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特表2022-533567没食子酸エピガロカテキンとチロシンキナーゼ阻害剤との併用の、癌治療薬の製造への用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-25
(54)【発明の名称】没食子酸エピガロカテキンとチロシンキナーゼ阻害剤との併用の、癌治療薬の製造への用途
(51)【国際特許分類】
A61K 31/353 20060101AFI20220715BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220715BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220715BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20220715BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220715BHJP
【ＦＩ】
A61K31/353
A61P35/00
A61K45/00
A61K31/5377
A61P43/00 121
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021566331
(86)(22)【出願日】2019-05-07
(85)【翻訳文提出日】2021-11-05
(86)【国際出願番号】 CN2019085776
(87)【国際公開番号】W WO2020223888
(87)【国際公開日】2020-11-12
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521487225
【氏名又は名称】雲南大葉帝紅生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＹＵＮＮＡＮ ＤＡＹＥ ＤＩＨＯＮＧ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｃ－２００， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ６， Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｐａｎｌｏｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｋｕｎｍｉｎｇ， Ｙｕｎｎａｎ ６５０２０１ （ＣＮ）
(71)【出願人】
【識別番号】521487236
【氏名又は名称】雲南農業大学
【氏名又は名称原語表記】ＹＵＮＮＡＮ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｅｎｔｅｒ ８０６， Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐａｎｌｏｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｋｕｎｍｉｎｇ， Ｙｕｎｎａｎ ６５０２０１ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】盛軍
(72)【発明者】
【氏名】王宣軍
(72)【発明者】
【氏名】黄艶苹
(72)【発明者】
【氏名】字成庭
(72)【発明者】
【氏名】向澤敏
(72)【発明者】
【氏名】黄業偉
(72)【発明者】
【氏名】趙雲麗
(72)【発明者】
【氏名】爨向丹
(72)【発明者】
【氏名】徐歓歓
(72)【発明者】
【氏名】羅瑞
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084ZB26
4C084ZC75
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086BC73
4C086GA07
4C086GA12
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC75
(57)【要約】
没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）又はそれをリード化合物として合成された化合物と１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の併用の、癌治療薬の製造への用途であって、そのうち、前記癌は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍である。このような併用は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍の成長を著しく阻害し、抗癌薬の毒性副作用を低下させることができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
癌治療薬の製造における没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）及びチロシンキナーゼ阻害剤の使用であって、前記没食子酸エピガロカテキンは、ＥＧＣＧと、ＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物と、を含み、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含む、使用。
【請求項2】
癌治療用医薬組成物であって、請求項１に記載の有効量の没食子酸エピガロカテキンＥＧＣＧと１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含むか、又は、ＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物と１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含む、癌治療用医薬組成物。
【請求項3】
前記癌は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項4】
請求項２に記載の医薬組成物の、ＥＧＦＲ野生型腫瘍治療薬の製造及びＥＧＦＲ野生型腫瘍の治療への使用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬技術分野に関し、具体的には抗癌組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
チロシンキナーゼ受容体（ＴＫＲ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、懸濁細胞以外の各類の細胞膜上で広く発現している。ＥＧＦＲタンパク質の過剰活性化は、腫瘍形成、進行、悪性度及び予後とは非常に密接な関係を有し、腫瘍細胞増殖を引き起こし、腫瘍組織の血管形成及び腫瘍細胞の転移を促進することができる。ＥＧＦＲは、ヒト腫瘍の標的療法における主要な標的の１つである。チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、標的治療薬の開発の主要な分野である。野生型ＥＧＦＲ腫瘍に対して開発されたゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）は、第１世代のＴＫＩ型ＥＧＦＲ阻害剤である。市販後にＧｅｆｉｉｔｎｉｂは、ＥＧＦＲが高度に活性化された患者に対して顕著な効果がないことが臨床的に発見した。検討によれば、Ｇｅｆｉｔｉｎｂの、Ｌ８５８Ｒ突然変異が発生したＥＧＦＲに対する親和性は、野生型ＥＧＦＲに対する親和性の５－６倍であり、該突然変異を有する患者に対する有効率が高くて８０％以上であり、これらの腫瘍患者に対する特効薬となることが発見した。ＥＧＦＲＬ８５８Ｒを有する患者は、全ての腫瘍患者の６％のみを占めるが、総数の６０％以上のＥＧＦＲ野生型患者に対して、臨床的に利用可能な、有効なＴＫＩ類阻害剤がない。従って、野生型ＥＧＦＲに対して新たな治療策を開発することは、重要な意義を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
