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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-21
(54)【発明の名称】疾病治療用ナノ粒子複合体及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
A61K 47/54 20170101AFI20220713BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20220713BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20220713BHJP
A61K 47/44 20170101ALI20220713BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220713BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220713BHJP
A61K 45/08 20060101ALI20220713BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20220713BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220713BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20220713BHJP
C12N 15/88 20060101ALN20220713BHJP
【ＦＩ】
A61K47/54
A61K9/51
A61K9/16
A61K47/44
A61P35/00
A61K45/00
A61K45/08
A61K47/24
A61K9/127
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/88 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021567055
(86)(22)【出願日】2020-05-08
(85)【翻訳文提出日】2021-12-24
(86)【国際出願番号】 KR2020006109
(87)【国際公開番号】W WO2020231105
(87)【国際公開日】2020-11-19
(31)【優先権主張番号】10-2019-0054778
(32)【優先日】2019-05-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515139031
【氏名又は名称】ソガン ユニバーシティ リサーチ ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＧＡＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヒョン チョル
(72)【発明者】
【氏名】キム，ド ヨン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジ ウォン
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA31
4C076AA65
4C076BB11
4C076BB24
4C076CC27
4C076DD15
4C076EE52
4C076EE59
4C076FF68
4C084AA17
4C084AA27
4C084MA05
4C084MA41
4C084NA05
4C084NA11
4C084ZB261
4C084ZB262
(57)【要約】
本発明は、疾病治療用ナノ粒子複合体及びその製造方法に係り、より詳細には、ナノ粒子の表面の一部分にチューブ状の脂質構造体が結合してエンドサイトーシスを引き起こすだけでなく、細胞膜を直接貫通することができ、向上した組織透過能力によりスフェロイド状の腫瘍細胞内にナノ粒子を効果的に取り込ませることができ、リピドーム形成の際に使用される第２反応基が結合しているリン脂質と第２反応基が結合していないリン脂質との比率を調節することにより、ナノ粒子の表面に十分な長さの脂質構造体を形成することができるナノ粒子複合体及びその製造方法に関する。
【選択図】図１６
【選択図】図１６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞内に取り込まれるナノ粒子と、前記ナノ粒子の外表面の一部分に結合してナノ粒子の細胞内取り込み効率を向上させる脂質ベースの脂質構造体を含み、前記ナノ粒子は、第１反応基を含み、前記脂質構造体は、前記ナノ粒子の第１反応基と化学結合する第２反応基を含み、前記第１反応基と前記第２反応基とが化学結合することにより脂質構造体がナノ粒子に結合することを特徴とする、ナノ粒子複合体。
【請求項2】
前記脂質構造体は、第２反応基が結合した脂質と、第２反応基が結合していない脂質との混合物からなるリピドームの再組み合わせによって形成され、前記第２反応基が結合した脂質と前記第２反応基が結合していない脂質との混合比率を調節して、ナノ粒子に結合した脂質構造体の生成及び形態を制御することができることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子複合体。
【請求項3】
前記第２反応基が結合した脂質と前記第２反応基が結合していない脂質は１：２．３３～９９のモル比で使用されることを特徴とする、請求項２に記載のナノ粒子複合体。
【請求項4】
前記脂質構造体は、親水性を呈する脂質頭部が外側面に位置し、内部に疎水性を呈する脂質尾部が位置することにより、全体的に長尺なチューブ形状を有することを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子複合体。
【請求項5】
前記ナノ粒子は５０～５００ｎｍの直径を有し、前記脂質構造体は５０～３００ｎｍの長さ及び３～２０ｎｍの幅を有することを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子複合体。
【請求項6】
前記ナノ粒子複合体は、エンドサイトーシスを引き起こすだけでなく、細胞膜を直接貫通して細胞内に取り込まれることができることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子複合体。
【請求項7】
前記脂質構造体は、前記ナノ粒子のスフェロイド細胞内取り込み効率を向上させることができることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子複合体。
【請求項8】
前記ナノ粒子は、抗がん剤を含み、抗がん抵抗性を有する腫瘍細胞の死滅効率を向上させることができることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子複合体。
【請求項9】
前記ナノ粒子は、誘電体を含むか或いは遺伝体からなり、前記ナノ粒子複合体は、遺伝子治療に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子複合体。
【請求項10】
第１反応基が存在するナノ粒子を形成するナノ粒子形成ステップと、前記第１反応基と化学的に結合する第２反応基が存在する脂質ベースのマイクロサイズのリピドームを形成するリピドーム形成ステップと、
前記ナノ粒子と前記リピドームとを混合して第１反応基と第２反応基とが互いに結合するようにして、リピドームの外面にナノ粒子が結合したリピドーム－ナノ粒子複合体を形成する脂質複合体形成ステップと、
前記脂質複合体形成ステップで形成されたリピドーム－ナノ粒子複合体に機械的な力を加えてリピドームを破砕して、ナノ粒子の外表面の一部分に結合した脂質構造体を形成することにより、ナノ粒子複合体を製造する破砕形成ステップと、を含み、
前記リピドーム形成ステップは、第２反応基が結合した脂質と第２反応基が結合していない脂質との混合物を用いてリピドームを形成し、
前記ナノ粒子は細胞内に取り込まれ、前記脂質構造体はナノ粒子の細胞内取り込み効率を向上させることを特徴とする、ナノ粒子複合体の製造方法。
【請求項11】
前記第２反応基が結合した脂質と前記第２反応基が結合していない脂質との混合比率を調節して、ナノ粒子に結合した脂質構造体の生成及び形態を制御することができることを特徴とする、請求項１０に記載のナノ粒子複合体の製造方法。
【請求項12】
前記破砕形成ステップでは、リピドーム－ナノ粒子複合体に機械的な力を加えて一定時間維持することにより、リピドームが破砕され、リピドームを成すリン脂質は再組み合わせが起こり、ナノ粒子に結合したチューブ状の脂質構造体が形成されることを特徴とする、請求項１０に記載のナノ粒子複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、疾病治療用ナノ粒子複合体及びその製造方法に係り、より詳細には、ナノ粒子の表面の一部分にチューブ状の脂質構造体が結合してエンドサイトーシスを引き起こすだけでなく、細胞膜を直接貫通することができ、向上した組織透過能力によりスフェロイド状の腫瘍細胞内にナノ粒子を効果的に取り込ませることができ、リピドーム形成の際に使用される第２反応基が結合したリン脂質と第２反応基が結合していないリン脂質との比率を調節することにより、ナノ粒子の表面に十分な長さの脂質構造体を形成することができるナノ粒子複合体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
薬物送達分野において、細胞内取り込み効率は、薬物送達効能を達成するための重要な尺度になる。このため、細胞内取り込み効率を向上させるための技術が広く開発されている。一例として、下記特許文献に記載されているように、ナノ粒子に細胞透過性ペプチドなどを化学的に結合させてナノ粒子の細胞内取り込み効率を向上させようとしている。
【0003】
しかしながら、従来の細胞内取り込み効率を向上させるための技術は、十分な効果を得ることができず、結合した物質が容易に分解されて安定性に劣るという問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】韓国公開特許第１０－２０１７－００４０７４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、かかる問題点を解決するためになされたもので、その目的は、安定性が高く生体適合性に優れた脂質ベースの物質でナノ粒子の表面を改質することにより細胞内取り込み効率を飛躍的に向上させたナノ粒子複合体及びその製造方法を提供することにある。
【0006】
本発明の他の目的は、ナノ粒子の表面の一部分にチューブ状の脂質構造体を形成することで、エンドサイトーシス（サイズ１００～２００ｎｍの粒子が細胞内に取り込まれるメカニズムである）だけでなく、細胞膜を直接貫通しうるナノ粒子複合体及びその製造方法を提供することにある。
【0007】
本発明の別の目的は、向上した組織透過（ｔｉｓｓｕｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）能力によりスフェロイド状の腫瘍細胞内にナノ粒子を効果的に取り込ませることができるナノ粒子複合体及びその製造方法を提供することにある。
【0008】
本発明の別の目的は、誘電体薬物を担持する或いは誘電体薬物自体からなるナノ粒子の細胞及び組織への送達効果を向上させることにより、遺伝子治療効率を高めることができるナノ粒子複合体及びその製造方法を提供することにある。
【0009】
本発明の別の目的は、脂質構造体をナノ粒子に直接付着させることなく、脂質ベースのリピドーム（バブル、リポソームなど）とナノ粒子とを結合させた後、物質的な力を加えてリピドームが破砕されてナノ粒子の表面に脂質構造体が形成されるようにするＴｏｐ－ｄｏｗｎ方式を用いるので、容易に量産が可能なナノ粒子複合体及びその製造方法を提供することにある。
【0010】
本発明の別の目的は、リピドーム形成の際に用いられる第２反応基が結合したリン脂質と第２反応基が結合していないリン脂質との比率を調節して、前記ナノ粒子の表面に十分な長さの脂質構造体を形成することができるナノ粒子複合体及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、上記の目的を達成するために、以下の構成を持つ実施形態によって実現される。
【0012】
本発明の一実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体は、細胞内に取り込まれるナノ粒子と、前記ナノ粒子の外表面の一部分に複数個が自己組織化されてナノ粒子の細胞内取り込み効率を向上させる脂質ベースの脂質構造体と、を含むことを特徴とする。
【0013】
本発明の他の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体において、前記ナノ粒子は、第１反応基を含み、前記脂質構造体を構成する脂質のうちの一部の脂質はナノ粒子の第１反応基と化学結合する第２反応基を含んでおり、優先的に前記第１反応基と前記第２反応基とが化学結合し、一部の脂質がナノ粒子に結合し、これを始点として残りの脂質が自己組織化によって脂質構造体を形成することを特徴とする。
【0014】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体において、前記脂質構造体は、第２反応基が結合した脂質と、第２反応基が結合していない脂質との混合物からなるリピドームの自己組織化によって形成され、前記第２反応基が結合した脂質と第２反応基が結合していない脂質との混合比率を調節して、ナノ粒子に結合した脂質構造体の生成及び形態を制御することができることを特徴とする。
【0015】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体において、前記第２反応基が結合した脂質と第２反応基が結合していない脂質とは１：２．３３～９９のモル比で混合されることを特徴とする。
