特表 2022-533365 出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を処置する際に使用するためのハプトグロビン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-22

(54)【発明の名称】出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰を処置する際に使用するためのハプトグロビン

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20220714BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20220714BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220714BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220714BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220714BHJP

   A61K 31/4245 20060101ALI20220714BHJP

   A61K 33/26 20060101ALI20220714BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20220714BHJP

【ＦＩ】

A61K38/17

A61P9/10

A61P25/00

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K31/4245

A61K33/26

A61K47/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021568520

(86)(22)【出願日】2020-05-15

(85)【翻訳文提出日】2022-01-11

(86)【国際出願番号】 EP2020063732

(87)【国際公開番号】W WO2020234195

(87)【国際公開日】2020-11-26

(31)【優先権主張番号】62/849,249

(32)【優先日】2019-05-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/878,062

(32)【優先日】2019-07-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】517237735

【氏名又は名称】ウニベルシテート チューリッヒ

(71)【出願人】

【識別番号】501091604

【氏名又は名称】ツェー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ミカエル・フーゲルズホーファー

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン・シェアー

(72)【発明者】

【氏名】ドミニク・シェアー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076BB11

4C076BB21

4C076CC29

4C076EE57

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA44

4C084CA36

4C084CA53

4C084DC50

4C084MA02

4C084MA05

4C084MA16

4C084MA56

4C084MA65

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA012

4C084ZA361

4C084ZA362

4C086AA01

4C086BC71

4C086HA11

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA16

4C086MA56

4C086MA65

4C086NA05

4C086ZA01

4C086ZA40

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、血管外溶血および無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の対象において、有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための方法であって、ハプトグロビン（Ｈｐ）またはその機能的類似体が、無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、それを必要としている対象のＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程を含む前記方法と一般的に関連する。本発明の態様は、Ｈｐを含む人工ＣＳＦの組成物およびキットとさらに関連する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血管外溶血および無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法であって、ハプトグロビン（Ｈｐ）が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、それを必要としている対象のＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程を含む前記方法。

【請求項2】

出血性脳卒中は、天然に生じる出血または外傷性出血である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

出血性脳卒中は、脳室内出血またはクモ膜下出血である、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

クモ膜下出血は、動脈瘤性クモ膜下出血である、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、神経毒性、炎症、一酸化窒素枯渇、酸化性組織傷害、脳血管攣縮、脳血管反応性、および浮腫からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

有害な二次神経学的転帰は、脳血管攣縮である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害である、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

有害な二次神経学的転帰は、遅発性脳虚血である、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

有害な二次神経学的転帰は、脳実質内の有害な二次神経学的転帰である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

出血の発現後約２１日以内に、ＣＳＦをＨｐまたはその機能的類似体に曝露する工程を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

出血の発現後約２日間～約４日間、ＣＳＦをＨｐに曝露する工程を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

出血の発現後約５日間～約１４日間、ＣＳＦをＨｐに曝露する工程を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

対象に、Ｈｐを頭蓋内投与する工程を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

対象に、Ｈｐを髄腔内投与する工程を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

Ｈｐは、脊椎管中に髄腔内投与される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

Ｈｐは、クモ膜下腔中に髄腔内投与される、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

対象に、治療有効量のＨｐを脳室内投与する工程を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、少なくとも約２分である、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、約２分～約４５分である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、約２分～約２０分である、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、約４分～約１０分である、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

治療有効量のＨｐは、出血後の対象のＣＳＦ中の無細胞Ｈｂの濃度に対して、少なくとも等モル量である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦサンプルを、ＣＳＦをＨｐに曝露する前に取得する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた無細胞Ｈｂの濃度に基づき、少なくとも等モル量のＨｐを決定する工程
をさらに含む請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

Ｈｐの治療有効量は、約２μＭ～約２０ｍＭである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

Ｈｐの治療有効量は、約２μＭ～約３００μＭである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

Ｈｐの治療有効量は、約５μＭ～約５０μＭである、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

Ｈｐの治療有効量は、約１０μＭ～約３０μＭである、請求項２４に記載の方法。

【請求項28】

ＣＳＦ内で形成されたＨｐ：無細胞Ｈｂ複合体を除去する工程をさらに含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

ＣＳＦを、治療有効量のＨｐに体外的に曝露する工程を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

（ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからＣＳＦのサンプルを取得する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）のＣＳＦサンプルにＨｐを添加して、Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを取得する工程；
（ｉｉｉ）Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを対象に投与し、これによりＨｐが対象のＣＳＦコンパートメントにおいて無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程；および
（ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

（ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからある容積のＣＳＦを取り出す工程；
（ｉｉ）Ｈｐを含む人工ＣＳＦを提供する工程；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の人工ＣＳＦを対象に投与し、これにより、対象のＣＳＦコンパートメントにおいて、Ｈｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程；および
（ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取得する工程；
（ｉｉ）ＣＳＦにおいて、Ｈｐまたはその機能的類似体が無細胞Ｈｂと複合体を形成するのを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをＨｐに曝露する工程；
（ｉｉｉ）Ｈｐ：無細胞Ｈｂ複合体を、工程（ｉｉ）の後のＣＳＦから抽出して、工程（ｉ）から得られたＣＳＦと比較したときに、それより少ない量の無細胞Ｈｂを有するＨｂ減少ＣＳＦを取得する工程；
（ｉｖ）場合により、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復して、無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得する工程；ならびに
（ｖ）工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）から得られたＨｂ減少ＣＳＦを、対象のＣＳＦコンパートメントに投与する工程
を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項33】

工程（ｖ）の前に、Ｈｂ減少ＣＳＦに対して治療有効量のＨｐを添加する工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

Ｈｐは、基材上に固定されている、請求項３２または請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

基材は、アフィニティークロマトグラフィー樹脂である、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

工程（ｉｉ）は、ＣＳＦ中の無細胞Ｈｂが樹脂と結合するのを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをアフィニティークロマトグラフィー樹脂に通過させる工程を含み、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）後に樹脂からＣＳＦを溶出させる工程を含み、および工程（ｉｖ）は、溶出したＣＳＦを回収する工程を含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

場合により、工程（ｉ）後のＣＳＦコンパートメントを、洗浄溶液を用いて洗浄する工程を含む、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

洗浄溶液は、人工ＣＳＦである、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

人工ＣＳＦは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＮａＨＣＯ_３、ＭｇＣｌ_６・Ｈ_２Ｏ、ＣａＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ、およびグルコースを含む、請求項３１または請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

洗浄溶液は、Ｈｐを含む、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

洗浄溶液は、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

洗浄溶液は、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取り出す工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）後の対象のＣＳＦコンパートメントを、治療有効量のＨｐを含む洗浄溶液を用いてリンスする工程；
（ｉｉｉ）場合により工程（ｉｉ）を反復する工程；および
（ｉｖ）工程（ｉｉ）または工程（ｉｉｉ）後の対象のＣＳＦコンパートメントに人工ＣＳＦを投与する工程
を含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

人工ＣＳＦは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＮａＨＣＯ_３、ＭｇＣｌ_６・Ｈ_２Ｏ、ＣａＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ、およびグルコースを含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

人工ＣＳＦは、Ｈｐを含む、請求項４３または請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

人工ＣＳＦは、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

人工ＣＳＦは、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

Ｈｐは、Ｈｐ２－２多量体を含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

Ｈｐは、組換えタンパク質である、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

Ｈｐは、血漿由来である、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

対象に、脳室内出血後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

第２の薬剤は、血管拡張薬である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

第２の薬剤は、シドノンおよびニトロプルシドナトリウムからなる群から選択される、請求項５２または請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

Ｈｐを含む人工脳脊髄液（ＣＳＦ）。

【請求項56】

Ｈｐは、約２μＭ～約２０ｍＭの量で存在する、請求項５５に記載の人工ＣＳＦ。

【請求項57】

Ｈｐは、約５μＭ～約３００μＭの量で存在する、請求項５５に記載の人工ＣＳＦ。

【請求項58】

Ｈｐは、約５μＭ～約５０μＭの量で存在する、請求項５５に記載の人工ＣＳＦ。

【請求項59】

Ｈｐは、約１０μＭ～約３０μＭの量で存在する、請求項５８に記載の人工ＣＳＦ。

【請求項60】

Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の人工ＣＳＦ。

【請求項61】

Ｈｐ２－２多量体を含む、請求項６０に記載の人工ＣＳＦ。

【請求項62】

Ｈｐは、組換えタンパク質である、請求項５９または請求項６０に記載の人工ＣＳＦ。

【請求項63】

Ｈｐは、血漿由来である、請求項５７または請求項５８に記載の人工ＣＳＦ。

【請求項64】

請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬組成物であって、治療有効量のＨｐおよび薬学的に許容される担体を含む前記医薬組成物。

【請求項65】

請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する際に使用するための医薬組成物であって、治療有効量のＨｐおよび薬学的に許容される担体を含む前記医薬組成物。

【請求項66】

Ｈｐは、約２μＭ～約２０ｍＭの量で存在する、請求項６４または請求項６５に記載の組成物。

【請求項67】

Ｈｐは、約２μＭ～約３００μＭの量で存在する、請求項６６に記載の組成物。

【請求項68】

Ｈｐは、約５μＭ～約５０μＭの量で存在する、請求項６６に記載の組成物。

【請求項69】

Ｈｐは、約１０μＭ～約３０μＭの量で存在する、請求項６６に記載の組成物。

【請求項70】

Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される、請求項６４～６９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項71】

Ｈｐ２－２多量体を含む、請求項７０に記載の組成物。

【請求項72】

請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬の製造における、治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）の使用。

【請求項73】

請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰の処置または予防で使用するための治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）。

【請求項74】

請求項５５～６３のいずれか１項に記載の人工ＣＳＦまたは請求項６４～７１のいずれか１項に記載の組成物を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、脳脊髄液（ＣＳＦ）コンパートメント中への出血性脳卒中後、特にクモ膜下出血（ＳＡＨ）後の対象における、有害な二次神経学的転帰を処置および／または予防するための方法および組成物と一般的に関連する。

【背景技術】

【0002】

本明細書で引用されたすべての参照は、あらゆる特許または特許出願を含め、本発明の完全なる理解を可能にするために、参照によって本明細書により組み入れる。それにもかかわらず、そのような参照は、それらの文書のいずれかが、オーストラリアまたは任意のその他の国において、当技術分野における共通一般的知識の一部を形成する、という承認を構成するものと読み取られるものではない。

【0003】

出血性脳卒中は、周辺組織中への出血を伴う、脳内またはその表面における血管の破裂と関係する。出血性脳卒中の例として、ｉ）脳内血管の破裂と関係する脳内出血（本明細書ではＩＣＨと呼ばれる）；ｉｉ）脳室系中への出血である脳室内出血（本明細書ではＩＶＨと呼ばれる）；およびｉｉｉ）脳と脳を覆う組織との間の腔（クモ膜下腔として知られている）における出血と関係するクモ膜下出血（本明細書ではＳＡＨと呼ばれる）が挙げられる。最も高頻度のＳＡＨは、動脈瘤破裂（本明細書ではａＳＡＨと呼ばれる）により引き起こされる。ＳＡＨのその他の原因として、頭部傷害、出血障害、および血液希釈剤の使用が挙げられる。

【0004】

ＩＶＨのおよそ３０％は、対象の脳室系に主に限定され、また脳室内外傷、動脈瘤、血管奇形、または特に脈絡叢の腫瘍により一般的に引き起こされる。残りの７０％は本質的に二次的であり、実質内出血またはＳＡＨを問わず、既存の出血の拡大に起因する。ＩＶＨは、中程度～重度の外傷性脳傷害の３５％で生ずることが判明している。したがってＩＶＨは、大規模な関連損傷がなければ、通常生じない。

【0005】

動脈瘤性クモ膜下出血（ａＳＡＨ）はＳＡＨの最も一般的な原因であり、また最高死亡率および長期神経学的身体障害と関連している^１、２。動脈瘤修復および神経集中医療における進歩にもかかわらず、欧州における院内致死率中央値は４４．４％であり、また米国では３２．２％である^３。生存者の３５％が、出血イベントから１年後に、全体的な生活の質の不良を報告しており、８３～９４％が仕事に復帰することができない^４～６。米国内の頭蓋内動脈瘤破裂に起因するａＳＡＨの推定発生率は、１０，０００人当たり１症例であり、毎年およそ２７，０００件の新規症例が生ずる。さらに、ａＳＡＨは、男性よりも女性において一般的である（２：１）；発生率のピークは５５～６０歳である。

【0006】

過去数十年において、出血性脳卒中患者のマネジメントが改善し、また死亡例も低下したにもかかわらず、この集団において身体障害および死亡率は高止まりしたままである。脳傷害は、ＳＡＨ後の初日に突然生じる可能性がある。この早期脳傷害は、頭蓋内圧増加、ヘルニア形成、脳内出血、脳室内出血、および水頭症のような、脳に対する物理的効果に起因し得る。後続する有害な二次神経学的転帰が、血管造影脳血管攣縮（ＡＣＶ）を含め発生し、より重度の症例では、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）および脳梗塞を引き起こすおそれがある。遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）の発生を伴う有害な二次神経学的転帰は、初期の出血（ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ）または出血（ｂｌｅｅｄ）後の４～１４日目の間に一般的に生じ、またこれらの患者における身体障害および死亡に対する主たる寄与因子である。ＤＩＮＤは脳虚血の特徴的な症候群である。頭痛、髄膜症の増悪、および体温上昇の後に、意識の変動性の衰退および限局性神経症状の出現が後続するのが一般的である。臨床的ＤＩＮＤは、少なくとも２グラスゴーコーマスケール（ＧＣＳ）レベルの遅発的意識低下、および／または新たな限局性神経障害により定義可能である。遅発性梗塞についてスクリーニングするために、連続したＣＴスキャンが、手術後、臨床的退行時、およびモニタリング期間後に実施可能である。これは、選択された症例においてＭＲＩにより補完可能である。ＤＩＮＤの病因は部分的理解のみに留まるものの、しかし多因子性であることが幅広く受け入れられている^７。例えば、神経炎は、傷害の拡大および脳損傷において重要な役割を演じている。赤血球分解生成物は、血管攣縮および組織傷害のトリガーとなる炎症性サイトカインの放出を引き起こすおそれがある^８。末梢免疫細胞は、損傷を受けた組織において動員されると同時に活性化もされる。この細胞は、脳実質に進入し、そして炎症性サイトカインを放出する可能性がある^９。さらに、固有のｔｏｌｌ様受容体が梗塞後に上方制御され、広範にわたる神経炎症を引き起こす。神経炎症は、ＳＡＨ後に生ずる有害な二次転帰ともリンクしている^１０。脳血管攣縮（ＣＶ）を経た管腔は、白血球接着能を増加させ、遅発性の神経学的退行に寄与する^１５。

【0007】

炎症、脳微小血栓症、皮質拡延性虚血、血液脳関門の破綻、および遅発性脳虚血（ＤＣＩ）も脳損傷を引き起こすおそれがある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

残念ながら、これらのプロセスに狙いを定めた薬理学的処置のいずれも、出血性脳卒中において効能をなおも示せていない。経腸ニモジピンおよびａＳＡＨにおける責任動脈瘤の血管内処置が、患者の転帰を改善するためのランダム化された臨床試験から得られたエビデンスにより裏付けられた唯一の処置選択肢としてとどまる。したがって、出血性脳卒中後の患者において有害な二次神経学的転帰を処置および／または予防するための特別な療法に対する緊急かつ未だ対処されていない必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の１つの態様では、血管外溶血および無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の対象において、有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための方法であって、ハプトグロビン（Ｈｐ）が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、それを必要としている対象のＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程を含む前記方法が提供される。

【0010】

本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、脳室内出血後の対象において、有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬組成物であって、治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）および薬学的に許容される担体を含む前記医薬組成物が提供される。

【0011】

本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、脳室内出血後の対象において、有害な二次神経学的転帰を処置または予防する際に使用するための医薬組成物であって、治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）および薬学的に許容される担体を含む前記医薬組成物が提供される。

【0012】

本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、脳室内出血後の対象において、有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬を製造する際の、治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）の使用が提供される。

【0013】

本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載されるような人工ＣＳＦまたは本明細書に記載されるような組成物を含むキットが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】経斜台アプローチ（ｔｒａｎｓｃｌｉｖａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）を通じて、新たに屠殺されたブタからブタ脳底動脈を単離する例証的事例を示す図である。動物１匹当たり５～６個の血管輪（長さ２ｍｍ）を、解剖顕微鏡下で、広範にわたる機械的管腔操作を回避しつつ調製した。

【図2】左側脳室の前角内に進入する外部脳室ドレイン（ＥＶＤ）、右前頭白質内に埋め込まれたニューロモニタリングプローブ、および後頭下クモ膜下穿刺針を備えた実験構成のスキームおよび手術時の写真を示す図である。

【図3】デジタルサブトラクション血管造影法（ＤＳＡ）から得られた管腔径の半自動化された定量を示す図である。左図および右上の挿入図は、前大脳動脈（ＡＣＡ）、中大脳動脈（ＭＣＡ）、内頸動脈（ＩＣＡ）の大槽部分、および脳底動脈（ＢＡ）における直線状の対象領域（ＲＯＩ）について、その代表的な選択を示す。これらの対象領域は、ＡＣＡ、ｃＩＣＡ、およびＢＡの直線セグメントにおいては、０．５ｍｍ間隔で（５箇所）自動的に、ならびにＭＣＡの曲線セグメントにおいては手作業により（３箇所）設定された。すべてのＲＯＩについて、Ｆｉｓｃｈｅｒら（２０１０年）によりこれまでに記載されたように（右下）、管腔径を断面の強度プロファイルから計算し（中段右側）、そして各管腔のすべてのＲＯＩにおいて平均化した。

【図4】単離されたブタ脳底動脈を用いた血管機能実験における無細胞Ｈｂの効果を示す図である。Ａ、ＭＡＨＭＡ ＮＯＮＯａｔｅ（６０ｎＭ）をバッファーに添加した後、ブタ脳底部から得られた管腔セグメントにおいて、ＮＯ媒介式の血管拡張応答が観察可能である（灰色トレース）。１０μＭのｏｘｙＨｂを含有するバッファー（黒色トレース）では、ＭＡＨＭＡ ＮＯＮＯａｔｅを添加した後に血管拡張応答は観測されなかった。トレースは、バッファーおよびバッファー＋Ｈｂについて、管腔１５個および１４個の平均値±ＳＤをそれぞれ示す。Ｂ、等モル濃度のＨｐを、１０μＭのＨｂを含有するバッファーに添加した後、ＭＡＨＭＡ ＮＯＮＯａｔｅに対する血管拡張応答は回復する。トレースは、１群当たり管腔１６個の平均値±ＳＤを示す。この実験において、血管応答を、最適なＩＣ１／ＩＣ１００比まで受動的ストレッチングを行った後の張力（＝１００％）、およびＰＦ２α添加後の持続的収縮レベル（＝０％）と比較して標準化した。

【図5】ＨｐカラムによりＨｂを選択的に除去する前（暗色）およびその後（明色）の溶血性患者ＣＳＦサンプル（遠心分離後）の画像および吸収スペクトルを示す図である。ＣＳＦ中に浸漬されたブタ脳底動脈セグメントにおいて、張力記録が一時的に減少することにより示されるように（灰色）、Ｈｂを除去することで、ＭＡＨＭＡ ＮＯＮＯａｔｅ投与に対する血管拡張応答が回復した。拡張性のＮＯシグナルは、Ｈｂが枯渇する前の同一のＣＳＦサンプルにおいて脱共役したままであった（黒色）。

【図6】ａＳＡＨを有する患者（ｎ＝９）から得られたＣＳＦ中に浸漬されたブタ脳底動脈において、ＣＳＦに対してＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅを投与した後に、拡張性のＮＯシグナルが共役することを示す図である。溶血前ＣＳＦ（左側パネル）、溶血ＣＳＦ（中間パネル）、および溶血ＣＳＦに対してＨｐ添加後（右側パネル）において、動脈を連続して調査した。

【図7】デジタルサブトラクション血管造影法、解剖試料の写真、およびＴ１加重ＭＲ画像の曲面多断面再構成法（ｃｕｒｖｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌａｎａｒ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）（曲面ＭＰＲ）におけるウィリス動脈輪を示す図である。曲面ＭＰＲ内の明るい（白色）シグナルは、冠状の視野画像において表されるように、後交通動脈（ＰＣＯＭ）および脳底動脈（ＢＡ）を取り巻く輸注後のヘムタンパク質（この事例ではＨｂ－Ｈｐ複合体）を表す。曲面ＭＰＲ内の破線（１～３）は、冠状切片の場所を表す。

【図8】ＴＣＯ標識されたＨｂ（Ａ）およびＴＣＯ標識されたＨｂ：Ｈｐ（Ｂ）を注射し、核（「Ｎｕｃｌｅｉ」）および標識された化合物（「ＴＣＯ－Ｈｂ」または「ＴＣＯ－ＨｂＨｐ」）について染色した後の、側脳室を通過するヒツジ脳切片の代表的な組織学的画像を示す図である。Ａ、Ｈｂは、脳室系から脳室上皮関門（ｅｐｅｎｄｙｍａｌ ｂａｒｒｉｅｒ）を経由して脳間質腔中（Ａの「ＴＣＯ－Ｈｂ」画像内の明るいエリア）まで浸透する。Ｂ、脳室上皮関門を経由するＨｂ：Ｈｐ複合体の脳間質腔中への浸透は、Ｈｂ単独と比較して劇的に低下する。しかしながら、脳室上皮関門の完全性が阻害された場合（例えば、ＥＶＤ移植後の局所的損傷）、Ｈｂ：Ｈｐは、脳組織中に局所的に浸透する（矢印頭部）。スライド全体のスキャンを、１０×倍率で取得した単一画像のスティッチングにより生成した。上段パネルは、核染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ社）、およびＴＣＯ標識されたＨｂまたはＨｂ：Ｈｐ（Ｔｅｔ－Ｃｙ５）のオーバーレイをそれぞれ表示する一方、下段パネルは、標識されたタンパク質のみを示す。

【図9】ＴＣＯ標識されたＨｂ（Ａ）およびＴＣＯ標識されたＨｂ：Ｈｐ（Ｂ）を注射し、核（「Ｎｕｃｌｅｉ」）、および標識された化合物（「ＴＣＯ－Ｈｂ」または「ＴＣＯ－ＨｂＨｐ」）について染色した後の、中脳を通過するヒツジ脳切片の代表的な組織学的画像を示す図である。Ａ、Ｈｂは、頭蓋クモ膜下ＣＳＦ腔から、中脳のグリア境界膜を経由して脳実質中に浸透する（Ａの「ＴＣＯ－Ｈｂ」画像内の明るいエリア）。Ｂ、Ｈｂ：Ｈｐ複合体の分布は、貫通皮質血管のＣＳＦで満たされた血管周囲腔（Ｖｉｒｃｈｏｗ－Ｒｏｂｉｎ腔）に限定される。スライド全体のスキャンを、１０×倍率で取得した単一画像のスティッチングにより生成した。上段パネルは、核染色および標識された化合物のオーバーレイを表示する一方、下段パネルは、標識された化合物のみを示す。

【図10】ＴＣＯ標識されたＨｂ（Ａ～Ｄ）またはＨｂ：Ｈｐ複合体（Ｅ～Ｈ）を輸注した後に、ヒツジから得られた中脳の脳室周囲エリア内に位置する小動脈の代表的な共焦点画像を示す図である。１２０μｍビブラトーム切片を、血管平滑筋細胞（ａＳＭＡ）、アストロサイト終足（ＡＱＰ４）、およびＴＣＯ標識されたＨｂについて染色した（テトラジン－Ｃｙ５）。黒色～白色のグラジエント画像（Ｈｂシグナル）は、対応する画像から得られた標識ヘムタンパク質のシグナルのみを表示する。ＣＳＦから血管構造（平滑筋細胞層）および脳実質（アストロサイトエリア）内への無細胞Ｈｂの非局在化は、Ｈｐによりブロックされる。スケールバーは２０μｍである。

