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特表2022-533591リンホトキシンアルファ遮断剤によりターゲットされた制御性Ｔ細胞及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-25
(54)【発明の名称】リンホトキシンアルファ遮断剤によりターゲットされた制御性Ｔ細胞及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20220715BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20220715BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220715BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20220715BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220715BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20220715BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220715BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
A61K35/17 Z
A61P37/06
A61P1/04
A61P35/00
A61P37/08
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021567954
(86)(22)【出願日】2020-05-13
(85)【翻訳文提出日】2021-12-23
(86)【国際出願番号】 EP2020063346
(87)【国際公開番号】W WO2020229546
(87)【国際公開日】2020-11-19
(31)【優先権主張番号】19305618.1
(32)【優先日】2019-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(71)【出願人】
【識別番号】511025226
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ デクス－マルセイユ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ Ｄ’ＡＩＸ－ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ
【住所又は居所原語表記】Ｊａｒｄｉｎ ｄｕ Ｐｈａｒｏ， ５８， Ｂｌｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌｉｖｏｎ， Ｆ－１３２８４ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ ｃｅｄｅｘ ０７， Ｆｒａｎｃｅ
(71)【出願人】
【識別番号】595040744
【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】イルラ，マガリ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AA92Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087NA05
4C087ZB08
4C087ZB13
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、制御性Ｔ細胞及びその使用に関する。その免疫抑制活性及び抗炎症活性により、制御性Ｔ細胞は、末梢性寛容において中心的役割を果たし、このため、自己免疫障害及び炎症性障害の発症を決定的に予防する。本発明者らにより、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇが、高レベルのＬＴαを発現し、ＬＴαが、それらの免疫抑制サインを負にレギュレーションすることが示された。本発明者らにより、可溶性リンホトキシンβレセプターと共に予めインキュベーションされたＴｒｅｇのマウスへの養子移入によりデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎が保護されることが実証された。このため、養子移入において注入されるべき細胞数を減少させることができ、トランスフェクション又はトランスダクション工程を回避することができる。これにより、技術的容易化が提供される。特に、本発明は、自己免疫障害及び炎症関連ガンの治療又は予防を必要とする対象における自己免疫障害及び炎症関連ガンを治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の、有効量の可溶性リンホトキシンβレセプターと共に予めインキュベーションされた制御性Ｔ細胞を対象に投与する工程を含む、方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされた、制御性Ｔ細胞。
【請求項2】
リンホトキシンアルファ遮断剤が、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）である、請求項１記載の制御性Ｔ細胞。
【請求項3】
請求項１又は２記載の制御性Ｔ細胞の集団。
【請求項4】
ＴＣＲ又は自己抗原を認識する／自己抗原に結合するキメラ抗原レセプターを発現することを特徴とする、請求項１記載の制御性Ｔ細胞。
【請求項5】
請求項４記載の制御性Ｔ細胞の集団。
【請求項6】
キメラ抗原レセプター又はＴＣＲをコードするベクターを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで制御性Ｔ細胞をトランスフェクションし又はトランスダクションする工程を含む、請求項４記載の制御性Ｔ細胞を製造する方法。
【請求項7】
養子細胞療法を必要とする対象における養子細胞療法に使用するための、請求項３及び／又は５記載の制御性Ｔ細胞の集団。
【請求項8】
請求項３及び／又は５記載の制御性Ｔ細胞の集団を含む、医薬組成物。
【請求項9】
制御性Ｔ細胞免疫抑制活性を刺激するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、ｉ．対象から生体サンプルを取得することと、
ｉｉ．前記サンプルから制御性Ｔ細胞を単離することと、
ｉｉｉ．制御性Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることと、
ｉｖ．ＬＴα１β２／ＬＴβＲ又はＬＴα２β１／ＬＴβＲ相互作用を遮断するために、前記単離された制御性Ｔ細胞を有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共にインキュベーションすることとを含む、
方法。
【請求項10】
生体サンプルが、血液サンプルである、請求項９記載の方法。
【請求項11】
自己免疫障害の治療又は予防を必要とする対象における自己免疫障害を治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の請求項３又は／及び５記載の制御性Ｔ細胞の集団を対象に投与する工程を含む、
方法。
【請求項12】
自己免疫障害が、炎症性腸疾患である、請求項１記載の方法。
【請求項13】
炎症関連ガン若しくはアレルギーの治療又は予防を必要とする対象における炎症関連ガン若しくはアレルギーを治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の請求項３記載の制御性Ｔ細胞の集団を対象に投与する工程を含む、
方法。
【請求項14】
炎症関連ガンが、大腸炎関連ガンである、請求項１記載の方法。
【請求項15】
外因的に投与された分子に対する免疫反応又は移植組織もしくは移植細胞に対する免疫反応の治療又は予防を必要とする対象におけるこれらの免疫反応を治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の請求項３記載の制御性Ｔ細胞の集団を対象に投与する工程を含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、自己免疫障害及び炎症関連ガンの治療又は予防を必要とする対象における自己免疫障害及び炎症関連ガンを治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の制御性Ｔ細胞を対象に投与する工程を含み、ここで、制御性Ｔ細胞の集団が、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされている、方法に関する。
本発明は、自己免疫障害及び炎症関連ガンの治療又は予防を必要とする対象における自己免疫障害及び炎症関連ガンを治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の制御性Ｔ細胞を対象に投与する工程を含み、ここで、制御性Ｔ細胞の集団が、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされている、方法に関する。
【0002】
発明の背景
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、末梢自己寛容の維持に重要な役割を果たすＣＤ４＋ Ｔ細胞のサブセットを構成する（１）。この細胞型は、胸腺の負の選択を免れた有害な自己反応性Ｔ細胞を免疫抑制する固有の能力を有し、それにより、炎症性障害及び自己免疫障害の発症を予防する。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺と、末梢でのナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からの変換との両方に由来し、それぞれ天然Ｔｒｅｇ及び誘導性Ｔｒｅｇと呼ばれる（２）。個体発生の間、天然Ｔｒｅｇの発生は、従来のＣＤ４＋ Ｔ細胞の発生と比較して実質的に遅延する。Ｔｒｅｇの第一波が、周産期の間に発生し、一方で、従来のＣＤ４＋ Ｔ細胞は、胚の段階でより早く現れるためである（３）。
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、末梢自己寛容の維持に重要な役割を果たすＣＤ４＋ Ｔ細胞のサブセットを構成する（１）。この細胞型は、胸腺の負の選択を免れた有害な自己反応性Ｔ細胞を免疫抑制する固有の能力を有し、それにより、炎症性障害及び自己免疫障害の発症を予防する。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺と、末梢でのナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞からの変換との両方に由来し、それぞれ天然Ｔｒｅｇ及び誘導性Ｔｒｅｇと呼ばれる（２）。個体発生の間、天然Ｔｒｅｇの発生は、従来のＣＤ４＋ Ｔ細胞の発生と比較して実質的に遅延する。Ｔｒｅｇの第一波が、周産期の間に発生し、一方で、従来のＣＤ４＋ Ｔ細胞は、胚の段階でより早く現れるためである（３）。
【0003】
ヒトの免疫系の制御及び維持におけるＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ細胞の重要性は、切断された非機能的Ｆｏｘｐ３タンパク質が生じるＦｏｘｐ３遺伝子における突然変異を示す壊血病マウスで実証された（４）。これらのマウスは、若齢で死亡してしまう。胸腺由来Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇを産生できず、このため、多臓器炎症を伴う致死的なリンパ増殖症候群を発症するためである。続けて、Ｆｏｘｐ３は、Ｔｒｅｇの発生、機能及びホメオスタシスのマスターレギュレーターとして特定された。Ｆｏｘｐ３遺伝子における遺伝子突然変異が、ヒトでも特定されており、免疫調節異常多腺性内分泌不全症腸疾患Ｘ連鎖（ＩＰＥＸ）症候群と呼ばれる重症自己免疫疾患の原因となっている（５）。Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇは、幾つかのメカニズムを使用して、免疫応答を抑制する（Workman et al., 2009）。４つの主な作用機序：免疫抑制サイトカイン（ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β及びＩＬ－３５）、エフェクターＴ細胞及び樹状細胞の細胞溶解（マウス及びヒトそれぞれにおけるグランザイムＢ及びＡ）、代謝破壊（ＣＤ３９、ＣＤ７３及びＣＤ２５）並びに樹状細胞における抗原提示のモデュレーション（ＣＴＬＡ－４及びＬＡＧ－３）が記載されている。
【0004】
マウスにおいて、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）におけるＷＴ Ｔｒｅｇの養子移入は、確立された腸炎症（６）、Ｉ型糖尿病（７）、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（８）及び喘息（９）を予防し、治癒することが示されている。さらに、Ｔｒｅｇ細胞は、多くの場合、腫瘍の免疫監視機構を減弱させることにより腫瘍形成を促進するが、対照的に、大腸炎関連ガン（ＣＡＣ）等の炎症を抑制することにより、慢性炎症を介したガンにおいて抗腫瘍的な役割を果たす（１０）。ヒトにおいて、Ｔｒｅｇ系細胞治療が現実のものとなりつつある（１１）。例えば、ヒトＴｒｅｇを使用する第I相臨床試験が、Ｉ型糖尿病（１２）、難治性クローン病（１３）又は幹細胞移植時の急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（１４）を患っている患者において報告されている。しかしながら、自己免疫疾患及び炎症性疾患の新規な治療法の開発が依然として必要とされている。
【0005】
さらに、Ｔｒｅｇ養子移入技術には、主な制限段階が存在する。ヒトにおける有効な治療には、大量の細胞が必要である。このため、Ｔｒｅｇ細胞療法の分野において、効率的に炎症性障害及び自己免疫障害を所定するのに必要な細胞数を減少させる必要性が依然として存在する。
【0006】
発明の概要
Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、その免疫抑制活性及び抗炎症活性により、末梢寛容において中心的な役割を果たし、このため、自己免疫障害及び炎症性障害の発症を決定的に予防する。本発明者らにより、胸腺及び脾臓Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇが、膜アンカーＬＴα１β２ヘテロ複合体として、従来のＣＤ４＋ Ｔ細胞より高レベルのリンホトキシンα（ＬＴα）を発現することが実証された。ＬＴα－／－マウス由来の胸腺及び脾臓Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ（ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇ）は、高度に抑制性の細胞のサインを示す。これは、ＬＴαがこの細胞型の免疫抑制機能を負にレギュレーションすることを示す。興味深いことに、腸炎を制限することにより、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入（ＡＴ）は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎を保護し、炎症性腸疾病（ＩＢＤ）を治癒し、大腸炎関連ガン（ＣＡＣ）の発症を減弱させる。重要なことに、混合骨髄キメラを使用することにより、本発明者らにより、造血細胞において特異的なＬＴα発現によりＴｒｅｇの抑制サインが負に制御されることが見出された。本発明者らにより、ＬＴαによりＴｒｅｇの免疫抑制特性が負にレギュレーションされるため、Ｔｒｅｇの抑制活性を向上させるための治療における有益で新規なターゲットとなる可能性があることを特定された。また、本発明者らにより、Ｔｒｅｇと抗原提示細胞（すなわち、樹状細胞と胸腺上皮細胞）との間のＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用それぞれによりＴｒｅｇの免疫抑制サインが制御されることが明らかにされた。最後に、本発明者らにより、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）と共に予めインキュベーションされた制御性Ｔ細胞のＡＴによりＤＳＳ誘発大腸炎が減弱されることが見出された。Ｔｒｅｇを可溶性リンホトキシンβレセプターと共にインキュベーションすることにより、養子移入において注入される細胞数を減少させることができ、トランスフェクション又はトランスダクション工程を回避することができ、これは、技術的容易性を表わす。
Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ 制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、その免疫抑制活性及び抗炎症活性により、末梢寛容において中心的な役割を果たし、このため、自己免疫障害及び炎症性障害の発症を決定的に予防する。本発明者らにより、胸腺及び脾臓Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇが、膜アンカーＬＴα１β２ヘテロ複合体として、従来のＣＤ４＋ Ｔ細胞より高レベルのリンホトキシンα（ＬＴα）を発現することが実証された。ＬＴα－／－マウス由来の胸腺及び脾臓Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇ（ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇ）は、高度に抑制性の細胞のサインを示す。これは、ＬＴαがこの細胞型の免疫抑制機能を負にレギュレーションすることを示す。興味深いことに、腸炎を制限することにより、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入（ＡＴ）は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎を保護し、炎症性腸疾病（ＩＢＤ）を治癒し、大腸炎関連ガン（ＣＡＣ）の発症を減弱させる。重要なことに、混合骨髄キメラを使用することにより、本発明者らにより、造血細胞において特異的なＬＴα発現によりＴｒｅｇの抑制サインが負に制御されることが見出された。本発明者らにより、ＬＴαによりＴｒｅｇの免疫抑制特性が負にレギュレーションされるため、Ｔｒｅｇの抑制活性を向上させるための治療における有益で新規なターゲットとなる可能性があることを特定された。また、本発明者らにより、Ｔｒｅｇと抗原提示細胞（すなわち、樹状細胞と胸腺上皮細胞）との間のＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用それぞれによりＴｒｅｇの免疫抑制サインが制御されることが明らかにされた。最後に、本発明者らにより、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）と共に予めインキュベーションされた制御性Ｔ細胞のＡＴによりＤＳＳ誘発大腸炎が減弱されることが見出された。Ｔｒｅｇを可溶性リンホトキシンβレセプターと共にインキュベーションすることにより、養子移入において注入される細胞数を減少させることができ、トランスフェクション又はトランスダクション工程を回避することができ、これは、技術的容易性を表わす。
【0007】
発明の詳細な説明
本発明の第１の態様は、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされた、制御性Ｔ細胞に関する。このリンホトキシンアルファ遮断剤とのインキュベーションにより、制御性Ｔ細胞の抑制活性を高めることが可能となる。
本発明の第１の態様は、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされた、制御性Ｔ細胞に関する。このリンホトキシンアルファ遮断剤とのインキュベーションにより、制御性Ｔ細胞の抑制活性を高めることが可能となる。
【0008】
本明細書で使用する場合、「リンホトキシンアルファ遮断剤」という用語は、ＬＴαリガンドがＬＴβＲに結合するのを遮断することができる、例えば、ＬＴα１β２／ＬＴＢＲ（優勢な形態）又はＬＴα２β１／ＬＴβＲ相互作用を遮断することができる薬剤を指す。
【0009】
本明細書で使用する場合、「リンホトキシンアルファ」又は「ＬＴα」（腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ－β）としても公知）という用語は、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーを指す。リンホトキシンアルファは、リンパ球により分泌されるサイトカインである。リンホトキシンアルファ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｐ０１３７４（Homo sapiens）、Ｐ０９２２５（Mus musculus））は、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）遺伝子（ＮＣＢＩ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：遺伝子ＩＤ：４０４９（Homo sapiens）、遺伝子ＩＤ：１６９９２（Mus musculus））によりコードされる。ＬＴαとＬＴβとの相互作用により、ＬＴβＲと相互作用することができる膜結合複合体ＬＴα１β２（優勢型）又はＬＴα２β１／ＬＴβＲの形成がもたらされる。本発明者らにより、ＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用を遮断することにより制御性Ｔ細胞の抑制活性を増大させることが可能となることが示される。
【0010】
一部の実施態様では、リンホトキシンα遮断剤は、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）である。
【0011】
このため、本発明は、有効量の可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）と共に予めインキュベーションされた、制御性Ｔ細胞を指す。
【0012】
本明細書で使用する場合、「リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバーを指す。ＬＴβＲ（そのＵｎｉｐｒｏｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｐ３６９４１（Homo sapiens）、Ｐ５０２８４（Mus musculus））は、リンホトキシン膜型ＬＴα１β２又はＬＴα２β１（リンホトキシンアルファとリンホトキシンベータとの複合体）に結合し、アポトーシス及びサイトカイン放出に関与するリンホトキシンについての細胞表面レセプターである。
【0013】
本明細書で定義された「可溶性ＬＴβＲ」は、ＬＴβＲの細胞外領域のリンホトキシン（ＬＴ）結合フラグメントを含むポリペプチドである。例えば、可溶性ＬＴβＲは、ヒトＬＴβＲの細胞外ドメインの全て又はフラグメントを含むことができる。ヒトＬＴβＲの細胞外ドメインは、配列番号：１として示されるアミノ酸配列からなる。
【0014】
【化1】
【0015】
可溶性形態のリンホトキシンβレセプターは、当技術分野において周知であり、ＷＯ第９７／０３６８７号に開示されている。一部の実施態様では、ＬＴβＲポリペプチドは、任意の種（例えば、任意のほ乳類（例えば、マウス、ラット又はサル））由来の全長未成熟ＬＴβＲポリペプチドである。好ましい実施態様では、ＬＴβＲポリペプチドは、ヒトである。
【0016】
一部の実施態様では、可溶性ＬＴβＲは、配列番号：１のアミノ酸配列を含む。
【0017】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用され、長さ又は翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸の任意のペプチド連結鎖を意味する。本発明の方法のいずれかにおいて使用されるＬＴβＲ、異種ポリペプチド又はそれらの融合タンパク質は、ヒトタンパク質を含有することができもしくはヒトタンパク質であることができ又は５０以下の保存的アミノ酸置換を有する変異体であることができる。
【0018】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチドフラグメント」は全長の未成熟ポリペプチドより短いポリペプチドのセグメントを指す。ポリペプチドの「機能的フラグメント」は、成熟ポリペプチドの活性の少なくとも１０％（例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％又は１００％）を有する。ポリペプチドのフラグメントは、ポリペプチドの末端及び内部欠失変異体を含む。
【0019】
一部の実施態様では、ＬＴβＲ部分自体が可溶性である。一部の実施態様では、ＬＴβＲは、その溶解度を向上させる異種部分、例えば、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合される。一部の実施態様では、異種部分は、ＬＴβＲ部分に共有結合することができる。
【0020】
一部の実施態様では、可溶性ＬＴβＲを第２のポリペプチド部分、例えば、異種ポリペプチド（例えば、ＬＴβＲ融合タンパク質を形成するため）又は非ポリペプチド部分の共有結合により改変することができる。
【0021】
幾つかの場合において、このような部分により、薬力学的又は薬物動態学的パラメーター、例えば、溶解性又は半減期を改善することができる。ＬＴβＲ融合タンパク質は、抗体の定常領域（例えば、Ｆｃドメイン）、トランスフェリン又はアルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の全部又は一部を含むことができる。融合タンパク質は、ＬＴβＲ配列と非ＬＴβＲタンパク質ドメインとの間にリンカー領域を含むことができる。一部の実施態様では、可溶性ＬＴβＲは、ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）への共有結合により改変される。特定の理論又はメカニズムにより何ら限定されないが、このような可溶性ＬＴβＲは、ＬＴβＲ活性を減少させ（遮断する又は中和する）ためのデコイレセプターとして作用することができる。
【0022】
一部の実施態様では、ＬＴβＲ融合タンパク質は、免疫グロブリン定常重鎖ドメインに融合したＬＴβＲ細胞外リガンド結合ドメインを有する。より好ましくは、ＬＴβＲリガンド結合ドメインは、ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインに融合される。
【0023】
抗体の「Ｆｃドメイン」という用語は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むが、抗原結合部位を欠く分子の一部を指す。また、この用語は、ＩｇＭ又は他の抗体アイソタイプの等価な領域を含むことも意味する。
【0024】
一部の実施態様では、可溶性ＬＴβＲは、バミネルセプトである。バミネルセプトは、Biogen Idecにより開発されたリンホトキシンベータレセプターアンタゴニストである。そのＣＡＳ番号は、９０９１１０－２５－４であり、そのアミノ酸配列は、配列番号：２からなる。
【0025】
一部の実施態様では、可溶性ＬＴβＲタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列を含む。
【0026】
【化2】
【0027】
一部の実施態様では、リンホトキシンアルファ遮断剤は、抗ＬＴα遮断抗体である。
【0028】
本明細書で使用する場合、「抗体」は、天然の抗体及び非天然の抗体の両方を含む。具体的には、「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにその一価及び二価フラグメントを含む。さらに「抗体」は、キメラ抗体、完全合成抗体、一本鎖抗体及びそのフラグメントを含む。抗体は、ヒト又は非ヒト抗体であることができる。非ヒト抗体は、ヒトにおけるその免疫原性を減少させるために、リコンビナント法によりヒト化されていることができる。
【0029】
本明細書で使用する場合、「抗ＬＴα遮断抗体」は、他の抗体又はレセプターがＬＴαと結合するのを妨げる抗ＬＴα抗体を指す。抗ＬＴα遮断抗体は、ＬＴα１β２／ＬＴβＲ又はＬＴα２β１／ＬＴβＲ相互作用を妨げる。
【0030】
抗ＬＴα遮断抗体の例は、下記のもの：
を含む。
【表1】
を含む。
【0031】
抗体は、従来の方法に従って調製される。モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein（Nature, 256:495, 1975）の方法を使用して生成することができる。本発明において有用なモノクローナル抗体を調製するために、マウス又は他の適切なホスト動物を、抗原形態のＬＴαで適切な間隔（例えば、週２回、週１回、月２回又は月１回）において免疫化する。この動物に、殺処分の１週間以内に抗原の最終「追加免疫」を投与することができる。免疫化の間、免疫学的アジュバントを使用するのが望ましい場合が多い。適切な免疫学的アジュバントは、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ribiアジュバント、Hunter's Titermax、サポニンアジュバント、例えば、QS21もしくはQuil A又はＣｐＧ含有免疫刺激オリゴヌクレオチドを含む。他の適切なアジュバントは、当技術分野において周知である。動物を皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は他の経路により免疫化することができる。所定の動物を複数の経路により複数の形態の抗原で免疫化することができる。
【0032】
簡潔に、抗原をＬＴαにおける目的の抗原性領域に対応する合成ペプチドとして提供することができる。免疫化計画に続けて、リンパ球を動物の脾臓、リンパ節又は他の臓器から単離し、ポリエチレングリコール等の作用剤を使用して適切な骨髄腫細胞系統と融合させて、ハイブリドーマを形成する。融合後、細胞を記載されているように（Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996）、標準的な方法を使用して、ハイブリドーマの増殖を許容するが、融合パートナーの増殖を許容しない培地に入れる。ハイブリドーマの培養後、細胞上清を所望の特異性の抗体、すなわち、抗原に選択的に結合する抗体の存在について分析する。適切な分析技術は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降及びウェスタンブロッティングを含む。他のスクリーニング技術は、当技術分野において周知である。好ましい技術は、コンホメーション的にインタクトなネイティブに折り畳まれた抗原への抗体の結合を確認するもの、例えば、非変性ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及び免疫沈降である。
【0033】
重要なことに、当技術分野において周知のように、抗体分子のごく一部であるパラトープが、そのエピトープへの抗体の結合に関与する（一般的には、Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York；Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照のこと）。例えば、Ｆｃ’及びＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に開裂されたか又はｐＦｃ’領域なしに産生された抗体（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと呼ばれる）は、インタクトな抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に開裂され又はＦｃ領域なしに産生された抗体（Ｆａｂフラグメントと呼ばれる）は、インタクトな抗体分子の１つの抗原結合部位を保持する。さらに進めて、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖とＦｄと呼ばれる抗体重鎖の一部とからなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主な決定因子であり（１つのＦｄフラグメントを抗体特異性を変化させることなく、最大１０種類の軽鎖と会合させることができ）、Ｆｄフラグメントは、単離された状態でエピトープ結合能を保持する。
【0034】
