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特表2022-532874白質ジストロフィーの治療のための組成物および方法、ならびに白質ジストロフィーの治療のための有効な薬剤を同定するための動物全体および細胞モデル
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-20
(54)【発明の名称】白質ジストロフィーの治療のための組成物および方法、ならびに白質ジストロフィーの治療のための有効な薬剤を同定するための動物全体および細胞モデル
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20220712BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220712BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220712BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220712BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220712BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20220712BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20220712BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220712BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20220712BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220712BHJP
A01K 67/027 20060101ALI20220712BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20220712BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220712BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220712BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20220712BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20220712BHJP
A61K 38/17 20060101ALN20220712BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20220712BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z
A61K48/00 ZNA
A61P25/00
A61K31/7088
A61K31/7105
A61K31/713
A61K31/711
A61K9/127
A61K9/51
A61K35/76
A01K67/027
C12N15/12
C12Q1/02
C12N15/09 100
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
A61K38/17
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021566128
(86)(22)【出願日】2020-05-11
(85)【翻訳文提出日】2022-01-06
(86)【国際出願番号】 US2020032364
(87)【国際公開番号】W WO2020227713
(87)【国際公開日】2020-11-12
(31)【優先権主張番号】62/924,910
(32)【優先日】2019-10-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/845,637
(32)【優先日】2019-05-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】301040958
【氏名又は名称】ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィア
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＣＨＩＬＤＲＥＮ’Ｓ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＯＦ ＰＨＩＬＡＤＥＬＰＨＩＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100104411
【弁理士】
【氏名又は名称】矢口 太郎
(72)【発明者】
【氏名】アルマッド、アクシャタ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァンダーバー、アデリーナ、エル．
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
4C076
4C084
4C086
4C087
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ13
4B063QR31
4B063QR51
4B063QS38
4B063QX01
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA91X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA46
4C076AA19
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC01
4C084AA13
4C084DC50
4C084MA24
4C084MA38
4C084MA66
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA02
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA24
4C086MA38
4C086MA66
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZA02
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA24
4C087MA38
4C087MA66
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA02
(57)【要約】
白質ジストロフィー、特にＨ－ＡＢＣの治療のための組成物および方法が開示されている。
【選択図】図１Ｃ
【選択図】図１Ｃ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト変異型Ｔｕｂｂ４－ａタンパク質をコードする核酸と作動可能に連結された、マウス細胞での発現を駆動するのに有効なプロモーターを有するゲノムを有するトランスジェニックマウスであって、前記ヒト変異型Ｔｕｂｂ４－タンパク質が前記マウスのニューロンおよび／またはオリゴデンドロサイトで発現し、白質ジストロフィー表現型をもたらす、トランスジェニックマウス。
【請求項2】
請求項１記載のトランスジェニックマウスにおいて、前記Ｔｕｂｂ４－タンパク質は、表１に記載の核酸によってコードされるものである、トランスジェニックマウス。
【請求項3】
請求項１記載のトランスジェニックマウスにおいて、Ｔｕｂｂ４－タンパク質は、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ変異体である、トランスジェニックマウス。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１つに記載のトランスジェニックマウスにおける白質ジストロフィーの存在を評価する方法であって、前記方法は、運動機能障害、歩行異常、運動失調、および生存率低下のうち１つ以上から選択される白質ジストロフィー症状を測定する工程を有し、ＴＵＢＢ４Ａ導入遺伝子を欠く対照マウスと比較した前記症状の存在は、前記マウスが白質ジストロフィーを有することを示す、方法。
【請求項5】
白質ジストロフィーの治療のための候補化合物を同定する方法であって、前記方法は、請求項１または請求項２記載のトランスジェニックマウス、または、請求項１または請求項２記載のトランスジェニックマウスのニューロンからの細胞、組織、または器官を、試験化合物と接触させる工程と、
前記試験化合物の存在下および非存在下での動物、細胞、組織、または器官の白質ジストロフィーに関連する物理的パラメータのレベルを測定する工程と、および、これらのパラメータの１つ以上を変化させる試験化合物を候補化合物として同定する工程と、
を有する、方法。
【請求項6】
請求項５記載の方法において、前記白質ジストロフィーに関連する物理的パラメータは、オリゴデンドロサイト数の減少、低髄鞘形成、小脳顆粒ニューロン喪失、線条体ニューロン喪失、髄鞘形成不全、髄鞘形成遅延、異常増加、運動失調、およびニューロン生存率の低下のうちの１つ以上から選択される、方法。
【請求項7】
低髄鞘形成および大脳基底核の萎縮（Ｈ－ＡＢＣ）を治療するための治療候補化合物を同定する方法であって、前記方法は、Ｈ－ＡＢＣのモデルマウスである請求項１～３のいずれか１つに記載のトランスジェニックマウスを試験化合物に曝す工程と、前記試験化合物の存在下および非存在下で、前記マウスにおける白質ジストロフィーの１つ以上のパラメータを測定する工程と、前記１つ以上のパラメータを改善する試験化合物を治療候補化合物として同定する工程とを有する、方法。
【請求項8】
請求項７記載の方法において、前記１つ以上のパラメータは、オリゴデンドロサイト数の減少、低髄鞘形成、小脳顆粒ニューロン喪失、線条体ニューロン喪失、髄鞘形成不全、髄鞘形成遅延、異常増加、運動失調、およびニューロン生存率の低下のうちの１つ以上から選択される、方法。
【請求項9】
低髄鞘形成および大脳基底核の萎縮（Ｈ－ＡＢＣ）を治療するための治療候補化合物を同定する方法であって、前記方法は、ａ）ｉ）ＴＵＢＢ－４Ａ突然変異を有する対象と
ｉｉ）ＴＵＢＢ４－Ａの突然変異を欠く対照対象
からＰＢＭＣを得る工程と、
ｂ）工程ａ）の単球を再プログラムして、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する工程と、
ｃ）ｉＰＳＣを線条体有棘ニューロンの運命に向けて分化させる工程であって、前記細胞は、ＤＡＲＰＰ３２、ＣＴＩＰ２、ＧＡＢＡおよびＦｏｘＰ１から選択される１つ以上のマーカーを発現する、分化させる工程と、
ｄ）前記細胞を前記化合物と接触させて、前記化合物が、前記突然変異を欠く対照細胞と比較して、白質ジストロフィーの表現型に関連するパラメータを変化させるかどうかを評価する工程と、
を有する、方法。
【請求項10】
請求項９記載の方法において、前記細胞は、デュアルＳＭＡＤ阻害プロトコルを適用することによって分化させる、方法。
【請求項11】
請求項９記載の方法において、分化した細胞は、ＤＡＲＰＰ３２、ＣＴＩＰ２、ＧＡＢＡおよびＦｏｘＰ１を発現する、方法。
【請求項12】
請求項９記載の方法において、前記パラメータは、細胞生存率の低下、有棘ニューロンマーカー発現の変化、および細胞形態またはシグナル伝達の変化のうち１つ以上から選択される、方法。
【請求項13】
請求項９記載の方法において、前記ＴＵＢＢ－４Ａ突然変異は表１に記載されているものである、方法。
【請求項14】
請求項９記載の方法において、前記ＴＵＢＢ－４Ａ突然変異はＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎである、方法。
【請求項15】
請求項９記載の方法において、前記薬剤は、ＴＵＢＢ－４Ａの発現を低下させる、方法。
【請求項16】
請求項９記載の方法において、前記薬剤は、野生型ＴＵＢＢ－４Ａの発現を増加させる、方法。
【請求項17】
野生型および変異型のＴＵＢＢ４－Ａの両方の発現をダウンモジュレートする化合物を有効量投与することにより、Ｈ－ＡＢＣの症状を改善する工程を有する、低髄鞘形成および大脳基底核の萎縮（Ｈ－ＡＢＣ）白質ジストロフィーの治療または予防のための方法。
【請求項18】
請求項１７記載の方法において、前記化合物は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびＴＵＢＢ４Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに十分に相補的であるリボザイムから選択される、方法。
【請求項19】
請求項１８記載の方法において、前記化合物はｓｉＲＮＡである、方法。
【請求項20】
請求項１９記載の方法において、前記化合物はアンチセンスＲＮＡ、または、アンチセンス核酸である、方法。
【請求項21】
請求項２０記載の方法において、前記アンチセンス核酸は、配列ＩＤ番号：１および配列ＩＤ番号：２から選択される、方法。
【請求項22】
ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の発現をダウンモジュレートするアンチセンス核酸を、薬学的に許容される担体に有する医薬組成物。
【請求項23】
請求項２２記載の医薬組成物において、前記アンチセンス核酸は配列ＩＤ番号：１である、医薬組成物。
【請求項24】
請求項２２記載の医薬組成物において、前記アンチセンス核酸は配列ＩＤ番号：２である、医薬組成物。
【請求項25】
請求項２２記載の医薬組成物において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に複合化される、医薬組成物。
【請求項26】
請求項２２記載の医薬組成物において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはリポソームに存在する、医薬組成物。
【請求項27】
薬学的に許容される担体において、目的の細胞におけるＴＵＢＢ４Ａの発現を増加させるためのＴＵＢＢ４Ａ野生型タンパク質をコードする核酸を有する、医薬組成物。
【請求項28】
請求項２７記載の医薬組成物において、前記ＴＵＢＢ４Ａをコードする核酸はコドン最適化されている、医薬組成物。
【請求項29】
請求項２７または２８記載の医薬組成物において、前記核酸は、ＵｎｉＰｒｏｔ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｐ０４３５０－ＴＢＢ４Ａ＿ｈｕｍａｎにおいて提供されるアミノ酸配列をコードする核酸、またはその機能的フラグメントをコードする核酸である、医薬組成物。
【請求項30】
請求項２９記載の医薬組成物において、前記核酸は、発現ベクターまたはウイルスベクターに存在する、医薬組成物。
【請求項31】
請求項２９記載の医薬組成物において、前記核酸またはベクターは、ナノ粒子に複合化される、医薬組成物。
【請求項32】
請求項２９記載の医薬組成物において、前記核酸またはベクターは、リポソームに存在する、医薬組成物。
【請求項33】
ＴＵＢＢ４Ａをコードする核酸のゲノム編集のための方法であって、前記方法は、（ａ）対象にベクターを投与する工程であって、前記対象はヒトであり、前記ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ媒介塩基エディター３（ＢＥ３）システムの核酸成分およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を有し、前記ｇＲＮＡは、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の突然変異を標的とする、投与する工程と、
（ｂ）治療用遺伝子を塩基編集することにより、前記治療用遺伝子に修正コドンを導入する工程であって、前記塩基編集はベクターにより行われる、導入する工程と、
を有する、方法。
【請求項34】
請求項３３記載の方法において、疾患の発症前に前記塩基編集が行われ、前記疾患が前記ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の突然変異に起因する表現型である、方法。
【請求項35】
請求項３３記載の方法において、前記修正コドンは、表１に記載の突然変異で導入される、方法。
【請求項36】
変異型Ｔｕｂｂ４Ａ遺伝子を保有する対象における低髄鞘形成および大脳基底核の萎縮（Ｈ－ＡＢＣ）白質ジストロフィーの治療または予防のための方法であって、前記方法は、野生型ＴＵＢＢ４－Ａタンパク質の発現を増加させ、それによってＨ－ＡＢＣの症状を改善する有効量の請求項２９記載の組成物を投与する工程を有する、方法。
【請求項37】
請求項３５記載の方法において、前記組成物は、野生型Ｔｕｂｂ４－ａタンパク質またはその機能的フラグメントをコードするベクターである、方法。
【請求項38】
Ｔｕｂｂ４ａを発現する核酸の発現をダウンモジュレートするｓｉＲＮＡ。
【請求項39】
Ｔｕｂｂ４ａの発現をダウンモジュレートするアンチセンス核酸。
【請求項40】
前述の請求項のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年５月９日に出願された米国仮出願第６２／８４５，６３７号、および２０１９年１０月２３日に出願された米国仮出願第６２／９２４，９１０号の優先権を主張するものであり、前述の各出願の開示内容は、完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年５月９日に出願された米国仮出願第６２／８４５，６３７号、および２０１９年１０月２３日に出願された米国仮出願第６２／９２４，９１０号の優先権を主張するものであり、前述の各出願の開示内容は、完全に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
電子形式で提出された資料の参照による組み込み
本明細書に参照により全体が組み込まれているのは、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されたＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前のテキストファイルで、２０２０年５月７日に作成され、１，１６７バイトのサイズを持つ配列表である。
本明細書に参照により全体が組み込まれているのは、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されたＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名前のテキストファイルで、２０２０年５月７日に作成され、１，１６７バイトのサイズを持つ配列表である。
【0003】
発明の分野
本発明は、白質ジストロフィーの分野およびこの障害の症状を改善するための改善された治療法に関する。本発明はまた、白質ジストロフィー、特にＨ－ＡＢＣの治療または予防に有用な薬剤を同定するための動物全体のモデルを提供する。
本発明は、白質ジストロフィーの分野およびこの障害の症状を改善するための改善された治療法に関する。本発明はまた、白質ジストロフィー、特にＨ－ＡＢＣの治療または予防に有用な薬剤を同定するための動物全体のモデルを提供する。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
本発明が関連する技術の状況を説明するために、本明細書全体を通していくつかの刊行物および特許文書が引用されている。これらの引用のそれぞれは、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明が関連する技術の状況を説明するために、本明細書全体を通していくつかの刊行物および特許文書が引用されている。これらの引用のそれぞれは、完全に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【0005】
大脳基底核および小脳の萎縮を伴う低髄鞘症（Ｈ－ＡＢＣ）は、散発的な、典型的にはＴＵＢＢ４Ａ遺伝子のヘテロ接合の突然変異によって引き起こされる白質ジストロフィーである(Simons et al., 2013a)。この遺伝子は、βチューブリン４ａタンパク質をコードしており、αチューブリンとヘテロ二量体化して微小管に集合する。ＴＵＢＢ４Ａの一重変異は、早期に発症する白質脳症から成人になってから発症する４型ジストニア（ＤＹＴ４；嗄声発声障害）に至るまで、様々な神経疾患を引き起こす。Ｈ－ＡＢＣの影響を受けた個人は、このスペクトラムに含まれ、幼児期に、通常はジストニア(Hersheson et al., 2013)、進行性の歩行障害、言語障害、認知障害を示す。また、ＴＵＢＢ４Ａの変異を持つ他の患者との違いは、神経画像上の特徴であり、尾状体と後頭葉の低髄化と萎縮、小脳の萎縮が見られる(van der Knaap et al., 2007)。
【0006】
病理標本では、背側線条体領域と小脳の顆粒層で、軸索の膨らみとミエリンのびまん性減少を伴う神経細胞の喪失が見られる (Simons et al., 2013a; Curiel et al., 2017b)。Ｈ－ＡＢＣに特徴的な症状を持つ個人は、発表された症例の約６５％を占めており(Blumkin et al., 2014; Ferreira et al., 2014; Miyatake et al., 2014; Pizzino et al., 2014; Purnell et al., 2014)、共通の変異であるｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎの影響を受けている可能性が高い（166人のコホートにおける全変異の２４．１％、以下、ＴＵＢＢ４ＡＤ２４９Ｎと呼ぶ）。Ｈ－ＡＢＣは現在のところ、重篤な乳児期早期変異型と若年成人期の軽度変異型の中間的な表現型と考えられている (Nahhas N, 2016)。
【0007】
ＴＵＢＢ４Ａは、中枢神経系（ＣＮＳ）、特に小脳と脳の白質路で高発現しており、線条体ではより緩やかな発現となっている(Hersheson et al., 2013)。細胞レベルでは、ＴＵＢＢ４Ａは主に神経細胞とオリゴデンドロサイト（ＯＬ）系統のニューロンと細胞に局在し、成熟した髄鞘形成ＯＬで最も高い発現を示す(Zhang et al., 2014)。ＴＵＢＢ４Ａの発現パターンと関連する疾患の表現型は、神経細胞とオリゴデンドロサイトの両方でベータチューブリン４ａタンパク質が機能的役割を果たしていることを示唆しているが、ＴＵＢＢ４Ａの突然変異の病理学的メカニズムについてはほとんど知られていない。我々のグループは、ＯＬ細胞株およびマウス小脳神経細胞での過剰発現試験を用いて、より広範なＴＵＢＢ４Ａ変異の影響を報告した。ＯＬ細胞株でＴｕｂｂ４ａ変異Ｄ２４９Ｎを過剰発現させたところ、ミエリン遺伝子の発現が低下し、Ｔｕｂｂ４ａＷＴ発現に比べて突起の少ない未熟なＯＬが形成された(Curiel et al., 2017b)。同様に、Ｔｕｂｂ４ａＷＴの発現と比較して、Ｈ－ＡＢＣの原因となるＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ変異を用いて、軸索が短く、樹状突起が少なく、樹状突起の分岐が少ない異常な神経細胞の表現型を調べた(Curiel et al., 2017b)。他のＴＵＢＢ４Ａ変異は、特にニューロンおよび/またはOL細胞株でのみ表現型の異常を強調し、さまざまな臨床表現型に対応する変異特異的効果を示唆している。Ｔｕｂｂ４ａのホモ接合体であるｐ．Ａｌａ３０２Ｔｈｒ Ｔｕｂｂ４ａ変異を有する自然発生ラットモデルであるｔａｉｅｐラットは、脳、視神経および脊髄の一部の領域で低髄液圧表現型を示すことが報告されている。この特定の突然変異は、これまでヒトでは見られなかったものである。Ｔａｉｅｐで観察された興味深い特徴は、微小管の蓄積であり、特にその後の脱髄を伴うＯＬでの蓄積であった(Duncan et al., 2017b)。現在のところ、Ｈ－ＡＢＣに特異的に関連するｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ変異の動物モデルは存在しない。
【0008】
このようなモデルや、衰弱性障害を治療するための新しい治療アプローチが必要であることは明らかである。
【発明の概要】
【0009】
本発明によれば、Ｈ－ＡＢＣのトランスジェニックマウスモデルが提供される。一態様では、マウスは、ヒトの変異型Ｔｕｂｂ４－ａタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたマウス細胞での発現を駆動するのに有効なプロモーターを有するゲノムを有し、前記ヒト変異型Ｔｕｂｂ４－タンパク質は、マウスのニューロンおよび／またはオリゴデンドロサイトで発現され、白質ジストロフィーの表現型を生成する。表１は、本明細書に記載されている動物モデル、細胞モデル、組成物および方法で使用することができる、変異型Ｔｕｂｂ４をコードする核酸のリストを提供する。特定の実施形態では、変異型Ｔｕｂｂ４－ａタンパク質は、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ変異体である。
【0010】
また、本発明は、上記トランスジェニックマウスにおける白質ジストロフィーの存在を評価する方法も提供し、前記方法は、トランスジェニックマウスにおいて、運動機能障害、歩行異常、運動失調、および生存率低下のうち１つ以上から選択される白質ジストロフィー症状を測定する工程を有し、変異型ＴＵＢＢ４Ａ導入遺伝子を欠く対照マウスと比較した前記症状の存在は、当該マウスが白質ジストロフィーを有することを示す。
【0011】
別の実施形態では、白質ジストロフィーの治療のための候補化合物を同定する方法が提供される。例示的な方法は、トランスジェニックマウス、またはトランスジェニックマウスの神経細胞からの細胞、組織、または器官を試験化合物と接触させる工程と、前記試験化合物の存在下および非存在下で、動物、細胞、組織、または器官における白質ジストロフィーに関連する物理的パラメータのレベルを測定する工程と、これらのパラメータの１つまたは複数を変化させる試験化合物を候補化合物として同定する工程を有する。特定の実施形態では、白質ジストロフィーに関連する物理的パラメータは、オリゴデンドロサイト数の減少、低髄鞘形成、小脳顆粒ニューロン喪失、線条体ニューロン喪失、髄鞘形成不全、髄鞘形成遅延、異常増加、運動失調、およびニューロン生存率の低下のうちの１つ以上から選択される。
【0012】
別の態様では、低髄鞘形成および大脳基底核の萎縮（Ｈ－ＡＢＣ）の治療のための治療候補化合物を同定する方法が開示される。例示的な方法は、Ｈ－ＡＢＣのトランスジェニックマウスモデルを試験化合物に曝す工程と、前記試験化合物の存在下および非存在下でマウスの白質ジストロフィーの１つまたは複数のパラメータを測定する工程と、１つまたは複数のパラメータを改善する試験化合物を治療候補化合物として同定する工程とを有する。
【0013】
さらに別の態様では、本発明は、低髄鞘形成および大脳基底核の萎縮（Ｈ－ＡＢＣ）の治療のための治療候補化合物を同定する方法であって、前記方法は、ＴＵＢＢ－４Ａ変異を有する対象およびＴＵＢＢ－４Ａ変異を有さない対照対象からＰＢＭＣを得る工程と、工程ａ）からの単球を再プログラムして人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する工程と、デュアルＳＭＡＤ阻害プロトコルを適用して、ｉＰＳＣを線条体有棘ニューロンの運命に向けて分化させる工程であって、前記細胞は、ＤＡＲＰＰ３２、ＣＴＩＰ２、ＧＡＢＡおよびＦｏｘＰ１から選択される１つ以上のマーカーを発現する、分化させる工程と、前記細胞を前記化合物と接触させて、前記化合物が、前記変異を持たない対照細胞と比較して、白質ジストロフィーの表現型に関連するパラメータを変化させるかどうかを評価する工程とを有する。いくつかの実施形態では、パラメータは、細胞生存の低下、有棘ニューロンマーカー発現の変化、および細胞形態またはシグナル伝達の変化のうちの１つまたは複数から選択される。細胞は、表１に記載されるＴＵＢＢ－４Ａ変異のいずれかを保有する患者から得ることができる。
【0014】
Ｈ－ＡＢＣを治療するための別のアプローチは、ＴＵＢＢ４－Ａの全体的な発現をダウンモジュレートし、それによってＨ－ＡＢＣの症状を改善する有効量の化合物の投与を伴う。特定の態様では、化合物は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および変異型Ｔｕｂｂ４Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡのいずれかに十分に相補的であるリボザイムから選択される。
【0015】
治療のための別のアプローチでは、ＴＵＢＢ４Ａをコードする核酸をゲノム編集する方法が開示される。例示的な方法は、対象者にベクターを投与する工程を有し、前記対象はヒトであり、前記ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ媒介塩基エディター３（ＢＥ３）システムの核酸成分およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を有し、前記ｇＲＮＡは、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の変異を標的とする。治療用遺伝子を塩基編集することで、治療用遺伝子に修正コドンが導入され、前記塩基編集は前記ベクターによって行われる。
【0016】
変異型Ｔｕｂｂ４Ａ遺伝子を有する対象における低髄鞘形成および大脳基底核の萎縮（Ｈ－ＡＢＣ）白質ジストロフィーの治療または予防のための別の方法は、野生型ＴＵＢＢ４－Ａタンパク質の発現を増加させる化合物の有効量を投与することを含み、それによってＨ－ＡＢＣの症状を改善する。特定の実施形態では、発現の増加は、発現またはウイルスベクター、または核酸をコードする野生型ＴＵＢＢ４－Ａを有するナノ粒子の導入を介した野生型ＴＵＢＢ４－Ａの過剰発現によって達成される。
【0017】
最後に、本発明は、前述の請求項のいずれかに記載の方法を実施するためのキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図１Ａ－１Ｍ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは生存率の低下、歩行異常、進行性の運動機能障害を示す（図１Ａ）マウスのＴｕｂｂ４ａ遺伝子を示す模式図と、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、およびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスのシークエンスチャート。赤い矢印はエクソン４の７４５ヌクレオチドの位置を示しており、ＷＴはＧの１つのピーク、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは「Ｇ」と「Ａ」のそれぞれに１つのピーク、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスはＴが２つのピークを示す。（図１Ｂ）ＷＴと比較して重度のジストニアと運動失調を伴う末期（ＥＳ）のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス（～Ｐ３５－Ｐ４０）の代表的な画像。（図１Ｃ）ＷＴ同腹子と比較したＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスのカプランマイヤー生存曲線（ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定、ｎ＝２８）。（図１Ｄ）行動テストの時間経過を表示する模式図。（図１Ｅ）はい歩きと歩行の様子を示す図：歩行測定では、はい歩きと歩行を採点した（表３参照）。はい歩きでは、後肢全体が地面につく（＃）、尾が低い、または、地面につく（赤い矢印で示す）。はい歩きから歩行に移行する際には、頭が上がり始める。歩行は後肢のつま先が地面につき、踵が上がった状態でのみ見られ、［＃＃］で示される。（図１Ｆ）Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ７、Ｐ１０、Ｐ１４における歩行障害。二元配置分散分析とそれに続くテューキー事後分析による統計分析、ｎ＝１０。（図１Ｇ）ＷＴ同腹子と比較したＴｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮのＰ７、Ｐ２１、Ｐ３５における歩行角度の代表的な画像。（図１Ｈ）Ｐ７、Ｐ１４、Ｐ２１、Ｐ２８、Ｐ３５におけるＷＴ同腹子と比較したＴｕｂｂ４ａＤ２４９ＮとＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎの歩行角度の測定。二元配置分散分析とそれに続くテューキー事後分析による統計分析、ｎ＝１４。（図１Ｉ）ぶら下がり握力測定の図解。（図１Ｊ）Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの倒立角度で測定した握力をＷＴと比較した結果。一元配置分散分析とそれに続くテューキー事後分析による統計的検定、ｎ＝１０。（図１Ｋ）ＷＴと比較したＴｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ２１、Ｐ２８、Ｐ３５における落下までの待ち時間（秒）を示すローターロッドテスト、ｎ＝１４。（図１Ｌ）Ｐ７からのＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮおよびＷＴの体重測定のグラフ、ｎ＝１０。（図１Ｍ）Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ、ＷＴマウスの立ち直り反射の変化、ｎ＝１４。統計的検定は、反復測定による二元配置分散分析を行い、テューキーの事後分析を行った。データは平均値とＳＥＭで示した。＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<０．００１。
