーターの制御下にあるＣｒｅリコンビナーゼを含む。組織特異的プロモーター又は誘導性プロモーターを使用することによって、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３遺伝子は、細胞、組織、及び／又は器官を回収する前に、目的の細胞、組織、及び／又は器官において切除されるか、又は切除が動物において誘導され得る。ヒトＭＨＣ－Ｉで置換されたＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２、及びＳＬＡ－３を有する豚は、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）によって作製することができ、条件的及び／又は組織特異的条件的置換遺伝子をコードする子豚を作製することができる。

【0106】

実施例３：ＭＨＣクラスＩＩ不活性化
[0172] ＭＨＣ－ＩＩα鎖の発現を欠く豚（「ＭＨＣ－ＩＩ ＫＯ豚」）を、確立されたｇＲＮＡ技術をブタ細胞内で用いて、ＤＱＡ遺伝子を切除し、ＤＲＡ遺伝子を不活性化することにより作製し、その後ＳＣＮＴを介して宿主豚に移入した。簡潔には、ブタ細胞へのｇＲＮＡ移入後、ゲノムをシーケンシングし、ＭＨＣ－ＩＩ遺伝子座における変異を同定した。Ｃａｓ９をこれらの細胞に送達し、次いでこれを選別して単一細胞を単離した。これらの単一細胞をシーケンシングして、標的とするＤＱＡ及びＤＲＡ遺伝子の遺伝子型を決定した。ＤＱＡ及びＤＲＡ不活性化を有する単一細胞において、胚をＳＣＮＴ後に生成し、その後豚にインプラントしてＭＨＣ－ＩＩ ＫＯ豚を作製した。生後４週で、ＭＨＣ－ＩＩ ＫＯ豚は健康のままであった。

【0107】

[0173] 図３Ａ及び３Ｂは、ＤＱＡ遺伝子に基づくＭＨＣ－ＩＩ ＫＯの遺伝子型を示している。ＭＨＣ－ＩＩ ＫＯ豚の遺伝子型を、ＤＱＡ遺伝子のエクソンターゲティングに基づく増幅及びシーケンシング並びにＤＲＡ遺伝子のシーケンシングによって遺伝子型決定した。左のパネルに示すように、インデルのサイズ及び位置は、ＤＲＡ遺伝子に位置する。ＤＲＡ遺伝子の不活性化は、右のパネルに示すように、ＤＲＡアンプリコン中の１２６位及び１２７位のそれぞれにおける２つの単一ヌクレオチド挿入によって引き起こされた。

【0108】

[0174] 図４Ａ及び４Ｂは、ＭＨＣ－ＩＩ ＫＯ豚の別の遺伝子型を示している。ＤＲＡ遺伝子型は、ＤＲＡ遺伝子のエクソンターゲティングに基づく増幅及びシーケンシングを用いて決定した。ＤＲＡからのエクソン標的化領域を増幅及びシーケンシングした。左のパネルに示すように、インデルのサイズ及び位置は、ＤＲＡ遺伝子に位置する。ＤＲＡ遺伝子の不活性化は、右のパネルに示すように、ＤＲＡアンプリコン中の１０６位及び１０７位のそれぞれにおける２つの単一ヌクレオチド挿入によって引き起こされた。

【0109】

[0175] ＭＨＣ－ＩＩ発現を欠くヒトと同様に、ＭＨＣ－ＩＩ ＫＯ豚は、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞の減少した集団を有するが、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞集団は無傷のままである（図５）。さらに、ＭＨＣ－ＩＩ ＫＯ豚は、他の問題の中でも、免疫抑制されており、増加した自己免疫及びリンパ系欠損を有する。これらの表現型は、ＭＨＣ－ＩＩ ＫＯ表現型と関連することが知られており、ＭＨＣ－ＩＩ発現を欠くマウスで観察されている。これらの類似性から、ＭＨＣ－ＩＩ ＫＯ豚は、活性な遺伝子改変ではなく、有効なＭＨＣ－ＩＩ ＫＯであることが確認される（図６）。

【0110】

実施例４：適応免疫に基づく拒絶を低減するためのＰＤ－Ｌ１ノックイン
[0176] ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（例えば、ＰＤ－Ｌ１導入遺伝子）を豚ゲノムに送達した。図７の構造を有するスキームを参照されたい。ヒトＰＤ－Ｌ１導入遺伝子の発現を、２つの異なるＰＤ－Ｌ１アンプリコンを使用するｑＰＣＲによって確認した（図８）。

【0111】

[0177] ＰＤ－Ｌ１を発現しているブタ組織は、異種移植後にヒトなどの宿主による拒絶反応が減少した可能性がある。

【0112】

実施例５：血小板凝集を調節するブタフォン・ウィルブランド因子の遺伝子改変
[0178] ｐｖＷＦ由来の相同アーム、Ａ１ドメイン、及びｈｖＷＦ由来の隣接領域中の特定の残基を含むＨＤＲベクターを設計し、構築した。（図１０）。２つのｓｇＲＮＡもまた、内因性ブタゲノムにおいてＨＤＲ置換を開始し、ヒト配列：ＴＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＣＧ（配列番号５）及びＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＴＧＧＧＣＣＡＣＴＡ（配列番号６）によって置換されるべき領域の近くで切断するように設計した。

【0113】

[0179] ＨＤＲベクターは、ブタｖＷＦ及びヒトＡ１及び隣接ドメインからの約１ｋｂの相同アーム、並びに、ｓｇＲＮＡがドナー及び改変されたブタゲノムを切断するのを妨げるためのｓｇＲＮＡ切断部位における不活性化突然変異から構成される。ＨＤＲベクターはまた、ｓｇＲＮＡ切断部位近傍の内因性ブタゲノムからＨＤＲベクターを識別できるＳｐｈＩ及びＢｓｐＥＩ部位を含む。

【0114】

[0180] ブタ初代線維芽細胞を、Neon Transfection System（Invitrogen）を使用して、８μｇのＣａｓ９、１μｇのｓｇＲＮＡ１、及び１μｇのｓｇＲＮＡ２、並びに１０μｇのＨＤＲベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞をＦＡＣＳを用いて単一細胞サブクローニングした。単一細胞を、ＨＤＲベクターのエピソーム型が細胞分裂の間に失われるまで、さらに１２日間培養した。ｈｖＷＦのＡ１及び隣接領域を、隣接プライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ産物をＳｐｈＩ及びＢｓｐＥＩ連続消化に供して、連続消化後に７００ｂｐ、３２３ｂｐ及び２５８ｂｐの大きさの断片を有するＰＣＲ産物に新規ＳｐｈＩ及びＢｓｐＥＩ部位を付加するＨＤＲ置換を有するクローンをスクリーニングした（図１１）。完全な二対立遺伝子ＨＤＲは、１２８１ｂｐの野生型産物、及び７００ｂｐより大きい任意の部分消化産物を排除する。

【0115】

[0181] 二対立遺伝子ＨＤＲを有する細胞を、約１５０個の単一細胞コロニーから単離した（図１１）。シーケンシングによって確認されたように、ブタＡ１ドメイン及び隣接領域の対立遺伝子は、いずれもヒト対応物と置換された（図１２Ａ及び１２Ｂ）。Ａ１ドメインは強調されているが、隣接領域の潜在的なグリコシル化部位は、ダッシュで標識されている。ｐｖＷＦにおいて欠失したヒト特異的残基をバーで標識し、ヒト化Ａ１ドメイン及び隣接領域を半括弧で標識する。この単離された細胞は、細胞株に増殖され、ＳＣＮＴによって遺伝子改変豚を作製するために使用され得る。

【0116】

[0182] Ａ１－ヒト化ｐｖＷＦを発現している細胞は、血小板活性化アッセイの間、ヒト血小板に対して有意に減少した凝集応答を有した（図１３）。簡潔には、細胞をヒト血小板とともにインキュベートし、剪断応力によって凝集を誘導した。Ａ１－ヒト化ｐｖＷＦを発現している細胞は、より穏やかで誘導性の凝集曲線を示したが、野生型ｐｖＷＦを発現している細胞は、ヒト血小板に対してより強い凝集応答を有した。したがって、Ａ１ ｈｖＷＦを有するブタの器官は、ｐｖＷＦを発現しているブタの器官と比較して、ヒト血液においてより軽度の凝固応答を誘導する可能性が高く、豚からヒトへの異種移植で観察される血管不適合を改善する可能性がある。

【0117】

[0183] 合わせて、これらのデータは、内因性ブタｐｖＷＦの１つ以上の隣接ドメインにおけるＡ１ドメイン及び特定の残基を、ヒト対応物（ｈｖＷＦ）由来の対応する残基で置換することが、異種移植の間に生じる血小板凝集応答を調節し得ることを示す（図９）。

【0118】

実施例６：ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を防止するブタ古典的ＭＨＣＩ抗原のゲノム欠失
[0184] ＭＨＣクラスＩ分子は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞へのペプチド提示を介して同種移植の拒絶に重要な役割を果たす。ここでは、ブタ初代線維芽細胞における約２００ｋｂの古典的ＭＨＣクラスＩ遺伝子座全部の削除が、異種移植におけるＣＤ８＋ Ｔ細胞媒介毒性を防止したか否かを試験した。

【0119】

[0185] 古典的ＭＨＣクラスＩ遺伝子は、細胞表面に広く発現している高度に多型のタンパク質をコードしている。これらは、外来ペプチドをＣＤ８＋ Ｔリンパ球に提示し、標的細胞の溶解をもたらす。また、ミスマッチしたＭＨＣＩ分子も移植における抗原として働く。異種移植のためのドナーブタ器官における古典的ＭＨＣＩ分子を除去する様々な戦略が検討されている。１つの試みにおいて、Tectorのグループは、Ｃａｓ９及び３ｓｇＲＮＡを使用して、ＳＬＡ－１、ＳＬＡ－２及びＳＬＡ－３分子の保存されたエクソン４をノックアウトした（Reyes 2014）。しかしながら、このエクソンは、他の古典的及び非古典的ＭＨＣＩ分子によっても共有されており、予測されないオフターゲット効果を生み出す可能性がある。また、残りのエクソン１～３は、依然として細胞表面抗原として提示され得る。別の試みでは、ヘテロ二量体化パートナーＢ２Ｍを、ＴＡＬＥＮを用いてノックアウトした（Wang 2016）。この方法はまた、非古典的ＭＨＣＩ分子に影響を及ぼし得、残りのＭＨＣＩは、依然として、細胞表面上に脱構造化タンパク質として提示され得る。異種移植との関連において、ヒトＨＬＡ－Ｅ／Ｂ２Ｍ分子は、通常、ＮＫ細胞媒介毒性を防止するために、ＭＨＣＩ欠損細胞において補完される。ヒトＢ２Ｍは、Ｂ２Ｍノックアウト豚において、ブタＳＬＡと二量体を形成し、その抗原性を回復させる可能性がある。

【0120】

[0186] この実施例では、古典的ＭＨＣＩ抗原を特異的且つ完全に除去するために、ブタゲノム中に独特の隣接配列を有するＭＨＣ古典的クラスＩクラスターを最初に同定した（図１４）。この約２００ｋｂクラスターは、他のタンパク質コード遺伝子を有さない８つの古典的ＭＨＣＩ遺伝子の全てを含む。次いで、独特の隣接領域中のｓｇＲＮＡ（配列番号１～４）を同定して、この遺伝子クラスター全体の断片的欠失を誘導した。約２００ｋｂの断片的欠失の頻度は比較的低いので、二対立遺伝子削除クローンを単離するように濃縮戦略も設計された。

【0121】

[0187] ブタ初代線維芽細胞を、Neonトランスフェクションシステム（Invitrogen）を用いて、１．２５μｇのTrueCut Ｃａｓ９タンパク質及び７．５ｎｍｏｌｅのｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖（Invitrogen）でトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ゲノムＤＮＡをトランスフェクトした細胞から回収し、図１５Ａに示す指定プライマー対を用いてＰＣＲに供した。断片的欠失は、予想される欠失接合部に隣接するプライマーを用いて検出した。このＰＣＲ産物を、トポイソメラーゼに基づくクローニング（「ＴＯＰＯクローニング」）を用いてサブクローニングし、個々のＴＯＰＯクローンをサンガーシーケンシングして欠失接合部の配列を確認した。配列を、図１５Ｂに示す予想される接合部に整列させた。同時に、細胞のアリコートを豚特異的ＳＬＡ－１抗体で染色した。ＭＨＣＩ陰性細胞の部分を図１６に示した。

【0122】

[0188] 単一細胞サブクローニング後、二対立遺伝子欠失を含む細胞を用いて、体細胞核移植を介して古典的ＭＨＣＩノックアウト豚を作製することができる。豚は、全ての古典的ＭＨＣＩ分子を完全に欠損し、受精能及び他の生理学的機能に関与する可能性のある非古典的ＭＨＣＩ分子に熟達していると考えられる。残りのＢ２Ｍ分子は非多型であり、ヒト対応物に高度に保存されているので、抗原性である可能性は低い。また、ヒトＨＬＡ－Ｅ／Ｂ２Ｍの外因性発現は、古典的ＭＨＣＩ分子の欠損を救済することができない。得られた豚は、以前の報告と比較して、最もクリーンな古典的ＭＨＣＩノックアウトバックグラウンドを有する筈である。

【0123】

実施例７：免疫学的に適合するブタ細胞、組織、器官、豚及び子孫の作製
[0189] 安全な異種移植のために遺伝子導入豚を作製するための他の研究者による多くの試みにもかかわらず、現在までのところ、異種移植のための最も進んだ遺伝子導入豚は、構築物のコンパシティと導入遺伝子間の転写干渉のため、限られた数の導入遺伝子を保有していた。ここでは、ＫＯ、ＫＩ、及びゲノム置換の組合せを利用して、ドナー豚のいくつかの反復を作製した。図２１は、連続的な遺伝子編集によるドナー豚作製の進行を概説する。以下に記載するように、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋１２ＴＧ）の場合、これらの遺伝子編集には、免疫学的、凝固、種不適合に対処するために設計された３つのノックアウトと１２個の導入遺伝子ノックインが含まれていた。

【0124】

[0190] ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介ＮＨＥＪを用いて、３つの主要な炭水化物産生グリコシルトランスフェラーゼ／グリコシルヒドロラーゼ遺伝子ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ及びＢ４ＧＡＬＮＴ２を機能的にノックアウトした。野生型豚組織に結合する予め形成された抗体は、異種移植に対する主要な初期免疫学的障壁であり、これらの３つの遺伝子は、これらの抗体によって標的化される異種抗原を産生する主な原因であると同定されている（Byrne 2014、Lai 2002、Lutz 2013、Martens 2017、Tseng 2006）。したがって、これらの遺伝子の機能喪失は、予め形成された抗豚抗体のブタ移植片の内皮への結合をほとんど排除するであろうと予測された。このことは、標的Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋１２ＴＧ）線維芽細胞への宿主抗体の結合の減少を示すフローサイトメトリーの結果によって確認された（図２２）。抗体結合の減少を実証するために、遺伝子操作した豚線維芽細胞をプールしたヒト血清とともにインキュベートし、結合したヒトＩｇＭ及びＩｇＧを結合した二次抗ヒト抗体で検出し、フローサイトメトリーによって分析した。野生型豚線維芽細胞（赤色輪郭プロット）とは対照的に、３つの遺伝子を排除すると、抗体結合が有意に減少した（緑色及び褐色の輪郭プロット、約９８％の減少）。

