▶ シャンハイ ジーピー バイオテック カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-25
(54)【発明の名称】免疫細胞を増殖させるＩＬ－２突然変異体タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220715BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220715BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220715BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20220715BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220715BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220715BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220715BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220715BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220715BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20220715BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220715BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220715BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20220715BHJP
C12P 21/02 20060101ALN20220715BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C07K14/55
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K38/20
A61P35/00
A61P37/04
A61K38/02
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021568420
(86)(22)【出願日】2020-05-14
(85)【翻訳文提出日】2022-01-11
(86)【国際出願番号】 CN2020090365
(87)【国際公開番号】W WO2020228791
(87)【国際公開日】2020-11-19
(31)【優先権主張番号】201910399641.1
(32)【優先日】2019-05-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】521497903
【氏名又は名称】シャンハイ ジーピー バイオテック カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＧＰ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ． ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ７， Ｌａｎｅ ２０６６， Ｗａｎｇｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｆｅｎｇｘｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】特許業務法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フー ホイ
(72)【発明者】
【氏名】チャン イン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG05
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA06
4C084BA01
4C084BA03
4C084BA22
4C084BA44
4C084DA12
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB26
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA04
4H045EA20
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ＩＬ－２突然変異体タンパク質、当該ＩＬ－２突然変異体タンパク質を含む融合タンパク質またはコンジュゲート、および当該ＩＬ－２突然変異体タンパク質、融合タンパク質またはコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、本発明のＩＬ－２突然変異体タンパク質は、高親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性を排除または減少し、かつ基本的に中親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性を維持する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＬ－２突然変異体であって、野生型ＩＬ－２に対応する３９位、４９位、７３位および１０９位のうちの一つまたは複数の部位にアミノ酸残基突然変異が発生しており、好ましくは、３９位でのみ発生していることを特徴とする、ＩＬ－２突然変異体。
【請求項2】
ＩＬ－２突然変異体であって、野生型ＩＬ－２に対応する３９位ならびに任意選択で４９位、７３位および１０９位のうちの一つまたは複数の部位にアミノ酸残基突然変異が発生していることを特徴とする、ＩＬ－２突然変異体。
【請求項3】
前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対して、Ｍ３９Ｄ、Ｍ３９Ｅ、Ｍ３９Ｑ、Ｍ３９Ｎ、Ｍ３９Ａ、Ｋ４９Ｎ、Ａ７３Ｔ、Ａ７３ＳおよびＤ１０９Ｎのうちの一つまたは複数のアミノ酸残基突然変異が発生したものであることを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項に記載のＩＬ－２突然変異体。
【請求項4】
前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対して、Ｍ３９Ｄ、Ｍ３９Ｅ、Ｍ３９Ｑ、Ｍ３９ＮまたはＭ３９Ａ、好ましくはＭ３９Ｄ、Ｍ３９Ｅ、Ｍ３９ＱまたはＭ３９Ｎ、より好ましくはＭ３９Ｄ、Ｍ３９ＥまたはＭ３９Ｑ、より好ましくはＭ３９ＤまたはＭ３９Ｅ、最も好ましくはＭ３９Ｄのアミノ酸残基点突然変異が発生したものであることを特徴とする、請求項３に記載のＩＬ－２突然変異体。
【請求項5】
融合タンパク質またはコンジュゲートであって、請求項１～４のいずれか１項に記載のＩＬ－２突然変異体および非ＩＬ－２機能部分を含むことを特徴とする、融合タンパク質またはコンジュゲート。
【請求項6】
ポリヌクレオチドであって、請求項１～４のいずれか１項に記載のＩＬ－２突然変異体または請求項５に記載の融合タンパク質またはコンジュゲートをコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項7】
発現ベクターであって、請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項8】
宿主細胞であって、請求項７に記載の発現ベクターを含むか、または前記宿主細胞のゲノムには請求項６に記載のポリヌクレオチドが統合されていることを特徴とする、宿主細胞。
【請求項9】
医薬組成物であって、請求項１～４のいずれか１項に記載のＩＬ－２突然変異体または請求項５に記載の融合タンパク質またはコンジュゲートと、薬学的に許容される補助剤とを含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項10】
個体の疾患の治療のための薬物の調製における請求項１～４のいずれか１項に記載のＩＬ－２突然変異体または請求項５に記載の融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質工学の分野に関する。具体的には、本発明は、新規インターロイキン－２（ＩＬ－２）突然変異体およびその調製方法に関し、前記インターロイキン－２（ＩＬ－２）突然変異体は、野生型ＩＬ－２の元のタンパク質およびその結合パートナーであるＩＬ－２受容体αサブユニットと比較して、結合能力が低下するが、ＩＬ－２受容体βサブユニットおよびＩＬ－２受容体γサブユニットの結合能力、ならびに対応する生物学的活性を維持しており、Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞の増殖を含むがこれらに限定されない、腫瘍免疫細胞をよりよく刺激することができる。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン－２（ＩＬ－２、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２）は、免疫系の細胞増殖因子の一種であり、免疫系の白血球の細胞活性を調節し、Ｔｈ０およびＣＴＬの増殖を促進し、抗体応答、造血および腫瘍モニタリングにも参加する。ＩＬ－２は、ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に結合することにより、その効果を仲介し、ＩＬ－２Ｒは、α、βおよびγの三つの鎖から構成され、それらの異なる組み合わせにより、ＩＬ－２に対して異なる親和性を有する受容体形態を生成することができ、ＩＬ－２Ｒγ鎖だけではＩＬ－２に結合できず、βγ鎖は、中親和性ＩＬ－２Ｒであり、αβγ鎖は、高親和性ＩＬ－２Ｒである。
【0003】
ＩＬ－２は、主に活性化されたＴ細胞、特にヘルパーＴ細胞によって合成される。これは、Ｔ細胞の増殖および分化を刺激し、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の生成および末梢血リンパ球の細胞毒性細胞とリンホカイン活性化殺傷（ＬＡＫ）細胞への分化を誘導し、Ｔ細胞によるサイトカインと細胞溶解分子の発現を促進し、Ｂ細胞の増殖と分化およびＢ細胞を介した免疫グロブリンの合成を促進し、天然殺傷（ＮＫ）細胞の生成、増殖および活性化を刺激する。
【0004】
インビボでリンパ球集団を増殖させ、これらの細胞のエフェクター機能を増強するＩＬ－２の能力は、ＩＬ－２抗腫瘍効果を付与して、ＩＬ－２免疫療法を特定の転移性癌の魅力的な治療選択にする。従って、高用量のＩＬ－２治療は、転移性腎細胞癌および悪性黒色腫の患者に対して承認される。しかしながら、ＩＬ－２は、免疫応答において二重の機能を有し、これは、エフェクター細胞の増殖および活性を仲介するだけでなく、末梢免疫寛容の維持にも決定的に関与しているためである。
【0005】
ＩＬ－２免疫療法に関連するのは、組換えヒトＩＬ－２治療によって引き起こされる副作用である。高用量のＩＬ－２治療を受けている患者は、しばしば深刻な心血管、肺、腎臓、肝臓、胃腸、神経学、皮膚、血液および全身性有害事象を経験し、これは、綿密なモニタリングおよび入院患者（ｉｎ－ｐａｔｉｅｎｔ）の管理を必要とする。これらの副作用のほとんどは、いわゆる血管（または毛細血管）リーク症候群（ＶＬＳ）の形成によって説明することができ、当該症候群は、血管透過性の病理学的増加であり、複数の臓器での体液のオーバーフロー（例えば、肺と皮膚の浮腫および肝臓細胞の損傷）および血管内液の喪失（血圧の低下および心拍数の代償的な増加）につながる。低用量のＩＬ－２による解決策は、ＶＬＳを回避するために試験され、しかしながら、これは、治療の結果を減らすという犠牲が伴う。
【0006】
腫瘍免疫は、近年腫瘍を効果的に治療する方法であり、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を介して、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ－４７抗体等の他の類似の免疫阻害剤によって、インビボでＴ細胞およびＮＫ細胞による腫瘍細胞の殺傷を達成する。ＩＬ－２は、既知の有効なＴ細胞およびＮＫ細胞の増殖促進因子であるが、上記副作用のためにその応用が制限される。
【0007】
細胞免疫治療は、近年、腫瘍または自己免疫疾患を効果的に治療する方法でもある。人体から自己免疫細胞を収集し、インビトロで培養して、数を数千倍に増やし、標的性殺傷機能が増強された後、人体に戻されて、血液および組織の病原体、癌細胞、突然変異細胞を殺し、免疫寛容を破壊し、体の免疫能力を活性化および増強し、治療およびヘルスケアの二重の効果が得られると考えられる。これは、サイトカインによって誘導される殺傷細胞（ＣＩＫ）療法、樹状細胞（ＤＣ）療法、ＤＣ＋ＣＩＫ細胞療法、ナチュラル殺傷細胞（ＮＫ）療法、ＤＣ－Ｔ、ＣＡＲＴ、ＣＡＲ－ＮＫ細胞療法等である。ＩＬ－２は、そのインビトロでの増殖過程でよく使用され、野生型ＩＬ－２は、同時に非腫瘍殺傷の免疫細胞を増殖するため、ＣＤ８等の免疫細胞のＩＬ－２をより効果的に増殖する必要がある。
【0008】
ＩＬ－２免疫治療に関連するこれらの問題を克服するために、いくつかのアプローチがこの分野で使用される。例えば、ＩＬ－２を特定の抗ＩＬ－２モノクローナル抗体と組み合わせて、インビボでのＩＬ－２治療効果を増強することができる（Ｋａｍｉｍｕｒａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ１７７、３０６－１４（２００６）、Ｂｏｙｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１１、１９２４－２７（２００６））。突然変異ＩＬ－２は、その毒性を減少し、および／またはその効果を向上させるために、様々な方法で変異させることができる。例えば、Ｈｕら（Ｂｌｏｏｄ１０１、４８５３－４８６１（２００３）、米国特許公開番号２００３／０１２４６７８）は、ＩＬ－２の血管透過性活性を排除するために、ＩＬ－２の３８位のアルギニン残基をトリプトファンに置換する。Ｓｈａｎａｆｅｌｔら（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８、１１９７－１２０２（２０００））は、アスパラギン８８をアルギニンに突然変異させて、Ｔ細胞の選択的増殖を増強し、毒性副作用を伴うＮＫ細胞の増殖を減少する。Ｈｅａｔｏｎら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３、２５９７－６０２（１９９３）、米国特許第５２２９１０９号）は、ＮＫ細胞による炎症性サイトカインの分泌を減少させるために、Ａｒｇ３８ＡｌａおよびＰｈｅ４２Ｌｙｓの二つの突然変異を導入する。Ｇｉｌｌｉｅｓら（米国特許公開番号２００７／００３６７５２）は、ＶＬＳを減らすためにＩＬ－２の三つの残基を置換する（Ａｓｐ２０Ｔｈｒ、Ａｓｎ８８ＡｒｇおよびＧｌｎｌ２６Ａｓｐ）。Ｇｉｌｌｉｅｓら（Ｗ０２００８／００３４４７３）は、Ａｒｇ３８ＴｒｐおよびＰｈｅ４２Ｌｙｓ突然変異体ＩＬ－２とＣＤ２５の界面でアミノ酸を置換することにより、ＣＤ２５との相互作用およびＴｉｍｆ細胞の活性化を減少して効果を増強する。同じ目的で、Ｗｉｔｔｒｕｐら（Ｗ０２００９／０６１８５３）は、ＣＤ２５に対する親和性が増加するが、受容体を活性化せず、それによって拮抗剤として作用するＩＬ－２突然変異体を取得する。突然変異を導入する目的は、受容体βサブユニットおよび／またはγサブユニットの相互作用を破壊することである。しかしながら、これらの既知のＩＬ－２突然変異体のいずれも、ＩＬ－２免疫治療に関連する上記の問題、即ち、ＶＬＳによって引き起こされる毒性の誘導、ＡＩＣＤによって引き起こされる腫瘍寛容性の誘導、およびＴｉｍｆ細胞の活性化によって引き起こされる免疫阻害を克服する。Ｒｏｃｈｅｇｌｉｃａｔ社（ＣＮ１０３４９２４１１Ａ）は、ＩＬ－２のＦ４２Ａ、Ｙ４５ＡおよびＬ７２Ｇの三つの部位のアミノ酸を突然変異させて、ＩＬ－２タンパク質の高親和性ＩＬ－２受容体への親和性を減少し、かつ中親和性ＩＬ－２受容体に対する前記突然変異体ＩＬ－２タンパク質の親和性を維持するが、同時に得られたＩＬ－２突然変異体の生物学的活性も減少する。例えば、マイアミ大学（ＣＮ１０７０７４９６７Ａ）は、融合タンパク質を構築し、当該融合タンパク質は、インターロイキン－２またはその機能的変異体またはフラグメントの第１のポリペプチドおよび第１のポリペプチドの開放リーディングフレームに融合する第２のポリペプチドを含み、ここで、第２のポリペプチドは、インターロイキン－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα）の細胞外ドメインまたはその機能的変異体またはフラグメントを含み、ここで、前記融合タンパク質は、ＩＬ－２活性を有する。構築された融合タンパク質は、自己結合によって細胞表面に対するＩＬ－２の高親和性ＩＬ－２Ｒα結合効果を排除するが、当該融合タンパク質は、自己または異なる分子間の相互結合が存在し、多量体を生成するのが容易であり、生成および品質管理に不利であり、当該融合タンパク質は、インビボで結合および解離のバランスを有し、細胞表面への高親和性ＩＬ－２Ｒα結合効果を完全に排除することができず、依然に細胞表面ＩＬ－２Ｒαに結合することができる。