【0016】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体において、前記脂質構造体は、親水性を呈する脂質頭部が外側面に位置し、内部に疎水性を呈する脂質尾部が位置することで、全体的に長尺なチューブ形状を有することを特徴とする。
【0017】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体において、前記ナノ粒子は５０～５００ｎｍの直径を有し、前記脂質構造体は５０～３００ｎｍの長さ及び３～２０ｎｍの幅を有することを特徴とする。
【0018】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体は、従来のナノ粒子の細胞内に入り込むメカニズムであるエンドサイトーシスを引き起こすだけでなく、細胞膜を直接貫通して細胞内に取り込まれることができることを特徴とする。
【0019】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体において、前記脂質構造体は、前記ナノ粒子のがん細胞スフェロイド細胞内取り込み効率を向上させることができることを特徴とする。
【0020】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体において、前記ナノ粒子は、抗がん剤を含み、抗がん抵抗性を有する腫瘍細胞の死滅効率を向上させることができることを特徴とする。
【0021】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体において、前記ナノ粒子は、誘電体薬物が担持されたナノ粒子又は誘電体薬物自体からなるナノ粒子が使用され、遺伝子治療効率を向上させることができることを特徴とする。
【0022】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体の製造方法は、第１反応基が存在するナノ粒子を形成するナノ粒子形成ステップと、前記第１反応基と化学的に結合する第２反応基が存在する脂質ベースのマイクロサイズのリピドームを形成するリピドーム形成ステップと、前記ナノ粒子と前記リピドームとを混合して第１反応基と第２反応基とが互いに結合するようにして、前記リピドームの外面にナノ粒子が結合したリピドーム－ナノ粒子複合体を形成する脂質複合体形成ステップと、前記脂質複合体形成ステップで形成されたリピドーム－ナノ粒子複合体に機械的な力を加えてリピドームを破砕して、ナノ粒子の外表面の一部分に結合した脂質構造体を形成することにより、ナノ粒子複合体を製造する破砕形成ステップと、を含み、前記リピドーム形成ステップは、第２反応基が結合した脂質と第２反応基が結合していない脂質との混合物を用いてリピドームを形成し、前記ナノ粒子は細胞内に取り込まれ、前記脂質構造体はナノ粒子の細胞内取り込み効率を向上させることを特徴とする。
【0023】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体の製造方法において、前記第２反応基が結合した脂質と前記第２反応基が結合していない脂質との混合比率を調節して、ナノ粒子に結合した脂質構造体の生成及び形態を制御することができることを特徴とする。
【0024】
本発明の別の実施形態によれば、本発明によるナノ粒子複合体の製造方法において、前記破砕形成ステップでは、リピドーム－ナノ粒子複合体に機械的な力を加えて一定時間維持することにより、リピドームが破砕され、リピドームを成すリン脂質は再組み合わせが起こり、ナノ粒子に結合したチューブ状の脂質構造体が形成されることを特徴とする。
【発明の効果】
【0025】
本発明は、まず、本実施形態によって次の効果を得ることができる。
【0026】
本発明は、安定性が高く生体適合性に優れた脂質ベースの物質でナノ粒子の表面を改質することにより、細胞内取り込み効率を飛躍的に向上させることができるという効果がある。
【0027】
また、本発明は、ナノ粒子の表面の一部分にチューブ状の脂質構造体が形成されることにより、エンドサイトーシス（サイズ１００～２００ｎｍの粒子が細胞内に取り込まれるメカニズムである）を引き起こすだけでなく、細胞膜を直接貫通することができるようにするという効果がある。
【0028】
また、本発明は、向上した組織透過（ｔｉｓｓｕｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）能力によりスフェロイド状の腫瘍細胞内にナノ粒子を効果的に取り込ませることができるという効果がある。
【0029】
また、本発明は、脂質構造体をナノ粒子に直接付着させず、脂質ベースのリピドーム（バブル、リポソームなど）とナノ粒子とを結合させた後、物質的な力を加えることにより、リピドームが破砕され、ナノ粒子の表面に脂質構造体が形成されるようにするＴｏｐ－ｄｏｗｎ方式を用いるので、容易に量産が可能であるという効果がある。
【0030】
また、本発明は、リピドーム形成の際に用いられる第２反応基が結合したリン脂質と第２反応基が結合していないリン脂質との比率を調節して、前記ナノ粒子の表面に十分な長さの脂質構造体を形成することができるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0031】
【図1】本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体の模式図である。
【図2】本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体のＴＥＭ画像である。
【図3】本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体のＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像である。
【図4】本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体に結合する脂質構造体のＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像である。
【図5】リン脂質の比率を異にして製造された本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体のＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像である。
【図6】本発明の他の実施形態によるナノ粒子複合体に使用されるウイルスナノ粒子のＴＥＭ画像である。
【図7】本発明の他の実施形態によるナノ粒子複合体のＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像である。
【図8】本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を確認するためのフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いた分析結果を示す図である。
【図9】本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を確認するための共焦点マイクロスコープ（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）画像である。
【図10】本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を確認するための共焦点マイクロスコープ（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）画像である。
【図11】本発明の他の実施形態によるナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を確認するための共焦点マイクロスコープ画像である。
【図12】本発明の別の実施形態によるナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を確認するための共焦点マイクロスコープ画像である。
【図13】様々な脂質及び官能基を用いて製造されたナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を確認するためのフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いた分析結果を示す図表である。
【図14】様々な脂質及び官能基を用いて製造されたナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を確認するためのフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いた分析結果を示す図表である。
【図15】エンドサイトーシス阻害剤（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を処理した後の本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を確認するためのフローサイトメトリーを用いた分析結果を示す図表である。
【図16】エンドサイトーシス阻害剤（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を処理した後、リン脂質の比率を異にして製造された本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を確認するためのフローサイトメトリーを用いた分析結果を示す図表である。
【図17】ＨＡを過剰処理した後の本発明の別の実施形態によるナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を確認するための共焦点マイクロスコープ画像である。
【図18】本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体の抗がん剤送達体としての効能を確認するための細胞生存アッセイ（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ）の結果を示す図表である。
【図19】本発明の別の実施形態によるナノ粒子複合体の誘電体薬物送達体としての効能を確認するための遺伝子サイレンシング（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）の結果を示す図である。
【図20】本発明の別の実施形態によるナノ粒子複合体の誘電体薬物送達体としての効能を確認するための遺伝子サイレンシング（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）の結果を示す図である。
【図21】本発明の別の実施形態によるナノ粒子複合体の誘電体薬物送達体としての効能を確認するための遺伝子サイレンシングの結果を示す図である。
【図22】本発明の別の実施形態によるナノ粒子複合体の誘電体薬物送達体としての効能を確認するための遺伝子サイレンシングの結果を示す図である。
【図23】本発明の一実施形態によるナノ粒子複合体のスフェロイド腫瘍細胞モデルにおける細胞取り込み効率を確認するための共焦点マイクロスコープ画像である。
【図24】本発明の別の実施形態によるナノ粒子複合体のスフェロイド腫瘍細胞モデルにおける細胞取り込み効率を確認するための共焦点マイクロスコープ画像である。
【図25】本発明の別の実施形態によるナノ粒子複合体のスフェロイド腫瘍細胞モデルから誘電体薬物送達体としての効能を確認するための遺伝子サイレンシング結果を示す図である。
【図26】本発明の別の実施形態によるナノ粒子複合体のスフェロイド腫瘍細胞モデルから誘電体薬物送達体としての効能を確認するための遺伝子サイレンシング結果を示す図である。
【図27】動物モデルにおける本発明の別の実施形態によるナノ粒子複合体の細胞取り込み効率を評価するための共焦点マイクロスコープ画像である。
【発明を実施するための形態】
【0032】
以下、本発明による疾病治療用ナノ粒子複合体及びその製造方法を添付図面を参照して詳細に説明する。特別な定義がない限り、本明細書のすべての用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する技術者が理解する当該用語の一般的な意味と同一であり、もし本明細書で使用された用語の意味と衝突する場合には、本明細書で使用された定義に従う。なお、本発明の要旨を無駄に不明瞭にするおそれのある公知の機能及び構成についての詳細な説明は省略する。本明細書全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは、特に反対の記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
【0033】
本発明の一実施形態による疾病治療用ナノ粒子複合体を図１～図２４を参照して説明すると、前記ナノ粒子複合体は、細胞内に取り込まれるナノ粒子１と、前記ナノ粒子１の外表面の一部分に結合してナノ粒子１の細胞内取り込み効率を向上させる脂質ベースの脂質構造体２などを含む。
【0034】
前記ナノ粒子１は、細胞内に取り込まれる構成であり、疾病の治療などに用いられることができる。前記ナノ粒子１は、例えば薬物を担持するか、或いは疾病を治療することができる物質からなるが、細胞内に取り込まれて疾病の治療に用いられる従来の様々なナノ粒子が使用でき、例えば、疾患の治療に用いられる、アルブミンナノ粒子、核酸とアルブミンからなるナノ粒子、生分解性高分子ナノ粒子、核酸ナノ粒子、ウイルス粒子などを例示することができる。前記ナノ粒子は、例えば５０～５００ｎｍの直径及び球形の形状などを有することができる。前記ナノ粒子は、脂質構造体と結合する化学反応基（以下、「第１反応基」という）を含むことができる。例えば、第１反応基としては、チオール基、アミン基、アミノ基、カルボキシ基などを含む化合物であり得る。
【0035】
