(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-26
(54)【発明の名称】単為生殖のための遺伝子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/29 20060101AFI20220719BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20220719BHJP
C12N 15/82 20060101ALI20220719BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220719BHJP
C12N 5/04 20060101ALI20220719BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220719BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20220719BHJP
A01H 5/10 20180101ALI20220719BHJP
A01H 1/00 20060101ALI20220719BHJP
C12N 15/90 20060101ALI20220719BHJP
C07K 14/415 20060101ALI20220719BHJP
【ＦＩ】
C12N15/29 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/82 Z
C12N15/113 Z
C12N5/04
C12N5/10
A01H5/00 A
A01H5/10
A01H1/00 A
C12N15/90 Z
C07K14/415
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021563374
(86)(22)【出願日】2020-05-29
(85)【翻訳文提出日】2021-12-10
(86)【国際出願番号】 EP2020064991
(87)【国際公開番号】W WO2020239984
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】19177252.4
(32)【優先日】2019-05-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】19200872.0
(32)【優先日】2019-10-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】20170243.8
(32)【優先日】2020-04-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508186875
【氏名又は名称】キージーン ナムローゼ フェンノートシャップ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】アンダーウッド， チャールズ ジョセフ
(72)【発明者】
【氏名】リゴラ， ダイアナ
(72)【発明者】
【氏名】ファン ダイク， ピーター ヨハネス
(72)【発明者】
【氏名】オプ デン キャンプ， リク ヒューベルトゥス マルティニュス
(72)【発明者】
【氏名】シュランツ， マイケル， エリック
(72)【発明者】
【氏名】ファイフェルベルク， カタリナ， アドリアナ
【テーマコード（参考）】
2B030
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
2B030AA02
2B030AD20
2B030CA06
2B030CA14
2B030CA17
2B030CA19
2B030CB02
4B065AA88X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA53
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA30
4H045EA60
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、タンポポ属（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）の単為生殖遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びにそれらの（機能的）相同体、断片及びバリアントを提供し、これらは、アポミクシスの一部として単為生殖を実現する。また、単為生殖植物及びこれらを作製する方法が提供され、分子マーカー及びこれらを使用する方法も提供される。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）配列番号１、６又は１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；ｂ）配列番号２、７又は１２のヌクレオチド配列を有するプロモーター；
ｃ）配列番号３、８又は１３のヌクレオチド配列を有するコード配列；
ｄ）配列番号４、９又は１４のヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲ；
ｅ）配列番号５、１０又は１５のヌクレオチド配列を有する遺伝子；
ｆ）ａ）～ｅ）うちのいずれか１つのバリアント又は断片
のうちの少なくとも１つを含む、植物における単為生殖に関連する核酸であって、
好ましくは単為生殖において機能的である
核酸。
【請求項2】
キメラ遺伝子、遺伝子構築物又は核酸ベクターに含まれる、請求項１に記載の核酸。
【請求項3】
ａ）請求項１に記載の核酸によってコードされる；ｂ）配列番号１、６若しくは１１のアミノ酸配列を有する；並びに／又は
ｃ）ａ）及び／若しくはｂ）のバリアント若しくは断片である、
植物における単為生殖に関連するタンパク質であって、
好ましくは単為生殖において機能的である
タンパク質。
【請求項4】
広義のセイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）種ではない植物又は植物細胞であって、請求項１に記載の核酸及び／又は請求項３に記載のタンパク質を含み、好ましくは、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ（コンポジテ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）））、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）及びイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）からなる群から選択される科由来である、植物又は植物細胞。
【請求項5】
遺伝子改変によって又は遺伝子移入によって請求項１に記載の核酸を含み、好ましくは前記核酸が前記植物又は植物細胞のゲノムに統合されている、請求項４に記載の植物又は植物細胞。
【請求項6】
単為生殖が可能である、請求項４又は５に記載の植物又は植物細胞。
【請求項7】
さらにアポマイオシスが可能であり、好ましくはアポミクシスが可能である、請求項４～６のいずれか一項に記載の植物又は植物細胞。
【請求項8】
請求項４～７のいずれか一項に記載の植物又は植物細胞の種子、植物部分又は植物産物。
【請求項9】
ａ）単為生殖を誘導することが可能である請求項１に記載の核酸を１つ又は複数の植物細胞に導入するステップと；ｂ）前記核酸を含む植物細胞を選別するステップであって、好ましくは、前記核酸が前記植物細胞のゲノムに統合されているステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む、単為生殖植物を作出する方法。
【請求項10】
請求項９に記載のステップａ）～ｃ）を含み、ステップａ）の前記１つ又は複数の植物細胞はアポマイオシスが可能である、アポミクティック植物を作出する方法。
【請求項11】
ａ）有性生殖する第１の植物を第２の植物の花粉と他家受精させて、Ｆ１雑種種子を生産するステップであって、前記第２の植物が請求項１に記載の核酸を含み、前記第１の植物及び／又は第２の植物はアポマイオシスが可能であるステップを含む、アポミクティックＦ１雑種種子を生産する方法。
【請求項12】
ｂ）好ましくは遺伝子型決定により、アポミクティック表現型を含む前記Ｆ１種子から、選別するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
請求項１１又は１２記載のステップを含み、ｃ）前記Ｆ１雑種種子から少なくとも１つのＦ１植物を育成するステップ
をさらに含む、アポミクティック雑種植物を作出する方法。
【請求項14】
請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法によって入手可能な植物、種子、植物部分又は植物産物。
【請求項15】
植物若しくは植物細胞における単為生殖遺伝子をスクリーニングするための、単為生殖向けに植物若しくは植物細胞を遺伝子型決定するための、及び／又は植物若しくは植物細胞に単為生殖を付与するための、請求項１若しくは２に記載の核酸又は請求項３に記載のタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はバイオテクノロジーの分野に、特に、植物育種を含む植物バイオテクノロジーに関する。本発明は、例えばアポミクシス及び単数体誘導に関連し且つこれらにおいて有用な遺伝子の同定及び使用に特に関する。本発明は、単為生殖に関連する遺伝子、並びにそのコードされたタンパク質及び双方の断片に特に関する。本発明は、植物及び作物において単為生殖を抑制及び／又は誘導する方法に、アポマイオシス性遺伝子（複数可）と特に組み合わせたアポミクシスのための、又はその染色体を倍加して倍加単数体を生産することができる単数体植物の作出のための、遺伝子及び／若しくはタンパク質又はそれらの断片の使用に、さらに関する。
【背景技術】
【0002】
アポミクシス（無融合種子形成（ａｇａｍｏｓｐｅｒｍｙ）とも呼ばれる）とは、種子を通しての無性植物生殖である。アポミクシスはおよそ４００種の顕花植物種で報告されている（Ｂｉｃｋｎｅｌｌ及びＫｏｌｔｕｎｏｗ、２００４）。顕花植物のアポミクシスは以下の２つの形態で生じる：
（１）配偶体のアポミクシス、この場合、胚は、単為生殖によって、非減数未受精卵細胞から発生する；
（２）胞子体アポミクシス、この場合、胚は、胞子体細胞から体細胞性に発生する。
配偶体アポミクトの例は、タンポポ（タンポポ属の種（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｓｐ．））、ヤナギタンポポ（ヤナギタンポポ属の種（Ｈｉｅｒａｃｉｕｍ ｓｐ．））、ケンタッキーブルーグラス（ナガハグサ（Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ））及びイースタンガマグラス（トリプサクム・ダクチロイデス（Ｔｒｉｐｓａｃｕｍ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ））である。胞子体アポミクシスの例は、シトラス（シトラス属の種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐ．））及びマンゴスチン（ガルシニア・マンゴスタナ（Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ））である。配偶体のアポミクシスは、２つの発生プロセス：
（１）減数分裂組換え及び減数の回避（アポマイオシス）；及び
（２）受精なしでの卵細胞の胚への発生（単為生殖）
が、関与する。
（１）配偶体のアポミクシス、この場合、胚は、単為生殖によって、非減数未受精卵細胞から発生する；
（２）胞子体アポミクシス、この場合、胚は、胞子体細胞から体細胞性に発生する。
配偶体アポミクトの例は、タンポポ（タンポポ属の種（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｓｐ．））、ヤナギタンポポ（ヤナギタンポポ属の種（Ｈｉｅｒａｃｉｕｍ ｓｐ．））、ケンタッキーブルーグラス（ナガハグサ（Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ））及びイースタンガマグラス（トリプサクム・ダクチロイデス（Ｔｒｉｐｓａｃｕｍ ｄａｃｔｙｌｏｉｄｅｓ））である。胞子体アポミクシスの例は、シトラス（シトラス属の種（Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐ．））及びマンゴスチン（ガルシニア・マンゴスタナ（Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ））である。配偶体のアポミクシスは、２つの発生プロセス：
（１）減数分裂組換え及び減数の回避（アポマイオシス）；及び
（２）受精なしでの卵細胞の胚への発生（単為生殖）
が、関与する。
【0003】
アポミクティック的に生産された種子は、親植物と遺伝的に同一である。アポミクシスは植物育種に極めて有用であり得ることはずっと以前から認識されていた（Ａｓｋｅｒ、１９７９；Ｈｅｒｍｓｅｎ、１９８０；Ａｓｋｅｒ及びＪｅｒｌｉｎｇ、１９９０；Ｖｉｅｌｌｅ－Ｃａｌｚａｄａら、１９９５）。作物へのアポミクシスの導入に関して最も明白な利点とは、ヘテロ強勢Ｆ１雑種の純粋な育種である。ほとんどの作物では、Ｆ１雑種は優良の品種である。しかし、有性作物では、Ｆ１雑種の自家受精は、Ｆ２後代植物のゲノムにおける組換えによるヘテロ強勢の喪失を引き起こすので、Ｆ１雑種は、再度、同系交配のホモ接合型の両親の交配によって各世代で作出する必要がある。有性Ｆ１種子を生産することは、何度も繰り返される、複雑な、費用のかかるプロセスである。対照的に、アポミクティックＦ１雑種は、永続的に純粋種を生み出すと思われる。換言すれば、種子を通してのＦ１雑種の遺伝的固定及び均一な後代植物の作出が可能となる。
【0004】
アポミクシスによるＦ１固定とは、その遺伝的複雑さが何であれ、任意の遺伝子型が一段階で純粋種を生み出すことになる、アポミクシスの一般的特性の特例である。このことが意味するところは、アポミクシスを使用して、多遺伝子性の定量的形質を即座固定することが可能であることである。ほとんどの収量形質は多遺伝子性であることに留意されたい。アポミクシスは、多重形質（例えば、種々の耐性、いくつかの導入遺伝子、又は多重量的形質遺伝子座）のスタッキング（又はピラミッド化）に使用可能である。アポミクシスを使用しない場合、そのような一連の形質を固定するためには、各形質の遺伝子座を個別にホモ接合型とし、後に組み合わせる必要がある。形質に関与する遺伝子座の数が増加するにつれて、交配によってこれらの形質遺伝子座をホモ接合型にすることは、時間がかかり、事業遂行上難しい課題となり、それによって費用がかかるようになる。さらに、対立遺伝子間の特定のエピスタシス相互作用は、ホモ接合性によって喪失する。アポミクシスを使用すると、このタイプの非相加的な遺伝的変異を固定することが可能になる。したがって、アポミクシス、種子を通してのクローン繁殖は、植物育種、商業的種子生産及び農業におけるパラダイムシフトを引き起こす可能性を有する（ｖａｎ Ｄｉｊｋら ２０１６、Ｖａｎ Ｄｉｊｋ及びＳｃｈａｕｅｒ ２０１６）。
【0005】
任意の遺伝子型を即座に固定することに加えて、その複雑性が何であれ、アポミクシスのさらなる重要な農業用途が存在する。有性種間雑種及び同質倍数体については、減数分裂の問題に起因する不稔に悩まされている場合が多い。アポミクシスは減数分裂をスキップするので、アポミクシスを使用すると、種間雑種と同質倍数体に関するそういった不稔の問題を解決できる。アポミクシスは雌性ハイブリダイゼーションを防止するので、雄性不稔と組み合わせたアポミクシスは、トランスジェニック作物の野生関連種における導入遺伝子の遺伝子移入を防止する、導入遺伝子の封じ込め向けに提案された（Ｄａｎｉｅｌｌ、２００２）。虫媒受粉作物（例えば、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ））では、アポミクティック種子結実は、不十分な受粉媒介者のサービスによって制限されないはずである。これは、受粉ハチの集団の増大する健康問題（ミツバチヘギイタダニ（Ｖａｒｒｏａ ｍｉｔｅ）感染症、アフリカ系キラービー等）と照らして、より重要となってきている。ジャガイモのような塊茎増殖作物では、アポミクシスは、クローン的に優れた遺伝子型を維持するが、クリーンな生産、封じ込め及び認証におけるウイルス伝染及び関連するコストの現在のリスクを軽減又は排除をもすると思われる。また、アポミクティック種子の貯蔵コストは、塊茎又はその他の栄養繁殖した植物部分の貯蔵コストよりもはるかに低い。観賞用では、アポミクシスは労働集約的で費用のかかる組織培養増殖に取って代わる可能性がある。一般に、アポミクシスは栽培品種の開発と植物増殖のコストを強力に削減すると考えられる。
【0006】
残念なことに、アポミクシスは主たる作物のいずれでも存在しない。有性作物にアポミクシスを導入する試みは数多くある。例をあげると、アポミクシス遺伝子の遺伝子移入、有性モデル種の突然変異、ハイブリダイゼーションによるアポミクシスのデノボ生産、及び候補遺伝子のクローニング。遠縁交配による野生アポミクトから作物種へのアポミクシス遺伝子の遺伝子移入は、これまで成功していない（例えば、トリプサクム・ダクチロイデスからトウモロコシへのアポミクシス － Ｓａｖｉｄａｎ，Ｙ．、２００１；Ｍｏｒｇａｎら、１９９８；国際公開第９７／１０７０４号）。突然変異有性モデル種に関して、国際公開第２００７／０６６２１４号では、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）においてＤｙａｄと呼ばれるアポマイオシス変異体の使用が記載されている。しかし、Ｄｙａｄは浸透率が極めて低い劣性突然変異である。作物種では、この突然変異の用途は限定される。２つの有性エコタイプ間のハイブリダイゼーションによるデノボでのアポミクシスの生産は、農業上興味深いアポミクトをもたらさなかった（米国特許出願公開第２００４／０１６８２１６Ａ１号及び米国特許出願公開第２００５／０１５５１１１Ａ１号）。トウモロコシにおけるトランスポゾンタグ付けによる候補アポミクシス遺伝子のクローニングが、米国特許出願公開第２００４／０１４８６６７号に記載されている。アポミクシスを誘導すると仮定される、伸長遺伝子のオルソログが特許請求された。しかし、Ｂａｒｒｅｌｌ及びＧｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ（２００５）によると、伸長遺伝子は減数分裂ＩＩをスキップし、したがって母親の遺伝子型を維持せず、このことによって、その伸長遺伝子は有用性がかなり低いものとなる。
【0007】
米国特許出願公開第２００６／０１７９４９８号では、いわゆる逆育種がアポミクシスの代替となると思われることが記載された。しかし、逆育種は、技術的に複雑なｉｎ ｖｉｔｒｏの実験室手順であり、一方、アポミクシスは植物自体によって実行されるｉｎ ｖｉｖｏ手順である。さらに、逆育種を使用する場合、いったん親系統が再構築されると（倍加配偶子ホモ接合体）、交配をなおも実行する必要がある。
【0008】
天然アポミクトにおけるアポミクシスは一般に遺伝的ベースを有する（Ｏｚｉａｓ－Ａｋｉｎｓ及びＶａｎ Ｄｉｊｋによるレビュー、２００７）。したがって、代替法は、天然アポミクティック種からのアポミクシス遺伝子の単離となり得る。しかし、これは容易なタスクではない、その理由は、天然アポミクトは倍数体ゲノムを有することが多く、倍数体でのポジショナルクローニングは極めて困難である。他の複雑な要因とは、アポミクシスに特異的な染色体領域における組換えの抑制、反復配列であり、交配における分離の歪みである。
【発明の概要】
【0009】
本明細書に記載のように、現在の技術水準の限界の少なくとも一部がない、作物においてアポミクシスを誘導するための手順に対するニーズがある。特に、アポミクティック植物及びアポミクティック種子を生産するための方法に対するニーズがある。また、アポミクシスのプロセス、特に単為生殖に関与する遺伝子及びタンパク質を提供するニーズもあり、これら遺伝子及びタンパク質は、作物にアポミクシスを導入する際に使用するのに適しているとともに、アポミクティック経路を実質的に模倣することができる。
【0010】
本発明者らは今回、単為生殖遺伝子座及び遺伝子、単為生殖表現型に関連する対立遺伝子（本明細書では単為生殖対立遺伝子又はＰａｒ対立遺伝子として指示される）及び非単為生殖表現型（本明細書では有性若しくは非単為生殖対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子と指示される）、それらの遺伝子配列、すなわちプロモーター又は５’ＵＴＲ配列、コード配列、３’ＵＴＲ配列並びにコードされたタンパク質配列を同定且つ単離した。単為生殖は、おそらくランダム又は標的突然変異誘発によって、形質転換によって、又は体細胞ハイブリダイゼーションによって、有性植物に直接導入することができる。有性植物の単為生殖遺伝子座の有性対立遺伝子を遺伝的に改変することによって、例えば、突然変異誘発、遺伝子導入により、又は特定の部位での二本鎖切断の導入及び相同組換えを介した挿入により、Ｐａｒ対立遺伝子を導入されてもよく、植物及び／又はその子孫が卵細胞を胚へと発生させることが可能となってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】コード配列（Ｐａｒ対立遺伝子コード配列のヌクレオチド３２５～３６０）、並びに、野生型配列（配列番号２３）を示す対照植物からの及び改変配列（配列番号２４～２７）を示すＣａｓ９／ＲＮＡ－１複合体をコードするベクターを含むトランスジェニック植物からの、アンプリコンのコードされたアミノ酸、の多重整列の図である。ガイドＲＮＡ－１の遺伝子特異的部分をボックスで指示する。改変を太字で下線付きで指示する。野生型配列は、アラインメントの理由からスペーシング（－）を含む。
【図2】発芽実験の図である。上の列；Ａ６８対照、発芽する正常な生存可能な黒い種子。中の列；遺伝子１６４に３ｂｐの欠失を有する植物ｐＫＧ１０８２１－６の生存不能、ライトグレー、非発芽の種子。下の列；ＦＣＨ７２単数体花粉で受粉した植物ｐＫＧ１０８２１－６のすべての四倍体、発芽及び生存可能な子孫。各シャーレの種子は、単一のシードヘッドに由来する。
【図3】シロイヌナズナのＥＣ１．１プロモーターによって駆動されるセイヨウタンポポのＰａｒ対立遺伝子の遺伝子を宿すトランスジェニックレタス系統の除雄後７５時間での胚を含む透徹化胚珠の例の図である。かかる胚が見いだされた場合は、表３に示すように、観察の合計に当該胚も含めた。
【図4】シロイヌナズナのＥＣ１．１プロモーターによって駆動されるセイヨウタンポポのＰａｒ対立遺伝子の遺伝子を宿すトランスジェニックレタス系統の除雄後７５時間での透徹化胚珠における多胚形成の例の図である。各アスタリスクは胚をマークする。
【図5】ＡＰＯ、ＰＡＲ及びＳＥＸの各植物におけるＰａｒ遺伝子発現の解析の図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
定義
本明細書で使用される場合、「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形：遺伝子座（ｌｏｃｉ））という用語は、例えば、遺伝子又は遺伝子マーカーが見いだされる染色体上の特定の１つの場所（若しくは複数の場所）又は部位を意味する。例えば、「単為生殖遺伝子座」とは、単為生殖遺伝子が位置するゲノムの位置、単為生殖表現型に寄与する対立遺伝子、すなわち（単為生殖対立遺伝子若しくはＰａｒ対立遺伝子）及び／又はその有性カウンターパート（複数可）、すなわち、非単為生殖遺伝子（複数可）（非単為生殖対立遺伝子（複数可）若しくはｐａｒ対立遺伝子（複数可））、を指す。「単為生殖において機能的」である遺伝子、対立遺伝子、タンパク質又は核酸とは、本明細書では、単為生殖表現型に寄与するもの及び／又は卵細胞を胚へと発生させる植物若しくは植物細胞への能力を変換するもの、であると理解されたい。
本明細書で使用される場合、「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（複数形：遺伝子座（ｌｏｃｉ））という用語は、例えば、遺伝子又は遺伝子マーカーが見いだされる染色体上の特定の１つの場所（若しくは複数の場所）又は部位を意味する。例えば、「単為生殖遺伝子座」とは、単為生殖遺伝子が位置するゲノムの位置、単為生殖表現型に寄与する対立遺伝子、すなわち（単為生殖対立遺伝子若しくはＰａｒ対立遺伝子）及び／又はその有性カウンターパート（複数可）、すなわち、非単為生殖遺伝子（複数可）（非単為生殖対立遺伝子（複数可）若しくはｐａｒ対立遺伝子（複数可））、を指す。「単為生殖において機能的」である遺伝子、対立遺伝子、タンパク質又は核酸とは、本明細書では、単為生殖表現型に寄与するもの及び／又は卵細胞を胚へと発生させる植物若しくは植物細胞への能力を変換するもの、であると理解されたい。
【0013】
本明細書で使用される場合、「対立遺伝子（複数可）」という用語は、特定の遺伝子座での遺伝子の１つ又は複数の代替形態のいずれかを意味する。生物の二倍体細胞及び／又は倍数体細胞では、所与の遺伝子の対立遺伝子は、染色体上の特定の位置又は遺伝子座に位置し、この場合、１つの対立遺伝子が、相同染色体のセットの各染色体上に存在する。二倍体及び／若しくは倍数体、又は植物種は、特定の遺伝子座に非常に多数の様々な対立遺伝子を含むことができる。
【0014】
本明細書で使用される「優性対立遺伝子」という用語は、１つの対立遺伝子の表現型に及ぼす効果（すなわち優性対立遺伝子）が、同じ遺伝子座での第２の対立遺伝子（すなわち劣性対立遺伝子）の寄与をマスクする、一遺伝子の対立遺伝子間の関係を指す。常染色体（性染色体以外の任意の染色体）上の遺伝子の場合、対立遺伝子と対立遺伝子の関連形質は常染色体優性又は常染色体劣性である。優性とは、メンデルの遺伝及び古典的遺伝学における重要な概念である。例えば、優性対立遺伝子は機能性タンパク質をコードすることができ、一方、劣性対立遺伝子はコードしない。一実施形態では、本明細書で教示の遺伝子及びそれらの断片又はバリアントは、単為生殖遺伝子の優性対立遺伝子を指す。
【0015】
本明細書で使用される「雌性子房（ｏｖａｒｙ）」（複数形：「子房（ｏｖａｒｉｅｓ）」）という用語は、胞子が形成される包囲体を指す。雌性子房は、単一の細胞から構成される場合もあり、又は多細胞である場合もある。すべての植物、真菌、及び他の多くの系列が、それらのライフサイクルのある時点で子房を形成する。子房は有糸分裂又は減数分裂によって胞子を生産することができる。一般的に、各子房内で、大胞子母細胞の減数分裂によって、４つの単数体大胞子が生産される。裸子植物及び被子植物では、これらの４つの大胞子のうちの１つだけが成熟時に機能的であり、他の３つは退化する。残っている大胞子は、有糸分裂的に分裂し、雌性配偶体（大配偶体）に生長し、これが最終的に１つの卵細胞を生産する。
【0016】
本明細書で使用される「雌性配偶子」という用語は、正常な（有性）状況下で、有性的に生殖する生物において受精（受胎）過程に別の（「雄性」）細胞と融合する細胞を指す。形態学的に明確に異なる２つタイプの配偶子を生産し、各個体が１つのタイプのみ生産する種では、雌とは、より大きなタイプの配偶子（胚珠（卵子）又は卵細胞と呼ばれる）を作り出す任意の個体である。植物では、雌性胚珠は花の子房によって生産される。成熟すると、単数体胚珠は雌性配偶子を生産し、これが次いで受精に備える。雄性細胞は（ほとんどが単数体）花粉であり、葯によって生産される。
【0017】
「遺伝子マーカー」又は「多型マーカー」という用語は、ゲノムＤＮＡ上のある領域を指し、これを使用して染色体上の特定の位置を「マーク」することができる。遺伝子マーカーが遺伝子に密接に連結されているか、又は遺伝子「上に（‘ｏｎ’）」ある場合、遺伝子マーカーは当該遺伝子が見いだされるＤＮＡを「マークし（‘ｍａｒｋｓ’）」、したがって、（分子）マーカーアッセイにおいて遺伝子マーカーを使用して、例えばマーカー支援育種／選別（ＭＡＳ）法において、当該遺伝子の存在を選別又は当該遺伝子の存在に対抗して選別することができる。遺伝子マーカーの例は、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型、欧州特許第５３４８５８号）、マイクロサテライト、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）、ＳＴＳ（配列タグ化部位）、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）、ＳＦＰ（単一特徴多型；Ｂｏｒｅｖｉｔｚら、２００３を参照されたい）、ＳＣＡＲ（配列が特徴づけられた増幅領域）、ＣＡＰＳマーカー（切断された増幅された多型配列）等である。マーカーが遺伝子からさらに離れているほど、マーカーと遺伝子の間で組換え（交叉）が起こり、それによって連鎖（及びマーカーと遺伝子の共分離）が喪失する可能性が高くなる。遺伝子座間の距離は、組換え頻度の点で測定され、ｃＭ単位（センチモルガン；１ｃＭとは、１％の２マーカー間の減数分裂組換え頻度である）で与えられる。ゲノムサイズは種間で大いに異なるため、１ｃＭによって表される実際の物理的距離（すなわち、２つのマーカー間のキロベース、ｋｂ）も種間で大いに異なる。
【0018】
本明細書で「連結された」マーカーに言及する場合、これはまた、遺伝子それ自体「上の」マーカーも包含することが理解される。
【0019】
「ＭＡＳ」とは、「マーカー支援選抜」を指し、これによって、（エリート）育種系統への、マーカーを含む（及び任意選択で隣接領域を欠く）ＤＮＡ領域の移入を加速するために、植物が、１つ又は複数の遺伝子マーカー及び／又は表現型マーカーの存在及び／又は非存在についてスクリーニングされる。
【0020】
「分子マーカーアッセイ」（又は試験）とは、植物又は植物部分の対立遺伝子、例えば、Ｐａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子の存在又は非存在を（直接的又は間接的に）指示する（ＤＮＡベースの）アッセイを指す。好ましくは、このアッセイによって、任意の個々の植物において単為生殖遺伝子座にて、特定の対立遺伝子がホモ接合型とヘテロ接合型のどちらであるかを判定すること、が可能となる。例えば、一実施形態では、ＰＣＲプライマーを使用して単為生殖遺伝子座に連結された核酸を増幅し、増幅産物を酵素的に消化し、増幅産物の電気泳動的解像度パターンに基づいて、どの対立遺伝子（複数可）が任意の個々の植物に存在し、単為生殖遺伝子座での対立遺伝子の接合性を決定することができる（すなわち、各遺伝子座での遺伝子型）。例としては、ＳＣＡＲマーカー（配列特徴づけ増幅領域）、ＣＡＰＳマーカー（切断増幅多型配列）及び類似のマーカーアッセイがある。
【0021】
本明細書で使用される場合、「ヘテロ接合型」という用語は、異なる２つの対立遺伝子が、特定の遺伝子座に存在するが、細胞の相同染色体の対応するセット上に個別に配置されている場合に存在する、遺伝子状態を意味する。逆に、本明細書で使用される場合、「ホモ接合型」という用語は、同一の２つの（又は倍数体の場合には２超の）対立遺伝子が特定の遺伝子座に存在するが、細胞の相同染色体の対応するセット上に個別に配置されている場合に存在する、遺伝子状態を意味する。
【0022】
「品種」とは、ＵＰＯＶ条約に準拠して本明細書で使用され、最も低い既知のランクの単一植物分類群内の植物のグループ分けを指し、このグループ分けは、特徴の発現によって定義することができ、前記特徴のうちの少なくとも１つの発現によって他の任意の植物のグループ分けと区別を付けることができ、変化せずに（安定して）繁殖させるための適合性に関する単位であると考えられる。
【0023】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は交換可能に使用され、特定の様式の作用、サイズ、３次元構造又は起源と関係なく、アミノ酸鎖から構成される分子を指す。したがって、タンパク質の「断片」又は「部分」は、なおも「タンパク質」と呼ぶことができる。「単離されたタンパク質」とは、もはやその天然の環境にはない、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は組換え細菌細胞若しくは植物宿主細胞にある、タンパク質を指すために使用される。
【0024】
「遺伝子」という用語は、適切な調節領域（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された、細胞でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡにプロセシングされるプレｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含むＤＮＡ配列を意味する。したがって、遺伝子は、いくつかの作動可能に連結された配列、例えば、プロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、及び例えば転写終止部位を含む３’非翻訳配列を含むことができる。
【0025】
「キメラ遺伝子」（又は組換え遺伝子）とは、種においては天然では通常は見いだされない任意の遺伝子、特に、天然では互いに会合してないヌクレオチド配列の１つ又は複数の部分が存在する、遺伝子を指す。例えば、プロモーターは、転写された領域の一部若しくは全部と又は別の調節領域と、天然では会合していない。「キメラ遺伝子」という用語には、１つ又は複数のコード配列に又はアンチセンス配列（センス鎖の逆相補体）若しくは逆方向反復配列（センス及びアンチセンス、それによりＲＮＡ転写物が転写の際に二本鎖ＲＮＡを形成する）に、プロモーター又は転写調節配列が作動可能に連結している、発現構築物が含まれると理解される。
【0026】
「３’ＵＴＲ」又は「３’非翻訳配列」（３’非翻訳領域又は３’末端とも呼ばれることが多い）とは、遺伝子のコード配列の下流に見いだされるヌクレオチド配列を指し、これは、例えば、転写終止部位、及び（真核生物ｍＲＮＡのすべてではないがほとんどにおいて）ポリアデニル化シグナル（例えば、ＡＡＵＡＡＡ又はそのバリアントなど）を含む。転写の終止後、ｍＲＮＡ転写物は、ポリアデニル化シグナルの下流で切断されてもよく、ｍＲＮＡの細胞質（翻訳が行われる）への輸送に関与するポリＡ尾部が付加されてもよい。
【0027】
「５’ＵＴＲ」又は「リーダー配列」又は「５’非翻訳領域」とは、ｍＲＮＡ転写が始まる＋１の位置とコード領域の翻訳開始コドン（通常、ｍＲＮＡ上のＡＵＧ又はＤＮＡ上のＡＴＧ）の間の、ｍＲＮＡ転写物の領域、及び対応するＤＮＡである。５’ＵＴＲは、翻訳、ｍＲＮＡ安定性及び／又は代謝回転、並びにその他の調節エレメントにとって重要な部位を、通常は含有する。
