知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ウルトラジェニクス ファーマシューティカル インク．の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-22
(54)【発明の名称】ヘモクロマトーシスの処置のための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220714BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20220714BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220714BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20220714BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20220714BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220714BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20220714BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220714BHJP
A61K 9/72 20060101ALI20220714BHJP
A61K 47/20 20060101ALI20220714BHJP
A61K 38/17 20060101ALN20220714BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/88 Z
A61P43/00 111
A61P3/00
A61P7/00
A61K48/00
A61K9/107
A61K9/127
A61K9/72
A61K47/20
A61K38/17
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021569849
(86)(22)【出願日】2020-05-22
(85)【翻訳文提出日】2022-01-21
(86)【国際出願番号】 US2020034377
(87)【国際公開番号】W WO2020243002
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】62/852,549
(32)【優先日】2019-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/991,907
(32)【優先日】2020-03-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516134291
【氏名又は名称】ウルトラジェニクス ファーマシューティカル インク．
【氏名又は名称原語表記】ＵＬＴＲＡＧＥＮＹＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】ドガーティ，ショーン クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ウォン，ティモシー プレストン
(72)【発明者】
【氏名】カーソン，ロザリン ドゥ
(72)【発明者】
【氏名】カタルド，ジェイソン ロバート
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA17
4C076AA19
4C076AA93
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB21
4C076BB25
4C076BB27
4C076BB31
4C076CC14
4C076CC21
4C076CC29
4C076DD16
4C076DD55
4C076FF11
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA53
4C084CA56
4C084DC50
4C084MA05
4C084MA22
4C084MA24
4C084MA52
4C084MA56
4C084MA59
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA511
4C084ZA512
4C084ZC021
4C084ZC022
4C084ZC211
4C084ZC212
(57)【要約】
本発明は、機能的に活性な遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)またはその機能的に活性なフラグメントのためのコード配列を含む、ポリヌクレオチドを提供する。本発明は、該ポリヌクレオチドを含む組成物および対象におけるヘモクロマトーシスの予防または処置におけるその使用方法をさらに提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)またはそのフラグメントを発現するためのポリヌクレオチドであって、ここで、該ポリヌクレオチドは天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドを含み、ヒトＨＦＥまたはＨＦＥ活性を有するそのフラグメントを提供するように発現し得る、ポリヌクレオチド。
【請求項2】
ポリヌクレオチドがヒトＨＦＥ野生型ｍＲＮＡと比較してコドン最適化されている、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項3】
修飾ヌクレオチドが５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、５－プロピニルシチジン、２－チオシチジン；
５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５,６－ジヒドロ－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン、２’－アジド－２’－デオキシウリジン、４－チオウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシメチルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－プロピニルウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨードウリジン、５－フルオロウリジン；
シュードウリジン、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２’－Ｏ－メチル－Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシメチルシュードウリジン、アラウリジン；
Ｎ６－メチルアデノシン、２－アミノアデノシン、３－メチルアデノシン、７－デアザアデノシン、８－オキソアデノシン、イノシン；
チエノグアノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソグアノシンおよび６－Ｏ－メチルグアニン
から選択される、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項4】
修飾ヌクレオチドが５－メトキシウリジンである、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項5】
修飾ヌクレオチドがＮ１－メチルシュードウリジンである、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項6】
修飾ヌクレオチドがシュードウリジンとＮ１－メチルシュードウリジンの組み合わせである、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項7】
修飾ヌクレオチドが５－メトキシウリジンとＮ１－メチルシュードウリジンの組み合わせである、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項8】
ポリヌクレオチドが５’－キャップ、５’非翻訳領域、コード領域、３’非翻訳領域およびテイル領域を含む、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項9】
ポリヌクレオチドがヒトＨＦＥまたはＨＦＥ活性を有するそのフラグメントを発現するよう哺乳動物細胞で翻訳可能である、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項10】
ポリヌクレオチドが、対象でインビボでヒトＨＦＥまたはＨＦＥ活性を有するそのフラグメントを発現するよう翻訳し得る、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項11】
ポリヌクレオチドがヒトＨＦＥ野生型ｍＲＮＡと比較して免疫原性が低減されている、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項12】
ポリヌクレオチド配列番号４～３１から選択される核酸塩基配列を含む、請求項１のポリヌクレオチド。
【請求項13】
５’－キャップがＮ７－メチル－Ｇｐｐｐ(２’－Ｏ－メチル－Ａ)を含む、請求項８のポリヌクレオチド。
【請求項14】
５’非翻訳領域が配列番号３３を含むまたはそれからなる、請求項８のポリヌクレオチド。
【請求項15】
３’非翻訳領域が配列番号３５を含むまたはそれからなる、請求項８のポリヌクレオチド。
【請求項16】
テイル領域がポリＡテイル領域である、請求項８のポリヌクレオチド。
【請求項17】
ポリＡテイル領域が６０～２２０アデノシンヌクレオチドである、請求項１６のポリヌクレオチド。
【請求項18】
ポリＡテイル領域が約８０ヌクレオチド長である、請求項１７のポリヌクレオチド。
【請求項19】
配列番号４～３１から選択される核酸塩基配列と少なくとも９５％同一である核酸塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項20】
ポリヌクレオチドが配列番号４～３１から選択される核酸塩基配列と少なくとも９９％同一である核酸塩基配列を含む、請求項１９のポリヌクレオチド。
【請求項21】
ポリヌクレオチドが配列番号４～３１から選択される核酸塩基を含む、請求項１９のポリヌクレオチド。
【請求項22】
少なくとも１つのウリジンヌクレオチドが５－メトキシウリジンヌクレオチドで置換されている、請求項１９のポリヌクレオチド。
【請求項23】
全ウリジンヌクレオチドが５－メトキシウリジンヌクレオチドで置換されている、請求項１９のポリヌクレオチド。
【請求項24】
少なくとも１つのウリジンヌクレオチドがＮ１－メチルシュードウリジンヌクレオチドで置換されている、請求項１９のポリヌクレオチド。
【請求項25】
全ウリジンヌクレオチドが５－メトキシウリジンヌクレオチドで置換されている、請求項１９のポリヌクレオチド。
【請求項26】
ポリヌクレオチドが５’－キャップ、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域および／またはテイル領域をさらに含む、請求項１９のポリヌクレオチド。
【請求項27】
５’－キャップがＮ７－メチル－Ｇｐｐｐ(２’－Ｏ－メチル－Ａ)を含む、請求項２６のポリヌクレオチド。
【請求項28】
５’非翻訳領域が配列番号３３を含むまたはそれからなる、請求項２６のポリヌクレオチド。
【請求項29】
３’非翻訳領域が配列番号３５を含むまたはそれからなる、請求項２６のポリヌクレオチド。
【請求項30】
テイル領域がポリＡテイル領域である、請求項２６のポリヌクレオチド。
【請求項31】
ポリＡテイル領域が６０～２２０アデノシンヌクレオチドである、請求項３０のポリヌクレオチド。
【請求項32】
ポリＡテイル領域が約８０ヌクレオチド長である、請求項３１のポリヌクレオチド。
【請求項33】
ポリヌクレオチドが配列番号４の核酸塩基配列を含む、請求項１９のポリヌクレオチド。
【請求項34】
１以上の請求項１～３３の何れかに記載のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項35】
担体がトランスフェクション試薬、脂質ナノ粒子またはリポソームを含む、請求項３４の組成物。
【請求項36】
担体が脂質ナノ粒子である、請求項３５の組成物。
【請求項37】
脂質ナノ粒子がＡＴＸ－００２、ＡＴＸ－０８１、ＡＴＸ－０９５またはＡＴＸ－１２６から選択されるカチオン性脂質を含む、請求項３６の組成物。
【請求項38】
薬物療法において使用するための、請求項３４～３７のいずれかの組成物。
【請求項39】
ヒトまたは動物身体の処置に使用するための、請求項３４～３７のいずれかの組成物。
【請求項40】
処置を必要とする対象における、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)の活性低減に関連する疾患または障害の改善、予防、発症遅延または処置用医薬の調製または製造のための、請求項３４～３７のいずれかの組成物の使用。
【請求項41】
疾患が遺伝性ヘモクロマトーシスである、請求項４０の使用。
【請求項42】
対象に請求項３４～３７のいずれかの組成物を投与することを含む、処置を必要とする対象における、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)の活性低減に関連する疾患または障害の改善、予防、発症遅延または処置のための方法。
【請求項43】
疾患が遺伝性ヘモクロマトーシスである、請求項４２の方法。
【請求項44】
対象に請求項３４～３７のいずれかの組成物を投与することを含む、処置を必要とする対象における、ヘモクロマトーシスを改善、予防、発症遅延または処置する方法。
【請求項45】
ヘモクロマトーシスが遺伝性ヘモクロマトーシスおよび続発性ヘモクロマトーシスから選択される、請求項４４の方法。
【請求項46】
ヘモクロマトーシスが遺伝性ヘモクロマトーシスである、請求項４５の方法。
【請求項47】
ヘモクロマトーシスが続発性ヘモクロマトーシスある、請求項４５の方法。
【請求項48】
投与が静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、経鼻または吸入である、請求項４２～４７の何れかの方法。
【請求項49】
投与が１日１回、毎週、２週毎、毎月、２か月毎、四半期または毎年である、請求項４２～４８の何れかの方法。
【請求項50】
投与が０.０１～１０mg／kgの用量を含む、請求項４２～４９の何れかの方法。
【請求項51】
組成物が約０.１mg／kg、０.３mg／kg、０.５mg／kg、１mg／kg、３mg／kg、５mg／kgまたは約１０mg／kgの用量で投与される、請求項４２～４９の何れかの方法。
【請求項52】
投与が対象の肝臓におけるＨＦＥ発現を増加させる、請求項４２～５１の何れかの方法。
【請求項53】
０.１～５００mg用量の１以上の請求項１～３３の何れかに記載のポリヌクレオチドおよび該用量を投与するためのデバイスを含む、インビボでヒトＨＦＥを発現させるためのキット。
【請求項54】
デバイスが注射針、静脈注射針または吸入デバイスである、請求項５３のキット。
【請求項55】
配列番号１の完全長ヒトＨＦＥコード配列にわたり野生型ヒトＨＦＥコード配列と９５％未満同一である核酸塩基配列を含み、ヒトＨＦＥコード配列が配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９５％同一である、ポリヌクレオチド。
【請求項56】
配列番号１の完全長ヒトＨＦＥコード配列にわたり野生型ヒトＨＦＥコード配列と９５％未満同一である核酸塩基配列からなり、ヒトＨＦＥコード配列が配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９５％同一である、ポリヌクレオチド。
【請求項57】
配列番号１の完全長ヒトＨＦＥコード配列にわたり野生型ヒトＨＦＥコード配列と９５％未満同一である核酸塩基配列を含み、ヒトＨＦＥコード配列が配列番号４と少なくとも９５％同一である、ポリヌクレオチド。
【請求項58】
配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９８％同一である核酸塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項59】
配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９９％同一である核酸塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項60】
配列番号４～３１から選択される核酸塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項61】
配列番号４の核酸塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項62】
配列番号６７の核酸塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本発明は、２０１９年５月２４日出願の米国仮出願６２／８５２,５４９および２０２０年３月１９日出願の米国仮出願６２／９９１,９０７に基づく利益を主張し、それら各々の内容を、引用により全体として本明細書に包含させる。
本発明は、２０１９年５月２４日出願の米国仮出願６２／８５２,５４９および２０２０年３月１９日出願の米国仮出願６２／９９１,９０７に基づく利益を主張し、それら各々の内容を、引用により全体として本明細書に包含させる。
【0002】
発明の技術分野
本発明は、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)をコードする核酸分子およびヘモクロマトーシスの処置に使用するためのそれを含む組成物に関する。
本発明は、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)をコードする核酸分子およびヘモクロマトーシスの処置に使用するためのそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
発明の背景
１型ヘモクロマトーシスまたは遺伝的ヘモクロマトーシスとしても知られる遺伝性ヘモクロマトーシス(ＨＨ)は、変異ＨＦＥタンパク質(遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質としても知られる)が原因の常染色体劣性障害である。ＨＦＥタンパク質における変異は、通常の食事摂取量であっても、体内、特に肝臓、膵臓、心臓、甲状腺、下垂体および関節への多量の鉄沈着に至る、鉄の腸吸収の増加を引き起こす。過剰の鉄沈着は、処置しないままであれば、肝硬変、糖尿病、関節症、うっ血性心不全、性腺機能低下症および皮膚色素沈着を生じる可能性のある組織損傷および線維症を起こす。
１型ヘモクロマトーシスまたは遺伝的ヘモクロマトーシスとしても知られる遺伝性ヘモクロマトーシス(ＨＨ)は、変異ＨＦＥタンパク質(遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質としても知られる)が原因の常染色体劣性障害である。ＨＦＥタンパク質における変異は、通常の食事摂取量であっても、体内、特に肝臓、膵臓、心臓、甲状腺、下垂体および関節への多量の鉄沈着に至る、鉄の腸吸収の増加を引き起こす。過剰の鉄沈着は、処置しないままであれば、肝硬変、糖尿病、関節症、うっ血性心不全、性腺機能低下症および皮膚色素沈着を生じる可能性のある組織損傷および線維症を起こす。
【0004】
３０を超える種々の疾患を引き起こすＨＦＥ変異がＨＨで究明されており、Ｃｙｓ２８２Ｔｙｒ(Ｃ２８２Ｙ)、Ｈｉｓ６３Ａｓｐ(Ｈ６３Ｄ)およびＳｅｒ６５Ｃｙｓ(Ｓ６５Ｃ)を含む。最も多く見られる変異は、ＨＦＥタンパク質におけるＣｙｓ２８２Ｔｙｒアミノ酸置換(すなわち、Ｃ２８２Ｙ)を起こす８４５Ｇ多型である。Ｃ２８２Ｙ変異は、ＨＦＥタンパク質におけるジスルフィド結合の形成を妨害し、β２－ミクログロブリンに結合する能力を損なわせる。その結果、ＨＦＥタンパク質は細胞表面に到達できず、細胞内で凝集し、これが、ヘプシジンｍＲＮＡ発現減少、血漿ヘプシジンレベル低下および過剰な全身性の鉄蓄積に至るシグナル伝達障害を起こす。遺伝的疾患は、鉄過負荷および臓器損傷が最小である初期に認識され得る。この段階で、疾患は、漸く早期または前硬変期ヘモクロマトーシスと称される。
【0005】
ＨＨの現在の標準治療は瀉血である。体内の鉄の主要動員因子である赤血球の除去により、鉄毒性は最小化され得る。患者は、鉄レベルを正常まで下げるために、各５００mLで１００回を超える瀉血を必要とし得る。瀉血は、通常誘導期の間、３年間まで週１回または２回実施される。過剰の体内鉄が除去され、フェリチンレベルが５０μg／Ｌ未満の定値に達したら、生涯の、しかし低頻度の、瀉血(一般に年４～８回)が、５０μg／Ｌ未満の血清フェリチンレベルを維持するために、維持期の間必要である。
【0006】
瀉血は、一部患者で有効な治療ではあるが、静脈アクセス困難、低血圧、うっ血性心不全またはＨＨに関連する合併症により瀉血が不適格である患者小集団がある。さらに、一部ＨＨ患者は、瀉血(例えば、注射針恐怖症による)に対するコンプライアンスが低い可能性がありまたは処置後貧血、皮下出血および／または意識朦朧に苦しみ得る。
【0007】
瀉血に付随する合併症を考慮して、特に、瀉血レジメンの開始または維持が本意でないまたは不可能である患者のための、ＨＨの別の治療法の必要がある。
【0008】
ＨＨに加えて、異常ヘモグロビン症(例えば、鎌状赤血球症、サラセミアおよび鉄芽球性貧血)、先天性溶血性貧血および骨髄異形成を有する患者に起こり得る続発性ヘモクロマトーシスとして知られる、もう一つの形態のヘモクロマトーシスがある。続発性ヘモクロマトーシス(二次鉄過負荷としても知られる)を有する患者において、鉄過負荷は、鉄吸収増加、貧血処置のために与えられた外因性鉄および反復輸血が原因である。これらの患者の一部における鉄吸収増加は、鉄吸収の損害因子であるヘプシジンの欠乏または抑制が原因である可能性がある。Papanikolaou et al., 2005, Blood 105(10): 4103-5参照。事実、Kautzらは、ヘプシジン合成および鉄恒常性の赤血球系調節因子であるエリスロフェロン(ＥＦＲＥ)が、βサラセミアのマウスモデルで異常に高いレベルで発現され、ＥＲＦＥがヘプシジンｍＲＮＡ発現の抑制に介在し、鉄過負荷に寄与できることを示した。Kautz et al., 2015, Blood 126(17): 2031-7参照。続発性ヘモクロマトーシスは、通常、デフェロキサミンまたはデフェラシロクスなどの鉄キレート剤で処置されるが、残念ながら、これらの治療は投与が複雑であり、患者を非常に長時間拘束することが必要であるおよび／または低血圧、ＧＩ障害、盲聾障害ならびに肝機能および腎機能異常などの有害作用を伴うことがある。故に、続発性ヘモクロマトーシスを有する患者のための別の治療法の必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、ＨＨなどの機能的ＨＦＥタンパク質の欠乏に関連する疾患または状態または続発性ヘモクロマトーシスなどのヘプシジンの減少または抑制に関連する他の疾患または状態を改善、予防または処置できる、機能的ＨＦＥタンパク質を提供するように翻訳されることができる核酸分子の提供により、ヘモクロマトーシスの別の治療法の必要性に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【0010】
