特表 2022-533448 ＵＢＥ３Ａ遺伝子および発現カセットならびにそれらの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-22

(54)【発明の名称】ＵＢＥ３Ａ遺伝子および発現カセットならびにそれらの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/54 20060101AFI20220714BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20220714BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220714BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20220714BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20220714BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220714BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220714BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20220714BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220714BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20220714BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20220714BHJP

【ＦＩ】

C12N15/54 ZNA

C12N15/864 100Z

C12N5/10

A01K67/027

C12N9/10

A61P25/00

A61K48/00

A61K35/12

A61K31/7088

A61K35/761

C12N15/11 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021569494

(86)(22)【出願日】2020-05-22

(85)【翻訳文提出日】2022-01-24

(86)【国際出願番号】 US2020034171

(87)【国際公開番号】W WO2020237130

(87)【国際公開日】2020-11-26

(31)【優先権主張番号】62/851,411

(32)【優先日】2019-05-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500093834

【氏名又は名称】ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(72)【発明者】

【氏名】フィルポット，ベンジャミン・デイヴィッド

(72)【発明者】

【氏名】グレイ，スティーブン・ジェイムズ

(72)【発明者】

【氏名】シン，チャールズ

(72)【発明者】

【氏名】ジャドソン，マシュー

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050DD11

4B050LL01

4B065AA91X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA022

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA02

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB65

4C087BC83

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA02

(57)【要約】

本発明は、ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含むポリヌクレオチド、それを含むベクター、ならびに細胞または対象への上記ＯＲＦの送達のために、およびアンジェルマン症候群等、対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子の異常発現またはＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の異常活性と関連した障害を治療するためにそれを使用する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドであって、前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォームをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項2】

前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォーム（すなわち、アイソフォーム１）および長いアイソフォーム２をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項3】

前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォーム（すなわち、アイソフォーム１）および長いアイソフォーム３をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項4】

前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、発現を低下させる１つまたは複数のヌクレオチド改変が欠如した天然ＯＲＦの発現と比較して、前記長いアイソフォームの発現を低下させる前記１つまたは複数のヌクレオチド改変を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項5】

前記長いアイソフォームの前記発現は、発現を低下させるヌクレオチド改変を含まない天然ＯＲＦと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下する、請求項４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項6】

前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、発現を増強するヌクレオチド改変を含まない天然ＯＲＦと比較して、前記短いアイソフォームの発現を増強する（例えば、発現を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上増強する）１つまたは複数のヌクレオチド改変を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項7】

前記短いアイソフォームの前記発現は、発現を増強するヌクレオチド改変を含まない天然ＯＲＦと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増強される、請求項６に記載のポリヌクレオチド。

【請求項8】

前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、前記長いアイソフォームの発現と比較して、約１：１～約１５：１の比での前記短いアイソフォームの発現をコードする１つまたは複数のヌクレオチド改変を含む、請求項１から７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項9】

前記長いアイソフォームに対するコード配列に作動可能に連結された、配列番号６を含む第１のコザック配列を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項10】

前記短いアイソフォームに対するコード配列に作動可能に連結された、配列番号８を含む第２のコザック配列を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】

前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１から１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項12】

前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒト細胞における細胞内または非分泌発現のためにコドン最適化されている、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。

【請求項13】

前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、配列番号９、配列番号２６、もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％、７５％、７６％、７７％、８０％、８５％、もしくは９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現カセット。

【請求項15】

前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームはプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１４に記載の発現カセット。

【請求項16】

前記プロモーターはニューロン特異的プロモーターである、請求項１５に記載の発現カセット。

【請求項17】

前記プロモーターはヒトシナプシンプロモーターである、請求項１５または１６に記載の発現カセット。

【請求項18】

前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームはポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されている、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項19】

前記ポリアデニル化シグナルはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）である、請求項１８に記載の発現カセット。

【請求項20】

少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）をさらに含む、請求項１４から１９のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項21】

前記発現カセットは２つのＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項２０に記載の発現カセット。

【請求項22】

前記ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびＡＡＶ１３ ＩＴＲからなる群から選択される、請求項２１に記載の発現カセット。

【請求項23】

前記ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲである、請求項２２に記載の発現カセット。

【請求項24】

一本鎖ＡＡＶゲノムである、請求項１４から２３のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項25】

プロモーター、前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、およびポリアデニル化部位を含む、請求項１４から２４のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項26】

ＡＡＶ ＩＴＲ、プロモーター、前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項１４から２５のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項27】

ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ヒトシナプシンプロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォーム２を含む前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ｂＧＨｐＡ、ならびにＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項１４から２６のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項28】

ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ヒトシナプシンプロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォーム３を含む前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ｂＧＨｐＡ、ならびにＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項１４から２６のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項29】

ＡＡＶ２ ＩＴＲ；ヒトシナプシンプロモーター；配列番号６および／または配列番号８を含む、それから本質的になる、またはそれからなる１つまたは複数のコザック配列をさらに含む、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォーム２を含む前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム；ｂＧＨｐＡ；ならびにＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項１４から２８のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項30】

ＡＡＶ２ ＩＴＲ；ヒトシナプシンプロモーター；配列番号６および／または配列番号８を含む、それから本質的になる、またはそれからなる１つまたは複数のコザック配列をさらに含む、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォーム３を含む前記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム；ｂＧＨｐＡ；ならびにＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、請求項１４から２８のいずれか１項に記載の発現カセット。

【請求項31】

配列番号１４のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％同一の配列を含む、請求項３０に記載の発現カセット。

【請求項32】

請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４から３１のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、ベクター。

【請求項33】

神経向性ベクターである、請求項３２に記載のベクター。

【請求項34】

ウイルスベクターである、請求項３２または３３に記載のベクター。

【請求項35】

ＡＡＶベクターである、請求項３４に記載のベクター。

【請求項36】

前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項３５に記載のベクター。

【請求項37】

前記ＡＡＶベクターはＡＡＶ９またはＡＡＶ９由来ベクターである、請求項３５に記載のベクター。

【請求項38】

前記ＡＡＶ９由来ベクターは、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅＢ、またはＡＡＶ９．ＨＲ）である、請求項３７に記載のベクター。

【請求項39】

請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４から３１のいずれか１項に記載の発現カセット、および／または請求項３２から３８のいずれか１項に記載のベクターを含む、形質転換細胞。

【請求項40】

前記ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、前記細胞ゲノムに安定に組み入れられている、請求項３９に記載の形質転換細胞。

【請求項41】

請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４から３１のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項３２から３８のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３９もしくは４０に記載の形質転換細胞を含む、トランスジェニック動物。

【請求項42】

薬学的に許容される担体中に、請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４から３１のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項３２から３８のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３９もしくは４０に記載の形質転換細胞を含む、医薬組成物。

【請求項43】

細胞を、請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４から３１のいずれか１項に記載の発現カセット、および／または請求項３２から３８のいずれか１項に記載のベクターに接触させ、それによって前記細胞においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させるステップを含む、細胞においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させる方法。

【請求項44】

請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４から３１のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項３２から３８のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３９もしくは４０に記載の形質転換細胞を対象に送達し、それによって前記対象においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させるステップを含む、対象においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させる方法。

【請求項45】

請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４から３１のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項３２から３８のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３９もしくは４０に記載の形質転換細胞の治療有効量を対象に投与し、それによりＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームが前記対象において発現されるステップを含む、それを必要とする対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子の異常発現またはＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の異常活性と関連した障害を治療する方法。

【請求項46】

前記ＵＢＥ３Ａ遺伝子の発現と関連した前記障害はアンジェルマン症候群である、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

請求項１から１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４から３１のいずれか１項に記載の発現カセット、請求項３２から３８のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項３９もしくは４０に記載の形質転換細胞の治療有効量を対象に投与し、それによりＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームが前記対象において発現されるステップを含む、それを必要とする対象におけるアンジェルマン症候群を治療する方法。

【請求項48】

前記ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームは、前記長いアイソフォームの発現と比較して約１：１～約１５：１の比で発現される、請求項４３から４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記対象は、前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞の送達前に疾患の症状を呈する、請求項４４から４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は子宮内に送達される、請求項４４から４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記対象はヒトである、請求項４４から５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は、前記対象の神経系に送達される、請求項４４から５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記ＡＡＶベクターは、少なくとも約１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、または１０^１６ウイルスゲノム／キログラム、任意で１０^８～１０^１４ウイルスゲノム／キログラムの用量で前記対象に投与される、請求項４４から５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は静脈内に送達される、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は、髄腔内、脳内、大槽内、実質内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼球内、もしくは眼球周囲送達、またはその任意の組み合わせによって送達される、請求項５２に記載の方法。

【請求項56】

前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は髄腔内に送達される、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は脳室内に送達される、請求項５５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１９年５月２２日に出願された米国仮出願第６２／８５１，４１１号の利益を主張するものであり、その全内容は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

【0002】

配列表の電子出願に関する声明
２０２０年５月２０日に作成された、サイズが４９，２５６バイトの５４７０－８６７ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題された、米国特許規則１．８２１の下で提出され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して出願されたＡＳＣＩＩテキスト形式での配列表が、紙複製物の代わりに提供される。この配列表は、その開示のために、本明細書へ引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

【0003】

本発明は、ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含むポリヌクレオチド、それを含むベクター、ならびに細胞または対象への上記ＯＲＦの送達のために、およびアンジェルマン症候群等、対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子の異常発現またはＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の異常活性と関連した障害を治療するためにそれを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、およそ１：１５，０００の個体に影響を及ぼす神経発達障害である。ＡＳを有する個体は、生涯にわたって、発作、運動障害、知的障がい、および言語能力欠如を有する。個体は、通常、生後１年の間に運動失調を呈する。ニューロンにおける機能的ＵＢＥ３Ａ遺伝子の喪失がＡＳを引き起こす。

【0005】

ＵＢＥ３Ａは第１５染色体に位置し、母由来アレルからの偏った発現を呈する、１５ｑ１１～ｑ１３領域内の唯一の遺伝子である。父由来アレルは、父由来インプリンティングに起因してニューロンにおいて発現停止されている。したがって、母由来の１５ｑ１１～１３の欠失、および母由来ＵＢＥ３Ａの機能喪失変異の両方がＡＳを引き起こす（図１を参照されたい）。ＵＢＥ３Ａタンパク質のＥ３ユビキチンリガーゼ機能（Ｅ６ＡＰユビキチンタンパク質リガーゼ（Ｅ６ＡＰ）としても知られる）を損なう点変異は、ＡＳ表現型の全スペクトルをもたらすのに十分であり、ＡＳの発病に対するＵＢＥ３Ａの重要性を強調している。コンセンサスは、ＵＢＥ３Ａのニューロン喪失がＡＳを誘発するということである。グリアは、ニューロンとは異なり、役割を担う可能性が低く、それらはＵＢＥ３Ａを両アレルでかつ非常に低いレベルで発現する。

【0006】

現在、ＡＳに利用可能な特異的治療はない。ＡＳの影響を受けた個体は、支えとなる対症療法によって管理される。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、一部には、アンジェルマン症候群等、ＵＢＥ３Ａ誤発現と関連した障害を治療するための、最適化されたＵＢＥ３Ａ遺伝子、遺伝子カセット、および治療レベルのＵＢＥ３Ａ発現を提供し得るベクターの開発に基づく。本発明の態様は、ＡＳ等、ＵＢＥ３Ａ発現と関連した障害を治療するための、治療レベルのＵＢＥ３Ａ発現を提供し得るコドン最適化ＵＢＥ３Ａ遺伝子、遺伝子カセット、およびベクターを提供することによって、当技術分野における欠点を克服する。

【0008】

ゆえに、本発明の１つの態様は、ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドであって、ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォームをコードする、ポリヌクレオチドに関する。

【0009】

本発明のさらなる態様は、ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを含む発現カセット、ならびに本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、形質転換細胞、およびトランスジェニック動物に関する。

【0010】

本発明の別の態様は、薬学的に許容される担体中に、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞を含む薬学的製剤に関する。

【0011】

本発明の付加的な態様は、細胞を、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターに接触させ、それによって細胞においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させるステップを含む、細胞においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させる方法に関する。

【0012】

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞を対象に送達し、それによって対象においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させるステップを含む、対象においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させる方法に関する。

【0013】

本発明の付加的な態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞の治療有効量を対象に投与し、それによりＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームが対象において発現されるステップを含む、それを必要とする対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子の異常発現またはＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の異常活性と関連した障害を治療する方法に関する。

【0014】

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞の治療有効量を対象に投与し、それによりＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームが対象において発現されるステップを含む、それを必要とする対象におけるアンジェルマン症候群（ＡＳ）を治療する方法に関する。

【0015】

本発明の別の態様は、それを必要とする対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子の異常発現またはＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の異常活性と関連した障害を治療する方法における使用のための、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞に関する。

【0016】

本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の本発明の説明においてより詳細に示される。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】ニューロンが父由来ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを有する、ＵＢＥ３Ａの神経調節の略図である。

【図2】フルロチルキンドリングおよび再負荷（ｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の実験設計を示した図（図２Ａ）、ならびに野生型マウス（ＷＴ）、長いＵＢＥ３Ａを欠如するマウス（ＩＳＯ２－ＫＯ）、および短いＵＢＥ３Ａを欠如するマウス（ＩＳＯ３－ＫＯ）に関する全般発作誘発閾値を示したグラフ（ＧＳＴ、図２Ｂ）である。

【図3A】ＷＴヒトおよびマウスＵＢＥ３ＡアイソフォームのＮ末端アミノ酸配列（配列番号１５～１９）を示す図である。マウスアイソフォーム１（示されず）は切断され、安定なタンパク質を発現しない。

【図3B】結果として得られるｈＵＢＥ３Ａタンパク質の対応するアミノ酸残基（配列番号２１）（下）と合わせた、コドン最適化ｈＵＢＥ３Ａ１＞＞３オープンリーディングフレームの５’ＤＮＡ配列（配列番号２０）（上）を示す図である。長いおよび短いｈＵＢＥ３Ａの両方とも、同じリーディングフレームにおいてコードされる。ｈＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームを始める第２の開始コドン（ＣＡＧＧＡＴＧＡ）からの翻訳開始に偏るように、種々の強さのコザック配列を操作した。

【図3C】ｈＵＢＥ３Ａの長い（アイソフォーム３）および短い（アイソフォーム１）アイソフォームの両方（配列番号２２～２４）を発現させるための全体的なＡＳ遺伝子療法構築物を描写した概略図である。

【図4】ＷＴおよびＡＳモデルマウス（Ｕｂｅ３ａ^{ｍ－／ｐ＋}）から採取されたＵＢＥ３Ａ染色された矢状断面の画像であり、ＡＳマウスは、神経ＵＢＥ３Ａ発現のほぼ完全な喪失を呈する（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９８：２１（４）：７９９－８１１）。

【図5】マウス海馬ｍＲＮＡから逆転写された内因性マウスＵｂｅ３ａ転写産物（ｍＵｂｅ３ａ、左のパネル）またはコドン最適化ヒトＵＢＥ３Ａ転写産物（ｈＵＢＥ３Ａ－ｏｐｔ、右のパネル）のいずれかを検出するドロップレットデジタルＰＣＲ実験の結果を示したグラフである。Ｐ１におけるビヒクルまたはＡＳ遺伝子療法ウイルス（ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ）のＩＣＶ注射後に、成体ＷＴおよびＡＳマウスから海馬を採取した。遺伝子療法処理されたＡＳ＋ＡＡＶ群におけるｈＵＢＥ３Ａ－ｏｐｔの選択的検出に留意されたい。

【図6】アイソフォームに関係なく、マウスおよびヒトＵＢＥ３Ａの両方に等しく結合するＵＢＥ３Ａ抗体を使用した、Ｐ９マウス全脳溶解物のウェスタンブロッティングを示した画像である。ＷＴサンプル（左端）では、短いＵＢＥ３Ａアイソフォームを表す主要なバンドは、長いＵＢＥ３Ａに相当するすぐ上の（ｕｐｆｉｅｌｄ）微量のバンドと並置される（短に対する長の比、約５：１）。短いＵＢＥ３Ａの神経発現が欠如する母由来ＩＳＯ３－ＫＯマウス由来のサンプル（右端）では、長：短のＵＢＥ３Ａ比は劇的に低下し、２つの個別のＵＢＥ３Ａアイソフォームバンドの非常にはっきりとした分解が可能となる。ホモ接合性ＩＳＯ３－ＫＯマウス由来のサンプル（左から２番目）は、長いアイソフォームバンドのみを生じさせる。ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ処理されたＡＳマウス由来のサンプル（右から２番目）は、およそ３：１の比で短いおよび長いｈＵＢＥ３Ａアイソフォームの両方を発現し、ゆえに二重アイソフォーム手法の実現可能性を実証する。

【図7】ＷＴおよびＡＳモデルマウスの免疫組織化学を示した画像である。図７Ａは、Ｐ１におけるＡＳ遺伝子療法ウイルス（ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ）のＩＣＶ注射後に、様々な生後齢（Ｐ１０、Ｐ１５、Ｐ２５）のマウスから採取された、外側から内側への一連のＵＢＥ３Ａ染色された矢状断面を示している。図７Ｂは、高倍率共焦点顕微鏡写真における海馬エリアＣＡ３内へのｈＵＢＥ３Ａ遺伝子移入の効率を示す図である。矢状は、ＵＢＥ３Ａを再発現しない希少なニューロン（ＮｅｕＮ＋）を示す。ＵＢＥ３Ａタンパク質は、短いｈＵＢＥ３Ａアイソフォームの優勢な発現と一致した、顕著な核局在を示している。

【図8】ｈＵＢＥ３Ａ遺伝子移入後の、細胞内局在における細胞質から核へのシフトを示した画像である。パネルＡ～Ｃは、Ｐ１におけるＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３ＡウイルスのＩＣＶ注射後の、Ｐ１０（パネルＡ）、Ｐ１５（パネルＢ）、およびＰ２０（パネルＣ）におけるＡＳモデルマウスからのＵＢＥ３Ａ染色された第２／３層新皮質を示している。Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０１４：５２２（８）：１８７４－１８９６からのパネルＤ～Ｆに示されるように、ウイルスにより形質導入されたｈＵＢＥ３Ａの核における漸進的蓄積が発達にわたって見られ、内因性ＵＢＥ３Ａ発現の時空間パターンを忠実に再現している。

【図9】生後０～２日にビヒクルまたはＡＳ遺伝子療法ウイルス（ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ）のいずれかをＩＣＶ注射された雄ＷＴおよびＡＳモデルマウスの毎月の総重量増大を示したグラフである。体重は、ＷＴ＋ビヒクル、ＷＴ＋ＡＡＶ、ＡＳ＋ビヒクル、ＡＳ＋ＡＡＶの１ヶ月齢の時点で実験群にわたって統計的に同程度であり、ｈＵＢＥ３Ａ遺伝子移入の良好な忍容性および顕在的毒性がないことを実証した。２ヶ月までにかつ成体期まで続いて、ＡＳ＋ビヒクルマウスは、重量増大の統計的に有意な増加を呈した。この表現型は、ＡＳ＋ＡＡＶマウスにおいて完全にレスキューされた。

【図10】生後０～２日にビヒクル（ＷＴ＋ビヒクル、ＡＳ＋ビヒクル）またはＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ ＡＳ遺伝子療法ウイルス（ＷＴ＋ＡＡＶ、ＡＳ＋ＡＡＶ）のいずれかをＩＣＶ注射された成体ＷＴおよびＡＳモデルマウスにおける行動試験の結果を示したグラフである。パネルＡは、実験スケジュールの概略を示している。パネルＢは、自発運動を試験するオープンフィールド実験を要約している。データは、５分間ビンで（左のパネル）および１時間の記録セッションにおける活動の合計として（右のパネル）の両方で示される。傾向は明白であったものの、以前に報告されるように、ＡＳ＋ビヒクルおよびＷＴ＋ビヒクルマウスの間に統計的に有意な減少はなく、それはＡＳ＋ＡＡＶマウスにおいてレスキューされないように見えた。注目すべきは、ＷＴ＋ＡＡＶマウスは、ＵＢＥ３Ａ過剰発現の潜在的副作用である軽度の活動亢進を呈する。パネルＣは、２日の別々の日：３回の習得試行からなる１日目；４８時間後にある２回の再試験試行からなる２日目に行われたロータロッド運動パフォーマンスアッセイからの結果を描写している。すべての試行は、５分間の継続時間のものであった。ＡＳ＋ビヒクルマウスとは異なり、ＡＳ＋ＡＡＶマウスは、習得の間にそれらの運動欠損を有意に克服し、ＷＴ＋ビヒクル対照群のパフォーマンスのレベルに接近し、それは再試験の間持続した。パネルＤは、自発的穴掘りおよび穿孔行動を測定するアッセイであるガラス玉覆い隠しの結果を示している。ＡＳ＋ビヒクルマウスは、典型的に、３０分間のセッションの間にほとんどガラス玉を覆い隠さず、これは、これらのマウスがこの動物行動学的関連行動の重度の欠損を有することを示した。この表現型は、ほとんどのＡＳ＋ＡＡＶマウスにおいて、十分にではないにせよ部分的にレスキューされた。パネルＥは、ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ処理が、ＡＳ＋ＡＡＶ群において、ＡＳマウスにおいて重度に欠如している別の先天的行動である巣作りを有意に向上させたことを実証している。ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ処理されたＡＳマウスは、より多くの利用可能な巣作り材料をそれらの巣に組み入れ（左のパネル）、それらのビヒクル処理された対応動物よりも高い品質の巣を作り上げた。