【0009】
従って、この分野では、ＩＬ－２の有効性を改善し、増強型ＩＬ－２ポリペプチドを安定かつ便利に生成する必要がある。
【発明の概要】
【0010】
本発明の目的は、新規ＩＬ－２突然変異体を提供することである。野生型ＩＬ－２と比較して、本発明のＩＬ－２突然変異体は、ＩＬ－２免疫治療に関連する問題を克服することができるが、依然に必要とする生物学的活性を維持する。
【0011】
第１の態様において、本発明は、ＩＬ－２突然変異体を提供し、野生型ＩＬ－２に比較して、前記ＩＬ－２突然変異体のアミノ酸残基が突然変異しているため、ＩＬ－２とその受容体の結合能力が改変され、高親和性ＩＬ－２受容体に対する前記ＩＬ－２突然変異体の親和性は、排除または減少し、かつ基本的に中親和性ＩＬ－２受容体への親和性を維持する。
【0012】
好ましい実施形態において、前記高親和性ＩＬ－２受容体は、ＩＬ－２受容体のヘテロ三量体形態であり、受容体αサブユニット、受容体βサブユニットおよび受容体γサブユニットで構成され、前記中親和性ＩＬ－２受容体は、ＩＬ－２受容体βサブユニットおよびＩＬ－２受容体γサブユニットのみを含み、ＩＬ－２受容体αサブユニットは含まれない。
【0013】
好ましい実施形態において、野生型ＩＬ－２と比較して、高親和性ＩＬ－２受容体に対する前記ＩＬ－２突然変異体の結合親和性は、５５％以上、より好ましくは６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上減少し、最も好ましくは前記ＩＬ－２突然変異体は、高親和性ＩＬ－２受容体に結合しない。
【0014】
前記ＩＬ－２突然変異体と中親和性ＩＬ－２受容体の結合親和性は、野生型ＩＬ－２と中親和性ＩＬ－２受容体の結合親和性の５０％以上、より好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上であり、最も好ましくは、前記ＩＬ－２突然変異体と中親和性ＩＬ－２受容体の結合親和性は、野生型ＩＬ－２と中親和性ＩＬ－２受容体の結合親和性に相当する。
【0015】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞を含むがこれらに限定されない活性化腫瘍免疫細胞の増殖効果を維持する。
【0016】
具体的な実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置３９、４９、７３および１０９のうちの一つまたは複数の部位でアミノ酸残基突然変異が発生される。
【0017】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置３９、４９、７３および１０９のいずれかの部位にアミノ酸残基突然変異が発生される。
【0018】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置３９にのみアミノ酸残基突然変異が発生される。
【0019】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置３９ならびに任意選択で位置４９、７３および１０９のうちの一つまたは複数の部位でアミノ酸残基突然変異が発生され、
前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置４９ならびに、位置３９、７３および１０９のうちの一つまたは複数の部位でアミノ酸残基突然変異が発生され、
前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置７３ならびに位置３９、４９および１０９のうちの一つまたは複数の部位でアミノ酸残基突然変異が発生され、
前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置１０９ならびに位置３９、４９および７３のうちの一つまたは複数の部位でアミノ酸残基突然変異が発生される。
前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置４９ならびに、位置３９、７３および１０９のうちの一つまたは複数の部位でアミノ酸残基突然変異が発生され、
前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置７３ならびに位置３９、４９および１０９のうちの一つまたは複数の部位でアミノ酸残基突然変異が発生され、
前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置１０９ならびに位置３９、４９および７３のうちの一つまたは複数の部位でアミノ酸残基突然変異が発生される。
【0020】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置３９、４９、７３および１０９のうちの一つ、二つ、三つまたは四つの部位で突然変異が発生される。
【0021】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２において、Ｍ３９Ｄ、Ｍ３９Ｅ、Ｍ３９Ｑ、Ｍ３９Ｎ、Ｍ３９Ａ、Ｋ４９Ｎ、Ａ７３Ｔ、Ａ７３ＳおよびＤ１０９Ｎのうちの一つまたは複数のアミノ酸残基突然変異が発生される。
【0022】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２において、Ｍ３９Ｄ、Ｍ３９Ｅ、Ｍ３９Ｑ、Ｍ３９ＮまたはＭ３９Ａ、好ましくはＭ３９Ｄ、Ｍ３９Ｅ、Ｍ３９ＱまたはＭ３９Ｎ、より好ましくはＭ３９Ｄ、Ｍ３９ＥまたはＭ３９Ｑ、より好ましくはＭ３９ＤまたはＭ３９Ｅ、最も好ましくはＭ３９Ｄのアミノ酸残基点突然変異で発生される。
【0023】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、Ｏ糖部位を排除する。
【0024】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２に対応する位置３で突然変異が発生され、それにより、Ｏ糖部位を排除する。
【0025】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２タンパク質に対応するＴ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３Ｋ和Ｔ３Ｐ、好ましくはＴ３Ａの位置３でアミノ酸残基突然変異が発生される。
【0026】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体は、位置Ｃ１２５Ｌ、Ｃ１２５Ｓ、Ｃ１２５Ａ、好ましくはＣ１２５Ｓの位置１２５のｃｙｓ部位で突然変異する。
【0027】
第２の態様において、本発明は、融合タンパク質またはコンジュゲートを提供し、前記融合タンパク質またはコンジュゲートは、第１の態様に記載のＩＬ－２突然変異体および非ＩＬ－２機能部分を含む。
好ましい実施形態において、非ＩＬ－２機能部は、
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のＦｃフラグメント、およびその相同性が９０％以上である突然変異体のＦｃフラグメントを含む、Ｆｃフラグメント、
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、
抗ＨＳＡ抗体または抗体フラグメント、
トランスフェリン、
ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットカルボキシ基末端ペプチド（ＣＴＰ）、
エラスチン様ペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＥＬＰ）、および
抗原結合部分からなる群から選択される。
好ましい実施形態において、非ＩＬ－２機能部は、
ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のＦｃフラグメント、およびその相同性が９０％以上である突然変異体のＦｃフラグメントを含む、Ｆｃフラグメント、
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、
抗ＨＳＡ抗体または抗体フラグメント、
トランスフェリン、
ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットカルボキシ基末端ペプチド（ＣＴＰ）、
エラスチン様ペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＥＬＰ）、および
抗原結合部分からなる群から選択される。
【0028】
好ましい実施形態において、前記抗原結合部分は、
抗体またはその活性抗体フラグメント、
Ｆａｂ分子、ｓｃＦｖ分子およびＶＨＨ分子、または
細胞受容体またはリガンドである。
抗体またはその活性抗体フラグメント、
Ｆａｂ分子、ｓｃＦｖ分子およびＶＨＨ分子、または
細胞受容体またはリガンドである。
【0029】
好ましい実施形態において、前記融合タンパク質のＩＬ－２突然変異体および非ＩＬ－２機能部分は、直接接続することも、アダプターを介して接続することもでき、前記アダプターは、例えば、（Ｇ３Ｓ）４等のＧ３Ｓの反復配列またはＧ４Ｓの反復配列を含むがこれらに限定されない、ＡＡＡまたはＧＳの反復配列であり得る。
【0030】
好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体または融合タンパク質は、コンジュゲートを形成するために次のようにさらに修飾することができる：
ポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）、
ポリシアル化修飾（ＰＳＡ化）、
飽和脂肪酸修飾、
ヒアルロン酸修飾（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）、
ポリアミノ酸修飾（ｐｒｏｌｉｎｅ－ａｌａｍｉｎｅ－ｓｅｒｉｎｅ ｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＡＳ化）。
ポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）、
ポリシアル化修飾（ＰＳＡ化）、
飽和脂肪酸修飾、
ヒアルロン酸修飾（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）、
ポリアミノ酸修飾（ｐｒｏｌｉｎｅ－ａｌａｍｉｎｅ－ｓｅｒｉｎｅ ｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＡＳ化）。
【0031】
第３の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、第１の態様に記載のＩＬ－２突然変異体または第２の態様に記載の融合タンパク質またはコンジュゲートをコードする。
【0032】
第４の態様において、本発明は、発現ベクターを提供し、前記発現ベクターは、第３の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。
【0033】
第５の態様において、本発明は、宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、第４の態様に記載の発現ベクターを含むか、または前記宿主細胞のゲノムに第３の態様に記載のポリヌクレオチドが統合される。
【0034】
好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは酵母、昆虫細胞、動物細胞であり、哺乳動物細胞であってもよい。
【0035】
第６の態様において、本発明は、無細胞発現モードを提供し、前記発現系は、第４の態様に記載の発現ベクターを含む。
【0036】
第７の態様において、本発明は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、第１の態様に記載のＩＬ－２突然変異体または第２の態様に記載の融合タンパク質またはコンジュゲートおよび薬学的に許容される補助剤を含む。
【0037】
第８の態様において、本発明は、Ｔリンパ球、自然殺傷ＮＫ細胞のインビトロでの増殖または個体の疾患の治療のための薬物調製における、第１の態様に記載のＩＬ－２突然変異体または第２の態様に記載の融合タンパク質の用途を提供する。
【0038】
好ましい実施形態において、前記疾患は、ＩＬ－２を適用して免疫治療する疾患である。
【0039】
好ましい実施形態において、前記疾患は、癌、免疫疾患、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ感染、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ感染、関節リウマチ、アトピー皮膚炎等である。
【0040】
好ましい実施形態において、前記癌、免疫疾患、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ感染、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ感染、関節リウマチ、アトピー皮膚炎等は、免疫系を刺激するか、または免疫細胞を増殖することによって治療される。
【0041】
第９の態様において、本発明は、Ｔリンパ球、自然殺傷ＮＫ細胞のインビトロでの増殖または個体疾患の治療に使用される、第１の態様に記載のＩＬ－２突然変異体または第２の態様に記載の融合タンパク質を提供する。
【0042】
好ましい実施形態において、前記疾患は、ＩＬ－２を適用して免疫治療する疾患である。
【0043】
好ましい実施形態において、前記疾患は、癌、免疫疾患、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ感染、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ感染、関節リウマチ、アトピー皮膚炎等である。
