特表 2022-533842 一塩基置換蛋白質およびそれを含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-07-26

(54)【発明の名称】一塩基置換蛋白質およびそれを含む組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220719BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220719BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20220719BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20220719BHJP

   C12N 9/24 20060101ALI20220719BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20220719BHJP

   C12N 9/14 20060101ALI20220719BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20220719BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20220719BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20220719BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20220719BHJP

   C12N 9/78 20060101ALI20220719BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C12N15/09 110

C12N15/56 ZNA

C12N15/55

C12N9/24

C12N9/22

C12N9/14

C07K19/00

C12N15/63 Z

C12Q1/04

C12Q1/68

C12N9/78

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021569222

(86)(22)【出願日】2020-05-22

(85)【翻訳文提出日】2022-01-19

(86)【国際出願番号】 KR2020006731

(87)【国際公開番号】W WO2020235974

(87)【国際公開日】2020-11-26

(31)【優先権主張番号】62/851,372

(32)【優先日】2019-05-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/898,094

(32)【優先日】2019-09-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516355531

【氏名又は名称】ツールゲン インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＴＯＯＬＧＥＮ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110002262

【氏名又は名称】ＴＲＹ国際特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ベ スンミン

(72)【発明者】

【氏名】キム ヨンフン

(72)【発明者】

【氏名】イ ジョンジュン

【テーマコード（参考）】

4B050

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B050CC04

4B050CC05

4B050DD02

4B050LL03

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ42

4B063QR10

4B063QR14

4B063QR32

4B063QS10

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

4H045AA10

4H045BA41

4H045CA11

4H045DA89

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本出願は、一塩基置換蛋白質およびそれを含む組成物およびその用途に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸であって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、
（ｂ）デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、および
（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体を含み、
前記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンまたはアデニンを任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項2】

前記一塩基置換融合蛋白質は、
（ｉ）Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[デアミナーゼ]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、
（ｉｉ）Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[デアミナーゼ]－Ｃ末端、
（ｉｉｉ）Ｎ末端－[デアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、
（ｉｖ）Ｎ末端－[デアミナーゼ]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、
（ｖ）Ｎ末端－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[デアミナーゼ]－Ｃ末端、および
（ｖｉ）Ｎ末端－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[デアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端のうちいずれか１つの構成を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項3】

前記デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり、
前記ＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体であり、
前記一塩基置換融合蛋白質は標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンを任意の塩基への置換を誘導する、ことを特徴とする請求項１に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項4】

前記シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＡＩＤ）またはその変異体である、ことを特徴とする請求項３に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項5】

前記デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり、
前記ＤＮＡグリコシラーゼは、アルキラデニン－ＤＮＡグリコシラーゼ（Ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体であり、
前記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるアデニンを任意の塩基への置換を誘導する、ことを特徴とする請求項１に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項6】

前記アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ，Ｔａｄ２ｐ，ＡＤＡ，ＡＤＡ１，ＡＤＡ２，ＡＤＡＲ２，ＡＤＡＴ２，ＡＤＡＴ３またはその変異体である、ことを特徴とする請求項５に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項7】

前記一塩基置換融合蛋白質は、１つ以上の核局在配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ）をさらに含む、ことを特徴とする請求項１に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項8】

前記ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９蛋白質、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９蛋白質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９蛋白質、ストレプトコッカス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９蛋白質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９蛋白質、およびＣｐｆ１蛋白質からなる群より選択されるいずれか１つ以上を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項9】

前記ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインのうちいずれか１つ以上が不活性化される、ことを特徴とする請求項８に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項10】

前記ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）である、ことを特徴とする請求項９に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項11】

前記一塩基置換融合蛋白質は、各構成要素（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の間に連結部分（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸。

【請求項12】

請求項１～請求項１１の中いずれか一項に記載の一塩基置換融合蛋白質をコードする核酸を含む、ベクター。

【請求項13】

一塩基置換複合体であって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、
（ｂ）デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、
（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、および
（ｄ）２つ以上の結合ドメインを含み、
ここで、前記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンまたはアデニンを任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換複合体。

【請求項14】

前記ＣＲＩＳＰＲ酵素、前記デアミナーゼ、および前記ＤＮＡグリコシラーゼは、それぞれ１つ以上の結合ドメインに連結され、
ここで、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素、デアミナーゼ、および前記ＤＮＡグリコシラーゼは、前記結合ドメインの間の相互作用を通じて複合体を形成する、ことを特徴とする請求項１３に記載の一塩基置換複合体。

【請求項15】

前記ＣＲＩＳＰＲ酵素、前記デアミナーゼ、および前記ＤＮＡグリコシラーゼのうちいずれか１つ（ｏｎｅ）は、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインに連結され、
ここで、前記第１結合ドメインおよび他の構成（ａｎｏｔｈｅｒ）の結合ドメインは相互作用するペアであり、前記第２結合ドメインおよび残りの構成（ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ）の結合ドメインは相互作用するペアであり、
前記ペアによって複合体を形成する、ことを特徴とする請求項１４に記載の一塩基置換複合体。

【請求項16】

前記デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり、
前記ＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体であり、
前記一塩基置換融合蛋白質は標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンを任意の塩基への置換を誘導する、ことを特徴とする請求項１３に記載の一塩基置換複合体。

【請求項17】

前記シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＡＩＤ）またはその変異体である、ことを特徴とする請求項１６に記載の一塩基置換複合体。

【請求項18】

前記デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり、
前記ＤＮＡグリコシラーゼは、アルキラデニン－ＤＮＡグリコシラーゼ（Ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体であり、
前記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるアデニンを任意の塩基への置換を誘導する、ことを特徴とする請求項１３に記載の一塩基置換複合体。

【請求項19】

前記アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ，Ｔａｄ２ｐ，ＡＤＡ，ＡＤＡ１，ＡＤＡ２，ＡＤＡＲ２，ＡＤＡＴ２，ＡＤＡＴ３またはその変異体である、ことを特徴とする請求項１８に記載の一塩基置換複合体。

【請求項20】

（ｉ）前記ＣＲＩＳＰＲ酵素、前記デアミナーゼ、および前記ＤＮＡグリコシラーゼから選択される２つの構成と第１結合ドメインを含む第１融合蛋白質と、
（ｉｉ）前記選択されなかった残りの１つの構成と第２結合ドメインを含む第２融合蛋白質と、を含み、
ここで、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインは相互作用するペアであり、
前記ペアによって複合体を形成する、ことを特徴とする請求項１３に記載の一塩基置換複合体。

【請求項21】

（ｉ）前記デアミナーゼ、前記ＤＮＡグリコシラーゼおよび第１結合ドメインを含む第１融合蛋白質と、
（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素および第２結合ドメインを含む第２融合蛋白質と、を含むことを特徴とする請求項２０に記載の一塩基置換複合体。

【請求項22】

前記結合ドメインは、ＦＲＢ ｄｏｍａｉｎ，ＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ），ＥＲＴ ｄｏｍａｉｎｓ，ＶＰＲ ｄｏｍａｉｎ，ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅ，単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）中のいずれか１つ、またはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するドメインのうちいずれか１つである、ことを特徴とする請求項１４に記載の一塩基置換複合体。

【請求項23】

前記ペアは、
（ｉ）ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ、
（ｉｉ）第１インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）および第２インテイン、
（ｉｉｉ）ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓ、
（ｉｖ）ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよび単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）、または
（ｖ）ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成する第１ドメインおよび第２ドメインの中から選択されるいずれか１つである、ことを特徴とする請求項１５または２０に記載の一塩基置換複合体。

【請求項24】

前記ペアは、ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよび単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）である、ことを特徴とする請求項２３に記載の一塩基置換複合体。

【請求項25】

前記第１結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）であり、前記第２融合蛋白質は、少なくとも１つ以上の結合ドメインをさらに含み、
ここで、さらに含まれる結合ドメインはＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅであり、
２つ以上の第１融合蛋白質は前記ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅ中のいずれか１つとそれぞれ相互作用することによって複合体を形成する、ことを特徴とする請求項２１に記載の一塩基置換複合体。

【請求項26】

一塩基置換組成物であって、
（ａ）ガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸と、
（ｂ）ｉ）請求項１に記載の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸、またはｉｉ）請求項１３に記載の一塩基置換複合体と、を含み、
ここで、前記ガイドＲＮＡは標的核酸配列と相補的に結合し、
前記ガイドＲＮＡと結合される標的核酸配列は１５～２５ｂｐであり、
前記一塩基置換融合蛋白質または前記一塩基置換複合体は前記標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）内に存在する１つ以上のシトシンまたはアデニンの任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換組成物。

【請求項27】

１つ以上のベクターを含む、ことを特徴とする請求項２６に記載の一塩基置換組成物。

【請求項28】

一塩基置換方法であって、
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ上で標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）に（ｉ）ガイドＲＮＡおよび（ｉｉ）請求項１に記載の一塩基置換融合蛋白質または請求項１２に記載の一塩基置換複合体を接触することを含み、
前記ガイドＲＮＡは標的核酸配列に相補的に結合し、
このとき、前記ガイドＲＮＡと結合される標的核酸配列は１５～２５ｂｐであり、
前記一塩基置換融合蛋白質または前記一塩基置換複合体は、前記標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）内に存在する１つ以上のシトシンまたはアデニンの任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換方法。

【請求項29】

標的遺伝子のＳＮＰスクリーニング方法であって、
前記標的遺伝子を含む細胞に請求項２６に記載の一塩基置換組成物を導入して前記標的遺伝子上で人為的にＳＮＰを誘導する（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）ことと、
標的とするＳＮＰを含む細胞を選別する（ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ）ことと、
前記選別された細胞を分析することによって標的とするＳＮＰに対する情報（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を得る（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）ことと、を含み、
このとき、前記標的とするＳＮＰは、前記標的遺伝子から発現する蛋白質の構造または機能に関連する、標的遺伝子のＳＮＰスクリーニング方法。

【請求項30】

前記一塩基置換組成物は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、およびプロテイントランスロケーションドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ；ＰＴＤ）の融合蛋白質方法のうち選択される１つ以上の方法で導入される、ことを特徴とする請求項２９に記載の標的遺伝子のＳＮＰスクリーニング方法。

【請求項31】

薬物耐性突然変異のスクリーニング方法であって、
標的遺伝子を含む、少なくとも１つ以上の細胞に請求項２６に記載の一塩基置換組成物を導入して前記標的遺伝子上で人為的にＳＮＰを誘導する（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）ことと、
前記細胞に特定の薬物を処理する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）ことと、
生存した細胞を選別する（ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ）ことと、
前記選別された細胞を分析することによって標的とするＳＮＰに対する情報（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を得る（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）ことと、を含み、
このとき、前記標的とするＳＮＰは前記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連する、薬物耐性突然変異のスクリーニング方法。

【請求項32】

オシメルチニブ（Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）耐性ＳＮＰ情報を取得する方法であって、
ａ）標的核酸配列を含む細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸、およびガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を導入することと、
ｂ）前記ａ）の細胞に前記オシメルチニブを処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに対する情報を得ることと、を含み、
このとき、前記標的とするＳＮＰは、前記標的核酸配列を含むＥＧＦＲ遺伝子から発現するＥＧＦＲの構造または機能に関連する、オシメルチニブ（Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）耐性ＳＮＰ情報を取得する方法。

【請求項33】

前記一塩基置換組成物は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）およびＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）の融合蛋白質方法のうち選択される１つ以上の方法で導入される、ことを特徴とする請求項３１に記載の標的遺伝子のＳＮＰスクリーニング方法．

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、デアミナーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼを使用した一塩基置換蛋白質を使用してシトシン（Ｃ）やアデニン（Ａ）を任意の塩基で置換する技術に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＲＩＳＰＲ酵素が連結されたデアミナーゼ（ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）は、点突然変異が起こった遺伝子部位を校正して遺伝的障害を治療したり、ヒトまたは真核細胞の遺伝子内の標的とする一塩基多型（ＳＮＰ）を誘導したりするために使用されている。

【0003】

現在報告されているＣＲＩＳＰＲ酵素が連結されたデアミナーゼとして、
１）（ｉ）Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の触媒欠損Ｃａｓ９（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９；ｄＣａｓ９）またはＤ１０Ａ Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と、（ｉｉ）ラットのシチジンデアミナーゼであるｒＡＰＯＢＥＣ１とを含むベースエディター（Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒｓ；ＢＥｓ）、
２）（ｉ）ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９と（ｉｉ）ウミヤツメ（ｓｅａ ｌａｍｐｒｅｙ）の活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ（ＡＩＤ））オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）であるＰｍＣＤＡ１またはヒトＡＩＤを含むＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、
３）ＭＳ２－結合蛋白質に融合した過活性化ＡＩＤ変異体を募集するためにＭＳ２ ＲＮＡヘアピンに連結されたｓｇＲＮＡｓとｄＣａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、および
４）ジンク－フィンガー蛋白質または転写活性化因子様エフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ（ＴＡＬＥｓ））がシチジンデアミナーゼに融合したものがある。

