▶ ザ クリーブランド クリニック ファウンデーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-21
(54)【発明の名称】背側前腸及び前方ドメイン内胚葉細胞の生成
(51)【国際特許分類】
C12N 5/073 20100101AFI20220713BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20220713BHJP
C12N 5/0735 20100101ALN20220713BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20220713BHJP
【ＦＩ】
C12N5/073
C12M1/00 C
C12N5/0735
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021568897
(86)(22)【出願日】2020-05-22
(85)【翻訳文提出日】2021-12-15
(86)【国際出願番号】 US2020034201
(87)【国際公開番号】W WO2020237141
(87)【国際公開日】2020-11-26
(31)【優先権主張番号】62/851,348
(32)【優先日】2019-05-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】595033056
【氏名又は名称】ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＣｌｉｎｉｃＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】９５００ Ｅｕｃｌｉｄ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ジェンセン，ジャン
(72)【発明者】
【氏名】ブーキス，マイケル エー．
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029BB11
4B029FA02
4B029GA02
4B029GB01
4B029GB02
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065BB19
4B065CA44
(57)【要約】
本明細書では、幹細胞を形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストに曝露することなく、多能性幹細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及び骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と接触させることによって、背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）細胞を生成するための組成物、システム、キット、及び方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＤＦＥ細胞を、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及びＦＧＦＲ経路阻害剤と接触させて、（例えば、背側同一性を有する）膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞を生成する。他の実施形態では、ＰＥ細胞をＡＬＫ５阻害剤及びＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させて、内分泌細胞（例えば、インスリン発現内分泌細胞）を生成する。ある特定の実施形態では、前方ドメイン内胚葉（ＡＤＥ）細胞を生成するための組成物、システム、キット、及び方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
背側前腸内胚葉細胞の生成方法であって、ａ）多能性幹細胞の集団を、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及び骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と接触させることと、
ｂ）背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）細胞の集団が生成されるように、前記多能性幹細胞の集団の少なくとも一部分を培養することと、を含み、
前記幹細胞が、前記培養中または前記接触中に形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストに曝露されない、前記方法。
【請求項2】
前記ＢＭＰ経路阻害剤が、ＢＭＰ４経路阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＢＭＰ経路阻害剤が、ＬＤＮ１９３３１８９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ＢＭＰ経路阻害剤が、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、ドルソモルフィン、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ２１４１１７、ＭＬ３４７、及びノギンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストが、ｉ）レチノイド化合物、ｉｉ）レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニスト、及びｉｉｉ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストが、レチノイン酸、Ｓｒ１１２３７、アダパレン、ＥＣ２３、９－シスレチノイン酸、１３－シスレチノイン酸、４－オキソレチノイン酸、及びオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記培養することが、１～５日間または２～４日間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
ｃ）前記ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部分を、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及びＦＧＦＲ経路阻害剤と接触させることと、ｄ）膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞の集団が生成されるように、前記ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部分を培養することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記ＤＦＥ細胞が、工程ｄ）における前記培養中または工程ｃ）における前記接触中に、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストに曝露されない、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
工程ｄ）における前記培養することが、１～５日間または２～４日間行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記ＰＥ細胞が、背側膵臓同一性を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記ＦＧＦＲ経路阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１、アルクチゲニン、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ１９８３０６、ＰＤ３３４５８１、ＳＬ３２７、Ｕ０１２６、ＭＥＫ阻害剤、ＦＧＦＲ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＭＥＫ１６２、ＧＳＫ１１２０２１２、ＰＤ３２５９０１、ＣＩ－１０４０、ＴＡＫ－７３３、セルメチニブ、及びＸＬ５１８からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項13】
工程ｃ）における前記接触させることが、前記ＤＦＥ細胞の集団をソニック・ヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（ＳＨＨ）経路阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項14】
ｅ）前記ＰＥ細胞の集団の少なくとも一部分を、Ｎｏｔｃｈ経路阻害剤及びＡＬＫ５阻害剤と接触させることと、ｆ）内分泌細胞の集団が生成されるように、前記ＰＥ細胞の集団の少なくとも一部分を培養することと、をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項15】
前記内分泌細胞が、インスリン発現細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記内分泌細胞が、胎児型β細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記Ｎｏｔｃｈ経路阻害剤が、ガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項18】
前記Ｎｏｔｃｈ経路阻害剤が、ＤＡＰＴ、ＭＲＫ－００３、ＭＲＫ－０７５２、ｚ－Ｉｌｅ－ｌｅｕ－ＣＨＯ、ガンマセクレターゼ阻害剤、Ｌ－６８５，４８５、ＬＹ４１１５７５、化合物Ｅ、Ｆ－０３０８４０１４、ＲＯ４９２９０９７、ＢＭＳ－９０６０２４、Ｄａｐｔ、ＦＬＩ－０６、ＹＯ－０１０２７、ＬＹ４５０１３９、Ｅ２０１２、ＴＣ－Ｅ５００６、アバガセスタット（Ａｖａｇａｃｅｓｔａｔ）、ベガセススタット（Ｂｅｇａｃｅｓｔａｔ）、ＢＭＳ２９９８９７、化合物Ｅ、化合物Ｗ、ＤＢＺ、フルリザン、ＪＬＫ６、Ｌ－６８５，４５８、ＭＲＫ５６０、及びＰＦ３０８４０１４からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項19】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、Ａ８３０１を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項20】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、Ａ７７０１、Ａ８３－０１、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ４３１５４２、アラントラクトン、ＬＹ２１５７２９９、ＲｅｐＳｏｘ、Ｒ２６８７１２、ＳＭ１６、ＩＮ１１３０、ＢＩ４６５９、ＳＤ－２０８、ＧＷ７８８３８８、ＴＰ０４２７７３６ＨＣＬ、ＴＥＷ－７１９７、ＤＭＨ１、ＬＤＮ２１２８５４、Ｄ４４７６、及びＳＢ５２５３３４からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項21】
工程ｆ）における前記培養することが、５～１５日間行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項22】
前記内分泌細胞を対象に移植することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項23】
ｃ）前記ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部分をＥＧＦと接触させることと、ｄ）胃内胚葉（ＳＥ）細胞の集団が生成されるように、前記ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部分を培養することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
ｃ）前記ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部分をＢＭＰ経路アゴニストまたはＢＭＰ４と接触させることと、ｄ）肝臓内胚葉（ＬＥ）細胞の集団が生成されるように、前記ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部分を培養することと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
細胞を含む組成物であって、前記細胞が、ｉ）外因性レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストと、
ｉｉ）外因性骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と、を含み、
前記細胞が、ｉ）任意の外因性形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストを含まず、かつｉｉ）多能性幹細胞または背側前腸内胚葉細胞である、前記組成物。
【請求項26】
前記外因性ＢＭＰ経路阻害剤が、ＬＤＮ１９３３１８９を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項27】
前記外因性ＢＭＰ経路阻害剤が、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、ドルソモルフィン、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ２１４１１７、ＭＬ３４７、ノギン、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＤＮ２１２８５４、及びホリスタチンからなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項28】
前記外因性レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストが、ｉ）レチノイド化合物、ｉｉ）レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニスト、及びｉｉｉ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストからなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項29】
前記レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストが、レチノイン酸、Ｓｒ１１２３７、アダパレン、ＥＣ２３、９－シスレチノイン酸、１３－シスレチノイン酸、４－オキソレチノイン酸、及びオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）からなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項30】
前記細胞がＤＦＥ細胞であり、前記ＤＦＥ細胞が、外因性ＦＧＦＲ経路阻害剤をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項31】
前記ＦＧＦＲ経路阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１、アルクチゲニン、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ１９８３０６、ＰＤ３３４５８１、ＳＬ３２７、Ｕ０１２６、ＭＥＫ阻害剤、ＦＧＦＲ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＭＥＫ１６２、ＧＳＫ１１２０２１２、ＰＤ３２５９０１、ＣＩ－１０４０、ＴＡＫ－７３３、セルメチニブ、及びＸＬ５１８からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
細胞培養培地を含む組成物であって、前記細胞培養培地が、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト化合物と、
ｉｉ）骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と、を含み、
前記培養培地が、任意の形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストを含まないか、または検出可能に含まない、前記組成物。
【請求項33】
細胞の集団をさらに含み、前記細胞が、多能性幹細胞または背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）細胞である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項34】
前記細胞が、多能性幹細胞であり、前記レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及びＢＭＰ経路阻害剤が、前記培地中で少なくとも２日間培養したときに前記多能性幹細胞の少なくとも一部がＤＦＥになるようにする濃度で、前記培養培地中に存在する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
前記ＢＭＰ経路阻害剤が、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、ドルソモルフィン、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ２１４１１７、ＭＬ３４７、ノギン、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＤＮ２１２８５４、及びホリスタチンからなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項36】
前記レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストが、ｉ）レチノイド化合物、ｉｉ）レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニスト、及びｉｉｉ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストからなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項37】
前記レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストが、レチノイン酸、Ｓｒ１１２３７、アダパレン、ＥＣ２３、９－シスレチノイン酸、１３－シスレチノイン酸、４－オキソレチノイン酸、及びオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）からなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項38】
キットまたはシステムであって、ａ）細胞培養容器内に存在する多能性幹細胞の集団と、
ｂ）第１の容器内に存在するレチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト化合物と、
ｃ）第２の容器内に存在する骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と、を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなり、
前記細胞培養容器が、いかなる、またはいかなる検出可能な外因性形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストも含まず、かつ
前記キット及び前記システムが、前記第１の容器内または前記第２の容器内、もしくは第３の容器内に、いかなる形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストも含有しない、前記キットまたは前記システム。
【請求項39】
前記ＢＭＰ経路阻害剤が、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、ドルソモルフィン、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ２１４１１７、ＭＬ３４７、ノギン、ＬＤＮ１９３１８９、ＬＤＮ２１２８５４、及びホリスタチンからなる群から選択される、請求項３８に記載のキットまたはシステム。
【請求項40】
前記レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストが、ｉ）レチノイド化合物、ｉｉ）レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニスト、及びｉｉｉ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストからなる群から選択される、請求項３８に記載のキットまたはシステム。
【請求項41】
前記レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストが、レチノイン酸、Ｓｒ１１２３７、アダパレン、ＥＣ２３、９－シスレチノイン酸、１３－シスレチノイン酸、４－オキソレチノイン酸、及びオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）からなる群から選択される、請求項３８に記載のキットまたはシステム。
【請求項42】
前記培養容器内の培養培地をさらに含む、請求項３８に記載のキットまたはシステム。
【請求項43】
前方ドメイン内胚葉細胞の生成方法であって、ａ）多能性幹細胞の集団を、ｉ）Ｎｏｄａｌタンパク質及びＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰ経路アゴニスト、または前記Ｎｏｄａｌタンパク質及び前記ＢＭＰタンパク質をコードするベクター（複数可）、ならびにｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤に接触させることと、
ｂ）前方ドメイン内胚葉（ＡＤＥ）細胞の集団が生成されるように、前記多能性幹細胞の集団の少なくとも一部を培養することと、を含み、
前記多能性幹細胞が、前記培養中または前記接触中に、ｉ）ＢＭＰ阻害剤、及び／またはｉｉ）形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストに曝露されない、前記方法。
【請求項44】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、Ａ７７０１、Ａ－８３－０１、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ４３１５４２、アラントラクトン、及びＬＹ２１５７２９９からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記ＢＭＰタンパク質が、ＢＭＰ４タンパク質である、請求項４３に記載の方法。