【図2】図２Ａ－２Ｄ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは１年後に低髄鞘形成を示す（図２Ａ）ＷＴと比較したＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスのカプランマイヤー生存曲線（ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソンテスト、ｎ＝１０）。（図２Ｂ）ＷＴと比較したＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスの９ヶ月齢および１歳におけるローターロッドテストのパフォーマンス（ｎ＝７～８）。（図２Ｃ）統計的検定は一元配置分散分析とテューキー事後検定で行った。（図２Ｄ）ＷＴおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９ＮマウスのＥＳにおけるＰＬＰ（緑）。
【図3】図３Ａ－３Ｚ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは髄鞘形成に重度の発達遅延を示す（図３Ａ）免疫組織化学的アッセイの時間経過を示す模式図。（図３Ｂ）脳梁（ＣＣ）と小脳（Ｃｂ）の分析を示す模式図。（図３Ｃ－３Ｄ）脳梁におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎのエリオクロムシアニン（Ｅｒｉ－Ｃ）染色（ミエリン[青]）の代表的な末期画像（ＥＳ）（図３Ｃ）および定量化（図３Ｄ）。スケールバー＝２５０μｍ（「＄＄＄」はＰ２１とＥＳの間の有意差を示す）。（図３Ｅ－３Ｆ）小脳におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮのＥｒｉ－Ｃ染色の代表的なＥＳ画像（図３Ｅ）と定量化（図３Ｆ）。スケールバー＝１ｍｍ（「＄＄＄＄」はＰ２１とＥＳの間の有意差を示す）。（図３Ｇ－３Ｊ）１歳のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスに見られるＣＣでのＥｒｉ－Ｃ染色の消失（図３Ｇおよび図３Ｈ）とＭＢＰ免疫染色の消失（図３Ｉおよび図３Ｊ）の代表画像と定量化。（図３Ｋ－３Ｌ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの脳梁におけるＰ１４、Ｐ２１、ＥＳでのＰＬＰ（緑色）の代表的な末期画像（図３Ｋ）と定量化（図３Ｌ）。スケールバー＝２５０μｍ。（図３Ｍ－３Ｎ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの前脳におけるＰ２１およびＥＳでの正規化されたＰＬＰタンパク質レベルの代表的なウェスタンブロット画像（図３Ｍ）と定量化（図３Ｎ）。（図３Ｏ－３Ｐ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの小脳におけるＰ１４、Ｐ２１、ＥＳでのＰＬＰ（緑色）の代表的な末期画像（図３Ｏ）と定量化（図３Ｐ）。スケールバー＝１ｍｍ。（図３Ｑ－３Ｒ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの小脳におけるＰ２１およびＥＳでの正規化したＰＬＰタンパク質レベルの代表的なウェスタンブロット画像（図３Ｑ）と定量化（図３Ｒ）。（図３Ｓ－３Ｔ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの小脳におけるＰ１４、Ｐ２１、ＥＳでのＭＢＰ（赤）の代表的なＥＳ画像（図３Ｓ）と定量化（図３Ｔ）。スケールバー＝２５０μｍ。（図３Ｕ－３Ｖ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの前脳におけるＰ２１およびＥＳでの正規化したＭＢＰタンパク質レベルの代表的なウェスタンブロット画像（図３Ｕ）と定量化（図３Ｖ）。（図３Ｗ－３Ｘ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの小脳におけるＰ１４、Ｐ２１、ＥＳでのＭＢＰ（赤）の代表的なＥＳ画像（図３Ｗ）と定量化（図３Ｘ）。（図３Ｙ－３Ｚ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの前脳におけるＰ２１およびＥＳでの正規化したＭＢＰタンパク質レベルの代表的なウェスタンブロット画像（図３Ｙ）と定量化（図３Ｚ）。統計的検定は、二元配置分散分析を行い、テューキーの事後検定を行った。代表的なデータは、Ｐ１４（Ｐ１４時点でのＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎのｎ＝３を除く）およびＰ２１ではｎ＝４マウス／グループ、ＥＳではｎ＝３マウス／グループである。データは平均値とＳＥＭで示した。＊ｐ<０．０５および＊＊＊および＄＄＄ｐ<０．００１。
【図4】図４Ａ－４Ｆ：脊髄の電子顕微鏡分析は、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎマウスが低髄鞘形成および髄鞘形成不全を示す。（図４Ａ－Ｆ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎマウスの末期における腹側脊髄の代表的な電子顕微鏡（ＥＭ）画像。スケールバー＝１μｍ（図４Ａ－Ｆ）脊髄の高倍率画像は、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎ組織における軸索（青いアスタリスク）のマクロファージ（Ｍ）媒介食作用を伴うＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎ動物におけるミエリン鞘の厚さを示す。スケールバー＝８００ｎｍ。
【図5】図５Ａ－５Ｊ：視神経の電子顕微鏡検査は、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎマウスが低髄鞘形成および髄鞘形成不全を示すことを示している（図５Ａ－５Ｃおよび図５Ｈ－５Ｊ）。ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎマウスの末期における視神経の代表的な電子顕微鏡（ＥＭ）画像。スケールバー＝８００ｎｍ（図５Ａ－５Ｃおよび図５Ｈ－５Ｊ）。ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎの各動物におけるミエリン鞘の厚さを示す視神経の高倍率画像。赤いアスタリスク＝無髄の軸索、黒いアスタリスク＝薄く有髄の軸索である。スケールバー＝４００ｎｍ。（図５Ｄ）Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎ組織における軸索（青いアスタリスク）のマクロファージ（Ｍ）媒介食作用。スケールバー＝２μｍ。（図５Ｅ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎ組織の視神経におけるＧ比の測定。（図５Ｆ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎ組織の軸索直径に対するＧ比の散布図。（図５Ｇ）軸索の直径をすべてのグループについてプロットした。各グループｎ＝３動物で、動物あたり５０本の軸索をカウントし、データは平均値とＳＥＭで示した。データは平均値とＳＥＭで示した。一元配置分散分析を行い、テューキー事後検定を行った。＊ｐ<０．０５、＊＊＊ｐ<０．００１。
【図6】図６Ａ－６Ｇ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９ＮマウスはＰ２１で低髄鞘形成を示す。（図６Ａ）免疫組織化学的アッセイの時間経過を表示する模式図。（図６Ｂ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎの脳梁におけるエリオクロムシアニン（Ｅｒｉ－Ｃ）染色（ミエリン［青］）のＰ２１代表的な画像。スケールバー＝１ｍｍ（図６Ｃ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの脳梁におけるＰＬＰ（緑）の代表的なＰ２１画像。スケールバー＝２５０μｍ（図６Ｄ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの脳梁におけるＭＢＰ（赤）の代表的なＰ２１画像。スケールバー＝２５０μｍ（図６Ｅ）小脳におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、およびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ末期のエリオクロムシアニン（Ｅｒｉ－Ｃ）染色（ミエリン［青］）の代表的なＰ２１画像。スケールバー＝１ｍｍ（図６Ｆ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの小脳におけるＰＬＰ（緑）の代表的なＰ２１画像。スケールバー＝１ｍｍ（図６Ｇ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの小脳におけるＭＢＰ（赤）の代表的なＰ２１画像。スケールバー＝２５０μｍ。
【図7】図７Ａ－７Ｊ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスはオリゴデンドロサイト（ＯＬ）の数が減少している（図７Ａ）免疫組織化学的アッセイの時間経過を示す模式図。（図７Ｂ）カウントを実行するために使用される脳梁の領域を示す模式図。（図７Ｃ）末期（ＥＳ）にあるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＡＳＰＡ陽性ＯＬの代表的な画像。スケールバー＝５０μｍおよび２５μｍ。（図７Ｄ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ１４、Ｐ２１、およびＥＳにおけるＡＳＰＡ陽性ＯＬ数／ｍｍ２の定量化。（図７Ｅ）ＥＳでのＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスにおける二重陽性ＮＧ２＋Ｏｌｉｇ２＋の代表的な画像。スケールバー＝５０μｍおよび２５μｍ。（図７Ｆ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ１４、Ｐ２１、ＥＳにおける二重陽性ＮＧ２＋Ｏｌｉｇ２＋数／ｍｍ２の定量化。（図７Ｇ）Ｐ１４およびＰ２１におけるｎ＝４マウス／グループ（Ｐ１４時点でのＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎのｎ＝３を除く）、ＥＳにおけるｎ＝３マウス／グループとした２つの独立した実験の代表的なデータ。（図７Ｈ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／＋、およびＥＳ Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ１４、Ｐ２１、および～Ｐ３５－Ｐ４０における二重陽性ＮＧ２＋カスパーゼ細胞／ｍｍ２の定量化。（図７Ｉ）ＥＳでのＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／＋、およびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの二重陽性ＮＧ２＋Ｋｉ－６７細胞の代表的な画像。（図７Ｊ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／＋、およびＥＳ Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ１４、Ｐ２１、および～Ｐ３５－Ｐ４０における二重陽性ＮＧ２＋Ｋｉ－６７細胞／ｍｍ２の定量化。統計的検定は、二元配置分散分析を行い、テューキー事後検定を行った。データは平均値とＳＥＭで示した。＊ｐ<０．０５および＊＊＊ｐ<０．００１。
【図8】図８Ａ－８Ｇ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９ＮマウスはＰ１４で低髄鞘形成を示す（図８Ａ）免疫組織化学的アッセイの時間経過を表示する模式図。（図８Ｂ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎの脳梁におけるエリオクロムシアニン（Ｅｒｉ－Ｃ）染色（ミエリン［青］）の代表的なＰ１４画像。スケールバー＝１ｍｍ。（図８Ｃ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの脳梁におけるＰＬＰ（緑）の代表的なＰ１４画像。スケールバー＝２５０μｍ。（図８Ｄ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの脳梁におけるＭＢＰ（赤）の代表的なＰ１４画像。スケールバー＝２５０μｍ（図８Ｅ）小脳におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎの末期のエリオクロムシアニン（Ｅｒｉ－Ｃ）染色（ミエリン［青］）の代表的なＰ１４画像。スケールバー＝１ｍｍ（図８Ｆ）小脳におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰＬＰ（緑）の代表的なＰ１４画像。スケールバー＝１ｍｍ（図８Ｇ）小脳におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＭＢＰ（赤）の代表的なＰ１４画像。スケールバー＝２５０μｍ
【図9】図９Ａ－９Ｊ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、重度の小脳顆粒ニューロンの損失と、著しい線条体ニューロン喪失を示す（図９Ａ）免疫組織化学的アッセイの時間経過を表示する模式図。（図９Ｂ）Ｐ４０におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの全脳マウントを示す模式図。（図９Ｃ）ＷＴおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ２１およびＰ４０における小脳のニッスル染色像。スケールバー＝１ｍｍ（図９Ｄ）ＷＴおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ２１および末期（ＥＳ）における小脳の顆粒状ニューロンを示すＮｅｕＮ（緑）の代表的な画像。スケールバー＝１ｍｍ。（図９Ｅ）Ｐ１４、Ｐ２１、およびＥＳにおける小脳顆粒状ニューロン数／ｍｍ２の定量化。（図９Ｆ）ＷＴおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ２１およびＥＳにおける、ＮｅｕＮ（緑）と切断型カスパーゼ３（赤）で染色した二重免疫陽性の小脳顆粒ニューロンの代表的な画像（白矢印で示した）。スケールバー＝２５μｍ（図９Ｈ）ニューロン数の定量化に使用した領域（破線枠）を示す線条体の模式図。スケールバー＝１ｍｍ（図９Ｉ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＥＳでＮｅｕＮ（緑）で染色した線条体ニューロンの代表的な画像。スケールバー＝１００μｍ（図９Ｊ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ１４、Ｐ２１、およびＥＳにおける線条体ニューロン数／ｍｍ２の定量化。統計的検定は、二元配置分散分析を行い、テューキー事後検定を行う。Ｐ１４およびＰ２１におけるｎ＝４マウス／グループ（Ｐ１４時点でのＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎのｎ＝３を除く）、ＥＳにおけるｎ＝３マウス／グループとした２つの独立した実験の代表的なデータ。データは平均値とＳＥＭで示した。＊ｐ<０．０５および＊＊＊ｐ<０．００１。
【図10】図１０Ａ－１０Ｃ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎマウスは低髄鞘形成を示す。Ｐ１４（図１０Ａ）、Ｐ２１（図１０Ｂ）、およびＥＳ（図１０Ｃ）（スケールバー＝１ｍｍ）におけるＷＴおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎの矢状断面の代表的なＥｒｉ－Ｃ（ミエリン）染色像。
【図11】図１１Ａ－１１Ｋ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎマウスのオリゴデンドロサイトおよびニューロンは、枝分かれや突起の低下を示す（図１１Ａ－Ｃ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎマウスから分離したＰＬＰ標識オリゴデンドロサイト（ＯＬ）の代表的な画像。スケールバー＝５０μｍ（図１１Ｄ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、およびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９ＮマウスのカバースリップでＯｌｉｇ２標識細胞の数をカウントし、ＷＴ動物のＯｌｉｇ２＋細胞の割合としてプロットした。（図１１Ｅ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９ＮマウスのＰＬＰ＋細胞の総数を、ＷＴ動物におけるＰＬＰ＋細胞の割合としてプロットした。（図１１Ｆ）全Ｏｌｉｇ２＋細胞からの成熟ＰＬＰ＋細胞の数を、ＷＴ動物の割合としてプロットした。実験は少なくとも３回、独立して繰り返された。（図１１Ｇ）Ｔｕｊ１（軸索マーカー）とＭＡＰ２（樹状突起マーカー）で染色したＷＴマウスの皮質ニューロンの代表的な画像。（図１１Ｈ）Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎマウスの皮質ニューロンをＴｕｊ１とＭＡＰ２で染色した画像。スケールバー＝７５μｍ（図１１Ｉ）プレーティング後１週間で生存しているニューロン数を定量化し、ＷＴニューロンの割合としてプロットした。（図１１Ｊ）軸索長はＮｅｕｒｉｔｅ ｔｒａｃｅｒプラグインを用いて測定し、全グループでプロットした（図１１Ｋ）樹状突起長はＮｅｕｒｉｔｅ ｔｒａｃｅｒプラグインを用いて測定し、全グループでプロットした。データは平均値とＳＥＭで示した。データセットに対して一元配置分散分析を行い、テューキー事後検定を行った。＊ｐ<０．０５、＊＊＊ｐ<０．００１
【図12】図１２Ａ－１２Ｅ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９ＮマウスはＰ１４およびＰ２１でオリゴデンドロサイトの数の減少を示す（図１２Ａ－Ｂ）Ｐ１４（図１２Ａ）およびＰ２１（図１２Ｂ）におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＡＳＰＡ陽性ＯＬの代表的な画像。スケールバー＝５０μｍと２５μｍ（図１２Ｃ－１２Ｄ）Ｐ１４（図１２Ｃ）およびＰ２１（図１２Ｄ）におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの二重陽性ＮＧ＋Ｏｌｉｇ２＋の代表的な画像。スケールバー＝５０μｍおよび２５μｍ（図１２Ｅ）Ｐ１４、Ｐ２１、およびＥＳにおけるＯｌｉｇ２＋細胞のカウントの定量化。統計的検定は、二元配置分散分析を行い、テューキー事後検定を行った。データは平均値とＳＥＭで示した。
【図13】図１３Ａ－１３Ｆ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎマウスでは微小管の重合が阻害されている（図１３Ａ）。ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎの皮質ニューロンからＥＢ３トラッキングに基づいて作成したカイモグラフの例（図１３Ｂ）。１００μｍあたりのＥＢ３コメットの数を１０分間追跡したグラフがプロットされている（図１３Ｃ）。ＥＢ３の追跡に基づいて、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎの微小管重合についてプロットされた速度（図１３Ｄ－Ｅ）。ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９ＮＥＢ３コメットについて、総実行時間（図１３Ｄ）および実行時間のヒストグラム（図１３Ｅ）をプロットした。（図１３Ｆ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９ＮＥＢ３コメットについてプロットされた総走行距離。データは平均値とＳＥＭで示した。データセットに対して一元配置分散分析を行い、その後テューキー事後検定を行った。＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．００１、＊＊＊ｐ<０．００１。
【図14】図１４Ａ－１４Ｅ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎマウスは同等のプルキンエニューロン数を示す（図１４Ａ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ１４における小脳顆粒ニューロンとカスパーゼ染色の代表的な画像。スケールバー＝１ｍｍおよび５０μｍ（図１４Ｂ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ１４とＰ２１における線条体ニューロンの代表的な画像。スケールバー＝１００μｍ（図１４Ｃ）ＷＴおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ１４におけるニッスル染色。スケールバー＝１ｍｍ（図１４Ｄ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ２１および末期にカルビンジンで染色したプルキンエニューロンの代表的な画像。スケールバー＝１００μｍ（図１４Ｅ）ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ２１および末期におけるプルキンエニューロン数／ｍｍ２の定量化。統計的検定は、二元配置分散分析を行い、その後テューキー事後検定を行う。データは平均とＳＥＭで示した。
【図15】図１５Ａ－１５Ｂ：Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９ＮマウスはＰ１４およびＰ２１でＯＬ細胞死を示す（図１５Ａ）Ｐ１４におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの二重陽性Ｏｌｉｇ２＋カスパーゼの代表的な画像。（図１５Ｂ）Ｐ２１におけるＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎのマウスにおける二重陽性Ｏｌｉｇ２＋カスパーゼの代表的な画像。スケールバー＝５０μｍおよび２５μｍ
【図16】図１６Ａ－１６Ｄ：野生型（図１６Ａ）とＴｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９Ｎ（図１６Ｂ）細胞のＭａｐ２およびＤａｐｉ染色。ＴＵＢＢ４ＡＤ２４９ＮｉＰＳＣ由来ニューロンからの全ニューロン（図１６Ｃ）および線条体ニューロン（図１６Ｄ、ＣＴＩＰ２＋ニューロン）は、対照ｉＰＳＣ由来ニューロンと比較して生存率が低下し、（図１６Ｅ）ＴＵＢＢ４ＡＤ２４９Ｎはアポトーシスおよび神経病理学を増加させた。（図１６Ｆ－Ｇ）対照患者株におけるＣＲＩＳＰＲを介したＴＵＢＢ４Ａの欠失は、ニューロンの発達／形成には影響がない。＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<０．００１
【図17】図１７Ａ－１７Ｂ：ＴＵＢＢ４Ａの欠失はＴＵＢＢ４ＡＤ２４９ＮＭＳＮｓにおいて神経保護的である。総ニューロン（図１７Ａ）および中有棘ニューロン（図１７Ｂ）ＴＵＢＢ４ＡＤ２４９Ｎ ＭＳＮの定量化。
【図20】図２０Ａ－２０Ｃ：確立されたＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスモデルにおけるＴＵＢＢ４Ａのダウンレギュレーションの治療効果。確立されたマウスモデルをＴｕｂｂ４ａノックアウト（ＫＯ）マウスと交配したが、これらのマウスは生存しており、正常に見える。（図２０Ａ）Ｔｕｂｂ４ａトランスジェニックマウスの交配の図。（図２０Ｂ）得られたＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／ＫＯマウスは、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスと比較して、運動機能の改善と生存率の向上を示し、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／ＫＯ（～Ｐ１０８）の生存率は、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス（～Ｐ３５－Ｐ４０）と比較して延長された。（図２０Ｃ）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／ＫＯとＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎとの比較による運動機能の改善（ｎ＝２－３、＊＊＊ｐ<０．０００１）。
【図21】図２１Ａ－２１Ｄ：実行可能な治療標的としてのＡＳＯの評価。マウスのＯｌｉ－ｎｅｕ細胞を用いてＡＳＯのライブラリをスクリーニングした。２つの強力なＡＳＯ（ＡＳＯ １３１６および１８５１）が最大のＴｕｂｂ４ａノックダウンを示した。（図２１Ａ）Ｏｌｉ－Ｎｅｕ細胞でｑＲＴ－ＰＣＲを用いて生体外でＡＳＯライブラリをスクリーニングした後、２つの有望なＡＳＯの選択。＊＊＊ｐ<０．０００１。可変ＡＳＯ用量２５、１０、５、２、１、０．５μｇ／ｇの用量）での単回脳室内（ＩＣＶ）ボーラス注射の投与により、用量反応が確立された。最も毒性の低い最も強力なＡＳＯ１３１６が選択された（データは示さず）。（図２１Ｂ）Ｐ１ Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスに２μｇ／ｇの用量で単回ＩＣＶ注射したところ、対照マウス（ＰＢＳ、スクランブルＡＳＯ）と比較して治療を受けたマウスの生存率が上昇した。（図２１Ｃ）Ｔｕｂｂ４ａ ＡＳＯで治療したＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスも、対照マウス（ＰＢＳ、スクランブルＡＳＯ）と比較して、Ｐ３４－Ｐ３７にからの発作の減少を示した。（図２１Ｄ）さらに、これらのマウスは、Ｐ２８およびＰ３５において、ローターロッドで測定した運動機能の有意な改善を示した（ＮＣ５－スクランブルＡＳＯ；＊ｐ<０．０１、＊＊ｐ<０．００１、＊＊＊ｐ<０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【0019】
大脳基底核および小脳の髄鞘形成不全と萎縮（Ｈ－ＡＢＣ）は、チューブリン アルファ４（ＴＵＢＢ４Ａ）の原因となる変異に関連するまれな髄鞘形成不全白質ジストロフィーであり、ｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ（Ｄ２４９Ｎ）は、影響を受けた個人の大多数で発生する再発性の変異である。また、ＴＵＢＢ４Ａの単一対立遺伝子変異は、早期発症型脳症から成人発症のジストニア４型（嗄声発声障害）に至るまで、より広い範囲の神経障害を引き起こす可能性がある。Ｈ－ＡＢＣは、このスペクトラムに含まれ、通常、幼少期に発症し、ジストニア、運動失調、歩行障害、進行性の運動機能障害を特徴とし、人生の最初の１０年が経過する前に歩行ができなくなる。現在のところ、この進行性で身体障害を伴う小児疾患に対する治療アプローチはない。ＴＵＢＢ４Ａ変異がどのようにＨ－ＡＢＣを引き起こすかを理解し、治療戦略の開発と前臨床試験を促進するために、我々のグループは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９アプローチを用いて、ヘテロ接合（Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ）またはホモ接合（Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ）Ｔｕｂｂ４ａ変異を持つノックインマウスモデルを開発した。
【0020】
Ｔｕｂｂ４ａマウスＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎは、生存率が低く、振戦、異常歩行、運動失調を伴う進行性の運動機能障害を示し、この疾患の表現型を再現している。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの神経病理学的評価では、生後１４日目、２１日目、４０日目に免疫標識法とウェスタンブロット法を用いて、初期の髄鞘形成の遅れとそれに続く最終的な脱髄を示した。ミエリンタンパク質は時間とともに減少し、ＡＳＰＡ陽性のオリゴデンドロサイト（ＣＮＳの髄鞘形成細胞）は劇的に減少している。電子顕微鏡による脳の超薄切片では、これらのマウスの脊髄および視神経において、低髄鞘形成とミエリンの継続的な喪失がさらに確認された。さらに、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスから培養したオリゴデンドロサイトの生体外研究では、成熟度の低下とミエリンマーカーの減少が確認された。同様に、神経病理学的にも線条体や小脳顆粒細胞で深刻な神経細胞の減少が見られた。さらに、培養した神経細胞にも影響があり、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの細胞では、神経細胞の生存率が低下し、微小管の動きが不安定になっていることがわかった。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、Ｈ－ＡＢＣの新しいモデルマウスであり、この疾患における細胞生理学の複雑さを示している。また、ＴＵＢＢ４Ａ変異によって微小管が不安定になり、オリゴデンドロサイト、線条体ニューロン、小脳顆粒細胞に細胞自律的な影響を与え、深刻な神経発達の表現型をもたらす可能性がある。
【0021】
追加の研究において、Ｈ－ＡＢＣ患者から採取した末梢血サンプルから、再プログラムされ、誘導された、多能性幹細胞株を提供する。これらの細胞株の使用は、変異型Ｔｕｂｂ－４ａをコードする核酸を、この配列を標的とする核酸を用いてダウンモジュレーションすることにより、白質ジストロフィーの新たな治療パラダイムを発見した。別のアプローチでは、野生型のＴｕｂｂ－４ａを目的の部位で過剰発現させるベクターが提供される。Ｔｕｂｂ－４ａの過剰発現は、ＭＢＰ、ＰＬＰ、およびＣＮＰ ｍＲＮＡレベルの増加と関連しており、そのような治療を必要とする対象のＨ－ＡＢＣ症状を緩和するはずである。
【0022】
また、ＴＵＢＢ４Ａ発現を効果的にダウンモジュレートする新たな治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドを開発し、それによって白質ジストロフィーの治療に新たなアプローチを提供する。
【0023】
定義
本主題は、本開示の一部を構成する以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本発明は、本明細書に記載および／または示された特定の製品、方法、条件またはパラメータに限定されるものではなく、また、本明細書で使用される用語は、例示として特定の実施形態を説明するためのものであり、請求された発明を限定することを意図したものではないことを理解されたい。
本主題は、本開示の一部を構成する以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。本発明は、本明細書に記載および／または示された特定の製品、方法、条件またはパラメータに限定されるものではなく、また、本明細書で使用される用語は、例示として特定の実施形態を説明するためのものであり、請求された発明を限定することを意図したものではないことを理解されたい。
【0024】
本明細書で特に定義されていない限り、本願に関連して使用される科学技術用語は、当業者に共通して理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【0025】
上記および本開示全体で採用されているように、以下の用語および略語は、特に明記されていない限り、以下の意味を持つと理解されるものとする。
【0026】
本開示では、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形の参照を含み、特定の数値への参照は、文脈が明らかに他を示さない限り、少なくともその特定の値を含む。したがって、例えば、「化合物」への言及は、当業者に知られているそのような化合物およびその等価物の１つまたは複数への言及である、など。本明細書で使用される用語「複数」は、２つ以上を意味する。値の範囲が表現される場合、別の実施形態には、１つの特定の値および／または他の特定の値が含まれる。同様に、値が近似値として表現される場合、先行詞「約」の使用により、特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。すべての範囲は、包括的で組み合わせ可能である。
【0027】
本明細書で使用される用語「成分」、「組成物」、「化合物の組成物」、「化合物」、「薬剤」、「薬理学的に活性な薬剤」、「活性剤」、「治療的な」、「療法」、「治療」、または「医薬品」は、本明細書において互換的に使用され、対象（ヒトまたは動物）に投与されたときに、局所的および／または全身的作用によって所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘発する化合物または複数の化合物、または物質の組成物を指すものとする。用語「薬剤」および「試験化合物」は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子、またはバクテリア、植物、菌類、または動物（特に哺乳類）の細胞や組織などの生物学的材料から作られた抽出物を意味する。生物学的高分子には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体、および本明細書に記載のＴＵＢＢ４Ａ含有核酸またはそれらのコードされたタンパク質の活性を調節する能力を示す任意の核酸ベースの分子が含まれる。
【0028】