【0028】
「遺伝子の発現」とは、適当な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域が、生物学的に活性である、すなわち生物学的に活性なタンパク質若しくはペプチド（若しくは活性ペプチド断片）に翻訳可能である、又はそれ自体が活性である（例えば、転写後の遺伝子サイレンシング若しくはＲＮＡｉ）、ＲＮＡに転写されるプロセスを指す。ある特定の実施形態での活性タンパク質とは、構成的活性型であるタンパク質を指す。コード配列は、センス配向であり、所望の、生物学的に活性なタンパク質若しくはペプチド、又は活性なペプチド断片をコードすることが好ましい。遺伝子サイレンシングアプローチでは、ＤＮＡ配列は、アンチセンスＤＮＡ又は逆方向反復ＤＮＡの形態で存在することが好ましく、標的遺伝子の短い配列をアンチセンスで又はセンス方向及びアンチセンス方向で含む。
【0029】
「転写調節配列」とは、本明細書では、転写調節配列に作動可能に連結された（コード）配列の転写速度を調節することが可能であるヌクレオチド配列と定義される。したがって、本明細書で定義の転写調節配列は、転写開始に（プロモーターエレメント）、転写を維持するのに及び調節するのに、例えばアテニュエーター又はエンハンサーを含めて、必要な配列エレメントのすべてを含むことになる。大部分は、コード配列の上流（５’）転写調節配列を指すが、コード配列の下流（３’）に見いだされる調節配列もまたこの定義に包含される。
【0030】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置して、１つ又は複数の遺伝子の転写を制御するように機能する、並びに、それらに限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベーターのタンパク質結合部位、及び直接的又は間接的に作用してプロモーターからの転写量を調節する、当業者に知られるヌクレオチドの他の任意の配列を含めて、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのための結合部位、転写開始部位及び他の任意のＤＮＡ配列、の存在によって構造的に同定される核酸断片を指す。任意選択で、本明細書では「プロモーター」という用語にはまた、５’ＵＴＲ領域が含まれるが（例えば、プロモーターは、本明細書では、遺伝子の翻訳開始コドンの上流（５’）に１つ又は複数の部分を含むことができるが）、その理由は、この５’ＵＴＲ領域が転写及び／又は翻訳を調節する上である役割を有することができるからである。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの生理学的及び発生条件下でほとんどの組織で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターとは、生理学的（例えば、ある特定の化合物の外部適用によって）又は発生的に調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定のタイプの組織又は細胞においてのみ活性である。「植物又は植物細胞において活性なプロモーター」とは、植物又は植物細胞内で転写を駆動するためのプロモーターの一般的な能力を指す。このことは、プロモーターの時空間的活性については何ら意味合いをなさない。
【0031】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連鎖を指す。核酸は、別のヌクレオチド配列との機能的関係に置かれる場合、「作動可能に連結されている」。例をあげると、プロモーターは、又はむしろ転写調節配列は、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたとは、連結されるＤＮＡ配列が通常は隣接しており、必要に応じて、隣接しリーディングフレームにある２つのタンパク質コード領域を接続して、「キメラタンパク質」を生産することを意味する。「キメラタンパク質」又は「ハイブリッドタンパク質」とは、天然においてそのような形では見いだされないが、機能的タンパク質を形成するように接続された種々のタンパク質「ドメイン」（又はモチーフ）から構成されるタンパク質であり、これは、接続されたドメインの機能性を発揮する。キメラタンパク質は、天然に存在する２つ以上のタンパク質の融合タンパク質とすることもできる。本明細書で使用される「ドメイン」という用語は、少なくともドメインの機能的特徴を有する新規なハイブリッドタンパク質を提供するために、別のタンパク質に移すことができる、特定の構造又は機能を有するタンパク質の任意の部分（複数可）又はドメイン（複数可）を意味する。
【0032】
「標的ペプチド」という用語は、色素体、好ましくは、葉緑体、ミトコンドリアなどの標的である細胞内小器官に、又は細胞外空間若しくはアポプラスト（分泌シグナルペプチド）に、タンパク質又はタンパク質断片を送り込む、アミノ酸配列を指す。標的ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、タンパク質若しくはタンパク質断片のアミノ末端（Ｎ末端）をコードするヌクレオチド配列に融合（インフレームで）していてもよく、又は天然標的ペプチドを置き換えるために使用されてもよい。
【0033】
「核酸構築物」又は「ベクター」とは、本明細書では、組換えＤＮＡ技術の使用から得られ、宿主細胞への外来性ＤＮＡの送達に使用される、人造の核酸分子を意味すると理解される。ベクター骨格は、例えば、当該技術分野において知られているように且つ本明細書の他の箇所に記載のように、バイナリー若しくはスーパーバイナリーベクター（例えば、米国特許第５，５９１，６１６号、米国特許出願公開第２００２／１３８８７９号、及び国際公開第９５／０６７２２号を参照されたい）、同時統合ベクター又はＴ－ＤＮＡベクターとすることができ、こういったベクターへと遺伝子又はキメラ遺伝子が統合され、或いは、適切な転写調節配列がすでに存在する場合、所望のヌクレオチド配列（例えば、コード配列、アンチセンス配列又は逆方向反復配列）のみが、転写調節配列の下流に統合される。ベクターは通常は、例えば、選択マーカー、マルチクローニングサイト等などの、分子クローニングにおけるベクターの使用を容易にする遺伝的エレメントをさらに含む。
【0034】
「組換え宿主細胞」又は「形質転換細胞」又は「トランスジェニック細胞」とは、特に、前記細胞に導入されている、所望のタンパク質をコードする遺伝子若しくはキメラ遺伝子、又は転写されると標的遺伝子／遺伝子ファミリーをサイレンシングするためのアンチセンスＲＮＡ若しくは逆方向反復ＲＮＡ（若しくはヘアピンＲＮＡ）をもたらすヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸分子の結果として生じる、新たな個々の細胞（又は生物）を指す用語である。「単離された核酸」とは、もはやその天然の環境にはない、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は組換え細菌細胞若しくは植物宿主細胞にある、核酸を指すために使用される。
【0035】
「宿主細胞」とは、導入遺伝子で形質転換されて組換え宿主細胞となる、当初の細胞である。宿主細胞は、植物細胞又は細菌細胞であることが好ましい。組換え宿主細胞は、染色体外で（エピソームで）複製する分子として核酸構築物を含有することができるか、又は、より好ましくは、宿主細胞の核若しくは色素体ゲノムに統合された遺伝子若しくはキメラ遺伝子を含む。
【0036】
「組換え植物」又は「組換え植物部分」又は「トランスジェニック植物」とは、遺伝子が発現しない場合があるとしても又はすべての細胞で発現しない場合があるとしても、組換え遺伝子又はキメラ遺伝子を含む植物又は植物部分（例えば、種子又は果実又は葉）である。
【0037】
「エリートイベント」とは、植物の良好な表現型及び／又は農学的特徴をもたらす、ゲノム中の位置に組換え遺伝子を含むように選抜された組換え植物である。統合部位の隣接ＤＮＡを配列決定して、統合部位を特徴づけること及びゲノム中の他の位置で同じ組換え遺伝子を含む他のトランスジェニック植物から上記イベントを区別することができる。
【0038】
「選択マーカー」という用語は、当業者によく知られている用語であり、本明細書では、発現した場合、当該選択マーカーを含有する１つの細胞又は複数の細胞を選別するのに使用することができる任意の遺伝的実体を記載するために、使用される。選択マーカー遺伝子産物は、例えば、抗生物質抵抗性、又はより好ましくは、除草剤抵抗性若しくは別の選択可能な形質、例えば表現型形質（例えば色素沈着の変化）若しくは栄養要求性を、付与する。「レポーター」という用語は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｅＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ＧＵＳ等などの可視マーカーを指すために、主として使用される。
【0039】
遺伝子又はタンパク質の「オルソログ」という用語は、本明細書では、当該遺伝子又はタンパク質と同じ機能を有するが、当該遺伝子を宿す種が分岐した時点から配列において（通常は）分岐した、別の種において見いだされる相同な遺伝子又はタンパク質を指す（すなわち、種分化によって共通の祖先から進化した遺伝子）。したがって、タンポポ属の単為生殖遺伝子のオルソログは、配列比較（例えば、配列全体にわたる又は特定のドメインにわたる配列同一性のパーセンテージに基づく）と機能解析の両方に基づいて、他の植物種において同定することができる。
【0040】
「相同」及び「異種」という用語は、特にトランスジェニック生物の文脈において、核酸配列又はアミノ酸配列とその宿主細胞又は宿主生物との間の関係を指す。したがって、相同配列は宿主種に天然に見いだされ（例えば、レタス遺伝子で形質転換されたレタス植物）、一方、異種配列は、宿主細胞には天然に見いだされない（例えば、ジャガイモ植物由来の配列で形質転換されたレタス植物）。文脈に応じて、「ホモログ」又は「相同」という用語は、共通の祖先の配列の子孫である配列を代替的に指す場合がある（例えば、それらはオルソログであってもよい）。
【0041】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」を使用して、所与のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定することができる。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況において異なることになる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨにて、特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるよう選択される。Ｔｍとは、標的配列の５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）である。通常は、塩濃度はｐＨ７にて約０．０２モル濃度であり、温度は少なくとも６０℃である、ストリンジェントな条件が選ばれることになる。塩濃度の低下及び／又は温度の上昇によって、ストリンジェンシーが高まる。ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば１００ｎｔのプローブを使用したノーザンブロット）にとってストリンジェントな条件とは、例えば、６３℃での０．２×ＳＳＣにおける２０分間の少なくとも１回の洗浄を含む条件、又は同等条件である。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば１００ｎｔのプローブを使用したサザンブロット）にとってストリンジェントな条件とは、例えば、少なくとも５０℃の、通常は約５５℃の温度での、０．２×ＳＳＣにおける２０分間の少なくとも１回の洗浄（通常２回）を含む条件又は同等条件である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）も参照されたい。
【0042】
「高ストリンジェンシー」条件については、例えば、６×ＳＳＣ（３．０Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウムを含有する２０×ＳＳＣ、ｐＨ７．０）、５×デンハルト（２％フィコール、２％ポリビニルピロリドン、２％ウシ血清アルブミンを含有する１００×デンハルト）、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び非特異的コンペティタとして２０μｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ（一本鎖のサカナ精子ＤＮＡ、平均長１２０～３０００ヌクレオチドを有する）を含有する水溶液中６５℃でのハイブリダイゼーションによって、提供することができる。ハイブリダイゼーションに続いて、０．２～０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で上記ハイブリダイゼーション温度での最終洗浄（約３０分間）という条件で、高ストリンジェンシー洗浄をいくつかの段階で行ってもよい。
【0043】
「中ストリンジェンシー」とは、上に記載の溶液中のハイブリダイゼーションと同等であるが約６０～６２℃にての条件を指す。その場合、最終洗浄を、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で上記ハイブリダイゼーション温度にて行う。
【0044】
「低ストリンジェンシー」とは、約５０～５２℃にての上に記載の溶液中のハイブリダイゼーションと同等の条件を指す。その場合、最終洗浄を、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で上記ハイブリダイゼーション温度にて行う。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）も参照されたい。
【0045】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバル又はローカルのアラインメントアルゴリズムを使用して２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。同様の長さの配列は、配列を全長にわたり最適に整列するグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して整列するのが好ましいが、一方、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列するのが好ましい。次いで、配列は、（例えば、デフォルトパラメータを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合に）、（本明細書で定義した）配列同一性の少なくともある特定の最少パーセンテージを共有する場合、「実質的に同一の」又は「本質的に類似の」と呼ぶことができる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をそれらの全長（完全長）にわたり整列し、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。グローバルアライメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合に配列同一性を決定するのに適切に使用される。一般に、ギャップ作成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）の条件で、ＧＡＰデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ ８９、９１５～９１９）。配列アラインメント及び配列同一性パーセンテージのスコアは、コンピュータープログラム、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１－３７５２米国から入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇ、バージョン１０．３を使用して、又はオープンソースソフトウェア、例えば、上のＧＡＰと同じパラメータを使用するか、若しくはデフォルト設定を使用するＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）を使用して、決定してもよい（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方について並びにタンパク質及びＤＮＡアライメントの両方について、デフォルトギャップオープンペナルティは１０．０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてはＢｌｏｓｕｍ６２であり、ＤＮＡについてはＤＮＡＦｕｌｌである）。配列が実質的に異なる全長を有する場合は、ローカルアラインメント、例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するものが好ましい。
【0046】
或いは、類似性又は同一性のパーセンテージは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等などのアルゴリズムを使用して、公共データベースに対して検索することにより決定してもよい。したがって、本発明の核酸配列及びタンパク質配列は、「クエリ配列」としてさらに使用して、公共データベースに対して検索を実施し、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施して、本発明のオキシドレダクターゼ核酸分子に相同なヌクレオチド配列を入手することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を入手することができる。比較の目的でギャップを加えたアライメントを入手するには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９～３４０２に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴのプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照されたい。
【0047】
本明細書で使用される「有性植物生殖」という用語は、「大胞子母細胞」と呼ばれる（例えば二倍体）体細胞が減数分裂を経て４つの減数大胞子を生産する発生経路を指す。これらの大胞子のうちの１つは有糸分裂で分裂して、減数卵細胞（すなわち、母親と比較して染色体数が減少した細胞）及び２つの減数極核を含有する大配偶体（胚嚢としても知られている）を形成する。花粉粒の１つの精細胞による卵細胞の受精は、（例えば二倍体）胚を生じ、一方、第２の精細胞による２つの極核の受精は、（例えば三倍体）胚乳を生じる（重複受精と呼ばれるプロセス）。
【0048】
本明細書で使用される「大胞子母細胞（ｍｅｇａｓｐｏｒｅ ｍｏｔｈｅｒ ｃｅｌｌ）」又は「メガ胞子母細胞（ｍｅｇａｓｐｏｒｏｃｙｔｅ）」という用語は、雌性配偶体へと発生する４つの単数体大胞子を創り出すために、減数、通常は減数分裂によって大胞子を生産する細胞を指す。被子植物（顕花植物としても知られる）では、大胞子母細胞は、大胞子形成（珠心における大胞子、又は大胞子嚢の形成）、及び大配偶子形成（大配偶体への大胞子の発生）を含む異なる２つのプロセスを通して大配偶体へと発生する、大胞子を生産する。
【0049】
本明細書で使用される「無性植物生殖」という用語は、受精なしで且つ配偶子の融合なしで植物の生殖が行われるプロセスである。無性生殖によって、突然変異又は体細胞組換えが生じる場合を除いて、親植物と及び互いに遺伝的に同一である新しい個体が生産する。植物は、栄養生殖（すなわち、当初の植物の栄養片の出芽、分げつ等を含む）及びアポミクシスを含めて、主要な２つのタイプの無性生殖を有する。
【0050】
本明細書で使用される「アポミクシス」という用語は、無性プロセスによる種子の形成を指す。アポミクシスの一形態は以下によって特徴づけられる：１）アポマイオシス、これは子房での非減数胚嚢の形成を指す、及び２）単為生殖、これは非減数卵の胚への発生を指す。数百の野生植物種は、アポミクティック繁殖を特徴とし、無性的に殖える。アポマイオシスとは、母植物の体細胞組織と同じ染色体数と同一又は高度に類似の遺伝子型とを備える、非減数卵細胞の生産をもたらすプロセスである。非減数卵細胞は、非減数大胞子（複相胞子生殖）に又は体細胞の始原細胞（無胞子生殖）に、由来することができる。複相胞子生殖の場合、大胞子形成は有糸分裂に又は改変された減数分裂に代わる。改変された減数分裂とは、組換えなしの第一分裂復旧型のものであるのが好ましい。或いは、改変された減数分裂とは、第二分裂復旧型のものであってもよい。好ましい実施形態では、アポマイオシスとは、第一減数分裂に影響を与える複相胞子生殖型タイプのものである。アポミクシスは、配偶体のアポミクシスと胞子体のアポミクシス（不定胚形成とも呼ばれる）として知られる少なくとも２つの形態を含む様々な形態で生じることが知られている。配偶体のアポミクシスが生じる植物の例としては、タンポポ（タンポポ属の種）、ヤナギタンポポ（ヤナギタンポポ属の種）、ケンタッキーブルーグラス（ナガハグサ）、イースタンガマグラス（トリプサクム・ダクチロイデス）及びその他などが挙げられる。胞子体のアポミクシスが生じる植物の例としては、シトラス（シトラス属の種）、マンゴスチン（ガルシニア・マンゴスタナ）及びその他などが挙げられる。
【0051】
本明細書で使用される「複相胞子生殖」という用語は、非減数胚嚢が、有糸分裂によって又は中断された減数分裂イベントによって、直接的にいずれかで大胞子母細胞に由来する、状況を指す。複相胞子生殖に関して主たる３つのタイプが報告されており、これらのタイプが生じる植物の名を取って命名されており、その植物はタンポポ属、ニガナ属（Ｉｘｅｒｉｓ）及びアンテンナリア属（Ａｎｔｅｎｎａｒｉａ）である。タンポポ属タイプでは、減数分裂前期が開始されるが、その後プロセスが中断され、２つの非減数二分染色体がもたらされ、そのうちの１つが有糸分裂によって胚嚢を生じる。ニガナ属タイプでは、８つの核体の胚嚢を生じる核のさらなる２回の有糸分裂は、減数分裂前期の後の均等分裂に従う。タンポポ属タイプ及びニガナ属タイプは、減数分裂の改変を伴うので、減数分裂複相胞子生殖として知られる。対照的に、有糸分裂複相胞子生殖と呼ばれるアンテンナリア属タイプでは、大胞子母細胞は減数分裂を開始せず、直接３回分裂して非減数胚嚢を生産する。複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスでは、非減数配偶体が非減数大胞子から生産される。この非減数大胞子は、有糸分裂様の分裂（有糸分裂の変形（ｄｉｓｐｌｏｒｙ））又は改変された減数分裂（減数分裂の変形）のいずれかの結果生じる。無胞子生殖による配偶体のアポミクシスと複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスの両方では、非減数卵細胞は、胚へと単為生殖的に発生する。タンポポ属のアポミクシスは、複相胞子生殖型のものであり、これは、第一雌性減数分裂（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（減数分裂（ｍｅｉｏｓｉｓ）Ｉ）はスキップされ、その結果、母植物と同じ遺伝子型を有する２つの非減数大胞子が生じることを意味する。これらの大胞子のうちの一方は退化し、他方の生存している非減数大胞子は、非減数大配偶体（又は胚嚢）を生じ、これは非減数卵細胞を含有する。この非減数卵細胞は、母植物と同じ遺伝子型を有する胚へと受精することなく発生する。配偶体のアポミクシスのプロセスの結果生じる種子は、アポミクティック種子と呼ばれる。
【0052】
「複相胞子生殖機能」という用語は、好ましくは雌性子房の中での、好ましくは大胞子母細胞の中での及び／又は雌性配偶子の中での、植物の複相胞子生殖を誘導する能力を指す。したがって、複相胞子生殖機能が導入されている植物は、複相胞子生殖プロセスを行うことが可能である、すなわち、減数分裂Ｉ復旧型を介して非減数配偶子を生産することができる。
【0053】
「配偶体のアポミクシスの一部としての複相胞子生殖」という用語は、アポミクシスのプロセスの複相胞子生殖成分を指す、すなわち、複相胞子生殖が無性プロセスによる種子の形成において果たす役割を指す。特に、複相胞子生殖機能の次に、単為生殖機能は、同様にアポミクシスのプロセスを確立する上で必要である。したがって、複相胞子生殖機能と単為生殖機能の組合せは、アポミクシスをもたらすことができる。
【0054】
本明細書で使用される「複相胞子生殖型植物」という用語は、複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを経る植物、又は複相胞子生殖により配偶体のアポミクシスを経るように（例えば、遺伝子改変によって）誘導された植物を指す。両方の場合において、複相胞子生殖型植物は、単為生殖因子と組み合わせた場合、アポミクティック種子を生産する。
【0055】
本明細書で使用される「アポミクティック種子」という用語は、アポミクティック植物種から、又は、アポミクシス、特に複相胞子生殖による配偶体のアポミクシスを経るように誘導された植物若しくは作物により得られる、種子を指す。アポミクティック種子は、クローンであり、親植物と遺伝的に同一であり、純粋な育種が可能である植物を発芽することを特徴とする。本発明では、「アポミクティック種子」とは、「クローンのアポミクティック種子」も指す。
【0056】
本明細書で使用される「アポミクティック植物（複数可）」という用語は、受精なしで、それ自体、無性生殖する植物を指す。アポミクティック植物とは、アポミクティックとなるように改変された有性植物であってよく、例をあげると、アポミクティック植物又はアポミクティック植物の子孫である植物を得るように本明細書で教示の単為生殖遺伝子のうちの１つ又は複数で遺伝子改変された、有性植物である。その場合、アポミクティック的に作出された後代は、親植物と遺伝的に同一である。
【0057】
細胞、植物、植物部分又は種子の「クローン」は、それらが、それらの同胞種と並びにそれらが由来する親植物と、遺伝的に同一であることを特徴とする。個々のクローンのゲノムＤＮＡ配列はほとんど同一であるが、しかし、突然変異が軽微な差異を引き起こす場合がある。
【0058】
本明細書で使用される「純粋な繁殖」又は「純粋な繁殖生物」（純血生物としても知られる）という用語は、その子孫に未変化又はほとんど未変化のある特定の表現型形質を常に伝える生物を指す。ある生物は、当該生物があてはまる各形質について純粋な育種と称され、「純粋な育種」という用語はまた、個々の遺伝形質を記載するためにも使用される。
【0059】
本明細書で使用される「Ｆ１雑種」（又は雑種第一代）という用語は、明確に異なる親タイプの子孫の最初の雑種世代を指す。親タイプは、近交系であってもよいが、そうでなくてもよい。Ｆ１雑種は、遺伝学において及び選抜育種において使用され、この場合、それはＦ１交配種として現れ得る。親タイプが明らかに異なる子孫は、両親からの特徴の組合せを伴う新しい均一な表現型を生み出す。Ｆ１雑種は雑種強勢などの明確な利点を伴い、したがって、農業の実践で高度に所望されている。本発明の実施形態では、本明細書で教示の方法、遺伝子、タンパク質、それらのバリアント又は断片を使用して、その遺伝的複雑性にかかわらず、Ｆ１雑種の遺伝子型を固定することができ、それらによって、一段階で純粋育種を行うことができる生物の作出が可能になる。
【0060】
本明細書で使用される「受粉」又は「受粉すること」という用語は、花粉が植物の葯（雄の部分）から柱頭（雌の部分）に移され、それによって受精及び生殖が可能になるプロセスを指す。受粉は、被子植物、花をつける植物に固有である。花粉粒それぞれが、雄性単数体配偶体であり、雌性配偶体に輸送されるように構成されており、ここで、雄性単数体配偶体は、重複受精のプロセスにおいて、雄性配偶子（又は複数の配偶子）を生産することによって受精を行うことができる。雄性配偶子を含有する成功した被子植物の花粉粒（配偶体）は、柱頭に運搬され、ここで、発芽し、その花粉管は、子房に花柱を下方へと生長させる。その２つの配偶子は、雌性配偶子を含有する配偶体（複数可）が心皮内で保持されているところまで管を下方へ進む。一方の核は極体と融合して胚乳組織を生産し、他方の核は胚珠と融合して胚を生産する。
【0061】
本明細書で使用される「単為生殖」という用語は、受精なしで胚の生長及び発生が生じる無性生殖の形態を指す。本発明の遺伝子及びタンパク質は、複相胞子生殖型因子、例をあげると、遺伝子又は化学因子との組合せで、アポミクティック子孫を作出することができる。
【0062】
本明細書で使用される「ピラミッド化遺伝子又はスタッキング遺伝子」という用語は、望ましい又は好ましい形質（例えば、耐病害性形質、色、干ばつ耐性、有害生物耐性等）の根底にある、異なる親系統からの関連又は非関連遺伝子を、１つの植物へと組み合わせるプロセスを指す。ピラミッド化遺伝子又はスタッキング遺伝子は、従来の育種法を使用して実行することができるか、又は、分子マーカーを使用することによって加速して、所望の対立遺伝子の組合せを含有する植物を同定及び維持し且つ所望の対立遺伝子の組合せを備えない植物を破棄することができる。本発明の一実施形態では、本明細書で教示の単為生殖遺伝子を、遺伝子のピラミッド化プログラム又はスタッキングプログラムにおいて有利に使用して、アポミクティック植物を作出すること又は有性作物にアポミクシスを導入することができる。
【0063】
本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「を含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその語形変化は、この単語に続く項目が包含されるが、特に言及されていない項目が除外されないことを意味するよう、その非限定な意義で使用される。加えて、文脈が、１つであること及び要素のうちの１つのみであることを明らかに要求しない限り、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の言及は、２つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は通常、「少なくとも１つ」を意味する。本明細書において「配列」に言及する場合、一般に、サブユニット（例えば、アミノ酸）のある特定の配列を有する実際の物理的な分子を指すことがさらに理解される。
【0064】
本明細書で使用される場合、「植物」という用語には、植物細胞、植物組織若しくは器官、植物プロトプラスト、植物を再生することができる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物細胞塊、及び植物おいてインタクトな植物細胞、又は植物の部分、例えば、胚、花粉、胚珠、果実、花、葉（例えば、収穫されたレタス作物）、種子、根、根端等が含まれる。
【発明の詳細な説明】
【0065】
本発明のヌクレオチド配列
本発明者らは、単為生殖を担う遺伝子、コード配列、プロモーター、３’ＵＴＲ及びタンパク質を初めて同定した。前記の遺伝子配列、プロモーター配列、コード配列及び３’ＵＴＲ配列は、Ｐａｒ対立遺伝子上に位置している。本発明者らはまた、Ｐａｒ対立遺伝子の有性カウンターパート上に、すなわちｐａｒ対立遺伝子上に位置する遺伝子配列、プロモーター配列、コード配列、及び３’ＵＴＲ配列を同定した。単為生殖を引き起こす優性対立遺伝子の有性カウンターパートとして、ｐａｒ対立遺伝子の存在は単為生殖表現型に寄与ものではないが、これらｐａｒ対立遺伝子は、単為生殖に関連するものとして本明細書でも指示されており、その理由は、ｐａｒ対立遺伝子の存在が有性表現型、すなわち非単為生殖表現型を示すものであり得るためである。Ｐａｒ対立遺伝子は優性対立遺伝子であってもよいので、有性表現型の確認には、ｐａｒ対立遺伝子としてのＰａｒ遺伝子座のすべての対立遺伝子の評価が必要な場合がある、及び／又はＰａｒ対立遺伝子の非存在の評価が必要な場合がある。換言すれば、「関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」とは、本明細書では、単為生殖又は非単為生殖の表現型を指示すると、及び、任意選択で単為生殖において機能的であることを指示すると、理解されたい。例をあげると、コードされたタンパク質の発現の変化をもたらすプロモーター配列などの当該ｐａｒ対立遺伝子の１つ又は複数の発現調節配列を改変することによるが、ｐａｒ対立遺伝子を改変することで、単為生殖表現型を誘導することが可能なＰａｒ対立遺伝子に当該ｐａｒ対立遺伝子を付与することができる。
本発明者らは、単為生殖を担う遺伝子、コード配列、プロモーター、３’ＵＴＲ及びタンパク質を初めて同定した。前記の遺伝子配列、プロモーター配列、コード配列及び３’ＵＴＲ配列は、Ｐａｒ対立遺伝子上に位置している。本発明者らはまた、Ｐａｒ対立遺伝子の有性カウンターパート上に、すなわちｐａｒ対立遺伝子上に位置する遺伝子配列、プロモーター配列、コード配列、及び３’ＵＴＲ配列を同定した。単為生殖を引き起こす優性対立遺伝子の有性カウンターパートとして、ｐａｒ対立遺伝子の存在は単為生殖表現型に寄与ものではないが、これらｐａｒ対立遺伝子は、単為生殖に関連するものとして本明細書でも指示されており、その理由は、ｐａｒ対立遺伝子の存在が有性表現型、すなわち非単為生殖表現型を示すものであり得るためである。Ｐａｒ対立遺伝子は優性対立遺伝子であってもよいので、有性表現型の確認には、ｐａｒ対立遺伝子としてのＰａｒ遺伝子座のすべての対立遺伝子の評価が必要な場合がある、及び／又はＰａｒ対立遺伝子の非存在の評価が必要な場合がある。換言すれば、「関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）」とは、本明細書では、単為生殖又は非単為生殖の表現型を指示すると、及び、任意選択で単為生殖において機能的であることを指示すると、理解されたい。例をあげると、コードされたタンパク質の発現の変化をもたらすプロモーター配列などの当該ｐａｒ対立遺伝子の１つ又は複数の発現調節配列を改変することによるが、ｐａｒ対立遺伝子を改変することで、単為生殖表現型を誘導することが可能なＰａｒ対立遺伝子に当該ｐａｒ対立遺伝子を付与することができる。
【0066】