【請求項46】
組成物であって、ａ）Ｎｏｄａｌタンパク質、または前記Ｎｏｄａｌタンパク質をコードするベクターと、
ｂ）ＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰ経路アゴニスト、またはタンパク質である場合、前記ＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰアゴニストをコードするベクターと、
ｃ）ＡＬＫ５阻害剤と、を含む、前記組成物。
【請求項47】
前記組成物が、ＢＭＰ阻害剤、及び／またはｉｉ）形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストを含まない、請求項４６に記載の組成物。
【請求項48】
細胞の集団をさらに含み、前記細胞が、多能性幹細胞または前方ドメイン内胚葉（ＡＤＥ）細胞である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項49】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、Ａ７７０１、Ａ－８３－０１、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ４３１５４２、アラントラクトン、及びＬＹ２１５７２９９からなる群から選択される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項50】
前記ＢＭＰタンパク質が、ＢＭＰ４タンパク質である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項51】
キットまたはシステムであって、ａ）細胞培養容器内に存在する細胞の集団と、
ｂ）第１の容器内に存在するＮｏｄａｌタンパク質または前記Ｎｏｄａｌタンパク質をコードするベクターと、
ｃ）第２の容器内に存在するＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰ経路アゴニスト、またはタンパク質である場合、前記ＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰアゴニストをコードするベクターと、
ｄ）第３の容器に存在するＡＬＫ５阻害剤と、を含むか、それらから本質的胃になるか、またはそれらからなる、前記キットまたは前記システム。
【請求項52】
前記細胞培養容器が、いかなる、またはいかなる検出可能な外因性ＢＭＰ阻害剤、及び／または外因性形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）を含まず、かつ前記キット及び前記システムが、前記第１の容器内、前記第２の容器内、前記第３の容器内、もしくは第４の容器内に、いかなる検出可能な外因性ＢＭＰ阻害剤も、及び／または外因性形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）も含有しない、請求項５１に記載のキットまたはシステム。
【請求項53】
前記細胞が、多能性幹細胞または前方ドメイン内胚葉（ＡＤＥ）細胞である、請求項５１に記載のキットまたはシステム。
【請求項54】
前記ＡＬＫ５阻害剤が、Ａ７７０１、Ａ－８３－０１、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ４３１５４２、アラントラクトン、及びＬＹ２１５７２９９からなる群から選択される、請求項５１に記載のキットまたはシステム。
【請求項55】
前記ＢＭＰタンパク質が、ＢＭＰ４タンパク質である、請求項５１に記載のキットまたはシステム。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【0001】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年５月２２日に出願された米国仮出願第６２／８５１，３４８号に対する優先権を主張する。
【技術分野】
【0002】
本明細書では、幹細胞を形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストに曝露することなく、多能性幹細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及び骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と接触させることによって、背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）細胞を生成するための組成物、システム、キット、及び方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＤＦＥ細胞を、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及びＦＧＦＲ経路阻害剤と接触させて、（例えば、背側同一性を有する）膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞を生成する。他の実施形態では、ＰＥ細胞をＡＬＫ５阻害剤及びＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させて、内分泌細胞（例えば、インスリン発現細胞）を生成する。ある特定の実施形態では、前方ドメイン内胚葉（ＡＤＥ）細胞を生成するための組成物、システム、キット、及び方法が提供される。
【背景技術】
【0003】
内胚葉は、肺、胃、膵臓、肝臓、及び腸などのほとんどの内臓系内の細胞の大部分を作り出す発生胚葉である。多能性細胞から内胚葉を誘導するためのほとんど全ての努力は、ＴＧＦβ経路アゴニスト、最も一般的にはアクチビンＡ（ＡＡ）を、インビトロ原腸形成イベントを通して多能性細胞を押し出すためのＮｏｄａｌ模倣物として使用することに依存してきた（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｇａｄｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。これにより、腸管（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、膵臓（Ｋｒｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｐａｇｌｉｕｃａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、及び肝臓（Ｓａｍｐａｚｉｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を含む複数の子孫運命の生成に使用することができる内胚葉集団がもたらされる。肺などのより前方の内胚葉運命の生成は、その後の段階でパターン化入力を提供することによって達成されている（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかしながら、最近の研究では、胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｅｎｄｏｄｅｒｍ）の初期パターン化は、その発生中に起こり得ると主張している（Ｍａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
【0004】
膵臓は、インスリン産生細胞の欠損を特徴とする糖尿病における細胞ベースの療法に特に興味深い。膵臓は、原腸管の背側及び腹側に生じる２つの空間的に異なる原基から形成され、その後融合する。両方の膵芽は、成人の膵臓の全ての系統を生成することができるが（Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９）、腸管の対向する側の膵臓ドメインの初期誘導は、異なる転写プログラムによって制御されている。マウスにおいて、腹側膵芽は、まず、膵臓及び肝臓の二分化能コンピテンスを有する内胚葉の領域からおよそ胎生８．５日（Ｅ８．５）に形成される（Ａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｄｅｕｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｔｒｅｍｂｌａｙ ａｎｄ Ｚａｒｅｔ，２００５）。この初期の腹側内胚葉部は、Ｐｄｘ１／Ｓｏｘ１７を一過性に共発現する前駆細胞集団で構成されており、これがＥ９．５までに分裂してそれぞれ腹側膵臓及び肝胆管外系を形成する（Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００９）。腹側膵臓の特異化は、遺伝子アブレーションモデルが背側膵芽形成に影響を及ぼすことなく完全な腹側非形成を示したＨＨｅｘ発現に依存する（Ｂｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）。対照的に、マウスにおける背側膵芽は、およそ胚生９．０日に出現し、外側尾状部から胃前庭部領域までを形成する。マウスを対象とした研究では、腹側器官形成に影響を及ぼさない背側膵臓特異性に関与する因子も同定されている。Ｍｎｘ１（Ｈｌｘｂ９）ノックアウトモデルは、腹側表現型を伴わずに背側非形成が生じることを示している（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。Ｍｎｘ１発現は、腹側部に観察されるが、Ｐｄｘ１発現に続いてのみ観察され、一方、背側部では、Ｍｎｘ１は、Ｐｄｘ１発現より先に起こる。Ｒａｌｄｈ２ノックアウトモデルは、背側芽におけるＰｄｘ１及びＰｒｏｘ１発現の喪失に起因する背側特異的非形成をもたらした（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｍｏｌｏｔｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００５）。さらに、ヒヨコにおける研究では、背側膵臓の初期芽形成が背側中腸内のＳＨＨの選択的阻害に依存していることが示されている（Ｈｅｂｒｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。マウスの系統が種間で保存されているかどうかは不明であるが、レーザーキャプチャーとその後のディープシーケンシング解析を使用した最近の研究では、ヒト発生中の腹側膵臓と背側膵臓との間のいくつかの根本的な違いが記載されている（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0005】
経路利用の差異と異なる細胞内性因子にもかかわらず、背側及び腹側の膵臓プログラムには多くの共通点がある。ＨＮＦ１β（Ｔｃｆ２）は、両方の膵芽における膵臓特異化に必要であり、膵臓発生を通して重要である。Ｔｃｆ２ノックアウトマウスは、腹側膵臓を生成することに失敗し、分化または増殖することができない大幅に低下した背側芽を有する（Ｈａｕｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＨＮＦ１βは、前膵臓前腸において発現され、遺伝子は、連続的な転写カスケードの頂点で機能し、Ｈｎｆ６（Ｏｃ１）、続いてＰｄｘ１の活性化をもたらす（Ｐｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＨＮＦ１βの条件付き不活性化は、Ｇｌｉｓ３及びＮｇｎ３発現の損失をもたらし、胆嚢管を特徴とする膵臓及び内分泌促進部の損失をもたらす（Ｄｅ Ｖａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ヒト発生において、ＨＮＦ１βの重要性は、ＨＮＦ１β遺伝子の変異に起因する病態である「若年発症成人型糖尿病型５」（ＭＯＤＹ５）症候群の発生によって強調される。ＨＮＦ１βのヘテロ接合変異は、マウス研究において表現型を示さないが、ヒトにおいて、ＨＮＦ１βのヘテロ接合変異は、ＭＯＤＹ５または完全な膵臓非形成と関連することが示されており、ヒト膵臓発生におけるＨＮＦ１βの役割がマウスよりも重要であることが示唆されている（Ｂｏｄｙ－Ｂｅｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
【発明の概要】
【0006】
本明細書では、幹細胞を形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストに曝露することなく、多能性幹細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及び骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と接触させることによって、背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）細胞を生成するための組成物、システム、キット、及び方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＤＦＥ細胞を、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及びＦＧＦＲ経路阻害剤と接触させて、（例えば、背側同一性を有する）膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞を生成する。他の実施形態では、ＰＥ細胞をＡＬＫ５阻害剤及びＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させて、内分泌細胞（例えば、インスリン発現内分泌細胞）を生成する。ある特定の実施形態では、前方ドメイン内胚葉（ＡＤＥ）細胞を生成するための組成物、システム、キット、及び方法が提供される。
【0007】
いくつかの実施形態では、本明細書において、ａ）多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣまたは胚性幹細胞）の集団を、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及び骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と接触させることと、ｂ）背側前腸内肺葉（ＤＦＥ）細胞の集団が生成されるように多能性幹細胞の集団の少なくとも一部を培養することであって、幹細胞が、培養中または接触中に形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストに曝露されない、培養することと、を含む、背側前腸内胚葉細胞の生成方法が提供される。
【0008】
ある特定の実施形態では、本明細書において、細胞を含む組成物であって、細胞が、ｉ）外因性レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストと、ｉｉ）外因性骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と、を含み、細胞が、ｉ）任意の外因性形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストを含まず、ｉｉ）多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣまたは胚性幹細胞）であるか、または背側前腸内胚葉細胞である、組成物が提供される。
【0009】
特定の実施形態では、本明細書において、細胞培養培地を含む組成物であって、細胞培養培地が、ｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト化合物と、ｉｉ）骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と、を含み、培養培地が、任意の外因性形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストを含まないか、または検出可能に含まない、組成物が提供される。特定の実施形態では、細胞培養培地は、適切なエネルギー源と、細胞周期を調節する化合物とを含む。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、増殖因子、ホルモン、及び接着因子の供給源として、アミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコース、及び血清のうちの大部分または全てを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞集団をさらに含み、細胞は、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣまたは胚性幹細胞）または背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）細胞である。他の実施形態では、細胞は多能性幹細胞であり、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及びＢＭＰ経路阻害剤は、培地中で少なくとも２日間培養したときに多能性幹細胞の少なくとも一部がＤＦＥになるようにする濃度で培養培地中に存在する。
【0010】
他の実施形態では、本明細書においてａ）細胞培養容器内に存在する多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣまたは胚性幹細胞）の集団、ｂ）第１の容器内に存在するレチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト化合物、及びｃ）第２の容器内に存在する骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるキット及びシステムが提供され、細胞培養容器は、いかなる、またはいかなる検出可能な外因性形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストも含まず、かつキット及びシステムは、第１の容器もしくは第２の容器内、または第３の容器内に任意の形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストを含有しない。さらなる実施形態では、キット及びシステムは、培養容器内に培養培地をさらに含む。
【0011】
他の実施形態では、ＢＭＰ経路阻害剤はＢＭＰ４経路阻害剤である。ある特定の実施形態では、ＢＭＰ経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９を含む。さらなる実施形態では、ＢＭＰ経路阻害剤は、ＤＭＨ１、ＤＭＨ２、ドルソモルフィン、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ２１４１１７、ＬＤＮ２１２８５４、ホリスタチン、ＭＬ３４７、ノギンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストは、ｉ）レチノイド化合物、ｉｉ）レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニスト、及びｉｉｉ）レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニストからなる群から選択される。特定の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニストは、レチノイン酸、Ｓｒ１１２３７、アダパレン、ＥＣ２３、９－シスレチノイン酸、１３－シスレチノイン酸、４－オキソレチノイン酸、及びオールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、培養は、１～５日間（例えば、１、２、３、４、もしくは５日間）または２～４日間行われる。
【0012】
いくつかの実施形態では、本方法は、ｃ）ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部を、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及びＦＧＦＲ経路阻害剤と接触させることと、ｄ）膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞の集団が生成されるように、ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部を培養することとをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＤＦＥ細胞は、工程ｄ）における培養中または工程ｃ）における接触中に、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストに曝露されない。いくつかの実施形態では、工程ｄ）における培養は、約１～５日間（例えば、１、２、３、４、もしくは５日）または２～４日間行われる。ある特定の実施形態では、ＰＥ細胞は、背側膵臓同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＦＧＦＲ経路阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１、アルクチゲニン、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ１９８３０６、ＰＤ３３４５８１、ＳＬ３２７、Ｕ０１２６、ＭＥＫ阻害剤、ＦＧＦＲ阻害剤、及びＭＡＰＫ阻害剤からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、工程ｃ）における接触は、ＤＦＥ細胞集団を、ソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤と接触させることをさらに含む。
【0013】
ある特定の実施形態では、本方法は、ｅ）ＰＥ細胞集団の少なくとも一部をＮｏｔｃｈ経路阻害剤及びＡＬＫ５阻害剤と接触させることと、ｆ）内分泌細胞の集団が生成されるようにＰＥ細胞の集団の少なくとも一部を培養することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、内分泌細胞は、インスリン発現細胞である。他の実施形態では、内分泌細胞は、胎児型β細胞である。特定の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路阻害剤は、ＤＢＺとしても知られるガンマセクレターゼ阻害剤ＸＸを含む。他の実施形態では、Ｎｏｔｃｈ経路阻害剤は、ＤＡＰＴ、ＭＲＫ－００３、ＭＲＫ－０７５２、ｚ－Ｉｌｅ－ｌｅｕ－ＣＨＯ、ガンマセクレターゼ阻害剤、Ｌ－６８５，４８５、ＬＹ４１１５７５、化合物Ｅ、Ｆ－０３０８４０１４、ＲＯ４９２９０９７、及びＢＭＳ－９０６０２４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤は、Ａ８３０１を含む。さらなる実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤は、Ａ７７０１、Ａ８３－０１、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ４３１５４２、アラントラクトン、及びＬＹ２１５７２９９からなる群から選択される。さらなる実施形態では、工程ｆ）における培養は、５～１５日間（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間）行われる。