【0044】
好ましい実施形態において、前記癌は、免疫系を刺激するか、または免疫細胞を増殖することによって治療される癌である。
【0045】
第１０の態様において、本発明は、第１の態様に記載のＩＬ－２突然変異体または第２の態様に記載の融合タンパク質またはコンジュゲートまたは第６の態様に記載の医薬組成物を、ＩＬ－２免疫治療を必要とする患者に投与する段階を含む、治療方法を提供する。
【0046】
好ましい実施形態において、前記治療方法は、免疫系を刺激するか、または免疫細胞を増殖することにより、癌または免疫疾患、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ感染、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ感染、関節リウマチ、アトピー皮膚炎等を治療する。
【0047】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【0048】
【図1】酵素免疫測定法によって検出されたＩＬ－２突然変異体とＣＤ２５との結合能力を示す。
【図2】ｒｈＩＬ－２および突然変異体インターロイキン－２（Ｈｉｓタグ）に応答したＣＴＬＬ－２細胞の増殖状況を示す。
【図3】ｒｈＩＬ－２および突然変異体インターロイキン－２（Ｆｃタグ）に応答したＣＴＬＬ－２細胞の増殖状況を示す。
【図4】ｒｈＩＬ－２および突然変異体インターロイキン－２（Ｈｉｓタグ）に応答したＮＫ９２細胞の増殖状況を示す。
【図5】ｒｈＩＬ－２および突然変異体インターロイキン－２（Ｆｃタグ）に応答したＮＫ９２細胞の増殖状況を示す。
【図6-1】それぞれ配列番号１～２５の配列を示す。
【図6-2】それぞれ配列番号１～２５の配列を示す。
【図6-3】それぞれ配列番号１～２５の配列を示す。
【図6-4】それぞれ配列番号１～２５の配列を示す。
【図6-5】それぞれ配列番号１～２５の配列を示す。
【図7-1】それぞれ配列番号２６～３７の配列を示す。
【図7-2】それぞれ配列番号２６～３７の配列を示す。
【図7-3】それぞれ配列番号２６～３７の配列を示す。
【図7-4】それぞれ配列番号２６～３７の配列を示す。
【図7-5】それぞれ配列番号２６～３７の配列を示す。
【図8A(1)】それぞれＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ａ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｂ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｃ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｄ－ＨＳＡ、野生型ＩＬ－２－ＨＳＡとヒトＩＬ－２Ｒαサブユニットおよびヒト組換えＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体との親和性を示す。
【図8A(2)】それぞれＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ａ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｂ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｃ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｄ－ＨＳＡ、野生型ＩＬ－２－ＨＳＡとヒトＩＬ－２Ｒαサブユニットおよびヒト組換えＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体との親和性を示す。
【図8B(1)】それぞれＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ａ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｂ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｃ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｄ－ＨＳＡ、野生型ＩＬ－２－ＨＳＡとヒトＩＬ－２Ｒαサブユニットおよびヒト組換えＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体との親和性を示す。
【図8B(2)】それぞれＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ａ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｂ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｃ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｄ－ＨＳＡ、野生型ＩＬ－２－ＨＳＡとヒトＩＬ－２Ｒαサブユニットおよびヒト組換えＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体との親和性を示す。
【図9】ＩＬ－２突然変異体および野生型ＩＬ－２がＮＫ９２細胞増殖を刺激する状況を示す。
【図10】ＩＬ－２突然変異体によって誘導されるＩＦＮ－γの放出を示し、ここで、図１０Ａは、異なる濃度のＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２－ＨＳＡがＮＫ９２細胞を誘導して、インターフェロンγの放出を刺激することを示し、図１０Ｂは、異なる濃度のＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２－ＨＳＡでＮＫ９２細胞がインターフェロンγの放出を刺激するように誘導することを示す。
【発明を実施するための形態】
【0049】
本発明者らは、広範囲にわたる詳細の研究の後、ＩＬ－２ポリペプチドに対する部位特異的突然変異後にグリコシル化修飾が生じた新規ＩＬ－２突然変異体ポリペプチドが高親和性ＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２タンパク質の親和性を排除または減少することができ、かつ中親和性ＩＬ－２受容体に対する前記突然変異体ＩＬ－２タンパク質の親和性を維持するとともに、ＩＬ－２の生物学的活性を維持し、Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞を含むがこれらに限定されない腫瘍免疫細胞の増殖をよりよく刺激することができ、治療の目的を達成することが予期せずに発見された。これに基づいて、本発明を完成させた。
【0050】
部位特異的突然変異技術
部位特異的突然変異は、既知のタンパク質の構造および機能に基づいて、既知のＤＮＡ配列の特定のヌクレオチドを置換、挿入または欠失して、新しい形質を有する突然変異タンパク質分子を生成するタンパク質工学技術である。
部位特異的突然変異は、既知のタンパク質の構造および機能に基づいて、既知のＤＮＡ配列の特定のヌクレオチドを置換、挿入または欠失して、新しい形質を有する突然変異タンパク質分子を生成するタンパク質工学技術である。
【0051】
部位特異的突然変異技術は、タンパク質の物理的および化学的性質を変えることができ、例えば、タンパク質薬物の安定性を向上させ、タンパク質薬物の溶解性能を増強させ、基質に対する酵素の特異性を変更し、酵素活性を向上させ、親和性および特異性を改善する等、生物学的性質を改善することができる。
【0052】
部位特異的突然変異技術は、結合ドメインのアミノ酸を突然変異させて、リガンドと受容体、酵素と基質との間の結合活性を増加または排除することができ、このような突然変異は、タンパク質の特性を改変して、二次構造または高レベル構造および持っている電荷等の特性の変化をもたらす。突然変異されたアミノ酸が最終的に重要な抗原－抗体作用部位にある場合、当該アミノ酸の変化は、当該部位の電荷および二次構造または高レベル構造の変化をもたらし、リガンドと受容体、酵素と基質との間に結合することができなくなり、突然変異の目的を達成する。同時に、元の抗体がこの部位を認識することができなくなり、即ち、新しい抗原を形成する。これは、このような既存の突然変異法において不可避的に起こる。
【0053】
本発明のＩＬ－２突然変異体
本発明において、部位特異的突然変異を介して、ＩＬ－２ポリペプチドにアミノ酸残基が生じるようにすることにより、ＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２Ｒ受容体との結合モードを改変する。本発明の改変ＩＬ－２突然変異体とＩＬ－２受容体との親和性は、改変される。具体的な実施形態において、本発明のＩＬ－２突然変異体は、高親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性を排除または減少するが、中親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性を維持する同時に、ＩＬ－２の生物学的活性を維持する。従って、本発明のＩＬ－２突然変異体は、Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞を含むがこれらに限定されない腫瘍免疫細胞の増殖等をよりよく刺激することができるだけでなく、野生型ＩＬ－２と比較して、その副作用も、有意に減少するため、より良い治療目的を達成することができる。
本発明において、部位特異的突然変異を介して、ＩＬ－２ポリペプチドにアミノ酸残基が生じるようにすることにより、ＩＬ－２ポリペプチドとＩＬ－２Ｒ受容体との結合モードを改変する。本発明の改変ＩＬ－２突然変異体とＩＬ－２受容体との親和性は、改変される。具体的な実施形態において、本発明のＩＬ－２突然変異体は、高親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性を排除または減少するが、中親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性を維持する同時に、ＩＬ－２の生物学的活性を維持する。従って、本発明のＩＬ－２突然変異体は、Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞を含むがこれらに限定されない腫瘍免疫細胞の増殖等をよりよく刺激することができるだけでなく、野生型ＩＬ－２と比較して、その副作用も、有意に減少するため、より良い治療目的を達成することができる。
【0054】
本発明のＩＬ－２突然変異体または融合タンパク質がグリコシル化修飾を有する場合、好ましくは真核細胞発現を使用し、細胞培養によって得られる。酵母、昆虫細胞、動物細胞を選択することができ、遺伝子改変動物を選択することができる。具体的な実施形態において、前記宿主細胞は、真核細胞であり、好ましくは酵母、昆虫細胞、動物細胞であり、本発明のＩＬ－２突然変異体または融合タンパク質がグリコシル化修飾を有さない場合、無細胞発現、大腸菌、酵母等の発現を使用することができ、無細胞発現および酵母細胞が好ましい。
【0055】
酵母細胞または昆虫細胞を宿主細胞として使用する場合、得られるＩＬ－２突然変異体のグリコフォームは、非ヒトである可能性がある。当業者は、非ヒトグリコフォームがさらに成人グリコフォームに変換されることができることを知っている。
【0056】
他の実施形態において、原核細菌の発現発酵またはインビトロ無細胞合成を使用して、ＩＬ－２突然変異体を取得し、次にインビトロ酵素触媒等の方法で正しくグリコシル化されたＩＬ－２突然変異体を取得することができる。インビボおよびインビトロの修飾解決策は、同じ目的、即ち、ＩＬ－２の部位特異的グリコシル化を達成することができる。
【0057】
タンパク質のグリコシル化修飾および突然変異
タンパク質のグリコシル化は、複雑な翻訳後の修飾プロセスであり、タンパク質の特定の部位でグリコシル化修飾を行い、通常、修飾部位は、アスパラギン残基（Ｎ－結合）またはセリン／スレオニン残基（Ｏ－結合）であり、Ｎ－結合型グリコシル化修飾は、一般にＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒで発生し（Ｘは、非プロリンアミノ酸であり、Ｎ糖部位と呼ばれる）、Ｏ－結合型グリコシル化修飾は、一般にセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基（Ｏ糖部位と呼ばれる）で発生し、Ｎ－アセチルガラクトサミン（Ｇａｌ－ＮＡｃ）およびＳｅｒ／Ｔｈｒのヒドロキシル基によってＯ－グリコシド結合を形成する。対応的に、部位特異的突然変異によって野生型ＩＬ－２に導入されたグリコシル化部位は、即ち人工的なグリコシル化部位である。
タンパク質のグリコシル化は、複雑な翻訳後の修飾プロセスであり、タンパク質の特定の部位でグリコシル化修飾を行い、通常、修飾部位は、アスパラギン残基（Ｎ－結合）またはセリン／スレオニン残基（Ｏ－結合）であり、Ｎ－結合型グリコシル化修飾は、一般にＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒで発生し（Ｘは、非プロリンアミノ酸であり、Ｎ糖部位と呼ばれる）、Ｏ－結合型グリコシル化修飾は、一般にセリン（Ｓｅｒ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）残基（Ｏ糖部位と呼ばれる）で発生し、Ｎ－アセチルガラクトサミン（Ｇａｌ－ＮＡｃ）およびＳｅｒ／Ｔｈｒのヒドロキシル基によってＯ－グリコシド結合を形成する。対応的に、部位特異的突然変異によって野生型ＩＬ－２に導入されたグリコシル化部位は、即ち人工的なグリコシル化部位である。
【0058】
本発明者らは、受容体およびリガンドが直接接触できないように、人工的にグリコシル化突然変異を導入することによって、受容体タンパク質とリガンドタンパク質の間の結合表面上の三次元空間構造を増加させる。同時に、特定の部位で突然変異が発生される場合、グリコシル化修飾な字で受容体とリガンドとの結合を大幅に変化させる可能性があることが分かる。本発明は、以前の複数のアミノ酸部位特異的突然変異とは完全に異なり、本発明は、アミノ酸の突然変異の数を大幅に減らす。従来の部位特異的突然変異は、複数のアミノ酸の後にタンパク質の結合表面の親水性または疎水性領域を変更するか、またはその高レベル構造を変更して、二つのタンパク質が接触後に安定した結合状態を形成できないようにすることである。本発明において、グリコシル化突然変異後、結合表面が糖鎖によって切断されているため、二つのタンパク質を近づけることができず、適切な部位選択の条件下で、結合を排除するその能力は、従来の突然変異法よりもはるかに高いか、または位置３９のアミノ酸メチオニン等の一つのアミノ酸を変更するだけで、リガンド受容体間の結合を減少または排除するという目的を達成することができる。
【0059】
具体的には、本発明者らは、インターロイキン２およびインターロイキン２受容体の可能な結合領域およびそれらの近くのアミノ酸配列における突然変異点を選択し、ＡＳＮ、ＴｈｒまたはＳｅｒ部位を含む元のアミノ酸配列を可能な限り使用し、ＴｈｒまたはＳｅｒ部位の最初の二つのアミノ酸突然変異を優先的に選択することにより、グリコシル化が完了した後、突然変異点のアミノ酸が糖鎖によってマスクされ、免疫原性が最小限に抑えられる。Ａｓｎ部位後のＴｈｒまたはＳｅｒの突然変異も、実行可能な解決策である。
【0060】
３９位の点突然変異は、グリコシル化に関係なく受容体に結合する能力を変える可能性があり、単一点の突然変異しかないため、生成される潜在的な免疫原性は非常に小さい。
【0061】