当技術分野において周知のように、抗体の抗原結合部分内には、抗原のエピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）及びパラトープの三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が存在する（一般的には、Clark, 1986；Roitt, 1991を参照のこと）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄフラグメント及び軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１～ＣＤＲＳ）によりそれぞれ分離された４つのフレームワーク領域（ＦＲ１～ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にｍ、ＣＤＲＳ領域、とりわけ、重鎖ＣＤＲＳは、抗体特異性を主に担う。
【0035】
ほ乳類抗体の非ＣＤＲ領域を元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、同種又は異種特異性抗体の類似領域により置き換えることができることが、現在、当技術分野において十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合して機能的抗体を産生する「ヒト化」抗体の開発及び使用において最も明白に示される。
【0036】
本発明は、特定の実施態様では、ヒト化形態の抗体を含む、組成物及び方法を提供する。本明細書で使用する場合、「ヒト化」は、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の幾つか、大部分又は全てがヒト免疫グロブリン分子に由来する対応するアミノ酸により置き換えられている抗体を説明する。ヒト化の方法は、ＵＳ第４，８１６，５６７号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号及び同第５，８５９，２０５号に記載されている方法を含むが、これらに限定されない。これらの文献は、参照により本明細書に組み入れられる。また、上記ＵＳ第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６１号並びにＷＯ第９０／０７８６１号には、ヒト化抗体を設計するのに使用することができる４つの可能性のある基準も提案されている。最初の提案は、アクセプターについて、ヒト化されるドナー免疫グロブリンと異常に相同である特定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを使用するか又は多くのヒト抗体からのコンセンサスフレームワークを使用することであった。第２の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク中のアミノ酸が異常であり、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列に典型的である場合には、アクセプターではなくドナーアミノ酸を選択することができるというものであった。第３の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖における３つのＣＤＲに直接隣接する位置において、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択することができるというものであった。第４の提案は、アミノ酸が抗体の三次元モデルにおいてＣＤＲの３Ａ内に側鎖原子を有すると予想され、ＣＤＲと相互作用可能であると予想されるフレームワーク位置に存在するドナーアミノ酸を使用することであった。上記方法は、当業者がヒト化抗体を調製するのに利用することができた方法の一部の例でしかない。当業者であれば、抗体ヒト化のための他の方法に精通しているであろう。
【0037】
ヒト化形態の抗体の一実施態様では、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の幾つか、大部分又は全てが、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸により置き換えられているが、この場合、１つ以上のＣＤＲ領域内の幾つか、大部分又は全てのアミノ酸は変化していない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換又は改変は、抗体が所定の抗原に結合する能力を無効にしないであろう限り許容される。適切なヒト免疫グロブリン分子は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＭ分子を含むであろう。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。ただし、ヒト化の特定の方法を使用して、抗体の結合の親和性及び／又は特異性を、Wu et al., /. Mol. Biol. 294:151, 1999に記載されているように、「指向性進化」の方法を使用して向上させることができる。この文献の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【0038】
また、完全なヒトモノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖ローカスの大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫化することによっても調製することができる。例えば、ＵＳ第５，５９１，６６９号、同第５，５９８，３６９号、同第５，５４５，８０６号、同第５，５４５，８０７号、同第６，１５０，５８４号及びそれらに引用された参考文献を参照のこと。これらの文献の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。これらの動物は、内因性（例えば、マウス）抗体の産生において機能的欠失が存在するように、遺伝的に改変されている。この動物をさらに改変して、これらの動物の免疫化により目的の抗原に対する完全なヒト抗体の産生がもたらされるであろうように、ヒト生殖細胞系統免疫グロブリン遺伝子ローカスの全部又は一部を含ませるようにする。これらのマウス（例えば、XenoMouse（Abgenix）、HuMAbマウス（Medarex/GenPharm））の免疫化後、モノクローナル抗体を標準的なハイブリドーマ技術に従って調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、したがって、ヒトに投与された場合、ヒト抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を誘発しないであろう。
【0039】
ヒト抗体を産生するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法も存在する。これらは、ファージディスプレイ技術（ＵＳ第５，５６５，３３２号及び同第５，５７３，９０５号）及びヒトＢ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激（ＵＳ第５，２２９，２７５号及び同第５，５６７，６１０号）を含む。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【0040】
このため、当業者に明らかであろうように、本発明は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ並びにＦｄフラグメント；Ｆｃ及び／又はＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒト又は非ヒト配列により置き換えられているキメラ抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒト又は非ヒト配列により置き換えられているキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒト又は非ヒト配列により置き換えられているキメラＦａｂフラグメント抗体並びにＦＲ及び／又はＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２領域が相同ヒト又は非ヒト配列により置き換えられているキメラＦｄフラグメント抗体も提供する。また、本発明は、いわゆる一本鎖抗体も含む。
【0041】
種々の抗体分子及びフラグメントは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含むが、これらに限定されない、一般的に公知の免疫グロブリンクラスのいずれかから得ることができる。また、ＩｇＧサブクラスも、当業者に周知であり、ヒトＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない。
【0042】
別の実施態様では、本発明の抗体は、単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）又は「ＶＨＨ」という用語は、本来軽鎖を欠くラクダ科ほ乳類において見出すことができるタイプの抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。このようなＶＨＨは、「nanobody（登録商標）」とも呼ばれる。本発明によれば、ｓｄＡｂは、特に、ラマｓｄＡｂであることができる。「ＶＨＨ」という用語は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する単一重鎖を指す。「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、ＶＨＨの結合親和性及び特異性を規定する超可変アミノ酸配列を指す。
【0043】
本発明のＶＨＨを、通常の実験を使用して当業者により容易に調製することができる。ＶＨＨ変異体及びその改変形態を当技術分野において公知の任意の技術、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟で産生することができる。
【0044】
ＶＨＨ又はｓｄＡｂは、通常、免疫化された動物から得られた血液、リンパ節又は脾臓ｃＤＮＡから、ファージディスプレイベクター、例えば、ｐＨＥＮ２へのＶ－ドメインレパートリーのＰＣＲクローニングにより生成される。抗原特異的ＶＨＨは、一般的には、固定化抗原、例えば、試験管のプラスチック表面上に被覆された抗原、ストレプトアビジンビーズ上に固定化されたビオチン化抗原又は細胞の表面上に発現された膜タンパク質上にファージライブラリーをパニングすることにより選択される。ただし、このようなＶＨＨは、多くの場合、幾らかの免疫化を受けた動物に由来するＶＨＨより、それらの抗原に対して低い親和性を示す。免疫ライブラリーからのＶＨＨの高い親和性は、免疫化動物のリンパ器官におけるＢ細胞のクローン性増殖中の変異ＶＨＨの自然選択に起因する。非免疫ライブラリーからのＶＨＨの親和性を多くの場合、このストラテジーをｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣することにより、すなわち、ＣＤＲ領域の部位特異的突然変異誘発及び高まったストリンジェンシー（より高い温度、高い又は低い塩濃度、高い又は低いｐＨ及び低い抗原濃度）の条件下での固定化抗原上での更なるラウンドのパニングにより改善することができる。ラクダに由来するＶＨＨは、従来の抗体の対応するドメインよりはるかに高いレベルで、E. coliペリプラズムにおいて容易に発現され、そこから精製される。ＶＨＨを一般的には、高い溶解性及び安定性を表わし、酵母、植物及びほ乳類細胞において容易に産生することができる。例えば、「Hamers特許」には、任意の所望のターゲットに対してＶＨＨを生成するための方法及び技術が記載されている（例えば、ＵＳ第５，８００，９８８号；同第５，８７４，５４１号及び同第６，０１５，６９５号を参照のこと）。「Hamers特許」には、とりわけ、細菌ホスト、例えば、E. coli（例えば、ＵＳ第６，７６５，０８７号を参照のこと）及び下等真核生物ホスト、例えば、カビ（例えば、Aspergillus又はTrichoderma）又は酵母（例えば、Saccharomyces、Kluyveromyces、Hansenula又はPichia）（例えば、ＵＳ第６，８３８，２５４号を参照のこと）におけるＶＨＨの産生が記載されている。
【0045】
本明細書で使用する場合、「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」という用語は、免疫系をモデュレーションし、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患及び炎症性疾患を抑制するＴ細胞の部分集団を指す。これらの細胞は、一般的には、エフェクターＴ細胞の誘導及び増殖を抑制し又はダウンレギュレーションし、抗原提示細胞機能をモデュレーションする。Ｔｒｅｇは、細胞間接触又は免疫抑制サイトカインの放出のいずれかにより、抑制活性（すなわち、従来のＴ細胞の増殖を阻害すること）が可能な細胞である。
【0046】
本発明の別の目的は、本発明の制御性Ｔ細胞の集団に関する。
【0047】
本明細書で使用する場合、「集団」という用語は、細胞の集団を指す。ここで、細胞の総数の大部分（例えば、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％）が、目的の細胞の特定の特徴を有し、目的のマーカーを発現する。
【0048】
本発明の別の目的は、制御性Ｔ細胞免疫抑制活性を刺激するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、
ｉ）対象から生体サンプルの取得することと、
ｉｉ）前記サンプルから制御性Ｔ細胞を単離することと、
ｉｉｉ）制御性Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることと、
ｉｖ）ＬＴα１β２／ＬＴβＲ又はＬＴα２β１／ＬＴβＲ相互作用を遮断するために、前記単離された制御性Ｔ細胞を有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤、例えば、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）と共にインキュベーションすることとを含む、方法に関する。
ｉ）対象から生体サンプルの取得することと、
ｉｉ）前記サンプルから制御性Ｔ細胞を単離することと、
ｉｉｉ）制御性Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることと、
ｉｖ）ＬＴα１β２／ＬＴβＲ又はＬＴα２β１／ＬＴβＲ相互作用を遮断するために、前記単離された制御性Ｔ細胞を有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤、例えば、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）と共にインキュベーションすることとを含む、方法に関する。
【0049】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、ほ乳類、例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ及び霊長類を指す。好ましくは、本発明の対象は、ヒトである。
【0050】
本明細書で使用する場合、「生体サンプル」という用語は、任意の体液又は組織を指す。一実施態様では、生体サンプルは、血液サンプルである。
【0051】
本明細書で使用する場合、「制御性Ｔ細胞免疫抑制活性」という用語は、当技術分野において周知であり、エフェクターＴ細胞の誘導及び増殖を抑制し又はダウンレギュレーションするＴｒｅｇの能力を指す。本明細書で使用する場合、「制御性Ｔ細胞免疫抑制活性の刺激」という用語は、制御性Ｔ細胞免疫抑制活性の向上を指す。
【0052】
本明細書で使用する場合、「単離する」は、その本来の環境から細胞又は細胞集団を取り出すことを指す。本明細書で使用する場合、「単離された」は、その本来の環境（例えば、血液サンプル）から取り出され、単離され、精製され又は分離され、本来存在する他の細胞を少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％含まない細胞又は細胞集団を指す。
【0053】
本発明の方法によれば、本発明の制御性Ｔ細胞は、サンプルから単離される。当業者に公知の全ての技術を使用することができる。一実施態様では、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋及びＣＤ１９＋細胞の枯渇によるＣＤ４＋ Ｔ細胞の事前濃縮後に、セルソーターにより単離される。選別された制御性Ｔ細胞の純度は、９７％超であった。