Ｐａｒ対立遺伝子とｐａｒ対立遺伝子の両方が、「ＰＡＲタンパク質」と本明細書で称されるタンパク質をコードするコード配列を有する遺伝子を含み、このタンパク質は、ジンクフィンガーＣ２Ｈ２型ドメイン（ＩＰＲ１３０８７）、好ましくはコンセンサス配列Ｃ．｛２｝Ｃ．｛７｝［Ｋ／Ｒ］Ａ．｛２｝ＧＨ．［Ｒ／Ｎ］．Ｈを有するジンクフィンガーＫ２－２様ドメインを含むが、このタンパク質は：ＣＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸ［Ｋ／Ｒ］ＡＸＸＧＨＸ［Ｒ／Ｎ］ＸＨ（配列番号３７）と注記を付けることもできる（式中、Ｘは、天然に存在する任意のアミノ酸であってよく、［Ｋ／Ｒ］は、１２位のアミノ酸がリジン又はアルギニンであることを指示し、［Ｒ／Ｎ］は、１９位のアミノ酸がアルギニン又はアスパラギンであることを指示する）（Ｅｎｇｌｂｒｅｃｈｔら、２００４を参照されたい）。ジンクフィンガーＣ２Ｈ２型ドメイン、好ましくは本明細書で定義のジンクフィンガーＫ２－２様ドメインに加えて、タンパク質は、コンセンサスアミノ酸配列ＤＬＮＸＸＰ（配列番号５８）又はＤＬＮＸＰ（配列番号５９）を有するＥＡＲモチーフを含む（式中、Ｘは天然に存在する任意のアミノ酸とすることができる）（Ｋａｇａｌｅら、２０１０を参照されたい）。好ましくは、タンパク質は最大で４００個のアミノ酸であり、ここで、前記タンパク質は、本明細書で指示される１つ又は２つのＥＡＲモチーフ及び本明細書で定義のジンクフィンガーＫ２－２様ドメインを含む。好ましくは、タンパク質は最大で４００個のアミノ酸であり、ここで、前記タンパク質は、本明細書で指示される１つ又は２つのＥＡＲモチーフのみ、及び本明細書で定義の１つのみのジンクフィンガーＫ２－２様ドメインを含む、すなわち、本明細書で定義のさらなるＥＡＲモチーフ及び本明細書で定義のさらなるジンクフィンガーＫ２－２様ドメインを含まない。最大サイズ４００個のアミノ酸、本明細書で指示される１つ又は２つのみのＥＡＲモチーフ、及び定義された単一のジンクフィンガーＫ２－２様ドメインの特徴に加えて、ＰＡＲタンパク質は、ジンクフィンガーコンセンサス配列Ｃ．｛２｝Ｃ．｛１２｝Ｈ．｛３｝Ｈを有するさらなる１つのみのジンクフィンガードメインを含むことができ、これは：ＣＸＸＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＨＸＸＸＨ（配列番号３８）と注記を付けることもできるが、より好ましくは、ジンクフィンガーコンセンサス配列Ｃ．｛２｝Ｃ．｛１２｝Ｈ．｛３｝Ｈ（配列番号３８）を有するさらなるジンクフィンガードメインを含まない。
【0067】
したがって、本発明は、植物における単為生殖に関連する核酸を提供し、ここで、前記核酸は、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、前記ＰＡＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列及び３’ＵＴＲも提供する。セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）は、単為生殖を誘導可能な１つの優性Ｐａｒ対立遺伝子と、配列番号１、６、又は１１のそれぞれアミノ酸配列を有するＰＡＲタンパク質をコードする２つの有性カウンターパート、すなわち、ｐａｒ対立遺伝子－１及びｐａｒ対立遺伝子－２とを含む。Ｐａｒ対立遺伝子は、配列番号５のヌクレオチド配列を有する遺伝子を含み、ｐａｒ対立遺伝子－１は、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するｐａｒ遺伝子を含み、ｐａｒ対立遺伝子－２は、配列番号１５のヌクレオチド配列を有するｐａｒ遺伝子を含む。Ｐａｒ遺伝子は、配列番号２を有するプロモーター配列、配列番号３を有するコード配列、及び配列番号４を有する３’ＵＴＲを含む。ｐａｒ遺伝子－１は、配列番号７を有するプロモーター配列、配列番号８を有するコード配列、及び配列番号９を有する３’ＵＴＲを含む。ｐａｒ遺伝子－２は、配列番号１２を有するプロモーター配列、配列番号１３を有するコード配列、及び配列番号１４を有する３’ＵＴＲを含む。したがって、本発明は、
ａ）配列番号１、６又は１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
ｂ）配列番号２、７又は１２のヌクレオチド配列を有するプロモーター；
ｃ）配列番号３、８又は１３のヌクレオチド配列を有するコード配列；
ｄ）配列番号４、９又は１４のヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲ；
ｅ）配列番号５、１０又は１５のヌクレオチド配列を有する遺伝子；
ｆ）ａ）～ｅ）うちのいずれか１つのバリアント；及び
ｇ）ａ）～ｆ）うちのいずれか１つの断片
のうちの少なくとも１つを含む、植物における単為生殖に関連する核酸を提供する。
ａ）配列番号１、６又は１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
ｂ）配列番号２、７又は１２のヌクレオチド配列を有するプロモーター；
ｃ）配列番号３、８又は１３のヌクレオチド配列を有するコード配列；
ｄ）配列番号４、９又は１４のヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲ；
ｅ）配列番号５、１０又は１５のヌクレオチド配列を有する遺伝子；
ｆ）ａ）～ｅ）うちのいずれか１つのバリアント；及び
ｇ）ａ）～ｆ）うちのいずれか１つの断片
のうちの少なくとも１つを含む、植物における単為生殖に関連する核酸を提供する。
【0068】
表１に、本明細書で使用されるすべての配列番号の概要を提供する。
【0069】
好ましくは、前記核酸は単為生殖において機能的である。
一実施形態では、本発明の核酸は：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列を有するプロモーター；
ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列を有するコード配列；
ｄ）配列番号４のヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲ；
ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列を有する遺伝子；
ｆ）ａ）～ｅ）のうちのいずれか１つのバリアント；及び
ｇ）ａ）～ｆ）のうちのいずれか１つの断片
のうちの少なくとも１つを含むか又はそれらからなる。
一実施形態では、本発明の核酸は：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
ｂ）配列番号２のヌクレオチド配列を有するプロモーター；
ｃ）配列番号３のヌクレオチド配列を有するコード配列；
ｄ）配列番号４のヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲ；
ｅ）配列番号５のヌクレオチド配列を有する遺伝子；
ｆ）ａ）～ｅ）のうちのいずれか１つのバリアント；及び
ｇ）ａ）～ｆ）のうちのいずれか１つの断片
のうちの少なくとも１つを含むか又はそれらからなる。
【0070】
好ましくは、本実施形態の核酸及び／又はそれに由来する生産物、例えばそのＲＮＡ転写物又はコードされたタンパク質は、単為生殖を指示し、例えば、前記核酸を含む植物は、前記植物が単為生殖を示すことを指示し、このことは、前記植物は、減数卵細胞又は非減数卵細胞から胚を発生する能力を有することを意味する。好ましくは、前記核酸及び／又はそれに由来する生産物、例えばそのＲＮＡ転写物又はコードされたタンパク質は、好ましくは植物又は植物細胞に存在する場合、単為生殖において機能的であり、さらにより好ましくは、単為生殖を誘導する又は誘導することが可能である。
【0071】
別の実施形態では、本発明の核酸は：
ａ）配列番号６又は１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
ｂ）配列番号７又は１２のヌクレオチド配列を有するプロモーター；
ｃ）配列番号８又は１３のヌクレオチド配列を有するコード配列；
ｄ）配列番号９又は１４のヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲ；
ｅ）配列番号１０又は１５のヌクレオチド配列を有する遺伝子；
ｆ）ａ）～ｅ）うちのいずれか１つのバリアント；及び
ｇ）ａ）～ｆ）うちのいずれか１つの断片
のうちの少なくとも１つを含むか又はそれらからなる。
ａ）配列番号６又は１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子；
ｂ）配列番号７又は１２のヌクレオチド配列を有するプロモーター；
ｃ）配列番号８又は１３のヌクレオチド配列を有するコード配列；
ｄ）配列番号９又は１４のヌクレオチド配列を有する３’ＵＴＲ；
ｅ）配列番号１０又は１５のヌクレオチド配列を有する遺伝子；
ｆ）ａ）～ｅ）うちのいずれか１つのバリアント；及び
ｇ）ａ）～ｆ）うちのいずれか１つの断片
のうちの少なくとも１つを含むか又はそれらからなる。
【0072】
好ましくは、本実施形態の前記核酸及び／又はそれに由来する生産物、例えばそのＲＮＡ転写物又はコードされたタンパク質は、好ましくは植物又は植物細胞にホモ接合状態で存在する場合、単為生殖を誘導しないか、又は誘導することが不可能である。換言すれば、本実施形態の核酸の存在が、非単為生殖表現型又は有性表現型を示すものであってよく、例えば、前記核酸を含む植物は、前記植物が有性表現型であること、すなわち、卵細胞から胚を発生することが不可能であることを示す。
【0073】
Ｐａｒ対立遺伝子は優性対立遺伝子であってもよい。Ｐａｒ対立遺伝子が優性である場合、植物が非単為生殖表現型であることを確認するために、前記植物のＰａｒ遺伝子座のすべての対立遺伝子はｐａｒ対立遺伝子と評価されることを必要とし、単一のＰａｒ対立遺伝子の存在が、上記植物は単為生殖が可能であると指示するのに十分である。
【0074】
本発明の核酸は、スクリーニング及び／又は遺伝子型決定に使用することができる。任意選択で、推定核酸若しくは遺伝子及び／又はその派生物の単為生殖における機能性、又は推定核酸及び／若しくはその派生物が単為生殖を誘導する能力は、発現を低下させることによって、単為生殖植物における前記核酸若しくは遺伝子をサイレンシングすることによって又はノックアウトすることによって、例えば前記遺伝子のコード配列に早期停止を導入することによって、評価してもよい。単為生殖表現型のその後の喪失は、推定上の核酸及び／又はその派生物が単為生殖を誘導することが可能であることを意味する。単為生殖を誘導する能力は、機能喪失型アポミクティック植物を推定核酸及び／又はその派生物（ｍＲＮＡ若しくはタンパク質）で補完することによっても評価することができる。かかる機能喪失型アポミクティック植物は、機能的Ｐａｒ対立遺伝子の発現を減少させることによって（例えば、欠失又はノックアウトによって）アポミクティック表現型を喪失するように改変されたセイヨウタンポポ分離株Ａ６８であってもよい。かかる機能喪失型アポミクティック植物は、本明細書で定義の配列番号２３が配列番号２４～２７のうちのいずれか１つに改変された、Ｐａｒ対立遺伝子を含むセイヨウタンポポ分離株Ａ６８であってもよい（表２を参照されたい）。セイヨウタンポポ分離株Ａ６８の機能的アポミティック植物のかかる喪失は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ複合体を使用して標的ゲノム編集によって得てもよく、ここで、本明細書に例示のように、前記ガイドＲＮＡ（本明細書ではｇＲＮＡとしても指示される）は、配列番号１９の標的特異的配列を含む。セイヨウタンポポ分離株Ａ６８のＰａｒ対立遺伝子の欠失によって、単為生殖喪失型、したがってアポミクシス喪失型、がもたらされる。前記推定核酸又はその派生物が単為生殖を誘導する能力を有する場合、例えば前記核酸を含む及び／又は前記派生物をコードするベクターを前記分離株にトランスフェクトすることにより、前記分離株に前記核酸又は派生物を導入すると、アポミクティック表現型が回復（又はレスキュー）されることになる。かかるベクターは、好ましくは、分離株中のコードされた派生物の発現を駆動するのに適した配列を含む。例をあげると、本発明のＰＡＲタンパク質をおそらくコードする推定核酸を、前記ベクター内で、配列番号２によって本明細書で定義のプロモーターに、及び任意選択で配列番号４によって本明細書で定義の３’ＵＴＲに、作動可能に連結させてもよい。セイヨウタンポポ分離株Ａ６８の場合、他家受粉の非存在下での高い種子結実は、アポミクシスの明確な指標である。この分離株での自家受粉については代替の説明として排除することができるが、その理由は、不均衡な三倍体の雄と雌の減数分裂に起因して、有性生殖した卵細胞と花粉粒は受精能が極めて低いことになるからである。
【0075】
好ましくは、本明細書で定義のバリアント核酸は、本明細書で定義のセイヨウタンポポ分離株Ａ６８のＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子の遺伝子、プロモーター、コード配列及び／又は３’ＵＴＲのホモログ又はオルソログである。好ましくは、前記バリアント核酸及び／又はそれに由来する生産物、例えばそのＲＮＡ転写物又はコードされたタンパク質は、好ましくは植物又は植物細胞に存在する場合、本明細書で定義の単為生殖に関連し、任意選択で単為生殖を誘導するか又は誘導することが可能である。上記バリアントは好ましくは、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質をコードするか、又はＰＡＲタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されている。他の植物種における、セイヨウタンポポ分離株Ａ６８で同定されたＰａｒ遺伝子及びｐａｒ遺伝子のオルソログを、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質の特徴に基づいて同定することができる。かかる遺伝子は、それらに限定されないが、以下からなる群から選択されるＰＡＲタンパク質のうちのいずれか１つをコードすることができる：パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１９９ＵＲＫ４）、アポスタシア・シェンゼニカ（Ａｐｏｓｔａｓｉａ ｓｈｅｎｚｈｅｎｉｃａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ０ＡＺＷ３）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＧＸＰ９、Ａ０Ａ１７８Ｖ２Ｓ４、Ｏ８１７９３、Ａ０Ａ１７８Ｖ１Ｑ３、Ａ０ＭＦＣ１、Ｏ８１８０１）、セイヨウミヤマハタザオ亜種リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｌｙｒａｔａ ｓｕｂｓｐ． Ｌｙｒａｔａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｄ７ＭＣ５２又はＤ７ＭＣＥ８）、アラキス・イパエンシス（Ａｒａｃｈｉｓ ｉｐａｅｎｓｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４５又は配列番号４９）、ミナトカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｉ１Ｊ０Ｄ９）、ヤセイカンラン変種オルラセア（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ ｖａｒ． ｏｌｅｒａｃｅａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｄ３Ａ１Ｑ６又はＡ０Ａ０Ｄ３Ａ１Ｑ３）、ブラシカ・カンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３９８ＡＨＴ１）、ブラシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４７）、ブラシカ・ラパ亜種ペキネンシス（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ ｓｕｂｓｐ． Ｐｅｋｉｎｅｎｓｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ４Ｄ５７４又はＭ４Ｄ５７１）、ヤセイカンラン（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｐ６ＥＳＢ１又はＡ０Ａ３Ｐ６Ｆ７２６）、ブラシカ・カンペストリス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｐ５ＺＭＭ３又はＡ０Ａ３Ｐ５Ｚ１Ｍ１）、キマメ（Ｃａｊａｎｕｓ ｃａｊａｎ）由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４６）、ルベラナズナ（Ｃａｐｓｅｌｌａ ｒｕｂｅｌｌａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｒ０Ｈ２Ｊ１又はＲ０Ｈ０Ｃ２）、フクロユキノシタ（Ｃｅｐｈａｌｏｔｕｓ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｑ３ＣＳＫ１）、ヒヨコマメ（Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｑ７ＹＢＺ１、Ａ０Ａ１Ｓ２ＹＺＬ９、Ａ０Ａ３Ｑ７Ｙ０Ｚ６若しくはＡ０Ａ１Ｓ２ＹＺＭ６；又は配列番号５５、５６若しくは５７）、エンダイブ（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ ｅｎｄｉｖｉａ）のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号３９）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ａ０ＫＧＷ４又はＡ０Ａ０Ａ０Ｌ０Ｘ７）、マスクメロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ３ＢＬＦ２又はＡ０Ａ１Ｓ３Ｂ２９８）、キュウリ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ａ０ＫＡＷ８）、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４３）、アメリカネナシカズラ（Ｃｕｓｃｕｔａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４８４ＭＧＲ１）、キバナノセッコク（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｔｅｎａｔｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ０Ｖ７Ｎ９、Ａ０Ａ２Ｉ０Ｘ２Ｔ２又はＡ０Ａ２Ｉ０Ｗ０Ｑ８）、ドルコセラス・ヒグロメトリカム（Ｄｏｒｃｏｃｅｒａｓ ｈｙｇｒｏｍｅｔｒｉｃｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｚ７Ｄ３Ｙ１）、ユートレマ・サルスギネウム（Ｅｕｔｒｅｍａ ｓａｌｓｕｇｉｎｅｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ４ＬＳＨ０；又は配列番号４４）、ヨーロッパブナ（Ｆａｇｕｓ ｓｙｌｖａｔｉｃａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｎ９Ｅ５Ｙ５、Ａ０Ａ２Ｎ９ＨＡＢ９、又はＡ０Ａ２Ｎ９Ｈ９９３）、ゲンリセア・アウレア（Ｇｅｎｌｉｓｅａ ａｕｒｅａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｓ８Ｅ１Ｍ６）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号５１、５２、５３又は５４）、リクチワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｕ８ＬＤＵ９）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号２１）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４２）、コウリンタンポポ（Ｈｉｅｒａｃｉｕｍ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４０）、ペルシャグルミ（Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅｇｉａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ： Ａ０Ａ２Ｉ４Ｅ６Ｂ１）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｊ６ＫＺＦ７；又は配列番号２２）、ユウガオ（Ｌａｇｅｎａｒｉａ ｓｉｃｅｒａｒｉａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４８）、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｇ７Ｋ０２４）、マルバグワ（Ｍｏｒｕｓ ｎｏｔａｂｉｌｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｗ９ＳＭＹ３又はＷ９ＳＭＱ７）、ビロードマメ（Ｍｕｃｕｎａ ｐｒｕｒｉｅｎｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３７１ＥＬＪ８）、ニコチアナ・アテヌアタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｔｔｅｎｕａｔａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｊ６ＩＱＩ６）、ニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｕ７ＶＸＪ０）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ４Ａ６５１又はＡ０Ａ１Ｓ３ＹＨＱ２）、イネ亜種ジャポニカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ． Ｊａｐｏｎｉｃａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ９ＦＧＨ８）、オリザ・バルシー（Ｏｒｙｚａ ｂａｒｔｈｉｉ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｄ３ＦＷＸ３）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｌ６Ｑ０１０又はＡ０Ａ３Ｌ６Ｔ１Ｄ６）、パラスポニア・アンデルソニイ（Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｐ５ＢＭＩ５）、ギンドロ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ａｌｂａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４Ｕ５ＰＳＹ９）、ブラックコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ９Ｈ６６１）、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ０ＩＢＢ９、Ａ０Ａ２１８ＸＢ８５又はＡ０Ａ２１８Ｗ１０２）、セネシオ・カンブレンシス（Ｓｅｎｅｃｉｏ ｃａｍｂｒｅｎｓｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４１）、モモ（Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号５０）、ウラジロエノキ（Ｔｒｅｍａ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｐ５ＥＢ０４）、ムラサキツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｋ３Ｎ８５１）、ジモグリツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｚ６ＭＹＤ３又はＡ０Ａ２Ｚ６ＭＤＲ７）、ムラサキツメクサ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｋ３ＰＲ４４）、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４３８Ｃ７７８、Ａ０Ａ４３８ＥＳＣ４又はＡ０Ａ４３８ＤＢＲ４）及びトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｄ６ＨＦ４６、Ｂ６ＵＡＣ５、Ａ０Ａ３Ｌ６Ｆ４Ｓ１、Ａ０Ａ３Ｌ６ＥＭＣ６、Ａ０Ａ３Ｌ６ＥＭＣ６、Ｋ７ＵＨＱ６又はＡ０Ａ１Ｄ６ＫＨＺ４）。かかる遺伝子はまた、以下からなる群から選択されるＰＡＲタンパク質をコードすることができる：オニマタタビ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｒ６Ｓ２Ｓ９）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＸＰ＿０１０６９０６５６．１）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＸＰ＿０１５１５９１５１．１）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｑ７ＧＸＢ３）、キイロトウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｂａｃｃａｔｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｇ２ＷＪＲ７）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＶＣ１８９７４．１）、ツルマメ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ）由来のＰＡＲタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＸＰ＿０２８２０１０１４．１、ＸＰ＿００６５９６５７７．１又はＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４４５Ｍ３Ｍ６）、ナンキンマメ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４４４ＷＵＸ５）、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ７ＣＩＦ６）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ）由来のＰＡＲタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＸＰ＿０１７２４５４１３．１）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｂ６ＲＰ６４）、イネ亜種インディカ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｓｕｂｓｐ． ｉｎｄｉｃａ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ２ＹＨ６３）、イネ亜種ジャポニカ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５Ｚ７Ｐ５）及びカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０６１ＤＬ６３）。本発明は、これらのオーソロガス遺伝子、それらのプロモ
ーター配列、コード配列（ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡの配列を含めて）及び３’ＵＴＲを包含する。
ーター配列、コード配列（ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡの配列を含めて）及び３’ＵＴＲを包含する。
【0076】
本発明の核酸は、それらに限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのＲＮＡであってよい。好ましくは、本発明の核酸は、単離された核酸である。好ましくは、本明細書で定義のバリアント核酸は、好ましくは、例えば、デフォルトパラメータを用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（グローバル配列アラインメント）を使用してペアワイズアラインメントを行った場合、それぞれ、配列番号２、３、４、５、７、８、９、１０、１２、１３、１４及び１５の配列のうちのいずれか１つと、並びに／若しくは、配列番号１、６、及び１１をコードする配列のうちのいずれか１つと、又はそれらの相補体と、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ超のヌクレオチド配列同一性を好ましくは含む。例えば、配列番号３のコード配列のバリアントは、配列番号３と、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ超のヌクレオチド配列同一性を好ましくは含む：配列番号５のコード配列のバリアントは、配列番号５と、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ超のヌクレオチド配列同一性を好ましくは含む、等。
【0077】
好ましくは、バリアントは、１つ又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入、及び／又は置換によって、配列番号２、３、４、５、７、８、９、１０、１２、１３、１４及び１５の並びに配列番号１、６及び１１をコードする配列のうちのいずれか１つ又はそれらの相補体、とは異なっており、上記バリアントには、天然及び／又は合成／人工のバリアントが含まれる。「天然バリアント」とは、天然に、例えば他のタンポポ属の種に又はその他の植物に、見いだされるバリアントである。好ましくは、バリアントは、異なる植物種からの、例えば、広義のセイヨウタンポポとは異なるタンポポ属の種、例えば、異なる栽培品種、系統種又は育種系統からのヌクレオチド配列（遺伝子、プロモーター配列又はコード配列）である。前記バリアントはまた、タンポポ属に属する植物以外の植物に見いだすこと及び／又はこれらから単離することができる。
【0078】
本明細書で指示される場合、本発明の核酸はまた、本明細書で定義の、Ｐａｒ対立遺伝子若しくはｐａｒ対立遺伝子の定義の遺伝子、プロモーター若しくはコード配列の断片、又はそれらの任意のバリアントを包含する。「断片」は、少なくとも約１０、１２、１５、１８、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、２０００若しくはそれ超の連続したヌクレオチドなどの、配列番号２、３、４、５、７、８、９、１０、１２、１３、１４及び１５のうちのいずれか１つの並びに／若しくは配列番号１、６、及び１１をコードする配列のうちのいずれか１つの連続するヌクレオチド配列、若しくはそれらのバリアント、又は、前記配列にハイブリダイズすることが可能であることが好ましいその相補体、を含むか又はそれらからなる。一実施形態では、かかる断片は、本明細書で定義の単為生殖において機能的であるとすることができる（単為生殖を誘導することが可能であることが好ましい）。別の実施形態では、かかる断片は単為生殖において機能的であるとすることはできないが、単為生殖に関連しているとすることができ、その理由は、例をあげると、かかる断片は、単為生殖において機能的である配列にハイブリダイズすることができ、したがって単為生殖を指示することができるからである。かかる断片は、例えば、ＰＣＲプライマー又はハイブリダイゼーションプローブとして有用である場合があり、それにより、マッピングアッセイ若しくは分子アッセイで使用するための、並びに／又は他の植物からのＰａｒ対立遺伝子若しくはｐａｒ対立遺伝子を同定及び／若しくは単離するための遺伝子マーカーとして使用することができる。
【0079】
好ましくは、本発明の核酸は、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質をコードする遺伝子の、調節配列、好ましくはプロモーター配列を含むか又はそれらからなり、ここで、前記調節配列、好ましくはプロモーター配列は、核酸インサート、好ましくは二本鎖ＤＮＡインサートを含み、この場合、前記インサートは、５０～２０００ｂｐの間、１００～１９００ｂｐの間、２００～１８００ｂｐの間、３００～１７００ｂｐの間、４００～１６００ｂｐの間、５００～１５００ｂｐの間、６００～１４００ｂｐの間、１０００～１４００の間、１２００～１４００の間、又は１３００～１４００ｂｐの間の長さを有する。さらにより好ましくは、前記インサートは約１３００ｂｐの長さを有する。好ましくは、インサートは、本明細書で定義の単為生殖表現型に関連しており、任意選択で単為生殖表現型において機能的である。好ましくは、前記インサートの３’末端とＰＡＲタンパク質をコードする配列の開始コドンとの間の距離が、５０～２００ｂｐの間、好ましくは約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ｂｐ、最も好ましくは約１０２ｂｐ、であるように、好ましくは、前記インサートは、ＰＡＲタンパク質をコードする配列のすぐ上流（３’）に局在するプロモーター配列内に局在する。好ましくは、前記インサートは、インサートの３’末端ヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド１７９８の及び／又は配列番号５のヌクレオチド１７９８の位置に相同である位置にあるように、局在する。好ましくは、前記インサートは、オープンリーディングフレームがない。さらにより好ましくは、前記インサートは、ミニチュア逆方向反復転位因子（ＭＩＴＥ）又はＭＩＴＥ様配列であり、ここで、前記ＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、オープンリーディングフレームがない内部配列を含有しており、内部配列は、小直列反復配列によって次いで隣接されている末端逆方向反復配列（ＴＩＲ）が隣接する（標的部位の重複）、ことを特徴とする、非自律的エレメントである。ＭＩＴＥ、ＴＩＲ、及び配列の詳細については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｏら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１７年６月１日；７（１）：２６３４、を参照されたい。前記インサート、好ましくは前記ＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、配列番号６０と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ超の同一性を有することができる。好ましくは、前記インサートは、本明細書で定義の単為生殖表現型に関連しており、任意選択で単為生殖表現型において機能的である。さらに好ましい実施形態では、本発明の核酸は、調節配列、好ましくは、プロモーター配列を含むか又はそれらからなり、上に本明細書で定義の位置に前記インサートを包含する。好ましくは、本発明の核酸は、前記プロモーター配列に作動可能に連結された、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質をコードする配列を含むか又はそれらからなり、ここで、好ましくは、前記プロモーター配列は、ＰＡＲタンパク質をコードする配列の直接上流に局在する。任意選択で、本発明の前記核酸は、１つ又は複数のさらなる転写調節配列を含むことができる。