【0125】

[0191] １２個のヒト導入遺伝子（ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ３９、ＣＤ４７、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、ＨＯ－１）を、ＰｉｇｇｙＢＡＣトランスポゾン媒介ランダム組込みを介して豚ゲノム中の単一マルチ導入遺伝子カセットに組み込み、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋１２ＴＧ）の最初の反復を生成した（図１７～２０、３１、４７～４９；配列番号２１２～２１４参照）。導入遺伝子を、所望の遍在性又は組織特異的プロモーターを有する４つの異なるシストロンに配置した。各シストロン内の導入遺伝子を、リボソームスキッピング２Ａペプチドで分離して、同様のモル比での発現を確実にした。さらに、遍在性クロマチンをプニングエレメント（ＵＣＯＥ）などのシスエレメントの組合せを導入して、導入遺伝子サイレンシングを防止し、強いポリアデニル化部位及びターミネーターを有するインスレーターを導入して、導入遺伝子間及び導入遺伝子と隣接染色体間の相互作用を最小にした。

【0126】

[0192] 導入遺伝子発現レベル及び組織特異的プロモーター駆動発現を、ｑＰＣＲを使用して決定し（図２３）、組込み部位及びコピー数を、逆ＰＣＲに基づく接合捕捉を使用して決定した。原理の証明として、隣接するシストロンの全ての導入遺伝子は、検出可能な転写干渉なしに線維芽細胞及び内皮細胞株において所望の組織特異性を示した。さらに、全ての導入遺伝子は、ゲノム組込みの様々な位置を有するクローン全体にわたって高度に一致した発現レベルを示し、このことは、導入遺伝子発現が染色体状況とは無関係であることを示す。予想通り、補体制御遺伝子（ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９；ＥＦ１αプロモーター）及びＢ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ、並びにＣＤ４７（ＣＡＧプロモーター）を含む、遍在性プロモーターの制御下に挿入された６つの遺伝子は、線維芽細胞及び内皮細胞の両方で発現した。対照的に、組織特異的プロモーター（ＮｅｕｒｏＤ又はＩＣＡＭ２）の調節下で発現した６つの遺伝子（Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、ＨＯ１、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、及びＣＤ３９）は、内皮細胞における発現と比較して線維芽細胞における発現レベルが低いことを示した。ｑＰＣＲデータと一致して、タンパク質の細胞表面発現は、豚脾臓細胞及び豚線維芽細胞において、挿入されたヒト導入遺伝子によって発現されることが観察された（図２４）。簡潔には、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋１２ＴＧ）脾臓細胞又は線維芽細胞を単離し、示したように特異的ヒトタンパク質を認識する抗体とともにインキュベートし、染色細胞をフローサイトメトリーを用いて分析した。図２４の各パネルにおいて、左側のピークは、アイソタイプ対照で染色された細胞を表し、右側のピークは、特異的抗体で染色された細胞を表す。

【0127】

[0193] 前臨床実験では、導入遺伝子ノックインをＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼを用いてゲノムにランダムに組み込み、遺伝子間領域に単一コピーが組み込まれ、予測可能な結果を有さないクローンを豚生産に用いる。臨床開発のために、ホモ接合の雌／雄豚を、ソースドナー豚の大規模飼育及び生産に先立って、セーフハーバー（例えば、ＡＡＶＳ１ゲノム遺伝子座）への二対立遺伝子部位特異的導入遺伝子組込みで作製する。

【0128】

[0194] 自然及び適応免疫細胞機能並びに補体及び凝固カスケードのさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ評価には、抗体反応性プロファイリング、混合リンパ球反応、補体依存性細胞毒性、ＮＫ細胞細胞毒性、マクロファージ食作用、並びに凝固因子及び血小板凝集への影響が含まれる。

【0129】

[0195] 豚移植片機能を維持し、補体媒介毒性からドナー器官を保護するために、ヒト補体調節タンパク質を過剰発現させた。簡潔には、遺伝子操作された豚線維芽細胞及び豚脾細胞を、２５％ヒト補体とともに１時間インキュベートした。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーにより分析して細胞死を定量した。野生型線維芽細胞及び脾細胞は、ヒト補体との培養後に細胞死の割合が最も高かった。４－７Ｐ及び４－７Ｈ細胞は、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋１２ＴＧ）子豚に由来し、４－７Ｆ細胞（３ＫＯ＋１２ＴＧ）は、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋１２ＴＧ）胎児に由来する。３－９は、３種の炭水化物抗原産生酵素ＫＯ、ＨＬＡ－ＤＱＡ ＫＯ、ＨＬＡ－ＤＲＡ ＫＯ、及びヒト補体調節因子Ｃ３ ＫＯである。図２５に示すように、ヒトＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９を発現するように遺伝子操作された豚線維芽細胞及び脾細胞は、対照ヒト線維芽細胞と比較して、補体媒介性細胞死のレベルが有意に低かった。

【0130】

[0196] 標的細胞上のＭＨＣ Ｉと、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のキラー阻害受容体（ＫＩＲ）とを連結すると、ＮＫ細胞を介した標的細胞の殺傷が阻害される。豚ＭＨＣ Ｉは、ヒトＮＫ ＫＩＲを介してシグナルを伝達することができないため、豚細胞は、ＮＫ細胞による標的細胞殺傷の影響を受けやすい。ＮＫ媒介細胞死を克服するために、ヒトＮＫ ＫＩＲ受容体を連結するヒトＨＬＡ－Ｅを豚細胞で過剰発現させた。ＷＴ豚線維芽細胞及びＫ５６２細胞（ヒトＭＨＣ欠損細胞株）の７０％が、ＮＫ細胞による殺傷の標的となった。図２６に示すように、ヒトＨＬＡ－Ｅ＋操作豚線維芽細胞は、有意に低いＮＫ媒介細胞殺傷を示した。対照的に、ＨＬＡ－Ｅ＋豚線維芽細胞は、ＮＫ細胞による殺傷が有意に低いことを示し、このことは、ＨＬＡ－Ｅの発現がこれらの細胞を溶解から保護することを示唆している。

【0131】

[0197] 豚細胞におけるヒトＣＤ５５の過剰発現は、補体媒介毒性を低下させ、これは凝固を減少させ、異種移植片の生存を改善する可能性がある。凝固の活性化は、最終的には、安定したトロンビン－アンチトロンビン（ＴＡＴ）複合体中でアンチトロンビンと結合することによって不活性化されるトロンビンの形成につながる。簡潔には、野生型、ＣＤ５５ ＫＩ＋ＧＧＴＡ１欠損細胞、及びヒト内皮細胞をヒト血液とともに培養した。図２７に示すように、ヒト血液単独又はヒト内皮細胞と６０分間インキュベートしたヒト血液は、約１０ｎｇ／ｍＬのＴＡＴタンパク質を産生した。さらに、ヒト血液と野生型豚内皮細胞との共培養により、凝固が活性化され、ＴＡＴ複合体形成が５８ｎｇ／ｍＬに増加した。対照的に、ＣＤ５５ ＫＩ＋ＧＧＴＡ欠損豚内皮細胞との共培養は、ＴＡＴ複合体形成の有意な減少をもたらした。これらのデータは、ヒトＣＤ５５発現が凝固活性化を調節することができることを示唆する。

【0132】

[0198] ペイロード９又はペイロード１０で遺伝子改変された豚から単離したサンプルについてＲＮＡｓｅｑを実施した。結果から、細胞毒性遺伝子（Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７）とともに、ペイロード免疫改変導入遺伝子、即ち補体導入遺伝子の発現増加が示された（図３６）。

【0133】

実施例８：異種移植における抗体と機能的結合を妨げる酵素切断の可能性
[0199] 抗体媒介性拒絶反応は、歴史的に、末期器官不全に対する実行可能な処置としての異種移植の開発の主な妨げとなっている。しかしながら、最近の遺伝学的進歩により、確立された異種抗原標的を欠く多重遺伝子ノックアウト豚の開発が可能になった。ａＧａｌ、Ｎｅｕ５Ｇｃ、及びＳＤａのノックアウトは、移植片生存の改善に関連している。しかしながら、他の異種抗原標的への残留抗体結合の影響、及びこれらの抗原の除去が高度に感作されたヒト血清から組織を保護するか否かを十分に理解するために、さらなる研究が必要である。ここでは、異種抗原ノックアウトが高いＰＲＡ血清結合を減少させるか否か、また酵素分解によって機能的抗体結合が減少するか否かを調べた。

【0134】

[0200] ヒト及びブタのＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ分離を用いて末梢血から収集した。ＷＴ豚及び実施例７の遺伝子改変Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋１２ＴＧ）から、ブタ大動脈内皮細胞（ｐＡＥＣ）を処理した。Massachusetts General Hospital HLA研究室から、無記名の高及び低ＰＲＡ血清サンプルが惜しみなく提供された。心臓、肝臓、腎臓の異種移植レシピエントから血清を収集した。血清抗体をＩｄｅＳ（Genovis Inc.）によって酵素的に切断した。

【0135】

[0201] 低ＰＲＡヒト血清は、ヒトＰＢＭＣ標的細胞への最小の結合を示すが、高ＰＲＡヒト血清は、高レベルで同じヒトＰＢＭＣに結合する（図４３Ａ）。対照的に、高ＰＲＡ血清及び低ＰＲＡ血清の両方がブタＰＢＭＣに強く結合する（図４３Ｂ）。高ＰＲＡ血清はまた、ブタ大動脈内皮細胞（ｐＡＥＣ）への有意な結合を示す。遺伝的改変は、全ヒト血清の結合を劇的に（＞９５％）減少させる（図４４）。重要なことに、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋１２ＴＧ）由来の心臓、肝臓、及び腎臓異種移植片を用いたｉｎ ｖｉｖｏ異種移植実験は、移植後に採取されたレシピエント血清からの抗体結合の減少を通してブタ特異的抗体の隔離を示す（図４５）。これらのデータは、低いレベルの残留異種抗体が存在することを示唆する。図４６Ａ～４６Ｃは、ＩｇＧ特異的プロテアーゼ、ＩｄｅＳがヒト及びカニクイザル血清からの機能的ＩｇＧの結合をバックグラウンドレベルへ効果的に減少させることを示す。

【0136】

[0202] 既知の異種抗原標的を除去する遺伝子改変は、ヒト及び霊長類の血清のブタ細胞への結合を減少させるが、低レベルの異種抗体結合は残っている。高ＰＲＡ血清と低ＰＲＡ血清は類似しており、結合はＨＬＡ－ＳＬＡ交差反応性に関係しない可能性が示唆される。高度に感作された患者の血清をＩｄｅＳ処理したところ、Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋１２ＴＧ）細胞との交差適合が陰性であった。未知の標的を有する抗体から異種移植片標的を保護する他のアプローチは、補体活性化及び血栓形成などの下流の後遺症を防止するためにさらなる遺伝子改変を用いることである。このデータは、酵素的抗体切断が残留ＩｇＧの機能的結合を首尾よく減少させ得ることを初めて示し、この処置はまた、予め形成された異種抗体結合の影響を減少させるためのアプローチであり得ることを示唆する。

【0137】

実施例９：ＰＥＲＶ非含有免疫学的に適合するブタ細胞、組織、器官、豚、及び子孫の作製
[0203] ブタの器官は、大きさ及び機能がヒトの器官と類似しており、豚を多数飼育できることから、異種移植に有利な資源と考えられている。しかしながら、ブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）伝播の潜在的リスク、及び免疫学的不適合により、ブタ器官の臨床使用が妨げられている。ＰＥＲＶは、全ての豚系統のゲノムにみられるγレトロウイルスである。豚ゲノムには、ＰＥＲＶエレメントが数コピーから数十コピー含まれている（Lee 2011）。他の人畜共通病原体とは異なり、ＰＥＲＶは、豚ゲノムの不可欠な部分である。このように、それらは、生物学的に安全な繁殖によって排除することはできない（Schuurman 2009）。現在までのところ、臨床現場でヒトへのＰＥＲＶ伝播を示した研究はないが、ＰＥＲＶは、「コピー＆ペースト」機構を介してヒト細胞に感染し、増殖することができることが示されている。細胞培養において、ウイルス粒子が放出され得、ヒト細胞に感染し得、ヒトゲノムに、優先的に遺伝子内領域において、及び活性クロマチンリモデリングの領域において、ランダムに組み込まれ得ることが示されている（Armstrong 1971、Moalic 2006、Niu 2017、Patience 1997）。また、ＰＥＲＶ－Ａ及びＰＥＲＶ－Ｂの両方がヒト細胞に感染できることが示されている。ＰＥＲＶ－Ｃはエコトロピックであるが、組換えウイルス型（Ａ／Ｃ）は最大の感染能を示す。さらに、いったんＰＥＲＶがＬＴＲ配列の伸長を介して新たな宿主ゲノム環境に適応すると、感染能が増大する可能性がある。ＰＥＲＶはまた、感染したヒト細胞から、ブタ細胞と接触したことのない他のヒト細胞へ水平伝播することができる。ｉｎ ｖｉｖｏの免疫不全マウスでは、ＰＥＲＶが豚細胞からマウス細胞へと伝播できることが示されている（Clemenceau 2002）。ＰＥＲＶの組込みは、他のレトロウイルスで報告されているように、免疫不全及び腫瘍形成につながる可能性がある。遺伝子工学における最近のブレークスルーは、不死化豚細胞株におけるＰＥＲＶのゲノム全体にわたる不活性化（Yang 2015；ＰＣＴ公開番号国際公開第１７／０６２７２３号）及びＰＥＲＶ非含有豚の作製（Niu 2017；ＰＣＴ公開番号国際公開第１８／１９５４０２号）を示している。

【0138】

[0204] ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を利用して、ＰＫ１５豚腎臓上皮細胞ゲノムからのＰＥＲＶエレメントの全６２コピー（Yang 2015）、及びブタ胎児線維芽細胞からの全２５コピーの完全排除と、その後の全ＰＥＲＶエレメントを不活性化した生きた豚の作製（Niu 2017）が達成されている。この成功は、現在、ＰＥＲＶ非含有豚を誘導することが可能であり、それが異種移植のための安全なドナープールを提供する可能性があることを示した。

【0139】

[0205] ＰＥＲＶが依然として活性であり、ヒト細胞において伝播しているか否かを判定するために、ＰＥＲＶ感染ＨＥＫ２９３Ｔ－ＧＦＰ細胞（ｉＨＥＫ２９３Ｔ－ＧＦＰ）の集団及びクローンの両方において４ヶ月を超えてＰＥＲＶコピー数を監視した。ｄｄＰＣＲ（Pinheiro 2012）により測定したところ、ＰＥＲＶコピー数は、経時的に増加することが観察された。

【0140】

[0206] 豚ゲノム中のＰＥＲＶ ｐｏｌの全コピーを破壊することが、豚からヒト細胞へのＰＥＲＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ伝播を排除できるか否かを調べる研究が実施されている（Niu 2017）。高度に操作されたＰＥＲＶ胎児線維芽細胞クローンの細胞培養上清中に逆転写酵素活性は検出できなかったことから、改変された細胞がＰＥＲＶ粒子を産生することはあったとしてもごくわずかであることが示唆される。９７％を超えるＰＥＲＶ ｐｏｌを標的とするＰＫ１５クローンは、バックグラウンドレベルと同様のＰＥＲＶ感染の最大１０００倍の減少を示した。これらの結果は、ＰＫ１５クローンとの接触歴のあるヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞の連続希釈液のＰＣＲ増幅によって確認された。豚の様々な組織から単離した総ＲＮＡは、ｍＲＮＡレベルで約１００％のＰＥＲＶ不活性化を確認している。