【0054】
本発明の更なる目的は、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現することを特徴とする、本発明の予めインキュベーションされた制御性Ｔ細胞に関する。
【0055】
本明細書で使用する場合、「ＴＣＲ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＭＨＣ分子に結合した抗原を認識することを担うＴ細胞の表面上に見出される分子を指す。特に、「ＴＣＲを発現することを特徴とするＴ細胞」は、Ｔ細胞が例えば、前記ＴＣＲをコードする核酸分子によりｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで前記Ｔ細胞をトランスフェクションし又はトランスダクションすることにより、前記ＴＣＲを発現するように遺伝子操作されたことを意味する。
【0056】
本明細書で使用する場合、「キメラ抗原レセプター」又は「ＣＡＲ」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結された抗体の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を含有する人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドを指す。本発明の文脈において、抗体の抗原結合ドメインは、自己抗原を認識する／自己抗原に結合する。
【0057】
本明細書で使用する場合、「認識する」又は「結合する」という用語は、ＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターが抗原に対する親和性を有することを意味する。
【0058】
本明細書で使用する場合、「自己抗原」という用語は、免疫系により認識される内因性抗原又はその活性フラグメントを指す。自己抗原は、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、細胞表面レセプターを含む糖タンパク質を含むが、これらに限定されない。自己抗原の例は、プレプロインスリン（ＰＰＩ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ－２）、膵島特異的グルコース－６－ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）及びＴ１Ｄ用クロモグラニンＡ；多発性血管炎を伴う肉芽腫症に対するミエロペルオキシダーゼ及びプロテイナーゼ３；多発性硬化症におけるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；セリアック病におけるグリアジンを含むが、これらに限定されない。
【0059】
別の目的は、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現する、本発明の制御性Ｔ細胞の集団に関する。
【0060】
一実施態様では、本発明の制御性Ｔ細胞は、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するキメラ抗原レセプター又は抗原特異的ＴＣＲを発現するために、キメラ抗原レセプター又は抗原特異的ＴＣＲをコードするベクターによりｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクションされ又はトランスダクションされている。このため、本発明の別の目的は、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するキメラ抗原レセプター又は抗原特異的ＴＣＲを発現する本発明の制御性Ｔ細胞を製造する方法に関する。この方法は、キメラ抗原レセプター又は抗原特異的ＴＣＲをコードするベクターにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで本発明の制御性Ｔ細胞をトランスフェクションし又はトランスダクションする工程を含む。
【0061】
「トランスダクション」又は「トランスダクションする」という用語は、レシピエント細胞における遺伝物質のウイルス移入及びその発現を指す。
【0062】
本明細書で使用する場合、「トランスフェクション」又は「トランスフェクションする」という用語は、ＤＮＡ（例えば、組み立てられたＤＮＡ発現ベクター）を細胞に導入し、それにより、細胞トランスフォーメーションを可能にするプロセスを指す。
【0063】
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、ホスト細胞において複製しかつ／又は組み込むベクターの能力を破壊することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子を指す。
【0064】
本発明の制御性Ｔ細胞集団（有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤、例えば、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）と共に予めインキュベーションされ、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現するか又は発現しない制御性Ｔ細胞の集団）は、治療的使用に特に適している。
【0065】
本発明の更なる目的は、養子細胞療法に使用するための、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされ、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現するか又は発現しない、制御性Ｔ細胞の集団に関する。
【0066】
本明細書で使用する場合、「養子細胞療法」という用語は、遺伝的に改変されている又は改変されていない自己又は同種リンパ球の注入に関連する細胞系免疫療法を指す。
【0067】
本発明のＴｒｅｇの集団を本開示に基づいて当業者に明らかであろう公知の技術又はその変形例に従って養子細胞療法のための方法及び組成物に利用することができる。例えば、Gruenberg et alのＵＳ第２００３／０１７０２３８号を参照のこと。RosenbergのＵＳ第４，６９０，９１５号も参照のこと。一部の実施態様では、細胞をまず、それらの培養培地からそれらを収集し、ついで、投与に適した培地及び容器システム（「薬学的に許容し得る」担体）中で、処置有効量に洗浄し、濃縮することにより配合される。適切な注入媒体は、任意の等張媒体配合物、典型的には、通常の生理食塩水、Normosol R（Abbott）又はPlasma-Lyte A（Baxter）であることができるが、水中の５％ デキストロース又は乳酸リンゲル液も利用することができる。注入媒体に、ヒト血清アルブミンを補充することができる。組成物中の細胞の処置上有効量は、レシピエントの年齢及び体重、ターゲットとする状態の重症度により決まる。古典的には、注入されるＴｒｅｇの数は、約１～３×１０６個/kgである（Adair et al. Human Tregs Made Antigen Specific by Gene Modification: The Power to Treat Autoimmunity and Antidrug Antibodies with Precision. Front Immunol 2017）。ただし、本発明のＴｒｅｇを使用する場合、それらの免疫抑制活性が向上するため、用量を減らすことができる。一実施態様では、用量を少なくとも５０％減少させることができる。一実施態様では、用量を７５％減少させることができる。一実施態様では、標準的な細胞治療用量を使用することができる。これらの細胞量は、約１０３個/kg、好ましくは、５×１０３個/kg程度少なくすることができ、１０７個/kg、好ましくは、１０８個/kg程度多くすることができる。細胞数は、組成物が意図される最終的な用途により決まり、その中に含まれる細胞の型も同様であろう。臨床的に関連する数の免疫細胞を、細胞の所望の総量に累積的に等しいか又はそれを超える複数回の注入に配分することができる。
【0068】
本発明の目的で、養子細胞療法に使用される本発明の制御性Ｔ細胞を対象（「自己細胞」）又は別の個体（「同種細胞」）から単離することができる。
【0069】
本明細書で使用する場合、「同種細胞」は、ある対象（ドナー）から単離され、別の対象（レシピエント又はホスト）に注入される細胞を指す。
【0070】
本明細書で使用する場合、「自己細胞」は、単離され、同じ対象（レシピエント又はホスト）に注入されて戻される細胞を指す。
【0071】
一実施態様では、養子細胞療法に使用される本発明の制御性Ｔ細胞は、幹細胞に由来することができる。
【0072】
本明細書で使用する場合、「幹細胞」という用語は、自己再生の特性を有し、発達の可能性（すなわち、全能性、多能性、多能性等）に関して特定の暗示的意味なしに、複数の細胞タイプに分化する発達の可能性を有する、未分化又は部分的に分化した状態にある細胞を指す。
【0073】
特定の実施態様では、養子細胞療法に使用される本発明の制御性Ｔ細胞は、誘導された多能性幹細胞に由来することができる。
【0074】
本明細書で使用する場合、「ｉＰＳＣ」及び「誘導多能性幹細胞」という用語は、互換的に使用され、非多能性細胞、典型的には、成体体細胞から、例えば、１つ以上の遺伝子の強制発現を誘引することにより人工的に誘導される（例えば、誘導され又は完全な逆転により）多能性幹細胞を指す。
【0075】
特定の実施態様では、養子細胞療法に使用される本発明の制御性Ｔ細胞制御性Ｔ細胞は、胚性幹細胞に由来することができる。
【0076】
本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」という用語は、胚性胚盤胞の内部細胞塊の天然の多能性幹細胞を指す（例えば、ＵＳ第５，８４３，７８０号；同第６，２００，８０６号；同第７，０２９，９１３号；同第７，５８４，４７９号を参照のこと。これらの文献は、参照により本明細書に組み入れられる）。このような細胞を、体細胞核移植（核移植）に由来する胚盤胞の内部細胞塊からも同様に得ることができる（例えば、ＵＳ第５，９４５，５７７号、同第５，９９４，６１９号、同第６，２３５，９７０号を参照のこと。これらの文献は、参照により本明細書に組み入れられる）。胚性幹細胞は多分化能を有し、発生の過程で外胚葉、内胚葉及び中胚葉という３つの一次胚葉の全ての誘導体を生じる。すなわち、それらは、特定の細胞種に十分かつ必要な刺激を与えると、成体の２００以上の細胞種それぞれに発生することができる。それらは、胚体外膜や胎盤には寄与しない。すなわち、全能性ではない。
【0077】
一実施態様では、養子細胞療法に使用される本発明の制御性Ｔ細胞は、従来のＣＤ４＋ Ｔ細胞の変換に由来することができる。
【0078】
本発明の更なる目的は、自己免疫障害を治療し又は予防する方法であって、自己免疫障害を必要とする患者に、制御性Ｔ細胞免疫抑制活性を刺激するのに有効な量のリンホトキシンアルファ遮断剤を投与することを含む、方法に関する。とりわけ、本発明は、自己免疫障害又は炎症関連ガンの処置又は予防を必要とする対象における自己免疫障害又は炎症関連ガンを治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の制御性Ｔ細胞の集団を対象に投与する工程を含み、ここで、制御性Ｔ細胞の集団は、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされている、方法に関する。このリンホトキシンアルファ遮断剤とのインキュベーションにより、制御性Ｔ細胞の抑制活性を高めることが可能となる。
【0079】
一実施態様では、リンホトキシンアルファ遮断剤は、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）である。
【0080】
一実施態様では、制御性Ｔ細胞は、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現する。
【0081】
一部の実施態様では、制御性Ｔ細胞は、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現しない。
【0082】
このため、本発明は、自己免疫障害の治療又は予防を必要とする対象における自己免疫障害を治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の、有効量の可溶性ＬＴβＲと共に予めインキュベーションされた制御性Ｔ細胞の集団及び／又は有効量の可溶性ＬＴβＲと共に予めインキュベーションされ、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現する制御性Ｔ細胞の集団を対象に投与する工程を含む、方法を指す。
【0083】
本明細書で使用する場合、「自己免疫疾患」という用語は、対象における自己免疫応答（自己又は自己抗原に対して向けられる免疫応答）の存在を指す。自己免疫疾患は、適応免疫系が自然免疫系の細胞と共同して、自己抗原に応答し、細胞及び組織の損傷を媒介するような自己寛容の破綻により引き起こされる疾患を含む。一部の実施態様では、自己免疫疾患は、少なくとも部分的に、体液性及び／又は細胞性免疫応答の結果であると特徴付けられる。自己免疫疾患の例は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経失調症、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経障害、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、自己免疫性心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ－ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コガンス症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合性クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維筋痛、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーブス病、ギラン－バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ－シェーンライン紫斑病、妊娠性ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、高ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパチー、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫制御性リポタンパク質、封入体筋炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、川崎症候群、ランバート－イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、モーレン潰瘍、ムシャ－ハバーマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（Ｄｅｖｉｃ’ｓ）、自己免疫性好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌に関連する小児自己免疫性神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、ペイリーロンベルグ症候群、パーソネージ－ターナー症候群、扁平部炎（末梢性ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎、心筋梗塞後症候群、心外膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、純赤血球無形成症、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィ、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、レストレスレッグス症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣の自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、サッカ症候群、交感神経性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トローザ－ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱性皮膚症、白斑、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）及びヴェーゲナー肉芽腫症［多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）］を含むが、これらに限定されない。一部の実施態様では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ループス又はＳＬＥ）、重症筋無力症、多発性硬化症、強皮症、アジソン病、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ギラン－バレー症候群、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、血栓性血小板減少性紫斑病、高ガンマグロブリン血症、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、慢性炎症性脱髄性多発根ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、橋本脳症（ＨＥ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ヴェーゲナー肉芽腫症［多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）］からなる群より選択される。