現在まで、野生型ＥＧＦＲの腫瘍患者に対して有効な阻害剤がないという背景技術に存在する問題を克服するために、本発明は、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）及びＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物と１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤との併用による治療方法を提供する。両者を併用することによって、野生型ＥＧＦＲの、従来のチロシンキナーゼ阻害剤に対する感受性を向上させ、従来の阻害剤の適用範囲を広くし、ＥＧＦＲ野生型癌患者のために、有効な治療策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明は、下記技術的解決手段により実現される。
没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）とチロシンキナーゼ阻害剤との併用の、癌治療薬の製造への用途である。前記没食子酸エピガロカテキンは、ＥＧＣＧと、ＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物と、を含み、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含む。
好ましくは、前記癌は、野生型ＥＧＦＲを発現する腫瘍である。
具体的に好ましくは、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）とゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）との併用の、ＥＧＦＲ野生型腫瘍治療薬の製造への用途である。
癌を治療する医薬組成物であって、有効量の没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）と１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含むか、又は、ＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物と１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含む。
好ましくは、前記医薬組成物の、ＥＧＦＲ野生型腫瘍治療薬の製造及びＥＧＦＲ野生型腫瘍の治療への用途である。
具体的に好ましくは、癌を治療する医薬組成物は、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）と、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）と、を含む。ＥＧＦＲ野生型腫瘍に対する薬物を製造する時、化合物の使用量は、投与経路、患者の年齢、体重、治療される疾患のタイプ及び重症度などに応じて調整されてもよい。ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの用量は、０．１－５ｍｇ／ｋｇ体重であり、ＥＧＣＧの用量は、０．１－８ｍｇ／ｋｇ体重である。
没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）とチロシンキナーゼ阻害剤との併用の、癌治療薬の製造への用途である。前記没食子酸エピガロカテキンは、ＥＧＣＧと、ＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物と、を含み、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含む。
好ましくは、前記癌は、野生型ＥＧＦＲを発現する腫瘍である。
具体的に好ましくは、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）とゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）との併用の、ＥＧＦＲ野生型腫瘍治療薬の製造への用途である。
癌を治療する医薬組成物であって、有効量の没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）と１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含むか、又は、ＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物と１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含む。
好ましくは、前記医薬組成物の、ＥＧＦＲ野生型腫瘍治療薬の製造及びＥＧＦＲ野生型腫瘍の治療への用途である。
具体的に好ましくは、癌を治療する医薬組成物は、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）と、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）と、を含む。ＥＧＦＲ野生型腫瘍に対する薬物を製造する時、化合物の使用量は、投与経路、患者の年齢、体重、治療される疾患のタイプ及び重症度などに応じて調整されてもよい。ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの用量は、０．１－５ｍｇ／ｋｇ体重であり、ＥＧＣＧの用量は、０．１－８ｍｇ／ｋｇ体重である。
【発明の効果】
【0005】
本発明の有益な効果は以下のとおりである。
本発明は、ＥＧＣＧ及びＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物とチロシンキナーゼ阻害剤の併用を開示し、特に、ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂとの併用により製造された医薬組成物は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍患者の治療に用いることができ、体外では、腫瘍細胞の成長を著しく阻害することが見られ、体内では、ＥＧＦＲ野生型腫瘍細胞の異種移植による腫瘍の体積の増大を阻害することができ、両者の併用により、用量が大きい抗癌薬による治療リスク及び毒性副作用を減少させる。
本発明は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍患者のために有効な治療策を提供するだけでなく、従来のチロシンキナーゼ阻害剤の適用範囲も拡張する。