【0014】
いくつかの実施形態では、本明細書における方法によって生成された細胞（例えば、内分泌細胞）を対象に移植して、治療効果を提供する。いくつかの実施形態では、移植細胞は、対象が糖尿病を有するため、インスリン発現細胞である。
【0015】
ある特定の実施形態では、本明細書における方法は、ｃ）ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部をＥＧＦと接触させることと、ｄ）胃内胚葉（ＳＥ）細胞の集団が生成されるように、ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部を培養することと、をさらに含む。
【0016】
他の実施形態では、本明細書における方法は、ｃ）ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部分を、ＢＭＰ４またはＢＭＰ経路アゴニスト（例えば、ｓｂ４）と接触させることと、ｄ）肝臓内胚葉（ＬＥ）細胞の集団が生成されるように、ＤＦＥ細胞の集団の少なくとも一部を培養することと、をさらに含む。
【0017】
他の実施形態では、本明細書における方法を用いて、前方胚体内胚葉（ＡＤＥ）を作り出す。前方胚体内胚葉は、ＤＦＥ及びＤＥよりも前方にあり、咽頭内胚葉に対応する細胞を包含する。該ＡＤＥは、ＴＢＸ１、ＰＡＸ９、及びＯＳＲ１などの特異的マーカー遺伝子を発現し、肺、胸腺、及び甲状腺が挙げられるが、これらに限定されない、咽頭領域の細胞系統の前駆細胞を表す。
【0018】
いくつかの実施形態では、本明細書において、ａ）多能性幹細胞の集団を、ｉ）Ｎｏｄａｌタンパク質及びＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰ経路アゴニスト、または該Ｎｏｄａｌタンパク質及び該ＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰ経路アゴニスト（それがタンパク質である場合）をコードするベクター（複数可）、ならびにｉｉ）ＡＬＫ５阻害剤と、接触させることと、ｂ）前方ドメイン内肺葉（ＡＤＥ）細胞の集団が生成されるように、多能性幹細胞の集団の少なくとも一部を培養することと、を含む、前方ドメイン内胚葉細胞を生成する方法が提供される。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞は、該培養中または該接触中に、ｉ）ＢＭＰ阻害剤、及び／またはｉｉ）形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストに曝露されない。
【0019】
ある特定の実施形態では、本明細書において、ａ）Ｎｏｄａｌタンパク質またはＮｏｄａｌタンパク質をコードするベクター、ｂ）ＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰ経路アゴニスト、またはタンパク質の場合、ＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰアゴニストをコードするベクター、及びｃ）ＡＬＫ５阻害剤を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組成物は、ＢＭＰ阻害剤、及び／またはｉｉ）形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストを含まない。ある特定の実施形態では、単一のベクターは、Ｎｏｄａｌタンパク質及びＢＭＰタンパク質（またはタンパク質の場合はＢＭＰ経路アゴニスト）の両方をコードし、他の実施形態では、別個のベクターが用いられる。他の実施形態では、組成物は、細胞の集団をさらに含み、これらの細胞は、多能性幹細胞または前方ドメイン内胚葉（ＡＤＥ）細胞である。
【0020】
いくつかの実施形態では、本明細書において、ａ）細胞培養容器に存在する細胞集団と、ｂ）第１の容器に存在するＮｏｄａｌタンパク質またはＮｏｄａｌタンパク質をコードするベクターと、ｃ）ＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰ経路アゴニストまたは第２の容器にタンパク質が存在する場合に、ＢＭＰタンパク質もしくはＢＭＰアゴニストをコードするベクターと、ｄ）第３の容器に存在するＡＬＫ５阻害剤と、から本質的になる、またはそれらからなるキットまたはシステムが提供される。
【0021】
特定の実施形態では、細胞培養容器は、いかなる、またはいかなる検出可能な外因性ＢＭＰ阻害剤も、及び／または外因性形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）も含まず、キット及びシステムは、第１の容器、第２の容器、第３の容器、または第４の容器に任意の検出可能な外因性ＢＭＰ阻害剤、及び／または外因性形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）を含有しない。他の実施形態では、細胞は、多能性幹細胞または前方ドメイン内胚葉（ＡＤＥ）細胞である。さらなる実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤は、Ａ７７０１、Ａ－８３－０１、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ４３１５４２、アラントラクトン、及びＬＹ２１５７２９９からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＢＭＰタンパク質は、ＢＭＰ４タンパク質である。
【0022】
特許ファイルまたは出願ファイルは、カラーで描画される少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、要求され、必要な料金を支払うことにより、特許庁が提供する。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）細胞を生成するための例示的な方法を示す。
【図2】ＡＡ／ＷＮＴの不在下での効果的な内胚葉誘導の結果を示す。Ａ：前方原始線条（Ａｎｔｅｒｉｏｒ Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ Ｓｔｒｅａｋ）（ＡＰＳ）のアクチビンＡ誘導対ＨＮＦ１β誘導を最適化する内胚葉誘導を通した内胚葉遺伝子の概略図。Ｂ：ＡＰＳ遺伝子誘導（上の円）対ＨＮＦ１β誘導（下の円）を満たす条件のための予測条件。Ｃ：２つの別々のプロトコルを使用した内胚葉マーカー誘導の検証。Ｄ：選択された内胚葉遺伝子の係数プロット（一次エフェクターのみ）。
【図3】非ＡＰＳ由来の内胚葉がレチノイン酸及びＢＭＰ阻害によって非常に活性化されることを示し、背側前腸特性を示している。Ａ：実施した実験の概略図。Ｂ：レチノイン酸及びＢＭＰ阻害に応答するいくつかの内胚葉遺伝子の相対的発現を示すグラフ。遺伝子を、ＹＷＨＡＺ、ＧＡＰＤＨ及びＴＢＰの内因性レベルの平均発現に対して正規化した。ＤＥ－胚体内胚葉、ＲＡ－レチノイン酸、ＬＤＮ－ＬＤＮ３１８９、ＢＭＰ阻害剤及びＷＩＮ－Ｗｉｎ ＸＸＸ、ＡＬＤＨ阻害剤。Ｃ：多能性培養物由来の主要な内胚葉遺伝子を含有するヒートマップは、古典的な胚体内胚葉分化条件を受けるか、またはＨＮＦ１βオプティマイザーで予測される条件を使用して分化した。
【図4】ＤＦＥが高度に背側化された性質を有する膵臓内胚葉を生成することができることを示す。Ａ：胃遺伝子ＳＯＸ２、ＯＳＲ１及び膵臓遺伝子ＰＤＸ１の最適化のモデリングを示す概略図。Ｂ：それぞれ、ＳＯＸ２、ＯＳＲ１及びＰＤＸ１の予測される最大誘導のための対応するオプティマイザー。Ｃ：それぞれの遺伝子活性化を最も担うエフェクターの動的プロファイル。Ｄ：ＰＤＸ１Ｏｐｔの代表的なＩＨＣ。Ｅ：それぞれのＤＥ及びＤＦＥ由来の膵臓内胚葉のＫｅｙＧｅｎｅｓ予測。Ｆ：２つのプロトコル間のいくつかの膵臓遺伝子及び背側特異的膵臓遺伝子の差次的発現を評価するヒートマップ。
【図5】小分子を使用した、ＤＦＥ内胚葉を介した多能性からの膵臓内分泌運命の効果的かつ迅速な誘導の結果を示す。Ａ：膵臓誘導を変化させるために実施した反応の概略図を示す。Ｂ：ＥＬＩＳＡを通じて決定されるように、異なる実験条件の全体を通して検出されるＣペプチドレベル。Ｃ：ＧＡＰＤＨ、ＴＢＰ及びＹＷＨＡＺの平均発現に対して正規化されたいくつかの主要な膵臓及び内分泌特異的遺伝子のＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏベースの発現レベル。
【図6】ＤＦＥ由来の内分泌細胞が未成熟表現型を有することを示す結果を示す。Ａ：内分泌部を生成するために使用される指向性分化プロトコルを示す概略図。Ｂ：様々な内分泌特異的因子についてのエンドポイント培養のＩＨＣ評価。Ｃ：１４日間の内分泌誘導を、ＥＬＩＳＡを通じてｃペプチド生成のために毎日アッセイした。Ｄ：凝集体として成長した多能性誘導体によるジチゾンの保持。Ｅ：内分泌培養物の内分泌機能のグルコース刺激インスリン放出アッセイ（ＧＳＩＳ）評価。Ｆ：グルコース及びカリウムチャレンジに応答する内部カルシウム放出のマイクロ流体解析。
【図7】小分子ベースの膵臓内分泌誘導プロトコルの生物学的同等性試験の結果を示す。Ａ：ＨＮＦ１βＯｐｔ及びＰＤＸ１Ｏｐｔが、最も高い予測される因子寄与を有するモデリング実験からの因子、それぞれレチノイン酸及びＬＤＮ３１８９、またはレチノイン酸及びＰＤ０３２５のみで置き換えられた、実施された反応の概略図を示す。Ｂ：ＧＡＰＤＨ、ＴＢＰ及びＹＷＨＡＺの平均発現に正規化されたＰＥ段階（ライトグレーで示される）または内分泌段階（ダークグレーで示される）のいずれかでの４つのそれぞれの反応条件のＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏベースの転写物分析を示す。
【図8】ＤＦＥ誘導の動力学を示す。Ａ：ＨＮＦ１βｏｐｔを用いた４日間のインキュベーション期間にわたる、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１β、ＨＬＸＢ９及びＯＣＴ３／４陽性細胞の相対的割合を示すグラフ。Ｂ：分化プロトコルの３日目のＨＮＦ１β、ＦＯＸＡ２、及びＨＬＸＢ９についての代表的なＩＨＣ。
【図9】ＤＦＥのプロトコル入力がＤＥのパターン化を変更しないことを示す。Ａ：ＴＧＦβまたはレチノイン酸応答性遺伝子間の差次的発現を示す代表的なＩＨＣ。
【図10】ＤＦＥのパターン化能力が、ＤＥ由来の内胚葉とは異なることを示す。Ａ：ＨＮＦ１β最適化培養物または胚体内胚葉に分化した培養物のいずれかが、胃、膵臓、または肝臓の運命に向かう分化にチャレンジさせることにどのように反応するかの概略図を示す。Ｂ：異なるプロトコル間で示される遺伝子に対する選択マーカーの相対的発現。青色バーは、胃に向かって分化するように設計された条件が提供された培養物を表す。黄色バーは、膵臓を生成するように設計された条件が提供された培養物である。赤色バーは、肝臓を生成するように設計された条件が提供された培養物を表す。Ｃ：胃誘導条件でチャレンジしたＨＮＦ１βｏｐｔ培養物からオルガノイドを増殖させた追跡実験の概略図。Ｄ：ＤＦＥ由来のオルガノイドで、２３日間にわたって分化及び増殖させたもの。Ｅ：ＰＳＣ由来の推定上の前庭部ＰＤＸ１＋／ＳＯＸ２＋／ＯＳＲ１＋胃の遺伝子マーカーの代表的なオルガノイド染色。
【図11】ＤＦＥにおいて、ＤＥ由来の内胚葉と対比して膵臓能力が増強したことを示す。Ａ：コンピュータモデリングによって最適化し、続いて膵臓コンピテンスのためにチャレンジした４つの異なる初期内胚葉遺伝子を示す概略図。Ｂ：一般的な内胚葉遺伝子ＦＯＸＡ２についての４つのそれぞれの培養物のＩＨＣ検証。Ｃ：膵臓特異的遺伝子ＰＤＸ１についての４つのそれぞれの培養物のＩＨＣ検証。
【図12】ｉＰＳＣ及び雌ｈＥＳＣを用いたＤＦＥからの膵臓運命の堅牢かつ均質な誘導の結果を示す。Ａ：対応する主要因子の発現レベルが上方制御された状態の３つの異なる多能性細胞株間のＨＮＦ１βｏｐｔプロトコルのＩＨＣ検証。Ｂ：対応する主要な膵臓因子の発現レベルが上方制御された状態の３つの異なる多能性細胞株間のＤＦＥからの膵臓誘導のＩＨＣ検証
【図13】多能性由来細胞をいくつかの一次組織と比較する階層クラスタリングを示す。Ｒ中のＫｅｙＧｅｎｅｓデータセット上で階層的クラスタリングを行った。全ての多能性由来試料は、ヒト胎児胃、胎児膵臓、及び成体膵島試料を含む同じクラスター内に入ったため、クラスターのこの領域のみが示されている。
【図14】レチノイン酸代謝産物が背側前腸内胚葉を活性化するのに有効であることを示す。Ａ：実施した実験を示す概略図。Ｂ：パネルＡに記載された実験についてのＨＮＦ１βＯｐｔ。Ｃ：選択された内胚葉遺伝子を活性化する際の異なるレチノイドの示差的効果を示すグラフ。Ｄ：元のＨＮＦ１βＯｐｔ間のタンパク質レベルを現在の実験設計で予測される条件と比較する対応するＩＨＣ検証。Ｅ：反応条件についての添加化合物は、新旧のＨＮＦ１βＯｐｔと称される。
【図15】オールトランスレチノイン酸がＮｏｄａｌを活性化することを示す。全てのトランスレチノイン酸及びレチノイン酸代謝産物は、原始線条マーカーＮｏｄａｌを活性化するための分化能を有する。Ａ：実施した実験の概略図。Ｂ：レチノイドベースの誘導と比較した、選択された内胚葉遺伝子の相対的発現。Ｃ：レチノイドベースのＮＯＤＡＬｏｐｔ条件を得るために実施された実験を示す概略図。
【図16】原腸形成を開始することによる内胚葉運命空間のパターン化を示す。Ａ：ＰＳＣ培養物を、原腸形成を開始または阻害するいずれかが知られている化合物のＤｏＥの定義済みマトリックスに曝露した。Ｂ：アッセイした内胚葉遺伝子のために得られた全てのオプティマイザーのｔＳＮＥプロット。Ｃ：ｔＳＮＥプロットに定義されている示された４つの決定された集団の各々に、どの遺伝子が分離されているかを示す対応するヒートマップ。
【図17】原腸形成中の内胚葉のパターン化に対するアクチビンＡ、ＢＭＰ４及びレチノイン酸の寄与を示す。インビトロ原腸形成イベント中のアクチビンＡ、ＢＭＰ４及びレチノイン酸の効果をアッセイするＤｏＥベースのモデリング実験から得られた相対的な因子寄与を表に示す。
【図18】ＤＦＥプロトコルの定量化。Ａ：上記画像の概略図に記載されているような４つの異なるＤＦＥプロトコルからの代表的なＩＨＣ。Ａ’：パネルＡからの異なるプロトコルの対応する定量化。Ｂ：上記画像の概略図に詳説されているような、膵臓前駆細胞に向かってさらに分化した４つの異なるＤＦＥプロトコルからの代表的なＩＨＣ。Ｂ’：パネルＢからの異なるプロトコルの対応する定量化。Ｃ：分化モデルを通して定義され、上記画像の概略図に詳説されているような、重要なプロセスパラメータのみを使用した膵臓前駆細胞に向かってさらに分化した４つの異なるＤＦＥプロトコルからの代表的なＩＨＣ。Ｃ’：パネルＢからの異なるプロトコルの対応する定量化。
【図19】代表的なパターン化された内胚葉集団に対する相対的エフェクター寄与を定義する。Ａ：実験全体を通して使用される異なるエフェクターの相対レベルを示すリッジプロット（ｒｉｄｇｅ ｐｌｏｔ）。異なるプロットは、オプティマイザーのクラスタリングを参照し、異なるクラスターにカラーマッチングされる。Ｂ：元のクラスターは、提示された対応するクラスター番号（０～３）を参照しやすくするために再び表示される。
【図20】内胚葉クラスター内の発現パターンを評価する。Ａ：元のクラスターは、提示された対応するクラスター番号（０～３）を参照しやすくするために再び表示されている。Ｂ：クラスター０は、背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）からなる。Ｃ：クラスター１は、前方から中腸内胚葉（ＡＤＥ）集団からなる。Ｄ：原始線条マーカーＮｏｄａｌ及びＡＬＤＨ１Ａ２の発現パターン。
【図21】前方及び中腸遺伝子は、ＡＡの不在下で誘導される。選択された内胚葉遺伝子の異なるクラスター全体にわたる相対発現レベルを定義するバイオリンプロット。
【図22】前方内胚葉遺伝子は、ＢＭＰ４及びＮｏｄａｌ応答性である。個々のグラフに記載されている各遺伝子のための２０個の独立したオプティマイザーは、それぞれの遺伝子の活性化に関与するＴＧＦβファミリーリガンドＡＡ、Ｎｏｄａｌ、及びＢＭＰ４の予測濃度に焦点を当てて示されている。
【図23】ＡＡ、ＢＭＰ、Ｎｏｄａｌ、及びレチノイン酸は全て、独自の応答性遺伝子ネットワークを有する。測定された内胚葉遺伝子に対する全てのそれぞれのオプティマイザーからのエフェクター因子寄与を正規化し、最も応答性の高い遺伝子から最も応答性の低い遺伝子まで順位付けした。
【図24】ＡＡ刺激された多能性細胞は、いくつかのＴＧＦβファミリーリガンドを活性化する。Ａ：ＲＮＡ配列データを使用して、ＤＥ及びＤＦＥ条件の両方で活性化されたＴＧＦβファミリーリガンドの発現パターンを決定した。遺伝子をＤＥ集団内の最も多い転写物から最も少ない転写物まで順位付けし、未検出レベルをヒートマップから除去した。Ｂ：ＡＡ刺激された多能性細胞におけるＮｏｄａｌの発現を確認するＩＨＣ。
【図25】前方及び中腸のパターン化は、ＡＡシグナル伝達の非存在下で起こる。前方及び中腸遺伝子の主要制御因子についての代表的なオプティマイザー。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本明細書では、幹細胞を形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）経路アゴニストに曝露することなく、多能性幹細胞をレチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及び骨形態形成（ＢＭＰ）経路阻害剤と接触させることによって、背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）細胞を生成するための組成物、システム、キット、及び方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＤＦＥ細胞を、レチノイン酸シグナル伝達経路アゴニスト及びＦＧＦＲ経路阻害剤と接触させて、（例えば、背側同一性を有する）膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞を生成する。他の実施形態では、ＰＥ細胞をＡＬＫ５阻害剤及びＮｏｔｃｈ阻害剤と接触させて、内分泌細胞（例えば、インスリン発現内分泌細胞）を生成する。ある特定の実施形態では、前方ドメイン内胚葉（ＡＤＥ）細胞を生成するためのシステム、キット、及び方法が提供される。
【0025】
膵臓、肝臓、及び腸などの内胚葉ならびに子孫臓器の誘導は、疾患モデリング及び再生医療に影響を与えている。多能性から胚体内胚葉を誘導するための一般的な方法は、必然的に、ＴＧＦβシグナル伝達アゴニズム、最も一般的にはアクチビンＡの使用を伴う。本明細書に記載の実施形態の開発中に行われた作業は、アクチビンＡを必要としなかったが、ＢＭＰアンタゴニズム及びレチノイド入力を、背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）の誘導につながるように成功裏に用いられ得ること、ならびにアクチビン誘導内胚葉が、腹側の不均一な特徴を示す細胞をもたらすことを決定した。膵臓同一性は、ＤＦＥから迅速かつ堅牢に誘導され得ること、及びそのような細胞が背側膵臓同一性のものであることをそれによって実証した。そのような作業では、ＤＦＥ集団は、胃オルガノイドと膵臓組織の両方のタイプに分化するコンピテントが高く、小分子ベースのプロセスを通じて、２つの後続の分化によって胎児型β細胞を効果的に生成することができた。そのような膵臓インスリン産生細胞の生成は、例えば、糖尿病患者の細胞ベースの療法に有用である。
【0026】
本明細書における実施形態の発生中に実施された作業は、有効かつ領域化されたパターン化内胚葉が、ＴＧＦβアゴニズムを使用せずに多能性から直接確実に分化することができ、そのような細胞から膵臓及び他の内胚葉誘導体を作り出すことができることを実証した。本明細書における実施形態は、腸管の背側前腸領域を代表する特殊なヒト内胚葉を誘導するための堅牢なプロトコルを提供する。このような生成された細胞は、背側膵臓前駆細胞に効果的に変換することができ、背側膵臓前駆細胞は続いて、胎児様ベータ細胞の生成を含む、内分泌の運命を取り入れることができる。
【0027】
本開示は、用いられる培地または培養系の種類によって限定されない。任意の好適な培地及び培養系が用いられてもよい。例えば、当業者であれば、間葉系フィーダー細胞の有り無しで、ならびに完全に化学的に定義された条件、例えば、血清、または他の複雑な完全には定義されていない添加剤の存在下での培養の有り無しで、多能性幹細胞の培養及び増殖のための複数の方法が利用可能であることを理解する。また、複数の、柔軟な増殖培地基剤が利用可能であり、これらは、ハイブリッド培地（例えば、内部で使用されるようなＣＤＭ２などの培地混合物）、ならびにＥｓｓｅｎｔｉａｌ－８、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ－６、ＴｅｓＲ培地などの特殊な培地、及びＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの細胞起源に関わらず、多能性幹細胞状態の増殖を支援するために使用されるＫＯＳＲなどの様々な補助剤によって例示される。ある特定の実施形態では、一連の継続的、連続的な性質の特殊な培地を用いてもよく、これらの培地は全て、基礎となる基礎培地を有し、これは、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、Ｆ２、及び他のものなどの広範に使用される細胞培養培地の範囲から柔軟に探索されてもよい。次いで、当業者によって一般的に行われるように、そのような培地には、一連の、ピルビン酸塩などの代謝支持分子、グルタミンなどのアナプレロティック剤（ａｎａｐｌｅｒｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、化学的に定義された脂質、グルコースなど燃料源、及び場合によってはＢ２７などの化学的に定義された増殖支持体などが提供される。ある特定の実施形態では、種々の基礎培地、ならびに代謝支持分子が用いられる。
【0028】