【0141】

[0207] 現在までに、ヨークシャー（Yorkshire）種から１００％のＰＥＲＶ ＫＯを有する複数のクローンが作製され、豚クローニングが進行中である。ＰＥＲＶ不活性化豚生産は、頑健で、６３頭のＰＥＲＶ不活性化子豚が生産されており、そのうち４７頭は雌、１６頭は雄である。今日まで、最も古い健康な動物は、２年間生存してきた。４３頭のＰＥＲＶ ＫＯ豚は、現在、繁殖のために老化している。豚のクローニングに用いた細胞の正常な核型と一致して、ＰＥＲＶ不活性化豚では、異常な染色体構造変化は検出されていない。

【0142】

[0208] ＰＥＲＶの不活性化及び遺伝子編集が大動物に及ぼす影響をモニタリングするための長期研究が実施されている。この技術は、米国においてヨークシャー（Yorkshire）及びユカタン（Yucatan）の両豚系統を含むさらなる豚系統に適用されている。ソースのドナー豚は、全てのＰＥＲＶエレメントを無効にしてバックグラウンドラインで遺伝子操作されるであろう。

【0143】

[0209] ＰＥＲＶ非含有及び免疫学的に適合性の豚のバージョン反復。ゲノム中に活性ＰＥＲＶを保有していないドナー豚、並びにヒト組織に適合する免疫系、炎症系、及び凝固系が亢進している豚を遺伝子操作するための研究が行われている。前者に関しては、豚ゲノム中の全てのＰＥＲＶの機能が、ＰＥＲＶエレメント中の逆転写酵素遺伝子（ｐｏｌ）の触媒ドメインを破壊するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９工学を用いて根絶されている豚（Ｎｉｕ ２０１７及びＷＩＰＯ公開番号国際公開第２０１８／１９５４０２号に記載されている方法を用いて）、並びにヒト組織適合性器官を提供するためのノックアウト（ＫＯ）、ノックイン（ＫＩ）、及びゲノム置換の組合せを用いている。後者に関しては、体液性拒絶を誘発する主要な異種炭水化物抗原産生遺伝子／酵素のうちの３つ、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ、及びβ１，４Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ４ＧＡＬＮＴ２）が遺伝的に不活性化された豚を、本明細書に記載されるように作製した。これらの遺伝子の機能喪失は、ブタ移植片の内皮への予め形成された抗豚抗体の結合を大部分排除することが意図された。さらに、例えばヒト補体系（ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、及びｈＣＤ５９）、凝固系（例えば、ｈＣＤ３９、ｈＴＨＢＤ、及びｈＴＦＰＩ）、炎症応答（例えば、ｈＡ－２０、ｈＣＤ４７、及びｈＨＯ－１）、並びにＮＫ（例えば、ＰＤ－Ｌ１）及びＴ細胞応答（例えば、ｈＨＬＡ－Ｅ、ｈＢ２Ｍ）を調節するために、重要な免疫調節因子をＰＥＲＶ非含有豚ゲノム内の単一遺伝子座に挿入した。転位を介した単一コピーポリシストロン性導入遺伝子組込みを用いて、これらのヒト化遺伝子をノックインした。

【0144】

[0210] ＰＥＲＶを含まず、免疫適合性ペイロードを有する豚が作製され得、この豚は、種々の所望の特性を有することが意図された。この目標に向けて、ドナー豚は、遺伝子改変のいくつかの反復を介して作出された。図２１は、連続的な遺伝子編集によるドナー豚作製の進行を概説する。最初の反復、Ｐｉｇ １．０において、ブタ線維芽細胞は、全ＰＥＲＶコピーがゲノム内から機能的に削除されるか、又はゲノム内で不活性化されるように、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９仲介非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を用いて遺伝的に操作された。Ｐｉｇ ２．０は、異種免疫応答の様々な成分を改変するＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ２Ｍ、ＣＤ４７、ＣＤ３９、ＴＨＢＤ、ＴＦＰＩ、Ａ２０、ＰＤ－Ｌ１、及びＨＯ－１から選択した１２個までの導入遺伝子又はノックインのＰｉｇｇｙＢＡＣを介したブタゲノムへのランダム組込みと結合させて、３つの主要な異種炭水化物抗原産生遺伝子（３ＫＯ；ＧＧＴＡ１、Ｂ４ＧＡＬＮＴ２、ＣＭＡＨ）を欠失させるために、ＣＲＩＳＰＲを介したＮＨＥＪによって作製した。Ｐｉｇ ３．０反復に関しては、次いで、３ＫＯ及び最大１２の特定の導入遺伝子をＰＥＲＶ非含有バックグラウンド上に保有するソースドナー豚を作製した。ソースドナー豚の次世代（Ｐｉｇ ３．１、３．２など）は、ｖＷＦ遺伝子のヒト化並びにアシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）及び内因性Ｂ２Ｍ遺伝子の欠失などの追加的改変を保有するように遺伝子操作されるであろうと考えられる。

【0145】

[0211] ＰＥＲＶ非含有３ＫＯ＋ＴＧ豚（Ｐｉｇ ３．０、図２１）を遺伝子操作した後、これらの豚を交雑させて、豚の子孫及び／又はドリフト（drift）、ドローブ（drove）、同腹仔、及び／又はサウンダー（sounder）が作製されるであろう。

【0146】

[0212] 免疫適合性ペイロード、異種抗原破壊、及びＰＥＲＶ破壊を組み込んだＰｉｇ ３．０を作製するための細胞工学及びＳＣＮＴ
[0213] ＰＥＲＶ非含有Ｐｉｇ ３．０の作製のために、異種適合性改変を有するＰｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）を最初に作製した。Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）には、導入遺伝子ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９、ｈＢ２Ｍ、ｈＨＬＡ－Ｅ、ｈＣＤ４７、ｈＴＨＢＤ、ｈＴＦＰＩ及びｈＣＤ３９が含まれていた。Ｐｉｇ ２．０を作製するための体細胞核移植（ＳＣＮＴ）のためのドナー細胞を生成するために、野生型ブタ耳線維芽細胞を、最初に、以下の両方で電気穿孔した：ａ）ＧＧＴＡ、ＣＭＡＨ、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９試薬；及びｂ）（ｉ）ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼカセット（ｉｉ）３つの発現可能なシストロンに組織化された９つのヒト導入遺伝子（ｈＣＤ４６、ｈＣＤ５５、ｈＣＤ５９、ｈＢ２Ｍ、ｈＨＬＡ－Ｅ、ｈＣＤ４７、ｈＴＨＢＤ、ｈＴＦＰＩ、及びｈＣＤ３９）からなる遺伝子導入構築物を有するペイロードプラスミド（図５１参照）。線維芽細胞の単一細胞クローンを作製し、ａ）所望のゲノム改変を有するクローンを同定するための断片分析／全ゲノムシーケンシング（図５１Ｃ参照）及びｂ）従来のＰＣＲ（図５１Ｄ参照）によってスクリーニングした。次いで、所望の改変を有するクローンをドナーとして使用して、ＳＣＮＴによりＰｉｇ ２．０を作製した。

【0147】

[0214] Ｐｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）から単離された細胞を手に入れて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用するＰＥＲＶ工学を用いて、ＰＥＲＶ非含有でもある異種適合性改変を有する細胞を作製した。Ｐｉｇ ２．０線維芽細胞を、ＰＥＲＶエレメントの全ゲノムコピーに共通の逆転写酵素（Ｐｏｌ）遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９試薬で電気穿孔した。電気穿孔した細胞の単一細胞クローンを作製し、これらのクローンをディープシーケンシングによってスクリーニングして、Ｐｏｌ遺伝子の触媒コアが破壊されたクローンを同定した（図５１Ｃ参照）。次いで、Ｐｏｌにおいて所望の破壊を有するクローンを核型分析に供し（図５１Ｅ参照）；次いで、正常な核型を有するクローンをＳＣＮＴにおいて使用して、Ｐｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）胚及び豚を作製した。

【0148】

[0215] Ｐｉｇ ３．０のゲノム、生化学、表現型特徴のキャラクタリゼーション
[0216] Ａ）導入遺伝子及びノックアウトの完全性の評価
[0217] Ｐｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）を作製したので、次に、本発明者らは、そこでの遺伝子改変のオンターゲット及びオフターゲット効果を綿密に調べることを模索した。これを目的として、本発明者らは、ＷＴ線維芽細胞並びに上記で作製したＰｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０線維芽細胞について、１０Ｘ全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を実施した。スクリーニングのために行われたディープシーケンシングと一致して、ＷＧＳは、ＰＥＲＶ ｐｏｌ及びＧＧＴＡ／Ｂ４ＧＡＬＮＴ２／ＣＭＡＨ遺伝子のゲノムコピーに導入された突然変異は全て、改変された遺伝子コピーの機能的ノックアウトに翻訳されると予想されるフレームシフト挿入又は欠失であることを確認した（図５１Ａ及び５１Ｃ参照）。さらに、本発明者らは、ブタゲノム中に９つの全導入遺伝子が存在することを確認し、驚くべきことに、遺伝子導入構築物は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的部位のＧＧＴＡ１対立遺伝子の１つに組み込まれていることがわかった。

【0149】

[0218] ＣＲＩＳＰＲ編集の潜在的に交絡するオフターゲット効果に関して、本発明者らは、本発明者らの所望の編集の機能を妨害することが予想されるアーチファクト、又は豚の健康に対する予想される有害な効果を妨害することが予想されるアーチファクトを見出さなかった。本発明者らは、ＷＴとＰｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）の間、又はＰｉｇ ２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）とＰｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）の間で構造変異体の差は観察せず、これらの豚の全般的なゲノム安定性を示した。小さなインデルのようなより小さなゲノム変化に関して、本発明者らは、使用したガイドＲＮＡの全１，２１１の予測オフターゲット部位を調べ、ＷＴと比較してＰｉｇ ２．０のＢ４ＧＡＬＮＴ２ ｇＲＮＡオフターゲット部位に２つの小さな挿入を見出した；しかしながら、どちらもタンパク質コード配列に影響しなかった。さらに、本発明者らがＰｉｇ ３．０細胞とＰｉｇ ２．０細胞を比較すると、結果として予想されるさらなるゲノム変更は観察されなかった。本発明者らは、２つのＰＥＲＶ ｇＲＮＡオフターゲット部位内に２つの欠失と１つの挿入のみを認め、どちらもタンパク質コード領域外に発生し、実際には体細胞突然変異を表している可能性がある（Kim 2014参照）。機能的意味がなく、本発明者らの豚の大部分が正常な病態生理学データとあわせて考えて、本発明者らは、選択したＰｉｇ ３．０がゲノム安定性を維持していると結論付ける。

【0150】

[0219] ＤＮＡレベルでゲノム改変を確認したので、本発明者らは、Ｐｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）が適切なトリプルノックアウトと９ＴＧ発現を有するか否かを、ＲＮＡ発現と免疫アッセイ法を用いてさらに検討した。本発明者らは、最初にＲＮＡ－ｓｅｑを実施し、Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０の両方が、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からのものと同等のレベルで全ての導入遺伝子を発現することを見出した（図５２Ａ）。さらに、本発明者らは、豚臍帯静脈内皮細胞（ＰＵＶＥＣ）と線維芽細胞の両方で同等の導入遺伝子発現プロファイルとレベルを観察し、導入遺伝子がこれらの細胞型の間で遍在的に発現することを示唆した。次に、本発明者らは、遺伝子操作した豚におけるタンパク質発現の特性を調べた。本発明者らは、細胞表面上のα－Ｇａｌ、Ｎｅｕ５ＧＣ、及びＳＤａのグリカンマーカーの減少を認め、これは、Ｐｉｇ ２．０細胞（３ＫＯ＋９ＴＧ）及びＰｉｇ ３．０細胞の両方において、これらのグリカンエピトープの合成に関与する３つの遺伝子（それぞれ、ＧＧＴＡ、ＣＭＡＨ、及びＢ４ＧＡＬＮＴ２）の機能的排除を示唆する（図５２Ｂ）。ＰＵＶＥＣのＦＡＣＳ分析により、本発明者らは、Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０の両方がタンパク質レベルで全ての導入遺伝子を発現することを認めた。実際、９つの導入遺伝子のうち８つは、ＨＵＶＥＣのものと同等のレベルで強固に発現している。興味深いことに、ＴＨＢＤ発現は検出可能であるが、はるかに低いレベルである。ＦＡＣＳ分析と一致して、ＩＨＣ研究は、Ｐｉｇ ３．０腎臓が３つのグリカン抗原を欠くことを示した（図５２Ｃ）。また、ＦＡＣＳ染色と一致して、本発明者らは、ＴＨＢＤを除いて、Ｐｉｇ ３．０腎臓における８つの導入遺伝子の発現を検出した（図５２Ｃ）。まとめると、本発明者らは、ＲＮＡ発現及び免疫アッセイデータから、本発明者らのトリプルノックアウト及び９ＴＧ遺伝子改変が、遺伝子操作した豚において、細胞及び組織レベルでのＲＮＡ及びタンパク質発現の成功につながると結論付ける。

【0151】

[0220] Ｂ）Ｐｉｇ ３．０細胞の異種適合性の特徴の評価
[0221] 次に、本発明者らは、ゲノム改変豚が異種適合性機能を獲得したか否かを検討した。本発明者らは、最初に、改変豚細胞が予め形成されたヒト抗体結合を回避することを遺伝子改変が可能にするか否かを試験した。Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣは、ＷＴ ＰＵＶＥＣと比較して、ヒトＩｇＧ及びＩｇＭへの抗体結合の９０％を超える減少を示し、異種移植に対する抗体障壁が３ＫＯによって大幅に軽減され得ることを確認した（図５３Ａ）。さらに、プールされたヒト血清由来のヒト補体とインキュベートした場合、ヒト補体モジュレーターＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９を発現するトリプルノックアウトを有するＰｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣは、それらのヒトＨＵＶＥＣ対応物と同様に、最小のｉｎ ｖｉｔｒｏヒト補体毒性を示した（図５３Ｂ）。まとめると、これらの結果は、移植した場合、抗体結合及び補体活性化が有意に低下した結果として、Ｐｉｇ ３．０由来異種移植片は、体液性損傷及び超急性拒絶反応に対する感受性が低いことが予想されることを示唆している。

【0152】

[0222] さらに、本発明者らは、Ｐｉｇ ３．０がヒト自然細胞免疫によって媒介される損傷に対してより抵抗性であるか否かを検討した。ｅｘ ｖｉｖｏアッセイに供した場合、ＨＬＡ－Ｅ／Ｂ２Ｍを発現するＰｉｇ ３．０は、ＷＴ ＰＵＶＥＣのものと比較して、ＮＫ媒介細胞殺傷に対して有意に強い耐性を示した（図５３Ｃ）。まとめると、これらの結果は、移植した場合、Ｐｉｇ ３．０細胞は、ヒト自然免疫による攻撃に対してより抵抗性であることが期待されることを示唆した。