伝統的に、高分子アミノ酸および複雑な芳香環を含むアミノ酸の免疫原性がより大きく、複数の点の突然変異がより明白な免疫原性を生み出すと考えられる。糖鎖の分子量が大きいため、特にＮ糖は、複雑な２アンテナ、３アンテナ～４アンテナ構造を有するため（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｊ．Ｌｙｏｎｓら、免疫を指示するグリカン：臨床免疫学における変化したグリコシル化の新たな役割（Ｇｌｙｃａｎｓ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｌｔｅｒｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｆｒｏｎｔ、Ｐｅｄｉａｔｒ、２０１５年６月１１日）、結合部位の近くの任意の突然変異は、二つのタンパク質間の結合に影響を与える。
【0062】
本発明の教示によれば、当業者は、部位特異的突然変異により、より少ない突然変異部位を野生型ＩＬ－２に導入する方法を知っている。得られたＩＬ－２突然変異体の免疫原性を減少させるために、本発明のＩＬ－２突然変異体は、突然変異点の数を可能な限り減らし、かつ天然ＩＬ－２の既存のアミノ酸残基を使用して、新しいグリコシル化部位を生成する必要があり、従って、得られたＩＬ－２突然変異体の構造は、天然ＩＬ－２の構造に近く、タンパク質の他の構造部位への突然変異の影響を回避し、生物学的活性を維持する。具体的な実施形態において、野生型ＩＬ－２の３９、４９、７３および１０９の一つまたは複数の部位（即ち、一つ、二つ、三つまたは四つの部位）でアミノ酸残基の突然変異が発生する。具体的な実施形態において、野生型ＩＬ－２において、Ｍ３９Ｄ、Ｍ３９Ｅ、Ｍ３９Ｑ、Ｍ３９Ｎ、Ｍ３９Ａ、Ｋ４９Ｎ、Ａ７３Ｔ、Ａ７３ＳおよびＤ１０９Ｎのうちの一つまたは複数のアミノ酸残基の突然変異が発生し、好ましくはＭ３９Ｄ、Ｍ３９Ｅ、Ｍ３９Ｑ、Ｍ３９ＮまたはＭ３９Ａの点突然変異、より好ましくはＭ３９Ｄ、Ｍ３９Ｅ、Ｍ３９ＱまたはＭ３９Ｎの点突然変異、より好ましくはＭ３９Ｄ、Ｍ３９ＥまたはＭ３９Ｑの点突然変異、より好ましくはＭ３９ＤまたはＭ３９Ｅの点突然変異、最も好ましくはＭ３９Ｄの点突然変異が発生する。
【0063】
この分野での従来の慣行に基づいて、ＩＬ－２ポリペプチドの元のＯ－糖部位を排除することもでき、Ｏ糖の除去はＩＬ－２の生物学的活性に影響を与えず、Ｏ糖は、複雑な構造を有し、分析が困難であり、生産品質管理の複雑さを減少させるために、通常、遺伝子工学的突然変異技術を使用して、当該グリコシル化部位を排除することができる。従って、本発明のＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２タンパク質に対応する位置３に、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｇ、Ｔ３Ｑ、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｄ、Ｔ３Ｒ、Ｔ３ＫおよびＴ３Ｐのアミノ酸残基の突然変異が発生することができ、好ましくはＴ３Ａのアミノ酸残基の突然変異が発生することができる。ＩＬ－２遺伝子生成物の精製および再生中に、例えば、ジスルフィド結合のミスマッチングまたは分子間でのジスルフィド結合の形成は、いずれもＩＬ－２の活性を低下させる可能性がある。現在の点突然変異を用いて、１２５番目の位置のシステインをロイシンまたはセリンに突然変異して、一つのジスルフィド結合のみを形成させることにより、ＩＬ－２再生過程での活性を保証する。さらに、タンパク質工学技術を利用して新規ｒＩＬ－２を生産するという報告もあり、ＩＬ－２分子の１２５番目のシステインをアラニンに変更し、変更されたＩＬ－２の活性が天然ＩＬ－２より著しく増加するようにする。従って、本発明のＩＬ－２突然変異体は、野生型ＩＬ－２タンパク質に対応する１２５位でＣ１２５Ｌ、Ｃ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｓのアミノ酸残基の突然変異が発生することができ、好ましくはＣ１２５Ｓのアミノ酸残基の突然変異が発生することができる。
【0064】
本発明のＩＬ－２突然変異体タンパク質は、高親和性ＩＬ－２受容体に対する親和性を排除または減少するが、基本的に中親和性ＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２突然変異体の親和性を維持することができる。本明細書において、「排除または減少」とは、元のレベルと比較して（例えば、野生型ＩＬ－２および高親和性ＩＬ－２受容体の親和性との比較）、５０％を超えて変化する状況を指す。従って、本明細書に記載の「高親和性ＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２突然変異体の親和性を排除または減少する」こととは、是指野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、本発明のＩＬ－２突然変異体と高親和性ＩＬ－２受容体との結合親和性を５０％以上、より好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上減少し、最も好ましくは前記ＩＬ－２突然変異体タンパク質と高親和性ＩＬ－２受容体とは結合しないことを意味する。類似的に、本明細書に記載の「基本的に中親和性ＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２突然変異体の親和性を維持する」こととは、前記ＩＬ－２突然変異体と中親和性ＩＬ－２受容体との結合親和性が野生型ＩＬ－２と中親和性ＩＬ－２受容体との結合親和性の５０％以上、より好ましくは６０％以上７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上であることを意味する。好ましい実施形態において、前記ＩＬ－２突然変異体と中親和性ＩＬ－２受容体との結合親和性は、野生型ＩＬ－２と中親和性ＩＬ－２受容体との結合親和性と対応する。
【0065】
さらに、被験者間の個体の差が非常に大きいため、本発明者らは、従来の技術のいくつかのＩＬ－２突然変異体タンパク質が異なる分子構造下または異なる実験バッチ（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂａｔｃｈ）間で比較的差が大きい効果を示すことを結論付けた。例えば、低濃度および高濃度下で比較的差が大きい効果を示す。しかしながら、本発明のＩＬ－２突然変異体は、低濃度および高濃度の両方下で優れた技術的効果を示すことができる。
【0066】
「に対応する」
本明細書に記載の「に対応する」という用語は、当業者が一般に理解する意味を有する。具体的には、「に対応する」は、二つの配列の相同性または配列の同一性を比較した後、一つの配列が他方の配列の指定位置に対応する位置を示す。従って、例えば、「野生型ＩＬ－２に対応する」とは、特定のアミノ酸配列と野生型ＩＬ－２とのアミノ酸配列を比較し、当該アミノ酸配列上から野生型ＩＬ－２に対応する部位を見つけること意味する。
本明細書に記載の「に対応する」という用語は、当業者が一般に理解する意味を有する。具体的には、「に対応する」は、二つの配列の相同性または配列の同一性を比較した後、一つの配列が他方の配列の指定位置に対応する位置を示す。従って、例えば、「野生型ＩＬ－２に対応する」とは、特定のアミノ酸配列と野生型ＩＬ－２とのアミノ酸配列を比較し、当該アミノ酸配列上から野生型ＩＬ－２に対応する部位を見つけること意味する。
【0067】
当業者に知られている配列相同性または同一性を測定する方法は、計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編集、オックスフォード大学出版社、ニューヨーク、１９８８、バイオコンピューティング：情報学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編集、アカデミックプレス、ニューヨーク、１９９３、配列データのコンピューター分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）、第１の部分、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ。ニュウージャージー、１９９４、分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、アカデミックプレス、１９８７および配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編集、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１およびＣａｒｉｌｌｏ、Ｈ．とＬｉｐｍａｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）を含むが、これらに限定されない。同一性を測定する好ましい方法は、試験する配列間で最大のマッチングを得ることである。同一性を測定する方法は、公衆が獲得できるコンピュータープログラムにコンパイルされる。二つの配列間の同一性を測定する好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＣＧパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．等、１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ、Ｆ．等、１９９０）を含むが、これらに限定されない。公衆は、ＮＣＢＩおよび他のソースからＢＬＡＳＴＸプログラム（ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、１９９０）を得ることができる。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性測定に使用することができる。
【0068】
本発明の融合タンパク質またはコンジュゲート
本発明のＩＬ－２突然変異体に基づいて、当業者は、本発明のＩＬ－２突然変異体および非ＩＬ－２の他の機能部分を融合タンパク質またはコンジュゲートで作ることができることを理解される。本明細書において、コンジュゲートとは、突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドの残基に共有結合する水溶性ポリマーを意味する。具体的な実施形態において、前記非ＩＬ－２機能部分は、Ｆｃフラグメント、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、抗ＨＳＡ抗体または抗体フラグメント、トランスフェリン、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）、エラスチン様ペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＥＬＰ）および抗原結合部分を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、前記抗原結合部分は、抗体またはその活性抗体フラグメント、Ｆａｂ分子、ｓｃＦｖ分子とＶＨＨ分子、免疫グロブリン分子、受容体タンパク質分子またはリガンドタンパク質分子であり得、前記免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ分子であり得る。
本発明のＩＬ－２突然変異体に基づいて、当業者は、本発明のＩＬ－２突然変異体および非ＩＬ－２の他の機能部分を融合タンパク質またはコンジュゲートで作ることができることを理解される。本明細書において、コンジュゲートとは、突然変異体ＩＬ－２ポリペプチドの残基に共有結合する水溶性ポリマーを意味する。具体的な実施形態において、前記非ＩＬ－２機能部分は、Ｆｃフラグメント、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、抗ＨＳＡ抗体または抗体フラグメント、トランスフェリン、ヒト絨毛性ゴナドトロピンβサブユニットカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）、エラスチン様ペプチド（ｅｌａｓｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＥＬＰ）および抗原結合部分を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、前記抗原結合部分は、抗体またはその活性抗体フラグメント、Ｆａｂ分子、ｓｃＦｖ分子とＶＨＨ分子、免疫グロブリン分子、受容体タンパク質分子またはリガンドタンパク質分子であり得、前記免疫グロブリン分子は、ＩｇＧ分子であり得る。
【0069】
この分野の一般的な操作に基づいて、当業者は、本発明のＩＬ－２突然変異体を含む融合タンパク質またはコンジュゲートを得る方法を知ることができる。例えば、本発明のＩＬ－２突然変異体を他の非ＩＬ－２機能部分に直接連結することができ、アダプターを介して連結することができる。前記アダプターは、（Ｇ３Ｓ）４等のＧ３Ｓの反復配列またはＧ４Ｓの反復配列を含むがこれらに限定されないＡＡＡまたはＧＳの反復配列であり得る。
【0070】
さらに、前記ＩＬ－２突然変異体または融合タンパク質コンジュゲートに対して、ポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）、ポリシアル化修飾（ＰＳＡ化）、飽和脂肪酸修飾、ヒアルロン酸修飾（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＨＡ）またはポリアミノ酸修飾（ｐｒｏｌｉｎｅ－ａｌａｍｉｎｅ－ｓｅｒｉｎｅ ｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＡＳ化）を実施してコンジュゲートを形成することもできる。
【0071】
本発明の医薬組成物およびその投与方式
本発明のＩＬ－２突然変異体に基づいて、本発明は、医薬組成物をさらに提供する。具体的な実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明のＩＬ－２突然変異体または融合タンパク質またはコンジュゲート、および任意選択で薬学的に許容される補助剤を含む。
本発明のＩＬ－２突然変異体に基づいて、本発明は、医薬組成物をさらに提供する。具体的な実施形態において、本発明の医薬組成物は、本発明のＩＬ－２突然変異体または融合タンパク質またはコンジュゲート、および任意選択で薬学的に許容される補助剤を含む。
【0072】
任意選択で、本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。所望であれば、本発明のＩＬ－２突然変異体ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲーに薬学的に許容される賦形剤を添加して組成物を形成することができる。
【0073】
例示的な賦形剤は、糖、無機塩、抗微生物剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、アミノ酸およびその組み合わせからなる群から選択されるそれらの賦形剤を含むが、これらに限定されない。糖、誘導体化糖（例えば、糖アルコール、アルドン酸、エステル化糖および／または糖ポリマー）等の糖は、賦形剤として存在し得る。特定の糖賦形剤は、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボース等の単糖類、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオス等の二糖類、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン、澱粉等の多糖類、および、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、ソルビトール（グルシトール）、イノシトール、シクロデキストリン等の糖アルコールを含む。