発明の要約
本発明は、機能的に活性なタンパク質またはそのフラグメントを提供するために使用できる、新規核酸分子を含む組成物を提供する。本発明は、さらに、遺伝性ヘモクロマトーシス(ＨＨ)および続発性ヘモクロマトーシスを含む種々の障害の予防または処置のための、新規核酸分子を含むこれら組成物の使用方法も提供する。より具体的に、本発明の実施態様は、機能的に活性な遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥタンパク質)またはその機能的に活性なフラグメントを提供するための翻訳可能核酸分子を含む組成物およびヘモクロマトーシスの処置のためのその使用方法を提供する。ある実施態様において、本発明の核酸分子は、ＨＨなどのＨＦＥタンパク質欠乏に関連する疾患または状態または続発性ヘモクロマトーシスなどのヘプシジンの減少または抑制に関連する他の疾患または状態の改善、予防または処置のために機能的に活性であるＨＦＥタンパク質産物を提供するように発現可能であり得る。
本発明は、機能的に活性なタンパク質またはそのフラグメントを提供するために使用できる、新規核酸分子を含む組成物を提供する。本発明は、さらに、遺伝性ヘモクロマトーシス(ＨＨ)および続発性ヘモクロマトーシスを含む種々の障害の予防または処置のための、新規核酸分子を含むこれら組成物の使用方法も提供する。より具体的に、本発明の実施態様は、機能的に活性な遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥタンパク質)またはその機能的に活性なフラグメントを提供するための翻訳可能核酸分子を含む組成物およびヘモクロマトーシスの処置のためのその使用方法を提供する。ある実施態様において、本発明の核酸分子は、ＨＨなどのＨＦＥタンパク質欠乏に関連する疾患または状態または続発性ヘモクロマトーシスなどのヘプシジンの減少または抑制に関連する他の疾患または状態の改善、予防または処置のために機能的に活性であるＨＦＥタンパク質産物を提供するように発現可能であり得る。
【0011】
第一の態様において、本発明は、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥタンパク質)のｍＲＮＡコード配列またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドに関する。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの混合物を含む。故に、ある実施態様において、本発明は、ヒト遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)またはそのフラグメントを発現するためのポリヌクレオチドに関し、ここで、ポリヌクレオチドは天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドを含み、ヒトＨＦＥまたはＨＦＥ活性を有するそのフラグメントを提供するように発現可能である。
【0012】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列は、野生型コード配列である。別の実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列は、コドン最適化配列である。ある例示的実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列は、ヒトでの発現のためにコドン最適化されている。
【0013】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質は、配列番号１に示す野生型コード配列によりコードされる。他の実施態様において、UniProtKB/Swiss-Prot Accession Nos. Q6B0J5(配列番号２)またはF8W7W8(配列番号３)に示されるＨＦＥタンパク質などのＨＦＥタンパク質の天然アイソフォームを発現するコード配列が使用され得る。別の実施態様において、ＨＦＥタンパク質は、配列番号１に示す野生型コード配列と９５％未満同一であるコドン最適化コード配列によりコードされる。ある例示的実施態様において、ＨＦＥタンパク質は、配列番号４～３１から選択される核酸を含むまたはそれからなるコドン最適化コード配列によりコードされる。ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドは、コドン最適化コード配列のすぐ下流に停止コドン(ＵＧＡ、ＵＡＡまたはＵＡＧ)をさらに含む。ある実施態様において、発現されたＨＦＥタンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列(GenBank Accession No. NP_000401.1、UniProtKB Accession No. Q30201、３４８アミノ酸)を含むまたはそれからなる。ある実施態様において、発現されたポリペプチドは、機能的ＨＦＥ活性を保持する配列番号３２のフラグメントである。
【0014】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、５’－キャップをさらに含む。ある実施態様において、５’－キャップは、Ｎ７－メチル－Ｇｐｐｐ(２’－Ｏ－メチル－Ａ)を含む。当業者には認識されるとおり、５’－キャップは、ＲＮＡオリゴマーの５’末端にＡ残基を提供できる。
【0015】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、５’非翻訳領域(５’ＵＴＲ)配列をさらに含む。ある実施態様において、５’ＵＴＲ配列は、配列番号３３～３４から選択される。例示的実施態様において、５’ＵＴＲ配列は、配列番号３３を含むまたはそれからなる。
【0016】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、３’非翻訳領域(３’ＵＴＲ)配列をさらに含む。ある実施態様において、３’ＵＴＲ配列は、配列番号３５～３６から選択される。例示的実施態様において、３’ＵＴＲ配列は、配列番号３５を含むまたはそれからなる。
【0017】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、３’ポリＡテイル配列をさらに含む。ある実施態様において、ポリＡテイル配列の長さは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００または３００ヌクレオチドであり得る。ある実施態様において、３’ポリＡテイル配列は、約５～３００アデノシンヌクレオチド(例えば、約３０～２５０アデノシンヌクレオチド、約６０～２２０アデノシンヌクレオチド、約８０～２００アデノシンヌクレオチド、約９０～約１５０アデノシンヌクレオチドまたは約１００～約１２０アデノシンヌクレオチド)含む。ある実施態様において、３’ポリＡテイル配列は、６０～２２０アデノシンヌクレオチドである。例示的実施態様において、３’ポリＡテイル配列は、約８０ヌクレオチド長である。他の例示的実施態様において、３’ポリＡテイル配列は約１００ヌクレオチド長である。さらに他の例示的実施態様において、３’ポリＡテイル配列は約１１５ヌクレオチド長である。
【0018】
ある実施態様において、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥタンパク質)のｍＲＮＡコード配列またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドは、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、５－プロピニルシチジン、２－チオシチジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５,６－ジヒドロ－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン、２’－アジド－２’－デオキシウリジン、４－チオウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシメチルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－プロピニルウリジン、５－ブロモウリジン、５－ヨードウリジン、５－フルオロウリジン、シュードウリジン、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２’－Ｏ－メチル－Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシメチルシュードウリジン、アラウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、２－アミノアデノシン、３－メチルアデノシン、７－デアザアデノシン、８－オキソアデノシン、イノシン、チエノグアノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソグアノシンおよび６－Ｏ－メチルグアニンから選択される１以上の修飾ヌクレオチドを含む。
【0019】
ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、１以上のシュードウリジンを含む。ある実施態様において、シュードウリジン残基は、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、Ｎ１－プロピルシュードウリジン、Ｎ１－シクロプロピルシュードウリジン、Ｎ１－フェニルシュードウリジン、Ｎ１－アミノメチルシュードウリジン、Ｎ３－メチルシュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシシュードウリジンおよびＮ１－ヒドロキシメチルシュードウリジンから選択される。例示的実施態様において、ポリヌクレオチドは、ウリジン残基の代わりにＮ１－メチルシュードウリジン残基を含むよう完全に修飾される。
【0020】
別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシメチルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－プロピニルウリジン、５－ブロモウリジン、５－フルオロウリジン、５－ヨードウリジン、２－チオウリジンおよび６－メチルウリジンから選択される１以上の修飾ヌクレオチドを含む。例示的実施態様において、ポリヌクレオチドは、ウリジン残基の代わりに５－メトキシウリジン残基を含むよう完全に修飾される。
【0021】
ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ウリジン残基の代わりに修飾ヌクレオチドの混合物、例えば、５－メトキシウリジン残基とＮ１－メチルシュードウリジン残基の混合物を含み得る。
【0022】
他の態様において、本発明は、ＨＦＥをコードする新規コドン最適化ｍＲＮＡ配列を提供する。ある実施態様において、ＨＦＥをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号４～３１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.９％またはそれ以上同一である。ある実施態様において、本発明は、配列番号１に示す野生型コード配列と８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％未満同一であるＨＦＥをコードする核酸配列を提供する。例示的実施態様において、本発明は、配列番号４～３１から選択される配列を含むまたはそれからなるＨＦＥをコードする核酸配列を提供する。機能的ＨＦＥ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号４～３１に示す核酸配列のフラグメントもさらに提供される。ある実施態様において、核酸配列は、３’末端に停止コドン(ＵＧＡ、ＵＡＡまたはＵＡＧ)をさらに含み得る。
【0023】
さらに他の態様において、本発明は、配列番号１の完全長ヒトＨＦＥコード配列にわたり野生型ヒトＨＦＥコード配列と９５％未満同一である核酸塩基配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドに関し、ここで、ヒトＨＦＥコード配列は、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９５％同一である。例示的実施態様において、本発明は、配列番号４の核酸塩基配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【0024】
さらに他の態様において、本発明は、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９５％同一である核酸塩基配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドに関する。ある実施態様において、本発明は、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９５％同一である核酸塩基配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドに関する。他の実施態様において、本発明は、配列番号４～３１から選択される配列と少少なくとも９８％同一である核酸塩基配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドに関する。さらに他の実施態様において、本発明は、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９９％同一である核酸塩基配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドに関する。さらに他の実施態様において、本発明は、配列番号４～３１から選択される核酸塩基配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドに関する。
【0025】
さらなる態様において、本発明は、ＨＦＥをコードするｍＲＮＡ配列を提供するよう翻訳され得る新規コドン最適化ＤＮＡ配列を提供する。従って、本発明は、さらに、配列番号３７～６４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.９％またはそれ以上同一である核酸配列に関する。例示的実施態様において、本発明は、配列番号３７～６４から選択されるＨＦＥをコードするｍＲＮＡ配列を提供するよう翻訳され得る核酸配列を提供する。機能的ＨＦＥ活性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列を提供するよう翻訳され得る配列番号３７～６４に示す核酸配列のフラグメントもさらに提供される。ある実施態様において、コドン最適化ＤＮＡ配列は、３’末端に停止コドン(ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ)をさらに含み得る。
【0026】
他の態様において、本発明は、(１)ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントおよび(２)薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。ある実施態様において、薬学的に許容される担体は、トランスフェクション試薬、ナノ粒子(例えば、脂質ナノ粒子)またはリポソームから選択される。
【0027】
例示的実施態様において、薬学的に許容される担体は脂質ナノ粒子である。例示的実施態様において、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、凝集低減剤(例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)脂質またはＰＥＧ修飾脂質)、非カチオン性脂質(例えば中性脂質)およびステロールを含む。さらなる例示的実施態様において、脂質ナノ粒子は、約２０～６０％カチオン性脂質：５～２５％非カチオン性脂質：２５～５５％ステロール：０.５～１５％ＰＥＧ－脂質のモル比で、少なくとも１つのカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ステロール、例えば、コレステロールおよびＰＥＧ－脂質を含む。さらに他の実施態様において、カチオン性脂質は、下記詳細な記載に記載のとおり、ＡＴＸ－００２、ＡＴＸ－０８１、ＡＴＸ－０９５およびＡＴＸ－１２６から選択される。
【0028】
さらなる態様において、本発明は、例えば、ヒトまたは動物身体の処置における、薬物療法における(１)ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントおよび(２)薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物の使用に関する。
【0029】
他の態様において、本発明は、処置を必要とする対象における、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)の活性低減に関連する疾患または障害の改善、予防、発症遅延または処置のための医薬の調製または製造のための、(１)ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントおよび(２)薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物の使用に関する。ある実施態様において、疾患または障害は、遺伝性ヘモクロマトーシスである。
【0030】
さらに他の態様において、本発明は、処置を必要とする対象における、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)の活性低減に関連する疾患または障害の改善、予防、発症遅延または処置のための方法であって、対象、(１)ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントおよび(２)薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。ある実施態様において、疾患または障害は、遺伝性ヘモクロマトーシスである。
【0031】
さらに他の態様において、本発明は、ヒト対象におけるヘモクロマトーシスを処置する方法であって、ヒト対象に治療有効量の本発明の医薬組成物、例えば、(１)ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントおよび(２)薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。ある実施態様において、ヘモクロマトーシスは遺伝性ヘモクロマトーシス(ＨＨ)である。ある実施態様において、ヘモクロマトーシスは続発性ヘモクロマトーシスある。ある実施態様において、本発明は、ヒト対象におけるヘモクロマトーシスを処置する方法であって、ヒト対象に(１)ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントおよび(２)薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。例示的実施態様において、薬学的に許容される担体は脂質ナノ粒子である。さらなる例示的実施態様において、ナノ粒子は、カチオン性脂質、凝集低減剤(例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)脂質またはＰＥＧ修飾脂質)、非カチオン性脂質(例えば中性脂質)およびステロールを含む。他のさらなる例示的実施態様において、ナノ粒子は、約２０～６０％カチオン性脂質：５～２５％非カチオン性脂質：２５～５５％ステロール：０.５～１５％ＰＥＧ－脂質のモル比で、少なくとも１つのカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ステロール、例えば、コレステロールおよびＰＥＧ－脂質を含む。ある実施態様において、カチオン性脂質は、ＡＴＸ－００２、ＡＴＸ－０８１、ＡＴＸ－０９５およびＡＴＸ－１２６から選択される。ある実施態様において、医薬組成物は、配列番号４～３１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.９％またはそれ以上同一であるＨＦＥをコードするコドン最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。例示的実施態様において、医薬組成物は、配列番号４と少なくとも９５％同一であるＨＦＥをコードするコドン最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。他の例示的実施態様において、医薬組成物は、配列番号４と少なくとも９８％同一であるＨＦＥをコードするコドン最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【0032】
さらに他の態様において、本発明は、ヒト対象における遺伝性ヘモクロマトーシスを処置する方法であって、ＨＦＥに少なくとも１変異を有すると診断されたヒト対象に、治療有効量のここに記載する医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【0033】
ある実施態様において、本発明の医薬組成物は、静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、経鼻または吸入投与を介して投与される。
【0034】
ある実施態様において、本発明の医薬組成物は、１日１回、毎週、２週毎、毎月、２か月毎、四半期毎または毎年投与される。
【0035】
ある実施態様において、本発明の医薬組成物は、約０.０１～約１０mg／kgの用量で投与される。ある実施態様において、本発明の医薬組成物は、約０.１mg／kg、０.３mg／kg、０.５mg／kg、１mg／kg、３mg／kg、５mg／kgまたは約１０mg／kgの用量で投与される。
【0036】
さらに他の態様において、本発明は、インビボでヒトＨＦＥを発現するためのキットに関する。ある実施態様において、キットは、０.１～５００mg用量の１以上の本発明のポリヌクレオチドおよび該用量を投与するためのデバイスを含む。ある実施態様において、デバイスは、注射針、静脈内針または吸入デバイスである。