本明細書で使用される用語「ＴＵＢＢ４Ａ」とは、ベータチューブリンファミリーのメンバーをコードする遺伝子を意味する。ベータチューブリンは、ヘテロ二量体化して集合し、微小管を形成する２つのコアタンパク質ファミリー（アルファおよびベータチューブリン）の１つである。この遺伝子の変異は、髄鞘形成不全の白質ジストロフィー－６および常染色体優性捻転ジストニア－４およびＨ－ＡＢＣを引き起こし、現在ではより一般的にＴＵＢＢ４Ａ関連白質脳症と呼ばれている。ＴＵＢＢ４Ａの参照配列としては、ＧｅｎＢａｎｋに掲載されているＮＭ＿００１２８９１２３．１、ＮＭ＿００１２８９１２７．１、ＮＭ＿００１２８９１２９．１などがある。選択的スプライシングにより、異なるアイソフォームをコードする複数の転写変異体が生じる。野生型のＴｕｂｂ４ａタンパク質の配列は、ＵｎｉＰｒｏｔのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｐ０４３５０－ＴＢＢ４Ａ＿ｈｕｍａｎにある。ヒトの疾患に関連することが知られているいくつかのＴＵＢＢ４Ａ変異体が同定されており、下記の表１に記載されている。本発明では、Ｄ２４９Ｎ変異体に焦点を当てているが、その知見は他の既存のＴＵＢＢ４Ａ突然変異にも一般化できる。
【表1】
【0029】
表２は、さまざまな形態のＴＵＢＢ４Ａ関連白質脳症に関連する特定のアミノ酸の変化の一覧である。
【表2】
【0030】
本明細書で使用される場合、用語「治療」または「療法」（およびその異なる形態）には、病気を防ぐあるいは予防に寄与する（例えば、予防的）、治癒的または緩和的な治療が含まれる。本明細書では、「治療する」という用語には、状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害または負の効果または症状を緩和または軽減することが含まれる。
【0031】
本明細書では、用語「対象」、「個人」、および「患者」という用語は互換的に使用され、予防的治療を含む本発明による医薬組成物による治療が提供される動物、例えばヒトを指す。本明細書で使用される用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳類」という用語は、本明細書において互換的に使用され、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類、（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマなどの哺乳類、および爬虫類、両生類、ニワトリおよび七面鳥などの非哺乳類を含む。
【0032】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用される。これらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体のポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドやヌクレオチド類似体など、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される可能性がある。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などにより、重合後にさらに修飾され得る。
【0033】
本明細書で使用される用語「野生型」は、当業者が理解する技術用語であり、変異体または変異型形態とは区別される、自然界に存在する生物、株、遺伝子または特性の典型的な形態を意味する。本明細書では、「変異型」という用語は、野生型から逸脱したパターンを持つ性質の発現、または非天然由来の成分からなる性質の発現を意味すると考えられるべきである。
【0034】
用語「自然に発生しない」または「設計された」は、互換的に使用され、人の手が関与していることを示す。用語は、核酸分子またはポリペプチドに言及するときの用語は、核酸分子またはポリペプチドが、自然界で見られるような、それらが自然に関連している少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【0035】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益または所望の結果をもたらすのに十分な薬剤の量を意味する。治療有効量は、治療を受ける対象および疾患の状態、対象の体重および年齢、疾患の状態の重症度、投与方法などの１つまたは複数に応じて変化する可能性があり、当業者であれば容易に決定することができる。この用語は、本明細書に記載されているイメージング方法のいずれか１つによる検出のための画像を提供する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の薬剤、従うべき投与計画、他の化合物と組み合わせて投与するかどうか、投与のタイミング、画像化される組織、およびそれが運ばれる物理的な送達システムのうちの１つまたは複数に応じて変化し得る。
【0036】
本発明の実施には、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、および組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)：PCR 2:A PRACTICAL APPROACH（M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds.(1995))、Harlow and Lane, eds.(1988)「ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL」、「ANIMAL CELL CULTURE」（R. I. Freshney, ed.(1987))を参照されたい。
【0037】
本発明のいくつかの態様は、１つまたは複数のベクター、またはそのようなベクターを有するベクターシステムに関するものである。ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素）の発現のために設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、または哺乳類細胞で発現させることができる。適切な宿主細胞については、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press.San Diego, Calif.(1990)でさらに説明される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、生体外で転写および翻訳することができる。
【0038】
いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳類発現ベクターを使用して、哺乳類細胞で１つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Seed, 1987. Nature 329: 840）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には１つ以上の制御要素によって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、および本明細書に開示され、当技術分野で知られている他のものに由来する。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１６章および１７章、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL.2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【0039】
いくつかの実施形態では、組換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的制御要素を用いて核酸を発現させる）。組織特異的調節要素は当技術分野で知られている。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277）、リンパ系特異的プロモーター（Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733）および免疫グロブリン（Baneiji, et al., 1983.Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983.Cell 33: 741-748）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86: 5473-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルクホエイプロモーター、米国特許第4,873,316号および欧州出願公開第264,166号）がある。発生的に制御されるプロモーターもまた包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Kessel and Gruss, 1990.Science 249：374-379）およびα－フェトプロテインプロモーター（Campes and Tilghman, 1989, Genes Dev.3：537-546）が挙げられる。高レベルの発現を得るために、Tubb4-Aをコードする核酸をコドン最適化することができる。
【0040】
一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現または活性の指示に関与する転写産物およびその他の要素を総称して指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において、「直接反復」およびｔｒａｃｒＲＮＡ処理部分直接反復を包含する）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈では「スペーサー」とも呼ばれる）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数の要素は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数の要素は、化膿レンサ球菌などの内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを構成する特定の生物に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈ではプロトスペーサーとも呼ばれる）の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素を特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成という文脈では、「標的配列」とは、ガイド配列が相補性を持つように設計された配列を指し、標的配列とガイド配列の間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではなく、ハイブリダイゼーションを起こしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があればよい。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなど、任意のポリヌクレオチドから構成されてもよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。いくつかの実施形態では、標的配列は、真核細胞の細胞小器官、例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体内にあってもよい。標的配列を構成する標的遺伝子座への組換えに使用され得る配列またはテンプレートは、「編集テンプレート」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と呼ばれる。本発明の態様において、外因性テンプレートポリヌクレオチドは、編集テンプレートと呼ばれることがある。本発明の一態様では、組換えは相同組換えである。
【0041】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つまたは複数の要素の発現を駆動する１つまたは複数のベクターが、ＣＲＩＳＰＲシステムの要素の発現が１つまたは複数の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示するように、宿主細胞に導入される。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別々のベクター上の別々の制御要素に動作可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節要素から発現される２つまたはそれ以上の要素が、単一のベクターに組み合わされ、１つまたは複数の追加のベクターが、第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素を提供してもよい。単一のベクターに組み合わされるＣＲＩＳＰＲシステム要素は、１つの要素が第２の要素に対して（「上流」の）５’または（「下流」の）３’に位置するなど、任意の適切な向きに配置されてもよい。１つの要素のコード化配列は、２つ目の要素のコード化配列の同じまたは反対側の鎖に位置し、同じまたは反対の方向に配向していてもよい。いくつかの実施形態では、単一のプロモーターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素と、ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列（任意でガイド配列に動作可能に連結されている）、および１つ以上のイントロン配列（例えば、それぞれが異なるイントロンにある、２つまたはそれ以上が少なくとも１つのイントロンにある、またはすべてが１つのイントロンにある）内に埋め込まれたｔｒａｃｒ配列のうちの１つ以上をコードする転写物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒメイト配列、およびｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに動作可能に連結され、同じプロモーターから発現される。
【0042】
いくつかの実施形態では、ベクターは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニングサイト」とも呼ばれる）などの１つまたは複数の挿入部位を備える。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の挿入部位）が、１つまたは複数のベクターの１つまたは複数の配列要素の上流および／または下流に位置する。いくつかの実施形態では、ベクターは、挿入部位にガイド配列を挿入した後、発現時にガイド配列が真核細胞内の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示するように、ｔｒａｃｒメイト配列の上流に、任意にｔｒａｃｒメイト配列に動作可能に連結された調節要素の下流に、挿入部位を備える。いくつかの実施形態では、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含み、各挿入部位は、各部位にガイド配列を挿入することができるように、２つのトレーサーメイト配列の間に配置されている。このような配置では、２つ以上のガイド配列は、単一のガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、またはこれらの組み合わせで構成されていてもよい。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化することができる。例えば、単一のベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ以上のガイド配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のそのようなガイド配列含有ベクターが提供され得、任意に細胞に送達され得る。代替の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ媒介の塩基エディターは、ＢＥ３ではなく、塩基エディター４（ＢＥ４）である。注目すべきは、塩基編集は、表１に記載された変異核酸のいずれかを変更するために採用され得ることである。
【0043】
いくつかの実施形態では、本方法は、別の塩基への変化についてウィンドウ内のＣ塩基を評価する工程をさらに有する。実施形態では、ＢＥ３ ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）が、標的シトシン塩基（複数可）から１３～１７ヌクレオチド離れている場合に、ｇＲＮＡが選択される。特定の実施形態では、変化はセンス鎖上のＣからＴを介しており、修正コドンはナンセンスコドンに変更される。追加の実施形態では、変化はアンチセンス鎖上のＧからＡを経由しており、修正コドンはナンセンスコドンに変更される。さらなる実施形態では、変化はセンス鎖上のＣからＴを介しており、変化はミスセンス変異体である。さらなる実施形態では、変化はアンチセンス鎖上のＧからＡを介しており、変化はミスセンス変異体である。疾患が治療用遺伝子の変異に起因する表現型である場合、塩基編集は、疾患の発症前に行われてもよい。特定の実施形態では、塩基編集は、疾患を発症するリスクを減少させる。
【0044】
用語「ベクター」は、細胞に感染、遺伝子導入、または形質転換することができ、宿主細胞ゲノム内で独立してまたは複製することができる一本鎖または二本鎖の環状核酸分子に関する。円形の二本鎖核酸分子は、制限酵素で処理することにより切断され、線状化することができる。ベクター、制限酵素、および制限酵素が標的とするヌクレオチド配列の知識は、当業者が容易に入手可能であり、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスなどの任意のレプリコンであって、付着した配列または要素の複製をもたらすように別の遺伝的配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を付着させることができるものを含む。本発明の核酸分子は、制限酵素でベクターを切断し、２つのフラグメントを一緒に連結することにより、ベクターに挿入することができる。
【0045】
いくつかの態様では、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、三重核酸など）、例えば、または本明細書に記載の１つ以上のベクター、その１つ以上の転写物、および／またはそれから転写された１つまたはタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、本発明はさらに、そのような方法によって産生された細胞、およびそのような細胞を含んでいるか、またはそのような細胞から産生された生物（動物、植物、または菌類など）を提供する。いくつかの実施形態では、ガイド配列と組み合わせた（任意に複合化された）ＣＲＩＳＰＲ酵素が細胞に送達される。哺乳類細胞または標的組織に核酸を導入するために、従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用することができる。このような方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素をコードする核酸を、培養中の細胞、または宿主生物に投与するために用いることができる。非ウイルス性ベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれ、これらは、細胞への送達後にエピソームまたは統合されたゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順のレビューについては、Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bihm (eds) (1995); and Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994) を参照。
【0046】
核酸の非ウイルス性送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ヴィロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤増強ＤＮＡの取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号、および第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））も市販されている。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性の脂質には、Ｆｅｉｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４のものが含まれる。送達は、細胞（例えば、試験管内または生体外の投与）または標的組織（例えば、生体内の投与）に行うことができる。
【0047】
免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者にはよく知られている（例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al, Cancer Gene Ther.2:291-297(1995); Behr et al, Bioconjugate Chem.5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao et al、Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad et al., Cancer Res.52:4817-4820(1992)；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、および第４，９４６，７８７号を参照）。
【0048】
核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスのペイロードを核に輸送するという高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することもできるし（生体内）、生体外で細胞を処理し、その処理した細胞を患者に投与することも可能である（生体外）。従来のウイルスベースのシステムには、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスベクターなどが含まれ得る。宿主ゲノムへの統合は、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法で可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現が得られることが多い。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織で高い形質導入効率が観察されている。
【0049】
レトロウイルスのトロピズムは、外来のエンベロープタンパク質を組み込むことで変化し、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質転換または感染させることができるレトロウイルスベクターであり、一般的に高いウイルス力価を生成する。したがって、レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存することになる。レトロウイルスベクターは、シス作用を持つ長末端反復構造からなり、最大６～１０ｋｂの外来配列をパッケージングすることができる。ベクターの複製とパッケージングには最小のシス作用ＬＴＲで十分であり、これを用いて治療用遺伝子を標的細胞に組み込み、導入遺伝子を永続的に発現させることができる。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせをベースにしたものが含まれる（例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700を参照）。
【0050】
一過性の発現が望ましい用途では、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型で非常に高い導入効率を示すことができ、細胞分裂を必要としない。このようなベクターでは、高い力価とレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的簡単なシステムで大量に生成することができる。
【0051】
アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターはまた、標的核酸を細胞に導入するために、例えば、核酸およびペプチドの試験管内生産において、ならびに生体内および生体外の遺伝子治療手順のために使用することができる（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987); U.S. Pat. No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、U.S. Pat. No. 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); and Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)を含む多くの出版物に記載されている）。
【0052】
パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージする細胞株を製造することによって生成される。ベクターには、パッケージ化とその後の宿主への組み込みに必要な最小限のウイルス配列が含まれており、その他のウイルス配列は、発現すべきポリヌクレオチドの発現カセットで置き換えられる。不足しているウイルスの機能は、典型的にはパッケージング細胞株によってトランス状態で供給される。例えば、遺伝子治療に用いられるＡＡＶベクターは、パッケージ化と宿主ゲノムへの組み込みに必要なＡＡＶゲノムのＩＴＲ配列のみを有している。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株でパッケージ化される。この細胞株には、ヘルパーとしてアデノウイルスが感染している場合もある。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製とヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列がないため、有意な量ではパッケージされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減することができる。
【0053】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つまたは複数のベクターで一過性または非一過性に遺伝子導入される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象において自然に発生するように遺伝子導入される。いくつかの実施形態では、遺伝子導入される細胞は、対象から採取される。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞に由来する。
【0054】
一態様では、本発明は、生体内、生体外または試験管内であってもよい真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒトまたは非ヒトの動物から細胞または細胞の集団をサンプリングする工程と、細胞または細胞（複数）を改変する工程とを有する。培養は、生体外のどの段階で行ってもよい。細胞または細胞（複数）は、ヒトまたは非ヒト動物に再導入されてもよい。
【0055】
一態様では、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて、前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、それによって標的ポリヌクレオチドを改変する工程を有し、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、次にｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒメイト配列に連結されている。
【0056】
一態様では、本発明は、上記の方法および組成物に開示された要素のいずれか１つまたは複数を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、前記キットは、上述のような代替送達システムのためのベクターシステムまたは構成要素、およびキットの使用説明書を有する。いくつかの実施形態では、前記ベクターまたは送達システムは、（ａ）ｔｒａｃｒメイト配列に作動可能に連結された第１の制御要素と、ｔｒａｃｒメイト配列の上流にガイド配列を挿入するための１つまたは複数の挿入部位とを有し、発現すると前記ガイド配列が、真核細胞内の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示し、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズしたガイド配列、および（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした前記ｔｒａｃｒメイト配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を有し、および／または、（ｂ）核局在化配列を有する前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード化配列に作動可能に連結された第２の制御要素を有する。要素は、個別にまたは組み合わせて提供されてもよく、バイアル、ボトル、またはチューブなどの任意の適切な容器で提供されてもよい。いくつかの実施形態では、キットは、１つまたは複数の言語、例えば２つ以上の言語による説明書を含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載された１つまたは複数の要素を利用するプロセスで使用するための１つまたは複数の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器で提供されてもよい。例えば、キットは、１つまたは複数の反応または保存バッファーを提供してもよい。試薬は、特定のアッセイに使用可能な形態、または使用前に１つまたは複数の他の成分を加える必要がある形態（例えば、濃縮または凍結乾燥形態）で提供されてもよい。バッファーは、炭酸ナトリウムバッファー、炭酸水素ナトリウムバッファー、ホウ酸塩バッファー、トリスバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、およびこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない任意のバッファーであることができる。いくつかの実施形態では、バッファーはアルカリ性である。いくつかの実施形態では、バッファーは、約７～約１０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、キットは、ガイド配列と調節要素を作動可能に連結するようにベクターに挿入するためのガイド配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、キットは、相同組換えテンプレートポリヌクレオチドを有する。
【0058】
ダウンモジュレーションまたは阻害性核酸は、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、トリプレックス形成分子、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、外部ガイド配列を含むが、これらに限定されるものではない。これらの核酸分子は、標的分子が有する特定の活性の影響因子、阻害因子、調節因子、および刺激因子として作用することができ、また、機能性核酸分子は、他の分子に依存しないデノボ活性を有することができる。特定の実施形態では、阻害性核酸が採用される。
【0059】
アンチセンス分子は、正規または非正規の塩基対を介して標的核酸分子と相互作用するように設計されている。アンチセンス分子と標的分子の相互作用は、例えばＲＮａｓｅ Ｈを介したＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドの分解などにより、標的分子の破壊を促進するように設計されている。あるいは、アンチセンス分子は、転写や複製など、標的分子で通常行われる処理機能を阻害するように設計されている。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセスしやすい領域を見つけてアンチセンスの効率を最適化する方法は数多く存在する。例示的な方法としては、試験管内の選択実験や、ＤＭＳやＤＥＰＣを用いたＤＮＡ修飾研究が挙げられる。アンチセンス分子は、１０－６、１０－８、１０－１０、１０－１２以下の解離定数（Ｋｄ）で標的分子と結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計と使用に役立つ方法と技術の代表的な例は、米国特許第５，１３５，９１７号、第５，２９４，５３３号、第５，６２７，１５８号、第５，６４１，７５４号、第５，６９１，３１７号、第５，７８０，６０７号、第５，７８６，１３８号、第５，８４９，９０３号、第５，８５６，１０３号、第５，９１９，７７２号、第５，９５５，５９０号、第５，９９０，０８８号、第５，９９４，３２０号、第５，９９８，６０２号、第６，００５，０９５号、第６，００７，９９５号、第６，０１３，５２２号、第６，０１７，８９８号、第６，０１８，０４２号、第６，０２５，１９８号、第６，０３３，９１０号、第６，０４０，２９６号、第６，０４６，００４号、第６，０４６，３１９号、および第６，０５７，４３７号に記載されている。
【0060】