【図11】Ｈｂ（Ａ）またはＨｂ：Ｈｐ複合体（Ｂ）を輸注した後の２匹のヒツジについて側面投影したときの例証的ＤＳＡの比較を示す図である。脳底動脈（矢印）の分節性血管攣縮（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｖａｓｏｓｐａｓｍ）は、Ｈｂ輸注から６０分後に明らかとなった一方、Ｈｂ：Ｈｐ複合体が輸注された動物では分節性血管攣縮を検出することはできなかった。

【図12】ベースライン（Ａ）およびＨｂ輸注から６０分後（Ｂ）における例証的な血管造影図を、側面投影したときの中大脳動脈における分節性血管攣縮（上段パネル、矢印）について、また背腹方向に投影したときの前大脳動脈（下段パネル、矢印）ならびに中大脳動脈（下段パネル、アスタリスク）について示す図である。画像は、すべての主要血管テリトリーに生ずる分節性血管攣縮を示す。

【図13】上段パネル（Ａ）は、ＨｂまたはＨｂ：Ｈｐの輸注から６０分後の大脳動脈の相対的直径変化を示す図である（ＡＣＡ：前大脳動脈、ＢＡ：脳底動脈、ＩＣＡ：内頸動脈、ＭＣＡ：中大脳動脈）。ダイヤモンドは平均および９５％信頼区間を表す（１群当たりｎ＝４のヒツジ）。下段パネルは、ａＣＳＦ（Ｂ）、ＨｂまたはＨｂ：Ｈｐ（Ｃ）の輸注から６０分後の全分析対象動脈領域の相対的直径変化の累積的分析を示す図である。ダイヤモンドは平均および９５％信頼区間を表す。（ＡＣＡ：前大脳動脈、ＢＡ：脳底動脈、ＩＣＡ：内頸動脈、ＭＣＡ：中大脳動脈）。

【図14】（Ａ）表示の通り、Ｈｂおよび（後続する）Ｈｐの脳室内輸注後のクモ膜下腔から収集されたヒツジＣＳＦサンプルの連続したＳＥＣ溶出プロファイル。ＨｂおよびＨｂ－Ｈｐ複合体の標準的な溶出プロファイルを最上段に示す；および（Ｂ）ベースライン、Ｈｂ輸注から４５分後、およびＨｐ輸注から４５分後における中大脳動脈（ＭＣＡ）のＤＳＡを示す図である。

【図15】処置後血管造影の前後６０分において収集したヒツジＣＳＦ中に浸漬されたブタ脳底動脈のＮＯ媒介式の弛緩の共役を示す図である。人工ＣＳＦの輸注後（ＣＳＦ－ｈｅｍｅ ０μＭのＨｂ＝対照ＣＳＦ；左側パネル）、Ｈｂ輸注後（ＣＳＦ－ｈｅｍｅ ２００～２４０μＭのＨｂ；中央パネル）：Ｈｂ－Ｈｐ輸注後（ＣＳＦ－ｈｅｍｅ ２００～２４０μＭ；右側パネル）。中央パネル内の点線は、等モルＨｐのｅｘ ｖｉｖｏ添加を通じたＮＯ応答の復旧を示す。拡張性の応答が、すべての実験において、ＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅの単回ボーラスにより誘発された。

【図16】急性出血後１、４、７、１１、および１４日目の患者サンプルにおけるＣＳＦタンパク質の分類を示す図である。ＬＣ－ＭＳＭＳにより同定されるタンパク質を、対数変換後の標準化されたイオン強度比のＫ平均クラスタリングにより分析した。右側パネルは、同定されたタンパク質の主成分分析を示す。クラスター１：不変のまま存続するタンパク質（すなわち、ＡＬＢ）。クラスター２：経時的に減少するタンパク質（すなわち、ＨＰ、ＨＰＲ）。クラスター３：経時的に増加するタンパク質（すなわち、ＨＢＢ、ＨＢＡ、ＦＴＨ、ＨＢＤ、ＣＡＴ、ＣＡ１、ＦＴＬ）。略号：ＡＬＢ、アルブミン；ＨＰ、ハプトグロビン；ＨＰＲ、ハプトグロビン関連タンパク質；ＨＢＢ、Ｈｂ－β；ＨＢＡ、Ｈｂ－α；ＦＴＨ、フェリチン重鎖；ＨＢＤ、Ｈｂ－δ；ＣＡＴ、カタラーゼ；ＣＡ１、カルボニックアンヒドラーゼ；ＦＴＬ、フェリチン軽鎖。

【図17-1】第四脳室の脈絡膜内細動脈の組織形態計測分析を示す図である。ヒツジ脳の１２０μｍ切片をα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）について染色した。（Ａ）試験された脳切片の解剖学的位置の例証図。処置に対して盲検化された研究者が、脈絡膜内管腔の共焦点画像を記録した。（Ｂ）Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて、αＳＭＡ陽性構造の内周および外周をマニュアル描写することにより、内腔面積（Ａ_{ｉｎｎｅｒ}）、およびセクション毎の管腔面積の合計（Ａ_{ｏｕｔｅｒ}）を管腔毎に数値化し、そして内腔面積率を計算した。この測定を、盲検化された研究者３名により、すべての画像について実施し、そして平均値をさらに分析した。（Ｃ）ＨｂおよびＨｂ－ハプトグロビン処置ヒツジの脈絡膜内細動脈の代表的な画像。（Ｄ）分析された全管腔に関するプロット後のデータおよび統計分析（ｎ＝５７）。（Ｅ）ヒツジ１匹当たりの平均内腔面積に関するプロット後のデータおよび統計分析（ｎ＝３）。ドットは個々の動物を表す。ダイヤモンドは、平均および９５％ＣＩを表す。オーバーラップマーク（平均ラインよりも上および下の水平ライン）は、重複しない場合には、群間の統計的有意差を定義する（ｐ＜０．０５）。

【図17-2】図１７－１の続き。

【図18】１０μＭのｏｘｙＨｂを含有するバッファー中に浸漬後の単離された脳底動脈セグメントの、組換えＨｐ１－１または血漿由来のＨｐ２－２をバッファーに添加する前（左側の２つの箱ひげ図）およびその後の、ＭＡＨＭＡ ＮＯＮＯａｔｅ（６０ｎＭ）に対する応答を示す図である。ＮＯ誘発性の血管拡張応答の回復において、Ｈｐ１－１およびＨｐ２－２の間で有意差を認めることはできない。１テスト条件当たりＮ＝４の血管セグメント。この実験において、血管応答は、最適なＩＣ１／ＩＣ１００比まで受動的ストレッチングを行った後の張力（＝１００％）およびＰＦ２α添加後の持続的収縮レベル（＝０％）と比較して標準化した。

【図19】１０μＭのｏｘｙＨｂを含有するバッファー中に浸漬後の単離された脳底動脈セグメントの、等モル濃度の血漿由来Ｈｐ１－１（黒色点線トレース）または血漿由来Ｈｐ２－２（灰色のトレース）をバッファーに添加する前（上段パネルの「Ｈｂディップ」）およびその後（下段パネルの「Ｈｐディップ」）の、ＭＡＨＭＡ ＮＯＮＯａｔｅ（６０ｎＭ）に対する応答を示す図である。ＮＯに対する血管拡張応答の回復において、血漿由来Ｈｐ１－１およびＨｐ２－２の間で、定性的な差異を認めることはできない。１テスト条件当たりＮ＝６の血管セグメント。この実験において、血管応答は、最適なＩＣ１／ＩＣ１００比まで受動的ストレッチングを行った後の張力（＝１００％）およびＰＦ２α添加後の持続的収縮レベル（＝０％）と比較して標準化した。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本明細書全体を通じて、文脈から別途必要とされない限り、言葉「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「～を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変化形は、記載された要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の組入れを意味するが、しかし任意のその他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を除外しないものと理解される。

【0016】

本明細書において、任意の先行する公開資料（またはそれに由来する情報）、または公知である任意の事案を参照したからといって、先行する公開資料（もしくはそれに由来する情報）または公知の事案が、本明細書と関連する試みの範囲（ｆｉｅｌｄ ｏｆ ｅｎｄｅａｖｏｕｒ）における共通一般知識の一部分を形成するという容認もしくは承認、またはその任意の形態の示唆と受け取られるものではなく、またそうすべきでない。

【0017】

対象とする明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈より別途明確に指示されない限り、複数形の側面を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「ある薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）」という場合、それは単一の樹脂、ならびに２つまたはそれより多くの薬剤を含む；「その組成物（ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という場合、それは単一の組成物、ならびに２つまたはそれより多くの組成物を含む；以下同様。

【0018】

相反する何らかの示唆が存在しない場合、「％」含有量というのは、本明細書全体を通じて、％ｗ／ｗ（重量／重量）を意味するものと解釈される。例えば、総タンパク質の少なくとも８０％を占めるハプトグロビン含有量を含む溶液は、総タンパク質の少なくとも８０％ｗ／ｗを占めるハプトグロビン含有量を含む組成物を意味するものと解釈される。

【0019】

本発明は、Ｈｐは、ｉｎ ｖｉｖｏでの、脳血管攣縮のような無細胞Ｈｂ媒介式の有害な二次神経学的転帰を低下させ、さもなければ防止することができる、という本発明者らの驚くべき発見に少なくとも一部において基づく。したがって、本明細書で開示される１つの態様では、血管外溶血および無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法であって、Ｈｐまたはその機能的類似体が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、それを必要としている対象のＣＳＦを、治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）に曝露する工程を含む前記方法が提供される。

【0020】

出血性脳卒中
出血性脳卒中またはＣＳＦコンパートメント中への出血は、本明細書では、脳内出血、脳溢血、または頭蓋内出血とも交換可能に呼ばれる。そのような出血は、局所的出血を引き起こす脳内の血管破裂により一般的に特徴づけられる。出血の場所は変化し得る。例えば、ＣＳＦコンパートメント中への出血は、脳室内出血、実質内出血、および／またはクモ膜下出血に起因し得る。

【0021】

出血性脳卒中は、当業者にとってなじみ深いように、異なる自然経過、評価、およびマネジメントを伴う一連の病理学からなる。出血性脳卒中は、病因論に応じて一次または二次として一般的に分類される。

【0022】

一実施形態では、出血性脳卒中は、脳室内出血（ＩＶＨ）またはクモ膜下出血（ＳＡＨ）である。一実施形態では、血性脳卒中は、動脈瘤性クモ膜下出血（ａＳＡＨ）である。

【0023】

対象における出血性脳卒中、特にＳＡＨを診断する方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、脳血管造影法、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、ならびに対象のＣＳＦ内ｏｘｙＨｂおよびビリルビンの分光光度分析が挙げられる（例えば、Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ ＡＭ．，２００１，ＡＣＰ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｎｏ １６６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，５４（１１）：８２７－８３０を参照）。

【0024】

出血性脳卒中は、天然に生じる出血（例えば、動脈瘤破裂の結果としての）または外傷性出血（例えば、頭部に対する外傷の結果としての）であり得るものと当業者により理解される。一実施形態では、出血性脳卒中は、非外傷性出血としても知られている天然に生じる出血である。一実施形態では、出血性脳卒中は外傷性出血である。

【0025】

用語「脳脊髄液」またはＣＳＦは、脳室、ならびに頭蓋および脊髄クモ膜下腔内の液体を意味するものと理解される。脳室、頭蓋および脊髄クモ膜下腔は、本明細書では、まとめて「ＣＳＦコンパートメント」と呼ばれる。したがって、本明細書で開示される一実施形態では、方法は、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程を含む。

【0026】

ＣＳＦは、主として、ただしこれに限らず脈絡叢により分泌されるが、脈絡叢は、脳室腔（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｕｍｅｎ）中に突き出た髄膜の粒状突起から構成され、その上皮表面は脳室上皮に連なる。試験より、脳間質液、脳室上皮、および毛細血管は、ＣＳＦ分泌においてもやはり役割を演じ得ることが示唆されている。ＣＳＦ容積は、ヒト成人において約１５０ｍＬであると見積もられ、個人間で顕著に異なるものの、頭蓋と脊髄クモ膜下腔内に１２５ｍＬおよび脳室内に２５ｍＬというように、両者間において一般的に分布している。ヒト成人におけるＣＳＦ分泌量は、１日当たり４００～６００ｍＬの間で変化し、ＣＳＦの約６０～７５％は、側脳室の脈絡叢、ならびに第三および第四脳室の脈絡膜により生成される。ＣＳＦの脈絡膜分泌は、２つの工程：（ｉ）圧力勾配による、脈絡膜毛細血管から脈絡膜間質コンパートメントへの血漿の受動的濾過、ならびに（ｉｉ）カルボニックアンヒドラーゼおよび膜イオンキャリアタンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｏｎ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）が関与する、脈絡膜上皮を横断する間質コンパートメントから脳室腔への能動輸送を一般的に含む。ＣＳＦは、電解質バランスの制御、活性分子の循環、およびカタボライトの除去により、脳間質液およびニューロン環境のホメオスタシスにおいて必要不可欠な役割を演ずる。ＣＳＦは、脈絡叢分泌生成物をその作用部位に移送し、そうすることで含浸による脳の特定領域の活性を調節する一方、シナプス伝達は、より迅速な活性変化を生み出す。脳代謝の老廃物である過酸化生成物およびグリコシル化されたタンパク質は、加齢に関連するＣＳＦターンオーバーの減少と共に蓄積する（Ｓａｋｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，１２８（６）：３０９－３１６）。

【0027】

有害な二次神経学的転帰
ＳＡＨのような出血性脳卒中から生き延びても、そのような患者は、１つまたはそれ以上の有害な二次神経学的転帰または合併症を発症する有意なリスクに晒されている。用語「有害な二次神経学的転帰」とは、本明細書で使用される場合、出血性脳卒中に後続する有害な神経学的イベント（脳組織に対する二次傷害）を指す。出血性脳卒中後の二次傷害は、一次傷害（例えば、質量効果および物理的破綻）により、血腫に対する生理学的応答（例えば、炎症）により、ならびに／または血液および血液成分の放出により開始されるイベントのカスケードにより引き起こされると考えられる。有害な二次神経学的転帰は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、神経毒性、アポトーシス、炎症、一酸化窒素枯渇、酸化性組織傷害、脳血管攣縮、脳血管反応性、浮腫、および広汎性脱分極（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｄｅｐｏｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）が挙げられる（例えば、Ａｌ－Ｔａｍｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，７３（６）：６５４－６６７（２０１０）；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ，１３：４１６－４２４（２０１０）；およびＭａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９９：６４４－６５２（２００３）を参照）。

【0028】

用語「～を処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「～を処置する（ｔｒｅａｔ）」などは、本明細書に記載されるように、有害な二次神経学的転帰（１つまたはそれ以上のその症状を含む）を緩和し、最小限に抑え、低下させ、軽減、改善し、さもなければ阻害することを意味するように、本明細書では交換可能に使用される。用語「～を処置すること」、「処置」などは、有害な二次神経学的転帰を発症しやすい、またはそのリスクを有するおそれがあるが、しかしそれを有するとはまだ診断されていない対象において、有害な二次神経学的転帰が生ずるのを阻止し、または有害な二次神経学的転帰の発現もしくは後続する進行を遅延させることを意味するように、本明細書においてやはり交換可能に使用される。その文脈において、用語「～を処置すること」、「処置」などは、「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」、「予防上（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）」、および「予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）」のような用語と交換可能に使用される。しかしながら、本明細書に開示される方法は、有害な二次神経学的転帰が処置される対象において生ずるのを完全に防止する必要はないものと理解される。本明細書に開示される方法は、処置が存在しない場合に観察されるはずであった有害な二次神経学的転帰よりもその数が少なくなり、その重症度が低くなりさえすれば、対象内の有害な二次神経学的転帰を単に緩和し、低下させ、軽減、改善し、さもなければ阻害するだけで十分であり得る。したがって、明細書に記載される方法は、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度を低下させることができる。

【0029】

本明細書で対象と呼ぶ場合、それは対象が出血性脳卒中を有したことがあることを意図するものではなく、出血性脳卒中のリスクを有する対象も含まれるものと理解される。一実施形態では、対象は、出血性脳卒中またはその症状を有する（すなわち、経験している）。別の実施形態では、対象は、処置時に出血性脳卒中をすでに有するものではないが、しかし出血性脳卒中のリスクを有する。例証的事例として、対象は、まだ破裂していないが、しかし破裂のリスクを有する動脈瘤を有する。この事例において、対象は、動脈瘤が破裂するリスクを最小限に抑えるために、外科的介入（例えば、クリッピング術または血管内コイリング（ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｉｌｉｎｇ）により）を受ける可能性がある。したがって、外科的介入の前、その期間中または後に動脈瘤が破裂するような場合には、本明細書に記載される方法が、有害な二次神経学的転帰を最小限に抑え、低下させ、無効にし、さもなければ阻害するために、対象に対して予防上の措置として好適に指定される可能性がある。その文脈において、本明細書に記載される方法は外科的介入の前、その期間中または後に行われる予防上の措置として採用される場合もある。

【0030】

本明細書に開示される方法が、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度において、主観的、定性的、および／または定量的な低下をもたらす程度は、ＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する前の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度と比較したとき、例えば少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の低下として表すことができる。

【0031】

有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度において、出血性脳卒中後に、主観的、定性的、および／または定量的低下が測定可能である好適な方法は、当業者にとってなじみ深く、また測定される有害な二次神経学的転帰の性質に概ね依存する。例証的事例は本明細書に別途記載される。

【0032】

一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、神経毒性、炎症、一酸化窒素枯渇、酸化性組織傷害、脳血管攣縮、脳血管反応性、浮腫、および広汎性脱分極からなる群から選択される。

【0033】

一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）である。ＳＡＨ後のＤＩＮＤは、頭痛、髄膜症の増悪、および／または体温上昇により特徴づけられ、その後に意識の変動性の衰退および限局的神経学的症状の出現が一般的に後続する脳虚血の重篤な症候群であり、その理解は十分でない。ＤＩＮＤは、出血性発作後、少なくとも３～４日に認められる神経学的機能の劣化として特徴的に定義される。ＤＩＮＤは、臨床的／症候性血管攣縮または遅発性脳虚血（ＤＣＩ）とも呼ばれる。ＤＩＮＤは、初期出血からの生存者における疾病率および死亡率の主要原因として存続する。ＤＩＮＤの報告された有病率は約２０％～３５％であるが、血液負荷がより高い者であっても、有病率は高くて４０％であり得る。ＤＩＮＤは、患者のおよそ２０％において脳梗塞に、またａＳＡＨ後に生じたすべての死亡および身体障害のうちの約１３％にその原因がある。ＤＩＮＤを判定する、適する方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，２００６；１２９（１２）：３２２４－３２３７に記載されており、その内容は、参照によって本明細書にそのまま組み入れる。一実施形態では、ＤＩＮＤは、例えば、皮質脳波検査法による広汎性陰性低速電圧変化（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｌｏｗ ｖｏｌｔａｇｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）によって証明されるように、広汎性マス脱分極（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｍａｓｓ ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）により判定される。一実施形態では、ＤＩＮＤは、少なくとも２ＧＣＳレベルの遅発性意識低下および／または新たな限局的神経障害と関連する。

【0034】

一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は脳血管攣縮である。脳血管攣縮またはＣＶ（「血管造影脳血管攣縮」とも呼ばれる）は、出血性脳卒中後の限局性虚血の最も一般的な原因の１つであり、またＳＡＨ関連の身体障害および死亡の最大約２３％を占める可能性がある。ＣＶは、クモ膜下腔中への出血性脳卒中後の、特に脳の基底部にある大キャパシタンス動脈（ｌａｒｇｅ ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ａｒｔｅｒｙ）（すなわち、大脳動脈）における持続的血管収縮により引き起こされる血管の狭窄により一般的に特徴づけられる。用語「血管攣縮」は、したがって、血管造影的に決定される動脈の狭窄との関連で一般的に使用される。血管の持続的収縮は、遠位脳領域の潅流を低下させ、そして脳血管抵抗を高める。未処置のまま放置すると、ＣＶは、脳組織に対する血液供給量が限定されることに主に起因して、脳虚血および脳梗塞の形態の神経毒性（脳細胞損傷）を最終的に引き起こすおそれがある。ＣＶは、当業者にとって公知の任意の適する手段により検出可能であり、その例証的事例として、デジタルサブトラクション血管造影法（ＤＳＡ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）血管造影法（ＣＴＡ）、磁気共鳴（ＭＲ）血管造影法（ＭＲＡ）、経頭蓋ドップラー超音波法、およびカテーテル（脳）血管造影法（ＣＡ）が挙げられる。一実施形態では、ＣＶはデジタルサブトラクション血管造影法（ＤＳＡ）により検出される。理論または特定の適用様式に拘泥するものではないが、大脳動脈の血管攣縮は、ＳＡＨ後の約３日目に一般的に開始し、約７～８日間後にピークに達し、そして約１４日目までに消散するが（例えば、Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ω．，４８：１７３－１７８（１９７８）を参照）、ただしＳＡＨ後４～１２日において血管造影を有する患者の少なくとも２／３に、ある程度の血管造影狭窄が生ずる。

【0035】

ＣＶの発生率は、ＳＡＨ後の時間に依存する。本明細書において別途指摘するように、発生率のピークは、ＳＡＨ後の約７～８日（３～１２日の範囲）に一般的に生ずる。ＳＡＨ後の時間に付加して、血管攣縮の有病率に影響を及ぼすその他の主要因子は、クモ膜下血液の容積、密度、時間的持続性、および分布である。ＣＶに対する予後因子として、ＣＴスキャン上でのクモ膜下血液の量、高血圧症、解剖学的および全身的要因、臨床グレード、および患者に対する抗線維素溶解薬投与の有無を挙げることができる。

【0036】

ＣＶの症状は、亜急性的に発現するのが一般的であり、また変動する可能性があり、そして過剰の眠気、傾眠、昏睡、片側不全麻痺または片麻痺、意志欠乏、言語障害、視野欠損、視線障害（ｇａｚｅ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）、および脳神経麻痺を挙げることができる。いくつかの症状は局所的であるものの、何らかの特定の病理学的プロセスの診断には役立たないのが一般的である。脳血管造影法が、大脳動脈を可視化および試験するためのゴールドスタンダードとして一般的に利用されるが、ただし経頭蓋ドップラー超音波法も使用可能である。

【0037】

本明細書において別途指摘するように、本発明者らは、Ｈｐが無細胞Ｈｂ媒介式のＣＶをｉｎ ｖｉｖｏで低下させ、さもなければ防止することが可能であることを驚くべきことに見出した。本明細書に開示される方法が、Ｈｂ媒介式のＣＶを低下させ、さもなければ防止する程度は、出血性脳卒中後の無細胞Ｈｂにより誘発される血管収縮（管腔狭窄）の程度、出血性脳卒中後の対象のＣＳＦ内に含まれる無細胞Ｈｂの濃度、ＣＳＦがＨｐに曝露される期間、および何らかの持続性出血の有無などのようないくつかの因子に依存し得るものと理解される。本明細書に開示の方法が対象におけるＣＶを低下させ、さもなければ防止したか評価する手段は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、デジタルサブトラクション血管造影法（ＤＳＡ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）血管造影法（ＣＴＡ）、磁気共鳴（ＭＲ）血管造影法（ＭＲＡ）、およびカテーテル血管造影法（ＣＡ）が挙げられる。