【0074】
賦形剤は、クエン酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、およびその組み合わせ等の無機塩または緩衝剤をさらに含むことができる。
【0075】
組成物は、微生物の成長を防止または阻害する抗微生物剤をさらに含み得る。本発明の一つまたは複数の実施例に適した抗微生物剤の非限定的な例は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、フェノール、フェネチルアルコール、およびその組み合わせである。
【0076】
高酸化剤も組成物に存し得る。抗酸化剤は、酸化を防止することによって、タンパク質、コンジュゲートまたは製剤の他の成分の変質を防止する。本発明の一つまたは複数の実施例に適した抗酸化剤は、例えば、アスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、ヒポアリン酸、モノチオグリセロールおよびその組み合わせを含む。
【0077】
界面活性剤は、賦形剤として存在することができる。例示的な界面活性剤は、「トゥイーン２０」および「トゥイーン８０」ならびにＦ６８およびＦ８８等のフルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）等のポリソルベート、ソルビタンエステル、リン脂質（例えば、レシチンおよび他のホスファチジルコリン）、脂肪酸および脂肪エステル等の脂質、コレステロールなどのステロイドを含む。
【0078】
酸または塩基は、賦形剤として組成物に存在することができる。使用可能な酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、硫酸、フマル酸およびその組み合わせからなる群から選択される酸を含む。塩基に適した例としては、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウムおよびその組み合わせからなる群から選択される塩基を含む（これらに限定されない）。
【0079】
ここで、組成物中に賦形剤として存在し得る一つまたは複数のアミノ酸について制つめ維する。この態様において、例示的なアミノ酸は、アルギニン、リジンおよびグリシンを含む。
【0080】
組成物中のコンジュゲート（即ち、活性剤とポリマー試薬との間に形成されるコンジュゲート）の量は、いくつかの要素に依存するが、組成物の単位用量容器（例えば、一つのバイアル）に貯蔵する時に最も好ましい治療有効量であろう。さらに、薬物製剤を一つの注射器に収納することができる。治療有効量は、徐々に増加する量の薬物を繰り返し投与することによってリン量的に所望の終点を生成する量を実験的に決定することができる。
【0081】
組成物の任意の個々の賦形剤の量は、賦形剤の活性および組成物の特定の必要性に応じて変化する。典型的に、任意の個々の賦形剤の最も好ましい量は、一般的な実験によって決定され、即ち、異なる量の賦形剤（範囲は、低いものから高いものまで）を含む組成物を調製して、安定性および他のパラメータを調べ、次に顕著な逆効果がない状況下で最も望ましい精嚢を得る範囲を決定する。
【0082】
しかしながら、全体として、賦形剤は、組成物中の賦形剤の約１重量％～約９９重量％、好ましくは約５重量％～約９８重量％、より好ましくは約１５重量％～約９５重量％の量で存在し、最も好ましくは、濃度は、３０重量％未満である。
【0083】
これらの組成物は、再構成可能な製剤および凍結乾燥剤および液体剤等、あらゆる種類の製剤および注射に特に適した製剤を含む。注射前の固体組成物の再構成に適した希釈剤の例としては、注射用静菌水、水中の５％デキストロース、リン酸緩衝生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、およびその組み合わせを含む。液体医薬組成物の場合、溶液剤および懸濁剤が企図される。
【0084】
本発明の一つまたは複数の実施例の組成物は、典型的に（必ずしもそうではない）注射によって投与されるため、投与の直前に全体的に液状溶液剤または懸濁剤である。薬物製剤は、シロップ剤、乳剤、軟膏剤、錠剤、散剤等の他の形態を使用することもできる。経肺、経直腸、経皮、経粘膜、経口、脊髄腔内、腫瘍内、腫瘍周囲、腹腔内、皮下、動脈内等の他の投与モードもさらに含む。
【0085】
本発明は、反応性症状を有する患者の治療に治療有効量の用量で投与する方法をさらに提供する。注射することができる（例えば、筋肉内、皮下および非経口）。非経口投与に適した製剤の種類としては、注射にすぐに使用可能な溶液剤、使用前の溶媒と組み合わせた乾燥剤、注射にすぐに使用可能な懸濁剤、使用前の溶媒と組み合わせた乾燥不溶性組成物、および投与前に希釈されるエマルジョンと液体濃縮剤を特に含む。
【0086】
投与方法は、当該突然変異体タンパク質、融合タンパク質またはコンジュゲートを投与することによって治療または予防することができる任意の症状を治療するために使用されることができる。当業者は、特定の組成物がどの症状を効果的に治療できるかを知っている。例えば、腎細胞がん、転移性黒色腫、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、急性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、小児関節リウマチ、アトピー性皮膚炎、乳がんおよび膀胱がんからなる群から選択される疾患を有する患者を治療する。
【0087】
投与される実際の用量は、被験者の年齢、体重および全体的な状態、ならびに治療する症状の重症度、衛生保健専門家の判断によって異なる。治療有効量は、当業者に知られており、および／または関連する参照文書および文献に記載される。全体的に、治療有効量の範囲は、約０．００１ｍｇ～１０００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／日～１００ｍｇ／日の用量であり、より好ましくは０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量内である。有機リン中毒などの症状が緩和および／または完全に解消されるまで、所定の用量を定期的に投与することができる。
【0088】
臨床医師の判断、患者のニーズ等に応じて、様々な投与スケジュールで単位投与量を投与することができる。特定の投与スケジュールは、当業者に知られているか、または従来の方法を使用して実験的に決定することができる。例示的な投与スケジュールは、１日２回、１日１回、週３回、週２回、週１回、月２回、月１回の投与、およびそれらの任意の組み合わせを含む（これらに限定されない）。臨床評価項目が達成されると、組成物の投与は中断される。
【0089】
本発明の好ましい特定の実施例を結び付けて本発明を説明するが、前述の説明および以下の実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点、および変形は、当業者にとって明らかである。
【0090】
本発明のＩＬ－２突然変異体の用途および使用方法
上記のように、本発明のＩＬ－２突然変異体は、高親和性ＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２タンパク質の親和性を排除または減少し、かつ中親和性ＩＬ－２受容体に対する前記突然変異体ＩＬ－２タンパク質の親和性を維持するとともに、ＩＬ－２の生物学的活性を維持することにより、Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞を含むがこれらに限定されない腫瘍免疫細胞の増殖をよりよく刺激することができる。従って、本発明のＩＬ－２突然変異体、融合タンパク質、コンジュゲートまたは医薬組成物は、対応する薬物に調製されることができる。前記薬物は、インビトロでＴリンパ球および自然殺傷ＮＫ細胞を増殖させたり、免疫治療にＩＬ－２を使用する疾患を治療したりするために使用されることができる。具体的な実施形態において、前記疾患は、癌であり、例えば、免疫系を刺激したり、免疫細胞を増殖させたりして治療する必要のある癌である。具体的な実施形態において、前記疾患は、免疫疾患、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ感染、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ感染、関節リウマチ、アトピー皮膚炎等であり得る。
上記のように、本発明のＩＬ－２突然変異体は、高親和性ＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２タンパク質の親和性を排除または減少し、かつ中親和性ＩＬ－２受容体に対する前記突然変異体ＩＬ－２タンパク質の親和性を維持するとともに、ＩＬ－２の生物学的活性を維持することにより、Ｔエフェクター細胞およびＮＫ細胞を含むがこれらに限定されない腫瘍免疫細胞の増殖をよりよく刺激することができる。従って、本発明のＩＬ－２突然変異体、融合タンパク質、コンジュゲートまたは医薬組成物は、対応する薬物に調製されることができる。前記薬物は、インビトロでＴリンパ球および自然殺傷ＮＫ細胞を増殖させたり、免疫治療にＩＬ－２を使用する疾患を治療したりするために使用されることができる。具体的な実施形態において、前記疾患は、癌であり、例えば、免疫系を刺激したり、免疫細胞を増殖させたりして治療する必要のある癌である。具体的な実施形態において、前記疾患は、免疫疾患、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ感染、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ感染、関節リウマチ、アトピー皮膚炎等であり得る。
【0091】
本発明は、ＣＡＴ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ等の細胞治療中にインビトロで細胞を増殖させる際の野生型ＩＬ－２に代替物そして使用されることができる。
【0092】
本発明の利点は、次のとおりである。
１．本発明のＩＬ－２突然変異体タンパク質は、高親和性ＩＬ－２受容体との親和性を減少または排除し、基本的に中親和性ＩＬ－２受容体への親和性を維持する。
２．本発明のＩＬ－２突然変異体の構造は、天然ＩＬ－２の構造に近く、タンパク質の他の構造部位に対する突然変異の影響を回避し、生物学的活性を維持する。
３．従来の技術の他のＩＬ－２突然変異体と比較して、本発明のＩＬ－２突然変異体は、より低い免疫原性を有する。
４．本発明のＩＬ－２突然変異体は、簡単な分子設計を有し、異なる分子への適用に便利である。
５．本発明のＩＬ－２突然変異体は、生産および品質管理に便利であり、一般にインビトロでの再修飾プロセスを必要とせず、生産効率を改善するための段階を減らす。
６．本発明のＩＬ－２突然変異体は、他の分子と二機能性または多機能性の融合タンパク質または免疫組成物を形成するのに便利である。
７．本発明のＩＬ－２突然変異体は、免疫治療に使用されることができ、それは、天然ＩＬ－２によって引き起こされる血管（または毛細血管）リーク症候群（ＶＬＳ）を引き起こされないであろう。
１．本発明のＩＬ－２突然変異体タンパク質は、高親和性ＩＬ－２受容体との親和性を減少または排除し、基本的に中親和性ＩＬ－２受容体への親和性を維持する。
２．本発明のＩＬ－２突然変異体の構造は、天然ＩＬ－２の構造に近く、タンパク質の他の構造部位に対する突然変異の影響を回避し、生物学的活性を維持する。
３．従来の技術の他のＩＬ－２突然変異体と比較して、本発明のＩＬ－２突然変異体は、より低い免疫原性を有する。
４．本発明のＩＬ－２突然変異体は、簡単な分子設計を有し、異なる分子への適用に便利である。
５．本発明のＩＬ－２突然変異体は、生産および品質管理に便利であり、一般にインビトロでの再修飾プロセスを必要とせず、生産効率を改善するための段階を減らす。
６．本発明のＩＬ－２突然変異体は、他の分子と二機能性または多機能性の融合タンパク質または免疫組成物を形成するのに便利である。
７．本発明のＩＬ－２突然変異体は、免疫治療に使用されることができ、それは、天然ＩＬ－２によって引き起こされる血管（または毛細血管）リーク症候群（ＶＬＳ）を引き起こされないであろう。
【0093】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。
【実施例】
【0094】
実施例１．突然変異体インターロイキン－２（ＩＬ－２）タンパク質の合成
１．遺伝子合成
インターロイキン－２（ＩＬ－２）タンパク質の突然変異体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、自動化された遺伝子合成法によって得られる。いくつかの実施例において、遺伝子フラグメントの末端にＨＩＳタグを追加することは、精製に有利し、いくつかの実施例において、遺伝子フラグメントの末端にＩｇＧ１－Ｆｃを追加することは、精製に有利し、同時にＦｃタグは、タンパク質医薬品の半減期を延長するための一般的な手段でもある。遺伝子フラグメントの側面には、単一の制限エンドヌクレアーゼ切断位置がある。すべての遺伝子合成配列は、真核細胞においてタンパク質を標的分泌するリーディングペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を有するように設計される。
１．遺伝子合成
インターロイキン－２（ＩＬ－２）タンパク質の突然変異体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、自動化された遺伝子合成法によって得られる。いくつかの実施例において、遺伝子フラグメントの末端にＨＩＳタグを追加することは、精製に有利し、いくつかの実施例において、遺伝子フラグメントの末端にＩｇＧ１－Ｆｃを追加することは、精製に有利し、同時にＦｃタグは、タンパク質医薬品の半減期を延長するための一般的な手段でもある。遺伝子フラグメントの側面には、単一の制限エンドヌクレアーゼ切断位置がある。すべての遺伝子合成配列は、真核細胞においてタンパク質を標的分泌するリーディングペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を有するように設計される。
【0095】
【表1】
【0096】
２．プラスミドの構築
合成後の遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４プラスミドにアクローニングし、方法は、メーカーの使用説明書に従って分子生物学試薬を使用する。
合成後の遺伝子をｐｃＤＮＡ３．４プラスミドにアクローニングし、方法は、メーカーの使用説明書に従って分子生物学試薬を使用する。
【0097】
３．突然変異体インターロイキン－２（ＩＬ－２）タンパク質の発現
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、プラスミドをトランスフェクトし、細胞を３７°Ｃ、８％ＣＯ２の条件下でシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養し、トランスフェクション前日に振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓ）に接種し、メーカーの指示に従ってトランスフェクション法を実施する。
２日目、４日目および５日目の細胞上清懸濁液をそれぞれ収集し、ウエスタンブロッティングを実施してタンパク質の発現を確認する。