【0084】
一実施態様では、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患である。
【0085】
一実施態様では、自己免疫疾患は、多発性硬化症又は１型糖尿病である。
【0086】
本発明の更なる目的は、炎症関連ガンの治療又は予防を必要とする対象における炎症関連ガンを治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の制御性Ｔ細胞を対象に投与する工程を含み、ここで、制御性Ｔ細胞の集団は、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされている、方法に関する。
【0087】
一部の実施態様では、リンホトキシンアルファ遮断剤は、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）である。
【0088】
本明細書で使用する場合、「炎症関連ガン」という用語は、炎症がガンの開始及び発生に関与する病因メカニズムの少なくとも１つと考えられる任意のガンを指す。炎症関連ガンの例は、大腸炎関連ガン、胃腺ガン、膀胱ガン、肝臓ガン、直腸ガン、胆管ガン、結腸ガン、結腸直腸ガン、胆のうガン、肝細胞ガン、卵巣ガン、子宮頸ガン、皮膚ガン、食道ガン、膀胱ガン、中皮腫、肺ガン、口腔扁平上皮ガン、膵ガン、外陰扁平上皮ガン、唾液腺ガン、肺ガン、ＭＡＬＴリンパ腫を含むが、これらに限定されない。
【0089】
一実施態様では、炎症関連ガンは、大腸炎関連ガンである。大腸炎関連ガンは、大腸ガンのサブタイプである。
【0090】
本発明の更なる目的は、アレルギーの治療又は予防を必要とする対象におけるアレルギーを治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の制御性Ｔ細胞を対象に投与する工程を含み、ここで、制御性Ｔ細胞の集団は、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされている、方法に関する。
【0091】
一部の実施態様では、リンホトキシンアルファ遮断剤は、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）である。
【0092】
本明細書で使用する場合、「アレルギー」という用語は、一般的には、炎症を特徴とする不適切な免疫応答を指し、食物アレルギー、呼吸器アレルギー並びに例えば、クインケ浮腫及びアナフィラキシー等の全身応答を引き起こすか又は引き起こす可能性がある他のアレルギーを含むが、これらに限定されない。この用語は、アレルギー、アレルギー性疾患、過敏性関連疾患又は気道炎症に関連する呼吸器疾患、例えば、喘息もしくはアレルギー性鼻炎を包含する。一部の実施態様では、本発明の方法は、アナフィラキシー、薬剤過敏症、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、ドライアイ疾患、アレルギー性接触アレルギー、食物過敏症、アレルギー性結膜炎、昆虫毒アレルギー、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、職業性喘息、アトピー性喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関連する１つ以上の症状を予防し、治療し又は軽減するのに有効である。本発明の方法により治療することができる過敏症関連疾患又は障害は、アナフィラキシー、薬剤反応、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、ドライアイ疾患［又は乾燥性角膜炎（ＫＣＳ）（乾性角膜炎、眼球乾燥症とも呼ばれる）と呼ばれるその他の疾患］、アレルギー性接触アレルギー、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、昆虫毒アレルギー及び気道炎症に関連する呼吸器疾患、例えば、ＩｇＥ媒介喘息及び非ＩｇＥ媒介喘息を含むが、これらに限定されない。気道炎症に関連する呼吸器疾患は、鼻炎、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性（外因性）喘息、非アレルギー性（内因性）喘息、職業性喘息、アトピー性喘息、運動誘発喘息、咳誘発喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含むが、これらに限定されない。
【0093】
本発明の更なる目的は、外因的に投与される分子に対する免疫反応の治療又は予防を必要とする対象における該免疫反応を治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の制御性Ｔ細胞を対象に投与する工程を含み、ここで、制御性Ｔ細胞の集団は、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされている、方法に関する。
【0094】
一部の実施態様では、リンホトキシンアルファ遮断剤は、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）である。
【0095】
この種の非限定的な例は、遺伝的欠損症に関する補充療法に対する免疫反応を含む。遺伝的欠損症は、血友病Ａ、血友病Ｂ、他の凝固因子、例えば、第ＩＩ因子、プロトロンビン及びフィブリノーゲンの先天的欠損、原発性免疫不全症（例えば、重症複合免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ欠損症）、原発性ホルモン欠損症、例えば、成長ホルモン欠損症及びレプチン欠損症、先天性酵素異常症及び代謝障害、例えば、炭水化物代謝障害（例えば、スクロース－イソマルターゼ欠損症、糖原病）、アミノ酸代謝障害（例えば、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、１型グルタル酸血症）、尿素サイクル障害（例えば、カルバモイルリン酸シンターゼＩ欠損症）、有機酸代謝障害（例えば、アルカプトン尿症、２－ヒドロキシグルタル酸尿症、脂肪酸酸化及びミトコンドリア代謝障害（例えば、中鎖アシルコエンザイムＡデヒドロゲナーゼ欠損症）、ポルフィリン代謝障害（例：ポルフィリン症）、プリン又はピリミジン代謝障害（例えば、レッシュ－ナイハン症候群）、ステロイド代謝障害（例えば、リポイド先天性副腎過形成、先天性副腎過形成）、ミトコンドリア機能障害（例えば、カーンズ－セイヤー症候群）、ペルオキシソーム機能障害（例えば、ツェルウェーガー症候群）、リソソーム蓄積障害（例えば、ゴーシェ病、ニーマンピック病）を含むが、これらに限定されない。
【0096】
本発明の更なる目的は、移植組織又は移植細胞に対する免疫反応の治療又は予防を必要とする対象における該免疫反応を治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の制御性Ｔ細胞を対象に投与する工程を含み、ここで、制御性Ｔ細胞の集団は、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされている、方法に関する。
【0097】
一部の実施態様では、リンホトキシンアルファ遮断剤は、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）である。
【0098】
本明細書で使用する場合、「移植」という用語は、第１の生物（又はドナー）から得ることができ、第２の生物（又はレシピエント）に移植することができる臓器及び／又は組織及び／又は細胞を指す。典型的には、対象に、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、膵島、脳組織、胃、大腸、小腸、角膜、皮膚、気管、骨、骨髄、筋肉又は膀胱からなる群より選択される移植片を移植することができる。また、本発明の方法は、レシピエント対象によるドナー組織、細胞、移植片又は臓器移植の拒絶に関連する免疫応答を予防し又は抑制するのにも特に適している。移植片関連疾患又は障害は、骨髄移植に関連するような移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及び例えば、皮膚、筋肉、ニューロン、膵島、臓器、肝臓の実質細胞等の移植片を含む臓器、組織又は細胞移植片移植（例えば、組織又は細胞同種移植片又は異種移植片）の拒絶を生じ又は拒絶に関連する免疫障害を含む。このため、本発明の方法は、宿主対移植片病（ＨＶＧＤ）及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防するのに有用である。キメラ構築物を移植前、移植中及び／又は移植後（例えば、移植の少なくとも１日前、移植の少なくとも１日後及び／又は移植法自体の間）に対象に投与することができる。一部の実施態様では、キメラ構築物を移植前及び／又は移植後に定期的に対象に投与することができる。
【0099】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、ほ乳類、例えば、げっ歯類、ネコ、イヌ及び霊長類を指す。好ましくは、本発明の対象は、ヒトである。
【0100】
本明細書で使用する場合、「処置」又は「処置する」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的で、有益な又は所望の臨床結果は、下記：疾患から生じる１つ以上の症状を軽減すること、疾患の程度を減少させること、疾患を安定化させること（例えば、疾患の悪化を予防し又は遅延させること）、疾患の広がりを予防しもしくは遅延させること、疾患の再発を予防しもしくは遅延させること、疾患の進行を遅延させもしくは遅くさせること、疾患状態を改善すること、疾患の寛解（部分的又は全体的）を提供すること、疾患を処置するのに必要とされる１つ以上の他の薬剤の用量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、生活の質を向上させること及び／又は生存を延長することのうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。「処置」という用語は、予防的処置を包含する。本明細書で使用する場合、「予防する」又は「予防」という用語は、所定の状態を獲得する又は発症するリスクの減少を指す。
【0101】
本明細書で使用する場合、「投与する」又は「投与」という用語は、体外に存在する物質を対象内に、例えば、粘膜、皮内、静脈内、皮下、筋肉内送達及び／又は本明細書に記載されるかもしくは当技術分野において公知の任意の他の物理的送達方法により、注入し又は何等かの方法で物理的に送達する行為を指す。疾患又はその症状が処置される場合、物質の投与を典型的には、疾患又はその症状の発症後に行う。疾患又はその症状が防止される場合、物質の投与を典型的には、疾患又はその症状の発症前に行う。
【0102】
「治療上有効量」は、「改善された治療アウトカム」が得られるように、当業者により日常的に利用される手法を使用して決定される。ただし、本発明の組成物の毎日の用法は全体として、正しい医学的判断の範囲内で主治医により決定されるであろうことが理解されるであろう。任意の特定の対象についての特定の治療上有効用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；利用される特定の化合物の活性；利用される特定の組成物；対象の年齢、体重、健康全般、性別及び食事；投与期間、投与経路並びに利用される特定の化合物の排泄速度；処置の期間；組み合わせて使用される薬剤並びに医療分野において周知の要因をも含む各種の要因により決まるであろう。本発明によれば、制御性Ｔ細胞を１～５００μg/ml 可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）の広範囲にわたって、５～１２０分の広範囲の時間インキュベーションすることができる。このため、制御性Ｔ細胞を１、２、５、１０、３０、５０、１００、１５０、２００又は５００μg/mlと共に、５、１０、３０、６０、９０又は１２０分間インキュベーションすることができる。
【0103】
一部の実施態様では、制御性Ｔ細胞を５０μg/ml 可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）と共に３０分間インキュベーションする。
【0104】
自然免疫系は、組織治癒過程に関与することが周知であるが、適応免疫系が、キープレイヤーとして最近出現してきた。Ｔ細胞、特に、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、種々の臓器系の修復及び再生を促進することが示されている（１５）。このため、本発明の更なる目的は、再生療法に使用するための、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされ、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現するか又は発現しない、制御性Ｔ細胞の集団に関する。
【0105】
本明細書で使用する場合、「再生療法」という用語は、正常な機能を回復させ又は確立するために、ヒト又は動物の細胞、組織又は臓器を再生するプロセスを指す。再生医療は、加齢、疾患又は外傷により損傷した組織及び臓器を治癒し又は置き換え、先天性欠損を正常化する可能性を有する。この分野には、以前は回復不能であった組織又は臓器を機能的に治癒させるために、身体自身の修復機構を刺激することにより、損傷した組織及び臓器を工学的に改良するという見込みがある。
【0106】
再生療法は、組織治癒プロセス、例えば、皮膚再生並びに臓器再生、例えば、心筋再生、肝臓再生、腎臓再生、膵臓再生、肺再生、毛包再生、心臓再生；膀胱再生；筋肉再生（例えば、骨格筋再生及び心筋再生）、骨再生及び中枢神経系再生を含むが、これらに限定されない。
【0107】
一部の実施態様では、再生療法は、筋肉再生、皮膚再生、骨再生又は中枢神経系再生である。
【0108】
使用する場合、「臓器又は組織再生」という用語は、臓器又は組織における分化した常在細胞の増殖活性を再開始させ、臓器損傷後の細胞のそれらの多量の喪失を置き換えることを指す。
【0109】