【図11】生後０～２日にビヒクル（ＷＴ＋ビヒクル、ＡＳ＋ビヒクル）またはＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ ＡＳ遺伝子療法ウイルス（ＷＴ＋ＡＡＶ、ＡＳ＋ＡＡＶ）のいずれかをＩＣＶ注射された成体ＷＴおよびＡＳモデルマウスにおけるフルロチルキンドリングおよび再負荷試験の結果を示したグラフである。パネルＡは、実験スケジュールの概略を示している。パネルＢは、８日間のフルロチルキンドリング期間およびその後３６日目のフルロチル再負荷にわたる、ミオクローヌス発作（左のパネル）および全般化発作（右のパネル）までの平均群潜時を要約している。ＡＳ＋ビヒクルマウスは、再負荷があるとミオクローヌス発作閾値（ＭＳＴ）および全般発作誘発閾値（ＧＳＴ）の減少を有する強い傾向を示した。発作誘発閾値はＡＳ＋ＡＡＶ群において正常化され、過剰なてんかん発生から保護するＡＳ遺伝子療法の潜在性を実証した。

【図12】フルロチル発作キンドリング後の発作感受性の増強についての解剖学的相関性を示した画像およびグラフである。パネルＡは、背側海馬の矢状断面におけるペリニューロナルネットのＷＦＡ染色（マゼンタ）を示している。歯状回における平均ＷＦＡ蛍光の定量により、この構造におけるペリニューロナルネット堆積の増強は、ＡＳ＋ビヒクルマウスに固有であることが裏付けられた。パネルＢは、海馬および皮質に及ぶ矢状断面におけるアストロサイトのＧＦＡＰ染色を示している。海馬における強く染色されたアストロサイトは、側頭葉てんかんの証である反応性アストログリオーシスを指し示し、平均海馬ＧＦＡＰ蛍光の定量によって実証されるように、ＡＳ＋ビヒクル群においてのみ観察された。

【図13】ＷＴコザック配列を有する、ヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム３およびアイソフォーム１の両方をコードするＵＢＥ３Ａ ＯＲＦのＷＴ（天然）コード配列（配列番号２６）を示す図である。それぞれの発現されるアイソフォームを調節するコザック配列が太字で示されており、翻訳開始部位に下線が引かれている。

【図14】改変されたコザック配列を有する、ヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム３およびアイソフォーム１の両方をコードするＵＢＥ３Ａ ＯＲＦのＷＴ（天然）コード配列（配列番号２７）である。それぞれの発現されるアイソフォームを調節するコザック配列が太字で示されており、翻訳開始部位に下線が引かれている。

【発明を実施するための形態】

【0018】

本発明は、以下でさらに詳細に説明される。本説明は、本発明が実行され得るすべての異なるやり方または本発明に付加され得るすべての特質についての詳細な目録であることを意図されるわけではない。例えば、１つの実施形態に関して例示される特質は、他の実施形態に組み入れられ得、特定の実施形態に関して例示される特質は、その実施形態から欠失され得る。加えて、本発明から逸脱しない、本明細書において示唆される様々な実施形態に対する数々の変形および付加が、本開示を踏まえて当業者に明らかであろう。それゆえ、以下の明細書は、本発明の一部の特定の実施形態を例示することを意図されるものであり、そのすべての順列、組み合わせ、および変形を徹底的に指定することを意図されるわけではない。

【0019】

文脈上別途に示されない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特質は、任意の組み合わせで使用され得ることが具体的に意図される。さらに、本発明は、本発明の一部の実施形態において、本明細書に示される任意の特質または特質の組み合わせが除外され得るまたは削除され得ることも企図する。例示するために、複合体が構成要素Ａ、Ｂ、およびＣを含むと本明細書が記述する場合、Ａ、Ｂ、もしくはＣまたはその組み合わせのいずれかは、単独でまたは任意の組み合わせで削除され得かつ放棄され得ることが具体的に意図される。

【0020】

別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明において使用される術語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、本発明を限定することを意図されるわけではない。

【0021】

ヌクレオチド配列は、別途具体的に示されない限り、左から右へ５’から３’方向に一本鎖のみによって本明細書において提示される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される様式で、または（アミノ酸に関しては）、両方とも米国特許規則１．８２２および確立された使用法に従った１文字表記もしくは３文字表記のいずれかによって本明細書において表される。

【0022】

別途記載される場合を除いて、当業者に公知の標準的な方法が、組み換えおよび合成ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメントの産生、核酸配列の操縦、形質転換細胞の産生、ｒＡＡＶ構築物、改変されたカプシドタンパク質、ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列を発現させるパッケージングベクター、ならびに一過性におよび安定にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築に使用され得る。そのような技法は当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；Ｆ．Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ．ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

【0023】

本明細書において触れられるすべての刊行物、特許出願、特許、ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、および他の参考文献は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

【0024】

定義
本発明の説明においておよび添付の特許請求の範囲において使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上別途明示されない限り、複数形も含むことを意図される。

【0025】

本明細書において使用するとき、「および／または」は、関連する列挙された品目のうちの１つまたは複数のありとあらゆる考え得る組み合わせ、ならびに選択肢（「または」）で解釈される場合には組み合わせがないことを指しかつ包含する。

【0026】

さらに、本発明は、本発明の一部の実施形態において、本明細書に示される任意の特質または特質の組み合わせが除外され得るまたは削除され得ることも企図する。

【0027】

さらには、本発明の化合物または作用物質の量、用量、時間、温度等の測定可能な値に言及する場合に本明細書において使用される「約」という用語は、指定の量の±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動を包含することを意図される。

【0028】

本明細書において使用するとき、「から本質的になる」という移行句は、挙げられた材料またはステップ、ならびに特許請求される発明の基本的なおよび新規の特徴に著しく影響を及ぼさないものを包含すると解釈されるべきである。ゆえに、本明細書において使用される「から本質的になる」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と等価として解釈されるべきではない。

【0029】

本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される「から本質的になる」という用語（および文法的変形）は、挙げられた配列（例えば、配列番号）と、挙げられた配列の５’および／もしくは３’またはＮ末端および／もしくはＣ末端にある、あるいはポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が著しく変更されないような２つの末端の間（例えば、ドメインの間）にある合計１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の付加的なヌクレオチドまたはアミノ酸との両方からなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。合計１０個以下の付加的なヌクレオチドまたはアミノ酸は、一緒に付加された付加的なヌクレオチドまたはアミノ酸の総数を含む。本発明のポリヌクレオチドに適用される「著しく変更された」という用語は、挙げられた配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して、少なくとも約５０％以上の、コードされたポリペプチドを発現する能力の増加または減少を指す。本発明のポリペプチドに適用される「著しく変更された」という用語は、挙げられた配列からなるポリペプチドの活性と比較して、少なくとも約５０％以上の生物学的活性の増加または減少を指す。

【0030】

本明細書において使用される「パルボウイルス」という用語は、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含めたパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科を包含する。自律性パルボウイルスは、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、デンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、およびコントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを含む。例となる自律性パルボウイルスは、これらに限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、ノバリケンパルボウイルス、ヘビパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスを含む。他の自律性パルボウイルスは当業者に公知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。

【0031】

ディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属は、これらに限定されないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含めた、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含有する。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；および表１を参照されたい。

【0032】

本発明の文脈における「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、限定されることなく、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶ、ならびに現在公知のまたは後に発見される他の任意のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。多数の付加的なＡＡＶ血清型およびクレードが同定されており（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１－６３８８および表１を参照されたい）、それも「ＡＡＶ」という用語によって包含される。

【0033】

本発明のパルボウイルス粒子およびゲノムは、これに限定されないが、ＡＡＶ由来のものであり得る。ＡＡＶおよび自律性パルボウイルスの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然ＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。そのような配列は、文献において、またはＧｅｎＢａｎｋ等の公的データベースにおいて見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、およびＡＹ５３０５７９を参照されたく；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。例えば、Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３－：３７５－３８３；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３０：３７５；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８；Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３８５；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：８９１１；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；国際特許公報ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４、および米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたく；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。表１も参照されたい。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、およびＡＡＶ３ ＩＴＲ配列の初期の説明は、Ｘｉａｏ，Ｘ．，（１９９６），“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，”Ｐｈ．Ｄ．Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ（その全体として本明細書に組み入れられる）によって提供される。

【0034】

「キメラ」ＡＡＶ核酸カプシドコード配列またはＡＡＶカプシドタンパク質とは、２つ以上のカプシド配列の部分を結合させるものである。「キメラ」ＡＡＶビリオンまたは粒子は、キメラＡＡＶカプシドタンパク質を含む。

【0035】

本明細書において使用される「向性」という用語は、任意でかつ好ましくは、細胞におけるベクター内容物（例えば、ウイルスゲノム）によって運ばれる配列の発現（例えば、転写および任意で翻訳）、例えば組み換えウイルスに関しては、異種ヌクレオチド配列の発現が後に続く、ある特定の細胞もしくは組織タイプへのベクター（例えば、ウイルスベクター）の優先的な、しかし必ずしも排他的ではない進入、および／またはある特定の細胞もしくは組織タイプへの進入を促す、細胞表面との優先的な、しかし必ずしも排他的ではない相互作用を指す。当業者であれば、ウイルスゲノムからの異種核酸配列の転写は、例えば誘導性プロモーターまたはさもなければ調節される核酸配列に対する、トランス作用因子の非存在下では開始され得ないことを解するであろう。ｒＡＡＶゲノムの場合、ウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定に組み込まれたプロウイルスからのおよび／または組み込まれないエピソームからの、ならびにウイルス核酸が細胞内で取り得る他の任意の形態からのものであり得る。

【0036】

「向性プロファイル」という用語は、１つまたは複数の標的細胞、組織、および／または臓器の形質導入のパターンを指す。キメラＡＡＶカプシドの代表的な例は、末梢臓器の低い形質導入とともに、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞の効率的な形質導入によって特徴付けられる向性プロファイルを有する（例えば、米国特許第９，６３６，３７０号、ＭｃＣｏｗｎら、および米国特許公報２０１７／０３６０９６０、Ｇｒａｙらを参照されたい）。特異的向性プロファイルを発現するベクター（例えばウイルスベクター、例えばＡＡＶカプシド）は、それらの向性プロファイルについて「向性」、例えば神経向性、肝臓向性等と称され得る。

【0037】

【0038】

本明細書において使用される「ＵＢＥ３Ａ遺伝子の異常発現と関連した障害」という用語は、正常な対象におけるまたは集団における発現レベルと比べて、対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子の減少したまたは変更された発現によって引き起こされるまたはその症状である疾患、障害、症候群、または状態を指す。

【0039】

本明細書において使用される「ＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の異常活性と関連した障害」という用語は、正常な対象におけるまたは集団における活性と比べて、対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の減少したまたは変更された活性によって引き起こされるまたはその症状である疾患、障害、症候群、または状態を指す。一部の実施形態において、ＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の異常活性と関連した障害はアンジェルマン症候群であり得る。

【0040】

アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、母由来ＵＢＥ３Ａアレルにおける欠失または変異によって引き起こされる単一遺伝子障害である。無傷の父由来アレルは、図１に略図化されるように、アンチセンスＤＮＡ転写産物ＵＢＥ３Ａ－ＡＴＳによって、健常およびＡＳ患者のニューロンにおいて発現停止される。３つのヒトＵＢＥ３Ａタンパク質アイソフォームがある（図３Ａ）。最も短いもの（すなわち、ヒトアイソフォーム１）は、核に局在する固有の能力を有し、２つの長いアイソフォームであるヒトアイソフォーム２および３を上回って発現され、２つの長いアイソフォームは、長いマウスアイソフォーム２のＮ末端とアラインするアミノ酸伸長によって識別される（Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３；３３（１）：３２７－３３３）。短いアイソフォームを欠損したマウス（マウスにおけるアイソフォーム３；ＩＳＯ３－ＫＯ）は、ＡＳモデルマウスにおける電気生理学的および行動学的欠損を広く表現型模写することが示されている（Ａｖａｇｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１９：２２（８）：１２３５－１２４７）。より最近には、本発明者らは、ＡＳマウス（Ｇｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１９；１２９（１）：１６３－１６８）と同様のＩＳＯ３－ＫＯマウスが、フルロチルキンドリング後の発作再負荷に対する感受性の増強を呈することを実証した。対照的に、長いＵＢＥ３Ａアイソフォームの選択的欠失を持つ補足的マウスモデル（マウスにおけるアイソフォーム２；ＩＳＯ２－ＫＯ）は、これまでのところいかなるＡＳマウス表現型も発現することができていない（図２Ｂ；Ａｖａｇｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１９：２２（８）：１２３５－１２４７）。最近の臨床データは、短いＵＢＥ３Ａの決定的な重要性を同様に裏付けているが、長いＵＢＥ３Ａも、より低いレベルで発現されているにもかかわらず、健常な脳発達および機能に寄与することを示唆している（Ｓａｄｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ，２０１８；１７６（７）：１６４１－１６４７）。理論に拘束されることを望まないものの、外因的に付加された発現カセットからの短いおよび長いＵＢＥ３Ａアイソフォームの内因性の発現比は、それらの翻訳を支配するコザック配列の相対的な強さまたは弱さをモジュレートすることによって近づけられ得る。

【0041】

本明細書において使用するとき、コザック配列とは、スタート／開始コドン（すなわち、翻訳開始部位）の上流にある、その下流にある、およびそれを包含するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を指す。コザック配列は、リボソームによって翻訳開始部位として認識される。公知のコザックコンセンサス配列（例えば、ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ（配列番号２４）の）からの配列変動（例えば、天然のおよび／または人工の改変による）は、開始の強さを変更し得（図３Ｃコザックコンセンサス配列を参照されたい）、下線が引かれたヌクレオチドはスタート／開始コドンを示し、大文字は、高度に保存された塩基を示し、Ｒは、保存されたプリン（最も一般的にはアデニン）を示し、小文字は、共通の、しかし可変の塩基を示す。公知のコンセンサスコザック配列は、数多くのヒトｍＲＮＡに基づく各箇所における最も一般的なヌクレオチドを代表するコンセンサスであり；個々の遺伝子および／またはオープンリーディングフレームの天然／野生型コザック配列は変動し得る。当技術分野において公知のように、ＤＮＡ配列におけるチミジン（Ｔ）ヌクレオチドは、対応するｍＲＮＡにおけるウリジン（Ｕ）ヌクレオチドに対応する（例えば、それとして転写される）（例えば、ＤＮＡ ＡＴＧ開始コドンは、ｍＲＮＡ ＡＵＧに対応する、等）。本明細書に開示される任意の配列は、ＤＮＡおよびＲＮＡに対するそれぞれＴおよびＵの両方としての開示と見なされる。

【0042】

本明細書において使用するとき、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）による細胞の「形質導入」は、ウイルスベクターへの核酸の組み入れ、およびそれに続くウイルスベクターを介した細胞内への移入による、細胞内へのベクターの進入および細胞内への遺伝物質の移入を意味する。

【0043】

別途示されない限り、「効率的な形質導入」または「効率的な向性」または同様の用語は、適切な陽性または陰性対照を参照することによって判定され得る（例えば、陽性対照の形質導入もしくは向性のそれぞれ少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれを上回る割合、または陰性対照の形質導入もしくは向性のそれぞれ少なくとも約１１０％、１２０％、１５０％、２００％、３００％、５００％、１０００％、もしくはそれを上回る割合）。

【0044】

同様に、適切な対照を参照することによって、ウイルスが、標的組織に対して「効率的に形質導入しない」または「効率的な向性を有しない」、または同様の用語かどうかが判定され得る。特定の実施形態において、ウイルスベクターは、ＣＮＳの外側の組織、例えば肝臓、腎臓、生殖腺、および／または生殖細胞に効率的に形質導入しない（すなわち、それらに対する効率的な向性を有しない）。特定の実施形態において、組織（例えば、肝臓）の望ましくない形質導入は、所望の標的組織（例えば、ＣＮＳ細胞）の形質導入のレベルの２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下である。

【0045】

「５’部分」および「３’部分」という用語は、２つ以上のエレメント間の空間的関係性を規定する相対的用語である。ゆえに、例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、別のセグメントの下流にある、ポリヌクレオチドのセグメントを示す。「３’部分」という用語は、セグメントが必ずポリヌクレオチドの３’末端にあること、またはさらに、それが必ずポリヌクレオチドの３’半分にあることを示すことを意図されるわけではないが、とはいえそれはあり得る。同じように、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、別のセグメントの上流にある、ポリヌクレオチドのセグメントを示す。「５’部分」という用語は、セグメントが必ずポリヌクレオチドの５’末端にあること、またはさらに、それが必ずポリヌクレオチドの５’半分にあることを示すことを意図されるわけではないが、とはいえそれはあり得る。

【0046】

本明細書において使用するとき、「ポリペプチド」という用語は、別途示されない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

【0047】

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、または「ヌクレオチド配列」とは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）のものであり得るが、好ましくは一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。

【0048】

「調節エレメント」という用語は、核酸配列の発現の一部の態様を制御する遺伝子エレメントを指す。例えば、プロモーターとは、作動可能に連結されたコード領域の転写の開始を促す調節エレメントである。他の調節エレメントは、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル等である。１つまたは複数の調節エレメントが見出される、核酸配列またはポリヌクレオチドにおける領域は、「調節領域」と称され得る。

【0049】

核酸に関して本明細書において使用するとき、「作動可能に連結され」という用語は、２つ以上の核酸間での機能的連結を指す。例えば、プロモーター配列は異種核酸配列の転写を開始しかつ／または媒介するため、プロモーター配列は、異種核酸配列に「作動可能に連結され」ていると記載され得る。一部の実施形態において、作動可能に連結された核酸配列は連続しておりかつ／または同じリーディングフレームにある。

【0050】

本明細書において使用される「オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）」という用語は、ポリペプチドをコードし、ポリペプチドの転写を開始する開始スタート部位（すなわち、コザック配列）を含む、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）の部分を指す。「コード領域」という用語は、オープンリーディングフレームと互換可能に使用され得る。

【0051】

本明細書において使用される「コドン最適化された」という用語は、コード配列に（例えばＵＢＥ３Ａに対するコード配列を含めた、例えば野生型配列に）通常存在する１つまたは複数のコドンを、同じアミノ酸に対するコドンと置換することによって、発現を増加させるように最適化されている遺伝子コード配列を指す。これは同義コドンと称される。このようにして、遺伝子によってコードされるタンパク質は同一であるが、遺伝子または対応するｍＲＮＡの根本的な核酸塩基配列は異なる。一部の実施形態において、最適化は、１つまたは複数のレアコドン（つまり、特定の種由来の細胞において相対的に低頻度に存在する、ｔＲＮＡに対するコドン）を、より高頻度に存在する同義コドンと置換して、翻訳の効率を向上させる。例えば、ヒトコドン最適化において、コード配列における１つまたは複数のコドンは、同じアミノ酸に対する、ヒト細胞においてより高頻度に存在するコドンによって置き換えられる。コドン最適化は、転写および／または翻訳の効率を向上させ得る他のメカニズムを通じても遺伝子発現を増加させ得る。ストラテジーは、限定されることなく、総ＧＣ含有量（つまり、コード配列全体におけるグアニンおよびシトシンのパーセント）を増加させること、ＣｐＧ含有量（つまり、コード配列におけるＣＧまたはＧＣジヌクレオチドの数）を減少させること、隠れたスプライスドナーもしくはアクセプター部位を除去すること、ならびに／またはコザック配列等のリボソーム進入および／もしくは開始部位を付加することもしくは除去することを含む。望ましくは、コドン最適化された遺伝子は、タンパク質発現の向上を呈し、例えばコードされたタンパク質は、それによって、その他の点では同様の細胞における野生型遺伝子によって提供されるタンパク質の発現のレベルと比較して、細胞における検出可能なほどにより高いレベルで発現される。コドン最適化は、インビトロまたはインビボで、コドン最適化された遺伝子および／または対応するｍＲＮＡと、内因性遺伝子および／または対応するｍＲＮＡとを識別する能力も提供する。

【0052】

本明細書において使用される「配列同一性」という用語は、当技術分野における標準的な意味を有する。当技術分野において公知であるように、いくつかの異なるプログラムを使用して、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、既知の配列との配列同一性または類似性を有するかどうかを同定し得る。配列同一性または類似性は、これらに限定されないが、好ましくは初期設定を使用した、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズムによるもの、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性の検索法によるもの、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行によるもの（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＧｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）によって記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、または点検によるものを含めた、当技術分野において公知の標準的技法を使用して判定され得る。

【0053】

有用なアルゴリズムの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、漸進的ペアワイズアラインメントを使用して、関連配列の群から複数の配列アラインメントを創出する。それはまた、アラインメントを創出するために使用されるクラスタリング関係性を示すツリーをプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）の漸進的アラインメント法の簡略化を使用し；該方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１（１９８９）によって記載されるものと同様である。

【0054】

有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３（１９９３）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２はいくつかの検索パラメーターを使用し、それは好ましくは初期設定値に設定される。パラメーターは動的な値であり、特定の配列の組成、および目的の配列が検索されている特定のデータベースの組成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；しかしながら、値を調整して感度を増加させ得る。

【0055】

付加的な有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）によって報告されるギャップ付きＢＬＡＳＴである。

【0056】

アミノ酸配列同一性パーセンテージ値は、アラインされた領域における「より長い」配列の残基の総数によって割られた、マッチしている同一の残基の数によって判定される。「より長い」配列とは、アラインされた領域における最も現実的な残基を有するものである（アラインメントスコアを最大限に高めるためにＷＵ－Ｂｌａｓｔ－２によって導入されたギャップは無視される）。