【0037】
本発明のこれらおよび他の態様および特性は、本明細書の次のセクションに記載される。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】種々の濃度のヒトＨＦＥタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトしたヒト初代肝細胞からトランスフェクション２４時間後単離したライセートからのウェスタンブロットを示す。これは、ｍＲＮＡ構築物がインビトロで相当量のＨＦＥタンパク質を産生する能力を示す。
【0039】
【図2】５００ngのヒトＨＦＥタンパク質をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトしたヒト初代肝細胞から種々の時点(トランスフェクション１～６日後)で単離したライセートからのウェスタンブロットデータを示す。これは、ＨＦＥコードｍＲＮＡの単回トランスフェクション後、相当期間のＨＦＥ発現を示す。
【0040】
【図3】脂質ナノ粒子封入ＨＦＥコードｍＲＮＡ静脈内投与４８時間後取ったＨｆｅノックアウトマウスの肝臓ホモジネートからのウェスタンブロットデータを示す。ｍＲＮＡを、０.３mg／kg、１mg／kgおよび３mg／kgで投与した。これは、肝臓ＨＦＥタンパク質発現が、ＨＦＥコードｍＲＮＡ単回投与後用量依存的方法で検出され得ることを示す。
【0041】
【図4】脂質ナノ粒子封入ＨＦＥコードｍＲＮＡ静脈内投与４８時間後のＨｆｅノックアウトマウスの肝臓ヘプシジン発現を示す。ｍＲＮＡを、０.３mg／kg、１mg／kgおよび３mg／kgで投与した。これは、肝臓ヘプシジン発現が、ＨＦＥコードｍＲＮＡ単回投与後、再構築され得ることを示す。
【0042】
【図5】脂質ナノ粒子封入ＨＦＥコードｍＲＮＡ静脈内投与４８時間後のＨｆｅノックアウトマウスの血清鉄レベルを示す。ｍＲＮＡを、０.３mg／kg(雌＝Ｆ)、１mg／kg(雌＝Ｆ)および３mg／kg(雄＝Ｍ)で投与した。これは、末梢鉄レベルが、ＨＦＥコードｍＲＮＡの単回投与に応答して低減されることを示す。
【0043】
【図6】脂質ナノ粒子封入ＨＦＥコードｍＲＮＡ静脈内投与４８時間後のＨｆｅノックアウトマウスにおける血液トランスフェリン(Ｔｆ)飽和レベルを示す。ｍＲＮＡを、０.３mg／kg(雌＝Ｆ)、１mg／kg(雌＝Ｆ)および３mg／kg(雄＝Ｍ)で投与した。これは、Ｔｆ飽和レベルが、ＨＦＥコードｍＲＮＡの単回投与に応答して低減されることを示す。
【0044】
【図7】脂質ナノ粒子封入ＨＦＥコードｍＲＮＡ静脈内投与７日後のＨｆｅノックアウトマウスにおける肝臓鉄レベルを示す。ｍＲＮＡを、１mg／kgで投与した。肝臓鉄レベルは、処置群の雌(Ｆ)および雄(Ｍ)マウスで、媒体(ｖｅｈ)対照で処置された動物より減少した。
【発明を実施するための形態】
【0045】
発明の詳細な記載
本発明は、治療適用に使用するための、広範な新規薬剤および組成物に関する。ある実施態様において、本発明の核酸分子および組成物は、対象における遺伝性ヘモクロマトーシスおよび／または遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)の存在もしくは機能の減少に関連するあらゆるさらなる疾患の改善、予防または処置に使用され得る。他の実施態様において、本発明の核酸分子および組成物は、続発性ヘモクロマトーシスの改善、予防または処置に使用され得る。
本発明は、治療適用に使用するための、広範な新規薬剤および組成物に関する。ある実施態様において、本発明の核酸分子および組成物は、対象における遺伝性ヘモクロマトーシスおよび／または遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)の存在もしくは機能の減少に関連するあらゆるさらなる疾患の改善、予防または処置に使用され得る。他の実施態様において、本発明の核酸分子および組成物は、続発性ヘモクロマトーシスの改善、予防または処置に使用され得る。
【0046】
ある実施態様において、本発明は、ヒト遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質の発現のための合成、精製、翻訳可能ポリヌクレオチド分子を包含する。分子は天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドを含んでよく、ヒト遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)またはＨＦＥ活性を有するそのフラグメントをコードする。
【0047】
ここで使用する用語「翻訳可能」は用語「発現可能」と相互交換可能に使用でき、ポリヌクレオチドまたはその一部が宿主細胞によりポリペプチドに変換され得る能力をいう。当分野で理解されるとおり、翻訳は、細胞の細胞質におけるリボソームがポリペプチドを作る過程である。翻訳において、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)は、特定のアミノ酸鎖またはポリペプチドを生じるようリボソーム複合体におけるｔＲＮＡにより解読される。さらに、用語「翻訳可能」は、本明細書でオリゴマーを参照して使用するとき、オリゴマーの少なくとも一部、例えば、オリゴマー配列のコード領域(コード配列またはＣＤＳとしても知られる)が、タンパク質またはそのフラグメントに変換され得ることを意味する。
【0048】
ここで使用する用語「モノマー」は、オリゴマーを形成するために同一または異なるタイプの他の分子と結合され得る単一単位、例えば、単一核酸をいう。
【0049】
その一方で、用語「オリゴマー」は「ポリヌクレオチド」と相互交換可能に使用でき、少なくとも２個のモノマーを含む分子をいい、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを含む。ＲＮＡモノマーを含むオリゴマーの場合、本発明のオリゴマーは、コード配列(ＣＤＳ)に加えて、複数配列含み得る。これらのさらなる配列は、非翻訳配列、すなわち、宿主細胞によりタンパク質に変換されない配列であり得る。これらの非翻訳配列は、５’－キャップまたはその一部、５’非翻訳領域(５’ＵＴＲ)、３’非翻訳領域(３’ＵＴＲ)およびテイル領域、例えば、ポリＡテイル領域を含み得る。本発明において、「翻訳可能オリゴマー」、「翻訳可能分子」、「翻訳可能ポリヌクレオチド」または「翻訳可能化合物」は、タンパク質またはそのフラグメント、例えば、ヒトＨＦＥタンパク質またはそのフラグメントに変換され得る領域、例えば、ＲＮＡのコード領域(例えば、ヒトＨＦＥまたはそのコドン最適化版のコード配列)を含む、配列をいう。
【0050】
ここで使用する用語「コドン最適化」は、タンパク質発現レベルを増加させる、コードされるタンパク質アミノ酸配列を変えることなく、異なるコドンを選択することにより再設計されている天然(または意図的に設計された天然のバリアント)コード配列を意味する(Gustafsson et al., 2004, Trends Biotechnol 22: 346-53)。高コドン適応指標(ＣＡＩ)、ＬｏｗＵ方法、ｍＲＮＡ二次構造、シス制御配列、ＧＣ含量などの変数および多くの他の類似変数は、タンパク質発現レベルとの幾分かの相関を示している(Villalobos et al., 2006, BMC Bioinformatics 7:285)。高ＣＡＩ(コドン適応指標)方法は、タンパク質コード配列全体の最も高頻度で使用される同義コドンを選択する。各アミノ酸の最も高頻度で使用されるコドンを、ヒトゲノムからの７４２１８タンパク質コード遺伝子から推定する。ＬｏｗＵ方法は、Ｕ部分が少ない同義コドンに置き換えられ得るＵ含有コドンのみ標的とする。置き換えの選択肢が少なければ、より高頻度で使用されるコドンが選択される。ＬｏｗＵ方法により、配列の残りのコドンは変えられない。この方法は、Ｎ１－メチルシュードウリジンまたは５－メトキシウリジンなどの１以上の修飾ヌクレオチドを含み合成されるコード配列の設計のために、ここに開示するｍＲＮＡと組み合わせて使用され得る。
【0051】
本開示を理解する当業者には認識されるとおり、本発明のポリヌクレオチドおよびそれを含む組成物が、対象における、遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥタンパク質)の活性低減(例えば、濃度、存在および／または機能の低減に起因する)に関連するあらゆる疾患または障害の改善、予防または処置に使用され得る。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝性ヘモクロマトーシス(ＨＨ)の改善、予防または処置のための方法に使用され得る。ここで処理される疾患または障害(例えば、ＨＨ)は、過剰の鉄沈着、組織損傷、線維症、肝硬変、糖尿病、関節症、うっ血性心不全、性腺機能低下症および皮膚色素過剰に関連し得る。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドおよびそれを含む組成物が、これら前記症状の何れかまたは全ての改善、予防または処置に使用され得る。
【0052】
当業者により理解されるとおり、遺伝性ヘモクロマトーシス(ＨＨ)は、ＨＦＥ欠乏、ＨＦＥ遺伝性ヘモクロマトーシス、ＨＦＥ関連遺伝性ヘモクロマトーシス、ヘモクロマトーシスＩ型、古典的ヘモクロマトーシス、原発性ヘモクロマトーシス、青銅色糖尿病またはヘモジデリン沈着症を含むが、これらに限定されない多くの別名で呼ばれ得る。従って、ＨＨは、本明細書、実施例、図面および特許請求の範囲において、これら別名と相互交換可能に使用され得る。
【0053】
本開示を理解する当業者には認識されるとおり、本発明のポリヌクレオチドおよびそれを含む組成物は、対象におけるヘプシジンの減少または抑制に関連するあらゆる疾患または障害の改善、予防または処置に有用であり得る。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、続発性ヘモクロマトーシスの改善、予防または処置のための方法において使用され得る。ある実施態様において、続発性ヘモクロマトーシスは、赤血球新生の遺伝的または後天的障害を有する患者で起こる。ある実施態様において、疾患は、サラセミア(例えば、βサラセミア)、鎌状赤血球貧血、ピルビン酸キナーゼ欠乏、先天性赤血球異形成貧血(ＣＤＡ)、ダイアモンド・ブラックファン貧血、遺伝性球状赤血球症またはＸ連鎖鉄芽球性貧血(ＡＬＡＳ２欠乏)などの遺伝的疾患である。ある実施態様において、疾患は、後天的特発性鉄芽球性貧血(ＡＩＳＡ)、ある種の骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)、骨髄線維症および難治性再生不良性貧血などの後天的疾患である。ある実施態様において、続発性ヘモクロマトーシスは、過剰の鉄沈着、組織損傷、線維症、肝硬変、糖尿病、関節症、うっ血性心不全、性腺機能低下症および皮膚色素沈着と関連し得る。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドおよびそれを含む組成物が、これら前記症状の何れかまたは全ての改善、予防または処置に使用され得る。
【0054】
当業者により理解されるとおり、続発性ヘモクロマトーシス(ＳＨ)は、鉄代謝の原発性、遺伝性障害によるものではない、鉄過負荷の全例を広く指称または包含するよう使用され得る。Gattermann, 2009, Dtsch Arztebl Int. 106(30): 499-504参照。続発性ヘモクロマトーシスはほぼ常に赤血球新生の遺伝的または後天的障害および／または輸血によるこのような障害の処置によるものである。続発性ヘモクロマトーシス(ＳＨ)は、二次鉄過負荷および非ＨＦＥヘモクロマトーシス、これらに限定されない多くの別名で呼ばれ得る。従って、続発性ヘモクロマトーシス(ＳＨ)は、本明細書、実施例、図面および特許請求の範囲において、これら別名と相互交換可能に使用され得る。
【0055】
機能的ＨＦＥタンパク質またはその機能的フラグメントをコードする本発明のポリヌクレオチドは、それを必要とする患者(例えば、ＨＨまたはＳＨを有する患者)の肝臓、特に肝細胞に送達され得て、患者の機能的に活性なＨＦＥレベルを上昇できる。ポリヌクレオチドおよびそれを含む組成物を、患者におけるＨＨまたはＳＨのあらゆる症状の予防、処置、改善または回復に使用され得る。例示的実施態様において、患者はヒトである。
【0056】
さらなる態様において、本発明のポリヌクレオチドおよびそれを含む組成物は、ＨＨ患者の疾患管理のための瀉血への依存の低減のためにも使用され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびそれを含む組成物は、血清フェリチンレベルを５０μg／Ｌ未満に維持するためにＨＨ患者で必要とされる総瀉血回数を減少(例えば、週１回または月／年期間の頻度の減少)させ得る。
【0057】
本発明の実施態様は、ヒト遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)の発現ができるポリヌクレオチドの製造方法を包含する。方法は、インビトロで天然および修飾ヌクレオシド三リン酸存在下でＨＦＥ ＤＮＡ鋳型を転写して産生混合物を形成させ、該産生混合物を精製して、ポリヌクレオチドを単離することを含む。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、当分野で知られる方法により製造され得る。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、インビトロ、エクスビボまたはインビボでポリペプチドまたはタンパク質を発現するよう設計された核酸塩基配列を示し得る。
【0058】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、５’－キャップ、モノマーの５’非翻訳領域、モノマーのコード領域、モノマーの３’非翻訳領域およびモノマーのテイル領域を含み得る。
【0059】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、約２００～約４,０００モノマー長であり得る。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、８００～２,０００モノマー長、１,０００～１,６００モノマー長または１,１００～１,５００モノマー長であり得る。例示的実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは１,２００～１,４００モノマー長である。さらなる例示的実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、約１,３００モノマー長である。
【0060】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの混合物を含み、ヒトＨＦＥまたはＨＦＥ活性を有するそのフラグメントを提供するように発現可能である。ある実施態様において、修飾ヌクレオチドは５－メトキシウリジンである。例示的実施態様において、ポリヌクレオチドは、ウリジン残基の代わりに５－メトキシウリジン残基を含むよう完全に修飾される。ある実施態様において、修飾ヌクレオチドはＮ１－メチルシュードウリジンである。例示的実施態様において、ポリヌクレオチドは、ウリジン残基の代わりにＮ１－メチルシュードウリジン残基を含むよう完全に修飾される。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、ウリジン残基の代わりに５－メトキシウリジン残基とＮ１－メチルシュードウリジン残基の混合物を含むよう修飾される。
【0061】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡモノマーおよび／またはアンロック核酸(ＵＮＡ)およびロック核酸(ＬＮＡ)モノマーなどの代替モノマーを含む翻訳可能分子であり得る。
【0062】
ある実施態様において、翻訳可能ポリヌクレオチドは、１～約８０個のアンロック核酸(ＵＮＡ)モノマーを含み得る。ある実施態様において、翻訳可能ポリヌクレオチドは、１～５０個のＵＮＡモノマーまたは１～２０個のＵＮＡモノマーまたは１～１０個のＵＮＡモノマーを含み得る。
【0063】
ある実施態様において、翻訳可能ポリヌクレオチドは、１～約８０個のロック核酸(ＬＮＡ)モノマーを含み得る。ある実施態様において、翻訳可能ポリヌクレオチドは、１～５０個のＬＮＡモノマーまたは１～２０個のＬＮＡモノマーまたは１～１０個のＬＮＡモノマーを含み得る。
【0064】
ある実施態様において、１以上の本発明のポリヌクレオチドは、インビトロ、エクスビボまたはインビボで、細胞に送達され得る。当分野で知られるようなウイルスおよび非ウイルス導入方法を使用して、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入できる。例示的実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、薬学的に許容される媒体、例えば、ナノ粒子またはリポソームで送達され得る。さらなる例示的実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)を介して送達される。
【0065】
さらなる実施態様において、本発明は、対象に本発明のポリヌクレオチドを含む組成物を投与することによる、対象における疾患または状態を処置する方法を提供する。
【0066】
ある態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物は、疾患または障害、例えば、対象におけるヘプシジンの活性低減(例えば、濃度、存在および／または機能の低減に起因する)に関連する疾患または障害の改善、予防または処置のために使用され得る。この態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物は、対象におけるヘプシジンの濃度または効力を制御、調節または増加するために投与される。ヘプシジンの活性低減に関連する疾患または障害は、ＨＨおよびＳＨを含む。
【0067】
ある態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物は、疾患または障害、例えば、対象における遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質(ＨＦＥ)の活性低減(例えば、濃度、存在および／または機能の低減に起因する)に関連する疾患または障害の改善、予防または処置ために使用され得る。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物は、対象におけるＨＦＥタンパク質の濃度または効力の制御、調節または増加のために投与され得る。ある実施態様において、発現されるＨＦＥタンパク質は、患者が欠損している非修飾、天然タンパク質であり得る(例えば、機能的ＨＦＥ活性が部分的にまたは完全にないＨＦＥの変異型を有する患者)。ある態様において、本発明のポリヌクレオチドにより発現されるＨＦＥタンパク質は、非修飾、天然、機能的に活性なＨＦＥタンパク質と同一であってよく、これは、変異型のＨＦＥタンパク質を担持する患者のＨＨの処置に使用され得る。例示的実施態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物は、ＨＨの改善、予防または処置のために使用され得る。
【0068】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは細胞または対象に送達されて、翻訳されて、細胞または対象におけるＨＦＥレベルを増加させ得る。
【0069】
ここで使用する用語「対象」は、ヒトまたはあらゆる非ヒト動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類)をいう。ヒトは、出生前および出生後の形態を含む。多くの実施態様において、対象はヒトである。対象は、疾患の診断または処置のために医療提供者を訪れるヒトをいう患者であり得る。用語「対象」は、ここでは、「個体」または「患者」と相互交換可能に使用される。対象は、疾患または障害を有してよくまたは有することが疑われるが、該疾患または障害の症状を示しても示していなくてもよい。
【0070】
例示的実施態様において、本発明の対象は、ヘプシジンの活性低減(例えば、濃度、存在および／または機能の低減に起因する)を有する対象である。他の例示的実施態様において、本発明の対象は、ＨＦＥの活性低減(例えば、濃度、存在および／または機能の低減に起因する)を有する対象である。さらなる例示的実施態様において、対象はヒトである。
【0071】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、処置対象の機能的に活性なＨＦＥタンパク質レベルを増加させ得る。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、対象の処置前のベースラインレベルに比して、機能的に活性なＨＦＥタンパク質レベルの約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、５００％またはそれ以上の増加をもたらす。例示的実施態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、対象の処置前のベースライン肝臓ＨＦＥレベルに比して、肝臓ＨＦＥレベルの増加をもたらす。ある実施態様において、肝臓ＨＦＥレベルの増加は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、５００％またはそれ以上であり得る。
【0072】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドから発現されるＨＦＥタンパク質は、肝臓、血清、血漿、腎臓、心臓、筋肉、脳、脳脊髄液またはリンパ節で検出可能である。例示的実施態様において、ＨＦＥタンパク質は、肝臓細胞、例えば、対象における肝細胞で発現される。
【0073】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、処置対象の肝臓における総タンパク質の１mgあたり約１０ng、約２０ng、約５０ng、約１００ng、約１５０ng、約２００ng、約２５０ng、約３００ng、約３５０ng、約４００ng、約４５０ng、約５００ng、約６００ng、約７００ng、約８００ng、約９００ng、約１０００ng、約１２００ngまたは約１５００ngまたはそれ以上の天然、非変異ヒトＨＦＥ(すなわち、異常または変異ＨＦＥではなく正常または野生型ＨＦＥ)タンパク質レベルの発現をもたらす。
【0074】
興味のある１以上の値に適用される、ここで使用する用語「約」または「おおよそ」は、記載される対照値に類似する値をいう。ある実施態様において、用語「おおよそ」または「約」は、特に断らない限りまたは他に文脈から明らかではない限り、記載される対照値のいずれかの方向で(超えるまたは少ない)１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の範囲内に入る広範な値をいう(このような数値が