【0038】

一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、収縮した脳血管の平均管腔径を、６０分間の曝露後に、ＤＳＡにより決定される場合、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、またはより好ましくは約４０％～約５０％回復させる。

【0039】

一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、収縮した前大脳動脈の平均管腔径を、６０分間の曝露後に、ＤＳＡにより決定される場合、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、またはより好ましくは約４０％～約５０％回復させる。

【0040】

一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、収縮した内頸動脈の平均管腔径を、６０分間の曝露後に、ＤＳＡにより決定される場合、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、またはより好ましくは約４０％～約５０％回復させる。

【0041】

一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、収縮した中大脳動脈の平均管腔径を、６０分間の曝露後に、ＤＳＡにより決定される場合、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、またはより好ましくは約４０％～約５０％回復させる。

【0042】

一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、収縮した脳底動脈の平均管腔径を、６０分間の曝露後に、ＤＳＡにより決定される場合、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、またはより好ましくは約４０％～約５０％回復させる。

【0043】

一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、６０分間の曝露の後、収縮した細い実質管腔（ｓｍａｌｌ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｖｅｓｓｅｌ）（例えば、脳細動脈）の平均管腔面積を、ｉｎ ｖｉｖｏでの潅流イメージング（例えば、ＭＲＩ潅流、ＣＴ潅流）により決定される場合、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、またはより好ましくは少なくとも８０％増加させる。一実施形態では、細い実質管腔は脳細動脈である。一実施形態では、それを必要としている対象のＣＳＦをＨｐに曝露する工程は、本明細書に記載されるように、６０分間の曝露の後、細い実質管腔の収縮を防止することにより、脳微小灌流を、ｉｎ ｖｉｖｏでの潅流イメージング（例えば、ＭＲＩ潅流、ＣＴ潅流）により決定される場合、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２５％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも４５％、好ましくは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、またはより好ましくは少なくとも８０％回復させる。一実施形態では、細い実質管腔は脳細動脈である。

【0044】

一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）である。ＤＣＩは、ａＳＡＨを有する患者の約１／３において一般的に生じ、そしてこの患者の半数において死または永久的な身体障害を引き起こす（Ｄｏｒｓｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１：１９－２６（１９９４））。ＤＣＩは、組織虚血に起因する遅発性の神経学的退行として多くの場合特徴づけられ、また片側不全麻痺、失語症、失行症、半盲、もしくは等閑などのような限局性の神経学的障害の発生、および／またはグラスゴーコーマスケールの減少（総スコアまたはその個別コンポーネントのうちの１つ［眼、いずれかの側の動き、言葉］）と通常関連する（例えば、Ｆｒｏｎｔｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ，４０：１９６３－１９６８（２００９）；Ｋａｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，７３：１８－３６（１９９０）；およびＶｅｒｇｏｕｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ，４１：ｅ４７－ｅ５２（２０１０）を参照）。これは、少なくとも１時間継続する可能性があり、動脈瘤閉塞直後には出現しないが、脳の臨床的評価、ＣＴ、またはＭＲＩスキャニングによっても、その他の原因に帰属させることはできない。ＤＣＩおよび発性脳梗塞の発現は、とりわけＳＡＨ後の不良転帰の最も重要な原因である。

【0045】

脳梗塞は、ＤＣＩの結果でもあり得る。例えば、ＤＣＩに起因する梗塞は、脳に対する動脈または静脈血の供給不足に起因する脳細胞死のエリアの存在として一般的に定義される。梗塞は、ＳＡＨ後約６週間以内の脳のＣＴまたはＭＲＩスキャンにより、または死亡の前約６週間以内に行われた最新のＣＴもしくはＭＲＩスキャンにおいて検出可能、または初期の動脈瘤閉塞後の約２４～４８時間の間のＣＴもしくはＭＲＩスキャンにおいては存在せず、またクリッピング術もしくは血管内処置などのようなその他の原因に帰属可能でなければ、検死時に証明可能である。脳室カテーテルまたは実質内血腫に一般的に起因するＣＴイメージング上の低吸収域（ｈｙｐｏｄｅｎｓｉｔｙ）は、ＤＣＩ起因の脳梗塞のエビデンスとはみなされない。

【0046】

Ｖｅｒｇｏｕｗｅｎらにより報告されたように（Ｓｔｒｏｋｅ．２０１０；４１：２３９１－２３９５）、「遅発性脳虚血により引き起こされた臨床的退行」および「脳梗塞」を統一的に定義することで、その病因について仮説を設けずに、形態学的および臨床的特性に関して最も意義のある要素が把握されるはずである。ＣＴ／ＭＲＩ上の脳梗塞は、ＳＡＨから３ヶ月後の機能的転帰と強い相関関係を有するので、またそれ（ＣＴ／ＭＲＩ上の脳梗塞）は観察者間で合意形成される割合が高いと期待されること、鎮静化され昏睡状態にある患者においてＤＣＩを検出できること、およびＤＣＩの結果を客観的に定量化できることを前提とすれば、ニューロイメージングにおける脳梗塞の方が、ＤＣＩ単独で引き起こされた臨床的退行よりも良好な転帰指標であると思われる。ＤＣＩのこれまでの定義では、ＤＣＩの臨床特性と、血管造影法／経頭蓋ドップラー法の所見、またはニューロイメージングもしくは検死における脳梗塞とが多くの場合統合されたが、著者らは、これらは個別に報告されるべきであることを提案する。著者らは、観察者間での合意形成の割合が低いと疑われることから、ＤＣＩにより引き起こされた臨床的退行を、転帰の二次的指標以上に重視すべきでないことも提案する。Ｖｅｒｇｏｕｗｅｎらによれば、ＤＣＩにより引き起こされた臨床的退行の提案された定義は、「限局性の神経学的障害（例えば、片側不全麻痺、失語症、失行症、半盲、または等閑など）の発生、またはグラスゴーコーマスケールにおける少なくとも２ポイントの減少（総スコアまたはその個別のコンポーネント［眼、いずれかの側の動き、言葉］のうちの１つにおける）」である。これは、少なくとも１時間継続するはずであり、動脈瘤閉塞直後には出現せず、また臨床的評価、脳のＣＴまたはＭＲＩスキャニング、および該当する検査室試験によってその他の原因に帰属させることはできない。

【0047】

ＳＡＨを含む、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰は、免疫細胞活性化、および／またはＣＳＦコンパートメント中への浸潤、および炎症性サイトカインの放出を含め、炎症と関連することが明らかにされた。Ｍｉｌｌｅｒら（Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４；２０１４：３８４３４２）が考察するように、試験から、炎症はＳＡＨ後の神経学的傷害の直接的なメディエーターであり、またＳＡＨ後血管攣縮の原因因子であることが明らかとなった。ＳＡＨの病態生理学と関わる主要な炎症性分子は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、セレクチン（Ｌ－セレクチンおよびＰ－セレクチン）、インテグリン（例えば、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）およびＭａｃ－１インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８））、ＴＮＦα、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）、炎症促進性インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－８）、およびエンドセリン１（ＥＴ－１）が挙げられる。本明細書で開示される一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は、セレクチン（例えば、Ｌ－セレクチンおよびＰ－セレクチン）、インテグリン（例えば、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）およびＭａｃ－１インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８））、ＴＮＦα、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）、炎症促進性インターロイキン、およびエンドセリン１（ＥＴ－１）からなる群から選択される１つまたはそれ以上の炎症マーカーの差次的発現と関連する。一実施形態では、炎症促進性インターロイキンは、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１Ｂ、およびＩＬ－８からなる群から選択される。

【0048】

Ｎｉｓｓｅｎらは、ＤＩＮＤを有する患者におけるＰ－セレクチンの血清濃度は、ＤＩＮＤを有さない患者と比較したとき、それよりも有意に高いことをこれまでに明らかにした（Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００１；７１：３２９－３３３）。また著者らは、ＤＩＮＤを有する患者におけるＬ－セレクチンの血清濃度が、ＤＩＮＤを有さない患者と比較したとき、それよりも有意に低いことも明らかにした。したがって、一実施形態では、本明細書に記載される方法が出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度を低下させる程度は、処置前の対象におけるＰ－セレクチンの濃度と比較したとき、対象の血清またはＣＳＦ中のＰ－セレクチン濃度における、例えば少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の低下により決定される。別の実施形態では、本明細書に記載される方法が、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度を低下させる程度は、処置前の対象におけるＬ－セレクチンの濃度と比較したとき、対象の血清またはＣＳＦ中のＬ－セレクチン濃度における、例えば少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の増加により決定される。Ｐ－セレクチンおよびＬ－セレクチンの濃度が測定可能である方法は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｎｉｓｓｅｎら（Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００１；７１：３２９－３３３）に記載されており、その内容は参照によって本明細書においてそのまま組み入れる。

【0049】

炎症促進性サイトカインＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα、およびＭＣＰ－１、ならびにエンドセリン－１のレベルもまた、ＳＡＨ後の患者において上昇していることが明らかにされた（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４；２０１４：３８４３４２）。したがって、本明細書で開示される一実施形態では、本明細書に記載される方法が、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度を低下させる程度は、処置前の対象における炎症促進性サイトカインの濃度と比較したとき、対象の血清またはＣＳＦ中の炎症促進性サイトカインの濃度における、例えば少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の低下により決定されるが、ただし炎症促進性分子は、ＩＬ－１Ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα、ＭＣＰ－１、およびエンドセリン－１からなる群から選択される。炎症性メディエーターの濃度が測定可能である方法は、本明細書に記載されるように、当業者にとってなじみ深い。

【0050】

ＣＳＦにおける一酸化窒素（ＮＯ）枯渇が、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の病因に寄与することも明らかにされている（Ｐｌｕｔａ ｅｔ ａｌ．ＪＡＭＡ．２００５；２９３（１２）：１４７７－１４８４を参照）。ＮＯレベルは、（１）動脈の外膜における、ニューロン型一酸化窒素シンターゼ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）（ＮＯＳ）を含有するニューロンに対するオキシヘモグロビンの毒性；（２）内皮ＮＯＳの内因性阻害；および（３）クモ膜下の血塊から放出されたオキシヘモグロビンによる一酸化窒素の除去に起因して、ＳＡＨ後のＣＳＦにおいて減少している。したがって、本明細書で開示される一実施形態では、本明細書に記載される方法が、出血性脳卒中後の有害な二次神経学的転帰の数および／または重症度を低下させる程度は、処置前の対象のＣＳＦ中のＮＯの濃度と比較したとき、対象のＣＳＦにおけるＮＯの濃度における、例えば少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の増加により決定される。ＣＳＦ中のＮＯ濃度が測定可能である方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｐｌｕｔａらの（ＪＡＭＡ．２００５；２９３（１２）：１４７７－１４８４）に記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。

【0051】

本明細書において別途指摘するように、本発明者らは、治療的Ｈｐは、ＣＳＦコンパートメントから脳の間質腔への無細胞Ｈｂの浸透を防止することができることを、驚くべきことに見出した。この驚くべき所見は、無細胞Ｈｂを、Ｈｐとの複合体形成を通じてＣＳＦコンパートメント内に閉じ込めてしまえば、大脳血管系および脳実質に対する、無細胞Ｈｂ（主としてｏｘｙＨｂ）の毒性効果を防止することができることを示唆する。したがって、一実施形態では、有害な二次神経学的転帰は、脳実質内の有害な二次神経学的転帰である。

【0052】

ハプトグロビン
ハプトグロビン（Ｈｐ）は、ジスルフィド結合によりリンクした２本のα鎖および２本のβ鎖を含む四量体構造を有する。β鎖（アミノ酸２４５個）は、約４０ｋＤａの質量を有し（そのおよそ３０％ｗ／ｗは炭水化物である）、またすべての表現型に共通する。α鎖は、少なくとも２つの形態：α１、（アミノ酸８３個、９ｋＤａ）およびα２（アミノ酸１４２個、１７．３ｋＤａ）で存在する。したがって、Ｈｐは、Ｈｐ１－１、Ｈｐ２－１、およびＨｐ２－２と呼ばれる３つの表現型として生ずる。Ｈｐ１－１は２本のα１鎖を含有し、Ｈｐ２－２は２本のα２鎖を含有し、そしてＨｐ２－１は１本のα１と１本のα２鎖を含有する。Ｈｐ１－１は、１００ｋＤａ、またはＨｂと複合体形成したとき１６５ｋＤａの分子質量を有する。Ｈｐ１－１は、単一のアイソフォームとして存在し、またＨｐダイマーとも呼ばれる。Ｈｐ２－１は、２２０ｋＤａの平均分子質量を有し、そして線状ポリマーを形成する。Ｈｐ２－２は、４００ｋＤａの平均分子質量を有し、そして環状ポリマーを形成する。異なる各ポリマー形態は、異なるアイソフォームである。ＰＣＲ法が、Ｈｐ多型を研究するために考案された（Ｋｏｃｈ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：１３７７－１３８２）。

【0053】

２つ重要な対立遺伝子、Ｈｐ１およびＨｐ２が、第１６染色体上に見出されるＨｐ遺伝子について存在する。２つの対立遺伝子が、構造的多型：ホモ接合型（１－１または２－２）およびヘテロ接合型２－１といった、考え得る３つの異なる遺伝子型に関与している。欧米の集団において、Ｈｐ１－１の分布は約１６％であり、Ｈｐ２－１は約４８％であり、そしてＨｐ２－２は約３６％であると見積もられている。Ｈｐは、２つサブユニットα鎖およびβ鎖（ジスルフィド結合により結びついている）に切断される。両対立遺伝子は同一のβ鎖を共有する。β鎖はＨｂとの結合に関わり、したがって両遺伝子型は類似したＨｂ結合親和性を有する。

【0054】

無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより無細胞Ｈｂの生物学的活性を中和する能力を有する限り、天然に存在する、および組換え型Ｈｐが、本明細書に記載される方法に適するものと理解される。Ｈｐの適する天然に存在する形態は当業者にとって公知であり、その例証的事例は、Ｋｏｃｈら（２００２，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８：１３７７－１３８２）、およびＫａｓｖｏｓｖｅら（２０１０，Ｃｈａｐｔｅｒ ２－Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０：２３－４６）に記載されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。

【0055】

一実施形態では、Ｈｐは、血漿由来のＨｐを含み、それから構成または実質的に構成される。Ｈｐは好ましくはヒトＨｐである。天然起源のＨｐ（例えば、血漿）からＨｐを単離するための様々なプロトコールは当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、米国特許第４、０６１、７３５号および同第４、１３７、３０７号（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら）、ならびに米国特許公報第２０１４００９４４１１号（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）に記載されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。天然起源のＨｐからＨｐを単離するためのその他の適する方法は、ＫａｔｎｉｋおよびＪａｄａｃｈ（１９９３，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｚ）４１：３０３－３０８）、Ｔｓｅｎｇら（２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ３３：２６５－２７３）、Ｋａｔｎｉｋら（１９９５，Ｅｕｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：７２７－７３２）、ＹａｎｇおよびＭａｏ（１９９９，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．，７３１：３９５－４０２）、ならびにＢａｓｌｅｒおよびＢｕｒｒｅｌ（１９８３ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ７（４）：３８７－４００）に記載されている。

【0056】

用語「ハプトグロビン」は、本明細書で使用される場合、Ｈｐのすべての表現型を含む（すべてのアイソフォームを含む）ものと理解される。Ｈｐは、均質（同一アイソフォームのＨｐから実質的に構成される場合）、または不均質（Ｈｐ１－１、Ｈｐ１－２、およびＨｐ２－２を含む、異なるＨｐアイソフォームの組合せを含む場合）であり得る。Ｈｐの組成は、元となるＨｐの表現型に最終的に依存するものと理解される。例えば、プールされた血漿サンプルが、Ｈｐを抽出／精製するのに使用される場合、Ｈｐの２以上のアイソフォームが単離される可能性がある。単離物中に存在するＨｐアイソフォームを決定するための適する方法は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｓｈｉｈら（２０１４，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，８９（４）：４４３－４４７）で議論されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。単離物中に存在するＨｐアイソフォームを決定するその他の適する方法として、高性能粒径排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＳＥＣアッセイ）、Ｈｐ ＥＬＩＳＡ、および比濁測定法（ｔｕｒｂｉｍｅｔｒｉｃ ｒｅａｄｉｎｇ）が挙げられ、Ｈｐの異なるアイソフォームが異なるアッセイにおいて異なるシグナルを一般的にもたらす。

【0057】

一実施形態では、Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される。好ましい実施形態では、Ｈｐは、Ｈｐ２－２多量体を含み、それから構成または実質的に構成される。Ｈｐは天然に存在するＨｐ（例えば、血漿由来）である場合もあれば、また組換えタンパク質として生成される場合もあり、その例証的事例は本明細書に別途記載される。一実施形態では、血漿由来のＨｐは、Ｈｐ２－２を含み、それから構成または実質的に構成される。別の実施形態では、血漿由来のＨｐは、Ｈｐ１－１を含み、それから構成または実質的に構成される。さらなる実施形態では、Ｈｐは、組換えＨｐを含み、それから構成または実質的に構成される。

【0058】

別途記載しない限り、用語Ｈｐには、本明細書で使用される場合、天然の、または天然に存在するＨｐの機能的類似体が含まれる。用語「機能的類似体」とは、天然に存在する（天然型の）Ｈｐの生物学的活性と実質的に同一の生物学的活性を共有する物質（ただし、生物学的活性が、少なくとも無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその生物学的活性を中和する類似体の能力である限りにおいて）を意味するものと理解される。「実質的に同一の生物学的活性」とは、機能的類似体は、天然に存在するＨｐアイソフォーム（例えば、Ｈｐ１－１、Ｈｐ１－２、およびＨｐ２－２）を含む、天然に存在するＨｐの結合親和性の少なくとも４０％（例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％など）である結合親和性を、無細胞Ｈｂに対して有することを一般的に意味する。物質がＨｐの機能的類似体であるか決定するための適する方法は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例（例えば、無細胞Ｈｂ誘発性の脳血管攣縮を低下させる機能的類似体の能力）は本明細書に別途記載される。

【0059】

本明細書で開示される一実施形態では、Ｈｐの機能的類似体は、天然型Ｈｐの機能的断片である。天然型Ｈｐの機能的断片は、断片が無細胞Ｈｂと複合体を形成する能力を保持し、これによりその生物学的活性を中和する限り、任意の適する長さであり得る。

【0060】

別の実施形態では、機能的類似体は、天然に存在する（天然型の）Ｈｐ分子とは異なるアミノ酸配列を有するペプチド（すなわち、コンパレーター）である。機能的類似体は、１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、またはそれより多くの）アミノ酸置換により、天然型Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する分子を含み得るが、ただし、前記差異は、類似体が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその生物学的活性を中和する能力を無効化しない、または完全には無効化しない。いくつかの実施形態では、機能的類似体は、天然型Ｈｐと比較して、類似体が無細胞Ｈｂと複合体を形成する能力を強化するアミノ酸置換を含む。一実施形態では、機能的類似体は、１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換により、天然型Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する。本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」とは、所与の位置において、アミノ酸の同一性を変化させて、それをほぼ等価なサイズ、電荷、および／または極性のアミノ酸に置き換えることを指す。アミノ酸の天然の保存的置換の例として、下記の８つの置換群（慣習的な１文字コードで表す）：（１）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（２）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（３）Ｋ、Ｒ、（４）Ａ、Ｇ；（５）Ｓ、Ｔ；（６）Ｑ、Ｎ；（７）、Ｄ；および（８）Ｃ、Ｓが挙げられる。

【0061】

一実施形態では、機能的類似体は、天然型Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する。「少なくとも８５％」という場合、それには、例えば、最適なアライメントまたは最良適合分析を行った後の、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性または類似性が含まれる。したがって、一実施形態では、配列は、例えば最適なアライメントまたは最良適合分析を行った後に、本明細書において識別された配列と、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、好ましくは少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％、または好ましくは１００％の配列同一性または配列相同性を有する。

【0062】

用語「同一性」、「類似性」、「配列同一性」、「配列類似性」、「相同性」、「配列相同性」などは、本明細書で使用される場合、アライメント済みの配列内の任意の特定のアミノ酸残基位置において、アミノ酸残基が、アライメント後の配列の間で同一であることを意味する。用語「類似性」または「配列類似性」は、本明細書で使用される場合、アライメント済みの配列内の任意の特定の位置において、アミノ酸残基のタイプが配列間で類似することを表す。例えば、ロイシンは、イソロイシンまたはバリン残基について置換することができる。本明細書において別途指摘するように、これは保存的置換と呼ばれる場合もある。一実施形態では、アミノ酸配列は、改変が、非改変（天然型）Ｈｐポリペプチドと比較したとき、改変後のポリペプチドの結合特異性または機能的活性に対して影響を及ぼさないように、その中に含まれるアミノ酸残基のいずれかを保存的に置換することによって改変され得る。

【0063】

いくつかの実施形態では、ペプチド配列における配列同一性は、相同性の割合（％）が最大となるように、ただし配列同一性の一環として保存的置換を一切考慮しないで配列をアライメントし、そして必要な場合にはギャップを導入した後、対応するペプチド配列の残基と同一である、候補配列内のアミノ酸残基の割合（％）と関係する。ＮまたはＣ末端延長部も、また挿入も、配列同一性または相同性を低下させるものとみなしてはならない。２つまたはそれより多くのアミノ酸配列のアライメントを実施し、そしてその配列同一性または相同性を決定するための方法およびコンピュータープログラムは、当業者に周知されている。例えば、２つのアミノ酸配列の同一性または類似性の割合（％）は、アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、またはＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して容易に計算できる。

【0064】

アミノ酸配列の「類似性」を決定するための技術は当業者に周知されている。一般的に、「類似性」とは、アミノ酸が同一である、または類似した化学および／もしくは物理特性（電荷もしくは疎水性などのような）を有する、２つもしくはそれより多くのペプチド配列の、または好適な場所におけるアミノ酸対アミノ酸の正確な比較を意味する。いわゆる「類似性の割合（％）」が、次に比較されるペプチド配列の間で決定可能である。一般的に、「同一性」とは、２つのペプチド配列のアミノ酸対アミノ酸の正確な対応を指す。

【0065】

２つまたはそれより多くのペプチド配列は、その「同一性の割合（％）」を決定することによっても比較可能である。２つの配列の同一性の割合（％）は、２つのアライメントされた配列間の正確な一致数を、より短い配列の長さで割り算して１００倍することとして記載することができる。核酸配列に対する近似的アライメント法が、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）のローカルホモロジーアルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ）により開発されたスコアリングマトリックスを使用して、ペプチド配列についても使用されるように拡張することができ、またＧｒｉｂｓｋｏｖ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３，１９８６）により標準化される。配列間の同一性または類似性の割合（％）を計算するための好適なプログラムは、当技術分野において一般的に公知である。

【0066】

比較ウィンドウをアライメントするための最適配列アライメント法が、アルゴリズムのコンピューターによる導入（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０に含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、米国）、または選択された様々な方法のいずれかにより生み出された検査法および最良アライメント法（すなわち、比較ウィンドウにおいて相同性の割合（％）が最高となる）により実施することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９）により開示されるようなＢＬＡＳＴプログラムファミリーについても参考にすることができる。配列分析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら（“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５）のユニット１９．３に見出すことが可能である。

【0067】

一実施形態では、機能的類似体は、類似体の安定性を増加させ、または類似体の溶解度を増加させるために、天然型Ｈｐと比較して、アミノ酸置換および／またはその他の改変を含む。