トリプレックス形成機能性核酸分子は、二本鎖または一本鎖の核酸と相互作用することができる分子である。トリプレックス分子が標的領域と相互作用すると、ワトソン・クリック塩基対とフーグスティーン塩基対の両方に依存した複合体を形成する３本のＤＮＡが存在する、トリプレックスと呼ばれる構造が形成される。トリプレックス分子は、高い親和性と特異性をもって標的領域と結合できるので好ましい。三重鎖形成分子は、１０－６、１０－８、１０－１０、または１０－１２以下のＫｄで標的分子と結合することが好ましい。トリプレックス形成分子を用いて様々な異なる標的分子を結合させる方法の代表的な例は、米国特許第5,176,996号、第5,176,996号、第5,645,985号、第5,650,316号、第5,683,874号、第5,693,773号、第５，８３４，１８５号、第５，８６９，２４６号、第５，８７４，５６６号、および第５，９６２，４２６号に記載されている。また、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、遺伝子の発現を極めて特異的に抑制することができる。このサイレンシングは、もともと二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加によって観察された（Fire, A., et al., Nature, 391:806-11 (1998); Napoli, C., et al., Plant Cell, 2:279-89 (1990); Hannon, G. J., Nature, 418:244-51 (2002)）。ｄｓＲＮＡが細胞内に入ると、ＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素であるダイサーによって切断され、３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む長さ２１～２３ヌクレオチドの二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になる（Elbashir, S. M., et al., Genes Dev., 15:188-200 (2001); Bernstein, E., et al., Nature, 409:363-6 (2001); Hammond, S. M., et al., Nature, 404:293-6 (2000)）。ＡＴＰ依存の工程において、ｓｉＲＮＡは、一般にＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるマルチサブユニットタンパク質複合体に統合され、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列に導く（Nykanen, A., et al., Cell, 107:309-21 (2001)）。ある時点でｓｉＲＮＡ二重鎖は巻き戻され、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに結合したまま、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの組み合わせによる相補的なｍＲＮＡ配列の分解を指示するようである（Martinez, J., et al., Cell, 110:563-74 (2002)）。しかし、ＲＮＡｉやｓｉＲＮＡの効果やその利用は、どのようなメカニズムにも限定されない。
【0061】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングを誘導し、それによって遺伝子発現を減少させるか、あるいは阻害することができる二本鎖ＲＮＡである。ある例では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとターゲットＲＮＡの両方の間の配列同一性の領域内で、ｍＲＮＡなどの相同性のあるＲＮＡ分子の特異的な分解を誘発する。例えば、ＷＯ０２／４４３２１には、３’オーバーハングエンドと塩基対向したときに標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡが開示されており、これらのｓｉＲＮＡの製造方法については参照により本明細書に組み込まれる。配列特異的な遺伝子サイレンシングは、酵素ダイサーによって産生されるｓｉＲＮＡを模倣した合成の短い二本鎖ＲＮＡを用いて哺乳類細胞で達成することができる（Elbashir, S. M., et al., Nature, 411:494 498(2001); Ui-Tei, K., et al., FEBS Lett, 479:79-82 (2000)）。ｓｉＲＮＡは、化学的または生体外で合成されることもあれば、短い二本鎖のヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が細胞内でｓｉＲＮＡに加工されたものであることもある。合成ｓｉＲＮＡは通常、アルゴリズムと従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて設計される。サプライヤーには、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースチン）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（マサチューセッツ州アシュランド）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（コロラド州ラファイエット）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）、ＭＷＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ドイツ・エスバースバーグ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（コロラド州ボルダー）、Ｑｉａｇｅｎ（オランダ・ヴェント）が含まれる。ｓｉＲＮＡはＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ．ＲＴＭ． ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔなどのキットを使用して試験管内で合成することもできる。
【0062】
ＲＮＡｉと同様に、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）干渉は、選択的なＤＮＡ切断を介して、内因性に発現するタンパク質の遺伝子発現を低下させる強力なアプローチである。ＣＲＩＳＰＲは、ユニークなスペーサーで区切られた直接反復を含む遺伝子要素で、その多くはファージやその他の外来遺伝子要素に見られる配列と同一である。最近の研究では、適応免疫におけるＣＲＩＳＰＲの役割が明らかにされ、ＣＲＩＳＰＲから派生した低分子ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が、外来ＤＮＡの標的干渉のためのホーミングオリゴヌクレオチドとして実装されていることが示された（Jinek et al., Science, 337:816-821 (2012））。ｃｒＲＮＡは、遺伝子レベルでＤＮＡを選択的に切断するために使用される。
【0063】
ｓｈＲＮＡとは、短いヘアピンＲＮＡのことで、タイトなヘアピンターンを形成するＲＮＡ構造であり、ＲＮＡ干渉による遺伝子発現のサイレンシングにも利用される。ｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、細胞内の機械によって切断されて低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）となり、この低分子干渉ＲＮＡがＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、それに結合しているｓｉＲＮＡと一致するｍＲＮＡに結合して切断する。
【0064】
本明細書では、宿主細胞でのタンパク質の産生に言及する際の用語「過剰発現」は、そのタンパク質が、自然に存在する環境で産生される量よりも多く産生されることを意味する。
【0065】
本明細書で使用される用語「遺伝子改変」は、１つまたは複数の核酸分子の野生型または参照配列からの変化を意味する。遺伝的変化には、既知の配列の核酸分子からの少なくとも１つのヌクレオチドの塩基対置換、付加、および欠失が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0066】
本明細書で使用される用語「固体マトリックス」は、ビーズ、微粒子、マイクロアレイ、微量滴定ウェルまたは試験管の表面、ディップスティックまたはフィルターなどの任意の形式を指す。マトリックスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、デキストラン、またはアガロースであり得る。
【0067】
特定のヌクレオチドまたはアミノ酸を参照する際の「本質的にからなる」という句は、所定の配列ＩＤ番号の特性を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に言及して使用される場合、この句は、配列自体および配列の機能的および新規の特性に影響を与えないであろう分子修飾を含む。
【0068】
本明細書で使用される「標的核酸」は、複合核酸混合物中に存在する核酸の以前に定義された領域を指し、定義された野生型領域は、白質ジストロフィーに関連する少なくとも１つの既知のヌクレオチド変異を含む。核酸分子は、ｃＤＮＡクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって天然源から単離されてもよいし、手動で合成されてもよい。核酸分子は、トリエステル合成法により手動で合成してもよいし、自動ＤＮＡ合成機を用いて合成してもよい。
【0069】
用語「相補的」は、互いに複数の有利な相互作用を形成することができる２つのヌクレオチドを表す。例えば、アデニンはチミンと相補的で、２つの水素結合を形成することができる。同様に、グアニンとシトシンは３つの水素結合を形成することができるので、相補的である。したがって、ある核酸配列が、チミン、アデニン、グアニン、シトシンという塩基配列を含んでいる場合、この核酸分子の「補体」は、チミンの代わりにアデニンを、アデニンの代わりにチミンを、グアニンの代わりにシトシンを、シトシンの代わりにグアニンを含む分子となる。補体は、親核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含むことができるため、そのような補体は親分子に高い親和性で結合することができる。
【0070】
用語「プロモーター要素」は、適切な細胞内に入ると、転写因子および／またはポリメラーゼが結合、ならびにその後のベクターＤＮＡの一部のｍＲＮＡへの転写を促進することができる、ベクターに組み込まれるヌクレオチド配列を説明する。一実施形態では、本発明のプロモーター要素は、白質ジストロフィー特異的マーカー核酸分子の５’末端に先行し、後者がｍＲＮＡに転写されるようにする。その後、宿主細胞の機構がｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳する。
【0071】
当業者は、核酸ベクターが、プロモーター要素および白質ジストロフィー特異的マーカー遺伝子核酸分子以外の核酸要素を含むことができることを認識するであろう。これらの他の核酸要素には、複製の起源、リボソーム結合部位、薬剤耐性酵素またはアミノ酸代謝酵素をコードする核酸配列、および分泌シグナル、局在化シグナル、またはポリペプチドの精製に有用なシグナルをコードする核酸配列が含まれるが、これらに限定されない。
【0072】
「レプリコン」とは、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、プラスチド、ファージ、ウイルスなど、大部分が自己の制御下で複製可能な任意の遺伝的要素をいう。レプリコンは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり、一本鎖または二本鎖である。
【0073】
「発現オペロン」とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写および翻訳制御配列を有し得、宿主細胞または生物におけるポリペプチドコード化配列の発現を促進することができる核酸セグメントをいう。
【0074】
本明細書では、「レポーター」、「レポーターシステム」、「レポーター遺伝子」、または「レポーター遺伝子産物」という用語は、核酸が、発現すると、例えば、生物学的アッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、または比色法、蛍光法、化学発光法などの方法で容易に測定可能なレポーターシグナルを生成する産物をコードする遺伝子を含んでいる作動可能な遺伝システムを意味するものとする。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、直鎖または環状、一本鎖または二本鎖、アンチセンス極性またはセンス極性のいずれかであり、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御要素と作動可能に連結されている。必要な制御要素は、レポーターシステムの性質や、レポーター遺伝子がＤＮＡの形態であるかＲＮＡの形態であるかによって異なるが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリＡ付加シグナル、転写終結シグナルなどの要素が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0075】
上述したように、導入された核酸は、レシピエント細胞または生物の核酸に組み込まれる（共有結合される）場合もあれば、組み込まれない場合もある。例えば、細菌、酵母、植物、哺乳類の細胞では、導入された核酸は、エピソーム要素やプラスミドなどの独立したレプリコンとして維持されていてもよい。あるいは、導入された核酸は、レシピエント細胞または生物の核酸に組み込まれ、その細胞または生物において安定的に維持され、さらにレシピエント細胞または生物の子孫の細胞または生物に受け継がれるか、または継承されてもよい。最後に、導入された核酸は、レシピエント細胞または宿主生物に一過性にのみ存在し得る。
【0076】
用語「作動可能に連結された」は、コード化配列の発現に必要な調節配列が、コード化配列に対して適切な位置にＤＮＡ分子内に配置されており、コード化配列の発現をもたらすことを意味する。この同じ定義は、発現ベクターにおける転写ユニットおよび他の転写制御要素（例えばエンハンサー）の配置にも適用されることがある。
【0077】
「修飾されたバックボーン連結」という句は、これに限定されないが、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、エチルホスホネート連結、ボラノホスフェート連結、スルホンアミド、カルボニルアミド、ホスホロジアミデート、正に帯電した側基を有するホスホロジアミデート連結、ホスホロジチオエート、アミノエチルグリシン、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、２－５’連結ボラノホスホネート類似体、反転した極性を有する連結、脱塩基連結、短鎖アルキル連結、シクロアルキルインターヌクレオシド連結、混合ヘテロ原子とアルキルまたはシクロアルキルインターヌクレオシド連結、シロキサンバックボーンとの短鎖ヘテロ原子または複素環式インターヌクレオシド連結、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル連結、チオホルムアセチル連結、メチレンホルムアセチル連結、チオホルムアセチル連結、リボアセチル連結、アルケン連結、スルファメートバックボーン、メチレンイミノ連結、メチレンヒドラジノ連結、スルホネート連結、およびアミド結合を含む。
【0078】
「修飾糖」という句は、２’フルオロ、２’フルオロ置換リボース、２’－フルオロ－Ｄ－アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）、２’－０－メトキシエチルリボース、２’－０－メトキシエチルデオキシリボース、２’－Ｏ－メチル置換リボース、モルホリノ、ピペラジン、およびロックド核酸（ＬＮＡ）を含むが、これらに限定されるものではない。
【0079】
「特異的結合対」とは、互いに特定の特異性を有し、通常の状態では他の分子よりも優先的に結合する特異的結合メンバー（ｓｂｍ）および結合パートナー（ｂｐ）を有する。特異的結合対の例は、抗原と抗体、リガンドと受容体、および相補的ヌクレオチド配列が挙げられる。当業者であれば、他にも多くの例を知っている。さらに、用語「特異的結合対」は、特異的結合メンバーおよび結合パートナーのいずれかまたは両方が大きな分子の一部を有する場合にも適用される。特異的結合対が核酸配列を有する実施形態では、それらはアッセイの条件下で互いにハイブリダイズする長さであり、好ましくは１０ヌクレオチド長より長く、より好ましくは１５または２０ヌクレオチド長より長い。
【0080】
「サンプル」または「患者サンプル」または「生物学的サンプル」は、一般に、特定の分子、好ましくは、以下の表に示されるマーカーなどの白質ジストロフィー特異的マーカー分子について試験され得るサンプルを指す。サンプルには、細胞、血液、血清、血漿、尿、唾液、脳脊髄液、涙、胸水などの体液が含まれ得るが、これらに限定されない。
【0081】
キットおよび製造品
前述の製品のいずれも、ＴＵＢＢ－４Ａ誘導性ダウンモジュレーション核酸を薬学的に許容される担体中に含むキットに組み込むことができる。核酸は、哺乳類細胞を形質導入することができるベクターに配置されていてもいなくてもよい。他の態様では、キットは、目的の標的細胞において同じものを過剰発現させるための、ヒト野生型ＴＵＢＢ－４Ａおよび／または変異型ＴＵＢＢ－４Ａをコードする核酸を発現するベクターを含む。キットには、核酸の細胞内への送達を容易にするナノ粒子またはリポソーム製剤を任意に含めることができる。また、キットには、使用説明書、容器、投与用の容器、アッセイ用の基質、またはそれらの任意の組み合わせが含まれていてもよい。
前述の製品のいずれも、ＴＵＢＢ－４Ａ誘導性ダウンモジュレーション核酸を薬学的に許容される担体中に含むキットに組み込むことができる。核酸は、哺乳類細胞を形質導入することができるベクターに配置されていてもいなくてもよい。他の態様では、キットは、目的の標的細胞において同じものを過剰発現させるための、ヒト野生型ＴＵＢＢ－４Ａおよび／または変異型ＴＵＢＢ－４Ａをコードする核酸を発現するベクターを含む。キットには、核酸の細胞内への送達を容易にするナノ粒子またはリポソーム製剤を任意に含めることができる。また、キットには、使用説明書、容器、投与用の容器、アッセイ用の基質、またはそれらの任意の組み合わせが含まれていてもよい。
【0082】
治療薬の開発とスクリーニングの方法
本明細書で同定されたＴＵＢＢ４－Ａの遺伝子変化は、Ｈ－ＡＢＣの病因と関連しているので、変異した遺伝子およびそのコード化された産物の活性を調節する薬剤を同定する方法は、白質ジストロフィー、特にＨ－ＡＢＣの治療のための有効な治療剤の生成をもたらすはずである。
本明細書で同定されたＴＵＢＢ４－Ａの遺伝子変化は、Ｈ－ＡＢＣの病因と関連しているので、変異した遺伝子およびそのコード化された産物の活性を調節する薬剤を同定する方法は、白質ジストロフィー、特にＨ－ＡＢＣの治療のための有効な治療剤の生成をもたらすはずである。
【0083】
分子モデリングにより、機能に必要な構造または主要なアミノ酸残基に基づいて、変化したＴＵＢＢ４－Ａタンパク質の活性部位に結合する能力を持つ特定の有機分子の同定が容易になるはずである。コンビナトリアルケミストリーの手法を用いて最大の活性を有する分子を同定し、その後、これらの分子の反復が、スクリーニングのさらなるサイクルのために開発される。
【0084】
薬物スクリーニングアッセイに使用されるポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中で遊離しているか、固体支持体に固定されているか、または細胞内にあるかのいずれかである。薬物スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換えポリヌクレオチドで安定的に形質転換された真核または原核の宿主細胞を利用するもので、好ましくは競合的な結合アッセイを行う。このような細胞は、生存中または固定された形態のいずれかで、標準的な結合アッセイに使用することができる。例えば、ポリペプチドまたはフラグメントと試験される薬剤との間の複合体の形成を決定するか、またはポリペプチドまたはフラグメントと既知の基質との間の複合体の形成が、試験される薬剤によって妨害される程度を調べることができる。
【0085】
薬剤スクリーニングのための別の技術は、コードされたポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開されたＧｅｙｓｅｎのＰＣＴ公開出願ＷＯ８４／０３５５６４に詳細に記載されている。簡単に述べると、上述のような多数の異なる小さなペプチド試験化合物を、プラスチックピンまたは他の何らかの表面などの固体基板上で合成する。このペプチド試験化合物を標的ポリペプチドと反応させ、洗浄する。結合したポリペプチドは、当業界でよく知られた方法で検出される。
【0086】
薬物スクリーニングのためのさらなる技術は、非機能的または改変されたＴＵＢＢ４－Ａ関連遺伝子を有する宿主の真核細胞株または細胞（上述のようなもの）を使用することを含む。これらの宿主細胞株または細胞は、ポリペプチドレベルで欠損している。この宿主細胞株または細胞は、薬物化合物の存在下で増殖する。宿主細胞の細胞代謝の速度を測定し、化合物が欠陥のある細胞の細胞代謝を調節することができるかどうかを決定する。ＤＮＡ分子を導入する方法も、上述したように当業者にはよく知られている。
【0087】
本発明のＨ－ＡＢＣ関連核酸またはその機能的フラグメントを発現する宿主細胞は、潜在的な化合物または薬剤を、白質ジストロフィーの発生を調節する能力についてスクリーニングするシステムを提供する。したがって、一実施形態では、本発明の核酸分子を使用して、神経細胞のシグナル伝達および神経細胞のコミュニケーションと構造に関連する細胞代謝の側面を調節する薬剤を同定するためのアッセイで使用する組換え細胞株を作成することができる。また、本明細書では、ＴＵＢＢ４－Ａ含有核酸によってコードされるタンパク質の機能を調節することができる化合物をスクリーニングする方法も提供される。
【0088】
別のアプローチでは、改変されたＴＵＢＢ４－Ａ核酸によってコードされるポリペプチドのフラグメントをファージ表面に発現するように設計されたファージディスプレイライブラリを使用する。そのようなライブラリは、次に、発現したペプチドと化学ライブラリの成分との間の結合親和性が検出され得る条件下で、コンビナトリアル化学ライブラリと接触される。米国特許第６，０５７，０９８号および第５，９６５，４５６号には、このようなアッセイを行うための方法および装置が記載されている。このような化合物ライブラリは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ，（英国、トレビレット、コーンウォール）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ニュージャージー州プリンストン）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒ（コネチカット州ニューミルフォード）、Ａｌｄｒｉｃｈ（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、Ａｋｏｓ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ（スイス、バーゼル）、Ａｍｂｉｎｔｅｒ（フランス、パリ）、Ａｓｉｎｅｘ（ロシア、モスクワ）、Ａｕｒｏｒａ（オーストリア、グラーツ）、ＢｉｏＦｏｃｕｓ ＤＰＩ（スイス）、Ｂｉｏｎｅｔ（英国、キャメルフォード）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ（カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｃｈｅｍ Ｄｉｖ（カリフォルニア州サンディエゴ）を含むがこれらに限定されない多くの企業から商業的に入手可能である。当業者であれば、他の入手先を知っており、容易に購入することができる。本明細書に記載されたスクリーニングアッセイで治療上有効な化合物が同定されたら、それらを医薬組成物に配合し、Ｈ－ＡＢＣの治療に利用することができる。
【0089】
合理的薬物設計の目的は、例えば、ポリペプチドのより活性なまたは安定な形態であるか、または例えば、生体内でポリペプチドの機能を増強または妨害する薬物を作るために、興味のある生物学的に活性なポリペプチドまたはそれらが相互作用する小分子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター）の構造的類似体を作り出すことである。例えば、Hodgson, (1991) Bio/Technology 9:19-21を参照のこと。上述した１つのアプローチでは、関心のあるタンパク質または例えばタンパク質－基質複合体の三次元構造は、Ｘ線結晶学によって、核磁気共鳴によって、コンピュータモデリングによって、または最も典型的には、アプローチの組み合わせによって解決される。ポリペプチドの構造に関する有用な情報は、相同性のあるタンパク質の構造に基づいてモデリングすることで得られることが少ない。合理的な薬物設計の例として、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発が挙げられる（Erickson et al., (1990) Science 249:527-533）。さらに、ペプチドは、アラニンスキャンによって分析することができる（Wells, (1991) Meth. Enzym. 202:390-411）。この技術では、アミノ酸残基をＡｌａで置換し、ペプチドの活性に対するその効果を決定する。このようにして、ペプチドの各アミノ酸残基を分析し、ペプチドの重要な領域を決定する。
【0090】
また、機能アッセイによって選択された標的特異的抗体を単離し、その結晶構造を解明することも可能である。原理的には、このアプローチは、ファーマコアを得て、それをもとに薬物設計を行うことができる。
【0091】
また、機能的で薬理学的に活性な抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ＩＤ）を作製することで、タンパク質の結晶構造解析を完全に回避することもできる。鏡像の鏡像として、抗ＩＤの結合部位は元の分子の類似体であることが予想される。そして、抗ＩＤは、化学的または生物学的に生成されたペプチドのバンクからペプチドを特定し、分離するために使用される。そして、選択されたペプチドは、ファーマコアとして機能する。
【0092】
別の実施形態では、改変されたＴＵＢＢ－４Ａ核酸の利用可能性により、本発明の白質ジストロフィー関連ＴＵＢＢ４－Ａ核酸を有する実験用マウスの系統の生産が可能になる。本発明の白質ジストロフィー関連核酸を発現するトランスジェニックマウスは、白質ジストロフィーの発症および進行におけるｇ核酸がコードする変異Ｔｕｂｂ４－ａタンパク質の役割を検討するモデルシステムを提供するものである。実験用マウスに導入遺伝子を導入する方法は、当業者に知られており、以下に記載する。３つの一般的な方法は、１．目的の外来遺伝子をコードするレトロウイルスベクターの初期胚への組み込み、２．新たに受精した卵の前核へのＤＮＡの注入、３．遺伝的に操作された胚性幹細胞の初期胚への組み込み、を含む。上記のようなトランスジェニックマウスを作製することで、標的タンパク質が様々な細胞の代謝や神経系で果たす役割を分子レベルで解明することができる。このようなマウスは、全動物モデルで推定治療薬を研究するための生体内スクリーニングツールを提供し、本発明に包含される。
【0093】
用語「動物」は、本明細書において、ヒトを除くすべての脊椎動物を含むように使用される。また、胚期および胎児期を含む、すべての発達段階にある個々の動物を含む。「トランスジェニック動物」とは、標的組換えや微量注入、組換えウイルスの感染など、細胞以下のレベルでの意図的な遺伝子操作により、直接的または間接的に変更されたまたは受け取られた遺伝情報を有する１つ以上の細胞を含む動物をいう。用語「トランスジェニック動物」は、古典的な異種交配や体外受精を包含するものではなく、むしろ、１つ以上の細胞が組換えＤＮＡ分子によって変化しているか、または組換えＤＮＡ分子を受け取っている動物を包含するものであると考えられる。この分子は、特定の遺伝子座を標的としたものであっても、染色体にランダムに組み込まれたものであっても、あるいは染色体外で複製されたＤＮＡであってもよい。用語「生殖細胞系トランスジェニック動物」とは、遺伝子改変または遺伝情報が生殖細胞系細胞に導入され、それによって遺伝情報を子孫に伝える能力が付与されたトランスジェニック動物を指す。その子孫が実際にその改変や遺伝情報の一部または全てを有する場合、その子孫もトランスジェニック動物であると言える。
【0094】
標的遺伝子を改変するために使用されるＤＮＡは、ゲノム源からの単離、単離されたｍＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの調製、直接合成、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない多様な技術によって得ることができる。
【0095】
導入遺伝子を導入するための好ましいタイプの標的細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、試験管内で培養した着床前の胚から得ることができる（Evans et al., (1981) Nature 292:154-156; Bradley et al., (1984) Nature 309:255-258; Gossler et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83:9065-9069）に記載されている。導入遺伝子は、ＤＮＡ遺伝子導入、またはレトロウイルスを介した導入などの標準的な技術によって、ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。得られた形質転換ＥＳ細胞は、その後、非ヒト動物の胚盤胞と組み合わせることができる。導入されたＥＳ細胞は、その後、胚をコロニー化し、得られたキメラ動物の生殖系列に寄与する。
【0096】
望む変異に任意の遺伝子領域を不活性化または改変する技術が利用可能である。本明細書において、ノックイン動物とは、例えば、内在性マウス遺伝子が本発明のヒト白質ジストロフィー関連ＴＵＢＢ４－Ａ遺伝子で置換された動物である。このようなノックイン動物は、白質ジストロフィーの発症を研究するための理想的なモデルシステムを提供する。ノックアウト動物も作成可能である。
【0097】
本明細書で使用されるように、白質ジストロフィー関連核酸、そのフラグメントの発現は、白質ジストロフィー関連核酸の全部または一部をコードする核酸配列が、コードされたタンパク質の発現を特定の組織または細胞型で指示する調節配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に作動可能に連結されたベクターを使用して、「組織特異的な方法」または「細胞型特異的な方法」で標的化することができる。このような調節要素は、生体外および生体内の両方の用途に有利に使用することができる。組織特異的なタンパク質を指示するためのプロモーターは、当技術分野でよく知られており、本明細書に記載されている。
【0098】
本発明のトランスジェニックマウスの使用方法も本明細書に記載されている。白質ジストロフィー関連ＴＵＢＢ４－Ａまたはそのコード化されたタンパク質を含む核酸が導入されたトランスジェニックマウスは、例えば、白質ジストロフィーの発症を調節することができるものを特定するために治療薬をスクリーニングするためのスクリーニング方法を開発するのに有用である。
【0099】
医薬品とペプチド治療薬
本明細書に記載された白質ジストロフィー関連ＣＮＶ／ＳＮＰが神経細胞のシグナル伝達や脳の構造において果たす役割が解明されたことにより、白質ジストロフィーの治療や診断に有用な医薬組成物の開発が促進される。これらの組成物は、上記の物質の１つに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者によく知られている他の材料を含んでいてもよい。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨げてはならない。担体やその他の材料の正確な性質は、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔内、筋肉内、腹腔内などの投与経路によって異なる。
本明細書に記載された白質ジストロフィー関連ＣＮＶ／ＳＮＰが神経細胞のシグナル伝達や脳の構造において果たす役割が解明されたことにより、白質ジストロフィーの治療や診断に有用な医薬組成物の開発が促進される。これらの組成物は、上記の物質の１つに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者によく知られている他の材料を含んでいてもよい。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨げてはならない。担体やその他の材料の正確な性質は、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔内、筋肉内、腹腔内などの投与経路によって異なる。
【0100】
医薬組成物
機能性核酸誘導体などの治療薬、予防薬、診断薬の誘導体を含む医薬組成物は、そのような治療を必要とする対象に非経口的に投与することができる。非経口投与は、注射器、任意にペン型注射器を用いて、皮下、筋肉内、または静脈内に注射することによって行うことができる。また、非経口投与は、輸液ポンプを用いて行うこともできる。さらなる選択肢は、治療薬、予防薬、または診断薬を鼻または肺に、好ましくはその目的のために特別に設計された組成物、粉末または液体で投与することである。