本明細書で使用する場合、「臓器損傷」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、臓器の細胞に対する任意の種類の可逆的又は不可逆的損傷を指す。臓器損傷は、任意の状態により生じる場合がある。典型的な臓器損傷は、アブレーション療法（例えば、骨髄移植（ＢＭＴ）に対して患者が準備するのに必要なもの等）、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに関連する合併症、加齢過程、栄養不良及び放射線中毒を含む。また、この用語は、加齢に関連する退縮、すなわち、加齢に伴う臓器の漸進的な収縮を含む。臓器損傷、例えば、胸腺損傷は、例えば、医学的処置としての放射線照射により生じる場合がある。放射線照射で部分的に処置される疾患の例は、ガン、例えば、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、神経芽腫、卵巣ガン、胚細胞腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性リンパ性白血病、若年性慢性骨髄性白血病及び他の疾患、例えば、自己免疫障害、アミロイドーシス、再生不良性貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ファンコニ貧血、ブラックファン－ダイアモンド貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症、ヴィスコット－オールドリッチ症候群、先天性代謝異常症を含むが、これらに限定されない。
【0110】
一部の実施態様では、臓器損傷は、虚血によっても生じる場合がある。虚血は、可逆的又は持続的（すなわち、永続的）虚血であることができる。持続性虚血は、臓器が血液により不適切に供給され、このため、安静時の対象においても低酸素状態にあることを特徴とする。
【0111】
一部の実施態様では、臓器損傷は、任意の形態の化学的もしくは物理的物質、例えば、薬剤、環境毒物又は対象に接触し、臓器もしくは組織への損傷を直接的もしくは間接的に生じる任意の他の物質により生じる場合がある。また、対象の治療的処置、例えば、臓器の細胞アポトーシスの誘導をもたらす処置（例えば、化学療法）等の成功により生じる損傷も含まれる。
【0112】
このため、本発明は、組織又は臓器を再生するのに使用するための、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされ、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現するか又は発現しない、制御性Ｔ細胞の集団に関する。
【0113】
一部の実施態様では、臓器又は組織は、骨格筋、心筋、骨、皮膚又は中枢神経系である。
【0114】
このため、本発明は、骨格筋、心筋、骨、皮膚又は中枢神経系を再生するのに使用するための、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされ、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現するか又は発現しない、制御性Ｔ細胞の集団に関する。
【0115】
本発明によれば、本発明の制御性Ｔ細胞の集団は、医薬組成物の形態で対象に投与される。
【0116】
したがって、本発明の更なる目的は、有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされた制御性Ｔ細胞の集団及び／又は有効量のリンホトキシンアルファ遮断剤と共に予めインキュベーションされ、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現する制御性Ｔ細胞の集団を含む、医薬組成物に関する。
【0117】
一部の実施態様では、リンホトキシンアルファ遮断剤は、可溶性リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）である。
【0118】
このため、本発明は、有効量の可溶性ＬＴβＲと共に予めインキュベーションされた制御性Ｔ細胞の集団及び／又は有効量の可溶性ＬＴβＲと共に予めインキュベーションされ、自己抗原を認識する／自己抗原に結合するＴＣＲ又はキメラ抗原レセプターを発現する制御性Ｔ細胞の集団を含む、医薬組成物に関する。
【0119】
典型的には、Ｔｒｅｇの集団を薬学的に許容し得る賦形剤及び場合により、徐放性マトリックス、例えば、生分解性ポリマーと組み合わせて、治療組成物を形成することができる。「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、ほ乳類、特に、ヒトに適宜投与された場合に、有害なアレルギー性又は他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意のタイプの無毒性固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料又は製剤補助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の医薬組成物において、有効成分を単独で又は別の有効成分と組み合わせて、単位投与形態で、従来の医薬支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、経口経路形態、例えば、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤及び経口懸濁剤又は液剤、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下及び鼻腔内投与形態並びに直腸投与形態を含む。
【0120】
一実施態様では、本発明のＴｒｅｇ集団は、非経口経路により投与される。好ましい実施態様では、本発明のＴｒｅｇ集団は、静脈内経路により投与される。
【0121】
典型的には、該医薬組成物は、注射製剤のための薬学的に許容し得る媒体を含有する。これらは、特に、等張性で無菌の生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウム等又はこのような塩の混合物）又は乾燥、特に、凍結乾燥組成物であることができる。これらは、場合に応じて、滅菌水又は生理食塩水の添加により、注射溶液の構成が可能となる。注射液用途に適した薬学的形態は、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナツ油又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び注射溶液又は懸濁液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合に、この形態は滅菌され、容易に注入できる程度の液状でなければならない。この形態は、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染作用に対して保持されなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩としての本発明の溶液を界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適切に混合された水中で調製することができる。また、分散液をグリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれら混合物中並びに油中で調製することもできる。保存及び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。Ｔｒｅｇの集団は、中性形態又は塩形態にある組成物に製剤化することができる。薬学的に許容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含む。酸付加塩は、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸等又は有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等と形成される。また、遊離カルボキシル基と形成される塩も、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄等及び有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等から得ることができる。また、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることもできる。適切な流動性を例えば、レシチン等の被覆の使用により、懸濁液の場合には必要な粒径の維持により及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止を種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含ませるのが好ましいであろう。注射可能な組成物の延長された吸収を、吸収を遅延させる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアラート及びゼラチンを組成物に使用することによりもたらすことができる。無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒中に、必要に応じて上記列記された他の成分の幾つかと共に包含させ、続けて、ろ過滅菌することにより調製される。一般的には、分散液は、基本的な分散媒体及び上記列記されたものからの必要とされる他の成分を含有する無菌媒体に種々の滅菌された有効成分を包含させることにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の典型的な方法は、その予めろ過滅菌された溶液から有効成分と任意の更なる所望の成分との粉末を生成する真空乾燥技術及び凍結乾燥技術である。直接注射のためのより多くの又は高度に濃縮された溶液の調製も企図される。この場合、溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、非常に迅速な浸透を生じ、小さな腫瘍領域に高濃度の活性剤を送達することが想定される。製剤に応じて、液剤は、投与製剤に適合した様式でかつ治療上有効なような量で投与されるであろう。製剤は、各種の剤形、例えば、上記された注射溶液のタイプで容易に投与されるが、薬剤放出カプセル等も利用することができる。水溶液中での非経口投与のために、例えば、液剤を必要に応じて適切に緩衝化させるべきであり、まず、液体希釈剤を十分な生理食塩液又はグルコースにより等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。この関係で、利用することができる無菌水性媒体は、本開示を考慮して、当業者に公知であろう。処置される対象の状態に応じて、ある程度の用量の変更が必然的に生じるであろう。いずれにしても、投与責任者が、個々の対象に適した用量を決定するであろう。
【0122】
本発明を下記図面及び実施例によりさらに説明するものとする。ただし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0123】
【図1】図１．ＬＴα－／－Ｔｒｅｇの養子移入によりＤＳＳ誘発大腸炎の重症度が保護される。（Ａ）ＷＴ及びＬＴα－／－マウス由来の精製脾臓ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現の代表的なフローサイトメトリープロファイル。（Ｂ）実験設定：２×１０５個のＷＴ又はＬＴα－／－Ｔｒｅｇを２日前に注入したＷＴマウスにおいて、飲料水中の２％ ＤＳＳを７日間投与し、続けて、水のみを１１日目まで投与することにより、大腸炎を誘発した。結腸炎症及び腸間膜リンパ節におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞プライミングをプロトコールの１１日目及び４日目のそれぞれに分析した。（Ｃ）２×１０５個のＷＴ又はＬＴα－／－Ｔｒｅｇを注入したＷＴマウスの０日目での初期体重に対する体重減少。データを、群あたりに４匹のマウスを使用した３回の独立した実験から得る。（Ｄ）疾患活動性指数（ＤＡＩ）をＤＳＳ誘発大腸炎の経過中にモニターした。（Ｅ）ヒストグラムは、両群のマウスにおける結腸の組織学的スコアを示す。
【図2】図２．可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃ融合タンパク質と共に予めインキュベーションされたＷＴ Ｔｒｅｇの養子移入によりＤＳＳ誘発大腸炎が減弱される。（Ａ）実験設定：ＬＴβＲ－Ｆｃタンパク質で予めインキュベーションされもしくはインキュベーションされなかった２×１０５個のＷＴ Ｔｒｅｇのいずれか又はＬＴα－／－Ｔｒｅｇを２日前に注入したＷＴマウスにおいて、飲料水中の２％ ＤＳＳを７日間投与し、続けて、水のみを１１日目まで投与することにより、大腸炎を誘発した。体重を毎日モニターし、結腸の長さをプロトコールの１１日目に測定した。（Ｂ）可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃタンパク質で予めインキュベーションされもしくはインキュベーションされなかったＷＴ Ｔｒｅｇのいずれか又はＬＴα－／－Ｔｒｅｇを注入したＷＴマウスの０日目での初期体重に対する体重減少。データを、群あたりに３～９匹のマウスを使用した１回の独立した実験から得る。（Ｃ）ヒストグラムは、実験プロトコールの最後に観察された結腸の長さを示す。
【0124】
実施例
材料及び方法
マウス
全てのマウス－ＣＤ４５．１ ＷＴ、ＣＤ４５．１×ＣＤ４５．２ ＷＴ、ＣＤ４５．２ ＷＴ及びＣＤ４５．２ ＬＴα－／－マウスを純粋なＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおき、ＣＩＭＬ（フランス）での特定の無菌条件下で維持した。標準的な食物及び水を自由に与えた。オス及びメスを、６～８週齢で使用した。動物に関わる全ての手法を施設及び倫理ガイドラインに準拠して行った。
材料及び方法
マウス
全てのマウス－ＣＤ４５．１ ＷＴ、ＣＤ４５．１×ＣＤ４５．２ ＷＴ、ＣＤ４５．２ ＷＴ及びＣＤ４５．２ ＬＴα－／－マウスを純粋なＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおき、ＣＩＭＬ（フランス）での特定の無菌条件下で維持した。標準的な食物及び水を自由に与えた。オス及びメスを、６～８週齢で使用した。動物に関わる全ての手法を施設及び倫理ガイドラインに準拠して行った。
【0125】
Ｔｒｅｇ細胞単離
脾臓Ｔｒｅｇ細胞を、７０μmメッシュを通して脾臓を引っ掻くことにより単離した。脾臓赤血球を溶解バッファー（eBioscience）により溶解した。細胞選別の前に、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、AutoMACS（Miltenyi Biotech）による抗ビオチンマイクロビーズを伴う抗ＣＤ８α（クローン５３．６．７）及び抗ＣＤ１９（クローン１Ｄ３）ビオチン化抗体を使用して、ＣＤ８＋及びＣＤ１９＋細胞を枯渇させることにより、枯渇プログラムを介して予め濃縮した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇを、FACSAriaIIIセルソーター（BD）を使用して選別した。
脾臓Ｔｒｅｇ細胞を、７０μmメッシュを通して脾臓を引っ掻くことにより単離した。脾臓赤血球を溶解バッファー（eBioscience）により溶解した。細胞選別の前に、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を、AutoMACS（Miltenyi Biotech）による抗ビオチンマイクロビーズを伴う抗ＣＤ８α（クローン５３．６．７）及び抗ＣＤ１９（クローン１Ｄ３）ビオチン化抗体を使用して、ＣＤ８＋及びＣＤ１９＋細胞を枯渇させることにより、枯渇プログラムを介して予め濃縮した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇを、FACSAriaIIIセルソーター（BD）を使用して選別した。
【0126】
ＤＳＳ誘発大腸炎実験
大腸炎の誘発の２日前に、ＷＴレシピエントマウスに、ＷＴ又はＬＴα－／－マウスから選別された２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを静脈内注入した。大腸炎の誘発を、飲料水中の２％ ＤＳＳ（Alfa Aesar）を７日間与え、続けて、１１日目に殺処分するまで水のみを与えることにより評価した。体重、直腸出血及び便の硬さをＤＳＳ投与後毎日モニターし、ＤＡＩを決定するのに使用した。
大腸炎の誘発の２日前に、ＷＴレシピエントマウスに、ＷＴ又はＬＴα－／－マウスから選別された２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを静脈内注入した。大腸炎の誘発を、飲料水中の２％ ＤＳＳ（Alfa Aesar）を７日間与え、続けて、１１日目に殺処分するまで水のみを与えることにより評価した。体重、直腸出血及び便の硬さをＤＳＳ投与後毎日モニターし、ＤＡＩを決定するのに使用した。
【0127】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養アッセイ