【0004】

従来のＤＮＡグリコシラーゼとともに使用されたＣＲＩＳＰＲ酵素が連結されたデアミナーゼは、ヌクレオチド内のシトシン（Ｃ）をチミン（Ｔ）のみに、またはアデニン（Ａ）をグアニン（Ｇ）のみに置換することができる。一例として、Ｃａｓ９、シチジンデアミナーゼ、およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（Ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＵＧＩ））が融合した物質は、シトシン（Ｃ）をチミン（Ｔ）で置換するために使用される。これは、ウラシル（Ｕ）がＤＮＡグリコシラーゼによってウラシルが除去されないように誘導するメカニズムを使用してチミン（Ｔ）に置換されるようにする。同様に、最近シチジンデアミナーゼの代わりにアデノシンデアミナーゼ（または、アデノシンデアミナーゼ）を使用すると、アデニン（Ａ）をグアニン（Ｇ）のみに置換することができることが報告された。

【0005】

そこで、本出願の発明者は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、デアミナーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼを使用した一塩基置換蛋白質を開発し、シトシン（Ｃ）やアデニン（Ａ）を任意の塩基に置換することを意図している。このような技術の開発は、突然変異による遺伝子疾患の究明、ＳＮＰによる疾患感受性に影響を与えたり、薬物に対する耐性を有する核酸配列を分析して薬物開発および治療剤などに使用されることができ、これは今後の薬物開発および治療効果を向上させるのにより一層役立つだろう。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従来のＣＲＩＳＰＲ酵素が連結されたデアミナーゼは、シトシン（Ｃ）やアデニン（Ａ）を特定の塩基（ＡまたはＧ）にのみ変更可能であるという限界を有している。このような限界によって突然変異による遺伝子疾患の究明、ＳＮＰによる疾患感受性、関連治療剤の開発などの研究範囲が制限される。

【0007】

したがって、シトシン（Ｃ）やアデニン（Ａ）を特定の塩基ではない、任意の塩基（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕ）で置換できる手段の開発が切実に求められる。

【0008】

本出願は、一塩基置換蛋白質または一塩基置換複合体、またはそれらを含む一塩基置換組成物およびそれらの用途を提供することを目的とする。

【0009】

また、本出願は、上記一塩基置換蛋白質をコードする核酸配列またはそれを含むベクターを提供することを目的とする。

【0010】

また、本出願は、一塩基置換方法を提供することを目的とする。

【0011】

さらに、本出願は、上記一塩基置換蛋白質または上記一塩基置換複合体、またはそれらを含む一塩基置換組成物の様々な用途を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本出願は、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸を提供する。

【0013】

本出願は、一塩基置換融合蛋白質をコードする核酸を含むベクターを提供する。

【0014】

本出願は、一塩基置換複合体を提供する。

【0015】

本出願は、一塩基置換組成物を提供する。

【0016】

本出願は、一塩基置換方法を提供する。

【0017】

本出願で提供される一塩基置換融合蛋白質、一塩基置換複合体、または一塩基置換組成物を使用して、エピトープスクリーニング、薬物耐性遺伝子または蛋白質スクリーニング、薬物感作スクリーニング、またはウイルス耐性遺伝子または蛋白質スクリーニング用途を提供する。

【0018】

本出願は、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸であって、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、（ｂ）デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、および（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体を含み、ここで、上記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンまたはアデニンを任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸を提供する。

【0019】

本出願は、（ｉ）Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[デアミナーゼ]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、（ｉｉ）Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[デアミナーゼ]－Ｃ末端、（ｉｉｉ）Ｎ末端－[デアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、（ｉｖ）Ｎ末端－[デアミナーゼ]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、（ｖ）Ｎ末端－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[デアミナーゼ]－Ｃ末端、および（ｖｉ）Ｎ末端－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[デアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端のうちいずれか１つの構成を有することを特徴とする、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸を提供する。

【0020】

本出願は、一塩基置換複合体であって、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、（ｂ）デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、および（ｄ）２つ以上の結合ドメインを含み、ここで、上記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンまたはアデニンを任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換複合体を提供する。

【0021】

本出願は、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素、上記デアミナーゼ、および上記ＤＮＡグリコシラーゼは、それぞれ１つ以上の結合ドメインに連結され、ここで、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素、デアミナーゼ、および上記ＤＮＡグリコシラーゼは、上記結合ドメインの間の相互作用を通じて複合体を形成することを特徴とする、一塩基置換複合体を提供する。

【0022】

本出願は、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素、上記デアミナーゼ、および上記ＤＮＡグリコシラーゼのうちいずれか１つ（ｏｎｅ）は、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインに連結され、ここで、上記第１結合ドメインおよび他の構成（ａｎｏｔｈｅｒ）の結合ドメインは相互作用するペアであり、上記第２結合ドメインおよび残りの構成（ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ）の結合ドメインは相互作用するペアであり、このとき、上記ペアによって複合体を形成することを特徴とする、一塩基置換複合体を提供する。

【0023】

本出願は、（ｉ）上記ＣＲＩＳＰＲ酵素、上記デアミナーゼ、および上記ＤＮＡグリコシラーゼから選択される２つの構成と第１結合ドメインを含む第１融合蛋白質と、（ｉｉ）上記選択されなかった残りの１つの構成と第２結合ドメインを含む第２融合蛋白質と、を含み、ここで、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインは相互作用するペアであり、このとき、上記ペアによって複合体を形成する、ことを特徴とする、一塩基置換複合体を提供する。

【0024】

本出願は、（ｉ）上記デアミナーゼ、上記ＤＮＡグリコシラーゼおよび第１結合ドメインを含む第１融合蛋白質と、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素および第２結合ドメインを含む第２融合蛋白質と、を含むことを特徴とする、一塩基置換複合体を提供する。

【0025】

ここで、上記第１結合ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ；ｓｃＦｖ）であり、上記第２融合蛋白質は、少なくとも１つ以上の結合ドメインをさらに含み、ここで、さらに含まれる結合ドメインはＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅであり、このとき、２つ以上の第１融合蛋白質は上記ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅ中のいずれか１つとそれぞれ相互作用することによって複合体を形成することを特徴とする、一塩基置換複合体を提供することができる。

【0026】

本出願は、一塩基置換組成物であって、（ａ）ガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸と、（ｂ）ｉ）第１項の一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸、またはｉｉ）第１３項の一塩基置換複合体と、を含み、ここで、上記ガイドＲＮＡは標的核酸配列と相補的に結合し、上記ガイドＲＮＡと結合される標的核酸配列は１５～２５ｂｐであり、上記一塩基置換融合蛋白質または上記一塩基置換複合体は上記標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）内に存在する１つ以上のシトシンまたはアデニンの任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換組成物を提供することができる。

【0027】

本出願は、１つ以上のベクターを含むことを特徴とする一塩基置換組成物を提供することができる。

【0028】

本出願は、一塩基置換方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ上で標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）に（ｉ）ガイドＲＮＡおよび（ｉｉ）上記第１項の一塩基置換融合蛋白質または上記第１２項の一塩基置換複合体を接触することを含み、上記ガイドＲＮＡは標的核酸配列に相補的に結合し、このとき、上記ガイドＲＮＡと結合される標的核酸配列は１５～２５ｂｐであり、上記一塩基置換融合蛋白質または上記一塩基置換複合体は上記標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）内に存在する１つ以上のシトシンまたはアデニンの任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換方法を提供することができる。

【0029】

このとき、上記デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり、上記ＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体であり、このとき、上記一塩基置換融合蛋白質は標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンを任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸を提供することができる。

【0030】

このとき、上記シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＡＩＤ）またはその変異体であることを特徴とする、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸を提供することができる。

【0031】

このとき、上記デアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり、上記ＤＮＡグリコシラーゼは、アルキラデニン－ＤＮＡグリコシラーゼ（Ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体であり、このとき、上記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるアデニンを任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸を提供することができる。

【0032】

このとき、上記アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ，Ｔａｄ２ｐ，ＡＤＡ，ＡＤＡ１，ＡＤＡ２，ＡＤＡＲ２，ＡＤＡＴ２，ＡＤＡＴ３またはその変異体であることを特徴とする、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸を提供することができる。

【0033】

このとき、上記結合ドメインは、ＦＲＢ ｄｏｍａｉｎ，ＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ），ＥＲＴ ｄｏｍａｉｎｓ，ＶＰＲ ｄｏｍａｉｎ，ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅ，ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）中のいずれか１つ、またはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するドメインのうちいずれか１つであることを特徴とするものを提供することができる。

【0034】

このとき、上記ペアは、（ｉ）ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ、（ｉｉ）第１インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）および第２インテイン、（ｉｉｉ）ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓ、（ｉｖ）ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよびｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）、または（ｖ）ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成する第１ドメインおよび第２ドメインの中から選択されるいずれか１つであることを特徴とする一塩基置換複合体を提供することができる。

【発明の効果】

【0035】

本出願は、一塩基置換蛋白質および／またはそれをコードする核酸を提供する。

【0036】

本出願は、一塩基置換型蛋白質および／またはそれをコードする核酸を含む一塩基置換組成物を提供する。

【0037】

本出願は、一塩基置換蛋白質またはそれを含む一塩基置換用組成物の様々な用途を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1】一塩基置換蛋白質によって標的核酸領域内のＣ（シトシン）がＮ（Ａ，Ｔ，Ｇ）に置換される過程を図式化して示す図である。

【図2】一塩基置換蛋白質によって標的核酸領域内のＡ（アデニン）がＮ（Ｃ，Ｔ，Ｇ）に置換される過程を図式化して示す図である。

【図3】シトシンを任意の塩基への置換を誘導する一塩基置換融合蛋白質の様々な設計構造の例を示す図である。

【図4】アデニンを任意の塩基への置換を誘導する一塩基置換融合蛋白質の様々な設計構造の例を示す図である。

【図5】図５（ａ）はカルボキシル末端に１０個の同じＧＣＮ４ペプチドを融合させたｎＣａｓ９を示す図であり、図５（ｂ）および図５（ｃ）はそれぞれｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｅｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）がＡｐｏｂｅｃとＵＮＧに融合された複合体（ｓｃＦｖ－Ａｐｏｂｅｃ－ＵＮＧ，ｓｃｆｖ－ＵＮＧ－Ａｐｏｂｅｃ）の様々な設計構造を示す図である。

【図6】図６（ａ）はＮ末端およびＣ末端にそれぞれ５個の同じＧＣＮ４ペプチドを融合させたｎＣａｓ９、一方のｓｃＦｖがＡＰＯＢＥＣに融合し、他方のｓｃＦｖがＵＮＧに融合した複合体の設計構造を示す図であり、図６（ｂ）はＣ末端にそれぞれ５個の同じＧＣＮ４ペプチドを融合させたｎＣａｓ９、一方のｓｃＦｖがＡＰＯＢＥＣに融合し、他方のｓｃＦｖがＵＮＧに融合した複合体の設計構造を示す図である。

【図7】図７（ａ）はＢＥ３ ＷＴおよびｂｐＮＬＳ ＢＥ３の設計構造を示すものであり、図７（ｂ）はＨＥＫ ｃｅｌｌでＢＥ３ ＷＴとｂｐＮＬＳ ＢＥ３を使用した一塩基置換効率を示すグラフである。

【図8】ｈｅｌａ ｃｅｌｌでＢＥ３ ＷＴ，ｎｃａｓ－ｄｅｌｔａ ＵＧＩ，ＵＮＧ－ｎｃａｓおよびｎｃａｓ－ＵＮＧを使用したＣ ｔｏ Ｇ、Ｃ ｔｏ Ｔまたは、Ｃ ｔｏ Ａの置換率（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を示すグラフであり、ｎｃａｓ－ｄｅｌｔａ ＵＧＩはＢＥ３ ＷＴからＵＧＩ（ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を除去した蛋白質である。

【図9】標的領域内の塩基置換が誘導される核酸配列（配列番号１）を示しており、そしてｈｅｌａ ｃｅｌｌ内でＢＥ３ ＷＴ，ｂｐＮＬＳ ＢＥ３，ｎｃａｓ－ｄｅｌｔａ ＵＧＩ，ＵＮＧ－ｎｃａｓおよびｎｃａｓ－ＵＮＧを使用した上記核酸配列（配列番号１）内の１５番目に位置したシトシンおよび１６番目に位置したシトシンの塩基置換率（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を示すグラフである。