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、プラスミドをトランスフェクトし、細胞を３７°Ｃ、８％ＣＯ２の条件下でシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養し、トランスフェクション前日に振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓ）に接種し、メーカーの指示に従ってトランスフェクション法を実施する。
２日目、４日目および５日目の細胞上清懸濁液をそれぞれ収集し、ウエスタンブロッティングを実施してタンパク質の発現を確認する。
【0098】
実施例２．ＣＤ２５タンパク質の発現
遺伝子合成
ＣＤ２５タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２３）をコードするヌクレオチド配列は、自動化された遺伝子合成法によって得られる。配列番号２４（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）は、アダプターのアミノ酸配列である。いくつかの実施例において、遺伝子フラグメントは、アダプターを介してＩｇＧ１－Ｆｃと共発現され、精製に有利する。遺伝子フラグメントの側面には、単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位がある。すべての遺伝子合成配列は、真核細胞においてタンパク質を標的分泌するリーディングペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を有するように設計される。配列番号２５は、例示的なリーディングペプチド配列を示す。合成後の遺伝子はをｐｃＤＮＡ３．４プラスミドにアクローニングし、方法は、メーカーの使用説明書に従って分子生物学試薬を使用する。
遺伝子合成
ＣＤ２５タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２３）をコードするヌクレオチド配列は、自動化された遺伝子合成法によって得られる。配列番号２４（ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）は、アダプターのアミノ酸配列である。いくつかの実施例において、遺伝子フラグメントは、アダプターを介してＩｇＧ１－Ｆｃと共発現され、精製に有利する。遺伝子フラグメントの側面には、単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位がある。すべての遺伝子合成配列は、真核細胞においてタンパク質を標的分泌するリーディングペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を有するように設計される。配列番号２５は、例示的なリーディングペプチド配列を示す。合成後の遺伝子はをｐｃＤＮＡ３．４プラスミドにアクローニングし、方法は、メーカーの使用説明書に従って分子生物学試薬を使用する。
【0099】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してプラスミドをトランスフェクトし、細胞を３７℃、８％ＣＯ２の条件下でシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養し、トランスフェクション前日に振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋｓ）に接種し、メーカーの指示に従ってトランスフェクション法を実施する。
２日目、４日目および５日目の細胞上清懸濁液をそれぞれ収集し、ウエスタンブロッティングを実施してタンパク質の発現を確認する。
２日目、４日目および５日目の細胞上清懸濁液をそれぞれ収集し、ウエスタンブロッティングを実施してタンパク質の発現を確認する。
【0100】
実施例３．ＥＬＩＳＡ、Ｆｏｒｔｅｂｉｏまたはｂｉａｃｏｒｅを用いてＣＤ２５との結合親和性の検出実験
本発明者らは、酵素結合免疫吸着剤分析を用いて、ＩＬ－２突然変異体とＣＤ２５との結合能力を検出する。
本発明者らは、酵素結合免疫吸着剤分析を用いて、ＩＬ－２突然変異体とＣＤ２５との結合能力を検出する。
【0101】
ＣＤ２５（実施例２に由来する）を９６ウェルこう吸着マイクロウェルプレート（３５９０、Ｃｏｓｔａｒ）にコーティングし、洗浄し、ブロックする。試験するサンプルを適切な濃度に希釈し、ウェルに加える。ＴＭＢで発色し、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍ５、Ｍｏｌｅｒｌｄｅｒ Ｄｅｖｉｅｓ）で４５０／６５０ｎｍの波長で各ウェルの信号値を読み取る。ｒｈＩＬ－２は、注射用組換えトインターロイキン－２（泉奇（ｑｕａｎｑｉ））である。
【0102】
【表2】
【0103】
結果は図１に示される。図からわかるように、実験濃度下で、ｒｈＩＬ－２が結合していることがはっきりとわかり、結合活性の用量関連性のある結合サイズを比較すると、ｒｈＩＬ－２＞ＩＬ－２ｇｍ２＞ＩＬ－２ｇｍ４＞ＩＬ－２ｇｍ１１＞ＩＬ－２ｇｍ３＞ＩＬ－２ｇｍ７＞ＩＬ－２ｇｍ１２＞ＩＬ－２ｇｍ１３である。これらの濃度下で、用量関連性がないものは、結合しないと判断することができ、これには、ＩＬ－２ｇｍ１、ＩＬ－２ｇｍ５、ＩＬ－２ｇｍ６、ＩＬ－２ｇｍ８、ＩＬ－２ｇｍ９、ＩＬ－２ｇｍ１０、ＩＬ－２ｇｍ１４、ＩＬ－２ｇｍ１５、ＩＬ－２ｑｍ（ＣＮ１０３４９２４１１Ａ）が含まれる。ＩＬ－２ｇｍ１、ＩＬ－２ｇｍ５、ＩＬ－２ｇｍ６、ＩＬ－２ｇｍ８、ＩＬ－２ｇｍ９、ＩＬ－２ｇｍ１０、ＩＬ－２ｇｍ１４、ＩＬ－２ｇｍ１５は、ＣＤ２５との結合能力を完全に失い、ＩＬ－２ｇｍ２、ＩＬ－２ｇｍ４、ＩＬ－２ｇｍ１１、ＩＬ－２ｇｍ３、ＩＬ－２ｇｍ７、ＩＬ－２ｇｍ１２、ＩＬ－２ｇｍ１３は、ＣＤ２５との結合能力を一部失ったことを証明する。
【0104】
実施例４．ＣＴＬＬ２細胞を用いた細胞増殖分析
本実施例において、本発明者らは、ＣＴＬＬ２細胞を用いて細胞増殖分析におけるｒｈＩＬ－２および実施例１の突然変異体インターロイキン－２の活性を評価する。
本実施例において、本発明者らは、ＣＴＬＬ２細胞を用いて細胞増殖分析におけるｒｈＩＬ－２および実施例１の突然変異体インターロイキン－２の活性を評価する。
【0105】
実験プレートに同数のＣＴＬＬ－２細胞（ＩＬ－２依存性に属し、細胞表面でＣＤ２５を高度に発現するマウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株）を接種し、次に濃度勾配に従ってｒｈＩＬ－２およびＩＬ－２突然変異体をそれぞれ入れ、４８時間インキュベートした後ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒに入れる。化学発光により細胞内ＡＴＰの含有量（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５）を検出し、各ウェルの細胞数を検出することにより、細胞増殖に対する異なる濃度のｒｈＩＬ－２およびＩＬ－２突然変異体の影響を検出する。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアで分析し、曲線を非線形回帰分析（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）でフィッティングする。用量反応曲線の非線形回帰分析から、細胞増殖のＥＣ５０値（最大応答の５０％を示すのに必要な試験化合物濃度）を得る。
【0106】
細胞増殖分析を用いてｒｈＩＬ－２および突然変異体インターロイキン－２（Ｈｉｓタグ）の活性を測定し、表２および図２に結果の概要を示す。すべての試験部品は、用量依存的な方式でＣＴＬＬ－２の細胞成長を誘導する。細胞増殖倍数が対応する場合、ＥＣ５０が大きいほど、ＣＴＬＬ２の成長を刺激するその活性がより弱いことが証明されると考えられる。このような変化は、ＣＤ２５への結合に対するその突然変異タンパク質影響によるものであり、突然変異体タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体活性化によるＩＬ－２Ｒシグナル伝達を維持するため、濃度が増加した後、細胞は、依然として効果的に増幅される。ｒｈＩＬ－２に対するすべてのＩＬ－２突然変異体（Ｈｉｓタグ）の有効性は、８．３１４％を超えない。ＩＬ－２ｇｍ（１～１５）は、ＣＤ２５との結合を除去することができ、ＩＬ－２Ｒαβγヘテロ三量体を形成しなかったため、刺激作用が減少することを証明する。好ましくは、ＩＬ－２ｇｍ１、ＩＬ－２ｇｍ３、ＩＬ－２ｇｍ５、ＩＬ－２ｇｍ６、ＩＬ－２ｇｍ７、ＩＬ－２ｇｍ８、ＩＬ－２ｇｍ９、ＩＬ－２ｇｍ１０、ＩＬ－２ｇｍ１２、ＩＬ－２ｇｍ１４およびＩＬ－２ｇｍ１５は、対照サンプルｒｈＩＬ－２と比較して、増殖エフェクターが５０倍を超えた。ここで、ＩＬ－２ｇｍ１、ＩＬ－２ｇｍ６、ＩＬ－２ｇｍ１４は、１００倍を超えた。
【0107】
【表3】
【0108】
細胞増殖分析を用いてｒｈＩＬ－２および突然変異体インターロイキン－２（Ｆｃタグ）の活性を測定し、表３および図３に結果の概要を示す。すべての試験部品は、用量依存的な方式でのＣＴＬＬ－２成長を誘導する。細胞増殖倍数が対応する場合に、ＥＣ５０が大きいほど、ＣＴＬＬ２成長を刺激するその活性がより弱いことが証明される。このような変化は、ＣＤ２５との結合に対するその突然変異体タンパク質の影響によるものであり、突然変異体タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体活性化によるＩＬ－２Ｒシグナル伝達を維持するため、濃度が増加した後、細胞は、依然として効果的に増幅される。ｒｈＩＬ－２に対するすべてのＩＬ－２突然変異体（Ｆｃタグ）の有効性は、３１．５４６％を超えない。同様に、ＩＬ－２ｇｍ（４～６）の二重体の形態は、ＣＤ２５との結合を除去することができ、ＩＬ－２Ｒαβγヘテロ三量体を形成しなかったため、刺激作用が減少することを証明する。好ましくは、ＩＬ－２ｑｍ－Ｆｃ、ＩＬ－２ｇｍ５およびＩＬ－２ｇｍ６は、対照サンプルｒｈＩＬ－２と比較してＣＴＬＬ２に対する増殖効果が５０倍を超える。ここで、ＩＬ－２ｑｍ－ＦｃおよびＩＬ－２ｇｍ６－Ｆｃは、試験濃度範囲で顕著な細胞増殖を観察されない。
【0109】
【表4】
【0110】
実施例５．ＮＫ９２細胞を用いた細胞増殖分析
本発明者らは、ＮＫ９２細胞を用いて細胞増殖分析におけるｒｈＩＬ－２、実施例１の突然変異体インターロイキン－２の活性を評価する。
実験プレートに同じ数のＮＫ９２細胞（ＮＫ－９２細胞は、急進性非ホジキンリンパ腫に罹患している５０歳の白人男性の末梢血単核細胞に由来するＩＬ－２依存性ＮＫ細胞株である。その一部の細胞表面でＣＤ２５を発現するもの。）を接種し、次に濃度勾配に従ってそれぞれｒｈＩＬ－２およびＩＬ－２突然変異体を加え、７２時間インキュベートした後、ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒを入れる。化学発光により細胞内ＡＴＰの含有量（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５）を検出し、各ウェルの細胞数を検出することにより、細胞増殖に対する異なる濃度のｒｈＩＬ－２およびＩＬ－２突然変異体の影響を検出する。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアで分析し、曲線を非線形回帰分析（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）でフィッティングする。用量反応曲線の非線形回帰分析から、細胞増殖のＥＣ５０値（最大応答の５０％を示すのに必要な試験化合物濃度）を得る。
本発明者らは、ＮＫ９２細胞を用いて細胞増殖分析におけるｒｈＩＬ－２、実施例１の突然変異体インターロイキン－２の活性を評価する。
実験プレートに同じ数のＮＫ９２細胞（ＮＫ－９２細胞は、急進性非ホジキンリンパ腫に罹患している５０歳の白人男性の末梢血単核細胞に由来するＩＬ－２依存性ＮＫ細胞株である。その一部の細胞表面でＣＤ２５を発現するもの。）を接種し、次に濃度勾配に従ってそれぞれｒｈＩＬ－２およびＩＬ－２突然変異体を加え、７２時間インキュベートした後、ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒを入れる。化学発光により細胞内ＡＴＰの含有量（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ５）を検出し、各ウェルの細胞数を検出することにより、細胞増殖に対する異なる濃度のｒｈＩＬ－２およびＩＬ－２突然変異体の影響を検出する。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアで分析し、曲線を非線形回帰分析（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）でフィッティングする。用量反応曲線の非線形回帰分析から、細胞増殖のＥＣ５０値（最大応答の５０％を示すのに必要な試験化合物濃度）を得る。
【0111】
細胞増殖分析を用いてｒｈＩＬ－２および突然変異体インターロイキン－２（Ｈｉｓタグ）の活性を測定し、表４および図４に結果の概要を示す。すべての試験部品は、用量依存的な方式でＮＫ９２の細胞成長を誘導する。細胞増殖倍数が対応する場合、ＥＣ５０が大きいほど、ＮＫ９２の成長を刺激するその活性がより弱いことが証明されると考えられる。このような変化は、ＣＤ２５への結合に対するその突然変異体タンパク質影響によるものであり、突然変異体タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体活性化によるＩＬ－２Ｒシグナル伝達を維持するため、濃度が増加した後、細胞は、依然として効果的に増幅される。ｒｈＩＬ－２に対するすべてのＩＬ－２突然変異体（Ｈｉｓタグ）の有効性は、１．７２１％を超えない。ＩＬ－２ｇｍ（１～１５）表面でＣＤ２５を発現する一部のＮＫ９２細胞においてＣＤ２５との結合を除去し、ＩＬ－２Ｒαβγヘテロ三量体を形成しなかったため、刺激作用が減少することを証明する。ここで、ＩＬ－２ｇｍ１、ＩＬ－２ｇｍ５およびＩＬ－２ｇｍ１４が最も明確であり、増殖効果は、１００より大きく減少する。
【0112】
【表5】
【0113】
細胞増殖分析を用いてｒｈＩＬ－２および突然変異体インターロイキン－２（Ｆｃタグ）の活性を測定し、表５および図５に結果の概要を示す。すべての試験部品は、用量依存的な方式でＮＫ９２細胞成長を誘導する。細胞増殖倍数が対応する場合に、ＥＣ５０が大きいほど、ＮＫ９２成長を刺激するその活性がより弱いことが証明される。このような変化は、ＣＤ２５との結合に対するその突然変異体タンパク質の影響によるものであり、突然変異体タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体活性化によるＩＬ－２Ｒシグナル伝達を維持するため、濃度が増加した後、細胞は、依然として効果的に増幅される。ｒｈＩＬ－２に対するすべてのＩＬ－２突然変異体（Ｆｃタグ）の効能は、３４．７８３％を超えない。同様に、ＩＬ－２ｑｍ－Ｆｃ、ＩＬ－２ｇｍ（４～６）の二重体型は、ＣＤ２５を発現する一部のＮＫ９２細胞とＣＤ２５との結合を減少させることができ、ＩＬ－２Ｒαβγヘテロ三量体を形成しなかったため、刺激作用が減少することを証明する。好ましくは、ＩＬ－２ｑｍ－ＦｃおよびＩＬ－２ｇｍ６－Ｆｃは、ｒｈＩＬ－２と比較して１００倍より大きく減少する。しかし、ＮＫ９２細胞に対するＩＬ－２ｑｍの増殖倍数は、他の突然変異体タンパク質よりも著しく小さい。
【0114】
【表6】
【0115】