本発明は、ＥＧＣＧ及びＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物とチロシンキナーゼ阻害剤の併用を開示し、特に、ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂとの併用により製造された医薬組成物は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍患者の治療に用いることができ、体外では、腫瘍細胞の成長を著しく阻害することが見られ、体内では、ＥＧＦＲ野生型腫瘍細胞の異種移植による腫瘍の体積の増大を阻害することができ、両者の併用により、用量が大きい抗癌薬による治療リスク及び毒性副作用を減少させる。
本発明は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍患者のために有効な治療策を提供するだけでなく、従来のチロシンキナーゼ阻害剤の適用範囲も拡張する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、ＥＧＦＲ野生型及び突然変異型細胞増殖に対する影響を示す。
【図2】ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、ＥＧＦＲ野生型及び突然変異型細胞中のＥＧＦＲシグナルパスウェイにおける関連タンパク質に対する影響を示す。
【図3】ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、Ａ４３１担癌マウスの体重に対する影響を示す。
【図4】ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、Ａ４３１移植腫瘍ヌードマウスの腫瘍成長に対する影響を示す直観図である。
【図5】ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、Ａ４３１移植腫瘍ヌードマウスの腫瘍体積に対する影響（移植腫瘍成長曲線）を示す。
【図6】ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、Ａ４３１移植腫瘍ヌードマウスの腫瘍重量に対する影響を示す。
【図7】ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、ＮＣＩ－Ｈ１９７５担癌マウスの体重に対する影響を示す。
【図8】ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、ＮＣＩ－Ｈ１９７５移植腫瘍ヌードマウスの腫瘍成長に対する影響を示す直観図である。
【図9】ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、ＮＣＩ－Ｈ１９７５移植腫瘍ヌードマウスの腫瘍体積に対する影響（移植腫瘍成長極性）を示す。
【図10】ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、ＮＣＩ－Ｈ１９７５移植腫瘍ヌードマウスの腫瘍重量に対する影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明の目的、技術的解決手段及び有益な効果をより明確にするために、以下では、本発明の好適な実施例を詳しく説明し、当業者に理解させる。
本発明は、ＥＧＦＲ野生型であって高度に発現された細胞株及びＥＧＦＲ二重突然変異の細胞株を検討対象として選択し、主に、ＥＧＦＲの第１世代の阻害剤ｇｅｆｉｔｉｎｉｂとＥＧＣＧの併用の、ＥＧＦＲ野生型腫瘍細胞増殖に対する阻害作用及び異種移植されたヌードマウスの腫瘍成長に対する阻害作用を検討し、且つ該効果の作用メカニズムを説明する。
本発明は、ＥＧＦＲ野生型であって高度に発現された細胞株及びＥＧＦＲ二重突然変異の細胞株を検討対象として選択し、主に、ＥＧＦＲの第１世代の阻害剤ｇｅｆｉｔｉｎｉｂとＥＧＣＧの併用の、ＥＧＦＲ野生型腫瘍細胞増殖に対する阻害作用及び異種移植されたヌードマウスの腫瘍成長に対する阻害作用を検討し、且つ該効果の作用メカニズムを説明する。
【0008】
実施例１ ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、ＥＧＦＲ野生型及び突然変異型細胞の体外での増殖効果に対する影響
１．実験材料
細胞株：ヒト扁平上皮細胞癌Ａ４３１、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１６６６、ＮＣＩ－Ｈ１９７５。
２．検出原理：ＭＴＴ法による細胞活性の検出
ＭＴＴにより細胞の活性を検出する実験：ＭＴＴの濃度は、５ｍｇ／ｍｌである。従って、ＭＴＴ ０．５グラムを秤量し、１００ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）又はフェノールレッドフリー培地に溶解し、０．２２μｍろ過膜によりろ過を行い、溶液中の細菌を除去し、調製を完了した後に、分注して４℃で暗所に保存した。容器は、好ましくは、アルミ箔で包まれる。
試験ステップ：Ａにおいて、付着細胞操作方法を用いて、まず、対数期細胞を収集して細胞懸濁液の濃度を調整し、被験細胞の密度を３×１０４／ウェルに調整し、各ウェルに２００μｌを添加する（周囲ウェルは、無菌ＰＢＳで満たされる）。それと同時に、ゼロ調節ウェル（ジメチルスルホキシド）、対照ウェル（細胞、同一の濃度の薬物溶解媒体（酸性培地）、ＭＴＴ、ジメチルスルホキシド）を設置して５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータで培養する。
Ｂにおいて、細胞付着後に、細胞単層がウェル底部（９６ウェルの平底プレート）で集密になることが見られ、まず、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、ＰＢＳを捨て、薬物を添加し、１ウェル当たり２００μｌに応じて、４－６個の二重ウェルを設置する。そうしなければ、真実の状況を反映しにくい。処理を完了した後に、周囲ウェルは、同様に、酸性培地で満たされる。サンプルの揮発を防止する。
Ｃにおいて、５％ＣＯ２を用いて３７℃で２４時間インキュベーションし、倒立顕微鏡下で細胞状態を観察する。
Ｄにおいて、各ウェルに２０μｌのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ、即ち０．５％ＭＴＴ）を添加し、引き続き４ｈ培養する。薬物とＭＴＴが反応できると、遠心分離した後に培養液を廃棄し、ＰＢＳで注意深く一回洗浄した後に、ＭＴＴを含む培養液を添加する。
Ｅにおいて、培養を中止し、ウェル内の培養液を注意深く抽出する。
Ｆにおいて、各ウェルに１５０μｌのジメチルスルホキシドを添加し、シェーカーに置いて１０ｍｉｎ低速振とうし、結晶物を十分に溶解させる。酵素結合免疫測定装置ＯＤ４９０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定する。６３０ｎｍは、参照部で検出された吸光度値（ＯＤ値）である。
Ｇにおいて、細胞活性演算式は、活性＝実験群のＯＤ平均値－コントロール群のＯＤ平均値／１）Ｘ１００％であり、これにより得られたデータを用いて、ｅｘｃｅｌにおいて棒グラフを求める。
３．実験の結果