ある特定の実施形態では、本明細書における方法及び組成物を用いて産生される細胞は、内分泌膵臓インスリン産生細胞である。特定の実施形態では、そのような細胞は、当該技術分野において既知であるようにマクロカプセル化され、次いで糖尿病を有する患者に移植される（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｉａｂ Ｒｅｐ．２０１８ Ｊｕｎ １６；１８（８）：５０を参照されたい）。他の実施形態では、インスリン産生細胞は、対象の肝臓（例えば、糖尿病を有する対象）に移植される。他の実施形態では、そのような細胞は、臨床治験ＮＣＴ０３１６３５１１に記載されているような保護デバイス内に皮下移植される。さらに他の実施形態では、そのような細胞は、臨床治験ＮＣＴ０１７３９８２９に記載されるようなマイクロカプセル化球体に移植される。他の実施形態では、そのような細胞は、臨床治験ＮＣＴ０２０６４３０９に記載されているような酸素供給デバイスに移植される。他の実施形態では、そのような細胞は、物理的保護はないが、免疫調節剤の存在下で、好適な部位（例えば、皮下、腹腔内、静脈内）に移植され得る。他の実施形態では、そのような細胞は、参照により本明細書に組み込まれるＡｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１８ Ｊａｎ ９；１１５（２）：Ｅ２６３－Ｅ２７２に記載されるような、アルギン酸塩でコーティングされ、腹腔内に埋め込まれる、回収可能なポリマーナノ多孔性ストリングを使用して移植され得る。いくつかの実施形態では、糖尿病患者は、自己免疫の徴候を有さないＩＩ型糖尿病患者であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞リプログラミングのプロセスを通じて誘導され、レシピエントと同様の遺伝子構造のものであり得る。
【0029】
ある特定の実施形態では、ある特定の細胞は、処理される細胞の元のセットとして、多能性幹細胞の代わりに置き換わる。そのような細胞としては、ＥＰ（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１２ Ａｐｒ ６；１０（４）：３７１－８４に記載されるような内胚葉の前駆細胞）、Ｔｅｓａｒ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００５ Ｊｕｎ ７；１０２（２３）：８２３９－４４（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなＥＰＩＢＬＡＳＴ幹細胞、または参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１４ Ｏｃｔ；３２（１０）：２６６８－７８により記載されるような胚性生殖細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本開示は、上述の多能性幹細胞または他の細胞が由来する種によって限定されない。全ての脊椎動物種は、前方内胚葉子孫組織を生成する、前方に位置する派生物をその中に形成する同様にパターン化された内胚葉を作り出し、全ての脊椎動物種は、グルコース恒常性を制御するインスリン分子を産生するそのような内胚葉の細胞を生成する。いくつかの実施形態では、非ヒト種由来の膵臓内胚葉、膵臓インスリン産生細胞の生成は、マイクロカプセル化デバイス、マクロカプセル化デバイス、または免疫抑制性薬物レジメンのいずれかと組み合わせた場合、または代替的に、免疫検出の喪失を可能にするように遺伝子改変された場合などに、細胞ベースの療法を誘導する手段を提供するために有利に使用され得る。さらに、このような細胞は、種由来にかかわらず、インビトロ由来インスリン産生細胞の創薬の基礎として使用することができるため、糖尿病状態に影響を及ぼす新規薬物の同定につながる。
【0030】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物によって産生されるインスリン産生細胞は、以下の会社のいずれかの技術と共に使用される：１）Ｓｅｒａｘｉｓ（１型糖尿病のための細胞置換療法）、２）Ｕｎｉｃｙｔｅ ＡＧ（糖尿病細胞療法）、３）ＶｉａＣｙｔｅ（糖尿病のためのインスリン）、４）Ｓｅｒｎｏｖａ（糖尿病治療のための幹細胞）、５）Ｂｅｔａｌｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（インスリンの産生）、６）ＡｌｔｕＣｅｌｌ（糖尿病２型のための幹細胞療法）、７）ＮｅｘｔＣｅｌｌ Ｐｈａｒｍａ ＡＢ（糖尿病１型のための幹細胞療法）、８）Ｏｓｉｒｉｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１型糖尿病の制御）、９）Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ（２型糖尿病治療）、１０）Ｅｖｏｔｅｃ ａｎｄ Ｓａｎｏｆｉ（糖尿病のための幹細胞）、１１）Ｏｒｇｅｎｅｓｉｓ（インスリン産生細胞）、１２）Ｓｅｍｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（１型糖尿病療法）、１３）Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ（１型糖尿病治療）、１４）ベータ－Ｏ２（糖尿病のための人工膵臓）、１５）Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｓｉｇｉｌｏｎ（糖尿病のための幹細胞）。
【実施例】
【0031】
実施例１
多能性からの背側膵臓内胚葉の堅牢かつ迅速な誘導条件
本実施例は、多能性幹細胞からの背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）細胞の生成について記載する。本実施例はまた、ＤＦＥ細胞から背側膵臓内胚葉細胞を生成することについても記載した。
多能性からの背側膵臓内胚葉の堅牢かつ迅速な誘導条件
本実施例は、多能性幹細胞からの背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）細胞の生成について記載する。本実施例はまた、ＤＦＥ細胞から背側膵臓内胚葉細胞を生成することについても記載した。
【0032】
結果
内胚葉誘導のための２つの独立した別個の経路が存在する
我々は当初、文献によって示唆されているように、原始線条子孫胚体内胚葉集団を定義するために必要な条件を予測することに着手した。これは、ＥＶＸ１（後方原始線条マーカー）を最小限に抑えながら、ＭＥＳＰ１、ＥＯＭＥＳ及びＢＲＡＣＨＹＵＲＹ／Ｔの最大発現についてモデリングすることによって前方原始線条（ＡＰＳ）集団を定義することによって達成された（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＩＳＰＡを通して、この分化イベントを生成すると予測される条件は、Ｗｎｔ阻害に対する低い耐性（ＦＣ＝１８．６５）及び高レベルのアクチビンＡ（ＦＣ＝１８．８５）から構成された（図２Ａ及び２Ｂ）。これらの条件は、ノードシグナル伝達に依存する胚体内胚葉（ＤＥ）を生成するための現在のプロトコル（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）と一致する。実際、この条件を使用して多能性培養物を分化させる場合、培養物の大部分は、３日以内にＦＯＸＡ２＋／ＳＯＸ１７＋集団に変換した（図２Ｃ）。ＩＳＰＡを通して、ＣＯＬ６Ａ１、ＨＨＥＸ、ＭＥＳＰ２、ＳＯＸ１７を含む、多数の他の遺伝子が、これらの条件下で高発現されること予測された（図２Ｄ、データ図示せず）。注目すべきことに、ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）は高いままであり、ノード様状態と一致した。これらの遺伝子は全て、マウスにおける原腸形成後の直系子孫において上昇することが知られている。しかしながら、ＩＳＰＡを通して、我々は、既知の初期の内胚葉発現遺伝子が全てＡＰＳ条件を通して一意に最大化されたわけではないことに注目した。上述の実験からの既知の空間を検査すると、胚体内胚葉で発現されることも知られているＨＮＦ１β（ＴＣＦ２）発現に焦点を当てて、かなり異なる解集合を得ることができた。ＨＮＦ１β発現の最大化は、内胚葉の全ての既知のマーカーであるＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＭＮＸ１、ＣＸＣＲ４、ＭＴＦ１などの付随する遺伝子の発現をもたらしたが、ＨＨＥＸ及びＳＯＸ１７の発現は低いままであった（ＩＳＰＡ結果は図示せず）。我々は、これらの異なる状態と、それらの誘導の要件を特徴付けることにした。
内胚葉誘導のための２つの独立した別個の経路が存在する
我々は当初、文献によって示唆されているように、原始線条子孫胚体内胚葉集団を定義するために必要な条件を予測することに着手した。これは、ＥＶＸ１（後方原始線条マーカー）を最小限に抑えながら、ＭＥＳＰ１、ＥＯＭＥＳ及びＢＲＡＣＨＹＵＲＹ／Ｔの最大発現についてモデリングすることによって前方原始線条（ＡＰＳ）集団を定義することによって達成された（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＩＳＰＡを通して、この分化イベントを生成すると予測される条件は、Ｗｎｔ阻害に対する低い耐性（ＦＣ＝１８．６５）及び高レベルのアクチビンＡ（ＦＣ＝１８．８５）から構成された（図２Ａ及び２Ｂ）。これらの条件は、ノードシグナル伝達に依存する胚体内胚葉（ＤＥ）を生成するための現在のプロトコル（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）と一致する。実際、この条件を使用して多能性培養物を分化させる場合、培養物の大部分は、３日以内にＦＯＸＡ２＋／ＳＯＸ１７＋集団に変換した（図２Ｃ）。ＩＳＰＡを通して、ＣＯＬ６Ａ１、ＨＨＥＸ、ＭＥＳＰ２、ＳＯＸ１７を含む、多数の他の遺伝子が、これらの条件下で高発現されること予測された（図２Ｄ、データ図示せず）。注目すべきことに、ＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ４）は高いままであり、ノード様状態と一致した。これらの遺伝子は全て、マウスにおける原腸形成後の直系子孫において上昇することが知られている。しかしながら、ＩＳＰＡを通して、我々は、既知の初期の内胚葉発現遺伝子が全てＡＰＳ条件を通して一意に最大化されたわけではないことに注目した。上述の実験からの既知の空間を検査すると、胚体内胚葉で発現されることも知られているＨＮＦ１β（ＴＣＦ２）発現に焦点を当てて、かなり異なる解集合を得ることができた。ＨＮＦ１β発現の最大化は、内胚葉の全ての既知のマーカーであるＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４ａ、ＭＮＸ１、ＣＸＣＲ４、ＭＴＦ１などの付随する遺伝子の発現をもたらしたが、ＨＨＥＸ及びＳＯＸ１７の発現は低いままであった（ＩＳＰＡ結果は図示せず）。我々は、これらの異なる状態と、それらの誘導の要件を特徴付けることにした。
【0033】
レチノイン酸及びＢｍｐ阻害は、相乗的に、アクチビン誘導内胚葉に互いに排他的な内胚葉プログラムを誘導する
我々は、ＩＳＰＡを用いて、内胚葉遺伝子誘導を支配する基本的な論理を抽出した。ＡＰＳ由来ＤＥについては、多くの初期内胚葉遺伝子がＴＧＦβシグナル伝達の直接制御下にあり、複雑な調節モデルにおいてＡＡからの強力で正の係数項を示すことが明らかであった。これらの遺伝子としては、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＬＥＦＴＹ１、ＭＩＸＬ１及びＨＨＥＸが挙げられたが、これらに限定されなかった（図２Ｄ）。これは、他の複数の既知の内胚葉マーカーについては当てはまらなかった。内胚葉遺伝子のサブグループは、アクチビンＡの刺激に応答しなかったが、レチノイン酸シグナル伝達に直接依存し、より低い程度で、ＢＭＰ経路の阻害を必要とした。これらの遺伝子として、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＣＤＸ２及びＭＮＸ１が挙げられ（図２Ｄ）、ＦＯＸＡ２（ＲＡ＝２４．８、ＢＭＰｉ＝２５．３でのＦＣ）、ＨＮＦ１β（ＲＡ＝３０．１、ＢＭＰｉ＝３１．７でのＦＣ）、ＭＮＸ１（ＲＡ＝２２．７、ＢＭＰｉ＝３０．５でのＦＣ）を含む高因子寄与を伴うレチノイン酸及びＢＭＰ阻害の相乗効果を通して直接制御されることが予測された（図２Ｂ、データ図示せず）。注目すべきことに、アクチビンＡは、これらの遺伝子の活性化に寄与しないと予測され、むしろ、ＴＧＦβ経路の阻害は、Ａｌｋ５ｉの因子寄与が、ＨＮＦ１βで７．５９、ＦＯＸＡ２で８．８８、及びＭＮＸ１で１８．９８であり、これらの遺伝子の発現に利益をもたらすと予測された（図２Ｂ、データ図示せず）。ＨＮＦ１β、ＭＮＸ１、及びＦＯＸＡ２を全て活性化し、細胞を効果的に変換することができるタンパク質発現に基づく検証のための多能性細胞の分化について、ＨＮＦ１β最適化のための予測条件（ＨＮＦ１βＯｐｔ）を試験した。ＨＮＦ１βＯｐｔ条件の適用は、細胞の大部分がＨＮＦ１β＋であることをもたらした（図８）が、一方ＡＰＳ分化細胞は弱いＨＮＦ１β発現のみを示した（図２Ｃ）。
我々は、ＩＳＰＡを用いて、内胚葉遺伝子誘導を支配する基本的な論理を抽出した。ＡＰＳ由来ＤＥについては、多くの初期内胚葉遺伝子がＴＧＦβシグナル伝達の直接制御下にあり、複雑な調節モデルにおいてＡＡからの強力で正の係数項を示すことが明らかであった。これらの遺伝子としては、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＬＥＦＴＹ１、ＭＩＸＬ１及びＨＨＥＸが挙げられたが、これらに限定されなかった（図２Ｄ）。これは、他の複数の既知の内胚葉マーカーについては当てはまらなかった。内胚葉遺伝子のサブグループは、アクチビンＡの刺激に応答しなかったが、レチノイン酸シグナル伝達に直接依存し、より低い程度で、ＢＭＰ経路の阻害を必要とした。これらの遺伝子として、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＯＮＥＣＵＴ１、ＣＤＸ２及びＭＮＸ１が挙げられ（図２Ｄ）、ＦＯＸＡ２（ＲＡ＝２４．８、ＢＭＰｉ＝２５．３でのＦＣ）、ＨＮＦ１β（ＲＡ＝３０．１、ＢＭＰｉ＝３１．７でのＦＣ）、ＭＮＸ１（ＲＡ＝２２．７、ＢＭＰｉ＝３０．５でのＦＣ）を含む高因子寄与を伴うレチノイン酸及びＢＭＰ阻害の相乗効果を通して直接制御されることが予測された（図２Ｂ、データ図示せず）。注目すべきことに、アクチビンＡは、これらの遺伝子の活性化に寄与しないと予測され、むしろ、ＴＧＦβ経路の阻害は、Ａｌｋ５ｉの因子寄与が、ＨＮＦ１βで７．５９、ＦＯＸＡ２で８．８８、及びＭＮＸ１で１８．９８であり、これらの遺伝子の発現に利益をもたらすと予測された（図２Ｂ、データ図示せず）。ＨＮＦ１β、ＭＮＸ１、及びＦＯＸＡ２を全て活性化し、細胞を効果的に変換することができるタンパク質発現に基づく検証のための多能性細胞の分化について、ＨＮＦ１β最適化のための予測条件（ＨＮＦ１βＯｐｔ）を試験した。ＨＮＦ１βＯｐｔ条件の適用は、細胞の大部分がＨＮＦ１β＋であることをもたらした（図８）が、一方ＡＰＳ分化細胞は弱いＨＮＦ１β発現のみを示した（図２Ｃ）。
【0034】
内胚葉活性化への２つの経路は、根本的に異なるものであり、これらの経路が互いに排他的であることを示唆する矛盾した入力ロジックに基づいていた。これを、アクチビンＡの存在下でＲＡ及びＢＭＰｉの効果をアッセイするハイブリッドプロトコルを作成することによって試験した（図３Ａ）。レチノイン酸をＡＰＳベースのＤＥ生成プロトコルに含めること（Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）は、ＣＤＸ２（データは図示せず）及びＯＳＲ１（図３Ｂ）のみがこの方法で顕著に上方制御されているレチノイン酸応答性遺伝子の遺伝子発現を適度に増加させるだけであることが証明された。逆に、既知のＴＧＦβ応答性遺伝子は、レチノイン酸が、ＨＨＥＸ、ＳＯＸ１７、及びＧＳＣを含むＡＰＳ型ＤＥ生成反応に含まれるときに、著しく下方制御されることが示された（図３Ｂ及び補足：図２）。これは、キープロトコルドライバ（ＡＡ対ＲＡ）のいずれかの存在が、他のプロトコルドライバを抑制することを示す。さらに、ＩＳＰＡによっても予測されるように、レチノイン酸及びＬＤＮ３１８９の存在下で上方制御された遺伝子は、アクチビンＡがこれらの反応から除外されたときにより効率的に活性化された。重要なことに、ＨＮＦ１βＯＰＴ条件のための２つの主要なプロトコル入力、ＲＡ及びＬＤＮ３１８９は、分化を効果的に開始するのに十分であった（図３Ｂ）。
【0035】
レチノイン酸／ＢＭＰ阻害誘導型内胚葉は、背側前腸形質のものである
内胚葉集団の異なる性質をよりよく理解するために、ＲＮＡ配列決定のために培養を行った。両方の集団において発現される共通の内胚葉遺伝子には、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＧＡＴＡ４及びＧＡＴＡ６が含まれた（図３Ｃ）。しかしながら、パターン化に関連する遺伝子について顕著な差異が観察され、ＨＮＦ１βＯｐｔ誘導型内胚葉が、既知の背側（ＭＮＸ１及びＰａｘ６）ならびに前腸内胚葉ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ及びＨＮＦ１βの特徴的な遺伝子に濃縮されたことが明らかになった（図３Ｃ）。対照的に、ＡＰＳ型ＤＥは、腹側内胚葉ＮＲ５Ａ２、ＨＨＥＸ、及びＳＯＸ１７、ならびにより後方の内胚葉（ＳＯＸ１７及びＡＦＰ、ただしＣＤＸ１ではない）を代表する遺伝子の濃縮を示した（図３Ｃ）。ＨＮＦ１βＯｐｔ培養物は、より多くの背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）表現型を有するように見えたため、胃、膵臓及び肝臓（後方前腸に由来する組織）に向かう分化コンピテンスについて、以前にＡＰＳ由来ＤＥからのこれらの運命を誘導することが示され（図３Ａ、補足）ＡＰＳ由来ＤＥと比較した条件を使用して取り組んだ。ＤＦＥをＡＰＳ－ＤＥ集団と比較した場合、コンピテンスの著しい差異が観察された。全ての場合において、ＡＰＳ－ＤＥ培養物は、肝臓遺伝子（ＡＰＯＢ、ＨＨＥＸ、及びＥＶＸ１（補足、図３Ｂ））を、ＤＦＥよりも効率的に活性化した。しかしながら、胃（ＯＳＲ１）及び膵臓（ＰＤＸ１）は、ＤＦＥ培養物においてより効果的に活性化された。胃オルガノイドを生成するためにＤＦＥ培養物に取り組む場合（図１０Ｃ及び１０Ｄ、（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４））、ＯＳＲ１及びＰＤＸ１の共発現がＳＯＸ２及びＰＤＸ１の共発現と同様に観察され、胃オルガノイドが優先的に前庭部型の最も後方の胃に変換されることが示唆された（図１０Ｅ）。
内胚葉集団の異なる性質をよりよく理解するために、ＲＮＡ配列決定のために培養を行った。両方の集団において発現される共通の内胚葉遺伝子には、ＣＸＣＲ４、ＦＯＸＡ２、ＥＰＣＡＭ、ＧＡＴＡ４及びＧＡＴＡ６が含まれた（図３Ｃ）。しかしながら、パターン化に関連する遺伝子について顕著な差異が観察され、ＨＮＦ１βＯｐｔ誘導型内胚葉が、既知の背側（ＭＮＸ１及びＰａｘ６）ならびに前腸内胚葉ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ３、ＨＮＦ４Ａ及びＨＮＦ１βの特徴的な遺伝子に濃縮されたことが明らかになった（図３Ｃ）。対照的に、ＡＰＳ型ＤＥは、腹側内胚葉ＮＲ５Ａ２、ＨＨＥＸ、及びＳＯＸ１７、ならびにより後方の内胚葉（ＳＯＸ１７及びＡＦＰ、ただしＣＤＸ１ではない）を代表する遺伝子の濃縮を示した（図３Ｃ）。ＨＮＦ１βＯｐｔ培養物は、より多くの背側前腸内胚葉（ＤＦＥ）表現型を有するように見えたため、胃、膵臓及び肝臓（後方前腸に由来する組織）に向かう分化コンピテンスについて、以前にＡＰＳ由来ＤＥからのこれらの運命を誘導することが示され（図３Ａ、補足）ＡＰＳ由来ＤＥと比較した条件を使用して取り組んだ。ＤＦＥをＡＰＳ－ＤＥ集団と比較した場合、コンピテンスの著しい差異が観察された。全ての場合において、ＡＰＳ－ＤＥ培養物は、肝臓遺伝子（ＡＰＯＢ、ＨＨＥＸ、及びＥＶＸ１（補足、図３Ｂ））を、ＤＦＥよりも効率的に活性化した。しかしながら、胃（ＯＳＲ１）及び膵臓（ＰＤＸ１）は、ＤＦＥ培養物においてより効果的に活性化された。胃オルガノイドを生成するためにＤＦＥ培養物に取り組む場合（図１０Ｃ及び１０Ｄ、（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４））、ＯＳＲ１及びＰＤＸ１の共発現がＳＯＸ２及びＰＤＸ１の共発現と同様に観察され、胃オルガノイドが優先的に前庭部型の最も後方の胃に変換されることが示唆された（図１０Ｅ）。
【0036】
背側前腸内胚葉からの臓器部特異化メカニズム
膵臓誘導のために培養物に取り組む場合、ＤＦＥパターン化培養物は、従来のＤＥ誘導方法と比較して、ＰＤＸ１活性化のコンピテンスが大きかった（図１０Ａ）。したがって、我々はＩＳＰＡに戻り、ステージ１で異なる早期内胚葉マーカーを最適化することによって膵臓誘導を調べ、どのマーカーが膵臓変換を最良に可能にするかを決定した。ＩＳＰＡを使用して、レチノイン酸の制御下での代表的な遺伝子としてのＨＮＦ１βまたはＯＣ２の発現を最大化するか、またはＴＧＦβシグナル伝達の制御下での代表的な遺伝子としてのＮＲ５Ａ２またはＳＯＸ１７の発現を最適化する独立した条件を特定し比較した（図１１Ａ）。最初に４つの遺伝子のそれぞれについて多能性培養物を誘導条件に曝露する（３日間）ことにより、次いで以前に定義された条件を使用して膵臓形成を誘導した（Ｍｆｏｐｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＨＮＦ１β、またはＯＣ２に最適化された培養物は、膵臓マーカーＰＤＸ１、ならびにＦＯＸＡ２に対してはるかに均質な誘導を示した（図１１Ｂ及びＣ）。ＤＦＥ培養物が胃と膵臓の両方の誘導にコンピテントであることが観察されたので、次に、ＤＦＥ培養物で実施された連続的なＤｏＥモデリング実験を通じて、この二分化能の性質を評価した。
膵臓誘導のために培養物に取り組む場合、ＤＦＥパターン化培養物は、従来のＤＥ誘導方法と比較して、ＰＤＸ１活性化のコンピテンスが大きかった（図１０Ａ）。したがって、我々はＩＳＰＡに戻り、ステージ１で異なる早期内胚葉マーカーを最適化することによって膵臓誘導を調べ、どのマーカーが膵臓変換を最良に可能にするかを決定した。ＩＳＰＡを使用して、レチノイン酸の制御下での代表的な遺伝子としてのＨＮＦ１βまたはＯＣ２の発現を最大化するか、またはＴＧＦβシグナル伝達の制御下での代表的な遺伝子としてのＮＲ５Ａ２またはＳＯＸ１７の発現を最適化する独立した条件を特定し比較した（図１１Ａ）。最初に４つの遺伝子のそれぞれについて多能性培養物を誘導条件に曝露する（３日間）ことにより、次いで以前に定義された条件を使用して膵臓形成を誘導した（Ｍｆｏｐｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＨＮＦ１β、またはＯＣ２に最適化された培養物は、膵臓マーカーＰＤＸ１、ならびにＦＯＸＡ２に対してはるかに均質な誘導を示した（図１１Ｂ及びＣ）。ＤＦＥ培養物が胃と膵臓の両方の誘導にコンピテントであることが観察されたので、次に、ＤＦＥ培養物で実施された連続的なＤｏＥモデリング実験を通じて、この二分化能の性質を評価した。
【0037】