【0153】

[0223] 最後に、本発明者らは、Ｐｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）が異種移植でしばしば観察される血小板の活性化及び凝固カスケードの調節不全を減弱できるか否かを検討した。血管新生したＷＴブタ器官をヒトに移植すると、予め形成された抗体、補体、自然免疫細胞は、内皮細胞の活性化を誘導し、凝固及び炎症を誘発し得る。豚内皮細胞からの凝固調節因子とヒト血液との不適合は、異常な血小板活性化とトロンビン形成を導き、損傷を悪化させる。さらに、豚とヒトとの間の凝固調節因子（例えば、組織因子経路阻害剤、ＴＦＰＩ）の分子不適合性は、外因性凝固調節を無効にする。

【0154】

[0224] これらの異種凝固問題に対処するために、本発明者らは、Ｐｉｇ ３．０に対する本発明者らのマルチ導入遺伝子構築物の一部として、Ｐｉｇ ３．０において以下の両方を過剰発現した：ａ）ヒトＣＤ３９（凝固カスケードにおけるＡＤＰの血栓効果を打ち消すＡＤＰヒドロラーゼ）及びｂ）ヒトＴＦＰＩ（内皮細胞活性化後に細胞表面に移行する因子）。次いで、本発明者らは、ブタ細胞に移植された場合に、これらの導入遺伝子が正しく機能し、凝固経路を調節する能力を検証するために、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏアッセイを行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＰａｓｅ生化学アッセイは、ＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣと比較した場合、Ｐｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣにおいて有意に高いＣＤ３９活性を示し、導入遺伝子からのそのより高いｍＲＮＡ及びタンパク質発現と一致した（図５３Ｆ）。同様に、活性化Ｐｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣは、ヒトＸａに効果的に結合し、中和する能力を示し、これは、凝固を軽減し、トロンビン－アンチトロンビン（ＴＡＴ）複合体の形成を減少させることができる（図５３Ｇ）。最後に、Ｐｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣと共培養されたヒト全血を用いたｅｘ ｖｉｖｏ凝固アッセイにおいて、最少のＴＡＴ（トロンビンアンチトロンビン）が形成され、ＴＡＴ形成のレベルはＨＵＶＥＣのそれと同様であり（図５３Ｅ）、Ｐｉｇ ３．０がヒト因子との強化された凝固適合性を獲得したことを示唆した。

【0155】

[0225] まとめると、これらの異種適合性実験の結果から、ヒト抗体結合の減弱、補体毒性、ＮＫ細胞毒性、食作用、凝固調節の回復から明らかなように、Ｐｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）は、ヒト免疫系との適合性の増強を獲得したことが示された。

【0156】

[0226] Ｃ）Ｐｉｇ ３．０祖先の生理学的表現型／概念実証豚
[0227] 遺伝子操作された豚の全体的な適応度を評価するために、本発明者らは、遺伝子操作された豚の生理学、受胎能、及び遺伝子改変の子孫への伝播を調べた。本発明者らは、ＰＥＲＶエレメント、免疫学的経路及び凝固経路上で広範に操作されたが、Ｐｉｇ １．０及び２．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）のいずれも、総白血球及び血小板、単球、好中球、及び好酸球数を含む正常な血球数を示すことを観察した（図５４Ａ）。本発明者らはまた、操作された豚について、正常な生体器官機能（肝臓、腎臓、及び心臓）を観察した（図５４Ｂ、５４Ｃ、及び５４Ｄ）。さらに、操作された豚は、ＷＴ豚と比較して、類似のプロトロンビン及びトロンビン時間を有した（図５４Ｅ）。

【0157】

[0228] さらに、本発明者らは、Ｐｉｇ １．０及び２．０が繁殖性であり、７匹の正常平均同腹仔サイズを産生することを見出した。ＷＴ豚と繁殖するＰｉｇ １．０の子孫は、その肝臓、腎臓、心臓組織に約５０％のＰＥＲＶ不活性化対立遺伝子を保有しており、このことは、メンデル遺伝学に従ってＰＥＲＶ－ＫＯ対立遺伝子が安定して遺伝することを示している（図５５）。同様に、Ｐｉｇ ２．０及びＷＴ豚の全ての子孫は、３ＫＯについてヘテロ接合であり（図５６Ａ）、約半分が９ＴＧを有し、発現は、ｍＲＮＡ（図５６Ｂ）及びタンパク質レベルの両方で確認された（図５６Ｃ）。このことは、遺伝子改変が通常の繁殖によって一掃されていないことを示唆している。したがって、本発明者らは、遺伝子操作された豚が編集された対立遺伝子の正常な生理学、受精能、及び生殖系列伝達を示すと結論付ける。

【0158】

[0229] Ｄ）結論
[0230] 遺伝子操作された豚は、器官不足の未解決の必要性に対処する上で非常に有望である。本報告では、本発明者らは、ＰＥＲＶ活性を根絶し、ヒトの免疫適合性を高めるように改変した４２のゲノム遺伝子座を有するＰｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）を操作した。Ｐｉｇ ３．０の広範な分析から、操作された豚細胞は、ヒト抗体結合の低下、補体毒性、ＮＫ細胞毒性、及び凝固調節異常を示すことが示された。また、本発明者らは、本発明者らの遺伝子操作した豚の正常な病態生理、受胎能、及び遺伝性を調べ、検証した。Ｐｉｇ ３．０の作製の成功は、臨床移植のための安全で有効な器官を提供する能力を高める。

【0159】

[0231] Ｐｉｇ ３．０（３ＫＯ＋９ＴＧ）の作製の成功は、ゲノムを広範囲に操作し、大型動物に新規機能を付与する合成生物学の力を実証している。Ｐｉｇ ３．０では、本発明者らは、ＰＥＲＶエレメントの２５コピー、異種遺伝子の８対立遺伝子を欠失させ、同時に９つのヒト導入遺伝子を生理学的に適切なレベルまで発現させた。これは、大型動物モデルにおけるゲノム改変の記録を４２に拡張する。この規模で複雑な遺伝子工学を実施できるようになり、本発明者らは、追加の編集を操作し、最終的には、異種移植に最も適した組合せで豚を選択する立場にある。さらに、本発明者らは、ツールを用いて、免疫寛容、器官寿命、及びウイルス免疫などのさらなる新規機能を達成するようにＰｉｇ ３．０をさらに操作することができると考える。

【0160】

[0232] Ｅ）方法
[0233] ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ設計
[0234] 本発明者らは、ＲライブラリＤＥＣＩＰＨＥＲを用いて、Ｐｉｇ ２．０ゲノム中の全てのｐｏｌ触媒配列を特異的に標的化するために、特異的ｇＲＮＡ（ＰＥＲＶ－３Ｎ：５’－ＴＣＴＧＧＣＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣＡＡＡＣ－３’、ＰＥＲＶ－５Ｎ：５’－ＧＧＣＴＴＣＧＴＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＣＧ－３’、ＰＥＲＶ－９Ｎ：５’－ＴＴＣＴＡＡＧＣＡＧＴＣＣＴＧＴＴＴＧＧ－３’）を設計した。さらに、本発明者らは、特異的ｇＲＮＡ（ＧＧＴＡ１：５’－ＧＣＴＧＣＴＴＧＴＣＴＣＡＡＣＴＧＴＡＡ－３’、ＣＭＡＨ：５’－ＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＡＴＣＴＣＡＡＧＧＡ－３’、Ｂ４ＧＡＬＴＮ２：５’ＧＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＧＴＣＡＣＡＴ－３’）を用いて、ＧＧＴＡ１、ＣＭＡＨ及びＢ４ＧＡＬＮＴ２をそれぞれ標的とした。

【0161】

[0235] 細胞培養
[0236] ブタ胎児線維芽細胞及び線維芽細胞ＦＦＦ３を、１５％ウシ胎児血清（Invitrogen）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Invitrogen）及び１％ ＨＥＰＥＳ（Thermo Fisher Scientific）を補充したピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Invitrogen）高グルコース中で維持した。全ての細胞を、３８℃、５％ ＣＯ２、９０％ Ｎ２、及び５％ Ｏ２の加湿トリガスインキュベーター中で維持した。

【0162】

[0237] ブタ臍帯静脈内皮細胞（ＰＵＶＥＣ）を臍帯静脈から新たに単離し、１０％ウシ胎児血清（Gibco）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Invitrogen）及び１％ ＨＥＰＥＳ（Thermo Fisher Scientific）を補充したPriGrow II培地（abm）中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、ＡＴＣＣ、ＰＣＳ－１００－０１０）を、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｋｉｔ－ＢＢＥ（ＥＣＧキット、ＡＴＣＣ）を補充した血管細胞基底培地（ＡＴＣＣ）中で培養した。ヒトＮＫ－９２細胞株を、１２．５％ウシ胎児血清（Gibco）、１２．５％ウマ胎児血清（ＦＥＳ、Solarbio）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Invitrogen）を補充したＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ（α－ＭＥＭ、Gibco）中で培養した。ヒトマクロファージ細胞株ＴＨＰ－１を、１０％ウシ胎児血清（Gibco）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Invitrogen）を補充したＲＰＭＩ １６４０（ＢＩ）中で培養した。ＴＨＰ－１細胞の分化は、６２．５ｎＭのＰｈｏｒｂｏｌ－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ、Sigma）中で３日間達成され、これらの細胞の組織培養プラスチックへの付着によって確認された。

【0163】

[0238] ＰｉｇｇｙＢａｃ－Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡの構築及び細胞株の樹立
[0239] 以前に記載された手順（Ｙａｎｇ ２０１５）と同様に、本発明者らは、Ｕ６－ｇＲＮＡ１－Ｕ６－ｇＲＮＡ２（Ｇｅｎｅｗｉｚ）をコードするＤＮＡ断片を合成し、それを以前に構築されたＰｉｇｇｙＢａｃ－ｃａｓ９プラスミドに組み込んだ。ＰｉｇｇｙＢａｃ－Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡ組込みを有するＦＦＦ３細胞株を確立するために、本発明者らは、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステムを使用して、ベンダー（Thermo Fisher Scientific）によって提供される指示に従って、１４．３μｇのＰｉｇｇｙＢａｃ－Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡプラスミド及び５．７μｇのSuper PiggyBac Transposaseプラスミド（System Biosciences）で５×１０５のＦＦＦ３細胞をトランスフェクトした。組み込まれた構築物を有する細胞を選択するために、２μｇ／ｍＬのピューロマイシンをトランスフェクトされた細胞に適用した。本発明者らが野生型ＦＦ３細胞にピューロマイシンを適用した陰性対照に基づき、本発明者らは、ピューロマイシン選択が４日で完了することを決定した。その後、ＦＦＦ３－ＰｉｇｇｙＢａｃ細胞株を２μｇ／ｍＬのピューロマイシンで維持し、２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを適用してドキシサイクリン誘導性ＦＦＦ３－ＰｉｇｇｙＢａｃ細胞株のＣａｓ９発現を１週間誘導した。

【0164】

[0240] ＦＦＦ３細胞株における構成的Ｃａｓ９発現を回避するために、本発明者らは、Lipofectamine 2000試薬を用いて３μｇのＰｉｇｇｙＢａｃ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ－Ｏｎｌｙ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅベクターで５×１０５細胞をトランスフェクトすることによって、ＦＦＦ３ゲノムからＰｉｇｇｙＢａｃ－Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡ切除を行った。次いで、ＰｉｇｇｙＢａｃ－Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡ切除ＦＦ３細胞を、クローン増殖及び遺伝子型決定のために９６ウェルプレートに単一細胞選別した。

【0165】

[0241] 単一細胞及び単一細胞クローンの遺伝子型決定
[0242] まず、ＦＦＦ３－ＰｉｇｇｙＢａｃ－Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡ細胞株について、ピューロマイシン選択とそれに続くＰｉｇｇｙＢａｃ切除を行った。次いで、細胞を、直接遺伝子型決定のための９６ウェルＰＣＲプレート及びコロニー増殖のための９６ウェル細胞培養プレートの両方に、単一細胞に選別した。クローン増殖なしに単一ＦＦ細胞の遺伝子型決定を行うために、本発明者らは、選別した単一細胞からＰＥＲＶ遺伝子座を直接増幅した。本発明者らはまた、選別した単一細胞から増殖したクローンについて遺伝子型決定を行った。遺伝子型決定の手順は、Yangら（６）の方法に従った。簡潔には、本発明者らは、０．５μｌの１０×ＫＡＰＡ発現抽出緩衝液（KAPA Biosystems）、０．１μｌの１Ｕ／μｌのKAPA Express Extract Enzyme、及び４．４μｌの水を含有する５μｌの溶解混合物を有する各ウェルを有する９６ウェルＰＣＲプレートに単一細胞を選別した。本発明者らは、溶解反応物を７５℃で１５分間インキュベートし、反応物を９５℃で５分間不活性化した。次いで、全ての反応物を、１×KAPA 2G fast（KAPA Biosystems）、０．２μＭ ＰＥＲＶ Illuminaプライマーを含有する２０μｌのＰＣＲ反応物に添加した（方法表２）。反応物を９５℃で３分間インキュベートし、９５℃の３０サイクル（単一細胞について）又は２５サイクル（単一細胞クローンについて）、２０秒；５９℃、２０秒及び７２℃、１０秒が続いた。Illumina配列アダプターを添加するために、３μｌの反応生成物を、次いで、１×KAPA 2G fast（KAPA Biosystems）及びIllumina配列アダプターを有する０．３μＭプライマーを含有する２０μｌのＰＣＲミックスに添加した。反応物を９５℃で３分間インキュベートし、９５℃の２０（単一細胞について）又は１０（単一細胞クローンについて）サイクル、２０秒；５９℃、２０秒及び７２℃、１０秒が続いた。ＰＣＲ産物をＥＸ２％ゲル（Invitrogen）で試験し、続いてゲルから約３６０ｂｐの標的生成物を回収した。次いで、これらの生成物をほぼ同量で混合し、精製し（QIAquick Gel Extraction Kit）、MiSeq Personal Sequencer（Illumina）でシーケンシングした。本発明者らは、次いで、ディープシーケンシングデータを分析し、CRISPR-GAを用いてＰＥＲＶ編集効率を決定した（５）。

【0166】

[0243] ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子型決定に用いられるプライマー
[0244] Ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ＰＥＲＶ＿ｐｏｌフォワード：５’－ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＧＡＣＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＴＴＣＡＡ－３’
[0245] Ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ＰＥＲＶ＿ｐｏｌリバース：５’－ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＡＴＣＴＧＧＧＣＣ－３’