結果は図１に示すとおりである。Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ単独処理群は、Ａ４３１細胞の生存率に対して影響がなく、ＮＣＩ－Ｈ１６６６細胞に対して著しい阻害効果を果たすが、予想通りに、ＧｅｆｉｔｉｎｉｂとＥＧＦの併用処理群及びＧｅｆｉｔｉｎｉｂとＥＧＣＧの併用処理群は、２つの野生型ＥＧＦＲの細胞株の成長に対して著しい阻害効果を果たしていない。しかしながら、ＧｅｆｉｔｉｎｉｂにＥＧＣＧ、ＥＧＦが同時に存在する場合、ＥＧＦＲ野生型細胞の成長を著しく阻害することができ、二重突然変異型ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞に対して効果を果たしない。このような併用により細胞を処理する方式は、細胞の成長に対して選択的な阻害効果を果たし、野生型ＥＧＦＲの細胞Ａ４３１及びＮＣＩ－Ｈ１６６６に対して非常に明らかな阻害効果を示すが、二重突然変異型ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞に対して効果がないことを示す。
１．実験材料
細胞株：ヒト扁平上皮細胞癌Ａ４３１、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１６６６、ＮＣＩ－Ｈ１９７５。
２．検出原理：ＭＴＴ法による細胞活性の検出
ＭＴＴにより細胞の活性を検出する実験：ＭＴＴの濃度は、５ｍｇ／ｍｌである。従って、ＭＴＴ ０．５グラムを秤量し、１００ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）又はフェノールレッドフリー培地に溶解し、０．２２μｍろ過膜によりろ過を行い、溶液中の細菌を除去し、調製を完了した後に、分注して４℃で暗所に保存した。容器は、好ましくは、アルミ箔で包まれる。
試験ステップ：Ａにおいて、付着細胞操作方法を用いて、まず、対数期細胞を収集して細胞懸濁液の濃度を調整し、被験細胞の密度を３×１０４／ウェルに調整し、各ウェルに２００μｌを添加する（周囲ウェルは、無菌ＰＢＳで満たされる）。それと同時に、ゼロ調節ウェル（ジメチルスルホキシド）、対照ウェル（細胞、同一の濃度の薬物溶解媒体（酸性培地）、ＭＴＴ、ジメチルスルホキシド）を設置して５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータで培養する。
Ｂにおいて、細胞付着後に、細胞単層がウェル底部（９６ウェルの平底プレート）で集密になることが見られ、まず、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄し、ＰＢＳを捨て、薬物を添加し、１ウェル当たり２００μｌに応じて、４－６個の二重ウェルを設置する。そうしなければ、真実の状況を反映しにくい。処理を完了した後に、周囲ウェルは、同様に、酸性培地で満たされる。サンプルの揮発を防止する。
Ｃにおいて、５％ＣＯ２を用いて３７℃で２４時間インキュベーションし、倒立顕微鏡下で細胞状態を観察する。
Ｄにおいて、各ウェルに２０μｌのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ、即ち０．５％ＭＴＴ）を添加し、引き続き４ｈ培養する。薬物とＭＴＴが反応できると、遠心分離した後に培養液を廃棄し、ＰＢＳで注意深く一回洗浄した後に、ＭＴＴを含む培養液を添加する。
Ｅにおいて、培養を中止し、ウェル内の培養液を注意深く抽出する。
Ｆにおいて、各ウェルに１５０μｌのジメチルスルホキシドを添加し、シェーカーに置いて１０ｍｉｎ低速振とうし、結晶物を十分に溶解させる。酵素結合免疫測定装置ＯＤ４９０ｎｍで各ウェルの吸光度を測定する。６３０ｎｍは、参照部で検出された吸光度値（ＯＤ値）である。
Ｇにおいて、細胞活性演算式は、活性＝実験群のＯＤ平均値－コントロール群のＯＤ平均値／１）Ｘ１００％であり、これにより得られたデータを用いて、ｅｘｃｅｌにおいて棒グラフを求める。
３．実験の結果
結果は図１に示すとおりである。Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ単独処理群は、Ａ４３１細胞の生存率に対して影響がなく、ＮＣＩ－Ｈ１６６６細胞に対して著しい阻害効果を果たすが、予想通りに、ＧｅｆｉｔｉｎｉｂとＥＧＦの併用処理群及びＧｅｆｉｔｉｎｉｂとＥＧＣＧの併用処理群は、２つの野生型ＥＧＦＲの細胞株の成長に対して著しい阻害効果を果たしていない。しかしながら、ＧｅｆｉｔｉｎｉｂにＥＧＣＧ、ＥＧＦが同時に存在する場合、ＥＧＦＲ野生型細胞の成長を著しく阻害することができ、二重突然変異型ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞に対して効果を果たしない。このような併用により細胞を処理する方式は、細胞の成長に対して選択的な阻害効果を果たし、野生型ＥＧＦＲの細胞Ａ４３１及びＮＣＩ－Ｈ１６６６に対して非常に明らかな阻害効果を示すが、二重突然変異型ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞に対して効果がないことを示す。
【0009】
実施例２ ＥＧＣＧ、ＥＧＦが同時に存在する場合、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの、野生型及び突然変異型細胞中のＥＧＦＲシグナルパスウェイにおける関連蛋白質リン酸化に対する影響
１．実験材料
細胞株：ヒト扁平上皮細胞癌Ａ４３１、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５。
２．検出原理：Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔによる細胞中の関連タンパク質の変動状況の検出
３．実験方法：ａにおいて、細胞を処理し、細胞が付着した後に、飢餓処理を行い、一晩処理した後に、ＥＧＣＧ、ＥＧＦの処理を行う。具体的な実験群に応じて実験を行い、コントロール対照群に直接的に酸性培地を添加し、残りの実験群に１０ｍＬの酸性培地を添加し、ＥＧＣＧの最終濃度を２０μｇ／ｍＬにし、ＥＧＦ母液を２０ｎｇ／ｍＬに希釈した後に、酸性培地に添加し、薬物を添加した後に、細胞培養インキュベーターに置き、実験群に応じて対応する処理時間を設定する。
ｂにおいてタンパク質抽出。
ｃにおいて、タンパク質定量化。タンパク質測定原理としてＢＣＡタンパク質定量化方法を用いる。
ｄにおいて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ原理は、異なるタンパク質が所持する電荷量によって異なる。電界強度により、分子量が異なるタンパク質を分離する。続いて、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移転し、非共有結合の形式により、タンパク質を吸着する。これは、タンパク質ポリペプチドの生物学的活性を破壊することがない。続いて、膜に移転したタンパク質を抗原として、対応する抗体と抗原を一晩又は室温で２時間結合させる。続いて、ＨＲＰで標識されている第２抗体と室温で１時間結合し、基質で発色させることにより、標的タンパク質の発現を検出することができる。
４．実験の結果
結果は図２に示すとおりである。野生型ＥＧＦＲＡ４３１細胞にＥＧＣＧ及びＥＧＦが同時に存在する場合、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂは、ＥＧＦＲファミリー及びその下流タンパク質ＥＲＫのリン酸化を著しく阻害することができる。しかしながら、二重突然変異型ＥＧＦＲ ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞においてこのような結果が見られていない。細胞生存率実験と一致した実験の結果を示す。