ＳＯＸ２、ＯＳＲ１またはＰＤＸ１の発現のＩＳＰＡ最大化からの結果を比較した（図４Ａ及びＢ）。動的プロファイリング分析（図４Ｃ）は、ＯＳＲ１（胃）とＰＤＸ１（膵臓）の両方が、同様の制御機構下にあることを明らかにした。両方の遺伝子は、それぞれＦＣ＝３０．６８及びＦＣ＝３１．３８でＲＡに強く応答した（図４Ｂ及びＣ）。しかしながら、ＦＧＦシグナル伝達に対する差異応答性が予測され、ＦＧＦ４は、１３．４５のＦＣでＯＳＲ１（胃）活性化に重要であると予測され、一方で、ＭＥＫ経路阻害は、小分子阻害剤ＰＤ０３２５９０１について、２９．６２の実質的なＦＣでＰＤＸ１活性化に強く寄与することが示された（図４Ｂ及びＣ）。したがって、胃／膵臓の運命の二分化能性は、それぞれＦＧＦ／ＦＧＦｉの入力によって解決される。注目すべきことに、ＳＯＸ２発現はＲＡによって強く減少し、ＳＨＨによって高度に調節され、それぞれのＦＣは－２８．５９及び２９．５８であった（図４Ｂ及びＣ）。ＳＯＸ２は、食道及び胃底胃円蓋の継続的なマーカーであり、したがって、げっ歯類におけるＰＤＸ１発現胃前庭部部のすぐ前方にある（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。我々のデータは、レチノイン酸が後方前庭部部を固定し、ＳＨＨの能動的阻害がＳＯＸ２発現の下方制御に寄与し、それにより胃部から膵臓部への切り替えを可能にすると主張している。この観察は、ヒヨコにおける発生の研究によって裏付けられている（Ｈｅｂｒｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
【0038】
ＤＦＥ由来の膵臓は、背側の同一性のものである
ＩＳＰＡが定義したＰＤＸ１最適化条件（図４Ｂに示す）を使用して、ＰＤＸ１発現ＤＦＥ由来ＰＥ培養物が、真のＰＥ状態が急速に誘導されたことを示すＦＯＸＡ２、ＮＲ５Ａ２、ＧＡＴＡ４及びＳＯＸ９を含むいくつかの既知の膵前駆細胞マーカーを共発現することが実証された（図４Ｄ）。このＤＦＥ由来の膵臓誘導は、Ｈ９雌胚性幹細胞株、ならびにｉＰＳＣ培養物で再現可能であることが示された（図１２）。ＲＮＡＳｅｑベースのＫｅｙＧｅｎｅｓ解析（Ｒｏｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を使用して、このＤＦＥ由来ＰＤＸ１誘導が本当に膵臓の運命であることを検証した（図４Ｅ）。我々は、以前に公開されたように（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、ＤＦＥに由来する膵臓内胚葉（ＰＥ）をＡＰＳ型ＤＥ由来の段階４のＰＥと比較した。興味深いことに、開始集団ＤＥ及びＤＦＥ培養物の両方は、最初に、脳への限定されたシグネチャを示し、これは、両方のプロトコルの連続的な段階を通じて失われた（図４Ｅ）。これは、両方の集団における連続段階（複数可）中に活性化されたニューロン運命抑制遺伝子の出現発現に起因する可能性が高い（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）（図４Ｆ）。公開されたＡＰＳ由来ＤＥ集団は、肺との類似性を示したが、ＤＦＥ集団は類似性を示さなかった（図４Ｅ）。これは、肺芽が腹側内胚葉のみに由来するためであると推測される。ＤＦＥ、ＤＥ及びそれらに由来するＰＥ集団間の階層クラスタリング比較は、ＤＦＥ及びＤＥ集団が、ＤＥ試料の３つのセットの間にクラスタリングされるＤＦＥ集団に非常に類似していることを示し（図１３）、腹側及び背側の両方のプロトコルが基本的な内胚葉プログラムを達成することを証明した。しかしながら、ＤＦＥまたはＤＥのいずれかに由来するＰＥを、ヒトの発生中の背側膵臓で高度に濃縮された遺伝子と比較すると（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、我々は、ＤＦＥ集団が、ＤＬＬ１、ＣＮＲ１、ＦＲＺＢ、ＨＯＸＡ１、及びＡＲＭＣ３を含むこれらの遺伝子のうちのいくつかを既に発現しているのに対し、ＡＰＳ－ＤＥ集団が、ＣＮＲ１及びＦＲＺＢの低い発現しか示していないことを見出した。また、前述の背側マーカーであるＭＮＸ１（Ｈｌｘｂ９）の発現は、ＤＦＥ培養物全体にわたって発現されたが、ＤＥ由来のＰＥは、ＰＦＧ段階で検出可能なＭＮＸ１発現を有するようになっただけであった（図４Ｆ）。その後、ＤＦＥに由来するＰＥは、背側特異的遺伝子の大部分を発現し続けた（図４Ｆ）。現在の膵臓ＤＤプロトコル（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）と比較すると、我々は、ＤＥ由来ＰＥが、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１ｂ、ＲＦＸ６、ＨＮＦ４Ａ、ＰＤＸ１、ＰＲＯＭ１及びＰＲＯＸ１の発現を通じて明らかなように、公開された「ＰＧＴ」段階で膵臓表現型を採用したが、「ＰＦＧ」段階で培養物がレチノイン酸に曝露されるまで、識別可能な背側同一性を有さなかったと結論づけた。前述のように、ＩＳＰＡの結果を考慮すると、本発明は任意の特定の機序に限定されず、本発明を理解または実施するために機序の理解は必要ではないが、これは、以前これらのプロトコルに起因する背側表現型が、プロトコルの後期に集団を背側運命にリダイレクトした結果であることを意味する。
ＩＳＰＡが定義したＰＤＸ１最適化条件（図４Ｂに示す）を使用して、ＰＤＸ１発現ＤＦＥ由来ＰＥ培養物が、真のＰＥ状態が急速に誘導されたことを示すＦＯＸＡ２、ＮＲ５Ａ２、ＧＡＴＡ４及びＳＯＸ９を含むいくつかの既知の膵前駆細胞マーカーを共発現することが実証された（図４Ｄ）。このＤＦＥ由来の膵臓誘導は、Ｈ９雌胚性幹細胞株、ならびにｉＰＳＣ培養物で再現可能であることが示された（図１２）。ＲＮＡＳｅｑベースのＫｅｙＧｅｎｅｓ解析（Ｒｏｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５）を使用して、このＤＦＥ由来ＰＤＸ１誘導が本当に膵臓の運命であることを検証した（図４Ｅ）。我々は、以前に公開されたように（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、ＤＦＥに由来する膵臓内胚葉（ＰＥ）をＡＰＳ型ＤＥ由来の段階４のＰＥと比較した。興味深いことに、開始集団ＤＥ及びＤＦＥ培養物の両方は、最初に、脳への限定されたシグネチャを示し、これは、両方のプロトコルの連続的な段階を通じて失われた（図４Ｅ）。これは、両方の集団における連続段階（複数可）中に活性化されたニューロン運命抑制遺伝子の出現発現に起因する可能性が高い（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）（図４Ｆ）。公開されたＡＰＳ由来ＤＥ集団は、肺との類似性を示したが、ＤＦＥ集団は類似性を示さなかった（図４Ｅ）。これは、肺芽が腹側内胚葉のみに由来するためであると推測される。ＤＦＥ、ＤＥ及びそれらに由来するＰＥ集団間の階層クラスタリング比較は、ＤＦＥ及びＤＥ集団が、ＤＥ試料の３つのセットの間にクラスタリングされるＤＦＥ集団に非常に類似していることを示し（図１３）、腹側及び背側の両方のプロトコルが基本的な内胚葉プログラムを達成することを証明した。しかしながら、ＤＦＥまたはＤＥのいずれかに由来するＰＥを、ヒトの発生中の背側膵臓で高度に濃縮された遺伝子と比較すると（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、我々は、ＤＦＥ集団が、ＤＬＬ１、ＣＮＲ１、ＦＲＺＢ、ＨＯＸＡ１、及びＡＲＭＣ３を含むこれらの遺伝子のうちのいくつかを既に発現しているのに対し、ＡＰＳ－ＤＥ集団が、ＣＮＲ１及びＦＲＺＢの低い発現しか示していないことを見出した。また、前述の背側マーカーであるＭＮＸ１（Ｈｌｘｂ９）の発現は、ＤＦＥ培養物全体にわたって発現されたが、ＤＥ由来のＰＥは、ＰＦＧ段階で検出可能なＭＮＸ１発現を有するようになっただけであった（図４Ｆ）。その後、ＤＦＥに由来するＰＥは、背側特異的遺伝子の大部分を発現し続けた（図４Ｆ）。現在の膵臓ＤＤプロトコル（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）と比較すると、我々は、ＤＥ由来ＰＥが、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ１ｂ、ＲＦＸ６、ＨＮＦ４Ａ、ＰＤＸ１、ＰＲＯＭ１及びＰＲＯＸ１の発現を通じて明らかなように、公開された「ＰＧＴ」段階で膵臓表現型を採用したが、「ＰＦＧ」段階で培養物がレチノイン酸に曝露されるまで、識別可能な背側同一性を有さなかったと結論づけた。前述のように、ＩＳＰＡの結果を考慮すると、本発明は任意の特定の機序に限定されず、本発明を理解または実施するために機序の理解は必要ではないが、これは、以前これらのプロトコルに起因する背側表現型が、プロトコルの後期に集団を背側運命にリダイレクトした結果であることを意味する。
【0039】
ＤＦＥ由来のＰＥからの内分泌膵臓の効果的な誘導は、時間に依存する
膵臓前駆体の同一性をさらに検証するために、ＤＦＥ由来のＰＥを、膵臓系統特異的マーカーを用いて最終膵臓運命に対する前方の分化能について特性化した。内分泌細胞の最終分化のためのＮＯＴＣＨ経路阻害の重要性は周知である（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ａｆｅｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）ので、全てがＮＯＴＣＨ経路阻害剤（ｇ－セクレターゼ阻害剤ＸＸ）を含み、単一のＳＭＡＤ（Ａｌｋ５阻害剤）及び二重ＳＭＡＤ阻害（Ａｌｋ５ｉ／ＬＤＮ）を評価する、内分泌コミットメントに対するＮＯＴＣＨ阻害の時間的効果を、図５Ａに概要を示した３つの培地入力を使用して評価した。条件にかかわらず、これらの培地は内分泌分化を誘導することができた。単一のＳＭＡＤ阻害は、二重のＳＭＡＤ阻害よりも好ましいように見え、ＳＭＡＤ阻害の非存在は、わずかに増加した腺房分化をもたらした（図５Ｂ～Ｃ）。複数の発生系（例として、体節形成、神経発達）は、ＮＯＴＣＨシグナル伝達の総持続時間に依存するため、膵臓誘導中、ＮＯＴＣＨ経路が活性化するようになる時間の滞在時間を変化させた。顕著なことに、ＰＥ誘導の期間を延長すると、内分泌コンピテンスが低下した。これらのデータは、ＰＤＸ１活性化後に培養がコンピテンスウインドウを通じて進行し、これが延長した場合、許容内分泌誘導条件下であっても内分泌運命の喪失をもたらすことを明らかにした（図５Ｃ）。注目すべきことに、ＰＥ段階で持続時間を増加させることにより、腺房に向かうコンピテンスが増加し、最終的に、管分化へのコンピテンスが増加した。ＣＰＢ１、ＭＩＳＴ１（ＢＨＬＨＡ１５）の発現を通じてアッセイしたように、腺房コンピテンスは、ＰＥ培養物が、ＮＯＴＣＨ阻害を受ける前に５日間ＮＯＴＣＨシグナル伝達に関与することが可能であり続けたときに観察された（図５Ｃ）。これは、内分泌系統のコンピテンスが、まず腺胞前で時間的に調節され、続いて最終的に管系統に向かって調節されることを意味する（図１４Ａ及び１４Ｃ）。Ｆ３、ＨＮＦ１β及びＰＲＯＭ１の発現を通して観察されるように、管分化は、ＰＥ集団が活性ＮＯＴＣＨのＰＥ状態に留まることを許容する期間が長いほど増加し（図５Ｃ）、ＮＯＴＣＨが管運命に対して許容的であることと一致した（Ａｆｅｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
膵臓前駆体の同一性をさらに検証するために、ＤＦＥ由来のＰＥを、膵臓系統特異的マーカーを用いて最終膵臓運命に対する前方の分化能について特性化した。内分泌細胞の最終分化のためのＮＯＴＣＨ経路阻害の重要性は周知である（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ａｆｅｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）ので、全てがＮＯＴＣＨ経路阻害剤（ｇ－セクレターゼ阻害剤ＸＸ）を含み、単一のＳＭＡＤ（Ａｌｋ５阻害剤）及び二重ＳＭＡＤ阻害（Ａｌｋ５ｉ／ＬＤＮ）を評価する、内分泌コミットメントに対するＮＯＴＣＨ阻害の時間的効果を、図５Ａに概要を示した３つの培地入力を使用して評価した。条件にかかわらず、これらの培地は内分泌分化を誘導することができた。単一のＳＭＡＤ阻害は、二重のＳＭＡＤ阻害よりも好ましいように見え、ＳＭＡＤ阻害の非存在は、わずかに増加した腺房分化をもたらした（図５Ｂ～Ｃ）。複数の発生系（例として、体節形成、神経発達）は、ＮＯＴＣＨシグナル伝達の総持続時間に依存するため、膵臓誘導中、ＮＯＴＣＨ経路が活性化するようになる時間の滞在時間を変化させた。顕著なことに、ＰＥ誘導の期間を延長すると、内分泌コンピテンスが低下した。これらのデータは、ＰＤＸ１活性化後に培養がコンピテンスウインドウを通じて進行し、これが延長した場合、許容内分泌誘導条件下であっても内分泌運命の喪失をもたらすことを明らかにした（図５Ｃ）。注目すべきことに、ＰＥ段階で持続時間を増加させることにより、腺房に向かうコンピテンスが増加し、最終的に、管分化へのコンピテンスが増加した。ＣＰＢ１、ＭＩＳＴ１（ＢＨＬＨＡ１５）の発現を通じてアッセイしたように、腺房コンピテンスは、ＰＥ培養物が、ＮＯＴＣＨ阻害を受ける前に５日間ＮＯＴＣＨシグナル伝達に関与することが可能であり続けたときに観察された（図５Ｃ）。これは、内分泌系統のコンピテンスが、まず腺胞前で時間的に調節され、続いて最終的に管系統に向かって調節されることを意味する（図１４Ａ及び１４Ｃ）。Ｆ３、ＨＮＦ１β及びＰＲＯＭ１の発現を通して観察されるように、管分化は、ＰＥ集団が活性ＮＯＴＣＨのＰＥ状態に留まることを許容する期間が長いほど増加し（図５Ｃ）、ＮＯＴＣＨが管運命に対して許容的であることと一致した（Ａｆｅｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
【0040】
背側型ＰＥ由来β細胞は胎児様である
内分泌運命への前方分化の条件が主にＮＯＴＣＨシグナル伝達阻害に依存しており、ＱｂＤアプローチを用いて最適化されていないことを認めて、得られた内分泌出力を検査し、成熟状態も決定した。短い持続時間のＰＥ状態（図６Ａ）を用いて、ＴｒＰＣプロ内分泌細胞を代表する細胞状態であり、機能的β細胞を生成するために必要なＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋共発現が、培養物全体にわたって生じたことを見出した（図６Ｂ）。マウスではないがヒトでは、ＮＫＸ２．２は、ベータ細胞特異的であり、ＭＰＣによって発現されない。ＮＫＸ２．２をインスリンＣペプチドと共に、培養物全体のパッチ内で共発現させた。さらに、ＩＮＳ＋／ＧＣＧ＋またはＩＮＳ＋／ＳＳＴ＋を共発現する細胞では、複数の内分泌産物の誘導が観察された（図６Ｂ）。Ｃペプチド産生が増加するほど、培養物がＮｏｔｃｈ阻害に曝露する時間が長くなり、１０日後に最大レベルが生じ、その後に安定した（図６Ｃ）。細胞集合体は、ジチゾン保持、結果としてＺｎ２＋負荷を実証した（図６Ｄ）。インスリン分泌をチャレンジさせたとき、ＫＣｌは、検出可能なＣペプチドレベルの４倍の増加を誘導したが、グルコースチャレンジ（２ｍＭ＞２０ｍＭ）は、Ｃペプチド分泌を誘導しなかった（図６Ｅ）。内分泌由来培養物のマイクロ流体評価は、約６％の検出可能なカルシウム流入を示し（図６Ｆ）、再びグルコース反応の非存在が観察された。古典的なＧＳＩＳ及びマイクロ流体分析アッセイの結果は、一貫しており、インスリンを合成及び貯蔵することができる未熟なβ細胞生理学を実証したが、グルコース変動に応答するときの機能プロファイルは限られており、これは、ＡＰＳ－ＤＥ由来のβ細胞から以前に観察された胎児様β細胞状態の特性である（Ｈｒｖａｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
内分泌運命への前方分化の条件が主にＮＯＴＣＨシグナル伝達阻害に依存しており、ＱｂＤアプローチを用いて最適化されていないことを認めて、得られた内分泌出力を検査し、成熟状態も決定した。短い持続時間のＰＥ状態（図６Ａ）を用いて、ＴｒＰＣプロ内分泌細胞を代表する細胞状態であり、機能的β細胞を生成するために必要なＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋共発現が、培養物全体にわたって生じたことを見出した（図６Ｂ）。マウスではないがヒトでは、ＮＫＸ２．２は、ベータ細胞特異的であり、ＭＰＣによって発現されない。ＮＫＸ２．２をインスリンＣペプチドと共に、培養物全体のパッチ内で共発現させた。さらに、ＩＮＳ＋／ＧＣＧ＋またはＩＮＳ＋／ＳＳＴ＋を共発現する細胞では、複数の内分泌産物の誘導が観察された（図６Ｂ）。Ｃペプチド産生が増加するほど、培養物がＮｏｔｃｈ阻害に曝露する時間が長くなり、１０日後に最大レベルが生じ、その後に安定した（図６Ｃ）。細胞集合体は、ジチゾン保持、結果としてＺｎ２＋負荷を実証した（図６Ｄ）。インスリン分泌をチャレンジさせたとき、ＫＣｌは、検出可能なＣペプチドレベルの４倍の増加を誘導したが、グルコースチャレンジ（２ｍＭ＞２０ｍＭ）は、Ｃペプチド分泌を誘導しなかった（図６Ｅ）。内分泌由来培養物のマイクロ流体評価は、約６％の検出可能なカルシウム流入を示し（図６Ｆ）、再びグルコース反応の非存在が観察された。古典的なＧＳＩＳ及びマイクロ流体分析アッセイの結果は、一貫しており、インスリンを合成及び貯蔵することができる未熟なβ細胞生理学を実証したが、グルコース変動に応答するときの機能プロファイルは限られており、これは、ＡＰＳ－ＤＥ由来のβ細胞から以前に観察された胎児様β細胞状態の特性である（Ｈｒｖａｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
【0041】
胎児様β細胞の誘導のための小分子法
ＰＤＸ１Ｏｐｔ条件の検査により、レチノイン酸及びＰＤ０３２５がそれぞれ３１．３８及び２９．６２の最も高い因子寄与度を有し（図７Ａ）、試験した他の全てのエフェクターが低い因子寄与度＜１０であることが確認された。膵臓内分泌細胞誘導のための複雑性が最小限の方法を達成するために、ＤＦＥ誘導のためのそのような構成要素（ＲＡ及びＬＤＮ（Ｒ／Ｌ））を、ＰＤＸ１Ｏｐｔ（Ｒ Ａ及びＰＤ０３２５（Ｒ／Ｐ））の重要な構成要素と組み合わせ、最後に、ＮＯＴＣＨ及びＡＬＫ５阻害を使用した内分泌運命への変換で完了した。まず、ＨＮＦ１βｏｐｔを使用したＤＦＥ誘導の後、アッセイした膵臓マーカーのＲ／Ｐの有意な増加が観察され、内分泌誘導が続いたときにこの増加が増幅された（図７Ｂ）。ＨＮＦ１βＯｐｔを（Ｒ／Ｌ）工程の使用で置き換えると、膵臓遺伝子のさらなる増加が観察された。Ｒ／Ｌ工程、続いてＰｄｘ１ｏｐｔ条件を使用して、最も高いレベルの膵臓遺伝子ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡ、ＧＬＰ１Ｒ、及びＰＤＸ１を生成した（図７Ｂ）。しかしながら、ＨＮＦ１βＯｐｔ及びＰＤＸ１Ｏｐｔの両方がＲ／Ｌ及びＲ／Ｐと併せて置き換えられたときに匹敵する変化が観察された。ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡ、ＧＬＰ１Ｒ及びＰＤＸ１発現のわずかな減少がこれらの条件下で観察されたが、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＭＡＦＡ及びＳＳＴの発現において中等度の代償的増加が観察された。我々は、多能性細胞の胎児β細胞への指向分化を、５つの小分子：ＲＡ、ＬＤＮ３１８９、ＰＤ０３２５９０１、ガンマ－ＸＸ及びＡ８３０１を用いた３つの連続した段階を通じて迅速に達成することができると結論する。
ＰＤＸ１Ｏｐｔ条件の検査により、レチノイン酸及びＰＤ０３２５がそれぞれ３１．３８及び２９．６２の最も高い因子寄与度を有し（図７Ａ）、試験した他の全てのエフェクターが低い因子寄与度＜１０であることが確認された。膵臓内分泌細胞誘導のための複雑性が最小限の方法を達成するために、ＤＦＥ誘導のためのそのような構成要素（ＲＡ及びＬＤＮ（Ｒ／Ｌ））を、ＰＤＸ１Ｏｐｔ（Ｒ Ａ及びＰＤ０３２５（Ｒ／Ｐ））の重要な構成要素と組み合わせ、最後に、ＮＯＴＣＨ及びＡＬＫ５阻害を使用した内分泌運命への変換で完了した。まず、ＨＮＦ１βｏｐｔを使用したＤＦＥ誘導の後、アッセイした膵臓マーカーのＲ／Ｐの有意な増加が観察され、内分泌誘導が続いたときにこの増加が増幅された（図７Ｂ）。ＨＮＦ１βＯｐｔを（Ｒ／Ｌ）工程の使用で置き換えると、膵臓遺伝子のさらなる増加が観察された。Ｒ／Ｌ工程、続いてＰｄｘ１ｏｐｔ条件を使用して、最も高いレベルの膵臓遺伝子ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡ、ＧＬＰ１Ｒ、及びＰＤＸ１を生成した（図７Ｂ）。しかしながら、ＨＮＦ１βＯｐｔ及びＰＤＸ１Ｏｐｔの両方がＲ／Ｌ及びＲ／Ｐと併せて置き換えられたときに匹敵する変化が観察された。ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＮＫＸ６．１、ＣＨＧＡ、ＧＬＰ１Ｒ及びＰＤＸ１発現のわずかな減少がこれらの条件下で観察されたが、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＭＡＦＡ及びＳＳＴの発現において中等度の代償的増加が観察された。我々は、多能性細胞の胎児β細胞への指向分化を、５つの小分子：ＲＡ、ＬＤＮ３１８９、ＰＤ０３２５９０１、ガンマ－ＸＸ及びＡ８３０１を用いた３つの連続した段階を通じて迅速に達成することができると結論する。
【0042】
多能性細胞を領域化内胚葉集団（ＤＦＥ）に迅速に変換することができる新しいプロトコルを実証した。この内胚葉集団は、背側膵像前駆細胞を形成し、５つの小分子のみの使用に依存する３段階のプロトコルを通じて内分泌変換を受けるコンピテンスを有する。
【0043】
ＲＮＡ－Ｓｅｑデータは、ＤＦＥが複数の遺伝子に基づく背側形質のものであることを実証した。Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．は、ヒトの発生中の膵臓の背側と腹側の同一性を調査し、１３個の遺伝子の定義されたセットが背側膵臓と腹側膵臓との間を区別できることを示した。我々の解釈の基礎として、ＤＦＥ集団は背側の運命と一致した。後の段階でのレチノイン酸の投与を用いて、この背側面をＡＰＳ－ＤＥに注入した。ＤＦＥの場合、背側の同一性は膵臓に持ち越され、この状態は全ての膵臓系統の誘導に許容される。以前の研究では、ＤＥは肝臓迷走運命を被っている（Ｍｆｏｐｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０）が、ＤＦＥ由来の膵臓はそうではないことが実証しているが、我々は、ＤＥが前庭部胃誘導に二分化能性であることを指摘している。これは、腹側膵臓が肝臓誘導のための二分化能性のコンピテンスを有するために予想される（Ａｎｇｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２、Ｄｅｕｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｔｒｅｍｂｌａｙ ａｎｄ Ｚａｒｅｔ，２００５、Ｂｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００４）。初期の側板由来ＢＭＰは、この前駆細胞を肝臓運命に向けて指示し（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８）、ＢＭＰ４で処置したＰＥもまた、肝臓遺伝子を誘導した。対照的に、ＩＳＰＡ分析は、ＳＨＨ及びレチノイン酸が、二分化能性膵臓／胃前駆細胞に影響を与える重要なプロセス入力であることを示唆した。これらの所見は、ヒヨコにおける背側膵臓特異化の以前の研究（Ｈｅｂｒｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９８）と一致する。内胚葉集団の背側／腹側起源にかかわらず、ＤＦＥ及びＡＰＳ－ＤＥの両方は、内分泌細胞を生成することができる膵臓内胚葉を容易に生じる。ＡＰＳ－ＤＥ由来細胞について観察されるように、ＤＦＥ由来内分泌細胞は、完全に成熟したグルコース応答性β細胞よりも、胎児β細胞に機能的に類似している。