前記脂質構造体２は、ナノ粒子１の外表面の一部分に結合してナノ粒子１の細胞内取り込み効率を向上させる脂質ベースの構造体であって、前記脂質構造体は、例えば５０～３００ｎｍの長さ及び３～２０ｎｍの幅を有することができ、前記ナノ粒子の外表面に一つ以上が結合することができる。また、前記脂質構造体は、ナノ粒子の第１反応基と化学結合する化学反応基（以下、「第２反応基」という）を含むことができる。例えば、第２反応基としてチオール基、アミン基、アミノ基、カルボキシ基などを含む化合物であってもよい。前記脂質構造体は、第２反応基が結合した脂質と、第２反応基が結合していない脂質との混合比率を調節して脂質構造体の生成及び形態（模様及び長さなど）を制御することができ、第２反応基が結合した脂質と第２反応基が結合していない脂質は、１：２．３３～９９のモル比で混合されることが好ましい。
【0036】
前記脂質構造体は、例えば、親水性を呈する脂質頭部２１が外側面に位置し、内部に疎水性を呈する脂質尾部２２が位置することにより、全体的に長尺なチューブ形状を有することができ、チューブ形状の脂質構造体の一端に位置する第２反応基が前記ナノ粒子の第１反応基と化学結合してチューブ状の脂質構造体がナノ粒子１の外表面に結合する。例えば、ナノ粒子がアルブミンナノ粒子であり、前記脂質構造体にＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシニミド）反応基を形成する場合、ＮＨＳ－アミン反応によって前記ナノ粒子１と脂質構造体２とを結合させることができる。本発明は、安定性が高く生体適合性に優れた脂質ベースの物質でナノ粒子の表面を改質することにより、細胞内取り込み効率を飛躍的に向上させることができ、サイズ１００～２００ｎｍのナノ粒子が細胞内に取り込まれるメカニズムはエンドサイトーシスであるが、前記ナノ粒子複合体は、ナノ粒子の表面の一部分にチューブ状の脂質構造体が結合してエンドサイトーシスを引き起こすだけでなく、細胞膜を直接貫通することができ、スフェロイド状の腫瘍細胞を効果的に摂取して生体モデルにも適用することができる。
【0037】
本発明の他の実施形態によるナノ粒子複合体の製造方法を説明すると、前記ナノ粒子複合体の製造方法は、第１反応基が存在するナノ粒子を形成するナノ粒子形成ステップと、前記第１反応基と化学的に結合する第２反応基が存在する脂質ベースのマイクロサイズのリピドーム（バブル、リポソームなど）を形成するリピドーム形成ステップと、前記ナノ粒子とリピドームとを混合して第１反応基と第２反応基とが互いに結合するようにして、リピドームの外面にナノ粒子が結合したリピドーム－ナノ粒子複合体を形成する脂質複合体形成ステップと、前記脂質複合体形成ステップで形成されたリピドーム－ナノ粒子複合体に機械的な力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えることでリピドームを破砕して、ナノ粒子の外表面の一部分に結合した脂質構造体を形成する破砕形成ステップなどとを含む。
【0038】
前記ナノ粒子形成ステップは、細胞内に取り込まれて疾病の治療に用いられるナノ粒子が第１反応基を含むように前記ナノ粒子を形成するステップであって、従来の様々なナノ粒子を製造する方法が使用でき、例えば、薬物を担持したアルブミンナノ粒子の場合、アルブミンにアミン基が存在して第１反応基として用いられることができ、特定のタンパク質の発現を抑制するｓｉＲＮＡナノ粒子の場合、アミンが付いているヒアルロン酸をｓｉＲＮＡナノ粒子にコーティングしてｓｉＲＮＡナノ粒子に第１反応基を形成することができる。
【0039】
前記リピドーム形成ステップは、前記第１反応基と化学的に結合する第２反応基が存在する脂質ベースのマイクロサイズのリピドーム（バブル、リポソームなど）を形成するステップであり、例えばバブルは脂質（例えば、リン脂質）で形成され、内部にガスが充填されており、前記バブルに第２反応基が位置する。内部にガスを有し、脂質からなるリポソーム状のマイクロサイズのバブルは、従来の製造方法によって製造でき、例えば、第２反応基が結合した脂質と第２反応基が結合していない脂質とを有機溶媒に一定の比率で混合して脂質フィルムを形成し、前記脂質フィルムを溶媒に溶かしてガスを注入することにより形成することができる。第２反応基が結合した脂質と第２反応基が結合していない脂質との混合比率を調節して脂質構造体の生成及び形態（模様及び長さなど）を制御することができ、第２反応基が結合した脂質と第２反応基が結合していない脂質とは、１：２．３３～９９のモル比で混合されることが好ましい。
【0040】
前記脂質複合体形成ステップは、前記ナノ粒子とリピドームとを混合して第１反応基と第２反応基とが互いに結合するようにして、脂質の外面にナノ粒子が結合したリピドーム－ナノ粒子複合体を形成するステップである。
【0041】
前記破砕形成ステップは、前記脂質複合体形成ステップで形成されたリピドーム－ナノ粒子複合体に機械的な力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えてリピドームを破砕することにより、ナノ粒子の外表面の一部分に結合した脂質構造体を形成するステップである。リピドーム－ナノ粒子複合体に超音波機器などを用いて機械的な力を加えて一定時間維持する場合、リピドームが破砕され、リピドームを成す脂質は再組み合わせが起こり、ナノ粒子に結合したチューブ状の脂質構造体が形成される。具体的には、リピドーム－ナノ粒子複合体に機械的な力を加えるとリピドームが破砕され、第２反応基を有する一部の脂質が優先的にナノ粒子に結合し（第１反応基と第２反応基とが化学結合する）、これを始点として残りの脂質が自己組織化で脂質構造体を形成する。
【0042】
本発明は、脂質構造体をナノ粒子に直接付着させず、脂質ベースのリピドームとナノ粒子とを結合させた後、機械的な力を加えてリピドームが破砕され、ナノ粒子の表面に脂質構造体が形成されるようにするＴｏｐ－ｄｏｗｎ方式を用いるので、容易に量産が可能であるようにすることができる。
【0043】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。ところが、これらの実施例は本発明をより詳細に説明するためのものに過ぎず、本発明の権利範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0044】
＜実施例１＞アルブミンナノ粒子複合体の製造
１．アルブミンナノ粒子（ＮＰｓ）の準備
アルブミン（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を蒸留水に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、０．２Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを８に調節してアルブミン溶液を準備し、１００％エタノールを１ｍＬ／ｍｉｎの速度で前記アルブミン溶液に滴定した。その後、４％のグルタルアルデヒド１０μＬを添加し、遮光下にエタノールを一晩蒸発させ、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、粒子化されていないアルブミンをピペットを用いて除去し、ＰＢＳで再分散して３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、マイクロペレット（ｍｉｃｒｏｐｅｌｌｅｔ）を除いた上清（ナノ粒子（ＮＰｓ））をピペットで得た（一方、蛍光実験を行うときには、必要による蛍光色素（ｄｙｅ）とナノ粒子を一晩常温で反応させた後、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行い、反応していない蛍光色素（ｄｙｅ）をピペットを用いて除去した後、ＰＢＳに再分散して使用する）。
１．アルブミンナノ粒子（ＮＰｓ）の準備
アルブミン（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）を蒸留水に２０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、０．２Ｍ ＮａＯＨを用いてｐＨを８に調節してアルブミン溶液を準備し、１００％エタノールを１ｍＬ／ｍｉｎの速度で前記アルブミン溶液に滴定した。その後、４％のグルタルアルデヒド１０μＬを添加し、遮光下にエタノールを一晩蒸発させ、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、粒子化されていないアルブミンをピペットを用いて除去し、ＰＢＳで再分散して３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、マイクロペレット（ｍｉｃｒｏｐｅｌｌｅｔ）を除いた上清（ナノ粒子（ＮＰｓ））をピペットで得た（一方、蛍光実験を行うときには、必要による蛍光色素（ｄｙｅ）とナノ粒子を一晩常温で反応させた後、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行い、反応していない蛍光色素（ｄｙｅ）をピペットを用いて除去した後、ＰＢＳに再分散して使用する）。
【0045】
２．リピドーム（リポソーム）の準備
脂質ＤＳＰＣ（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）を９．２５：０．７５のモル比で混合してクロロホルムに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かした後、１ｍｇ／ｍｌとなるようにｌｃバイアルに１００μｌずつ入れ、窒素ガスを用いてクロロホルムを蒸発させた後、デシケーター（ｄｅｓｉｃａｔｃａｔｏｒ）を用いて真空引きをしながら１時間以上乾かすことにより脂質薄膜（ｌｉｐｉｄ ｆｉｌｍ）を形成した。ｌｉｐｉｄ ｆｉｌｍ ｖｉａｌにａｕｔｏ ＰＢＳを１ｍｌ入れて脂質溶液を形成し、温度５５℃以上の水に脂質溶液入りのＨＰＬＣバイアルを入れて脂質溶液の温度が５５℃以上となるようにし、バスソニケーターで１５秒程度ソニケーション（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を行うことにより（このとき、お湯に浸す過程とソニカレーション実施過程を３回程度繰り返す）、リポソームを形成した。
脂質ＤＳＰＣ（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）を９．２５：０．７５のモル比で混合してクロロホルムに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かした後、１ｍｇ／ｍｌとなるようにｌｃバイアルに１００μｌずつ入れ、窒素ガスを用いてクロロホルムを蒸発させた後、デシケーター（ｄｅｓｉｃａｔｃａｔｏｒ）を用いて真空引きをしながら１時間以上乾かすことにより脂質薄膜（ｌｉｐｉｄ ｆｉｌｍ）を形成した。ｌｉｐｉｄ ｆｉｌｍ ｖｉａｌにａｕｔｏ ＰＢＳを１ｍｌ入れて脂質溶液を形成し、温度５５℃以上の水に脂質溶液入りのＨＰＬＣバイアルを入れて脂質溶液の温度が５５℃以上となるようにし、バスソニケーターで１５秒程度ソニケーション（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を行うことにより（このとき、お湯に浸す過程とソニカレーション実施過程を３回程度繰り返す）、リポソームを形成した。
【0046】
３．リピドーム（脂質を用いたバブル）の準備
実施例１の２の過程を経て得た結果物を含むバイアルに、Ｃ３Ｆ８ガスを３０秒間満たし、Ｖｉａｌ Ｍｉｘｅｒを用いて４５秒間混合することにより、ＮＨＳ反応基を含む脂質ベースのマイクロバブルを形成した。
実施例１の２の過程を経て得た結果物を含むバイアルに、Ｃ３Ｆ８ガスを３０秒間満たし、Ｖｉａｌ Ｍｉｘｅｒを用いて４５秒間混合することにより、ＮＨＳ反応基を含む脂質ベースのマイクロバブルを形成した。
【0047】
４．ナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）の形成
（１）実施例１の１で形成されたナノ粒子をリポソーム溶液（実施例１の２で形成されたリポソームがＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合されて形成）に入れた後、ＮＨＳ－アミン反応を誘導するためにＲＴで２時間以上反応させた後（このとき、リポソーム－ナノ粒子複合体（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ＮＰｓ）が形成される）、超音波機器を用いて２Ｗ、１ＭＨＺ、デューティ比（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）１００％の条件で５分以上機械的な力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えた。その後、破砕されたリポソームが脂質構造体を十分に形成することができるように、１時間以上ＲＴでインキュベートしてナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。
（１）実施例１の１で形成されたナノ粒子をリポソーム溶液（実施例１の２で形成されたリポソームがＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合されて形成）に入れた後、ＮＨＳ－アミン反応を誘導するためにＲＴで２時間以上反応させた後（このとき、リポソーム－ナノ粒子複合体（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ＮＰｓ）が形成される）、超音波機器を用いて２Ｗ、１ＭＨＺ、デューティ比（ｄｕｔｙ ｃｙｃｌｅ）１００％の条件で５分以上機械的な力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えた。その後、破砕されたリポソームが脂質構造体を十分に形成することができるように、１時間以上ＲＴでインキュベートしてナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。
【0048】
（２）リポソームの代わりに、実施例１の３で形成されたマイクロバブルを用いた以外は、他の条件を実施例１の４の（１）と同様にしてナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰ）を形成した。