１．実験材料
細胞株：ヒト扁平上皮細胞癌Ａ４３１、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ１９７５。
２．検出原理：Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔによる細胞中の関連タンパク質の変動状況の検出
３．実験方法：ａにおいて、細胞を処理し、細胞が付着した後に、飢餓処理を行い、一晩処理した後に、ＥＧＣＧ、ＥＧＦの処理を行う。具体的な実験群に応じて実験を行い、コントロール対照群に直接的に酸性培地を添加し、残りの実験群に１０ｍＬの酸性培地を添加し、ＥＧＣＧの最終濃度を２０μｇ／ｍＬにし、ＥＧＦ母液を２０ｎｇ／ｍＬに希釈した後に、酸性培地に添加し、薬物を添加した後に、細胞培養インキュベーターに置き、実験群に応じて対応する処理時間を設定する。
ｂにおいてタンパク質抽出。
ｃにおいて、タンパク質定量化。タンパク質測定原理としてＢＣＡタンパク質定量化方法を用いる。
ｄにおいて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ原理は、異なるタンパク質が所持する電荷量によって異なる。電界強度により、分子量が異なるタンパク質を分離する。続いて、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移転し、非共有結合の形式により、タンパク質を吸着する。これは、タンパク質ポリペプチドの生物学的活性を破壊することがない。続いて、膜に移転したタンパク質を抗原として、対応する抗体と抗原を一晩又は室温で２時間結合させる。続いて、ＨＲＰで標識されている第２抗体と室温で１時間結合し、基質で発色させることにより、標的タンパク質の発現を検出することができる。
４．実験の結果
結果は図２に示すとおりである。野生型ＥＧＦＲＡ４３１細胞にＥＧＣＧ及びＥＧＦが同時に存在する場合、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂは、ＥＧＦＲファミリー及びその下流タンパク質ＥＲＫのリン酸化を著しく阻害することができる。しかしながら、二重突然変異型ＥＧＦＲ ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞においてこのような結果が見られていない。細胞生存率実験と一致した実験の結果を示す。
【0010】
実施例３ ＥＧＣＧ とＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、ＥＧＦＲ野生型ＡＡ４３１細胞癌異種移植腫瘍モデルにおける腫瘍に対する阻害作用
１．実験材料
Ａ４３１細胞及び培養。ヒト扁平上皮細胞癌Ａ４３１を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース完全培地で培養し、細胞を１ｍＬの培養液当たりに２×１０６個の細胞となるように希釈する。培養皿に接種する。細胞培養インキュベーターに置いて培養する。対数成長期の細胞を取り、０．５％パンクレアチン溶液を用いて消化を行い、単細胞懸濁液を製造し、１５０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを廃棄し、ＰＢＳを用いて細胞密度を５×１０６／ｍＬに調整する。
ヌードマウス及びその飼育。オスのＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕクリーン級のマウスであり、６－８週齢であり、江蘇省常州市カーベンス実験動物有限公司により提供した。ヌードマウスを滅菌通気型密閉した動物飼育室に飼育し、温度を２５℃とし、昼間中に定時的に光照射を行い、夜では黒い環境とし、餌および飲水は自由摂取とする。ヌードマウス用ケージ及び水を高温、高圧で滅菌する。ヌードマウスのために、清浄なケージ、トイレ砂及び飲用水などを交換し、ヌードマウスの成長環境の清潔を保持する。
２．実験方法
ａにおいて、ヌードマウス移植腫瘍モデルを確立する。細胞を蘇生し、継代し、細胞状態を調整し、１週間後に細胞の成長環境は、安定していく傾向がある。細胞に対して消化、計数を行った後、生細胞数密度を、２００μＬの懸濁液当たりに５×１０６個の細胞を含有するように調整して使用に備える。続いて、１５００ｇを３ｍｉｎ遠心分離する。培地を抽出して除去した後、生理食塩水を用いて均一に吹き、細胞懸濁液を製造して使用に備える。無菌スーパークリーンベンチ内で、ヌードマウスを体重の平均値が一致したという原則に応じてグルーピングし、耳部を切って標識する。各ヌードマウスの背部に２００μＬの細胞懸濁液（約５×１０６個の細胞）を皮下注射する。１日おきにノギスにて腫瘍の長径（Ｄｍａｘ）と短径（Ｄｍｉｎ）を測定し、腫瘍の体積Ｖ（Ｖ＝ Ｄｍａｘ × Ｄｍｉｎ２／２）を算出する。
ｂにおいて、動物のグルーピング及び薬物投与を行う。下記グルーピングされたヌードマウスに応じて薬物投与を行う。（１）コントロール対照群：１週間に６日、１日に１回、生理食塩水を腹腔内注射し、１％－Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する生理食塩水を胃内投与する。（２）ゲフィチニブ群：５０ｍｇ／ｋｇの用量に応じて胃内投与する（１週間に２回）。（３）ＥＧＣＧ群：１週間に６日、１日に１回腹腔内注射し、用量がそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇである。（４）併用投与群に対して、１週間に６日（１日に１回）、用量がそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇであり、腹腔内注射方式で投与する。Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂを１週間に２回、５０ｍｇ／ｋｇの投与量に応じて投与し、実験を行う。投与する前に、腫瘍の体積を１週間に３回測定する。また、ヌードマウスの体重を測定し、１週間に１回の頻度に応じて実行し、実験に対して記録を行う。投与完了後に、ヌードマウスを屠殺し、腫瘍塊を取り出し、写真を撮る。後続の実験設定に応じて固形腫瘍を保存する。
３．実験の結果
図３に示すように、正常対照群の動物に比べて、各群に明らかな体重低下の現象が発生していない。しかしながら、ＥＧＣＧ単独処理群において、薬物を３週間投与した後に、ヌードマウスの体重の増加が促進され、対照群に比べて、著しい変動が発生した。各群の薬物は、動物に対して明らかな毒性副作用がない。薬物投与が完了した後に、ヌードマウスの腫瘍を取り出す。図４に示すように、併用の、腫瘍成長に対する影響を示す。１日おきに、ヌードマウス移植腫瘍を測定することによって、腫瘍成長曲線を描く。図５に示すように、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ併用群は、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ単独処理群に比べて、２９回目の腫瘍体積の測定から、腫瘍体積の成長を著しく阻害する。従来の実験の結果と一致したように、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの体外での選択性は、体内での実験における選択性よりもはるかに高い。本実験において、同様に、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの、ヌードマウスの腫瘍成長に対して良好な阻害効果を果たすことが得られる。ＥＧＣＧと併用した後、非常に明らかな阻害効果を示し、ほぼ腫瘍の成長を完全に阻害する。取り出された腫瘍を秤量する。結果は図６に示すとおりである。Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ単独処理群は、コントロール対照群に比べて、腫瘍阻害率が５２％であり、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ併用群とＧｅｆｉｔｉｎｉｂ単独処理群は、固形腫瘍に対する阻害率がそれぞれ６９％、８１％である。統計学的には差異がないが、併用群は、単独使用に比べて、腫瘍の成長を一定の程度阻害した。実験プロセス全体において、死んだ動物がいなかった。