可能な値の１００％を超える場合は例外である)。
可能な値の１００％を超える場合は例外である)。
【0075】
ある実施態様において、天然の、変異していない機能的に活性なヒトＨＦＥタンパク質またはその機能的に活性なフラグメントの発現は、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与後検出可能である。ある実施態様において、機能的に活性なＨＦＥタンパク質は、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与２時間、４時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４８時間、６０時間および／または７２時間後検出可能である。ある実施態様において、機能的に活性なＨＦＥタンパク質は、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与１日、２日、３日、４日、５日、６日および／または７日後検出可能である。ある実施態様において、機能的に活性なＨＦＥタンパク質は、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与１週間、２週間、３週間および／または４週間後検出可能である。ある実施態様において、機能的に活性なＨＦＥタンパク質は、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与後、肝臓、例えば、肝細胞で検出可能である。
【0076】
ヒトＨＦＥ
ヒトＨＦＥ遺伝子は、約４０.１kDaの分子量を有する３４８アミノ酸タンパク質をコードする。ＨＦＥタンパク質は、肝細胞鉄センサーおよびヘプシジンの上流制御因子である。ＨＦＥは、ヘプシジンのシグナル伝達に不可欠であり、より大型の鉄感知複合体の構成要素として働くと考えられる。この方法で、ＨＦＥは、肝臓における鉄恒常性維持のための重要な制御因子である。上記のとおり、正常な機能的ＨＦＥ活性の遺伝的欠乏は、処置しないままであれば、重度臓器損傷に至り得る食事による鉄の慢性過剰吸収に起因する遺伝性ヘモクロマトーシス(ＨＨ)を起こし得る。
ヒトＨＦＥ遺伝子は、約４０.１kDaの分子量を有する３４８アミノ酸タンパク質をコードする。ＨＦＥタンパク質は、肝細胞鉄センサーおよびヘプシジンの上流制御因子である。ＨＦＥは、ヘプシジンのシグナル伝達に不可欠であり、より大型の鉄感知複合体の構成要素として働くと考えられる。この方法で、ＨＦＥは、肝臓における鉄恒常性維持のための重要な制御因子である。上記のとおり、正常な機能的ＨＦＥ活性の遺伝的欠乏は、処置しないままであれば、重度臓器損傷に至り得る食事による鉄の慢性過剰吸収に起因する遺伝性ヘモクロマトーシス(ＨＨ)を起こし得る。
【0077】
コンセンサスヒトＨＦＥ ｍＲＮＡコード配列は、１,０４４核酸塩基(停止コドン不在)の配列を有し、配列番号１に示す。翻訳されたとき、コンセンサスヒトＨＦＥ ｍＲＮＡコード配列は、配列番号３２の野生型ＨＦＥタンパク質である３４８アミノ酸をコードする。
【0078】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、機能的に活性なヒトＨＦＥタンパク質または機能的ＨＦＥ活性を示すそのフラグメントに翻訳されることができるｍＲＮＡ配列を含む。機能的に活性なヒトＨＦＥタンパク質を発現する本発明のポリヌクレオチドは、正常ＨＦＥ活性の欠乏に関連する疾患の改善、予防または処置のための方法の使用に適し得る。
【0079】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチは、５’－キャップ、５’ＵＴＲ、ヒトＨＦＥコード配列(ＣＤＳ)、３’ＵＴＲおよび／またはテイル領域を含み得る。例示的実施態様において、ポリヌクレオチドは、５’－キャップ((例えば、Ｎ７－メチル－Ｇｐｐｐ(２’－Ｏ－メチル－Ａ))、配列番号３３を含むまたはそれからなる５’ＵＴＲ、ＨＦＥ ＣＤＳ、配列番号３５を含むまたはそれからなる３’ＵＴＲおよび／またはテイル領域を含み得る。さらなる例示的実施態様において、ＨＦＥ ＣＤＳは、下に詳述する配列番号４～３１のコドン最適化配列を含む。ここに記載するこれらおよび他の実施態様の何れかにおいて、ポリヌクレオチドは、１以上の(または全)ウリジン残基の代わりに１以上の修飾ヌクレオチド、例えば、５－メトキシウリジンおよび／またはＮ１－メチルシュードウリジンを含み得る。
【0080】
ある実施態様において、分子の翻訳効率は、ＨＦＥの天然ｍＲＮＡと比較して増加され得る。例えば、分子の翻訳発現は、ＨＦＥの天然ｍＲＮＡに比して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％またはそれ以上増加され得る。
【0081】
ある実施態様において、本発明の適当なｍＲＮＡ配列は、ＨＦＥタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列を含む。天然に存在する、機能的に活性なヒトＨＦＥタンパク質の配列を配列番号３２に示す。
【0082】
ある実施態様において、適当なｍＲＮＡ配列は、ヒトＨＦＥのホモログまたはバリアントをコードするｍＲＮＡ配列であり得る。ここで使用する、ヒトＨＦＥタンパク質のホモログまたはバリアントは、実質的機能的ＨＦＥタンパク質活性を保持しながら、野生型または天然に存在するヒトＨＦＥタンパク質と比較して１以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む修飾ヒトＨＦＥタンパク質であり得る。ある実施態様において、本発明に適するｍＲＮＡは、ヒトＨＦＥタンパク質と実質的に同一であるタンパク質をコードする。ある実施態様において、本発明に適するｍＲＮＡは、配列番号３２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するＨＦＥタンパク質をコードし、ここで、該ＨＦＥタンパク質は、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＨＦＥタンパク質と比較して、実質的に等しいまたは増加した機能的活性を示す。ある実施態様において、本発明に適するｍＲＮＡは、ヒトＨＦＥタンパク質の機能的に活性なフラグメント、機能的に活性な部分または機能的に活性な部分をコードする。
【0083】
ある実施態様において、本発明に適するｍＲＮＡはヒトＨＦＥタンパク質のフラグメントまたは部分をコードし、ここで、タンパク質のフラグメントまたは部分は、野生型タンパク質に類似するＨＦＥ活性をなお保持する。
【0084】
ある実施態様において、本発明に適するｍＲＮＡは、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.９％またはそれ以上同一である配列を含む。例示的実施態様において、本発明に適するｍＲＮＡは、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む。他の例示的実施態様において、本発明に適するｍＲＮＡは、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９８％同一である配列を含む。さらなる例示的実施態様において、本発明に適するｍＲＮＡは、配列番号４と少なくとも９８％同一である配列を含む。
【0085】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.９％またはそれ以上同一であるコード配列を含む。ある実施態様において、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.９％またはそれ以上同一であるコード配列を含むポリヌクレオチドは、さらに５’－キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲおよびテイル領域から選択される１以上の配列を含む。
【0086】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の完全長ヒトＨＦＥコード配列にわたり野生型ヒトＨＦＥコード配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％未満同一であるコード配列を含み、機能的に活性なヒトＨＦＥタンパク質を発現する。例示的実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の完全長ヒトＨＦＥコード配列にわたり野生型ヒトＨＦＥコード配列に９５％未満同一であるコード配列を含み、機能的ヒトＨＦＥタンパク質を発現する。他の例示的実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の完全長ヒトＨＦＥコード配列にわたり野生型ヒトＨＦＥコード配列に９５％未満同一であるコード配列を含み、機能的ヒトＨＦＥタンパク質を発現し、ここで、コード配列は、配列番号４～３１から選択される配列に少なくとも９５％同一である。従って、ある実施態様において、本発明は、配列番号１の完全長ヒトＨＦＥコード配列にわたり野生型ヒトＨＦＥコード配列と９５％未満同一である核酸塩基配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドを提供し、ここで、ヒトＨＦＥコード配列は、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である。例示的実施態様において、本発明は、配列番号１の完全長ヒトＨＦＥコード配列にわたり野生型ヒトＨＦＥコード配列と９５％未満同一である核酸塩基配列を含むまたはそれからなるポリヌクレオチドを提供し、ここで、ヒトＨＦＥコード配列は、配列番号４～３１から選択される配列と少なくとも９５％同一である。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号４～３１から選択される配列および該配列のすぐ下流に停止コドン(ＵＧＡ、ＵＡＡまたはＵＡＧ)を含み得る。特定の実施態様において、本発明は、配列番号４の核酸塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。さらに別の具体的実施態様において、本発明は、配列番号６７のヌクレオチド塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【0087】
ある実施態様において、本発明は、ＨＦＥをコードするｍＲＮＡ配列を提供するよう翻訳され得る新規コドン最適化ＤＮＡ配列をさらに提供する。従って、本発明は、さらに、配列番号３７～６４から選択される配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一である核酸配列に関する。例示的実施態様において、本発明は、配列番号３７～６４から選択されるＨＦＥをコードするｍＲＮＡ配列を提供するよう翻訳され得る核酸配列を提供する。さらに提供されるのは、機能的ＨＦＥ活性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列を提供するよう翻訳され得る配列番号３７～６４に示す核酸配列のフラグメントである。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号３７～６４から選択される配列および該配列のすぐ下流の停止コドン(ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧ)を含み得る。特定の実施態様において、本発明は、配列番号３７のＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【0088】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、１以上のアンロックヌクレオモノマー(すなわち、ＵＮＡモノマー)を含み得る。例えば、米国特許９,９４４,９２９参照。
【0089】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、１以上のロック核酸(すなわち、ＬＮＡモノマー)を含み得る。例えば、米国特許６,２６８,４９０、６,６７０,４６１、６,７９４,４９９、６,９９８,４８４、７,０５３,２０７、７,０８４,１２５、７,３９９,８４５および８,３１４,２２７参照。
【0090】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、他の配列に融合した(例えば、ＮまたはＣ末端融合)ＨＦＥタンパク質の完全長、フラグメントまたは部分を含む融合タンパク質をコードする。ある実施態様において、ＮまたはＣ末端配列は、シグナル配列または細胞ターゲティング配列である。
【0091】
修飾ヌクレオチド
ここに記載する種々の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、天然および修飾核酸モノマー(すなわち、ヌクレオチド)の組み合わせを含み得る。修飾ヌクレオチドの種々の例は、引用により全体として本明細書に包含させるＷＯ／２０１８／２２２９２６に開示される。
ここに記載する種々の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、天然および修飾核酸モノマー(すなわち、ヌクレオチド)の組み合わせを含み得る。修飾ヌクレオチドの種々の例は、引用により全体として本明細書に包含させるＷＯ／２０１８／２２２９２６に開示される。
【0092】
ある実施態様において、アルキル、シクロアルキルまたはフェニル置換基は、置換されていなくても、１以上のアルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノまたはニトロ置換基でさらに置換されていてもよい。
【0093】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、１以上のシュードウリジンを含む。シュードウリジンの例は、Ｎ１－アルキルシュードウリジン、Ｎ１－シクロアルキルシュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシアルキルシュードウリジン、Ｎ１－フェニルシュードウリジン、Ｎ１－フェニルアルキルシュードウリジン、Ｎ１－アミノアルキルシュードウリジン、Ｎ３－アルキルシュードウリジン、Ｎ６－アルキルシュードウリジン、Ｎ６－アルコキシシュードウリジン、Ｎ６－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ６－ヒドロキシアルキルシュードウリジン、Ｎ６－モルホリノシュードウリジン、Ｎ６－フェニルシュードウリジンおよびＮ６－ハロシュードウリジンを含む。シュードウリジンの例は、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－アルキルシュードウリジン、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－アルコキシシュードウリジン、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－ヒドロキシシュードウリジン、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－ヒドロキシアルキルシュードウリジン、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－モルホリノシュードウリジン、Ｎ１－アルキル－Ｎ６－フェニルシュードウリジンおよびＮ１－アルキル－Ｎ６－ハロシュードウリジンを含む。これらの例において、アルキル、シクロアルキルおよびフェニル置換基は、置換されていなくても、アルキル、ハロ、ハロアルキル、アミノまたはニトロ置換基でさらに置換されていてもよい。シュードウリジンの例は、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、Ｎ１－プロピルシュードウリジン、Ｎ１－シクロプロピルシュードウリジン、Ｎ１－フェニルシュードウリジン、Ｎ１－アミノメチルシュードウリジン、Ｎ３－メチルシュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシシュードウリジンおよびＮ１－ヒドロキシメチルシュードウリジンをさらに含む。
【0094】
ある実施態様において、シュードウリジン残基は、Ｎ１－メチルシュードウリジン、Ｎ１－エチルシュードウリジン、Ｎ１－プロピルシュードウリジン、Ｎ１－シクロプロピルシュードウリジン、Ｎ１－フェニルシュードウリジン、Ｎ１－アミノメチルシュードウリジン、Ｎ３－メチルシュードウリジン、Ｎ１－ヒドロキシシュードウリジンおよびＮ１－ヒドロキシメチルシュードウリジンから選択される。例示的実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ウリジン残基の代わりにＮ１－メチルシュードウリジン残基を含むよう完全に修飾される。
【0095】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシメチルエステルウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－プロピニルウリジン、５－ブロモウリジン、５－フルオロウリジン、５－ヨードウリジン、２－チオウリジンおよび６－メチルウリジンから選択される１以上の修飾ヌクレオチドを含む。例示的実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ウリジン残基の代わりに５－メトキシウリジン残基を含むよう完全に修飾される。
【0096】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルプリンヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチド、２’－デオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシプリンヌクレオチド、ユニバーザル塩基ヌクレオチド、５－Ｃ－メチル－ヌクレオチドおよび逆位デオキシ脱塩基モノマー残基から選択される１以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。
【0097】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、３’末端安定化ヌクレオチド、３’－グリセリルヌクレオチド、３’－逆位脱塩基ヌクレオチドおよび３’－逆位チミジンから選択される１以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。
【0098】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、アンロック核酸ヌクレオチド(ＵＮＡ)、ロック核酸ヌクレオチド(ＬＮＡ)、２’－Ｏ,４’－Ｃ－メチレン－(Ｄ－リボフラノシル)ヌクレオチド、２’－メトキシエトキシ(ＭＯＥ)ヌクレオチド、２’－メチル－チオ－エチル、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドおよび２’－Ｏ－メチルヌクレオチドから選択される１以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。ある例示的実施態様において、修飾ヌクレオチドは、アンロック核酸ヌクレオチド(ＵＮＡ)である。アンロック核酸およびポリヌクレオチドへのそれらの取り込みの方法の詳細な概要は、引用により全体として本明細書に包含させるＷＯ／２０１８／２２２９２６に見られる。他の例示的実施態様において、修飾ヌクレオチドは、ロック核酸ヌクレオチド(ＬＮＡ)である。
【0099】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、２’,４’－拘束２’－Ｏ－メトキシエチル(ｃＭＯＥ)および２’－Ｏ－エチル(ｃＥｔ)修飾ＤＮＡから選択される１以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。
【0100】
ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、２’－アミノヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノヌクレオチド、２’－Ｃ－アリルヌクレオチドおよび２’－Ｏ－アリルヌクレオチドから選択される１以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。
【0101】
上に記載する塩基修飾の例を、糖修飾および結合修飾を含むヌクレオシドまたはヌクレオチド構造のさらなる修飾と組み合わせ得る。
【0102】
分子キャップ構造
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、５’－キャップをさらに含む。
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、５’－キャップをさらに含む。
【0103】
５’－キャップおよびそのアナログは、当分野で知られる。５’－キャップ構造のいくつかの例は、ＷＯ／２０１７／０５３２９７、ＷＯ／２０１５／０５１１６９、ＷＯ／２０１５／０６１４９１および米国特許８,０９３,３６７および８,３０４,５２９に示される。
【0104】
ある実施態様において、本発明は、５’－キャップＲＮＡを提供し、ここで、開始キャップオリゴヌクレオチドプライマーは、一般形態ｍ７Ｇｐｐｐ[Ｎ２’Ｏｍｅ]ｎ[Ｎ]ｍ(式中、ｍ７ＧはＮ７－メチル化グアノシンまたは何れかのグアノシンアナログであり、Ｎは何れかの天然、非修飾もしくは非天然ヌクレオシドであり、「ｎ」は０～４の何れかの整数であってよく、「ｍ」は１～９の何れかの整数であってよい)を有する。このような５’－キャップＲＮＡを合成するための組成物および方法は、ＷＯ／２０１７／０５３２９７に記載される。
【0105】
例示的実施態様において、５’－キャップは、Ｎ７－メチル－Ｇｐｐｐ(２’－Ｏ－メチル－Ａ)を含む。
【0106】
例示的実施態様において、５’－キャップは、次の構造を有する。
【化1】
【0107】