【図10】ＨＥＫ ｃｅｌｌでＧＸ２０ ｓｇＲＮＡに標的されるｈＥＭＸ１標的核酸配列中の置換されるシトシンを確認したグラフである。

【図11】ＨＥＫ ｃｅｌｌでＵＮＧ－ｎｃａｓおよびｎｃａｓ－ＵＮＧを使用した一塩基置換効率を示すグラフであり、左側図はＧＸ２０ ｓｇＲＮＡに標的されるｈＥＭＸ１標的核酸配列中のＣ ｔｏ Ｎの置換率を示すグラフであり、右側図はＧＸ２０ ｓｇＲＮＡに標的されるｈＥＭＸ１標的核酸配列中の１３Ｃ、１５Ｃ、１６Ｃ、１７ＣにおけるＣ ｔｏ ＧまたはＣ ｔｏ Ａの置換率（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を示すグラフである。

【図12】Ｎｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９がＨＥＫ ｃｅｌｌのＮＧ ＰＡＭでＣ ｔｏ Ｎ塩基置換されるかどうかを確認したグラフである。

【図13】図５の一塩基置換複合体を使用してＣ ｔｏ Ｎ塩基置換されるかどうかを確認したグラフである。

【図14】図５の一塩基置換複合体を使用してＰＣ９細胞でｈＥＭＸ１ ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡに標的される核酸配列中の置換されるシトシンを確認したグラフである。

【図15】図５の一塩基置換複合体を使用してＰＣ９細胞でｈＥＭＸ１ ｓｇＲＮＡに標的される配列中の１６ＣにおけるＣ ｔｏ Ｇ、Ｃ ｔｏ Ｔ、またはＣ ｔｏ Ａの置換率（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を示すグラフである。

【図16】ｎＣａｓ９を使用した一塩基置換蛋白質をコードするプラスミドの設計構造を示す図であり、上記コード化した一塩基置換蛋白質は図３（ａ）の１）に図式化されている。

【図17】Ｎｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９を使用した一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質のプラスミドの設計構造を示す図であり、上記コード化した一塩基置換蛋白質は図３（ｃ）の２）に図式化されている。

【図18】ｎＣａｓ９を使用した一塩基置換蛋白質をコードするプラスミドの設計構造を示す図であり、上記コード化した一塩基置換蛋白質は図３（ａ）の３）に図式化されている。

【図19】図４（ａ）に図式化された一塩基置換蛋白質をコードするプラスミドの設計構造を示す図である。

【図20】図４（ｂ）に図式化された一塩基置換蛋白質をコードするプラスミドの設計構造を示す図である。

【図21】ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）を含む融合塩基置換ドメインの構造を図式化して示す図である。

【図22-24】ＨＥＫ ｃｅｌｌで一塩基置換複合体を使用した一塩基置換効率を示すグラフであり、図２２はＧＸ２０ ｓｇＲＮＡに標的されるｈＥＭＸ１標的核酸配列（配列番号１）内の１１Ｃ、図２３はＧＸ２０ ｓｇＲＮＡに標的されるｈＥＭＸ１標的核酸配列（配列番号１）内の１５Ｃ、図２４はＧＸ２０ ｓｇＲＮＡに標的されるｈＥＭＸ１標的核酸配列（配列番号１）内の１６ＣにおけるＣ ｔｏ Ｇ、Ｃ ｔｏ Ａ、またはＣ ｔｏ Ｇの置換率（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を示すグラフである。

【図25】科学雑誌「ネイチャー」に掲載された「ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ、Ｔ ｔｏ Ｇ、Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」論文でＥｘｔｅｎｄｅｄ Ｄａｔａ Ｆｉｇｕｒｅ２に明示されたｓｇＲＮＡ（配列番号２～２０）のうち３つ（配列番号２、３および１９）を選定した。

【図26】図２５で選定されたｓｇＲＮＡ１（配列番号２）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ ｃｅｌｌでＡ ｔｏ Ｎの塩基置換率（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を示すグラフである。

【図27】図２５で選定されたｓｇＲＮＡ２（配列番号３）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ ｃｅｌｌでＡ ｔｏ Ｎの塩基置換率（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を示すグラフである。

【図28】図２５で選定されたｓｇＲＮＡ３（配列番号１９）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ ｃｅｌｌでＡ ｔｏ Ｎの塩基置換率（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を示すグラフである。

【図29】ＥＧＦＲ遺伝子の一領域と相補的に結合できるｓｇＲＮＡ１（配列番号２１）およびｓｇＲＮＡ２（配列番号２２）を使用してＰＣ９ ｃｅｌｌでＣ ｔｏ Ｎの塩基置換率を示すグラフである。

【図30】ＥＧＦＲ遺伝子の一領域と相補的に結合できるｓｇＲＮＡ１（配列番号２１）およびｓｇＲＮＡ２（配列番号２２）を使用してＰＣ９ ｃｅｌｌでＣ ｔｏ Ａ、Ｃ ｔｏ Ｔ、またはＣ ｔｏ Ｇの塩基置換率を示すグラフである。

【図31】Ｃｙｔｏｓｉｎｅをランダムに塩基置換させた後、オシメルチニブ（Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）を添加した培地で培養して生き残った細胞を分析した結果である。

【発明を実施するための形態】

【0039】

別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同一の方法および物質が本発明の実施または試験において使用されることができるが、適合した方法および物質が以下に記載される。本明細書に言及されたすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参照文献は、全体が参照により組み込まれる。さらに、物質、方法および実施例は単に例示的であり、制限することを意図していない。

【0040】

本出願は、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、（ｂ）デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、および（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体を含む一塩基置換蛋白質を提供する。

【0041】

本出願は、上記一塩基置換蛋白質および（ｄ）ガイドＲＮＡを含む一塩基置換組成物を提供する。

【0042】

このとき、上記一塩基置換蛋白質は、ガイドＲＮＡと同時に作用して標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンまたはアデニンを任意の窒素塩基への置換を誘導することを特徴としてもよい。

【0043】

本出願によって提供される上記一塩基置換蛋白質の（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素および上記（ｄ）ガイドＲＮＡの組み合わせは標的核酸配列を含む標的領域に一塩基置換蛋白質を特異的に導く（ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｔｏ）ことができる。

【0044】

このとき、上記一塩基置換蛋白質の（ｂ）デアミナーゼおよび（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼの組み合わせは標的領域内の１つ以上のヌクレオチドの塩基を他の任意の塩基への置換を誘導することができる。

【0045】

窒素塩基（ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ ｂａｓｅ）
本出願において、窒素塩基とは、ヌクレオチドの一構成要素であるプリン（ｐｕｒｉｎｅ）またはピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）系列の塩基、または核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）を意味する。

【0046】

本出願において、窒素塩基は塩基と略称することができ、塩基とは、アデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ，Ａ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ，Ｔ）、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ，Ｕ）、ヒポザンチン（ｈｙｐｏｚａｎｔｈｉｎｅ，Ｈ），グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ，Ｇ）、またはシトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ，Ｃ）を意味することができる。

【0047】

本出願において、上記塩基の略称であるＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，ＵまたはＨは、塩基置換に関する内容についての時は上記窒素塩基を意味し、その他には一般的な核酸またはヌクレオチド配列に関する内容であるか、または明細書で別に設定した配列番号（Ｓｅｑ ＩＤ ＮＯ．：）に関するものである場合は、当業界で慣用される核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）またはヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に対する表現で使用される。

【0048】

一例として、「アデニン（Ａ）がグアニン（Ｇ）で置換される」とは、核酸配列上の同じ位置または同じ種類のヌクレオチド内の窒素塩基がＡからＧに置換されることを意味し得る。

【0049】

一例として、「アデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）で置換される」とは、核酸配列上の同じ位置または同じ種類のヌクレオチド内の窒素塩基がＡからＴに置換されることを意味し得る。

【0050】

一例として、「アデニン（Ａ）がシトシン（Ｃ）で置換される」とは、核酸配列上の同じ位置または同じ種類のヌクレオチド内の窒素塩基がＡからＣに置換されることを意味し得る。

【0051】

一例として、「シトシン（Ｃ）がグアニン（Ｇ）で置換される」とは、核酸配列上の同じ位置または同じ種類のヌクレオチド内の窒素塩基がＣからＧに置換されることを意味し得る。

【0052】

一例として、「シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）で置換される」とは、核酸配列上の同じ位置または同じ種類のヌクレオチド内の窒素塩基がＣからＴに置換されることを意味し得る。

【0053】

一例として、「シトシン（Ｃ）がアデニン（Ａ）で置換される」とは、核酸配列上の同じ位置または同じ種類のヌクレオチド内の窒素塩基がＣからＡに置換されることを意味し得る。

【0054】

一例として、「３’－ＡＴＧＣＡＡＡ－５’」は、窒素塩基そのものを意味するのではなく、当業界で慣用される核酸配列またはヌクレオチド配列を示すものである。

【0055】

塩基置換（Ｂａｓｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または塩基変形（Ｂａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
本出願において、「塩基置換（ｂａｓｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、標的遺伝子内のヌクレオチドの塩基が他の任意の塩基で置換されることである。より具体的に、標的領域内のヌクレオチドの塩基が他の任意の塩基で置換されることである。

【0056】

一例として、塩基置換は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ，Ａ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ，Ｇ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ，Ｃ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ，Ｔ）、ヒポザンチン（Ｈｙｐｏｚａｎｔｈｉｎｅ）またはウラシル（ｕｒａｃｉｌ，Ｕ）が他の任意の塩基に変更されることを意味し得る。

【0057】

一実施例では、アデニンがシトシン、チミン、ウラシル、ヒポザンチン、またはグアニンで置換されることを意味し得る。

【0058】

一実施例では、シトシンがアデニン、チミン、ウラシル、ヒポザンチン、またはグアニンで置換されることを意味し得る。

【0059】

一実施例では、グアニンがシトシン、チミン、ウラシル、ヒポザンチン、またはアデニンで置換されることを意味し得る。

【0060】

一実施例では、チミンがアデニン、シトシン、ウラシル、ヒポザンチン、またはグアニンで置換されることを意味し得る。

【0061】

一実施例では、ウラシルがシトシン、チミン、アデニン、ヒポザンチン、またはグアニンで置換されることを意味し得る。

【0062】

一実施例では、ヒポザンチンがアデニン、チミン、ウラシル、シトシン、またはグアニンで置換されることを意味し得る。

【0063】

ただし、これらに限定されない。

【0064】

本出願において、「塩基置換」とは、「塩基変形（Ｂａｓｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」を含む概念であり得る。このとき、変形は塩基の構造が変形されることによって他の塩基に変更されることを、塩基置換は塩基の種類が変更されることを意味し得る。

【0065】

一例として、塩基変形は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ，Ａ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ，Ｇ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ，Ｃ）、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ，Ｔ）、ヒポザンチン（Ｈｙｐｏｚａｎｔｈｉｎｅ）、またはウラシル（ｕｒａｃｉｌ，Ｕ）の化学構造が変形されることである。

【0066】

一実施例では、アデニンが脱アミン化されてヒポザンチンに変形することであり得る。

【0067】

一実施例では、ヒポザンチンがグアニンに変形することであり得る。

【0068】

一実施例では、シトシンが脱アミン化されてウラシルに変形することであり得る。

【0069】

一実施例では、ウラシルがチミンに変形することであり得る。

【0070】

ただし、これらに限定されない。

【0071】

標的核酸配列－ガイドＲＮＡと相補的に結合する核酸配列

【0072】

標的核酸配列は、一塩基置換組成物の一構成要素であるガイドＲＮＡと相補的に結合したりすることができるヌクレオチド配列を意味する。

【0073】

一例として、細胞内二本鎖ＤＮＡを一塩基置換の対象とする場合、上記細胞内二本鎖ＤＮＡは第１ＤＮＡ鎖および第２ＤＮＡ鎖で構成されている。このとき、上記二本鎖ＤＮＡの第１ＤＮＡ鎖および上記第１ＤＮＡ鎖と相補的な第２ＤＮＡ鎖のうちいずれか１つは標的核酸配列を含むことができる。上記標的核酸配列を含む第１または第２ＤＮＡ鎖は上記ガイドＲＮＡと結合することができる。このとき、上記ガイドＲＮＡと結合した第１または第２ＤＮＡ鎖内の核酸配列が標的核酸配列に相当する。