【0057】

同様の様式で、核酸配列同一性パーセントは、本明細書に具体的に開示されるポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドと同一である、候補配列におけるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。

【0058】

アラインメントは、アラインされる対象となる配列におけるギャップの導入を含み得る。加えて、本明細書に具体的に開示されるポリヌクレオチドよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含有する配列に関しては、１つの実施形態において、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの総数との関連で同一のヌクレオチドの数に基づいて判定されるであろうと理解される。ゆえに、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、１つの実施形態において、より短い配列におけるヌクレオチドの数を使用して判定されるであろう。同一性パーセント算出において、相対的加重は、挿入、欠失、置換等の配列変動の様々な現れには割り当てられない。

【0059】

１つの実施形態において、同一性のみがプラスに（＋１）採点され、ギャップを含めた配列変動のすべての形態は、「０」の値を割り当てられ、これは、配列類似性算出に関して以下に記載される加重尺度またはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、マッチしている同一の残基の数を、アラインされた領域における「より短い」配列の残基の総数によって割り、１００をかけることによって算出され得る。「より長い」配列とは、アラインされた領域における最も現実的な残基を有するものである

【0060】

本明細書において使用するとき、「単離された」核酸またはヌクレオチド配列（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）とは、天然に存在する生物もしくはウイルスの他の構成要素、例えば細胞もしくはウイルスの構造的構成要素の少なくとも一部から、または該核酸もしくはヌクレオチド配列と結び付いて一般に見出される他のポリペプチドもしくは核酸から分離されたまたはそれを実質的に含んでいない核酸またはヌクレオチド配列を意味する。

【0061】

同じように、「単離された」ポリペプチドとは、天然に存在する生物もしくはウイルスの他の構成要素、例えば細胞もしくはウイルスの構造的構成要素の少なくとも一部から、または該ポリペプチドと結び付いて一般に見出される他のポリペプチドもしくは核酸から分離されているまたはそれを実質的に含んでいないポリペプチドを意味する。

【0062】

本明細書において使用するとき、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に適用される「改変された」という用語は、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはその任意の組み合わせに起因して、野生型配列とは異なる配列を指す。

【0063】

本明細書において使用するとき、ウイルスベクターを「単離する」（または文法的等価物）によって、ウイルスベクターが、スタート材料における他の構成要素の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。

【0064】

「治療する」、「治療すること」、または「の治療」という用語（または文法的に等価の用語）によって、対象の状態の重症度を低下させることまたは少なくとも部分的に寛解させるもしくは改善すること、および／あるいは少なくとも１つの臨床症状を緩和する、軽減する、または減少させること、および／あるいは状態の進行を遅延させることを意味する。

【0065】

本明細書において使用するとき、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｓ）」、または「予防」という用語（およびその文法的等価物）は、疾患の発生を遅延させるまたは阻害することを意味する。該用語は、疾患の完全な廃絶を要することを意図されず、病状の出現を低下させるまたは病状の発生を遅延させる任意のタイプの予防的治療を包含する。

【0066】

本明細書において使用される「治療有効」量とは、対象に何らかの向上または利益を提供するのに十分である量である。代替的に述べると、「治療有効」量とは、対象における少なくとも１つの臨床症状における何らかの緩和、軽減、減少、または安定化を提供するであろう量である。当業者であれば、何らかの利益が対象に提供される限りにおいて、治療効果が完全であるまたは治癒的である必要はないことを解するであろう。

【0067】

本明細書において使用される「予防有効」量とは、本発明の方法の非存在下において生じるであろうものと比べて、対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発生を予防止するおよび／もしくは遅延させる、ならびに／または対象における疾患、障害、および／もしくは臨床症状の発生の重症度を低下させるおよび／もしくは遅延させるのに十分である量である。当業者であれば、何らかの利益が対象に提供される限りにおいて、予防のレベルが完全である必要はないことを解するであろう。

【0068】

核酸配列またはタンパク質を記載するために使用される「異種の」という用語は、核酸配列またはタンパク質が、それが発現される宿主細胞または対象とは異なる生物、または同じ生物の異なる種に由来したことを意味する。タンパク質、またはプラスミド、発現カセットまたはベクターにおける核酸に関して使用される場合の「異種の」という用語は、問題のタンパク質または核酸が本来はそれとの関係で見出されない別の配列または部分配列とともに該タンパク質または核酸が存在することを示す。典型的に、異種核酸は、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含みかつ／または非翻訳ＲＮＡを含む、目的の核酸であり、そのそれぞれが本明細書において「導入遺伝子」と称され得る。目的の核酸は、治療的ポリペプチドもしくは治療的ＲＮＡ、または診断的ポリペプチドもしくは診断的ＲＮＡをコードし得る。目的の核酸／異種核酸は、しばしば発現カセットという状況下にある。

【0069】

該用語が本明細書において使用されるように、「発現カセット」は、適当な調節エレメント配列（調節エレメント）、例えば転写／翻訳制御シグナル、複製の起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサー等と作動可能に連結された／結び付いた目的の核酸を含む。本発明の一部の実施形態において、発現カセットは、目的の核酸に作動可能に連結されたプロモーター（例えば、真核の）、および任意で（真核の）転写終結配列を含む。典型的に、発現カセットは、ベクターという状況下にある（例えば、ベクター配列と隣接している）。ウイルスベクターの状況下にある場合、それは、典型的に、ウイルスベクターのためのウイルスパッケージングシグナルと隣接している。例えば、ＡＡＶウイルスベクターに関して、パッケージングシグナルは、発現カセットに近接して位置する少なくとも１つの逆位末端反復であり、任意で５’逆位末端反復（ＩＴＲ）および３’ＩＴＲは発現カセットに隣接する。

【0070】

「ベクター」とは、それが複製され得かつ／または発現され得る、別の細胞内に外来遺伝物質を運ぶビヒクルとして使用される化合物を指す。外来核酸を含有するクローニングベクターは、組み換えベクターと称される。核酸ベクターの例は、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体である。組み換えベクターは、典型的に、複製の起点、マルチクローニングサイト、および選択可能なマーカーを含有する。核酸配列は、典型的に、インサート（組み換え核酸または導入遺伝子）、およびベクターの「骨格」として働くより大きな配列からなる。別の細胞に遺伝情報を移入するベクターの目的は、典型的に、標的細胞においてインサートを単離する、増やす、または発現させることである。発現ベクター（発現構築物）は、標的細胞における外因性遺伝子の発現のためのものであり、一般的に、外因性遺伝子／ＯＲＦの発現を推進するプロモーター配列を有する。標的細胞内へのベクターの挿入は、細菌細胞および真核細胞に対して形質転換またはトランスフェクションと称されるが、とはいえウイルスベクターの挿入はしばしば形質導入と呼ばれる。「ベクター」という用語は、これらに限定されないが、形質転換された細胞またはナノ粒子等、別の細胞内に外来遺伝物質を運ぶ働きをする物品を記載するためにも一般的に使用され得る。

【0071】

本明細書において使用するとき、具体的な実施形態における「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」という用語（および同様の用語）は、概して、核酸送達ビヒクルとして機能する、およびビリオン内にパッケージされたウイルス核酸（すなわち、ベクターゲノム）を含む、ウイルス粒子を指す。本発明に従ったウイルスベクターは、本発明に従ったキメラＡＡＶカプシドを含み、ＡＡＶもしくはｒＡＡＶゲノム、またはウイルス核酸を含めた他の任意の核酸をパッケージし得る。代替的に、一部の文脈において、「ベクター」、「ウイルスベクター」、「送達ベクター」という用語（および同様の用語）は、ビリオンの非存在下におけるベクターゲノム（例えば、ｖＤＮＡ）、および／またはカプシドにつながれたもしくはカプシド内にパッケージされた分子を送達する輸送体として作用するウイルスカプシドを指すために使用され得る。

【0072】

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際公開ＷＯ０１／９２５５１（その開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載される二重鎖パルボウイルス粒子であり得る。ゆえに、一部の実施形態において、二本鎖（二重鎖）ゲノムがパッケージされ得る。

【0073】

「組み換えＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」とは、少なくとも１つの逆位末端反復（例えば、１、２、または３つの逆位末端反復）および１つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含む、ＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般的に、１４５塩基の末端反復（ＴＲ）をシスに保持してウイルスを作出するが；しかしながら、部分的にまたは完全に合成の配列を含む改変ＡＡＶ ＴＲおよび非ＡＡＶ ＴＲも、この目的を果たし得る。他のすべてのウイルス配列は非必須であり、トランスに供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。ｒＡＡＶベクターは、任意で２つのＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＴＲ）を含み、それは、一般的に、異種ヌクレオチド配列の５’および３’末端にあるであろうが、それと連続している必要はない。ＴＲは、同じであり得るまたは互いと異なり得る。ベクターゲノムは、その３’または５’末端に単一のＩＴＲも含有し得る。

【0074】

「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、ヘアピン構造を形成しかつ逆位末端反復（ＩＴＲ）として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキュー等の所望の機能を媒介する）任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲ（本明細書においてＡＡＶ ＩＴＲと称される）または非ＡＡＶ ＴＲであり得る。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもの等の非ＡＡＶ ＴＲ（本明細書において非ＡＡＶ ＩＴＲと称される）配列、またはＳＶ４０複製の起点として働くＳＶ４０ヘアピンは、ＴＲとして使用され得、それは、切断、置換、欠失、挿入、および／または付加によってさらに改変され得る。さらには、ＴＲ（ＩＴＲ）は、Ｓａｍｕｌｓｋｉらへの米国特許第５，４７８，７４５号に記載される「ダブル－Ｄ配列」等、部分的にまたは完全に合成であり得る。

【0075】

パルボウイルスゲノムは、それらの５’および３’末端の両方に回文配列を有する。配列の回文性質は、相補的塩基対間での水素結合の形成によって安定化されるヘアピン構造の形成につながる。このヘアピン構造は、「Ｙ」または「Ｔ」の形状を取ると思われる。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。

【0076】

「ＡＡＶ逆位末端反復」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、これらに限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または現在公知のもしくは後に発見される他の任意のＡＡＶを含めた、任意のＡＡＶ血清型または単離株由来のものであり得る（例えば、表１を参照されたい）。ＩＴＲが所望の機能、例えば複製、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキュー等を媒介する限りにおいて、ＡＡＶ ＩＴＲは天然ＩＴＲを有する必要はない（例えば、天然ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、切断、および／またはミスセンス変異によって変更され得る）。

【0077】

「ｒＡＡＶ粒子」および「ｒＡＡＶビリオン」という用語は、本明細書で互換可能に使用される。「ｒＡＡＶ粒子」または「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶカプシド内にパッケージされたｒＡＡＶベクターゲノムを含む。

【0078】

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載される、「標的化」ウイルスベクター（例えば、指向性の向性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＩＴＲおよびウイルスカプシドが、異なるパルボウイルス由来のものである）であり得る。

【0079】

さらには、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失、および／または置換を含めた他の改変を含有し得る。

【0080】

本明細書において使用するとき、「アミノ酸」という用語は、任意の天然に存在するアミノ酸、その改変された形態、および天然に存在しないアミノ酸の含めた合成アミノ酸を包含する。

【0081】

天然に存在する左旋性（Ｌ－）アミノ酸が、表２に示されている。

【0082】

【0083】

代替的に、アミノ酸は、修飾アミノ酸残基であり得る（非限定的な例が、表３に示されている）、または翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化、または硫酸化（ｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ））によって改変されているアミノ酸であり得る。

【0084】

【0085】

さらには、天然に存在しないアミノ酸は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５－４９によって記載される「非天然」アミノ酸であり得る。これらの非天然アミノ酸を有利に使用して、目的の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結し得る。

【0086】

「鋳型」または「基質」という用語は、本明細書において、パルボウイルスウイルスＤＮＡを産生するために複製され得るポリヌクレオチド配列を指すために使用される。ベクター産生の目的のために、鋳型は、典型的に、プラスミド、裸のＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクター等）を含むがこれらには限定されない、より大きなヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれるであろう。代替的に、鋳型は、パッケージング細胞の染色体に安定に組み入れられ得る。

【0087】

本明細書において使用するとき、パルボウイルスまたはＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」とは、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の産生を媒介するパルボウイルスまたはＡＡＶ非構造タンパク質をコードする核酸配列を示す。パルボウイルスおよびＡＡＶ複製遺伝子およびタンパク質は、例えばＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。

【0088】

「Ｒｅｐコード配列」は、パルボウイルスまたはＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のすべてをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関して、Ｒｅｐコード配列は、４つすべてのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）をコードする必要はなく、実際、ＡＡＶ５は、スプライスされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質のみを発現すると思われる。代表的な実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、ウイルスゲノム複製および新たなビリオン内へのパッケージングに必要である少なくともそれらの複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般的に、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１つの小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードするであろう。特定の実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質、ならびにＡＡＶ Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８、ならびにＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。なおさらなる実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、またはＲｅｐ７８およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする。

【0089】

本明細書において使用するとき、「大きなＲｅｐタンパク質」という用語は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。特許請求される発明の大きなＲｅｐタンパク質は、野生型または合成のいずれかであり得る。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、これらに限定されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１３、または現在公知のもしくは後に発見される他の任意のＡＡＶを含めた、任意のパルボウイルスまたはＡＡＶ由来のものであり得る（例えば、表１を参照されたい）。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、切断、および／またはミスセンス変異によって変更され得る。

【0090】

当業者であれば、複製タンパク質は、同じポリヌクレオチドによってコードされる必要はないことをさらに解するであろう。例えば、ＭＶＭに関して、ＮＳ－１およびＮＳ－２タンパク質（スプライスバリアントである）は、互いと無関係に発現され得る。同じように、ＡＡＶに関して、ｐ１９プロモーターは不活性化され得、大きなＲｅｐタンパク質は１つのポリヌクレオチドから発現され、小さなＲｅｐタンパク質は異なるポリヌクレオチドから発現される。しかしながら、典型的に、単一の構築物から複製タンパク質を発現させることがより好都合であろう。一部のシステムにおいて、ウイルスプロモーター（例えば、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター）は細胞によって認識され得ず、それゆえ、別個の発現カセットから大きなおよび小さなＲｅｐタンパク質を発現させる必要がある。他の場合には、大きなＲｅｐおよび小さなＲｅｐタンパク質を別個に、すなわち別個の転写および／または翻訳制御エレメントの制御下で発現させることが望ましくあり得る。例えば、小さなＲｅｐタンパク質に対する大きなＲｅｐタンパク質の比を減少させるように、大きなＲｅｐタンパク質の発現を制御することが望ましくあり得る。昆虫細胞の場合には、大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）の発現を下方調節して、細胞への毒性を回避することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５を参照されたい）。

【0091】

本明細書において使用するとき、パルボウイルスまたはＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能的パルボウイルスまたはＡＡＶカプシド（すなわち、ＤＮＡをパッケージし得かつ標的細胞に感染し得る）を形成する構造タンパク質をコードする。典型的に、ｃａｐコード配列は、パルボウイルスまたはＡＡＶカプシドサブユニットのすべてをコードするであろうが、機能的カプシドが産生される限りにおいて、すべてに満たないカプシドサブユニットがコードされ得る。典型的に、しかし必ずではなく、ｃａｐコード配列は、単一の核酸分子上に存在するであろう。

【0092】

自律性パルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に記載される。

【0093】

特性を「実質的に保持する」によって、特性（例えば、活性または他の測定可能な特徴）の少なくとも約７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％が保持されることを意味する。

【0094】

ＵＢＥ３Ａ発現カセットおよびベクター
本発明は、ＵＢＥ３Ａタンパク質（Ｅ６ＡＰユビキチンタンパク質リガーゼ（Ｅ６ＡＰ）としても知られる）の治療レベルの細胞内（例えば、非分泌性）発現を提供するＵＢＥ３Ａ発現カセットの設計、ＵＢＥ３Ａ遺伝子によってコードされる酵素、および対象における治療レベルのＵＢＥ３Ａ／Ｅ６ＡＰを達成するための発現カセットの使用に関する。