【0080】
一実施形態では、本発明の核酸は、タンポポ属系統（例えば、広義のセイヨウタンポポ）に又はその他の種に由来することができる。
【0081】
一実施形態では、本発明の核酸は、タンポポ属又は広義のセイヨウタンポポとは異なる起源に由来する。
【0082】
一実施形態では、本発明は、野生植物若しくは栽培植物などの単為生殖が存在する植物に、及び／又はその他の植物に由来する、相同又はオーソロガスのＰａｒ対立遺伝子を包含する。かかるホモログ又はオルソログは、提供されたヌクレオチド配列又はその一部をプライマー又はプローブとして使用することによって容易に単離することができる。例えば、本明細書で定義のヌクレオチド配列の断片、又はその相補体を例えば使用して、適度の又はストリンジェントな核酸ハイブリダイゼーション法を使用することができる。バリアントも、他の野生の又は栽培されたアポミクティック又は非アポミクティック植物から（及び／又はＰＣＲ、ストリンジェントハイブリダイゼーション法等などの既知の方法を使用して、他の植物から）単離することができる。したがって、配列番号２、３、４、５、７、８、９、１０、１２、１３、１４及び１５の、並びに／又は配列番号１、６及び１１をコードする配列のうちのいずれか１つのバリアントには、他のタンポポ属の植物、系統若しくは栽培品種において天然に（若しくは自然界において）見いだされる、及び／又はその他の植物において天然に見いだされる核酸も含まれる。
【0083】
宿主又は宿主細胞での最適な発現の場合、本明細書で教示のコード配列を、利用可能なコドン使用頻度表を使用して、植物遺伝子において最も好ましいものに、特に、目的の植物の属又は種にとって本来の遺伝子に（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ及びＨａｌｌ、１９８２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７、３０２６～３０３１；Ｉｔａｋｕｒａら、１９７７ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８、１０５６～１０６３）、コドン使用頻度を適合させる（例えば、目的の植物での発現向けにいっそう適合させる）ことによって、コドン最適化することができる。種々の植物種のコドン使用頻度表が、例えば、Ｉｋｅｍｕｒａ（１９９３、「Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｆａｘ」、Ｃｒｏｙ編、Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ．において）及びＮａｋａｍｕｒａら（２０００、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８、２９２．）によって、並びに主要なＤＮＡ配列データベース（例えば、ＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇにあるＥＭＢＬ、ドイツ）において、公開されている。したがって、同じ又は実質的に同じタンパク質を、前記合成ＤＮＡ配列を使用して作製することができるように、合成ＤＮＡ配列を構築することができる。コドン使用頻度を宿主細胞が好むものに改変するためのいくつかの技法を、特許及び科学文献に見いだすことができる。コドン使用頻度の改変の正確な方法は、本発明にとって極めて重要なものではない。
【0084】
配列番号２、３、４、５、７、８、９、１０、１２、１３、１４、及び１５の、並びに／若しくは配列番号１、６、及び１１をコードする配列のうちのいずれか１つ、又はそれらのバリアントへの少改変は、すなわち、ランダム又は標的突然変異誘発によって（例をあげると、化学的突然変異誘発又はＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ媒介突然変異誘発によって）ルーチンに為すことができる。本明細書で教示の前記配列へのより重大な改変は、利用可能な技法を使用して所望の配列のデノボＤＮＡ合成によってルーチンに行うことができる。
【0085】
一実施形態では、本発明の核酸を、前記核酸によってコードされる本発明のタンパク質のＮ終端が、タンパク質のＮ末端で１つ又は複数のアミノ酸を付加すること又は欠失させることによって、最適な翻訳開始状況を有するように、改変することができる。多くの場合、植物細胞で発現される本発明のタンパク質は、最適な翻訳開始のために、Ｍｅｔ－Ａｓｐ又はＭｅｔ－Ａｌａのジペプチドで開始することが好ましい。したがって、Ａｓｐ又はＡｌａコドンを、既存のＭｅｔに続いて挿入してもよく、又は、２番目のコドンＶａｌを、Ａｓｐ（ＧＡＴ若しくはＧＡＣ）又はＡｌａ（ＧＯＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、若しくはＧＣＧ）のコドンに置き換えることができる。ヌクレオチド配列はまた、非正統的スプライス部位を除去するように改変することができる。
【0086】
一実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有する機能性タンパク質、又はそのバリアント若しくは機能的断片、例えば、別の植物（すなわち、タンポポ属又は広義のセイヨウタンポポ以外）で見いだされるオルソログ又はその断片、を（過剰）発現することによって好ましくは提供される、（遺伝的に）優勢な機能を、本発明の核酸は有することができる。
【0087】
好ましくは、本発明の核酸は、植物で産生される場合、機能的であり、単為生殖を誘導及び／又は増強するタンパク質又はその機能的断片（複数可）をコードする。例えば、配列番号３若しくは５を含む核酸、又はそれらのバリアント若しくは断片が発現（転写及び翻訳）され、適切な量の本発明のタンパク質が適当な植物組織で産生される場合、単為生殖効果は、前記核酸を欠いているという点だけが異なる植物と比較して、有意に増強されている。機能性についても、非単為生殖タンポポ属系統などの適切な宿主植物において本発明の核酸を（過剰）発現させること、及び例えば実施例２に記載のように、バイオアッセイにおいて形質転換体の単為生殖効果を解析することによって、容易に試験することができる。前記核酸の機能性は、これらの核酸の１つ又は複数が（過剰）発現している試験植物を、対照植物は前記核酸の（過剰）発現を欠くという点のみが試験植物と異なる対照植物と比較することによって、評価されるのが好ましい。或いは、単為生殖に関連する本発明の核酸のサイレンシング又は破壊によって、機能喪失型を、すなわち単為生殖の低減を招くことができる。
【0088】
本発明の核酸を使用して、適切な宿主細胞において本発明のタンパク質を発現させるための、又は１つ若しくは複数の内因性の単為生殖遺伝子若しくは遺伝子ファミリーをサイレンシングするための、ベクター又はプラスミドを作り出すことができる。したがって、本発明の核酸を含む構築物、ベクター及び／若しくはプラスミド、並びに／又はサイレンシング構築物も、本発明によって包含される。
【0089】
本発明によるアミノ酸配列
本発明は、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質を提供する。本発明はまた、植物における単為生殖に関連するタンパク質を提供し、ここで、前記タンパク質は：
ａ）本発明の核酸によってコードされ；
ｂ）配列番号１、６若しくは１１のアミノ酸配列を有し；
ｃ）ａ）及び／若しくはｂ）のバリアントであり；並びに／又は
ｄ）ａ）～ｃ）のうちのいずれかの１つの断片であり、
ここで、好ましくは、前記タンパク質は単為生殖において機能的である。
一実施形態では、本発明のタンパク質は：
ａ）配列番号３、８若しくは１３のうちのいずれか１つの核酸によってコードされており；
ｂ）配列番号１、６若しくは１１のアミノ酸配列を有し；
ｃ）ａ）及び／若しくはｂ）のバリアントであり；並びに／又は
ｄ）ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つの断片であり、
ここで、好ましくは、本発明のタンパク質は単為生殖を誘導するのに適している。
一実施形態では、本発明のタンパク質は：
ａ）配列番号３若しくは５の核酸によってコードされており；
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有し；
ｃ）ａ）及び／若しくはｂ）のバリアントであり；並びに／又は
ｄ）ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つの断片であり、
ここで、好ましくは、本発明のタンパク質は単為生殖を誘導するのに適している。バリアントは好ましくは、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質である。好ましくは、タンパク質又はタンパク質断片は、配列番号３若しくは５の核酸、又はそれらのバリアント及び／若しくは断片によってコードされるか、或いはかかるタンパク質は、配列番号１、又はそのバリアント及び／若しくは断片を含む。好ましくは、前記バリアントは、好ましくは、例えば、デフォルトパラメータを用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（グローバル配列アラインメント）を使用してペアワイズアラインメントを行った場合、それぞれ、配列番号１、６、又は１１と、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ超の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。バリアントは、１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は置換によって、提供された配列とは異なっており、上記バリアントには、天然及び／又は合成／人工のバリアントが含まれる。本発明の核酸によってコードされるアミノ酸を有するタンパク質のバリアントは、好ましくは、配列番号３、５、８、１０、１３、１５のうちのいずれか１つによってコードされるタンパク質のバリアントは、又は配列番号１、６若しくは１１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントは、ホモログであってもオルソログであってもよい。本発明によって包含されるかかるオーソロガスタンパク質は、それらに限定されないが、以下からなる群から選択されるＰＡＲタンパク質のうちのいずれか１つであってよい：パイナップル由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１９９ＵＲＫ４）、アポスタシア・シェンゼニカ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ０ＡＺＷ３）、シロイヌナズナ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＧＸＰ９、Ａ０Ａ１７８Ｖ２Ｓ４、Ｏ８１７９３、Ａ０Ａ１７８Ｖ１Ｑ３、Ａ０ＭＦＣ１、Ｏ８１８０１）、セイヨウミヤマハタザオ亜種リラタ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｄ７ＭＣ５２又はＤ７ＭＣＥ８）、アラキス・イパエンシス由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４５又は配列番号４９）、ミナトカモジグサ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｉ１Ｊ０Ｄ９）、ヤセイカンラン変種オルラセア由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｄ３Ａ１Ｑ６又はＡ０Ａ０Ｄ３Ａ１Ｑ３）、ブラシカ・カンペストリス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３９８ＡＨＴ１）、ブラシカ・ラパ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４７）、ブラシカ・ラパ亜種ペキネンシス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ４Ｄ５７４又はＭ４Ｄ５７１）、ヤセイカンラン由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｐ６ＥＳＢ１又はＡ０Ａ３Ｐ６Ｆ７２６）、ブラシカ・カンペストリス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｐ５ＺＭＭ３又はＡ０Ａ３Ｐ５Ｚ１Ｍ１）、キマメ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４６）、ルベラナズナ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｒ０Ｈ２Ｊ１又はＲ０Ｈ０Ｃ２）、フクロユキノシタ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｑ３ＣＳＫ１）、ヒヨコマメ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｑ７ＹＢＺ１、Ａ０Ａ１Ｓ２ＹＺＬ９、Ａ０Ａ３Ｑ７Ｙ０Ｚ６若しくはＡ０Ａ１Ｓ２ＹＺＭ６；又は配列番号５５、５６若しくは５７）、エンダイブ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号３９）、キュウリ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ａ０ＫＧＷ４又はＡ０Ａ０Ａ０Ｌ０Ｘ７）、マスクメロン由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ３ＢＬＦ２又はＡ０Ａ１Ｓ３Ｂ２９８）、キュウリ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ａ０ＫＡＷ８）、ニホンカボチャ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４３）、アメリカネナシカズラ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４８４ＭＧＲ１）、キバナノセッコク由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ０Ｖ７Ｎ９、Ａ０Ａ２Ｉ０Ｘ２Ｔ２又はＡ０Ａ２Ｉ０Ｗ０Ｑ８）、ドルコセラス・ヒグロメトリカム由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｚ７Ｄ３Ｙ１）、ユートレマ・サルスギネウム由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ４ＬＳＨ０；又は配列番号４４）、ヨーロッパブナ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｎ９Ｅ５Ｙ５、Ａ０Ａ２Ｎ９ＨＡＢ９、又はＡ０Ａ２Ｎ９Ｈ９９３）、ゲンリセア・アウレア由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｓ８Ｅ１Ｍ６）、ダイズ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号５１、５２、５３又は５４）、リクチワタ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｕ８ＬＤＵ９）、ヒマワリ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号２１）、パラゴムノキ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４２）、コウリンタンポポのＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４０）、ペルシャグルミ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ４Ｅ６Ｂ１）、レタス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｊ６ＫＺＦ７；又は配列番号２２）、ユウガオ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４８）、タルウマゴヤシ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｇ７Ｋ０２４）、マルバグワ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｗ９ＳＭＹ３又はＷ９ＳＭＱ７）、ビロードマメ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３７１ＥＬＪ８）、ニコチアナ・アテヌアタ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｊ６ＩＱＩ６）、ニコチアナ・シルベストリス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｕ７ＶＸＪ０）、タバコ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ４Ａ６５１又はＡ０Ａ１Ｓ３ＹＨＱ２）、イネ亜種ジャポニカ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ９ＦＧＨ８）、オリザ・バルシー由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｄ３ＦＷＸ３）、キビ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｌ６Ｑ０１０又はＡ０Ａ３Ｌ６Ｔ１Ｄ６）、パラスポニア・アンデルソニイ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｐ５ＢＭＩ５）、ギンドロ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４Ｕ５ＰＳＹ９）、ブラックコットンウッド由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ９Ｈ６６１）、ザクロ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ０ＩＢＢ９、Ａ０Ａ２１８ＸＢ８５又はＡ０Ａ２１８Ｗ１０２）、セネシオ・カンブレンシス由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４１）、モモ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号５０）、ウラジロエノキ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｐ５ＥＢ０４）、ムラサキツメクサ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｋ３Ｎ８５１）、ジモグリツメクサ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｚ６ＭＹＤ３又はＡ０Ａ２Ｚ６ＭＤＲ７）、ムラサキツメクサ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｋ３ＰＲ４４）、ヨーロッパブドウ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４３８Ｃ７７８、Ａ０Ａ４３８ＥＳＣ４又はＡ０Ａ４３８ＤＢＲ４）及びトウモロコシ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｄ６ＨＦ４６、Ｂ６ＵＡＣ５、Ａ０Ａ３Ｌ６Ｆ４Ｓ１、Ａ０Ａ３Ｌ６ＥＭＣ６、Ａ０Ａ３Ｌ６ＥＭＣ６、Ｋ７ＵＨＱ６又はＡ０Ａ１Ｄ６ＫＨＺ４）。かかるオーソロガスタンパク質はまた、以下からなる群から選択されるＰＡＲタンパク質とすることができる：オニマタタビ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｒ６Ｓ２Ｓ９）、テンサイ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＸＰ＿０１０６９０６５６．１）、ジャガイモ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＸＰ＿０１５１５９１５１．１）、トマト由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｑ７ＧＸＢ３）、キイロトウガラシ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｇ２ＷＪＲ７）、ナス由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＶＣ１８９７４．１）、ツルマメ由来のＰＡＲタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＸＰ＿０２８２０１０１４．１、ＸＰ＿００６５９６５７７．１又はＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４４５Ｍ３Ｍ６）、ナンキンマメ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４４４ＷＵＸ５）、インゲンマメ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ７ＣＩＦ６）、ニンジン由来のＰＡＲタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＸＰ＿０１７２４５４１３．１）、パンコムギ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｂ６ＲＰ６４）、イネ亜種インディカ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ２ＹＨ６３）、イネ亜種ジャポニカ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５Ｚ７Ｐ５）及びカカオ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０６１ＤＬ６３）。
本発明は、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質を提供する。本発明はまた、植物における単為生殖に関連するタンパク質を提供し、ここで、前記タンパク質は：
ａ）本発明の核酸によってコードされ；
ｂ）配列番号１、６若しくは１１のアミノ酸配列を有し；
ｃ）ａ）及び／若しくはｂ）のバリアントであり；並びに／又は
ｄ）ａ）～ｃ）のうちのいずれかの１つの断片であり、
ここで、好ましくは、前記タンパク質は単為生殖において機能的である。
一実施形態では、本発明のタンパク質は：
ａ）配列番号３、８若しくは１３のうちのいずれか１つの核酸によってコードされており；
ｂ）配列番号１、６若しくは１１のアミノ酸配列を有し；
ｃ）ａ）及び／若しくはｂ）のバリアントであり；並びに／又は
ｄ）ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つの断片であり、
ここで、好ましくは、本発明のタンパク質は単為生殖を誘導するのに適している。
一実施形態では、本発明のタンパク質は：
ａ）配列番号３若しくは５の核酸によってコードされており；
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を有し；
ｃ）ａ）及び／若しくはｂ）のバリアントであり；並びに／又は
ｄ）ａ）～ｃ）のうちのいずれか１つの断片であり、
ここで、好ましくは、本発明のタンパク質は単為生殖を誘導するのに適している。バリアントは好ましくは、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質である。好ましくは、タンパク質又はタンパク質断片は、配列番号３若しくは５の核酸、又はそれらのバリアント及び／若しくは断片によってコードされるか、或いはかかるタンパク質は、配列番号１、又はそのバリアント及び／若しくは断片を含む。好ましくは、前記バリアントは、好ましくは、例えば、デフォルトパラメータを用いてＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（グローバル配列アラインメント）を使用してペアワイズアラインメントを行った場合、それぞれ、配列番号１、６、又は１１と、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ超の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。バリアントは、１つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は置換によって、提供された配列とは異なっており、上記バリアントには、天然及び／又は合成／人工のバリアントが含まれる。本発明の核酸によってコードされるアミノ酸を有するタンパク質のバリアントは、好ましくは、配列番号３、５、８、１０、１３、１５のうちのいずれか１つによってコードされるタンパク質のバリアントは、又は配列番号１、６若しくは１１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントは、ホモログであってもオルソログであってもよい。本発明によって包含されるかかるオーソロガスタンパク質は、それらに限定されないが、以下からなる群から選択されるＰＡＲタンパク質のうちのいずれか１つであってよい：パイナップル由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１９９ＵＲＫ４）、アポスタシア・シェンゼニカ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ０ＡＺＷ３）、シロイヌナズナ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＧＸＰ９、Ａ０Ａ１７８Ｖ２Ｓ４、Ｏ８１７９３、Ａ０Ａ１７８Ｖ１Ｑ３、Ａ０ＭＦＣ１、Ｏ８１８０１）、セイヨウミヤマハタザオ亜種リラタ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｄ７ＭＣ５２又はＤ７ＭＣＥ８）、アラキス・イパエンシス由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４５又は配列番号４９）、ミナトカモジグサ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｉ１Ｊ０Ｄ９）、ヤセイカンラン変種オルラセア由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｄ３Ａ１Ｑ６又はＡ０Ａ０Ｄ３Ａ１Ｑ３）、ブラシカ・カンペストリス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３９８ＡＨＴ１）、ブラシカ・ラパ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４７）、ブラシカ・ラパ亜種ペキネンシス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｍ４Ｄ５７４又はＭ４Ｄ５７１）、ヤセイカンラン由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｐ６ＥＳＢ１又はＡ０Ａ３Ｐ６Ｆ７２６）、ブラシカ・カンペストリス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｐ５ＺＭＭ３又はＡ０Ａ３Ｐ５Ｚ１Ｍ１）、キマメ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４６）、ルベラナズナ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｒ０Ｈ２Ｊ１又はＲ０Ｈ０Ｃ２）、フクロユキノシタ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｑ３ＣＳＫ１）、ヒヨコマメ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｑ７ＹＢＺ１、Ａ０Ａ１Ｓ２ＹＺＬ９、Ａ０Ａ３Ｑ７Ｙ０Ｚ６若しくはＡ０Ａ１Ｓ２ＹＺＭ６；又は配列番号５５、５６若しくは５７）、エンダイブ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号３９）、キュウリ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ａ０ＫＧＷ４又はＡ０Ａ０Ａ０Ｌ０Ｘ７）、マスクメロン由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ３ＢＬＦ２又はＡ０Ａ１Ｓ３Ｂ２９８）、キュウリ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ａ０ＫＡＷ８）、ニホンカボチャ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４３）、アメリカネナシカズラ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４８４ＭＧＲ１）、キバナノセッコク由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ０Ｖ７Ｎ９、Ａ０Ａ２Ｉ０Ｘ２Ｔ２又はＡ０Ａ２Ｉ０Ｗ０Ｑ８）、ドルコセラス・ヒグロメトリカム由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｚ７Ｄ３Ｙ１）、ユートレマ・サルスギネウム由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ４ＬＳＨ０；又は配列番号４４）、ヨーロッパブナ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｎ９Ｅ５Ｙ５、Ａ０Ａ２Ｎ９ＨＡＢ９、又はＡ０Ａ２Ｎ９Ｈ９９３）、ゲンリセア・アウレア由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｓ８Ｅ１Ｍ６）、ダイズ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号５１、５２、５３又は５４）、リクチワタ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｕ８ＬＤＵ９）、ヒマワリ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号２１）、パラゴムノキ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４２）、コウリンタンポポのＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４０）、ペルシャグルミ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ４Ｅ６Ｂ１）、レタス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｊ６ＫＺＦ７；又は配列番号２２）、ユウガオ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４８）、タルウマゴヤシ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｇ７Ｋ０２４）、マルバグワ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｗ９ＳＭＹ３又はＷ９ＳＭＱ７）、ビロードマメ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３７１ＥＬＪ８）、ニコチアナ・アテヌアタ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｊ６ＩＱＩ６）、ニコチアナ・シルベストリス由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｕ７ＶＸＪ０）、タバコ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｓ４Ａ６５１又はＡ０Ａ１Ｓ３ＹＨＱ２）、イネ亜種ジャポニカ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ９ＦＧＨ８）、オリザ・バルシー由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０Ｄ３ＦＷＸ３）、キビ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｌ６Ｑ０１０又はＡ０Ａ３Ｌ６Ｔ１Ｄ６）、パラスポニア・アンデルソニイ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｐ５ＢＭＩ５）、ギンドロ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４Ｕ５ＰＳＹ９）、ブラックコットンウッド由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｂ９Ｈ６６１）、ザクロ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｉ０ＩＢＢ９、Ａ０Ａ２１８ＸＢ８５又はＡ０Ａ２１８Ｗ１０２）、セネシオ・カンブレンシス由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号４１）、モモ由来のＰＡＲタンパク質（例えば配列番号５０）、ウラジロエノキ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｐ５ＥＢ０４）、ムラサキツメクサ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｋ３Ｎ８５１）、ジモグリツメクサ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｚ６ＭＹＤ３又はＡ０Ａ２Ｚ６ＭＤＲ７）、ムラサキツメクサ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｋ３ＰＲ４４）、ヨーロッパブドウ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４３８Ｃ７７８、Ａ０Ａ４３８ＥＳＣ４又はＡ０Ａ４３８ＤＢＲ４）及びトウモロコシ由来のＰＡＲタンパク質（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ１Ｄ６ＨＦ４６、Ｂ６ＵＡＣ５、Ａ０Ａ３Ｌ６Ｆ４Ｓ１、Ａ０Ａ３Ｌ６ＥＭＣ６、Ａ０Ａ３Ｌ６ＥＭＣ６、Ｋ７ＵＨＱ６又はＡ０Ａ１Ｄ６ＫＨＺ４）。かかるオーソロガスタンパク質はまた、以下からなる群から選択されるＰＡＲタンパク質とすることができる：オニマタタビ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｒ６Ｓ２Ｓ９）、テンサイ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＸＰ＿０１０６９０６５６．１）、ジャガイモ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＸＰ＿０１５１５９１５１．１）、トマト由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｑ７ＧＸＢ３）、キイロトウガラシ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ２Ｇ２ＷＪＲ７）、ナス由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：ＡＶＣ１８９７４．１）、ツルマメ由来のＰＡＲタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＸＰ＿０２８２０１０１４．１、ＸＰ＿００６５９６５７７．１又はＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４４５Ｍ３Ｍ６）、ナンキンマメ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ４４４ＷＵＸ５）、インゲンマメ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｖ７ＣＩＦ６）、ニンジン由来のＰＡＲタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＸＰ＿０１７２４５４１３．１）、パンコムギ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ３Ｂ６ＲＰ６４）、イネ亜種インディカ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ２ＹＨ６３）、イネ亜種ジャポニカ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ５Ｚ７Ｐ５）及びカカオ由来のＰＡＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ａ０６１ＤＬ６３）。