【0068】

機能的類似体は、天然に存在する化合物／ペプチドであり得る、または当業者にとって公知の方法を使用して、化学合成により合成的に製造することができる。

【0069】

Ｈｐは、微生物内で、組換えタンパク質として好適に生成される場合もあり、それは単離可能、および所望の場合にはさらに精製可能である。組換えＨｐを産生させるための好適な微生物は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、細菌、酵母菌、もしくは菌類、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞）、または組換えウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルス、またはセンダイウイルス）が挙げられる。組換えペプチドを生成するための好適な細菌は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはペプチド配列を発現する能力を有する任意のその他のバクテリアが挙げられる。組換えペプチドを生成するための好適な酵母菌タイプの例証的事例として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ属、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、またはペプチドを発現する能力を有する任意のその他の酵母菌が挙げられる。対応する方法は、当技術分野において周知されている。組換えにより生成されたペプチド配列を単離および精製するための方法も当技術分野において周知されており、例えばゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。

【0070】

本明細書に記載されるように、組換えＨｐの単離を促進するために、融合ポリペプチドを作製することができ、その場合、Ｈｐのペプチド配列またはその機能的類似体は、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能にする異種ポリペプチドと翻訳において融合している（共有結合的にリンクする）。好適な異種ポリペプチドの例証的事例は、Ｈｉｓ－Ｔａｇ（例えば、Ｈｉｓ_６。６個のヒスチジン残基）、ＧＳＴ－Ｔａｇ（グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ）などである。

【0071】

組換えＨｐを製造する場合、例えばコンビナトリアル化学の手段により製造するのに、またはきわめて変動性の構造についてハイスループットスクリーニング技術によって取得するのに、ファージライブラリーおよび／またはペプチドライブラリーも適する（例えば、Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｃａｒｌｏｓ Ｆ．Ｂａｒｂａｓ（Ｅｄｉｔｏｒ），ｅｔ ａｌ．；およびＷｉｌｌａｔｓ ＷＧ Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ｐｒａｃｔｉｃａｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；５０（６）：８３７－５４を参照）。

【0072】

組換えＨｐの例証的事例として、受託番号ＮＰ＿００５１３４（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、２０１８，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ４８７，８４－８９により記載される）、および受託番号Ｐ００７３８を有するペプチドが挙げられる。

【0073】

Ｈｐは、融合タンパク質の一部として、１つまたはそれ以上の異種部分に融合、カップリング、さもなければ連結し得る。１つまたはそれ以上の異種部分は、Ｈｐの活性または安定性を改善、強化し、さもなければ拡張し得る。一実施形態では、Ｈｐは、本明細書に記載されるように、Ｈｐのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長するために、異種部分に好適に連結する。好適な半減期延長性の異種部分は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルスターチ（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、およびヒアルロン酸が挙げられる。したがって、本明細書で開示される一実施形態では、異種部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルスターチ（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、およびヒアルロン酸からなる群から選択される。その他の実施形態では、異種部分は、Ｈｐに融合した異種アミノ酸配列であり得る。

【0074】

代替的または付加的に、異種部分は、Ｈｐに化学的にコンジュゲートする場合があり、例えば共有結であり得る。半減期延長性の異種部分は、当業者にとって公知の任意の適する手段により、Ｈｐに融合、コンジュゲート、さもなければ連結可能であり、その例証的事例は化学的リンカーによる。このコンジュゲーション技術の原理は、Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ ＬＬＣ（例えば、米国特許第７、２５６、２５３号を参照）により事例的に記載されており、その全内容は参照によって本明細書に組み入れる。

【0075】

その他の実施形態では、異種部分は、半減期強化タンパク質（ＨＬＥＰ）である。好適な半減期強化タンパク質は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、アルブミンまたはその断片が挙げられる。したがって、一実施形態では、ＨＬＥＰはアルブミンまたはその断片である。アルブミンまたはその断片のＮ末端は、Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のＣ末端に融合し得る。代替的または付加的に、アルブミンまたはその断片のＣ末端は、Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のＮ末端に融合し得る。１つまたはそれ以上のＨＬＥＰは、そのようなＨＬＥＰが無細胞Ｈｂに対するＨｐの結合を無効化しないことを前提として、Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のＮまたはＣ末端部分（複数可）に融合し得る。しかしながら、融合タンパク質のＨｐコンポーネントが無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりそれを中和する能力をなおも有する限り、無細胞Ｈｂに対するＨｐの結合性の若干の低下は許容することができるものと理解される。

【0076】

融合タンパク質は、Ｈｐと異種部分の間に配置された化学結合またはリンカー配列をさらに含み得る。リンカー配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸、特に１～５０個、好ましくは１～３０個、好ましくは１～２０個、好ましくは１～１５個、好ましくは１～１０個、好ましくは１～５個、またはより好ましくは１～３個（例えば、１、２、または３個）のアミノ酸からなるペプチドリンカーであり得るが、ただしリンカー配列は、相互に等しい場合もあれば、また異なる場合もある。好ましくは、リンカー配列は、野生型Ｈｐ内の対応する位置に存在しない。前記リンカー配列中に存在する好ましいアミノ酸はＧｌｙおよびＳｅｒを含む。好ましい実施形態では、リンカー配列は、本明細書に開示される方法に基づき処置される対象に対して実質的に非免疫原性である。実質的に非免疫原性とは、リンカー配列が、それが投与される対象において、リンカー配列に対する検出可能な抗体応答を生じさせないことを意味する。好ましいリンカーは、グリシンおよびセリン残基の交互反復から構成されると考えられる。好適なリンカーは当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は国際公開第２００７／０９０５８４号に記載されている。一実施形態では、Ｈｐと異種部分の間のペプチドリンカーは、ヒトタンパク質において天然のドメイン間リンカーとして働くペプチド配列を含み、それから構成または実質的に構成される。そのようなペプチド配列は、その天然の環境において、タンパク質表面に接近して位置し得るが、またこの配列に対する天然の忍容性が想定可能なように、免疫系に対してアクセス可能である。例証的事例は、国際公開第２００７／０９０５８４号に提示されている。好適な切断可能リンカー配列は、例えば国際公開第２０１３／１２０９３９Ａ１号に記載されている。

【0077】

好適なＨＬＥＰ配列の例証的事例は下記記載されている。各ＨＬＥＰのまさに「Ｎ末端アミノ酸」、もしくはまさに「Ｃ末端アミノ酸」に対する融合、または各ＨＬＥＰの「Ｎ末端部分」もしくは「Ｃ末端部分」に対する融合が本明細書において同様に開示され、これにはＨＬＥＰの１つまたはそれ以上のアミノ酸のＮ末端欠損が含まれる。融合タンパク質は、２つ以上のＨＬＥＰ配列、例えば２または３つのＨＬＥＰ配列を含み得る。これらの複数のＨＬＥＰ配列は、Ｈｐのα鎖および／またはβ鎖のＣ末端部分に、タンデムに、例えば連続的な反復しとして融合し得る。

【0078】

一実施形態では、異種部分は半減期延長性ポリペプチドである。一実施形態では、半減期延長性ポリペプチドは、アルブミン、アルブミンファミリーのメンバーもしくはその断片、流体力学的容積が大きい溶媒和したランダム鎖（例えば、ＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６－１１９０を参照）、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）、またはプロリン－アラニン－セリンリピート（ＰＡＳ）、アファミン、αフェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスフェリンもしくはそのバリアントもしくは断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピン－βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する能力を有するポリペプチド、特に免疫グロブリン定常領域およびその一部分、例えばＦｃ断片、生理的条件下でアルブミンに対して、アルブミンファミリーのメンバーもしくはその断片に対して、または免疫グロブリン定常領域もしくはその一部分に対して結合する能力を有するポリペプチドもしくは脂質からなる群から選択される。免疫グロブリン定常領域またはその一部分は、好ましくは免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ断片、免疫グロブリンＧ２（ＩｇＧ２）のＦｃ断片、または免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）のＦｃ断片である。半減期強化ポリペプチドは、本明細書で使用される場合、Ｈｐの治療活性または生物学的活性を安定化または延長する能力、特にＨｐのｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を増加させる能力を有する完全長半減期強化タンパク質、または１つもしくはそれ以上のその断片であり得る。ＨＬＥＰが存在しない各Ｈｐと比較して、ＨＬＥＰ断片が、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、またはより好ましくは少なくとも２５％の機能的な半減期延長をもたらす限り、そのような断片は、長さが１０個もしくはそれより多くのアミノ酸であり得、またはＨＬＥＰ配列に由来する少なくとも約１５個、好ましくは少なくとも約２０個、好ましくは少なくとも約２５個、好ましくは少なくとも約３０個、好ましくは少なくとも約５０個、もしくはより好ましくは少なくとも約１００個、もしくはそれより多くの近接したアミノ酸を含み得る、または各ＨＬＥＰの特定のドメインの一部もしくは全部を含み得る。異種部分が機能的な半減期延長を（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで）Ｈｐに対してもたらすか判定する方法は、当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は本明細書において別途記載される。

【0079】

融合タンパク質のＨＬＥＰ部分は、本明細書に記載されるように、野生型ＨＬＥＰのバリアントであり得る。用語「バリアント」には、挿入、欠損および／または置換（保存的また非保存的を問わない）が含まれるが、そのような変化は、Ｈｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりそれを中和する能力を実質的に変化させない。ＨＬＥＰは、好適には、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来する可能性がある。非哺乳動物のＨＬＥＰとしてメンドリおよびサケが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。

【0080】

融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、ＨｐおよびＨＬＥＰなどのような異種部分をコードする少なくとも２つのＤＮＡ配列をインフレーム接合により作り出すことができる。当業者は、融合タンパク質ＤＮＡ配列が翻訳されると、単一のタンパク質配列がもたらされることを理解する。本明細書で開示される一実施形態に従い、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列をインフレーム挿入した結果として、Ｈｐ、好適なリンカー、および異種部分を含む融合タンパク質が取得可能である。

【0081】

本明細書で開示される一実施形態では、Ｈｐは異種部分に融合している。一実施形態では、異種部分は、アルブミンまたはその断片、トランスフェリンまたはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮ配列、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）、プロリン－アラニン－セリンリピート（ＰＡＳ）、アファミン、αフェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理的条件下で、アルブミンに対して、または免疫グロブリン定常領域に対して結合する能力を有するポリペプチド、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する能力を有するポリペプチド、特に免疫グロブリン定常領域およびその一部分、好ましくは免疫グロブリンのＦｃ部分、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択されるポリペプチドを含み、それから構成または実質的に構成される。別の実施形態では、異種部分は、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸およびアルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される。

【0082】

用語「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）および「ヒトアルブミン」（ＨＡ）および「アルブミン」（ＡＬＢ）は、本明細書では交換可能に使用される。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」はより広範囲にわたり、またヒト血清アルブミン（ならびにその断片およびバリアント）、ならびにその他の種に由来するアルブミン（ならびにその断片およびバリアント）を包含する。

【0083】

本明細書で使用される場合、「アルブミン」とは、アルブミンの１つまたはそれ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するアルブミンポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくはバリアントをまとめて指す。特に、「アルブミン」とは、ヒトアルブミンもしくはその他の脊椎動物由来のアルブミンの成熟した形態、もしくはその断片、またはこのような分子もしくはその断片の類似体もしくはバリアントを含む、ヒトアルブミンまたはその断片を指す。本明細書で開示されるいくつかの実施形態では、代替的用語「ＦＰ」は、ＨＬＥＰを特定するため、特にＨＬＥＰとしてアルブミンを定義するために使用される。

【0084】

本明細書に記載される融合タンパク質は、ヒトアルブミンおよび／またはヒトアルブミンの断片の天然に存在する多型変異体を好適に含む場合もある。一般的に言うと、アルブミン断片またはバリアントは、長さが少なくとも１０個、好ましくは少なくとも４０個、または最も好ましくは７０個を超えるアミノ酸である。

【0085】

一実施形態では、ＨＬＥＰは、ＦｃＲｎ受容体に対する結合性が強化されたアルブミンバリアントである。そのようなアルブミンバリアントは、野生型アルブミンに融合したＨｐまたはその機能的断片と比較して、Ｈｐまたはその機能的類似体に対してより長い血漿半減期をもたらす可能性がある。本明細書に記載される融合タンパク質のアルブミン部分は、ヒトアルブミンの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメイン、またはその保存的な改変を好適に含む可能性がある。

【0086】

一実施形態では、異種部分は、免疫グロブリン分子またはその機能的断片である。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）は、治療用タンパク質の半減期を増加させることが当技術分野において公知である（例えば、Ｄｕｍｏｎｔ Ｊ Ａ ｅｔ ａｌ．２００６．ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０：１５１－１６０を参照）。重鎖のＩｇＧ定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１～ＣＨ３）およびヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、任意の哺乳動物、またはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のそれぞれに由来し得る。抗原結合ドメインを有さないＩｇＧおよびＩｇＧ断片も、ＨＬＥＰを含め、異種部分として使用することができる。Ｈｐまたはその機能的類似体は、抗体のヒンジ領域またはペプチドリンカー（切断可能であってもよい）を介してＩｇＧまたはＩｇＧ断片と好適に接続してもよい。いくつかの特許および特許出願が、治療用タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を強化するために、治療用タンパク質を免疫グロブリン定常領域と融合させることを記載する。例えば、米国特許第２００４／００８７７７８号および国際公開第２００５／００１０２５号は、Ｆｃドメインまたは免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分と、生物学的に活性なペプチド（ペプチドの半減期を増加させ、さもなければｉｎ ｖｉｖｏで迅速に取り除かれる）からなる融合タンパク質について記載する。生物学的活性の強化、循環半減期の延長、および溶解度の向上を実現したＦｃ－ＩＦＮ－β融合タンパク質が記載された（国際公開第２００６／０００４４８Ａ２号）。血清半減期が延長され、そしてｉｎ ｖｉｖｏでの効力が高まったＦｃ－ＥＰＯタンパク質（国際公開第２００５／０６３８０８Ａ１号）、ならびにＧ－ＣＳＦ（国際公開第２００３／０７６５６７Ａ２号）、グルカゴン様ペプチド－１（国際公開第２００５／０００８９２Ａ２号）、凝固因子（国際公開第２００４／１０１７４０Ａ２号）、およびインターロイキン－１０（米国特許第６、４０３、０７７号）（いずれも半減期強化特性を有する）とのＦｃ融合体が開示された。

【0087】

本発明に基づき使用可能である好適なＨＬＥＰの例証的事例は、国際公開第２０１３／１２０９３９Ａ１号においても記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。

【0088】

用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、ＨｐがＣＳＦ中に存在する無細胞Ｈｂと結合し、そしてそれと複合体を形成し、これにより無細胞Ｈｂのそうでなければ有害な生物学的効果を中和することを可能にするのに十分な、ＣＳＦ内のＨｐの量または濃度を意味する。治療有効量のペプチドは、いくつかの因子に依存して変化し得ることが当業者により理解されるが、その例証的事例として、Ｈｐが対象に直接投与されるか、その投与法（例えば、髄腔内、頭蓋内、または脳室内）、処置される対象の健康および身体状態、処置される対象の分類群、出血の重症度（例えば、出血の範囲）、投与経路、ＣＳＦコンパートメント内の無細胞Ｈｂの濃度および／または量、ならびに上記のいずれかの組合せが挙げられる。

【0089】

Ｈｐの治療有効量は、当業者により決定可能な比較的幅広い範囲に及ぶ。Ｈｐの好適な治療有効量の例証的事例として、約２μＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約２μＭ～約５ｍＭ、好ましくは約１００μＭ～約５ｍＭ、好ましくは約２μＭ～約３００μＭ、好ましくは約５μＭ～約１００μＭ、好ましくは約５μＭ～約５０μＭ、またはより好ましくは約１０μＭ～約３０μＭが挙げられる。

【0090】

一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約２μＭ～約２０ｍＭである。一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約２μＭ～約５ｍＭである。一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約１００μＭ～約５ｍＭである。一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約２μＭ～約３００μＭである。一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約５μＭ～約５０μＭである。一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約１０μＭ～約３０μＭである。

【0091】

一実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、出血後の対象のＣＦＳ内無細胞Ｈｂ濃度に対して、少なくとも等モル量である。別の実施形態では、Ｈｐの治療有効量は、約３μＭ～約３００μＭのＣＳＦ内の無細胞Ｈｂと複合体形成するのに十分な量である。ＣＳＦ内の無細胞Ｈｂ濃度を測定する好適な方法は、当業者にとって公知であり、その例証的事例は、Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋ ＡＭ．，２００１，ＡＣＰ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｎｏ１６６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，５４（１１）：８２７－８３０）、およびＨｕｇｅｌｓｈｏｆｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１８．Ｗｏｒｌｄ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．；１２０：ｅ６６０－ｅ６６６）に記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。

【0092】

治療有効量のＨｐの実現は、本明細書に記載されるように、Ｈｐまたはその機能的類似体が曝露されるＣＳＦの最終容積に依存し得るものと理解される。例えば、Ｈｐが成人ヒト対象に投与される（例えば、髄腔内に）場合、成人ヒト対象におけるＣＳＦの平均容積が約１５０ｍＬであることを考慮すると、約３１０μＭのＨｐ溶液、５ｍＬを対象に投与することで、約１０μＭのＨｐの治療有効量が実現可能である。別の例証的事例では、本明細書に記載される方法は、５０ｍＬの対象由来のＣＳＦを除去すること、および約３０μＭのＨｐを含む５０ｍＬの人工ＣＳＦを用いてそれと置換し、これにより対象のＣＳＦコンパートメントにおいて約１０μＭのＨｐの治療有効量を実現することを含む。

【0093】

Ｈｐの投与量は、最適な治療応答を実現するように調整される場合もある。例えば、いくつかの分割された用量が、毎日、毎週、またはその他の適する時間間隔で投与される場合があり、または投与量は、状況の緊急性の示唆に従い、比例的に減じられる可能性がある。

【0094】

用語「～を曝露すること（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）」は、本明細書で使用される場合、ＨｐがＣＳＦ中に存在する無細胞Ｈｂ（ｏｘｙＨｂとなる主要な形態）と結合し、そしてそれと複合体を形成し、これによりＨｂ：Ｈｐ複合体の形成が、無細胞Ｈｂの脳組織に対する、そうでなければ有害な生物学的効果を実質的に中和することが可能となるように、ＣＳＦをＨｐと接触させることを意味する。「実質的に中和する」とは、治療的Ｈｐが存在しない場合に無細胞Ｈｂが脳組織に及ぼす生物学的効果と比較して、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％を含む、少なくとも１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約１５％～約２５％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約２５％～約３５％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約３５％～約４５％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約４５％～約５５％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約５５％～約６５％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約６５％～約７５％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約７５％～約８５％、好ましくは約８０％～約９０％、好ましくは約８５％～約９５％、または最も好ましくは約９０％～１００％の低下として主観的または定性的に表されるような、無細胞Ｈｂが脳組織に及ぼす有害な生物学的効果の低下を意味する。無細胞Ｈｂの有害な生物学的効果の低下が測定可能または決定可能である（定性的または定量的に）方法は、当業者によってなじみ深く、その例証的事例は本明細書において別途記載される。

【0095】

やはり本明細書において明記されることとして、本発明者らは、治療有効量のＨｐは、ＣＳＦ内の無細胞ｏｘｙＨｂが脳血管ＮＯシグナル伝達を妨害するのを阻止し、血管攣縮およびＤＩＮＤの発生率を低下させることができることも初めて明らかにした。動的ＭＲＩを使用して、本発明者らは、脳室系中に注射後のクモ膜下腔において、ＨｂおよびＨｂ：Ｈｐ複合体の迅速で巨視的に同一の分散を確認した。組織学的分析においても、ＨｂはＣＳＦコンパートメントから脳の間質腔中に広範に浸透する一方、Ｈｂ：Ｈｐ複合体は、クモ膜下腔に概ね限定されることが、思いがけず明らかとなった。これらの驚くべき所見は、Ｈｐとの複合体形成を通じて、無細胞ＨｂをＣＳＦコンパートメント内に閉じ込めることで、大脳血管系および脳実質に対する無細胞Ｈｂ（主としてｏｘｙＨｂ）の毒性効果を防止することができることを示唆する。

【0096】

それを必要としている対象のＣＳＦが、本明細書に記載されるように、治療有効量のＨｐに曝露される方式は、例えば、前記曝露が、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントにおいて実施されるか（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ）、または対象から得られたＣＳＦにおいて体外的に実施されるか（すなわち、ｅｘ ｖｉｖｏ）に応じて変化し得るものと理解される。前記曝露が、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントにおいて実施される場合（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏ）、Ｈｐの投与経路は、ＣＳＦコンパートメント内でＨｐが無細胞Ｈｂと接触するのが可能となるように選択される。好適な投与経路は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、髄腔内、頭蓋骨内、および脳室内が挙げられる。一実施形態では、治療有効量のＨｐは、例えば、出血性脳卒中後の対象内に、ＣＳＦを一時的に流出させ、そして頭蓋内圧を下げるために配置される外部脳室ドレイン経由で投与される。

【0097】

一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｐを対象に頭蓋内投与する工程を含む。

【0098】

一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｐを、対象に対して、髄腔内投与する工程を含む。一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｐを、対象に対して、その脊椎管中に髄腔内投与する工程を含む。一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｐを、対象に対して、そのクモ膜下腔中に髄腔内投与する工程を含む。一実施形態では、方法は、治療有効量のＨｐを、対象に対して、脳室内投与する工程を含む。

【0099】

代替的にまたは付加的に、本明細書に記載される方法は、それを必要としている対象からＣＳＦを取り出す工程、ＣＳＦ内でＨｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより無細胞Ｈｂの中和を可能にするのに十分な期間、ＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程、ＣＳＦ内に形成されたＨｂ：Ｈｐ複合体を除去してＨｂ減少ＣＳＦを生成する工程、およびＨｂ減少ＣＳＦを対象に投与する工程（例えば、髄腔内または脳室内）を含む。ＣＳＦをＣＳＦコンパートメントから除去しても、ＣＳＦのまったく存在しないＣＳＦコンパートメントが一般的にもたらされるわけではないものと理解され、少なくとも若干のＣＳＦがＣＳＦコンパートメント内に存続することに留意されたい。場合により、ＣＳＦコンパートメント内に存在し得る少なくとも若干量の残留Ｈｂを取り除くために、ＣＳＦが取り出されたら、ＣＳＦコンパートメントを、薬学的に許容される洗浄溶液でリンスすることができる。さらに複合体を形成させ、これによりＣＳＦコンパートメント内に存在し得る少なくとも若干量の残留無細胞Ｈｂを中和するために、洗浄溶液は、場合によりＨｐを含み得る。一実施形態では、洗浄溶液は、本明細書において別途記載されるような人工ＣＳＦである。

【0100】

一実施形態では、本明細書に記載される方法は、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントからＣＳＦのサンプルを取り出す工程、ＨｐをＣＳＦサンプルに添加して、Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを取得する工程、Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを対象のＣＳＦコンパートメントに投与する工程、それによって、ＣＳＦコンパートメントを、治療有効量のＨｐに、ある期間（Ｈｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより対象のＣＳＦにおいて無細胞Ｈｂを中和することを可能にするのに十分な期間）曝露する工程、および場合により、上記ステップを反復する工程を含む。好ましくは、ＣＳＦサンプルに添加されるＨｐの量は、対象に投与すると、対象のＣＳＦ内に治療有効量のＨｐをもたらすように決定される。したがって、ＣＳＦサンプル内に添加されるＨｐの量は、取り出され、そして対象に再投与されるＣＳＦサンプルの容積に依存する。

【0101】

一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからＣＳＦサンプルを取得する工程；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）のＣＳＦサンプルにＨｐを添加して、Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを取得する工程；
（ｉｉｉ）Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを対象に投与し、これにより、対象のＣＳＦコンパートメントにおいてＨｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを、治療有効量のＨｐに曝露する工程；および
（ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
を含む。