【0044】
材料及び方法
細胞培養
多能性培養物をＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｇｉｂｃｏ Ａ１５１６９－０１）に順応化させ、ビトロネクチン（Ｇｉｂｃｏ Ａ１４７００）コーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．３５９８）上で増殖させた。分化実験は、１ｃｍ２あたり７５，０００個の細胞で播種し、分化を開始させる前に培養物が約９０％の集密度になるまで、Ｅ８培地中で４８時間維持した。全ての増殖因子及び小分子を供給元の推奨に従って再構成し、アリコートを－８０℃で最長１年間保管した。増殖培地は毎日交換され、ＤＥプロトコルを除き、全ての分化実験で使用された基礎培地はＣＤＭ２であった（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＰＳＯｐｔは、２５０ｎＭのＬＤＮ３１８９（Ｓｅｌｌｅｋｃｈｅｍ Ｓ２６１８）、５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ １２０－１４）、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ １３２５６０２９）、１００ｎＭのＳａｎｔ１（Ｓｅｌｌｅｋｃｈｅｍ Ｓ７０９２）から構成された。ＨＮＦ１βＯｐｔに、２５０ｎＭのＬＤＮ３１８９、５００ｎＭのＡ８３０１（Ｂｉｏｇｅｍｓ ４４６３３２５）、１２．６ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ５０３６ＷＮ／ＣＦ）、２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２５０ｎＭのＰＤ０３２５（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｍｅ Ｓ１０３６）、４０ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ １００－４５）及び２ｕＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｒ２６２５）を補充した。前述の条件（Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）を使用して、ＤＥを生成した。ＰＤＸ１Ｏｐｔは、５００ｎＭのＡ８３０１、２５０ｎＭのＬＤＮ３１８９、１００ｎＭのＳａｎｔ１、２５０ｎＭのＰＤ０３２５、２ｕＭのレチノイン酸及び１％ Ｂ２７補助剤（Ｇｉｂｃｏ １２５８７）で構成され、テキスト内で異なることが記載されている場合を除き、細胞を分化するのに３日間連続して使用した。内分泌プッシュ培地に、１００ｎＭのガンマ－セクレターゼ阻害剤ＸＸ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ５６５７８９）及び５００ｎＭのＡ８３０１を補充した。胃オルガノイドは、修正プロトコルを使用して生成した（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。簡潔に言うと、ＨＮＦ１βＯｐｔ培養物を、５００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ、５００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４（Ｒ＆Ｄ ７４６０－Ｆ４）、２５０ｎＭのＬＤＮ３１８９及び２ｕＭのレチノイン酸（ＲＡ初日のみ）を補充したステージ２培地で３日間インキュベートした。培養物を、１：４のマトリゲル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３５４２３０）／ＣＤＭ２混合物中で播種を行い、３７℃で３０分間インキュベートした後、２ｕＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＬＤＮ３１８９及び１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ２３６－ＥＧ）から構成されたステージ３培地を３日間適用することによって３日間適用することによって１：６で継代させた。次いで、培養物を、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで補充したステージ４培地で２３日間補充した後、オルガノイドを回収し、切片化のために固定した。
細胞培養
多能性培養物をＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Ｇｉｂｃｏ Ａ１５１６９－０１）に順応化させ、ビトロネクチン（Ｇｉｂｃｏ Ａ１４７００）コーティングプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．３５９８）上で増殖させた。分化実験は、１ｃｍ２あたり７５，０００個の細胞で播種し、分化を開始させる前に培養物が約９０％の集密度になるまで、Ｅ８培地中で４８時間維持した。全ての増殖因子及び小分子を供給元の推奨に従って再構成し、アリコートを－８０℃で最長１年間保管した。増殖培地は毎日交換され、ＤＥプロトコルを除き、全ての分化実験で使用された基礎培地はＣＤＭ２であった（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＡＰＳＯｐｔは、２５０ｎＭのＬＤＮ３１８９（Ｓｅｌｌｅｋｃｈｅｍ Ｓ２６１８）、５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ １２０－１４）、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ １３２５６０２９）、１００ｎＭのＳａｎｔ１（Ｓｅｌｌｅｋｃｈｅｍ Ｓ７０９２）から構成された。ＨＮＦ１βＯｐｔに、２５０ｎＭのＬＤＮ３１８９、５００ｎＭのＡ８３０１（Ｂｉｏｇｅｍｓ ４４６３３２５）、１２．６ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ（Ｒ＆Ｄ５０３６ＷＮ／ＣＦ）、２５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２５０ｎＭのＰＤ０３２５（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｍｅ Ｓ１０３６）、４０ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ １００－４５）及び２ｕＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｒ２６２５）を補充した。前述の条件（Ｒｅｚａｎｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，２００５）を使用して、ＤＥを生成した。ＰＤＸ１Ｏｐｔは、５００ｎＭのＡ８３０１、２５０ｎＭのＬＤＮ３１８９、１００ｎＭのＳａｎｔ１、２５０ｎＭのＰＤ０３２５、２ｕＭのレチノイン酸及び１％ Ｂ２７補助剤（Ｇｉｂｃｏ １２５８７）で構成され、テキスト内で異なることが記載されている場合を除き、細胞を分化するのに３日間連続して使用した。内分泌プッシュ培地に、１００ｎＭのガンマ－セクレターゼ阻害剤ＸＸ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ５６５７８９）及び５００ｎＭのＡ８３０１を補充した。胃オルガノイドは、修正プロトコルを使用して生成した（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。簡潔に言うと、ＨＮＦ１βＯｐｔ培養物を、５００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ、５００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４（Ｒ＆Ｄ ７４６０－Ｆ４）、２５０ｎＭのＬＤＮ３１８９及び２ｕＭのレチノイン酸（ＲＡ初日のみ）を補充したステージ２培地で３日間インキュベートした。培養物を、１：４のマトリゲル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３５４２３０）／ＣＤＭ２混合物中で播種を行い、３７℃で３０分間インキュベートした後、２ｕＭのレチノイン酸、２５０ｎＭのＬＤＮ３１８９及び１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ２３６－ＥＧ）から構成されたステージ３培地を３日間適用することによって３日間適用することによって１：６で継代させた。次いで、培養物を、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで補充したステージ４培地で２３日間補充した後、オルガノイドを回収し、切片化のために固定した。
【0045】
コンピュータモデリング
全てのＤｏＥ実験設計は、ＭＯＤＤＥソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＳＳＤＡＳ）におけるＤ－最適インターラクション設計を使用してコンピュータで生成した。Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ１５０リキッドハンドリングロボット（ＴＥＣＡＮ，ＣＨ）上で摂動マトリックスを生成した（９６回の独立した実験を実施）。各ＤｏＥ分化実験は、培地を毎日交換して、摂動マトリックスの３日間の適用を使用した。手動での予備的増殖及び播種、ならびに任意のロボット操作を含む全ての細胞培養物は、細胞培養条件のプロセス分析技術（ＰＡＴ）を提供するモジュール式Ｘ－Ｖｉｖｏシステム（Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ，ＮＹ，ＵＳＡ）に含まれていた（％Ｎ２、％Ｏ２、％ＣＯ２、ならびに実験プロセスの任意の時点での温度制御及びモニタリングを提供する）。エンドポイントデータ収集は、Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙ ＲＴ－ＱＰＣＲ法（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、５３遺伝子／試料／カード）を使用して行った。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ遺伝子発現データを、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＳｕｉｔｅＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）内で正規化し、標準化し、ＭＯＤＤＥにエクスポートした。分化空間の数学的モデリングを、説明される変動（ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｖａｒｉａｎｃｅ）を最大化するＰＬＳを使用してＭＯＤＤＥで実行し、その後、遺伝子特異的モデルをＱ２最大化によって調整した。応答の最大化または最小化のための適合モデル最適化条件を、ソフトウェア予測ツール「オプティマイザー」及び「動的プロファイル」分析を使用して抽出した。仮想実験は、所望のパラメータに対する経路相対貢献に対処する、実験設計によってカバーされる既知の空間で行った。
全てのＤｏＥ実験設計は、ＭＯＤＤＥソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＳＳＤＡＳ）におけるＤ－最適インターラクション設計を使用してコンピュータで生成した。Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ１５０リキッドハンドリングロボット（ＴＥＣＡＮ，ＣＨ）上で摂動マトリックスを生成した（９６回の独立した実験を実施）。各ＤｏＥ分化実験は、培地を毎日交換して、摂動マトリックスの３日間の適用を使用した。手動での予備的増殖及び播種、ならびに任意のロボット操作を含む全ての細胞培養物は、細胞培養条件のプロセス分析技術（ＰＡＴ）を提供するモジュール式Ｘ－Ｖｉｖｏシステム（Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ，ＮＹ，ＵＳＡ）に含まれていた（％Ｎ２、％Ｏ２、％ＣＯ２、ならびに実験プロセスの任意の時点での温度制御及びモニタリングを提供する）。エンドポイントデータ収集は、Ｏｐｅｎ Ａｒｒａｙ ＲＴ－ＱＰＣＲ法（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、５３遺伝子／試料／カード）を使用して行った。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ遺伝子発現データを、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＳｕｉｔｅＴＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）内で正規化し、標準化し、ＭＯＤＤＥにエクスポートした。分化空間の数学的モデリングを、説明される変動（ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｖａｒｉａｎｃｅ）を最大化するＰＬＳを使用してＭＯＤＤＥで実行し、その後、遺伝子特異的モデルをＱ２最大化によって調整した。応答の最大化または最小化のための適合モデル最適化条件を、ソフトウェア予測ツール「オプティマイザー」及び「動的プロファイル」分析を使用して抽出した。仮想実験は、所望のパラメータに対する経路相対貢献に対処する、実験設計によってカバーされる既知の空間で行った。
【0046】
ＲＮＡ及びｃＤＮＡ調製物
モデリング分析用のＲＮＡ抽出は、ＭａｇＭａｘ－９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＭ１８３０）を使用して行い、製造業者のプロトコルに従って行った。ＲＮＡ試料の逆転写を、高容量ｃＤＮＡ ＲＴキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ４３６８８１４）により提供される反応条件を使用して行った。ＲＮＡ ＳｅｑのためのＲＮＡ抽出及びＱＲＴ－ＰＣＲバリデーションは、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １５５９６０１８）ベースの方法を使用して生じるＲＮＡ抽出を用いて、四通りで行った。次いで、ＯｐｅｎＡｒｒａｙバリデーション（モデリングではない）のために、ｃＤＮＡをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ分析に供した。次いで、得られたデータをハウスキーピング遺伝子に正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０２ソフトウェアを使用してグラフ化した。
モデリング分析用のＲＮＡ抽出は、ＭａｇＭａｘ－９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＡＭ１８３０）を使用して行い、製造業者のプロトコルに従って行った。ＲＮＡ試料の逆転写を、高容量ｃＤＮＡ ＲＴキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ４３６８８１４）により提供される反応条件を使用して行った。ＲＮＡ ＳｅｑのためのＲＮＡ抽出及びＱＲＴ－ＰＣＲバリデーションは、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １５５９６０１８）ベースの方法を使用して生じるＲＮＡ抽出を用いて、四通りで行った。次いで、ＯｐｅｎＡｒｒａｙバリデーション（モデリングではない）のために、ｃＤＮＡをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ分析に供した。次いで、得られたデータをハウスキーピング遺伝子に正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０２ソフトウェアを使用してグラフ化した。
【0047】
モデリング分析用のＱＲＴ－ＰＣＲ
試料を、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ ＡｃｃｕＦｉｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ４４７１０２１）を使用してカスタム設計のＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ Ｃａｒｄに装填し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ４４７１０９０）上で実行した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏオープンアレイ分析は、オープンアレイ構成ごとに選択された５３個の遺伝子の発現情報を提供した。得られたデータは、ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｉｔｅでＱＣ評価を受け、増幅に失敗した任意の遺伝子を除去し、３つの内部標準に対して正規化した（内部標準は設計間で変更された）。初期の設計には、多能性の下流にある全ての主要なサブ系統の運命に応答する遺伝子が含まれていたが、後の設計は、膵臓の運命に重点を置いた内胚葉系統により焦点を当てていた。使用した全てのオープンアレイ設計について、プラットフォーム当たりのプライマー／ＴａｑＭａｎプローブセットは、０．９７５以上の典型的な信頼性増幅（Ｃｑ Ｃｏｎｆ．）スコアを提供した。各モデリング実験は、約１０，０００個の個々の遺伝子発現応答データポイントを生成し、ＭＯＤＤＥ最適化はそれに基づいた。
試料を、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ ＡｃｃｕＦｉｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ４４７１０２１）を使用してカスタム設計のＱｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ Ｃａｒｄに装填し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １２ｋ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ４４７１０９０）上で実行した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏオープンアレイ分析は、オープンアレイ構成ごとに選択された５３個の遺伝子の発現情報を提供した。得られたデータは、ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｉｔｅでＱＣ評価を受け、増幅に失敗した任意の遺伝子を除去し、３つの内部標準に対して正規化した（内部標準は設計間で変更された）。初期の設計には、多能性の下流にある全ての主要なサブ系統の運命に応答する遺伝子が含まれていたが、後の設計は、膵臓の運命に重点を置いた内胚葉系統により焦点を当てていた。使用した全てのオープンアレイ設計について、プラットフォーム当たりのプライマー／ＴａｑＭａｎプローブセットは、０．９７５以上の典型的な信頼性増幅（Ｃｑ Ｃｏｎｆ．）スコアを提供した。各モデリング実験は、約１０，０００個の個々の遺伝子発現応答データポイントを生成し、ＭＯＤＤＥ最適化はそれに基づいた。
【0048】
培養物の免疫組織化学分析
細胞培養物を周囲温度で４％パラホルムアルデヒド（ＥＭＤ３０５２５－８９－４）溶液で１５分間処理することによって、組織学的特性化を行った。次いで、０．５％の遮断試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＦＰ１０１２）及び０．１％のＴｒｉｎｔｏｎＸ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ１５１）を補充した０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｈ５１２３）ｐＨ７．５を用いて試料を遮断し、１時間透過させた。全ての抗体溶液を０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｈ５１２３）ｐＨ７．５で希釈し、一次抗体を一晩インキュベートし、二次抗体を１時間インキュベートした。全てのインキュベーションは、周囲温度で行った。培養物をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｈ－１２００）の１：２希釈液で処理した。使用した特異的抗体及び希釈液を表１に示す。
細胞培養物を周囲温度で４％パラホルムアルデヒド（ＥＭＤ３０５２５－８９－４）溶液で１５分間処理することによって、組織学的特性化を行った。次いで、０．５％の遮断試薬（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＦＰ１０１２）及び０．１％のＴｒｉｎｔｏｎＸ－１００（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＢＰ１５１）を補充した０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｈ５１２３）ｐＨ７．５を用いて試料を遮断し、１時間透過させた。全ての抗体溶液を０．１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｈ５１２３）ｐＨ７．５で希釈し、一次抗体を一晩インキュベートし、二次抗体を１時間インキュベートした。全てのインキュベーションは、周囲温度で行った。培養物をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング培地（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｈ－１２００）の１：２希釈液で処理した。使用した特異的抗体及び希釈液を表１に示す。
【0049】
【表1-1】
【0050】
【表1-2】
【0051】
培養物は、一般に、それらが分化したＴＣ培養小胞内で染色され、一方凝集体またはオルガノイドは固定され、ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ４５８３）に埋め込まれ、その後染色前にクリオスタット切片化を行った。
【0052】
内分泌細胞の特性化