【0090】
したがって、本発明によって包含される配列番号１のタンパク質のバリアントは、それらに限定されないが、本明細書で定義のオルソログＰＡＲタンパク質のうちのいずれか１つであってもよい。
【0091】
本発明のＰＡＲタンパク質、及び／又は配列番号１、６若しくは１１を有するタンパク質のバリアントは、植物又は植物細胞に存在する場合、単為生殖を誘導することが可能であってもよい。タンパク質のバリアントは、前記植物又は植物細胞の内因性タンパク質であっても非内因性タンパク質であってもよい。任意選択で、本発明のＰＡＲタンパク質及び／又は配列番号１、６若しくは１１を有するタンパク質のバリアントは、当該タンパク質の発現が変化した、好ましくは増大した場合に、単為生殖を誘導することが可能である。好ましくは、かかる変化した発現、好ましくは増大した発現は、卵細胞内である。発現の変化又は増大は、植物若しくは植物細胞における前記タンパク質のデノボ発現であってもよく、又は、植物若しくは植物細胞における内因性タンパク質の増大した発現であってもよい。当業者であれば、タンパク質の発現を増大する方法を知っている。植物又は植物細胞における当該タンパク質のデノボ発現は、例えば、タンパク質をコードする構築物若しくはベクターを植物若しくは植物細胞にトランスフェクションすること、タンパク質をコードする遺伝子を植物若しくは植物細胞の後代へと遺伝子移入すること、及び／又は内因性配列を改変して、例をあげると遺伝子改変によって前記タンパク質をコードする配列をもたらすことによって、誘導してもよい。任意選択で、かかる構築物又はベクターは、卵細胞プロモーターに作動可能に連結されたＰＡＲタンパク質をコードする配列を含む。当業者であれば、卵細胞プロモーターについて知っている。植物の卵細胞における発現を駆動することが可能である例示的な卵細胞プロモーターには、それらに限定されないが、卵細胞特異的遺伝子ＥＣｌ．１、ＥＣｌ．２、ＥＣｌ．３、ＥＣｌ．４、又はＥＣｌ．５のプロモーター（例えば、Ｓｐｒｕｎｃｋら Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３８：１０９３～１０９７（２０１２）；ＡＴ２Ｇ２１７４０；Ｓｔｅｆｆｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ５１：２８１～２９２（２００７）を参照されたい）、シロイヌナズナ属ＤＤ４５プロモーター（Ｏｈｎｉｓｈｉら ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １６５：１５３３～１５４３（２０１４））が含まれる。好ましくは、本発明の構築物又はベクターは、調節配列、好ましくはプロモーター配列に作動可能に連結されたＰＡＲタンパク質をコードする配列を含み、核酸インサート、好ましくは二本鎖ＤＮＡインサートを含み、ここで、前記インサートは、５０～２０００ｂｐの間、１００～１９００ｂｐの間、２００～１８００ｂｐの間、３００～１７００ｂｐの間、４００～１６００ｂｐの間、５００～１５００ｂｐの間、６００～１４００ｂｐの間、１０００～１４００の間、１２００～１４００の間、又は１３００～１４００ｂｐの間、の長さを有する。さらにより好ましくは、前記インサートは約１３００ｂｐの長さを有する。好ましくは、インサートは、本明細書で定義の単為生殖表現型に関連しており、任意選択で単為生殖表現型において機能的である。好ましくは、前記インサートの３’末端とＰＡＲタンパク質をコードする配列の開始コドンとの間の距離が、５０～２００ｂｐの間、好ましくは約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ｂｐ、最も好ましくは約１０２ｂｐ、であるように、好ましくは、前記インサートは、ＰＡＲタンパク質をコードする配列のすぐ上流（３’）に局在するプロモーター配列内に局在する。好ましくは、前記インサートは、インサートの３’末端ヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド１７９８の及び／又は配列番号５のヌクレオチド１７９８の位置に相同である位置にあるように局在する。好ましくは、前記インサートは、オープンリーディングフレームがない。さらにより好ましくは、前記インサートは、ミニチュア逆方向反復転位因子（ＭＩＴＥ）又はＭＩＴＥ様配列であり、ここで、前記ＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、オープンリーディングフレームがない内部配列を含有しており、内部配列は、小直列反復配列によって次いで隣接されている末端逆方向反復配列（ＴＩＲ）が隣接する（標的部位の重複）、ことを特徴とする、非自律的エレメントである。ＭＩＴＥ、ＴＩＲ、及び配列の詳細については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｏら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１７年６月１日；７（１）：２６３４、を参照されたい。前記インサート、好ましくは前記ＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、配列番号６０と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ超の同一性を有することができる。好ましくは、前記インサートは、本明細書で定義の単為生殖表現型に関連しており、任意選択で単為生殖表現型において機能的である。さらに好ましい実施形態では、本発明の構築物又はベクターは、調節配列、好ましくは、プロモーター配列を含むか又はそれらからなり、上に本明細書で定義の位置に前記インサートを包含する。好ましくは、構築物又はベクターは、前記プロモーター配列に作動可能に連結された、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質をコードする配列を含むか又はそれらからなり、ここで、好ましくは、前記プロモーター配列は、ＰＡＲタンパク質をコードする配列の直接上流に局在する。任意選択で、本発明の前記構築物又はベクターは、１つ又は複数のさらなる転写調節配列を含むことができる。
【0092】
加えて、又は代替的に、かかる構築物又はベクターは、配列番号２のプロモーターに作動可能に連結されたＰＡＲタンパク質をコードする配列を含む。内因性タンパク質の発現の変化又は増大は、コード配列に作動可能に連結された１つ又は複数の調節配列を改変することによって誘導されてもよい。例えば、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター配列は、例えば遺伝子改変によって、改変してもよい。好ましい実施形態では、上に本明細書で定義のインサートは、プロモーター配列に、好ましくは上に本明細書で定義の位置に導入される。単為生殖を誘導することが可能であるかかる機能性は、本明細書に記載のように、前記バリアントをコードする核酸の単為生殖における機能性に適切な試験を使用することによって評価してもよい。本発明のタンパク質は単離されたタンパク質であってもよい。
【0093】
「天然バリアント」とは、天然に、例えば、栽培又は野生のレタス植物及び／又はその他の植物に見いだされるものである。断片、すなわち本発明のタンパク質の非全長ペプチド、好ましくは機能的断片も含まれ、すなわち、この断片は、適切な宿主植物で発現される場合に単為生殖を誘導することが可能である。本明細書で教示のタンパク質の断片には、本発明の核酸によってコードされる少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０若しくはそれ超の連続するアミノ酸配列を含むか若しくはそれらからなるペプチド、特に、配列番号１、６、若しくは１１の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０若しくはそれ超の連続するアミノ酸を含むか若しくはそれらからなるペプチド、又はそれらのバリアント（本明細書で定義の）、が含まれる。天然に見いだされる配列は、本明細書では「野生型」としても指示される。
【0094】
本発明のタンパク質は、天然源から単離したか、化学合成によってデノボで合成したか（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって供給されるようなペプチドシンセサイザーを使用して）、又は本発明のタンパク質をコードする本明細書で教示のヌクレオチド配列を発現させることにより組換え宿主細胞によって産生されたものであってもよい。本発明のタンパク質はまた、本明細書で定義の本発明の核酸からの発現によって産生することができる。
【0095】
タンパク質バリアントは、塩基性（例えばＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）、酸性（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ）、非極性（例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）又は極性（例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）のカテゴリー内での保存的アミノ酸置換を含むことができる。加えて、非保存的アミノ酸置換も本発明の範囲に包含される。
【0096】
配列番号１、６又は１１のタンパク質のＮ終端（例えば、タンポポ属（Ｔａｘａｒａｃｕｍ）又は植物種Ｘから得られた）及び配列番号１、６又は１１のバリアントの中間ドメイン及び／又はＣ終端ドメイン（例えば、タンポポ属又は植物種Ｙ又は別の植物種から得られた）などの、異なる供給源からのドメインから構成されるタンパク質などのキメラタンパク質も、本明細書に包含される。好ましくは、キメラタンパク質は、少なくとも２つのオーソロガスタンパク質由来のドメインから構成される。かかるキメラタンパク質は、例えば、植物宿主で発現される場合に、天然タンパク質よりも単為生殖をより効率的に付与することができるという意味で、向上した機能性を有することができる。
【0097】
また、本発明のタンパク質、タンパク質バリアント又はタンパク質断片をコードするすべてのヌクレオチド配列（ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等）は、本発明によって包含される。遺伝コードの縮重に起因して、種々のヌクレオチド配列が同じアミノ酸配列をコードすることができる。
【0098】
単為生殖植物及びこれらを作製する方法
さらなる態様では、本発明は、植物（例えば、植物細胞、器官、種子及び植物部分を含めて）と、改変された単為生殖を示す植物を、任意選択で、天然の又は未改変の植物と比較して改変された、好ましくは誘導された単為生殖を有するトランスジェニック植物を作製する方法と、に関する。かかる植物は、例えばさらに本明細書で記載のように、様々な方法を使用して作製することができる。好ましくは、本発明の植物は、技術的手段によって、好ましくは本明細書に記載の方法によって得られる。かかる技術的手段は当業者によく知られており、この技術的手段には、例えば、ランダム突然変異誘発、標的突然変異誘発、及び核酸挿入のうちの少なくとも１つなどの遺伝子改変が含まれる。
さらなる態様では、本発明は、植物（例えば、植物細胞、器官、種子及び植物部分を含めて）と、改変された単為生殖を示す植物を、任意選択で、天然の又は未改変の植物と比較して改変された、好ましくは誘導された単為生殖を有するトランスジェニック植物を作製する方法と、に関する。かかる植物は、例えばさらに本明細書で記載のように、様々な方法を使用して作製することができる。好ましくは、本発明の植物は、技術的手段によって、好ましくは本明細書に記載の方法によって得られる。かかる技術的手段は当業者によく知られており、この技術的手段には、例えば、ランダム突然変異誘発、標的突然変異誘発、及び核酸挿入のうちの少なくとも１つなどの遺伝子改変が含まれる。
【0099】
好ましくは、本発明の植物は、本質的に生物学的なプロセスによって得られない。好ましくは、本発明の植物は、本質的に生物学的なプロセスによってだけでは得られない。好ましくは、本発明の植物は、植物に単為生殖を導入するという本質的に生物学的なプロセスによって、得られない、好ましくは直接には得られない。好ましくは、本発明の植物は、植物に単為生殖を導入するという本質的に生物学的なプロセスによってだけでは得られない。好ましくは、本発明の植物は、天然起源の植物ではない、すなわち、天然に存在する植物ではない。
特に、本発明は、単為生殖植物を作出する方法を提供し、以下のステップ：
ａ）単為生殖を誘導することが可能であり及び／又は単為生殖において機能的である本発明の核酸及び／又はその派生物を１つ又は複数の植物細胞に導入するステップと；
ｂ）任意選択で、前記核酸を含む植物細胞を選別するステップであって、好ましくは、前記核酸が、前記植物細胞のゲノムに統合されている、選別するステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含み、
ここで好ましくは、本発明の前記核酸は、単為生殖において機能的である本明細書で定義のＰＡＲタンパク質を、コードする若しくはコードする配列に作動可能に連結されている、及び／或いは配列番号２～５のうちのいずれか１つである、若しくは配列番号１のタンパク質をコードする、又はそれらのバリアント若しくは断片である。
本発明は、アポミクティック植物を作出する方法をさらに提供し、以下のステップ：
ａ）単為生殖を誘導することが可能である、本発明の核酸及び／又はその派生物をアポマイオシスが可能な１つ又は複数の植物細胞に導入するステップと；
ｂ）任意選択で、前記核酸を含む植物細胞を選別するステップであって、好ましくは、前記核酸が、前記植物細胞のゲノムに統合されている、選別するステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含み、
ここで好ましくは、本発明の前記核酸は、単為生殖において機能的である本明細書で定義のＰＡＲタンパク質を、コードする若しくはコードする配列に作動可能に連結されている、及び／或いは配列番号２～５のうちのいずれか１つである、若しくは配列番号１のタンパク質をコードする、又はそれらのバリアント若しくは断片である。アポマイオシスが可能な植物細胞は、アポマイオシスを付与することができる核酸を導入するステップによって入手してもよい。任意選択で、前記核酸を、本発明の核酸の導入の前、導入と一緒、又は導入の後に植物細胞に導入する。
特に、本発明は、単為生殖植物を作出する方法を提供し、以下のステップ：
ａ）単為生殖を誘導することが可能であり及び／又は単為生殖において機能的である本発明の核酸及び／又はその派生物を１つ又は複数の植物細胞に導入するステップと；
ｂ）任意選択で、前記核酸を含む植物細胞を選別するステップであって、好ましくは、前記核酸が、前記植物細胞のゲノムに統合されている、選別するステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含み、
ここで好ましくは、本発明の前記核酸は、単為生殖において機能的である本明細書で定義のＰＡＲタンパク質を、コードする若しくはコードする配列に作動可能に連結されている、及び／或いは配列番号２～５のうちのいずれか１つである、若しくは配列番号１のタンパク質をコードする、又はそれらのバリアント若しくは断片である。
本発明は、アポミクティック植物を作出する方法をさらに提供し、以下のステップ：
ａ）単為生殖を誘導することが可能である、本発明の核酸及び／又はその派生物をアポマイオシスが可能な１つ又は複数の植物細胞に導入するステップと；
ｂ）任意選択で、前記核酸を含む植物細胞を選別するステップであって、好ましくは、前記核酸が、前記植物細胞のゲノムに統合されている、選別するステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含み、
ここで好ましくは、本発明の前記核酸は、単為生殖において機能的である本明細書で定義のＰＡＲタンパク質を、コードする若しくはコードする配列に作動可能に連結されている、及び／或いは配列番号２～５のうちのいずれか１つである、若しくは配列番号１のタンパク質をコードする、又はそれらのバリアント若しくは断片である。アポマイオシスが可能な植物細胞は、アポマイオシスを付与することができる核酸を導入するステップによって入手してもよい。任意選択で、前記核酸を、本発明の核酸の導入の前、導入と一緒、又は導入の後に植物細胞に導入する。
【0100】
本発明の核酸は、形質転換、遺伝子移入、体細胞ハイブリダイゼーション及び／又はプロトプラスト融合によって、１つ又は複数の植物細胞に導入することができる。かかる核酸は、外因性核酸、すなわち、天然で前記植物細胞に存在しない核酸であってもよい。
【0101】
本発明の核酸は、内因性核酸を改変して本発明の核酸を得ることにより、１つ又は複数の植物細胞に導入することができる。内因性遺伝子の改変は好ましくは、内因性タンパク質の発現を変化させるために、コード配列における並びに／又は調節配列及び／若しくはプロモーター配列における、１つ若しくは複数のヌクレオチドのランダム若しくは標的突然変異、又は例をあげると相同組換えによる短い若しくはより大きな配列の挿入若しくは欠失、を含む。かかる方法は好ましくは、本明細書で定義の１つ又は複数の内因性ｐａｒ対立遺伝子のＰａｒ対立遺伝子への改変をもたらす。ランダム突然変異誘発は、それらに限定されないが、化学的突然変異誘発及びガンマ線であってもよい。化学的突然変異誘発の非限定的な例としては、それらに限定されないが、ＥＭＳ（メタンスルホン酸エチル）、ＭＭＳ（メタンスルホン酸メチル）、ＮａＮ３（アジ化ナトリウム）Ｄ）、ＥＮＵ（Ｎ－エチル－Ｎ－ニトロソ尿素）、ＡｚａＣ（アザシチジン）及びＮＱＯ（４－ニトロキノリン１－オキシド）が挙げられる。任意選択で、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的化誘発局所的損傷（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；ＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １８：４５５、及びＭｃＣａｌｌｕｍら ２０００、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３、４３９～４４２、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）などの突然変異誘発系を使用して、本明細書で定義の改変された遺伝子を有する植物系統を作り出してもよい。ＴＩＬＬＩＮＧでは、従来の化学的突然変異誘発（例えばＥＭＳ突然変異誘発）を、これに続いて、突然変異向けにハイスループットスクリーニングを使用する。したがって、１つ又は複数の所望の突然変異を有する遺伝子を含む植物、種子及び組織を、ＴＩＬＬＩＮＧを使用して入手してもよい。標的化突然変異誘発とは、特定のヌクレオチド又は核酸配列を変更するように設計することができる突然変異誘発であり、例えば、それらに限定されないが、オリゴ指向性突然変異誘発、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ（例えばＣＲＩＳＰＲテクノロジー）、ＴＡＬＥＮ又はジンクフィンガーテクノロジーである。
【0102】
好ましくは、改変とは、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター配列における改変である。好ましくは、改変は、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質の発現を導入又は増大する。好ましくは、改変は、卵細胞において本明細書で定義のＰＡＲタンパク質の発現を導入又は増大する。
したがって、本発明の方法は、以下のステップ：
ａ）単為生殖に関連する及び／又は単為生殖において機能的であるタンパク質をコードする配列であるか、又はこの配列に作動可能に連結されている核酸を、１つ又は複数の植物細胞において改変するステップであって、好ましくは、前記核酸が前記１つ又は複数の植物細胞のゲノム内にある、改変するステップと；
ｂ）任意選択で、前記改変された核酸を含む植物細胞を選別するステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含むことができ、
ここで好ましくは、単為生殖に関連する及び／又は単為生殖において機能的である前記タンパク質は、上に本明細書で記載の本発明によるアミノ酸配列を有する。好ましくは、ステップａ）で改変される核酸は、内因性核酸であり、好ましくは、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質及び／又は配列番号１、６若しくは１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列であるか、又はこの配列に作動可能に連結されているヌクレオチド配列、又は、それらのバリアント若しくは断片を、含むか又はそれらからなる。
したがって、本発明の方法は、以下のステップ：
ａ）単為生殖に関連する及び／又は単為生殖において機能的であるタンパク質をコードする配列であるか、又はこの配列に作動可能に連結されている核酸を、１つ又は複数の植物細胞において改変するステップであって、好ましくは、前記核酸が前記１つ又は複数の植物細胞のゲノム内にある、改変するステップと；
ｂ）任意選択で、前記改変された核酸を含む植物細胞を選別するステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含むことができ、
ここで好ましくは、単為生殖に関連する及び／又は単為生殖において機能的である前記タンパク質は、上に本明細書で記載の本発明によるアミノ酸配列を有する。好ましくは、ステップａ）で改変される核酸は、内因性核酸であり、好ましくは、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質及び／又は配列番号１、６若しくは１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列であるか、又はこの配列に作動可能に連結されているヌクレオチド配列、又は、それらのバリアント若しくは断片を、含むか又はそれらからなる。
【0103】
特定の好ましい実施形態では、前記核酸は、本明細書で定義の単為生殖に関連するタンパク質をコードする遺伝子の（５’ＵＴＲ）プロモーター配列である。好ましくは、前記改変とは、核酸インサート、好ましくは二本鎖ＤＮＡインサートの導入であり、ここで、前記インサートは、５０～２０００ｂｐの間、１００～１９００ｂｐの間、２００～１８００ｂｐの間、３００～１７００ｂｐの間、４００～１６００ｂｐの間、５００～１５００ｂｐの間、６００～１４００ｂｐの間、１０００～１４００の間、１２００～１４００の間、又は１３００～１４００ｂｐの間の長さを有する。さらにより好ましくは、前記インサートは約１３００ｂｐの長さを有する。好ましくは、インサートは、本明細書で定義の単為生殖表現型に関連しており、任意選択で単為生殖表現型において機能的である。好ましくは、前記インサートの３’末端とＰＡＲタンパク質をコードする配列の開始コドンとの間の距離が、５０～２００ｂｐの間、好ましくは約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ｂｐ、最も好ましくは約１０２ｂｐ、であるように、好ましくは、前記インサートは、ＰＡＲタンパク質をコードする配列のすぐ上流（３’）に局在するプロモーター配列内に導入される。好ましくは、前記インサートは、インサートの３’末端ヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド１７９８の及び／又は配列番号５のヌクレオチド１７９８の位置に相同である位置にあるように導入される。好ましくは、前記インサートは、オープンリーディングフレームがない。さらにより好ましくは、前記インサートは、ミニチュア逆方向反復転位因子（ＭＩＴＥ）又はＭＩＴＥ様配列であり、ここで、前記ＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、オープンリーディングフレームがない内部配列を含有しており、内部配列は、小直列反復配列によって次いで隣接されている末端逆方向反復配列（ＴＩＲ）が隣接する（標的部位の重複）、ことを特徴とする、非自律的エレメントである。ＭＩＴＥ、ＴＩＲ、及び配列の詳細については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｏら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１７年６月１日；７（１）：２６３４、を参照されたい。前記インサート、好ましくは前記ＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、配列番号６０と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ超の同一性を有することができる。好ましくは、前記インサートは、本明細書で定義の単為生殖表現型に関連しており、任意選択で単為生殖表現型において機能的である。
【0104】
好ましくは、ヌクレオチド配列の改変は、好ましくは植物細胞から再生された植物の卵細胞において、前記タンパク質の導入された又は増大した発現をもたらす。好ましくは、改変されたプロモーター配列は、配列番号２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
さらに、本発明の方法は、以下のステップ：
ａ）単為生殖に関連する及び／又は単為生殖において機能的であるタンパク質をコードする配列であるか、又はこの配列に作動可能に連結されている核酸を、アポマイオシスが可能な１つ又は複数の植物細胞において改変するステップであって、好ましくは、前記核酸が前記１つ又は複数の植物細胞のゲノム内にある、改変するステップと；
ｂ）任意選択で、前記改変又は変更された核酸を含む植物細胞を選別するステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含むことができ、
ここで好ましくは、単為生殖に関連する及び／又は単為生殖において機能的である前記タンパク質は、上に本明細書で記載の本発明のタンパク質によるアミノ酸配列を有する。好ましくは、ステップａ）で改変される核酸は、内因性核酸であり、好ましくは、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質及び／又は配列番号１、６若しくは１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列であるか、又はこの配列に作動可能に連結されているヌクレオチド配列、又は、それらのバリアント若しくは断片を、含むか又はそれらからなる。好ましくは、ステップａ）で改変される核酸は、内因性核酸である。
さらに、本発明の方法は、以下のステップ：
ａ）単為生殖に関連する及び／又は単為生殖において機能的であるタンパク質をコードする配列であるか、又はこの配列に作動可能に連結されている核酸を、アポマイオシスが可能な１つ又は複数の植物細胞において改変するステップであって、好ましくは、前記核酸が前記１つ又は複数の植物細胞のゲノム内にある、改変するステップと；
ｂ）任意選択で、前記改変又は変更された核酸を含む植物細胞を選別するステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含むことができ、
ここで好ましくは、単為生殖に関連する及び／又は単為生殖において機能的である前記タンパク質は、上に本明細書で記載の本発明のタンパク質によるアミノ酸配列を有する。好ましくは、ステップａ）で改変される核酸は、内因性核酸であり、好ましくは、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質及び／又は配列番号１、６若しくは１１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列であるか、又はこの配列に作動可能に連結されているヌクレオチド配列、又は、それらのバリアント若しくは断片を、含むか又はそれらからなる。好ましくは、ステップａ）で改変される核酸は、内因性核酸である。
【0105】
特定の好ましい実施形態では、前記核酸は、本明細書で定義の、単為生殖に関連する及び／又は単為生殖において機能的であるタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター配列である。好ましくは、ヌクレオチド配列の改変は、好ましくは、前記植物細胞から再生された植物の卵細胞において、前記タンパク質の導入された又は増大した発現をもたらす。好ましくは、改変されたプロモーター配列は、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター配列である。好ましくは、前記改変されたプロモーター配列は、好ましくは上に本明細書で定義の位置に、上に本明細書で定義のインサートを含むように、改変される。
【0106】
好ましくは、改変されたプロモーター配列は、配列番号２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
本発明はまた、アポミクティック雑種種子を生産する方法を提供し、以下のステップ：
ａ）有性生殖する第１の植物を第２の植物の花粉と他家受精させて、Ｆ１雑種種子を生産するステップと；
ｂ）任意選択で、アポミクティック表現型を含む種子を前記Ｆ１種子から選別するステップと
を含み、
ここで、前記第１の植物及び／又は第２の植物は、アポマイオシスが可能であり、前記第２の植物は本発明の核酸を含み、好ましくは、前記選別ステップは、遺伝子型決定によって行われる。好ましくは、前記第２の植物は、配列番号２～５のうちのいずれか１つであるか若しくは配列番号１のタンパク質コードする、本発明の核酸、又はそれらのバリアント若しくは断片を含む。
本発明はまた、アポミクティック雑種種子を生産する方法を提供し、以下のステップ：
ａ）有性生殖する第１の植物を第２の植物の花粉と他家受精させて、Ｆ１雑種種子を生産するステップと；
ｂ）任意選択で、アポミクティック表現型を含む種子を前記Ｆ１種子から選別するステップと
を含み、
ここで、前記第１の植物及び／又は第２の植物は、アポマイオシスが可能であり、前記第２の植物は本発明の核酸を含み、好ましくは、前記選別ステップは、遺伝子型決定によって行われる。好ましくは、前記第２の植物は、配列番号２～５のうちのいずれか１つであるか若しくは配列番号１のタンパク質コードする、本発明の核酸、又はそれらのバリアント若しくは断片を含む。