実施例６．本発明の突然変異体タンパク質の半減期研究
本発明者らは、本発明の方法で得られた突然変異体タンパク質のインビボ半減期をさらに研究し、本発明の方法で得られた突然変異体タンパク質のインビボ半減期がすべて異なる程度に増加したことを見出した。
本発明者らは、本発明の方法で得られた突然変異体タンパク質のインビボ半減期をさらに研究し、本発明の方法で得られた突然変異体タンパク質のインビボ半減期がすべて異なる程度に増加したことを見出した。
【0116】
実施例７．ＩＬ－２突然変異体タンパク質の合成（ＨＳＡタグ）
本発明者らは、次のようなＩＬ－２突然変異体を合成した。
本発明者らは、次のようなＩＬ－２突然変異体を合成した。
【0117】
【表7】
【0118】
ＩＬ－２突然変異体分子ＩＬ－２ｇｍ１、ＩＬ－２ｇｍ４、ＩＬ－２ｇｍ６、ＩＬ－２ｇｍ７コード配列とＨＳＡコード配列とを連結し、分子クローニング手段を介して真核発現ベクターに構築し、ＩＬ－２突然変異体分子の発現ベクターを調製する。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地で培養した２９３Ｅ細胞を用いて、ＩＬ－２突然変異体分子の一過性トランスフェクション発現を実行する。トランスフェクションの２４時間前に、１Ｌの細胞培養フラスコに０．５×１０６細胞／ｍｌの２９３Ｅ細胞１５０ｍｌを接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１２０ｒｐｍで振とう培養する。トランスフェクションの際、まず１５０μｌの２９３フェクチン（ｆｅｃｔｉｎ）を取り、２．８５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭに入れ、十分に均一に混合し、室温下で２分間インキュベートし、同時に、ＩＬ－２分子を発現するためのプラスミド１５０μｇをそれぞれＯｐｔｉＭＥＭで３ｍｌに希釈する。希釈した上記トランスフェクション試薬およびプラスミドを十分に混合し、室温下で１５分間インキュベートし、次に、すべての混合物を細胞に入れて均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１２０ｒｐｍで７日間振とう培養する。細胞培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルター膜で上清をろ過し、次にＱ－ＨＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ）を用いて精製し、２０ｍＭのＴｒｉｓ０～５００ｍＭのＮａＣｌを用いて、ｐＨ８．０条件下で線形溶出し、用量に応じてサンプルを連続的に収集する。４～２０％勾配ゲル（ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）を用いて各収集成分に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行い、電気泳動純度に応じてサンプルを合わせる。
【0119】
実施例８．受容体タンパク質の調製
ＩＬ－２突然変異体分子がＩＬ－２Ｒα受容体およびＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体化受容体との結合能力を研究するために、ヒト由来ＩＬ－２Ｒα受容体およびＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体化受容体タンパク質を調製し、Ｂｉａｃｏｒｅ親和性検出に使用する。
ヒト由来ＩＬ－２Ｒα受容体の設計は、ＩＬ－２Ｒα細胞外ドメインコード配列を６×Ｈｉｓ Ｔａｇコード配列に連結し（配列番号３１）、真核発現ベクターにクローニングするものである。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地で培養した２９３Ｅ細胞を用いて、ＩＬ－２Ｒα受容体の一過性トランスフェクション発現を実施する。トランスフェクションの２４時間前に、１Ｌの細胞培養フラスコに０．５×１０６細胞／ｍｌの２９３Ｅ細胞１５０ｍｌを接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１２０ｒｐｍで振とう培養する。トランスフェクションの際、まず１５０μｌの２９３フェクチンを取り、２．８５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭに入れ、十分に均一に混合した後、室温下で２分間インキュベートし、同時に、ＩＬ－２Ｒα受容体を発現するためのプラスミド１５０μｇをＯｐｔｉＭＥＭで３ｍｌまで希釈する。希釈した上記トランスフェクション試薬およびプラスミドを十分に混合し、室温下で１５分間インキュベートし、次にすべての混合物を細胞に入れて均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１２０ｒｐｍで７日間振とう培養する。細胞培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルター膜で上清をろ過し、次にＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ）を用いて精製し、２０ｍＭのＰＢ－０．５ＭのＮａＣｌ－１００ｍＭのイミダゾール条件下で溶出する。４～２０％勾配ゲル（ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）を用いて、精製タンパク質に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行う。
ＩＬ－２突然変異体分子がＩＬ－２Ｒα受容体およびＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体化受容体との結合能力を研究するために、ヒト由来ＩＬ－２Ｒα受容体およびＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体化受容体タンパク質を調製し、Ｂｉａｃｏｒｅ親和性検出に使用する。
ヒト由来ＩＬ－２Ｒα受容体の設計は、ＩＬ－２Ｒα細胞外ドメインコード配列を６×Ｈｉｓ Ｔａｇコード配列に連結し（配列番号３１）、真核発現ベクターにクローニングするものである。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地で培養した２９３Ｅ細胞を用いて、ＩＬ－２Ｒα受容体の一過性トランスフェクション発現を実施する。トランスフェクションの２４時間前に、１Ｌの細胞培養フラスコに０．５×１０６細胞／ｍｌの２９３Ｅ細胞１５０ｍｌを接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１２０ｒｐｍで振とう培養する。トランスフェクションの際、まず１５０μｌの２９３フェクチンを取り、２．８５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭに入れ、十分に均一に混合した後、室温下で２分間インキュベートし、同時に、ＩＬ－２Ｒα受容体を発現するためのプラスミド１５０μｇをＯｐｔｉＭＥＭで３ｍｌまで希釈する。希釈した上記トランスフェクション試薬およびプラスミドを十分に混合し、室温下で１５分間インキュベートし、次にすべての混合物を細胞に入れて均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１２０ｒｐｍで７日間振とう培養する。細胞培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルター膜で上清をろ過し、次にＮｉ－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ）を用いて精製し、２０ｍＭのＰＢ－０．５ＭのＮａＣｌ－１００ｍＭのイミダゾール条件下で溶出する。４～２０％勾配ゲル（ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）を用いて、精製タンパク質に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行う。
【0120】
ヒト由来ＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体化受容体の設計は、「Ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ Ｈｏｌｅｓ」技術を利用し、ＩＬ－２Ｒβ細胞外ドメインコード配列をコード「Ｋｎｏｂｓ」Ｆｃフラグメントに連結し（配列番号３２）、真核発現ベクターにクローニングし、ＩＬ－２Ｒγ細胞外ドメインコード配列をコード「Ｈｏｌｅｓ」Ｆｃフラグメントに連結し（配列番号３３）、真核発現ベクターにクローニングする。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地で培養した２９３Ｅ細胞を用いて、ＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体化受容体の一過性トランスフェクション発現を実施する。トランスフェクションの２４時間前に、１Ｌの細胞培養フラスコに０．５×１０６細胞／ｍｌの２９３Ｅ細胞１５０ｍｌを接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１２０ｒｐｍで振とう培養する。トランスフェクションの際、まず１５０μｌの２９３フェクチンを取り、２．８５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭに入れ、十分に均一に混合した後、室温下で２分間インキュベートし、同時にＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体化受容体を発現するためのプラスミド７５μｇをそれぞれＯｐｔｉＭＥＭで３ｍｌまで希釈する。希釈した上記トランスフェクション試薬およびプラスミドを十分に混合し、室温下で１５分間インキュベートし、次にすべての混合物を細胞に入れて均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１２０ｒｐｍで７日間振とう培養する。細胞培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルター膜で上清をろ過し、次にＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ）を用いて精製し、２０ｍＭのクエン酸－クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０条件下で溶出し、１ＭのＴｒｉｓ ｂａｓｅでｐＨを中性に調節する。４～２０％勾配ゲル（ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社）を用いて精製タンパク質に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行う。
【0121】
実施例９．ｂｉａｃｏｒｅを用いた受容体との結合親和性の検出実験
野生型と比較した、ＩＬ－２突然変異体と受容体との親和性を研究するために、以下の条件下で組換えモノマーＩＬ－２Ｒαサブユニットを用い、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ）を介して、ヒトＩＬ－２Ｒαサブユニットに対するＩＬ－２突然変異体および野生型ＩＬ－２－ＨＳＡの親和性を測定し、ヒトＩＬ－２ＲαサブユニットをＣＭ５チップに固定する（１９０ＲＵ）。２５℃下でＨＢＳ－ＥＰ緩衝液中のＩＬ－２突然変異体およびＩＬ－２－ＨＳＡを分析物として使用する。ＩＬ－２Ｒαの場合、分析物濃度は、２００ｎＭから１．５２６ｎＭ（１：２希釈）に低下し、３０μｌ／分で流動する（結合時間は、１８０秒であり、解離時間は、３００秒である）。ＩＬ－２Ｒαの場合、２０ｍＭのＮａＯＨを用いて、３０ｕｌ／分で１０秒間再生する。ＩＬ－２Ｒαの場合、１：１結合、ＲＩ≠０、Ｒ最大値＝全体フィッティングデータを使用する。
野生型と比較した、ＩＬ－２突然変異体と受容体との親和性を研究するために、以下の条件下で組換えモノマーＩＬ－２Ｒαサブユニットを用い、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ）を介して、ヒトＩＬ－２Ｒαサブユニットに対するＩＬ－２突然変異体および野生型ＩＬ－２－ＨＳＡの親和性を測定し、ヒトＩＬ－２ＲαサブユニットをＣＭ５チップに固定する（１９０ＲＵ）。２５℃下でＨＢＳ－ＥＰ緩衝液中のＩＬ－２突然変異体およびＩＬ－２－ＨＳＡを分析物として使用する。ＩＬ－２Ｒαの場合、分析物濃度は、２００ｎＭから１．５２６ｎＭ（１：２希釈）に低下し、３０μｌ／分で流動する（結合時間は、１８０秒であり、解離時間は、３００秒である）。ＩＬ－２Ｒαの場合、２０ｍＭのＮａＯＨを用いて、３０ｕｌ／分で１０秒間再生する。ＩＬ－２Ｒαの場合、１：１結合、ＲＩ≠０、Ｒ最大値＝全体フィッティングデータを使用する。
【0122】
以下の条件下で、組換えＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥ）を介して、ヒトＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体に対するＩＬ－２突然変異体および野生型ＩＬ－２－ＨＳＡの親和性を測定し、ヒトｈＩＬ－２Ｒβおよびγ ＥＣＤ－Ｎ－ｈＩｇＧ１Ｆｃをタンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａチップに固定する（４００ＲＵ）。２５℃下でＨＢＳ－ＥＰ緩衝液中のＩＬ－２突然変異体およびＩＬ－２－ＨＳＡを分析物として使用する。ＩＬ－２Ｒβγの場合、分析物濃度は、２００ｎＭから１．５６２５ｎＭに低下し（１：２希釈）、３０μｌ／分で流動する（結合時間は、１８０秒であり、解離時間は、３００秒である）。ＩＬ－２Ｒβγの場合、１０ｍＭのグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）（ｐＨ１．５）を用いて、３０ｕｌ／分で３０秒間再生する。ＩＬ－２Ｒβγの場合、１：１結合、ＲＩ≠０、Ｒ最大値＝局所フィッティングデータを使用する。
結果は、次のようである。
結果は、次のようである。
【0123】
【表8】
【0124】
野生型ＩＬ－２－ＨＳＡと比較したヒトＩＬ－２Ｒαサブユニットとの親和性：ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ａ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｂ－ＨＳＡおよびＩＬ－２ｇｍ１ｃ－ＨＳＡは、結合がなく、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡおよびＩＬ－２ｇｍ１ｄ－ＨＳＡは、結合がある。
【0125】
野生型ＩＬ－２－ＨＳＡと比較したヒト組換えＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体との親和性：ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ａ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｂ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｃ－ＨＳＡおよびＩＬ－２ｇｍ１ｄ－ＨＳＡは、野生型に対応する。
【0126】
従って、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ａ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｂ－ＨＳＡおよびＩＬ－２ｇｍ１ｃ－ＨＳＡは、好ましい目的分子である。