【0095】

ゆえに、本発明の１つの態様は、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドに関する。オープンリーディングフレームは、ＵＢＥ３Ａ／Ｅ６ＡＰをコードするＵＢＥ３Ａ遺伝子の一部分である。一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームであり得る。ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、同じリーディングフレームにおけるヒトＵＢＥ３Ａの１つまたは複数のアイソフォームをコードし得る。例えば、一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォーム（すなわち、ヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム１）および／またはヒトＵＢＥ３Ａの長いアイソフォーム（例えば、ヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム２および／または３）オープンリーディングフレームであり得る。一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム１およびアイソフォーム３オープンリーディングフレームであり得る。他の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム１およびアイソフォーム２オープンリーディングフレームであり得る。本明細書において使用するとき、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームとは、哺乳類ＵＢＥ３Ａ／Ｅ６ＡＰをコードするヌクレオチド配列を指し、例えばヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームとは、ヒトＵＢＥ３Ａ／Ｅ６ＡＰをコードするヌクレオチド配列を指す。機能に対して適当な場合、ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームという用語が、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよびヒトＵＢＥ３Ａの長いアイソフォームの両方をコードするオープンリーディングフレームを指すために本明細書において使用されるので、オープンリーディングフレームは、長いアイソフォームの発現に影響するコザック配列を包含する５’上流核酸配列を含む。そのようなオープンリーディングフレームは、図１３および図１４に示されている。
配列番号：１．野生型ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォーム（アイソフォーム１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＮＭ＿１３０８３８．３）
GCTGCCTGCCGGGATACTCGGCCCGCCCAGCCAGTCCTCCCGTCTTGCGCCGCGGCCGCGAGATCCGTGT
GTCTCCCAAGATGGTGGCGCTGGGCTCGGGGTGACTACAGGAGACGACGGGGCCTTTTCCCTTCGCCAGG
ACCCGACACACCAGGCTTCGCTCGCTCGCGCACCCCTCCGCCGCGTAGCCATCCGCCAGCGCGGGCGCCC
GCCATCCGCCGCCTACTTACGCTTCACCTCTGCCGACCCGGCGCGCTCGGCTGCGGGCGGCGGCGCCTCC
TTCGGCTCCTCCTCGGAATAGCTCGCGGCCTGTAGCCCCTGGCAGGAGGGCCCCTCAGCCCCCCGGTGTG
GACAGGCAGCGGCGGCTGGCGACGAACGCCGGGATTTCGGCGGCCCCGGCGCTCCCTTTCCCGGCCTCGT
TTTCCGGATAAGGAAGCGCGGGTCCCGCATGAGCCCCGGCGGTGGCGGCAGCGAAAGAGAACGAGGCGGT
GGCGGGCGGAGGCGGCGGGCGAGGGCGACTACGACCAGTGAGGCGGCCGCCGCAGCCCAGGCGCGGGGGC
GACGACAGATCAGGAGAACCTCAGTCTGACGACATTGAAGCTAGCCGAATGAAGCGAGCAGCTGCAAAGC
ATCTAATAGAACGCTACTACCACCAGTTAACTGAGGGCTGTGGAAATGAAGCCTGCACGAATGAGTTTTG
TGCTTCCTGTCCAACTTTTCTTCGTATGGATAATAATGCAGCAGCTATTAAAGCCCTCGAGCTTTATAAG
ATTAATGCAAAACTCTGTGATCCTCATCCCTCCAAGAAAGGAGCAAGCTCAGCTTACCTTGAGAACTCGA
AAGGTGCCCCCAACAACTCCTGCTCTGAGATAAAAATGAACAAGAAAGGCGCTAGAATTGATTTTAAAGA
TGTGACTTACTTAACAGAAGAGAAGGTATATGAAATTCTTGAATTATGTAGAGAAAGAGAGGATTATTCC
CCTTTAATCCGTGTTATTGGAAGAGTTTTTTCTAGTGCTGAGGCATTGGTACAGAGCTTCCGGAAAGTTA
AACAACACACCAAGGAAGAACTGAAATCTCTTCAAGCAAAAGATGAAGACAAAGATGAAGATGAAAAGGA
AAAAGCTGCATGTTCTGCTGCTGCTATGGAAGAAGACTCAGAAGCATCTTCCTCAAGGATAGGTGATAGC
TCACAGGGAGACAACAATTTGCAAAAATTAGGCCCTGATGATGTGTCTGTGGATATTGATGCCATTAGAA
GGGTCTACACCAGATTGCTCTCTAATGAAAAAATTGAAACTGCCTTTCTCAATGCACTTGTATATTTGTC
ACCTAACGTGGAATGTGACTTGACGTATCACAATGTATACTCTCGAGATCCTAATTATCTGAATTTGTTC
ATTATCGTAATGGAGAATAGAAATCTCCACAGTCCTGAATATCTGGAAATGGCTTTGCCATTATTTTGCA
AAGCGATGAGCAAGCTACCCCTTGCAGCCCAAGGAAAACTGATCAGACTGTGGTCTAAATACAATGCAGA
CCAGATTCGGAGAATGATGGAGACATTTCAGCAACTTATTACTTATAAAGTCATAAGCAATGAATTTAAC
AGTCGAAATCTAGTGAATGATGATGATGCCATTGTTGCTGCTTCGAAGTGCTTGAAAATGGTTTACTATG
CAAATGTAGTGGGAGGGGAAGTGGACACAAATCACAATGAAGAAGATGATGAAGAGCCCATCCCTGAGTC
CAGCGAGCTGACACTTCAGGAACTTTTGGGAGAAGAAAGAAGAAACAAGAAAGGTCCTCGAGTGGACCCC
CTGGAAACTGAACTTGGTGTTAAAACCCTGGATTGTCGAAAACCACTTATCCCTTTTGAAGAGTTTATTA
ATGAACCACTGAATGAGGTTCTAGAAATGGATAAAGATTATACTTTTTTCAAAGTAGAAACAGAGAACAA
ATTCTCTTTTATGACATGTCCCTTTATATTGAATGCTGTCACAAAGAATTTGGGATTATATTATGACAAT
AGAATTCGCATGTACAGTGAACGAAGAATCACTGTTCTCTACAGCTTAGTTCAAGGACAGCAGTTGAATC
CATATTTGAGACTCAAAGTTAGACGTGACCATATCATAGATGATGCACTTGTCCGGCTAGAGATGATCGC
TATGGAAAATCCTGCAGACTTGAAGAAGCAGTTGTATGTGGAATTTGAAGGAGAACAAGGAGTTGATGAG
GGAGGTGTTTCCAAAGAATTTTTTCAGCTGGTTGTGGAGGAAATCTTCAATCCAGATATTGGTATGTTCA
CATACGATGAATCTACAAAATTGTTTTGGTTTAATCCATCTTCTTTTGAAACTGAGGGTCAGTTTACTCT
GATTGGCATAGTACTGGGTCTGGCTATTTACAATAACTGTATACTGGATGTACATTTTCCCATGGTTGTC
TACAGGAAGCTAATGGGGAAAAAAGGAACTTTTCGTGACTTGGGAGACTCTCACCCAGTTCTATATCAGA
GTTTAAAAGATTTATTGGAGTATGAAGGGAATGTGGAAGATGACATGATGATCACTTTCCAGATATCACA
GACAGATCTTTTTGGTAACCCAATGATGTATGATCTAAAGGAAAATGGTGATAAAATTCCAATTACAAAT
GAAAACAGGAAGGAATTTGTCAATCTTTATTCTGACTACATTCTCAATAAATCAGTAGAAAAACAGTTCA
AGGCTTTTCGGAGAGGTTTTCATATGGTGACCAATGAATCTCCCTTAAAGTACTTATTCAGACCAGAAGA
AATTGAATTGCTTATATGTGGAAGCCGGAATCTAGATTTCCAAGCACTAGAAGAAACTACAGAATATGAC
GGTGGCTATACCAGGGACTCTGTTCTGATTAGGGAGTTCTGGGAAATCGTTCATTCATTTACAGATGAAC
AGAAAAGACTCTTCTTGCAGTTTACAACGGGCACAGACAGAGCACCTGTGGGAGGACTAGGAAAATTAAA
GATGATTATAGCCAAAAATGGCCCAGACACAGAAAGGTTACCTACATCTCATACTTGCTTTAATGTGCTT
TTACTTCCGGAATACTCAAGCAAAGAAAAACTTAAAGAGAGATTGTTGAAGGCCATCACGTATGCCAAAG
GATTTGGCATGCTGTAAAACAAAACAAAACAAAATAAAACAAAAAAAAGGAAGGAAAAAAAAAGAAAAAA
TTTAAAAAATTTTAAAAATATAACGAGGGATAAATTTTTGGTGGTGATAGTGTCCCAGTACAAAAAGGCT
GTAAGATAGTCAACCACAGTAGTCACCTATGTCTGTGCCTCCCTTCTTTATTGGGGACATGTGGGCTGGA
ACAGCAGATTTCAGCTACATATATGAACAAATCCTTTATTATTATTATAATTATTTTTTTGCGTGAAAGT
GTTACATATTCTTTCACTTGTATGTACAGAGAGGTTTTTCTGAATATTTATTTTAAGGGTTAAATCACTT
TTGCTTGTGTTTATTACTGCTTGAGGTTGAGCCTTTTGAGTATTTAAAAAATATATACCAACAGAACTAC
TCTCCCAAGGAAAATATTGCCACCATTTGTAGACCACGTAACCTTCAAGTATGTGCTACTTTTTTGTCCC
TGTATCTAACTCAAATCAGGAACTGTATTTTTTTTAATGATTTGCTTTTGAAACTTGAAGTCTTGAAAAC
AGTGTGATGCAATTACTGCTGTTCTAGCCCCCAAAGAGTTTTCTGTGCAAAATCTTGAGAATCAATCAAT
AAAGAAAGATGGAAGGAAGGGAGAAATTGGAATGTTTTAACTGCAGCCCTCAGAACTTTAGTAACAGCAC
AACAAATTAAAAACAAAAACAACTCATGCCACAGTATGTCGTCTTCATGTGTCTTGCAATGAACTGTTTC
AGTAGCCAATCCTCTTTCTTAGTATATGAAAGGACAGGGATTTTTGTTCTTGTTGTTCTCGTTGTTGTTT
TAAGTTTACTGGGGAAAGTGCATTTGGCCAAATGAAATGGTAGTCAAGCCTATTGCAACAAAGTTAGGAA
GTTTGTTGTTTGTTTATTATAAACAAAAAGCATGTGAAAGTGCACTTAAGATAGAGTTTTTATTAATTAC
TTACTTATTACCTAGATTTTAAATAGACAATCCAAAGTCTCCCCTTCGTGTTGCCATCATCTTGTTGAAT
CAGCCATTTTATCGAGGCACGTGATCAGTGTTGCAACATAATGAAAAAGATGGCTACTGTGCCTTGTGTT
ACTTAATCATACAGTAAGCTGACCTGGAAATGAATGAAACTATTACTCCTAAGAATTACATTGTATAGCC
CCACAGATTAAATTTAATTAATTAATTCAAAACATGTTAAACGTTACTTTCATGTACTATGGAAAAGTAC
AAGTAGGTTTACATTACTGATTTCCAGAAGTAAGTAGTTTCCCCTTTCCTAGTCTTCTGTGTATGTGATG
TTGTTAATTTCTTTTATTGCATTATAAAATAAAAGGATTATGTATTTTTAACTAAGGTGAGACATTGATA
TATCCTTTTGCTACAAGCTATAGCTAATGTGCTGAGCTTGTGCCTTGGTGATTGATTGATTGATTGACTG
ATTGTTTTAACTGATTACTGTAGATCAACCTGATGATTTGTTTGTTTGAAATTGGCAGGAAAAATGCAGC
TTTCAAATCATTGGGGGGAGAAAAAGGATGTCTTTCAGGATTATTTTAATTAATTTTTTTCATAATTGAG
ACAGAACTGTTTGTTATGTACCATAATGCTAAATAAAACTGTGGCACTTTTCACCATAATTTAATTTAGT
GGAAAAAGAAGACAATGCTTTCCATATTGTGATAAGGTAACATGGGGTTTTTCTGGGCCAGCCTTTAGAA
CACTGTTAGGGTACATACGCTACCTTGATGAAAGGGACCTTCGTGCAACTGTAGTCATCTTAAAGGCTTC
TCATCCACTGTGCTTCTTAATGTGTAATTAAAGTGAGGAGAAATTAAATACTCTGAGGGCGTTTTATATA
ATAAATTCGTGAAGAAATGTGTGCTCTTCA
配列番号：２．野生型ヒトＵＢＥ３Ａの長いアイソフォーム（アイソフォーム２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＮＭ＿０００４６２．５）
GCTGCCTGCCGGGATACTCGGCCCGCCCAGCCAGTCCTCCCGTCTTGCGCCGCGGCCGCGAGATCCGTGT
GTCTCCCAAGATGGTGGCGCTGGGCTCGGGGTGACTACAGGAGACGACGGGGCCTTTTCCCTTCGCCAGG
ACCCGACACACCAGGCTTCGCTCGCTCGCGCACCCCTCCGCCGCGTAGCCATCCGCCAGCGCGGGCGCCC
GCCATCCGCCGCCTACTTACGCTTCACCTCTGCCGACCCGGCGCGCTCGGCTGCGGGCGGCGGCGCCTCC
TTCGGCTCCTCCTCGGAATAGCTCGCGGCCTGTAGCCCCTGGCAGGAGGGCCCCTCAGCCCCCCGGTGTG
GACAGGCAGCGGCGGCTGGCGACGAACGCCGGGATTTCGGCGGCCCCGGCGCTCCCTTTCCCGGCCTCGT
TTTCCGGATAAGGAAGCGCGGGTCCCGCATGAGCCCCGGCGGTGGCGGCAGCGAAAGAGAACGAGGCGGT
GGCGGGCGGAGGCGGCGGGCGAGGGCGACTACGACCAGTGAGGCGGCCGCCGCAGCCCAGGCGCGGGGGC
GACGACAGGTTAAAAATCTGTAAGAGCCTGATTTTAGAATTCACCAGCTCCTCAGAAGTTTGGCGAAATA
TGAGTTATTAAGCCTACGCTCAGATCAAGGTAGCAGCTAGACTGGTGTGACAACCTGTTTTTAATCAGTG
ACTCAAAGCTGTGATCACCCTGATGTCACCGAATGGCCACAGCTTGTAAAAGAGAGTTACAGTGGAGGTA
AAAGGAGTGGCTTGCAGGATGGAGAAGCTGCACCAGTGTTATTGGAAATCAGGAGAACCTCAGTCTGACG
ACATTGAAGCTAGCCGAATGAAGCGAGCAGCTGCAAAGCATCTAATAGAACGCTACTACCACCAGTTAAC
TGAGGGCTGTGGAAATGAAGCCTGCACGAATGAGTTTTGTGCTTCCTGTCCAACTTTTCTTCGTATGGAT
AATAATGCAGCAGCTATTAAAGCCCTCGAGCTTTATAAGATTAATGCAAAACTCTGTGATCCTCATCCCT
CCAAGAAAGGAGCAAGCTCAGCTTACCTTGAGAACTCGAAAGGTGCCCCCAACAACTCCTGCTCTGAGAT
AAAAATGAACAAGAAAGGCGCTAGAATTGATTTTAAAGATGTGACTTACTTAACAGAAGAGAAGGTATAT
GAAATTCTTGAATTATGTAGAGAAAGAGAGGATTATTCCCCTTTAATCCGTGTTATTGGAAGAGTTTTTT
CTAGTGCTGAGGCATTGGTACAGAGCTTCCGGAAAGTTAAACAACACACCAAGGAAGAACTGAAATCTCT
TCAAGCAAAAGATGAAGACAAAGATGAAGATGAAAAGGAAAAAGCTGCATGTTCTGCTGCTGCTATGGAA
GAAGACTCAGAAGCATCTTCCTCAAGGATAGGTGATAGCTCACAGGGAGACAACAATTTGCAAAAATTAG
GCCCTGATGATGTGTCTGTGGATATTGATGCCATTAGAAGGGTCTACACCAGATTGCTCTCTAATGAAAA
AATTGAAACTGCCTTTCTCAATGCACTTGTATATTTGTCACCTAACGTGGAATGTGACTTGACGTATCAC
AATGTATACTCTCGAGATCCTAATTATCTGAATTTGTTCATTATCGTAATGGAGAATAGAAATCTCCACA
GTCCTGAATATCTGGAAATGGCTTTGCCATTATTTTGCAAAGCGATGAGCAAGCTACCCCTTGCAGCCCA
AGGAAAACTGATCAGACTGTGGTCTAAATACAATGCAGACCAGATTCGGAGAATGATGGAGACATTTCAG
CAACTTATTACTTATAAAGTCATAAGCAATGAATTTAACAGTCGAAATCTAGTGAATGATGATGATGCCA
TTGTTGCTGCTTCGAAGTGCTTGAAAATGGTTTACTATGCAAATGTAGTGGGAGGGGAAGTGGACACAAA
TCACAATGAAGAAGATGATGAAGAGCCCATCCCTGAGTCCAGCGAGCTGACACTTCAGGAACTTTTGGGA
GAAGAAAGAAGAAACAAGAAAGGTCCTCGAGTGGACCCCCTGGAAACTGAACTTGGTGTTAAAACCCTGG
ATTGTCGAAAACCACTTATCCCTTTTGAAGAGTTTATTAATGAACCACTGAATGAGGTTCTAGAAATGGA
TAAAGATTATACTTTTTTCAAAGTAGAAACAGAGAACAAATTCTCTTTTATGACATGTCCCTTTATATTG
AATGCTGTCACAAAGAATTTGGGATTATATTATGACAATAGAATTCGCATGTACAGTGAACGAAGAATCA
CTGTTCTCTACAGCTTAGTTCAAGGACAGCAGTTGAATCCATATTTGAGACTCAAAGTTAGACGTGACCA
TATCATAGATGATGCACTTGTCCGGCTAGAGATGATCGCTATGGAAAATCCTGCAGACTTGAAGAAGCAG
TTGTATGTGGAATTTGAAGGAGAACAAGGAGTTGATGAGGGAGGTGTTTCCAAAGAATTTTTTCAGCTGG
TTGTGGAGGAAATCTTCAATCCAGATATTGGTATGTTCACATACGATGAATCTACAAAATTGTTTTGGTT
TAATCCATCTTCTTTTGAAACTGAGGGTCAGTTTACTCTGATTGGCATAGTACTGGGTCTGGCTATTTAC
AATAACTGTATACTGGATGTACATTTTCCCATGGTTGTCTACAGGAAGCTAATGGGGAAAAAAGGAACTT
TTCGTGACTTGGGAGACTCTCACCCAGTTCTATATCAGAGTTTAAAAGATTTATTGGAGTATGAAGGGAA
TGTGGAAGATGACATGATGATCACTTTCCAGATATCACAGACAGATCTTTTTGGTAACCCAATGATGTAT
GATCTAAAGGAAAATGGTGATAAAATTCCAATTACAAATGAAAACAGGAAGGAATTTGTCAATCTTTATT
CTGACTACATTCTCAATAAATCAGTAGAAAAACAGTTCAAGGCTTTTCGGAGAGGTTTTCATATGGTGAC
CAATGAATCTCCCTTAAAGTACTTATTCAGACCAGAAGAAATTGAATTGCTTATATGTGGAAGCCGGAAT
CTAGATTTCCAAGCACTAGAAGAAACTACAGAATATGACGGTGGCTATACCAGGGACTCTGTTCTGATTA
GGGAGTTCTGGGAAATCGTTCATTCATTTACAGATGAACAGAAAAGACTCTTCTTGCAGTTTACAACGGG
CACAGACAGAGCACCTGTGGGAGGACTAGGAAAATTAAAGATGATTATAGCCAAAAATGGCCCAGACACA
GAAAGGTTACCTACATCTCATACTTGCTTTAATGTGCTTTTACTTCCGGAATACTCAAGCAAAGAAAAAC
TTAAAGAGAGATTGTTGAAGGCCATCACGTATGCCAAAGGATTTGGCATGCTGTAAAACAAAACAAAACA
AAATAAAACAAAAAAAAGGAAGGAAAAAAAAAGAAAAAATTTAAAAAATTTTAAAAATATAACGAGGGAT
AAATTTTTGGTGGTGATAGTGTCCCAGTACAAAAAGGCTGTAAGATAGTCAACCACAGTAGTCACCTATG
TCTGTGCCTCCCTTCTTTATTGGGGACATGTGGGCTGGAACAGCAGATTTCAGCTACATATATGAACAAA
TCCTTTATTATTATTATAATTATTTTTTTGCGTGAAAGTGTTACATATTCTTTCACTTGTATGTACAGAG
AGGTTTTTCTGAATATTTATTTTAAGGGTTAAATCACTTTTGCTTGTGTTTATTACTGCTTGAGGTTGAG
CCTTTTGAGTATTTAAAAAATATATACCAACAGAACTACTCTCCCAAGGAAAATATTGCCACCATTTGTA
GACCACGTAACCTTCAAGTATGTGCTACTTTTTTGTCCCTGTATCTAACTCAAATCAGGAACTGTATTTT
TTTTAATGATTTGCTTTTGAAACTTGAAGTCTTGAAAACAGTGTGATGCAATTACTGCTGTTCTAGCCCC
CAAAGAGTTTTCTGTGCAAAATCTTGAGAATCAATCAATAAAGAAAGATGGAAGGAAGGGAGAAATTGGA
ATGTTTTAACTGCAGCCCTCAGAACTTTAGTAACAGCACAACAAATTAAAAACAAAAACAACTCATGCCA
CAGTATGTCGTCTTCATGTGTCTTGCAATGAACTGTTTCAGTAGCCAATCCTCTTTCTTAGTATATGAAA
GGACAGGGATTTTTGTTCTTGTTGTTCTCGTTGTTGTTTTAAGTTTACTGGGGAAAGTGCATTTGGCCAA
ATGAAATGGTAGTCAAGCCTATTGCAACAAAGTTAGGAAGTTTGTTGTTTGTTTATTATAAACAAAAAGC
ATGTGAAAGTGCACTTAAGATAGAGTTTTTATTAATTACTTACTTATTACCTAGATTTTAAATAGACAAT
CCAAAGTCTCCCCTTCGTGTTGCCATCATCTTGTTGAATCAGCCATTTTATCGAGGCACGTGATCAGTGT
TGCAACATAATGAAAAAGATGGCTACTGTGCCTTGTGTTACTTAATCATACAGTAAGCTGACCTGGAAAT
GAATGAAACTATTACTCCTAAGAATTACATTGTATAGCCCCACAGATTAAATTTAATTAATTAATTCAAA
ACATGTTAAACGTTACTTTCATGTACTATGGAAAAGTACAAGTAGGTTTACATTACTGATTTCCAGAAGT
AAGTAGTTTCCCCTTTCCTAGTCTTCTGTGTATGTGATGTTGTTAATTTCTTTTATTGCATTATAAAATA
AAAGGATTATGTATTTTTAACTAAGGTGAGACATTGATATATCCTTTTGCTACAAGCTATAGCTAATGTG
CTGAGCTTGTGCCTTGGTGATTGATTGATTGATTGACTGATTGTTTTAACTGATTACTGTAGATCAACCT
GATGATTTGTTTGTTTGAAATTGGCAGGAAAAATGCAGCTTTCAAATCATTGGGGGGAGAAAAAGGATGT
CTTTCAGGATTATTTTAATTAATTTTTTTCATAATTGAGACAGAACTGTTTGTTATGTACCATAATGCTA
AATAAAACTGTGGCACTTTTCACCATAATTTAATTTAGTGGAAAAAGAAGACAATGCTTTCCATATTGTG
ATAAGGTAACATGGGGTTTTTCTGGGCCAGCCTTTAGAACACTGTTAGGGTACATACGCTACCTTGATGA
AAGGGACCTTCGTGCAACTGTAGTCATCTTAAAGGCTTCTCATCCACTGTGCTTCTTAATGTGTAATTAA
AGTGAGGAGAAATTAAATACTCTGAGGGCGTTTTATATAATAAATTCGTGAAGAAATGTGTGCTCTTCA
配列番号：３．野生型ヒトＵＢＥ３Ａの長いアイソフォーム（アイソフォーム３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション＃ＮＭ＿１３０８３９．４）
GCTGCCTGCCGGGATACTCGGCCCGCCCAGCCAGTCCTCCCGTCTTGCGCCGCGGCCGCGAGATCCGTGT
GTCTCCCAAGATGGTGGCGCTGGGCTCGGGGTGACTACAGGAGACGACGGGGCCTTTTCCCTTCGCCAGG
ACCCGACACACCAGGCTTCGCTCGCTCGCGCACCCCTCCGCCGCGTAGCCATCCGCCAGCGCGGGCGCCC
GCCATCCGCCGCCTACTTACGCTTCACCTCTGCCGACCCGGCGCGCTCGGCTGCGGGCGGCGGCGCCTCC
TTCGGCTCCTCCTCGGAATAGCTCGCGGCCTGTAGCCCCTGGCAGGAGGGCCCCTCAGCCCCCCGGTGTG
GACAGGCAGCGGCGGCTGGCGACGAACGCCGGGATTTCGGCGGCCCCGGCGCTCCCTTTCCCGGCCTCGT
TTTCCGGATAAGGAAGCGCGGGTCCCGCATGAGCCCCGGCGGTGGCGGCAGCGAAAGAGAACGAGGCGGT
GGCGGGCGGAGGCGGCGGGCGAGGGCGACTACGACCAGTGAGGCGGCCGCCGCAGCCCAGGCGCGGGGGC
GACGACAGGTTAAAAATCTGTAAGAGCCTGATTTTAGAATTCACCAGCTCCTCAGAAGTTTGGCGAAATA
TGAGTTATTAAGCCTACGCTCAGATCAAGGTAGCAGCTAGACTGGTGTGACAACCTGTTTTTAATCAGTG
ACTCAAAGCTGTGATCACCCTGATGTCACCGAATGGCCACAGCTTGTAAAAGATCAGGAGAACCTCAGTC
TGACGACATTGAAGCTAGCCGAATGAAGCGAGCAGCTGCAAAGCATCTAATAGAACGCTACTACCACCAG
TTAACTGAGGGCTGTGGAAATGAAGCCTGCACGAATGAGTTTTGTGCTTCCTGTCCAACTTTTCTTCGTA
TGGATAATAATGCAGCAGCTATTAAAGCCCTCGAGCTTTATAAGATTAATGCAAAACTCTGTGATCCTCA
TCCCTCCAAGAAAGGAGCAAGCTCAGCTTACCTTGAGAACTCGAAAGGTGCCCCCAACAACTCCTGCTCT
GAGATAAAAATGAACAAGAAAGGCGCTAGAATTGATTTTAAAGATGTGACTTACTTAACAGAAGAGAAGG
TATATGAAATTCTTGAATTATGTAGAGAAAGAGAGGATTATTCCCCTTTAATCCGTGTTATTGGAAGAGT
TTTTTCTAGTGCTGAGGCATTGGTACAGAGCTTCCGGAAAGTTAAACAACACACCAAGGAAGAACTGAAA
TCTCTTCAAGCAAAAGATGAAGACAAAGATGAAGATGAAAAGGAAAAAGCTGCATGTTCTGCTGCTGCTA
TGGAAGAAGACTCAGAAGCATCTTCCTCAAGGATAGGTGATAGCTCACAGGGAGACAACAATTTGCAAAA
ATTAGGCCCTGATGATGTGTCTGTGGATATTGATGCCATTAGAAGGGTCTACACCAGATTGCTCTCTAAT
GAAAAAATTGAAACTGCCTTTCTCAATGCACTTGTATATTTGTCACCTAACGTGGAATGTGACTTGACGT
ATCACAATGTATACTCTCGAGATCCTAATTATCTGAATTTGTTCATTATCGTAATGGAGAATAGAAATCT
CCACAGTCCTGAATATCTGGAAATGGCTTTGCCATTATTTTGCAAAGCGATGAGCAAGCTACCCCTTGCA
GCCCAAGGAAAACTGATCAGACTGTGGTCTAAATACAATGCAGACCAGATTCGGAGAATGATGGAGACAT
TTCAGCAACTTATTACTTATAAAGTCATAAGCAATGAATTTAACAGTCGAAATCTAGTGAATGATGATGA
TGCCATTGTTGCTGCTTCGAAGTGCTTGAAAATGGTTTACTATGCAAATGTAGTGGGAGGGGAAGTGGAC
ACAAATCACAATGAAGAAGATGATGAAGAGCCCATCCCTGAGTCCAGCGAGCTGACACTTCAGGAACTTT
TGGGAGAAGAAAGAAGAAACAAGAAAGGTCCTCGAGTGGACCCCCTGGAAACTGAACTTGGTGTTAAAAC
CCTGGATTGTCGAAAACCACTTATCCCTTTTGAAGAGTTTATTAATGAACCACTGAATGAGGTTCTAGAA
ATGGATAAAGATTATACTTTTTTCAAAGTAGAAACAGAGAACAAATTCTCTTTTATGACATGTCCCTTTA
TATTGAATGCTGTCACAAAGAATTTGGGATTATATTATGACAATAGAATTCGCATGTACAGTGAACGAAG
AATCACTGTTCTCTACAGCTTAGTTCAAGGACAGCAGTTGAATCCATATTTGAGACTCAAAGTTAGACGT
GACCATATCATAGATGATGCACTTGTCCGGCTAGAGATGATCGCTATGGAAAATCCTGCAGACTTGAAGA
AGCAGTTGTATGTGGAATTTGAAGGAGAACAAGGAGTTGATGAGGGAGGTGTTTCCAAAGAATTTTTTCA
GCTGGTTGTGGAGGAAATCTTCAATCCAGATATTGGTATGTTCACATACGATGAATCTACAAAATTGTTT
TGGTTTAATCCATCTTCTTTTGAAACTGAGGGTCAGTTTACTCTGATTGGCATAGTACTGGGTCTGGCTA
TTTACAATAACTGTATACTGGATGTACATTTTCCCATGGTTGTCTACAGGAAGCTAATGGGGAAAAAAGG
AACTTTTCGTGACTTGGGAGACTCTCACCCAGTTCTATATCAGAGTTTAAAAGATTTATTGGAGTATGAA
GGGAATGTGGAAGATGACATGATGATCACTTTCCAGATATCACAGACAGATCTTTTTGGTAACCCAATGA
TGTATGATCTAAAGGAAAATGGTGATAAAATTCCAATTACAAATGAAAACAGGAAGGAATTTGTCAATCT
TTATTCTGACTACATTCTCAATAAATCAGTAGAAAAACAGTTCAAGGCTTTTCGGAGAGGTTTTCATATG
GTGACCAATGAATCTCCCTTAAAGTACTTATTCAGACCAGAAGAAATTGAATTGCTTATATGTGGAAGCC
GGAATCTAGATTTCCAAGCACTAGAAGAAACTACAGAATATGACGGTGGCTATACCAGGGACTCTGTTCT
GATTAGGGAGTTCTGGGAAATCGTTCATTCATTTACAGATGAACAGAAAAGACTCTTCTTGCAGTTTACA
ACGGGCACAGACAGAGCACCTGTGGGAGGACTAGGAAAATTAAAGATGATTATAGCCAAAAATGGCCCAG
ACACAGAAAGGTTACCTACATCTCATACTTGCTTTAATGTGCTTTTACTTCCGGAATACTCAAGCAAAGA
AAAACTTAAAGAGAGATTGTTGAAGGCCATCACGTATGCCAAAGGATTTGGCATGCTGTAAAACAAAACA
AAACAAAATAAAACAAAAAAAAGGAAGGAAAAAAAAAGAAAAAATTTAAAAAATTTTAAAAATATAACGA
GGGATAAATTTTTGGTGGTGATAGTGTCCCAGTACAAAAAGGCTGTAAGATAGTCAACCACAGTAGTCAC
CTATGTCTGTGCCTCCCTTCTTTATTGGGGACATGTGGGCTGGAACAGCAGATTTCAGCTACATATATGA
ACAAATCCTTTATTATTATTATAATTATTTTTTTGCGTGAAAGTGTTACATATTCTTTCACTTGTATGTA
CAGAGAGGTTTTTCTGAATATTTATTTTAAGGGTTAAATCACTTTTGCTTGTGTTTATTACTGCTTGAGG
TTGAGCCTTTTGAGTATTTAAAAAATATATACCAACAGAACTACTCTCCCAAGGAAAATATTGCCACCAT
TTGTAGACCACGTAACCTTCAAGTATGTGCTACTTTTTTGTCCCTGTATCTAACTCAAATCAGGAACTGT
ATTTTTTTTAATGATTTGCTTTTGAAACTTGAAGTCTTGAAAACAGTGTGATGCAATTACTGCTGTTCTA
GCCCCCAAAGAGTTTTCTGTGCAAAATCTTGAGAATCAATCAATAAAGAAAGATGGAAGGAAGGGAGAAA
TTGGAATGTTTTAACTGCAGCCCTCAGAACTTTAGTAACAGCACAACAAATTAAAAACAAAAACAACTCA
TGCCACAGTATGTCGTCTTCATGTGTCTTGCAATGAACTGTTTCAGTAGCCAATCCTCTTTCTTAGTATA
TGAAAGGACAGGGATTTTTGTTCTTGTTGTTCTCGTTGTTGTTTTAAGTTTACTGGGGAAAGTGCATTTG
GCCAAATGAAATGGTAGTCAAGCCTATTGCAACAAAGTTAGGAAGTTTGTTGTTTGTTTATTATAAACAA
AAAGCATGTGAAAGTGCACTTAAGATAGAGTTTTTATTAATTACTTACTTATTACCTAGATTTTAAATAG
ACAATCCAAAGTCTCCCCTTCGTGTTGCCATCATCTTGTTGAATCAGCCATTTTATCGAGGCACGTGATC
AGTGTTGCAACATAATGAAAAAGATGGCTACTGTGCCTTGTGTTACTTAATCATACAGTAAGCTGACCTG
GAAATGAATGAAACTATTACTCCTAAGAATTACATTGTATAGCCCCACAGATTAAATTTAATTAATTAAT
TCAAAACATGTTAAACGTTACTTTCATGTACTATGGAAAAGTACAAGTAGGTTTACATTACTGATTTCCA
GAAGTAAGTAGTTTCCCCTTTCCTAGTCTTCTGTGTATGTGATGTTGTTAATTTCTTTTATTGCATTATA
AAATAAAAGGATTATGTATTTTTAACTAAGGTGAGACATTGATATATCCTTTTGCTACAAGCTATAGCTA
ATGTGCTGAGCTTGTGCCTTGGTGATTGATTGATTGATTGACTGATTGTTTTAACTGATTACTGTAGATC
AACCTGATGATTTGTTTGTTTGAAATTGGCAGGAAAAATGCAGCTTTCAAATCATTGGGGGGAGAAAAAG
GATGTCTTTCAGGATTATTTTAATTAATTTTTTTCATAATTGAGACAGAACTGTTTGTTATGTACCATAA
TGCTAAATAAAACTGTGGCACTTTTCACCATAATTTAATTTAGTGGAAAAAGAAGACAATGCTTTCCATA
TTGTGATAAGGTAACATGGGGTTTTTCTGGGCCAGCCTTTAGAACACTGTTAGGGTACATACGCTACCTT
GATGAAAGGGACCTTCGTGCAACTGTAGTCATCTTAAAGGCTTCTCATCCACTGTGCTTCTTAATGTGTA
ATTAAAGTGAGGAGAAATTAAATACTCTGAGGGCGTTTTATATAATAAATTCGTGAAGAAATGTGTGCTC
TTCA