【0049】
（３）ＤＳＰＣとＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００の混合比率を異にするか、或いはＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００の代わりにＤＳＰＥ－ＰＥＧを使用した以外は、他の条件を実施例１の４の（２）と同様にして、ナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。ＤＳＰＣとＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００の混合比率は、それぞれ９．７５：０．２５、９．５：０．５、９：１、８：２、７：３とし、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００の代わりにＤＳＰＥ―ＰＥＧを用いて製造されたナノ粒子複合体は、下記の図面においてＮＨＳ Ｘと表記した。
【0050】
＜実施例２＞ウイルスナノ粒子複合体の製造
１．ウイルスナノ粒子の準備
ウイルスナノ粒子として、ＡＡＶ２－ＧＦＰ（ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、１×１０１３ＧＣ／ｍｌ、２０μｌ）粒子（ＡＡＶ）を用いた。
１．ウイルスナノ粒子の準備
ウイルスナノ粒子として、ＡＡＶ２－ＧＦＰ（ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、１×１０１３ＧＣ／ｍｌ、２０μｌ）粒子（ＡＡＶ）を用いた。
【0051】
２．リピドーム（脂質を用いたバブル）の準備
脂質ＤＳＰＣ（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）とＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ（１，２－Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－［ｓｕｃｃｉｎｙｌ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－２０００］）を９．５：０．５のモル比で混合した後、１ｍｇ／ｖｉａｌとなるようにクロロホルムに溶かし、窒素ガスを用いてクロロホルムを蒸発させた。その後、乾燥したりん脂質の濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳを入れ、５５℃以上のＤ．Ｗに５秒間浸漬した後、バスソニケーターを用いて３０秒間乾燥したリン脂質を水溶液上に分散させた。上記の過程を３回程度繰り返し行ってリン脂質を水溶液上に完全に分散させた後、Ｃ３Ｆ８ガスをバイアルにいっぱい充填し、バイアルミキサーを用いて４５秒間振とうして脂質ベースのマイクロバブルを形成した。
脂質ＤＳＰＣ（１，２－ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）とＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ（１，２－Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ－Ｎ－［ｓｕｃｃｉｎｙｌ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－２０００］）を９．５：０．５のモル比で混合した後、１ｍｇ／ｖｉａｌとなるようにクロロホルムに溶かし、窒素ガスを用いてクロロホルムを蒸発させた。その後、乾燥したりん脂質の濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳを入れ、５５℃以上のＤ．Ｗに５秒間浸漬した後、バスソニケーターを用いて３０秒間乾燥したリン脂質を水溶液上に分散させた。上記の過程を３回程度繰り返し行ってリン脂質を水溶液上に完全に分散させた後、Ｃ３Ｆ８ガスをバイアルにいっぱい充填し、バイアルミキサーを用いて４５秒間振とうして脂質ベースのマイクロバブルを形成した。
【0052】
３．ナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＡＡＶ）の形成
実施例２の１で準備されたウイルスナノ粒子と、実施例２の２で準備されたマイクロバブルとを混合し、３時間以上常温で反応させた後、超音波（２．０Ｗ／ｃｍ２）を用いて３０秒間機械的な力を加えた。その後、破砕されたマイクロバブルが脂質構造体を十分に形成することができるように１時間以上常温で反応させ、ナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＡＡＶ）を形成した。
実施例２の１で準備されたウイルスナノ粒子と、実施例２の２で準備されたマイクロバブルとを混合し、３時間以上常温で反応させた後、超音波（２．０Ｗ／ｃｍ２）を用いて３０秒間機械的な力を加えた。その後、破砕されたマイクロバブルが脂質構造体を十分に形成することができるように１時間以上常温で反応させ、ナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＡＡＶ）を形成した。
【0053】
＜実施例３＞アルブミンとＲＮＡからなるナノ粒子複合体の製造
１．アルブミンとＲＮＡからなるナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）の準備
アルブミン（ヒト血清アルブミン）を０．１ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｗｉｔｈ ０．０１ｍＭ ＥＤＴＡに４０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、ｔｈｉｏｌ－ｍｏｄｉｆｙ ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ（５’ｍｏｄｉｆｉｅｄ）を入れ、アルブミンとｓｉＲＮＡとが混合された溶液が濁るまで１００％エタノールを１ｍＬ/ｍｉｎの速度で滴定した後、遮光下にエタノールを一晩蒸発させ、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、粒子化されていない物質をピペットを用いて除去し、ＰＢＳに再分散して３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、マイクロペレットを除いた上清（ｓｉＲＮＡとアルブミンからなるナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ））をピペットで得た。前記ｔｈｉｏｌ－ｍｏｄｉｆｙ ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘのセンス鎖は、５’－ＡＵＧＵＧＡＡＵＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴ－３’（配列番号：１）であり、アンチセンス鎖は、５’－ｔｈｉｏｌ－ＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＵＴＴ－３’（配列番号：２）である。
１．アルブミンとＲＮＡからなるナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）の準備
アルブミン（ヒト血清アルブミン）を０．１ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｗｉｔｈ ０．０１ｍＭ ＥＤＴＡに４０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、ｔｈｉｏｌ－ｍｏｄｉｆｙ ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘ（５’ｍｏｄｉｆｉｅｄ）を入れ、アルブミンとｓｉＲＮＡとが混合された溶液が濁るまで１００％エタノールを１ｍＬ/ｍｉｎの速度で滴定した後、遮光下にエタノールを一晩蒸発させ、１３２００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、粒子化されていない物質をピペットを用いて除去し、ＰＢＳに再分散して３０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で遠心分離を行った後、マイクロペレットを除いた上清（ｓｉＲＮＡとアルブミンからなるナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ））をピペットで得た。前記ｔｈｉｏｌ－ｍｏｄｉｆｙ ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ ｄｕｐｌｅｘのセンス鎖は、５’－ＡＵＧＵＧＡＡＵＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴ－３’（配列番号：１）であり、アンチセンス鎖は、５’－ｔｈｉｏｌ－ＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＵＴＴ－３’（配列番号：２）である。
【0054】
２．ナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）の形成
実施例３の１で形成されたＲＮＡとアルブミンからなるナノ粒子をバブル溶液（実施例１の３で形成されたバブルがＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合されて形成）に入れた後、ＲＴで２時間以上反応させた後、超音波機器を用いて２Ｗ、１ＭＨＺ、デューティ比１００％の条件で５分以上機械的な力を加えた。その後、破砕されたバブルが脂質構造体を十分に形成することができるように、１時間以上ＲＴでインキュベートしてｓｉＲＮＡとアルブミンからなるナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。
実施例３の１で形成されたＲＮＡとアルブミンからなるナノ粒子をバブル溶液（実施例１の３で形成されたバブルがＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合されて形成）に入れた後、ＲＴで２時間以上反応させた後、超音波機器を用いて２Ｗ、１ＭＨＺ、デューティ比１００％の条件で５分以上機械的な力を加えた。その後、破砕されたバブルが脂質構造体を十分に形成することができるように、１時間以上ＲＴでインキュベートしてｓｉＲＮＡとアルブミンからなるナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。
【0055】
＜実施例４＞陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子複合体の製造
１．陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）の準備
マウスの血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｅｒ Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ））のセンス鎖は、５’－ＡＵＧＵＧＡＡＵＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴ－３’（配列番号：１）であり、アンチセンス鎖は、５’－ＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡ ＣＡＵＴＴ－３’（配列番号：２）である。前記センス鎖及びアンチセンス鎖をエンコードした長い線状の一本鎖ＤＮＡを製造した。ライゲーションされた円形のＤＮＡテンプレートをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのように３７℃で２０時間反応バッファー（８ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．４ｍＭ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ａｎｄ ２ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）で培養した。生成された溶液を複数回ピペッティングし、５分間超音波処理して粒子を分解した。溶液を４℃の条件下に１３，２００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去した。その後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加して粒子を洗浄した。溶液を１分間再び超音波処理し、遠心分離した。洗浄ステップをさらに３回繰り返してＲＣＴ試薬を除去することにより、ＲＮＡ－ｍｉｃｒｏｓｐｏｎｇｅ（ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を得た。前記ｓｉＲＮＡ ｈｙｄｒｏｇｅｌをバスソニケーター（ｂａｔｈ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）に１分以上入れて凝集なく解砕した後、ミニセントリフュージ（ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）で、壁面に飛び散ったものがダウン（ｄｏｗｎ）される程度に数秒回した後、前記ｓｉＲＮＡ ｈｙｄｒｏｇｅｌ３μｌとｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ１２μｌとを混合して第１溶液を形成し、１ｍｇ／ｍｌ ｂＰＥＩ１μｌとｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ９μｌとを混合して第２溶液を形成した後、第１溶液と第２溶液を１０分間常温で反応させ、１ｍｇ／ｍｌ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｎｅを５μｌゆっくりと入れた後、１０分間常温で反応させ、しかる後に、ソニケーションで凝集粒子を解砕することにより、陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）を得た。前記陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子の製造は、本発明者の先行特許（ＫＲ１０－１８８０７９０）を参照した。