共培養アッセイのために、２．１０３個の細胞選別総ＣＤ１１ｃｈｉ樹状細胞を可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃリコンビナントタンパク質（２μg/ml；R&D systems）と共に１時間予めインキュベーションされ又はされなかった１０４個の精製ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇと共に、３７℃で２４時間共培養した。
共培養アッセイのために、２．１０３個の細胞選別総ＣＤ１１ｃｈｉ樹状細胞を可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃリコンビナントタンパク質（２μg/ml；R&D systems）と共に１時間予めインキュベーションされ又はされなかった１０４個の精製ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇと共に、３７℃で２４時間共培養した。
【0128】
ＤＳＳ誘発大腸炎モデルにおける可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃタンパク質とのＴｒｅｇ細胞インキュベーション
ＣＤ４５．２ ＷＴマウスから精製された２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃ融合タンパク質（５０μg/ml；R&D Systems）と共に又は伴わずに、培養培地（１０％ ＦＢＳ（Sigma Aldrich）、２mM Ｌ－グルタミン（ThermoFisher）、１mM ピルビン酸ナトリウム（ThermoFisher）及び２×１０－５M ２－メルカプトエタノール（ThermoFisher）を含むRPMI ThermoFisher）中で３０分間予めインキュベーションし又はインキュベーションしなかった。ついで、ＴｒｅｇをＣＤ４５．２ ＷＴレシピエントに養子的に静脈内移入した。ＬＴα－／－マウス由来の２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを対照として使用した。２日後、大腸炎を、飲料水中の２％ ＤＳＳ（Alfa Aesar）を７日間与え、続けて、１１日目に殺処分するまで水のみを与えることにより誘発した。体重をＤＳＳ投与後毎日モニターした。
ＣＤ４５．２ ＷＴマウスから精製された２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃ融合タンパク質（５０μg/ml；R&D Systems）と共に又は伴わずに、培養培地（１０％ ＦＢＳ（Sigma Aldrich）、２mM Ｌ－グルタミン（ThermoFisher）、１mM ピルビン酸ナトリウム（ThermoFisher）及び２×１０－５M ２－メルカプトエタノール（ThermoFisher）を含むRPMI ThermoFisher）中で３０分間予めインキュベーションし又はインキュベーションしなかった。ついで、ＴｒｅｇをＣＤ４５．２ ＷＴレシピエントに養子的に静脈内移入した。ＬＴα－／－マウス由来の２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを対照として使用した。２日後、大腸炎を、飲料水中の２％ ＤＳＳ（Alfa Aesar）を７日間与え、続けて、１１日目に殺処分するまで水のみを与えることにより誘発した。体重をＤＳＳ投与後毎日モニターした。
【0129】
フローサイトメトリー
抗ＣＤ４（ＲＭ４．５）抗体をBDから得た。Ｆｏｘｐ３抗体による細胞内染色のために、細胞を固定し、透過性にし、製造メーカー（eBioscience）の説明書に従って、Ｆｏｘｐ３染色キットにより染色した。染色された細胞をFACSCanto II（BD）により分析し、データを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
抗ＣＤ４（ＲＭ４．５）抗体をBDから得た。Ｆｏｘｐ３抗体による細胞内染色のために、細胞を固定し、透過性にし、製造メーカー（eBioscience）の説明書に従って、Ｆｏｘｐ３染色キットにより染色した。染色された細胞をFACSCanto II（BD）により分析し、データを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
【0130】
定量ＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡを、TRIzol（Invitrogen）を使用して単離し、ｃＤＮＡを、ランダムオリゴｄＴプライマー及びSuperscript II逆転写酵素（Invitrogen）を使用して合成した。ｑＰＣＲを、ABI 7500高速リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystem）上でのSYBR Premix Ex Taqマスターミックス（Takara）を使用して行った。結果をアクチンｍＲＮＡに対して正規化した。
全ＲＮＡを、TRIzol（Invitrogen）を使用して単離し、ｃＤＮＡを、ランダムオリゴｄＴプライマー及びSuperscript II逆転写酵素（Invitrogen）を使用して合成した。ｑＰＣＲを、ABI 7500高速リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystem）上でのSYBR Premix Ex Taqマスターミックス（Takara）を使用して行った。結果をアクチンｍＲＮＡに対して正規化した。
【0131】
統計的分析
統計的有意差を、GraphPad Prism 6ソフトウェアを使用し、独立スチューデントｔ検定又はマン－ホイットニー検定を使用して評価した。ボンフェローニ補正による二方向Ａｎｏｖａ検定を、腫瘍増殖、体重減少及びＤＡＩの分析に使用した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。データの正規分布を、ダゴスティーノ－ピアソンオムニバス正規性検定を使用して評価した。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表わす。
統計的有意差を、GraphPad Prism 6ソフトウェアを使用し、独立スチューデントｔ検定又はマン－ホイットニー検定を使用して評価した。ボンフェローニ補正による二方向Ａｎｏｖａ検定を、腫瘍増殖、体重減少及びＤＡＩの分析に使用した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。データの正規分布を、ダゴスティーノ－ピアソンオムニバス正規性検定を使用して評価した。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表わす。
【0132】
結果
ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入により潰瘍性大腸炎から保護される
ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが、Ｔｒｅｇ抑制機能に関与する幾つかの遺伝子を高発現することを考慮して（データを示さず）、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎から保護するための治療的利益を示すかどうかを評価した。ＷＴ又はＬＴα－／－マウスから精製されたＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇを主に含有する２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（図１Ａ）を、２％ ＤＳＳによる大腸炎の誘発２日前にＷＴレシピエントマウスに注入した（図１Ｂ）。ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが注入されたマウスが、ＷＴ Ｔｒｅｇが注入されたマウスより有意に体重減少が少ないことが観察された（図１Ｃ）。さらに、便の硬さ、直腸出血及び体重減少を組み合わせた疾患活動性指数（ＤＡＩ）は、これらのマウスでは実質的に重要性が低かった（図１Ｄ）。体重減少及びＤＡＩに従って、これらのマウスでは、実験終了時に結腸上皮の損傷が少なく（データを示さず）、大腸炎の組織学的スコアが低下した（図１Ｅ）。また、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが移入されたマウスの結腸における炎症促進性サイトカイン、例えば、Ｉｌ６、Ｉｆｎγ、Ｔｎｆ－α、Ｉｌ１７Ａ、Ｉｌ１α及びＩｌ３３並びに免疫細胞のリクルートに関与するケモカイン、例えば、Ｃｃｌ２及びＣｘｃｌ１２の発現の低下が観察された（データを示さず）。さらに、フローサイトメトリーにより結腸浸潤免疫細胞の性質を分析した。好中球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の数は、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが移入されたマウスでは、ＷＴ Ｔｒｅｇが移入されたマウスと比較して劇的に減少した（データを示さず）。ＣＤ３＋及びＢ２２０＋細胞における浸潤の減少が、組織学的結腸切片で確認された（データを示さず）。Ｔｈ１及びＴｈ１７エフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞の数も減少した（データを示さず）。その結果、Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１及びＴｒｅｇ／Ｔｈ１７比が、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが移入されたマウスの結腸において上昇した（データを示さず）。ついで、養子移入された細胞数を２．１０５個から１．１０５個に、ついで、０．５．１０５個に減らすことにより、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが大腸炎に対する保護の可能性を評価した。１．１０５個のＬＴα－／－ Ｔｒｅｇであっても、重量減少の低減を特徴とする２．１０５個のＷＴ Ｔｒｅｇより良好な保護を示すことが観察された（データを図示せず）。興味深いことに、０．５．１０５個のＬＴα－／－ Ｔｒｅｇは、２．１０５個のＷＴ Ｔｒｅｇと同じ保護効果を示す。これは、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが、対応するＷＴよりｉｎ ｖｉｖｏにおいて、約４倍抑制性であることを示す。
ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入により潰瘍性大腸炎から保護される
ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが、Ｔｒｅｇ抑制機能に関与する幾つかの遺伝子を高発現することを考慮して（データを示さず）、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入は、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎から保護するための治療的利益を示すかどうかを評価した。ＷＴ又はＬＴα－／－マウスから精製されたＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇを主に含有する２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（図１Ａ）を、２％ ＤＳＳによる大腸炎の誘発２日前にＷＴレシピエントマウスに注入した（図１Ｂ）。ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが注入されたマウスが、ＷＴ Ｔｒｅｇが注入されたマウスより有意に体重減少が少ないことが観察された（図１Ｃ）。さらに、便の硬さ、直腸出血及び体重減少を組み合わせた疾患活動性指数（ＤＡＩ）は、これらのマウスでは実質的に重要性が低かった（図１Ｄ）。体重減少及びＤＡＩに従って、これらのマウスでは、実験終了時に結腸上皮の損傷が少なく（データを示さず）、大腸炎の組織学的スコアが低下した（図１Ｅ）。また、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが移入されたマウスの結腸における炎症促進性サイトカイン、例えば、Ｉｌ６、Ｉｆｎγ、Ｔｎｆ－α、Ｉｌ１７Ａ、Ｉｌ１α及びＩｌ３３並びに免疫細胞のリクルートに関与するケモカイン、例えば、Ｃｃｌ２及びＣｘｃｌ１２の発現の低下が観察された（データを示さず）。さらに、フローサイトメトリーにより結腸浸潤免疫細胞の性質を分析した。好中球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の数は、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが移入されたマウスでは、ＷＴ Ｔｒｅｇが移入されたマウスと比較して劇的に減少した（データを示さず）。ＣＤ３＋及びＢ２２０＋細胞における浸潤の減少が、組織学的結腸切片で確認された（データを示さず）。Ｔｈ１及びＴｈ１７エフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞の数も減少した（データを示さず）。その結果、Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１及びＴｒｅｇ／Ｔｈ１７比が、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが移入されたマウスの結腸において上昇した（データを示さず）。ついで、養子移入された細胞数を２．１０５個から１．１０５個に、ついで、０．５．１０５個に減らすことにより、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが大腸炎に対する保護の可能性を評価した。１．１０５個のＬＴα－／－ Ｔｒｅｇであっても、重量減少の低減を特徴とする２．１０５個のＷＴ Ｔｒｅｇより良好な保護を示すことが観察された（データを図示せず）。興味深いことに、０．５．１０５個のＬＴα－／－ Ｔｒｅｇは、２．１０５個のＷＴ Ｔｒｅｇと同じ保護効果を示す。これは、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが、対応するＷＴよりｉｎ ｖｉｖｏにおいて、約４倍抑制性であることを示す。
【0133】
次に、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入により、ＤＳＳ投与５日後に腸間膜リンパ節におけるＣＤ４＋ Ｔ細胞プライミングが阻害されるかどうかをさらに決定した。注目すべきことに、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが注入されたマウスが、既にこの時点で、より長い結腸長及び結腸重量／長さ比の低下を示したことが見出された。これは、結腸炎症の減弱を示す（データを示さず）。驚くべきことに、Ｔｈ１及びＴｈ１７エフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞数は、これらのマウスの腸間膜リンパ節において実質的に減少した（データを示さず）。これは、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇにより、ナイーブＣＤ４＋ Ｔ細胞のエフェクターへの変換が阻害されることを示す。要するに、これらのデータから、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入により、腸間膜リンパ節における結腸炎症及び病原性ＣＤ４＋ Ｔ細胞のプライミングを緩和することにより潰瘍性大腸炎の発症から保護されることが示される。
【0134】
可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃ融合タンパク質と共に予めインキュベーションされたＷＴ Ｔｒｅｇの養子移入によりＤＳＳ誘発大腸炎が減弱する