機能性核酸誘導体などの治療薬、予防薬、診断薬の誘導体を含む医薬組成物は、そのような治療を必要とする対象に非経口的に投与することができる。非経口投与は、注射器、任意にペン型注射器を用いて、皮下、筋肉内、または静脈内に注射することによって行うことができる。また、非経口投与は、輸液ポンプを用いて行うこともできる。さらなる選択肢は、治療薬、予防薬、または診断薬を鼻または肺に、好ましくはその目的のために特別に設計された組成物、粉末または液体で投与することである。
【0101】
治療薬、予防薬、または診断薬の誘導体の注射用組成物は、目的の最終製品を得るために必要に応じて成分を溶解および混合することを含む製薬業界の従来の技術を用いて調製することができる。したがって、１つの手順によれば、治療薬、予防薬、診断薬の誘導体を、調製する組成物の最終容量よりもやや少ない量の水に溶解することができる。必要に応じて、等張化剤、防腐剤およびバッファーを添加することができ、必要に応じて塩酸などの酸や水酸化ナトリウム水溶液などの塩基を用いて溶液のｐＨ値を調整する。最後に、水で溶液の量を調整して、成分の所望の濃度を得ることができる。
【0102】
いくつかの実施形態では、バッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、またはそれらの混合物からなる群から選択され得る。これらの特定のバッファーのそれぞれおよびその組み合わせが、代替の実施形態を構成する。
【0103】
本発明の実施を容易にするために、以下の材料と方法が提供される。
【0104】
モデルマウスの作成
ヘテロ接合性Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは、（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ－９技術を用いて、Ｔｕｂｂ４ａ遺伝子のエクソン４にｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ（ｃ．７４５Ｇ>Ａ）変異を挿入して作製された。マウスのＴｕｂｂ４ａ遺伝子は、４つのエクソンを有する１７番染色体上に位置する。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、オリゴヌクレオチド（ターゲティング配列を持ち、両側に１２０ｂｐの相同体が隣接している）を接合体に同時注入した。得られたＣＲＩＳＰＲノックインマウスモデルは、Ｔｕｂｂ４ａ遺伝子（Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ）の１つの対立遺伝子にｃ．７４５Ｇ>Ａのヘテロ接合性点変異を有する。これらのヘテロ接合マウスを繁殖させ、ヘテロ接合Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ動物に加えて、ｔａｅｉｐラットモデルで見られるホモ接合の変異(Li et al., 2003)と同じように、ホモ接合のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスを作製した。野生型（ＷＴ）、Ｔｕｂｂ４ａマウスＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスをすべての分析に含めた。動物はすべての実験段階で遺伝子型を決定した。マウスは清潔な施設で１２時間明期：１２時間暗期のサイクルで飼育し、餌と水を自由に摂取できるようにした。実験方法および研究プロトコルは、フィラデルフィア小児病院の施設内動物管理使用委員会によって完全に承認され、改訂された国立衛生研究所の実験動物福祉方針に準拠していた。
ヘテロ接合性Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは、（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ－９技術を用いて、Ｔｕｂｂ４ａ遺伝子のエクソン４にｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ（ｃ．７４５Ｇ>Ａ）変異を挿入して作製された。マウスのＴｕｂｂ４ａ遺伝子は、４つのエクソンを有する１７番染色体上に位置する。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、オリゴヌクレオチド（ターゲティング配列を持ち、両側に１２０ｂｐの相同体が隣接している）を接合体に同時注入した。得られたＣＲＩＳＰＲノックインマウスモデルは、Ｔｕｂｂ４ａ遺伝子（Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ）の１つの対立遺伝子にｃ．７４５Ｇ>Ａのヘテロ接合性点変異を有する。これらのヘテロ接合マウスを繁殖させ、ヘテロ接合Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ動物に加えて、ｔａｅｉｐラットモデルで見られるホモ接合の変異(Li et al., 2003)と同じように、ホモ接合のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスを作製した。野生型（ＷＴ）、Ｔｕｂｂ４ａマウスＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスをすべての分析に含めた。動物はすべての実験段階で遺伝子型を決定した。マウスは清潔な施設で１２時間明期：１２時間暗期のサイクルで飼育し、餌と水を自由に摂取できるようにした。実験方法および研究プロトコルは、フィラデルフィア小児病院の施設内動物管理使用委員会によって完全に承認され、改訂された国立衛生研究所の実験動物福祉方針に準拠していた。
【0105】
行動分析
歩行角、歩行力、ぶら下がり握力、立ち直り反射(Feather-Schussler and Ferguson, 2016)およびローターロッド(Shiotsuki et al., 2010)を定義された発育間隔で評価した（図１）。行動試験には、各条件につき少なくとも１０匹のコホートが含まれた。
歩行角、歩行力、ぶら下がり握力、立ち直り反射(Feather-Schussler and Ferguson, 2016)およびローターロッド(Shiotsuki et al., 2010)を定義された発育間隔で評価した（図１）。行動試験には、各条件につき少なくとも１０匹のコホートが含まれた。
【0106】
組織処理
マウスは体重に応じて９０～１５０ｍｇ／ｋｇのケタミンと７．５～１６ｍｇ／ｋｇのキシラジンの混合物で深く麻酔され、１Ｘ ＰＢＳで最初に洗浄した後、１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に灌流された。脳を回収し、１Ｘ ＰＢＳ中４％ ＰＦＡで一晩後に固定した後、組織を１Ｘ ＰＢＳ中３０％スクロースで脱水した。脳を最適切断温度化合物（Ｏ．Ｃ．Ｔ． Ｃｏｍｐｏｕｎｄ，ＳＡＫＵＲＡ，４５８３，米国）に埋め込み、クライオスタットミクロトーム（ＣＭ ３０５０ Ｓ，Ｌｅｉｃａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）を用いて冠状切片または矢状切片（５０μｍ）にスライスした。
マウスは体重に応じて９０～１５０ｍｇ／ｋｇのケタミンと７．５～１６ｍｇ／ｋｇのキシラジンの混合物で深く麻酔され、１Ｘ ＰＢＳで最初に洗浄した後、１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で経心的に灌流された。脳を回収し、１Ｘ ＰＢＳ中４％ ＰＦＡで一晩後に固定した後、組織を１Ｘ ＰＢＳ中３０％スクロースで脱水した。脳を最適切断温度化合物（Ｏ．Ｃ．Ｔ． Ｃｏｍｐｏｕｎｄ，ＳＡＫＵＲＡ，４５８３，米国）に埋め込み、クライオスタットミクロトーム（ＣＭ ３０５０ Ｓ，Ｌｅｉｃａ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）を用いて冠状切片または矢状切片（５０μｍ）にスライスした。
【0107】
免疫組織化学と画像取得
ミエリンの定量化とニューロフィラメントの染色は、以前に発表されたプロトコルに従ってエリオクロムシアニン（Ｅｒｉ－Ｃ）染色で行った(Sahinkaya et al., 2014)。
ミエリンの定量化とニューロフィラメントの染色は、以前に発表されたプロトコルに従ってエリオクロムシアニン（Ｅｒｉ－Ｃ）染色で行った(Sahinkaya et al., 2014)。
【0108】
ニッスル染色は、凍結切片を０．１％クレシルバイオレットで１５分間染色した後、ＰＢＳで洗浄し、段階的なアルコール（７０～１００％）で脱水し、続いてキシレン処理を行い、パーマウントでマウントした。免疫蛍光染色のために、自由浮遊切片を２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％トリトン（Ｔｘ）－１００で室温で１時間ブロックした後、一次抗体を４℃で一晩、蛍光二次抗体を室温で１時間、順次培養した。一次抗体は、ラット抗プロテオリピッドタンパク質（ＰＬＰ）（ＩＤＤＲＣ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，Ｊｕｄｉｔｈ Ｇｒｉｎｓｐａｎ博士提供）、ウサギ抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（１：２５０，Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ：ａｂ４０３８９）、ウサギ抗ＮＧ２（１：２５０，ＵＳ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ：Ｃ５０６７－７０Ｄ）、マウス抗Ｏｌｉｇ２（１：１００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＢＮ５０）、マウス抗ニューロン核（ＮｅｕＮ）（１：１０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ：ＭＡＢ３７７）、ウサギ抗アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）（１：１０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ：ＧＴＸ１１０６９９）、ウサギ抗切断カスパーゼ（１：２００，細胞シグナル伝達；Ｃａｔ：＃９５７９）、ウサギ抗カルビンジン（１：２５０，Ｓｗａｎｔ，Ｃａｔ：ＣＢ３８）を含む。使用した二次抗体はウサギ、マウス、ラットに対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８－またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７－コンジュゲート二次抗体（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。核はＤＡＰＩで対比染色された。
【0109】
免疫ブロット法
Ｐ１４、Ｐ２１、末期の小脳および前脳における主要なミエリンタンパク質、ＰＬＰおよびＭＢＰのタンパク質レベルを測定するために、それぞれの脳組織をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）の存在下、ＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）で溶解した。サンプルをＬａｅｍｍｌｉバッファーで煮沸し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４～１５％ ミニプロティアンプレキャストゲル，Ｂｉｏｒａｄ，米国）で還元条件で電気泳動した。タンパク質はエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ－ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｒａｄ，米国）に転写された。膜は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）に０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０を加えて調製したブロッキングバッファー（１％脱脂乳、Ｂｉｏｒａｄ）でブロックし、続いてブロッキングバッファーで希釈したラット抗ＰＬＰ（１：１０００、ＩＤＤＲＣ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、Ｊｕｄｉｔｈ Ｇｒｉｎｓｐａｎ博士提供）およびウサギ抗ＭＢＰ（１：２０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ：ａｂ４０３８９）に対する一次抗体を用いて４℃で一晩培養した。膜をＴＢＳＴで５回洗浄し、二次ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（１：５０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号＃ｓｃ２３５７）またはヤギ抗ラット抗体（１：５０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号＃３１４７０）をブロッキングバッファーで１時間培養し、ＴＢＳＴで洗浄し、製造者の指示に従って標準ＥＣＬプロトコルを用いて現像した（Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。画像は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアでスキャンおよび分析した。ローディング管理との正規化のために、製造者の指示（Ｏｎｅ ｍｉｎｕｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ，ＧＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってストリッピングを行った後、マウス抗アクチン（Ｃｏｍｐａｎｙ、１：４０００）およびマウス抗ビンキュリン（Ｃｏｍｐａｎｙ、１：２０００）を使用した。
Ｐ１４、Ｐ２１、末期の小脳および前脳における主要なミエリンタンパク質、ＰＬＰおよびＭＢＰのタンパク質レベルを測定するために、それぞれの脳組織をプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）の存在下、ＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国）で溶解した。サンプルをＬａｅｍｍｌｉバッファーで煮沸し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４～１５％ ミニプロティアンプレキャストゲル，Ｂｉｏｒａｄ，米国）で還元条件で電気泳動した。タンパク質はエレクトロブロッティングによりニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓ－ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｒａｄ，米国）に転写された。膜は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）に０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０を加えて調製したブロッキングバッファー（１％脱脂乳、Ｂｉｏｒａｄ）でブロックし、続いてブロッキングバッファーで希釈したラット抗ＰＬＰ（１：１０００、ＩＤＤＲＣ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、Ｊｕｄｉｔｈ Ｇｒｉｎｓｐａｎ博士提供）およびウサギ抗ＭＢＰ（１：２０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｔ：ａｂ４０３８９）に対する一次抗体を用いて４℃で一晩培養した。膜をＴＢＳＴで５回洗浄し、二次ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体（１：５０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、カタログ番号＃ｓｃ２３５７）またはヤギ抗ラット抗体（１：５０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号＃３１４７０）をブロッキングバッファーで１時間培養し、ＴＢＳＴで洗浄し、製造者の指示に従って標準ＥＣＬプロトコルを用いて現像した（Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。画像は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアでスキャンおよび分析した。ローディング管理との正規化のために、製造者の指示（Ｏｎｅ ｍｉｎｕｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ，ＧＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってストリッピングを行った後、マウス抗アクチン（Ｃｏｍｐａｎｙ、１：４０００）およびマウス抗ビンキュリン（Ｃｏｍｐａｎｙ、１：２０００）を使用した。
【0110】
電子顕微鏡
髄鞘形成は、電子顕微鏡（ＥＭ）を用いた構造解析のための超薄切片でさらに評価した。マウスの別のコホートを生理食塩水で経心的に灌流し、続いて末期（～３５日目）に、０．１Ｍ ＰＢ（ＰＢ；ｐＨ７．４）中の２％ＰＦＡおよび２％グルタルアルデヒドで灌流した（ｎ＝３／グループ）(Lancaster et al., 2018)。各マウスを解剖し、視神経、頸髄、小脳（虫部）を分離した。組織を２４時間後固定し、０．１Ｍ ＰＢでリンスし、０．１Ｍ ＰＢ中の２％ ＯｓＯ４に１時間移した後、エポンに埋め込むための処理を行った(Lancaster et al., 2018)。半薄切片を切り取り、アルカリ性トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡（Ｌｅｃｉａ ＤＭＲ）インタラクティブソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ）を用いて可視化した。超薄切片（７０ｎｍ）を切り取り、クエン酸鉛と酢酸ウラニルで染色し、Ｊｅｏｌ－１０１０透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて画像化した。視神経から１００倍で撮影されたＥＭ切片からの画像をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて評価し、ｇ－比分析のために内側と外側の軸索面積を測定し、１匹あたり５０軸索、１グループあたりｎ＝３で、既報の通り定量化した (Lancaster et al., 2018)。
髄鞘形成は、電子顕微鏡（ＥＭ）を用いた構造解析のための超薄切片でさらに評価した。マウスの別のコホートを生理食塩水で経心的に灌流し、続いて末期（～３５日目）に、０．１Ｍ ＰＢ（ＰＢ；ｐＨ７．４）中の２％ＰＦＡおよび２％グルタルアルデヒドで灌流した（ｎ＝３／グループ）(Lancaster et al., 2018)。各マウスを解剖し、視神経、頸髄、小脳（虫部）を分離した。組織を２４時間後固定し、０．１Ｍ ＰＢでリンスし、０．１Ｍ ＰＢ中の２％ ＯｓＯ４に１時間移した後、エポンに埋め込むための処理を行った(Lancaster et al., 2018)。半薄切片を切り取り、アルカリ性トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡（Ｌｅｃｉａ ＤＭＲ）インタラクティブソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｕｉｔｅ）を用いて可視化した。超薄切片（７０ｎｍ）を切り取り、クエン酸鉛と酢酸ウラニルで染色し、Ｊｅｏｌ－１０１０透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて画像化した。視神経から１００倍で撮影されたＥＭ切片からの画像をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて評価し、ｇ－比分析のために内側と外側の軸索面積を測定し、１匹あたり５０軸索、１グループあたりｎ＝３で、既報の通り定量化した (Lancaster et al., 2018)。
【0111】
オリゴデンドロサイトの培養
変異による細胞の自律効果は、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスからオリゴデンドロサイトを培養して分離することで評価した。一次オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）は、補足的な方法に記載されているように、Ｍｉｌｔｅｎｙｌ抗－Ｏ４マイクロビーズを用いて、出生後Ｐ４～Ｐ７の間に大脳皮質から分離した。Ｏ４＋細胞を、２４ウェルプレートの１ウェルあたり２０，０００個のＯＰＣの密度でプレーティングした。この細胞を５～７日間増殖させた後、ＰＤＧＦおよびｂＦＧＦを含まない培地およびチロキシン Ｔ４（２０ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ｔ０３９７）を含む培地でさらに５日間分化させた。その後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、標準的な免疫化学プロトコルで染色した。カバースリップを１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％ Ｔｘ－１００で透過処理した後、１０％ 正常ヤギ血清（ＮＧＳ）溶液で１時間ブロッキングした。一次抗体は５％ＮＧＳで調製し、４℃で一晩培養した。使用した一次抗体は、オリゴデンドロサイトマーカーウサギＯｌｉｇ２（１：８００；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＡＢ９６１０）、成熟ミエリンマーカーのラットＰＬＰ（１：１）およびラットＭＢＰ（１：１）（ＩＤＤＲＣ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，Ｊｕｄｉｔｈ Ｇｒｉｎｓｐａｎ博士提供）、翌日ＰＢＳで３回洗浄し、適切な二次蛍光抗体（１：５００；抗－ラットＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、抗－ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）で培養した。その後、Ｐｒｏｌｏｎｇ ｇｏｌｄ褐色防止剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞をマウントし、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡を用いて２０倍または４０倍の対物レンズで画像を撮影し、細胞数を分析した。
変異による細胞の自律効果は、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスからオリゴデンドロサイトを培養して分離することで評価した。一次オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）は、補足的な方法に記載されているように、Ｍｉｌｔｅｎｙｌ抗－Ｏ４マイクロビーズを用いて、出生後Ｐ４～Ｐ７の間に大脳皮質から分離した。Ｏ４＋細胞を、２４ウェルプレートの１ウェルあたり２０，０００個のＯＰＣの密度でプレーティングした。この細胞を５～７日間増殖させた後、ＰＤＧＦおよびｂＦＧＦを含まない培地およびチロキシン Ｔ４（２０ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ Ｔ０３９７）を含む培地でさらに５日間分化させた。その後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、標準的な免疫化学プロトコルで染色した。カバースリップを１Ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％ Ｔｘ－１００で透過処理した後、１０％ 正常ヤギ血清（ＮＧＳ）溶液で１時間ブロッキングした。一次抗体は５％ＮＧＳで調製し、４℃で一晩培養した。使用した一次抗体は、オリゴデンドロサイトマーカーウサギＯｌｉｇ２（１：８００；ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＡＢ９６１０）、成熟ミエリンマーカーのラットＰＬＰ（１：１）およびラットＭＢＰ（１：１）（ＩＤＤＲＣ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，Ｊｕｄｉｔｈ Ｇｒｉｎｓｐａｎ博士提供）、翌日ＰＢＳで３回洗浄し、適切な二次蛍光抗体（１：５００；抗－ラットＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、抗－ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７）で培養した。その後、Ｐｒｏｌｏｎｇ ｇｏｌｄ褐色防止剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞をマウントし、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡を用いて２０倍または４０倍の対物レンズで画像を撮影し、細胞数を分析した。
【0112】
大脳皮質ニューロン培養
変異の細胞自律的影響は、培養中のＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスからニューロンを分離することで評価した。一次皮質ニューロンは、前述のようにＥ１５．５胚から分離した(Guedes-Dias et al., 2019)。簡単に説明すると、各胚から皮質を取り出し、ＨＢＳＳで洗浄した後、各サンプルに２．５％のトリプシンを加え、３７℃で７分間培養した。トリプシンを除去し、新たに温めたＨＢＳＳで４回洗浄した後、付着培地（ＭＥＭ培地、１％ピルビン酸ナトリウム、１％馬血清、グルコース、塩化ナトリウム）に再懸濁した。均質な単一細胞溶液になるまで、ピペットを用いて細胞を粉砕した。細胞をカウントし、ＰＬＬコーティングされたＭａＴｅＫプレート（中央部のみ）に１５０，０００個／プレート、１００，０００個／ウェルの密度で２４ウェルプレートにプレーティングした。培地は４時間後にあらかじめ平衡化された維持培地（神経基底培地、１％ ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ ペニシリン/ストレプトマイシン、グルコース、塩化ナトリウムおよび２％Ｂ２７溶液）に交換した。３日後、培地の２０～３０％を除去し、有糸分裂阻害剤ＡｒａＣを添加した新鮮な培地を補充し、その後ニューロンを培養した。２４ウェルプレートにプレーティングしたニューロンは、細胞生存分析、軸索および樹状突起の長さの測定で評価した。神経細胞をＭＡＰ２（１：２００）とＴｕＪ１（１：２００）で染色し、樹状突起と細胞体／軸をそれぞれ標識し、２０倍または４０倍の対物レンズで撮影して細胞数を数え、軸索と樹状突起の長さを測定した。軸索と樹状突起の長さは、ＦｉＪｉソフトウェアのＮｅｕｒｉｔｅ ｔｒａｃｅｒプラグインを用いて測定した。
変異の細胞自律的影響は、培養中のＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスからニューロンを分離することで評価した。一次皮質ニューロンは、前述のようにＥ１５．５胚から分離した(Guedes-Dias et al., 2019)。簡単に説明すると、各胚から皮質を取り出し、ＨＢＳＳで洗浄した後、各サンプルに２．５％のトリプシンを加え、３７℃で７分間培養した。トリプシンを除去し、新たに温めたＨＢＳＳで４回洗浄した後、付着培地（ＭＥＭ培地、１％ピルビン酸ナトリウム、１％馬血清、グルコース、塩化ナトリウム）に再懸濁した。均質な単一細胞溶液になるまで、ピペットを用いて細胞を粉砕した。細胞をカウントし、ＰＬＬコーティングされたＭａＴｅＫプレート（中央部のみ）に１５０，０００個／プレート、１００，０００個／ウェルの密度で２４ウェルプレートにプレーティングした。培地は４時間後にあらかじめ平衡化された維持培地（神経基底培地、１％ ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ ペニシリン/ストレプトマイシン、グルコース、塩化ナトリウムおよび２％Ｂ２７溶液）に交換した。３日後、培地の２０～３０％を除去し、有糸分裂阻害剤ＡｒａＣを添加した新鮮な培地を補充し、その後ニューロンを培養した。２４ウェルプレートにプレーティングしたニューロンは、細胞生存分析、軸索および樹状突起の長さの測定で評価した。神経細胞をＭＡＰ２（１：２００）とＴｕＪ１（１：２００）で染色し、樹状突起と細胞体／軸をそれぞれ標識し、２０倍または４０倍の対物レンズで撮影して細胞数を数え、軸索と樹状突起の長さを測定した。軸索と樹状突起の長さは、ＦｉＪｉソフトウェアのＮｅｕｒｉｔｅ ｔｒａｃｅｒプラグインを用いて測定した。
【0113】
ＥＢ３ダイナミクスのライブイメージング
エンドバインディングタンパク３（ＥＢ３）が微小管の成長するプラス端をタグ付けするＥＢ３－ｍＣｈｅｒｒｙのライブセルイメージングにより、微小管ダイナミクスを評価した。大脳皮質ニューロンは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＢ３－ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトした。遺伝子導入から２０～２４時間後、維持培地を、２％のＢ２７と２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸを添加した低蛍光のＨｉｂｅｒｎａｔｅ Ｅイメージング培地（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ）に交換した。神経細胞は、パーキンエルマー製ＵｌｔｒａＶｉｅｗ Ｖｏｘ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｋ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステムとニコン製Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立顕微鏡を用いて、Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６０倍 １．４０ＮＡ油浸対物レンズを使用し、３７℃の環境チャンバー内でイメージングした。画像は、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって駆動される浜松のＥＭＣＣＤ Ｃ９１００－５０カメラを用いて、１フレーム２秒のフレームレートで６００秒かけて取得した。ＥＢ３ダイナミクスの定量化は、前述の方法で行った(Guedes-Dias et al., 2019)。カイモグラフの作成にはＩｍａｇｅＪのマクロツールセットＫｙｍｏＣｌｅａｒを使用した(Mangeol et al., 2016)。ＫｙｍｏＣｌｅａｒツールセットは、元のカイモグラフにフーリエフィルターをかけることで、前向性、逆向性、または静的コンポーネントの自動識別を可能にし、データの定量的分析に影響を与えることなく、ＥＢ３コメットのＳ／Ｎ比を向上させる。個々のＥＢ３コメットの軌跡は、カスタムＭＡＴＬＡＢ ＧＵＩ（Ｋｙｍｏｇｒａｐｈ Ｓｕｉｔｅ）を用いて手動でトレースし、各コメットの走行距離、走行時間、速度を測定した。研究者は、画像取得とキモグラフ解析の両方において、ニューロンの遺伝子型については盲検化した。
エンドバインディングタンパク３（ＥＢ３）が微小管の成長するプラス端をタグ付けするＥＢ３－ｍＣｈｅｒｒｙのライブセルイメージングにより、微小管ダイナミクスを評価した。大脳皮質ニューロンは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＢ３－ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトした。遺伝子導入から２０～２４時間後、維持培地を、２％のＢ２７と２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸを添加した低蛍光のＨｉｂｅｒｎａｔｅ Ｅイメージング培地（ＢｒａｉｎＢｉｔｓ）に交換した。神経細胞は、パーキンエルマー製ＵｌｔｒａＶｉｅｗ Ｖｏｘ Ｓｐｉｎｎｉｎｇ Ｄｉｓｋ Ｃｏｎｆｏｃａｌシステムとニコン製Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立顕微鏡を用いて、Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６０倍 １．４０ＮＡ油浸対物レンズを使用し、３７℃の環境チャンバー内でイメージングした。画像は、Ｖｏｌｏｃｉｔｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって駆動される浜松のＥＭＣＣＤ Ｃ９１００－５０カメラを用いて、１フレーム２秒のフレームレートで６００秒かけて取得した。ＥＢ３ダイナミクスの定量化は、前述の方法で行った(Guedes-Dias et al., 2019)。カイモグラフの作成にはＩｍａｇｅＪのマクロツールセットＫｙｍｏＣｌｅａｒを使用した(Mangeol et al., 2016)。ＫｙｍｏＣｌｅａｒツールセットは、元のカイモグラフにフーリエフィルターをかけることで、前向性、逆向性、または静的コンポーネントの自動識別を可能にし、データの定量的分析に影響を与えることなく、ＥＢ３コメットのＳ／Ｎ比を向上させる。個々のＥＢ３コメットの軌跡は、カスタムＭＡＴＬＡＢ ＧＵＩ（Ｋｙｍｏｇｒａｐｈ Ｓｕｉｔｅ）を用いて手動でトレースし、各コメットの走行距離、走行時間、速度を測定した。研究者は、画像取得とキモグラフ解析の両方において、ニューロンの遺伝子型については盲検化した。
【0114】
統計解析