【0102】

取り出され、そして対象に再投与されるＣＳＦの容積は、実質的に同一であるのが望ましい。例えば、５０ｍＬのＣＳＦサンプルが対象のＣＳＦコンパートメントから取り出される場合、Ｈｐを含むＣＳＦの全５０ｍＬの容積が対象に再投与される。しかしながら、容積に違いが生じたとしても、そのいずれもが有意な有害臨床転帰を惹起しない限り、容積は異なってもよいものと理解される。いくつかの実施形態では、対象に再投与されるＣＳＦの容積は、対象から取り出されたＣＳＦの容積よりも少ない。その他の実施形態では、対象に再投与されるＣＳＦの容積は、Ｈｐを単独で、または任意のその他の治療薬と組み合わせて添加することで余分の容積が生まれることから、対象から除去されたＣＳＦの容積を上回る。

【0103】

別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、それを必要としている対象のＣＳＦコンパートメントからある容積のＣＳＦを取り出す工程、対象から取り出されたＣＳＦの容積を、Ｈｐを含むある容積の人工ＣＳＦと置換する工程、これによりＨｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これにより対象のＣＳＦ内の無細胞Ｈｂを中和することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程を含む。好ましくは、人工ＣＳＦ内のＨｐの量は、対象に投与されたら、対象のＣＳＦ内に治療有効量のＨｐをもたらすように決定される。したがって、人工ＣＳＦに添加されるＨｐの量は、対象に投与される人工ＣＳＦの容積に依存する。

【0104】

一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからある容積のＣＳＦを取り出す工程；
（ｉｉ）Ｈｐを含む人工ＣＳＦを提供する工程；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の人工ＣＳＦを対象に投与し、これにより対象のＣＳＦコンパートメントにおいて、Ｈｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程；および
（ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
を含む。

【0105】

対象に投与される人工ＣＳＦの容積は、対象から取り出されるＣＳＦの容積と実質的に同一であるのが望ましい。例えば、５０ｍＬのＣＳＦサンプルが対象のＣＳＦコンパートメントから取り出される場合、治療有効量のＨｐを含む、約５０ｍＬの容積の人工ＣＳＦが、取り出されたＣＳＦの容積と置換するのに使用される。しかしながら、容積に違いが生じたとしても、そのいずれもが有意な有害臨床転帰を惹起しない限り、容積は異なってもよいものと理解される。いくつかの実施形態では、対象に投与される人工ＣＳＦの容積は、対象から取り出されたＣＳＦの容積よりも少ない。その他の実施形態では、対象に投与される人口ＣＳＦの容積は、対象から取り出されたＣＳＦの容積を上回る。

【0106】

一実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＣＳＦを、出血性脳卒中後の約２１日以内にＨｐに曝露する工程を含む。本明細書で開示される別の実施形態では、方法は、ＣＳＦを、出血性脳卒中後、約２日間～約４日間、Ｈｐに曝露する工程を含む。なおも別の実施形態では、方法は、ＣＳＦを、出血性脳卒中後、約５日間～約１４日間、Ｈｐに曝露する工程を含む。

【0107】

本発明者らは、クモ膜下腔内の無細胞Ｈｂを、治療有効量のＨｐに、少なくとも約２分間曝露することが、ＣＳＦにおいて検出可能なＨｂ：Ｈｐ複合体を形成するのに十分であることを驚くべきことに明らかにした。したがって、一実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、少なくとも約２分（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４分など）である。一実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、少なくとも約４分である。別の実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、少なくとも約５分である。なおも別の実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、少なくとも約１０分である。一実施形態では、ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、約２分～約４５分、好ましくは約２分～約２０分、またはより好ましくは約４分～約１０分である。

【0108】

用語「対象」とは、本明細書で使用される場合、処置または予防が望まれる哺乳動物の対象を指す。好適な対象の例証的事例として、霊長類、特にヒト、ネコやイヌなどのようなコンパニオン動物、ウマ、ロバなどのような使役動物、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタなどのような家畜動物、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのような研究テスト用動物、および動物園や野生動物公園内の動物、シカ、ディンゴなどのような野生捕獲動物が挙げられる。一実施形態では、対象はヒトである。さらなる実施形態では、対象は、（ｉ）出生～約２歳、（ｉｉ）約２～約１２歳、または（ｉｉｉ）約１２～約２１歳の小児患者である。

【0109】

一実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＣＳＦを治療有効量のＨｐに体外的に曝露する工程を含む。

【0110】

ＣＳＦがＨｐに体外的に（ｅｘ ｖｉｖｏ）曝露される場合、治療有効量は、Ｈｐに曝露されるＣＳＦの容積に依存すると考えられ、ＣＳＦが、溶液の状態にあるまたは基材上に固定化されたＨｐ（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）、および上記のいずれかの組合せに曝露されるかを問わない。例えば、無細胞Ｈｂと複合体を形成させ、そしてアフィニティークロマトグラフィーにより無細胞Ｈｂを除去するために、ＣＳＦがＨｐに曝露される場合、基材上に固定化されるＨｐの量は、初回通過期間中に無細胞Ｈｂの完全な複合体形成を引き起こす必要はなく、複合体を形成させるために基材上を複数回通過させることが必要となり得、これにより実質的にすべての無細胞ＨｂがＣＳＦから取り除かれるものと考えられる。

【0111】

一実施形態では、方法は、（ｉ）出血性脳卒中後およびＣＳＦをＨｐに曝露する前の、対象に由来するＣＳＦサンプルを取得する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた無細胞Ｈｂの濃度に基づき、少なくとも等モル量のＨｐを決定する工程を含む。ＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する好適な方法は、当業者にとって公知であり、その例証的事例は、Ｏｈら（２０１６，Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：１６７－１７７）により記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。

【0112】

本明細書において別途指摘するように、ＣＳＦ内でのＨｂと無細胞Ｈｂとの複合体形成は、脳組織上において、無細胞Ｈｂのそうでなければ有害な生物学的活性を中和する。本明細書に開示される方法に基づき形成された無細胞Ｈｂ：Ｈｐ複合体を抽出し、または取り除くことは一般的に不必要であるが、いくつかの事例では、前記複合体を取り除くことが望ましい場合もある。例えば、本明細書に記載される方法が、対象に由来するＣＳＦを取り出し、そしてその後ＣＳＦをＨｐに体外的に曝露する工程を含む場合、ＣＳＦ内で形成された無細胞Ｈｂ：Ｈｐ複合体を、ＣＳＦを対象に再投与するに前に取り除くことが望ましい場合もある。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、ＣＳＦ内に形成されたＨｐ：無細胞Ｈｂ複合体を取り除く工程を含む。

【0113】

一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取得する工程；
（ｉｉ）ＣＳＦ内でＨｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをＨｐに曝露する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の後に、ＣＳＦからＨｐ：無細胞Ｈｂ複合体を抽出して、工程（ｉ）から得られたＣＳＦと比較したときに、それより低い量の無細胞Ｈｂを有するＨｂ減少ＣＳＦを取得する工程；
（ｉｖ）場合により、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復して、無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得する工程；ならびに
（ｖ）工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）から得られたＨｂ減少ＣＳＦを、対象のＣＳＦコンパートメントに投与する工程
を含む。

【0114】

本明細書で使用される場合、「Ｈｂ減少ＣＳＦ」とは、工程（ｉｉｉ）の前の無細胞Ｈｂの量と比較したときに、ＣＳＦがそれよりも低い量の無細胞Ｈｂ有するように、ある量の無細胞Ｈｂが除去されているＣＳＦを意味する。用語「Ｈｂ減少ＣＳＦ」は、無細胞Ｈｂのすべてが、ＣＳＦから除去されていることを示唆するように意図するものではなく、したがって少なくとも若干の無細胞Ｈｂが存在する実施形態を含むものと理解される。一実施形態では、Ｈｂ減少ＣＳＦは、対象から得られたＣＳＦ中の無細胞Ｈｂの量と比較したとき、少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約４５％、好ましくは少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、またはより好ましくは少なくとも約９５％少ない無細胞Ｈｂを含む。一実施形態では、Ｈｂ減少ＣＳＦは、対象から得られたＣＳＦ中の無細胞Ｈｂの量と比較したとき、約５％～約１０％、好ましくは約１０％～約２０％、好ましくは約２０％～約３０％、好ましくは約３０％～約４０％、好ましくは約４０％～約５０％、好ましくは約５０％～約６０％、好ましくは約６０％～約７０％、好ましくは約７０％～約８０％、好ましくは約８０％～約９０％、またはより好ましくは約９０％～約９９％少ない無細胞Ｈｂを含む。

【0115】

本明細書に別途記載されるように、Ｈｂ減少ＣＳＦは、場合により、ＣＳＦから追加の無細胞Ｈｂを取り除くために、好ましくは無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得するために、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復する工程によりさらに処置されてもよい。「無細胞Ｈｂを実質的に含まない」とは、Ｈｂ減少ＣＳＦが、対象から得られたＣＳＦ中の無細胞Ｈｂの量と比較したときに、約７０％～約８０％、好ましくは約８０％～約９０％、またはより好ましくは約９０％～約９９％少ない無細胞Ｈｂを含むことを意味する。

【0116】

一実施形態では、方法は、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を少なくとも１回（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１回など）反復する工程を含む。一実施形態では、方法は、無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得するために、必要に応じて、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を少なくとも１回、好ましくは２回、好ましくは３回、好ましくは４回、好ましくは５回、好ましくは６回、好ましくは７回、好ましくは８回、好ましくは９回、またはより好ましくは１０回反復する工程を含む。

【0117】

無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得するために、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が反復される必要がある回数は、対象に由来するＣＳＦ中の無細胞Ｈｂの濃度、採用されるＨｂの濃度、抽出方法などを含む（ただしこれらに限定されない）いくつかの因子に依存し得るものと理解される。いくつかの事例では、特に工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の反復が、ＣＳＦを細菌、酵母菌、菌類、およびウイルスなどのような汚染物質に曝露させてしまうおそれがある場合、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を１回のみ実施するのが望ましい場合もある。

【0118】

Ｈｐ：無細胞Ｈｂ複合体をＣＳＦから抽出する好適な方法は当業者にとって公知であり、その例証的事例として、粒径排除クロマトグラフィーおよび／またはアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。粒径排除クロマトグラフィーは、遊離ＨｂおよびＨｐに対して複合体のサイズが相対的に大きいことから、Ｈｐ：無細胞Ｈｂ複合体の同定、およびＣＳＦにおけるその他のコンポーネントからの分離を可能にする。アフィニティークロマトグラフィーは、Ｈｂ：Ｈｐ複合体と特異的に結合し、遊離Ｈｂとの結合は無視し得る結合剤を使用することにより、Ｈｐ：無細胞Ｈｂ複合体の同定、およびＣＳＦにおけるその他のコンポーネントからの分離を可能にする。好適な結合剤として、当業者にとってなじみ深いように、抗体またはその抗結合性断片が挙げられる。

【0119】

一実施形態では、工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをＨｐが固定された基材上を通過させる工程を含む。これは、有利には、ＣＳＦ中の無細胞ＨｂがＨｐと結合し、これにより無細胞Ｈｂを基材に固定化し、そしてＨｂ減少ＣＳＦが基材から好都合に溶出するのを可能にする。したがって、一実施形態では、工程（ｉｉ）におけるＨｐは基材上に固定されている。好適な基材は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、粒径排除クロマトグラフィー樹脂およびアフィニティークロマトグラフィー樹脂が挙げられる。一実施形態では、基材はアフィニティークロマトグラフィー樹脂である。

【0120】

一実施形態では、工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）から得られたＣＳＦを、ＣＳＦ中の無細胞Ｈｂが樹脂と結合するのを可能にする条件下で、アフィニティークロマトグラフィー樹脂に通過させる工程を含む；その場合、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）を経た樹脂からＣＳＦを溶出させる工程を含む；およびその場合、工程（ｉｖ）は、溶出したＣＳＦを回収する工程を含む。

【0121】

工程（ｖ）において、工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）から得られたＨｂ減少ＣＳＦを、対象のＣＳＦコンパートメントに投与する前に、本明細書に別途記載されるように、対象のＣＳＦコンパートメント内に存在し有害な二次神経学的転帰を惹起するおそれのある残留無細胞Ｈｂを除去するために、Ｈｂ減少ＣＳＦに治療有効量のＨｐを添加するのが望ましい場合もある。したがって、一実施形態では、方法は、本明細書に別途記載されるように、工程（ｖ）の前のＨｂ減少ＣＳＦに対して治療有効量のＨｐを添加する工程を含む。

【0122】

ＣＳＦが出血性脳卒中後の対象のＣＳＦコンパートメントから除去されたとしても、ＣＳＦコンパートメント内に残留無細胞Ｈｂが存在し得ることを、当業者は理解する。したがって、少なくとも若干の残留無細胞Ｈｂを取り除くために、ＣＳＦコンパートメントをリンスし（ＣＳＦが上記工程（ｉ）に基づき取り出されたら）、これにより、そのような残留無細胞Ｈｂが惹起し得る有害な二次神経学的転帰を取り除き、さもなければ低下させるのが望ましい場合もある。したがって、一実施形態では、方法は、工程（ｉ）の後に、洗浄溶液を用いてＣＳＦコンパートメントを洗浄する工程をさらに含む。

【0123】

好適な洗浄溶液は当業者にとってなじみ深い。一実施形態では、洗浄溶液は人工ＣＳＦである。

【0124】

人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）は、塩含有量を含め、一般的に天然のＣＳＦを模倣する液体である。ＣＳＦの好適な組成は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、米国特許第２００６／００５７０６５号、およびＭａｔｚｎｅｌｌｅｒら（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１６；９７（５－６）：２３３－４４）に記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＮａＣｌを含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＮａＣｌの濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＮａＨＣＯ_３を含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＮａＨＣＯ_３の濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＫＣｌを含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＫＣｌの濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＮａＨ_２ＰＯ_４を含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＮａＨ_２ＰＯ_４の濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＭｇＣｌ_２を含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＭｇＣｌ_２の濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でグルコースを含み得るが、また天然のＣＳＦ中のグルコースの濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。あるいは、人工ＣＳＦは、ａＣＳＦを対象に投与するのに使用される任意のカテーテル内で細菌が増殖する可能性を低減するために、グルコースを省略する場合もある。

【0125】

一実施形態では、人工ＣＳＦ／洗浄溶液は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＮａＨＣＯ_３、ＭｇＣｌ_６・Ｈ_２Ｏ、ＣａＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ、およびグルコースを含む。

【0126】

一実施形態では、洗浄溶液はＨｐを含む。

【0127】

一実施形態では、洗浄溶液は、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約１００μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約５μＭ～約５０μＭのＨｐを含む。一実施形態では、洗浄溶液は、約１０μＭ～約３０μＭのＨｐを含む。

【0128】

一実施形態では、洗浄溶液は、出血後の対象のＣＦＳ中の無細胞Ｈｂの濃度に対して少なくとも等モル量のＨｐを含む。別の実施形態では、洗浄溶液は約３μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、対象のＣＳＦから無細胞Ｈｂを体外的に取り出す工程をなくし、むしろ本明細書に別途記載されるように、対象のＣＳＦを人工ＣＳＦと置換するのが望ましい場合もある。したがって、一実施形態では、方法は：
（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取り出す工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の後に、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐを含む洗浄溶液を用いてリンスする工程；
（ｉｉｉ）場合により、工程（ｉｉ）を反復する工程；および
（ｉｖ）工程（ｉｉ）または工程（ｉｉｉ）の後に、対象のＣＳＦコンパートメントに人工ＣＳＦを投与する工程
を含む。

【0130】

治療有効量のＨｐを洗浄溶液中に組み込むことにより、ＣＳＦコンパートメント内の残留無細胞Ｈｂは、Ｈｐと複合体形成し、これにより脳組織に対する無細胞Ｈｂの有害な生物学的効果を中和し得る。

【0131】

一実施形態では、人工ＣＳＦは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＮａＨＣＯ_３、ＭｇＣｌ_６・Ｈ_２Ｏ、ＣａＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ、およびグルコースを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦはＨｐを含む。

【0132】

一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約１００μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約５μＭ～約５０μＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約１０μＭ～約３０μＭのＨｐを含む。

【0133】

一実施形態では、人工ＣＳＦは、出血後の対象のＣＦＳ中の無細胞Ｈｂの濃度に対して少なくとも等モル量のＨｐを含む。別の実施形態では、人工ＣＳＦは約３μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。

【0134】

補助療法
出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法は、本明細書に記載されるように、出血性脳卒中後の対象における１つまたはそれ以上の有害な二次神経学的転帰を低下させ、阻害、防止し、さもなければ軽減するように設計された、１つまたはそれ以上の別の処置戦略と共に、連続して、またはそれと組み合わせて（例えば、同時に）好適に実施される可能性がある。したがって、一実施形態では、方法は、脳室内出血後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための第２の薬剤を対象に投与する工程をさらに含む。脳室内出血後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための好適なその他の処置戦略または第２の薬剤は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として：
（ｉ）凝固障害の是正－例えば、ビタミンＫアンタゴニスト（ＶＫＡ）、新規の経口抗凝固剤（ダビガトラン、リバーロキサバン、およびアピキサバンなどのようなＮＯＡＣ）、第ＶＩＩＩ因子インヒビターバイパス活性（ＦＥＩＢＡ）および活性化組換え第ＶＩＩ因子（ｒＦＶＩＩａ）、プロトロンビン複合体濃縮物、活性炭、抗血小板療法（ＡＰＴ）、およびアスピリン単剤療法を使用する；
（ｉｉ）血圧降下－例えば抗高血圧剤、その例証的事例として、（ｉ）クロルタリドン、クロルチアジド、ジクロロフェナミド（ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎａｍｉｄｅ）、ヒドロフルメチアジド、インダパミド、およびヒドロクロロチアジドを含むチアジド化合物のような利尿薬；ブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、およびトルセミドなどのようなループ利尿薬；アミロライドおよびトリアムテレンなどのようなカリウム保持性利尿剤；ならびにスピロノラクトン、エピレノン（ｅｐｉｒｅｎｏｎｅ）などのようなアルドステロンアンタゴニスト；（ｉｉ）アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、エスモロール、インデノロール、メタプロロール（ｍｅｔａｐｒｏｌｏｌ）、ナドロール、ネビボロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール、ソタロール、テルタトロール、チリソロール、およびチモロールなどのようなβ－アドレナリン受容体遮断薬；（ｉｉｉ）アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、ベプリジル、シナルジピン（ｃｉｎａｌｄｉｐｉｎｅ）、クレビジピン、ジルチアゼム、エホニジピン、フェロジピン、ガロパミル、イスラジピン、ラシジピン、レミルジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモデピン（ｎｉｍｏｄｅｐｉｎｅ）、ニソルジピン、ニトレンジピン、マニジピン、プラニジピン、およびベラパミルなどのようなカルシウムチャネル遮断薬；（ｉｖ）ベナゼプリル；カプトプリル；シラザプリル；デラプリル；エナラプリル；ホシノプリル；イミダプリル；ロシノプリル（ｌｏｓｉｎｏｐｒｉｌ）；モエキシプリル；キナプリル；キナプリラート；ラミプリル；ペリンドプリル；ペリンドロプリル（ｐｅｒｉｎｄｒｏｐｒｉｌ）；クアニプリル（ｑｕａｎｉｐｒｉｌ）；スピラプリル；テノカプリル（ｔｅｎｏｃａｐｒｉｌ）；トランドラプリル、およびゾフェノプリルなどのようなアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤；（ｖ）オマパトリラート、カドキサトリル（ｃａｄｏｘａｔｒｉｌ）、およびエカドトリル、フォシドトリル（ｆｏｓｉｄｏｔｒｉｌ）、サンパトリラット、ＡＶＥ７６８８、ＥＲ４０３０などのような中性エンドペプチダーゼ阻害剤；（ｖｉ）テゾセンタン、Ａ３０８１６５、およびＹＭ６２８９９などのようなエンドセリンアンタゴニスト；（ｖｉｉ）ヒドララジン、クロニジン、ミノキシジル、およびニコチニルアルコールなどのような血管拡張薬；（ｖｉｉｉ）カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、プラトサルタン、タソサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、およびＥＸＰ－３１３７、ＦＩ６８２８Ｋ、およびＲＮＨ６２７０などのようなアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト；（ｉｘ）ニプラジロール、アロチノロール、およびアモスラロールなどのようなα／βアドレナリン受容体遮断薬；（ｘ）テラゾシン、ウラピジル、プラゾシン、ブナゾシン、トリマゾシン、ドキサゾシン、ナフトピジル、インドラミン、ＷＨＩＰ１６４、およびＸＥＮＯＩＯのようなα１遮断薬；ならびに（ｘｉ）ロフェキシジン、チアメニジン、モクソニジン、リルメニジン、およびグアノベンズ（ｇｕａｎｏｂｅｎｚ）などのようなα２アゴニストが挙げられる。
（ｉｉ－ｂ）血管拡張薬－例えば、ヒドララジン（アプレゾリン）、クロニジン（カタプレス）、ミノキシジル（ロニテン）、ニコチニルアルコール（ロニアコール）、シドノン、およびニトロプルシドナトリウム。
（ｉｉｉ）発作、グルコース、および体温の管理－例えば、抗てんかん薬、血中グルコースレベルを制御するためのインスリン輸注、正常体温の維持および治療的冷却；
（ｉｖ）外科的処置－例えば、血腫除去（外科的血栓除去）、減圧開頭術（ＤＣ）、低侵襲手術（ＭＩＳ；基底核出血の針穿刺吸引などのような）、組換え組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｒｔＰＡ）を用いたＭＩＳ；
（ｖ）手術の時期－例えば、症状発現後の４～９６時間；
（ｖｉ）トロンビン阻害－例えば、ヒルジン、アルガトロバン、セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、メシル酸ナファモスタット）；
（ｖｉｉ）ヘムおよび鉄毒性の予防－例えば、スズ－メソポルフィリンなどのような非特異的ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）阻害剤、デフェロキサミンなどのような鉄キレート剤；
（ｖｉｉｉ）ＰＰＡＲｇアンタゴニストおよびアゴニスト－例えば、ロシグリタゾン、１５ｄ－ＰＧＪ２、およびピオグリタゾン；
（ｉｘ）ミクログリア活性化の阻害－例えば、タフトシン断片１～３（ミクログリア／マクロファージ阻害因子）またはミノサイクリン（テトラサイクリンクラス抗生物質）；
（ｘ）ＮＦ赤血球２関連因子２（Ｎｒｆ２）の上方制御；
（ｘｉ）シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害－例えば、セレコキシブ（選択的ＣＯＸ２阻害剤）；
（ｘｉｉ）マトリックスメタロプロテイナーゼ；
（ｘｉｉｉ）ＴＮＦαモジュレーター－例えば、ＣＧＳ２１６８０などのようなアデノシン受容体アゴニスト、ＯＲＦ４－ＰＥなどのようなＴＮＦα特異的アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド；ならびに
（ｘｉｖ）血圧上昇－例えば、カテコールアミン
（ｘｖ）ＴＬＲ４シグナル伝達の阻害剤－例えば、抗体Ｍｔｓ５１０およびＴＡＫ－２４２（シクロヘキセン誘導体）；
が挙げられる。

【0135】

一実施形態では、第２の薬剤は血管拡張薬である。好適な血管拡張薬は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例として、シドノンやニトロプルシドナトリウムが挙げられる。したがって、本明細書で開示される一実施形態では、第２の薬剤は、シドノンおよびニトロプルシドナトリウムからなる群から選択される。

【0136】

人工ＣＳＦ
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載されるように、Ｈｐを含む人工脳脊髄液（ＣＳＦ）が提供される。