【0167】

[0246] ＳＣＮＴ胚を生成するための体細胞マイクロインジェクション及び豚クローニングのための胚移植
[0247] 体細胞マイクロインジェクション手順は、Weiらによるものであった。全ての動物実験は、Yunnan Agricultural University,ChinaのAnimal Care Committeeの承認を得て行った。全ての化学物質は、特に断らない限り、Sigma Chemical Co.（St.Louis、MO、USA)から購入した。ブタの卵巣は、Hongteng Abattoir（Chenggong Ruide Food Co、Ltd、Kunming、Yunnan Province、China）から収集した。卵巣を、７５ｍｇ／ｍＬのペニシリンＧカリウム及び５０ｍｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンを補充した０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液中、２５℃～３０℃で実験室に移した。卵丘細胞－卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を直径３～６ｍｍの卵胞から単離し、次いで、０．１ｍｇ／ｍＬピルビン酸、０．１ｍｇ／ｍＬ Ｌ－システイン塩酸塩水和物、１０ｎｇ／ｍＬ表皮成長因子、１０％（ｖ／ｖ）ブタ卵胞液、７５ｍｇ／ｍＬペニシリンＧカリウム、５０ｍｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、並びに１０ＩＵ／ｍＬのｅＣＧ及びｈＣＧ（帝国臓器株式会社、東京、日本）を補充した２００μＬ ＴＣＭ－１９９培地中で、５％ ＣＯ２加湿雰囲気中で３８．５℃で培養した（ＡＰＣ３０Ｄ、ＡＳＴＥＣ、日本）。３８～４２時間のｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟後、ＣＯＣの増殖した卵丘細胞を、０．１％（ｗ／ｖ）ヒアルロニダーゼ中のＣＯＣのピペッティングを繰り返すことによって除去した。

【0168】

[0248] ＳＣＮＴは、前述したように行った。簡潔には、無傷の膜を有する第１の極体を押し出す卵母細胞を、０．１ｍｇ／ｍＬのデメコルシン、０．０５Ｍスクロース、及び４ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したＮＣＳＵ２３培地中で、核突出のために０．５～１時間培養した。次いで、突出した核を、０．１ｍｇ／ｍＬのデメコルシン及び５ｍｇ／ｍＬのサイトカラシンＢの存在下で、１０μＭのヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、０．３％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン、及び１０％のＦＢＳを補充したTyrodeの乳酸培地中で、斜角を付けたピペット（直径約２０μｍ）を使用することによって、極体とともに除去した。ＷＴ又はＰＥＲＶ非含有線維芽細胞を核ドナーとして使用した。単一のドナー細胞を除核卵母細胞の囲卵腔に注入した。

【0169】

[0249] ドナー細胞を、０．２５ＭのＤ－ソルビンアルコール、０．０５ｍＭのＭｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ（遊離酸）を含有する融合培地中で、胚細胞融合システム（ＥＴ３、富士平工業株式会社、東京、日本）を使用することによって、２００Ｖ／ｍｍの単一の直流パルスで２０μｓ、レシピエント細胞質体と融合させた。再構築された胚を、ＰＺＭ－３溶液（van’t Veer 1997）中で２時間培養して、核再プログラミングを可能にし、次いで、０．２５Ｍ Ｄ－ソルビンアルコール、０．０１ｍＭ Ｃａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、０．０５ｍＭ Ｍｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有する活性化培地中で、１５０Ｖ／ｍｍの単一パルスで１００μｓ活性化した。次いで、活性化された胚を、５ｍｇ／ｍＬのサイトカラシンＢを補充したＰＺＭ－３中で、５％ ＣＯ２、５％ Ｏ２、及び９０％ Ｎ２（さらなる活性化のためのAPM30D、ASTEC、日本）を有する加湿雰囲気中、３８．５℃で２時間培養した。次いで、再構築された胚を新たなＰＺＭ－３培地に移し、５％ ＣＯ２、５％ Ｏ２、及び９０％ Ｎ２を有する加湿空気中で３８．５℃で２日間及び７日間培養して、胚の卵割及び胚盤胞の発生率をそれぞれ検出した。

【0170】

[0250] １回の出産歴のある交雑種（Large White/Landrace Duroc）雌豚を、構築した胚の代理母として用いた。毎日午前９：００及び午後６：００に発情を調べた。活性化後６時間培養したＳＣＮＴ胚を外科的に代理物の卵管に移植した。胚移植２３日後に、超音波スキャナー（HS-101 V、本多電子株式会社、Yamazuka、日本）を用いて妊娠を調べた。

【0171】

[0251] 免疫蛍光法によるタンパク質発現のキャラクタリゼーション
[0252] ＷＴ、Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０の新生児（３～６日齢）ブタ腎臓凍結切片を免疫蛍光法に供して、組織レベルでの遺伝子改変（３ＫＯ及び９ＴＧ）の特性を評価した。凍結切片を氷冷アセトンで固定し、ブロックし、次いで１段階直接又は２段階間接免疫蛍光技術のいずれかを用いて染色した。使用した一次及び二次抗体を補足表２にまとめた。ProLong Gold DAPI（Thermo Fisher、P36931）を用いて核染色を行った。切片をLeica Fluorescence Microscopeを用いて画像化し、ImageJソフトウエアを用いて分析した。全ての写真は、ＷＴ、Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０凍結切片の間の蛍光強度の正確な比較を可能にするために、同じ条件下で撮られた。

【0172】

[0253] ブタ内皮細胞へのヒト抗体の結合
[0254] ブタ及びヒト内皮細胞へのヒトＩｇＧ及びＩｇＭ抗体の抗体結合を、以前に記載されたようにフローサイトメトリーによって評価した（Xenotransplantation, Methods and Protocols, Editors：Costa, Cristina, Manez, Rafael, ISBN 978-1-61779-845-0）。簡潔には、Ｐｉｇ ２．０、Ｐｉｇ ３．０、ＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣを収集し、２回洗浄し、染色緩衝液（１％ ＢＳＡを含有するＰＢＳ）に再懸濁した。正常ヒト男性ＡＢ血清（Innovative Research、ＩＰＬＡ－ＳＥＲＡＢ－Ｈ２６２２７）を５６℃で３０分間加熱不活性化し、染色緩衝液で１：４に希釈した。Ｐｉｇ ２．０、Ｐｉｇ ３．０、ＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣ（試験当たり１×１０５細胞）を、希釈したヒト血清とともに、それぞれ３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を冷染色緩衝液で洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Alexa Fluor 488（Invitrogen、Ａ１１０１３、１：２００希釈）及びヤギ抗ヒトＩｇＭ Alexa Fluor 647（Invitrogen、Ａ２１２４９、１：２００希釈）とともに４℃で３０分間インキュベートした。冷染色緩衝液で洗浄した後、細胞を、死／生ゲーティングを含むために、７－ＡＡＤ（ＢＤ、５５９９２５、１：１００希釈）を含有する染色緩衝液に再懸濁した。CytoFLEX Sフローサイトメーターで蛍光を取得し、FlowJo分析ソフトウエアを用いてデータを分析した。各サンプルについて、５，０００の事象を生細胞ゲートに収集し、「試験ＭＦＩ（ＩｇＧ又はＩｇＭ）－対照（二次抗体のみ）ＭＦＩ」によって生成される特異的メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）としてプロットした。

【0173】

[0255] ヒト補体細胞毒性アッセイ
[0256] Ｐｉｇ ２．０、Ｐｉｇ ３．０、ＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣを回収し、ＰＢＳで２回洗浄し、無血清培養培地に再懸濁した。細胞（試験当たり１×１０^５細胞）を、種々の濃度（０％、２５％、５０％及び７５％）のヒト血清補体（Quidel、Ａ１１３）の均一なプールとともに、３７℃及び５％ ＣＯ２で４５分間インキュベートした。その後、細胞をヨウ化プロピジウム（Invitrogen、Ｐ３５６６、１：５００希釈）で５分間染色し、CytoFLEX Sフローサイトメーターを使用することによって分析した。５，０００事象を各サンプルについて収集し、ヒト補体を介した細胞死の割合としてＰＩ陽性細胞の割合を用いた。

【0174】

[0257] ＮＫ細胞毒性アッセイ
[0258] ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣを標的細胞として使用し、それぞれ抗豚ＣＤ３１－ＦＩＴＣ抗体（Bio-Rad）及び抗ヒトＣＤ３１－ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ）で標識した。一方、ヒトＮＫ ９２細胞をエフェクター細胞として使用し、抗ヒトＣＤ５６－ＡＰＣ抗体（eBioscience）で標識した。エフェクター（Ｅ）及び標的細胞（Ｔ）を、３７℃及び５％ ＣＯ_２で４時間、Ｅ／Ｔ比３で共培養した。細胞をヨウ化プロピジウムで５分間染色し、次いでＦＡＣＳ分析に供した。ＣＤ３１＋ゲートにおけるＰＩ陽性細胞の割合を用いて、死滅した標的細胞の割合を計算した。

【0175】

[0259] 食作用アッセイ
[0260] ヒトマクロファージ細胞株ＴＨＰ－１の分化は、６２．５μＭの酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）によって３日間達成され、これらの細胞の組織培養プラスチックへの付着によって確認された。ブタ脾細胞（標的細胞）を、製造者のプロトコルに従って蛍光色素５／６－ＣＦＳＥ（Molecular Probes）で染色した。ＣＦＳＥ標識標的細胞を、ヒト分化ＴＨＰ－１細胞（エフェクター細胞）と、それぞれ１：１及び１：５のＥ／Ｔ比で、３７℃で４時間インキュベートした。マクロファージを抗ヒトＣＤ１１ｂ抗体で対比染色し、ＣＦＳＥ標識標的の食作用をＦＡＣＳで測定した。食作用活性は、以前に記載されているように計算した（Ide 2007）。

【0176】

[0261] ＣＤ３９生化学的ＡＤＰａｓｅアッセイ
[0262] Ｐｉｇ ２．０、Ｐｉｇ ３．０及びＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣを、アッセイの１日前に、９６ウェルプレートにおいてウェル当たり２×１０４で播種した。細胞を、３７℃及び５％ ＣＯ２で３０分間、５００μＭ ＡＤＰ（Chrono-Log Corp、＃３８４）とともにインキュベートした。マラカイトグリーン（Sigma、ＭＡＫ３０７）を添加して反応を停止し、６３０ｎｍで吸光度を測定して、ＫＨ２ＰＯ４の標準曲線に対するリン酸生成レベルを決定した。

【0177】

[0263] ＴＦＰＩ活性及びヒト第Ｘａ因子結合アッセイ
[0264] アッセイの前に、細胞を１μＭのＰＭＡで６時間処理して、Ｐｉｇ ２．０及びＰｉｇ ３．０ ＰＵＶＥＣの細胞表面上でｈＴＦＰＩ発現を誘導した。次いで、ＴＦＰＩ活性及びヒト第Ｘａ因子結合アッセイを、以前に記載されたように実施した（Xenotransplantation, Methods and Protocols, Editors：Costa, Cristina, Manez, Rafael, ISBN 978-1-61779-845-0）。全てのアッセイは、４連で行った。

【0178】

[0265] ＴＡＴ形成アッセイ
[0266] Ｐｉｇ ２．０、Ｐｉｇ ３．０及びＷＴ ＰＵＶＥＣ及びＨＵＶＥＣを、６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり３×１０５で播種した。１日後、細胞を、１ｍＬの新鮮なヒト全血（０．５Ｕ／ｍＬヘパリンを含む）とともに、３７℃で穏やかに振盪しながらインキュベートした。示された異なる時点で、血液を吸引し、そこから血漿を単離した。血漿中のＴＡＴ含有量を、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ－Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡキット（Abcam、ａｂ１０８９０７）を用いて測定した。

【0179】

[0267] 全ゲノムシーケンシングデータからの変異体コール
[0268] 対になった読み取りを、ＢＷＡ（ｖ０．７．１７－ｒ１１８８）によってＳｕｓ Ｓｃｒｏｆａ １１．１ゲノム（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｒｅｌｅａｓｅ－９１／ｆａｓｔａ／ｓｕｓ＿ｓｃｒｏｆａ／ｄｎａ／）にマッピングする。変異体（ＳＮＰ及びＩＮＤＥＬ）を、ＧＡＴＫ（ｖ４．０．７．０）を使用して、標準フィルターに加えて最小深度１０を必要とするＧＡＴＫベストプラクティス推奨に従ってコールした。

【0180】

[0269]オン／オフターゲット部位のＩｎ ｓｉｌｉｃｏ予測
[0270] Ｒ（ｖ３．５．０）におけるCRISPRSeek（ｖ１．２２．１）を用いて、６個までのミスマッチを可能にして、ゲノム全体のオンターゲット及びオフターゲット部位を予測する。インプットゲノムは、Sus Scrofa 11.1（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｒｅｌｅａｓｅ－９１／ｆａｓｔａ／ｓｕｓ＿ｓｃｒｏｆａ／ｄｎａ／）のいずれかである。

【0181】

[0271] 全ゲノムシーケンシングデータからのオフターゲットコール
[0272] CRISPRSeek（ｖ１．２２．１）によって予測されたオフターゲットのＰＡＭ部位に隣接する２０ｂｐ以内に含まれるＧＡＴＫからのフィルターされた変異体を、潜在的なオフターゲット改変としてコールする。親系統ＷＧＳデータが入手可能である場合、親系統から有意に０．５より多いか又は少ない対立遺伝子頻度を有する変異体を、自社開発の統計検定を用いて濾別する。この検定の仮定は、オフターゲット突然変異がまれな事象であるため、両対立遺伝子が同時に改変される可能性がきわめて低いことである。

【0182】

[0273] 突然変異の機能的影響解析
[0274] 変異体がフターゲット又は生殖系列突然変異であるかにかかわらず、ＶＥＰ（変異体効果予測因子、ｖ９３．３）を用いてその潜在的機能的影響を評価するために、転写レベルでの配列変化及びタンパク質レベルでのアミノ酸変化について注釈付けされる。高い影響を有する突然変異は、それらがフレームシフト、開始ゲイン／ロスト、停止ゲイン／ロスト、スプライスドナー／アクセプターシフト又はスプライス領域変化を生じ得る場合に、特に選択される。利用可能な場合はいつでも、突然変異は、ＡＰＰＲＩＳデータベースを使用して、それが原理又は代替転写物に影響を及ぼしているかを示すために注釈付けされる。

【0183】

[0275] ＲＮＡ－Ｓｅｑからの転写解析
[0276] ＲＮＡ－Ｓｅｑ読み取りを、スプライシング認識モード下でSTAR（ｖ２．６．１ａ）を用いてＳｕｓ Ｓｃｒｏｆａ １１．１ゲノムに整列させる。発現レベルは、豚トランスクリプトームと導入遺伝子の両方を入力転写物としてSalmon（ｖ０．１１．３）を用いてＴＰＭ（１００万当たりの転写物）として定量される。

【0184】

[0277] Ａｍｐｌｉｃｏｎ－ＳｅｑによるＰＥＲＶノックアウト効率解析
[0278] Ｑ２０未満の３’末端低品質塩基をトリミングした後、それらの重複が１００塩基を超える場合、対になった読み取りを断片にマージする。マージされた断片は、Ｑ２０未満の低品質塩基をハードマスクするためにさらにスキャンされ、スプライシング認識モード下でＳＴＡＲ（ｖ２．６．１ａ）を使用してＰＥＲＶアンプリコン標的配列に整列される。次いで、出力ＢＡＭファイルを社内Ｒスクリプト（ｖ３．５．０）によって解析して、アラインメントパターンを消化し、ＰＥＲＶアンプリコン標的配列内のＩＮＤＥＬの分布を評価し（触媒中心に対して）、ノックアウト効率を導出する。