１．実験材料
Ａ４３１細胞及び培養。ヒト扁平上皮細胞癌Ａ４３１を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース完全培地で培養し、細胞を１ｍＬの培養液当たりに２×１０６個の細胞となるように希釈する。培養皿に接種する。細胞培養インキュベーターに置いて培養する。対数成長期の細胞を取り、０．５％パンクレアチン溶液を用いて消化を行い、単細胞懸濁液を製造し、１５０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを廃棄し、ＰＢＳを用いて細胞密度を５×１０６／ｍＬに調整する。
ヌードマウス及びその飼育。オスのＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕクリーン級のマウスであり、６－８週齢であり、江蘇省常州市カーベンス実験動物有限公司により提供した。ヌードマウスを滅菌通気型密閉した動物飼育室に飼育し、温度を２５℃とし、昼間中に定時的に光照射を行い、夜では黒い環境とし、餌および飲水は自由摂取とする。ヌードマウス用ケージ及び水を高温、高圧で滅菌する。ヌードマウスのために、清浄なケージ、トイレ砂及び飲用水などを交換し、ヌードマウスの成長環境の清潔を保持する。
２．実験方法
ａにおいて、ヌードマウス移植腫瘍モデルを確立する。細胞を蘇生し、継代し、細胞状態を調整し、１週間後に細胞の成長環境は、安定していく傾向がある。細胞に対して消化、計数を行った後、生細胞数密度を、２００μＬの懸濁液当たりに５×１０６個の細胞を含有するように調整して使用に備える。続いて、１５００ｇを３ｍｉｎ遠心分離する。培地を抽出して除去した後、生理食塩水を用いて均一に吹き、細胞懸濁液を製造して使用に備える。無菌スーパークリーンベンチ内で、ヌードマウスを体重の平均値が一致したという原則に応じてグルーピングし、耳部を切って標識する。各ヌードマウスの背部に２００μＬの細胞懸濁液（約５×１０６個の細胞）を皮下注射する。１日おきにノギスにて腫瘍の長径（Ｄｍａｘ）と短径（Ｄｍｉｎ）を測定し、腫瘍の体積Ｖ（Ｖ＝ Ｄｍａｘ × Ｄｍｉｎ２／２）を算出する。
ｂにおいて、動物のグルーピング及び薬物投与を行う。下記グルーピングされたヌードマウスに応じて薬物投与を行う。（１）コントロール対照群：１週間に６日、１日に１回、生理食塩水を腹腔内注射し、１％－Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する生理食塩水を胃内投与する。（２）ゲフィチニブ群：５０ｍｇ／ｋｇの用量に応じて胃内投与する（１週間に２回）。（３）ＥＧＣＧ群：１週間に６日、１日に１回腹腔内注射し、用量がそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇである。（４）併用投与群に対して、１週間に６日（１日に１回）、用量がそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇであり、腹腔内注射方式で投与する。Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂを１週間に２回、５０ｍｇ／ｋｇの投与量に応じて投与し、実験を行う。投与する前に、腫瘍の体積を１週間に３回測定する。また、ヌードマウスの体重を測定し、１週間に１回の頻度に応じて実行し、実験に対して記録を行う。投与完了後に、ヌードマウスを屠殺し、腫瘍塊を取り出し、写真を撮る。後続の実験設定に応じて固形腫瘍を保存する。
３．実験の結果
図３に示すように、正常対照群の動物に比べて、各群に明らかな体重低下の現象が発生していない。しかしながら、ＥＧＣＧ単独処理群において、薬物を３週間投与した後に、ヌードマウスの体重の増加が促進され、対照群に比べて、著しい変動が発生した。各群の薬物は、動物に対して明らかな毒性副作用がない。薬物投与が完了した後に、ヌードマウスの腫瘍を取り出す。図４に示すように、併用の、腫瘍成長に対する影響を示す。１日おきに、ヌードマウス移植腫瘍を測定することによって、腫瘍成長曲線を描く。図５に示すように、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ併用群は、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ単独処理群に比べて、２９回目の腫瘍体積の測定から、腫瘍体積の成長を著しく阻害する。従来の実験の結果と一致したように、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの体外での選択性は、体内での実験における選択性よりもはるかに高い。本実験において、同様に、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの、ヌードマウスの腫瘍成長に対して良好な阻害効果を果たすことが得られる。ＥＧＣＧと併用した後、非常に明らかな阻害効果を示し、ほぼ腫瘍の成長を完全に阻害する。取り出された腫瘍を秤量する。結果は図６に示すとおりである。Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ単独処理群は、コントロール対照群に比べて、腫瘍阻害率が５２％であり、Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ併用群とＧｅｆｉｔｉｎｉｂ単独処理群は、固形腫瘍に対する阻害率がそれぞれ６９％、８１％である。統計学的には差異がないが、併用群は、単独使用に比べて、腫瘍の成長を一定の程度阻害した。実験プロセス全体において、死んだ動物がいなかった。
【0011】
実施例４ ＥＧＣＧとＧｅｆｉｔｉｎｉｂの併用の、ＥＧＦＲ二重突然変異型ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞癌異種移植腫瘍モデルにおけう腫瘍に対する阻害作用
１．実験材料
ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞及び培養。ヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ－Ｈ１９７５を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ１６４０完全培地で培養し、細胞を２×１０６／ｍＬに希釈する。培養皿に接種する。細胞培養インキュベーターに置いて培養する。対数成長期の細胞を取り、０．５％パンクレアチン溶液を用いて消化を行い、単細胞懸濁液を製造し、１５０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを廃棄し、ＰＢＳを用いて細胞密度を５×１０６ ／ｍＬに調整する。