１．陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）の準備
マウスの血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｅｒ Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ））のセンス鎖は、５’－ＡＵＧＵＧＡＡＵＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴ－３’（配列番号：１）であり、アンチセンス鎖は、５’－ＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡ ＣＡＵＴＴ－３’（配列番号：２）である。前記センス鎖及びアンチセンス鎖をエンコードした長い線状の一本鎖ＤＮＡを製造した。ライゲーションされた円形のＤＮＡテンプレートをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのように３７℃で２０時間反応バッファー（８ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．４ｍＭ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ａｎｄ ２ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）で培養した。生成された溶液を複数回ピペッティングし、５分間超音波処理して粒子を分解した。溶液を４℃の条件下に１３，２００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上清を除去した。その後、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加して粒子を洗浄した。溶液を１分間再び超音波処理し、遠心分離した。洗浄ステップをさらに３回繰り返してＲＣＴ試薬を除去することにより、ＲＮＡ－ｍｉｃｒｏｓｐｏｎｇｅ（ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ｓｉＲＮＡ ｈｙｄｒｏｇｅｌ）を得た。前記ｓｉＲＮＡ ｈｙｄｒｏｇｅｌをバスソニケーター（ｂａｔｈ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）に１分以上入れて凝集なく解砕した後、ミニセントリフュージ（ｍｉｎｉ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）で、壁面に飛び散ったものがダウン（ｄｏｗｎ）される程度に数秒回した後、前記ｓｉＲＮＡ ｈｙｄｒｏｇｅｌ３μｌとｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ１２μｌとを混合して第１溶液を形成し、１ｍｇ／ｍｌ ｂＰＥＩ１μｌとｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ９μｌとを混合して第２溶液を形成した後、第１溶液と第２溶液を１０分間常温で反応させ、１ｍｇ／ｍｌ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｉｎｅを５μｌゆっくりと入れた後、１０分間常温で反応させ、しかる後に、ソニケーションで凝集粒子を解砕することにより、陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）を得た。前記陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子の製造は、本発明者の先行特許（ＫＲ１０－１８８０７９０）を参照した。
【0056】
２．ナノ粒子複合体（Ｌｉｐｉｄ－ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ（ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ））の形成
実施例４の１で形成された陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子をバブル溶液（実施例１の３で形成されたバブルがＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合されて形成）に入れ、ＲＴで２時間以上反応させた後、超音波機器を用いて２Ｗ、１ＭＨＺ、デューティ比１００％の条件で５分以上機械的な力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えた。その後、破砕されたバブルが脂質構造体を十分に形成することができるように、１時間以上ＲＴでインキュベートして、陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｌｉｐｉｄ－ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ（ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。
実施例４の１で形成された陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子をバブル溶液（実施例１の３で形成されたバブルがＰＢＳに１ｍｇ／ｍｌの濃度で混合されて形成）に入れ、ＲＴで２時間以上反応させた後、超音波機器を用いて２Ｗ、１ＭＨＺ、デューティ比１００％の条件で５分以上機械的な力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ）を加えた。その後、破砕されたバブルが脂質構造体を十分に形成することができるように、１時間以上ＲＴでインキュベートして、陽イオン性高分子とヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体（Ｌｉｐｉｄ－ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ（ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）を形成した。
【0057】
＜実施例５＞様々な種類の脂質と官能基を用いたナノ粒子複合体の製造
１．ＤＳＰＣの代わりに、ＤＰＰＣ（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＥ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ｃｉｓ－ＰＣ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）を使用し、第２反応基が結合していない脂質（ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ｃｉｓ－ＰＣ）と第２反応基が結合した脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００）との混合比率を９．５：０．５のモル比とした以外は、他の条件を実施例１の４の（２）と同様にして、ナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体を形成した。
１．ＤＳＰＣの代わりに、ＤＰＰＣ（１，２－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＤＯＰＥ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、ｃｉｓ－ＰＣ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌ－ｓｎ－ｇｌｙｃｅｒｏ－３－ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）を使用し、第２反応基が結合していない脂質（ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ｃｉｓ－ＰＣ）と第２反応基が結合した脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００）との混合比率を９．５：０．５のモル比とした以外は、他の条件を実施例１の４の（２）と同様にして、ナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体を形成した。
【0058】
２．ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００の代わりに、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＳＨ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－Ａｍｉｎｅを使用し、第２反応基が結合していない脂質（ＤＳＰＣ）と第２反応基が結合した脂質（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＳＨ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－Ａｍｉｎｅ）との混合比率を９．５：０．５のモル比とした以外は、他の条件を実施例１の４の（２）と同様にして、ナノ粒子の外表面の一部分に脂質構造体が結合したナノ粒子複合体を形成した。
【0059】
＜実施例６＞ナノ粒子複合体の特性確認
１．実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）をＴＥＭで測定し、その結果を図２に示した。実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体及び脂質構造体をＣｒｙｏ－ＴＥＭで測定し、その結果をそれぞれ図３及び図４に示した。実施例１の４の（３）で形成したナノ粒子複合体をＣｒｙｏ－ＴＥＭで測定し、その結果をそれぞれ図５に示した（但し、ＤＳＰＣとＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００との混合比率がそれぞれ９．７５：０．２５、９．５：０．５、９：１、８：２であるナノ粒子複合体に対してのみ測定する）。実施例２の１で準備したウイルスナノ粒子をＴＥＭで測定し、その結果を図６に示した。実施例２の３で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＡＡＶ）をＣｒｙｏ－ＴＥＭで測定し、その結果を図７に示した。
１．実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）をＴＥＭで測定し、その結果を図２に示した。実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体及び脂質構造体をＣｒｙｏ－ＴＥＭで測定し、その結果をそれぞれ図３及び図４に示した。実施例１の４の（３）で形成したナノ粒子複合体をＣｒｙｏ－ＴＥＭで測定し、その結果をそれぞれ図５に示した（但し、ＤＳＰＣとＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００との混合比率がそれぞれ９．７５：０．２５、９．５：０．５、９：１、８：２であるナノ粒子複合体に対してのみ測定する）。実施例２の１で準備したウイルスナノ粒子をＴＥＭで測定し、その結果を図６に示した。実施例２の３で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＡＡＶ）をＣｒｙｏ－ＴＥＭで測定し、その結果を図７に示した。
【0060】
２．図２を参照すると、アルブミンナノ粒子の場合、表面が滑らかであることを確認することができるのに対し、アルブミンナノ粒子複合体は、脂質構造体がナノ粒子の表面に付いており、表面が滑らかでないことが分かる。また、図３を参照すると、ナノ粒子の表面にチューブ状の脂質構造体が付いていることが分かる。図４を参照すると、前記脂質構造体は、チューブ形状を有することをさらに明確にすることができる。また、図３及び図４を参照すると、前記脂質構造体が５０乃至３００ｎｍの長さ及び３乃至２０ｎｍの幅を有することが分かり、前記脂質構造体はナノ粒子の外表面に一つ以上が結合できることが分かる。また、図３及び図５を参照すると、ＤＳＰＣとＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳの比率に応じて脂質構造体の形成様相が変わることを確認することができ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳの量が増加するほど脂質構造体の長さが短くなり、ナノ粒子にも脂質構造体が少なく形成されることを確認することができる。図６を参照すると、ウイルスナノ粒子の場合、表面が滑らかであることを確認することができるのに対し、図７を参照すると、ウイルスナノ粒子の表面にチューブ状の脂質構造体が付いていることが分かる。
【0061】
＜実施例７＞ナノ粒子複合体の細胞取り込み効率の評価