【0185】

[0279] Ｃａｐｔｕｒｅ－ＳｅｑによるＰＥＲＶノックアウト効率解析
[0280] 対になった読み取りを、最初に、スプライシング認識モード下でＳＴＡＲ（ｖ２．６．１ａ）を使用してＰＥＲＶ標的配列に整列させ、続いて、Ｐｉｃａｒｄ（ｖ２．１８．１４）による整列位置依存性重複排除を行う。次いで、重複排除された対の読み取りを、社内スクリプトによって断片にマージする。次いで、マージされた断片を、スプライシング認識モード下でＳＴＡＲ（ｖ２．６．１ａ）を使用してＰＥＲＶ捕捉標的配列に再整列させる。次いで、出力ＢＡＭファイルを社内Ｒスクリプト（ｖ３．５．０）によって解析して、アラインメントパターンを消化し、捕捉標的配列内のＩＮＤＥＬの分布を評価し、ノックアウト効率を導出する。

【0186】

[0281] Ｃａｐｔｕｒｅ－ＳｅｑによるＰＥＲＶハプロタイプ解析
[0282] 対になった読み取りを、最初に、スプライシング認識モード下でＳＴＡＲ（ｖ２．６．１ａ）を使用してＰＥＲＶ標的配列に整列させる。Ｍｕｔｅｃｔ２（ｖ４．１．２．０）を使用して体細胞変異体をコールし、所与の閾値（ＭＡＦ＞０．０１）を超える小さい対立遺伝子頻度を有する変異体についてフィルタリングする。複数のサンプルからの濾過された変異体をマージして、ハプロタイプをタイピングするための変異体部位の集合を導出する。次に、適切に整列された対の読み取りを、社内スクリップによって断片にマージした。次いで、マージした断片を、スプライシング認識モード下でＳＴＡＲ（ｖ２．６．１ａ）を使用してＰＥＲＶ標的配列に再整列させる。目的の領域をカバーする各断片について、本発明者らは、改変部位の収集のための対立遺伝子を抽出して、断片のハプロタイプを規定する。最後に、ハプロタイプの分布を、目的の領域をカバーする全ての断片を計数することによって導出する。

【0187】

[0283] 全ゲノムシーケンシングデータを用いたペイロード組込み部位の同定
[0284] Ｓｕｓ Ｓｃｒｏｆａ １１．１ゲノム、ＰＥＲＶハプロタイプ、及びペイロードプラスミド配列からなる参照ライブラリに、スプライシング認識モード下でＳＴＡＲ（ｖ２．６．１ａ）を使用して、対の読み取りを整列させる。構造変異体（ＳＶ）は、ＤＮＡ融合点を検出するためにＬｕｍｐｙ（ｖ０．２．１３）を使用してＢＡＭファイルからコールされる。次に、本発明者らは、豚ゲノム及び組込み部位でのミスマッチ読み取りを伴うペイロード配列を架橋するＳＶについてスクリーニングする。

【0188】

[0285] 統計解析
[0286] 全ての統計解析は、Ｒ（ｖ３．５．０）及びExcel（ｖ２０１６）によって実施される。特に明記しない限り、ｐ値＜０．０５が有意である。複数のテストが同時に含まれる場合、全体的な誤発見率（ＦＤＲ）を制御するために、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順に従ってｐ値補正が実行される。特に明記しない限り、ＦＤＲ＜０．０５が典型的に使用される。

【0189】

実施例１０：ヒト血液による免疫学的に適合する豚肝臓の潅流
[0287] 器官機能解析のための異種移植の代用実験として、Ｐｉｇ ２．０（４－７；３ＫＯ＋１２ＴＧ）から分離した免疫学的に適合する豚肝臓を用いて肝潅流実験を行った。１２か月齢の豚から野生型肝臓と４－７肝臓（約８０ｋｇ）を分離した。肝臓をヒト全血及びヒト新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）で潅流した。簡潔な肝臓潅流プロトコルの概要を表１に示す。

【0190】

【表3】

【0191】

[0288] 種々の時点で肝臓から胆汁を収集し、分析した。図２８に示すように、総胆汁産生は、ＷＴ肝臓と比較して、４－７肝臓において約２倍増加した。さらに、４－７肝臓は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、及びアルブミン（ＡＬＢ）を含む肝障害のマーカーである代謝酵素の安定した血清レベルを示した（図２９Ａ～Ｃ）。さらに、４－７肝臓は、カリウム（Ｋ）及びナトリウム（Ｎａ）を含む安定した血清電解質レベルを示した（図２９Ｄ～Ｅ）。４－７及びＷＴ肝臓は、ＷＴ肝臓と比較して、４－７肝臓においてより高い、より安定したレベルで持続した補体（Ｃ３）発現についても試験された（図２９Ｆ）。凝固について分析した場合、４－７肝臓は、安定なプロトロンビン時間（ＰＴ）及び国際標準化比（ＰＴ－ＮＩＲ）、フィブリノーゲンレベル（ＦＩＢ）、並びにより低い活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を示した（図３０Ａ～Ｄ）。まとめると、これらのデータは、４－７肝臓が、改善された肝機能を有することを示している。

【0192】

実施例１１：豚から非ヒト霊長類（ＮＨＰ）への腎移植
[0289] ２０１４年以前は、豚から非ヒト霊長類（ＮＨＰ）への腎異種移植片の最長は９０日であり、移植片生着期間＞３０日はきわめて珍しい。宿主の自然免疫応答及び適応免疫応答を標的とする遺伝子変更を有するドナー豚の入手可能性の増加と相まって、導入及び維持免疫抑制療法レジメンが最近進歩した結果、移植片生着期間が＞１２５日に延長した（Higginbotham 2015、Iwase 2015b）。免疫、凝固、補体、炎症反応経路における分子不適合を補うためのさらなる遺伝子工学が、異種移植の分野を進歩させ始めている。ＧＴＫＯを作製する遺伝子改変及び１つのｈＣＲＰの過剰発現にもかかわらず、主として豚とＮＨＰの間の分子不適合に起因して、血栓性微小血管症及び全身性消費性凝固障害を含む凝固機能障害が持続した。

【0193】

[0290] 前臨床腎移植研究。腎移植前臨床研究のために、ＮＨＰで安全性及び有効性試験が実施される。安全性及び有効性検査のために、８～１０週齢のＰｉｇ ２．０ドナーの腎臓を、移植時に両側腎摘出術を受けるＮＨＰ（カニクイザル）レシピエントに移植する。異種移植片の機能は、血清クレアチニン値、全血球数、及びタンパク質の尿分析、並びに連続的な生検及び体重と全身状態の検査によってモニタリングする。免疫抑制は、同種移植において許容される組合せ及び強度の臨床的に関連する試薬からなる。これらには、ステロイド、抗ＮＨＰ胸腺細胞グロブリン、抗ＣＤ２０による誘導処置、及びステロイド、抗ＣＤ４０、ＭＭＦ及びラパマイシンによる維持免疫抑制が含まれる。予防的抗ウイルス療法、抗菌療法、及び抗凝固療法を実施し、ヘマトクリット値に基づいて必要に応じてEpogenの補充を行う。

【0194】

[0291] 正常なクレアチニンで、タンパク尿がないか又は低レベルであり、急性抗体又は細胞媒介性損傷がない生検で示された、６か月の良好に機能する異種移植片の生存は、有効性の十分な証拠を提供すると考えられる。

【0195】

[0292] 同種移植との類推により、予め形成された抗体－媒介性損傷のリスクが最も高い期間は、移植後の最初の数週間であり、急性細胞媒介性拒絶反応は、移植後の最初の３カ月間に最も起こりやすく、その後リスクが減弱することが予想される（Cowan 2014）。

【0196】

[0293] 同種移植片拒絶。２０１６年１２月に改訂されたガイダンス原案「Source Animal, Product, Preclinical, and Clinical Issues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans」（FDA 2016）に従って、異種移植製品の拒絶反応がレシピエントをその後の異種移植製品又は同種移植の拒絶反応に先行させる可能性が存在する（セクションＩＸ．Ｃ．１．ｇ）。

【0197】

[0294] ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗体反応性及び混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを用いて、前臨床モデルにおける異種移植後の反応性の欠如を実証する。異種移植片及びその後の同種移植片に対する反応の間の交差反応の可能性を試験するために、フローサイトメトリー交差適合試験を、上述のように正常豚及びＰｉｇ ２．０ドナーから腎臓移植を受けた雄ＮＨＰ由来の血清を用いて実施する。ＮＨＰドナーのパネル由来のリンパ球とブタドナー由来のリンパ球に対する血清の反応性を試験する。ブタ細胞への反応は、抗ブタ抗体レベルの上昇によって異種感作事象が起こったことを確認する。ＮＨＰ前移植（ナイーブ）からのサンプルを拒絶後サンプルと比較して、ＮＨＰリンパ球パネルへの抗体結合の変化を評価する。並行して、同種刺激因子パネルに対する移植前後（拒絶後）のＮＨＰレシピエントＴ細胞による直接的及び間接的Ｔ細胞応答を評価して、細胞媒介性同種応答が異種移植片の拒絶後に増大するか否かを判定する（Baertschiger 2004、Cooper 2004、Ye 1995）。

【0198】

[0295] 異種反応と同種反応との間の交差反応性が少なくとも低レベルで観察されることが予想される。しかしながら、これらの結果は、提案された試験との関連で考慮されるべきである。腎臓の試験では、適切な適合を同定できないために移植を受けることができなかった高度に感作された患者を対象に移植が計画されている。わずかな追加感作では、その後に同種移植片を受ける機会が変わる可能性は低いと考えられる。さらに、Ｔ細胞感作は、再移植に対する有意な障壁として同定されておらず、したがって、臨床的にモニターすることができない可能性がある（Baertschiger 2004、Cooper 2015）。したがって、異種細胞を介した感作が同種移植片の生存を妨げる可能性は低いと思われる。

【0199】

[0296] 生体内分布。異種移植の結果としての、レシピエントにおけるドナー細胞の遠位組織／器官への移動の可能性が残されている。キメラ研究は、これが生着の成功を実際に増加させ、拒絶の確率を減少させ得ることを実証する（Starzl 1993、Vagefi 2015）。しかしながら、豚ドナー細胞移動の未知の結果がある可能性があり、したがって細胞の移動が生じたか否かを決定するための戦略が開発されている。生体内分布は、Source Animal, Product, Preclinical, and Clinical Issues Concerning the Use of Xenotransplantation Products in Humans, Dec 2016 (Section IX.C.5; FDA Dec 2016)、Gene Therapy Clinical Trials - Observing Subjects for Delayed Adverse Events, Nov 2016 (Section IV.B.2; FDA Nov 2016)、及びPreclinical Assessment of Investigational Cellular and Gene Therapy Products, Nov 2013 (Section V.C.5.; FDA 2013)を含むＦＤＡガイダンス文書に概説されている原則に従って、豚－ＮＨＰ異種移植研究の一部として研究される。

【0200】

[0297] 腫瘍原性。ＳＣＮＴ及び生殖補助医療施設に含まれる全ての動物について、腫瘍形成の証拠について日常的にモニタリングする。瀕死状態又は死亡が認められた動物は全て、動物病理学者による全剖検並びに肉眼的及び顕微鏡的病理検査を実施する。遺伝子操作された全ての動物の健康及び病理学の記録を、特定の又は非意図的な遺伝子改変に起因する腫瘍原性の可能性のリスクを判定するために維持し、まとめる。

【0201】

実施例１２：豚からヒトへの腎移植
[0298] 腎異種移植は、数十年間研究されており、豚異種移植片は、初期の臨床試験で評価されている（Starzl 1964）。課題は、同種移植片の生存と同等の臨床的利益をもたらす異種移植手技を可能にすることである。

【0202】

[0299] 臨床試験デザイン。提案された臨床試験集団には、高いレベルのパネル反応性抗ＨＬＡ抗体（ＰＲＡ）が存在するために、適時に適切な腎臓ドナーを見つける見込みのない１８～６５歳の末期腎疾患の移植患者が含まれる。高ＰＲＡは、適切な死体ドナー又は生体ドナーとマッチングさせる上で実質的な課題を生じさせ、血液透析のさらなる年からの移植待ち時間の延長、及び過剰な罹病を引き起こす。待機リストの優先順位が付与されているにもかかわらず、＞９０％のＰＲＡ患者は、感作がより低い患者と比較して依然として顕著に長い待機時間を経験する。ＨＬＡ抗原に対して＞９０％のＰＲＡ感作を有し、ブタドナーリンパ球（又は内皮細胞）に対して負のフロークロスマッチを示す対象を標的とする。

【0203】

[0300] 患者は、４０～５０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の予想糸球体濾過率（ＧＦＲ）を提供する１２０±１０ｇｍのブタドナー腎臓を受ける。９～１２ヶ月齢のドナー由来の単一のブタ腎臓を、同種腎移植に用いたものと同一の方法で、右又は左腸骨窩に移植する。主要評価項目は、移植後１年間の血液透析からの解放である。患者は、クレアチニンレベル、尿タンパク、及び、ＭＤＲＤ式：ＧＦＲ（ｍＬ／分／１．７３ｍ^２）＝１７５×（Ｓｃｒ）^{－１．１５４}×（年齢）^{－０．２０３}×（女性の場合、０．７４２）×（アフリカ系アメリカ人の場合、１．２１２）を用いたＧＦＲの算出についての連続血液検査によって評価される。プロトコルで指定された移植片生検は、移植後最初の１ヵ月間における最良の連続３回のクレアチニン測定値の平均として定義されるベースラインからのクレアチニンの＞２０％上昇、又は３００ｍｇ／日を超えるタンパク尿に基づいて、３ヵ月ごと及び原因別に実施する。安全対策には、凝固パラメータ、臨床化学、血液学、及び外来性感染症のモニタリングが含まれる。

【0204】

[0301] ブタ－ヒト腎移植のための器官。データにより、ブタの腎臓は、ヒトの腎臓と同様の腎臓重量により機能的効力を発現することが示唆され、したがって、移植片による腎臓の移植及びレシピエントの体重は、同種移植片で臨床的に使用されるものと同等であることができる。ヒトでは、同種腎移植片の移植は、レシピエントの体重に対する腎臓重量の広い範囲にわたって行われる。平均して、成人男性腎臓の重量は１２５～１７０グラムであり、成人女性腎臓の重量は１１５～１５５グラムである（Boron 2003）。レシピエント体重に対する腎臓重量の比についての投与量の上限範囲を考慮すると、腎機能の過剰がいかなる形でも有害であるという証拠はない。むしろ、移植可能な腎質量の上限は、技術的問題によって制限される。例えば、１人の成人の腎臓を１０ｋｇの乳児にうまく移植することができ、これは、平均的な成人の腎質量比（３～４ｇｍの腎臓／ｋｇ；Ｄｏｎａｔｉ－Ｂｏｕｒｎｅ ２０１４）の約３～４倍である１２～１７ｇｍの腎臓／ｋｇに等しい。この移植片重量対レシピエント重量の上限範囲は、以下に詳述する提案された前臨床試験に関連する。実験的前臨床試験では、８～１０週齢のブタドナーからの５０～７５ｇｍの腎臓を５～１２ｋｇのＮＨＰレシピエント（約１０ｇｍの腎臓／ｋｇ）に移植する。