【0096】

理論に拘束されることを望まないものの、ヒト脳組織におけるＵＢＥ３Ａアイソフォーム発現の解析は、短いＵＢＥ３Ａアイソフォーム１が、アッセイされる特異的脳領域に応じて、長いＵＢＥ３Ａアイソフォームと比較して少なくとも４：１および最高８：１の比で発現されることを示した（Ｍｅｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５；３４８（６２３５）：６６０－６６５）。ゆえに、一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ＷＴまたは対照から改変されている１つまたは複数のコザック配列を含み得、例えば、ＷＴまたは対照、例えばコンセンサスコザック配列および／または野生型ＵＢＥ３Ａコザック配列と比較して、１、２、３、４、５個、またはそれ以上のヌクレオチドが置換されている、付加されている、かつ／または欠失しているポリヌクレオチド配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、オープンリーディングフレームにおける１つまたは複数の開始コドン（すなわち、翻訳開始部位としても知られる１つまたは複数の開始コドン）のイニシエーション活性を低下させるおよび／または増強するヌクレオチド改変（例えば、置換）を含む１つまたは複数のコザック配列を含み得る。一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、対照、例えばコンセンサスコザック配列、または例えば野生型（例えば、非改変）ＵＢＥ３Ａコザック配列と比較して、１つまたは複数の開始コドンのイニシエーション活性を５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上低下させる（例えば、アイソフォームの発現を低下させる）ヌクレオチド改変（例えば、置換）を含む１つまたは複数のコザック配列を含み得る。一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、対照、例えばコンセンサスコザック配列、または例えば野生型（例えば、非改変）ＵＢＥ３Ａコザック配列と比較して、１つまたは複数の開始コドンのイニシエーション活性を５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１５０％、２００％、またはそれ以上増強する（例えば、アイソフォームの発現を増強する）ヌクレオチド改変（例えば、置換）を含む１つまたは複数のコザック配列を含み得る。一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、長いアイソフォームの発現と比較して約１：１～約１５：１の比、例えば約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその中の任意の値もしくは値域の比での短いアイソフォームの発現を提供する１つまたは複数のヌクレオチド改変を含み得る。例えば、一部の実施形態において、哺乳類（例えば、ヒト）ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、長いアイソフォームの発現と比較して約２：１～約４．５：１、約１：１～約１０：１、約３：１～約８．５：１、または約３：１～約４：１の比での短いアイソフォームの発現を提供する１つまたは複数のヌクレオチド改変を含み得る。例えば、一部の実施形態において、哺乳類（例えば、ヒト）ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、長いアイソフォームの発現と比較して約２．５：１、約３：１、約４：１、約６．５：１、約８：１、または約１０：１の比での短いアイソフォームの発現を提供する１つまたは複数のヌクレオチド改変を含み得る。

【0097】

一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、配列番号６のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約５０％同一の、例えばそれと少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる第１のコザック配列を含む。一部の実施形態において、第１のコザック配列（例えば、配列番号６）は、ＷＴアイソフォーム３またはＷＴアイソフォーム２コザック配列（それぞれ配列番号５または４）を置き換えるまたは改変する等によって、アイソフォーム３またはアイソフォーム２に作動可能に連結される。
配列番号４．野生型ヒトＵＢＥ３Ａの長いアイソフォーム２コザック配列（下線部は開始コドン）
UGCAGGAUGG
配列番号５．野生型ヒトＵＢＥ３Ａの長いアイソフォーム３コザック配列（下線部は開始コドン）
CACCGAAUGG
配列番号６．低下したイニシエーション活性を有する、改変されたヒトＵＢＥ３Ａの第１のコザック配列（下線部は開始コドン）
UUUUUUAUGG

【0098】

一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、配列番号８のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約５０％同一の、例えばそれと少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる第２のコザック配列を含む。一部の実施形態において、第２のコザック配列（例えば、配列番号８）は、ＷＴヒトＵＢＥ３Ａアイソフォーム１コザック配列（配列番号７）を置き換えるまたは改変する等によって、短いアイソフォーム１に作動可能に連結される。
配列番号７．野生型ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォーム（アイソフォーム１）コザック配列（下線部は開始コドン）
AGCCGAAUGA
配列番号８．増強したイニシエーション活性を有する、改変されたヒトＵＢＥ３Ａの第２のコザック配列（下線部は開始コドン）
AGCAGGAUGA

【0099】

一部の実施形態において、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームの唯一のコドン最適化ヌクレオチド配列は、ヒトＵＢＥ３Ａに対する図１４に示されているもの等、一方または両方のコザック配列に対するものである。一部の実施形態において、付加的な（コザック配列に加えて）コドン最適化ヌクレオチド配列は、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム内にあり、哺乳類細胞における発現に影響する。本明細書において使用される「哺乳類」という用語は、これらに限定されないが、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類（例えば、サルおよびヒヒ）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター等）等を含む。コドン最適化は当技術分野において周知の技法であり、種々の種における発現のための最適なコドンが公知である。コドン最適化ＵＢＥ３Ａ配列の使用により、対象において、形質導入された配列の発現を内因性ＵＢＥ３Ａ配列の発現から識別することが可能となる。一部の実施形態において、本発明のヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化され得る。

【0100】

一部の実施形態において、コドン最適化ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、配列番号９、配列番号２６、もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えばそれと少なくとも約７０、７５、７６、７７、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一部の実施形態において、配列番号２７（図１４）におけるコザック配列の一方または両方はさらに改変されず、一方で他のヌクレオチド配列は、比較からコザック配列を削除した場合に、配列番号２７（図１４）におけるそれぞれの配列と少なくとも約７０％同一の、例えば少なくとも約７０、７５、７６、７７、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを作出するようにさらにコドン最適化され、それによって、短いアイソフォーム１に作動可能に連結されたコザック配列（配列番号８）を保ち、かつ／またはコザック配列（配列番号６）は、アイソフォーム３もしくはアイソフォーム２に作動可能に連結される。
配列番号９．ヒトコドン最適化ＵＢＥ３Ａアイソフォーム１およびアイソフォーム３オープンリーディングフレーム（ｈＵＢＥ３Ａ１＞＞３）
ATGGCCACAGCTTGTAAAAGATCAGGAGAACCTCAGTCTGACGACATTGAAGCTAGCAGGATGAAGAGAGCCGCCGCAAAGCACCTGATCGAACGCTACTACCATCAGCTCACCGAGGGTTGCGGCAACGAAGCGTGTACCAACGAGTTCTGTGCCTCCTGCCCCACGTTCCTGCGGATGGATAACAATGCCGCCGCAATCAAGGCGCTTGAACTGTATAAGATCAACGCCAAGCTGTGCGATCCCCACCCTTCCAAGAAGGGAGCCAGCTCAGCCTACCTGGAAAACTCCAAGGGCGCCCCTAACAACTCATGCTCCGAGATCAAGATGAATAAGAAGGGCGCCCGGATTGACTTCAAGGATGTGACCTACCTGACCGAGGAGAAGGTGTACGAGATCCTGGAACTCTGCCGAGAACGGGAGGACTACTCCCCTCTGATCCGCGTGATCGGAAGAGTGTTCAGCTCCGCTGAAGCGCTCGTGCAGTCGTTCAGAAAGGTCAAGCAGCACACTAAGGAAGAACTCAAGTCCCTGCAGGCCAAAGATGAGGATAAGGACGAAGATGAAAAAGAAAAGGCCGCCTGCTCAGCTGCCGCGATGGAAGAAGATTCAGAGGCCTCCAGCAGCAGGATTGGCGACAGCTCCCAGGGGGACAACAACCTCCAGAAGCTGGGTCCAGACGATGTGTCGGTGGACATCGACGCCATTCGGAGAGTGTACACCCGACTGCTCTCGAACGAAAAGATCGAGACTGCATTCCTGAACGCCCTTGTCTACCTGAGCCCGAACGTGGAATGCGACCTTACTTACCATAACGTCTACTCCCGGGACCCAAACTACCTGAACCTGTTCATCATCGTGATGGAAAACCGGAACCTCCATTCCCCCGAGTACCTGGAAATGGCCCTGCCCCTGTTCTGCAAGGCCATGTCAAAGCTTCCGCTGGCCGCACAAGGAAAGCTGATCCGCTTGTGGTCCAAGTACAACGCGGACCAGATCAGACGCATGATGGAAACGTTCCAGCAACTGATTACTTACAAGGTCATCTCCAATGAGTTCAACTCCCGGAATCTTGTGAACGACGATGATGCCATTGTGGCCGCCTCCAAATGCCTGAAGATGGTCTACTATGCGAACGTCGTGGGCGGGGAAGTCGATACCAACCACAACGAGGAGGACGACGAGGAACCTATCCCTGAGTCATCAGAACTGACTCTGCAAGAACTGCTGGGCGAAGAACGCCGGAACAAGAAGGGCCCAAGAGTCGACCCGTTGGAAACCGAACTGGGAGTCAAAACCCTGGACTGCAGAAAGCCTCTGATCCCGTTCGAAGAGTTCATCAACGAACCCCTGAACGAGGTGCTGGAAATGGACAAGGACTACACCTTCTTCAAGGTCGAAACCGAGAACAAGTTCTCTTTCATGACTTGCCCGTTCATTCTGAACGCAGTGACCAAGAACCTGGGCCTCTACTACGACAACCGCATCCGCATGTACAGCGAACGCCGCATCACCGTGCTGTACTCCCTGGTGCAAGGCCAACAGCTGAACCCCTACCTTCGCCTGAAAGTCCGCCGCGACCATATCATTGATGACGCTCTCGTGCGCCTTGAGATGATCGCGATGGAGAACCCCGCAGATCTGAAGAAGCAGCTCTACGTCGAGTTCGAAGGAGAACAGGGGGTGGACGAAGGAGGAGTGTCCAAGGAGTTCTTTCAGCTCGTGGTGGAGGAAATCTTTAACCCTGACATCGGAATGTTCACCTATGACGAATCCACAAAGCTGTTTTGGTTTAACCCGTCCTCGTTCGAAACTGAGGGTCAATTCACCCTCATCGGCATTGTGCTGGGACTCGCCATCTACAACAATTGCATCCTCGACGTGCACTTCCCGATGGTGGTGTACCGCAAACTGATGGGCAAAAAGGGAACCTTCAGAGATCTGGGAGACTCACACCCGGTGCTGTACCAGTCGCTCAAGGACTTGTTGGAATACGAAGGGAACGTGGAAGATGATATGATGATTACCTTCCAAATCTCGCAGACTGACTTGTTTGGAAACCCTATGATGTACGACCTGAAGGAGAATGGAGACAAGATCCCGATCACGAACGAAAACCGCAAGGAGTTCGTCAACCTGTACTCCGACTATATTCTGAACAAGAGCGTGGAGAAGCAGTTTAAGGCTTTCCGCCGGGGATTCCACATGGTCACCAACGAAAGCCCGCTCAAGTACCTCTTTCGGCCCGAAGAGATTGAACTGCTGATCTGCGGGTCGAGGAATCTGGACTTCCAGGCCCTTGAAGAGACTACTGAGTACGACGGAGGCTATACCCGGGACTCCGTGCTGATAAGAGAGTTCTGGGAGATCGTGCACTCCTTCACCGATGAGCAGAAGCGGCTGTTCCTCCAATTCACCACCGGCACTGACAGAGCGCCAGTCGGAGGACTGGGGAAGCTGAAGATGATCATTGCGAAGAACGGTCCCGACACTGAGAGGTTGCCCACTTCCCACACTTGTTTCAACGTGCTGCTGCTCCCGGAGTACTCCTCCAAGGAGAAGCTGAAGGAACGGCTCCTGAAGGCCATTACATACGCCAAAGGTTTCGGCATGCTTTAATGA

【0101】

本発明の別の態様は、本発明の哺乳類（例えば、ヒト）ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを含む発現カセットに関する。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒトコドン最適化配列、例えば配列番号９のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一の配列を含むポリヌクレオチドである。本明細書に記載される本発明の様々な実施形態において、配列番号９のＵＢＥ３Ａヌクレオチド配列は、第１のコザック配列を含むために、付加的な５’塩基対配列（例えば、配列番号６の改変されたコザック配列をもたらす６個のチミン）をさらに含む。

【0102】

発現カセットにおけるＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、局在化シグナル、および／または当技術分野において公知の他の発現エレメント等、ＵＢＥ３Ａおよび／またはＥ６ＡＰの発現を改変し得る（すなわち、増強するまたは低下させるまたは限定する）１つまたは複数の発現エレメントに作動可能に連結され得る。