すべてのグラフデータは、平均±標準誤差平均（ＳＥＭ）で示した。本文中の「ｎ」は、特に明記されていない限り、実験ごとに使用されたマウスの数を表す。歩行異常、立ち直り反射、ローターロッド、および体重評価については、反復測定法を用いた二元配置分散分析に続いて、事後テューキー検定を用いて分析した。握力と歩行については、一元配置分散分析とテューキー事後検定を行った。生存率はカプランマイヤー法で分析し、グループ間の差はゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定で推定した。ミエリン定量化、ＮｅｕＮ、ＡＳＰＡ、ＮＧ２、Ｏｌｉｇ２、切断型カスパーゼ３の数と蛍光強度の比較は、通常の二元配置分散分析で分析し、多重比較の事後テューキー検定を行った。ニューロンの生存、軸索と樹状突起の長さ、および試験管内で調べたＯＬマーカーの評価を、一元配置分散分析を用いて、テューキー事後分析テストで比較した。ニューロンにおけるＥＢ３ダイナミクスは、反復測定を伴う一元配置分散分析または二元配置分散分析を用いて分析した。すべての統計解析は、Ｐｒｉｓｍ ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行い、ｐ<０．０５を統計的に有意とした。
すべてのグラフデータは、平均±標準誤差平均（ＳＥＭ）で示した。本文中の「ｎ」は、特に明記されていない限り、実験ごとに使用されたマウスの数を表す。歩行異常、立ち直り反射、ローターロッド、および体重評価については、反復測定法を用いた二元配置分散分析に続いて、事後テューキー検定を用いて分析した。握力と歩行については、一元配置分散分析とテューキー事後検定を行った。生存率はカプランマイヤー法で分析し、グループ間の差はゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定で推定した。ミエリン定量化、ＮｅｕＮ、ＡＳＰＡ、ＮＧ２、Ｏｌｉｇ２、切断型カスパーゼ３の数と蛍光強度の比較は、通常の二元配置分散分析で分析し、多重比較の事後テューキー検定を行った。ニューロンの生存、軸索と樹状突起の長さ、および試験管内で調べたＯＬマーカーの評価を、一元配置分散分析を用いて、テューキー事後分析テストで比較した。ニューロンにおけるＥＢ３ダイナミクスは、反復測定を伴う一元配置分散分析または二元配置分散分析を用いて分析した。すべての統計解析は、Ｐｒｉｓｍ ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行い、ｐ<０．０５を統計的に有意とした。
【0115】
マウスのジェノタイピング
尾部からのＤＮＡ抽出は、既報の通りＨｏｔＳＨＯＴ法を用いて行った (Truett et al., 2000)。フォワードプライマー５’ＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＴＣ３’（配列ＩＤ番号：３）とリバースプライマー５’ＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＣＧ３’（配列ＩＤ番号：４）を用いて、ＰＣＲ産物の５４１ｂｐをｔａｑ－ｔａｋａｒａシステムで増幅した。増幅産物を配列決定して、マウスの遺伝子型を同定した。
尾部からのＤＮＡ抽出は、既報の通りＨｏｔＳＨＯＴ法を用いて行った (Truett et al., 2000)。フォワードプライマー５’ＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＧＡＴＣ３’（配列ＩＤ番号：３）とリバースプライマー５’ＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＣＴＣＧ３’（配列ＩＤ番号：４）を用いて、ＰＣＲ産物の５４１ｂｐをｔａｑ－ｔａｋａｒａシステムで増幅した。増幅産物を配列決定して、マウスの遺伝子型を同定した。
【0116】
行動テスト
歩行角度：歩行異常は、歩行／後肢の足の角度を測定することで決定された。歩行角度はいくつかの修正を加えて実施した(Feather-Schussler and Ferguson, 2016)。歩行角度は、Ｐ７、Ｐ１４、Ｐ２１、Ｐ２８、およびＰ３５で毎週測定された。仔マウスが両足を地面につけて直線的に完全な歩行を行っている場合にのみ、データを使用して３つの測定を実行した。
歩行角度：歩行異常は、歩行／後肢の足の角度を測定することで決定された。歩行角度はいくつかの修正を加えて実施した(Feather-Schussler and Ferguson, 2016)。歩行角度は、Ｐ７、Ｐ１４、Ｐ２１、Ｐ２８、およびＰ３５で毎週測定された。仔マウスが両足を地面につけて直線的に完全な歩行を行っている場合にのみ、データを使用して３つの測定を実行した。
【0117】
歩行：歩行障害は、いくつかの修正を加えた前記の方法で検出した(Feather-Schussler and Ferguson, 2016)。歩行行動は、Ｐ７、１０、１４で評価した。はい歩きと歩行のこれらの戦略に基づいて、トランスジェニックマウスがＷＴ同腹子よりも遅くはい歩き／歩行スキルを獲得するかどうかを調べた。マウスは１回の試行で、はい歩き、歩行の対称性、直進時の手足の動きを採点した（図１および表３）。
【表3】
【0118】
図１Ｅに示すように、はい歩き中は後肢全体が（＃）で示すように地面に触れ、尾は低いか地面に触れている。はい歩きから歩行に移行すると、頭が上がり始める。歩行は、［＃＃］で示されるように、後肢のつま先が地面につき、かかとが上がった状態で初めて見られる(Feather-Schussler and Ferguson, 2016)。対照的な四肢の動きとは、一歩ごとに後肢と前肢が重なり、一歩ごとに次の一歩へとスムーズに移行することをいう。非対称な四肢の動きを示すマウスは、前足の置き方が一定せず、一歩から次の一歩への移行がスムーズではない。
【0119】
ぶら下がり握力：前肢と後足の把持力は、ぶら下がり握力を測定することで決定された。ぶら下がり握力は、Feather-Schussler and Ferguson, 2016に記載した方法で行った。試行は３回繰り返され、平均角度を算出した。１３"×９．５"の金属スクリーン金網を用いて、Ｐ１４のぶら下がり握力を行った。分度器を金網と平行に設置し，仔マウスが落下する角度を測定した。マウスをスクリーン上に置き、この新しい環境に約１０秒間適応させた。スクリーンをゆっくりと１８０度反転させ、仔マウスが落ちたときのスクリーンのおおよその角度を記録した。この試行を３回繰り返し、平均角度を算出した。
【0120】
立ち直り反射：立ち直り反射は、マウスの体幹の制御と運動協調をテストする。立ち直り反射は、上記Feather-Schussler and Ferguson, 2016に記載されている通りに行った。立ち直り反射試験は、Ｐ７、Ｐ１４、Ｐ２１、Ｐ２８、Ｐ３５から１週間ごとに行い、その後、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスが運動障害を示したときに毎日実施された。３回の試行が行われ、必要に応じて、各試行に合計１分間が与えられた。立ち直り反射試験は、Ｐ７、１４、２１、２８、３５から１週間ごとに行い、その後、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスが運動障害を示したときに毎日実施された。マウスをベンチパッド上に仰向けに置き、５秒間その位置を保持した。マウスを放し、平らな位置に戻るまでの時間を記録した。３回の試行を行い、必要に応じて各試行に合計１分間が与えられた。
【0121】
ローターロッド：運動協調性、強度、バランスは、ローターロッド（ＵＧＯ ＢＡＳＩＬＥ Ｓ．Ｒ．Ｌ，Ｇｅｍｏｎｉｏ，イタリア）を使用して評価された。トレーニング期間（Ｐ２１）後の３回のテストトライアルにおいて、ローターロッドから落下するまでの待ち時間を各トライアルで記録し、その平均を分析に用いた。進行性の運動喪失を評価するために，Ｐ２８およびＰ３５にローターロッド試験を行い、マウスの年齢間の落下の潜時の平均を統計分析に用いた。装置に適応させるために、１日目は５ｒｐｍの一定速度で回転する円筒形の棒の上にマウスを１００秒間置いた。翌日は、５～３０ｒｐｍの加速速度で３００秒間、約２０分の間隔をおいて３回の試験を行った。３日目に、５～３０ｒｐｍの加速速度で３００秒間、３回の試験を行った。
【0122】
免疫組織化学、画像解析、定量化
ミエリンの定量化とニューロフィラメント染色：
浮遊切片をメタノール中の１０％過酸化水素で２０分間処理し、ブロッキングバッファー（４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１×ＰＢＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－ｘ（Ｔｘ）－１００）で１時間ブロッキングした後、同じブロッキングバッファーで１：５００のニワトリ抗ＮＦ（１：５００、Ａｖｅｓ、ｃａｔ：ＮＦＨ）を４℃で一晩培養した。一次抗体の培養後、切片をビオチン化抗ニワトリ二次抗体（１：１０００、Ａｖｅｓ、ｃａｔ：Ｂ－１００５）と１時間培養し、Ｅｌｉｔｅ Ａｖｉｄｉｎ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ）で現像し、ＤＡＢ基質で視覚化した。スライドを水道水ですすぎ、アセトンで処理し、水道水ですすぎ、エリオクロムシアニン（Ｅｒｉ－Ｃ）溶液に３０分浸した。切片を５％鉄ミョウバンで微粒化し、水道水ですすいだ後、フェリシアン化ホウ砂で微粒化した。切片は脱水、クリア、パーマウント（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）でマウントし、カバースリップを施した。脳梁および小脳におけるミエリンの定量化のために（１匹のマウスにつき３～４個の切片、ＰＮＤ１４、Ｐ２１および末期にはｎ＝少なくとも３）、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ－７００デジタル顕微鏡の明視野モードで画像を撮影した。１０倍の倍率で捕捉された画像は、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘソフトウェアで並べて表示された。染色された領域は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで測定され、白質全体と関連付けられた。
ミエリンの定量化とニューロフィラメント染色：
浮遊切片をメタノール中の１０％過酸化水素で２０分間処理し、ブロッキングバッファー（４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１×ＰＢＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－ｘ（Ｔｘ）－１００）で１時間ブロッキングした後、同じブロッキングバッファーで１：５００のニワトリ抗ＮＦ（１：５００、Ａｖｅｓ、ｃａｔ：ＮＦＨ）を４℃で一晩培養した。一次抗体の培養後、切片をビオチン化抗ニワトリ二次抗体（１：１０００、Ａｖｅｓ、ｃａｔ：Ｂ－１００５）と１時間培養し、Ｅｌｉｔｅ Ａｖｉｄｉｎ Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ）で現像し、ＤＡＢ基質で視覚化した。スライドを水道水ですすぎ、アセトンで処理し、水道水ですすぎ、エリオクロムシアニン（Ｅｒｉ－Ｃ）溶液に３０分浸した。切片を５％鉄ミョウバンで微粒化し、水道水ですすいだ後、フェリシアン化ホウ砂で微粒化した。切片は脱水、クリア、パーマウント（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）でマウントし、カバースリップを施した。脳梁および小脳におけるミエリンの定量化のために（１匹のマウスにつき３～４個の切片、ＰＮＤ１４、Ｐ２１および末期にはｎ＝少なくとも３）、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ－７００デジタル顕微鏡の明視野モードで画像を撮影した。１０倍の倍率で捕捉された画像は、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘソフトウェアで並べて表示された。染色された領域は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで測定され、白質全体と関連付けられた。
【0123】
ＮｅｕＮおよびカスパーゼの数：線条体および小脳の切片（マウス１匹につき３～４個の切片、Ｐ１４、Ｐ２１および末期ではｎ＝３～４）について、Ｌｅｉｃａ ＤＭ６０００Ｂ蛍光顕微鏡を用いて、１～２μｍ間隔でＺ－ｏｐｔｉｃａｌ切片を用いて、それぞれ２０倍および６３倍で画像を捕捉した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いてＤＡＰＩを含むＮｅｕＮ＋細胞をカウントした。解析はブラインドで行い、カウントはプロファイル／ｍｍ２として報告した。
【0124】
ＡＳＰＡおよびＯｌｉｇ２／ＮＧ２の数：プロトコルは、いくつかの変更を加えて、以前に出版されたものに従って行った（Lee et al., 1985）。ＡＳＰＡとＮＧ２＋／Ｏｌｉｇ２＋を標識し、ＤＡＰＩで対比染色した切片を用いて、脳梁のＡＳＰＡおよびＮＧ２＋／Ｏｌｉｇ２＋細胞の総数を定量化した。すべての画像は、オリンパスのレーザー走査型共焦点顕微鏡の４０倍の油浸レンズで、０．５～１μｍの光学間隔でｚスタックを用いて撮影した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用し、標準化されたサンプルボックス（０．０１ｍｍ２）を関心領域に配置した。陽性に標識された細胞は、ＡＳＰＡ＋またはＮＧ２＋／ＯＬＧ２＋またはＯＬＧ２＋細胞として同定され、ＤＡＰＩ核と重ね合わせた。最終的なカウントはプロファイル／ｍｍ２として報告される。
【0125】
蛍光密度と面積の定量化：蛍光陽性領域と密度を定量化するために、Ｌｅｉｃａ ＤＭ６０００Ｂ蛍光顕微鏡を用いて１０倍の倍率で画像を捕捉した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用し、関心のある領域を選択し、統合された領域密度とグレー値を計算した。蛍光の算出には以下の式を用いた。
補正された総蛍光量＝総密度－（選択されたセルの面積×バックグラウンド読み取り値の平均蛍光量）。
補正された総蛍光量＝総密度－（選択されたセルの面積×バックグラウンド読み取り値の平均蛍光量）。
【0126】
オリゴデンドロサイトの分離：
簡単に説明すると、皮質は各マウスの脳から顕微解剖して分離し、培養物を汚染しないように髄膜を除去した。皮質をより小さなフラグメントに切断し、Ｎｅｕｒａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｐ），１３０－０９２－６２８）を用いて解離させ、プロトコルに従って、各サンプルを酵素ミックス１（酵素ＰおよびバッファーＸ）とともに３７℃で１５分間培養した。次に、酵素ミックス２を加え、火で磨いたパスツールピペットを用いて組織を機械的に分離し、３７℃で１０分間培養した。このプロセスをさらに２回繰り返して単一細胞の溶液を得て、これを７０μｍストレーナーに塗布し、３００ｘｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、０．５％のウシ血清アルブミンを含む９０μｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）に再懸濁した。１０μｌの抗－Ｏ４マイクロビーズを細胞ペレットに加えて混合し、冷蔵庫で１５分間培養した。その後、細胞を１～２ｍｌのバッファーで洗浄し、３００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を５００μｌのバッファーに再懸濁した。ＭＳ ＭＡＣＳカラムを磁場に置き、５００μｌのバッファーでリンスした後、細胞懸濁液を磁気カラムにかけた。標識されていない細胞を含む通過画分を回収し、カラムを５００μｌのバッファーで３回すすいだ。その後、カラムをセパレーターから取り出し、適切な収集チューブの上に置き、そこに適量の培地を適用し、プランジャーをカラムに押し込むことで直ちにフラッシュした。この画分は、Ｏ４＋細胞を、２％Ｂ２７、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、１％グルタミンおよび成長因子であるヒトｂＦＧＦ（１００ｇ／ｍｌ；Ｒ&Ｄ ２３３－ＦＢ／ＣＦ）、ヒトＰＤＧＦ－ＡＡ（１００ｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ １００－１３Ａ）およびヒトＮＴ３（１００μｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ４５０－０３）を含むニューロバサル培地に懸濁したものである。
簡単に説明すると、皮質は各マウスの脳から顕微解剖して分離し、培養物を汚染しないように髄膜を除去した。皮質をより小さなフラグメントに切断し、Ｎｅｕｒａｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｐ），１３０－０９２－６２８）を用いて解離させ、プロトコルに従って、各サンプルを酵素ミックス１（酵素ＰおよびバッファーＸ）とともに３７℃で１５分間培養した。次に、酵素ミックス２を加え、火で磨いたパスツールピペットを用いて組織を機械的に分離し、３７℃で１０分間培養した。このプロセスをさらに２回繰り返して単一細胞の溶液を得て、これを７０μｍストレーナーに塗布し、３００ｘｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、０．５％のウシ血清アルブミンを含む９０μｌのＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）に再懸濁した。１０μｌの抗－Ｏ４マイクロビーズを細胞ペレットに加えて混合し、冷蔵庫で１５分間培養した。その後、細胞を１～２ｍｌのバッファーで洗浄し、３００ｘｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を５００μｌのバッファーに再懸濁した。ＭＳ ＭＡＣＳカラムを磁場に置き、５００μｌのバッファーでリンスした後、細胞懸濁液を磁気カラムにかけた。標識されていない細胞を含む通過画分を回収し、カラムを５００μｌのバッファーで３回すすいだ。その後、カラムをセパレーターから取り出し、適切な収集チューブの上に置き、そこに適量の培地を適用し、プランジャーをカラムに押し込むことで直ちにフラッシュした。この画分は、Ｏ４＋細胞を、２％Ｂ２７、１％ペニシリン・ストレプトマイシン、１％グルタミンおよび成長因子であるヒトｂＦＧＦ（１００ｇ／ｍｌ；Ｒ&Ｄ ２３３－ＦＢ／ＣＦ）、ヒトＰＤＧＦ－ＡＡ（１００ｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ １００－１３Ａ）およびヒトＮＴ３（１００μｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ４５０－０３）を含むニューロバサル培地に懸濁したものである。
【0127】
アンチセンスオリゴヌクレオチド合成
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより１１種類のＡＳＯが合成された。これらのＡＳＯの試験管内スクリーニングを行い、最適なＡＳＯデザインを特定した。マウスＯｌｉ－ｎｅｕ細胞を、ＮＥＰＡ２１電気穿孔システム（ＮＥＰＡ ＧＥＮＥ、米国）を用いて、１００μＬの培地にＡＳＯ濃度１μＭ、５μＭ、１０μＭを１５０Ｖで、１００，０００細胞／ウェルで電気穿孔した。電気穿孔後、細胞をポリ－Ｌ－オルニチンを塗布したプレートに移し、インキュベーターに入れた。処置から４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ：１２１８３０１８Ａ）を用いて、製造者の指示に従ってＲＮＡ抽出を行った。ＤＮＡアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した後、２００ｎｇのＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ：１８０９１２００）を用いてｃＤＮＡに使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔａ Ｆｌｅｘ ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いたリアルタイムＰＣＲ分析（Ｔａｑｍａｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）により、Ｔｕｂｂ４ａ、および、参照としてスプライシング因子、アルギニン／セリン－リッチ９（ｓｆｒｓ９）をコードする内因性ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを定量した。結果は、ΔΔＣＴ法を用いて分析した。
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより１１種類のＡＳＯが合成された。これらのＡＳＯの試験管内スクリーニングを行い、最適なＡＳＯデザインを特定した。マウスＯｌｉ－ｎｅｕ細胞を、ＮＥＰＡ２１電気穿孔システム（ＮＥＰＡ ＧＥＮＥ、米国）を用いて、１００μＬの培地にＡＳＯ濃度１μＭ、５μＭ、１０μＭを１５０Ｖで、１００，０００細胞／ウェルで電気穿孔した。電気穿孔後、細胞をポリ－Ｌ－オルニチンを塗布したプレートに移し、インキュベーターに入れた。処置から４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ：１２１８３０１８Ａ）を用いて、製造者の指示に従ってＲＮＡ抽出を行った。ＤＮＡアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した後、２００ｎｇのＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ：１８０９１２００）を用いてｃＤＮＡに使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔａ Ｆｌｅｘ ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いたリアルタイムＰＣＲ分析（Ｔａｑｍａｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）により、Ｔｕｂｂ４ａ、および、参照としてスプライシング因子、アルギニン／セリン－リッチ９（ｓｆｒｓ９）をコードする内因性ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを定量した。結果は、ΔΔＣＴ法を用いて分析した。
【0128】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を説明するために提供される。それらは、本発明をいかなる形でも限定することを意図していない。
【0129】
実施例
実施例Ｉ
Ｈ－ＡＢＣ疾患のマウスモデル
本実施例では、ジストニア、運動機能の喪失、歩行異常などのヒト疾患の特徴を再現したＨ－ＡＢＣのモデルとして、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ変異を有するノックインマウスを作製したことを述べている。このモデルマウスの病理組織学的特徴は、患者の組織で観察されたように、線条体と小脳のニューロンの喪失、脳と脊髄の髄鞘形成不全の両方を含んでいる（Curiel et al., 2017b）。また、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスを用いて、変異チューブリンの微小管重合に対する機能的影響や、Ｔｕｂｂ４ａ変異のニューロンおよびオリゴデンドロサイトにおける細胞自律的役割についても検討した。この研究は、最も頻繁に発生する突然変異を使用して、この壊滅的な病気の根底にあるメカニズムを理解し、治療法を開発する上で重要な、Ｈ－ＡＢＣの有望な最初のモデルを提供するものである。
実施例Ｉ
Ｈ－ＡＢＣ疾患のマウスモデル
本実施例では、ジストニア、運動機能の喪失、歩行異常などのヒト疾患の特徴を再現したＨ－ＡＢＣのモデルとして、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ変異を有するノックインマウスを作製したことを述べている。このモデルマウスの病理組織学的特徴は、患者の組織で観察されたように、線条体と小脳のニューロンの喪失、脳と脊髄の髄鞘形成不全の両方を含んでいる（Curiel et al., 2017b）。また、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスを用いて、変異チューブリンの微小管重合に対する機能的影響や、Ｔｕｂｂ４ａ変異のニューロンおよびオリゴデンドロサイトにおける細胞自律的役割についても検討した。この研究は、最も頻繁に発生する突然変異を使用して、この壊滅的な病気の根底にあるメカニズムを理解し、治療法を開発する上で重要な、Ｈ－ＡＢＣの有望な最初のモデルを提供するものである。
【0130】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮＣＲＩＳＰＲノックインマウスの作製
ｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ（ｐ．７４５Ｇ>Ａ）変異を持つ古典的なＨ－ＡＢＣの分子メカニズムと疾患経過を理解するために、ＣＲＩＳＰＲを用いてノックインマウスモデルＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎを作製した。さらに、これらのＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスを繁殖させて、ホモ接合のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスのコロニーを得た（図１Ａ）。ホモ接合性マウスをＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスと並行して研究した。これは、Ｈ－ＡＢＣの罹患者にヘテロ接合性の変異があるにもかかわらず、Ｔｕｂｂ４ａ変異のげっ歯類モデルで表現型の早期発現にホモ接合性の発現が必要とされていることと同様である（１３）。
ｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ（ｐ．７４５Ｇ>Ａ）変異を持つ古典的なＨ－ＡＢＣの分子メカニズムと疾患経過を理解するために、ＣＲＩＳＰＲを用いてノックインマウスモデルＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎを作製した。さらに、これらのＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスを繁殖させて、ホモ接合のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスのコロニーを得た（図１Ａ）。ホモ接合性マウスをＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスと並行して研究した。これは、Ｈ－ＡＢＣの罹患者にヘテロ接合性の変異があるにもかかわらず、Ｔｕｂｂ４ａ変異のげっ歯類モデルで表現型の早期発現にホモ接合性の発現が必要とされていることと同様である（１３）。
【0131】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは早期に病気を発症し、生存率が低下する
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮとＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの表現型を決定するために、マウスは生まれた後、毎日のように検査された。出生から生後８日目までは、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎの各マウスは、その発育に関して同様に見えた。しかし、Ｐ９までにＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは震えたような行動をとるようになる。この表現型は年齢とともに徐々に悪化し、時間の経過とともに重度の運動失調やジストニーになっていく。Ｐ３５～Ｐ４０になると、マウスは自力で食事をとることができなくなり、右足の動きも鈍くなり、この時点を「末期」（コンパッショネート末期）と表現する（ｐ<０．００１、図１Ｂおよび１Ｃ）。さらに、体重を測定したところ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスはＰ３５から徐々に体重が減少し始め、Ｐ３７（１５．０２±０．６７）ではＴｕｂｂ４ａマウスＤ２４９Ｎ（１８．５７±０．３８）およびＷＴマウス（１７．４４±０．４３）に比べて有意に減少した（ｐ<０．００１、図１Ｌ）。
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮとＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの表現型を決定するために、マウスは生まれた後、毎日のように検査された。出生から生後８日目までは、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎの各マウスは、その発育に関して同様に見えた。しかし、Ｐ９までにＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは震えたような行動をとるようになる。この表現型は年齢とともに徐々に悪化し、時間の経過とともに重度の運動失調やジストニーになっていく。Ｐ３５～Ｐ４０になると、マウスは自力で食事をとることができなくなり、右足の動きも鈍くなり、この時点を「末期」（コンパッショネート末期）と表現する（ｐ<０．００１、図１Ｂおよび１Ｃ）。さらに、体重を測定したところ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスはＰ３５から徐々に体重が減少し始め、Ｐ３７（１５．０２±０．６７）ではＴｕｂｂ４ａマウスＤ２４９Ｎ（１８．５７±０．３８）およびＷＴマウス（１７．４４±０．４３）に比べて有意に減少した（ｐ<０．００１、図１Ｌ）。
【0132】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは正常に見え、明らかな行動上の表現型は見られない。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスの生存率はＷＴマウスと同程度であり、主に高齢のために死亡する（カプランマイヤー生存曲線、図２Ａ）。
【0133】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの歩行異常を示す
Ｈ－ＡＢＣに罹患した個体は、歩行の遅れ、運動失調、歩行異常、進行性の運動機能障害を示すことから、我々はＴｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスで包括的な行動分析を行い、マウスがＨ－ＡＢＣの行動表現型を同様に再現するかどうかを確認することにした（図１Ｄ）（１，１０，２０）。
Ｈ－ＡＢＣに罹患した個体は、歩行の遅れ、運動失調、歩行異常、進行性の運動機能障害を示すことから、我々はＴｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスで包括的な行動分析を行い、マウスがＨ－ＡＢＣの行動表現型を同様に再現するかどうかを確認することにした（図１Ｄ）（１，１０，２０）。
【0134】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスが歩行の異常を示すかどうかを調べるために、歩行角または後肢足部の角度を測定した。Ｐ１４から開始したところ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスはＷＴ同腹子と比較して有意に広い歩行角度を示す一方で、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは歩行角度の欠損を伴わずに歩行した（ｐ<０．００１、図１Ｇおよび１Ｈ；Ｐ１４－７１．８２±４．２６ｖｓ４３．１６±２．４６、Ｐ２１－８４．００±７．５６ｖｓ６１．９６±２．９３、Ｐ３５－８１．０３±５．３７ｖｓ５２．６６±１．８７）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの広い歩行角度は、これらの年齢で見られる歩行の不安定さと一致している。仔マウスと大人のマウスは、歩行を安定させ、バランスと筋肉の動きの協調を支えるために、後肢の角度を大きくする必要があるためである（１４）。
【0135】
ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、マウスがはい歩きから歩行に移行する早い時期に歩行を評価した（歩行スコアについては表３参照）。Ｐ７では、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、ＷＴ対照マウスと同様に非対称な這い歩きを示した（図１Ｅ）。Ｐ１０までに、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは若い仔に見られるようなはい歩き歩行で非対称な肢の動きを示し、さらにＷＴ同腹子対照マウスに比べて震えを示した（Ｐ１０－１．２０±０．１３ｖｓ２．２０±０．２５）（ｐ<０．０５、図１Ｅおよび１Ｆ）。一方、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎははい歩き／歩行足取りでより対称的な肢の動きを示した。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスを含むすべてのマウスがＰ１４までに歩行能力を獲得したが、ホモ接合のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは依然として震えを示している。
【0136】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは進行性の運動機能障害を示す