２ｍＭのグルコースを補充したＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中の細胞を３０分間インキュベートして、基底Ｃペプチドレベルを決定することによって、ＧＳＩＳアッセイを行った。これに続いて、反応緩衝液を、２０ｍＭのグルコースまたは３０ｍＭのＫＣｌのいずれかを補充したＫｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液に交換し、さらに３０分間インキュベーションした。緩衝液試料を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ １０－１１４１－０１）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＣ－ペプチドレベルを定量化した。マイクロ流体アッセイを、前述の通り（Ａｄｅｗｏｌａ ｅｔ ａｌ，２０１０、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）に行った。
２ｍＭのグルコースを補充したＫｒｅｂｓ－Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液中の細胞を３０分間インキュベートして、基底Ｃペプチドレベルを決定することによって、ＧＳＩＳアッセイを行った。これに続いて、反応緩衝液を、２０ｍＭのグルコースまたは３０ｍＭのＫＣｌのいずれかを補充したＫｒｅｂｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液に交換し、さらに３０分間インキュベーションした。緩衝液試料を収集し、ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ １０－１１４１－０１）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってＣ－ペプチドレベルを定量化した。マイクロ流体アッセイを、前述の通り（Ａｄｅｗｏｌａ ｅｔ ａｌ，２０１０、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２）に行った。
【0053】
ＲＮＡ Ｓｅｑ及びキー遺伝子解析
ＲＮＡ試料を、シカゴ大学ゲノミクスコアによって配列決定した。ＨＩＳＡＴ２バージョン２．０．５ソフトウェアを使用して、ＦＡＳＴＱファイルを参照ｈｇ１９に対してアライメントさせた。アライメントされたリードの遺伝子数は、ＲｅｆＳｅｑアノテーションファイルを使用してＨＴＳｅｑバージョン０．８．０によって生成した。差次的発現解析は、１００万個あたり４カウントのカットオフを用いてｅｄｇｅＲバージョン３．１８．１を使用して行った。ＫｅｙＧｅｎｅｓ解析は、公開されたプロトコルに従って提供されたトレーニングセットを使用して行った（Ｒｏｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。階層的クラスタリングは、示される全てのｈＥＳＣ派生物を含有する部分のみを用いて、８７個のＫｅｙＧｅｎｅｓ分類子遺伝子上のＲパッケージｇｐｌｏｔ及びｇｇｐｌｏｔ２を有するＲＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して実施した。差次的発現は、ＥｄｇｅＲパッケージを用いて決定し、ヒートマップはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて生成した。
ＲＮＡ試料を、シカゴ大学ゲノミクスコアによって配列決定した。ＨＩＳＡＴ２バージョン２．０．５ソフトウェアを使用して、ＦＡＳＴＱファイルを参照ｈｇ１９に対してアライメントさせた。アライメントされたリードの遺伝子数は、ＲｅｆＳｅｑアノテーションファイルを使用してＨＴＳｅｑバージョン０．８．０によって生成した。差次的発現解析は、１００万個あたり４カウントのカットオフを用いてｅｄｇｅＲバージョン３．１８．１を使用して行った。ＫｅｙＧｅｎｅｓ解析は、公開されたプロトコルに従って提供されたトレーニングセットを使用して行った（Ｒｏｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。階層的クラスタリングは、示される全てのｈＥＳＣ派生物を含有する部分のみを用いて、８７個のＫｅｙＧｅｎｅｓ分類子遺伝子上のＲパッケージｇｐｌｏｔ及びｇｇｐｌｏｔ２を有するＲＳｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して実施した。差次的発現は、ＥｄｇｅＲパッケージを用いて決定し、ヒートマップはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて生成した。
【0054】
実施例２
レチノイド化合物を使用したＤＦＥ細胞の生成
本実施例は、既知の生物活性を有するレチノイドを使用した、多能性幹細胞からの背側前腸内胚葉細胞の生成について記載する。本実施例はまた、ＴＧＦｂアゴニズム、ＴＧＦｂ阻害及びレチノイドアゴニズムの協調活性を通じて、原腸形成中に内胚葉がどのようにパターン化されるかを記載する。
レチノイド化合物を使用したＤＦＥ細胞の生成
本実施例は、既知の生物活性を有するレチノイドを使用した、多能性幹細胞からの背側前腸内胚葉細胞の生成について記載する。本実施例はまた、ＴＧＦｂアゴニズム、ＴＧＦｂ阻害及びレチノイドアゴニズムの協調活性を通じて、原腸形成中に内胚葉がどのようにパターン化されるかを記載する。
【0055】
結果
レチノイン酸は、レチノールをレチナールに変換し、最終的にレチノイン酸に変換する一連の連続的な酵素酸化反応を通じて体内で生成される。オールトランスレチノイン酸が分子の生物学的に関連する形態であることは一般に認められているが、レチノイン酸が長い共役骨格のため、多くの異性体形態で存在する。３つの一般的なアイソフォーム；７－シスレチノイン酸、１３－シスレチノイン酸、及びオールトランスレチノイン酸が循環中に観察されており、これらの異なる異性体の血清比は、経時的に一貫していることが示されている。肝臓溶解物を使用した実験では、これらの異なる異性体間の変換が酵素的に調節されていることが示唆されているが、これらの変換に関与する酵素は明確に特定されていない。研究により、これらのアイソフォームは、ＲＡＲ及びＲＸＲに対する差次的な結合親和性を有することが示されている。レチノイン酸が細胞内に産生される、または細胞に入ると、レチノイン酸を４－オキソ－レチノイン酸に変換する酵素であるＣｙｐ２６ａの産生を誘導する。当初４－オキソ－レチノイン酸の産生は不活性化であると信じられていたが、いくつかの研究により、これらの４－オキソ－レチノイン酸がいくつかのレチノイン酸標的に対する差次的な結合親和性を有することが示された。総じて、これは、異なるレチノイン酸異性体が独自の生物学的活性を有し得ることを示唆する。
レチノイン酸は、レチノールをレチナールに変換し、最終的にレチノイン酸に変換する一連の連続的な酵素酸化反応を通じて体内で生成される。オールトランスレチノイン酸が分子の生物学的に関連する形態であることは一般に認められているが、レチノイン酸が長い共役骨格のため、多くの異性体形態で存在する。３つの一般的なアイソフォーム；７－シスレチノイン酸、１３－シスレチノイン酸、及びオールトランスレチノイン酸が循環中に観察されており、これらの異なる異性体の血清比は、経時的に一貫していることが示されている。肝臓溶解物を使用した実験では、これらの異なる異性体間の変換が酵素的に調節されていることが示唆されているが、これらの変換に関与する酵素は明確に特定されていない。研究により、これらのアイソフォームは、ＲＡＲ及びＲＸＲに対する差次的な結合親和性を有することが示されている。レチノイン酸が細胞内に産生される、または細胞に入ると、レチノイン酸を４－オキソ－レチノイン酸に変換する酵素であるＣｙｐ２６ａの産生を誘導する。当初４－オキソ－レチノイン酸の産生は不活性化であると信じられていたが、いくつかの研究により、これらの４－オキソ－レチノイン酸がいくつかのレチノイン酸標的に対する差次的な結合親和性を有することが示された。総じて、これは、異なるレチノイン酸異性体が独自の生物学的活性を有し得ることを示唆する。
【0056】
レチノイン酸が指向分化プロトコルで使用される場合、使用される選択された形態は全てトランスレチノイン酸であるが、この分子は非常に不安定であり、経時的にまたは光に曝されると急速に分解される。時間及び光の両方が、異なるアイソフォームの混合物を作製し、レチノイン酸のエポキシ及びケト形態を生じ得る。これらのエポキシ及びケトレチノイン酸誘導体は、レチノイン酸結合部位に対する生物学的活性及び親和性を有することが示されている。これらを全て合わせると、インビトロ実験でレチノイン酸を使用する際に、異なる分化能を有するいくつかの潜在的な生物学的活性分子を生み出す。どのレチノイン酸アイソフォーム及び誘導体が背側前腸内胚葉を誘導することができるかを確定するために、ＤｏＥベースのＩＳＰＡアプローチを使用した。
【0057】
４－オキソ及び９－シス－レチノイン酸の存在下でのＢＭＰ阻害はＤＦＥを誘導する
図１４Ａに示すように、いくつかの既知の生物学的活性レチノイドを包含するＤｏＥ設計を作成した。ＩＳＰＡベースの最適化を行ったとき（図４Ｂ）、試験したいくつかのレチノイドがＨＮＦ１β誘導に寄与したことが予測された。１３－シスレチノイン酸（ＦＣ＝２４．１６０９で有意）及びオールトランスレチノイン酸（ＦＣ＝２．７７２８１で有意性が低い）の両方が、実際に、ＨＮＦ１β誘導にマイナスの貢献を有していたのに対して、レチノイン酸の酵素分解形態である４－オキソ－レチノイン酸（ＦＣ＝１３．２１）は、試験した全てのレチノイドの中で最も高い因子寄与を有していたことが予測された（図４Ｂ）。ＩＳＰＡを検証するために、いくつかの主要なＤＦＥ遺伝子の転写物解析実施した。ＬＤＮ１９３１８９の存在下で最も高い寄与因子を有すると予測される２つのレチノイドから構成される新しいオプティマイザーが、元のＨＮＦ１βＯｐｔと同じレベルまでＨＮＦ１βを活性化し得ることが示された（図１４Ｃ及びＤ）。この新しいＨＮＦ１βＯｐｔの表現型は、ＭＮＸ１、ＳＦＲＰ５、ＯＳＲ１、ＯＮＥＣＵＴ１、ＭＹＴ１、ＦＯＸＡ２及びＦＲＺＢを含むいくつかの以前に記載されたＤＦＥマーカーの活性化によってさらに確認された（図１４Ｃ及びＤ）。４－オキソ－レチノイン酸を新たに再構築されたレチノイン酸で置き換えることにより、ＤＦＥ遺伝子のいくつかを活性化することができたが、著しく低いレベルまでであった。ＬＤＮ１９３１８９を分化培地配合物から除去したところ、ほとんどのＤＦＥ遺伝子マーカーが活性化されなかったことが示されたが、原腸形成遺伝子ＮＯＤＡＬを含むレチノイドを用いていくつかの内胚葉遺伝子（ＯＳＲ１、ＯＮＥＣＵＴ１、ＭＹＴ１、ＣＤＸ２、データ図示せず）を活性化することができ（図４Ｃ及びＤ）、異なるパターン化された内胚葉が誘導されていることが示唆された。
図１４Ａに示すように、いくつかの既知の生物学的活性レチノイドを包含するＤｏＥ設計を作成した。ＩＳＰＡベースの最適化を行ったとき（図４Ｂ）、試験したいくつかのレチノイドがＨＮＦ１β誘導に寄与したことが予測された。１３－シスレチノイン酸（ＦＣ＝２４．１６０９で有意）及びオールトランスレチノイン酸（ＦＣ＝２．７７２８１で有意性が低い）の両方が、実際に、ＨＮＦ１β誘導にマイナスの貢献を有していたのに対して、レチノイン酸の酵素分解形態である４－オキソ－レチノイン酸（ＦＣ＝１３．２１）は、試験した全てのレチノイドの中で最も高い因子寄与を有していたことが予測された（図４Ｂ）。ＩＳＰＡを検証するために、いくつかの主要なＤＦＥ遺伝子の転写物解析実施した。ＬＤＮ１９３１８９の存在下で最も高い寄与因子を有すると予測される２つのレチノイドから構成される新しいオプティマイザーが、元のＨＮＦ１βＯｐｔと同じレベルまでＨＮＦ１βを活性化し得ることが示された（図１４Ｃ及びＤ）。この新しいＨＮＦ１βＯｐｔの表現型は、ＭＮＸ１、ＳＦＲＰ５、ＯＳＲ１、ＯＮＥＣＵＴ１、ＭＹＴ１、ＦＯＸＡ２及びＦＲＺＢを含むいくつかの以前に記載されたＤＦＥマーカーの活性化によってさらに確認された（図１４Ｃ及びＤ）。４－オキソ－レチノイン酸を新たに再構築されたレチノイン酸で置き換えることにより、ＤＦＥ遺伝子のいくつかを活性化することができたが、著しく低いレベルまでであった。ＬＤＮ１９３１８９を分化培地配合物から除去したところ、ほとんどのＤＦＥ遺伝子マーカーが活性化されなかったことが示されたが、原腸形成遺伝子ＮＯＤＡＬを含むレチノイドを用いていくつかの内胚葉遺伝子（ＯＳＲ１、ＯＮＥＣＵＴ１、ＭＹＴ１、ＣＤＸ２、データ図示せず）を活性化することができ（図４Ｃ及びＤ）、異なるパターン化された内胚葉が誘導されていることが示唆された。
【0058】
レチノイン酸の全ての異性体は、ＮＯＤＡＬシグナル伝達を誘導することができる
ほとんどの指向分化プロトコルは、インビトロ原腸形成イベントを誘導するためのＮｏｄａｌ模倣物としてアクチビンＡを使用して内胚葉を生成するが、正常な胚発生の間、原始線条形成は、ＮｏｄａｌではなくアクチビンＡで開始される。以前の研究では、ＮｏｄａｌとアクチビンＡのシグナル伝達は同等ではなく、Ｎｏｄａｌシグナル伝達を介して生成される胚体内胚葉は、アクチビンＡによって生成される胚体内胚葉とは異なることが示されている。レチノイドシグナル伝達のための我々のＩＳＰＡモデルは、ＢＭＰ阻害の非存在下でレチノイド酸がＮＯＤＡＬを活性化することができることを予測したため、次に、ＮＯＤＡＬ誘導内胚葉形成をＮＯＤＡＬのレチノイン酸誘導に対して評価した。ＢＭＰ４、アクチビンＡまたはレチノイン酸のいずれかの存在下で、ＮＯＤＡＬ及びＣＲＩＰＴＯ（ＮＯＤＡＬの結合パートナー）で補充した分化培地を用いた反応を、我々のＩＳＰＡベースのＮＯＤＡＬＯｐｔと比較した（図１５Ａ）。試験した全ての反応は、早期及び中期の原腸形成マーカーのＮＯＤＡＬ及びＡＬＤＨ１Ａ２をそれぞれ誘導することができたが、最も低いレベルがＮＯＤＡＬＯｐｔに曝露された培養物で観察されたことに留意された（図１５Ｂ）。以前の観察と一致して、腹側マーカーＨＨＥＸは、レチノイン酸を欠く全ての反応において誘導されたが、しかしながら、古典的な胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７の最高の誘導は、レチノイン酸ベースのＮＯＤＡＬＯｐｔに曝露された培養物において生じた（図Ｂ及びＣ）。レチノイン酸で補充した全ての分化反応は、ＤＦＥマーカーＨＮＦ１β、ＭＮＸ１、ＳＦＲＰ５及びＯＳＲ１の最も高い誘導を示したが、得られたレベルは、ＢＭＰ阻害の非存在下では、より低い桁であった（図１５Ｂ）。
ほとんどの指向分化プロトコルは、インビトロ原腸形成イベントを誘導するためのＮｏｄａｌ模倣物としてアクチビンＡを使用して内胚葉を生成するが、正常な胚発生の間、原始線条形成は、ＮｏｄａｌではなくアクチビンＡで開始される。以前の研究では、ＮｏｄａｌとアクチビンＡのシグナル伝達は同等ではなく、Ｎｏｄａｌシグナル伝達を介して生成される胚体内胚葉は、アクチビンＡによって生成される胚体内胚葉とは異なることが示されている。レチノイドシグナル伝達のための我々のＩＳＰＡモデルは、ＢＭＰ阻害の非存在下でレチノイド酸がＮＯＤＡＬを活性化することができることを予測したため、次に、ＮＯＤＡＬ誘導内胚葉形成をＮＯＤＡＬのレチノイン酸誘導に対して評価した。ＢＭＰ４、アクチビンＡまたはレチノイン酸のいずれかの存在下で、ＮＯＤＡＬ及びＣＲＩＰＴＯ（ＮＯＤＡＬの結合パートナー）で補充した分化培地を用いた反応を、我々のＩＳＰＡベースのＮＯＤＡＬＯｐｔと比較した（図１５Ａ）。試験した全ての反応は、早期及び中期の原腸形成マーカーのＮＯＤＡＬ及びＡＬＤＨ１Ａ２をそれぞれ誘導することができたが、最も低いレベルがＮＯＤＡＬＯｐｔに曝露された培養物で観察されたことに留意された（図１５Ｂ）。以前の観察と一致して、腹側マーカーＨＨＥＸは、レチノイン酸を欠く全ての反応において誘導されたが、しかしながら、古典的な胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７の最高の誘導は、レチノイン酸ベースのＮＯＤＡＬＯｐｔに曝露された培養物において生じた（図Ｂ及びＣ）。レチノイン酸で補充した全ての分化反応は、ＤＦＥマーカーＨＮＦ１β、ＭＮＸ１、ＳＦＲＰ５及びＯＳＲ１の最も高い誘導を示したが、得られたレベルは、ＢＭＰ阻害の非存在下では、より低い桁であった（図１５Ｂ）。
【0059】
次に、研究されているインビトロで産生された内胚葉集団がどのようにパターン化されているかをよりよく理解するために、フォローアップのＤｏＥベースの原腸形成モデリング実験を行った（図１６Ａ）。次いで、測定した全ての個々の内胚葉遺伝子に対するＩＳＰＡ最適化を、Ｓｅｕｒａｔ Ｒパッケージを使用してクラスター分析に供した（図１６Ｂ）。この分析は、レチノイン酸及びＬＤＮ１９３１８９によってパターン化された、ＤＦＥを含有する単一のクラスターからなる４つの異なる群に全てのオプティマイザーを分割した（図１６Ｃ及び図１７）。別のクラスターは、Ｎｏｄａｌ／Ｂｍｐ４によってパターン化され、主に前方及び中腸の運命に向かってパターン化された内胚葉から構成されたが、後腸マーカーＣＤＸ２は、このクラスター内で上昇した（図１６Ｃ及び図１７）。Ｎｏｄａｌ／アクチビンＡによってパターン化されたクラスターは、腹側及び後方の運命に向かってパターン化された内胚葉からなった（図１６Ｃ及び図１７）。この実験全体を通してアッセイされた個々の遺伝子に対する因子寄与を考慮すると、（ＧＳＣを除く）前方及び背側の遺伝子は、一般的に、アクチビンＡの存在下では活性化されないことに留意されたい（図１７）。またこれらの前方または背側内胚葉遺伝子のうちのいくつかは、Ｎｏｄａｌ／レチノイン酸またはＮｏｄａｌ／ＢＭＰの相乗効果を通じて活性化されることが予測されるが、ＤＦＥ、ＨＮＦ１ｂ、ＭＮＸ１、ＨＮＦ６、ＯＳＲ１及びＳＦＲＰ５の遺伝子マーカーは、Ｎｏｄａｌの非存在下でレチノイン酸を使用して誘導されるのが最適であることに留意することが重要である。
【0060】
結論
ＮＯＤＡＬＯｐｔは、レチノイン酸の全ての生物学的に関連する異性体（９－シス、１３－シス、及びオールトランス）に強い寄与因子を有するが、ｃｙｐ２６ａ１阻害剤タラロゾールにも重要な因子寄与を有し、それらのそれぞれの４－オキソ形態への触媒変換が生じないことを保証する（図１５Ａ）。これは、レチノイン酸の１３－シス形態もオールトランス形態も許容されないが、４－オキソ代謝産物及び９－シスが必要であるＨＮＦ１βＯｐｔとは対照的である（図１４Ｂ）。これらを総合すると、レチノイン酸は、レチノイン酸の異性体が使用される場合にはＮｏｄａｌに依存して、または４－オキソ－レチノイン酸が使用される場合にはＮｏｄａｌとは独立に、ＤＦＥ表現型を誘導することが可能であるが、レチノイン酸が４－オキソ－レチノイン酸に酵素的に分解された後にＤＦＥの最適な誘導が行われることが示唆される。これは、元のＨＮＦ１βＯｐｔが不要な一過性ＮＯＤＡＬ誘導を介して生じ得ることを意味するが、レチノイン酸がｃｙｐ２６ａ１を誘導すると、いかなるＮｏｄａｌ産生も停止する。これらを総合すると、最適なＤＦＥ誘導は、Ｎｏｄａｌシグナル伝達の非存在下で生じることが示されている。
ＮＯＤＡＬＯｐｔは、レチノイン酸の全ての生物学的に関連する異性体（９－シス、１３－シス、及びオールトランス）に強い寄与因子を有するが、ｃｙｐ２６ａ１阻害剤タラロゾールにも重要な因子寄与を有し、それらのそれぞれの４－オキソ形態への触媒変換が生じないことを保証する（図１５Ａ）。これは、レチノイン酸の１３－シス形態もオールトランス形態も許容されないが、４－オキソ代謝産物及び９－シスが必要であるＨＮＦ１βＯｐｔとは対照的である（図１４Ｂ）。これらを総合すると、レチノイン酸は、レチノイン酸の異性体が使用される場合にはＮｏｄａｌに依存して、または４－オキソ－レチノイン酸が使用される場合にはＮｏｄａｌとは独立に、ＤＦＥ表現型を誘導することが可能であるが、レチノイン酸が４－オキソ－レチノイン酸に酵素的に分解された後にＤＦＥの最適な誘導が行われることが示唆される。これは、元のＨＮＦ１βＯｐｔが不要な一過性ＮＯＤＡＬ誘導を介して生じ得ることを意味するが、レチノイン酸がｃｙｐ２６ａ１を誘導すると、いかなるＮｏｄａｌ産生も停止する。これらを総合すると、最適なＤＦＥ誘導は、Ｎｏｄａｌシグナル伝達の非存在下で生じることが示されている。
【0061】
実施例３
免疫組織化学を用いたＤＦＥオプティマイザー条件の検証。
免疫組織化学を用いたＤＦＥオプティマイザー条件の検証。
【0062】
ＤＦＥマーカーの誘導条件をさらに検証するために、免疫染色を行い、続いてハイコンテントイメージングを行い、変換効率を評価した。レチノイン酸経路の代替アゴニストを試験することにより、４－オキソ－レチノイン酸と９－シスレチノイン酸との混合物を利用することが、完全なＨＮＦ１βＯｐｔ条件と同様に有効であることが示される。また、光安定性ＲＡアゴニストのＥＣ２３は、ＲＡ及び４－オキソ／９－シス条件と同等に動作する。
【0063】
実施例４
ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ、及びレチノイン酸からの相対的な入力に基づいて、内胚葉誘導及び多能性から派生する複数の内胚葉運命の特定に関連する重要なプロセスパラメータの評価。
ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ、及びレチノイン酸からの相対的な入力に基づいて、内胚葉誘導及び多能性から派生する複数の内胚葉運命の特定に関連する重要なプロセスパラメータの評価。
【0064】
アクチビンＡ（ＡＡ）、ＢＭＰ４、ＮＯＤＡＬ、レチノイン酸及びそれぞれの阻害剤を組み込んだＨＤ－ＤｏＥ設計を多能性培養物に使用し、主要な内胚葉遺伝子を監視した（図１６）。得られたデータを解析ソフトウェアにインポートし、モニタリングした全ての遺伝子を活性化するための最適な培養条件を予測するコンピュータモデルをクラスター化した（図１９Ｂ）。全てＮＯＤＡＬを許容する４つの明確な内胚葉集団が予測された。対応するリッジプロット（図１９Ａ）は、レチノイン酸シグナル伝達が、クラスター０及びクラスター１（それぞれ赤色及び緑色クラスター）によって定義される内胚葉集団の誘導に寄与することを実証している。クラスター０は、以前に特性化されたレチノイン酸及びＢＭＰ阻害のＣＰＰを伴う背側前腸内胚葉であり、クラスター１は、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ及びレチノイン酸の組み合わせ効果を通じて生成され、パターン化される、以下に記載される前方内胚葉集団である。クラスター２（青色クラスター）のみが、ＡＡに依存することが見出され、なぜなら、ＡＡの濃度がクラスター１及び３（緑色クラスター及び紫色クラスター）の両方において非常に可変であり、ＡＡシグナル伝達を特異的に標的とするＡｌｋ４／５／７阻害剤Ａ８３０１は、クラスター０、１及び３において高レベルで存在するためである。Ａ８３０１は、非阻害シグナル伝達を可能にする提案されたＡＡ駆動型クラスター２（青色クラスター）には本質的に存在しない。同様のパターンは、クラスター１（緑色クラスター）のみが、選択的経路阻害剤（この場合、ＡＬＫ２／３阻害剤ＬＤＮ１９３１８９の不在）を提供することなく高レベルのＢＭＰ４の両方を有するＢＭＰ４シグナル伝達で観察されている（図１９）。ＡＬＫ１／２／６阻害剤Ｋ０２２８８は、クラスター１内で許容され、ＢＭＰ４シグナル伝達が、この内胚葉集団内のＡＬＫ３受容体を介して生じることを示唆する。Ｎｏｄａｌは、提案されたＡＡ及びＢＭＰ４駆動型クラスターのそれぞれで、クラスター２（青色クラスター）及びクラスター１（緑色クラスター）の２つの最強の寄与を有する全てのクラスターに存在することが示された。Ｎｏｄａｌは、Ｎｏｄａｌシグナル伝達に古典的に起因するＳｍａｄ２／３媒介ＡＡ経路のいずれかを介してシグナル伝達することができ、Ｎｏｄａｌがより最近活性化することが示されたＳｍａｄ１／５／８ＢＭＰ駆動型シグナル伝達形質導入経路で役割を果たす可能性があることを示唆する。また、クラスター０及び３は共に、エフェクターＡＡ、ＢＭＰ４及びＮｏｄａｌならびにそれらのそれぞれの阻害剤の有意な寄与を有することが示されたことを考慮すると、内胚葉パターン化は、非カノニカルＴＧＦ－βシグナル伝達から強力な寄与を有し得ることを意味する。