ヌードマウス及びその飼育。オスのＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕクリーン級のマウスであり、６－８週齢であり、江蘇省常州市カーベンス実験動物有限公司により提供した。ヌードマウスを滅菌通気型密閉した動物飼育室に飼育し、温度を２５℃とし、昼間中に定時的に光照射を行い、夜では黒い環境とし、餌および飲水は自由摂取とする。ヌードマウス用ケージ及び水を高温、高圧で滅菌する。ヌードマウスのために、清浄なケージ、トイレ砂及び飲用水などを交換し、ヌードマウスの成長のための環境の清潔を保持する。
２．実験方法
ａにおいて、ヌードマウス移植腫瘍モデルを確立する。細胞を蘇生し、継代し、細胞状態を調整し、１週間後に細胞の成長環境は、安定していく傾向がある。細胞に対して消化、計数を行った後、生細胞数密度を、２００μＬの懸濁液当たりに３×１０６個の細胞を含有するように調整して使用に備える。続いて、１５００ｇを３ｍｉｎ遠心分離する。培地を抽出して除去した後、生理食塩水を用いて均一に吹き、細胞懸濁液を製造する。無菌スーパークリーンベンチ内で、ヌードマウスを体重の平均値が一致したという原則に応じてグルーピングし、耳部を切って標識する。各ヌードマウスの背部で２００μＬの細胞懸濁液（約３×１０６個の細胞）を皮下注射する。１日おきにノギスにて腫瘍の長径（Ｄｍａｘ）と短径（Ｄｍｉｎ）を測定し、腫瘍の体積Ｖ（Ｖ＝ Ｄｍａｘ × Ｄｍｉｎ２／２）を算出する。
ｂにおいて、動物のグルーピング及び薬物投与を行う。腫瘍細胞接種後翌日から、グルーピングされたヌードマウスに応じて薬物投与を行う。コントロール対照群：１週間に６日、毎日、生理食塩水を腹腔内注射し、１％－Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する生理食塩水を胃内投与する。Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂを１％ Ｔｗｅｅｎ－８０に溶解して懸濁液を製造する。（２）Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂを１週間に２回胃内投与する。５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇのＧｅｆｉｔｉｎｉｂを投与する。（３）ＥＧＣＧ群に対して、１週間に６日、１日に１回の頻度に応じて投与し、腹腔内注射の用量がＥＧＣＧ ４０ｍｇ／ｋｇである。（４）併用投与群に対して、１週間に６日、１日に１回のＥＧＣＧ ４０ｍｇ／ｋｇ及び１週間に２回のＧｅｆｉｔｉｎｉｂ ５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ ｍｇ／ｋｇの用量に応じて投与する。腫瘍体積の測定頻度は１日おきに行うことであり、ヌードマウスの体重を２日おきに１回秤量し、記録する。投与完了した後に、ヌードマウスを屠殺し、腫瘍塊を取り出し、写真を撮る。後続の実験設定に応じて固形腫瘍を保存する。モデリング実験において、６－８週齢のヌードマウスを選択し、６個の群に分け、各群に５－６匹があり、とし、減菌餌で飼育する。
１．実験材料
ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞及び培養。ヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ－Ｈ１９７５を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ１６４０完全培地で培養し、細胞を２×１０６／ｍＬに希釈する。培養皿に接種する。細胞培養インキュベーターに置いて培養する。対数成長期の細胞を取り、０．５％パンクレアチン溶液を用いて消化を行い、単細胞懸濁液を製造し、１５０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを廃棄し、ＰＢＳを用いて細胞密度を５×１０６ ／ｍＬに調整する。
ヌードマウス及びその飼育。オスのＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕクリーン級のマウスであり、６－８週齢であり、江蘇省常州市カーベンス実験動物有限公司により提供した。ヌードマウスを滅菌通気型密閉した動物飼育室に飼育し、温度を２５℃とし、昼間中に定時的に光照射を行い、夜では黒い環境とし、餌および飲水は自由摂取とする。ヌードマウス用ケージ及び水を高温、高圧で滅菌する。ヌードマウスのために、清浄なケージ、トイレ砂及び飲用水などを交換し、ヌードマウスの成長のための環境の清潔を保持する。
２．実験方法
ａにおいて、ヌードマウス移植腫瘍モデルを確立する。細胞を蘇生し、継代し、細胞状態を調整し、１週間後に細胞の成長環境は、安定していく傾向がある。細胞に対して消化、計数を行った後、生細胞数密度を、２００μＬの懸濁液当たりに３×１０６個の細胞を含有するように調整して使用に備える。続いて、１５００ｇを３ｍｉｎ遠心分離する。培地を抽出して除去した後、生理食塩水を用いて均一に吹き、細胞懸濁液を製造する。無菌スーパークリーンベンチ内で、ヌードマウスを体重の平均値が一致したという原則に応じてグルーピングし、耳部を切って標識する。各ヌードマウスの背部で２００μＬの細胞懸濁液（約３×１０６個の細胞）を皮下注射する。１日おきにノギスにて腫瘍の長径（Ｄｍａｘ）と短径（Ｄｍｉｎ）を測定し、腫瘍の体積Ｖ（Ｖ＝ Ｄｍａｘ × Ｄｍｉｎ２／２）を算出する。
ｂにおいて、動物のグルーピング及び薬物投与を行う。腫瘍細胞接種後翌日から、グルーピングされたヌードマウスに応じて薬物投与を行う。コントロール対照群：１週間に６日、毎日、生理食塩水を腹腔内注射し、１％－Ｔｗｅｅｎ ８０を含有する生理食塩水を胃内投与する。Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂを１％ Ｔｗｅｅｎ－８０に溶解して懸濁液を製造する。（２）Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂを１週間に２回胃内投与する。５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇのＧｅｆｉｔｉｎｉｂを投与する。（３）ＥＧＣＧ群に対して、１週間に６日、１日に１回の頻度に応じて投与し、腹腔内注射の用量がＥＧＣＧ ４０ｍｇ／ｋｇである。（４）併用投与群に対して、１週間に６日、１日に１回のＥＧＣＧ ４０ｍｇ／ｋｇ及び１週間に２回のＧｅｆｉｔｉｎｉｂ ５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ ｍｇ／ｋｇの用量に応じて投与する。腫瘍体積の測定頻度は１日おきに行うことであり、ヌードマウスの体重を２日おきに１回秤量し、記録する。投与完了した後に、ヌードマウスを屠殺し、腫瘍塊を取り出し、写真を撮る。後続の実験設定に応じて固形腫瘍を保存する。モデリング実験において、６－８週齢のヌードマウスを選択し、６個の群に分け、各群に５－６匹があり、とし、減菌餌で飼育する。
【0012】
３実験の結果