【0103】

一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーター、例えばニューロン特異的プロモーター、例えばヒトシナプシン（ｈＳＹＮ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、チューブリンアルファ１（Ｔａ１）、ＭｅＣＰ２（ＭｅＰ）に作動可能に連結される。

【0104】

一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒトシナプシンプロモーター、例えば配列番号１０のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるプロモーターに作動可能に連結される。
配列番号１０．ヒトシナプシン（ｈＳＹＮ）プロモーター
GGTACCAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTC

【0105】

一部の実施形態において、ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）、例えば配列番号１１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリアデニル化シグナルに作動可能に連結される。
配列番号１１．ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）
CTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAACAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCT

【0106】

一部の実施形態において、ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ポリアデニル化シグナル、例えば合成ポリＡ（ＳｐＡ）、例えば配列番号１２のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリアデニル化シグナルに作動可能に連結される。
配列番号１２．合成ポリアデニル化シグナル（ＳｐＡ）
AATAAAGAGCTCAGATGCATCGATCAGAGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG

【0107】

一部の実施形態において、ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ポリアデニル化シグナル、例えばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐＡ）、例えば配列番号１３のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるポリアデニル化シグナルに作動可能に連結される。
配列番号１３．ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ｐＡ）
AGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATT

【0108】

当業者であれば、多様なプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望されるレベルおよび組織特異的発現に応じて使用され得ることをさらに解するであろう。プロモーター／エンハンサーは、所望される発現のパターンに応じて、構成的または誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、生得（ｎａｔｉｖｅ）または外来であり得、天然または合成配列であり得る。外来によって、転写開始領域は、転写開始領域が導入される野生型宿主において見出されないことが意図される。

【0109】

プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞もしくは治療されるべき対象に生得のものであり得、かつ／または異種核酸配列に対して生得であり得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般的に、それが目的の標的細胞において機能するように選定される。代表的な実施形態において、プロモーター／エンハンサーエレメントは哺乳類プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは構成的または誘導性であり得る。

【0110】

誘導性発現制御エレメントは、一般的に、異種核酸配列の発現を上回る調節を提供することが望ましい、そうした適用において使用される。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または組織優先的プロモーター／エンハンサーエレメントであり得、筋肉特異的または優先的（心筋、骨格筋、および／または平滑筋を含む）、神経組織特異的または優先的（脳特異的を含む）、目（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または優先的、骨髄特異的または優先的、膵臓特異的または優先的、脾臓特異的または優先的、および肺特異的または優先的プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例となる誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、これらに限定されないが、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターを含む。

【0111】

ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームが標的細胞において転写され、次いで翻訳される実施形態において、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、特異的開始シグナルが一般的に採用される。ＡＴＧ開始コドン（すなわち、翻訳開始部位）および近接配列を含み得るこれらの外因性翻訳制御配列は、天然でも合成でも、多様な起源のものであり得る。これらの付加的な外因性翻訳制御配列の非限定的な例は、コザック配列（例えば、付加的なコザックコンセンサス配列）を含む。

【0112】

ある特定の実施形態において、発現カセットは、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、例えば２つのＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。２つのＩＴＲは、同じヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド配列を有し得る。ＡＡＶ ＩＴＲは、任意のＡＡＶ血清型または単離株（例えば、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、または表１に示されるいずれか）由来のものであり得る。一部の実施形態において、ＩＴＲはＡＡＶ２由来のものである。各ＩＴＲは、独立して、野生型配列または改変された配列であり得る。一部の実施形態において、改変されたＩＴＲは、Ｄ－エレメント欠失を有し得る（ＷＯ０１／９２５５１）。Ｄ－エレメント欠失とは、Ｄ－エレメントとして知られる、ＩＴＲのその部分の除去として定義される。Ｄ－エレメントは、代替的に、Ｄ領域もしくはＤ配列、および／または回文ヘアピン構造を形成しないＩＴＲのヌクレオチドと称され得るまたはそれとして知られ得る。一部の実施形態において、発現カセットはＡＡＶ一本鎖ベクターである。一部の実施形態において、発現カセットは、ＡＡＶゲノム、例えば自己相補的ＡＡＶゲノムである。

【0113】

ある特定の実施形態において、発現カセットは、任意で挙げられた順序で、プロモーター、哺乳類ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、およびポリアデニル化部位を含む。ある特定の実施形態において、発現カセットは、任意で挙げられた順序で、プロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、およびポリアデニル化部位を含む。ある特定の実施形態において、発現カセットは、任意で挙げられた順序で、ＡＡＶ ＩＴＲ、プロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、発現カセットは、任意で挙げられた順序で、ヒトシナプシンプロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、およびｂＧＨポリアデニル化部位を含む。ある特定の実施形態において、発現カセットは、任意で挙げられた順序で、ＡＡＶ ＩＴＲ、ヒトシナプシンプロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ｂＧＨポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、発現カセットは、任意で挙げられた順序で、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、プロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ｂＧＨポリアデニル化部位、およびＡＡ２Ｖ ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、発現カセットは、任意で挙げられた順序で、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ヒトシナプシンプロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォームを含むヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ｂＧＨポリアデニル化部位、ならびにＡＡ２Ｖ ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、発現カセットは、任意で挙げられた順序で、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ヒトシナプシンプロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォーム（すなわち、アイソフォーム１）および長いアイソフォーム３を含むヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ｂＧＨポリアデニル化部位、ならびにＡＡ２Ｖ ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、発現カセットは、任意で挙げられた順序で、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ヒトシナプシンプロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォーム２を含むヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ｂＧＨポリアデニル化部位、ならびにＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。前述の構成要素は作動可能な連結の状態にある。ある特定の実施形態において、発現カセットは、任意で挙げられた順序で、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ヒトシナプシンプロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよびヒトの長いアイソフォーム（すなわち、アイソフォーム２または３のいずれか）を含み、かつ配列番号６および／もしくは配列番号８、またはそれと少なくとも約５０％同一の、例えばそれと少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる１つまたは複数のコザック配列をさらに含むヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ｂＧＨポリアデニル化部位、ならびにＡＡ２Ｖ ＩＴＲを含む。前述の構成要素は作動可能な連結の状態にある。

【0114】

一部の実施形態において、発現カセットは、配列番号１４のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％同一の、例えばそれと少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一の配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
配列番号１４．ＩＴＲを除外したヒトＵＢＥ３Ａ発現カセット
GAATTCGGTACCAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGTCTCTCCGATTTTTTATGGCCACAGCTTGTAAAAGATCAGGAGAACCTCAGTCTGACGACATTGAAGCTAGCAGGATGAAGAGAGCCGCCGCAAAGCACCTGATCGAACGCTACTACCATCAGCTCACCGAGGGTTGCGGCAACGAAGCGTGTACCAACGAGTTCTGTGCCTCCTGCCCCACGTTCCTGCGGATGGATAACAATGCCGCCGCAATCAAGGCGCTTGAACTGTATAAGATCAACGCCAAGCTGTGCGATCCCCACCCTTCCAAGAAGGGAGCCAGCTCAGCCTACCTGGAAAACTCCAAGGGCGCCCCTAACAACTCATGCTCCGAGATCAAGATGAATAAGAAGGGCGCCCGGATTGACTTCAAGGATGTGACCTACCTGACCGAGGAGAAGGTGTACGAGATCCTGGAACTCTGCCGAGAACGGGAGGACTACTCCCCTCTGATCCGCGTGATCGGAAGAGTGTTCAGCTCCGCTGAAGCGCTCGTGCAGTCGTTCAGAAAGGTCAAGCAGCACACTAAGGAAGAACTCAAGTCCCTGCAGGCCAAAGATGAGGATAAGGACGAAGATGAAAAAGAAAAGGCCGCCTGCTCAGCTGCCGCGATGGAAGAAGATTCAGAGGCCTCCAGCAGCAGGATTGGCGACAGCTCCCAGGGGGACAACAACCTCCAGAAGCTGGGTCCAGACGATGTGTCGGTGGACATCGACGCCATTCGGAGAGTGTACACCCGACTGCTCTCGAACGAAAAGATCGAGACTGCATTCCTGAACGCCCTTGTCTACCTGAGCCCGAACGTGGAATGCGACCTTACTTACCATAACGTCTACTCCCGGGACCCAAACTACCTGAACCTGTTCATCATCGTGATGGAAAACCGGAACCTCCATTCCCCCGAGTACCTGGAAATGGCCCTGCCCCTGTTCTGCAAGGCCATGTCAAAGCTTCCGCTGGCCGCACAAGGAAAGCTGATCCGCTTGTGGTCCAAGTACAACGCGGACCAGATCAGACGCATGATGGAAACGTTCCAGCAACTGATTACTTACAAGGTCATCTCCAATGAGTTCAACTCCCGGAATCTTGTGAACGACGATGATGCCATTGTGGCCGCCTCCAAATGCCTGAAGATGGTCTACTATGCGAACGTCGTGGGCGGGGAAGTCGATACCAACCACAACGAGGAGGACGACGAGGAACCTATCCCTGAGTCATCAGAACTGACTCTGCAAGAACTGCTGGGCGAAGAACGCCGGAACAAGAAGGGCCCAAGAGTCGACCCGTTGGAAACCGAACTGGGAGTCAAAACCCTGGACTGCAGAAAGCCTCTGATCCCGTTCGAAGAGTTCATCAACGAACCCCTGAACGAGGTGCTGGAAATGGACAAGGACTACACCTTCTTCAAGGTCGAAACCGAGAACAAGTTCTCTTTCATGACTTGCCCGTTCATTCTGAACGCAGTGACCAAGAACCTGGGCCTCTACTACGACAACCGCATCCGCATGTACAGCGAACGCCGCATCACCGTGCTGTACTCCCTGGTGCAAGGCCAACAGCTGAACCCCTACCTTCGCCTGAAAGTCCGCCGCGACCATATCATTGATGACGCTCTCGTGCGCCTTGAGATGATCGCGATGGAGAACCCCGCAGATCTGAAGAAGCAGCTCTACGTCGAGTTCGAAGGAGAACAGGGGGTGGACGAAGGAGGAGTGTCCAAGGAGTTCTTTCAGCTCGTGGTGGAGGAAATCTTTAACCCTGACATCGGAATGTTCACCTATGACGAATCCACAAAGCTGTTTTGGTTTAACCCGTCCTCGTTCGAAACTGAGGGTCAATTCACCCTCATCGGCATTGTGCTGGGACTCGCCATCTACAACAATTGCATCCTCGACGTGCACTTCCCGATGGTGGTGTACCGCAAACTGATGGGCAAAAAGGGAACCTTCAGAGATCTGGGAGACTCACACCCGGTGCTGTACCAGTCGCTCAAGGACTTGTTGGAATACGAAGGGAACGTGGAAGATGATATGATGATTACCTTCCAAATCTCGCAGACTGACTTGTTTGGAAACCCTATGATGTACGACCTGAAGGAGAATGGAGACAAGATCCCGATCACGAACGAAAACCGCAAGGAGTTCGTCAACCTGTACTCCGACTATATTCTGAACAAGAGCGTGGAGAAGCAGTTTAAGGCTTTCCGCCGGGGATTCCACATGGTCACCAACGAAAGCCCGCTCAAGTACCTCTTTCGGCCCGAAGAGATTGAACTGCTGATCTGCGGGTCGAGGAATCTGGACTTCCAGGCCCTTGAAGAGACTACTGAGTACGACGGAGGCTATACCCGGGACTCCGTGCTGATAAGAGAGTTCTGGGAGATCGTGCACTCCTTCACCGATGAGCAGAAGCGGCTGTTCCTCCAATTCACCACCGGCACTGACAGAGCGCCAGTCGGAGGACTGGGGAAGCTGAAGATGATCATTGCGAAGAACGGTCCCGACACTGAGAGGTTGCCCACTTCCCACACTTGTTTCAACGTGCTGCTGCTCCCGGAGTACTCCTCCAAGGAGAAGCTGAAGGAACGGCTCCTGAAGGCCATTACATACGCCAAAGGTTTCGGCATGCTTTAATGACTCGAGCGGCCGCGGGATCCCTCGAGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAACAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGACCGCGT

【0115】

本発明のさらなる態様は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターに関する。適切なベクターは、これらに限定されないが、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクター）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。例えば、核酸は、５’および／または３’末端反復（例えば、５’および／または３’ＡＡＶ末端反復）を含むＡＡＶベクターを含み得る、それからなり得る、またはそれから本質的になり得る。一部の実施形態において、ベクターは、発現カセットが付着されるまたは発現カセットが埋め込まれる粒子（例えば、微粒子またはナノ粒子）またはリポソーム等の送達ビヒクルである。ベクターは、細胞内に発現カセットを運ぶのに適した任意の送達ビヒクルであり得る。一部の実施形態において、ベクターは神経向性ベクターであり得る。

【0116】

一部の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターおよび／またはＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターはＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型または単離株（例えば、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、または表１に示されるいずれか）であり得る。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、これらに限定されないが、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅＢ、またはＡＡＶ９．ＨＲ等、ＡＡＶ９および／またはＡＡＶ９由来バリアントであり得る。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、合成ＡＡＶベクター、例えばＡｎｃ８０であり得る。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、野生型カプシドタンパク質を含み得る。他の実施形態において、ＡＡＶベクターは、野生型カプシドタンパク質と比較して変更された向性を有する改変されたカプシドタンパク質を含み得、例えば改変されたカプシドタンパク質は、肝臓脱標的化されている、または特定の細胞に対する増強した向性を有する。

【0117】

一部の実施形態において、ベクターは一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、自己相補的または二重鎖ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。ｓｃＡＡＶベクターは、国際公開ＷＯ０１／９２５５１（その開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載される。ＵＢＥ３Ａ ＯＲＦを発現させるためのｓｃＡＡＶの使用は、形質導入された細胞の数、形質導入細胞あたりのコピー数、またはその両方の増加を提供し得る。

【0118】

本発明の付加的な態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターを含む形質転換細胞に関する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、細胞ゲノムに安定に組み入れられる。細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ細胞であり得る。

【0119】

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞を含むトランスジェニック動物に関する。一部の実施形態において、動物は、実験室動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、または非ヒト霊長類である。

【0120】

本発明のさらなる態様は、薬学的に許容される担体中に、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞を含む薬学的製剤に関する。

【0121】

具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は単離されている。

【0122】

別の具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は精製されている。

【0123】

ウイルスベクターを産生する方法
本発明は、ウイルスベクターを産生する方法をさらに提供する。１つの特定の実施形態において、本発明は、ＡＡＶ複製に対して寛容な細胞に、組み換えＡＡＶ鋳型の複製およびパッケージングに十分な条件下で、（ａ）（ｉ）本発明のポリヌクレオチドまたは発現カセット、および（ｉｉ）ＩＴＲ、を含む組み換えＡＡＶ鋳型；（ｂ）Ｒｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチドを提供し、それによって組み換えＡＡＶ粒子が細胞内で産生されるステップを含む、組み換えＡＡＶ粒子を産生する方法を提供する。組み換えＡＡＶ鋳型の複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、ＡＡＶ鋳型の複製およびＡＡＶカプシド内へのカプシド化に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ配列およびＡＡＶ ｃａｐ配列）、ならびにアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在であり得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ鋳型は、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、これらは本発明のポリヌクレオチドに対して５’および３’に位置するが、それと直接連続している必要はない。

【0124】

一部の実施形態において、組み換えＡＡＶ鋳型は、国際公開ＷＯ０１／９２５５１に記載されているように、二重鎖ＡＡＶベクターを作製するためにＲｅｐによって分離されないＩＴＲを含む。

【0125】

ＡＡＶ鋳型、ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージされたＡＡＶ鋳型を含むウイルスベクターが細胞内で産生されるような条件下で提供される。この方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含み得る。ウイルスベクターは、培地からおよび／または細胞を溶解することによって回収され得る。

【0126】

細胞は、ＡＡＶウイルス複製に対して寛容である細胞であり得る。当技術分野において公知の任意の適切な細胞が採用され得る。特定の実施形態において、細胞は哺乳類細胞（例えば、霊長類またはヒト細胞）である。別の選択肢として、細胞は、複製欠陥ヘルパーウイルスから欠失された機能を提供するトランス補完パッケージング細胞株、例えば２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞であり得る。

【0127】

ＡＡＶ複製およびカプシド配列は、当技術分野において公知の任意の方法によって提供され得る。現在のプロトコールは、典型的に、単一のプラスミド上にＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現させる。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は一緒に提供される必要はないが、そうすることが好都合であり得る。ＡＡＶ ｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失したアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入される）。ＡＡＶ ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現させるためにＥＢＶベクターも採用され得る。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターはエピソーム性であるが、それにもかかわらず、継続的な細胞分裂を通じて高いコピー数を維持するであろうことである（すなわち、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」と表される染色体外エレメントとして細胞内に安定に組み込まれる。Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照されたい）。

【0128】

さらなる選択肢として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞内に安定に組み入れられ得る。

【0129】

典型的に、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを阻止するためにＴＲに隣接しないであろう。

【0130】

ＡＡＶ鋳型は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して細胞に提供され得る。例えば、鋳型は、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施形態において、ＡＡＶ鋳型は、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失されたアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域に挿入される）。別の例示として、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５は、ＡＡＶ ＴＲによって隣接されたレポーター遺伝子を運ぶバキュロウイルスベクターを記載する。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上で記載されるように、鋳型を送達するためにＥＢＶベクターも採用され得る。

【0131】

別の代表的な実施形態において、ＡＡＶ鋳型は、複製性ｒＡＡＶウイルスによって提供される。さらに他の実施形態において、ＡＡＶ鋳型を含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体に安定に組み込まれる。

【0132】

ウイルス力価を増強するために、生産性の高いＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が細胞に提供され得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野において公知である。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供されるであろう。代替的に、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５、ならびに米国特許第６，０４０，１８３号および第６，０９３，５７０号によって記載されるように、効率的なＡＡＶ産生を促進するヘルパー遺伝子のすべてを運ぶ非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして提供され得る。

【0133】

さらには、ヘルパーウイルス機能は、染色体に埋め込まれたまたは安定な染色体外エレメントとして維持されたヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般的に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン内にパッケージされ得ず、例えばＩＴＲによって隣接されない。

【0134】

当業者であれば、単一のヘルパー構築物上にＡＡＶ複製およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であり得ることを解するであろう。このヘルパー構築物は非ウイルスまたはウイルス構築物であり得る。１つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。

【0135】

１つの特定の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターはＡＡＶ鋳型をさらに含み得る。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはＡＡＶ鋳型は、アデノウイルスの欠失した領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）に挿入され得る。

【0136】

さらなる実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施形態によれば、ＡＡＶ鋳型はプラスミド鋳型として提供され得る。

【0137】

別の例示的な実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、ＡＡＶ鋳型は、プロウイルスとして細胞内に組み込まれる。代替的に、ＡＡＶ鋳型は、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって提供される。

【0138】

さらなる例となる実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ＡＡＶ鋳型は、別個の複製ウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ＡＡＶ鋳型は、ＡＡＶ粒子または第２の組み換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。

【0139】

前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列、および存在する場合にはＡＡＶ鋳型は、アデノウイルス骨格に埋め込まれ、５’および３’シス配列によって隣接され、それによりこれらの配列はアデノウイルスカプシド内にパッケージされ得る。上で記載されるように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、一般的にＩＴＲによって隣接されず、それによりこれらの配列はＡＡＶビリオン内にパッケージされない。

【0140】

Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４－１２）は、アデノウイルスならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーを記載する。

【0141】

ヘルペスウイルスも、ＡＡＶパッケージング法におけるヘルパーウイルスとして使用され得る。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、拡張可能なＡＡＶベクター産生スキームを有利に促し得る。ＡＡＶ－２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９８６およびＷＯ００／１７３７７）。

【0142】

さらなる代替策として、本発明のウイルスベクターは、例えばＵｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５－４３によって記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ鋳型を送達するバキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞内で産生され得る。

【0143】

夾雑ヘルパーウイルスを含まないＡＡＶベクターストックは、当技術分野において公知の任意の方法によって獲得され得る。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。ＡＡＶは、ヘパリン基質に対するアフィニティーに基づいてもヘルパーウイルスから分離され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。いかなる夾雑ヘルパーウイルスも複製能がないように、欠失した複製欠陥ヘルパーウイルスを使用してもよい。さらなる代替策として、ＡＡＶのパッケージングを媒介するためには、アデノウイルス初期遺伝子発現のみが要されることから、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーが採用され得る。後期遺伝子発現に欠陥のあるアデノウイルス変異体は、当技術分野において公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。

【0144】

ＵＢＥ３Ａベクターを使用する方法
本発明は、例えばインビトロ、エクスビボ、および／またはインビボでの治療目的または研究目的のための、細胞または対象にＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを送達して、ＵＢＥ３Ａおよび／またはＥ６ＡＰの産生を増加させるための方法にも関する。ゆえに、本発明の１つの態様は、細胞を、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターに接触させ、それによって細胞においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させるステップを含む、細胞においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させる方法に関する。一部の実施形態において、細胞は、インビトロ細胞、エクスビボ細胞、および／またはインビボ細胞である。インビトロでの本発明の発現は、研究目的のために、例えば組み換えタンパク質を発現させるために、細胞に対する該タンパク質の効果を調査するために、インビボでの発現に先立って効力および／もしくは安全性を評価するために、ならびに／または研究および医療の診断法および／もしくはスクリーニング法の開発に有益であり得る。