【0065】
実施例５
領域特異的遺伝子の解析による前方ドメイン内胚葉集団の特定。
領域特異的遺伝子の解析による前方ドメイン内胚葉集団の特定。
【0066】
我々は、図１６及び図１９Ｂで同定した特定のクラスターの表現型をさらに明らかにしようとした。図２０は、４つの主要なクラスター内の特異的遺伝子の位置を明らかにしている。まず、クラスター０が以前に特定されたＤＦＥを表すことを示している。図２０Ｂ及び図２１で見ることができるように、腹側マーカーＨＨＥＸはほとんど存在せず、背側マーカーＭＮＸ１は、クラスター０で排他的に発現される。ＳＦＲＰ５及びＨＮＦ１βは共に、クラスター０を超えてより広い発現を有し、クラスター１内にも存在する。これは、ＳＦＲＰ５及びＨＮＦ１βは腸管の背側部に限定されず、前方領域全体及び中腸全体にわたって発現するためである。クラスター１は、ＤＦＥ及び標準的な文献で誘導されたＤＥ（クラスター２によって表される）とは異なる内胚葉集団を表す。特異的なマーカー発現により、前方遺伝子ＴＢＸ１、ＰＡＸ９及びＯＳＲ１の発現パターンに起因して、クラスター１は腸管の前方／中腸領域を代表する内胚葉集団を表す、と我々は判断した（図２０Ｃ及び図２１）。ここでは、この集団を前方ドメイン内胚葉（ＡＤＥ）と呼ぶ。発生において、ＴＢＸ１及びＰＡＸ９の両方が前方咽頭領域で発現され、ＯＳＲ１が咽頭全体を通して及び中腸で発現される（図２０Ｃ及び図２１）。
【0067】
ＡＤＥの重要なプロセス入力は、リッジプロット分析によって調べられる（図１９Ａ）。ＡＤＥの誘導は、ＢＭＰ阻害の非存在下でのＮｏｄａｌ、ＢＭＰ及びＡＬＫ５の阻害の提供に最も依存する。これは、ＲＡシグナル伝達の入力に耐性がある。この入力セットは、他のタイプの内胚葉にはない明確なＢＭＰ依存性特徴を明らかにする。リッジプロットは、ＡＤＥの誘導のためのレチノイン酸及びＮｏｄａｌの明確な寄与を示すが（図１９Ａ）、酵素ＡＬＤＨ１Ａ２を生成するＲＡは発現せず、Ｎｏｄａｌは、クラスター１全体を通して変化した発現を有する。ＡＬＤＨ１Ａ２の欠如は、レチノイン酸産生がより後方の中原腸形成において始まるため、より前方部を表すこの集団の一貫性がある。したがって、前方内胚葉のパターン化のいずれの関与も、胚内のレチノイドの拡散を通じて達成することができる。Ｎｏｄａｌ発現の欠如は、原始線条の最も前方の領域が最初に原腸形成を終了していると考えられるという事実に起因し得るが、これは、この集団が既に原始線条表現型を終了しているが、Ｎｏｄａｌに対する応答性を保持していることを暗示する。結論として、我々は、新規の内胚葉型を定義し、その誘導は、根底にあるその発生を入力する。
【0068】
実施例６
特異的内胚葉発現遺伝子に関連する重要なプロセスパラメータの比較
前方／中腸内胚葉集団の生成におけるＮｏｄａｌ及びＢＭＰ４シグナル伝達の重要性をより深く理解するために、ＴＢＸ１、ＰＡＸ９及びＯＳＲ１の最適化のための全ての予測モデルを編纂した（図２２）。ＴＢＸ１及びＰＡＸ９オプティマイザーを通じて示されるように、Ｎｏｄａｌ及びＢＭＰ４の両方とも、前方内胚葉の活性化に対する等しい平均累積寄与を示した。一方、より広く発現されたＯＳＲ１（中腸の前方）は、ＢＭＰ４は依然として有意な寄与を有していたが、Ｎｏｄａｌシグナル伝達に対してはるかに強い応答を示した。これは、腸管パターン化がより遠位で起こるほど、ＢＭＰシグナル伝達寄与が減少することを意味する。咽頭または胃の子孫を生成する全ての以前の努力はＡＡの初期使用に依存していたため、ＡＡはＴＢＸ１、ＰＡＸ９またはＯＳＲ１を誘導することにほとんどまたはまったく貢献しなかったことに留意することが重要である（図２２）。今度は、ＡＡが、ＡＰＯＢ、ＣＤＸ２及びＳＯＸ１７の選択された例示的なオプティマイザーを通じてそれぞれ示されるように、中腸、後方及び腹側内胚葉の運命を表す選択された遺伝子において増加したエフェクター寄与を有したことが留意された（図２２）。これは、文献で通常遭遇するＡＡ入力がより後方の内胚葉部を作り出す役割を果たすことを示している。
特異的内胚葉発現遺伝子に関連する重要なプロセスパラメータの比較
前方／中腸内胚葉集団の生成におけるＮｏｄａｌ及びＢＭＰ４シグナル伝達の重要性をより深く理解するために、ＴＢＸ１、ＰＡＸ９及びＯＳＲ１の最適化のための全ての予測モデルを編纂した（図２２）。ＴＢＸ１及びＰＡＸ９オプティマイザーを通じて示されるように、Ｎｏｄａｌ及びＢＭＰ４の両方とも、前方内胚葉の活性化に対する等しい平均累積寄与を示した。一方、より広く発現されたＯＳＲ１（中腸の前方）は、ＢＭＰ４は依然として有意な寄与を有していたが、Ｎｏｄａｌシグナル伝達に対してはるかに強い応答を示した。これは、腸管パターン化がより遠位で起こるほど、ＢＭＰシグナル伝達寄与が減少することを意味する。咽頭または胃の子孫を生成する全ての以前の努力はＡＡの初期使用に依存していたため、ＡＡはＴＢＸ１、ＰＡＸ９またはＯＳＲ１を誘導することにほとんどまたはまったく貢献しなかったことに留意することが重要である（図２２）。今度は、ＡＡが、ＡＰＯＢ、ＣＤＸ２及びＳＯＸ１７の選択された例示的なオプティマイザーを通じてそれぞれ示されるように、中腸、後方及び腹側内胚葉の運命を表す選択された遺伝子において増加したエフェクター寄与を有したことが留意された（図２２）。これは、文献で通常遭遇するＡＡ入力がより後方の内胚葉部を作り出す役割を果たすことを示している。
【0069】
次に、我々は、測定された内胚葉遺伝子のうち、どの遺伝子がそれぞれのＴＧＦβアゴニストに応答したかを直接定義するために、腸管に沿った別個の領域を定義することができる測定された全ての主要な内胚葉遺伝子に対してＩＳＰＡを行った。次いで、それぞれのエフェクター因子寄与を正規化し、ＡＡ、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ４及びＲＡについて、最も応答性の高い遺伝子から最も応答性の低い遺伝子まで順位付けした（図２３）。ＲＡがＤＦＥの生成に中心的な役割を果たすという我々の以前の知見は、ＨＮＦ６、ＨＮＦ１β、ＳＦＲＰ５、及びＭＮＸ１が全てＲＡによって高度に調節され、ＡＡによって阻害されることが示されたことで再度検証された（図２３）。ＡＤＥ、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ４及びＲＡを生成するための条件と一致して、全て、ＡＡから高度にマイナスの寄与、それぞれ－０．５９、－０．８５及び－１．０の正規化された因子寄与で、ＴＢＸ１、ＰＡＸ９及びＯＳＲ１の活性化に関与することが示されている。ＡＡ及びＮｏｄａｌが重複する機能を有するという現在の仮説と一致して、入力ロジックが重複するいくつかの遺伝子が２つのエフェクター間で観察された。これらには、原始線条遺伝子ＧＳＣ及びＮＯＤＡＬ（ＮＯＤＡＬは、図２３には示されていないが、図２１に示されている）、中腸遺伝子ＮＲ５Ａ２、ＣＤＸ２及びＰＲＯＸ１、ならびに腹側局在化遺伝子ＢＭＰ４及びＳＯＸ１７が含まれた。
【0070】
ＢＭＰ４及びＮＯＤＡＬの両方がＡＡによって活性化されることが示されているので、我々は、次に、ＲＮＡ Ｓｅｑデータを使用して、どのＴＧＦβファミリーリガンドが古典的ＤＥ及び新規のＤＦＥプロトコルの両方で活性化されるかを評価した。ＡＡとの多能性培養物のインキュベーションにより、ＴＤＧＦ１、ＬＥＦＴＹ１／２、ＮＯＤＡＬ、ＢＭＰ１／２／４／７、及びＴＧＦβ１を含むいくつかのＴＧＦβファミリーメンバーの内因性発現を誘導することが示され、ＡＡ内胚葉誘導のためのより広い効果に起因する以前の所見をおそらくは説明する（図２４Ａ）。ＤＥの生成による高レベルのＮｏｄａｌのこの誘導は、ＩＨＣベースのタンパク質検出によって確認された（図２４Ｂ）。一方、多能性細胞のＲＡ／ＬＤＮ処理は、ＢＭＰ１／２／４／７、ＧＤＦ１１、ＡＭＨ及びＴＧＦβ２の選択的活性化をもたらした（図２４）。このレチノイン酸媒介性ＢＭＰ誘導は、ＤＦＥプロトコルの背側化におけるＬＤＮの重要性を説明する。総じて、前方から中腸管に沿ったＮＯＤＡＬ及びＢＭＰパターン内胚葉ならびにＡＡ応答性遺伝子が、原始線条、腹側中腸及びより後方の領域をより代表することを、我々は実証する。ＡＡに応答しないいくつかのＮｏｄａｌ／ＢＭＰ／ＲＡ応答性遺伝子の選択的活性化のためのオプティマイザーを、図２５に例として挙げる。
【0071】
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ＫＲＯＯＮ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２６，４４３－５２。
ＫＵＭＡＲ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２５９，１０９－２２。
ＫＵＭＡＲ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，３０，８６－９９。
ＫＷＯＮ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，１５，５０９－２０。
ＬＩ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２３，６７－７０。
ＬＯＨ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１４，２３７－５２。
ＭＡＲＴＩＮ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２８４，３９９－４１１。
ＭＡＴＳＵＮＯ，ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，９２，２８１－２９０。
ＭＡＴＳＵＵＲＡ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ，１２６，８１７－２７。
ＭＣＣＲＡＣＫＥＮ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ，５１６，４００－４。
ＭＣＤＯＮＡＬＤ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１６，１１２８－９。
ＭＥＮＤＥＳ，ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２２，４７３－８６。
ＭＥＲＣＩＥＲ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６７，２６２－７０。
ＭＦＯＰＯＵ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３８，２２３３－４５，２２４５ ｅ１－１４。
ＭＯＬＯＴＫＯＶ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｅｖ Ｄｙｎ，２３２，９５０－７。
ＰＡＧＬＩＵＣＡ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ，１５９，４２８－３９。
ＰＯＬＬ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５５，６１－９。
ＲＡＴＨＯＲＥ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，３０，９６７－７３。
ＲＥＺＡＮＩＡ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３２，１１２１－３３。
ＲＯＯＳＴ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，１１１２－２４。
ＲＯＴＴＩＮＧＥＲ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｐｔｙｃｈｏｄｅｒａ ｆｌａｖａ．Ｂｉｏｌ Ｏｐｅｎ，４，８３０－４２。
ＳＡＤＯＷＳＫＩ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３４，２１４－２２７。
ＳＡＭＰＡＺＩＯＴＩＳ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３，８４５－８５２。
ＳＰＥＮＣＥ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，１７，６２－７４。
ＳＰＥＮＣＥ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，．Ｎａｔｕｒｅ，４７０，１０５－９。
ＳＷＡＩＮ，ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ。
ＴＲＥＭＢＬＡＹ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２８０，８７－９９。
ＵＬＶＥＮ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２２０，３７９－９１。
ＷＡＮＧ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，１４，４１９－２６。
ＸＩＥ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１２，２２４－３７。
ＡＤＥＷＯＬＡ，ｅｔ ｌａ．，Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，２０１０，１２，４０９－１７。
ＡＦＥＬＩＫ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１２，１３９，１７４４－５３。
ＡＮＧＥＬＯ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７，ｅ４０７０７。
ＢＯＤＹ－ＢＥＣＨＯＵ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ，３４，９０－３。
ＢＯＲＴ，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３１，７９７－８０６。
ＣＡＲＩＮＨＡＳ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３０，３７７－８５。
ＣＨＡＫＲＡＢＡＲＴＹ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，５，１８１－２０３。
ＣＨＥＮ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４０，６７５－８６。
ＣＨＵＮＧ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，１５，７３８－４８。
Ｄ’ＡＭＯＵＲ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，１５３４－４１。
ＤＡＶＥＮＰＯＲＴ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，３４，２６３５－２６４７。
ＤＥ ＶＡＳ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４２，８７１－８２。
ＤＥＵＴＳＣＨ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２８，８７１－８１。
ＧＡＤＵＥ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０３，１６８０６－１１。
ＧＥＲＩＮ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＢＭＣ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ，８，９６。
ＧＲＥＥＮ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２９，２６７－７２。
ＨＡＵＭＡＩＴＲＥ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１０２，１４９０－５。
ＨＥＢＲＯＫ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ，１２，１７０５－１３。
ＨＲＶＡＴＩＮ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１１１，３０３８－４３。
ＪＥＮＮＩＮＧＳ，ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，９，１３８７－１３９４。
ＪＥＮＳＥＮ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４９，１６３－７６。
ＫＩＴＡＮＯ，Ｈ．２００２．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔｕｒｅ，４２０，２０６－１０。
ＫＲＯＯＮ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２６，４４３－５２。
ＫＵＭＡＲ，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２５９，１０９－２２。
ＫＵＭＡＲ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，３０，８６－９９。
ＫＷＯＮ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，１５，５０９－２０。
ＬＩ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２３，６７－７０。
ＬＯＨ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１４，２３７－５２。
ＭＡＲＴＩＮ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２８４，３９９－４１１。
ＭＡＴＳＵＮＯ，ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，９２，２８１－２９０。
ＭＡＴＳＵＵＲＡ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ，１２６，８１７－２７。
ＭＣＣＲＡＣＫＥＮ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ，５１６，４００－４。
ＭＣＤＯＮＡＬＤ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１６，１１２８－９。
ＭＥＮＤＥＳ，ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２２，４７３－８６。
ＭＥＲＣＩＥＲ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６７，２６２－７０。
ＭＦＯＰＯＵ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３８，２２３３－４５，２２４５ ｅ１－１４。
ＭＯＬＯＴＫＯＶ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｅｖ Ｄｙｎ，２３２，９５０－７。
ＰＡＧＬＩＵＣＡ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｅｌｌ，１５９，４２８－３９。
ＰＯＬＬ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５５，６１－９。
ＲＡＴＨＯＲＥ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，３０，９６７－７３。
ＲＥＺＡＮＩＡ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３２，１１２１－３３。
ＲＯＯＳＴ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，１１１２－２４。
ＲＯＴＴＩＮＧＥＲ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｐｔｙｃｈｏｄｅｒａ ｆｌａｖａ．Ｂｉｏｌ Ｏｐｅｎ，４，８３０－４２。
ＳＡＤＯＷＳＫＩ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３４，２１４－２２７。
ＳＡＭＰＡＺＩＯＴＩＳ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３，８４５－８５２。
ＳＰＥＮＣＥ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ，１７，６２－７４。
ＳＰＥＮＣＥ，ｅｔ ａｌ．，２０１１，．Ｎａｔｕｒｅ，４７０，１０５－９。
ＳＷＡＩＮ，ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ。
ＴＲＥＭＢＬＡＹ，ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２８０，８７－９９。
ＵＬＶＥＮ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２２０，３７９－９１。
ＷＡＮＧ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ，１４，４１９－２６。
ＸＩＥ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１２，２２４－３７。
【0072】
本明細書で言及される、及び／または以下に列挙される全ての刊行物及び特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法及びシステムの様々な修正及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者に明白であろう。本発明は、特定の実施形態に関連して説明されてきたが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、関連分野の当業者にとって明白な、本発明を実施するための記載されたモードの様々な修正は、本明細書に記載される範囲内であることが意図される。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【国際調査報告】