１．実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）及び（３）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する細胞取り込み効率を評価するために、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いた分析結果を図８に示し、これを定量化した結果を表１に示し、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化してその結果を図９に示した。フローサイトメトリーを用いた分析は、Ａ５４９細胞（１×１０４）にＡｌｅｘａ ４８８蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理することにより行った。また、共焦点顕微鏡を用いた分析は、ＤＡＰＩを用いて核が染色され且つファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）を用いて細胞骨格（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）が染色されたＡ５４９細胞（１×１０５）に、Ｃｙ５．５蛍光色素が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理することにより行った。
１．実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）及び（３）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する細胞取り込み効率を評価するために、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いた分析結果を図８に示し、これを定量化した結果を表１に示し、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化してその結果を図９に示した。フローサイトメトリーを用いた分析は、Ａ５４９細胞（１×１０４）にＡｌｅｘａ ４８８蛍光色素（ｄｙｅ）が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理することにより行った。また、共焦点顕微鏡を用いた分析は、ＤＡＰＩを用いて核が染色され且つファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）を用いて細胞骨格（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）が染色されたＡ５４９細胞（１×１０５）に、Ｃｙ５．５蛍光色素が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理することにより行った。
【0062】
【表1】
【0063】
２．また、実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（１）で形成したリポソーム－ナノ粒子複合体（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ＮＰｓ）、ナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する細胞取り込み効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図１０に示す。共焦点顕微鏡を用いた分析は、ＤＡＰＩを用いて核が染色されたＡ５４９細胞（１×１０５）に、Ａｌｅｘａ ５５５蛍光色素が標識されたナノ粒子、リポソーム－ナノ粒子複合体、及びナノ粒子複合体を処理することにより行った。
【0064】
３．また、実施例２の１で準備したナノ粒子（ＡＡＶ）と実施例２の３で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＡＡＶ）に対する細胞取り込み効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図１１に示す。共焦点顕微鏡を用いた分析は、ＤＡＰＩを用いて核が染色されたＡＲＰＥ１９細胞（１×１０５）にウイルスナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理することにより行った。
【0065】
４．また、実施例４の１で準備したナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）と実施例４の２で形成したナノ粒子複合体（ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する細胞取り込み効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイマージ化し、その結果を図１２に示す。共焦点顕微鏡を用いた分析は、ＤＡＰＩを用いて核が染色され且つＦＩＴＣを用いて細胞骨格が染色されたＭＣＦ－７細胞（１×１０５）に、Ｃｙ３蛍光色素が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理することにより行った。
【0066】
５．また、Ａ５４９細胞（１×１０５）に、Ａｌｅｘａ ６４７蛍光色素が標識された実施例５の１及び２で形成したナノ粒子複合体を処理した後、蛍光強度を測定し、その結果を図１３及び図１４に示す。図１３においてＤＳＰＣと表記されたものは、ＤＳＰＣが使用されて製造されたナノ粒子複合体の結果を意味し、図１４においてチオールと表記されたものは、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＳＨが使用されて製造されたナノ粒子複合体の結果を意味する。
【0067】
６．図８及び表１を参照すると、ナノ粒子複合体がナノ粒子に比べて著しく優れた細胞取り込み効能を示すことが分かり、ＤＳＰＣとＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００の比率が９：１以上であるとき、Ａｌｅｘａ ４８８ ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞（染色されたナノ粒子を取り込んだ（ｕｐｔａｋｅ）細胞）の比率が対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて７８％以上であることを確認することができ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００の量がこれより増加すると、細胞内の取り込み（ｕｐｔａｋｅ）効率が著しく低下することを確認することができるため、脂質構造体がナノ粒子の表面に十分な長さ及び形状に形成されない場合、ナノ粒子の細胞取り込み効率が低下することが分かる。また、図９を参照すると、蛍光画像を用いた実験においても、図８及び表１の結果を確認することができる。また、図１０を参照すると、ナノ粒子複合体がナノ粒子やリポソーム－ナノ粒子複合体に比べて著しく優れた細胞取り込み効能を示すことを確認することができるので、ナノ粒子に脂質構造体が形成された場合、ナノ粒子にリポソームが単純に結合したものに比べて取り込み効率に優れることが分かり、脂質からなるバブルだけでなく、リポソーム又は他の脂質球状体の形でもナノ粒子複合体が形成できることが分かる。
【0068】
７．また、ＡＡＶ（Ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅ Ｖｉｒｕｓ）は、網膜組織内に治療用遺伝子または薬物を送達するベクターとして用いられ、他のベクターに比べて良好な効率を示すが、ＲＰＥ（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）までは送達されないが、図１１を参照すると、ナノ粒子複合体がナノ粒子に比べて著しく優れた取り込み効率を示すことが分かるので、脂質構造体がウイルスと細胞受容体との特異的反応を減少させることにより、ウイルストランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）率が増加し、ＲＰＥ層への送達率が増加することができることが分かる。また、図１２を参照すると、高分子とヒアルロン酸がコーティングされたＲＮＡナノ粒子を用いるナノ粒子複合体もナノ粒子に比べて著しく優れた細胞取り込み効率を示すことが分かる。図１３及び図１４を参照すると、様々な種類の脂質と様々な官能基を用いてナノ粒子複合体を製造しても、ナノ粒子複合体がナノ粒子に比べて著しく優れた細胞取り込み効率を示すことが分かる。
【0069】
＜実施例８＞ナノ粒子複合体が直接透過（ｄｉｒｅｃｔ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）で細胞内へ取り込まれることの確認
１．エンドサイトーシス阻害剤（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を処理した後のナノ粒子複合体の細胞取り込み効率の評価
（１）エンドサイトーシス阻害剤（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を処理した細胞に対して、実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）の細胞取り込み効率を評価した。サイズ２００ｎｍのナノ粒子は、マクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン依存性エンドサイトーシス（ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）の合計３つのメカニズムに細胞内摂取が行われることが知られているので、これを阻害する阻害剤を選定して、まず、Ａ５４９細胞（１×１０４）をそれぞれ又は同時に１時間処理した後、Ａｌｅｘａ ４８８蛍光色素が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を３時間処理し、フローサイトメトリーを用いて測定した。測定結果に対してナノ粒子を基準に標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）して図１５に示した。マクロピノサイトーシス阻害剤（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＥＩＰＡ（５－（Ｎ－Ｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）を選定（２５μｇ／ｍｌの濃度）してＮａ＋／Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅメカニズムを妨害し、クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＣＰＺ（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ）選定（２０μｇ／ｍｌの濃度）してｃｌａｔｈｒｉｎ－ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎを妨害し、クラスリン非依存性エンドサイトーシス阻害剤（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＭβＣＤ（ｍｅｔｈｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）を選定（３ｍｇ／ｍｌの濃度）してｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓを妨害した。また、上述のように、マクロピノサイトーシス阻害剤（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、クラスリン非依存性エンドサイトーシス阻害剤（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）をすべて処理したＡ５４９細胞（１×１０４）に、Ａｌｅｘａ ４８８蛍光色素が標識された実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と、実施例１の４の（２）及び（３）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）を導入した後、蛍光強度を測定することにより、その結果を図１６に示した。
１．エンドサイトーシス阻害剤（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を処理した後のナノ粒子複合体の細胞取り込み効率の評価