【0074】

一例として、細胞内二本鎖ＲＮＡを一塩基置換の対象とする場合、上記細胞内二本鎖ＲＮＡは第１ＲＮＡ鎖および第２ＲＮＡ鎖で構成されている。上記二本鎖ＲＮＡの第１ＲＮＡ鎖および上記第１ＲＮＡ鎖と相補的な第２ＲＮＡ鎖のうちいずれか１つは標的核酸配列を含むことができる。上記標的核酸配列を含む第１または第２ＲＮＡ鎖は上記ガイドＲＮＡと結合することができる。このとき、上記ガイドＲＮＡと結合した第１または第２ＲＮＡ鎖内の核酸配列が標的核酸配列に相当する。

【0075】

一例として、細胞内一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを一塩基置換の対象とする場合、、上記一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは標的核酸配列を含むことができる。すなわち、上記一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡはガイドＲＮＡと結合でき、このとき、上記ガイドＲＮＡと結合した核酸配列が標的核酸配列に相当する。

【0076】

一例として、標的核酸配列は、１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９または３０ｂｐ以上のヌクレオチド配列であり得る。

【0077】

標的領域（ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）－塩基置換されるヌクレオチドを含む領域
標的領域は、一塩基置換蛋白質によって塩基置換が誘導されるヌクレオチドを含む領域である。

【0078】

標的領域は、ガイドＲＮＡが結合する標的核酸配列を含む領域である。このとき、上記標的核酸配列は、一塩基置換蛋白質によって塩基置換が誘導されるヌクレオチドを含むことができる。

【0079】

標的領域は、ガイドＲＮＡと相補的に結合する第１ＤＮＡ鎖内の標的核酸配列と相補的に結合する第２ＤＮＡ鎖内の核酸配列を含むことができる。このとき、上記第２ＤＮＡ鎖内の核酸配列は、一塩基置換蛋白質によって塩基置換が誘導されるヌクレオチドを含むことができる。

【0080】

一例として、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ中の上記標的核酸配列を含む鎖を第１鎖とし、上記核酸配列を含まない鎖を第２鎖と称することができる。このとき、標的領域は、上記第１鎖内のガイドＲＮＡと相補的に結合する標的核酸配列および上記標的核酸配列と相補的に結合する上記第２鎖内の核酸配列を含むことができる。

【0081】

一例として、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ中の上記標的核酸配列を含む鎖を第２鎖とし、上記核酸配列を含まない鎖を第１鎖と称することができる。このとき、標的領域は、上記第２鎖内のガイドＲＮＡと相補的に結合する標的核酸配列および上記標的核酸配列と相補的に結合する上記第１鎖内の核酸配列を含むことができる。

【0082】

一塩基置換蛋白質は、上記標的領域内の１つ以上のヌクレオチドの塩基置換を誘導することができる。

【0083】

一例として、ガイドＲＮＡが二本鎖ＤＮＡの第１ＤＮＡ鎖に含まれる標的核酸配列と相補的に結合する場合、一塩基置換蛋白質は、（ｉ）上記標的核酸配列内の１つ以上のヌクレオチドの塩基を置換するか、または（ｉｉ）上記二本鎖ＤＮＡの第２鎖内の上記標的核酸配列と相補的に結合する核酸配列内の１つ以上のヌクレオチドの塩基を置換することができる。

【0084】

一例として、ガイドＲＮＡが二本鎖ＲＮＡの第１ＲＮＡ鎖に含まれる標的核酸配列と相補的に結合する場合、一塩基置換蛋白質は、（ｉ）上記標的核酸配列内の１つ以上のヌクレオチドの塩基を置換するか、または（ｉｉ）上記二本鎖ＲＮＡの第２鎖内の上記標的核酸配列と相補的に結合する核酸配列内の１つ以上のヌクレオチドの塩基を置換することができる。

【0085】

一実施例では、上記標的核酸領域内の１つ以上のヌクレオチドのシトシンをグアニン、チミン、ウラシル、ヒポザンチン、またはアデニンで置換することができる。

【0086】

一実施例では、上記標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドのアデニンをグアニン、チミン、ウラシル、ヒポザンチン、またはシトシンで置換することができる。

【0087】

本明細書において、標的遺伝子とは、標的領域および標的核酸配列を含む遺伝子を意味する。また、本明細書において、標的遺伝子とは、一塩基置換蛋白質によって標的領域内の１つ以上のヌクレオチドのシトシン塩基が任意の塩基で置換される遺伝子を意味する。

【0088】

技術的特徴－任意の塩基への置換
本出願で提供される一塩基置換蛋白質は、（ｉ）デアミナーゼおよび（ｉｉ）ＤＮＡグリコシラーゼを必要構成要素として含む。

【0089】

一塩基置換蛋白質の第１構成であるデアミナーゼと第２構成であるＤＮＡグリコシラーゼの組み合わせは、核酸配列内のヌクレオチドの塩基を任意の塩基への置換を誘導することができる。

【0090】

このとき、上記デアミナーゼおよび上記ＤＮＡグリコシラーゼによる塩基置換は、次の二段階、（ｉ）塩基の脱アミン化（Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）、および／または（ｉｉｉ）ＤＮＡグリコシラーゼによる切断または修復工程が順次または同時に進行した結果であり得る。

【0091】

第１工程：塩基の脱アミン化（Ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）
脱アミン化とは、アミノ基の切断を伴う生化学反応を意味する。一例として、ＤＮＡの場合、ヌクレオチドの一構成要素である塩基のアミノ基をヒドロキシ基またはケトン基に変えることを意味し得る。

【0092】

一実施例では、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり得る。上記シチジンデアミナーゼは、シトシンを脱アミン化してウラシルを提供することができる。上記シチジンデアミナーゼは、シトシンを変形させてウラシルを提供することができる。

【0093】

【0094】

一実施例では、一塩基置換蛋白質のデアミナーゼはアデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり得る。上記アデノシンデアミナーゼは、アデニンを脱アミン化してヒポザンチン（ｈｙｐｏｚａｎｔｈｉｎｅ）を提供することができる。上記アデノシンデアミナーゼは、アデニンを変形させてヒポザンチンを提供することができる。

【0095】

【0096】

一実施例では、デアミナーゼはグアニンデアミナーゼ（ｇｕａｎｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり得る。上記グアニンデアミナーゼは、グアニンを脱アミン化してキサンチン（ｘａｎｔｉｎｅ）を提供することができる。上記グアニンデアミナーゼは、グアニンを変形させてキサンチンを提供することができる。

【0097】

【0098】

第２工程：ＤＮＡのグリコシル化
ＤＮＡグリコシラーゼは、塩基除去修復（Ｂａｓｅ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｒｅｐａｉｒ，ＢＥＲ）に関与する酵素であり、ＢＥＲはＤＮＡの損傷した塩基を除去して交換するメカニズムである。ＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡ内の塩基とデオキシリボース（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）の間のＮ－グリコシド結合（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を加水分解して上記メカニズムの最初の段階を触媒する。ＤＮＡグリコシラーゼは、ｓｕｇａｒ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を残したまま、損傷した窒素塩基（ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ ｂａｓｅ）を除去する。その結果、ＡＰ付着部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）、具体的には無プリン部位（ａｐｕｒｉｎｉｃ ｓｉｔｅ）またはアピリミジン部位（ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｓｉｔｅ）が作られる。その後、ＡＰエンドヌクレアーゼ（ＡＰ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、末端処理酵素（Ｅｎｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、フラップ エンドヌクレアーゼ（Ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）、および／またはＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ）によって任意の塩基に置換することができる。

【0099】

一実施例では、ＤＮＡグリコシラーゼはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）であり得る。上記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡ内のウラシルとデオキシリボースの間のＮ－グリコシド結合（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を加水分解する。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシルを含むヌクレオチド内のウラシルとデオキシリボースの間のＮ－グリコシド結合を加水分解する。このとき、上記ウラシルを含むヌクレオチドは、シトシンを含むヌクレオチドにシチジンデアミナーゼが作動して脱アミン化され、提供されたものであってもよい。

【0100】

一実施例では、ＤＮＡグリコシラーゼはアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ（Ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）であり得る。上記アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡ内のヒポザンチンとデオキシリボースの間のＮ－グリコシド結合（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を加水分解する。アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼは、ヒポザンチンを含むヌクレオチド内のヒポザンチンとデオキシリボースの間のＮ－グリコシド結合を加水分解する。このとき、上記ヒポザンチンを含むヌクレオチドは、アデニンを含むヌクレオチドにアデノシンデアミナーゼが作動して脱アミン化され、提供されたものであってもよい。

【0101】

上記第１および第２工程の結果
本出願で提供される一塩基置換蛋白質を使用して標的領域内の１つ以上のアデニンまたはシトシンを任意の塩基で置換することができる。

【0102】

一例として、一塩基置換蛋白質のデアミナーゼはアデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり、ＤＮＡグリコシラーゼはアルキラデニン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体であり得る。このとき、上記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドのアデニンを任意の塩基（グアニン、チミン、シトシン）への置換を誘導することができる。

【0103】

一実施例では、標的領域内の１つ以上のヌクレオチド内のアデニンは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、（ｂ）アデノシンデアミナーゼ、および（ｃ）アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼを含む一塩基置換蛋白質によってシトシンへの置換を誘導することができる。

【0104】

【0105】

一実施例では、標的領域内の１つ以上のヌクレオチド内のアデニンは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、（ｂ）アデノシンデアミナーゼ、および（ｃ）アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼを含む一塩基置換蛋白質によってチミンへの置換を誘導することができる。

【0106】

【0107】

一実施例では、標的領域内の１つ以上のヌクレオチド内のアデニンは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、（ｂ）アデノシンデアミナーゼ、および（ｃ）アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼを含む一塩基置換蛋白質によってグアニンへの置換を誘導することができる。

【0108】

【0109】

一例として、一塩基置換蛋白質のデアミナーゼはシチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり、ＤＮＡグリコシラーゼはウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体であり得る。このとき、上記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドのシトシンを任意の塩基への置換を誘導することができる。

【0110】

一実施例では、標的領域内の１つ以上のヌクレオチド内のシトシンは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、（ｂ）シチジンデアミナーゼ、および（ｃ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを含む一塩基置換蛋白質によってアデニンへの置換を誘導することができる。

【0111】

【0112】

一実施例では、標的領域内の１つ以上のヌクレオチド内のシトシンは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、（ｂ）シチジンデアミナーゼ、および（ｃ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを含む一塩基置換蛋白質によってチミンへの置換を誘導することができる。

【0113】

【0114】

一実施例では、標的領域内の１つ以上のヌクレオチド内のシトシンは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、（ｂ）シチジンデアミナーゼ、および（ｃ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼを含む一塩基置換蛋白質によってグアニンへの置換を誘導することができる。

【0115】

【0116】

以下、詳細に説明する。

【0117】

本明細書によって開示される発明の一態様は一塩基置換蛋白質である。

【0118】

一塩基置換蛋白質は、一塩基置換を誘導または発生させることができる蛋白質、ポリペプチド、またはペプチドである。

【0119】

従来のベースエディターの限界
従来のベースエディター（Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ）は、デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）が融合、連結または結合した形態で使用されてきた。代表的な一例として、ラットのシチジンデアミナーゼであるｒＡＰＯＢＥＣと、ｎＣａｓ９およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼを結合したベースエディターを使用して、シトシン塩基をチミンに置換した。また、シチジンデアミナーゼの代わりにアデノシンデアミナーゼを使用してアデニン（Ａ）をグアニン（Ｇ）に置換した。

【0120】

従来のベースエディターは、点突然変異によって発生する疾患を治療するために使用することができる。例えば、遺伝子内の点突然変異発生部位を校正して遺伝的障害を治療するために使用するなど、有意な点がある。ただし、従来のベースエディターは、ＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を使用することによってアミノ基（－ＮＨ_２）を除去するか、アミノ基をケト基で置換することによって、シトシン（Ｃ）を特定の塩基チミン（Ｔ）にのみ、またはアデノシン（Ａ）を特定の塩基グアニン（Ｇ）にのみ変更可能という限界を有している。

【0121】

一塩基置換蛋白質の有用性
従来のベースエディターは、それを使用して置換された塩基から発現されるアミノ酸の種類が変わる可能性が低いという限界がある。ほとんどの疾患または病気は点突然変異によるものではなく、ヌクレオチドレベルを越えてペプチド、ポリペプチド、または蛋白質のレベルで構造や機能に異常が生じることによって発生する場合が多い。最終的に、従来のベースエディターは、アデニンおよびシトシンを特定の塩基にしか変更することができないため、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質の構造が変わる可能性が著しく低下する。