【0137】

人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）は、塩含有量を含め、一般的に天然のＣＳＦを模倣する液体である。ＣＳＦの好適な組成は当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、米国特許第２００６／００５７０６５号、およびＭａｔｚｎｅｌｌｅｒら（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１６；９７（５－６）：２３３－４４）に記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＮａＣｌを含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＮａＣｌの濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＮａＨＣＯ_３を含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＮａＨＣＯ_３の濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＫＣｌを含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＫＣｌの濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＮａＨ_２ＰＯ_４を含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＮａＨ_２ＰＯ_４の濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でＭｇＣｌ_２を含み得るが、また天然のＣＳＦ中のＭｇＣｌ_２の濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。ａＣＳＦは、当業者にとってなじみ深いように、天然のＣＳＦに見出される濃度と類似した濃度でグルコースを含み得るが、また天然のＣＳＦ中のグルコースの濃度の約１５％以内、より好ましくは約１０％以内の濃度を一般的に含む。あるいは、人工ＣＳＦは、ａＣＳＦを対象に投与するのに使用される任意のカテーテル内で細菌が増殖する可能性を低減するために、グルコースを省略する場合もある。

【0138】

一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約１００μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約５μＭ～約５０μＭのＨｐを含む。一実施形態では、人工ＣＳＦは、約１０μＭ～約３０μＭのＨｐを含む。

【0139】

一実施形態では、人工ＣＳＦは、出血後の対象のＣＦＳ中の無細胞Ｈｂの濃度に対して、少なくとも等モル量のＨｐを含む。別の実施形態では、人工ＣＳＦは、約３μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。

【0140】

一実施形態では、Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、Ｈｐは、Ｈｐ２－２多量体を含み、それから構成または実質的に構成される。

【0141】

医薬組成物
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、脳室内出血後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬組成物であって、本明細書に記載されるような治療有効量のＨｐ、および薬学的に許容される担体を含む前記医薬組成物が提供される。

【0142】

本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、脳室内出血後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する際に使用するための医薬組成物であって、本明細書に記載されるような治療有効量のＨｐ、および薬学的に許容される担体を含む前記医薬組成物が提供される。

【0143】

一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約５ｍＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約１００μＭ～約５ｍＭのＨｐ、またはその機能的類似体を含む。一実施形態では、組成物は、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約５μＭ～約５０μＭのＨｐを含む。一実施形態では、組成物は、約１０μＭ～約３０μＭのＨｐを含む。

【0144】

一実施形態では、組成物は、出血後の対象のＣＦＳ中の無細胞Ｈｂの濃度に対して、少なくとも等モル量のＨｐを含む。別の実施形態では、組成物は約３μＭ～約３００μＭのＨｐを含む。

【0145】

一実施形態では、Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、Ｈｐは、Ｈｐ２－２多量体を含み、それから構成または実質的に構成される。

【0146】

本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載される方法に基づき、脳室内出血後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬を製造する際の、本明細書に記載されるような治療有効量のＨｐの使用が提供される。

【0147】

一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、髄腔内投与用として製剤化される。好適な髄腔内送達システムは当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｋｉｌｂｕｒｎら（２０１３，Ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｒｕｄｅｋ Ｍ．，Ｃｈａｕ Ｃ．，Ｆｉｇｇ Ｗ．，ＭｃＬｅｏｄ Ｈ．（ｅｄｓ）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）により記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。

【0148】

別の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、頭蓋内投与用として製剤化される。好適な髄腔内送達システムは当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｕｐａｄｈｙａｙら（２０１４，ＰＮＡＳ，１１１（４５）：１６０７１－１６０７６）により記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。

【0149】

別の実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、脳室内投与用として製剤化される。好適な髄腔内送達システムは当業者にとってなじみ深く、その例証的事例は、Ｃｏｏｋら（２００９，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ．２９（７）：８３２－８４５）により記載されており、その内容は参照によって本明細書にそのまま組み入れる。

【0150】

好適な医薬組成物およびその単位投与剤形は、追加の活性化合物もしくは原理を伴い、または伴わずに従来の成分を従来の割合で含み得るが、またそのような単位投与剤形は、意図される１日の投薬量について、その採用された範囲と釣り合った任意の好適な有効量の有効成分を含有し得る。

【0151】

キット
本明細書で開示される別の態様では、本明細書に記載されるような人工ＣＳＦ、または本明細書に記載されるような医薬組成物を含むキットが提供される。本明細書に記載されるような活性な薬剤（Ｈｐを含む）は、活性な薬剤の同時、個別、または連続投与を可能にするために考案された、いくつかのコンポーネントからなるキットの形態で存在し得る。各担体、希釈剤、アジュバント、および／または賦形剤は、組成物のその他成分と適合性を有し、そして対象により生理学的に忍容されるように、「薬学的に許容され」なければならない。組成物は、単位投与剤形で好都合に提供され、そして薬学の分野において周知の方法により製造することができる。そのような方法は、有効成分を担体（１つまたはそれ以上のアクセサリー成分を構成する）と関連付ける工程を含む。一般的に、組成物は、有効成分を、液体の担体、希釈剤、アジュバント、および／もしくは賦形剤、または細かく分割された固体担体、またはその両方と均一かつ緊密に関連付け、次に必要な場合には生成物を成形することにより製造される。

【0152】

本発明は、したがって、特に下記の実施形態［１］～［７４］と関連する：
［１］血管外溶血および無細胞ヘモグロビン（Ｈｂ）の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への放出を伴う出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する方法であって、ハプトグロビン（Ｈｐ）が無細胞Ｈｂと複合体を形成し、これによりその中和を可能にするのに十分な期間、それを必要としている対象のＣＳＦを治療有効量のＨｐに曝露する工程を含む前記方法。
［２］出血性脳卒中は、天然に生じる出血または外傷性出血である、項目［１］に記載の方法。
［３］出血性脳卒中は、脳室内出血またはクモ膜下出血である、項目［１］または項目［２］に記載の方法。
［４］クモ膜下出血は、動脈瘤性クモ膜下出血である、項目［３］に記載の方法。
［５］有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）、遅発性脳虚血（ＤＣＩ）、神経毒性、炎症、一酸化窒素枯渇、酸化性組織傷害、脳血管攣縮、脳血管反応性、および浮腫からなる群から選択される、項目［１］～［４］のいずれか１項目に記載の方法。
［６］有害な二次神経学的転帰は、脳血管攣縮である、項目［５］に記載の方法。
［７］有害な二次神経学的転帰は、遅発性虚血性神経障害である、項目［５］に記載の方法。
［８］有害な二次神経学的転帰は、遅発性脳虚血である、項目［５］に記載の方法。
［９］有害な二次神経学的転帰は、脳実質内の有害な二次神経学的転帰である、項目［１］～［８］のいずれか１項目に記載の方法。
［１０］出血の発現後約２１日以内に、ＣＳＦをＨｐまたはその機能的類似体に曝露する工程を含む、項目［１］～［９］のいずれか１項目に記載の方法。
［１１］出血の発現後約２日間～約４日間、ＣＳＦをＨｐに曝露する工程を含む、項目［１０］に記載の方法。
［１２］出血の発現後約５日間～約１４日間、ＣＳＦをＨｐに曝露する工程を含む、項目［１０］に記載の方法。
［１３］対象に、Ｈｐを頭蓋内投与する工程を含む、項目［１］～［１２］のいずれか１項目に記載の方法。
［１４］対象に、Ｈｐを髄腔内投与する工程を含む、項目［１］～［１２］のいずれか１項目に記載の方法。
［１５］Ｈｐは、脊椎管中に髄腔内投与される、項目［１４］に記載の方法。
［１６］Ｈｐは、クモ膜下腔中に髄腔内投与される、項目［１４］に記載の方法。
［１７］対象に、治療有効量のＨｐを脳室内投与する工程を含む、項目［１］～［１２］のいずれか１項目に記載の方法。
［１８］ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、少なくとも約２分である、項目［１３］～［１７］のいずれか１項目に記載の方法。
［１９］ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、約２分～約４５分である、項目［１８］に記載の方法。
［２０］ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、約２分～約２０分である、項目［１８］に記載の方法。
［２１］ＣＳＦが治療有効量のＨｐに曝露される期間は、約４分～約１０分である、項目［１８］に記載の方法。
［２２］治療有効量のＨｐは、出血後の対象のＣＳＦ中の無細胞Ｈｂの濃度に対して、少なくとも等モル量である、項目［１］～［２１］のいずれか１項目に記載の方法。
［２３］
（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦサンプルを、ＣＳＦをＨｐに曝露する前に取得する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたＣＳＦサンプル中の無細胞Ｈｂの量を測定する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた無細胞Ｈｂの濃度に基づき、少なくとも等モル量のＨｐを決定する工程
をさらに含む［２２］項目に記載の方法。
［２４］Ｈｐの治療有効量は、約２μＭ～約２０ｍＭである、項目［１］～［２３］のいずれか１項目に記載の方法。
［２５］Ｈｐの治療有効量は、約２μＭ～約３００μＭである、項目［２４］に記載の方法。
［２６］Ｈｐの治療有効量は、約５μＭ～約５０μＭである、項目［２４］に記載の方法。
［２７］Ｈｐの治療有効量は、約１０μＭ～約３０μＭである、項目［２４］に記載の方法。
［２８］ＣＳＦ内で形成されたＨｐ：無細胞Ｈｂ複合体を除去する工程をさらに含む、項目［１］～［２７］のいずれか１項目に記載の方法。
［２９］ＣＳＦを、治療有効量のＨｐに体外的に曝露する工程を含む、項目［１］～［２８］のいずれか１項目に記載の方法。
［３０］
（ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからＣＳＦのサンプルを取得する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）のＣＳＦサンプルにＨｐを添加して、Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを取得する工程；
（ｉｉｉ）Ｈｐ富化ＣＳＦサンプルを対象に投与し、これによりＨｐが対象のＣＳＦコンパートメントにおいて無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程；および
（ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
を含む、項目［２９］に記載の方法。
［３１］
（ｉ）出血後の対象のＣＳＦコンパートメントからある容積のＣＳＦを取り出す工程；
（ｉｉ）Ｈｐを含む人工ＣＳＦを提供する工程；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の人工ＣＳＦを対象に投与し、これにより対象のＣＳＦコンパートメントにおいて、Ｈｐが無細胞Ｈｂと複合体を形成することを可能にするのに十分な期間、対象のＣＳＦコンパートメントを治療有効量のＨｐに曝露する工程；および
（ｉｖ）場合により、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復する工程
を含む、項目［２９］に記載の方法。
［３２］
（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取得する工程；
（ｉｉ）ＣＳＦにおいて、Ｈｐまたはその機能的類似体が無細胞Ｈｂと複合体を形成するのを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをＨｐに曝露する工程；
（ｉｉｉ）Ｈｐ：無細胞Ｈｂ複合体を、工程（ｉｉ）の後のＣＳＦから抽出して、工程（ｉ）から得られたＣＳＦと比較したときに、それより少ない量の無細胞Ｈｂを有するＨｂ減少ＣＳＦを取得する工程；
（ｉｖ）場合により、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を反復して、無細胞Ｈｂを実質的に含まないＨｂ減少ＣＳＦを取得する工程；ならびに
（ｖ）工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｖ）から得られたＨｂ減少ＣＳＦを、対象のＣＳＦコンパートメントに投与する工程
を含む、項目［２９］に記載の方法。
［３３］工程（ｖ）の前に、Ｈｂ減少ＣＳＦに対して治療有効量のＨｐを添加する工程をさらに含む、項目［３２］に記載の方法。
［３４］Ｈｐは、基材上に固定されている、項目［３２］または項目［３３］に記載の方法。
［３５］基材は、アフィニティークロマトグラフィー樹脂である、項目［３４］に記載の方法。
［３６］工程（ｉｉ）は、ＣＳＦ中の無細胞Ｈｂが樹脂と結合するのを可能にする条件下で、工程（ｉ）から得られたＣＳＦをアフィニティークロマトグラフィー樹脂に通過させる工程を含み、工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉ）後に樹脂からＣＳＦを溶出させる工程を含み、および工程（ｉｖ）は、溶出したＣＳＦを回収する工程を含む、項目［３５］に記載の方法。
［３７］場合により、工程（ｉ）後のＣＳＦコンパートメントを、洗浄溶液を用いて洗浄する工程を含む、項目［３２］～［３６］のいずれか１項目に記載の方法。
［３８］洗浄溶液は、人工ＣＳＦである、項目［３７］に記載の方法。
［３９］人工ＣＳＦは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＮａＨＣＯ_３、ＭｇＣｌ_６・Ｈ_２Ｏ、ＣａＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ、およびグルコースを含む、項目［３１］または項目［３８］に記載の方法。
［４０］洗浄溶液は、Ｈｐを含む、項目［３７］～［３９］のいずれか１項目に記載の方法。
［４１］洗浄溶液は、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む、項目［４０］に記載の方法。
［４２］洗浄溶液は、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む、項目［４１］に記載の方法。
［４３］
（ｉ）出血後の対象に由来するＣＳＦを取り出す工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）後の対象のＣＳＦコンパートメントを、治療有効量のＨｐを含む洗浄溶液を用いてリンスする工程；
（ｉｉｉ）場合により工程（ｉｉ）を反復する工程；および
（ｉｖ）工程（ｉｉ）または工程（ｉｉｉ）後の対象のＣＳＦコンパートメントに人工ＣＳＦを投与する工程
を含む、項目［１］～［４２］のいずれか１項目に記載の方法。
［４４］人工ＣＳＦは、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＮａＨＣＯ_３、ＭｇＣｌ_６・Ｈ_２Ｏ、ＣａＣｌ_２・Ｈ_２Ｏ、およびグルコースを含む、項目［４３］に記載の方法。
［４５］人工ＣＳＦは、Ｈｐを含む、項目［４３］または項目［４４］に記載の方法。
［４６］人工ＣＳＦは、約２μＭ～約２０ｍＭのＨｐを含む、項目［４５］に記載の方法。
［４７］人工ＣＳＦは、約２μＭ～約３００μＭのＨｐを含む、項目［４６］に記載の方法。
［４８］Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される、項目［１］～［４７］のいずれか１項目に記載の方法。
［４９］Ｈｐは、Ｈｐ２－２多量体を含む、項目［４８］に記載の方法。
［５０］Ｈｐは、組換えタンパク質である、項目［１］～［４９］のいずれか１項目に記載の方法。
［５１］Ｈｐは、血漿由来である、項目［１］～［４９］のいずれか１項目に記載の方法。
［５２］対象に、脳室内出血後の有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための第２の薬剤を投与する工程をさらに含む、項目［１］～［５１］のいずれか１項目に記載の方法。
［５３］第２の薬剤は、血管拡張薬である、項目［５２］に記載の方法。
［５４］第２の薬剤は、シドノンおよびニトロプルシドナトリウムからなる群から選択される、項目［５２］または項目［５３］に記載の方法。
［５５］Ｈｐを含む人工脳脊髄液（ＣＳＦ）。
［５６］Ｈｐは、約２μＭ～約２０ｍＭの量で存在する、項目［５５］に記載の人工ＣＳＦ。
［５７］Ｈｐは、約５μＭ～約３００μＭの量で存在する、項目［５５］に記載の人工ＣＳＦ。
［５８］Ｈｐは、約５μＭ～約５０μＭの量で存在する、項目［５５］に記載の人工ＣＳＦ。
［５９］Ｈｐは、約１０μＭ～約３０μＭの量で存在する、項目［５８］に記載の人工ＣＳＦ
［６０］Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される、項目［５７］～［５９］いずれか１項に記載の人工ＣＳＦ。
［６１］Ｈｐ２－２多量体を含む、項目［６０］に記載の人工ＣＳＦ。
［６２］Ｈｐは、組換えタンパク質である、項目［５９］または［６０］に記載の人工ＣＳＦ。
［６３］Ｈｐは、血漿由来である、項目［５７］または［５８］に記載の人工ＣＳＦ。
［６４］項目［１］～［５４］のいずれか１項目に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬組成物であって、治療有効量のＨｐおよび薬学的に許容される担体を含む前記医薬組成物。
［６５］項目［１］～［５４］のいずれか１項目に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防する際に使用するための医薬組成物であって、治療有効量のＨｐおよび薬学的に許容される担体を含む前記医薬組成物。
［６６］Ｈｐは、約２μＭ～約２０ｍＭの量で存在する、項目［６４］または項目［６５］に記載の組成物。
［６７］Ｈｐは、約２μＭ～約３００μＭの量で存在する、項目［６６］に記載の組成物。
［６８］Ｈｐは、約５μＭ～約５０μＭの量で存在する、項目［６６］に記載の組成物。
［６９］Ｈｐは、約１０μＭ～約３０μＭの量で存在する、項目［６６］に記載の組成物。
［７０］Ｈｐは、Ｈｐ１－１ホモ二量体、Ｈｐ１－２多量体、Ｈｐ２－２多量体、および上記のいずれかの組合せからなる群から選択される、項目［６４］～［６９］のいずれか１項目に記載の組成物。
［７１］Ｈｐ２－２多量体を含む、項目［７０］に記載の組成物。さらなる項目によれば、項目［７０］に記載の組成物は、Ｈｐ１－１ホモ二量体を含む。
［７２］項目［１］～［５４］のいずれか１項目に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰を処置または予防するための医薬の製造における、治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）の使用。
［７３］項目［１］～［５４］のいずれか１項目に記載の方法に基づき、出血性脳卒中後の対象における有害な二次神経学的転帰の処置または予防で使用するための治療有効量のハプトグロビン（Ｈｐ）。
［７４］項目［５５］～［６３］のいずれか１項目に記載の人工ＣＳＦまたは項目［６４］～［７１］のいずれか１項目に記載の組成物を含むキット。

【0153】

当業者は、本明細書に記載される本発明は、特に記載されている形態以外の変形形態および改変形態を採りやすい傾向にあることを認識する。本発明は、精神および範囲に収まるすべてのそのような変形形態および改変形態を含むものと理解される。本発明には、本明細書において参照または表示される工程、特性、組成物、および化合物のすべても個別にまたは全体として含まれ、ならびに前記工程または特性の任意の２つまたはそれより多くのあらゆるすべての組合せもやはり含まれる。

【0154】

例証目的に限定されるように意図されており、そして本明細書にこれまでに記載された一般性を制限するように意図するものではない下記の実施例を参照しながら、本発明の特定の実施形態をここで記載する。

【実施例】

【0155】

材料および方法
Ａ．Ｅｘ ｖｉｖｏでの血管機能実験
標的管腔の単離
脳底動脈を、地方の畜殺場から入手した屠殺後のブタの新鮮な頭部から単離した（ＳＢＺ、チューリッヒ（Ｚｕｒｉｃｈ）、スイス）。頭部を特注の保持デバイス内に仰向けに配置し、そして残留軟組織を摘出することにより、斜台を後頭関節丘のレベルから後鼻孔まで露出させた。硬膜を、大後頭孔の前縁（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｒｉｍ）から慎重に引き剥がし、そしてわずかに移動させて開頭術のためのスペースを設けた。斜台の両側傍正中骨切り術（ｂｉｌａｔｅｒａｌ ｐａｒａｍｅｄｉａｎ ｏｓｔｅｏｔｏｍｙ）およびチゼルを使用する部分的下顎頭切除術を行い、腹側硬膜を露出させた。腹側脳幹の血管周囲のクモ膜下槽を傷つけずに、硬膜を慎重に取り除いた。脳神経ＩＩＩ－ＸＩＩを切除して脳幹を可動化させた。橋中脳接合部および小脳腕のレベルにおいて鋭く切開することにより脳幹を単離し、そして事前冷却された（４℃）バッファー溶液に移した。解剖顕微鏡を使用して、椎骨動脈を解剖学的ランドマークとして特定し、そして椎骨脳底動脈合流部（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）に近接する２ｍｍを切断した。クモ膜を慎重に調製することで、管腔に対する過剰な機械的操作を回避しながら、脳底動脈の段階的な可動化を可能にした。椎骨脳底動脈合流部と後大脳動脈（ｃａｕｄａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ）の間の脳底動脈セグメントを、最大６個の血管輪（１輪につき２ｍｍの長さ）を調製するのに使用した（図１）。

【0156】

動脈が圧縮または拡張されるのを一切回避するように、すべての外科的調製の間、特別な注意を払った。動物の死亡から切除された管腔をバッファー中に移すまでの時間を９０分未満に保った。

【0157】

バッファーおよび化学物質の製造
Ｋｒｅｂｓ－Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔバッファー（ＫＨＢ）を、５リットルのバッチで調製した。２．２７ＭのＮａＣｌおよびＫＣｌ、ならびに１．００ＭのＫＨ_２ＰＯ_４からなるストック溶液を調製した。いくつかのコンポーネントのうち、イオン性組成物は最大溶解度近くにあるので、各添加工程を行った後、化学物質について正しい順序に従うこと、および徹底混合することがこのバッファーの調製において重要である；これは特にライム（ＣａＣＯ_３）として沈殿物しやすい傾向を有する炭酸水素カルシウムの他、リン酸カルシウムおよび石膏（ＣａＳＯ_４）に当てはまる。室温で４リットルの蒸留水において、２．２７ＭのＫＣｌ（１０．３５ｍｌ）および２．２７ＭのＮａＣｌ（１３８．１ｍｌ）を混合した。ＮａＨＣＯ_３（１０．５０ｇ）を添加し、そしてすべての塩が完全に溶解するまでバッファーをかき混ぜた。１．００ＭのＫＨ_２ＰＯ_４（６．０ｍｌ）を添加し、そして溶液を再度かき混ぜた。ＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ（１．８４ｇ）、その後にＭｇＳＯ_４×７Ｈ_２Ｏ（１．４８ｇ）をバッファー中に溶解した。２．２７ＭのＮａＣｌ（１２１ｍｌ）を添加した。バッファーを正確に３７℃まで加熱し、そして５％ＣＯ_２および９５％Ｏ_２を用いて少なくとも１時間バブリングすることにより平衡化した。濃縮オルトリン酸を滴下することにより、ｐＨを７．４０に調整した。蒸留水を用いて容積を５リットルに調整した。バッファーを室温で保管した（塩は４℃で沈殿する）。バッファーの微生物学的早期劣化を防止するために、グルコースは、使用直前にのみ、２ｇ／ｌの濃度になるまで添加した。ＫＨＢの最終的なイオン組成は：１４３ｍＭのＮａ^＋、５．９０ｍＭのＫ^＋、１．２０ｍＭのＭｇ_２ ^＋、２．５０ｍＭのＣａ_２ ^＋、１２５ｍＭのＣｌ^－、２５．０ｍＭのＨＣＯ_３ ^－、１．２０ｍＭのＳＯ_４ ^２＋、１．２０ｍＭのＰＯ_４ ^３－、および１１．１ｍＭのグルコースである。

【0158】

ＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅ
ＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅ（ＥＮＺＯ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ラウゼン（Ｌａｕｓｅｎ）、スイス）を、１０ｍＭのストック濃度となるように２０ｍＭのＮａＯＨに溶解し、そして小分けして－８０℃で保管した。利用前に、化合物を、５ｍＭのＮａＯＨ中、２５μＭの濃度まで希釈し、そして氷上保管した。生理学的ｐＨでは、この化合物（ＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅ）の半減期は、温度に応じてたった数秒～数分の範囲内にあるので、ＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅを使用直前まで高ｐＨで保管することが重要である。

【0159】

ＰＧＦ２α
プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）（Ｓｉｇｍａ社、ブフス（Ｂｕｃｈｓ）、スイス）を、１０ｍＭのストック濃度となるようにＰＢＳ、ｐＨ７．４に溶解し、そして小分けして－８０℃で保管した。

【0160】

ａＳＡＨ患者のＣＳＦサンプル
本発明者らのＮｅｕｒｏｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｕｎｉｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ（学術的三次医療センター）に入院した連続する患者（ａＳＡＨと診断され、そして水頭症に起因してＥＶＤが挿入された）について、２０１７年４月から２０１８年１２月にかけて、治験組入れを目的としてスクリーニングした。治験は現地の倫理審査委員会により承認され、そして文書による同意をすべての患者またはその法定代理人から、治験組入れ前に取得した。