【0127】
図８Ａは、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ａ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｂ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｃ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｄ－ＨＳＡ、野生型ＩＬ－２－ＨＳＡとヒトＩＬ－２Ｒαサブユニットとの親和性を示す。
【0128】
図８Ｂは、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ａ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｂ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｃ－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ１ｄ－ＨＳＡ、野生型ＩＬ－２－ＨＳＡとヒト組換えＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体との親和性を示す。
【0129】
実施例１０．ＮＫ９２細胞を用いた細胞増殖分析
ＮＫ－９２細胞は、急進性非ホジキンリンパ腫に罹患している５０歳の白人男性の末梢血単核細胞に由来するＩＬ－２依存性ＮＫ細胞株である。その一部の細胞表面でＣＤ２５を発現する。本発明者らは、ＮＫ９２細胞を用いて細胞増殖分析におけるＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２－ＨＳＡの活性を評価する。
ＮＫ－９２細胞は、急進性非ホジキンリンパ腫に罹患している５０歳の白人男性の末梢血単核細胞に由来するＩＬ－２依存性ＮＫ細胞株である。その一部の細胞表面でＣＤ２５を発現する。本発明者らは、ＮＫ９２細胞を用いて細胞増殖分析におけるＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２－ＨＳＡの活性を評価する。
【0130】
対数増殖期のＮＫ９２細胞を回収し、基礎培地ＭＥＭ－αで１回洗浄した後、これ（５０００個／ウェル）とは異なる濃度のＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２－ＨＳＡを実験培地（Ｇｉｂｃｏ（商品番号３２５６１－０３７）から購入したＭＥＭ－α培地に１２．５％のウシ胎児血清および１２．５％のウマ血清を加えたもの）で、３７℃、５％二酸化炭素インキュベーターで４８時間共培養する。各ウェルに１００μｌのＡＴＰ検出基質ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（ｐｒｏｍｅｇａ（商品番号Ｇ７５７１）から購入）を入れ、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（モデルＩ３ｘ）から購入）で欠点法で全波長蛍光値を検出する。
【0131】
細胞増殖分析を用いてＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２分子ＩＬ－２－ＨＳＡの活性を測定し、結果は、図９に示される。すべての試験部品は、用量依存的な方式でＮＫ９２細胞の成長を誘導する。細胞増殖倍数が対応する場合、ＥＣ５０が大きいほど、ＮＫ９２の成長を刺激するその活性がより弱いことが証明される。このような変化は、ＣＤ２５との結合に対するその突然変異体タンパク質の影響によるものであり、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ突然変異体タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβγヘテロ二量体活性化によるＩＬ－２Ｒシグナル伝達を維持するため、濃度が増加した後、細胞は、依然として効果的に増殖される。ＩＬ－２－ＨＳＡと比較して、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡがＮＫ９２細胞増殖を刺激する比活性は、１．０７％であり、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡが表面でＣＤ２５を発現する一部のＮＫ９２細胞においてＣＤ２５との結合を除去し、ＩＬ－２Ｒαβγヘテロ三量体を形成しなかったため、刺激作用が減少することを証明する。ＩＬ－２－ＨＳＡと比較して、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡがＮＫ９２細胞増殖を刺激する効果は、約１００倍減少する。ＩＬ－２－ＨＳＡと比較して、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡがＮＫ９２細胞増殖を刺激する比活性は、１．７８％であり、ＩＬ－２－ＨＳＡと比較して、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡがＮＫ９２細胞増殖を刺激する比活性は、０．０８７％である。濃度が増加した後、細胞は、依然として効果的に増殖され、生物学的活性を維持する。
【0132】
実施例１１．ＩＬ－２突然変異体誘導的ＩＦＮ－γ放出の測定
対数増殖期のＮＫ９２細胞を回収し、基礎培地ＭＥＭ－αで１回洗浄した後、これ（５０００個／ウェル）とは異なる濃度のＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２－ＨＳＡを実験培地（Ｇｉｂｃｏ（商品番号３２５６１－０３７）から購入したＭＥＭ－α培地に、１２．５％ウシ胎児血清および１２．５％のウマ血清を加える）で、３７℃、５％二酸化炭素インキュベーターで２４時間共培養する。上清を回収し、Ｒ＆Ｄ由来の抗ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（＃ＳＩＦ５０）を用いてＩＦＮ－γの放出を分析する。
対数増殖期のＮＫ９２細胞を回収し、基礎培地ＭＥＭ－αで１回洗浄した後、これ（５０００個／ウェル）とは異なる濃度のＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２－ＨＳＡを実験培地（Ｇｉｂｃｏ（商品番号３２５６１－０３７）から購入したＭＥＭ－α培地に、１２．５％ウシ胎児血清および１２．５％のウマ血清を加える）で、３７℃、５％二酸化炭素インキュベーターで２４時間共培養する。上清を回収し、Ｒ＆Ｄ由来の抗ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（＃ＳＩＦ５０）を用いてＩＦＮ－γの放出を分析する。
【0133】
結果は、図１０Ａに示されるように、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ、ＩＬ－２ｇｍ４－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２－ＨＳＡは、いずれもインターフェロンγに対して刺激作用がある。
【0134】
結果は、図１０Ｂに示されるように、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２－ＨＳＡは、いずれもインターフェロンγに対して刺激作用がある。
【0135】
実施例１２．ＰＢＭＣ増殖に対するＩＬ－２突然変異体の刺激の測定
本発明者らは、ヘパリンナトリウムチューブに健康な中国人（ｎ＝２）の新鮮な血液サンプルを収集し、ＰＢＭＣを分離した後、ＲＰＭＩ－１６４０培地（１０％のＦＢＳを含む）でＰＢＭＣを再懸濁した後、４８ウェルプレート（１＊１０６個／ウェル）に接種し、異なる濃度のＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡおよび及野生型ＩＬ－２－ＨＳＡでＰＢＭＣを刺激し、３７℃、５％の二酸化炭素インキュベーターで６日間共培養する。細胞表面および細胞内マーカー抗体でＦＡＣＳ染色を行い、異なる細胞集団を検出し、サンプルは、すべてＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）で細胞分析器を通して得る。
本発明者らは、ヘパリンナトリウムチューブに健康な中国人（ｎ＝２）の新鮮な血液サンプルを収集し、ＰＢＭＣを分離した後、ＲＰＭＩ－１６４０培地（１０％のＦＢＳを含む）でＰＢＭＣを再懸濁した後、４８ウェルプレート（１＊１０６個／ウェル）に接種し、異なる濃度のＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡおよび及野生型ＩＬ－２－ＨＳＡでＰＢＭＣを刺激し、３７℃、５％の二酸化炭素インキュベーターで６日間共培養する。細胞表面および細胞内マーカー抗体でＦＡＣＳ染色を行い、異なる細胞集団を検出し、サンプルは、すべてＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）で細胞分析器を通して得る。
【0136】
ＮＫ細胞は、ＣＤ３－／ＣＤ５６＋に限定し、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋に限定する。
【0137】
結果は、図１１Ａ～Ｂに示されるようである。ここで、図１１Ａは、４ｎＭの濃度下で、野生型ＩＬ－２－ＨＳＡと比較して、ＮＫ細胞にの増殖に対するＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡの刺激作用が少し悪く、１００ｎＭの濃度下で、野生型ＩＬ－２－ＨＳＡと比較して、ＮＫ細胞の増殖に対するＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡの刺激作用が有意に増加することを示し、図１１Ｂは、４ｎＭおよび１００ｎＭの濃度下で、野生型ＩＬ－２－ＨＳＡと比較して、Ｔｒｅｇ細胞の増殖に対するＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡの刺激作用がすべて有意に減少することを示す。
【0138】
従って、当該実験において、ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡは、ＮＫ細胞に対して顕著な増殖刺激作用があり、Ｔｒｅｇ細胞に対して顕著な増殖阻害作用がある。
【0139】
次に、本発明者らは、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡおよび野生型ＩＬ－２－ＨＳＡがＰＢＭＣ増殖を刺激する作用を測定する。
【0140】
ＮＫ細胞は、ＣＤ３－／ＣＤ５６＋に限定し、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋に限定する。
【0141】
結果は、図１２Ａ～Ｂに示されるようである。ここで、図１２Ａは、０～５００ｎＭサンプル濃度の刺激下で、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡが野生型ＩＬ－２－ＨＳＡと比較してＮＫ細胞の増殖に対する刺激作用を有意に増加することを示し、図１２Ｂは、０～５００ｎＭの濃度刺激条件下で、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡが野生型ＩＬ－２－ＨＳＡと比較してＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対する刺激作用をすべて有意に減少することを示す。
【0142】
従って、当該実験において、ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡは、ＮＫ細胞に対して顕著な増殖刺激作用があり、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して顕著な増殖阻害作用がある。
【0143】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【0144】
配列番号１： ＩＬ－２ｇｍ１
配列番号２： ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ
配列番号３： ＩＬ－２ｇｍ２
配列番号４： ＩＬ－２ｇｍ３
配列番号５： ＩＬ－２ｇｍ３
配列番号６： ＩＬ－２ｇｍ７
配列番号７： ＩＬ－２ｇｍ８
配列番号８： ＩＬ－２ｇｍ４
配列番号９： ＩＬ－２ｇｍ４－Ｆｃ
配列番号１０： ＩＬ－２ｇｍ９
配列番号１１： ＩＬ－２ｇｍ１０
配列番号１２： ＩＬ－２ｇｍ１１
配列番号１３： ＩＬ－２ｇｍ１２
配列番号１４： ＩＬ－２ｇｍ５
配列番号１５： ＩＬ－２ｇｍ５－Ｆｃ
配列番号１６： ＩＬ－２ｇｍ１３
配列番号１７： ＩＬ－２ｇｍ１４
配列番号１８： ＩＬ－２ｇｍ１５
配列番号１９： ＩＬ－２ｇｍ６
配列番号２０： ＩＬ－２ｇｍ６－Ｆｃ
配列番号２１： ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡ
配列番号２２： ＩＬ－２ｑｍ－Ｆｃ
配列番号２３： ＣＤ２５タンパク質
配列番号２４： リンカー
配列番号２５： リーディングペプチド
配列番号２６： ＩＬ－２－ｇｍ１－ＨＳＡ
配列番号２７： ＩＬ－２－ｇｍ４－ＨＳＡ
配列番号２８： ＩＬ－２－ｇｍ６－ＨＳＡ
配列番号２９： ＩＬ－２－ｇｍ７－ＨＳＡ
配列番号３０： 野性型ＩＬ－２－ＨＳＡ
配列番号３１： ＩＬ－２Ｒアルファ
配列番号３２： ＩＬ－２Ｒベータ
配列番号３３： ＩＬ－２Ｒガンマ
配列番号３４： ＩＬ－２－ｇｍ１ａ－ＨＳＡ
配列番号３５： ＩＬ－２－ｇｍ１ｂ－ＨＳＡ
配列番号３６： ＩＬ－２－ｇｍ１ｃ－ＨＳＡ
配列番号３７： ＩＬ－２－ｇｍ１ｄ－ＨＳＡ
配列番号２： ＩＬ－２ｇｍ１－ＨＳＡ
配列番号３： ＩＬ－２ｇｍ２
配列番号４： ＩＬ－２ｇｍ３
配列番号５： ＩＬ－２ｇｍ３
配列番号６： ＩＬ－２ｇｍ７
配列番号７： ＩＬ－２ｇｍ８
配列番号８： ＩＬ－２ｇｍ４
配列番号９： ＩＬ－２ｇｍ４－Ｆｃ
配列番号１０： ＩＬ－２ｇｍ９
配列番号１１： ＩＬ－２ｇｍ１０
配列番号１２： ＩＬ－２ｇｍ１１
配列番号１３： ＩＬ－２ｇｍ１２
配列番号１４： ＩＬ－２ｇｍ５
配列番号１５： ＩＬ－２ｇｍ５－Ｆｃ
配列番号１６： ＩＬ－２ｇｍ１３
配列番号１７： ＩＬ－２ｇｍ１４
配列番号１８： ＩＬ－２ｇｍ１５
配列番号１９： ＩＬ－２ｇｍ６
配列番号２０： ＩＬ－２ｇｍ６－Ｆｃ
配列番号２１： ＩＬ－２ｇｍ６－ＨＳＡ
配列番号２２： ＩＬ－２ｑｍ－Ｆｃ
配列番号２３： ＣＤ２５タンパク質
配列番号２４： リンカー
配列番号２５： リーディングペプチド
配列番号２６： ＩＬ－２－ｇｍ１－ＨＳＡ
配列番号２７： ＩＬ－２－ｇｍ４－ＨＳＡ
配列番号２８： ＩＬ－２－ｇｍ６－ＨＳＡ
配列番号２９： ＩＬ－２－ｇｍ７－ＨＳＡ
配列番号３０： 野性型ＩＬ－２－ＨＳＡ
配列番号３１： ＩＬ－２Ｒアルファ
配列番号３２： ＩＬ－２Ｒベータ
配列番号３３： ＩＬ－２Ｒガンマ
配列番号３４： ＩＬ－２－ｇｍ１ａ－ＨＳＡ
配列番号３５： ＩＬ－２－ｇｍ１ｂ－ＨＳＡ
配列番号３６： ＩＬ－２－ｇｍ１ｃ－ＨＳＡ
配列番号３７： ＩＬ－２－ｇｍ１ｄ－ＨＳＡ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図7-5】
【図8A(1)】
【図8A(2)】
【図8B(1)】
【図8B(2)】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】