【0122】

従来技術の限界は、本明細書によって提供される一塩基置換蛋白質を使用して克服することができる。本出願で提供される一塩基置換蛋白質は、（ａ）エディター蛋白質、（ｂ）デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、および（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）からなる新規な組み合わせを有する。すなわち、本出願で提供する一塩基置換蛋白質は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）を任意の塩基（Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕ，Ｈ）で置換できるという利点がある。

【0123】

また、上記新規な構成要素および新規な組み合わせの一塩基置換蛋白質は、標的核酸配列内に存在する１つ以上の塩基を同時に置換できるという利点がある。

【0124】

結局のところ、本出願で提供する一塩基置換蛋白質は、様々な塩基がランダムに置換された「突然変異」を提供することができる。上記突然変異された遺伝子から様々な構造を有するペプチド、ポリペプチド、または蛋白質を発現することができる。

【0125】

上記の技術的効果により、本出願で提供する一塩基置換蛋白質は、エピトープスクリーニング、薬物耐性遺伝子または蛋白質スクリーニング、薬物感作スクリーニング、および／またはウイルス耐性遺伝子または蛋白質スクリーニング用途で使用することができる。

【0126】

本出願で提供する一塩基置換蛋白質は、ガイドＲＮＡとともに使用することによって標的遺伝子の標的領域内の塩基を任意の塩基への置換を誘導することができる。

【0127】

＜一塩基置換蛋白質の第１構成－デアミナーゼ＞
デアミナーゼは、脱アミノ酵素を意味し、化合物のアミノ基をヒドロキシ基またはケトン基に変える酵素を総称する。シトシン、アデニン、グアニン、アデノシン、シチジン、ＡＭＰ、ＡＤＰなどに結合するアミノ基をそれぞれ加水分解する酵素が存在し、このような酵素は一般的に動物組織に含まれている。

【0128】

本出願の明細書において、デアミナーゼは塩基置換ドメインと呼ばれることもある。このとき、塩基置換ドメインは、標的遺伝子内の１つ以上のヌクレオチドの塩基を他の任意の塩基で置換するのに関与するペプチド、ポリペプチド、ドメイン、蛋白質を意味する。

【0129】

本出願のデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼであり得る。
このとき、上記シチジンデアミナーゼは、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、シチジン（ｃｙｔｉｄｉｎｅ）、またはデオキシシチジン（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）のアミノ（－ＮＨ_２）基を除去する活性を有するすべての酵素を意味する。本明細書で上記シチジンデアミナーゼはシトシンデアミナーゼを含む概念として使用される。本明細書で上記シチジンデアミナーゼは上記シトシンデアミナーゼと組み合わせて使用されることもある。

【0130】

上記シチジンデアミナーゼは、シトシンをウラシル（ｕｒａｃｉｌ）に変える可能性がある。

【0131】

上記シチジンデアミナーゼは、シチジンをウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）に変える可能性がある。

【0132】

上記シチジンデアミナーゼは、デオキシシチジンをデオキシウリジン（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）に変える可能性がある。

【0133】

シチジンデアミナーゼは、ヌクレオチドに存在する塩基であるシトシン（例えば、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに存在するシトシン）をウラシルに変換（Ｃ－ｔｏ－Ｕ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｒ Ｃ－ｔｏ－Ｕ ｅｄｉｔｉｎｇ）させる活性を有するすべての酵素を意味することで、標的部位の配列（標的核酸配列）のＰＡＭ配列が存在する鎖に位置するシトシンをウラシルに変換する。

【0134】

一例として、シチジンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの原核生物、またはヒトやサルなどの霊長類、ラットやマウスなどのげっ歯類などのような哺乳類から由来したものであってもよいが、これに限定されない。例えば、上記シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ（「ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｍＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ，ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｉｋｅ」）または活性－誘導シチジンデアミナーゼ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ，ＡＩＤ）ファミリーに属する酵素から選択された１つ以上であり得る。

【0135】

上記シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、ＡＩＤまたはＣＤＡであり得るが、これらに限定されない。

【0136】

例えば、上記シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ１、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００５８８９，ＮＭ＿００１３０４５６６，ＮＭ＿００１６４４などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ１、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２９１４９５，ＮＰ＿００１６３５，ＮＰ＿００５８８０などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0137】

例えば、上記シチジンデアミナーゼは、マウスＡＰＯＢＥＣ１、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１２７８６３，ＮＭ＿１１２４３６などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記シチジンデアミナーゼは、マウスＡＰＯＢＥＣ１、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１２７８６３，ＮＰ＿１１２４３６などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0138】

例えば、上記シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＩＤ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２０６６１，ＮＭ＿００１３３０３４３などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＩＤ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１３１７２７２，ＮＰ＿０６５７１２などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0139】

以下、シチジンデアミナーゼの一例を挙げる。

【0140】

ＡＰＯＢＥＣ１：ヒトＡＰＯＢＥＣ１（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２９１４９５，ＮＰ＿００１６３５，ＮＰ＿００５８８０）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００５８８９，ＮＭ＿００１３０４５６６，ＮＭ＿００１６４４と表現されるＡＰＯＢＥＣ１遺伝子、またはマウスＡＰＯＢＥＣ１（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１２７８６３，ＮＰ＿１１２４３６）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１２７８６３，ＮＭ＿１１２４３６と表現されるＡＰＯＢＥＣ１遺伝子。

【0141】

ＡＰＯＢＥＣ２：ヒトＡＰＯＢＥＣ２（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００６７８０）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００６７８９と表現されるＡＰＯＢＥＣ２遺伝子、またはマウスＡＰＯＢＥＣ２（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３３８２４）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００９６９４と表現されるＡＰＯＢＥＣ２遺伝子。

【0142】

ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ：ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２５７３４０，ＮＰ＿００４８９１）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００４９００，ＮＭ＿００１２７０４１１と表現されるＡＰＯＢＥＣ３Ｂ遺伝子、またはマウスＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１５３８８７，ＮＰ＿００１３３３９７０，ＮＰ＿０８４５３１）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１６０４１５，ＮＭ＿０３０２５５，ＮＭ＿００１３４７０４１と表現されるＡＰＯＢＥＣ３Ｂ遺伝子。

【0143】

ＡＰＯＢＥ３Ｃ：ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｃ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０５５３２３）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４５０８と表現されるＡＰＯＢＥＣ３Ｃ遺伝子。

【0144】

ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ：ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿６８９６３９，ＮＰ＿００１３５７０７１０）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１５２４２６，ＮＭ＿００１３６３７８１と表現されるＡＰＯＢＥＣ３Ｄ遺伝子。

【0145】

ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ：ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｆ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１００６６６７，ＮＰ＿６６０３４１）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１００６６６６，ＮＭ＿１４５２９８と表現されるＡＰＯＢＥＣ３Ｆ遺伝子。

【0146】

ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ：ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０６８５９４，ＮＰ＿００１３３６３６５，ＮＰ＿００１３３６３６６，ＮＰ＿００１３３６３６７）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２１８２２と表現されるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ遺伝子。

【0147】

ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ：ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１５９４７４，ＮＰ＿００１１５９４７５，ＮＰ＿００１１５９４７６，ＮＰ＿８６１４３８）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１６６００２，ＮＭ＿００１１６６００３，ＮＭ＿００１１６６００４，ＮＭ＿１８１７７３と表現されるＡＰＯＢＥＣ３Ｈ遺伝子。

【0148】

ＡＰＯＢＥＣ４：ヒトＡＰＯＢＥＣ４（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿９８２２７９）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿２０３４５４と表現されるＡＰＯＢＥＣ４遺伝子、またはマウスＡＰＯＢＥＣ４をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０８１１９７と表現されるＡＰＯＢＥＣ４遺伝子。

【0149】

上記シチジンデアミナーゼは、活性－誘導シチジンデアミナーゼ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ，ＡＩＤ）遺伝子から発現することができる。例えば、ＡＩＤ遺伝子は、ヒトＡＩＤ遺伝子（ｅ．ｇ．，ＮＰ＿００１３１７２７２，ＮＰ＿０６５７１２）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２０６６１，ＮＭ＿００１３３０３４３と表現されるＡＩＤ遺伝子、またはマウスＡＩＤ遺伝子（ｅ．ｇ．，ＮＰ＿０３３７７５１２）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００９６４５と表現されるＡＩＤ遺伝子からなる群より選択されるが、これらに限定されない。

【0150】

上記シチジンデアミナーゼは、ＣＤＡ遺伝子からコード化することができる。例えば、ＣＤＡ遺伝子は、ヒトＣＤＡ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１７７６）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１７８５と表現されるＣＤＡ遺伝子、またはマウスＣＤＡ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０８２４５２）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２８１７６と表現されるＣＤＡ遺伝子からなる群より選択されるが、これらに限定されない。

【0151】

上記シチジンデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼ変異体であり得る。

【0152】

上記シチジンデアミナーゼ変異体は、野生型シチジンデアミナーゼよりもシチジンデアミナーゼ活性（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が増加した酵素であり得る。シチジンデアミナーゼ活性は、シトシンまたはその類似体のうちの１つの脱アミノ酸反応を含むと理解される。

【0153】

例えば、シチジンデアミナーゼ変異体は、上記シチジンデアミナーゼ内の１つ以上のアミノ酸配列が変形された酵素であり得る。

【0154】

このとき、アミノ酸配列の変形は、アミノ酸の置換、欠失および挿入から選択されるいずれか１つであり得る。

【0155】

本出願のデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼであり得る。
アデノシンデアミナーゼは、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、またはデオキシアデノシン（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）のアミノ（－ＮＨ_２）基の除去またはケト（＝Ｏ）基で置換する活性を有するすべての酵素を意味する。本明細書において、上記アデノシンデアミナーゼはアデニンデアミナーゼを含む概念として使用される。本明細書において、上記アデノシンデアミナーゼは上記アデニンデアミナーゼを含む概念として使用される。

【0156】

上記アデノシンデアミナーゼは、アデニンをヒポザンチン（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）に変える可能性がある。

【0157】

上記アデノシンデアミナーゼは、アデノシンニンをイノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）に変える可能性がある。

【0158】

上記アデノシンデアミナーゼは、デオキシアデノシンをテオクシイノシン（ｄｅｏｘｙｉｎｏｓｉｎｅ）に変える可能性がある。

【0159】

アデノシンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの原核生物、またはヒトやサルなどの霊長類、ラットやマウスなどのげっ歯類などのような哺乳類から由来したものであってもよいが、これに限定されない。例えば、上記アノシンデアミナーゼはＴａｄＡ（ｔＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）またはＡＤＡ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）ファミリーに属する酵素から選択される１つ以上であり得る。

【0160】

上記アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ，Ｔａｄ２ｐ，ＡＤＡ，ＡＤＡ１，ＡＤＡ２，ＡＤＡＲ２，ＡＤＡＴ２またはＡＤＡＴ３であってもよいが、これらに限定されない。

【0161】

例えば、上記アデノシンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴａｄＡ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３．３などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記アデノシンデアミナーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＴａｄＡ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿４１７０５４．２などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0162】

例えば、上記アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００００２２，ＮＭ＿００１３２２０５０，ＮＭ＿００１３２２０５１などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００００１３，ＮＰ＿００１３０８９７９，ＮＰ＿００１３０８９８０などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0163】

例えば、上記アデノシンデアミナーゼは、マウスＡＤＡ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２７２０５２，ＮＭ＿００７３９８などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記アデノシンデアミナーゼは、マウスＡＤＡ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２５８９８１，ＮＰ＿０３１４２４などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0164】

例えば、上記アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＲ２、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０３３０４９，ＮＭ＿００１１１２，ＮＭ＿００１１６０２３０，ＮＭ＿０１５８３３，ＮＭ＿０１５８３４などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＲ２、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１０３，ＮＰ＿００１１５３７０２，ＮＰ＿００１３３３６１６，ＮＰ＿００１３３３６１７，ＮＰ＿０５６６４８などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0165】

例えば、上記アデノシンデアミナーゼは、マウスＡＤＡＲ２、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０２４８３７，ＮＭ＿００１０２４８３８，ＮＭ＿００１０２４８３９，ＮＭ＿００１０２４８４０，ＮＭ＿１３０８９５などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記アデノシンデアミナーゼは、マウスＡＤＡＲ２、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０２０００８，ＮＰ＿５７０９６５，ＮＰ＿００１０２０００９などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0166】

例えば、上記アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＴ２、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１８２５０３．３，ＮＭ＿００１２８６２５９．１などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＴ２、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２７３１８８．１，ＮＰ＿８７２３０９．２などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0167】