【0107】
本発明の核酸は、キメラ遺伝子、遺伝子構築物又は核酸ベクターに含まれてもよい。本発明の一実施形態では、本発明の核酸を使用して、核酸の宿主細胞への移入及び宿主細胞において前記核酸によってコードされる機能的（好ましくは、単為生殖を誘導可能である）タンパク質の産生のために、この核酸を含むキメラ遺伝子、及び／又は、ベクターを、作製してもよい。植物細胞におけるかかるタンパク質（又はタンパク質断片若しくはバリアント）の産生向けのベクターは、本明細書において、すなわち「発現ベクター」と呼ばれる。宿主細胞は好ましくは植物細胞である。
【0108】
宿主細胞のゲノムへのタンパク質をコードするヌクレオチド配列の、任意選択で一過性であるが好ましくは安定な導入向けのキメラ遺伝子、構築物及び／又はベクターの構築は、当技術分野で一般に知られている。単為生殖を誘導する及び／又は単為生殖における機能性を改善するためのキメラ遺伝子を作り出すために、配列番号１、６若しくは１１のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又はその機能的バリアント及び／若しくは機能的断片を、標準分子生物学的技法を使用して、宿主細胞での発現に適したプロモーター配列に、作動可能に連結してもよい。プロモーター配列は、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列をプロモーター配列の下流にベクターへと単に挿入することができるように、ベクター中にすでに存在させてもよい。次いで、ベクターを使用して宿主細胞を形質転換することができ、本発明の核酸及び／又はキメラ遺伝子を核ゲノムに又は色素体、ミトコンドリア若しくは葉緑体のゲノムへと挿入してもよく、適切なプロモーターを使用して宿主細胞で発現してもよい（例えば、Ｍｃ Ｂｒｉｄｅら、１９９５；米国特許第５，６９３，５０７号）。一実施形態では、本発明の核酸及び／又はキメラ遺伝子は、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に、任意選択でこれに続いて、３’非翻訳ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、植物細胞又は微生物細胞（例えば、細菌）における発現に適したプロモーターを含むことができる。コード配列の前には、任意選択で５’ＵＴＲ配列がある。プロモーター、３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲは、例えば、天然の単為生殖遺伝子由来であってもよく、代替的に他の供給源由来であってもよい。
【0109】
本明細書で教示の単為生殖を誘導することが可能であるタンパク質をコードする、本明細書で教示の核酸を、単一植物細胞の核ゲノムへと安定して挿入することができ、そのように形質転換された植物細胞を使用して、ある特定の時間にある特定の細胞に前記タンパク質が存在することにより、変化した表現型を有する形質転換された植物を作出することができる。非限定的な例では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）において、本明細書で教示の単為生殖において機能的なタンパク質をコードする、本明細書で教示の核酸を含むＴ－ＤＮＡベクターを使用して、植物細胞を形質転換することができ、その後、形質転換された植物は、例えば、欧州特許第０１１６７１８号、欧州特許出願公開第０２７０８２２号、ＰＣＴ公開国際公開第８４／０２９１３号及び公開欧州特許出願第０２４２２４６号に並びにＧｏｕｌｄら（１９９１）に記載の手順を使用して、形質転換された植物細胞から再生することができる。アグロバクテリウム媒介植物形質転換用のＴ－ＤＮＡベクターの構築は当技術分野でよく知られている。Ｔ－ＤＮＡベクターは、欧州特許第０１２０５６１号及び欧州特許第０１２０５１５号に記載のバイナリーベクター、又は欧州特許第０１１６７１８号に記載のように、相同組換えによってアグロバクテリウムＴｉプラスミドへと統合することができるコインテグレートベクター、のいずれかにしてもよい。レタス形質転換プロトコルが、例えば、Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅら（１９８７）及びＣｈｕｐｅａｕら（１９８９）に記載されている。
【0110】
好ましいＴ－ＤＮＡベクターは、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する；例えば、プロモーターは、Ｔ－ＤＮＡ境界配列の間、配列番号３のヌクレオチド配列又はそれらのバリアント若しくは機能的断片に作動可能に連結されているか、又は右側境界配列の左方に少なくとも位置している。好ましくは、前記プロモーターは、核酸インサート、好ましくは二本鎖ＤＮＡインサートを含むプロモーターであり、ここで、前記インサートは、５０～２０００ｂｐの間、１００～１９００ｂｐの間、２００～１８００ｂｐの間、３００～１７００ｂｐの間、４００～１６００ｂｐの間、５００～１５００ｂｐの間、６００～１４００ｂｐの間、１０００～１４００の間、１２００～１４００の間、又は１３００～１４００ｂｐの間の長さを有する。さらにより好ましくは、前記インサートは約１３００ｂｐの長さを有する。好ましくは、インサートは、本明細書で定義の単為生殖表現型に関連しており、任意選択で単為生殖表現型において機能的である。好ましくは、前記インサートの３’末端とＰＡＲタンパク質をコードする配列の開始コドンとの間の距離が、５０～２００ｂｐの間、好ましくは約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ｂｐ、最も好ましくは約１０２ｂｐ、であるように、好ましくは、前記インサートは、ＰＡＲタンパク質をコードする配列のすぐ上流（３’）に局在するプロモーター配列内に局在する。好ましくは、前記インサートは、インサートの３’末端ヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド１７９８の及び／又は配列番号５のヌクレオチド１７９８の位置に相同である位置にあるように局在する。好ましくは、前記インサートは、オープンリーディングフレームがない。さらにより好ましくは、前記インサートは、ミニチュア逆方向反復転位因子（ＭＩＴＥ）又はＭＩＴＥ様配列であり、ここで、前記ＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、オープンリーディングフレームがない内部配列を含有しており、内部配列は、小直列反復配列によって次いで隣接されている末端逆方向反復配列（ＴＩＲ）が隣接する（標的部位の重複）、ことを特徴とする、非自律的エレメントである。ＭＩＴＥ、ＴＩＲ、及び配列の詳細については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｏら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１７年６月１日；７（１）：２６３４、を参照されたい。前記インサート、好ましくは前記ＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、配列番号６０と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ超の同一性を有することができる。好ましくは、前記インサートは、本明細書で定義の単為生殖表現型に関連しており、任意選択で単為生殖表現型において機能的である。さらに好ましい実施形態では、Ｔ－ＤＮＡベクターは、調節配列、好ましくはプロモーター配列を含むか又はそれらからなり、上に本明細書で定義の位置に前記インサートを包含する。好ましくは、Ｔ－ＤＮＡベクターは、前記プロモーター配列に作動可能に連結された、本明細書で定義のＰＡＲタンパク質をコードする配列を含むか又はそれらからなり、ここで、好ましくは、前記プロモーター配列は、ＰＡＲタンパク質をコードする配列の直接上流に局在する。任意選択で、前記Ｔ－ＤＮＡベクターは、１つ又は複数のさらなる転写調節配列を含むことができる。
【0111】
境界配列は、Ｇｉｅｌｅｎら（１９８４）に記載されている。もちろん、他のタイプのベクターを使用して、直接遺伝子導入（例えば、欧州特許出願公開第０２２３２４７号に記載の）、花粉媒介形質転換（例えば、欧州特許第０２７０３５６号及び国際公開第８５／０１８５６号に記載の）、例えば米国特許第４，６８４，６１１号に記載のプロトプラスト形質転換、植物ＲＮＡウイルス媒介形質転換（例えば、欧州特許出願公開第００６７５５３号及び米国特許第４，４０７，９５６号に記載の）、リポソーム媒介形質転換（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号に記載の）、及びその他の方法などの手順を使用して、植物細胞を形質転換することができる。
【0112】
さらなる実施形態では、本発明の核酸は、体細胞ハイブリダイゼーションによって導入してもよい。体細胞ハイブリダイゼーションは、プロトプラスト融合によって行ってもよい（例えばＨｏｌｍｅｓ、２０１８を参照されたい）。
【0113】
本発明の核酸はまた、例をあげると、ゲノムの適当な部位に二本鎖切断を導入するための１つ又は複数の特定のエンドヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体などの）とゲノムに統合するための本発明の核酸を含むドナー構築物とを使用して、ゲノムに統合することができる。当業者であれば、統合に適した二本鎖切断及びドナー構築物を導入するためのかかるＣＲＩＳＰＲ－エンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体を設計する方法を知っている（レビューについては、Ｂｏｒｔｅｓｉ及びＦｉｓｃｈｅｒ、２０１５を参照されたい）。
【0114】
代替的に、植物を、内因性ヌクレオチド配列を変更することによって形質転換してもよく、それにより、例をあげると、例えばランダム又は標的突然変異誘発によって、植物に含まれる１つ又は複数のｐａｒ対立遺伝子を１つ又は複数のＰａｒ対立遺伝子に変換する。前記突然変異誘発は、コード配列の突然変異誘発を含むことができるが、プロモーター配列、５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲなどの調節配列の突然変異誘発も含むことができる。ｐａｒ対立遺伝子の前記内因性５’ＵＴＲプロモーターヌクレオチド配列は、上に本明細書で定義のインサートを、好ましくは上に本明細書で定義の位置に含むように、改変してもよい。
【0115】
同様に、形質転換細胞からの形質転換植物の選別及び再生は、当技術分野でよく知られている。明らかに、様々な種に対して、単一種の様々な品種又は栽培品種に対してさえ、高頻度で形質転換体を再生するように特異的にプロトコルは構成されている。本発明はまた、単為生殖を示し、本発明の核酸及び／又はタンパク質を含む形質転換植物の後代も包含する。
【0116】
核ゲノムの形質転換に加えて、色素体ゲノム、好ましくは葉緑体ゲノムの形質転換も本発明に含まれる。色素体ゲノムの形質転換の一利点とは、導入遺伝子（複数可）の拡散のリスクを低減し得ることである。色素体ゲノムの形質転換は、当技術分野で知られているように実施することができ、例えば、Ｓｉｄｏｒｏｖら（１９９９）又はＬｕｔｚら（２００４）を参照されたい。
【0117】
結果として得られる形質転換植物は、従来の植物育種スキームにおいて使用して、導入遺伝子を含有するより多くの形質転換植物を作出することができる。シングルコピー形質転換体は、例えばサザンブロット解析又はＰＣＲベースの方法又はインベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）（登録商標）テクノロジーアッセイ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、選別することができる。形質転換細胞及び植物は、本発明の核酸若しくはタンパク質及び／又はキメラ遺伝子の存在によって、非形質転換のものと容易に区別することができる。導入遺伝子の挿入部位に隣接する植物ＤＮＡの配列も配列決定することができ、それにより、ルーチン使用向けに「イベント固有の」検出方法を開発することができる。例えば、統合された配列及び隣接（ゲノム）配列に基づくエリートイベント検出キット（ＰＣＲ検出キットなどの）について記載する、例えば国際公開第０１４１５５８号を参照されたい。
【0118】
挿入されたコード配列（複数可）が、植物細胞における発現を誘導することができるプロモーターの下流（すなわち３’）にあるとともに、その制御下にあるように、本発明の核酸を植物細胞ゲノムに挿入してもよい。このようなことは、そういったエレメントを含むキメラ遺伝子を、植物細胞ゲノム、特に核又は色素体（例えば葉緑体）のゲノムに挿入することによって行われるのが好ましい。
【0119】
配列番号３に作動可能に連結することができるプロモーター、又はそれらのバリアント若しくは断片は、例えば構成的活性型のプロモーターであってもよく、例としてあげるのなら以下である：各分離株ＣＭ１８４１（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９８１）、ＣａｂｂＢ－２（Ｆｒａｎｃｋら、１９８０）及びＣａｂｂＢ－ＪＩ（Ｈｕｌｌ及びＨｏｗｅｌｌ、１９８７）のカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の強力な構成的３５Ｓプロモーター又は増強された３５Ｓプロモーター（「３５Ｓプロモーター」）；Ｏｄｅｌｌら（１９８５）によって又は米国特許第５，１６４，３１６号に記載の３５Ｓプロモーター、ユビキチンファミリー由来のプロモーター（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９２；欧州特許第０３４２９２６号のトウモロコシユビキチンプロモーター；またＣｏｒｎｅｊｏら １９９３も参照されたい）、ｇｏｓ２プロモーター（ｄｅ Ｐａｔｅｒら、１９９２）、ｅｍｕプロモーター（Ｌａｓｔら、１９９０）、Ａｎら（１９９６）によって記載のプロモーターなどのシロイヌナズナ属アクチンプロモーター、Ｚｈａｎｇら（１９９１）によって記載のプロモーター及び米国特許第５，６４１，８７６号に記載のプロモーター又は国際公開第０７００６７号に記載のイネアクチン２プロモーターなどのイネアクチンプロモーター；キャッサバ葉脈モザイクウイルスのプロモーター（国際公開第９７／４８８１９号、Ｖｅｒｄａｇｕｅｒら １９９８）、地下クローバー矮化（Ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ Ｃｌｏｖｅｒ Ｓｔｕｎｔ）ウイルス由来のｐＰＬＥＸシリーズのプロモーター（国際公開第９６／０６９３２号、特にＳ７プロモーター）、アルコール脱水素酵素プロモーター、例えば、ｐＡｄｈ１Ｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ０４０４９、Ｘ００５８１）、並びにＴ－ＤＮＡのそれぞれ１’及び２’遺伝子の発現を駆動するＴＲ１’プロモーター及びＴＲ２’プロモーター（それぞれ「ＴＲ１’プロモーター」及び「ＴＲ２’プロモーター」）（Ｖｅｌｔｅｎら、１９８４）、米国特許第６，０５１，７５３号及びＥＰ４２６６４１に記載のゴマノハグサモザイクウイルス（Ｆｉｇｗｏｒｔ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ヒストン遺伝子プロモーター、例えばシロイヌナズナ属由来のＰｈ４ａ７４８プロモーター（ＰＭＢ ８：１７９～１９１）、又はその他。
【0120】
代替的に、構成的ではないが、むしろ植物の１つ若しくは複数の組織又は器官に特異的である（発生的に調節されたプロモーターを含めて、組織優先の／組織特異的な）プロモーター、例えば卵細胞特異的プロモーターを利用することができ、それにより、本発明のタンパク質は、特異的な組織（複数可）又は器官（複数可）の細胞中のみで又は優先的に、及び／或いはある特定の発生段階過程のみで、発現される。
【0121】
本発明のタンパク質の構成的生産は、植物の適応度に高いコストがかかる場合があるので、一実施形態では、その活性が誘導性であるプロモーターを使用することが好ましい。誘導性プロモーターの例は、創傷誘導性プロモーターであり、例えば、創傷により誘導される（例えば、昆虫又は身体創傷によって引き起こされる）Ｃｏｒｄｅｒａら（１９９４）によって記載のＭＰＩプロモーター、又はＣＯＭＰＴＩＩプロモーター（国際公開第００５６８９７号）又は米国特許第６，０３１，１５１号に記載のＲＰ１プロモーターである。或いは、プロモーターは、Ａｏｙａｍａ及びＣｈｕａ（１９９７）によって及び米国特許第６，０６３，９８５号に記載のデキサメタゾンなどの化学物質によって、又はテトラサイクリン（ＴＯＰＦＲＥＥ若しくはＴＯＰ１０プロモーター、Ｇａｔｚ、１９９７及びＬｏｖｅら、２０００を参照されたい）によって誘導可能であってよい。
【0122】
「誘導性」という言葉は、必ずしも、誘導因子刺激の非存在下で、プロモーターが完全に不活性であることを必要としない。このことが植物の深刻な収量又は品質ペナルティをもたらさない限り、低レベルの非特異的活性が存在してもよい。したがって、誘導性とは、プロモーターの活性の増大を好ましくは指し、誘導因子との接触に続いて本発明のタンパク質をコードする下流のコード領域の転写の増大をもたらす。
【0123】
一実施形態では、天然の単為生殖遺伝子のプロモーターが使用される。例えば、タンポポ属Ｐａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子のプロモーターを、単離し、本発明によるタンパク質をコードするコード領域に作動可能に連結してもよい。一実施形態では、前記プロモーター（上流転写調節領域、例えば、翻訳開始コドン及び／又は転写開始コドンの上流、約２０００ｂｐ以内）は、ＴＡＩＬ－ＰＣＲ（Ｌｉｕら、１９９５；Ｌｉｕら、２００５）、リンカー－ＰＣＲ、又は逆ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）などの既知の方法を使用して、アポミクティック植物及び／又は他の植物から単離することができる。
【0124】
一実施形態では、天然の単為生殖遺伝子のプロモーター、又はそれに由来するプロモーターが使用される。例えば、配列番号２に由来するプロモーター、又はそのバリアント若しくは断片を使用してもよい。好ましくは、前記プロモーターは、核酸インサート、好ましくは二本鎖ＤＮＡインサートを含むプロモーターであり、ここで、前記インサートは、５０～２０００ｂｐの間、１００～１９００ｂｐの間、２００～１８００ｂｐの間、３００～１７００ｂｐの間、４００～１６００ｂｐの間、５００～１５００ｂｐの間、６００～１４００ｂｐの間、１０００～１４００の間、１２００～１４００の間、又は１３００～１４００ｂｐの間の長さを有する。さらにより好ましくは、前記インサートは約１３００ｂｐの長さを有する。好ましくは、インサートは、本明細書で定義の単為生殖表現型に関連しており、任意選択で単為生殖表現型において機能的である。好ましくは、前記インサートの３’末端とＰＡＲタンパク質をコードする配列の開始コドンとの間の距離が、５０～２００ｂｐの間、好ましくは約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００ｂｐ、最も好ましくは約１０２ｂｐ、であるように、好ましくは、前記インサートは、ＰＡＲタンパク質をコードする配列のすぐ上流（３’）に局在するプロモーター配列内に局在する。好ましくは、前記インサートは、インサートの３’末端ヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド１７９８の及び／又は配列番号５のヌクレオチド１７９８の位置に相同である位置にあるように局在する。好ましくは、前記インサートは、オープンリーディングフレームがない。さらにより好ましくは、前記インサートは、ミニチュア逆方向反復転位因子（ＭＩＴＥ）又はＭＩＴＥ様配列であり、ここで、前記ＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、オープンリーディングフレームがない内部配列を含有しており、内部配列は、小直列反復配列によって次いで隣接されている末端逆方向反復配列（ＴＩＲ）が隣接する（標的部位の重複）、ことを特徴とする、非自律的エレメントである。ＭＩＴＥ、ＴＩＲ、及び配列の詳細については、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｏら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１７年６月１日；７（１）：２６３４、を参照されたい。前記インサート、好ましくは前記ＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、配列番号６０と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ超の同一性を有することができる。好ましくは、前記インサートは、本明細書で定義の単為生殖表現型に関連しており、任意選択で単為生殖表現型において機能的である。プロモーターは、配列番号２のヌクレオチド配列を有することができる。また、本明細書に記述の配列よりも長い配列も使用してもよい。コード領域の翻訳開始コドンの約２０００ｂｐ上流までの領域は、転写調節エレメント（すなわちプロモーター）を含むことができる。したがって、一実施形態では、本発明のタンパク質をコードする配列の翻訳開始コドンの２０００ｂｐ、１５００ｂｐ、１０００ｂｐ、８００ｂｐ、５００ｂｐ、３００ｂｐ又はそれ未満の上流でのヌクレオチド配列を単離し、プロモーター活性を試験してもよく、機能的である場合、上記配列を、本明細書で教示の本発明のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結してもよい。全配列及びこれらの断片のプロモーター活性は、例えば欠失解析によって試験することができ、それにより、５’部分及び／又は３’部分を欠失させ、既知の方法（例えば、プロモーター又は断片をレポーター遺伝子に作動可能に連結する）を使用してプロモーター活性を試験する。
【0125】
本明細書で教示のコード配列が適切な３’末端非翻訳領域（「３’末端」又は３’ＵＴＲ）の上流（すなわち５’）にあるように、上記コード配列を植物ゲノムに挿入することが好ましい。適切な３’末端には、ＣａＭＶ ３５Ｓ遺伝子（「３’３５Ｓ」）、ノパリンシンターゼ遺伝子（「３’ｎｏｓ」）（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、１９８２）、オクトピンシンターゼ遺伝子（「３’ｏｃｓ」）（Ｇｉｅｌｅｎら、１９８４）及びＴ－ＤＮＡ遺伝子７（「３’遺伝子７」）（Ｖｅｌｔｅｎ及びＳｃｈｅｌｌ、１９８５）の３’末端が含まれ、これらは形質転換植物細胞等において３’－非翻訳ＤＮＡ配列として作用する。一実施形態では、天然の単為生殖遺伝子の３’ＵＴＲ、又はそれに由来する３’ＵＴＲが使用される。例えば、配列番号４に由来する任意の３’ＵＴＲ、又はそれらのバリアント若しくは断片を使用してもよい。３’ＵＴＲは、配列番号４のヌクレオチド配列を有していてもよい。
【0126】
一実施形態では、配列番号２のヌクレオチド配列、又は本明細書のバリアント及び／若しくは断片を有するプロモーターは、本発明のタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結してもよく、好ましくは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書で教示の単為生殖を誘導することが可能であり、より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列、又はそのバリアント及び／若しくは断片を有する。好ましくは、前記プロモーター及びコード配列は、配列番号４の３’ＵＴＲ、又はそのバリアント及び／若しくは断片にさらに作動可能に連結されている。
【0127】
アグロバクテリウムへのＴ－ＤＮＡベクターの導入は、エレクトロポレーション又は三系交雑などの既知の方法を使用して実行することができる。
【0128】
本明細書で教示のコード配列は、ハイブリッド遺伝子配列として植物ゲノムに任意選択で挿入することができ、これにより、コード配列が、選択マーカー又はスコア可能マーカーをコードする遺伝子（米国特許第５，２５４，７９９号；Ｖａｅｃｋら、１９８７）に、例えば、カナマイシン耐性をコードするｎｅｏ（又はｎｐｔＩＩ）遺伝子（欧州特許第０２４２２３６号）などにインフレームで連結され、その結果、植物は、容易に検出可能である融合タンパク質を発現する。
【0129】
本発明のタンパク質をコードする配列の全部又は一部を使用して、例えば細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）等）などの微生物、真菌、若しくは藻類若しくは昆虫を形質転換することも、又は、組換えウイルスを作製することもできる。このことは、タンパク質、好ましくは単離されたタンパク質の生産及びその後の精製に特に適している。適切なクローニングビヒクルに組み込まれた、本明細書で教示のコード配列の全部又は一部による細菌の形質転換は、従来の方法で、好ましくは、Ｍａｉｌｌｏｎら（１９８９）及び国際公開第９０／０６９９９号に記載の従来のエレクトロポレーション技法を使用して、実施することができる。原核宿主細胞における発現に関して、核酸配列のコドン使用頻度はそれに応じて最適化してもよい（本明細書の植物について記載のように）。イントロン配列を除去する必要があり、最適な発現のための他の適合を既知の通りに為してもよい。本発明の核酸を含む及び／又はタンパク質を発現するかかる原核宿主細胞は、本発明によって包含される。かかる宿主細胞を使用して、本発明のタンパク質及び／又は核酸を産生させてもよい。
【0130】
本発明の核酸のＤＮＡ配列は、翻訳上中立的な方法でさらに変化させて、遺伝子部分に存在するおそらく阻害性であるＤＮＡ配列を、及び／又はコドン使用頻度に変化を導入することによって、例えばコドン使用頻度を植物にて、例えば宿主植物として本明細書に記載の、好ましくは特定の関連する植物属にて、最も好まれるコドン使用頻度に適合させることによって、改変することができる。
【0131】
本発明の一実施形態によれば、本発明のタンパク質は、色素体、好ましくは葉緑体、ミトコンドリアなどの細胞内小器官を標的とするか又は細胞から分泌され、その結果、タンパク質の安定性及び／又は発現を潜在的に最適化する。同様に、タンパク質は液胞を標的にしてもよい。この目的のために、本発明の一実施形態では、本発明のキメラ遺伝子は、本発明のタンパク質をコードする領域に連結された、シグナル又は標的ペプチドをコードするコード領域を含む。本発明のタンパク質に含まれる特に好ましいペプチドは、特に遺伝子産物が色素体に標的化される植物遺伝子からの重複トランジットペプチド領域を標的とする葉緑体又は他の色素体向けのトランジットペプチド、Ｃａｐｅｌｌａｄｅｓら（米国特許第５，６３５，６１８号）の最適化されたトランジットペプチド、ホウレンソウからのフェレドキシン－ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼのトランジットペプチド（Ｏｅｌｍｕｌｌｅｒら、１９９３）、Ｗｏｎｇら（１９９２，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２０，８１～９３）に記載のトランジットペプチド及び公開されたＰＣＴ特許出願国際公開第００／２６３７１号の標的化ペプチド、である。また、好ましいものは、ポテトプロテイナーゼインヒビターＩＩの分泌シグナル（Ｋｅｉｌら、１９８６）、イネのアルファ－アミラーゼ３遺伝子の分泌シグナル（Ｓｕｔｌｉｆｆら、１９９１）及びタバコＰＲ１タンパク質の分泌シグナル（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら、１９８６）などの、細胞外でかかるペプチドに連結したタンパク質の分泌をシグナル伝達するペプチドである。本発明による特に有用なシグナルペプチドには、葉緑体トランジットペプチド（例えば、Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｒｏｅｃｋら、１９８５）、又は葉緑体へのタンパク質の輸送を引き起こす、米国特許第５，５１０，４７１号及び米国特許第５，６３５，６１８号の最適化された葉緑体トランジットペプチド、分泌シグナルペプチド、又は標的である他の色素体、ミトコンドリア、ＥＲ、若しくは別のオルガネラにタンパク質を向かはせるペプチド、が含まれる。細胞内オルガネラへの標的化のための又は植物細胞外に若しくは細胞壁への分泌のためのシグナル配列は、天然に標的化又は分泌されたタンパク質に、好ましくは、Ｋｌｏｓｇｅｎら（１９８９）、Ｋｌｏｓｇｅｎ及びＷｅｉｌ（１９９１）、Ｎｅｕｈａｕｓ ＆ Ｒｏｇｅｒｓ（１９９８）、Ｂｉｈら（１９９９）、Ｍｏｒｒｉｓら（１９９９）、Ｈｅｓｓｅら（１９８９）、Ｔａｖｌａｄｏｒａｋｉら（１９９８）、Ｔｅｒａｓｈｉｍａら（１９９９）、Ｐａｒｋら（１９９７）、Ｓｈｃｈｅｒｂａｎら（１９９５）によって記載のものに見いだされる。
【0132】
一実施形態では、本明細書で教示の本発明のタンパク質は、任意選択で様々なプロモーターの制御下で、単一宿主での単為生殖、アポマイオシス又はアポミクシスを、制御する、好ましくは増強又は誘導する他のタンパク質と、共発現する。かかる他の遺伝子は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／０３９４５２Ａ１号に記載の、複相胞子生殖などのアポマイオシスを付与するための遺伝子であってもよい。
【0133】
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、アポマイオシスを付与するための遺伝子（例えば、複相胞子生殖用の遺伝子）などの興味深い他の遺伝子を好ましくは含む生殖質に遺伝子移入される。交配と選抜を介して、興味深いいくつかの遺伝子をスタッキングすることができる雑種が作出される。
【0134】
共発現宿主植物は、本発明のタンパク質をすでに発現している植物を形質転換することによって、又は本発明の様々な核酸で形質転換した植物を交配することによって容易に得られる。様々なタンパク質を同じ植物で発現させることができるか、又はそれぞれを単一植物で発現させ、次いで、単一植物どうしを互いに交配することによって同じ植物で組み合わせることができることが理解される。例えば、雑種種子生産では、各親植物は、共発現することが望まれるタンパク質のそれぞれを発現することができる。親植物を交配して雑種を作出すると、両方のタンパク質が雑種植物において組み合わされる。両方の遺伝子を含み、及び／又は両方のタンパク質を発現するかかる雑種又はその子孫は、本発明によって包含される。
【0135】
好ましくは、選抜目的向けとともに雑草防除オプション向けにも、本発明のトランスジェニック植物はまた、除草剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡで、形質転換されるが、例をあげるなら、広域スペクトル除草剤、例えば、有効成分としてグルホシネートアンモニウム（例えば、リバティ（Ｌｉｂｅｒｔｙ）（登録商標）又はＢＡＳＴＡ；ＰＡＴ又はｂａｒ遺伝子によって耐性が付与される；欧州特許第０２４２２３６号及び欧州特許第０２４２２４６号を参照されたい）又はグリホサート（例えば、ラウンドアップ（ＲｏｕｎｄＵｐ）（登録商標）；ＥＰＳＰＳ遺伝子によって耐性が付与される；例えば、欧州特許第０５０８９０９号及び欧州特許第０５０７６９８号を参照されたい）、をベースとする除草剤である。選択マーカーとして除草剤耐性遺伝子（又は所望の表現型を付与する他の遺伝子）を使用することで、抗生物質耐性遺伝子の導入を回避することができるという利点をさらに有する。
【0136】
代替的に又は加えて、抗生物質耐性遺伝子などの他の選択マーカー遺伝子を使用してもよい。形質転換宿主植物では抗生物質耐性遺伝子を保持することは一般に認められていないので、これらの遺伝子は、形質転換体の選別に続いて再び除去することができる。導入遺伝子の除去については様々な技術が存在する。除去を行う一方法とは、導入遺伝子を、ｌｏｘ部位で隣接させ、選別に続いて、形質転換植物をＣＲＥリコンビナーゼ発現植物と交配することによるものである（例えば、ＥＰ５０６７６３Ｂ１を参照されたい）。部位特異的組換えは、マーカー遺伝子の切除をもたらす。別の部位特異的組換え系は、ＥＰ６８６１９１及び米国特許第５，５２７，６９５号に記載のＦＬＰ／ＦＲＴ系である。ＣＲＥ／ＬＯＸやＦＬＰ／ＦＲＴなどの部位特異的組換え系も遺伝子スタッキングの目的で使用することができる。さらに、一成分切除系が記載されており、例えば、国際公開第９７／３７０１２号又は国際公開第９５／００５５５号を参照されたい。
【0137】
好ましくは、本発明の核酸は、単為生殖表現型が増強された、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子等、及びそれらの任意の派生体／後代を作り出すために使用される。単為生殖が増強されたトランスジェニック植物は、本明細書に記載のように、適切なプロモーターの制御下で、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を好ましくはコードする本発明の核酸又はそのバリアント及び／若しくは断片で植物宿主細胞を形質転換することによって、及び前記細胞からトランスジェニック植物を再生することによって、作り出すことができる。好ましくは、本発明のトランスジェニック植物は、非形質転換ベクター又は空ベクターの対照と比較して、単為生殖の増強を含む。その結果、例えば、単為生殖の増強を含むトランスジェニックレタス植物が提供される。こうして、本発明によるタンパク質を発現する形質転換植物は、非形質転換又は空ベクター形質転換の対照と比較して、単為生殖の著明な増大を示す場合、単為生殖の増強を示す。適切な時間及び／又は位置で単為生殖を誘導することが可能な本発明のタンパク質の適切な量を発現させることによって、単為生殖表現型の増強を微調整することができる。最も適当なプロモーターを決定することによって、及び／又は所望の発現レベルを示すトランスジェニック「イベント」を選別することによって、かかる微調整を行ってもよい。
【0138】