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスが運動発達にさらなる障害を示すかどうかを評価するために、Ｐ１４においてぶら下がり握力を行うことで、その把持能力を測定した。マウスが凹凸のある場所を登ったり走ったりするためには、４本の足すべてでつかむことが不可欠であり（１４）、握力のパフォーマンス低下は、マウスの運動能力が低下していることを意味する。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは、ＷＴ同腹子と比較して同程度の握力を示したが、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの落下角度はＷＴよりも有意に小さかった（８６．４０±２．５１ｖｓ１０３．９±１．８４；ｐ<０．００１，図１Ｉおよび１Ｊ）。
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスが運動発達にさらなる障害を示すかどうかを評価するために、Ｐ１４においてぶら下がり握力を行うことで、その把持能力を測定した。マウスが凹凸のある場所を登ったり走ったりするためには、４本の足すべてでつかむことが不可欠であり（１４）、握力のパフォーマンス低下は、マウスの運動能力が低下していることを意味する。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは、ＷＴ同腹子と比較して同程度の握力を示したが、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの落下角度はＷＴよりも有意に小さかった（８６．４０±２．５１ｖｓ１０３．９±１．８４；ｐ<０．００１，図１Ｉおよび１Ｊ）。
【0137】
疾患が進行性であるかどうか、また、幼若マウスのＴｕｂｂ４ａの変異が協調性やバランスに影響を与えるかどうかを評価するために、Ｐ２１、Ｐ２８、Ｐ３５において、これらのマウスのローターロッドでのパフォーマンスを評価した。その結果、ヘテロ接合体のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスのパフォーマンス（転倒までの時間（秒）で測定）は、ＷＴ同腹子と比較して有意な差は見られなかったが、ホモ接合体のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、Ｐ２１（１０７．１±７．５８ｖｓ２１３．８±１５．１６秒）、Ｐ２８（１０１．０±１０．３０ｖｓ２３９．０±１０．７６秒）、Ｐ３５（２０．６９±６．７１ｖｓ２５７．９±１１．４０秒）において、加速式のローターロッドでの落下までの時間が短くなり、時間の経過とともに徐々に悪化した（ｐ<０．００１、図１Ｋ）。
【0138】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスが後の段階で行動障害を起こすかどうかを調べるために、生後９か月と１年の時点でローターロッドテストを行ったが、ＷＴマウスに比べて変化は見られなかった（図２Ｂ）。
【0139】
最後に、Ｐ７からＰ３５までは毎週、続いてＰ３５からＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの末期までは毎日、立ち直り反射を評価した。表面立ち直り能力テストでは、マウスの体幹制御と協調能力をテストする（１４）。また、自己ケアや摂食のために必要な能力であるため、本研究では倫理的なエンドポイントとして使用される（２１，２２）。Ｐ１４までに、すべてのマウスがすぐに身を起こすことができたが、３８日目以降、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスはＷＴ同腹子に比べて有意に身を起こす能力が低下していた（ｐ<０．００１、図１Ｌ）。
【0140】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは髄鞘形成の重度の発達遅延を示し、Ｔｕｂｂ４ａマウスＤ２４９ＮマウスもＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９マウスも最終的には髄鞘形成の消失を示す
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、Ｈ－ＡＢＣに罹患した人に典型的に見られるミエリンの異常を再現している（３，１０）を再現し、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは発達性または変性性のミエリン消失を示す。マウスの髄鞘形成は、出生時に脊髄で始まり、Ｐ２１までにほぼ成体のパターンを示す（２３）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、ＷＴ同腹子と比較して、Ｐ１４およびＰ２１の脳梁および小脳において、免疫組織化学（Ｅｒｉ－Ｃ）で測定した典型的なミエリンの発達が著しく欠如している。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、髄鞘形成の初期遅延（Ｐ１４－ｐ<０．００１、Ｐ２１－ｐ<０．００１、図６Ｂ）が見られ、終盤には以前に達成された髄鞘形成が失われる（脳梁では０．０５３±０．００４ｖｓ０．９４８±０．００９、小脳では０．０３７±０．００１ｖｓ０．８５４±０．０３３）（ｐ<０．００１，図３Ｃ－３Ｆ）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスにおけるミエリン表現型のより遅い発症を評価するために、１歳時にＥｒｉ－Ｃ染色を行ったところ、ミエリン染色の減少が見られた（ｐ<０．００１、図３Ｇおよび３Ｈ）。
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、Ｈ－ＡＢＣに罹患した人に典型的に見られるミエリンの異常を再現している（３，１０）を再現し、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは発達性または変性性のミエリン消失を示す。マウスの髄鞘形成は、出生時に脊髄で始まり、Ｐ２１までにほぼ成体のパターンを示す（２３）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、ＷＴ同腹子と比較して、Ｐ１４およびＰ２１の脳梁および小脳において、免疫組織化学（Ｅｒｉ－Ｃ）で測定した典型的なミエリンの発達が著しく欠如している。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、髄鞘形成の初期遅延（Ｐ１４－ｐ<０．００１、Ｐ２１－ｐ<０．００１、図６Ｂ）が見られ、終盤には以前に達成された髄鞘形成が失われる（脳梁では０．０５３±０．００４ｖｓ０．９４８±０．００９、小脳では０．０３７±０．００１ｖｓ０．８５４±０．０３３）（ｐ<０．００１，図３Ｃ－３Ｆ）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスにおけるミエリン表現型のより遅い発症を評価するために、１歳時にＥｒｉ－Ｃ染色を行ったところ、ミエリン染色の減少が見られた（ｐ<０．００１、図３Ｇおよび３Ｈ）。
【0141】
さらに、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、免疫染色により主要なミエリンタンパク質が存在しないことが確認された。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、ＭＢＰおよびＰＬＰの発現は、脳梁および小脳でＰ１４では変化していないが（図６Ｃ～６Ｇ）、Ｐ２１（ｐ<０．００１、図８Ｃ～８Ｇ）および末期までに、脳梁（ｐ<０．００１、図３Ｋ～３Ｌおよび図３Ｓ～３Ｔ；ＰＬＰ－２７．９９±３．０２ｖｓ１１３．４６±１６．１８、およびＭＢＰ－２５．７３±３．４２ｖｓ９２．４０±５．７６）および小脳（ｐ<０．００１、図３Ｏ～３Ｐおよび図３Ｗ～３Ｘ；ＰＬＰ－１１．１１±１．１７ｖｓ５８．９０±８．１９、およびＭＢＰ－１２．６５±２．９８ｖｓ６９．７９±１．２０）で有意に減少した。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ２１および末期において、脳梁および小脳でＷＴと同等のＭＢＰおよびＰＬＰの発現を示した。しかし、１年後には、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは、ＷＴと比較してＰＬＰ（ｐ<０．０５、図２Ｃ～２Ｄ）とＭＢＰ（ｐ<０．０５、図３Ｉ～３Ｊ）のレベルの低下を示す。
【0142】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスにおける、ＰＬＰとＭＢＰのレベルの同様の低下は、Ｐ２１（ｐ<０．０５）および末期（ｐ<０．００１）で前脳（ＰＬＰ－０．２８６±０．０８ｖｓ１．１０１±０．０１、図３Ｍ～３Ｎ、ＭＢＰ－０．６０５±０．０６ｖｓ２．６１５±０．０９、図３Ｕ～３Ｖ）および小脳（ＰＬＰ－０．１２３±０．０３ｖｓ０．８６０±０．１２、図３Ｑ～３ＲおよびＭＢＰ－１．３０７±０．１７８ｖｓ２．３０６±０．１４、図３Ｙ～３Ｚ）におけるウェスタンブロットを使用して検出される。
【0143】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスはオリゴデンドロサイトの著しい減少を示す
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎにおけるミエリン形成の発達および変性の両方の異常を考慮して、オリゴデンドロサイト（ＯＬ）およびオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の数を評価した（２３）。Ｐ１４、Ｐ２１、末期の脳梁において、ＯＬのマーカーであるＡＳＰＡを用いた免疫染色により、ＯＬの数を調べた。
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎにおけるミエリン形成の発達および変性の両方の異常を考慮して、オリゴデンドロサイト（ＯＬ）およびオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）の数を評価した（２３）。Ｐ１４、Ｐ２１、末期の脳梁において、ＯＬのマーカーであるＡＳＰＡを用いた免疫染色により、ＯＬの数を調べた。
【0144】
Ｐ１４、Ｐ２１、および末期（図７Ｃ～Ｄ）において、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、脳梁においてＡＳＰＡ陽性ＯＬの数がＷＴ同腹子と比べて大幅に減少していた（ｐ<０．００１、１６６±３２．３４ｖｓ６８１±３８．４５）。ＯＰＣの数に変化があるかどうかを評価するために、脳梁で二重陽性のＮＧ２＋Ｏｌｉｇ２＋（ｐａｎ ＯＬ系統マーカー）細胞を数えた。ＮＧ２＋Ｏｌｉｇ２＋細胞の数は、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ１４、Ｐ２１（図１２Ａ～Ｂ）および末期（図７Ｅ～Ｆ）において変化しなかった。さらに、Ｏｌｉｇ２＋細胞の数は、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮマウスのＰ１４、Ｐ２１および末期（図１２Ｃ～Ｅ）において同等であり、すべてのＯＬ系統細胞の数に変化がないことが示唆された。
【0145】
ＯＬ系統細胞が細胞アポトーシスを起こしているかどうかを調べるために、細胞アポトーシスマーカーであるカスパーゼとＯＬ系統マーカーであるＯｌｉｇ２の二重免疫染色を行った。その結果、Ｔｕｂｂ４ＡＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、Ｐ１４、Ｐ２１（図１５Ａ～Ｄ）、末期（ｐ<０．００１、図７Ｇ～Ｈ）の脳梁において、カスパーゼとＯＬ（ＡＳＰＡ）の二重陽性細胞の数が有意かつ漸増していることがわかった。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、ＯＰＣやＯｌｉｇ２細胞の数が保たれていることから、Ｔｕｂｂ４ａの変異が成熟ＯＬに毒性を及ぼし、成熟ＯＬが失われている可能性が高いと推測される。
【0146】
超微細構造解析により、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの髄鞘形成障害が裏付けられる
視神経切片を電子顕微鏡で観察したところ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、ＷＴコントロールマウスと比較して、Ｐ２１から無髄および低髄の軸索が認められ（データは示されていない）、末期には悪化していた（図５Ａ～３Ｃおよび５Ｈ～５Ｊ）。また、末期のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ組織では、マクロファージに取り込まれて空洞化し、変性した軸索（青いアスタリスク）が観察される（図５Ｄ）。興味深いことに、軸索のミエリン厚を測定するｇ－ｒａｔｉｏは、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス（ｐ<０．００１；０．９１４±０．００４）だけでなく、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ視神経（ｐ<０．００１；０．８５９±０．００６）でもＷＴマウス（図５Ｅ、０．８０２±０．００５）に比べて有意に異なっていた。ｇ－比を軸索の直径の関数としてプロットすることによって測定されたミエリンの厚さの定量化（図５Ｆ）は、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでミエリン鞘の発達が停止していることを示している。さらに、コントロールマウス（０．９４５±０．０２４）と比較して、Ｔｕｂｂ４ａマウスのＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ視神経組織では軸索の口径が有意に減少しており（図５Ｇ、ｐ<０．０５；０．８７±０．０３４）、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは最終段階で太い軸索が失われていることが示された。脊髄のＴＥＭ断面図でも、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは腹側白質でミエリンが劇的に失われており（図４Ａ～４Ｆ）、マクロファージによる軸索の巻き込みが進行していた（図４Ｆ）。しかし、異なるグループ間の脊髄の前角では、大型運動ニューロンの消失は調べられなかった（データは示されていない）。
視神経切片を電子顕微鏡で観察したところ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、ＷＴコントロールマウスと比較して、Ｐ２１から無髄および低髄の軸索が認められ（データは示されていない）、末期には悪化していた（図５Ａ～３Ｃおよび５Ｈ～５Ｊ）。また、末期のＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ組織では、マクロファージに取り込まれて空洞化し、変性した軸索（青いアスタリスク）が観察される（図５Ｄ）。興味深いことに、軸索のミエリン厚を測定するｇ－ｒａｔｉｏは、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス（ｐ<０．００１；０．９１４±０．００４）だけでなく、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ視神経（ｐ<０．００１；０．８５９±０．００６）でもＷＴマウス（図５Ｅ、０．８０２±０．００５）に比べて有意に異なっていた。ｇ－比を軸索の直径の関数としてプロットすることによって測定されたミエリンの厚さの定量化（図５Ｆ）は、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでミエリン鞘の発達が停止していることを示している。さらに、コントロールマウス（０．９４５±０．０２４）と比較して、Ｔｕｂｂ４ａマウスのＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ視神経組織では軸索の口径が有意に減少しており（図５Ｇ、ｐ<０．０５；０．８７±０．０３４）、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは最終段階で太い軸索が失われていることが示された。脊髄のＴＥＭ断面図でも、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは腹側白質でミエリンが劇的に失われており（図４Ａ～４Ｆ）、マクロファージによる軸索の巻き込みが進行していた（図４Ｆ）。しかし、異なるグループ間の脊髄の前角では、大型運動ニューロンの消失は調べられなかった（データは示されていない）。
【0147】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは末期になると線条体や小脳でニューロンが失われる。
Ｈ－ＡＢＣに罹患した個体の病理標本では、基底核と小脳の顆粒細胞層でニューロンの消失が見られる（４，１０）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、Ｐ１４（図１４Ａ）、Ｐ２１、末期（図９Ｃ）において、ＮｅｕＮおよびニッスル染色による免疫染色により、線条体および小脳でのニューロンの消失が見られた。
Ｈ－ＡＢＣに罹患した個体の病理標本では、基底核と小脳の顆粒細胞層でニューロンの消失が見られる（４，１０）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、Ｐ１４（図１４Ａ）、Ｐ２１、末期（図９Ｃ）において、ＮｅｕＮおよびニッスル染色による免疫染色により、線条体および小脳でのニューロンの消失が見られた。
【0148】
Ｐ１４およびＰ２１の時点で（図１４Ｄ）、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎの線条体におけるＮｅｕＮ数はＷＴ対照と同等であるが、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは末期に著しい線条体ニューロンの喪失を示した（ｐ<０．０１、図９Ｊ；１８３±８．４４ｖｓ２４６±２８．５１）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの小脳切片をニッスル染色したところ、Ｐ２１から末期にかけて顆粒状ニューロン層の重度の進行性喪失と、小脳体積の顕著な減少を明らかにした（図９Ｃ）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、Ｐ１４ではＷＴマウスと同等の顆粒状ニューロン数を示していたが（図１４Ｂ）、Ｐ２１（２１２±６．７１ｖｓ３１２±４．３０）および末期（ｐ<０．００１、図９Ｄ～Ｅ；５７±４．７ｖｓ２６２±１４．８５）には劇的かつ進行性の顆粒状ニューロンの消失が観察された。また、ＮｅｕＮと共局在するカスパーゼ３陽性細胞の数は、Ｐ２１（１１±３．９９ｖｓ０．３±０．１６）および末期（１３．５±０．３８ｖｓ０．７５±０．３８）で有意に増加しており、細胞のアポトーシスを示唆している（ｐ<０．００１、図９Ｆ～Ｇ）。さらに、小脳で他のニューロン集団の消失があるかどうかを評価するため、カルビンジン免疫染色によりプルキンエニューロンを評価したが、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮとＷＴマウス（図１４Ｃ、１４Ｄ）は同様であった。
【0149】
オリゴデンドロサイトにおけるＴｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ変異の細胞自律的効果
我々は、ＷＴ対照、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス由来の試験管内培養を用いて、ＯＬにおけるＴｕｂｂ４ａ変異の細胞自律効果を研究した。Ｏ４＋（ミエリン形成前マーカー）ＯＰＣをこれらのマウスから分離し、ＯＬの運命に向けて分化させた。この細胞は、ｐａｎ ＯＬ系統マーカーであるＯｌｉｇ２と共局在する成熟ＯＬのマーカーとしてのＰＬＰについて調べられた。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウス（ｐ<０．０５、７２．１２％±８．９９）およびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス（ｐ<０．０１、５５．２３％±４．９７）では、ＷＴマウス由来の成熟ＯＬ（図１１Ｅ）と比較して、成熟ＰＬＰ＋ＯＬの数が有意に減少していることが確認された（図１１Ａ～Ｃ）。しかし、Ｏｌｉｇ２＋細胞の総数はすべてのグループで同程度であり（図１１Ｄ）、その結果、ＷＴマウス（ｐ<０．０５、９０．５％±１４．１８）に比べて、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウス（ｐ<０．０５、５５．３４％±６．８３）とＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス（ｐ<０．０５、５６．０４％±５．３９）のＯＬ系統に関与する全細胞（ＰＬＰ＋／Ｏｌｉｇ２細胞、図１１Ｆ）に占める成熟ＯＬの割合は、有意に減少した。これらの結果は、マウス組織で生体内において見られたのと同様の変化を全体的に反映しており、ＯＬ系統細胞の発達におけるＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ変異の細胞自律的寄与を裏付けている。
我々は、ＷＴ対照、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス由来の試験管内培養を用いて、ＯＬにおけるＴｕｂｂ４ａ変異の細胞自律効果を研究した。Ｏ４＋（ミエリン形成前マーカー）ＯＰＣをこれらのマウスから分離し、ＯＬの運命に向けて分化させた。この細胞は、ｐａｎ ＯＬ系統マーカーであるＯｌｉｇ２と共局在する成熟ＯＬのマーカーとしてのＰＬＰについて調べられた。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウス（ｐ<０．０５、７２．１２％±８．９９）およびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス（ｐ<０．０１、５５．２３％±４．９７）では、ＷＴマウス由来の成熟ＯＬ（図１１Ｅ）と比較して、成熟ＰＬＰ＋ＯＬの数が有意に減少していることが確認された（図１１Ａ～Ｃ）。しかし、Ｏｌｉｇ２＋細胞の総数はすべてのグループで同程度であり（図１１Ｄ）、その結果、ＷＴマウス（ｐ<０．０５、９０．５％±１４．１８）に比べて、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウス（ｐ<０．０５、５５．３４％±６．８３）とＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス（ｐ<０．０５、５６．０４％±５．３９）のＯＬ系統に関与する全細胞（ＰＬＰ＋／Ｏｌｉｇ２細胞、図１１Ｆ）に占める成熟ＯＬの割合は、有意に減少した。これらの結果は、マウス組織で生体内において見られたのと同様の変化を全体的に反映しており、ＯＬ系統細胞の発達におけるＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ変異の細胞自律的寄与を裏付けている。
【0150】
ニューロンにおけるＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ変異の細胞自律的効果
また、ＷＴ対照、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、およびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス由来の試験管内培養を用いて、皮質ニューロンにおけるＴｕｂｂ４ａ変異の細胞自律性効果を調べた。生存分析のために、プレーティング後１週間でＴｕｊ１およびＭＡＰ２染色で標識されたニューロンの数を分析し、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮニューロンがＷＴニューロンと比較して生存の有意な減少を示すことを観察した（図１１Ｇ、６Ｈ、６Ｉ、ｐ<０．０１、６９．５３％±４．８）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎニューロンは、ＷＴニューロンと比較してニューロンの生存に差は見られなかった。次に、チューブリン変異が軸索の伸長と樹状突起の分岐に影響を与えることで、ニューロンの健康状態および形態が変化するかどうかを評価した。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスのニューロンの軸索長は、ＷＴのニューロンと比較して短く（図１１Ｊ、１５５．８±２４．４２μｍ対１８７．５±２３．２９μｍ）、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスのニューロンの軸索長はＷＴの神経突起の長さに比べて有意に短かった（ｐ<０．０５、１１７．７±１０．１８μｍ）。同様に、ニューロンの樹状突起の分岐を調べたところ（図１１Ｋ）、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎニューロンの全樹状突起の長さは、ＷＴニューロンに比べて有意に短く（ｐ<０．００１、２７．４３±１．５３μｍ対４１．２６±４．０１μｍ）、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎニューロンでは有意な変化は見られなかった（３１．３１±３．８１μｍ）。これらの形態学的研究は、Ｈ－ＡＢＣに結合したＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎがニューロンの構造と形成に影響を与えていることを示している。
また、ＷＴ対照、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、およびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス由来の試験管内培養を用いて、皮質ニューロンにおけるＴｕｂｂ４ａ変異の細胞自律性効果を調べた。生存分析のために、プレーティング後１週間でＴｕｊ１およびＭＡＰ２染色で標識されたニューロンの数を分析し、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮニューロンがＷＴニューロンと比較して生存の有意な減少を示すことを観察した（図１１Ｇ、６Ｈ、６Ｉ、ｐ<０．０１、６９．５３％±４．８）。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎニューロンは、ＷＴニューロンと比較してニューロンの生存に差は見られなかった。次に、チューブリン変異が軸索の伸長と樹状突起の分岐に影響を与えることで、ニューロンの健康状態および形態が変化するかどうかを評価した。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスのニューロンの軸索長は、ＷＴのニューロンと比較して短く（図１１Ｊ、１５５．８±２４．４２μｍ対１８７．５±２３．２９μｍ）、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスのニューロンの軸索長はＷＴの神経突起の長さに比べて有意に短かった（ｐ<０．０５、１１７．７±１０．１８μｍ）。同様に、ニューロンの樹状突起の分岐を調べたところ（図１１Ｋ）、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎニューロンの全樹状突起の長さは、ＷＴニューロンに比べて有意に短く（ｐ<０．００１、２７．４３±１．５３μｍ対４１．２６±４．０１μｍ）、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎニューロンでは有意な変化は見られなかった（３１．３１±３．８１μｍ）。これらの形態学的研究は、Ｈ－ＡＢＣに結合したＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎがニューロンの構造と形成に影響を与えていることを示している。
【0151】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎは、ニューロンの不安定な微小管ダイナミクスを導く
形態学的な研究に加えて、Ｔｕｂｂ４ａの変異が、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス由来の皮質ニューロンの微小管（ＭＴ）ダイナミクスに影響を与えるかどうかを評価するための機能的な研究を行った。ニューロンにＭＴプラス末端結合タンパク質ＥＢ３－ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトし、プレーティング後１週間のＭＴの成長端を画像化した。タイムラプスビデオからカイモグラフを作成し、遠位軸索におけるＥＢ３コメットを評価した（図１３Ａ）。ＥＢ３コメットの数は、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスのニューロンで有意な差はなかったが（図１３Ｂ）、興味深いことに、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスのニューロンでは、ＥＢ３コメットの発現数が多いものと少ないものとで、異なる集団が見られた（図１３Ｃ）。また、ニューロンにおけるＥＢ３コメットの全体的な速度は、異なるグループ間でほぼ同様であり（図１３Ｄ；ＷＴ－０．２５±０．０４９μｍ／ｓ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ－０．２４１±０．０５５μｍ／ｓ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ－０．２５４±０．０６６μｍ／ｓ）、重合速度が同様であることを示している。
形態学的な研究に加えて、Ｔｕｂｂ４ａの変異が、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウス由来の皮質ニューロンの微小管（ＭＴ）ダイナミクスに影響を与えるかどうかを評価するための機能的な研究を行った。ニューロンにＭＴプラス末端結合タンパク質ＥＢ３－ｍＣｈｅｒｒｙをトランスフェクトし、プレーティング後１週間のＭＴの成長端を画像化した。タイムラプスビデオからカイモグラフを作成し、遠位軸索におけるＥＢ３コメットを評価した（図１３Ａ）。ＥＢ３コメットの数は、ＷＴ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスのニューロンで有意な差はなかったが（図１３Ｂ）、興味深いことに、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスのニューロンでは、ＥＢ３コメットの発現数が多いものと少ないものとで、異なる集団が見られた（図１３Ｃ）。また、ニューロンにおけるＥＢ３コメットの全体的な速度は、異なるグループ間でほぼ同様であり（図１３Ｄ；ＷＴ－０．２５±０．０４９μｍ／ｓ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ－０．２４１±０．０５５μｍ／ｓ、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ－０．２５４±０．０６６μｍ／ｓ）、重合速度が同様であることを示している。
【0152】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮニューロンにおけるこれらのＥＢ３コメットの平均実行時間（図１３Ｅ）は、ＷＴニューロン（２９．６７±０．７９秒）およびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎニューロン（２８．５５±０．５８秒）に比べて、有意に短い（ｐ<０．００１、２４．８６±０．５９秒）。同様に、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮニューロンのＥＢ３コメットの平均滑走距離（６．０±０．１４６μｍ）とＴｕｂｂ４ａＤ２４９ＮニューロンのＥＢ３コメットの平均ランレングス（６．７±０．１４μｍ）は、ＷＴニューロン（７．２０±０．１９μｍ、ｐ<０．００１、図１３Ｆ）に比べて有意に短かった。このように、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮニューロンではＭＴダイナミクスは大きく、かつ有意に変化しており、Ｔｕｂｂ４ａ遺伝子の変異の存在によるニューロンにおける機能的な細胞自律効果が確認された。
【0153】
議論：
ここで説明するマウスモデルは、Ｈ－ＡＢＣの行動表現型の特徴を再現しており、運動機能および歩行の欠陥を示す。さらに、ミエリンの発達的喪失、重度の小脳萎縮、線条体ニューロンの喪失など、Ｈ－ＡＢＣの特徴的な病理を含むこのモデルの組織学的表現型を検証した。
ここで説明するマウスモデルは、Ｈ－ＡＢＣの行動表現型の特徴を再現しており、運動機能および歩行の欠陥を示す。さらに、ミエリンの発達的喪失、重度の小脳萎縮、線条体ニューロンの喪失など、Ｈ－ＡＢＣの特徴的な病理を含むこのモデルの組織学的表現型を検証した。
【0154】