腫瘍細胞注射完了後翌日に、投与を開始する。投与期間において、３日おきにヌードマウスの体重を測定し、結果は、図７に示すとおりである。各群の薬物の、ＮＣＩ－Ｈ１９７５担癌マウスの体重に対する影響に差別がなく、プロセス全体において、薬物によるヌードマウスの死亡が発生しなかった。薬物がヌードマウスに対して毒性副作用がないことを示す。各群の薬物の、ＮＣＩ－Ｈ１９７５担癌マウスの腫瘍成長に対する阻害作用は、図８に示すとおりである。図面から分かるように、ＧｅｆｉｔｉｎｉｂとＥＧＣＧを併用した後、ＮＣＩ－Ｈ１９７５担癌ヌードマウスの腫瘍成長が阻害されず、各群における腫瘍の成長に差異がない。結果から分かるように、このような併用は、ＥＧＦＲ二重突然変異型細胞ＮＣＩ－Ｈ１９７５移植腫瘍に対して効果がない。更に、このような併用がＥＧＦＲ野生型腫瘍に対して阻害作用があることを証明した。１日おきに移植腫瘍ヌードマウスの腫瘍体積を測定することによって、腫瘍成長曲線を描く。結果は図９に示すとおりである。併用は、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞移植腫瘍の腫瘍体積に対して影響がない。剥離した腫瘍の重量を秤量する。結果は、図１０に示すとおりである。併用は、ＥＧＦＲ二重突然変異型１９７５細胞の移植腫瘍の腫瘍重量に対して影響がない。
腫瘍細胞注射完了後翌日に、投与を開始する。投与期間において、３日おきにヌードマウスの体重を測定し、結果は、図７に示すとおりである。各群の薬物の、ＮＣＩ－Ｈ１９７５担癌マウスの体重に対する影響に差別がなく、プロセス全体において、薬物によるヌードマウスの死亡が発生しなかった。薬物がヌードマウスに対して毒性副作用がないことを示す。各群の薬物の、ＮＣＩ－Ｈ１９７５担癌マウスの腫瘍成長に対する阻害作用は、図８に示すとおりである。図面から分かるように、ＧｅｆｉｔｉｎｉｂとＥＧＣＧを併用した後、ＮＣＩ－Ｈ１９７５担癌ヌードマウスの腫瘍成長が阻害されず、各群における腫瘍の成長に差異がない。結果から分かるように、このような併用は、ＥＧＦＲ二重突然変異型細胞ＮＣＩ－Ｈ１９７５移植腫瘍に対して効果がない。更に、このような併用がＥＧＦＲ野生型腫瘍に対して阻害作用があることを証明した。１日おきに移植腫瘍ヌードマウスの腫瘍体積を測定することによって、腫瘍成長曲線を描く。結果は図９に示すとおりである。併用は、ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞移植腫瘍の腫瘍体積に対して影響がない。剥離した腫瘍の重量を秤量する。結果は、図１０に示すとおりである。併用は、ＥＧＦＲ二重突然変異型１９７５細胞の移植腫瘍の腫瘍重量に対して影響がない。
【0013】
本発明において、ＥＧＦＲ野生型であって高度に発現された扁平上皮細胞株及びＥＧＦＲ二重突然変異型肺癌細胞株を対照として、一連の細胞実験（ＭＴＴ：Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行うことによって、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂとＥＧＣＧ及びその誘導体の併用後に、ＥＧＦＲ野生型腫瘍に対して非常に明らかな阻害作用を示すが、ＥＧＦＲ二重突然変異型非小細胞肺癌に効果がないことを証明した。このような併用が選択性を有することを表す。
【0014】
体内での実験によれば、ｇｅｆｉｔｉｎｉｂとＥＧＣＧの併用は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍細胞移植腫瘍の成長を著しく阻害することができ、有機体の体重に明らかな影響を与えず、このような併用は、明らかな毒性副作用がないことを更に証明した。
要するに、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）とＥＧＦＲ阻害剤ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの併用は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍細胞の成長を著しく阻害することができ、且つ有機体に対して損傷を与えることなく、両者の併用により、用量が大きい抗癌薬による治療のリスク及び毒性副作用を減少させる。本発明は、ＥＧＦＲ野生型癌患者のために、有効な治療策を提供し、従来の阻害剤の感受性を向上させ、従来の阻害剤の適用範囲を拡張した。
ＥＧＦＲ野生型肺癌に対する薬物を製造する場合、化合物の用量は、投与経路、患者の年齢、体重、治療される疾患のタイプ及び重症度などに応じて調整されてもよい。ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの用量は、０．１－５ｍｇ／ｋｇ体重であり、ＥＧＣＧの用量は、０．１－８ｍｇ／ｋｇ体重である。
要するに、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）とＥＧＦＲ阻害剤ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの併用は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍細胞の成長を著しく阻害することができ、且つ有機体に対して損傷を与えることなく、両者の併用により、用量が大きい抗癌薬による治療のリスク及び毒性副作用を減少させる。本発明は、ＥＧＦＲ野生型癌患者のために、有効な治療策を提供し、従来の阻害剤の感受性を向上させ、従来の阻害剤の適用範囲を拡張した。
ＥＧＦＲ野生型肺癌に対する薬物を製造する場合、化合物の用量は、投与経路、患者の年齢、体重、治療される疾患のタイプ及び重症度などに応じて調整されてもよい。ｇｅｆｉｔｉｎｉｂの用量は、０．１－５ｍｇ／ｋｇ体重であり、ＥＧＣＧの用量は、０．１－８ｍｇ／ｋｇ体重である。
【0015】
最後に説明しておきたいこととして、上記好適な実施例は、本発明の技術的解決手段を説明するためのものだけであり、これを限定するものではない。上記好適な実施例を参照しながら本発明を詳しく説明したが、形式及び細部に対して種々の変更を行うことができ、これらはいずれも本発明の特許請求の範囲によって限定される範囲に含まれることは、当業者であれば理解されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【手続補正書】
【提出日】2021-11-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
癌治療薬の製造における没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）及びチロシンキナーゼ阻害剤の使用であって、前記没食子酸エピガロカテキンは、ＥＧＣＧと、ＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物と、を含み、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含み、前記癌は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍である、使用。
【請求項2】
癌治療用医薬組成物であって、請求項１に記載の有効量の没食子酸エピガロカテキンＥＧＣＧと１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含むか、又は、ＥＧＣＧをリード化合物として部分的または全体的に設計合成された化合物と１種又は複数種のチロシンキナーゼ阻害剤の組み合わせを含み、前記癌は、ＥＧＦＲ野生型腫瘍である、癌治療用医薬組成物。【国際調査報告】