ある実施態様において、５’－キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＧｍキャップであり得る。さらなる実施態様において、５’－キャップは、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップアナログ(例えば、ＧｐｐｐＧ)；ジメチル化キャップアナログ(例えば、ｍ２,７ＧｐｐｐＧ)、トリメチル化キャップアナログ(例えば、ｍ２,２,７ＧｐｐｐＧ)、ジメチル化対称キャップアナログ(例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ)またはアンチリバースキャップアナログ(例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７、２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７,３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７,３’ｄＧｐｐｐＧおよびその四リン酸誘導体)(例えば、Jemielity et al., 2003, RNA 9: 1108-1122参照)から選択され得る。他の実施態様において、５’－キャップは、ＡＲＣＡキャップ(３’－ＯＭｅ－ｍ７Ｇ(５’)ｐｐｐＧ)またはｍＣＡＰ(ｍ７Ｇ(５’)ｐｐｐ(５’)Ｇ、Ｎ７－メチル－グアノシン－５’－Ｔｒｉホスフェート－５’－グアノシン)であり得る。
【0108】
５’および３’非翻訳領域(ＵＴＲ)
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、５’非翻訳領域(５’ＵＴＲ)および／または３’非翻訳領域(３’ＵＴＲ)をさらに含み得る。当分野で理解されるとおり、５’および／または３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響し得る。例示的実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、５’非翻訳領域(５’ＵＴＲ)および／または３’非翻訳領域(３’ＵＴＲ)をさらに含み得る。当分野で理解されるとおり、５’および／または３’ＵＴＲは、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響し得る。例示的実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲを含む。
【0109】
５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲ配列の例は、米国特許９,１４９,５０６およびＷＯ／２０１８／２２２８９０に見られ得る。
【0110】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、少なくとも約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００または５００ヌクレオチドである５’ＵＴＲを含み得る。ある実施態様において、５’ＵＴＲは、約１０～１５０ヌクレオチド(例えば、約２５～１００ヌクレオチド、約３５～７５ヌクレオチド、約４０～６０ヌクレオチドまたは約５０ヌクレオチド)含む。例示的実施態様において、５’ＵＴＲは、約４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド長である。
【0111】
ある実施態様において、５’ＵＴＲは、ポリヌクレオチドの安定性を増加するために、当分野で比較的安定として知られるｍＲＮＡ分子(例えば、ヒストン、チューブリン、グロビン、ＧＡＰＤＨ、アクチンまたはクエン酸サイクル酵素)に由来する。他の実施態様において、５’ＵＴＲ配列は、ＣＭＶ前初期１(ＩＥ１)遺伝子の部分的配列を含み得る。ある実施態様において、５’ＵＴＲは、ヒトＩＬ－６、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノゲンアルファ鎖、ヒトトランスチレチン、ヒトハプトグロビン、ヒトアルファ－１－抗キモトリプシン、ヒト抗トロンビン、ヒトアルファ－１－抗トリプシン、ヒトアルブミン、ヒトベータグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト補体Ｃ５、ＳｙｎＫ、ＡＴ１Ｇ５８４２０、マウスベータグロビン、マウスアルブミンおよびタバコエッチウイルスまたは前記の何れかのフラグメントの５’ＵＴＲから選択される配列を含む。
【0112】
例示的実施態様において、５’ＵＴＲは、配列番号３３に示す配列を含むまたはそれからなる。さらに他の例示的実施態様において、５’ＵＴＲは、配列番号３３に示す配列のフラグメント、例えば、配列番号３３の少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または４５連続ヌクレオチドのフラグメントである。
【0113】
別の実施態様において、５’ＵＴＲは、タバコエッチウイルス(ＴＥＶ)由来である。ある実施態様において、５’ＵＴＲは、配列番号３４に示す配列を含むまたはそれからなる。他の実施態様において、５’ＵＴＲは、配列番号３４に示す配列のフラグメント、例えば、配列番号３４の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１２５連続ヌクレオチドのフラグメントである。
【0114】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)を含む。当分野で理解されるとおり、ＩＲＥＳは、末端非依存的様式での翻訳開始を可能とするＲＮＡ要素である。例示的実施態様において、ＩＲＥＳは５’ＵＴＲにある。他の実施態様において、ＩＲＥＳは５’ＵＴＲ外にあり得る。
【0115】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、少なくとも約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００または５００ヌクレオチドである３’ＵＴＲを含み得る。ある実施態様において、３’ＵＴＲは、約２５～２００ヌクレオチド(例えば、約５０～１５０ヌクレオチド、約７５～１２５ヌクレオチド、約８０～１２０ヌクレオチドまたは約１００ヌクレオチド)含む。例示的実施態様において、３’ＵＴＲは、約１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１１０ヌクレオチド長である。
【0116】
ある実施態様において、３’ＵＴＲは、アラニンアミノトランスフェラーゼ１、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、ヒトフィブリノゲンアルファ鎖、ヒトハプトグロビン、ヒト抗トロンビン、ヒトアルファグロビン、ヒトベータグロビン、ヒト補体Ｃ３、ヒト増殖因子、ヒトヘプシジン、ＭＡＬＡＴ－１、マウスベータグロビン、マウスアルブミンおよびアフリカツメガエルベータグロビンまたは前記の何れかのフラグメントの３’ＵＴＲから選択される配列を含む。
【0117】
例示的実施態様において、３’ＵＴＲは、配列番号３５に示す配列を含むまたはそれからなる。他の例示的実施態様において、３’ＵＴＲは、配列番号３５に示す配列のフラグメント、例えば、配列番号３５の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００連続ヌクレオチドのフラグメントである。
【0118】
別の実施態様において、３’ＵＴＲは、アフリカツメガエルベータグロビンに由来する。ある実施態様において、３’ＵＴＲは、配列番号３６に示す配列を含むまたはそれからなる。他の実施態様において、３’ＵＴＲは、配列番号３６に示す配列のフラグメント、例えば、配列番号３６の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０連続ヌクレオチドのフラグメントである。
【0119】
ある例示的実施態様において、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３３の５’ＵＴＲ配列および配列番号３５の３’ＵＴＲ配列を含む。
【0120】
テイル領域
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立ち得るテイル領域を含む。ある実施態様において、テイル領域は、ポリＡテイルであり得る。
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立ち得るテイル領域を含む。ある実施態様において、テイル領域は、ポリＡテイルであり得る。
【0121】
ポリＡテイルは、当分野で知られる多様な方法を使用して、例えば、合成またはインビトロ転写ＲＮＡにテイルを付加するポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用して、付加できる。他の方法は、ポリＡテイルをコードするための転写ベクターの使用またはリガーゼの使用(例えば、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよび／またはＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用するスプリントライゲーションを経て)を含み、ここで、ポリＡは、センスＲＮＡの３’末端にライゲートされ得る。ある実施態様において、上記方法の何れかの組み合わせが利用される。
【0122】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、３’ポリＡテイル構造を含む。ある実施態様において、ポリＡテイルの長さは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００または３００ヌクレオチドであり得る。ある実施態様において、３’ポリＡテイルは、約５～３００アデノシンヌクレオチド(例えば、約３０～２５０アデノシンヌクレオチド、約６０～２２０アデノシンヌクレオチド、約８０～２００アデノシンヌクレオチド、約９０～約１５０アデノシンヌクレオチドまたは約１００～約１２０アデノシンヌクレオチド)含む。例示的実施態様において、３’ポリＡテイルは、約８０ヌクレオチド長である。他の例示的実施態様において、３’ポリＡテイルは約１００ヌクレオチド長である。さらに他の例示的実施態様において、３’ポリＡテイルは約１１５ヌクレオチド長である。さらに他の例示的実施態様において、３’ポリＡテイルは、約２５０ヌクレオチド長である。
【0123】
ある実施態様において、３’ポリＡテイルは、１以上のＵＮＡモノマーを含む。ある実施態様において、３’ポリＡテイルは、２、３、４、５、１０、１５、２０またはそれ以上のＵＮＡモノマーを含む。例示的実施態様において、３’ポリＡテイルは、２個のＵＮＡモノマーを含む。さらなる例示的実施態様において、３’ポリＡテイルは、は、連続して見られる２個のＵＮＡモノマーを含み、すなわち、３’ポリＡテイルで互いに連続している。
【0124】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、３’ポリＣテイル構造を含む。ある実施態様において、ポリＣテイルの長さは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００または３００ヌクレオチドであり得る。ある実施態様において、３’ポリＣテイルは、約５～３００シトシンヌクレオチド(例えば、約３０～２５０シトシンヌクレオチド、約６０～２２０シトシンヌクレオチド、約８０～約２００シトシンヌクレオチド、約９０～１５０シトシンヌクレオチドまたは約１００～約１２０シトシンヌクレオチド)含む。例示的実施態様において、３’ポリＣテイルは、約８０ヌクレオチド長である。他の例示的実施態様において、３’ポリＣテイルは約１００ヌクレオチド長である。さらに他の例示的実施態様において、３’ポリＣテイルは約１１５ヌクレオチド長である。さらに他の例示的実施態様において、３’ポリＣテイルは、約２５０ヌクレオチド長である。ポリＣテイルをポリＡテイルに付加してよくまたはポリＡテイルを置き換えてよい。ポリＣテイルは、ポリＡテイルの５’末端またはポリＡテイルの３’末端に付加され得る。
【0125】
ある実施態様において、ポリＡおよび／またはポリＣテイルの長さを、本発明の修飾ポリヌクレオチドの安定性、故に、タンパク質の転写を制御するために調節する。例えば、ポリＡテイルの長さがポリヌクレオチドの半減期に影響し得るため、ポリＡテイルの長さを、ｍＲＮＡのヌクレアーゼ抵抗性のレベルを修飾するよう調節し、それにより、標的細胞におけるポリヌクレオチド発現および／またはポリペプチド産生の時間経過を制御することができる。
【0126】
トリプル停止コドン
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ＣＤＳのすぐ下流に、トリプル停止コドンを作る配列を含み得る。トリプル停止コドンは、翻訳効率を増強するために取り込まれ得る。ある実施態様において、翻訳可能オリゴマーは、配列番号４～３１に例示される、ここに記載するＨＦＥ ＣＤＳのすぐ下流に、配列ＡＵＡＡＧＵＧＡＡ(配列番号６５)を含み得る。
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ＣＤＳのすぐ下流に、トリプル停止コドンを作る配列を含み得る。トリプル停止コドンは、翻訳効率を増強するために取り込まれ得る。ある実施態様において、翻訳可能オリゴマーは、配列番号４～３１に例示される、ここに記載するＨＦＥ ＣＤＳのすぐ下流に、配列ＡＵＡＡＧＵＧＡＡ(配列番号６５)を含み得る。
【0127】
翻訳開始部位
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、翻訳開始部位を含み得る。このような配列は当分野で知られ、コザック配列を含む。例えば、Kozak, Marilyn, 1988, Mol. and Cell Biol. 8: 2737-2744; Kozak, Marilyn, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870; Kozak, Marilyn, 1990, PNAS USA 87:8301-8305;およびKozak, Marilyn, 1989, J. Cell Biol. 108: 229-241参照。当分野で理解されるとおり、コザック配列は、ｍＲＮＡの効率的翻訳開始を可能とする、真核生物ｍＲＮＡの訳開始部位周囲を中心とする短コンセンサス配列である。リボソーム翻訳機構は、コザック配列の状況でＡＵＧ開始コドンを認識する。
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、翻訳開始部位を含み得る。このような配列は当分野で知られ、コザック配列を含む。例えば、Kozak, Marilyn, 1988, Mol. and Cell Biol. 8: 2737-2744; Kozak, Marilyn, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870; Kozak, Marilyn, 1990, PNAS USA 87:8301-8305;およびKozak, Marilyn, 1989, J. Cell Biol. 108: 229-241参照。当分野で理解されるとおり、コザック配列は、ｍＲＮＡの効率的翻訳開始を可能とする、真核生物ｍＲＮＡの訳開始部位周囲を中心とする短コンセンサス配列である。リボソーム翻訳機構は、コザック配列の状況でＡＵＧ開始コドンを認識する。
【0128】
ある実施態様において、翻訳開始部位、例えば、コザック配列は、ＨＦＥのコード配列の上流に挿入される。ある実施態様において、翻訳開始部位は、５’ＵＴＲの下流に挿入される。ある例示的実施態様において、翻訳開始部位は、ＨＦＥのコード配列の上流および５’ＵＴＲの下流に挿入される。
【0129】
当分野で理解されるとおり、コザック配列の長さは種々であり得る。一般に、リーダー配列の長さの延長は、翻訳を増強する。
【0130】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、配列番号６６の配列を有するコザック配列を含む。ある例示的実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは配列番号６６の配列を有するコザック配列を含み、ここで、コザック配列は５’ＵＴＲのすぐ下流およびＨＦＥのコード配列のすぐ上流である。
【0131】
合成方法
種々の態様において、本発明は、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドを合成する方法を提供する。
種々の態様において、本発明は、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチドを合成する方法を提供する。
【0132】
本発明のポリヌクレオチドは、ここに開示する方法および当分野で知られるあらゆる関連技術を使用して、合成および単離され得る。
【0133】
核酸を調製するある方法は、例えば、Merino, Chemical Synthesis of Nucleoside Analogues, (2013); Gait, Oligonucleotide synthesis: a practical approach (1984); Herdewijn, Oligonucleotide Synthesis, Methods in Molecular Biology, Vol. 288 (2005)に示される。
【0134】
ある実施態様において、ＨＦＥタンパク質のためのｍＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、インビトロ転写(ＩＶＴ)反応により製造され得る。ヌクレオシド三リン酸(ＮＴＰ)の混合物を、Ｔ７試薬を使用して重合して、例えば、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを産生し得る。ＤＮＡ鋳型をＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅおよびＲＮＡカラム分離で分解し得る。
【0135】
ある実施態様において、リガーゼを使用して、合成オリゴマーをＲＮＡ分子またはＲＮＡ転写物の３’末端に結合し、本発明のポリヌクレオチドを形成できる。３’末端にライゲートされた合成オリゴマーは、ポリＡテイルの官能基を提供でき、有利に３’－エキソリボヌクレアーゼによる抵抗性を提供する。ライゲート産物は比活性が増加し得て、タンパク質発現レベルを増加する。
【0136】
ある実施態様において、ライゲート産物は、天然特異性を有するＲＮＡ転写物で産生され得る。ライゲート産物は、天然特異性との適合性を確実にするために、５’末端にＲＮＡ転写物の構造を保持する合成分子であり得る。
【0137】
さらなる実施態様において、ライゲート産物は、外因性ＲＮＡ転写物または非天然ＲＮＡで産生され得る。ライゲート産物は、ＲＮＡの構造を保持する合成分子であり得る。
【0138】
理論に拘束されることを意図しないが、細胞における標準的ｍＲＮＡ分解経路は、(ｉ)ポリＡテイルが３’エキソヌクレアーゼにより徐々に切断されて、小さくなり、効率的翻訳に必要なループ相互作用を遮断し、キャップをオープンにして攻撃させる；(ii)キャップ除去複合体は、５’－キャップを除去する；(iii)転写物の非保護および翻訳不適格残余物を、５’および３’エキソヌクレアーゼ活性により分解する工程を含む。
【0139】
本発明の実施態様は、天然転写物より増加した翻訳活性を有し得る、新規ポリヌクレオチド構造に関する。数ある中で、ここに提供されるポリヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼが脱アデニル化過程においてポリＡテイルを逆トリミングすることを阻止し得る。
【0140】
脂質ベースの製剤
脂質ベースの製剤は、生体適合性および大規模産生の容易さにより、ＲＮＡの最も有望な送達系の一つとしての認識が高まっている。カチオン性脂質は、ＲＮＡ送達のための合成物質として広く試験されている。互いに混合された後、核酸は、カチオン性脂質により凝縮して、リポプレックスとして知られる脂質／核酸複合体を形成する。これらの脂質複合体は、遺伝物質をヌクレアーゼから保護し、負荷電細胞膜との相互作用により、細胞に送達させることができる。リポプレックスは、正荷電脂質を、生理学的ｐＨで負荷電核酸と直接混合することにより調製され得る。
脂質ベースの製剤は、生体適合性および大規模産生の容易さにより、ＲＮＡの最も有望な送達系の一つとしての認識が高まっている。カチオン性脂質は、ＲＮＡ送達のための合成物質として広く試験されている。互いに混合された後、核酸は、カチオン性脂質により凝縮して、リポプレックスとして知られる脂質／核酸複合体を形成する。これらの脂質複合体は、遺伝物質をヌクレアーゼから保護し、負荷電細胞膜との相互作用により、細胞に送達させることができる。リポプレックスは、正荷電脂質を、生理学的ｐＨで負荷電核酸と直接混合することにより調製され得る。
【0141】
慣用のリポソームは、カチオン性、アニオン性または中性(ホスホ)脂質およびコレステロールからなり得る脂質二重層からなり、水性コアを封入する。脂質二重層および水性空間両者が、それぞれ、疎水性または親水性化合物を取り込み得る。リポソーム特徴およびインビボ行動は、立体安定化を提供するために、リポソーム表面への親水性ポリマーコーティング、例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)の付加により修飾され得る。さらに、リポソームを、表面または結合ＰＥＧ鎖の末端へのリガンド(例えば、抗体、ペプチドおよび炭水化物)への結合により、特異的ターゲティングのために使用できる。
【0142】
リポソームは、水性区画を囲むリン脂質二重層からなる、コロイド状脂質ベースおよび界面活性剤ベースの送達系である。球形小胞として存在でき、サイズは２０nm～数ミクロンの範囲であり得る。カチオン性脂質ベースのリポソームは、静電相互作用を介して負荷電核酸と複合体化でき、生体適合性、低毒性およびインビボ臨床適用に必要な大規模産生の可能性を提供する複合体をもたらす。リポソームは、取り込みのために原形質膜と融合できる；細胞に入ったら、リポソームは、エンドサイトーシス経路を介して処理され、次いで、遺伝物質がエンドソーム／担体から細胞質に放出される。リポソームは、リポソームが基本的に生物学的膜のアナログであると考えると優れた生体適合性であり、天然および合成両者のリン脂質から合成できるため、薬物送達媒体として長く認識されている。
【0143】
カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴおよびｓｉＲＮＡ／小ヘアピンＲＮＡ－ｓｈＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドのための、伝統的に最も一般的に使用される非ウイルス送達系である。ＤＯＴＡＰ(１,２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン)およびＤＯＴＭＡ(Ｎ－[ｌ－(２,３－ジオレオイルオキシ)プロピル]－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチル－アンモニウムメチルスルフェート)などのカチオン性脂質は、静電相互作用により負荷電核酸と複合体またはリポプレックスを形成でき、ナノ粒子を形成し、高インビトロトランスフェクション効率を提供する。さらに、例えば、中性１,２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)ベースのナノリポソームなどのＲＮＡ送達のための中性脂質ベースのナノリポソームが開発された。