本発明のタンパク質の所望のレベルを発現する、及び／又は所望、又は所望のレベルの本発明の核酸を含む形質転換体、雑種又は近交系は、例えば、コピー数（サザンブロット分析）、ｍＲＮＡ転写レベル（例えば、本発明のタンパク質を増幅可能なプライマー対若しくは隣接プライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲ）を解析することによって、又は種々の組織中の単位生殖タンパク質の存在及びレベルを解析する（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；ＥＬＩＳＡアッセイ等）ことによって、選別される。例をあげると調節の理由から、単一コピーの形質転換体を選別してもよいが、導入遺伝子の挿入部位に隣接する配列を解析して、好ましくは配列決定して、「イベント」を特徴づける。本発明のタンパク質の高度又は中度の発現をもたらすトランスジェニックイベントを、安定な導入遺伝子を有する高性能エリートイベントが得られるまで、さらなる開発向けに選別する。
【0139】
本発明のタンパク質を発現する、及び／又は本発明の核酸を含む形質転換体はまた、他の導入遺伝子、例えば、耐病性を付与する又は他の生物的及び／又は非生物的ストレスに対する耐性を付与する、又は複相胞子生殖を付与する他の導入遺伝子を含むことができる。「スタッキングされた」導入遺伝子を有するかかる植物を得るために、他の導入遺伝子を前記形質転換体に導入してもよく、又は前記形質転換体を１つ又は複数の他の遺伝子で引き続き形質転換してもよく、又は代替的にいくつかのキメラ遺伝子を使用して植物系統又は品種を形質転換してもよく、いずれかでよい。例えば、いくつかの導入遺伝子が、単一のベクター上に存在してもよく、又は共形質転換される様々なベクター上に存在してもよい。
【0140】
一実施形態では、以下の遺伝子が本発明の核酸と組み合わされる：既知の病害抵抗性遺伝子、特に壊死病原体に対して耐性の増強を付与する遺伝子、ウイルス耐性遺伝子、昆虫抵抗性遺伝子、非生物的ストレス耐性遺伝子（例えば耐乾性、耐塩性、耐熱性又は耐寒性等）、除草剤耐性遺伝子等。したがって、スタッキングされた形質転換体は、病原体耐性、昆虫耐性、線虫耐性、塩分、低温ストレス、熱ストレス、水ストレス等に対して、さらに広い生物的及び／又は非生物的ストレス耐性を有することができる。また、サイレンシングアプローチを、単一植物での発現アプローチと組み合わせてもよく、例をあげると、Ｐａｒ対立遺伝子のサイレンシングは、ｐａｒ対立遺伝子の発現と組み合わせてもよく、又はその逆も同様である。
任意選択で、本発明の核酸を使用して、例をあげると、植物又は植物細胞における１つ又は複数のＰａｒ対立遺伝子上の単為生殖遺伝子の発現をサイレンシング、ノックダウン、又は低減することによって、単為生殖を抑制してもよい。これは、前記植物又は植物細胞に存在する、Ｐａｒ対立遺伝子（複数可）のコード配列又は１つ又は複数の調節配列（例えば、プロモーター配列）を改変することによって、又はＰａｒ対立遺伝子（複数可）の転写物を標的とするＲＮＡｉを導入することによって、行ってもよい。したがって、本発明はまた、植物又は植物細胞における単為生殖を低減又は消失する方法を提供し、以下のステップ：
ａ）１つ又は複数の植物細胞において、本明細書で定義の、単為生殖を誘導することが可能な及び／又は単為生殖において機能的な核酸の発現を低減又は消失するステップと；
ｂ）前記発現が低減又は消失している植物細胞を選別するステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む。
任意選択で、本発明の核酸を使用して、例をあげると、植物又は植物細胞における１つ又は複数のＰａｒ対立遺伝子上の単為生殖遺伝子の発現をサイレンシング、ノックダウン、又は低減することによって、単為生殖を抑制してもよい。これは、前記植物又は植物細胞に存在する、Ｐａｒ対立遺伝子（複数可）のコード配列又は１つ又は複数の調節配列（例えば、プロモーター配列）を改変することによって、又はＰａｒ対立遺伝子（複数可）の転写物を標的とするＲＮＡｉを導入することによって、行ってもよい。したがって、本発明はまた、植物又は植物細胞における単為生殖を低減又は消失する方法を提供し、以下のステップ：
ａ）１つ又は複数の植物細胞において、本明細書で定義の、単為生殖を誘導することが可能な及び／又は単為生殖において機能的な核酸の発現を低減又は消失するステップと；
ｂ）前記発現が低減又は消失している植物細胞を選別するステップと；
ｃ）前記植物細胞から植物を再生するステップと
を含む。
【0141】
前記核酸は好ましくは、配列番号２～５のうちのいずれか１つを含むか又はそれらからなる核酸、並びにそれらのバリアント及び／又は断片、並びに／或いは配列番号１のタンパク質をコードする核酸及び／又はそのバリアント若しくは断片、である。
【0142】
本明細書に記載の形質転換植物のいずれかの全植物、植物部分（例えば、種子、細胞、組織）、及び植物産物（例えば、果実）及び後代は、本明細書に包含される。上記全植物、植物部分及び植物産物及び子孫については、導入遺伝子の存在によって、例えば、全ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した及び単為生殖遺伝子に特異的なＰＣＲプライマーペアを使用したＰＣＲ解析によって、並びに又はそれらに限定されないが、シーケンスをベースとするジェノタイピング（ＳＢＧ）やキージーン（ＫｅｙＧｅｎｅ）（登録商標）ＳＮＰＳｅｌｅｃｔ解析などのゲノム変異解析を使用することによって、同定することができる。また、「イベント固有の」ＰＣＲ診断法を開発することもできるが、この場合、ＰＣＲプライマーは、挿入された導入遺伝子に隣接する植物ＤＮＡをベースとする、米国特許第６，５６３，０２６号を参照されたい。同様に、トランスジェニック植物又はそれに由来する任意の植物、種子、組織又は細胞を同定する、イベント固有のＡＦＬＰフィンガープリント又はＲＦＬＰフィンガープリントを開発してもよい。
【0143】
本発明によるトランスジェニック植物は好ましくは、収量の減少、病害に対する（特に死体栄養性（ｎｅｃｒｏｔｒｏｐｈ）に対する）感受性の増強、又は望ましくない構造変化（矮化、変形）等の望ましくない表現型を示さないこと、並びに、かかる表現型が一次形質転換体に見られる場合、これらを従来の方法によって除去し得ること、が理解される。本明細書に記載のトランスジェニック植物のいずれもが、導入遺伝子に関して、ヘテロ接合型であっても、ホモ接合型であっても、ヘミ接合型であってもよい。
【0144】
本発明はまた、本明細書に詳述の方法によって入手される又は入手可能な、好ましくは本発明のタンパク質、本発明の核酸及び／又は本発明の構築物を含む、植物、種子、植物部分（例えば、植物細胞）及び植物産物に関する。好ましくは前記タンパク質、核酸及び／又は構築物は、本明細書に詳述のように、単為生殖を誘導することが可能及び／又は単為生殖において機能的である。本発明の植物は好ましくは、適切な宿主植物として本明細書に列記の種のものである。かかる方法は、植物から後代への本発明の核酸の遺伝子移入、及び／又は導入遺伝子としての本発明の核酸による植物細胞の形質転換、及び前記植物細胞からの植物のその後の再生を含む。好ましくは、植物、植物部分及び／又は植物産物は、広義のセイヨウタンポポ種のものではないが、本発明の核酸を含み、ここで、前記植物又は植物細胞は好ましくは、適切な宿主植物として本明細書に列記の種のものであり、好ましくは、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）及びキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ（コンポジテ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）））からなる群から選択される科由来である。
【0145】
好ましくは、植物、植物部分及び／又は植物産物は、遺伝子改変によって又は遺伝子移入によって本発明の核酸を含み、ここで、好ましくは、前記核酸は植物、植物部分及び／又は植物産物のゲノムに統合されている。好ましくは、前記植物、植物部分及び／又は植物産物は、単為生殖が可能及び／又は単為生殖において機能的である。さらにより好ましくは前記植物、植物部分及び／又は植物産物は、アポマイオシスがさらに可能である。本発明は、本発明の植物の種子、植物部分若しくは植物産物又は植物細胞を提供する。
【0146】
本発明はまた、本発明の植物に由来する植物部分及び植物産物にも関し、ここで、植物部分及び／又は植物産物は、本明細書で定義の本発明のタンパク質、本明細書で定義の本発明の核酸、及び／又は本明細書で定義の本発明の構築物、を含むが、これらは、植物産物の植物部分が由来する植物におけるかかるタンパク質、核酸又は構築物の存在を評価することを可能にする、本明細書で定義の断片であってもよい。かかる部分及び／又は産物は、種子又は果実及び／又はそれに由来する産物（例えば、糖類又はタンパク質）であってもよい。かかる部分、産物、及び／又はそれに由来する産物は、非増殖性材料であってもよい。
【0147】
いずれもの植物が適切な宿主となり得るが、最も好ましくは、宿主植物種は、単為生殖の増強又は低減から利益を得ると思われる植物種であることが求められる。適切な宿主には、いずれもの植物種が含まれる。特に、栽培品種又はそうでなければ良好な農業特性を有する育種系統が好ましい。当業者であれば、適切な対照植物と一緒に、トランスジェニック植物を作り出すこと及び単為生殖を評価することにより、本明細書で教示の核酸及び／若しくはタンパク質、並びに／又はそれらのバリアント若しくは断片が、単為生殖の必要とされる増大又は低減を宿主植物上へと付与することができるか否かを試験する方法を知っている。
【0148】
適切な宿主植物には、例えば、アブラナ科、ウリ科、マメ科、イネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）、ナス科、キク科（コンポジテ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）及びイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、に属する宿主が含まれる。
【0149】
好ましい実施形態では、宿主植物は、タンポポ属、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、エンゾウ属（Ｐｉｓｕｍ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）属及びモロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）からなる群から選択される植物種であってもよい。
【0150】
好ましい実施形態では、本明細書で教示の植物、植物部分、植物細胞又は種子は、タンポポ属、アキノノゲシ属、エンゾウ属、トウガラシ属、ナス属、キュウリ属、トウモロコシ属、ワタ属、ダイズ属、コムギ属、イネ属、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、キクニガナ属（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、ペンニセツム属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、オオオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、アマ属（Ｌｉｎｕｍ）、アサ属（Ｃａｎａｂｉｓ）、キャッサバ属（Ｃａｓｓａｖａ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、及びモロコシ属からなる群から選択される植物種由来である。
【0151】
適切な宿主植物には、例えば、トウモロコシ／コーン（トウモロコシ属種）、小麦（コムギ属種）、大麦（例えば、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、オートムギ（例えば、アヴィーナ・サティヴァ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ））、ソルガム（モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ））、ライ麦（ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、大豆（ダイズ属種（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｐｐ）、例えばダイズ）、コットン（ワタ属種（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、リクチワタ、Ｇ．バルバデンス（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ））、アブラナ属種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐｐ．）（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、メキャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ）、カブ（Ｂ．ｒａｐａ）等）、ヒマワリ（ヒグルマ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ））、ベニバナ、ヤム、キャッサバ、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、イネ（イネ属種（Ｏｒｙｚａ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えば、オリザ・サティバ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）インディカ栽培品種群又はジャポニカ栽培品種群）、イソマツ（ｆｏｒａｇｅ ｇｒａｓｓｅｓ）、トウジンビエ（ｐｅａｒｌ ｍｉｌｌｅｔ）（ペンニセツム属種（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｓｐｐ．）、例えば、Ｐ．グラウクム（Ｐ．ｇｌａｕｃｕｍ））、樹種（マツ（Ｐｉｎｕｓ）、ポプラ、モミ、オオバコ等）、チャノキ、コーヒーノキ、オイルパーム、ココナッツ、野菜種、例えば、エンドウマメ、ズッキーニ、豆類（例えば、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕ）属種）、トウガラシ、キュウリ、アーティチョーク、アスパラガス、ナス、ブロッコリー、ニンニク、ニラ、レタス、タマネギ、ダイコン、カブ、トマト、ジャガイモ、メキャベツ、ニンジン、カリフラワー、チコリー、セロリ、ホウレンソウ、エンダイブ、ウイキョウ、ビート、果肉を有する果物（ブドウ、モモ、プラム、イチゴ、マンゴー、リンゴ、プラム、サクランボ、アプリコット、バナナ、ブラックベリー、ブルーベリー、シトラス、キウイ、イチジク、レモン、ライム、ネクタリン、ラズベリー、スイカ、オレンジ、グレープフルーツ等）、観賞用種（例えば、バラ、ペチュニア、キク、ユリ、ガーベラ種）、ハーブ類（ミント、パセリ、バジル、タイム等）、木質の樹木（例えば、ヤマナラシ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、コナラ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）の種）、繊維種、例えば、亜麻（アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ））及び大麻（アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ））が含まれる。
【0152】
マーカー支援選別及び１つ又は複数のＰａｒ対立遺伝子の移入又は組合せ
本発明の核酸は、タンポポ属種の及び／又は他の植物種のＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子のマーカー支援選別のため、並びに、目的の植物への／目的の植物における、及び／又はＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子（又はバリアント）が見いだされる植物との種内又は種間雑種を作り出すために使用することができる植物への／このような植物における、異なる又は同一のＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子の移入及び／又はこれらの組合せのための遺伝子マーカーとして使用することができる。
本発明の核酸は、タンポポ属種の及び／又は他の植物種のＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子のマーカー支援選別のため、並びに、目的の植物への／目的の植物における、及び／又はＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子（又はバリアント）が見いだされる植物との種内又は種間雑種を作り出すために使用することができる植物への／このような植物における、異なる又は同一のＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子の移入及び／又はこれらの組合せのための遺伝子マーカーとして使用することができる。
【0153】
これらの配列に基づいて様々な多くのマーカーアッセイを開発することができる。マーカーアッセイの開発には一般に、Ｐａｒ対立遺伝子とｐａｒ対立遺伝子の間の多型の同定を伴い、その結果、多型は、特定の対立遺伝子を「マークする」遺伝子マーカーである。次いで、多型（複数可）がマーカーアッセイで使用される。例えば、本明細書で教示のＰａｒ対立遺伝子の配列は、単為生殖の存在又は増強と相関している。このことは、特定の対立遺伝子を単為生殖又は非単為生殖と相関させるために、本明細書で教示のＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子のヌクレオチド配列（の一部）について単為生殖植物材料及び／又は非単為生殖植物材料をスクリーニングすることによって、例えば行われる。したがって、（非）単為生殖植物材料から得られた試料（例えば、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ試料）中のかかるヌクレオチド配列を検出するＰＣＲプライマー又はプローブを作り出してもよい。配列又はそれらの一部が比較され、単為生殖と相関する多型マーカーが同定される。次いで、Ｐａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子に連結されたＳＮＰマーカーなどの多型マーカーを、単為生殖対立遺伝子の有無について植物材料をスクリーニングするための迅速分子アッセイへと開発することができる。したがって、これらの「遺伝子マーカー」の有無によって、マーカーに連結したＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子の存在が指示され、Ｐａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子の検出を遺伝子マーカーの検出で置き換えることができる。
【0154】
好ましくは、試料（例えば、ＤＮＡ試料）中のＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子、或いは対立遺伝子の組合せの迅速な検出を可能にする、簡単且つ急速マーカーアッセイを使用する。したがって、一実施形態では、試料中のＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子の有無を決定するための、及び／又はこの対立遺伝子のホモ接合性又はヘテロ接合性を決定するための、分子アッセイにおける、本発明の核酸の使用が本明細書に提供される。
かかるアッセイは、以下のステップを例えば含むことができる：
（ａ）単為生殖及び非単為生殖の植物材料及び／又はその核酸試料を用意するステップと；
（ｂ）（ａ）の前記材料中の本発明の核酸の全部又は一部のヌクレオチド配列を決定するステップ。
かかるアッセイは、以下のステップを例えば含むことができる：
（ａ）単為生殖及び非単為生殖の植物材料及び／又はその核酸試料を用意するステップと；
（ｂ）（ａ）の前記材料中の本発明の核酸の全部又は一部のヌクレオチド配列を決定するステップ。
【0155】
一態様では、本発明の核酸、又は関連する若しくは誘導されたＲＮＡ配列（転写物などの）を検出するためのＰＣＲプライマー及び／又はプローブ、分子マーカー並びにキットが提供される。試料から本発明の核酸を増幅するための縮重又は特異的ＰＣＲプライマー対は、当技術分野で知られているように、本明細書で教示のヌクレオチド配列又はそれらのバリアントに基づいて合成することができる（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ及びＤｖｅｋｓｌｅｒ、１９９５；並びにＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、２０００を参照されたい）。例えば、これらの配列（又は相補鎖）の９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８又はそれ超の連続したヌクレオチドの任意のストレッチをプライマー又はプローブとして使用してもよい。
【0156】
同様に、本明細書で教示のＰａｒ対立遺伝子又はｐａｒ対立遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片、又はそれらの相補体を、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。本明細書で提供の検出キットは、Ｐａｒ（対立遺伝子－）特異的プライマー及び／又はＰａｒ（対立遺伝子－）特異的プローブのいずれか、並びに関連プロトコルを備えて、上記プライマー又はプローブを使用し、その結果、試料中の本発明の核酸を検出することができる。かかる検出キットは、例えば、植物が本発明の核酸で形質転換されたか否かを判定するために、又はＰａｒ対立遺伝子の存在及び任意選択で接合性決定について、タンポポの生殖質及び／又は他の植物種の生殖質をスクリーニングするために、使用することができる。
したがって、一実施形態では、植物組織、例えば、タンポポ属組織、又はその核酸試料において、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の有無を検出する方法が提供される。本発明の方法は：
ａ）１つ又は複数の植物からの植物組織試料又はその核酸試料を得るステップ；
ｂ）Ｐａｒ対立遺伝子に連結した１つ又は複数のマーカーの有無について分子マーカーアッセイを使用して核酸試料を解析するステップであって、マーカーアッセイが、単為生殖に関連する本発明の核酸の存在を検出する、解析するステップ、並びに任意選択で
ｃ）さらなる使用のために前記マーカーの１つ又は複数を含む植物を選別するステップ、
を含むことができる。
代替的に又は加えて、本発明の方法は：
ａ）１つ又は複数の植物からの植物組織試料又はその核酸試料を得るステップ；
ｂ）ｐａｒ対立遺伝子に連結した１つ又は複数のマーカーの有無について分子マーカーアッセイを使用して核酸試料を解析するステップであって、マーカーアッセイが、非単為生殖に関連する本発明の核酸の存在を検出する、解析するステップ、並びに任意選択で
ｃ）さらなる使用のために前記マーカーの１つ又は複数を含む植物を選別するステップ、
を含むことができる。
したがって、一実施形態では、植物組織、例えば、タンポポ属組織、又はその核酸試料において、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の有無を検出する方法が提供される。本発明の方法は：
ａ）１つ又は複数の植物からの植物組織試料又はその核酸試料を得るステップ；
ｂ）Ｐａｒ対立遺伝子に連結した１つ又は複数のマーカーの有無について分子マーカーアッセイを使用して核酸試料を解析するステップであって、マーカーアッセイが、単為生殖に関連する本発明の核酸の存在を検出する、解析するステップ、並びに任意選択で
ｃ）さらなる使用のために前記マーカーの１つ又は複数を含む植物を選別するステップ、
を含むことができる。
代替的に又は加えて、本発明の方法は：
ａ）１つ又は複数の植物からの植物組織試料又はその核酸試料を得るステップ；
ｂ）ｐａｒ対立遺伝子に連結した１つ又は複数のマーカーの有無について分子マーカーアッセイを使用して核酸試料を解析するステップであって、マーカーアッセイが、非単為生殖に関連する本発明の核酸の存在を検出する、解析するステップ、並びに任意選択で
ｃ）さらなる使用のために前記マーカーの１つ又は複数を含む植物を選別するステップ、
を含むことができる。
【0157】
好ましくは、これらの方法のいずれかで使用される１つ又は複数の植物は、本明細書でさらに定義される、宿主植物として適切な植物である。
【0158】
単為生殖の適用
本発明の核酸及び／又はタンパク質は、単為生殖を、スクリーニング（例えば、植物又は植物細胞における１つ又は複数の単為生殖遺伝子座）、遺伝子型決定、付与するために、倍数性を増加させるためのアポミクシスを付与するために、及び／又は倍加単数体の作出のために、使用してもよい。好ましくは、前記使用は、植物バイオテクノロジー及び／又は育種内のものである、すなわち、植物又は植物細胞内／上のものである。
本発明の核酸及び／又はタンパク質は、単為生殖を、スクリーニング（例えば、植物又は植物細胞における１つ又は複数の単為生殖遺伝子座）、遺伝子型決定、付与するために、倍数性を増加させるためのアポミクシスを付与するために、及び／又は倍加単数体の作出のために、使用してもよい。好ましくは、前記使用は、植物バイオテクノロジー及び／又は育種内のものである、すなわち、植物又は植物細胞内／上のものである。
【0159】
単為生殖はアポミクシスのエレメントであり、単為生殖の遺伝子をアポマイオシス（例えば複相胞子生殖）の遺伝子との組合せで使用して、アポミクシスを作り出し、その結果好ましくは、本明細書に列記の適用向けにアポミクシスを使用し得る。これらの遺伝子を、形質転換、遺伝子移入によって、又は内因性の適切な遺伝子を改変することによって有性作物に導入し、それによって単為生殖遺伝子をアポメイオティック（ａｐｏｍｅｉｏｔｉｃ）（又は複相胞子生殖型）遺伝子に変換することができる。アポミクシス遺伝子の構造と機能に関する知識を使用して、内因性の有性生殖遺伝子がアポミクシス遺伝子となるように、これらの遺伝子を改変することもできる。好ましい使用とは、有性生殖が新しい遺伝子型を作り出す場合にアポミクシスをスイッチオフに、エリート遺伝子型を増殖させるためにアポミクシスが必要な場合にスイッチオンにすることができるように、アポミクシス遺伝子を誘導性プロモーターの下に置くことである、と思われる。
【0160】
核酸又はその派生物は、アポミクシスの成分として使用することができる。機能性配偶体のアポミクシスには、アポマイオシスと単為生殖の両方が必要である。アポマイオシスは、減数分裂に影響を与える突然変異の組合せによって行うことができ（Ｃｒｉｓｍａｎｉら、２０１３）、大胞子において染色体の減数を生じないこと、すなわち減数分裂ではなく有糸分裂の結果を伴う。後成的な変化を通して配偶体の運命をとる体細胞（Ｇｒｉｍａｎｅｌｌｉ、２０１２）は、非減数配偶子（卵細胞）を生じることができる可能性がある、非減数胞子様細胞ももたらす。別の実施形態では、アポマイオシスは、天然のアポマイオシス遺伝子のトランスジェニック又は非トランスジェニック発現によって行われる。どんな手段を用いても、非減数卵細胞が形成され、単為生殖を誘導することが可能な本発明の核酸の適当な時間的及び空間的発現によって、接合子として振る舞い、受精の非存在下で分裂するように卵細胞を誘導することができる。
【0161】
単為生殖遺伝子は、まったく新しい方法で、例えば、アポミクシスのツールとして直接ではなく、使用し得る。例えば、アポミクシスでは単為生殖とアポマイオシスの両方が単一植物で組み合わされるが、一方、１つの世代でアポマイオシスを使用し且つ次世代で単為生殖を使用すると、アポマイオシスにより倍数性レベルが上昇し単為生殖により倍数性レベルが低下することによって、二倍体で及び倍数体レベルで作物の有性遺伝子プールが、結びつくと思われる。このようなことは非常に有用であり、その理由は、倍数体集団は、より多くの突然変異を許容することができるので、突然変異誘導にとってより良好であり得るからである。倍数体植物はより強壮であるとすることもできる。しかし、二倍体集団は選別にとってより良好であり、二倍体の交配は遺伝的マッピング、ＢＡＣライブラリーの構築等にとってより良好である。倍数体の単為生殖は二倍体と交配することができる単数体を作り出すことができる。二倍体の複相胞子生殖は、倍数体由来の花粉によって受精して、倍数体の子孫を作出することができる非減数２ｎ卵細胞を作り出す。こうして、異なる育種世代におけるアポマイオシスと単為生殖の交代は、二倍体と倍数体遺伝子プールとを結びつける。
【0162】
アポマイオシスを伴わない核酸及びその派生物（転写物又はコードされたタンパク質）の別の使用とは、単数体子孫の作出であり、これは、単数体の作出にとって且つ倍加単数体（ＤＨ）のゲノム倍加（例えば、自発的ゲノム倍加、コルヒチン、アジドナトリウム又はその他の化学物質）によって、使用し得る。倍加単数体を両親として使用して、有性Ｆ１雑種を作出することができる。倍加単数体は、植物をホモ接合にするための最速の方法である。倍加単数体によれば植物をホモ接合型と為すことができるが、一方、２番目に速い方法、自家受粉によれば、二倍体植物でホモ接合性が有意に高いレベルに達するには、５～７世代かかる。倍加単数体を作出するいくつかの方法がある。一部の植物種では、小胞子培養によって単数体を作り出すことができる。他の方法とは、照射された花粉（メロン）での受粉、又は特定の受粉媒介者ストック（トウモロコシ、ジャガイモ）での受粉による、単数体胚の生産（雌性発生）である。これらの方法には、コスト、遺伝子型の不応性、労働集約性等などの制限がある。一部の作物では、単数体作出の方法が存在しない（例えばトマト）。単為生殖遺伝子の優性対立遺伝子によれば、雌性発生の頻度が著明に向上し、単数体作出のコストが削減される可能性がある。
【0163】
以下の非限定的な実施例では、本発明の様々な実施形態を例示する。実施例に別段の記載がない限り、すべての組換えＤＮＡ技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）；並びにＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４）の巻１と２、に記載の標準プロトコルに従って実施される。植物分子研究の標準的な材料及び方法が、Ｒ．Ｄ．Ｄ．ＣｒｏｙによるＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｆａｘ（１９９３）、ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ（英国）及びＢｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、英国による共同出版、に記載されている。
【0164】
【表1】
【0165】
【表2】
【実施例】
【0166】
実施例１
材料及び方法
植物材料
野生型アポミクシス三倍体セイヨウタンポポＡ６８及び有性二倍体セイヨウタンポポＦＣＨ７２。
材料及び方法
植物材料
野生型アポミクシス三倍体セイヨウタンポポＡ６８及び有性二倍体セイヨウタンポポＦＣＨ７２。
【0167】
ＤＮＡ構築物
バイナリーベクターを、Ｔ－ＤＮＡ領域上にコードされた以下のコンポーネントを用いて構築した；３５Ｓターミネーターを備えるＣａｓ９遺伝子（配列番号１７）を駆動するパセリユビキチンプロモーター（配列番号１６）、及びＴＴＴＴＴＴターミネーター配列を備えるガイドＲＮＡ－１（配列番号１９の標的特異的配列を有する）を駆動するトマトＵ６プロモーター（配列番号１８、Ｎｅｋｒａｓｏｖら．２０１３）及び選別用のグルホシネート耐性遺伝子。ガイドＲＮＡ－１の配列をガイドＲＮＡ－２の配列（配列番号２０の標的特異的配列を有する）で置き換えている類似のバイナリーベクターを構築した。かかるバイナリーベクターを作り出すのに適した技術は、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）（登録商標）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ、又はギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）（登録商標）である（例えば、Ｍａら、２０１５を参照されたい）。対照構築物として使用されるＴ－ＤＮＡ領域上の３５Ｓ－ＧＵＳをコードするベクター。
バイナリーベクターを、Ｔ－ＤＮＡ領域上にコードされた以下のコンポーネントを用いて構築した；３５Ｓターミネーターを備えるＣａｓ９遺伝子（配列番号１７）を駆動するパセリユビキチンプロモーター（配列番号１６）、及びＴＴＴＴＴＴターミネーター配列を備えるガイドＲＮＡ－１（配列番号１９の標的特異的配列を有する）を駆動するトマトＵ６プロモーター（配列番号１８、Ｎｅｋｒａｓｏｖら．２０１３）及び選別用のグルホシネート耐性遺伝子。ガイドＲＮＡ－１の配列をガイドＲＮＡ－２の配列（配列番号２０の標的特異的配列を有する）で置き換えている類似のバイナリーベクターを構築した。かかるバイナリーベクターを作り出すのに適した技術は、ゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）（登録商標）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ、又はギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）（登録商標）である（例えば、Ｍａら、２０１５を参照されたい）。対照構築物として使用されるＴ－ＤＮＡ領域上の３５Ｓ－ＧＵＳをコードするベクター。
【0168】
植物の形質転換法