【0205】

[0302] 糸球体濾過率（ＧＦＲ；ｍＬ／分／１．７３ｍ２）は、透析及び／又は移植に適格な慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）及び腎不全の進行をステージ分類するために使用される腎機能又は腎効力の標準的な尺度である。レシピエント体重に対する腎臓重量についての投与量の下限範囲の決定において、目標は、４５～６０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２のＧＦＲを達成することである（ＣＫＤステージ３Ａ；Levey 2011）。このＧＦＲの目標範囲は、ＣＫＤ ３Ａの腎機能はヒトの単腎同種移植で達成される腎機能と同等で安定しているが、ＣＫＤステージ３Ｂ（ＧＦＲ ３０～４５ｍＬ／分／１．７３ｍ^２）のより低いＧＦＲは末期腎疾患及び全死因死亡率及び心血管死亡率の増加に関連することを示唆するデータに基づいている（Sharma 2010）。４５～６０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の目標ＧＦＲ範囲は、ヒトにおける単腎同種移植によって達成されるものと同等である（５０～６５ｍＬ／分／１．７３ｍ^２；Gourishankar 2003、Marcen 2010）。

【0206】

[0303] これには、腎質量当たりのＧＦＲがヒトとブタの腎臓で同等であることを考慮すると、同種移植で日常的に用いられているもの（１１５～１７０ｇｍ）と同等の腎臓質量の異種移植が必要であろう。カルシニューリン阻害剤の形態の腎毒性免疫抑制を用いたレシピエントの処置に起因して、提供プロセス及び移植後に何らかの腎機能が失われる可能性があることを考慮するべきである。

【0207】

[0304] 薬理学及び毒性学の情報。有効性及び安全性は、げっ歯類及びＮＨＰの両モデルを用いた薬理試験により評価される。様々な統合的安全性エンドポイント、並びに遺伝子操作ドナーブタ組織における臨床病理学及び病態生理学の評価を用いる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞及び組織機能、並びにドナー豚及びＮＨＰ異種移植片における臨床病理学及び組織病理学の評価を含む段階的アプローチを採用する。エンドポイントには、移植片機能及び拒絶反応、並びに自然及び適応免疫、炎症、並びに補体及び凝固カスケードの機能に関連するレシピエントの安全性が含まれる。

【0208】

[0305] 体細胞核移植及び遺伝子操作されたドナー豚の補助された生殖。遺伝子操作されたドナー豚は、臨床化学及び血液学、並びに肉眼的及び顕微鏡的組織病理学的検査を含む完全な臨床病理学的検査を伴う安全性の検討のために、日常的にモニタリングされる。繁殖コロニー内の全てのドナー豚について、生殖能、胚・胎児発生、器官及び組織発生、並びに潜在的な腫瘍形成をモニタリングし、記録する。

【0209】

[0306] 動物は、永久インク（原点に置かれた）で印刷された独特の耳タグによって識別される。豚の流れは隔離区域を含み、隔離区域は、木材削り屑の床敷きを備えた、野外の集団飼育小屋である。飼料トラフは木製で、ごみ及び廃棄物がないように清潔に保たれている。新鮮で自由選択の水は、ニップルドリンカーを介して常に利用可能である。小屋は、空気を循環させるために屋外の風の動きに頼っており、温度は１０℃超に維持されている。バイオセキュリティは、少なくとも２４時間他の豚と接触しないこと、特定の小屋の服装、及び小屋との接触の前後の消毒剤へのブーツの浸漬を必要とする。隔離期間は、３５～４０日間の隔離、Parvo Shield L5E、FluSure XP/ER Bac Plus、Ingelvac FLEXコンボ（サーコウイルス及びマイコウイルス）、及びDectomaxの接種を含み、疾患抗体（ＰＲＲＳＶ、ＰＲＲＳＸ３）の増加がないことを証明する２回の採血を含む。隔離からのクリアランス後、豚を施設の緩衝領域に移動させる。この領域は、１２匹までのグループの閉鎖された集団飼育小屋であり、おがくず敷きの小屋である。寝具は毎週交換する。温度は、サーモスタット制御ファンとプロパンヒーターによって１５～２４℃の範囲に制御される。豚はステンレス鋼のトラフに給餌され、新鮮で自由選択の水がニップルドリンカーを介して常に利用可能である。豚を１日に少なくとも１回、健康状態に応じて観察する。

【0210】

[0307] 健康上の問題が観察された豚は、個別のケア及び注意のために単一の小屋に収容され、担当獣医師及び発生学部長の指示に従って処置される。バイオセキュリティは、他の豚群との接触が少なくとも２４時間ないことを必要とする。小屋領域での使用に限定されたカバーオール及びブーツは、小屋接触の前後に、Ｖｉｒｋｏｎ－Ｓ又はＳｙｎｅｒｇｉｚｅのいずれかで消毒される。臨床試験に使用するソースドナー豚の作製は、関連する全てのガイダンス及び規則に従う。

【0211】

[0308]遺伝子工学の検証。内因性遺伝子ＫＯ及びヒト導入遺伝子発現は、ゲノムレベル、ｍＲＮＡレベル、及びタンパク質レベルで検証される。遺伝子ＫＯについては、サンガーシーケンシング又はディープシーケンシングのいずれかを実施して、意図された標的部位での遺伝子突然変異を確認する。第２に、ＲＮＡ－ｓｅｑ及び／又はＲＴ－ＰＣＲを実施して、ｍＲＮＡが意図された突然変異を含み、ナンセンス媒介崩壊を受けやすいことを保証する。ＲＴアッセイを実施して、ＰＥＲＶ ＫＯ細胞におけるＲＴ活性の消失を実証する。さらに、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色及び／又はフローサイトメトリーを実施して、遺伝子産物が細胞中又は細胞表面に存在しないことを確実にする。

【0212】

[0309]オフターゲット変異は、精密遺伝子編集の分野の進歩にもかかわらず依然として存在する可能性があり、臨床的異種移植のための安全且つ有効なドナー器官を作製するために理解する必要がある。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集の潜在的なオフターゲット効果を確認するために、以下の多段階評価アプローチを使用した：
１． 染色体構造の完全性を決定するための改変された細胞クローンの核型；
２． ＣＩＲＣＬＥ－Ｓｅｑ：任意の所与のｇＲＮＡのゲノムワイドなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９オフターゲット突然変異を包括的に検出する高感度のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング戦略。潜在的なオフターゲット部位は、その後の標的化アンプリコンシーケンシングを使用して、特定のｇＲＮＡ由来の任意の派生細胞株において監視（censor）される；
３． 全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）：単一点突然変異、及び遺伝子操作した細胞株又は豚の小さな構造変異を調べるため。表２は、使用した検出方法の分解能及び感度を列挙する。

【0213】

【表4】

【0214】

[0310] 導入遺伝子の発現に関しては、ゲノムレベル、ｍＲＮＡレベル、及びタンパク質レベルにおけるヒト導入遺伝子の無傷性及び発現を、シーケンシング、ＲＴ－ＰＣＲ／ＲＮＡ－ｓｅｑ、及びＩＨＣ／フローサイトメトリー技術を用いて検証する。さらに、ランダム導入遺伝子組込みの位置を、逆ＰＣＲに基づく接合部捕捉によって決定し、結果を接合ＰＣＲによって検証する。

【0215】

[0311] クローンは、任意の既知の遺伝子及びｎｃＲＮＡから少なくとも１０，０００ｂｐ、並びに任意の癌遺伝子及び腫瘍抑制因子から少なくとも５０，０００ｂｐの遺伝子間領域に組み込まれた単一コピー導入遺伝子を用いて選択される。部位特異的組込み及び内因性遺伝子ヒト化のために、二対立遺伝子部位特異的組込み／置換は、接合ＰＣＲ及び液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により検証される。

【0216】

実施例１３：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）腎移植
[0312] 前臨床移植研究。移植前臨床研究のために、ＮＨＰで安全性及び有効性試験を実施した。８～１０週齢のＰｉｇ ２．０ドナーの心臓、腎臓、及び肝臓を移植固形器官研究に用い、肝臓及び肺を潅流器官研究に用いた。５ヶ月の期間で、１５回の器官移植及び１１回の器官潅流を行った。具体的には、表３にまとめたように、４回の肝臓及び７回の肺潅流を実施しながら、７回の腎臓移植、４回の心臓移植、４回の肝臓移植を実施した。

【0217】

【表5】

【0218】

[0313] 腎臓移植の免疫抑制レジメンは、同種移植で許容可能な臨床的に関連する試薬の組合せ及び強度で構成された。臨床モニタリングには：２、５、７、９、１２、１４日目の腹部超音波と、２、５、７、９、１２、１４日目及び週１回の臨床検査（ＣＢＣ、Ｃｈｅｍ １７、血液、血清）が含まれた。

【0219】

[0314] Ｐｉｇ２．０ドナー及び対照豚（ＧＴＫＯ．ｈＣＤ５５）からの移植腎臓の生存を分析した。結果の概要を表４に提供する。

【0220】

【表6】

【0221】

[0315] ＧＴＫＯ．ｈＣＤ５５豚腎臓の最も長期間生存した２頭のレシピエントは、腎不全及び体重減少によりそれぞれ安楽死させた７６日目及び９３日目まで生存した。これら２頭のうち、１頭は血栓性微小血管症（ＴＭＡ）、慢性抗体媒介性拒絶反応（ＡＭＲ）及び境界型Ｔ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）を有することが判明し；一方、他の１頭はＣ４ｄ沈着を有したが、それ以外では明らかな拒絶反応の組織学的証拠はなかった。残りの７頭のレシピエントは、Ｐｉｇ ２．０から腎臓を受けた。これらの豚では、免疫応答又は補体活性化を調節する形質導入ヒトタンパク質が高レベルで発現していた。これらの遺伝子改変豚腎臓のＮＨＰレシピエントは、腎臓移植のための免疫抑制レジメンにより＞１９０、７２、２０、１５及び６日間生存した。

【0222】

[0316] １頭のレシピエントは、現在、腎臓移植のための免疫抑制レジメンにより、１９０日目に正常な腎臓機能（クレアチニン０．６ｍｇ／ｄｌ）で良好に経過している。複数回の生検では、拒絶反応又はＴＭＡの所見は認められなかった。

【0223】

[0317] これらのデータを総合すると、自然応答及び補体経路における調節タンパク質をコードするヒト遺伝子の複数の形質導入を伴う三重異種抗原ＫＯを有する腎臓異種移植片の長期生存が実証され、即ち拒絶反応又はＴＭＡがないことが、最小限の維持免疫抑制で達成されている。

【0224】

[0318] サルの健康状態の悪化は、異種移植サルのいくつかの早期終了に寄与した。合併症には、輸血、注射部位膿瘍及び感染、創傷治癒が含まれた。いくつかの症例は、おそらく過剰抗凝固により、膀胱及び／又は尿管に出血を呈した。Ｐｉｇ２．０移植片の概要を表５に示す。

【0225】

【表7】

【0226】

[0319] ペイロード９（Ａ）及びペイロード１０（Ｂ）ドナー豚から分離した腎臓を移植した宿主サルを分析したところ、宿主は安定した血清クレアチニン濃度を示すことが実証された（図３２Ａ及び３２Ｂ）。いくつかの宿主サルはまた、安定な又は回復するヘマトクリットレベルを示した（図３３Ａ及び３３Ｂ）。血小板数は、いくつかの宿主サルで低かったが、他のサルでは回復していた（図３４Ａ及び３４Ｂ）。ＷＢＣの変動は、免疫抑制レジメン及び感染事象を反映している（図３５Ａ及び３５Ｂ）。

【0227】

[0320] 肝臓異種移植。最近まで、豚からヒヒへの同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）生存期間は９日間に限られていた。ＧＴＫＯ肝臓のレシピエント２例では、ヒト凝固因子の投与により生存期間が２５日及び２９日に改善したが、一貫した生存は依然として解明されていない。

【0228】

[0321] 今回、４頭の豚からヒヒへのＯＬＴｘを実施した。肝臓は、異種抗体の標的を欠損し、補体活性化及び自然免疫細胞機能に対処するためのヒト導入遺伝子を含む遺伝子導入豚の２つの遺伝子構築物から得た（グループ１：Ｂ１、Ｂ２；グループ２：Ｂ３、Ｂ４）。免疫抑制は、ＡＴＧ、リツキシマブ、コルチコステロイド、ＭＭＦ及びａＣＤ１５４で構成された。全レシピエントはKCentraの注入を受けた。先行研究と異なり、脾摘出術は行わず、コブラ毒因子及びタクロリムスは省略した。Ｂ２及びＢ４は、ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤の連続注入を受けた。移植片機能を、毎日の化学、乳酸塩、ＣＢＣ、ＩＮＲ及び毎週の凝固プロファイルを用いて評価した。

【0229】

[0322] ヒヒＢ１、Ｂ２及びＢ４は、生命維持移植片機能を有するＯＬＴｘに成功した。ＬＦＴは、全てのヒヒにおいてＰＯＤ１でピークに達し、ＰＯＤ４～７の間で正常化された（図３８Ａ、３８Ｂ）。各ヒヒは血小板減少症を示し、Ｂ２ではＰＯＤ８及びＢ４ではＰＯＤ４で自然回復が始まった（図３８Ｃ）。輸血要求（図３８Ｄ）は、歴史的経験よりも少なかった。凝固因子の消費は、ＯＬＴｘの直後に起こり、その後、正常な豚レベルで産生された（図３８Ｅ～３８Ｉ）。Ｂ１は、体液過負荷と腹部コンパートメント症候群による呼吸不全のため、ＰＯＤ８に安楽死させた。肝臓生検では、限局性虚血が認められ、拒絶反応は認められず、Ｃ４ｄ陰性であった（図３８Ａ～Ｂ）。Ｂ２は順調に回復し、ＰＯＤ８の生検は正常であった。喀血の発現と輸血要求の増加により、ＰＯＤ１４に安楽死させる必要が生じた。剖検で肺出血が確認された。肝臓のＨ＋Ｅ染色は、びまん性類洞好中球浸潤（diffuse sinusoidal neutrophil infiltrate）を示し、これは、拒絶に対する感染性合併症を示唆し、Ｂ２はＣ４ｄ陰性であり、ＬＦＴは全体を通して正常のままであった（図３８Ｃ～Ｄ）。Ｂ３は低血圧で、再潅流後の術中低酸素血症であり、安楽死が必要であった。剖検では、正常な肝臓及び開存性血管系を伴うびまん性肺出血が認められた。Ｂ４は無事に回復した。１回のみの術後輸血を必要とした。ＰＯＤ７に、Ｔｂｉｌｉ及びＬＦＴの上昇は探索を促し、そこで胆汁漏出及び肝動脈血栓症（ＨＡＴ）が確認され、安楽死が必要であった。生検はＣ４ｄ陰性を有する限局性被膜下壊死を示し、拒絶の証拠はなく、ＨＡＴと一致した（図３８Ｅ～Ｆ）。

【0230】

[0323] 新規な遺伝子組換え豚器官を用いたＯＬＴｘのこれらのデータを総合すると、再潅流傷害の減少、ＲＢＣ消費の減少、及び脾摘出術又はＣＶＦの使用を伴わない最初の抗体媒介性拒絶反応のない生存が実証される。明らかな拒絶反応が存在しなかったことから、このブタ系統は、さらなるＯＬＴｘ研究に適していることが示唆される。

【0231】

[0324] 肝臓異種潅流。異種豚肝臓移植の成功の障壁には、予め形成された異種抗体による超急性拒絶反応、調節不全の補体、凝固、並びに自然及び適応免疫をもたらす分子不適合がある。遺伝子改変豚は、これらの障害を回避する可能性があり、様々な遺伝子構築物の有効性を評価するための迅速且つ効率的なモデルが必要となる。ここでは、野生型（ＷＴ）のｅｘ－ｖｉｖｏ肝臓異種潅流（ＥＶＬＸＰ）と、ヒト血液及び血漿で潅流した遺伝子改変豚肝臓（ｈＷＢ＋Ｐ）を用いて、最初の結果を報告する。