【0144】
一部実施態様によると、ＨＦＥをコードするここに記載するポリヌクレオチドは、脂質製剤化される。脂質製剤は、好ましくは、リポソーム、リポプレックス、ＰＬＧＡなどのコポリマーおよび脂質ナノ粒子から選択されるが、これらに限定されない。例示的実施態様において、脂質製剤は脂質ナノ粒子である。さらなる例示的実施態様において、ポリヌクレオチドは脂質ナノ粒子に封入され、ここで、脂質ナノ粒子は、リポソームがない医薬組成物の一部である。
【0145】
ある好ましい実施態様において、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)は
(ａ)核酸(例えば、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチド)、
(ｂ)カチオン性脂質、
(ｃ)凝集低減剤(例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)脂質またはＰＥＧ修飾脂質)、
(ｄ)所望により非カチオン性脂質(例えば中性脂質)および
(ｅ)所望により、ステロール
を含む。
(ａ)核酸(例えば、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチド)、
(ｂ)カチオン性脂質、
(ｃ)凝集低減剤(例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)脂質またはＰＥＧ修飾脂質)、
(ｄ)所望により非カチオン性脂質(例えば中性脂質)および
(ｅ)所望により、ステロール
を含む。
【0146】
ある実施態様において、脂質ナノ粒子製剤は、(ｉ)少なくとも１つのカチオン性脂質；(ii)中性脂質；(iii)ステロール、例えば、コレステロール；および(iv)ＰＥＧ－脂質からなり、約２０～６０％カチオン性脂質：５～２５％中性脂質：２５～５５％ステロール；０.５～１５％ＰＥＧ－脂質のモル比である。
【0147】
チオカルバメートおよびカルバメート含有脂質製剤
ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを送達するための脂質および脂質組成物のいくつかの例が、ＷＯ／２０１５／０７４０８５および米国特許公報ＵＳ２０１８／０１６９２６８およびＵＳ２０１８０１７０８６６に示される。ある実施態様において、脂質は、次の式
〔式中、
Ｒ１およびＲ２はいずれも１～１４炭素からなる直鎖状アルキルまたは２～１４炭素からなるアルケニルもしくはアルキニルであり；
Ｌ１およびＬ２はいずれも５～１８炭素からなる直鎖状アルキレンまたはアルケニレンであるかまたはＮとヘテロ環を形成し；
ＸはＳであり；
Ｌ３は結合または１～６炭素からなる直鎖状アルキレンからなるかまたはＮとヘテロ環を形成し；
Ｒ３は１～６炭素からなる直鎖または分枝鎖アルキレンからなり；そして
Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水素または１～６炭素からなる直鎖もしくは分枝鎖アルキルからなる。〕
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩である。
ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを送達するための脂質および脂質組成物のいくつかの例が、ＷＯ／２０１５／０７４０８５および米国特許公報ＵＳ２０１８／０１６９２６８およびＵＳ２０１８０１７０８６６に示される。ある実施態様において、脂質は、次の式
【化2】
Ｒ１およびＲ２はいずれも１～１４炭素からなる直鎖状アルキルまたは２～１４炭素からなるアルケニルもしくはアルキニルであり；
Ｌ１およびＬ２はいずれも５～１８炭素からなる直鎖状アルキレンまたはアルケニレンであるかまたはＮとヘテロ環を形成し；
ＸはＳであり；
Ｌ３は結合または１～６炭素からなる直鎖状アルキレンからなるかまたはＮとヘテロ環を形成し；
Ｒ３は１～６炭素からなる直鎖または分枝鎖アルキレンからなり；そして
Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、水素または１～６炭素からなる直鎖もしくは分枝鎖アルキルからなる。〕
を有する化合物またはその薬学的に許容される塩である。
【0148】
脂質製剤は、次のものから選択される、１以上のイオン化可能カチオン性脂質を含み得る。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【0149】
カチオン性脂質
本発明のポリヌクレオチドを封入する脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)は、好ましくは脂質ナノ粒子の形成に適するカチオン性脂質を含む。好ましくは、カチオン性脂質は、ほぼ生理学的ｐＨで正味正電荷を有する。
本発明のポリヌクレオチドを封入する脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)は、好ましくは脂質ナノ粒子の形成に適するカチオン性脂質を含む。好ましくは、カチオン性脂質は、ほぼ生理学的ｐＨで正味正電荷を有する。
【0150】
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ,Ｎ－ジオレイル－Ｎ,Ｎ－ジメチルアンモニウムクロライド(ＤＯＤＡＣ)、Ｎ,Ｎ－ジステアリル－Ｎ,Ｎ－ジメチルアンモニウムブロマイド(ＤＤＡＢ)、１,２－ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパンクロライド(ＤＯＴＡＰ)(Ｎ－(２,３－ジオレオイルオキシ)プロピル)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライドおよび１,２－ジオレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロライド塩としても知られる)、Ｎ－(ｌ－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル)－Ｎ,Ｎ,Ｎ－トリメチルアンモニウムクロライド(ＤＯＴＭＡ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシ)プロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジリノレイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｅｎＤＭＡ)、１,２－ジ－ｙ－リノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(γ－ＤＬｅｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(ＤＬｉｎ－ＤＡＣ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－モルホリノプロパン(ＤＬｉｎ－ＭＡ)、１,２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＡＰ)、１,２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ)、ｌ－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩(ＤＬｉｎ－ＴＭＡ.ＣＩ)、１,２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパン塩化物塩(ＤＬｉｎ－ＴＡＰ.ＣＩ)、１,２－ジリノレイルオキシ－３－(Ｎ－メチルピペラジノ)プロパン(ＤＬｉｎ－ＭＰＺ)または３－(Ｎ,Ｎ－ジリノレイルアミノ)－１,２－プロパンジオール(ＤＬｉｎＡＰ)、３－(Ｎ,Ｎ－ジオレイルアミノ)－１,２－プロパンジオール(ＤＯＡＰ)、１,２－ジリノレイルオキソ－３－(２－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノ)エトキシプロパン(ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ)またはそのアナログ、(３ａＲ,５ｓ,６ａＳ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,２－ジ((９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエニル)テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ[ｄ][１,３]ジオキソール－５－アミン、(６Ｚ,９Ｚ,２８Ｚ,３１Ｚ)－ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＭＣ３)、１,１’－(２－(４－(２－((２－(ビス(２－ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)(２－ヒドロキシドデシル)アミノ)エチル)ピペラジン－１－イル)エチルアザンジイル)ジドデカン－２－オール(Ｃ１２－２００)、２,２－ジリノレイル－４－(２－ジメチルアミノエチル)－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ)、(６Ｚ,９Ｚ,２８Ｚ,３１Ｚ)－ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ)、３－((６Ｚ,９Ｚ,２８Ｚ,３１Ｚ)－ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イルオキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチルプロパン－１－アミン(ＭＣ３エーテル)、４－((６Ｚ,９Ｚ,２８Ｚ,３１Ｚ)－ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イルオキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチルブタン－１－アミン(ＭＣ４エーテル)または前記の何れかの何らかの組み合わせであり得る。他のカチオン性脂質は、Ｎ,Ｎ－ジステアリル－Ｎ,Ｎ－ジメチルアンモニウムブロマイド(ＤＤＡＢ)、３Ｐ－(Ｎ－(Ｎ’,Ｎ’－ジメチルアミノエタン)－カルバモイル)コレステロール(ＤＣ－Ｃｈｏｉ)、Ｎ－(ｌ－(２,３－ジオレイルオキシ)プロピル)－Ｎ－２－(スペルミンカルボキサミド)エチル)－Ｎ,Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート(ＤＯＳＰＡ)、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン(ＤＯＧＳ)、１,２－ジレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＤＡＰ)、Ｎ－(１,２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド(ＤＭＲＩＥ)および２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－[１,３]－ジオキソラン(ＸＴＣ)を含むが、これらに限定されない。さらに、例えば、リポフェクチン(ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能)およびリポフェクタミン(ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能)などの市販のカチオン性脂質調製物を使用できる。
【0151】
他の適当なカチオン性脂質は、国際公開ＷＯ０９／０８６５５８、ＷＯ０９／１２７０６０、ＷＯ１０／０４８５３６、ＷＯ１０／０５４４０６、ＷＯ１０／０８８５３７、ＷＯ１０／１２９７０９およびＷＯ２０１１／１５３４９３；米国特許公報２０１１／０２５６１７５、２０１２／０１２８７６０および２０１２／００２７８０３；米国特許８,１５８,６０１；およびLove et al., 2010, PNAS 107(5): 1864-69に開示される。他の適当なアミノ脂質は、アルキル置換基が異なるもの(例えば、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノ－およびＮ－プロピル－Ｎ－エチルアミノ－)を含む、別の脂肪酸基および他のジアルキルアミノ基を有するものを含む。一般に、低飽和アシル鎖を有するアミノ脂質は、特に、濾過滅菌の目的で、複合体が約０.３ミクロンより小さくなければならないとき、より容易にサイズ調整される。Ｃ１４～Ｃ２２の範囲の炭素鎖長の不飽和脂肪酸を含むアミノ脂質が使用され得る。他の足場を使用して、アミノ脂質のアミノ基と脂肪酸または脂肪アルキル部分を分けることもできる。
【0152】
ある実施態様において、本発明のアミノまたはカチオン性脂質は、脂質が生理学的ｐＨ以下(例えば、ｐＨ７.４)のｐＨで正荷電であり、好ましくは生理学的ｐＨ以上の第二のｐＨで中性あるように、少なくとも１つのプロトン化可能または脱プロトン化可能基を有する。当然、ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去は、平衡化過程であり、荷電または中性脂質との記載は、優勢種の性質をいい、全脂質が該荷電または中性形態で存在する必要がないことは理解される。１を超えるプロトン化可能または脱プロトン化可能基を有するまたは双性イオン性である脂質は、本発明における使用から除外されない。ある実施態様において、プロトン化可能脂質は、プロトン化可能基の約４～約１１のｐＫａ、例えば、約５～約７のｐＫａを有する。
【0153】
カチオン性脂質は、粒子に存在する総脂質の約２０mol％～約７０mol％または７５mol％または約４５mol％～約６５mol％または約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または約７０mol％を構成し得る。他の実施態様において、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質のモルベースで約２５％～約７５％、例えば、モルベースで約２０％～約７０％、約３５％～約６５％、約４５％～約６５％、約６０％、約５７.５％、約５７.１％、約５０％または約４０％含む(脂質ナノ粒子中の脂質の１００％総モルに基づく)。ある実施態様において、カチオン性脂質対核酸比は、約３～約１５、例えば、約５～約１３または約７～約１１である。
【0154】
医薬組成物
ある態様において、本発明は、機能的に活性なＨＦＥタンパク質またはその機能的フラグメントをコードできる本発明のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
ある態様において、本発明は、機能的に活性なＨＦＥタンパク質またはその機能的フラグメントをコードできる本発明のポリヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0155】
医薬組成物は、局所または全身投与され得る。ある態様において、医薬組成物は、あらゆる投与方法で投与され得る。ある態様において、投与は、静脈内、皮下、肺、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、吸入または経鼻投与を含むあらゆる経路により得る。
【0156】
本発明の実施態様は、脂質製剤、例えば、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)にＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物を含む。
【0157】
ある実施態様において、医薬組成物は、カチオン性脂質、アニオン性脂質、ステロール、ペグ化脂質および前記の何れかの組み合わせから選択される１以上の脂質を含み得る。ある実施態様において、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、カチオン性脂質、リン脂質、コレステロールおよびペグ化脂質を含む。
【0158】
ある例示的実施態様において、本発明の医薬組成物は、リポソームを含まない。
【0159】
さらなる実施態様において、医薬組成物は、ナノ粒子を含み得る。
【0160】
ある例示的実施態様において、本発明の医薬組成物は、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)に封入された本発明のＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含み、リポソームを含まない。
【0161】
本発明のＨＦＥをコードするポリヌクレオチド送達のための脂質および脂質組成物のいくつかの例は、引用により全体として本明細書に包含させる、ＷＯ／２０１５／０７４０８５に示される。ある実施態様において、脂質はカチオン性脂質である。ある実施態様において、カチオン性脂質は、式II
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、各々直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、Ｌ１およびＬ２は、同一または異なって、各々少なくとも５炭素原子を有する直鎖アルキルであるかまたはＮとヘテロ環を形成し、Ｘ１は結合または－－ＣＯ－－Ｏ－－であり、それにより、Ｌ２－ＣＯ－－Ｏ－－Ｒ２が形成され、Ｘ２はＳまたはＯであり、Ｌ３は結合または低級アルキルであり、Ｒ３は低級アルキルであり、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、各々低級アルキルである。〕
の化合物を含む。Ｌ３が存在せず、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも７炭素原子からなり、Ｒ３がエチレンまたはｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５がメチルまたはエチルであり、Ｌ１およびＬ２が各々少なくとも５炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３が存在せず、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも７炭素原子からなり、Ｒ３がエチレンまたはｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５がメチルまたはエチルであり、Ｌ１およびＬ２が各々少なくとも５炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３が存在せず、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも９炭素原子のアルケニルからなり、Ｒ３がエチレンまたはｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５がメチルまたはエチルであり、Ｌ１およびＬ２が各々少なくとも５炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３がメチレンであり、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも７炭素原子からなり、Ｒ３がエチレンまたはｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５がメチルまたはエチルであり、Ｌ１およびＬ２が各々少なくとも５炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３がメチレンであり、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも９炭素原子からなり、Ｒ３がエチレンまたはｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５が各々メチルであり、Ｌ１およびＬ２が少なくとも７炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３がメチレンであり、Ｒ１が少なくとも９炭素原子を有するアルケニルからなり、Ｒ２が少なくとも７炭素原子を有するアルケニルからなり、Ｒ３がｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５が各々メチルであり、Ｌ１およびＬ２が少なくとも７炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３がメチレンであり、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも９炭素原子を有するアルケニルからなり、Ｒ３がエチレンであり、Ｒ４およびＲ５が各々メチルであり、Ｌ１およびＬ２が少なくとも７炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。
【化3】
の化合物を含む。Ｌ３が存在せず、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも７炭素原子からなり、Ｒ３がエチレンまたはｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５がメチルまたはエチルであり、Ｌ１およびＬ２が各々少なくとも５炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３が存在せず、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも７炭素原子からなり、Ｒ３がエチレンまたはｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５がメチルまたはエチルであり、Ｌ１およびＬ２が各々少なくとも５炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３が存在せず、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも９炭素原子のアルケニルからなり、Ｒ３がエチレンまたはｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５がメチルまたはエチルであり、Ｌ１およびＬ２が各々少なくとも５炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３がメチレンであり、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも７炭素原子からなり、Ｒ３がエチレンまたはｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５がメチルまたはエチルであり、Ｌ１およびＬ２が各々少なくとも５炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３がメチレンであり、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも９炭素原子からなり、Ｒ３がエチレンまたはｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５が各々メチルであり、Ｌ１およびＬ２が少なくとも７炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３がメチレンであり、Ｒ１が少なくとも９炭素原子を有するアルケニルからなり、Ｒ２が少なくとも７炭素原子を有するアルケニルからなり、Ｒ３がｎ－プロピレンであり、Ｒ４およびＲ５が各々メチルであり、Ｌ１およびＬ２が少なくとも７炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。Ｌ３がメチレンであり、Ｒ１およびＲ２が各々少なくとも９炭素原子を有するアルケニルからなり、Ｒ３がエチレンであり、Ｒ４およびＲ５が各々メチルであり、Ｌ１およびＬ２が少なくとも７炭素原子を有する直鎖アルキルからなる式IIの化合物もここに記載される。