アグロバクテリウムの形質転換を、Ｏｓｃａｒｓｓｏｎ（Ｏｓｃａｒｓｓｏｎ，Ｌｏｔｔａ． 「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｂｂｅｒ ｆｒｏｍ ｄａｎｄｅｌｉｏｎ－ａ ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．」２０１５）のプロトコルの改変版に従って実行した。０．８％寒天を含む半強度ＭＳ２０培地で育成した、継代培養のｉｎ ｖｉｔｒｏ繁殖種子由来植物から得たセイヨウタンポポＡ６８外植片を、植物形質転換の出発材料とした。バイナリーベクターを備える株Ｃ５８Ｃ１などのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ））のＬＢ培地での一晩培養物５０ｍｌを、共培養用に１０×希釈（液体ＭＳ２０で再懸濁及び希釈）で使用した。外植片を概０．５ｃｍ２の小片に切断し、２～３日間共培養した。次いで、外植片を、カルス誘導培地（ＣＩＭ；スクロース２０ｇｌ－１、ミクロ栄養素及びマクロ栄養素を含むＭＳ ４．４ｇｌ－１、寒天８ｇｌ－１、ＢＡＰ １ｍｇｌ－１、ＩＡＡ ０．２ｍｇｌ－１、植物選別用のグルホシネート３ｍｇｌ－１、バンコマイシン１００ｍｇ１－１及びセフォタキシム１００ｍｇｌ－１、ｐＨ５．８）に移した。外植片を毎週新しいＣＩＭに移した。カルスが現れたとき、カルスを茎葉誘導培地（ＳＩＭ；スクロース２０ｇｌ－１、ミクロ栄養素及びマクロ栄養素を含むＭＳ ４．４ｇｌ－１、寒天８ｇｌ－１、ゼアチン２ｍｇｌ－１、ＩＡＡ ０．１ｍｇｌ－１、ＧＡ３ ０．０５ｍｇｌ－１、植物選別用のグルホシネート３ｍｇｌ－１、バンコマイシン１００ｍｇ１－１及びセフォタキシム１００ｍｇｌ－１、ｐＨ５．８）に移した。最終的に、直径数ｃｍの形成シュートを発根培地（ＲＭ；；スクロース２０ｇｌ－１、ミクロ栄養素及びマクロ栄養素を含むＭＳ ２．２ｇｌ－１、寒天８ｇｌ－１、バンコマイシン１００ｍｇ１－１及びセフォタキシム１００ｍｇｌ－１、ｐＨ５．８）で発根させた。発根シュートを、鉢植えの土壌に温室に移した。
アグロバクテリウムの形質転換を、Ｏｓｃａｒｓｓｏｎ（Ｏｓｃａｒｓｓｏｎ，Ｌｏｔｔａ． 「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｂｂｅｒ ｆｒｏｍ ｄａｎｄｅｌｉｏｎ－ａ ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ ｆｏｒ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．」２０１５）のプロトコルの改変版に従って実行した。０．８％寒天を含む半強度ＭＳ２０培地で育成した、継代培養のｉｎ ｖｉｔｒｏ繁殖種子由来植物から得たセイヨウタンポポＡ６８外植片を、植物形質転換の出発材料とした。バイナリーベクターを備える株Ｃ５８Ｃ１などのアグロバクテリウム・ツメファシエンス（リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ））のＬＢ培地での一晩培養物５０ｍｌを、共培養用に１０×希釈（液体ＭＳ２０で再懸濁及び希釈）で使用した。外植片を概０．５ｃｍ２の小片に切断し、２～３日間共培養した。次いで、外植片を、カルス誘導培地（ＣＩＭ；スクロース２０ｇｌ－１、ミクロ栄養素及びマクロ栄養素を含むＭＳ ４．４ｇｌ－１、寒天８ｇｌ－１、ＢＡＰ １ｍｇｌ－１、ＩＡＡ ０．２ｍｇｌ－１、植物選別用のグルホシネート３ｍｇｌ－１、バンコマイシン１００ｍｇ１－１及びセフォタキシム１００ｍｇｌ－１、ｐＨ５．８）に移した。外植片を毎週新しいＣＩＭに移した。カルスが現れたとき、カルスを茎葉誘導培地（ＳＩＭ；スクロース２０ｇｌ－１、ミクロ栄養素及びマクロ栄養素を含むＭＳ ４．４ｇｌ－１、寒天８ｇｌ－１、ゼアチン２ｍｇｌ－１、ＩＡＡ ０．１ｍｇｌ－１、ＧＡ３ ０．０５ｍｇｌ－１、植物選別用のグルホシネート３ｍｇｌ－１、バンコマイシン１００ｍｇ１－１及びセフォタキシム１００ｍｇｌ－１、ｐＨ５．８）に移した。最終的に、直径数ｃｍの形成シュートを発根培地（ＲＭ；；スクロース２０ｇｌ－１、ミクロ栄養素及びマクロ栄養素を含むＭＳ ２．２ｇｌ－１、寒天８ｇｌ－１、バンコマイシン１００ｍｇ１－１及びセフォタキシム１００ｍｇｌ－１、ｐＨ５．８）で発根させた。発根シュートを、鉢植えの土壌に温室に移した。
【0169】
結果
アグロバクテリウム形質転換から得られた発根植物について、ＰＣＲによって植物ゲノム中のＣａｓ９及びガイドＲＮＡ－１又はガイドＲＮＡ－２をコードするそれぞれのＴ－ＤＮＡの存在に関して遺伝子型決定を行った。この試験に陽性であった植物（トランスジェニック植物として本明細書では指示される）を、結実するまで生育した。これらの構築物のうちのいずれか１つを含む個々のカルスに由来する個々のトランスジェニック植物は、正常な生存可能なダークブラックグレーの種子を有し、かかる植物の一部は、異常なライトグレーの種子を有した（表２を参照されたい）。こういったライトグレーの種子は空であることが見いだされ、胚を欠き、生育不能であることがわかり、発芽しなかった。対照植物（Ｔ－ＤＮＡに陰性であるか、３５Ｓ－ＧＵＳ対照構築物で形質転換）は、同様の異常なライトグレーの種子を決して有さず、対照植物はすべて、肥沃なブラックグレーの種子を含む正常なシードヘッドを有した。次に、すべてのトランスジェニック植物について、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ上のガイドＲＮＡ－１標的ゲノムＤＮＡ領域のアンプリコンシーケンシングによって遺伝子型決定を行った。異常なライトグレーの種子を示したすべてのトランスジェニック植物は、単為生殖遺伝子に、より特には、ｇＲＮＡ－１が標的とするＤＮＡのストレッチ内に、小欠失又は少挿入を有することが見いだされた。Ａ６８は三倍体植物である。他の２つの対立遺伝子上のこの遺伝子の配列を同定したが、配列番号１０及び１５によって本明細書では表される。これらの２つの対立遺伝子の配列は、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡがＤＳＢを誘導するのに必要なＰＡＭ配列を欠く。
アグロバクテリウム形質転換から得られた発根植物について、ＰＣＲによって植物ゲノム中のＣａｓ９及びガイドＲＮＡ－１又はガイドＲＮＡ－２をコードするそれぞれのＴ－ＤＮＡの存在に関して遺伝子型決定を行った。この試験に陽性であった植物（トランスジェニック植物として本明細書では指示される）を、結実するまで生育した。これらの構築物のうちのいずれか１つを含む個々のカルスに由来する個々のトランスジェニック植物は、正常な生存可能なダークブラックグレーの種子を有し、かかる植物の一部は、異常なライトグレーの種子を有した（表２を参照されたい）。こういったライトグレーの種子は空であることが見いだされ、胚を欠き、生育不能であることがわかり、発芽しなかった。対照植物（Ｔ－ＤＮＡに陰性であるか、３５Ｓ－ＧＵＳ対照構築物で形質転換）は、同様の異常なライトグレーの種子を決して有さず、対照植物はすべて、肥沃なブラックグレーの種子を含む正常なシードヘッドを有した。次に、すべてのトランスジェニック植物について、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ上のガイドＲＮＡ－１標的ゲノムＤＮＡ領域のアンプリコンシーケンシングによって遺伝子型決定を行った。異常なライトグレーの種子を示したすべてのトランスジェニック植物は、単為生殖遺伝子に、より特には、ｇＲＮＡ－１が標的とするＤＮＡのストレッチ内に、小欠失又は少挿入を有することが見いだされた。Ａ６８は三倍体植物である。他の２つの対立遺伝子上のこの遺伝子の配列を同定したが、配列番号１０及び１５によって本明細書では表される。これらの２つの対立遺伝子の配列は、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡがＤＳＢを誘導するのに必要なＰＡＭ配列を欠く。
【0170】
正常な黒い種子を有したトランスジェニック植物はいずれも、遺伝子の配列に変化がなかった。表２に、観察された小欠失又は少挿入及びコード配列のタンパク質配列への翻訳に及ぼす影響をまとめており、図１に、アンプリコンの多重整列を示す。
【0171】
配列番号５の遺伝子に小欠失を有するトランスジェニック植物について観察された結実については、アポミクティック表現型の喪失（アポミクシス喪失型又はＬｏＡと本明細書で称される）、さらには単為生殖表現型の喪失（単為生殖喪失型又はＬｏＰ）の指標として解釈された。アポミクティック植物は優性Ｐａｒ対立遺伝子を常に有する。
【0172】
他家受粉の非存在下での三倍体タンポポの種子結実が高いことは、アポミクシスの明確な指標である。自家受粉は代替の説明として排除することができるが、その理由は、不均衡な三倍体の雄と雌の減数分裂に起因して、有性生殖した卵細胞と花粉粒は受精能が極めて低いことになるからである。Ｐａｒ対立遺伝子が欠失すると、ＬｏＰに、したがってＬｏＡという結果となる。しかし、ＬｏＡは、他の発生プロセスの乱れによっても引き起こされる場合もある。したがって、ＬｏＰ植物はＬｏＡ植物のサブセットであり、観察された表現型をＬｏＰ欠失表現型として同定するには、さらなる試験が必要である。
【0173】
観察されたライトグレーの種子表現型の性質をさらに調査するために、交配を行った。三倍体トランスジェニック植物におけるＬｏＰを、三倍体トランスジェニックＡ６８植物を有性ＦＣＨ７２二倍体植物からの単数体花粉と他家受粉することによって検出した。これら交配の種子を収集し、播種し、子孫の倍数性レベルをフローサイトメトリーによって測定した。均一に四倍体の子孫が見いだされ、このことは、ＬｏＡ植物が複相胞子生殖型であり、種子繁殖が可能であるが、単為生殖を欠くことを示した。
【0174】
対照として、アポミクシス三倍体Ａ６８植物の種子を播種したが、これらはすべて三倍体であることが見いだされた。同じ播種で、ライトグレーの表現型を示すガイドＲＮＡ－１を含むＴ－ＤＮＡを有する種々の植物からの種子も取ったが、これらの種子で発芽が見られることは決してなかった（図２）。ＦＨＣ７２との交配後の同様の発芽試験結果は、ガイドＲＮＡ－２を含むＴ－ＤＮＡを有し、粃の表現型を示す植物で予想される（発芽実験は実施しなかった）。まとめると、セイヨウタンポポＡ８６は、単為生殖に必須である配列番号５の配列を有する優性Ｐａｒ対立遺伝子と、それぞれ、配列番号１０及び１５の配列を有する２つの劣性有性対立遺伝子を有すると結論付けられた。
【0175】
実施例２
単為生殖に必須な遺伝子を使用して、アポミクシスを伴わない又は単為生殖を伴わない植物に、単為生殖形質を移すことができる。単為生殖に必須な遺伝子若しくは配列番号５を有する遺伝子のコード配列又は相同遺伝子のいずれかを使用して、そのような単為生殖形質の移入を行うことができる。その天然プロモーター又は雌性配偶子特異的プロモーターによって駆動される、バイナリーベクターを、少なくとも配列番号５の遺伝子又は相同遺伝子を有するＴ－ＤＮＡで調製する。この遺伝子構築物を、アグロバクテリウム媒介形質転換によって、単為生殖のない植物、例えばレタス又はシロイヌナズナに形質転換する。導入遺伝子の存在について陽性と試験された植物を、単為生殖の発生について評価する。形質が優勢であるので、試験は一次形質転換植物（Ｔ０）で行う。単為生殖については、サリチル酸メチルで透徹化した胚珠のＮｏｍａｒｓｋｉ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＤＩＣ）によって、顕微鏡的に非アポミクティック植物において検出することができる（Ｖａｎ Ｂａａｒｌｅｎら ２００２）。他家受精又は自家受精の非存在下では、単為生殖卵細胞は胚へと発生する。上述のＴ－ＤＮＡを宿す植物では、かかる胚の少なくともいくつかが見いだされる。
単為生殖に必須な遺伝子を使用して、アポミクシスを伴わない又は単為生殖を伴わない植物に、単為生殖形質を移すことができる。単為生殖に必須な遺伝子若しくは配列番号５を有する遺伝子のコード配列又は相同遺伝子のいずれかを使用して、そのような単為生殖形質の移入を行うことができる。その天然プロモーター又は雌性配偶子特異的プロモーターによって駆動される、バイナリーベクターを、少なくとも配列番号５の遺伝子又は相同遺伝子を有するＴ－ＤＮＡで調製する。この遺伝子構築物を、アグロバクテリウム媒介形質転換によって、単為生殖のない植物、例えばレタス又はシロイヌナズナに形質転換する。導入遺伝子の存在について陽性と試験された植物を、単為生殖の発生について評価する。形質が優勢であるので、試験は一次形質転換植物（Ｔ０）で行う。単為生殖については、サリチル酸メチルで透徹化した胚珠のＮｏｍａｒｓｋｉ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＤＩＣ）によって、顕微鏡的に非アポミクティック植物において検出することができる（Ｖａｎ Ｂａａｒｌｅｎら ２００２）。他家受精又は自家受精の非存在下では、単為生殖卵細胞は胚へと発生する。上述のＴ－ＤＮＡを宿す植物では、かかる胚の少なくともいくつかが見いだされる。
【0176】
植物材料
本実験では、野生型レタス：Ｉｃｅｂｅｒｇ型、レガシー、タキイ種苗株式会社及びＲｅｄ Ｒｏｍａｉｎｅ型、Ｂａｋｅｒ Ｃｒｅｅｋ Ｈｅｉｒｌｏｏｍ Ｓｅｅｄｓを使用した。
本実験では、野生型レタス：Ｉｃｅｂｅｒｇ型、レガシー、タキイ種苗株式会社及びＲｅｄ Ｒｏｍａｉｎｅ型、Ｂａｋｅｒ Ｃｒｅｅｋ Ｈｅｉｒｌｏｏｍ Ｓｅｅｄｓを使用した。
【0177】
ＤＮＡ構築物
バイナリーベクターを、Ｔ－ＤＮＡ領域上にコードした以下の成分で構築した；セイヨウタンポポのＰａｒ対立遺伝子ＣＤＳ配列（配列番号３）の発現を駆動するシロイヌナズナのＥＣ１．１プロモーター（Ｓｐｒｕｎｋら ２０１２のように）とこれに続く３’ＵＴＲの最初の２５０塩基（配列番号４の最初の２５０塩基）、これに続く３５Ｓターミネーター及び選別用ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）。このようなバイナリーベクターを作り出すのに適した技術は、ゲートウェイ（登録商標）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ、又はギブソンアセンブリ（登録商標）である（例えば、Ｍａら、２０１５を参照されたい）。このＴ－ＤＮＡを宿すトランスジェニック系統には、コードｐＫＧ１０８２４で番号付けした。
バイナリーベクターを、Ｔ－ＤＮＡ領域上にコードした以下の成分で構築した；セイヨウタンポポのＰａｒ対立遺伝子ＣＤＳ配列（配列番号３）の発現を駆動するシロイヌナズナのＥＣ１．１プロモーター（Ｓｐｒｕｎｋら ２０１２のように）とこれに続く３’ＵＴＲの最初の２５０塩基（配列番号４の最初の２５０塩基）、これに続く３５Ｓターミネーター及び選別用ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）。このようなバイナリーベクターを作り出すのに適した技術は、ゲートウェイ（登録商標）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ、又はギブソンアセンブリ（登録商標）である（例えば、Ｍａら、２０１５を参照されたい）。このＴ－ＤＮＡを宿すトランスジェニック系統には、コードｐＫＧ１０８２４で番号付けした。
【0178】
植物の形質転換法
アグロバクテリウムの形質転換を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用してレタスの遺伝子型非依存性形質転換によって実施した。かかる方法は当技術分野でよく知られており、例えばＣｕｒｔｉｓらに教示されている。Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅら（１９８７）又はＣｈｕｐｅａｕら（１９８９）に記載されているなどの、レタスの遺伝的形質転換に適した他の任意の方法を使用して、所望のＴ－ＤＮＡを宿す植物を作出してもよい。
アグロバクテリウムの形質転換を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用してレタスの遺伝子型非依存性形質転換によって実施した。かかる方法は当技術分野でよく知られており、例えばＣｕｒｔｉｓらに教示されている。Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅら（１９８７）又はＣｈｕｐｅａｕら（１９８９）に記載されているなどの、レタスの遺伝的形質転換に適した他の任意の方法を使用して、所望のＴ－ＤＮＡを宿す植物を作出してもよい。
【0179】
結果
上の「ＤＮＡ構築物」のセクションの下で記載のように、導入遺伝子の存在について陽性と試験された植物を、単為生殖の発生について評価した。形質が優勢であるので、試験は一次形質転換植物（Ｔ０）で行った。他家受精又は自家受精の非存在下では、単為生殖卵細胞は胚へと発生する。導入遺伝子を宿す任意の植物の受精を防止するために、植物を温室で育成し、顕微鏡観察に先立ち、すべての花を手で除雄した。除雄については、花冠が生長する前に、総苞をクリップすることによって実行した。単為生殖については、透徹化した胚珠のＮｏｍａｒｓｋｉ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＤＩＣ）によって、顕微鏡的に非アポミクティック植物において検出することができる。ここでは、抱水クロラールを使用した透徹化方法を適用した、これは、顕微鏡イメージング用に植物の胚珠を透徹化するのに一般に使用される方法である（例えばＦｒａｎｋｓら ２０１６）。除雄後７５時間で、花芽を収穫し、抱水クロラールで胚珠を透徹化した。評価した７つのトランスジェニック系統すべてにおいて、複数の胚がこれらの透徹化胚珠中に観察された（これらの系統のうちの５つについてデータを示す表３を参照されたい）。図３に、かかる観察された胚の例を示す。一部の単一胚珠では、複数の胚が観察された（多胚形成）。図４に、観察された多胚形成の例を示す。しかし、多胚形成は単一胚よりもはるかに低い頻度で観察された。非除雄のトランスジェニック系統では、雄性配偶子形成が完了する前、したがって受精前に、胚をすでに観察することができた。また、これらの非除雄のトランスジェニック植物では、一部の稀な事例で多胚形成が観察された。非形質転換対照植物では、これは同一方法で除雄及び画像化されたものであるが、胚はまったく観察されなかった。
上の「ＤＮＡ構築物」のセクションの下で記載のように、導入遺伝子の存在について陽性と試験された植物を、単為生殖の発生について評価した。形質が優勢であるので、試験は一次形質転換植物（Ｔ０）で行った。他家受精又は自家受精の非存在下では、単為生殖卵細胞は胚へと発生する。導入遺伝子を宿す任意の植物の受精を防止するために、植物を温室で育成し、顕微鏡観察に先立ち、すべての花を手で除雄した。除雄については、花冠が生長する前に、総苞をクリップすることによって実行した。単為生殖については、透徹化した胚珠のＮｏｍａｒｓｋｉ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＤＩＣ）によって、顕微鏡的に非アポミクティック植物において検出することができる。ここでは、抱水クロラールを使用した透徹化方法を適用した、これは、顕微鏡イメージング用に植物の胚珠を透徹化するのに一般に使用される方法である（例えばＦｒａｎｋｓら ２０１６）。除雄後７５時間で、花芽を収穫し、抱水クロラールで胚珠を透徹化した。評価した７つのトランスジェニック系統すべてにおいて、複数の胚がこれらの透徹化胚珠中に観察された（これらの系統のうちの５つについてデータを示す表３を参照されたい）。図３に、かかる観察された胚の例を示す。一部の単一胚珠では、複数の胚が観察された（多胚形成）。図４に、観察された多胚形成の例を示す。しかし、多胚形成は単一胚よりもはるかに低い頻度で観察された。非除雄のトランスジェニック系統では、雄性配偶子形成が完了する前、したがって受精前に、胚をすでに観察することができた。また、これらの非除雄のトランスジェニック植物では、一部の稀な事例で多胚形成が観察された。非形質転換対照植物では、これは同一方法で除雄及び画像化されたものであるが、胚はまったく観察されなかった。
【0180】
【表3】
【0181】
これらの結果が実証するところは、セイヨウタンポポのＰａｒ対立遺伝子の遺伝子がそれ自体でレタスの胚形成を誘導するのに十分であることである。このことは、他家受精又は自家受精の非存在下で、卵細胞が胚へと発生したように、セイヨウタンポポのＰａｒ対立遺伝子の遺伝子によりレタスにおいて単為生殖を誘導する、明確な例である。レタス相同体（配列番号２２）を、同じ方法で植物の形質転換に使用する場合、例えば、レタスホモログ（配列番号２２）をコードする配列の発現を駆動する（Ｓｐｒｕｎｋら ２０１２におけるような）シロイヌナズナのＥＣ１．１プロモーターを含むＴ－ＤＮＡ領域を、３５Ｓターミネーター及び選別用のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）と一緒に含むベクターで前記レタス植物を形質転換する場合、同様の結果が期待される。
【0182】
実施例３
配列番号５の遺伝子は、単為生殖及び非単為生殖の植物種において相同体を有する。かかるすべての配列を、５’及び３’調節配列を含めて、多重整列及びバリアントコールによって比較した。これは、配列番号５の遺伝子の単為生殖植物種バージョンでどの差異が専ら表されるかを決定するように行った。
配列番号５の遺伝子は、単為生殖及び非単為生殖の植物種において相同体を有する。かかるすべての配列を、５’及び３’調節配列を含めて、多重整列及びバリアントコールによって比較した。これは、配列番号５の遺伝子の単為生殖植物種バージョンでどの差異が専ら表されるかを決定するように行った。
【0183】
本発明者らは、開始コドンの１０２ｂｐ上流（３’）の距離にてＰａｒ対立遺伝子のプロモーター配列（配列番号２）中に、１３３５ｂｐのミニチュア逆方向反復転位因子（ＭＩＴＥ）配列又はＭＩＴＥ様（配列番号６０によって本明細書では定義の）を同定したが、この配列は、有性カウンターパート（配列番号７及び１２）では存在しないことが同定された。このＭＩＴＥ又はＭＩＴＥ様配列は、例をあげるとコード化したタンパク質の発現レベルの変化を担うことによって、単為生殖表現型を指示するとものと期待されるとともに、そういった単為生殖表現型の原因であるとすることができる。
【0184】
これらの単為生殖対立遺伝子の特異的多型、挿入又は欠失は、非単為生殖植物に、本発明の単為生殖遺伝子の有性対立遺伝子相同体の化学的突然変異誘発又は標的遺伝子編集によって導入することができる。例をあげると、ＰＡＲ遺伝子のプロモーター配列を、タンポポ属対立遺伝子のプロモーター、すなわち配列番号２によって置き換えてもよく、上に示したように、タンポポ属Ｐａｒ対立遺伝子のＭＩＴＥ配列に相同な位置で非単為生殖植物のＰＡＲ遺伝子に、ＭＩＴＥ配列を導入してもよい。こういった単為生殖対立遺伝子の特異的多型、挿入又は欠失を導入すると、植物は単為生殖形質を獲得することになる。単為生殖については、サリチル酸メチルで透徹化した胚珠のＮｏｍａｒｓｋｉ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＤＩＣ）によって、顕微鏡的に非単為生殖植物において検出することができる（Ｖａｎ Ｂａａｒｌｅｎら ２００２）。他家受精又は自家受精の非存在下では、単為生殖卵細胞は胚へと発生する。上述の特異的多型、挿入又は欠失を宿す植物では、かかる胚の少なくともいくつかが見いだされる。
【0185】
実施例４
三倍体及び四倍体のタンポポ属アポミクトを、花粉ドナーとして二倍体のロシアタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）植物と交配した。花粉ドナー自体は、有性ロシアタンポポをアポミクティックゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ）花粉ドナーと交配することによって得た。したがって、アポミクシス遺伝子はゴムタンポポに由来した（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら ２０１２）。三倍体後代植物を、ＰＣＲマーカーを使用して、Ｐａｒ対立遺伝子及び複相胞子生殖（Ｄｉｐ）対立遺伝子（国際公開第２０１７／０３９４５２Ａ１号を参照されたい）の存在について、及びアポミクティック種子の生産について、試験した。アポミクティック種子結実を、他家受粉なしで三倍体植物上での生存可能な種子の生産として定義した。
三倍体及び四倍体のタンポポ属アポミクトを、花粉ドナーとして二倍体のロシアタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）植物と交配した。花粉ドナー自体は、有性ロシアタンポポをアポミクティックゴムタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ）花粉ドナーと交配することによって得た。したがって、アポミクシス遺伝子はゴムタンポポに由来した（Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒら ２０１２）。三倍体後代植物を、ＰＣＲマーカーを使用して、Ｐａｒ対立遺伝子及び複相胞子生殖（Ｄｉｐ）対立遺伝子（国際公開第２０１７／０３９４５２Ａ１号を参照されたい）の存在について、及びアポミクティック種子の生産について、試験した。アポミクティック種子結実を、他家受粉なしで三倍体植物上での生存可能な種子の生産として定義した。
【0186】
プライマーＤＩＰ＿Ｆ（配列番号３３）及びＤＩＰ＿Ｒ（配列番号３４）を、Ｄｉｐ対立遺伝子を特異的に増幅するために複相胞子生殖遺伝子ＶＰＳ１３上で設計した。これらのプライマーを使用すると、Ｄｉｐ対立遺伝子が存在するとＰＣＲ ８２９ｂｐのＰＣＲ産物がもたらされ、一方、この対立遺伝子が存在しないとＰＣＲ産物はもたらされなかった。
【0187】
プライマーＰＡＲ＿Ｆ（配列番号３５）及びＰＡＲ＿Ｒ（配列番号３６）を、Ｐａｒ、ｐａｒ１、及びｐａｒ２対立遺伝子のうちのいずれか１つを増幅するために、配列番号２及び配列番号４上で設計した。表４に示すように、Ｐａｒ対立遺伝子の存在はＰＣＲ産物の長さによって区別することができた。
【0188】
【表4】
【0189】
下に本明細書で報告する表５に示すように、５６の後代植物を試験し、Ｐａｒ対立遺伝子の存在と単為生殖の間に１００％の相関関係が観察された。アポミクティック種子を生産し且つＤＩＰ及びＰＡＲのマーカーが陰性である植物は、観察されなかった。
【0190】
【表5】
【0191】
したがって、セイヨウタンポポのＰａｒ遺伝子座から開発したマーカーは、異なる種ゴムタンポポにおける単為生殖の存在も同定し、この存在は、Ｐａｒ対立遺伝子が単為生殖を引き起こすことのさらなる証明である、と結論付けることができる。
【0192】
実施例５
アポミクティックＡ６８のガンマ線照射欠失集団の構築
クローンＡ６８からの概３×２０００の種子を、異なる３線量：３分の１を２５０Ｇｙ、３分の１を３００Ｇｙ及び３分の１を４００Ｇｙ、でガンマ線照射した。照射種子からの合計３０７５の植物を温室の鉢で育成した。１０℃未満で２か月の春化処理期間の後、植物を加温温室で再度育成した。植物のうちの９０％超が開花し、種子を生産した。植物は、アポミクシス喪失型表現型（ＬｏＡ）を示すか否かで分類した。アポミクシスＡ６８植物は自発的に種子を生産し、暗褐色の中心部を有する、白色で大きいシードヘッドを形成し、そこでは、種子（痩果：１つの種子を持つ果実）が花托に付着する。アポミクシス喪失型表現型では、シードヘッドの中心部はより軽く、多くの場合、シードヘッドは直径が減少する。最終的に１０２の植物を、アポミクシス喪失型表現型を有すると同定した。
アポミクティックＡ６８のガンマ線照射欠失集団の構築
クローンＡ６８からの概３×２０００の種子を、異なる３線量：３分の１を２５０Ｇｙ、３分の１を３００Ｇｙ及び３分の１を４００Ｇｙ、でガンマ線照射した。照射種子からの合計３０７５の植物を温室の鉢で育成した。１０℃未満で２か月の春化処理期間の後、植物を加温温室で再度育成した。植物のうちの９０％超が開花し、種子を生産した。植物は、アポミクシス喪失型表現型（ＬｏＡ）を示すか否かで分類した。アポミクシスＡ６８植物は自発的に種子を生産し、暗褐色の中心部を有する、白色で大きいシードヘッドを形成し、そこでは、種子（痩果：１つの種子を持つ果実）が花托に付着する。アポミクシス喪失型表現型では、シードヘッドの中心部はより軽く、多くの場合、シードヘッドは直径が減少する。最終的に１０２の植物を、アポミクシス喪失型表現型を有すると同定した。
【0193】
単回投与優性マーカーを、Ｗｕら（１９９２）の方法を使用して、同質倍数体植物にマッピングすることができる。Ｐａｒ遺伝子座に連結したＡＦＬＰマーカー（Ｖｏｓら １９９５）を見いだすために、分離群解析アプローチを使用した（Ｍｉｃｈｅｌｍｏｒｅら １９９１）。対照的な２つのＤＮＡプール、１０の三倍体ＰＡＲ植物からのＤＮＡによるプールＡと１０の三倍体非ＰＡＲ植物からのＤＮＡによるプールＢを構築したが、すべてＴＪＸ３－２０（二倍体有性）×Ａ６８の交配からの後代である。非Ｐａｒ植物を、Ｎｏｍａｒｓｋｉ ＤＩＣ顕微鏡を使用して、単為生殖の非存在について注意深く表現型決定した（Ｖａｎ Ｂａａｒｌｅｎら ２００２）。Ｐａｒプールの場合、アポミクティック植物を使用した。１４７個のＡＦＬＰプライマー組合せ（Ｖｏｓら １９９５）を、プールＡでは断片の存在について、プールＢでは断片の非存在についてスクリーニングした。両プール中の対照的な断片について両プールからの個体で検証した。１７個のＡＦＬＰマーカーを使用して、ＴＪＸ３－２０×Ａ６８交配（７６植物）に基づいてＰａｒ－遺伝子座染色体領域の遺伝子マップを構築した。１７個のＡＦＬＰマーカーのうち１４個を、Ｐａｒ表現型とともに厳密に同時分離した。これは、Ｐａｒ遺伝子座近傍での組換えの抑制の指標である。
【0194】
３つの相同染色体のうちの１つが部分的に欠失されると、欠失領域に位置する単回投与ＡＦＬＰマーカーが喪失することになる。ＬｏＡ植物のＡＦＬＰ解析は、いくつかのＬｏＡ植物がＰａｒ遺伝子座に遺伝子的に連結した１つ又は複数のＡＦＬＰマーカーを喪失していたことを示した。Ｐａｒ連結ＡＦＬＰマーカーを欠いたＬｏＡ植物によって、二倍体の花粉ドナーと交配した後、四倍体の子孫が作出された。このことは、これらのＬｏＡ植物は、アポミクシス表現型を喪失していたが、依然として複相胞子生殖型であり、非減数卵細胞を生産したことを示した。これらのＬｏＡ植物は、それらが欠いたＰａｒの遺伝子的連結ＡＦＬＰマーカーの数に基づいてランク付けすることができた。喪失ＡＦＬＰマーカーの数は、欠失のサイズの指標である。ＬｏＡ植物で最も頻繁に喪失したＡＦＬＰマーカーは、Ｐａｒ遺伝子座に最も近いと考えられた。植物ｉ３４は、最も少ないＰＡＲ連結ＡＦＬＰマーカーを喪失しており、したがって、最も小さい欠失を有すると考えられた。
【0195】
実施例６
アポミクトタンポポ属植物対Ｐａｒ欠失及び有性植物における大配偶体中のＰａｒ遺伝子の遺伝子型及び対立遺伝子特異的発現
配偶体の様々な発生段階からの細胞と組織を、Ｗｕｅｓｔら（２０１０）及びＦｌｏｒｅｚ－Ｒｕｅｄａら（２０２０）に記載のように、組織を切断するために固体ＵＶ－Ａレーザー（波長概３５０ｎｍ）を使用するＳＬ μＣｕｔ機器を使用して（２００１、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）、レーザー支援マイクロダイセクション（ＬＡＭ）によって分離した。続いて、トランスクリプトーム解析を実行した。製造元（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の取扱説明書に従ってピコピュア（ＰｉｃｏＰｕｒｅ）（商標）ＲＮＡ分離キットを使用して、ＲＮＡを抽出した。試料間の当初の発現の差異を維持するために、ＤＮＡへの逆転写後に、Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙら（２０１２）及びＨａｓｈｉｍｓｈｏｎｙら（２０１６）に記載のように、ＣＥＬ－ｓｅｑ及びＣＥＬ－ｓｅｑ２のプロトコルを使用してｍＲＮＡを線形増幅した。
アポミクトタンポポ属植物対Ｐａｒ欠失及び有性植物における大配偶体中のＰａｒ遺伝子の遺伝子型及び対立遺伝子特異的発現
配偶体の様々な発生段階からの細胞と組織を、Ｗｕｅｓｔら（２０１０）及びＦｌｏｒｅｚ－Ｒｕｅｄａら（２０２０）に記載のように、組織を切断するために固体ＵＶ－Ａレーザー（波長概３５０ｎｍ）を使用するＳＬ μＣｕｔ機器を使用して（２００１、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、スイス）、レーザー支援マイクロダイセクション（ＬＡＭ）によって分離した。続いて、トランスクリプトーム解析を実行した。製造元（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の取扱説明書に従ってピコピュア（ＰｉｃｏＰｕｒｅ）（商標）ＲＮＡ分離キットを使用して、ＲＮＡを抽出した。試料間の当初の発現の差異を維持するために、ＤＮＡへの逆転写後に、Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙら（２０１２）及びＨａｓｈｉｍｓｈｏｎｙら（２０１６）に記載のように、ＣＥＬ－ｓｅｑ及びＣＥＬ－ｓｅｑ２のプロトコルを使用してｍＲＮＡを線形増幅した。
【0196】
３つの植物系統を比較した：１．オランダに起源を持つ三倍体アポミクトＡ６８（省略形：ＡＰＯ）、２．三倍体欠失系統ｉ３４（Ａ６８に由来するＰＡＲ欠失系統、上の実施例５を参照されたい）と二倍体花粉ドナーＦＣＨ７２との交配からの四倍体ＰＡＲ欠失子孫（省略形：ＤＥＬ）及び３．フランスに起源を持つ二倍体有性植物ＦＣＨ７２（省略形：ＳＥＸ）。
【0197】
植物系統毎に、異なる５つの発生段階／組織タイプをサンプリングした（表６）。非常に若い段階の場合、単一試料を解析した。成熟胚嚢から、中央細胞と卵母細胞装置（卵細胞と助細胞）を３回重複でサンプリングした。まとめると、これらは、植物系統毎に９試料を表す（表６）。
【0198】
【表6】
【0199】
線形増幅ＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑプラットフォームで配列決定した。個々のリードをＰａｒ遺伝子の配列にマッピングした（図５）。Ｐａｒ遺伝子の発現は、ＰＡＲ欠失又はＳＥＸ植物（すべての段階及び組織）のいずれにも検出されなかった。ＡＰＯ系統では、Ｐａｒ遺伝子に特異的なリードが、卵細胞装置及び中央細胞の両方で、成熟配偶体のすべての試料で見いだされた。一部の転写リードが、アポミクトのより若い発生段階のうちの１つでも検出された。この方法の３’末端増幅バイアスにより、ほとんどのリードがコード配列の３’末端と遺伝子の３’－ＵＴＲにマッピングされた。
【0200】
したがって、Ｐａｒ遺伝子は、アポミクトの７つの試料で発現するが、一方、同等の発生状態である、欠失系統の７つの試料でも有性系統の７つの試料でも発現しない。このことのよって、中央細胞及び卵細胞装置における遺伝子の異所性発現が、卵細胞停止の喪失、及びその結果として、胚の単為生殖的発生の原因であることが、さらに強調されている。
【0201】
実施例３にも示されているように、これらの細胞のアポミクトにおけるＰａｒ遺伝子の発現は、おそらくプロモーター領域のＭＩＴＥ配列の影響に起因して、有性の場合のようには抑制することができない。ＭＩＴＥは大きいので、Ｐａｒ遺伝子の転写因子の結合を物理的に妨げる可能性がある。
【0202】
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】