（１）エンドサイトーシス阻害剤（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を処理した細胞に対して、実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）の細胞取り込み効率を評価した。サイズ２００ｎｍのナノ粒子は、マクロピノサイトーシス（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン非依存性エンドサイトーシス（ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン依存性エンドサイトーシス（ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）の合計３つのメカニズムに細胞内摂取が行われることが知られているので、これを阻害する阻害剤を選定して、まず、Ａ５４９細胞（１×１０４）をそれぞれ又は同時に１時間処理した後、Ａｌｅｘａ ４８８蛍光色素が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を３時間処理し、フローサイトメトリーを用いて測定した。測定結果に対してナノ粒子を基準に標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）して図１５に示した。マクロピノサイトーシス阻害剤（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＥＩＰＡ（５－（Ｎ－Ｅｔｈｙｌ－Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｌｏｒｉｄｅ）を選定（２５μｇ／ｍｌの濃度）してＮａ＋／Ｈ＋ｅｘｃｈａｎｇｅメカニズムを妨害し、クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＣＰＺ（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ）選定（２０μｇ／ｍｌの濃度）してｃｌａｔｈｒｉｎ－ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎを妨害し、クラスリン非依存性エンドサイトーシス阻害剤（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）としては、ＭβＣＤ（ｍｅｔｈｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）を選定（３ｍｇ／ｍｌの濃度）してｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓを妨害した。また、上述のように、マクロピノサイトーシス阻害剤（Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、クラスリン依存性エンドサイトーシス阻害剤（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、クラスリン非依存性エンドサイトーシス阻害剤（Ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）をすべて処理したＡ５４９細胞（１×１０４）に、Ａｌｅｘａ ４８８蛍光色素が標識された実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と、実施例１の４の（２）及び（３）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）を導入した後、蛍光強度を測定することにより、その結果を図１６に示した。
【0070】
（２）図１５を参照すると、ナノ粒子の場合（ＮＰｓ）は、ＣＰＺ、ＥＩＰＡ阻害剤により細胞取り込み効能が大きく減少することを確認することができ、３種類の阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を全て処理してエンドサイトーシスメカニズムを全て妨害したときにナノ粒子の細胞摂取が殆ど行われないことが分かり、ナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）の場合、ナノ粒子と比較して３５０％程度さらに優れた細胞取り込み効能を示すことを確認することができ、３種類の阻害剤でエンドサイトーシスメカニズムをすべて妨害したときにも、ナノ粒子よりも優れた細胞取り込み効能を示すことを観察することができる。これにより、ナノ粒子複合体は、エンドサイトーシスを引き起こすだけでなく、細胞膜を直接透過（ｄｉｒｅｃｔ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を介して直接貫通することを確認することができる。また、図１６を参照すると、ＤＳＰＣとＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００を８：２、７：３の比率で混合して製造されたナノ粒子複合体の場合は、３種類の阻害剤を全て処理すると、細胞取り込み（ｕｐｔａｋｅ）効能が著しく低下することが分かるのに対し、ＤＳＰＣとＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨＳ２０００を９：１以上の比率で混合して製造されたナノ粒子複合体の場合は、３種類の阻害剤をすべて処理してエンドサイトーシスメカニズムをすべて妨害したにも拘らず、細胞取り込み効能に優れることを確認することができるので、脂質構造体がナノ粒子に十分な長さと個数で形成された場合、ナノ粒子がエンドサイトーシスメカニズムではなく、トランスロケーション（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）などの直接透過（ｄｉｒｅｃｔ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を介して細胞内に取り込まれることが分かる。
【0071】
２．ＨＡブロッキング後のナノ粒子複合体の細胞取り込み効率の評価
（１）実施例４の１で形成されたナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）は、最外殻がＨＡでコーティングされており、ＣＤ４４レセプターを用いて細胞内に入るので、予めＭＣＦ－７細胞にＨＡを過量で処理してＣＤ４４レセプターを全てブロックした後、実施例４の１で形成したナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）と実施例４の２で形成したナノ粒子複合体（ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）を処理した後、共焦点顕微鏡を用いて分析し、その結果を図１７に示す。共焦点顕微鏡を用いた分析は、ＤＡＰＩを用いて核が染色され且つＦＩＴＣを用いて細胞骨格が染色されたＭＣＦ－７細胞（１×１０５）に対してＨＡを過量で処理した後、Ｃｙ３蛍光色素が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理することにより行った。
（１）実施例４の１で形成されたナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）は、最外殻がＨＡでコーティングされており、ＣＤ４４レセプターを用いて細胞内に入るので、予めＭＣＦ－７細胞にＨＡを過量で処理してＣＤ４４レセプターを全てブロックした後、実施例４の１で形成したナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）と実施例４の２で形成したナノ粒子複合体（ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）を処理した後、共焦点顕微鏡を用いて分析し、その結果を図１７に示す。共焦点顕微鏡を用いた分析は、ＤＡＰＩを用いて核が染色され且つＦＩＴＣを用いて細胞骨格が染色されたＭＣＦ－７細胞（１×１０５）に対してＨＡを過量で処理した後、Ｃｙ３蛍光色素が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理することにより行った。
【0072】
（２）図１７を参照すると、細胞をＨＡでブロックしたので、ナノ粒子の場合は、低い効率で取り込まれたが、ナノ粒子複合体の場合は、ＣＤ４４レセプターがブロックされたにも拘らず、細胞内の取り込み効率に優れることが分かるので、ナノ粒子複合体がエンドサイトーシスまたはレセプターバインディング（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ）の他にも、直接透過（ｄｉｒｅｃｔ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を介して細胞内に取り込まれることが分かる。
【0073】
＜実施例９＞ナノ粒子複合体の抗がん剤送達体としての効能評価
１．アルブミン溶液にドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）が混合された溶液を添加して反応させた後、混合溶液が濁るまでエタノール滴定を行った以外は、実施例１の１及び実施例１の４の（２）と同様にして、ドキソルビシン含有ナノ粒子、ドキソルビシンナノ粒子複合体を形成し、抗がん抵抗性を有する乳がん細胞株ＭＣＦ－７／ＡＤＲをウェルプレートにシードし、それぞれドキソルビシン（１００ｍＭ、ＤＯＸ）ドキソルビシン含有ナノ粒子（１００ｍＭのドキソルビシンを含む）及びドキソルビシン含有ナノ粒子複合体（１００ｍＭのドキソルビシンを含む）を含む培地をもって３７℃で６時間培養した後、前記細胞株をノーマル培地（ｎｏｒｍａｌ ｍｅｄｉａ）をもって４８時間培養して細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定し、その結果を図１８に示す。細胞生存率の測定には、ＭＴＴアッセイ及びトリパンブルー色素排除法（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いるが、細胞生存率は、０．４％トリパンブルー色素を有する細胞を培養し、ノイバウアー血球計（Ｎｅｕａｕｅｒ ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で計数することにより決定される。ＭＴＴアッセイで９６ウェルプレートと１．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）が使用され、１５μｌのＭＴＴ試薬をもって２時間培養した後、２００μｌのＤＭＳＯが各ウェルに追加され、Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓは、プレートリーダー（Ｂｉｏ Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）によって５７０ｎｍで測定した。
１．アルブミン溶液にドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）が混合された溶液を添加して反応させた後、混合溶液が濁るまでエタノール滴定を行った以外は、実施例１の１及び実施例１の４の（２）と同様にして、ドキソルビシン含有ナノ粒子、ドキソルビシンナノ粒子複合体を形成し、抗がん抵抗性を有する乳がん細胞株ＭＣＦ－７／ＡＤＲをウェルプレートにシードし、それぞれドキソルビシン（１００ｍＭ、ＤＯＸ）ドキソルビシン含有ナノ粒子（１００ｍＭのドキソルビシンを含む）及びドキソルビシン含有ナノ粒子複合体（１００ｍＭのドキソルビシンを含む）を含む培地をもって３７℃で６時間培養した後、前記細胞株をノーマル培地（ｎｏｒｍａｌ ｍｅｄｉａ）をもって４８時間培養して細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定し、その結果を図１８に示す。細胞生存率の測定には、ＭＴＴアッセイ及びトリパンブルー色素排除法（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いるが、細胞生存率は、０．４％トリパンブルー色素を有する細胞を培養し、ノイバウアー血球計（Ｎｅｕａｕｅｒ ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で計数することにより決定される。ＭＴＴアッセイで９６ウェルプレートと１．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）が使用され、１５μｌのＭＴＴ試薬をもって２時間培養した後、２００μｌのＤＭＳＯが各ウェルに追加され、Ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｓは、プレートリーダー（Ｂｉｏ Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）によって５７０ｎｍで測定した。
【0074】
２．図１８を参照すると、同濃度のドキソルビシンを乳がん細胞に処理したとき、ナノ粒子複合体を用いる場合、一般がん細胞だけでなく、抗がん剤に対する抗がん抵抗性を有する細胞においても抗がん剤による細胞死滅効果を増加させることができることを分かる。
【0075】
＜実施例１０＞ナノ粒子複合体の誘電体薬物送達体としての評価
１．実施例３の１及び２で形成されたナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）及びナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する遺伝子サイレンシング（Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を確認して、図１９及び図２０に示す。また、実施例４の１及び２で形成されたナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）及びナノ粒子複合体（ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する遺伝子サイレンシング（Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を確認して、図２１及び図２２に示す。遺伝子サイレンシングの確認は、ＭＣＦ－７細胞（１×１０５）にナノ粒子、ナノ粒子複合体をそれぞれ３時間処理し、２４時間培養した後にｍＲＮＡを抽出した。同様の方法で細胞に対するＰＣＲを行った。ＰＣＲ ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙにおいて、遺伝子バンド（ｇｅｎｅ ｂａｎｄｓ）は、ＧｅｌＲｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓｔａｉｎで染色され、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅによって視覚化される。図２０及び図２２の場合、遺伝子バンドの強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をＩｍａｇｅＰｒｏを用いて相対的に定量化した値を示した。