【0145】

本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞を対象に送達し、それによって対象においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させるステップを含む、対象においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させる方法に関する。一部の実施形態において、対象は、異常なＵＢＥ３Ａ遺伝子発現と関連した障害の動物モデルである。

【0146】

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞の治療有効量を対象に送達し、それによって、対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子の異常発現またはＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の異常活性と関連した障害を治療するステップを含む、それを必要とする対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子の異常発現またはＵＢＥ３Ａ遺伝子産物（例えば、Ｅ６ＡＰ）の異常活性と関連した障害を治療する方法に関する。本発明は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞の治療有効量を対象に投与し、それによりＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームが対象において発現されるステップを含む、それを必要とする対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子の異常発現またはＵＢＥ３Ａ遺伝子産物（例えば、Ｅ６ＡＰ）の異常活性と関連した障害を治療する方法を提供する。一部の実施形態において、ＵＢＥ３Ａ遺伝子または遺伝子産物の異常発現と関連した障害はアンジェルマン症候群であり得る。

【0147】

本発明は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞の治療有効量を対象に投与し、それによりＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームが対象において発現されるステップを含む、それを必要とする対象におけるアンジェルマン症候群を治療する方法をさらに提供する。

【0148】

ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は、対象に、例えば対象の中枢神経系に全身的に（例えば、静脈内に）または直接的に（例えば、髄腔内または脳室内または大槽内注射によって脳脊髄液に）送達される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は静脈内に送達される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は脳室内に送達される。

【0149】

本発明に従う組み換えウイルスベクターは、獣医学的および医学的適用の両方において用途を見出す。適切な対象は、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、および哺乳類を含む。本明細書において使用される「哺乳類」という用語は、これらに限定されないが、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類（例えば、サルおよびヒヒ）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター等）等を含む。ヒト対象は、胚、胎児、新生児、幼児、若者、および成人を含む。任意で、例えば、対象は、本明細書に記載されるものを含めた障害または本明細書に記載されるものを含めたポリヌクレオチドの送達により利益を得るであろう障害を有するまたはその危険性があると思われるため、対象は本発明の方法「を必要とする」。さらなる選択肢として、対象は、実験室動物および／または疾患の動物モデルであり得る。好ましくは、対象はヒトである。

【0150】

ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、対象の生涯においてできる限り早く、例えば対象が、異常なＵＢＥ３Ａおよび／もしくはＥ６ＡＰ発現もしくは活性、または前述の疾患もしくは障害のいずれかを有すると診断され次第、それを必要とする対象に投与される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば新生児スクリーニングが異常なＵＢＥ３Ａおよび／またはＥ６ＡＰの発現または活性を同定した後、新生児対象に投与される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、１０歳より前に、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０歳より前に、対象に投与される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、１０歳以降の若者または成人対象に投与される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、例えば出生前スクリーニングが異常なＵＢＥ３Ａおよび／もしくはＥ６ＡＰの発現もしくは活性、または前述の疾患もしくは障害の１つの存在を同定した後、子宮内の胎児に投与される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、対象が、異常なＵＢＥ３Ａおよび／もしくはＥ６ＡＰ発現もしくは活性と関連した症状を発症し次第、あるいは異常なＵＢＥ３Ａおよび／もしくはＥ６ＡＰ発現もしくは活性または前述の疾患もしくは障害の１つを有すると疑われ次第または診断され次第、対象に投与される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、対象が、異常なＵＢＥ３Ａおよび／もしくはＥ６ＡＰ発現もしくは活性と関連した症状または疾患／障害を発症する前に、対象に、例えば異常なＵＢＥ３Ａおよび／もしくはＥ６ＡＰ発現もしくは活性または前述の疾患もしくは障害の１つを有すると疑われるまたは診断されるが症状を呈し始めていない対象に投与される。

【0151】

特定の実施形態において、本発明は、薬学的に許容される担体中に、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞、ならびに任意で、他の薬効のある作用物質、薬学的作用物質、安定剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤等を含む医薬組成物を提供する。注射に関して、担体は、典型的に液体であろう。投与の他の方法に関して、担体は、固体または液体のいずれかであり得る。吸入投与に関して、担体は呼吸に適しているであろう、かつ好ましくは固体または液体微粒子形態にあるであろう。一部の実施形態において、薬学的担体は、Ｄ－ソルビトールを含み得る（例えば、ＰＢＳ ５％ ｗ／ｖ Ｄ－ソルビトール）。

【0152】

「薬学的に許容される」によって、それは、有毒でないか、そうでなければ望ましくなくない材料が意図され、すなわち材料は、いかなる望ましくない生物学的影響も引き起こすことなく、対象に投与され得る。

【0153】

本発明の１つの態様は、ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームをインビトロで細胞に移入する方法である。本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、適当な量で細胞に導入され得る。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適当な標準的形質導入法に従って、適当な感染多重度で細胞に導入され得る。投与するウイルスベクターまたはカプシドの力価は、標的細胞タイプおよび数、ならびに特定のウイルスベクターまたはカプシドに応じて変動し得、過度の実験なしに当業者によって判定され得る。特定の実施形態において、少なくとも約１０^３感染単位、より好ましくは少なくとも約１０^５感染単位が細胞に導入される。

【0154】

本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えばウイルスベクターが導入され得る細胞は、これらに限定されないが、神経細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特にニューロン、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、アストロサイト等の脳細胞を含む）、肺細胞、目の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸器上皮細胞）、骨格筋細胞（筋芽細胞、筋管、および筋線維を含む）、横隔膜筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝細胞、消化管の細胞（平滑筋細胞、上皮細胞を含む）、心臓細胞（心筋細胞を含む）、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、関節細胞（例えば、軟骨、半月板、滑膜、および骨髄を含む）、生殖細胞等を含めた、任意のタイプのものであり得る。代替的に、細胞は任意の前駆細胞であり得る。さらなる代替策として、細胞は幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であり得る。なおさらなる代替策として、細胞はがんまたは腫瘍細胞であり得る。さらに、細胞は、上で示されるように、任意の起源の種に由来するものであり得る。

【0155】

本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えばウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞に導入され得る。特定の実施形態において、細胞は対象から取り出されており、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えばウイルスベクターはその中に導入され、次いで細胞は対象に戻し置き換えられる。対象への戻し導入が後に続く、エクスビボでの処理のために対象から細胞を取り出す方法は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい）。代替的に、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えばウイルスベクターは、別の対象由来の細胞に、培養細胞に、または他の任意の適切な供給源由来の細胞に導入され、細胞は、それを必要とする対象に投与される。

【0156】

エクスビボ遺伝子療法のための適切な細胞は、上述のとおりである。対象に投与する細胞の投薬量は、対象の年齢、状態、および種、細胞のタイプ、細胞によって発現されている核酸、投与の様態等によって変動するであろう。典型的に、少なくとも約１０^２～約１０^８または約１０^３～約１０^６個細胞が、薬学的に許容される担体中にて投薬あたり投与されるであろう。特定の実施形態において、エクスビボでウイルスベクターを形質導入された細胞は、薬学的担体と組み合わせて、有効量で対象に投与される。

【0157】

本発明のさらなる態様は、本発明のポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクター、例えばウイルスベクターを対象に投与する方法である。特定の実施形態において、方法は、ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを動物対象に送達する方法を含み、方法は、本発明に従ったウイルスベクターの有効量を動物対象に投与するステップを含む。それを必要とするヒト対象または動物への本発明のウイルスベクターの投与は、当技術分野において公知の任意の手段によるものであり得る。任意で、ウイルスベクターは、薬学的に許容される担体中にて有効用量で送達される。

【0158】

対象に投与されるべきウイルスベクターの投薬量は、投与の様態、治療される対象となる疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター、および送達される対象となる核酸に依存すると考えられ、ルーチン的な様式で決定され得る。治療効果を達成するための例となる用量は、少なくとも約１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、１０^１６形質導入単位（ＴＵ）またはそれ以上、例えば約１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、または１０^１５ＴＵのウイルス力価であり、さらにより好ましくは約１０^８～１０^１４ＴＵ、または約１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、もしくは１０^１５ＴＵが投薬に使用される。用量およびウイルス力価形質導入単位は、ベクターもしくはウイルスゲノム（ｖｇ）、および／またはｖｇ／ｋｇ対象として算出され得る。一部の実施形態において、用量は、少なくとも約１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、１０^１６ｖｇ／ｋｇ対象、例えば約１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、もしくは１０^１５ｖｇ／ｋｇ対象、または約１０^８～１０^１４ｖｇ／ｋｇ対象、一部の実施形態では約１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、もしくは１０^１５ｖｇ／ｋｇ対象である。

【0159】

一部の実施形態において、本発明の方法は、ＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームが、長いアイソフォームの発現と比較して約１：１～約１５：１の比、例えば約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、もしくは１５：１、またはその中の任意の値もしくは値域の比で発現されるようにＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させるステップおよび／またはそのような用量（例えば、ウイルス力価）で投与するステップを含み得る。例えば、一部の実施形態において、哺乳類（例えば、ヒト）ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、短いアイソフォームが、長いアイソフォームの発現と比較して約２：１～約４．５：１、約１：１～約１０：１、約３：１～約８．５：１、または約３：１～約４：１の比で発現されるように投与され得る。一部の実施形態において、哺乳類（例えば、ヒト）ＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、短いアイソフォームが、長いアイソフォームの発現と比較して約２．５：１、約３：１、約４：１、約６．５：１、約８：１、または約１０：１の比で発現されるように投与され得る。

【0160】

特定の実施形態において、１回を上回る回数の投与（例えば、２、３、４回、またはそれ以上の回数の投与）を採用して、様々な間隔、例えば毎日、週１回、月１回、年１回等の期間にわたって所望のレベルの遺伝子発現を達成し得る。

【0161】

例となる投与の様態は、経口、直腸、経粘膜、局部、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介して）、口腔（例えば、舌下）、膣内、髄腔内、眼球内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、および関節内）、局部（例えば、気道表面を含めた皮膚表面および粘膜表面の両方への、ならびに経皮投与）、リンパ内（ｉｎｔｒｏ－ｌｙｍｐｈａｔｉｃ）等、ならびに直接的な組織または臓器注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋、または脳への）を含む。投与は、腫瘍への（例えば、腫瘍またはリンパ節におけるまたはその付近における）ものでもあり得る。任意の所与の場合における最も適切な経路は、治療されている病状の性質および重症度、ならびに使用されている特定のベクターの性質に依存するであろう。一部の実施形態において、投与の１つを上回る種類の様態および／または経路、例えば実質内投与および脳室内投与が利用され得る。

【0162】

一部の実施形態において、発現カセット（例えば、ウイルスベクター、ＡＡＶベクター）を含むベクターは、ＣＮＳ、末梢神経系、またはその両方に投与される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＣＮＳ、例えば脳または脊髄に直接投与される。直接投与は、ＣＮＳ細胞の形質導入の高い特異性をもたらし得、例えば形質導入された細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上はＣＮＳ細胞である。ＣＮＳにベクターを直接投与するための当技術分野において公知の任意の方法が使用され得る。ベクターは、脊髄、脳幹（延髄、橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭部、側頭部、頭頂葉および前頭葉を含めた大脳、大脳皮質、大脳基底核、海馬、ならびに扁桃体）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘に導入され得る。ベクターは、網膜、角膜、または視神経等、目の種々の領域にも投与され得る。ベクターは、ベクターのより分散した（ｄｉｓｐｅｒｓｅ）投与のために脳脊髄液（例えば、腰椎穿刺によって）に送達され得る。

【0163】

発現カセットを含むベクター（例えば、ウイルスベクター、ＡＡＶベクター）は、これらに限定されないが、髄腔内、脳内、脳室内、大槽内、実質内、鼻腔内、耳内、眼球内（例えば、硝子体内、網膜下、前眼房）、および眼球周囲（例えば、テノン嚢下領域）送達、またはその任意の組み合わせを含めた、当技術分野において公知の任意の経路によって、ＣＮＳの所望の領域に投与され得る。

【0164】

ベクターは、ＣＮＳ、末梢神経系、および／または他の組織を含めた、組織のより幅広い拡散した形質導入をもたらす様式で投与され得る。

【0165】

典型的に、発現カセットを含むベクター（例えば、ウイルスベクター、ＡＡＶベクター）は、ＣＮＳおよび／または他の組織における所望の領域または区画への直接注射（例えば、定位注射）によって液体製剤で投与されるであろう。一部の実施形態において、ベクターは、貯留槽および／またはポンプを介して送達され得る。他の実施形態において、ベクターは、所望の領域に局所適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。目へのまたは耳の中への投与は、液滴の局所適用によるものであり得る。さらなる代替策として、ベクターは、固形の徐放性製剤として投与され得る。パルボウイルスおよびＡＡＶベクターの制御放出は、国際公開ＷＯ０１／９１８０３によって記載される。

【0166】

注射物質は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前に溶解する溶液もしくは懸濁液に適した固体形態として、または乳濁液として、従来の形態で調製され得る。代替的に、全身よりもむしろ局所様式で、例えばデポー剤または持続放出製剤でウイルスベクターを投与し得る。さらには、ウイルスベクターは、骨移植代用品、縫合糸、ステント等の外科的に植え込み可能なマトリックスに乾燥させて送達され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号に記載される）。

【0167】

経口投与に適した医薬組成物は、それぞれが本発明の組成物の所定の量を含有するカプセル、カシェー、ドロップ、または錠剤等の個別の単位で；粉末もしくは顆粒として；水性もしくは非水性液体の溶液もしくは懸濁液として；または水中油型もしくは油中水型乳濁液として提示され得る。経口送達は、本発明のウイルスベクターを、動物の腸内の消化酵素による分解に耐え得る担体と複合体を形成することによって実施され得る。そのような担体の例は、当技術分野において公知のように、プラスチックカプセルまたは錠剤を含む。そのような製剤は、薬学の任意の適切な方法によって調製され、それは、組成物と適切な担体（上で記される１種または複数の補助的成分を含有し得る）との会合をもたらすステップを含む。一般的に、本発明の実施形態に従った医薬組成物は、組成物と液体もしくは微細化された固体担体、またはその両方とを均一にかつ密接に混和し、次いで必要な場合には、得られた混合物を形作ることによって調製される。例えば、錠剤は、組成物を含有する粉末または顆粒を、任意で１種または複数の補助的成分とともに圧縮するまたは成形することによって調製され得る。圧縮錠剤は、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、および／または表面活性剤／分散剤と任意に混合された、粉末または顆粒等の自由流動形態の組成物を適切な機械で圧縮することによって調製される。成形錠剤は、不活性液体結合剤で湿らせた粉末化合物を適切な機械で成形することによって作製される。

【0168】

口腔（舌下）投与に適した医薬組成物には、風味付けされた基剤、通常ではスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント中に本発明の組成物を含むドロップ剤；ならびに、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴム等の不活性基剤中に組成物を含むトローチ剤が含まれる。

【0169】

非経口投与に適した医薬組成物は、本発明の組成物の無菌の水性および非水性注射溶液を含み得、調製物は、意図されるレシピエントの血液と任意で等張である。これらの調製物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および組成物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。水性および非水性の無菌懸濁液、溶液、および乳濁液は、懸濁化剤および増粘剤を含み得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝媒体を含めた、水、アルコール性／水性の溶液、乳濁液、または懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくもの等）等を含む。例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等、防腐剤および他の添加物も存在し得る。

【0170】

組成物は、単位／用量または複数回用量容器中に、例えば密封アンプルおよびバイアル中に提示され得、使用の直前に無菌の液体担体、例えば生理食塩水または注射用水の添加のみを要するフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保管され得る。

【0171】

即時の注射溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の無菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。例えば、密封容器中に単位剤形での注射可能で安定な無菌の本発明の組成物が提供され得る。組成物は、凍結乾燥物の形態で提供され得、それは適切な薬学的に許容される担体で再構成されて、対象への注射に適した液体組成物を形成し得る。単位剤形は、約１μｇ～約１０グラムの本発明の組成物であり得る。組成物が実質的に非水溶性である場合、生理学的に許容される十分な量の乳化剤を十分な分量で含んで、水性担体中に組成物を乳化し得る。１つのそのような有用な乳化剤はホスファチジルコリンである。

【0172】

直腸投与に適した医薬組成物は、単位用量坐薬として提示され得る。これらは、組成物と、例えばココアバター等の１種または複数の従来の固体担体とを混和し、次いで得られた混合物を形作ることによって調製され得る。

【0173】

皮膚への局所適用に適した本発明の医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油の形態を取り得る。使用され得る担体は、これらに限定されないが、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、経皮増強剤、およびそれらの２種以上の組み合わせを含む。一部の実施形態において、例えば、局所送達は、本発明の医薬組成物と、皮膚に入り得る親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）とを混合することによって実施され得る。

【0174】

経皮投与に適した医薬組成物は、長期間にわたって対象の表皮と密接に接触したままであり続けるように適応した個別のパッチの形態にあり得る。経皮投与に適した組成物は、イオン導入（例えば、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３：３１８（１９８６）を参照されたい）によっても送達され得、典型的に、本発明の組成物の任意で緩衝された水溶液の形態を取る。適切な製剤は、クエン酸もしくはビス／トリス緩衝液（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み得、０．１～０．２Ｍの活性成分を含有し得る。

【0175】

本明細書に開示されるウイルスベクターは、任意の適切な手段によって、例えば対象が吸入する、ウイルスベクターから構成される呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液を投与することによって、対象の肺に投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であり得る。ウイルスベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知であるように、圧力駆動型エアロゾル噴霧器または超音波噴霧器等を用いた任意の適切な手段によって生成され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ウイルスベクターを含む固体粒子のエアロゾルは、医薬の技術分野において公知の技法によって、任意の固体微粒子薬用エアロゾル発生器を用いて同じように生成され得る。