【0162】
例示的実施態様において、カチオン性脂質は、ＡＴＸ－００１、ＡＴＸ－００２、ＡＴＸ－００３、ＡＴＸ－００４、ＡＴＸ－００５、ＡＴＸ－００６、ＡＴＸ－００７、ＡＴＸ－００８、ＡＴＸ－００９、ＡＴＸ－０１０、ＡＴＸ－０１１、ＡＴＸ－０１２、ＡＴＸ－０１３、ＡＴＸ－０１４、ＡＴＸ－０１５、ＡＴＸ－０１６、ＡＴＸ－０１７、ＡＴＸ－０１８、ＡＴＸ－０１９、ＡＴＸ－０２０、ＡＴＸ－０２１、ＡＴＸ－０２２、ＡＴＸ－０２３、ＡＴＸ－０２４、ＡＴＸ－０２５、ＡＴＸ－０２６、ＡＴＸ－０２７、ＡＴＸ－０２８、ＡＴＸ－０２９、ＡＴＸ－０３０、ＡＴＸ－０３１、ＡＴＸ－０３２、ＡＴＸ－０８１、ＡＴＸ－０９５およびＡＴＸ－１２６またはその薬学的に許容される塩からなる群から選択される化合物を含む。
【0163】
例示的実施態様において、カチオン性脂質は、ＡＴＸ－００２、ＡＴＸ－０８１、ＡＴＸ－０９５またはＡＴＸ－１２６から選択される。
【0164】
ある実施態様において、カチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩は、脂質分子のナノ粒子または二重層を含む脂質組成物に存在し得る。脂質二重層は、好ましくは中性脂質またはポリマーをさらに含む。脂質組成物は、好ましくは液体媒体を含む。組成物は、好ましくは本発明のＨＦＥコード配列を含むポリヌクレオチドをさらに封入する。脂質組成物は、好ましくは本発明のポリヌクレオチドおよび中性脂質またはポリマーをさらに含む。脂質組成物は、好ましくはＨＦＥコード配列を含むポリヌクレオチドを封入する。
【0165】
さらなる実施態様において、カチオン性脂質は、式III
〔Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、各々１～９炭素からなる直鎖または分枝鎖アルキル、２～１１炭素からなるアルケニルまたはアルキニルまたはコレステリルであり、Ｌ１およびＬ２は、同一または異なって、各々５～１８炭素からなる直鎖アルキレンまたはアルケニレンであり、Ｘ１は－－ＣＯ－－Ｏ－－であり、それにより－Ｌ２－ＣＯ－－Ｏ－－Ｒ２が形成され、Ｘ２はＳまたはＯであり、Ｘ３は－－ＣＯ－－Ｏ－－であり、それにより－Ｌ１－ＣＯ－－Ｏ－－Ｒ１が形成され、Ｌ３は結合であり、Ｒ３は１～６炭素からなる直鎖または分枝鎖アルキレンであり、Ｒ４およびＲ５は、同一または異なって、各々水素または１～６炭素からなる直鎖または分枝鎖アルキルである。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩を含むである。ある実施態様において、Ｘ２がＳである。他の実施態様において、Ｒ３がエチレン、ｎ－プロピレンまたはイソブチレンから選択される。さらに他の実施態様において、Ｒ４およびＲ５が別々にメチル、エチルまたはイソプロピルである。さらに他の実施態様において、Ｌ１およびＬ２が同一である。さらに他の実施態様において、Ｌ１およびＬ２が異なる。さらに他の実施態様において、Ｌ１またはＬ２が７炭素を有する直鎖アルキレンからなる。さらに他の実施態様において、Ｌ１またはＬ２が９炭素を有する直鎖アルキレンからなる。さらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ２が同一である。さらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ２が異なる。さらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ２が各々アルケニルからなる。さらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ２が各々アルキルからなる。さらに他の実施態様において、アルケニルは１個の二重結合からなる。さらに他の実施態様において、Ｒ１またはＲ２は９炭素からなる。さらに他の実施態様において、Ｒ１またはＲ２は１１炭素からなる。さらに他の実施態様において、Ｒ１またはＲ２は７炭素からなる。さらに他の実施態様において、Ｌ３が結合であり、Ｒ３がエチレンであり、Ｘ２がＳおよびＲ４およびＲ５が各々メチルである。さらに他の実施態様において、Ｌ３が結合であり、Ｒ３がｎ－プロピレンであり、Ｘ２がＳであり、Ｒ４およびＲ５が各々メチルである。さらに他の実施態様において、Ｌ３が結合であり、Ｒ３がエチレンであり、Ｘ２がＳおよびＲ４およびＲ５が各々エチルである。
【化4】
の化合物またはその薬学的に許容される塩を含むである。ある実施態様において、Ｘ２がＳである。他の実施態様において、Ｒ３がエチレン、ｎ－プロピレンまたはイソブチレンから選択される。さらに他の実施態様において、Ｒ４およびＲ５が別々にメチル、エチルまたはイソプロピルである。さらに他の実施態様において、Ｌ１およびＬ２が同一である。さらに他の実施態様において、Ｌ１およびＬ２が異なる。さらに他の実施態様において、Ｌ１またはＬ２が７炭素を有する直鎖アルキレンからなる。さらに他の実施態様において、Ｌ１またはＬ２が９炭素を有する直鎖アルキレンからなる。さらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ２が同一である。さらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ２が異なる。さらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ２が各々アルケニルからなる。さらに他の実施態様において、Ｒ１およびＲ２が各々アルキルからなる。さらに他の実施態様において、アルケニルは１個の二重結合からなる。さらに他の実施態様において、Ｒ１またはＲ２は９炭素からなる。さらに他の実施態様において、Ｒ１またはＲ２は１１炭素からなる。さらに他の実施態様において、Ｒ１またはＲ２は７炭素からなる。さらに他の実施態様において、Ｌ３が結合であり、Ｒ３がエチレンであり、Ｘ２がＳおよびＲ４およびＲ５が各々メチルである。さらに他の実施態様において、Ｌ３が結合であり、Ｒ３がｎ－プロピレンであり、Ｘ２がＳであり、Ｒ４およびＲ５が各々メチルである。さらに他の実施態様において、Ｌ３が結合であり、Ｒ３がエチレンであり、Ｘ２がＳおよびＲ４およびＲ５が各々エチルである。
【0166】
当業者には認識されるとおり、式IIおよびIIIの化合物は塩を形成し、それもまた本開示の範囲内である。ここでの式IIおよびIIIの化合物の記載は、特に断らない限り、その塩の記載を含むと」理解される。ここで使用する用語「塩」は、無機および／または有機酸と形成される酸性塩ならびに無機および／または有機塩基と形成される塩基性塩を意味する。さらに、式IIまたはIIIの化合物が、ピリジンまたはイミダゾールを含むが、これらに限定されない塩基性部分と、カルボン酸などの、しかしこれに限定されない酸性部分両者を含むとき、双性イオン(「分子内塩」)が形成され得て、ここで使用する用語「塩」に含まれる。塩は、薬学的に許容される(すなわち、非毒性の、生理学的に許容される)塩であり得るが、他の塩も有用である。式IIまたはIIIの化合物の塩は、例えば、式IIまたはIIIの化合物と、等量など一定量の酸または塩基を、塩が沈殿するものなどの媒体または水性媒体中で反応させ、その後凍結乾燥により形成され得る。
【0167】
酸付加塩の例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピルビン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩(例えばここに記載のもの)、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸(トシル酸としても知られる)、ウンデカン酸塩などを含む。さらに、塩基性医薬化合物からの薬学的に有用な塩の形成に適すると一般に考えられる酸は、例えば、Berge et al., 1977, J. Pharmaceutical Sciences 66(1) 1-19; P. Gould, 1986, International J. Pharmaceutics 33 201-217; Anderson et al., 1996, The Practice of Medicinal Chemistry Academic Press, New York; and in The Orange Book (Food & Drug Administration, Washington, D.C.)に記載される。
【0168】
塩基性塩の例は、アンモニウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、有機塩基(例えば、有機アミン)との塩、例えば、ベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン(Ｎ,Ｎ－ビス(デヒドロアビエチル)エチレンジアミンと形成)、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミド、ｔ－ブチルアミンおよびアルギニン、リシンなどのアミノ酸との塩などを含む。塩基性窒素含有基は、低級アルキルハライド(例えば、メチル、エチル、プロピルおよびブチルクロライド、ブロマイドおよびアイオダイド)、ジアルキル硫酸(例えば、ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミル硫酸)、長鎖ハライド(例えば、デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリルクロライド、ブロマイドおよびアイオダイド)、アリールアルキルハライド(例えば、ベンジルおよびフェネチルブロマイド)およびその他などの薬剤で四級化され得る。
【0169】
全てのこのような酸および塩基塩は、本開示の範囲内で薬学的に許容される塩であると意図され、全ての酸および塩基塩は、本開示の目的で、遊離形態の対応する化合物と同等であると考える。式IIまたはIIIの化合物は、溶媒和されていない形および水和を含む溶媒和された形で存在し得る。一般に、水、エタノールなどの薬学的に許容される溶媒との溶媒和形態は、本開示の目的で、溶媒和されていない形態と同等であると考える。式IIまたはIIIの化合物およびその塩、溶媒和物は、互変異性形態(例えば、アミドまたはイミノエーテルとして)で存在し得る。全てのこのような互変異性形態は、本開示の一部としてここでは考慮される。
【0170】
ここに記載するカチオン性脂質化合物を、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、微粒子、ナノ粒子、リポソームまたはミセルを形成し得る。粒子、リポソームまたはミセルにより送達される本発明のポリヌクレオチドは、ガス、液体または固体の形であり得る。カチオン性脂質化合物およびポリヌクレオチドを、他のカチオン性脂質化合物、ポリマー(合成または天然)、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質などと組み合わせて、粒子を形成し得る。次いで、これらの粒子を、所望により医薬添加物と合わせて、医薬組成物を形成し得る。
【0171】
ある実施態様において、カチオン性脂質化合物は、比較的非細胞毒性である。カチオン性脂質化合物は、生体適合性および生分解性であり得る。カチオン性脂質は、約５.５～約７.５、より好ましくは約６.０～約７.０の範囲のｐＫａを有し得る。約３.０～約９.０または約５.０～約８.０の所望のｐＫａを有するよう設計し得る。
【0172】
カチオン性脂質化合物を含む組成物は、３０～７０％カチオン性脂質化合物、０～６０％コレステロール、０～３０％リン脂質および１～１０％ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)であり得る。好ましくは、組成物は３０～４０％カチオン性脂質化合物、４０～５０％コレステロールおよび１０～２０％ＰＥＧである。他の好ましい実施態様において、組成物は５０～７５％カチオン性脂質化合物、２０～４０％コレステロールおよび５～１０％リン脂質および１～１０％ＰＥＧである。組成物は、６０～７０％カチオン性脂質化合物、２５～３５％コレステロールおよび５～１０％ＰＥＧを含み得る。組成物は、９０％までのカチオン性脂質化合物および２～１５％ヘルパー脂質を含み得る。製剤は、例えば８～３０％化合物、５～３０％ヘルパー脂質および０～２０％コレステロール；４～２５％カチオン性脂質、４～２５％ヘルパー脂質、２～２５％コレステロール、１０～３５％コレステロール－ＰＥＧおよび５％コレステロール～アミン；または２～３０％カチオン性脂質、２～３０％ヘルパー脂質、１～１５％コレステロール、２～３５％コレステロール－ＰＥＧおよび１～２０％コレステロール～アミン；または９０％までのカチオン性脂質および２～１０％ヘルパー脂質を含むまたは１００％カチオン性脂質を含む、脂質粒子製剤であり得る。
【0173】
ある実施態様において、１以上のコレステロールベースの脂質は、コレステロール、ペグ化コレステロールおよびＤＣ－Ｃｈｏｌ(Ｎ,Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール)および１,４－ビス(３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル)ピペラジンから選択される。例示的実施態様において、コレステロールベースの脂質はコレステロールである。
【0174】
ある実施態様において、１以上のペグ化脂質、すなわち、ＰＥＧ修飾脂質。ある実施態様において、１以上のＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６－Ｃ２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した５kDa長までのポリ(エチレン)グリコール鎖を含む。ある実施態様において、ＰＥＧ修飾脂質は、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－[スクシニル(メトキシポリエチレングリコール)－２０００]などの誘導体化セラミドである。ある実施態様において、ＰＥＧ修飾またはペグ化脂質は、ペグ化コレステロールまたはジミリストイルグリセロール(ＤＭＧ)－ＰＥＧ－２Ｋである。例示的実施態様において、ＰＥＧ修飾脂質はペグ化コレステロールである。
【0175】
さらなる実施態様において、医薬組成物は、ウイルスまたは細菌ベクター内に本発明のＨＦＥをコードするポリヌクレオチド(例えば、配列番号４～３１から選択される配列を含むポリヌクレオチド)を含み得る。
【0176】
本発明の医薬組成物は、当分野で知られるとおり、担体、希釈剤または添加物を含み得る。医薬組成物および方法の例は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro ed. 1985), and Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition (2005)に記載される。
【0177】
医薬組成物のための添加物は、抗酸化剤、懸濁化剤、分散剤、防腐剤、緩衝剤、等張化剤および界面活性剤を含む。
【0178】
本発明の薬剤または医薬製剤の有効用量は、細胞でＨＦＥをコードするポリヌクレオチドの翻訳を引き起こすのに十分な量であり得る。
【0179】
治療有効用量は、治療効果をもたらすのに十分な薬剤または製剤の量であり得る。治療有効用量を、１以上の別々の投与でおよび異なる経路で投与し得る。当分野で認識されるとおり、治療有効用量または治療有効量は、本発明の医薬組成物に含まれる治療剤の総量に基づき、主として決定される。一般に、治療有効量は、対象に有意義な利益(例えば、ヘモクロマトーシスの処置、調節、治癒、予防および／または改善)の達成に十分である。例えば、治療有効量は、所望の治療および／または予防効果の達成に十分な量であり得る。一般に、処置を必要とする対象に投与される治療剤(例えば、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドまたはその機能的に活性なフラグメント)の量は、対象の特徴による。このような特徴は、対象の状態、疾患重症度、一般的健康状態、年齢、性別および体重を含む。当業者は、これらおよび他の関連因子によって適切な投与量を容易に決定できる。さらに、最適投与量範囲を決定するために、客観的および主観的両アッセイを、所望により用いてよい。
【0180】
ここに提供される方法は、治療有効量のここに記載するポリヌクレオチド(例えば、ＨＦＥまたはその機能的に活性なフラグメントをコードするポリヌクレオチド)の単回および複数回投与を意図する。ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物は、対象の状態の態様、重症度および程度(例えば、対象のヘモクロマトーシス疾患状態およびヘモクロマトーシスの関連症状の重症度および／または対象のＨＦＥ活性レベル)により、一定間隔で投与され得る。ある実施態様において、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド(例えば、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメント)を、定常的間隔(例えば、年１回、６か月毎に１回、４か月毎に１回、３か月毎に１回、２か月毎に１回、月１回)、２週毎に１回、毎週、毎日、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回または連続的に周期的に投与し得る。例示的実施態様において、治療有効量の本発明のポリヌクレオチド(例えば、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドまたはそのフラグメント)は、毎週、２週毎に１回または毎月投与される。
【0181】
ある実施態様において、本発明の医薬組成物は、その中に含まれるＨＦＥをコードするポリヌクレオチドの長期放出に適するように製剤化される。このような長期放出組成物は、長い投与間隔で、好都合に対象に投与される。例えば、ある実施態様において、本発明の医薬組成物は、対象に１日２回、毎日または隔日投与される。ある実施態様において、本発明の医薬組成物は、対象に週２回、週１回、１０日毎、２週毎、２８日毎、毎月、６週毎、８週毎、一か月おき、３か月毎、４か月毎、６か月毎、９か月毎または年１回投与される。ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを長期にわたり送達または放出するためにデポー投与(例えば、皮下、筋肉内)に製剤化された、医薬組成物も考慮される。好ましくは、用いられる長期放出手段は、安定性を増強するためにＨＦＥをコードするポリヌクレオチドになされる修飾と組み合わせる。
【0182】
ある実施態様において、治療有効用量は、投与により、機能的ＨＦＥの１～１０００pg／mlまたは１～１０００ng／mlまたは１～１０００μg／mlまたはそれ以上の血清または血漿レベルをもたらし得る。
【0183】
ある実施態様において、治療有効用量の本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、処置した対象の患者の機能的ＨＦＥタンパク質のレベルを増加させ得る。ある実施態様において、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、処置前の対象のベースライン機能的ＨＦＥタンパク質レベルに比して、肝臓における機能的ＨＦＥタンパク質レベルを５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％増加させる。ある実施態様において、治療有効用量の本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、処置前の対象の肝臓におけるベースライン機能的ＨＥＦレベルに比して、機能的ＨＦＥタンパク質レベルを増加させる。ある実施態様において、肝臓におけるベースライン機能的ＨＦＥレベルに比した肝臓の機能的ＨＦＥレベル増加は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％またはそれ以上である。
【0184】
ある実施態様において、治療有効用量は、定常的に投与したとき、処置前のベースラインレベルと比較して、肝臓における機能的ＨＦＥ発現レベルを増加させる。ある実施態様において、治療有効用量の本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、処置対象の肝臓における総タンパク質のmgあたり約１０ng、約２０ng、約５０ng、約１００ng、約１５０ng、約２００ng、約２５０ng、約３００ng、約３５０ng、約４００ng、約４５０ng、約５００ng、約６００ng、約７００ng、約８００ng、約９００ng、約１０００ng、約１２００ngまたは約１５００ng以上の機能的ＨＦＥタンパク質発現レベルをもたらす。
【0185】
ある実施態様において、治療有効用量のＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、ヘプシジンｍＲＮＡ発現増加、血漿ヘプシジンレベル増加、血清フェリチン減少、血漿鉄減少、尿中排泄鉄減少および／または肝臓鉄減少をもたらす。
【0186】
ある実施態様において、治療有効用量は、定常的に投与したとき、生物学的サンプルにおけるフェリチンレベル減少をもたらす。ある実施態様において、治療有効用量のＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、処置前のベースラインフェリチンレベルと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％生物学的サンプル(例えば、血清サンプル)におけるフェリチンレベル減少をもたらす。例示的実施態様において、生物学的サンプルは血清サンプルである。