２０１３年にＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の変異がＨ－ＡＢＣと関連していることが判明して以来（２４）、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の他にも多数の変異が同定されている（１０，２０）。ＴＵＢＢ４Ａのｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ（Ｄ２４９Ｎ）変異は、Ｈ－ＡＢＣの古典的な機能と密接に関連しており、他の変異に関連するより広範な表現型を備えている。残念ながら、現在のところ、利用可能な治療アプローチはない。ｔａｅｉｐラットモデルには、Ｔｕｂｂ４ａの変異（ホモ接合のｐ．Ａｌａ３０２Ｔｈｒ）が存在することが報告されているが、このモデルでは小脳と線条体の萎縮が見られない（１３，２５）。本研究では、古典的な突然変異（Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ）のＣｒｉｓｐｒ－Ｃａｓ９トランスジェニックモデルを開発することで、Ｈ－ＡＢＣの完全なモデル化を試みた。特に、このアプローチは、表１にリストされている変異Ｔｕｂｂ４ａをコードする核酸のいずれにも適用可能である。早期発症の表現型を示すためには、ｔａｅｉｐラットのようにホモ接合のマウスが必要であるが、ヒトに見られるようなヘテロ接合の突然変異では、後期発症の疾患も見られる。種の違いを説明する１つの可能性として、用量感受性があり、その結果、表現型の浸透性が異なることが挙げられる。これはｔａｉｅｐラットモデルで報告されている（１３）；さらに、ＧＡＴＡ３（２６）、ＴＢＸ１（２７）、ＧＬＩ３（２８）のように、ヒトではヘテロ接合の変異が存在するが、ホモ接合のマウスではヒトの疾患と同様の表現型を示す遺伝子もいくつか報告されている。
【0155】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、～Ｐ９から振戦行動を示し、Ｈ－ＡＢＣ罹患者に見られるような小脳失調症および振戦と同様に、小脳性運動失調および振戦と一致する運動発達スキルおよび歩行の欠陥を示す。時間の経過とともに、ジストニアの発症と一致する運動機能の深刻な低下が見られる。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、重度のジストニアと痙性運動失調のために自給自足できないため、約Ｐ３７で体重と生存率の大幅な低下を示す。ヘテロ接合型Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎマウスは、ホモ接合型のマウスに見られる重篤な行動および神経病理学的表現型の初期の証拠を示さないが、１年後には識別可能な行動表現型を伴わないミエリン消失が見られる。
【0156】
神経病理学では、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスはミエリンの減少と進行性の発達喪失を示し、経時的に髄鞘形成不全と低髄鞘の混合と一致し、これがＳｈｉｖｅｒｅｒ（２９）、Ｓｈｉｍｉｌｄ（３０）、Ｊｉｍｐｙマウス（３１）に見られるような早期発症の振戦の原因となっている可能性がある。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、Ｐ１４で深刻なオリゴデンドロサイト（ＯＬ）の喪失を示す。ミエリンの喪失は、組織学的に基づくＯＬの数の減少によって証明されるように、ＯＬの死に起因する可能性がある。さらに、ＯＬにおけるＴｕｂｂ４ａの高発現（１１）とカスパーゼの染色に基づいて、Ｔｕｂｂ４ａの突然変異がＯＬの死に寄与していると考えられる。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、ＯＰＣの数が維持されていることから、Ｔｕｂｂ４ａの変異がＯＬのＯＰＣからの分化にも影響を与える可能性があることを示唆している。これらのメカニズムが相まって、このモデルで見られる髄鞘形成不全と異髄の複合的な症状につながっていると考えられる。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、Ｐ２１での小脳顆粒ニューロンが著しく喪失と、～Ｐ３７後の有意な線条体ニューロンの変性の証拠も示す。これは、Ｈ－ＡＢＣに罹患した患者で報告されている病理学的特徴と一致する（９，３２）。しかし、プルキンエニューロンは完全に無傷であった。このモデルマウスや患者に見られる進行性の歩行異常、運動失調、運動機能障害は、時間をかけた小脳の劇的な変化が根底にあると考えられる。線条体ニューロンの障害がやや軽度であるのは、Ｔｕｂｂ４ａの発現が線条体よりも小脳で相対的に高いという、Ｔｕｂｂ４ａの可変的な発現に関連している可能性がある（２）。ＴＵＢＢ４Ａの変異の数の増加が報告されているため（９，３３，３４）、線条体、有髄細胞、および小脳の独立した関与を伴う変異特異的な細胞作用が、この疾患に見られる幅広い表現型の変動の原因である可能性があることが認識されつつある（４，９）。
【0157】
Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスは、Ｈ－ＡＢＣで影響を受ける関連する細胞サブタイプの分子解剖を完全に可能にする初めてのモデルを提供する。ここで、ニューロンとＯＬで観察される細胞効果は、独立して生じている可能性もあれば、相加的な非細胞自律効果である可能性もある。各細胞集団の脆弱性を調べることは、Ｈ－ＡＢＣ患者に対する効果的な治療オプションを開発する上で重要である。
【0158】
これを解明するために、還元型細胞培養モデルを用いて、ニューロンとＯＬの細胞自律効果を調べた。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮマウスおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスから分離したＯＰＣは、ＷＴ対照マウスと比較してＯＬへの分化効率が低く、ＯＬにおけるＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎの細胞自律効果が確認され、生体内で観察される低髄鞘形成や髄鞘形成不全にも反映されている。また、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮマウスとＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスでは、Ｏｌｉｇ２標識細胞の総数は同程度であるが、成熟ＯＬの数が減少していることから、Ｔｕｂｂ４ａ変異によりＯＰＣの成熟ＯＬ運命への分化が阻害されていると考えられる。Ｔｕｂｂ４ａの変異による非細胞自律効果をさらに詳しく調べるには、条件付きトランスジェニックマウスモデルを用いた十分な遺伝子調査が必要である。
【0159】
ＴＵＢＢ４Ａ突然変異による微小管（ＭＴ）の機能障害および関連するＯＬの成熟のいくつかの証拠は、ｔａｅｉｐラットモデルで行われた研究から得られている。ｔａｅｉｐラットでは、ＯＬに微小管の蓄積を示し、ＰＬＰ、ＭＡＧ、およびＭＢＰミエリン遺伝子のＲＮＡが核周辺に局在することが確認されており、これはさらにＯＬにおけるＭＢＰ輸送のためのモータータンパク質ダイニンの活性が増加したことによると考えられている（３５）。これらの主要なミエリンタンパク質は、ミエリン合成のために、ＯＬ細胞体からＭＴに沿って周辺部に輸送される必要がある。ＯＬのプロセスとミエリン鞘の発達が複雑であることを考えると、ＭＴに沿ったカーゴの輸送が非効率的であることが、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９ＮＯＬの成熟度と複雑性の低下に寄与していることが予測される。
【0160】
ニューロンの細胞自律的効果を解析するため、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスから培養した皮質ニューロンを同様に研究したところ、生存率の低下と、軸索および樹状突起の分岐の阻害を示した。機能的な研究では、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９ＮおよびＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎ変異を持つニューロンでは、ＭＴプラス末端の重合距離および時間が短く、ＭＴのダイナミクスが不安定であることが明らかになった。ＭＴはニューロンの発達と機能に不可欠であり、ニューロンの構造、極性、成長円錐のダイナミクス、細胞内輸送（３６）に寄与し、変異型Ｔｕｂｂ４ａタンパク質は、これらの重要な機能に影響を及ぼす可能性がある。α－チューブリンおよびβ－チューブリンの多くの変異は、ニューロンの移動、分化、および軸索誘導の障害を特徴とする一連の神経障害の原因とされている（３７－３９）。我々の研究と同様に、マウスの皮質ニューロンや酵母におけるＴｕｂｂ３の変異は、ＭＴダイナミクスの変化と、ＭＴとキネシンモーターとの相互作用の破壊を示した（４０）。パーキンソン病（４１）やＡＬＳ（４２）の研究では、ＭＴダイナミクスが変化すると、能動的な輸送に不可欠な軸索の輸送が阻害されることが示されており、Ｔｕｂｂ４ａがＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎは非効率的なＭＴダイナミクスをもたらし、軸索伸長と樹状突起の分岐に必要なカーゴの輸送が阻害される可能性が考えられる。これらの研究はＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスの皮質ニューロンで実施されたが、線条体または小脳の顆粒状ニューロンでも同様の、あるいはより劇的な効果が期待される。
【0161】
ＭＴの表面にある特定の残基は、多くのタンパク質の相互作用を制御しており、これらの残基の変化がその機能に影響を与え、さまざまな神経疾患を引き起こす（３９）。ＭＴのダイナミクスは、チロシン化、アセチル化、ポリアミノ化、グルタミン化、グリシル化、グルタチオン化などの翻訳後修飾（ＰＴＭ）によって変化する可能性があり（４３）、ＭＴの安定性を高めている。ＴＵＢＢ４Ａの機能ドメインにおけるｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ変異の位置は、組み立てられた微小管の安定性に影響を与えると考えられていることから（４）、ＰＴＭの変化がＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎを介したＭＴ異常の要因となる可能性がある。ＰＴＭは、キネシン、ダイニンなどのモータータンパク質、および、細胞小器官や分子レベルでのカーゴ輸送に重要なタウやダブルコルチンなどのＭＴ関連タンパク質（ＭＡＰ）の結合をさらに変化させる可能性がある（３６）。しかし、Ｔｕｂｂ４ａ変異が微小管の機能にどのような影響を与えるのか、その正確なメカニズムはまだ解明されておらず、今後の研究が必要である。
【0162】
ＴＵＢＢ４Ａのヘテロ接合変異は、さまざまな脳の奇形を引き起こすことから、Ｔｕｂｂ４ａがニューロンおよびグリア機能に重要な役割を果たしている可能性が示唆されている。しかし、Ｔｕｂｂ４ａノックアウト（ＫＯ）マウスモデルは、Ｔｕｂｂ４ａが脳機能に冗長である可能性を示唆している。ＬａｃＺ発現を伴うＴｕｂｂ４ａ ＫＯマウス（４４）は、ワールドワイドウェブの.mousephenotype.org/data/genes/MGI:10784#section-associationsの部分的な表現型データとともに、ＫＯＭＰリポジトリで入手できる。ホモ接合のＴｕｂｂ４ａ ＫＯマウスは、正常な胚発生を示し、ＷＴと比較して正常な体重で正常に成長する。表現型のｌａｃ Ｚの発現データによると、神経系は正常に見え、識別可能な小脳ニューロンの喪失がないことを示している。現在のデータは、ＴＵＢＢ４Ａが脳の発達と機能に必須ではない可能性があることを示唆しており、ＴＵＢＢ４Ａ変異がニューロンやオリゴデンドロサイトに及ぼす有害な機能獲得効果を示唆している。さらに、これまでに行ってきた試験管内の細胞研究（４５）および人工多能性幹細胞由来ニューロンの最近の研究（４６）は、Ｄ２４９Ｎの突然変異がチューブリンの重合速度の変化を引き起こし、Ｈ－ＡＢＣ病の病因における優勢な機能獲得効果を裏付けることを報告している。
【0163】
Ｈ－ＡＢＣは、利用可能な治療戦略がない、壊滅的で進行性の障害のある小児疾患である。Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９／Ｄ２４９ＮＮマウスは、古典的なＨ－ＡＢＣ病の分子的、行動的、神経変性的特徴を最初に開発したものである。マウスは、ニューロンとオリゴデンドログリア細胞の両方に欠陥が見られた。これらのデータは、微小管の変化が病気の発症の重要な要因であるというモデルを裏付けるものである。これらのマウスは、ニューロンとグリアが関与するこの複雑な疾患の分子メカニズムを解明し、治療戦略の有効性を検証するための重要なツールを提供する。
【0164】
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【0165】
以下の材料と方法は、実施例ＩＩの実施を容易にするために提供される。
【0166】
ｉＰＳ培養の方法：
ＴＵＢＢ４Ａ変異のある個体と影響のない個体（対照）から分離した末梢血単球（ＰＢＭＣ）を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラムした。すべてのｉＰＳＣ株は、フローサイトメトリーおよびＤＮＡフィンガープリンティングを用いて多能性マーカーを確認し、ｉＰＳＣクローンの遺伝的完全性を確認した（Maguire et.al 2019）。ｉＰＳＣクローンは、連続継代を通じて正常な核型を示し、実施したマイコプラズマ検査はすべての株で陰性であった。
ＴＵＢＢ４Ａ変異のある個体と影響のない個体（対照）から分離した末梢血単球（ＰＢＭＣ）を、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に再プログラムした。すべてのｉＰＳＣ株は、フローサイトメトリーおよびＤＮＡフィンガープリンティングを用いて多能性マーカーを確認し、ｉＰＳＣクローンの遺伝的完全性を確認した（Maguire et.al 2019）。ｉＰＳＣクローンは、連続継代を通じて正常な核型を示し、実施したマイコプラズマ検査はすべての株で陰性であった。
【0167】
ｉＰＳＣのニューロン分化
線条体中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）の運命に向けた神経誘導は、以前に発表されたデュアルＳＭＡＤ阻害プロトコルを使用して実施された（Telezhkin 2016）。簡単に説明すると、ｉＰＳＣをＴＧＦ－βとｂＦＧＦを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地で７０％の培養密度になるまで培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、レチノイン酸（ＲＡ）を含まないニューロバサル培地に１０μＭ ＳＢ４３１５４２、１．５μＭ ＬＤＮ １９３１８９、１．５μＭ ＩＷＲ１を含む神経誘導ＳＬＩ培地を加えた。４日目、コンフルエントになった培養を１：２の割合でマトリゲルでコーティングした新しいプレートに継代した。８日目に１：２の割合で継代し、２００ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９、１．５μＭ ＩＷＲ１を含むニューロバサル培地のＲＡなしのＬ１培地で培養し、培地は毎日交換した。Ｄ１６ ｉＰＳＣ由来の神経前駆細胞（ＮＰＣＳ）は、そのままニューロンの分化に使用するか、後の分化のために凍結した。ＮＰＣに対してフローサイトメトリーを行い、ＳＯＸ２、Ｐａｘ６、ＦＯＸＧ１、Ｎｅｓｔｉｎなどの分化の初期マーカーを調べた。
線条体中型有棘ニューロン（ＭＳＮ）の運命に向けた神経誘導は、以前に発表されたデュアルＳＭＡＤ阻害プロトコルを使用して実施された（Telezhkin 2016）。簡単に説明すると、ｉＰＳＣをＴＧＦ－βとｂＦＧＦを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地で７０％の培養密度になるまで培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、レチノイン酸（ＲＡ）を含まないニューロバサル培地に１０μＭ ＳＢ４３１５４２、１．５μＭ ＬＤＮ １９３１８９、１．５μＭ ＩＷＲ１を含む神経誘導ＳＬＩ培地を加えた。４日目、コンフルエントになった培養を１：２の割合でマトリゲルでコーティングした新しいプレートに継代した。８日目に１：２の割合で継代し、２００ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９、１．５μＭ ＩＷＲ１を含むニューロバサル培地のＲＡなしのＬ１培地で培養し、培地は毎日交換した。Ｄ１６ ｉＰＳＣ由来の神経前駆細胞（ＮＰＣＳ）は、そのままニューロンの分化に使用するか、後の分化のために凍結した。ＮＰＣに対してフローサイトメトリーを行い、ＳＯＸ２、Ｐａｘ６、ＦＯＸＧ１、Ｎｅｓｔｉｎなどの分化の初期マーカーを調べた。
【0168】
ニューロンを分化させるために、アキュターゼを用いてＮＰＣを解離させ、マトリゲルと１００μｇ／ｍｌのポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）を塗布した２４ウェルプレートに、１ウェルあたり１００，０００個の細胞でプレーティングした。ｄ１６ ＮＰＣは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭＦ１２、２μＭ ＰＤ０３３２９９１、１０μＭ ＤＡＰＴ、０．６ｍＭ ＣａＣｌ２、２００μＭ アスコルビン酸、１０μＭ フォルスコリン、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、３００μＭ ＧＡＢＡを含むＳＣＭ１培地で最初の７日間培養した。
【0169】
ＮＰＣの８日目（または合計２３日目）のプレーティング後、ＲＡ、２μＭ ＰＤ０３３２９９１、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、０．３ｍＭ ＣａＣｌ２、２００μＭ アスコルビン酸、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＤＮＦを含む、１：１ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ－１２：ニューロバサル Ａを含むＳＣＭ２培地でＮＰＣを培養した。培地は３８日目になるまで３日ごとに交換し、その後、細胞は実験の準備が整った。
【0170】
神経細胞の生存と分析：
カバースリップ上で成長したニューロンを４％ＰＦＡで２０分間固定し、Ｔｕｊ１（ニューロンマーカー）、ＭＡＰ２（樹状突起マーカー）、およびＤＡＲＰＰ３２、ＣＴＩＰ２、ＧＡＢＡ、ＦＯＸＰ１などのＭＳＮの特異的マーカーを染色した。成熟後の異なる時点（３８日目、４５日目、５２日目）で細胞を固定し、ライカ顕微鏡でカバースリップを染色して画像化することにより、生存分析および神経病理学を実施した。データは盲検下で解析し、統計解析にはグラフパッド・プリズムを用いた。すべての分析は、一元配置分散分析または二元配置分散分析に続いてテューキーの事後検定を用いて行った。＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<０．０１。
カバースリップ上で成長したニューロンを４％ＰＦＡで２０分間固定し、Ｔｕｊ１（ニューロンマーカー）、ＭＡＰ２（樹状突起マーカー）、およびＤＡＲＰＰ３２、ＣＴＩＰ２、ＧＡＢＡ、ＦＯＸＰ１などのＭＳＮの特異的マーカーを染色した。成熟後の異なる時点（３８日目、４５日目、５２日目）で細胞を固定し、ライカ顕微鏡でカバースリップを染色して画像化することにより、生存分析および神経病理学を実施した。データは盲検下で解析し、統計解析にはグラフパッド・プリズムを用いた。すべての分析は、一元配置分散分析または二元配置分散分析に続いてテューキーの事後検定を用いて行った。＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<０．０１。
【0171】
実施例ＩＩ
ＴＵＢＢ４Ａ ヒトｉＰＳ細胞
前述の例で述べたように、大脳基底核および小脳の萎縮を伴う低髄鞘症（Ｈ－ＡＢＣ）は希少な白質ジストロフィーであり、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の散発的なｄｅ ｎｏｖｏヘテロ接合変異によって引き起こされることが私たちのグループによって特定された(Simons et al. 2013)。ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の単対立遺伝子変異は、早期発症型脳症から成人発症型ジストニア４型（嗄声発声障害）まで、さまざまな神経疾患を引き起こす可能性がある。Ｈ－ＡＢＣの影響を受けた個人は、このスペクトラムに含まれ、幼児期にジストニア(Hersheson et al. 2013)、進行性の歩行障害、言語障害、および認知障害を典型的に示す。また、ＴＵＢＢ４Ａの変異を持つ他の患者との違いは、神経画像上の特徴であり、小脳萎縮を伴う尾状核および被殻の髄鞘形成不全および萎縮が見られる(van der Knaap et al. 2007)。病理学的標本では、背側線条体領域および小脳の顆粒層で、軸索の膨らみとミエリンの減少を伴うニューロンの損失が見られる(Curiel et al. 2017; Simons et al. 2013)。Ｈ－ＡＢＣ患者は、公表されているＴＵＢＢ４Ａの変異の約６５％を占めており、１つの共通した変異であるｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ（以下、Ｄ２４９Ｎと称する）の影響を受けている可能性が高い。
ＴＵＢＢ４Ａ ヒトｉＰＳ細胞
前述の例で述べたように、大脳基底核および小脳の萎縮を伴う低髄鞘症（Ｈ－ＡＢＣ）は希少な白質ジストロフィーであり、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の散発的なｄｅ ｎｏｖｏヘテロ接合変異によって引き起こされることが私たちのグループによって特定された(Simons et al. 2013)。ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子の単対立遺伝子変異は、早期発症型脳症から成人発症型ジストニア４型（嗄声発声障害）まで、さまざまな神経疾患を引き起こす可能性がある。Ｈ－ＡＢＣの影響を受けた個人は、このスペクトラムに含まれ、幼児期にジストニア(Hersheson et al. 2013)、進行性の歩行障害、言語障害、および認知障害を典型的に示す。また、ＴＵＢＢ４Ａの変異を持つ他の患者との違いは、神経画像上の特徴であり、小脳萎縮を伴う尾状核および被殻の髄鞘形成不全および萎縮が見られる(van der Knaap et al. 2007)。病理学的標本では、背側線条体領域および小脳の顆粒層で、軸索の膨らみとミエリンの減少を伴うニューロンの損失が見られる(Curiel et al. 2017; Simons et al. 2013)。Ｈ－ＡＢＣ患者は、公表されているＴＵＢＢ４Ａの変異の約６５％を占めており、１つの共通した変異であるｐ．Ａｓｐ２４９Ａｓｎ（以下、Ｄ２４９Ｎと称する）の影響を受けている可能性が高い。
【0172】
本実施例では、ＣＨＯＰ幹細胞コアにおいて、Ｈ－ＡＢＣおよびその他のＴＵＢＢ４Ａ変異を有する個体から分離した末梢血単球（ＰＢＭＣ）から再プログラムした人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株について説明する（表１参照）。Ｈ－ＡＢＣに関連して、３系統のＴＵＢＢ４ＡＤ２４９Ｎ系統を線条体中型有棘ニューロンに分化させるために特別にプログラムし直し、その病理を調べた。これまでに得られたデータによると、ＴＵＢＢ４ＡＤ２４９ＮｉＰＳＣから分化した中有棘ニューロン（赤棒）では、対照患者由来のニューロン（黒棒）と比較して、生存率が低下し（図１６Ａ～Ｄ、＊＊ｐ<０．０１、＊＊＊ｐ<０．００１）、明らかな神経病理が認められた（図１６Ｅ、＊ｐ<０．０５）。ＴＵＢＢ４Ａに関連する病状が機能の喪失によるものか、それとも機能の獲得によるものかを検証するために、対照患者のｉＰＳＣ株でＣＲＩＳＰＲを用いてＴＵＢＢ４Ａを欠失させ、ノックアウト（ＴＵＢＢ４Ａ ＫＯ）株が発生学的に正常であり、線条体ニューロンに効率よく分化するかどうかをテストした。実際、対照と対照のＴＵＢＢ４Ａ ＫＯ ｉＰＳＣの分化は同等であることが観察され（図１６Ｆ、Ｇ）、ＴＵＢＢ４Ａが線条体ニューロンの生成に発達上の役割を果たしていないことが示された。
【0173】
ＴＵＢＢ４Ａを欠損させても機能が失われないことから、次に、ＴＵＢＢ４ＡＤ２４９Ｎ患者のｉＰＳＣでＴＵＢＢ４Ａを欠損させることで、病態やニューロン死（図１６に見られる）が救済されるかどうかを、患者のｉＰＳＣでＴＵＢＢ４ＡＫＯ（ＴＵＢＢ４ＡＤ２４９ＮＫＯ）を作製して検証した。さらに、ＴＵＢＢ４ＡＤ２４９ＮＫＯのｉＰＳＣをニューロンに分化させたところ、ＴＵＢＢ４ＡのＤ２４９Ｎニューロンと比較して、ＴＵＢＢ４ＡＤ２４９ＮＫＯではニューロンの総数（図１７；＊ｐ<０．０５、６７．１０±４．７６対４１．５５±５．８２）およびＣＴＩＰ２＋ＭＳＮ（図１６Ｂ；＊＊ｐ<０．０１、４３．１４±３．３８対１７．３８±２．０１）が有意に減少したことが確認された。
【0174】
これらの知見は、変異型ＴＵＢＢ４Ａの発現を抑制したり、野生型ＴＵＢＢ４Ａを増加させたりすることで、Ｈ－ＡＢＣや関連するＴＵＢＢ４Ａ関連白質ジストロフィーを治療できる可能性を示すものである。この方法を用いた治療アプローチには、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡサイレンシングアプローチ、または野生型ＴＵＢＢ４Ａの過剰発現による変異型ＴＵＢＢ４Ａとの競合が含まれる。
【0175】
実施例ＩＩＩ
標的ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子のダウンモジュレーションのためのアンチセンス分子
本発明者らは、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子発現の全体的なレベルをダウンモジュレートするのに有効な一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発した。以下に説明するアプローチにより、目的の標的細胞における野生型および変異型のＴＵＢＢ４－Ａの発現をダウンモジュレートすることができる。
標的ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子のダウンモジュレーションのためのアンチセンス分子
本発明者らは、ＴＵＢＢ４Ａ遺伝子発現の全体的なレベルをダウンモジュレートするのに有効な一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを開発した。以下に説明するアプローチにより、目的の標的細胞における野生型および変異型のＴＵＢＢ４－Ａの発現をダウンモジュレートすることができる。
【0176】
Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより１１種類のＡＳＯが合成された。これらのＡＳＯの試験管内スクリーニングを行い、最適なＡＳＯデザインを特定した。マウスＯｌｉ－ｎｅｕ細胞を、ＮＥＰＡ２１電気穿孔システム（ＮＥＰＡ ＧＥＮＥ、米国）を用いて、１００μＬの培地にＡＳＯ濃度１μＭ、５μＭ、１０μＭを１５０Ｖで、１００，０００細胞／ウェルで電気穿孔した。電気穿孔後、細胞をポリ－Ｌ－オルニチンを塗布したプレートに移し、インキュベーターに入れた。処置から４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ：１２１８３０１８Ａ）を用いて、製造者の指示に従ってＲＮＡ抽出を行った。ＤＮＡアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した後、２００ｎｇのＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ：１８０９１２００）を用いてｃＤＮＡに使用した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｑｕａｎｔａ Ｆｌｅｘ ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いたリアルタイムＰＣＲ分析（Ｔａｑｍａｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）により、Ｔｕｂｂ４ａ、および、参照としてスプライシング因子、アルギニン／セリン－リッチ９（ｓｆｒｓ９）をコードする内因性ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを定量した。結果は、ΔΔＣＴ法を用いて分析した。
【0177】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の配列：電気穿孔後、以下のＡＳＯ配列は１０μＭでＴｕｂｂ４ａの最大のダウンレギュレーションを示した。図１８および図２１Ａを参照。
ＡＳＯ １３１６：配列：５’＋Ａ＊＋Ｃ＊＋Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊＋Ｔ＊＋Ｔ＊＋Ｇ３’
（配列ＩＤ番号：１）
ＡＳＯ １８５１：配列：５’＋Ｇ＊＋Ａ＊＋Ｔ＊Ｃ＊Ｔ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊＋Ｇ＊＋Ｇ＊＋Ａ３’
（配列ＩＤ番号：２）
＊融解ＴｍはＭｇ２＋やｄＮＴＰの濃度を使用して評価してはならない
＋ＬＮＡ修飾
ＡＳＯ １３１６：配列：５’＋Ａ＊＋Ｃ＊＋Ａ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊＋Ｔ＊＋Ｔ＊＋Ｇ３’
（配列ＩＤ番号：１）
ＡＳＯ １８５１：配列：５’＋Ｇ＊＋Ａ＊＋Ｔ＊Ｃ＊Ｔ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ａ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊＋Ｇ＊＋Ｇ＊＋Ａ３’
（配列ＩＤ番号：２）
＊融解ＴｍはＭｇ２＋やｄＮＴＰの濃度を使用して評価してはならない
＋ＬＮＡ修飾
【0178】
上記の各配列は、１つ以上の修飾された骨格結合および／または修飾された糖を任意に含むことができる。これらのＡＳＯは、Ｔｕｂｂ４Ａのダウンレギュレーションのための実行可能な治療標的である。（図２１）これらのＡＳＯは、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭで、最小限の毒性でＴｕｂｂ４ａを効果的にダウンレギュレーションすることが示されている。（図２１Ａ）実際、ＡＳＯで治療した場合、対象は生存率が上昇し（図２１Ｂ）、発作が減少し（図２１Ｃ）、運動機能が大幅に改善した（図２１Ｄ）ことが示された。
【0179】
図１９は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた生体内全動物治療の模式図である。
【0180】
図２０は、確立されたＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスモデルにおいて、ＴＵＢＢ４Ａを生存可能で正常に見えるＴｕｂｂ４ａノックアウト（ＫＯ）マウスと交配することで、ＴＵＢＢ４Ａをダウンレギュレーションすることの治療効果を示したものである。結果として得られたＴｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／ＫＯマウスは、運動機能の改善、生存の向上と延長（図２０Ｂ）、運動機能の改善（図２０Ｃ）を示した。
【0181】
実施例ＩＶ
ＷＴ ＴＵＢＢ４Ａの過剰発現
上記の情報は、野生型チューブリンの過剰発現によるチューブリン変異に伴う表現型の救済に適用することができる。
ＷＴ ＴＵＢＢ４Ａの過剰発現
上記の情報は、野生型チューブリンの過剰発現によるチューブリン変異に伴う表現型の救済に適用することができる。
【0182】
α－チューブリンとβ－チューブリンは二量体を形成し、異なるチューブリンアイソフォームと交差二量体化する。チューブリン変異は発達上の脳の欠陥を引き起こす可能性があるが、野生型（ＷＴ）チューブリンの過剰発現は変異しβ－チューブリンを凌駕し、ショウジョウバエや線虫では関連する表現型を回復させる。
【0183】
好ましい実施形態では、我々は、ＷＴ ＴＵＢＢ４Ａを過剰発現させることにより、ＯＬ細胞株においてミエリン遺伝子の発現が増加することを示す（図２２）。このように、発現ベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））を用いてＷＴ ＴＵＢＢ４Ａの過剰発現は、Ｔｕｂｂ４ａＤ２４９Ｎ／Ｄ２４９Ｎマウスにおける機能獲得型ＴＵＢＢ４Ａ変異の毒性を克服し、表現型を救済することができる。ＡＡＶ送達は、目的の核酸を細胞に送達するための１つの手段にすぎない。送達に必要ないくつかの追加のアプローチおよび試薬は上に記載されている。
【0184】
ＷＴチューブリンの過剰発現は、変異型チューブリンモデルを救済することができる。したがって、影響を受けた細胞でＷＴ対変異型Ｔｕｂｂ４Ａを増やしてチューブリンの化学量論を変えると、Ｈ－ＡＢＣの神経変性を阻止できるだろう。好ましい実施形態では、独自のカプシドは、霊長類モデルにおいて、対象となる細胞を効果的に標的とする。別の実施形態では、新規のウイルスベクターは、ＳＮ、ＣＧＣおよび／またはＯＬを標的にしてＷＴ ＴＵＢＢ４Ａを過剰発現させ、試験管内で表現型を救済するであろう。これらのベクターを標的とすることで、関係する細胞型（ＯＬ、線条体ニューロン、小脳顆粒ニューロン）を標的とした治療アプローチが改善されるだろう。
【0185】
本明細書では、本発明の特定の特徴を説明してきたが、多くの修正、置換、変更、および等価物が、当業者には生じるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神の範囲内にあるすべてのそのような修正および変更を網羅することが意図されていることを理解されたい。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図1-6】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図3-4】
【図3-5】
【図3-6】
【図3-7】
【図3-8】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図16-3】
【図16-4】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】