１．実施例３の１及び２で形成されたナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）及びナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する遺伝子サイレンシング（Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を確認して、図１９及び図２０に示す。また、実施例４の１及び２で形成されたナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）及びナノ粒子複合体（ｓｉＲＮＡ ＬＴ－ＮＰｓ）に対する遺伝子サイレンシング（Ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）を確認して、図２１及び図２２に示す。遺伝子サイレンシングの確認は、ＭＣＦ－７細胞（１×１０５）にナノ粒子、ナノ粒子複合体をそれぞれ３時間処理し、２４時間培養した後にｍＲＮＡを抽出した。同様の方法で細胞に対するＰＣＲを行った。ＰＣＲ ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙにおいて、遺伝子バンド（ｇｅｎｅ ｂａｎｄｓ）は、ＧｅｌＲｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓｔａｉｎで染色され、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅによって視覚化される。図２０及び図２２の場合、遺伝子バンドの強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をＩｍａｇｅＰｒｏを用いて相対的に定量化した値を示した。
【0076】
２．図１９及び図２０を参照すると、アルブミンとＲＮＡからなるナノ粒子よりもナノ粒子複合体を使用したとき、一層優れた遺伝子サイレンシング（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）効率を示すことを確認することができるため、ナノ粒子複合体が誘電体薬物送達体として効果的に使用できることが分かる。また、図２１及び図２２を参照すると、高分子及びヒアルロン酸が順次コーティングされたＲＮＡナノ粒子においても、上記の結果を得ることができることが分かる。
【0077】
＜実施例１１＞腫瘍細胞スフェロイド（Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）における効能評価
１．腫瘍細胞スフェロイド（Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）は、一般なａｄｈｅｒｅｎｔがん細胞とは異なり、３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅを用いて増殖し、このようなスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）は、がん細胞が培地上でフロート（ｆｌｏａｔｉｎｇ）して成長するため、集まって成長する。集まって成長した形態ががん組織のＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）をミミック（ｍｉｍｉｃ）するという研究結果があるため、脂質表面改質による組織透過（ｔｉｓｓｕｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）の如何をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認するためにこのモデルで実験を行った。
１．腫瘍細胞スフェロイド（Ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）は、一般なａｄｈｅｒｅｎｔがん細胞とは異なり、３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅを用いて増殖し、このようなスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）は、がん細胞が培地上でフロート（ｆｌｏａｔｉｎｇ）して成長するため、集まって成長する。集まって成長した形態ががん組織のＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）をミミック（ｍｉｍｉｃ）するという研究結果があるため、脂質表面改質による組織透過（ｔｉｓｓｕｅ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）の如何をｉｎ ｖｉｔｒｏで確認するためにこのモデルで実験を行った。
【0078】
２．スフェロイド細胞形成
Ｐｏｌｙ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）１０ｇを１Ｌの１００％純粋エタノール（１００％ ｐｕｒｅ ｅｔｈａｎｏｌ）に添加して６０℃で溶かした後、溶かしたポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）を１００ｐｈｉ基準３．３ｍｌだけプレート全体に均一に分散させた後、２４時間乾燥させてコーティングを行い、上記で準備されたプレートにＭＣＦ７細胞をシードし、５日間維持してスフェロイドを形成した細胞を得た。
Ｐｏｌｙ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）１０ｇを１Ｌの１００％純粋エタノール（１００％ ｐｕｒｅ ｅｔｈａｎｏｌ）に添加して６０℃で溶かした後、溶かしたポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）を１００ｐｈｉ基準３．３ｍｌだけプレート全体に均一に分散させた後、２４時間乾燥させてコーティングを行い、上記で準備されたプレートにＭＣＦ７細胞をシードし、５日間維持してスフェロイドを形成した細胞を得た。
【0079】
３．スフェロイド細胞へのナノ粒子複合体の処理
（１）実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）に対するスフェロイド細胞取り込み効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図２３に示す。ＤＡＰＩを用いて核が染色された実施例１１の２で形成されたスフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状のＭＣＦ－７細胞（１×１０５）に、Ａｌｅｘａ ５５５蛍光色素が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理した後、３時間が経過した時点で共焦点顕微鏡を用いて測定した。
（１）実施例１の１で形成したナノ粒子（ＮＰｓ）と実施例１の４の（２）で形成したナノ粒子複合体（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＬＴ－ＮＰｓ）に対するスフェロイド細胞取り込み効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図２３に示す。ＤＡＰＩを用いて核が染色された実施例１１の２で形成されたスフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状のＭＣＦ－７細胞（１×１０５）に、Ａｌｅｘａ ５５５蛍光色素が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理した後、３時間が経過した時点で共焦点顕微鏡を用いて測定した。
【0080】
（２）また、実施例４の１で形成したナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）と実施例４の２で形成したナノ粒子複合体（Ｌｉｐｉｄ ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）に対するスフェロイド細胞取り込み効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図２４に示す。ＤＡＰＩを用いて核が染色され且つＡｌｅｘａ ４８８を用いて細胞骨格が染色された実施例１１の２で形成されたスフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状ＭＣＦ－７細胞（１×１０５）に、Ｃｙ３蛍光色素が標識されたナノ粒子及びナノ粒子複合体を処理し、３時間、６時間が経過した時点で共焦点顕微鏡を用いて測定した。
【0081】
（３）また、実施例４の１で形成したナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）と実施例４の２で形成したナノ粒子複合体（Ｌｉｐｉｄ－ｓｉＲＮＡ ＮＰ）に対するスフェロイド（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ）細胞遺伝子サイレンシング（Ｇｅｎｅ ｓｅｌｌｅｎｇｉｎｇ）を確認し、図２５及び図２６に示す。遺伝子サイレンシングの確認は、スフェロイド状ＭＣＦ－７細胞（１×１０５）にナノ粒子、ナノ粒子複合体をそれぞれ３時間処理し、２４時間培養した後にｍＲＮＡを抽出した。同様の方法で細胞に対するＰＣＲを行った。ＰＣＲ ｇｅｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ａｓｓａｙにおいて、遺伝子バンドは、ＧｅｌＲｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｓｔａｉｎで染色され、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅによって視覚化される。図２６は、遺伝子バンドの強度をＩｍａｇｅＰｒｏを用いて相対的に定量化した値を示した。
【0082】
（４）図２３乃至図２６を参照すると、ナノ粒子複合体がナノ粒子に比べて細胞取り込み効率に優れることを確認することができ、これにより、単純ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境だけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏをミミック（ｍｉｍｉｃ）した環境でもナノ粒子複合体の取り込み効率に優れることを確認することができるので、ナノ粒子複合体は組織で優れた透過（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）効率を有することが分かる。
【0083】
＜実施例１２＞動物モデルにおけるナノ粒子複合体の細胞取り込み効率の評価
１．実施例４の１で形成したナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）と実施例４の２で形成したナノ粒子複合体（Ｌｉｐｉｄ ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）に対する動物モデルにおける細胞取り込み効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図２７に示す。前記動物モデル実験は、Ｃｙ５蛍光色素が標識されたナノ粒子とナノ粒子複合体をそれぞれ含む眼薬製剤５μｌを準備し、前記眼薬製剤をブラウンノーウェイラット（Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙ Ｒａｔ）の眼球に硝子体腔内注射で送達した。薬物を注入し、３０日後に眼球を摘出し、４％ＰＦＡで固定した後、２０％スクロースに３０分間浸し、しかる後に、眼球をスクロースから取り出してＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドに混ぜ、クリオモルド（Ｃｒｙｏｍｏｌｄ）にＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドを注いで凍らせた後、眼球組織をクリオモルド（Ｃｒｙｏｍｏｌｄ）から分離し、ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ機で切ってシワなく伸ばし、ＤＡＰＩ溶液を５分間反応させて組織の核を染色した後、共焦点顕微鏡を用いて測定した。
１．実施例４の１で形成したナノ粒子（ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）と実施例４の２で形成したナノ粒子複合体（Ｌｉｐｉｄ ｓｉＲＮＡ ＮＰｓ）に対する動物モデルにおける細胞取り込み効率を評価するために、共焦点顕微鏡を用いてイメージ化し、その結果を図２７に示す。前記動物モデル実験は、Ｃｙ５蛍光色素が標識されたナノ粒子とナノ粒子複合体をそれぞれ含む眼薬製剤５μｌを準備し、前記眼薬製剤をブラウンノーウェイラット（Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙ Ｒａｔ）の眼球に硝子体腔内注射で送達した。薬物を注入し、３０日後に眼球を摘出し、４％ＰＦＡで固定した後、２０％スクロースに３０分間浸し、しかる後に、眼球をスクロースから取り出してＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドに混ぜ、クリオモルド（Ｃｒｙｏｍｏｌｄ）にＯ．Ｃ．Ｔコンパウンドを注いで凍らせた後、眼球組織をクリオモルド（Ｃｒｙｏｍｏｌｄ）から分離し、ｃｒｙｏｓｅｃｔｉｏｎ機で切ってシワなく伸ばし、ＤＡＰＩ溶液を５分間反応させて組織の核を染色した後、共焦点顕微鏡を用いて測定した。
【0084】
２．図２７を参照すると、ナノ粒子複合体がナノ粒子よりも長い間眼球組織に滞留することが分かるため、ナノ粒子複合体は細胞取り込み効率に優れることが分かる。
以上、出願人は本発明の様々な実施例を説明したが、これらの実施例は本発明の技術的思想を実現する一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想を実現する限り、いかなる変更例又は修正例も本発明の範囲に属するものと解釈されるべきである。
以上、出願人は本発明の様々な実施例を説明したが、これらの実施例は本発明の技術的思想を実現する一実施例に過ぎず、本発明の技術的思想を実現する限り、いかなる変更例又は修正例も本発明の範囲に属するものと解釈されるべきである。
【符号の説明】
【0085】
１ ナノ粒子
２ 脂質構造体
２１ 脂質頭部
２２ 脂質尾部
２ 脂質構造体
２１ 脂質頭部
２２ 脂質尾部
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【国際調査報告】