【0161】

除外基準を以下の通り規定した：７２時間以内の起源不明の出血、７２時間以内の動脈瘤確保の不奏功、未確保動脈瘤からの再出血、ならびに年齢１８歳未満および８０歳超。

【0162】

動脈瘤修復後、脳室ＣＳＦを、０日目（出血イベント当日）～１４日目の間、ＥＶＤカテーテルから毎日サンプリングした。ＣＳＦを、１５００Ｇで１５分間遠心分離した（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ ＣＥＰ ２０００ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ ｌａｂｓ社、英国）。分光光度法用として、上清をさらに希釈せずに収集した。

【0163】

髄液上清の視覚範囲内のスペクトルを、３５０～６５０ｎｍの間で、２ｎｍの分解能にて、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－１８００分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社、日本）上で記録した。これまでに記載されたように、Ｒ統計ソフトウェア、バージョン４．２．３（ｗｗｗ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）^１２を用いた、非負最小二乗アルゴリズムのＬａｗｓｏｎ－Ｈａｎｓｏｎ実装（Ｌａｗｓｏｎ－Ｈａｎｓｏｎ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）^１１により、既知濃度のオキシヘモグロビン（Ｆｅ^２＋）、メトヘモグロビン（Ｆｅ^３＋）、およびビリルビンの参照スペクトルを当て嵌めることによって、スペクトルをデコンボリューションした。ソーレーピーク（ｓｏｒｅｔ ｐｅａｋ）について２．０を超える消衰が認められるサンプルでは、高吸収における分光光度計の直線からの乖離を補償するために、デコンボリューションは、４３５ｎｍよりも高い波長に限定した。

【0164】

ワイヤーミオグラフィー実験のためのＣＳＦサンプルを、溶血前（１～３日目）および溶血性（４～１４日目）として定義した。１日に得られる入手可能なＣＳＦ容積には限りがあるので、必要な場合には、連続した複数日のサンプルをプールした。

【0165】

ワイヤーミオグラフィー
血管輪を、温度制御され（３７℃）そして連続通気された（９５％Ｏ_２および５％ＣＯ_２の気体混合物）、Ｋｒｅｂｓ－Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔバッファー（ＫＨＢ）（５ｍｌ）を含有する臓器浴に浸漬されたＭｕｌｔｉ－Ｃｈａｎｎｅｌ Ｍｙｏｇｒａｐｈ Ｓｙｓｔｅｍ ６２０Ｍ（Ｄａｎｉｓｈ Ｍｙｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、オーフス（Ａａｒｈｕｓ）、デンマーク）の２つのピン（直径０．２ｍｍ）に取り付けた。ＣＳＦを用いた実験の場合、臓器浴には、３Ｄ印刷された特注インレイ（２．５ｍｌの容積）を装着し、そしてＣＳＦサンプルは、実験１回毎の患者サンプルの必要容積を抑えるために、人工ＣＳＦを用いて１：１希釈した。

【0166】

管腔を、これまでの実験において決定された最適なＩＣ１／ＩＣ１００比まで徐々に引き延ばした。事前収縮剤（ｐｒｅ－ｃｏｎｔｒａｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として、プロスタグランジンＦ２α（ＰＧＦ２α）を、１０μＭの濃度で使用した。ＮＯ媒介式の血管拡張応答は、ＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅを浸漬バッファーに添加することにより誘発した。すべてのデータを、Ｌａｂ Ｃｈａｒｔソフトウェア、バージョン７．２．１（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ヘイティングズ（Ｈａｓｔｉｎｇｓ）、英国）を使用して記録した。別途記載がなければ、記録されたヘモグロビン誘発性の血管機能応答は、１回の実験毎に、Ｈｂに曝露しない場合の最大ＮＯ拡張（＝１００％）、およびＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅを添加する前の持続的収縮レベル（＝０％）に対してそれぞれ標準化した。プロットにおける応答は、したがって相対的収縮として表される。

【0167】

Ｂ．ｏｘｙＨｂ誘発性の血管攣縮のヒツジモデル
動物、飼育室、および飼育管理
試験を、動物保護および福祉に関するスイス国の法令要求事項（ＴｓｃｈＧ４５５）に従い実施し、そして連邦獣医当局「Ｋａｎｔｏｎａｌｅ Ｔｉｅｒｖｅｒｓｕｃｈｓｋｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｚｕｒｉｃｈ」（許可番号ＺＨ２３４／１７）より倫理承認を受けた。

【0168】

２～４歳のスイスアルプスヒツジ（メス）（Ｓｔａｆｆｅｌｅｇｇｈｏｆ社、キュッティンゲン・バイ・アーラウ（Ｋｕｔｔｉｇｅｎ ｂｅｉ Ａａｒａｕ）、スイス）を、チューリッヒ獣医学病院（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｚｕｒｉｃｈ）の実験ユニットに移し、そして新しい環境に環境順化させるために、少なくとも７日間過ごさせた。環境順化期間中に、獣医師を通じて、身体検査および血液検査を伴う標準化されたスクリーニングを実施した。動物を、手術前に、水へのアクセスは自由として１８～２４時間絶食させた。

【0169】

麻酔
麻酔誘発の３０分前に、担当の獣医学麻酔医により動物の身体状態を再度チェックした。次に、各動物に、ブプレノルフィン（０．０１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、筋中）およびメデトミジン（０．０７～０．１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、筋中）を前投与した。２０分後、鎮静化された動物を血管造影室に搬送し、鎮静の程度および健康状態を再度臨床的に評価した。

【0170】

１４Ｇ、３．５インチの静脈内カテーテルを、滅菌プレコンディショニング下で左頸静脈中に挿入し、そして皮膚に外科的に固定した。麻酔状態を、ミダゾラム（０．１ｍｇ／ｋｇ ＢＷＴ）、ケタミン（３ｍｇ／ｋｇ ＢＷＴ）の用量固定注射、および効果を得るために、プロポフォール（０．３～１．５ｍｇ／ｋｇ ＢＷＴ）の可変用量注射により経静脈的に誘発した。

【0171】

その後、１０％リドカインの直接噴霧を使用し、そして喉頭鏡を通じた目視制御を行いながら、各動物の喉頭について除感作した。２０～３０秒待機した後、次に、内径１１または１２ｍｍのしかるべき長さを有するシリコーン気管内チューブを使用して動物の気管に挿管した。動物を、次にＡｌｌｕｒａ Ｃｌａｒｉｔｙ血管造影室の診察台上に置かれた可撓性真空マットレス上に、左側横臥位で配置した。

【0172】

動物を、しかるべきサイズの共軸円型呼吸システム（ｃｏａｘｉａｌ ｃｉｒｃｌｅ ｂｒｅａｔｈｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）とすみやかに接続し、そして１分間当たり呼吸６～８回の速度、および１回の換気量１０ｍＬ／ｋｇ ＢＷＴで人工換気を開始した。手順全体を通じて、イソフルランを０．８～２Ｖｏｌ％で酸素中に送達した。手順全体を通じて、パルスオキシメータープローブを動物に接続して、適切なヘモグロビン酸素供給状態を評価および保証した。炭酸正常状態を維持するために、カプノグラフィー（呼気終末ＣＯ_２）により、および動脈血液ガス測定により、ならびに動脈と肺胞との差異を計算し、そしてＢｏｈｒの肺胞ガス式を使用し、これにより換気－血流適合（ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍａｔｃｈ）の相対的機能性を推定することにより評価しながら、換気を調整した。動脈ＣＯ_２は、特に４～９ｋＰａの範囲において、脳血管反応性の主要因子を代表することが公知であるので、ＣＯ_２の動脈分圧（２．５～５．５ｋＰａ）を正常かつ一定に維持することがきわめて重要である。

【0173】

手順期間中に尿が流出するのを可能にするため、および尿生産を経時的にモニタリングするために、尿カテーテル（Ｆｏｌｅｙ、サイズ９）を膀胱内に挿入した。超音波エコーコントロール下で、後に血管内カテーテルを導入するためのポートとして、８Ｆ血管内カニューレを右外頸動脈内に挿入した。配置後、抗凝固を確実にするために、１００ＩＵ／ｋｇ／ＢＷＴの未分画ヘパリンを静脈内投与した。これを、手順全体を通じて６時間毎に反復した。次に、最終的な体位として、動物を、その前肢が頸部の下で折り曲げられ、そしてその後肢が前方に折り曲げられた腹ばいに配置し、それを残りの手順においてそのまま維持した。

【0174】

両方の耳介動脈について、動脈圧を直接、連続的にモニタリングするため、および間欠的血液ガス分析用の動脈血をサンプリングするために、２０Ｇ Ｓｕｒｆｌｏ Ｔｅｒｕｍｏ（登録商標）カテーテルを使用してカニューレ処置した。

【0175】

心拍数、心電図、観血的直接動脈圧（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｄｉｒｅｃｔ ａｒｔｅｒｉａｌ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、酸素ヘモグロビン飽和度、ならびに酸素、二酸化炭素、およびイソフルランの吸気と呼気の濃度を、連続測定（Ｄａｔｅｘ－ Ｏｈｍｅｄａ Ｓ３コンパクトライフサインモニター）および記録（ラップトップコンピューターにより）するために、動物を装置に繋いだ。手順の全期間にわたり、動物に、乳酸リンゲル溶液を、３ｍＬ／ｋｇ ＢＷＴ／時の標準速度で、静脈内投与し、正常血圧（６０～１００ｍＭＨｇの平均動脈圧）および２ｍＬ／ｋｇ／時の正常な尿生産を維持することが必要とされるときには調整した。

【0176】

麻酔状態を維持し、そして必要な場合には、イソフルラン吸入濃度および／またはシリンジポンプによって静脈内投与されるプロポフォールの可変速度輸注（Ｐｅｒｆｕｓｏｒ（登録商標）、ＢＢｒａｕｎ社；０．５～２ｍｇ／ｋｇ／時の速度）を調整することにより、麻酔深度を変化させた。

【0177】

さらに、体動アーチファクトを抑え、そして人工呼吸を促進するために、手順の全期間を通じて、２時間毎に、または筋弛緩度を臨床的に評価し、後者（人工呼吸）が不十分であることが示唆されたときに、０．５ｍｃｇ／ｋｇの用量でロクロニウムを断続的に静脈内投与した。

【0178】

治験期間の終了時に、すなわち計画されたすべてのデータ取得が終了したとき、ペントバルビタール（１５０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与により、動物を麻酔下で安楽死させた。取り付けられたモニタリング装置ならびに経胸的聴診により死亡を確認した。

【0179】

外科的モデル
麻酔されたヒツジを、特注の保持デバイス内に頭部を強固に固定しながら、真空マットレスにおいてうつぶせに配置した。皮膚のクリッピングおよび殺菌後、滅菌ドレープを術野周囲に配置した。神経外科用ボルトキット（Ｒａｕｍｅｄｉｃ社、ヘルムブレヒツ（Ｈｅｌｍｂｒｅｃｈｔｓ）、ドイツ）を使用して、ニューロモニタリングプローブ（Ｌｕｃｉｏｌｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ ＡＧ社、チューリッヒ（Ｚｕｒｉｃｈ）、スイス）を、右側前方傍正中穿頭孔を通じて挿入した。外部脳室ドレイン（ＥＶＤ）（ＤｅＰｕｙｓ Ｓｙｎｔｈｅｓ社、オーバードルフ（Ｏｂｅｒｄｏｒｆ）、スイス）を、１１ｍｍの穿頭孔を通じて左側脳室の前角に挿入した。ＣＳＦを放出させ、そして標準的な２０Ｇクモ膜下穿刺針（Ｄａｌｈａｕｓｅｎ社、ケルン（Ｋｏｌｎ）、ドイツ）を用いてサンプリングするための後頭下大槽穿刺を、蛍光透視ガイダンスに従い実施した。ＣＳＦサンプルを、１５００Ｇで１５分間、すみやかに遠心分離した。上清を、Ｈｂ濃度測定および血管機能実験用として収集した。制御された脳室注射を行うために、ＰＨＤ Ｕｌｔｒａシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、ホリストン（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ）、米国）をＥＶＤと接続した。脳室注射を３０ｍｌ／時の最大流速で実施した。実験構成の例証図については（図２を参照）。

【0180】

モニタリング
頭蓋内圧（ＩＣＰ）、脳温、心拍数、血圧、酸素飽和度、および呼気終末ＣＯ_２の連続モニタリングを、すべての動物において実施した。さらに、動脈血ガス分析を、全実験手順期間中に３０分毎に分析し、そして尿アウトプットをモニタリングした。

【0181】

デジタルサブトラクション血管造影法（ＤＳＡ）
血管造影を、Ａｌｌｕｒａ Ｃｌａｒｉｔｙ血管造影室（Ｐｈｉｌｉｐｓ社、ハンブルグ（Ｈａｍｂｕｒｇ）、ドイツ）において実施した。右顎動脈（Ａ．ｍａｘｉｌｌａｒｉｓ）および硬膜外奇網間の最大吻合に、血管造影マイクロカテーテルを、右頸動脈内の動脈ポートを通じて選択的にカテーテル挿入した。バイプラナー斜筋（ｂｉｐｌａｎａｒ ｏｂｌｉｑｕｅ）の横方向および背腹方向の投影図を同時に取得した。１１ｍｌのイオベルソール（ヨウ素３００ｍｇ／ｍｌ相当）（Ｏｐｔｉｒａｙ３００、Ｇｕｅｂｅｒｔ ＡＧ社、チューリッヒ（Ｚｕｒｉｃｈ）、スイス）の造影剤ボーラスを、高圧造影剤注入装置（Ａｃｃｕｔｒｏｎ ＭＲ、Ｍｅｄｔｒｏｎ ＡＧ社、ザールブリュッケン（Ｓａａｒｂｒｕｃｋｅｎ）、ドイツ）を用い、マイクロカテーテルを通じて２ｍｌ／秒で注射した。

【0182】

ＤＳＡから得られた管腔径の数値化
血管造影画像を、ＩｍａｇｅＪを使用して処理し、そしてＩｍａｇｅＪ用のプラグインを用いて管腔径を測定した^１３。各ヒツジについて、ａＣＳＦ前、処置前、および処置後（ＨｂまたはＨｂＨｐ輸注後、６０分）の時点における血管造影図を比較した。記載した時点における１回のＤＳＡの画像配列内で、横方向の投影図は、皮質静脈の流入箇所から上矢状静脈洞までの造影剤描写（「静脈Ｔサイン（ｖｅｎｏｕｓ Ｔ ｓｉｇｎ）」）により、静脈相の始まりを定義するのに役立った。各時点において、動脈相の最後の３画像の重ね合わせについて、その強度を平均化した。ａＣＳＦ前、処置前、および処置後の血管造影図について、その強度平均化後の動脈相を統合した重ね合わせにおいて、すべての管腔測定を背腹方向の投影図上で実施した（図３）。ウィリス動脈輪の下記の４つの管腔：前大脳動脈（ＡＣＡ）、中大脳動脈（ＭＣＡ）、内頸動脈（ＩＣＡ）の大槽部分、および脳底動脈（ＢＡ）において、測定を実施した。管腔毎に、最も近接する非重畳的セグメントをａＣＳＦ前画像上で選択した。解剖学的に直線的な通路（ＡＣＡ、ＩＣＡ、およびＢＡ）を有する管腔において、５つの直線状の対象領域（ＲＯＩ）を、０．５ｍｍ間隔で自動的に生成した。湾曲したＭＣＡにおいて、ＲＯＩを非垂直に配置した場合、モーションアーチファクトによる測定誤差のリスクが存在するので、３つのＲＯＩを手作業により定義した。直線状のＲＯＩ毎に、管腔径を、ＩｍａｇｅＪプラグインを使用して決定した^１３。１つのＲＯＩ当たり５回の測定を平均化し、そして直径の平均値の変化を計算した。管腔特異的な平均直径変化を、ヒツジ毎および処置方式（ＨｂとＨｂ：Ｈｐ）に関連するセット毎に、マン・ホイットニーのＵ検定およびクラスカル－ウォリスの検定を使用して、ａＣＳＦ前、処置前、および処置後血管造影の間で比較した。

【0183】

磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
ｉｎ ｖｉｖｏでの磁気共鳴画像法を、臨床用３－Ｔｅｓｌａ ＭＲＩユニット（Ｐｈｉｌｉｐｓ ｉｎｇｅｎｉａ、アムステルダム（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）、オランダ）において実施した。解剖学的方向づけ、およびカテーテル留置の術後コントロールのために、軸方向および矢状断Ｔ２強調画像を取得した。動的３Ｄ Ｔ１強調画像化を、ＭｎＨｂ輸注の時間をカバーする１０分間にわたり、高時間分解能を用いて実施した。動的３ＤＴ１強調画像化を、後続する８０分間、１０分間隔を置きながら、高空間分解能を用いて継続した。画像を再構成および分析するために、ＤＩＣＯＭデータを、ＨＯＲＯＳソフトウェア（Ｎｉｍｂｌｅ Ｃｏ ＬＬＣ社、ｄ／ｂ／ａ Ｐｕｒｖｉｅｗ、アナポリス（Ａｎｎａｐｏｌｉｓ）、ＭＤ、米国）を使用して処理した。

【0184】

ヘモグロビン
精製されたオキシヘモグロビン（ｏｘｙＨｂ、Ｆｅ^２＋）は、これまでの記載に従い、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により、期限切れの血液から生成した^１４。Ｈｂ濃度は、本稿全体を通じてヘム等価量として常に表される。

【0185】

組織学的に可視化するためのタンパク質の標識
組織学的分析のために、精製済みのタンパク質溶液（Ｈｂ、Ｈｐ）を、ＴＣＯ－ＮＨＳエステル（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、イェーナ（Ｊｅｎａ）、ドイツ）で標識した。ＴＣＯ－ＮＨＳエステルを、精製済みタンパク質溶液（１００ｍＭのＮａＨＣＯ_３バッファー中、２０ｍｇ／ｍＬ）に滴下した。室温において１時間インキュベートした後、１０％１Ｍトリス－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を添加して反応を中止し、その後、４０００ｇで３０分間遠心分離して変性したタンパク質を取り除いた。その後、ディスポーザブル脱塩カラム（ＰＤ－１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ）、ＩＬ）を使用して過剰の試薬を除去した。必要な場合には、標識済みタンパク質溶液を、限外濾過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５、１０ｋＤａ ＮＭＷＬ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）、ＭＡ）を用いて濃縮した。処理後、すべてのタンパク質溶液を、ポアサイズが０．２２μｍのポリエーテルスルホンメンブレン（Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルター、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、バーリントン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）、ＭＡ）を通じて無菌濾過し、そして使用するまで－８０℃で保管した。

【0186】

人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）
ａＣＳＦの最終組成は、１２７ｍＭのＮａＣｌ、１．０ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＫＨ_２ＰＯ_４、２６ｍＭのＮａＨＣＯ_３、１．３ｍＭのＭｇＣｌ_２×６Ｈ_２Ｏ、２．４ｍＭのＣａＣｌ_２×２Ｈ_２Ｏ、および６．７ｍＭのグルコースであった。

【0187】

ハプトグロビンおよびヘモグロビン－ハプトグロビン複合体
ヒト血漿からの精製済みハプトグロビン（主たる表現型２－２）を、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ社（ベルン（Ｂｅｒｎ）、スイス）から得た。表現型１－１を有するヒト血漿由来のハプトグロビンも、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＡＧ社（ベルン（Ｂｅｒｎ）、スイス）から得た。主たる表現型２－２を有するヒト血漿由来のハプトグロビンは、国際公開第２０１４／０５５５５２Ａ１号においてこれまで記載されたように精製した。ＨｐのＨｂ結合容量を、ＨＰＬＣを用いて数値化した。複合体形成後、複合体の純度および遊離Ｈｂの不存在を、ＨＰＬＣを使用して検証した。

【0188】

組換えハプトグロビン１－１を提供するための潅流式細胞培養
細胞培養プロセスは、バイアルの解凍、細胞増殖、潅流リアクターのイノキュレーション、リアクター内細胞増殖相、その後の産生相から構成される。

【0189】

細胞培養物上清は、細胞セパレーター経由の潅流式採取物として、産生相期間中にリアクターから連続して取り出され、そして新鮮な培地に置き換わる。潅流式採取物は、リアクター稼働期間中に収集される。潅流式採取物のそれぞれには、さらなる中間処理が施される。

【0190】

ＨＩＳタグを含むヒト野生型ハプトグロビン表現型１を発現するＣＨＯ細胞クローンを解凍し、そしてＴ８０フラスコ（３７℃、５％ＣＯ_２）より開始し、３つの２Ｌ振盪フラスコまで培養を拡張するシードトレインにおいて培養した。（パラメーター：３７℃、１２０ｒｐｍ、８０％湿度、５％ＣＯ_２）。５０ＬのＢｉｏＳｅｐデバイスを装備したＳａｒｔｏｒｉｕｓ ＤＣＵ Ｓｙｓｔｅｍの２０Ｌガラス容器を、３Ｌシードトレインを用いてイノキュレーションした。３日目まで、バッチ培養を実施し、その後、ＶＶＤ（１日当たり容器容積交換回数（Ｖｅｓｓｅｌ Ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｈａｎｇｅｓ ｐｅｒ ｄａｙ））１．０として潅流を開始した。一日置きに、およそ４０Ｌの採取物が生成し、そして採取ライン内で、Ｐａｌｌ（登録商標）Ｋｌｅｅｎｐａｋ（商標）Ｎｏｖａ ＮＰ７ Ｆｉｌｔｅｒ Ｃａｐｓｕｌｅ ０．２μｍにより、細胞分解残留物を分離した。発酵期間中の細胞濃度（およそ細胞４０×１０^５個／ｍＬ）を、２ｍＭの最低グルタミン濃度を維持するように調整した。（発酵パラメーター：３７℃、ｐＨ７．０、３０％のｐＯ_２、１５０ｒｐｍ、ＶＶＤ１．０）。全プロセス期間中に使用される培地は、改変されたＰｒｏＣＨＯ５ｗ／８ｍＭのＬ－Ｇｌｎ、０．２５％のＰｌｕｒｏ（Ｆａ．Ｌｏｎｚａ社）であった。全体で２２の採取物（およそ９００Ｌ）を生成した。

【0191】

ｒハプトグロビン１－１－Ｈｉｓ（ｒＨｐ１－１）の精製
無細胞採取物を、３０ｋＤａカットオフメンブレンを備えたＴＦＦシステム（Ｐａｌｌ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ ５００Ｓ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、米国）を使用して３０倍濃縮した。ｒハプトグロビン１－１－ＨＩＳの濃縮物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム＋５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で事前平衡化したＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅエクセルカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、１７－３７１２－０２）上にオーバーナイトでロードした。平衡バッファーを用いてカラムを洗浄した後、溶出バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム＋５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ＋１５０ｍＭｏｌ／Ｌのイミダゾール、ｐＨ７．４）を用いて、ｒハプトグロビン１－１－Ｈｉｓを溶出させた。溶出液を、３０ｋＤａカットオフメンブレンを備えたＴＦＦシステム（Ｐａｌｌ社）を使用して１０倍濃縮した。ｒハプトグロビン１－１－Ｈｉｓを望ましくない不純物から分離するために、該物質を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて事前平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ミュンヘン（Ｍｕｎｉｃｈ）、ドイツ）上にロードし、そしてｒハプトグロビン１－１－Ｈｉｓを含有するピーク分画をプールし、そしてＵＦ－ＰＥＳ－２０メンブレンを備えたＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ（モデル４０２）（Ｆａ．Ｈｏｅｃｈｓｔ社、＃ＦＰ０８０８５）を撹拌しながらこれを使用して、最終濃度約４０ｍｇ／ｍＬのｒハプトグロビン１－１－ＨＩＳまで再度濃縮した。