次に、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃ融合タンパク質と共に予めインキュベーションされたＴｒｅｇの養子移入が、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎から保護する治療的利益を示すかどうかを評価した。ＬＴα－／－又はＷＴマウスから精製されたＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇを主に含有する２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（図１Ａ）を、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃ融合タンパク質と共に又は伴わずに、培地媒体中で３０分間予めインキュベーションした。２％ ＤＳＳにより大腸炎を誘発する２日前に、ＴｒｅｇをＷＴレシピエントマウスに注入した（図２Ａ）。ＬＴβＲ－Ｆｃで予めインキュベーションされたＴｒｅｇが注入されたマウスでは、ＬＴα－／－が注射されたマウスと同様に、ＷＴ Ｔｒｅｇが注入されたマウスより有意に体重減少が少なかったことが観察された（図２Ｂ）。さらに、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃで予めインキュベーションされたＴｒｅｇが注入されたマウスの結腸は、ＷＴ Ｔｒｅｇが注入されたマウスより有意に長い。一方、ＬＴα－／－が注入されたマウスの長さと同様である（図２Ｃ）。
次に、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃ融合タンパク質と共に予めインキュベーションされたＴｒｅｇの養子移入が、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎から保護する治療的利益を示すかどうかを評価した。ＬＴα－／－又はＷＴマウスから精製されたＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇを主に含有する２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞（図１Ａ）を、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃ融合タンパク質と共に又は伴わずに、培地媒体中で３０分間予めインキュベーションした。２％ ＤＳＳにより大腸炎を誘発する２日前に、ＴｒｅｇをＷＴレシピエントマウスに注入した（図２Ａ）。ＬＴβＲ－Ｆｃで予めインキュベーションされたＴｒｅｇが注入されたマウスでは、ＬＴα－／－が注射されたマウスと同様に、ＷＴ Ｔｒｅｇが注入されたマウスより有意に体重減少が少なかったことが観察された（図２Ｂ）。さらに、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃで予めインキュベーションされたＴｒｅｇが注入されたマウスの結腸は、ＷＴ Ｔｒｅｇが注入されたマウスより有意に長い。一方、ＬＴα－／－が注入されたマウスの長さと同様である（図２Ｃ）。
【0135】
要するに、これらのデータから、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃと共に予めインキュベーションされたＷＴ Ｔｒｅｇの養子移入により、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇと同程度に効果的に潰瘍性大腸炎の発症から保護されることが示される。
【0136】
造血細胞におけるＬＴα発現及びＬＴα１β２／ＬＴβＲ軸によりＴｒｅｇ細胞の抑制サインが負に制御される
ＬＴα－／－マウスが、無秩序な胸腺及び脾臓微小環境を示すため、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの高度免疫抑制表現型における非造血間質細胞の寄与を分析した。このために、致死的に照射されたＣＤ４５．２ ＷＴ又はＬＴα－／－レシピエントマウスをＣＤ４５．１コンジェニックマウス（それぞれＷＴ ＣＤ４５．１：ＷＴ及びＷＴ ＣＤ４５．１：ＬＴα－／－マウス）からのＷＴ ＢＭ細胞で再構成した骨髄（ＢＭ）キメラを生成した。ＢＭ移植の６週間後、ＣＤ４５．１ドナー起源のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞を脾臓から細胞選別し、Ｔｒｅｇエフェクター機能に関連する幾つかの遺伝子の発現について分析した（データを示さず）。同様の頻度及び数のＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇが、両群のマウスにおいて観察された（データを示さず）。さらに、幾つかの遺伝子、例えば、Ｋｌｒｇ１、Ｔｇｆｂ、Ｇｚｍｂ及びＦａｓｌの発現は、両群のマウスで類似していた。これは、非造血細胞がＬＴα－／－マウスで観察されたＴｒｅｇの高度な抑制サインに関与していないことを示す（データを示さず）。
ＬＴα－／－マウスが、無秩序な胸腺及び脾臓微小環境を示すため、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの高度免疫抑制表現型における非造血間質細胞の寄与を分析した。このために、致死的に照射されたＣＤ４５．２ ＷＴ又はＬＴα－／－レシピエントマウスをＣＤ４５．１コンジェニックマウス（それぞれＷＴ ＣＤ４５．１：ＷＴ及びＷＴ ＣＤ４５．１：ＬＴα－／－マウス）からのＷＴ ＢＭ細胞で再構成した骨髄（ＢＭ）キメラを生成した。ＢＭ移植の６週間後、ＣＤ４５．１ドナー起源のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞を脾臓から細胞選別し、Ｔｒｅｇエフェクター機能に関連する幾つかの遺伝子の発現について分析した（データを示さず）。同様の頻度及び数のＦｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇが、両群のマウスにおいて観察された（データを示さず）。さらに、幾つかの遺伝子、例えば、Ｋｌｒｇ１、Ｔｇｆｂ、Ｇｚｍｂ及びＦａｓｌの発現は、両群のマウスで類似していた。これは、非造血細胞がＬＴα－／－マウスで観察されたＴｒｅｇの高度な抑制サインに関与していないことを示す（データを示さず）。
【0137】
次に、致死的に照射されたＣＤ４５．１×ＣＤ４５．２ ＷＴレシピエントマウスをＷＴ ＣＤ４５．１及びＷＴ ＣＤ４５．２（ＷＴドナー群）又はＷＴ ＣＤ４５．１及びＬＴα－／－ ＣＤ４５．２（ＬＴα－／－ドナー群）からのＢＭ細胞（５０：５０）で再構成した混合骨髄キメラを生成することにより、造血区画のそれぞれの寄与を決定した（データを示さず）。６週間後、脾臓におけるＷＴ ＣＤ４５．２ ＢＭ細胞に由来するものと比較して、ＬＴα－／－ ＣＤ４５．２ ＢＭ細胞に由来するＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇの頻度及び数の増加が見出された（データを示さず）。驚くべきことに、精製されたＬＴα－／－ ＣＤ４５．２ Ｔｒｅｇにより、ＷＴ ＣＤ４５．２ Ｔｒｅｇと比較して、Ｉｌ１０、Ｅｂｉ３、Ｔｇｆｂ１、Ｉｆｎｇ、Ｇｚｍｂ及びＦａｓｌ遺伝子の発現の向上が示された（図３Ａ）。これらのデータから、造血細胞におけるＬＴαの発現により、Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制サインが負に制御されることが示される。
【0138】
Ｔｒｅｇが、ＬＴαを膜アンカーＬＴα１β２ヘテロ複合体として発現することが観察されたため（データを示さず）、Ｔｒｅｇの抑制サインの制御におけるＬＴα１β２／ＬＴβＲ軸の寄与を評価した。特に、Ｔｒｅｇと樹状細胞との間のＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用の遮断が、Ｔｒｅｇ細胞の抑制サインに影響を及ぼすかどうかを分析した。このため、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃ融合タンパク質と共に予めインキュベーションされ又はインキュベーションされていない精製されたＷＴ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇを、精製されたＣＤ１１ｃ＋樹状細胞と共培養した。興味深いことに、ＬＴβＲ－Ｆｃと共に予めインキュベーションされたＴｒｅｇにより、予め処理されていないＴｒｅｇと比較して、Ｔｒｅｇ抑制機能に関連する幾つかの遺伝子、例えば、Ｋｌｒｇ１、Ｉｌ１０、Ｅｂｉ３、Ｔｇｆｂ１、Ｇｚｍｂ及びＦａｓｌの発現がアップレギュレーションされた（図３Ｂ）。このように、これらのデータから、Ｔｒｅｇと樹状細胞との間のＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用により、Ｔｒｅｇの抑制サインが負にレギュレーションされることが示される。
【0139】
ＬＴαの発現は末梢血由来のヒトＴｒｅｇにおいて保存されている
次に、ＬＴα発現が女性及び男性の健康なドナーの末梢血由来のヒトＴｒｅｇにおいて保存されているかどうかを評価した。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇを古典的に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞として特定した。細胞内ＬＴαタンパク質（データを示さず）及び細胞表面ＬＴα１β２ヘテロ複合体（データを示さず）を分析された全てのドナーのＴｒｅｇにおいて、フローサイトメトリーにより実質的に検出した。これは、この発現がマウスからヒトにおいて保存されていることを示している。
次に、ＬＴα発現が女性及び男性の健康なドナーの末梢血由来のヒトＴｒｅｇにおいて保存されているかどうかを評価した。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇを古典的に、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞として特定した。細胞内ＬＴαタンパク質（データを示さず）及び細胞表面ＬＴα１β２ヘテロ複合体（データを示さず）を分析された全てのドナーのＴｒｅｇにおいて、フローサイトメトリーにより実質的に検出した。これは、この発現がマウスからヒトにおいて保存されていることを示している。
【0140】
議論
幾つかの研究から、Ｔｒｅｇ細胞の発生及び機能の正のレギュレーションに関与する多数の分子が特定された。対照的に、Ｔｒｅｇ機能を負にレギュレーションするシグナルが記載されているレポートはほとんどない。ここでは、制御性特性が付与された別個のＴ細胞集団を分析することにより、Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇが膜アンカーＬＴα１β２ヘテロ複合体として、ＬＴαを実質的に発現することを見出した。ＬＴβＲ－／－マウスと同様に、ＬＴα－／－マウスは、胸腺におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ細胞の発達に明らかな欠損を何ら示さない。一方、抑制機能に関連する遺伝子のサインは、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの両方において大幅に向上する。これは、ＬＴα、より正確には、Ｔｒｅｇと樹状細胞との間のＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用により、それらの免疫抑制サインが負にレギュレーションされることを示す。
幾つかの研究から、Ｔｒｅｇ細胞の発生及び機能の正のレギュレーションに関与する多数の分子が特定された。対照的に、Ｔｒｅｇ機能を負にレギュレーションするシグナルが記載されているレポートはほとんどない。ここでは、制御性特性が付与された別個のＴ細胞集団を分析することにより、Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇが膜アンカーＬＴα１β２ヘテロ複合体として、ＬＴαを実質的に発現することを見出した。ＬＴβＲ－／－マウスと同様に、ＬＴα－／－マウスは、胸腺におけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ Ｔｒｅｇ細胞の発達に明らかな欠損を何ら示さない。一方、抑制機能に関連する遺伝子のサインは、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの両方において大幅に向上する。これは、ＬＴα、より正確には、Ｔｒｅｇと樹状細胞との間のＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用により、それらの免疫抑制サインが負にレギュレーションされることを示す。
【0141】
興味深いことに、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入により、ＤＳＳ誘発大腸炎から保護され（図１）、ＷＴ Ｔｒｅｇより効率的にＩＢＤが処置されることが、以前に実証されている。これは、ＷＴ Ｔｒｅｇが注入されたマウスと比較して、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが移入されたマウスにおいて、体重減少の低下、結腸の長さの増加及び組織学的スコアの減少により反映された。さらに、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇにより、結腸炎症及び炎症性免疫細胞の浸潤が実質的に減少することが観察された。ＤＳＳ誘発大腸炎モデルにおいて、大腸炎誘発前でのＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの移入により、腸間膜リンパ節におけるＴｈ１及びＴｈ１７病原性細胞のプライミング及び／又は増殖が減少することが見出された。重要なことに、Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１及びＴｒｅｇ／Ｔｈ１７の比率は、ＤＳＳ誘発大腸炎とＩＢＤモデルの両方で結腸において上昇した。これは、Ｔｒｅｇがこの組織で局所的にそれらの抑制効果も発揮することができることを示唆している。結腸炎症を抑制する能力により、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入により、慢性炎症により促進されることが公知のＣＡＣの発症も減弱する。要するに、これらのデータから、対応するＷＴと比較して、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇが、大腸炎を処置し、大腸炎及びＣＡＣ発症の両方から保護するより高い能力を示すことが示される。また、Ｔｒｅｇと樹状細胞、特に、Ｓｉｒｐα＋従来型樹状細胞及び形質細胞様樹状細胞との間のＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用により、Ｔｒｅｇ細胞の抑制サインが負に制御されることも明らかとなった。抗原提示細胞との直接的な細胞接点により、Ｔｒｅｇ抑制活性がレギュレーションすることが示唆される。
【0142】
本明細書において、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃと共に予めインキュベーションされたＷＴ Ｔｒｅｇの養子移入により、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇと同程度に効果的に潰瘍性大腸炎の発症から保護されることが示される（図２Ｂ～図２Ｃ）。さらに、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃと共に予めインキュベーションされたＷＴ Ｔｒｅｇは、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇと同様の抑制サインを示す（図３）。したがって、可溶性ＬＴβＲ－Ｆｃと共に予めインキュベーションされたＷＴ Ｔｒｅｇの養子移入は、ＤＳＳ誘発大腸炎から保護するだけでなく、ＩＢＤも処置し、ＬＴα－／－ Ｔｒｅｇの養子移入と同程度に効果的にＣＡＣの発生を減弱させることも期待される。
【0143】
参考文献
本願全体を通して、種々の参考文献に、本発明が属する最新技術が記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
本願全体を通して、種々の参考文献に、本発明が属する最新技術が記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
【表2】
【図1A】
【図1B】
【図1C-1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A-3B】
【配列表】
【国際調査報告】