【0176】

本発明は、以下の番号付けされた項のいずれか１つに規定されるとおりであり得る。
１．ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドであって、上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォームをコードする、ポリヌクレオチド。
２．上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォーム（すなわち、アイソフォーム１）および長いアイソフォーム２をコードする、第１項のポリヌクレオチド。
３．上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォーム（すなわち、アイソフォーム１）および長いアイソフォーム３をコードする、第１項のポリヌクレオチド。
４．上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、発現を低下させる１つまたは複数のヌクレオチド改変が欠如した天然ＯＲＦの発現と比較して、上記長いアイソフォームの発現を低下させる上記１つまたは複数のヌクレオチド改変を含む、第１項から第３項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
５．上記長いアイソフォームの上記発現は、発現を低下させるヌクレオチド改変を含まない天然ＯＲＦと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下する、第４項のポリヌクレオチド。
６．上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、発現を増強するヌクレオチド改変を含まない天然ＯＲＦと比較して、上記短いアイソフォームの発現を増強する（例えば、発現を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上増強する）１つまたは複数のヌクレオチド改変を含む、第１項から第５項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
７．上記短いアイソフォームの上記発現は、発現を増強するヌクレオチド改変を含まない天然ＯＲＦと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％増強される、第６項のポリヌクレオチド。
８．上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、上記長いアイソフォームの発現と比較して、約１：１～約１５：１の比での上記短いアイソフォームの発現をコードする１つまたは複数のヌクレオチド改変を含む、第１項から第７項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
９．上記長いアイソフォームに対するコード配列に作動可能に連結された、配列番号６を含む第１のコザック配列を含む、第１項から第８項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
１０．上記短いアイソフォームに対するコード配列に作動可能に連結された、配列番号８を含む第２のコザック配列を含む、第１項から第９項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
１１．上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化されている、第１項から第１０項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
１２．上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、ヒト細胞における細胞内または非分泌発現のためにコドン最適化されている、第１２項のポリヌクレオチド。
１３．上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームは、配列番号９、配列番号２５、もしくは配列番号２６のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも約７０％、７５％、７６％、７７％、８０％、８５％、もしくは９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、第１項から第１２項のいずれか１項のポリヌクレオチド。
１４．第１項から第１３項のいずれか１項のポリヌクレオチドを含む、発現カセット。
１５．上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームはプロモーターに作動可能に連結されている、第１４項の発現カセット。
１６．上記プロモーターはニューロン特異的プロモーターである、第１５項の発現カセット。
１７．上記プロモーターはヒトシナプシンプロモーターである、第１５項または第１６項の発現カセット。
１８．上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームはポリアデニル化シグナルに作動可能に連結されている、第１４項から第１７項のいずれか１項の発現カセット。
１９．上記ポリアデニル化シグナルはウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）である、第１８項の発現カセット。
２０．少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）をさらに含む、第１４項から第１９項のいずれか１項の発現カセット。
２１．上記発現カセットは２つのＡＡＶ ＩＴＲを含む、第２０項の発現カセット。
２２．上記ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、およびＡＡＶ１３ ＩＴＲからなる群から選択される、第２１項の発現カセット。
２３．上記ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ２ ＩＴＲである、第２２項の発現カセット。
２４．一本鎖ＡＡＶゲノムである、第１４項から第２３項のいずれか１項の発現カセット。
２５．プロモーター、上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、およびポリアデニル化部位を含む、第１４項から第２４項のいずれか１項の発現カセット。
２６．ＡＡＶ ＩＴＲ、プロモーター、上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ポリアデニル化部位、およびＡＡＶ ＩＴＲを含む、第１４項から第２５項のいずれか１項の発現カセット。
２７．ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ヒトシナプシンプロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォーム２を含む上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ｂＧＨｐＡ、ならびにＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、第１４項から第２６項のいずれか１項の発現カセット。
２８．ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ヒトシナプシンプロモーター、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォーム３を含む上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム、ｂＧＨｐＡ、ならびにＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、第１４項から第２６項のいずれか１項の発現カセット。
２９．ＡＡＶ２ ＩＴＲ；ヒトシナプシンプロモーター；配列番号６および／または配列番号８を含む、それから本質的になる、またはそれからなる１つまたは複数のコザック配列をさらに含む、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォーム２を含む上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム；ｂＧＨｐＡ；ならびにＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、第１４項から第２８項のいずれか１項の発現カセット。
３０．ＡＡＶ２ ＩＴＲ；ヒトシナプシンプロモーター；配列番号６および／または配列番号８を含む、それから本質的になる、またはそれからなる１つまたは複数のコザック配列をさらに含む、ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームおよび長いアイソフォーム３を含む上記ヒトＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレーム；ｂＧＨｐＡ；ならびにＡＡＶ２ ＩＴＲを含む、第１４項から第２８項のいずれか１項の発現カセット。
３１．配列番号１４のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも約９０％同一の配列を含む、第３０項の発現カセット。
３２．第１項から第１３項のいずれか１項のポリヌクレオチド、または第１４項から第３１項のいずれか１項の発現カセットを含む、ベクター。
３３．神経向性ベクターである、第３２項のベクター。
３４．ウイルスベクターである、第３２項または第３３項のベクター。
３５．ＡＡＶベクターである、第３４項のベクター。
３６．上記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、およびその組み合わせからなる群から選択される、第３４項のベクター。
３７．上記ＡＡＶベクターはＡＡＶ９またはＡＡＶ９由来ベクターである、第３５項のベクター。
３８．上記ＡＡＶ９由来ベクターは、ＰＨＰ．Ｂ、ＰＨＰ．ｅＢ、またはＡＡＶ９．ＨＲ）である、第３７項のベクター。
３９．第１項から第１３項のいずれか１項のポリヌクレオチド、第１４項から第３１項のいずれか１項の発現カセット、および／または第３２項から第３８項のいずれか１項のベクターを含む、形質転換細胞。
４０．上記ポリヌクレオチド、発現カセット、および／またはベクターは、上記細胞ゲノムに安定に組み入れられている、第３９項の形質転換細胞。
４１．第１項から第１３項のいずれか１項のポリヌクレオチド、第１４項から第３１項のいずれか１項の発現カセット、第３２項から第３８項のいずれか１項のベクター、および／または第３９項もしくは第４０項の形質転換細胞を含む、トランスジェニック動物。
４２．薬学的に許容される担体中に、第１項から第１３項のいずれか１項のポリヌクレオチド、第１４項から第３１項のいずれか１項の発現カセット、第３２項から第３８項のいずれか１項のベクター、および／または第３９項もしくは第４０項の形質転換細胞を含む、医薬組成物。
４３．細胞を、第１項から第１３項のいずれか１項のポリヌクレオチド、第１４項から第３１項のいずれか１項の発現カセット、および／または第３２項から第３８項のいずれか１項のベクターに接触させ、それによって上記細胞においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させるステップを含む、細胞においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させる方法。
４４．第１項から第１３項のいずれか１項のポリヌクレオチド、第１４項から第３１項のいずれか１項の発現カセット、第３２項から第３８項のいずれか１項のベクター、および／または第３９項もしくは第４０項の形質転換細胞を対象に送達し、それによって上記対象においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させるステップを含む、対象においてＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームを発現させる方法。
４５．第１項から第１３項のいずれか１項のポリヌクレオチド、第１４項から第３１項のいずれか１項の発現カセット、第３２項から第３８項のいずれか１項のベクター、および／または第３９項もしくは第４０項の形質転換細胞の治療有効量を対象に投与し、それによりＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームが上記対象において発現されるステップを含む、それを必要とする対象におけるＵＢＥ３Ａ遺伝子の異常発現またはＵＢＥ３Ａ遺伝子産物の異常活性と関連した障害を治療する方法。
４６．上記ＵＢＥ３Ａ遺伝子の発現と関連した上記障害はアンジェルマン症候群である、第４５項の方法。
４７．第１項から第１３項のいずれか１項のポリヌクレオチド、第１４項から第３１項のいずれか１項の発現カセット、第３２項から第３８項のいずれか１項のベクター、および／または第３９項もしくは第４０項の形質転換細胞の治療有効量を対象に投与し、それによりＵＢＥ３Ａオープンリーディングフレームが上記対象において発現されるステップを含む、それを必要とする対象におけるアンジェルマン症候群を治療する方法。
４８．上記ヒトＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームは、上記長いアイソフォームの発現と比較して約１：１～約１５：１の比で発現される、第４３項から第４７項のいずれか１項の方法。
４９．上記対象は、上記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞の送達前に疾患の症状を呈する、第４４項から第４８項のいずれか１項の方法。
５０．上記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は子宮内に送達される、第４４項から第４９項のいずれか１項の方法。
５１．上記対象はヒトである、第４４項から第５０項のいずれか１項の方法。
５２．上記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は、上記対象の神経系に送達される、第４４項から第５１項のいずれか１項の方法。
５３．上記ＡＡＶベクターは、少なくとも約１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４、１０^１５、または１０^１６ウイルスゲノム／キログラム、任意で１０^８～１０^１４ウイルスゲノム／キログラムの用量で上記対象に投与される、第４４項から第５２項のいずれか１項の方法。
５４．上記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は静脈内に送達される、第５２項の方法。
５５．上記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は、髄腔内、脳内、大槽内、実質内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼球内、もしくは眼球周囲送達、またはその任意の組み合わせによって送達される、第５２項の方法。
５６．上記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は髄腔内に送達される、第５５項の方法。
５７．上記ポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、および／または形質転換細胞は脳室内に送達される、第５５項の方法。

【0177】

本発明を記載しているが、それは、単に例示目的のために本明細書に含まれ、本発明を限定することを意図されない以下の実施例でさらに詳細に説明されるであろう。

【実施例】

【0178】

［実施例１］
細胞内発現のためのヒトＵＢＥ３Ａコドン最適化構築物の作出
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ｈＵＢＥ３Ａ＿アイソフォーム１＞＞３を組み入れたＰＨＰ．Ｂ／ＳＹＮ－ＵＢＥ３Ａと本明細書において称される、適当な発現比での短いおよび長いＵＢＥ３Ａアイソフォームの両方（例えば、ヒトアイソフォーム１（「短い」としても知られる）および３（「長い」としても知られる））の共送達を可能にする新規のアンジェルマン症候群療法を設計した。ウイルスベクターパッケージング制限により、通常では１つのアイソフォームのみの発現が可能となることから、これは著しい技術的利点である。この構築物は、２つの主な課題：（１）広く脳全体にわたるＵＢＥ３Ａの送達；および（２）自閉症の症候群型（Ｄｕｐ１５ｑ症候群）に関連付けられ得るＵＢＥ３Ａ過剰発現の回避、を克服する。ＡＡＶ９由来カプシドは、幼少期の間に送達された場合、脳全体にわたるニューロンに広く形質導入し得る。非ヒト霊長類およびヒトの脳におけるさらにより幅広い遺伝子移入を可能にし得る他のＡＡＶカプシドはあるものの、ＡＡＶ９由来カプシドを選択して、ＵＢＥ３Ａ過剰発現を限定することに留意した。

【0179】

加えて、この構築物は、細胞内（例えば、細胞質および／または核）ＵＢＥ３Ａを発現するために作出されたものであり、外因的に付加された分泌シグナルを含まず、それによってＵＢＥ３Ａの細胞外発現およびその分泌型の作出を阻止するという点で他の研究室において実施された仕事とは異なる。理論に拘束されることを望まないものの、分泌ＵＢＥ３ＡをもたらすＵＢＥ３Ａのそのような操作は、適当なレベルのＵＢＥ３Ａの発現を調節する能力を除去すると考えられ、それは危険な過剰発現につながり得ると思われる。ＵＢＥ３Ａの過剰発現は、自閉症の症候群型であるＤｕｐ１５ｑ症候群に関連付けられ得る。分泌ＵＢＥ３Ａは、ＵＢＥ３Ａ発現の細胞タイプ特異性または生体内分布の調節も喪失し得、ならびに翻訳後修飾の変更および／またはそのリガーゼ活性に対する基質相互作用の変更および／もしくは拡大を有し得る。この点において、本明細書に記載される構築物から作出されるＵＢＥ３Ａ産物は、以前に報告されているよりも優れた結果を生むと考えられる。

【0180】

図３Ｂは、短いヒトＵＢＥ３Ａ（ｈＵＢＥ３Ａ）アイソフォームの偏った発現を達成するベクター設計のための、コドン最適化ｈＵＢＥ３Ａ１＞＞３オープンリーディングフレームのコザック最適化の５’ベクターＤＮＡ配列（配列番号２０）（上）およびタンパク質（配列番号２１）（下）の概略を示している。長いおよび短いｈＵＢＥ３Ａの両方とも、同じリーディングフレームにおいてコードされる。ｈＵＢＥ３Ａの短いアイソフォームを始める第２の開始コドン（ＡＧＣＡＧＧＡＴＧＡ；配列番号２５）からの翻訳開始に偏るように、種々の強さのコザック配列を操作した（図３Ｂおよび図３Ｃ）。

【0181】

マウスがニューロンにおけるすべてのＵＢＥ３Ａアイソフォームの完全な喪失を示すＡＳマウスモデル（Ｕｂｅ３ａ^{ｍ－／ｐ＋}）において、構築物の発現特性を検討した（図４；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９８：２１（４）：７９９－８１１）。新生仔マウスに、生後Ｐ１日目に約１×１０^１１ウイルスゲノム（ｖｇ）のＡＡＶ９由来バリアントウイルスベクターＰＨＰ．Ｂ／ＳＹＮ－ｈＵＢＥ３Ａを脳室内（ＩＣＶ）注射し、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の補完的解析のために様々な時点で回収した。図５は、構築物から発現されたｈＵＢＥ３Ａ転写産物が、コドン最適化により導入された固有のヌクレオチド配列の存在に起因して、処理された対象において内因性ｍＲＮＡの中で選択的に検出され得ることを示している。構築物設計のこの態様を活用して、ＰＨＰ．Ｂ／ＳＹＮ－ｈＵＢＥ３Ａ生体内分布を忠実にたどり得、それによって、マウス、非ヒト霊長類、および最終的にはヒトにおける生体内送達（ｂｉｏｄｅｌｉｖｅｒｙ）ストラテジーの最適化を促し得る。該設計によってコードされるｈＵＢＥ３Ａ転写産物は、図６におけるウェスタンブロッティング実験によって示されるように、短いおよび長いｈＵＢＥ３Ａタンパク質アイソフォームの両方を発現し得ることが判明した。重要なことに、長いｈＵＢＥ３Ａに対する短いものの比は３：１であり、内因性マウスＵＢＥ３Ａアイソフォームに関して以前に観察された４：１比（Ａｖａｇｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１９：２２（８）：１２３５－１２４７）に近づき、コザック配列強度の操作により所望のｈＵＢＥ３Ａアイソフォーム比を達成する構築物設計の実現可能性を実証するものであった。

【0182】

図７Ａは、生後Ｐ１０、Ｐ１５、およびＰ２５日目に実施されたＵＢＥ３Ａ免疫組織化学（ＩＨＣ）によって証明されるように、新生仔ＡＳモデルマウスへのｈＵＢＥ３Ａ＿アイソフォーム１＞＞３産物の送達の成功を実証している。脳構造をより厳密に検討し、ＵＢＥ３ＡとニューロンマーカーＮｅｕＮとを共染色することにより、ほぼ完全な共局在が示され、これは、ＰＨＰ．Ｂ／ＳＹＮ－ＵＢＥ３Ａを用いたニューロンの非常に効率的な形質導入を示す（図７Ｂ）。ＵＢＥ３Ａタンパク質は、短いｈＵＢＥ３Ａアイソフォームの優勢な発現と一致した顕著な核局在を示した。矢印は、ＵＢＥ３Ａが再発現されなかった希少な海馬ニューロンを示し、これは、皮質および海馬におけるほとんどのニューロンがｈＵＢＥ３Ａ＿アイソフォーム１＞＞３産物を発現することを示す。

【0183】

定性的評価は、ｈＵＢＥ３Ａが遺伝子移入の後に細胞内局在の細胞質から核へのシフトを呈する、適当なレベルでのかつ細胞内局在の内因性パターンに従った、発達中の脳へのＵＢＥ３Ａアイソフォームの有効な再導入を示した（図８パネルＡ～Ｆ）。図８パネルＡ～Ｃは、Ｐ１におけるＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３ＡウイルスのＩＣＶ注射後の、Ｐ１０（パネルＡ）、Ｐ１５（パネルＢ）、およびＰ２５（パネルＣ）におけるＡＳモデルマウスからのＵＢＥ３Ａ染色された第２／３層新皮質を示している。Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０１４：５２２（８）：１８７４－１８９６からのパネルＤ～Ｆに示されるように、ウイルスにより形質導入されたｈＵＢＥ３Ａの核における段階的蓄積が発達にわたって見られ、内因性ＵＢＥ３Ａ発現の時空間パターンの忠実な再現であった。

【0184】

［実施例２］
ＡＳモデルマウスにおける解剖学的および行動的表現型の回復のためのヒトＵＢＥ３Ａコドン最適化構築物処理
図９は、１ヶ月齢の時点での遺伝子療法処理群（ＷＴ＋ＡＡＶおよびＡＳ＋ＡＡＶ）およびビヒクル処理ＷＴ対照（ＷＴ＋ビヒクル）において等価であった体重によって実証されるように、ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａが、ＷＴおよびＡＳモデルマウスの両方において概ね忍容性良好であったことを示している。ビヒクル処理ＡＳマウスは、成体期へと過大に重量を増やし、以前の報告（Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２０１７：３７（３１）：７３４７－７３６１）、およびＡＳ個体における成体発症肥満の臨床観察（Ｂｉｎｄｅｌｓ－ｄｅ Ｈｅｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ，２０２０：１８２（１）：５３－６３）の両方と一致した。この表現型は、ＡＳ＋ＡＡＶ群においてＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ処理によって完全にレスキューされた。

【0185】

新生仔ＩＣＶ ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ処理が、浸透率が高くかつ再現性のあるＡＳマウスモデル欠損をレスキューする能力についてのさらなる試験を遂行した（図１０、パネルＡ；Ｒｏｔａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０２０：Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）。図１０、パネルＢは、遺伝子療法処理によって影響を受けなかったＡＳ＋ビヒクルマウスにおける自発運動抑制（ｈｙｐｏｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ）の傾向を示している。ＡＳ＋ビヒクルおよびＡＳ＋ＡＡＶは、ロータロッド課題の最初の試行において同程度に低いパフォーマンスを呈し、ＡＳにおけるある特定のレベルの運動機能障害は、新生仔ＩＣＶ ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ処理に鈍感であり得ることを示唆した。しかしながら、繰り返しのロータロッド試験により、ＡＳ＋ＡＡＶマウスにおける運動学習および可塑性の能力の回復が明らかとなり、それは継続的な習得試行にわたって運動パフォーマンスを高め、それを経時的に対照レベル近くに持続させた（図１０、パネルＣ）。

【0186】

穴掘りおよび巣作りを含めた先天的行動も、ＡＳマウスにおいて重度に欠損していることが知られる（Ｒｏｔａｒｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０２０：Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）。図１０、パネルＤおよびＥは、十分に確立されたガラス玉覆い隠しおよび巣作りアッセイで、ＷＴ＋ビヒクル対照と比べてＡＳ＋ビヒクルマウスの低いパフォーマンスによって証明されるように、これらの表現型はＡＳ＋ビヒクルマウスにおいて再現されることを示している。これらの表現型の浸透率は、ＡＳ＋ＡＡＶ群において大きく低下し、多くの個々の対象は対照レベルで課題を実施した。それにもかかわらず、不良なＡＳ＋ＡＡＶ応答者の小サブセットがあり、それはガラス玉覆い隠しデータの広がりにおいてとりわけ目立った。これらの結果は、行動的レスキューの測定を狂わせる技術的誤差である低い注射標的化または広がりに起因して、処理の真の効力が過小評価されないことを確保するためのｈＵＢＥ３Ａ生体内分布についての慎重な事後解析を保証する。

【0187】

図１１は、フルロチル発作キンドリングおよび再負荷により明らかとなった、ＡＳ＋ビヒクルマウスにおける重度のてんかん発生の証拠を示している。この結果は、以前の調査（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１８：１２９（１）：１６３－１６８）の知見と一致しており、ＡＳマウスは、キンドリングの１ヶ月後のフルロチル再曝露に対して同程度に亢進した感度を呈した。さらに、ＡＳマウスにおける過剰なてんかん発生は、生後発達の間のＵＢＥ３Ａのタモキシフェン誘導性復活によるレスキューを受けやすく、したがって、新生仔ＩＣＶ ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ処理は、ＡＳ＋ＡＡＶマウスをフルロチル再負荷に対して回復力のある状態にした（図１１、パネルＢ）。

【0188】

脳回路への解剖学的および生理学的変化は、てんかん発生を規定する。フルロチルによりキンドリングされたＡＳマウスは、海馬において、具体的には歯状回の分子層においてペリニューロナルネット（ＰＮＮ）の堆積の増強を示す（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２０１８：１２９（１）：１６３－１６８）。図１２、パネルＡは、この異常なＰＮＮ表現型もＡＳ＋ビヒクルマウスにおいて浸透性であるが、ＡＳ＋ＡＡＶマウスにおいて十分にレスキューされたことを示している。反応性アストログリオーシスは、てんかん原性病巣の別の証である。図１２、パネルＢは、ＡＳ＋ビヒクルマウスの海馬において強くＧＦＡＰ染色されたアストロサイトの劇的な増加があり、それは、ＡＳ＋ＡＡＶ群において完全に正常化されることが判明したことを示している。集合的に、これらの調査は、新生仔ＩＣＶ ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ処理が、ＡＳにおける発作転帰を向上させることにおいて非常に有効であり得るという裏付けとなる証拠を提供する。

【0189】

ＷＴ＋ＡＡＶマウスは、これらの調査においてＵＢＥ３Ａ過剰発現の忍容性についての事実上の試験として働いた。ほとんどの場合、ＷＴ＋ＡＡＶおよびＷＴ＋ビヒクル群パフォーマンスは同程度であり、ＰＨＰ．Ｂ／ｈＵＢＥ３Ａ処理により生じるＵＢＥ３Ａ過剰発現が比較的忍容性良好であることを示唆した。しかしながら、ＷＴ＋ＡＡＶマウスは、適度に自発運動亢進性（ｈｙｐｅｒｌｏｃｏｍｏｔｉｖｅ）であることが判明し（図１０、パネルＢ）、それらはガラス玉覆い隠し課題でややパフォーマンスが及ばない（図１０、パネルＤ）。ゆえに、ある特定の行動および根本的な神経回路は、ＵＢＥ３Ａ過剰発現に対して、他のものよりも潜在的に脆弱であり得る。

【0190】

［実施例３］
インビトロおよびインビボでのヒト由来細胞における構築物処理
実施例１に記載される構築物は、ニューロンに分化しておりかつＡＳ細胞表現型を呈する、患者由来ｉＰＳＣにインビトロで送達されるであろう。次いで、レシピエント細胞は、構築物を受けていない適当な対照細胞と比較して、特徴的なＡＳ細胞表現型の回復について観察されるであろう。

【0191】

ＡＳ ｉＰＳＣ株は、主要な転写因子であるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、およびＬＩＮ２８を発現するレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによって多能性を付与される患者末梢皮膚または血液細胞から作出され得る（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００７：１３１：８６１－８７２；Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００８：２７：５４３－５４９）。一部の調製において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集を使用して、定型発達（ｎｅｕｒｏｔｙｐｉｃａｌ）患者に由来するｉＰＳＣに、ＡＳを引き起こすＵＢＥ３Ａ欠失を導入し得、ゆえに、付随する同質遺伝子対照を有する新規のＡＳ ｉＰＳＣ株が産出される。ＡＳ ｉＰＳＣは、確立されたプロトコールに従って補給剤および神経成長因子を含有する神経誘導培地を用いてニューロンに分化し得る（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０１０：１０７：１７６６８－１７６７３）。

【0192】

患者由来ＡＳニューロンは、静止膜電位の過分極および活動電位発火を含めた電気生理学的特性の特徴的に遅延した成熟を呈することが示されており、それは、薬理学的作用物質による父由来ＵＢＥ３Ａ非サイレンシング（ｕｎｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）によるレスキューを受けやすい（Ｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．，２０１７：Ａｐｒ ２４；８：１５０３８）。同様に、構築物を患者由来ＡＳニューロンに送達して（インビトロおよびインビボで）、ｈＵＢＥ３Ａの発現および電気生理学的成熟の正しい遅延を回復させるであろう。非ヒト霊長類およびヒトにおける概念実証治療に関して、構築物は、安全性および効力調査に基づき必要に応じて用量漸増を有して、１～３人の患者において早期介入段階（例えば、２歳未満）で送達されるであろう。臨床的有益性および安全性が評価されるであろう（例えば、適当な対照と比較して）。

【0193】

前述の実施例は本発明の例示であり、それを限定するものとして解釈されるべきではない。本発明は、好ましい実施形態を参照して詳細に記載されているものの、変形および改変は、以下の特許請求の範囲において記載されかつ規定される本発明の範囲および精神の範囲内にある。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

2022533448000001.app

【国際調査報告】