上記アデノシンデアミナーゼは、ａｄＡ ｖａｒｉａｎｔｓ、ＡＤＡＲ２ ｖａｒｉａｎｔｓおよびＡＤＡＴ２ ｖａｒｉａｎｔｓ中のいずれか１つであってもよいが、これらに限定されない。

【0168】

例えば、ＡＤＡＲ２ ｖａｒｉａｎｔｓは、以下のものからなる群より選択される１つ以上であってもよいが、これらに限定されない。ヒトＡＤＡＲ２をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１２８２２２５，ＮＭ＿００１２８２２２６，ＮＭ＿００１２８２２２７，ＮＭ＿００１２８２２２８，ＮＭ＿００１２８２２２９，ＮＭ＿０１７４２４，ＮＭ＿１７７４０５等で表現されるＣＤＡ遺伝子であり得る。

【0169】

上記アデノシンデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ変異体であり得る。

【0170】

上記アデノシンデアミナーゼ変異体は、野生型アデノシンデアミナーゼよりもアデノシンデアミナーゼ活性（ａｄｅｎｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が増加した酵素であり得る。

【0171】

例えば、アデノシンデアミナーゼ変異体は、上記アデノシンデアミナーゼ内の１つ以上のアミノ酸配列が変形された酵素であり得る。

【0172】

上記アデノシンデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ変異体であり得る。

【0173】

上記アデノシンデアミナーゼ変異体は、野生型アデノシンデアミナーゼよりもアデノシンデアミナーゼ活性（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が増加した酵素であり得る。このとき、上記アデノシンデアミナーゼ活性は、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、デオキシアデノシン（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ）またはその類似体のアミノ（－ＮＨ_２）基の除去またはケト（＝Ｏ）基による置換反応を含んでもよいが、これに限定されない。

【0174】

上記アデノシンデアミナーゼ変異体は、野生型アデノシンデアミナーゼを構成するアミノ酸配列から選択される１つ以上のアミノ酸配列が変形された酵素であり得る。

【0175】

このとき、アミノ酸配列の変形は、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および挿入から選択されるいずれか１つであり得る。

【0176】

上記アデノシンデアミナーゼ変異体は、ＴａｄＡ変異体、Ｔａｄ２ｐ変異体、ＡＤＡ変異体、ＡＤＡ１変異体、ＡＤＡ２変異体、ＡＤＡＲ２変異体、ＡＤＡＴ２変異体、またはＡＤＡＴ３変異体であってもよいが、これらに限定されない。

【0177】

例えば、上記アデノシンデアミナーゼはＴａｄＡ変異体であり得る。一例として、上記ＴａｄＡ変異体は、ＡＢＥ０．１，ＡＢＥ１．１，ＡＢＥ１．２，ＡＢＥ２．１，ＡＢＥ２．９，ＡＢＥ２．１０，ＡＢＥ３．１，ＡＢＥ４．３，ＡＢＥ５．１，ＡＢＥ５．３，ＡＢＥ６．３，ＡＢＥ６．４，ＡＢＥ７．４，ＡＢＥ７．８，ＡＢＥ７．９またはＡＢＥ７．１０であり得、上記ＴａｄＡ変異体に対する具体的な内容は、論文「ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ、Ｔ ｔｏ Ｃ、Ｇ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」（Ｎｉｃｏｌｅ Ｍ．Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ、５５１，４６４－４７１）に詳しく記載されているので、当該文献を参照にすることができる。

【0178】

上記アデノシンデアミナーゼは、融合アデノシンデアミナーゼであり得る。

【0179】

本出願で提供されるデアミナーゼ、例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼは、１つ以上の機能的ドメインが連結されて融合した形態で提供されることができる。

【0180】

このとき、上記デアミナーゼおよび上記機能的ドメインは、それぞれの機能が発現されるように連結または融合したものであり得る。

【0181】

アデノシンディアアデノシンディアアデノシンディア上記機能的ドメインは、メチラーゼ（ｍｅｔｈｙｌａｓｅ）活性、ジメチラーゼ（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）活性、転写促進（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）活性、転写阻害（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）活性、転写放出因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｆａｃｔｏｒ）活性、ヒストン変形（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）活性、ＲＮＡ切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）活性、または核酸結合（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）活性を有するドメインであってもよく、または、蛋白質（ペプチドを含む）の分離精製のためのタグ（ｔａｇ）またはレポーター遺伝子であってもよいが、これに限定されない。

【0182】

上記機能的ドメインは、蛋白質（ペプチドを含む）の分離精製のためのタグ（ｔａｇ）またはレポーター遺伝子であり得る。

【0183】

このとき、上記タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグのうちいずれか１つを含むことができる。このとき、上記レポーター遺伝子は、自己蛍光蛋白質、例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素（ＨＲＰ）、クロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、青緑色蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）、および青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）中のいずれか１つを含むことができる。ただし、これらに限定されない。

【0184】

上記機能的ドメインは、核局在化配列またはシグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｓｉｇｎａｌ；ＮＬＳ）または核外輸送配列またはシグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｓｉｇｎａｌ；ＮＥＳ）であり得る。

【0185】

このとき、上記ＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ末端またはその近傍、カルボキシ末端またはその近傍、またはそれらの組み合わせに１つ以上のＮＬＳを含むことができる。上記ＮＬＳは、以下に由来するＮＬＳ配列であってもよいが、これらに限定されない。アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２３）を有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ－抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ）からのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２４）を有するヌクレオプラスミン二分割（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２５）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２６）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２７）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２８）、マイオマ（ｍｙｏｍａ）Ｔ蛋白質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２９）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３０）、ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ（配列番号３１）、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３２）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号３３）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３４）、感染性ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３５）、マウスＭｘ１蛋白質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３６）、ヒトポリ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３７）、およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３８）中から選択されるいずれか１つ以上であり得る。

【0186】

上記機能的ドメインは、他のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質と複合体を形成することができるようにする結合ドメインであり得る。

【0187】

上記結合ドメインは、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）、ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよびｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）のうちの１つまたはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するドメインであり得る。

【0188】

上記結合ドメインはｓｃＦｖであり得る。このとき、上記ｓｃＦｖはＧＣＮ４ ｐｅｐｅｔｉｄｅとペアであり、上記ＧＣＮ４と特異的に結合または連結することができる。

【0189】

一例として、上記アデノシンデアミナーゼにｓｃＦｖ機能的ドメインが連結された第１融合蛋白質は、ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅを含むペプチド、ポリペプチド、蛋白質、または第２融合蛋白質と互いに結合することができる、

【0190】

＜一塩基置換蛋白質の第２構成－ＤＮＡグリコシラーゼ＞

【0191】

ＤＮＡグリコシラーゼは、塩基除去修復（Ｂａｓｅ Ｅｘｃｉｓｉｏｎ Ｒｅｐａｉｒ，ＢＥＲ）に関与する酵素であり、ＢＥＲは、ＤＮＡの損傷した塩基を除去して交換するメカニズムである。ＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡ内の塩基とデオキシリボース（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）の間のＮ－グリコシド結合（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を加水分解して上記メカニズムの最初の段階を触媒する。ＤＮＡグリコシラーゼは、ｓｕｇａｒ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を残したまま、損傷した窒素塩基（ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ ｂａｓｅ）を除去する。

【0192】

本出願のグリコシラーゼは、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼであり得る。

【0193】

ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡに存在するウラシル（Ｕ）を除去してＤＮＡの突然変異を防止するように作用する酵素として、ウラシルのＮ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｉｃ ｂｏｎｄを切断することでｂａｓｅ－ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ（ＢＥＲ） ｐａｔｈｗａｙを開始するように作用するすべての酵素から１種以上選択することができる。

【0194】

上記グリコシル加水分解酵素はＵｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＤＧ ｏｒ ＵＮＧ）であり得る。上記Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）は、ヒトＵＮＧ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００３３５３，ＮＰ＿５５０４３３）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０８０９１１，ＮＭ＿００３３６２と表現されるＵＮＧ遺伝子、またはマウスＵＮＧ遺伝子（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３５７８１，ＮＰ＿０３５８０７）をコードする遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０４０６９１，ＮＭ＿０１１６７７と表現されるＵＮＧ遺伝子またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＵＮＧ（ｅ．ｇ．，ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＤＸ４９７８８．１，ＡＣＴ２８１６６．１，ＥＦＮ３６８６５．１，ＢＡＡ１０９２３．１，ＡＣＡ７６７６４．１，ＡＣＸ３８７６２．１，ＥＦＵ５９７６８．Ａ，ＥＦＵ５３８８５．Ａ，ＥＦＪ５７２８１．１，ＥＦＵ４７３９８．１，ＥＦＫ７１４１２．１，ＥＦＪ９２３７６．１，ＥＦＪ７９９３６．１，ＥＦＯ５９０８４．１，ＥＦＫ４７５６２．１，ＫＸＨ０１７２８．１，ＥＳＥ２５９７９．１，ＥＳＤ９９４８９．１，ＥＳＤ７３８８２．１，ＥＳＤ６９３４１．１）をコードする遺伝子からなる群より選択されるが、これらに限定されない。

【0195】

上記ＤＮＡグリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ変異体であり得る。上記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ変異体は、野生型ウラシルＤＮＡグリコシラーゼよりもＤＮＡグリコシラーゼ活性（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が増加した酵素であり得る。

【0196】

例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ変異体は、野生型ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの１つ以上のアミノ酸配列が変形された酵素であり得る。このとき、アミノ酸配列の変形は少なくとも１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0197】

上記グリコシラーゼは、融合ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼであり得る。

【0198】

本出願のグリコシラーゼは、アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ，ＡＡＧ）であり得る。

【0199】

アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡに存在するアルキル化または脱アミノ化された塩基を除去してＤＮＡの突然変異を防止するように作用する酵素として、アルキル化または脱アミノ化された塩基のＮ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｂｏｎｄの加水分解（ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）を触媒することによって、ｂａｓｅ－ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ（ＢＥＲ） ｐａｔｈｗａｙを開始するように作用するすべての酵素から１種以上選択することができる。

【0200】

上記ＤＮＡグリコシラーゼは、アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ（Ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＡＡＧ））またはその変異体であり得る。

【0201】

例えば、上記アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＡＧ）は、ヒトＡＡＧ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２４３４，ＮＭ＿００１０１５０５２，ＮＭ＿００１０１５０５４などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＡＧ）は、ヒトＡＡＧ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０１５０５２，ＮＰ＿００１０１５０５４，ＮＰ＿００２４２５などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0202】

例えば、上記アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＡＧ）は、マウスＡＡＧ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１０８２２などで表現される遺伝子またはｍＲＮＡによって発現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。または、上記アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＡＧ）は、ヒトＡＡＧ、例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３４９５２などで表現される蛋白質またはポリペプチドであり得る。

【0203】

上記ＤＮＡグリコシラーゼは、アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ変異体であり得る。上記アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ変異体は、野生型アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼよりもＤＮＡグリコシラーゼ活性（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が増加した酵素であり得る。

【0204】

例えば、アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ変異体は、野生型アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼの１つ以上のアミノ酸配列が変形された酵素であり得る。このとき、アミノ酸配列の変形は少なくとも１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、またはそれらの組み合わせであり得る。

【0205】

上記グリコシラーゼは、融合アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼであり得る。

【0206】

本出願は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼまたはアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼに１つ以上の機能的ドメインが連結された融合ウラシルＤＮＡグリコシラーゼまたは融合アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼを提供することができる。このとき、上記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼまたは上記アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼおよび上記機能的ドメインのそれぞれの機能が発現するように連結または融合したものであってもよい。

【0207】

上記機能的ドメインは、メチラーゼ（ｍｅｔｈｙｌａｓｅ）活性、ジメチラーゼ（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）活性、転写促進（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）活性、転写阻害（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）活性、転写放出因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｆａｃｔｏｒ）活性、ヒストン変形（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）活性、ＲＮＡ切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）活性、または核酸結合（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）活性を有するドメインであってもよく、または、蛋白質（ペプチドを含む）の分離精製のためのタグ（ｔａｇ）またはレポーター遺伝子であってもよいが、これに限定されない。

【0208】

このとき、上記機能的ドメインは、蛋白質（ペプチドを含む）の分離精製のためのタグ（ｔａｇ）またはレポーター遺伝子であり得る。

【0209】

このとき、上記タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグのうちいずれか１つを含むことができる。このとき、上記レポーター遺伝子は、自己蛍光蛋白質、例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素（ＨＲＰ）、クロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、青緑色蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）、および青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）中のいずれか１つを含むことができる。ただし、これらに限定されない。

【0210】

上記機能的ドメインは、ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｓｉｇｎａｌ）またはＮＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｓｉｇｎａｌ）であり得る。