【0192】

Ｈｎ－ＨｂおよびＭｎ－Ｈｂ：Ｈｐ複合体
Ｍｎ（ＩＩＩ）プロトポルフィリンＩＸクロリド（ＭｎＰＰ）を、アルカリ性条件下（１００ｍＭのＮａＯＨ）で、四量体アポヘモグロビン、またはアポヘモグロビン：ハプトグロビン複合体の空の「ヘムポケット」内に挿入した。次にバッファーを生理食塩水に置換した。化合物を４℃ですみやかに保管し、またはさらに処理するまで、抗凍結溶液（１：１：１：１の比のプロピレングリコール、グリセリン、０．１ＭのＰＢＳ、およびｄｄＨ_２Ｏ）中、－２０℃で保管した。

【0193】

Ｃ．組織学的染色およびイメージング
ヒツジを安楽死させた後、脳を採取する前に、ＥＶＤを通じて、４％のＰＦＡ（１０ｍＬ）により、３０ｍＬ／時の輸注速度でＣＳＦ腔をフラッシュした。脳全体を厚さ１ｃｍの冠状切片に裁断し、そして４％ＰＦＡ中、４℃、オーバーナイトで固定した。次にさらに処理するために、スライスの縁を切り落として好適なサイズにし、ＰＢＳ中、４％アガロースに包埋し、そしてビブラトーム（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００Ｓ振動式ブレードミクロトーム、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ヴェツラー（Ｗｅｔｚｌａｒ）、ドイツ）を使用して１２０μｍの浮遊切片に裁断した。切片を処理したが、その第１の工程では、浮遊切片を透過処理バッファー（ＰＢＳ中、０．５％トリトンＸ１００を含む２％ＢＳＡ）中、室温で４時間事前調整し、その後４０ｎＭのテトラジン－Ｃｙ５（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、イェーナ（Ｊｅｎａ）、ドイツ）およびα－平滑筋アクチンに対するＦＩＴＣカップリングモノクロナール抗体（１：１０，０００、クローン１Ａ４、Ｓｉｇｍａ社）を含有するブロッキングバッファー（ＰＢＳ中、２％ＢＳＡ）（２ｍＬ）中、４℃、オーバーナイトでのインキュベートが後続した。次に核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：２，０００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ＣＡ）を用いて室温で４０分間染色した。ＰＢＳを用いて１５分間、３回洗浄した後、切片を、ＦｌｕｏｒｏＳａｆｅ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、バーリントン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）、ＭＡ）を用いてマウントした。

【0194】

Ｃｏｌｉｂｒｉ．２、ＡｐｏＴｏｍｅ．２システム、およびモーター付きのステージとカップリングしたＺｅｉｓｓ Ｏｂｓｅｒｂｅｒ．Ｚ１顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ社、フェルトバッハ（Ｆｅｌｄｂａｃｈ）、スイス）を用いて取得された、１０×倍率の個々の画像を共につなぎ合わせることにより、組織学的切片の全スライドスキャンを生成した。６３×倍率の画像を、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ヴェツラー（Ｗｅｔｚｌａｒ）、ドイツ）を使用して取得した．

【0195】

Ｄ．ＨＰＬＣ測定
定性的および定量的サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）では、ＨｂおよびまたはＨｐを含有するサンプルを、ＢｉｏＳｅｐ－ＳＥＣ－ｓ３０００（７５×７．８ｍｍ）Ｇｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、トーランス（Ｔｏｒｒａｎｃｅ）、ＣＡ）とカップリングし、そしてＬＫＢ ２１５０ ＨＰＬＣ Ｐｕｍｐ（ＬＫＢ－Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ ＡＢ社、ブロンマ（Ｂｒｏｍｍａ）、スウェーデン）およびＪａｓｃｏ ＵＶ－９７０ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ ＵＶ／ＶＩＳ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＪＡＳＣＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．社、東京、日本）と連結した分析用ＢｉｏＳｅｐ－ＳＥＣ－ｓ３０００（６００×７．８ｍｍ）ＬＣカラム上で分離した。２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．８を移動相として使用した。吸収を４１４ｎｍにおいて測定し、そしてＬａｂ Ｃｈａｒｔソフトウェア、バージョン７．２．１（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｉｍｅｎｔｓ社、ヘイスティングス（Ｈａｓｔｉｎｇｓ）、英国）を使用して記録した。ＨＰＬＣ曲線を、Ｒ統計ソフトウェア、バージョン４．２．３（ｗｗｗ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いて分析および可視化した。

【0196】

結果
Ａ．ハプトグロビンは、Ｈｂに曝露されたブタ脳底動脈におけるＮＯ媒介式の血管拡張をｅｘ ｖｉｖｏで回復させる
１０μＭの濃度でＫｒｅｂｓ－Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔバッファーに添加した無細胞Ｈｂは、ワイヤーミオグラフィー実験においてＮＯ誘発性の血管拡張を完全に平坦化させた（図４Ａ）。等モルのＨｐを添加すると、２０分間のインキュベーション期間後に、ＮＯ応答は概ね回復する（図４Ｂ）。Ｈｐは、出血から２日後、溶血が生じる前に同一の患者からサンプリングされたＣＳＦについて観察された程度に、外因性ＮＯに対する血管拡張応答も回復した（図６）。血管機能実験では、血漿由来のＨｐ２－２と組換えＨｐ１－１（図１８）または血漿由来Ｈｐ１－１（図１９）の間で、ＮＯ応答の回復に有意差は認められなかった。

【0197】

Ｂ．無細胞Ｈｂは、ａＳＡＨを有する患者の脳脊髄液における動脈性一酸化窒素シグナル伝達の主要な破綻因子である
ＤＩＮＤの初期臨床特性として、大脳動脈における血管攣縮の発生が挙げられる。無細胞ｏｘｙＨｂ（Ｆｅ^２＋Ｏ_２）／ｄｅｏｘｙＨｂ（Ｆｅ^２＋）と血管拡張物質である一酸化窒素（ＮＯ）との反応は、血管収縮力側にバランスをシフトさせる可能性がある。この脱調節の機構を調査するために、ヒトＣＳＦサンプル中に浸漬されたブタ脳底動脈のＮＯ媒介式の血管拡張応答を、ｅｘ ｖｉｖｏで定量した。多量の無細胞Ｈｂを含有するＤＩＮＤ患者由来のＣＳＦにおいて、短寿命のＮＯドナー（ＭＡＨＭＡ－ＮＯＮＯａｔｅ）の投与に対して期待される拡張性の応答は抑制された（図５）。しかしながら、無細胞ＨｂがＨｐ親和性カラムによりＣＳＦから選択的に除去されると、生理学的血管拡張応答は回復した。Ｈｂ除去前後の患者ＣＳＦのＬＣ－ＭＳＭＳ分析より、溶血性ＣＳＦ中のタンパク質組成物のバルクは不変のままであったことが実証された。この実験では、ａＳＡＨを有する患者の脳脊髄液における動脈性ＮＯシグナル伝達の主要な破綻因子として、無細胞Ｈｂが同定された。

【0198】

Ｃ．側脳室内に注射されたＨｂおよびＨｂ：Ｈｐは、クモ膜下腔中にｉｎ ｖｉｖｏで迅速に分布する
動的３Ｄ ＭＲＩにおいて、側脳室内に注射されたＭｎＨｂおよびＭｎＨｂ：Ｈｐ複合体は、第三脳室、水管、および第四脳室を通じて、生理学的内部ＣＳＦ経路に沿って迅速に分布することが明らかにされた（ｎ＝５）（図７）。数分以内に、ＭｎＨｂの高いシグナルが、すべての動物において、後頭蓋窩の大脳動脈を浸している大脳基底槽において検出することが可能であった（図８）。ウィリス動脈輪に続く大脳後頭窩中間部および前方部へのさらなる分布が、注射後２０分以内に観察された。予想通り、ＣＳＦコンパートメント内のＨｂとＨｂ：Ｈｐ複合体間でその分布に差異を検出することはできなかった。

【0199】

Ｄ．ハプトグロビンはＣＳＦコンパートメント内のＨｂを閉じ込め、そして大脳血管壁および脳実質中への浸透を低下させる
組織学的分析より、ＴＣＯ標識されたヘモグロビンがＣＳＦから脳間質腔中に、脳室系の脳室上皮関門を通じて浸透する一方、Ｈｐを同時輸注すると、この拡散は劇的に低下することが明らかとなった（図８）。さらに、Ｈｂが、クモ膜下腔から脳表面のグリア境界膜を通じて間質に強く浸透することも認められた（図９Ａ）。対照的に、Ｈｂ：Ｈｐ複合体は、貫通皮質血管のＣＳＦで満たされた血管周囲腔（Ｖｉｒｃｈｏｗ－Ｒｏｂｉｎ腔）に主に限定された（図９Ｂ）。

【0200】

体循環において、サイズ制限性の関門が、大分子のＨｂ－Ｈｐ複合体が、腎臓、心筋層、または抵抗動脈の血管壁などのような脆弱な組織中に非局在化するのを防止する。脳に対するＨｐ保護のこの一般的な概念を説明するために、ＴＣＯ－ＨｂまたはＴＣＯ－Ｈｂ－Ｈｐ複合体を、ヒツジのＣＳＦ中に輸注した。ｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）タグ化ヘムタンパク質が、ホルマリン固定組織切片において、蛍光顕微鏡検査により、テトラジンコンジュゲート蛍光色素とのクリックケミストリー反応後に、非常に高いシグナル対ノイズ比で可視化された。前脳および中脳の２つの異なる位置において、ヒツジ脳切片の蛍光スキャンを行い、無細胞Ｈｂは、２時間以内に、内部および外部ＣＳＦ腔から脳実質中に非局在化し、内部および外部ＣＳＦ－脳界面に沿って蛍光シグナルの縁部として現れることを実証した。この非局在化のパターンは、ＴＣＯ－Ｈｂ－Ｈｐ複合体が輸注されたヒツジの試料には存在しなかった。

【0201】

図８および図９においてＨｂ－Ｈｐ複合体分布を例証するために、ＥＶＤカテーテルの先端部が脳実質内部にわずかに配置された前脳の切片を選択した。この場所に、小量のＴＣＯ－Ｈｂ－Ｈｐを脳組織内に直接注射し、染色およびイメージング手順のための陽性コントロールとした。この他に、唯一際立ったＨｂ－Ｈｐシグナルが、軟膜表面から脳内に貫通する小動脈に沿って認識することができた。ヒツジを犠牲にする前に、ＳＥＣおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析用としてクモ膜下腔からＣＳＦを収集した。脳切片内にＨｂ－Ｈｐシグナルが存在しないにもかかわらず、大分子のＨｂ－Ｈｐ複合体（Ｃｙ５－テトラジンとのＴＣＯ反応後にきわめて蛍光性である２－２型Ｈｐポリマーのラダーから構成される）がＣＳＦ内で同定された。全体として、これらのデータは、Ｈｂ－Ｈｐ複合体はＣＳＦ腔内に閉じ込められたままであることを裏付ける。血管構造の共焦点顕微鏡では、ＴＣＯ－ＨｂまたはＴＣＯ－Ｈｂ－Ｈｐが輸注された動物から得られたヒツジ脳切片を、血管平滑筋細胞（αＳＭＡ）、およびアクアポリン－４（ＡＱＰ４）陽性アストロサイト終足について染色した。

【0202】

図１０は、ＴＣＯ標識されたＨｂまたはＨｂ－Ｈｐ複合体がそれぞれ輸注されたヒツジ中脳の脳室周囲エリア内にある内径の異なるいくつかの小動脈の共焦点画像を示す。画像から、Ｈｂ－Ｈｐ複合体が、貫通動脈のＣＳＦが満たされた血管周囲腔（Ｖｉｒｃｈｏｗ－Ｒｏｂｉｎ腔）内に高濃度で閉じ込められたままであることが確認される。この腔は、一方の側にある動脈の最外層（すなわち、外膜）および他方の側にあるアストロサイト終足（すなわち、グリア境界膜）により描写される。Ｈｐが存在しない場合、無細胞Ｈｂはアストロサイト関門を横断して脳組織中に、そしてさらに血管平滑筋層中に非局在化して内皮下腔に達する。この観測から、無細胞Ｈｂが大脳動脈において血管拡張性のＮＯシグナル伝達を遮断し、これにより血管攣縮を誘発するが、しかし大分子のＨｂ－Ｈｐ複合体はそうではない理由を説明することができる。

【0203】

Ｅ．クモ膜下腔内の無細胞Ｈｂはｉｎ ｖｉｖｏで急性血管攣縮を誘発するが、ハプトグロビンの同時輸注により防止し得る
クモ膜下腔内の無細胞Ｈｂは、すべての動物（４／４）において、急性の血管造影血管攣縮を誘発した。血管攣縮は、Ｈｂの脳室注射から６０分後に、後頭および前頭蓋窩の動脈（脳底動脈、小脳動脈、前大脳動脈）において再現的に局在した（図１１Ａおよび１２Ｂ）。しかしながら、血管攣縮は、中頭蓋窩（中大脳動脈、内頸動脈）においても検出可能であり、個体間変動はより大きかった（図１２）。Ｈｐを同時輸注すると、分節性動脈血管攣縮の誘発は完全に阻止された（図１１Ｂ）。Ｈｂ：Ｈｐを同時輸注された動物１匹が、分析したすべての血管テリトリーにおいてより細い管腔径を示したが、Ｈｂ輸注動物において認められた分節性の血管攣縮パターンを有することはなかった（データ図示せず）。血管攣縮の視覚的印象を客観化するために、半自動化された管腔径の定量を、４つの事前に定義された大脳動脈領域のＤＳＡ画像上で実施した。前大脳動脈（ＡＣＡ）および中大脳動脈（ＭＣＡ）において、脳底動脈（ＢＡ）の、ならびに大槽内頸動脈（ＩＣＡ）の有意な狭窄が、Ｈｂ：Ｈｐ輸注動物と比較して、Ｈｂ輸注動物において認められた（図１３Ａ）。Ｈｂ誘発性の血管収縮が、すべての動脈セグメントのプール分析においてよりいっそう明らかとなった（図１３Ｂ）。各実験の初期段階において一般的な対照手順として実施したものであるが、Ｈｂ－Ｈｐ輸注後でも、また同容積の人工ＣＳＦ輸注後においても、動脈の直径について有意な変化は認められなかった（図１３Ｃ）。

【0204】

Ｆ．ｉｎ ｖｉｖｏでＨｂを輸注した後にＨｐを連続投与すると、ＣＳＦにおいて完全なＨｂの複合体形成を引き起こす
連続注射されたＨｐは、ｉｎ ｖｉｖｏで、クモ膜下腔に分散した遊離Ｈｂと迅速かつ完全に結合する。脳室系へのＨｐ投与後１０分経過すると、後頭下から収集したＣＳＦサンプルにおいて、複合体未形成のＨｂはすでに検出不能であった（図１４）。

【0205】

ｉｎ ｖｉｖｏでの血管造影血管攣縮の時点で収集したヒツジＣＳＦの血管収縮効果は、ｅｘ ｖｉｖｏでの血管機能実験においても、Ｈｐにより中和可能である。

【0206】

Ｇ．ｉｎ ｖｉｖｏでの血管造影血管攣縮の時点で収集したヒツジＣＳＦの血管収縮効果は、ｅｘ ｖｉｖｏでの血管機能実験においても、Ｈｐにより中和可能である
単離された脳底動脈をＨｂ注射前に収集したヒツジＣＳＦに曝露すると、ａＣＳＦ内の管腔のように、ＮＯに対して類似した拡張性の応答を示した。血管造影血管攣縮の時点で収集した出血性ＣＳＦに曝露した後、ＮＯ応答は大きく低下した。等モルのＨｐ（ＣＳＦサンプル中の個々のＨｂ濃度に対応して調整した）を添加することにより、ｅｘ ｖｉｖｏで処置を行うと、ＮＯ応答性は幅広く回復する。Ｈｂ：Ｈｐ複合体の輸注から６０分後に収集したＣＳＦに曝露しても、ＮＯ誘発性の血管拡張は損なわれなかった（図１５）。

【0207】

Ｈ．無細胞Ｈｂは、ａＳＡＨを有する患者の脳脊髄液における動脈一酸化窒素シグナル伝達の主要な破綻因子である
出血後２～１３日目の間に外部脳室ドレイン（ＥＶＤ）カテーテルから収集した、ａＳＡＨを有する患者由来の連続したＣＳＦサンプル上で、定量的ＬＣ－ＭＳＭＳプロテオーム分析を実施した。対数変換後の標準化されたイオン強度比（ｘ日目／２日目）のｋ平均クラスタリングにより、少なくとも２つの固有ペプチドを用いて同定されたすべてのタンパク質を分類した（図１６）。カテゴリー３には、経時的に不変のままであったタンパク質が含まれる。カテゴリー２には、経時的に増加したタンパク質が包含される。カテゴリー２は、ほぼ赤血球（ＲＢＣ）コンポーネント、すなわちＨｂおよびＲＢＣ酵素のみから構成され、ａＳＡＨ後のクモ膜下腔において生ずる遅発性溶血プロセスを例証する。カテゴリー２では、Ｈｐは初期サンプルにおいて豊富に存在したが、しかし経時と共に枯渇し、無細胞Ｈｂの分画が過剰に残ることが判明した。カテゴリー１は、経時的に減少したタンパク質を表し、血漿タンパク質から主に構成された。

【0208】

Ｉ．第四脳室の脈絡膜における細動脈の組織形態計測分析
細い実質管腔（直径が５０～１００μｍの範囲）について、その観測された血管周囲Ｈｂ曝露を、本発明者らの試験において得られた大脳動脈に対する機能的読取りと結びつけるために、組織形態計測分析を実施した。この目的のために、第四脳室を通過する１２０μｍのヒツジ脳切片を平滑筋細胞について染色した（図１７Ａ）。脈絡膜内の細いα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）陽性管腔について、その共焦点画像を、処置に対して盲検化された研究者により取得した（１群当たりｎ＝３のヒツジ、Ｈｂ処置したヒツジにつき合計２５画像、Ｈｂ－ハプトグロビン処置したヒツジについて３２画像）。脳室内に滴下注入された定着剤に対して非常に迅速に曝露されることから、脳室周囲エリアをこの分析用として選択して、考え得る最良の構造的保存を確実にした。管腔毎に、αＳＭＡ陽性構造の内周および外周に基づき内腔および総断面積を数値化した（盲検化された研究者３名によって手作業により決定された）（図１７Ｂ）。縮小した外観を有する管腔は、すべてのＨｂ輸注動物において豊富に存在したが、Ｈｂ－ハプトグロビン輸注動物ではまったく見出すことはできなかった（図１７Ｃ）。図１７Ｄおよび１７Ｅは、分析したすべての管腔の内腔面積率の定量分析、ならびにヒツジ１匹当たりの平均値を示す。両分析方式のいずれにおいても、差異は統計的に有意であり、Ｈｂ－ハプトグロビン処置動物と比較して、Ｈｂ処置動物の内腔面積はより小さかった。

【0209】

まとめと結論
ａＳＡＨ患者では、遅発性虚血性神経障害（ＤＩＮＤ）が出血後４～１４日目の間で主に生ずる。この時間的プロファイルは、溶解性赤血球からクモ膜下コンパートメント中へのｏｘｙＨｂの放出量と相関関係を有し、ＣＳＦ ｏｘｙＨｂは４～１４日目の間にピークに達する。小規模の観察的臨床試験では、ＤＩＮＤを発症したａＳＡＨ患者とその発症を認めないａＳＡＨ患者の間で、累積的ＣＳＦ ｏｘｙＨｂレベルに有意差が観察された。二次神経学的退行が好ましくない転帰に対する主要な寄与因子であり、またＤＩＮＤを予防することがａＳＡＨ患者の処置における転機となる。

【0210】

この試験では、無細胞Ｈｂを通じてＮＯが除去されることで大脳動脈が受ける効果、およびハプトグロビンがこの毒性を阻止し、さもなければ低下させる可能性を探索するために、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルが確立された。無細胞ｏｘｙＨｂを通じた壁内ＮＯ枯渇とそれに続く血管収縮の概念を、単離されたブタ脳底動脈においてｅｘ ｖｉｖｏで確認した。Ｈｂに曝露された動脈をハプトグロビンで処置すると、ＮＯ誘発性の血管拡張が完全に回復した。さらに、ａＳＡＨ患者から収集された出血性ＣＳＦのＮＯ依存性血管作用性の効果が、同一モデルにおいて実証された。出血性ＣＳＦにおいて非常に多くの血管作用性分子が知られているにもかかわらず、ハプトグロビン処置によってｏｘｙＨｂを除去することで、ＮＯに対する血管拡張性の応答が、単離された大脳動脈において、生理学的レベルまで回復した。Ｈｐ２－２およびＨｐ１－１（組換えまたは血漿由来）の間で、血管拡張性のＮＯ応答を回復させる有効性について、差異は認められなかった。

【0211】

観測された効果をｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、高度にトランスレーショナルな大型の動物モデルを確立した。ヒツジのＣＳＦコンパートメント中に無細胞ｏｘｙＨｂを注射すると、すべての動物において再現性のある血管造影血管攣縮が誘発された。予防上の観点からより重要なこととして、ハプトグロビンを用いてｏｘｙＨｂと複合体形成させることで、この血管反応はｉｎ ｖｉｖｏで消滅した。さらに、治療的ハプトグロビンを投与してＮＯ誘発性の血管拡張を回復させるという概念が、血管造影血管攣縮を有する動物から収集された出血性ＣＳＦに曝露された動脈において、ｅｘ ｖｉｖｏで明らかにされた。これらの結果は、脳血管攣縮やＤＩＮＤを含む有害な二次神経学的転帰の発生率を低下させるために、ａＳＡＨ患者に治療的ハプトグロビンを投与して、ＣＳＦ中の無細胞ｏｘｙＨｂが脳血管のＮＯシグナル伝達を妨げるのを防止することに対する理論的根拠を強く裏付ける。

【0212】

ＣＳＦコンパートメント中に注射した無細胞ｏｘｙＨｂの分布を試験するため、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでのイメージングのためのいくつかの新規標識法を開発した。動的ＭＲＩを使用し、ＨｂおよびＨｂ：Ｈｐ複合体が、脳室系中への注射後、クモ膜下腔内を巨視的に同じように迅速に分散するのを確認した。組織学的分析より、ＨｂがＣＳＦから脳の間質腔中に広範に浸透する一方、Ｈｂ：Ｈｐ複合体はクモ膜下腔内に概ね限定されることが判明した。これらの予期せぬ所見から、ハプトグロビンとの複合体形成を通じて無細胞ＨｂをＣＳＦ腔内に閉じ込めることで、無細胞Ｈｂの大脳血管系および脳実質に対する毒性効果の防止に、少なくとも部分的に寄与することが強く示唆され、これによりａＳＡＨ患者のＣＳＦコンパートメントにおいてＨｂ除去能力が十分となるように、治療的アプローチとしてハプトグロビンを髄腔内投与することが注目される。

【0213】

あらゆる種類の天然に生じる、または外傷性の頭蓋内出血には、血管外溶血ならびに無細胞ＨｂのＣＳＦおよび／または脳間質腔中への放出が伴うことに留意すれば、ハプトグロビン処置の治療可能性は、ａＳＡＨ患者に限定されるものではないと考えられる。したがって、無細胞の頭蓋内ヘモグロビンを除去するための治療アプローチが奏功すれば、そのような治療アプローチは、神経疾患患者の大きな集団に対して多大なる潜在的影響を有する。

【0214】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18】

【図19】

【国際調査報告】