【0187】
ある実施態様において、治療有効用量は、定常的に投与したとき、血清フェリチンを、５００μg／Ｌ、６００μg／Ｌ、７００μg／Ｌ、８００μg／Ｌ、９００μg／Ｌ、１０００μg／Ｌ、２０００μg／Ｌ、３０００μg／Ｌ、４０００μg／Ｌ、５０００μg／Ｌ以上のレベルから、５００μg／Ｌ、４００μg／Ｌ、３００μg／Ｌ、２００μg／Ｌ、１００μg／Ｌまたは５０μg／Ｌ未満のレベルまで減少できる。例示的実施態様において、治療有効用量は、定常的に投与したとき、血清フェリチンを１０００μg／Ｌ以上のレベルから２００μg／Ｌ未満のレベルまで減少できる。さらなる例示的実施態様において、治療有効用量は、定常的に投与したとき、血清フェリチンを１０００μg／Ｌ以上のレベルから５０μg／Ｌ未満のレベルまで減少できる。
【0188】
血清フェリチンレベルの測定は、当分野で知られる何れかの方法を使用してなされ得る。例えば、血清フェリチンは、免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、免疫化学発光法(Abbott Architectアッセイ、ADVIA CentaurアッセイまたはRoche ECLIAアッセイ)または免疫比濁アッセイ(Tinta-quantアッセイ)を使用して、測定できる。例えば、Cullis et al., 2018, British Journal of Haematology 181(3): 331-340参照。
【0189】
ある実施態様において、治療有効用量は、定常的に投与したとき、生物学的サンプルにおける鉄レベルを減少させる。ある実施態様において、治療有効用量のＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、処置前のベースライン鉄レベルと比較して、生物学的サンプル(例えば、血漿または尿サンプル)における鉄レベルを、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％減少させる。例示的実施態様において、生物学的サンプルは、血漿サンプルである。他の例示的実施態様において、生物学的サンプルは、尿サンプルである。
【0190】
ある実施態様において、治療有効用量は、定常的に投与したとき、血漿鉄を、１８０μg／dL、１９０μg／dL、２００μg／dL、２１０μg／dL、２２０μg／dL、２３０μg／dL、２４０μg／dL、２５０μg／dL、２６０μg／dL、２７０μg／dL以上のレベルから１８０μg／dL、１５０μg／dL、１２５μg／dL、１００μg／dLまたは７５μg／dL未満のレベルに減少できる。例示的実施態様において、治療有効用量は、定常的に投与したとき、血漿鉄を、１８０μg／dL以上のレベルから１５０μg／dL未満のレベルまで減少できる。さらなる例示的実施態様において、治療有効用量は、定常的に投与したとき、血漿を１８０μg／dL以上のレベルから１００μg／dL未満のレベルまで減少できる。
【0191】
さらなる実施態様において、治療有効用量、定常的に投与したとき、処置対象の血漿ヘプシジンレベルを増加させる。ある実施態様において、治療有効用量、定常的に投与したとき、瀉血の必要性を減らすかまたは無くす。
【0192】
インビボの活性剤(例えば、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む組成物)の治療有効用量は、約０.００１～約５００mg／kg体重の用量であり得る。例えば、治療有効用量は、約０.００１～０.０１mg／kg体重または０.０１～０.１mg／kgまたは０.１～１mg／kgまたは１～１０mg／kgまたは１０～１００mg／kgであり得る。ある実施態様において、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、約０.１～約１０mg／kg体重、例えば、約０.３～約５mg／kg、約０.５～約４.５mg／kgまたは約２～約４mg／kg範囲の用量で提供される。
【0193】
インビボの活性剤(例えば、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む組成物)の治療有効用量は、少なくとも約０.００１mg／kg体重または少なくとも約０.０１mg／kgまたは少なくとも約０.１mg／kgまたは少なくとも約１mg／kgまたは少なくとも約２mg／kgまたは少なくとも約３mg／kgまたは少なくとも約４mg／kgまたは少なくとも約５mg／kg、少なくとも約１０mg／kg、少なくとも約２０mg／kg、少なくとも約５０mg／kgまたはそれ以上の用量であり得る。ある実施態様において、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、約０.１mg／kg、約０.５mg／kg、約１mg／kg、約１.５mg／kg、約２mg／kg、約２.５mg／kg、約３mg／kg、約３.５mg／kg、約４mg／kg、約５mg／kgまたは約６mg／kg、７mg／kg、８mg／kg、９mg／kg、１０mg／kg、１５mg／kg、２０mg／kg、２５mg／kg、５０mg／kg、７５mg／kgまたは１００mg／kgの用量で提供される。例示的実施態様において、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、約０.３mg／kgの用量で提供される。他の例示的実施態様において、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、約１mg／kgの用量で提供される。さらに他の例示的実施態様において、ＨＦＥをコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、約３mg／kgの用量で提供される。
【0194】
本明細書をとおして、組成物が特定の成分を有する、含むまたは包含すると記載されるときまたは過程および方法が特定の工程を有する、含むまたは包含すると記載されるとき、さらに、記載の成分から本質的になるまたはそれからなる本発明の組成物および記載する工程から本質的になるまたはそれからなる本発明の過程および方法があることが意図される。
【0195】
本発明において、要素または成分が記載する要素または成分に含まれるおよび／または記載の一覧から選択されるとされるとき、要素または成分は、記載する要素または成分の何れか一つであってよく、または記載する要素または成分は、２以上の記載する要素または成分からなる群から選択されてよいことは理解されるべきである。
【0196】
さらに、ここに記載する組成物または方法の要素および／または特性は、本明細書で明示または暗示されているかに関わらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多様な方法で組み合わせ得る。例えば、特定の化合物が記載されているとき、その化合物は、文脈から他の解釈が必要でない限り、本発明の組成物の種々の実施態様および／または本発明の方法で使用され得る。換言すると、本明細書内で、実施態様は、記載しかつ描かれるべき明確かつ簡潔な適用を可能とするよう記載および記述されているが、本教示および発明から離れることなく、実施態様を種々に組み合わせまたは分離し得ることが意図されかつそうされるであろう。例えば、ここに記載しかつ記述する全ての特性を、ここに記載しかつ記述する本発明の全ての態様に適用し得ることは理解される。本明細書に開示する全特性を、何れかの組み合わせで組み合わせ得る。本明細書に開示された各特性を、同一、同等または類似目的を果たす別の特性に置き換え得る。
【0197】
「少なくとも１つ」なる表現は、文脈および用途から他の解釈がされない限り、該表現の後に記載する物質の個々の各々および２以上の記載する物質の種々の組み合わせを含むと理解されるべきである。３以上の物質に関連する「および／または」の表現は、文脈から他の解釈が必要でない限り、同様の意味を有すると理解されるべきである。
【0198】
用語「含む」、「含み」、「含んで」、「有する」、「有し」、「有して」、「含有」、「含有する」または「含有して」は、それらの文法的等価物を含み、他に具体的に記載されるかまたは文脈から解釈されない限り、一般にオープンエンドかつ非限定的として、例えば、さらなる未記載の要素または工程の包含を排除しないと理解されるべきである。
【0199】
工程の順序またはある行為の実施の順序は、本発明が操作可能なままである限り、重要でないと解釈されるべきである。さらに、２以上の工程または行為を同時に実施し得る。
【0200】
例えば、「など」または「含む」などの、任意かつ全ての例または例示的用語の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図し、請求されない限り、本発明の範囲の限定を意図しない。本明細書におけるいかなる用語も、請求されていない何らかの要素を、本発明の実施に必須であるとして示すものと解釈されてはならない。
【0201】
本発明は、記載する特定の方法、プロトコール、物質および試薬に、これらが変わり得るため、限定されないことは理解される。ここで使用する用語は、特定の実施態様を記載する目的のみであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、それは、添付する特許請求の範囲により包含される。
【実施例】
【0202】
一般に記載してきた本発明は、単に本発明のある態様および実施態様の説明の目的のみで記載し、本発明の限定を意図しない、次の実施例を参照して、より容易に理解される。
【0203】
実施例１：肝細胞におけるＨＦＥ ｍＲＮＡからのＨＦＥタンパク質の発現。
この実施例は、外因性ＨＦＥタンパク質が、市販の送達剤を使用するｍＲＮＡのトランスフェクション後、培養ヒト初代肝細胞で産生され得ることを示す。
ヒト初代肝細胞を購入し(Thermo-Fisher Scientific)、ベンダーの推奨法に従い凍結回収し、播種した。コドン最適化ＨＦＥコードｍＲＮＡ(ウリジンをＮ１－メチル－シュードウリジン[「Ｎ１ＭＰＵ」]または５－メトキシウリジン[「５ＭＯＵ」]に置き換える修飾)を、種々の量のLipofectamine MessengerMAX(Thermo-Fisher Scientific)を使用してトランスフェクトした。本実施例で使用したＲＮＡ配列は配列番号６７に記載し、これは、５’－キャップ(単一５’ Ａ残基を提供)、配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号４のＨＦＥコード配列(配列番号３２のタンパク質をコード)および配列番号３５の３’ＵＴＲを含む。
トランスフェクション２４時間後、細胞を、続くウェスタンブロッティングのためにＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。各サンプルから１０μgの総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに負荷し、電気泳動を実施した。次いで、分離したタンパク質を、ベンダーが推奨する条件で、iBlot 2 Blotting System(Thermo-Fisher Scientific)を使用してＰＶＤＦ膜に移した。次いで、膜を抗ＨＦＥ抗体(Abcam)および抗シクロフィリンＢ(内因性対照として)抗体でプローブした。二次抗体検出をＥＣＬ基質により実施し、ブロットを市販の撮像装置で造影した。
結果を図１に示し、トランスフェクトｍＲＮＡの量が高いほどシグナル強度が増強することにより示されるとおり、ＭＯＣＫ－トランスフェクト細胞に対して有意かつ濃度依存的外因性ＨＦＥタンパク質発現が達成される。
データは、相当量の外因性ＨＦＥタンパク質が、コドン最適化ｍＲＮＡ(Ｎ１－メチル－シュードウリジンまたは５－メトキシウリジンを含む)により翻訳され得ることを示す。
この実施例は、外因性ＨＦＥタンパク質が、市販の送達剤を使用するｍＲＮＡのトランスフェクション後、培養ヒト初代肝細胞で産生され得ることを示す。
ヒト初代肝細胞を購入し(Thermo-Fisher Scientific)、ベンダーの推奨法に従い凍結回収し、播種した。コドン最適化ＨＦＥコードｍＲＮＡ(ウリジンをＮ１－メチル－シュードウリジン[「Ｎ１ＭＰＵ」]または５－メトキシウリジン[「５ＭＯＵ」]に置き換える修飾)を、種々の量のLipofectamine MessengerMAX(Thermo-Fisher Scientific)を使用してトランスフェクトした。本実施例で使用したＲＮＡ配列は配列番号６７に記載し、これは、５’－キャップ(単一５’ Ａ残基を提供)、配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号４のＨＦＥコード配列(配列番号３２のタンパク質をコード)および配列番号３５の３’ＵＴＲを含む。
トランスフェクション２４時間後、細胞を、続くウェスタンブロッティングのためにＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。各サンプルから１０μgの総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに負荷し、電気泳動を実施した。次いで、分離したタンパク質を、ベンダーが推奨する条件で、iBlot 2 Blotting System(Thermo-Fisher Scientific)を使用してＰＶＤＦ膜に移した。次いで、膜を抗ＨＦＥ抗体(Abcam)および抗シクロフィリンＢ(内因性対照として)抗体でプローブした。二次抗体検出をＥＣＬ基質により実施し、ブロットを市販の撮像装置で造影した。
結果を図１に示し、トランスフェクトｍＲＮＡの量が高いほどシグナル強度が増強することにより示されるとおり、ＭＯＣＫ－トランスフェクト細胞に対して有意かつ濃度依存的外因性ＨＦＥタンパク質発現が達成される。
データは、相当量の外因性ＨＦＥタンパク質が、コドン最適化ｍＲＮＡ(Ｎ１－メチル－シュードウリジンまたは５－メトキシウリジンを含む)により翻訳され得ることを示す。
【0204】
実施例２：肝細胞におけるＨＦＥ ｍＲＮＡからのＨＦＥタンパク質発現の期間。
この実施例は、市販の送達剤を使用するＨＦＥ ｍＲＮＡのトランスフェクション後の外因性ＨＦＥ発現の期間を示す。
ヒト初代肝細胞を購入し(Thermo-Fisher Scientific)、ベンダーの推奨法に従い凍結回収し、播種した。５００ngのコドン最適化ＨＦＥコードｍＲＮＡ(ウリジンをＮ１－メチル－シュードウリジン[「Ｎ１」]または５－メトキシウリジン[「５ＭＵ」]に置き換える修飾)を、Lipofectamine MessengerMAX(Thermo-Fisher Scientific)を使用してトランスフェクトした。本実施例で使用したＲＮＡ配列は配列番号６７に記載し、これは、５’－キャップ(単一５’ Ａ残基を提供)、配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号４のＨＦＥコード配列(配列番号３２のタンパク質をコード)および配列番号３５の３’ＵＴＲを含む。
トランスフェクション２４時間後(およびその後毎日)、細胞をウェスタンブロッティングのためにＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。各サンプル時点から１０μgの総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに負荷し、電気泳動を実施した。次いで、分離したタンパク質を、ベンダーが推奨する条件を使用して、iBlot 2 Blotting System(Thermo-Fisher Scientific)を使用してＰＶＤＦ膜に移した。次いで、膜を抗ＨＦＥ抗体(Abcam)および抗シクロフィリンＢ(内因性対照として)抗体でプローブした。直接検出を、近赤外(ＮＩＲ)蛍光色素で標識した二次抗体を使用して実施し、ブロットを市販の撮像装置で造影した。
結果を図２に示し、ＭＯＣＫ－トランスフェクト細胞に対して、トランスフェクション後６日まで相当量の外因性ＨＦＥタンパク質発現が検出されることを示す。
データは、ヒト肝細胞において、持続性ＨＦＥ発現が、ｍＲＮＡの１回投与で得られ得ることを示す。
この実施例は、市販の送達剤を使用するＨＦＥ ｍＲＮＡのトランスフェクション後の外因性ＨＦＥ発現の期間を示す。
ヒト初代肝細胞を購入し(Thermo-Fisher Scientific)、ベンダーの推奨法に従い凍結回収し、播種した。５００ngのコドン最適化ＨＦＥコードｍＲＮＡ(ウリジンをＮ１－メチル－シュードウリジン[「Ｎ１」]または５－メトキシウリジン[「５ＭＵ」]に置き換える修飾)を、Lipofectamine MessengerMAX(Thermo-Fisher Scientific)を使用してトランスフェクトした。本実施例で使用したＲＮＡ配列は配列番号６７に記載し、これは、５’－キャップ(単一５’ Ａ残基を提供)、配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号４のＨＦＥコード配列(配列番号３２のタンパク質をコード)および配列番号３５の３’ＵＴＲを含む。
トランスフェクション２４時間後(およびその後毎日)、細胞をウェスタンブロッティングのためにＲＩＰＡ緩衝液で溶解した。各サンプル時点から１０μgの総タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに負荷し、電気泳動を実施した。次いで、分離したタンパク質を、ベンダーが推奨する条件を使用して、iBlot 2 Blotting System(Thermo-Fisher Scientific)を使用してＰＶＤＦ膜に移した。次いで、膜を抗ＨＦＥ抗体(Abcam)および抗シクロフィリンＢ(内因性対照として)抗体でプローブした。直接検出を、近赤外(ＮＩＲ)蛍光色素で標識した二次抗体を使用して実施し、ブロットを市販の撮像装置で造影した。
結果を図２に示し、ＭＯＣＫ－トランスフェクト細胞に対して、トランスフェクション後６日まで相当量の外因性ＨＦＥタンパク質発現が検出されることを示す。
データは、ヒト肝細胞において、持続性ＨＦＥ発現が、ｍＲＮＡの１回投与で得られ得ることを示す。
【0205】
実施例３：Ｈｆｅノックアウトマウスにおける肝臓ＨＦＥタンパク質の発現および末梢鉄レベルの減少。
この実施例は、脂質ナノ粒子に封入されたＨＦＥをコードするｍＲＮＡの投与が、Ｈｆｅノックアウトマウスにおいて用量依存的様式で肝臓ＨＦＥタンパク質発現をもたらし得ることを示す。
この実施例において、ヒトＨＦＥ(配列番号６７)をコードできるｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入し、Ｈｆｅノックアウトマウスに、尾静脈注射により、０.３mg／kg、１mg／kgおよび３mg／kgで投与した。投与約４８時間後、鉄レベルアッセイのために、肝臓を摘出し、血液を集めた。
ＨＦＥコードｍＲＮＡの１回投与後、抗ＨＦＥ免疫ブロットにより、マウス肝臓ホモジネートにおいて用量依存的ＨＦＥタンパク質発現が観察された(図３)。処置マウスにおいて、その後のヘプシジン遺伝子発現の回復が分岐ＤＮＡ(ｂＤＮＡ)アッセイにより観察され、野生型対照に類するレベルであった(図４)。ＨＦＥおよびヘプシジン発現の増加に伴い、ＨＦＥコードｍＲＮＡ－ＬＮＰの１回の投与後、血中で血清鉄(図５)およびトランスフェリン飽和(図６)レベルの減少が観察された。
これらの所見は、ＨＦＥコード化ｍＲＮＡと脂質ナノ粒子送達系の組み合わせが、ヘモクロマトーシスの処置に有望であることを示す。
この実施例は、脂質ナノ粒子に封入されたＨＦＥをコードするｍＲＮＡの投与が、Ｈｆｅノックアウトマウスにおいて用量依存的様式で肝臓ＨＦＥタンパク質発現をもたらし得ることを示す。
この実施例において、ヒトＨＦＥ(配列番号６７)をコードできるｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入し、Ｈｆｅノックアウトマウスに、尾静脈注射により、０.３mg／kg、１mg／kgおよび３mg／kgで投与した。投与約４８時間後、鉄レベルアッセイのために、肝臓を摘出し、血液を集めた。
ＨＦＥコードｍＲＮＡの１回投与後、抗ＨＦＥ免疫ブロットにより、マウス肝臓ホモジネートにおいて用量依存的ＨＦＥタンパク質発現が観察された(図３)。処置マウスにおいて、その後のヘプシジン遺伝子発現の回復が分岐ＤＮＡ(ｂＤＮＡ)アッセイにより観察され、野生型対照に類するレベルであった(図４)。ＨＦＥおよびヘプシジン発現の増加に伴い、ＨＦＥコードｍＲＮＡ－ＬＮＰの１回の投与後、血中で血清鉄(図５)およびトランスフェリン飽和(図６)レベルの減少が観察された。
これらの所見は、ＨＦＥコード化ｍＲＮＡと脂質ナノ粒子送達系の組み合わせが、ヘモクロマトーシスの処置に有望であることを示す。
【0206】
実施例４：ＨＦＥコード化ｍＲＮＡで処置したＨｆｅノックアウトマウスにおける肝臓鉄減少。
この実施例は、脂質ナノ粒子封入ＨＦＥをコードするｍＲＮＡの投与が、Ｈｆｅノックアウトマウスにおける肝臓鉄レベルを減少できることを示す。
この実施例において、ヒトＨＦＥ(配列番号６７)をコードできるｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入し、Ｈｆｅノックアウトマウスに尾静脈注射により１mg／kgで投与した。投与７日後、その後の分析のために肝臓を摘出した。
肝臓鉄濃度を測定するために、肝臓をまず乾燥状態で重さを量り、６５℃で一夜、３Ｍ ＨＣｌ、１０％ＴＣＡ混合物中で消化させた。次に、消化抽出物をバトフェナントロリンクロマゲン試薬と混合し、その後分光光度計で５３５nm吸光度を測定した。吸光度値を、既知Ｆｅ濃度の標準曲線に対して定量した。
図７に示すとおり、Ｈｆｅノックアウトマウスにおいて、１mg／kg ＨＦＥコードｍＲＮＡの１回静脈内投与後、肝臓鉄レベルの減少(約２０％)が観察された。効果は、ＨＨマウスの雄および雌両コホートで観察された。
この実施例は、脂質ナノ粒子封入ＨＦＥをコードするｍＲＮＡの投与が、Ｈｆｅノックアウトマウスにおける肝臓鉄レベルを減少できることを示す。
この実施例において、ヒトＨＦＥ(配列番号６７)をコードできるｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入し、Ｈｆｅノックアウトマウスに尾静脈注射により１mg／kgで投与した。投与７日後、その後の分析のために肝臓を摘出した。
肝臓鉄濃度を測定するために、肝臓をまず乾燥状態で重さを量り、６５℃で一夜、３Ｍ ＨＣｌ、１０％ＴＣＡ混合物中で消化させた。次に、消化抽出物をバトフェナントロリンクロマゲン試薬と混合し、その後分光光度計で５３５nm吸光度を測定した。吸光度値を、既知Ｆｅ濃度の標準曲線に対して定量した。
図７に示すとおり、Ｈｆｅノックアウトマウスにおいて、１mg／kg ＨＦＥコードｍＲＮＡの１回静脈内投与後、肝臓鉄レベルの減少(約２０％)が観察された。効果は、ＨＨマウスの雄および雌両コホートで観察された。
【0207】
ここに具体的に記載する全ての刊行物、特許および文献は、全ての目的のために、引用により全体として本明細書に包含させる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【国際調査報告】