【0211】

このとき、上記ＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ末端またはその近傍、カルボキシ末端またはその近傍、またはそれらの組み合わせに１つ以上のＮＬＳを含むことができる。上記ＮＬＳは、以下に由来するＮＬＳ配列であってもよいが、それらに限定されない。アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２３）を有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ－抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ）からのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２４）を有するヌクレオプラスミン二分割（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２５）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２６）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２７）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２８）、マイオマ（ｍｙｏｍａ）Ｔ蛋白質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２９）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３０）、ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ（配列番号３１）、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３２）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号３３）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３４）、感染性ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３５）、マウスＭｘ１蛋白質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３６）、ヒトポリ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３７）、およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３８）中から選択されるいずれか１つ以上であり得る。

【0212】

上記機能的ドメインは、他のドメイン、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質と複合体を形成することができるようにする結合ドメインであり得る。

【0213】

上記結合ドメインは、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）、ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよびｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）のうちの１つまたはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するドメインであり得る。

【0214】

上記結合ドメインはｓｃＦｖであり得る。このとき、上記ｓｃＦｖはＧＣＮ４ ｐｅｐｅｔｉｄｅとペアであり、上記ＧＣＮ４と特異的に結合または連結することができる。

【0215】

一例として、上記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼまたは上記アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼにｓｃＦｖ機能的ドメインが連結された第１融合蛋白質は、ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅを含むペプチド、ポリペプチド、蛋白質、または第２融合蛋白質と互いに結合することができる。

【0216】

＜一塩基置換蛋白質の第３構成－ＣＲＩＳＰＲ酵素＞
本出願で提供する一塩基置換蛋白質は、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはそれを含むＣＲＩＳＰＲシステムを含む。本明細書でＣＲＩＳＰＲ酵素はＣＲＩＳＰＲ蛋白質と称することもある。

【0217】

ＣＲＩＳＰＲシステムは、ゲノムＤＮＡ上でＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列周辺の標的核酸配列を標的して人為的な突然変異を導入できるシステムである。具体的に、上記ガイドＲＮＡとＣａｓ蛋白質は互いに結合して（または、相互作用して）ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ蛋白質複合体を形成し、標的化するＤＮＡ配列を切断することによって、ゲノムＤＮＡ上に突然変異インデル（ｉｎｄｅｌ）を誘導することができる。

【0218】

上記ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ蛋白質、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ蛋白質複合体に対するより具体的な説明として、韓国公開特許第１０－２０１７－０１２６６３６号を参照することができる。

【0219】

Ｃａｓ蛋白質は、天然型蛋白質に加えて、ガイドＲＮＡと協働して活性化したエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（Ｎｉｃｋａｓｅ）として作用できる変異体全体を含む概念として本明細書で使用されている。活性化したエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼの場合、標的核酸配列を切断でき、それを使用して核酸配列を操作または変形させることができる。また、不活性化される変異体である場合、それを使用して転写を調節したり標的とするＤＮＡを分離したりすることができる。

【0220】

本出願において、ＣＲＩＳＰＲ蛋白質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、スターピロコッカス・アウレス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ノカルディオプシス・ダソンヴィレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトマイセス・プリスティネス・ピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウム・ロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリサイクロバクルスアシドカルダリウス（ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シュドマイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・セレニティ・レドゥセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エクシグオバクテリウム・シビリクム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・デルブルエキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバシラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ミクロスキラマリーナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブルクホルデリアレスバクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナスナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、クロコスパエラ・ワトソニイ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノテセ属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．）、マイクロシスティス・アエルギノサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、アセトハロビウム・アラバチクム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アンモニペックス・デゲンシイ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルジセルロシロプトベシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｓｃｉｉ）、カンジダトゥスデスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、クロストリジウムボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ピネゴルディアマグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、ナトラナエロビウスサーモフィラス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマクラムサーモプロピオニクム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、アシディチオバチルス・カルドゥス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ）、アシディチオバチルス・ペロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマチウム・ビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ニトロソコッカス・ハロフィラス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワトソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ）、プシュー・アルテロ・モナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドノバクテル・ラセミペル（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスティガトゥム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノドラリア・スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノーストーク属（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、アルトロスピラマキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、アルトロスピラプラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルトロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、リンビア属（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）、マイクロコレウス・クトノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．）、ペトロトガモビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシポアフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、またはカリオクロリスマリーナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）等、様々な微生物由来のＣａｓ９またはＣｐｆ１であり得る。

【0221】

上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全活性を有するＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。

【0222】

一実施例では、上記完全活性を有するＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＳｐＣａｓ９ストレプトコッカス・ピヨジェンス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９蛋白質の変異体であり得る。以下、変異の例を挙げる。

【0223】

変異体は、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ２１７Ａ、Ａ２６２Ｔ、Ｒ３２４Ｌ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｅ１２１９Ｖ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｅ１０８Ｇ、Ｅ２１７Ａ、Ａ２６２Ｔ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ａ２６２Ｔ、Ｒ３２４Ｌ、Ｓ４０９Ｉ、Ｅ４８０Ｋ、Ｅ５４３Ｄ、Ｍ６９４Ｉ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５ＶおよびＴ１３３７Ｒのうちの１つ以上のアミノ酸が置換された酵素であり得る。このとき、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は異なるＰＡＭ配列を認識し、このようなＣＲＩＳＰＲ酵素変異体はＣＲＩＳＰＲ酵素が認識できるＰＡＭ配列のシークエンスの長さを短くすることによってゲノム内の標的核酸配列を拡張することができ、核酸近接能力を向上することができる。

【0224】

一実施例では、ＳｐＣａｓ９の場合、ＳｐＣａｓ９をＬ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７Ｒとともに変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）させると、上記ＳｐＣａｓ９変異体は既存の認識していたＰＡＭ配列「ＮＧＧ」でＰＡＭ配列「ＮＧ」のみ認識して作動することができる（ＮはＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇのうちの１つである）。

【0225】

このとき、上記ＳｐＣａｓ９（Ｌ１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５Ｖ、およびＴ１３３７Ｒ）変異体は「Ｎｕｒｅｋｉ Ｃａｓ９」と組み合わせて使用することができる（「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐａｃｅ」ｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６１，１２５９－１２６２）。

【0226】

上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）であり得る。

【0227】

例えば、上記Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ酵素が野生型ＳｐＣａｓ９の場合、上記ニッカーゼは野生型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列８４０番のヒスチジンをアラニンに変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）させ、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＳｐＣａｓ９変異体であり得る。このとき、生成されたニッカーゼ、すなわち、ＳｐＣａｓ９変異体はＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の非相補的鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的に結合しない鎖を切断することができる。

【0228】

別の例において、上記Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ酵素が野生型ＣｊＣａｓ９の場合、上記ニッカーゼは野生型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列５５９番のヒスチジンをアラニンに変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）させ、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＣｊＣａｓ９変異体であり得る。このとき、生成されたニッカーゼ、すなわち、ＣｊＣａｓ９変異体は、ＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の非相補的鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的に結合しない鎖を切断することができる。

【0229】

また、上記ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有することができる。すなわち、上記ニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を含まない可能性があり、そのために、ＲｕｖＣドメインは操作または変更され得る。

【0230】

一例として、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＴｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ酵素である場合、上記ニッカーゼは変形されたＲｕｖＣドメインを含むＴｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。

【0231】

例えば、上記Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ酵素が野生型ＳｐＣａｓ９の場合、上記ニッカーゼは野生型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列１０番のアスパラギン酸をアラニンに変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）させ、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＳｐＣａｓ９変異体であり得る。このとき、生成されたニッカーゼ、すなわち、ＳｐＣａｓ９変異体はＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の相補的鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的に結合する鎖を切断することができる。

【0232】

別の例において、上記Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ酵素が野生型ＣｊＣａｓ９の場合、上記ニッカーゼは野生型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列８番のアスパラギン酸をアラニンに変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）させ、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＣｊＣａｓ９変異体であり得る。このとき、生成されたニッカーゼ、すなわち、ＣｊＣａｓ９変異体はＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の相補的鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的に結合する鎖を切断することができる。

【0233】

一実施例では、上記ニッカーゼは、Ｎｕｒｅｋｉ Ｃａｓ９のアミノ酸配列１０番のアスパラギン酸をアラニンに変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）させ、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＮｕｒｅｋｉ Ｃａｓ９変異体、すなわち、Ｎｕｒｅｋｉ Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｎｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９）であり得る。このとき、生成されたＮｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９はＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の相補的鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的に結合する鎖を切断することができる。

【0234】

他の一実施例では、上記ニッカーゼは、Ｎｕｒｅｋｉ Ｃａｓ９のアミノ酸配列８４０番のヒスチジンをアラニンに変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）させ、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＮｕｒｅｋｉ Ｃａｓ９変異体、すなわち、Ｎｕｒｅｋｉ Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｎｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９）であり得る。このとき、生成されたＮｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９はＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の非相補的鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補的に結合しない鎖を切断することができる。

【0235】

上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。

【0236】

「不活性」とは、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、ＤＮＡの二本鎖のうち第１鎖を切断する第１機能と、ＤＮＡの二本鎖のうち第２鎖を切断する第２機能との両方が失われた状態を意味する。このような状態のＣＲＩＳＰＲ酵素は不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と呼ばれる。

【0237】

上記不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を有するドメインに変異によるヌクレアーゼ不活性を有することができる。

【0238】

上記不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインに変異によるヌクレアーゼ不活性を有することができる。すなわち、上記不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を含まないこともあり、そのために、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインは操作または変更され得る。

【0239】

一例として、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＴｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ酵素である場合、上記不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は変形されたＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインを含むＴｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。

【0240】

例えば、上記Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ酵素が野生型ＳｐＣａｓ９の場合、上記不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は野生型ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列１０番のアスパラギン酸と８４０番のヒスチジンを全部アラニンに変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）させ、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＳｐＣａｓ９変異体であり得る。このとき、生成された不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、ＳｐＣａｓ９変異体は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性になるので、標的遺伝子または核酸の二本鎖を全て切断することができない。

【0241】

別の例において、上記Ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ酵素が野生型ＣｊＣａｓ９の場合、上記不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は野生型ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列８番のアスパラギン酸と５５９番のヒスチジンを全部アラニンに変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）させ、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されるＣｊＣａｓ９変異体であり得る。このとき、生成された不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素、すなわち、ＣｊＣａｓ９変異体は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性になるので、標的遺伝子または核酸の二本鎖を全て切断することができない。

【0242】

また、本出願は機能的ドメインに連結されたＣＲＩＳＰＲ酵素を提供することができる。このとき、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は野生型ＣＲＩＳＰＲ酵素の元の機能に加えて付加的な機能を有することができる。

【0243】

上記機能的ドメインは、メチラーゼ（ｍｅｔｈｙｌａｓｅ）活性、ジメチラーゼ（ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）活性、転写促進（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）活性、転写阻害（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）活性、転写放出因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｌｅａｓｅ ｆａｃｔｏｒ）活性、ヒストン変形（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）活性、ＲＮＡ切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）活性、または核酸結合（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）活性を有するドメインであってもよく、または、蛋白質（ペプチドを含む）の分離精製のためのタグ（ｔａｇ）またはレポーター遺伝子であってもよいが、これに限定されない。

【0244】

上記機能的ドメインは、蛋白質（ペプチドを含む）の分離精製のためのタグ（ｔａｇ）またはレポーター遺伝子であり得る。

【0245】

このとき、上記タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグのうちいずれか１つを含むことができる。このとき、上記レポーター遺伝子は、自己蛍光蛋白質、例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）過酸化酵素（ＨＲＰ）、クロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、青緑色蛍光蛋白質（ＣＦＰ）、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）、および青色蛍光蛋白質（ＢＦＰ）中のいずれか１つを含むことができる。ただし、これらに限定されない。

【0246】

上記機能的ドメインは、ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｓｉｇｎａｌ）またはＮＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｓｉｇｎａｌ）であり得る。

【0247】

このとき、上記ＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ末端またはその近傍、カルボキシ末端またはその近傍、またはそれらの組み合わせに１つ以上のＮＬＳを含むことができる。上記ＮＬＳは、以下に由来するＮＬＳ配列であってもよいが、これに限定されない。アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２３）を有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ）からのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号２４）を有するヌクレオプラスミン二分割（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２５）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号２６）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号２７）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号２８）、マイオマ（ｍｙｏｍａ）Ｔ蛋白質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号２９）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号３０）、ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ（配列番号３１）、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号３２）、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号３３）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号３４）、感染性ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号３５）、マウスＭｘ１蛋白質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号３６）、ヒトポリ（ＡＤＰ－ｒｉｂｏｓｅ）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号３７）、およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号３８）から選択されたいずれか１つ以上であり得る。