【0232】

[0325] 簡潔には、Ｐｉｇ ２．０（ＥＧ群、ｎ＝３）、ＷＴ（ｎ＝２）由来の肝臓、及びＧＴＫＯ．ｈＣＤ５５（ｎ＝４）肝臓を研究した。ＥＶＸＬＰを、新鮮なヘパリン化ｈＷＢ＋Ｐを用いて３７℃で行った。ＥＶＸＬＰ中の失敗は、血管抵抗の上昇、重度の代謝攪乱又は肉眼的壊死による血流の減少によって定義した。ＣＢＣ、血清臨床化学、及び血液ガス分析を行った。組織生検は、Ｈ＋Ｅで染色し、ＩｇＧ、ＩｇＭ及び補体（Ｃ４ｄ）の沈着を調べた。

【0233】

[0326] 全ての群は、対応する血管抵抗の上昇を伴う進行性の血流減少を示した。血行動態の悪化は、ＥＧ肝臓と比較して、ＷＴ及びＧＴＫＯ．ＣＤ５５でより早期に生じ、より速く進行し（図３９Ａ、３９Ｂ）、より長いＥＧ肝臓生存と相関した。ＷＴの平均肝臓生存時間は、５時間（５～７時間の範囲）、ＧＴＫＯ．ＣＤ５５で４．５時間（４～６時間の範囲）及びＥＧ肝臓で１３時間（１１～１４時間の範囲）であった。血小板及び好中球は、全ての群で急速に減少し、ＷＴで最も大きい損失が観察されたが、差は統計的有意差を満たさなかった（図３９Ｃ、３９Ｄ）。ＲＢＣ数は、ＥＧで潅流を通して保存され、ＷＴ肝臓よりも有意に高く、ＧＴＫＯ．ＣＤ５５よりも高い傾向があった（図３９Ｅ）。

【0234】

[0327] ＥＧ肝臓組織生検は、軽度のびまん性門脈及び類洞炎症を伴う保存された肝構造をＨ＋Ｅ上で示した（図４１Ａ）。ＷＴ肝臓は、Ｈ＋Ｅ上で限局性虚血性壊死及び血管うっ血を示し（図４１Ｅ）、ＩｇＭ及びＩｇＧについての強い染色（図４１Ｆ～４１Ｇ）並びにＣ４ｄ陽性を示した（図４１Ｈ）。対照的に、ＥＧ肝臓は、Ｃ４ｄ陰性（図４１Ｄ）を伴う、びまん性の軽度の類洞ＩｇＧ及びＩｇＭ沈着（図４１Ｂ～４１Ｃ）を示し、おそらく、予め形成された抗原の減少及びヒト補体調節タンパク質発現の添加による補体調節の改善が、より少ない傷害をもたらしたことを示唆した。

【0235】

[0328] 異種特異的抗原を欠き、補体活性化及び免疫細胞機能に関連するヒト化導入遺伝子を含む遺伝子導入豚由来の異種肝臓は、ＷＴ又はＧＴＫＯ．ＣＤ５５異種移植片と比較して、血小板捕捉の程度が軽度で、ＲＢＣ量が維持され、抗体及び補体沈着が減少し、生存期間が有意に延長した。このモデルは、豚からヒトへの異種移植をシミュレートし、特定の遺伝子改変の有効性を評価するための効率的で有益なツールである。

【0236】

[0329] 肺異種潅流。ヒト血液を用いたＥｘ ｖｉｖｏ肺潅流は、導入遺伝子の組合せの影響を評価するための標準化された方法である。ここでは、参照コホートの関連で評価した、新規遺伝子導入豚系統と関連した結果を報告する。

【0237】

[0330] 簡潔には、Ｇａｌ１、３αＧａｌ、β４Ｇａｌ、及びＮｅｕ５Ｇｃノックアウト（ＴＫＯ）の組合せを有し、補体活性化と自然及び適合免疫細胞機能における分子不適合に対処するヒト導入遺伝子を含む豚由来の組合せた８対の肺を有する豚由来の８対の肺を、新たに収集したヘパリン化ヒト血液でｅｘ ｖｉｖｏで潅流した。ＧａｌＴＫＯ．ｈＣＤ５５肺は、参照群としての役割を果たした。各豚の肺の対では、血液を「未処置」のままとし（ｎ＝５ Ｐｉｇ ２．０、ｎ＝３参照）、又はトロンボキサンシンターゼ阻害薬及びヒスタミン受容体遮断薬である１－ＢＩＡで「処置」した（Ｐｉｇ ２．０はｎ＝７、参照はｎ＝４）。組織及び血液サンプルを所定の時点で収集し、肺が早期に機能しなくなっていない場合には、８時間の潅流後に実験を選択的に終了した。

【0238】

[0331] Ｐｉｇ ２．０肺の生存期間中央値は、未処置群では、４５０分（３００～４８０分の範囲）、対、参照肺の３０分（２０～３００分の範囲）（Ｐ＝０．０４）であり、処置コホートでは４８０分（３６０～４８０分の範囲）、対、３００分（１４５～３６０分の範囲）（Ｐ＝０．００９）であった。肺血管抵抗（ＰＶＲ）上昇は、ＧａｌＴＫＯ．ｈＣＤ５５肺と比較して、「未処置」豚２．０肺で有意に減弱し、遅延した（図４２）。１－ＢＩＡ及びＨ－ブロッカーによる追加の血液処置は、Ｐｉｇ ２．０と参照群の両方でＰＶＲ上昇を減弱した。好中球及び血小板の捕捉は、通常、潅流後５～１５分以内に起こり、Ｐｉｇ ２．０マルチ遺伝子導入肺に関連して減弱しなかった。

【0239】

[0332] これらのデータは、新規なＰｉｇ ２．０ドナー遺伝学がＰＶＲ上昇及び肺傷害から肺を保護し、この厳密なモデルにおいて肺生存の有意な改善と関連していることを実証している。他の肺遺伝学で既に報告されているように、白血球（leukocyte）及び白血球（white cell）の捕捉は予防されなかった。Ｐｉｇ ２．０肺によって発現される導入遺伝子の組合せは、肺、及び他の器官の異種移植の成功を達成するために役立つ可能性がある。

【0240】

[0333] 導入遺伝子の発現。ＲＮＡｓｅｑ発現データは、補体及び細胞毒性遺伝子がペイロード９及びペイロード１０Ｐｉｇ ２．０豚から収集されたサンプルにおいて発現されることを示した（図３６）。ＦＡＣＳデータは、補体及び細胞毒性タンパク質がペイロード５、ペイロード９及びペイロード１０豚から収集されたサンプルにおいて発現されることを示した（図３７）。３つのペイロードの全ては、補体（ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９）及び細胞毒性関連タンパク質（例えば、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４７）を発現した。さらに、ペイロード５はＣＤ３９を発現するとともに、ペイロード１０はＰＤＬ１を発現した。ＮＨＰにおける性能は大幅に異なるが、ペイロード５を保有する５頭の豚間では遺伝子発現プロファイルは類似している。

【0241】

[0334] 本出願において特定される数値の使用は、特に明記しない限り、記載された範囲内で特定される最小値及び最大値を通じた近似として記載され、前に「約」という語が付されている。範囲の開示は、記載された最小値と最大値との間の全ての値、並びにそのような値を通して形成され得る任意の範囲を含む連続的な範囲として意図される。本出願で提示される数値は、本開示の様々な実施形態を表す。

【0242】

[0335] この開示は、網羅的であること、又は本技術を本明細書に開示された厳密な形態に限定することを意図していない。特定の実施形態が例示の目的で本明細書に開示されているが、関連分野の当業者が認識するもののように、様々な同等の修正が本技術から逸脱することなく可能である。場合によっては、本技術の実施形態の説明を不必要に曖昧にすることを避けるために、周知の構造及び機能は示されておらず、及び／又は詳細に記載されていない。方法のステップは、本明細書において特定の順序で提示され得るが、代替の実施形態では、ステップは別の適切な順序を有する可能性がある。同様に、特定の実施形態の文脈で開示された本技術の特定の実施形態は、他の実施形態において組合せるか、又は排除することができる。さらに、特定の実施形態に関連する利点がそれらの実施形態の文脈で開示されてきたが、他の実施形態もそのような利点を示すことができ、全ての実施形態が、本技術の範囲内に含まれるそのような利点又は本明細書に開示される他の利点を必ずしも示す必要はない。したがって、本開示及び関連技術は、本明細書に明示的に示されておらず、及び／又は記載されていない他の実施形態を包含することができる。

【0243】

[0336] 上記から、本開示の特定の実施形態が、例示の目的のために本明細書に記載されたが、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な修正がなされ得ることが理解される。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、制限されない。

【0244】

[0337] 本開示の特定の実施形態が議論されてきたが、上記の明細書は例示であり、限定ではない。本開示の多くの変形が本明細書及び以下の特許請求の範囲を検討することにより、当業者に明らかになるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲をそれらの均等物の全範囲とともに、及び明細書をそのような変形とともに参照することによって決定されるべきである。

【0245】

略語
急性血管拒絶反応（ＡＶＲ）；活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）；アデノ関連ウイルス組込み部位１（ＡＡＶＳ１）：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）；アルブミン（ＡＬＢ）：α１，３－ガラクトシル－ガラクトース（Ｇａｌ又はαＧａｌ）；抗体媒介性拒絶反応（ＡＭＲ）；抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）；アシアロ糖タンパク質受容体１（ＡＳＧＲ１）；アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）；β１，４ Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ４ＧａｌＮＴ２）；β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；分化のクラスター３９（ＣＤ３９）；分化のクラスター４７（ＣＤ４７）；クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）；クラスＩＩトランスアクチβードミナントネガティブ（ＣＩＩＴＡ－ＤＮ）；ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）；補体因子３（Ｃ３）；補体因子３ノックアウト（Ｃ３－ＫＯ）；全血球数（ＣＢＣ）；Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）；Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン受容体１２（ＣＸＣＲ１２）；シチジン一リン酸－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ（ＣＭＡＨ）；細胞傷害性Ｔリンパ球関連免疫グロブリン（ＣＴＬＡ－Ｉｇ）；デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）；ＤＱα（ＤＱＡ）；ＤＲα（ＤＲＡ）；液滴デジタルｐＣＲ（ｄｄＰＣＲ）；エクト－５’ヌクレオチダーゼ（ＣＤ７３）；伸長因子１α（ＥＦ１α）；内皮細胞（ＥＣ）；内皮タンパク質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）；ｅｘ－ｖｉｖｏ肝臓異種潅流（ＥＶＬＸＰ）；Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）；フィブリノーゲンレベル（ＦＩＢ）；蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）；新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＲ）；糸球体濾過率（ＧＦＲ）；グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ－１Ｒ）；糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ）；糖タンパク質α－ガラクトシルトランスフェラーゼ１（ＧＧＴＡ）；ＧＧＴＡノックアウト（ＧＴＫＯ）；ガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）；ヘモトキシリンとエオシン（Ｈ＋Ｅ）；肝動脈血栓症（ＨＡＴ）；ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）；ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１）；相同組換え修復（ＨＤＲ）；ヒト血液及び血漿（ｈＷＢ＋Ｐ）；ヒト膜補因子タンパク質（ｈＣＤ４６）；ヒト補体崩壊促進因子（ｈＣＤ５５）；ヒト補体調節タンパク質（ｈＣＲＰ）；ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）；ヒト白血球抗原Ｅ（ＨＬＡ－Ｅ）；ヒトＭＡＣ阻害因子（ｈＣＤ５９）；免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）；化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）の免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＳ）；免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）；免疫組織化学（ＩＨＣ）；イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＤＨ）；インターロイキン１２（ＩＬ１２）；インターロイキン３５（ＩＬ３５）；国際標準化比（ＩＮＲ）；細胞内接着分子－２（ＩＣＡＭ２）；キラー阻害受容体（ＫＩＲ）；ノックイン（ＫＩ）；ノックアウト（ＫＯ）；Ｋｒｕｅｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）；肝機能検査（ＬＦＴ）；長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）；主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）；主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）；主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩ、Ｅ単鎖三量体（ＨＬＡ－ＥＳＣＴ）；ラパマイシンの機械的標的（ｍＴＯＲ）；メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）；腎疾患における食事の変更（ＭＤＲＤ）；混合リンパ球反応（ＭＬＲ）；ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）；ナチュラルキラー（ＮＫ）；Ｎ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）；神経分化１（ＮｅｕｒｏＤ）；非ヒト霊長類（ＮＨＰ）；非相同末端結合（ＮＨＥＪ）；同所性肝臓異種移植（ＯＬＴｘ）；パネル反応性抗体（ＰＲＡ）；末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）；豚腎臓－１５細胞（ＰＫ１５）；ブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）；ブタ内在性レトロウイルスノックアウト（ＰＥＲＶ ＫＯ）；プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ブタ大動脈内皮細胞株（ＰＥＣ－Ａ又はｐＡＥＣ）；カリウム（Ｋ）；プロトロンビン時間（ＰＴ）及び国際標準化比（ＰＴ－ＮＩＲ）；定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）；リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）；赤血球（ＲＢＣ）；リボ核酸シーケンシング（ＲＮＡｓｅｑ）；逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＴ）；ｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）；低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）；ナトリウム（Ｎａ）；体細胞核移植（ＳＣＮＴ）；スーパーオキシドジスムターゼ３（ＳＯＤ３）；豚白血球抗原（ＳＬＡ）；Ｔ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）；トロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ（ＴＡＴ）；トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ、ＴＢＭ又はＴＭ）；血栓性微小血管症（ＴＭＡ）；組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）；トポイソメラーゼ（ＴＰＯ）；総ビリルビン（Ｔｂｉｌｉ）；転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター及びヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）；腫瘍壊死因子α誘導タンパク質３（Ａ２０）；腫瘍壊死因子受容体１免疫グロブリン（ＴＮＦＲ１－Ｉｇ）；遍在性クロマチン開放エレメント（ＵＣＯＥ）；フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）；全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）；野生型（ＷＴ）；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）。

【0246】

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【0247】

配列

【0248】

【表8】

【0249】

【表9】

【0250】

【表10】

【0251】

【表11】

【0252】

【表12】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1C-2】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3B-2】

【図3B-3】

【図3B-4】

【図4A】

【図4B】

【図4B-2】

【図4B-3】

【図4B-4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32A】

【図32B】

【図33A】

【図33B】

【図34A】

【図34B】

【図35A】

【図35B】

【図36】

【図37】

【図37-2】

【図38A】

【図38B】

【図38C】

【図38D】

【図38E】

【図38F】

【図38G】

【図38H】

【図38I】

【図39】

【図40A】

【図40B】

【図40C】

【図40D】

【図40E】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51A】

【図51B】

【図51C】

【図51D】

【図51E】

【図52A】

【図52B】

【図52C】

【図53A】

【図53B】

【図53C】

【図53D】

【図53E】

【図53F】

【図53G】

【図54A】

【図54B】

【図54C】

【図54D】

【図54E】

【図55】

【図56A】

【図56B】

【図56C】

【配列表】

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【国際調査報告】