【0248】

上記機能的ドメインは、他のドメイン、ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質と複合体を形成することができるようにする結合ドメインであり得る。

【0249】

上記結合ドメインは、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）、ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよびｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）のうちの１つ、またはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するドメインであり得る。

【0250】

上記結合ドメインは、ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅであり得る。このとき、上記ＧＣＮ４ ｐｅｐｅｔｉｄｅはｓｃＦｖとペアであり、上記ｓｃＦｖと特異的に結合または連結することができる。

【0251】

一例として、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素にＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅ機能的ドメインが連結された第１融合蛋白質は、ｓｃＦｖを含むペプチド、ポリペプチド、蛋白質、または第２融合蛋白質と互いに結合することができる、

【0252】

＜一塩基置換蛋白質の第１態様－一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸＞

【0253】

本明細書によって開示される一塩基置換蛋白質の一態様は一塩基置換融合蛋白質である。

【0254】

一例として、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸として、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、
（ｂ）デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、および
（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体を含み、
このとき、上記アデニン置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンまたはアデニンを任意の塩基への置換を誘導する一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸であり得る。

【0255】

一実施例では、上記一塩基置換融合蛋白質は、各構成要素（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の間に連結部分（ｌｉｎｋｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を含むことを特徴とする一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸であり得る。

【0256】

一実施例では、上記一塩基置換融合蛋白質は、
（ｉ）Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[デアミナーゼ]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、
（ｉｉ）Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[デアミナーゼ]－Ｃ末端、
（ｉｉｉ）Ｎ末端－[デアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、
（ｉｖ）Ｎ末端－[デアミナーゼ]－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、
（ｖ）Ｎ末端－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[デアミナーゼ]－Ｃ末端、および
（ｖｉ）Ｎ末端－[ＤＮＡグリコシラーゼ]－[デアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端のうちいずれか１つの構成を有することを特徴とする一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸であり得る。

【0257】

一実施例では、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９蛋白質、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９蛋白質、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９蛋白質、ストレプトコッカス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９蛋白質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９蛋白質、およびＣｐｆ１蛋白質からなる群より選択されるいずれか１つ以上を含む一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸であり得る。

【0258】

一実施例では、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインのうちいずれか１つ以上が不活性化されることを特徴とする、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸であり得る。

【0259】

一実施例では、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）であることを特徴とする、一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸であり得る。

【0260】

一実施例では、アデニン置換融合蛋白質を提供することができる。

【0261】

アデニン置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸として、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、
（ｂ）アデノシンデアミナーゼ（ａｄｅｎｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、および
（ｃ）アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼまたはその変異体を含み、
このとき、上記アデニン置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるアデニンを任意の塩基への置換を誘導するアデニン置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸であり得る。

【0262】

上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[アデノシンデアミナーゼ]－［アルキラデニナルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ］－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0263】

上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[アデノシンデアミナーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0264】

上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[アデノシンデアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0265】

上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[アデノシンデアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0266】

上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[アデノシンデアミナーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0267】

上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[アデノシンデアミナーゼ]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0268】

上記アデニン塩基置換蛋白質は、追加として連結ドメインをさらに含むことができる。

【0269】

一例として、上記連結ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ酵素およびアデノシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ、および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素およびアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼを作動可能に連結するドメインであり、ＣＲＩＳＰＲ酵素、アデノシンデアミナーゼおよびアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼが各々の機能が活性となるように連結されるドメインであり得る。

【0270】

一例として、上記連結ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、アデノシンデアミナーゼおよびアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼの機能活性および／または構造にいかなる影響を及ぼさないアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。

【0271】

一例として、上記アデニン塩基置換ドメインは、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[アデノシンデアミナーゼ]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[アデノシンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、またはＮ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[アデノシンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0272】

一例として、上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[アデノシンデアミナーゼ]－Ｃ末端、Ｎ末端－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[アデノシンデアミナーゼ]－Ｃ末端、またはＮ末端－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[アデノシンデアミナーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0273】

一例として、上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[アデノシンデアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、Ｎ末端－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[アデノシンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、またはＮ末端－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[アデノシンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0274】

一例として、上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[アデノシンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、Ｎ末端－[アデノシンデアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、またはＮ末端－[アデノシンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0275】

一例として、上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[アデノシンデアミナーゼ]－Ｃ末端、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[アデノシンデアミナーゼ]－Ｃ末端、またはＮ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[アデノシンデアミナーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0276】

一例として、上記アデニン塩基変形蛋白質は、Ｎ末端－[アデノシンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、Ｎ末端－[アデノシンデアミナーゼ]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、またはＮ末端－[アデノシンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[アルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0277】

一実施例では、シトシン置換融合蛋白質を提供することができる。

【0278】

シトシン置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸として、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、
（ｂ）シチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、および
（ｃ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体を含み、
このとき、上記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンを任意の塩基への置換を誘導するシトシン置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸であり得る。

【0279】

上記シトシン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[シチジンデアミナーゼ]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0280】

上記シトシン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[シチジンデアミナーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0281】

上記シトシン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[シチジンデアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0282】

上記シトシン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[シチジンデアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0283】

上記シトシン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[シチジンデアミナーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0284】

上記シトシン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[シチジンデアミナーゼ]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0285】

上記シトシン塩基置換蛋白質は、追加として連結ドメインをさらに含むことができる。

【0286】

一例として、上記連結ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ酵素およびシチジンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、および／またはＣＲＩＳＰＲ酵素およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼを作動可能に連結するドメインであり、ＣＲＩＳＰＲ酵素、シチジンデアミナーゼおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼが各々の機能が活性となるように連結されるドメインであり得る。

【0287】

一例として、上記連結ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、シチジンデアミナーゼおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼの機能活性および／または構造にいかなる影響を及ぼさないアミノ酸、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。

【0288】

一例として、上記シトシン塩基置換ドメインは、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[シチジンデアミナーゼ]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[シチジンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、またはＮ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[シチジンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0289】

一例として、上記シトシン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[シチジンデアミナーゼ]－Ｃ末端、Ｎ末端－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[シチジンデアミナーゼ]－Ｃ末端、またはＮ末端－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[シチジンデアミナーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0290】

上記シトシン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[シチジンデアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、Ｎ末端－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[シチジンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、またはＮ末端－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[シチジンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0291】

上記シトシン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[シチジンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、Ｎ末端－[シチジンデアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端、またはＮ末端－[シチジンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0292】

上記シトシン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[シチジンデアミナーゼ]－Ｃ末端、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[シチジンデアミナーゼ]－Ｃ末端、またはＮ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[連結ドメイン]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[シチジンデアミナーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0293】

上記シトシン塩基変形蛋白質は、Ｎ末端－[シチジンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、Ｎ末端－[シチジンデアミナーゼ]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端、またはＮ末端－[シチジンデアミナーゼ]－[連結ドメイン]－[ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ]－[連結ドメイン]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0294】

＜一塩基置換蛋白質の第２態様－一塩基置換複合体＞
本明細書によって開示される一塩基置換蛋白質の一態様は一塩基置換複合体である。

【0295】

一例として、一塩基置換複合体あって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素またはその変異体、
（ｂ）デアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、
（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼ（ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、および
（ｄ）２つ以上の結合ドメインを含み、
このとき、上記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンまたはアデニンを任意の塩基への置換を誘導する一塩基置換複合体であり得る。

【0296】

一例として、上記一塩基置換複合体は、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素が２つ以上の結合ドメインと連結されることを特徴としてもよい。

【0297】

このとき、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素に連結された上記２つ以上の結合ドメインのうちの一方は、上記（ｂ）デアミナーゼに連結された結合ドメインとペアであり、他方は上記（ｃ） ＤＮＡグリコシラーゼに連結された結合ドメインとペアであり得る。このとき、上記ペアの間の結合によって上記構成要素（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、（ｂ）デアミナーゼ、および（ｃ） ＤＮＡグリコシラーゼが複合体を形成して一塩基置換複合体を提供することができる。

【0298】

一実施例では、上記２つ以上の結合ドメインと連結されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、[結合ドメイン（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ）]_ｎ－ＣＲＩＳＰＲ酵素の構成を有することができる（ｎは２つ以上の整数であり得る）。

【0299】

例えば、図３２（ａ）であり得る。

【0300】

このとき、上記ＧＣＮ４は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と連結された結合ドメインの一例であり、他の種類の結合ドメインを連結することができる。これに限定されない。

【0301】

このとき、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個以上の結合ドメインと連結することができる。

【0302】

他の例では、図３２（ｂ）であり得る。

【0303】

このとき、上記ＧＣＮ４は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と連結された結合ドメインの一例であり、他の種類の結合ドメインを連結することができる。これに限定されない。

【0304】

このとき、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃ末端およびＮ末端にそれぞれ１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個以上の結合ドメインと連結することができる。

【0305】

本出願で提供される一塩基置換複合体は、一実施例として、図３３の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）構成内の結合ドメイン間の特異的結合にて提供することができる。

【0306】

このとき、上記（ａ）の結合ドメインＧＣＮ４、上記（ｂ）の結合ドメインｓｃＦｖ、および上記（ｃ）の結合ドメインｓｃＦｖは、１つの例示であり、これに限定されない。上記ＡＰＯＢＥＣの代わりにアデノシンデアミナーゼに取替することができ、上記ＵＮＧの代わりにアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼに取替することができる。

【0307】

このとき、上記１つの（ａ）に複数個の上記（ｂ）および／または複数個の上記（ｃ）を結合することができる。

【0308】

このとき、上記複数とは、２，３，４，５，６，７，８，９または１０以上の整数を意味する。

【0309】

本出願で提供される一塩基置換複合体は、一実施例として、図３４の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）構成内の結合ドメイン間の特異的結合にて提供することができる。

【0310】

このとき、上記（ａ）の結合ドメインＧＣＮ４、上記（ｂ）の結合ドメインｓｃＦｖ、および上記（ｃ）の結合ドメインｓｃＦｖは、１つの例示であり、これに限定されない。上記ＡＰＯＢＥＣの代わりにアデノシンデアミナーゼに取替することができ、上記ＵＮＧの代わりにアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼに取替することができる。

【0311】

このとき、上記１つの（ａ）に複数個の上記（ｂ）および／または複数個の上記（ｃ）を結合することができる。

【0312】

このとき、上記複数とは、２，３，４，５，６，７，８，９または１０以上の整数を意味する。

【0313】

一例として、上記一塩基置換複合体は、上記デアミナーゼが２つ以上の結合ドメインと連結されることを特徴としてもよい。このとき、上記デアミナーゼに連結される上記２つ以上の結合ドメインそれぞれは上記（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素に連結された結合ドメインおよび上記（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼに連結された結合ドメインとペアになる。このとき、上記ペアの間の結合によって上記構成要素（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、（ｂ）デアミナーゼ、および（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼが複合体を形成して一塩基置換複合体を提供することができる。

【0314】

一例として、上記一塩基置換複合体は、上記ＤＮＡグリコシラーゼが２つ以上の結合ドメインと連結されることを特徴としてもよい。このとき、上記ＤＮＡグリコシラーゼに連結される上記２つ以上の結合ドメインそれぞれは上記（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素に連結された結合ドメインおよび上記（ｂ）デアミナーゼに連結された結合ドメインとペアになる。このとき、上記ペアの間の結合によって上記構成要素（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、（ｂ）デアミナーゼ、および（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼが複合体を形成して一塩基置換複合体を提供することができる。

【0315】

一例として、上記一塩基置換複合体は、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素が２つ以上の結合ドメインと連結され、上記デアミナーゼおよび上記ＤＮＡグリコシラーゼが連結された融合蛋白質の形態で存在することを特徴としてもよい。このとき、上記融合蛋白質は１つ以上の結合ドメインを含む。一実施例では、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素に連結されるある結合ドメインは上記融合蛋白質の結合ドメインとペアになる。このとき、上記ペアの間の結合によって上記構成要素（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、（ｂ）デアミナーゼ、および（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼが複合体を形成して一塩基置換複合体を提供することができる。

【0316】

本出願で提供される一塩基置換複合体は、一実施例として、図３５中の（ａ）の結合ドメインおよび（ｂ）の結合ドメイン間の特異的結合にて複合体を形成したものであり得る。

【0317】

このとき、上記（ａ）の結合ドメインＧＣＮ４および上記（ｂ）の結合ドメインｓｃＦｖは、１つの例示であり、これに限定されない。上記ＡＰＯＢＥＣの代わりにアデノシンデアミナーゼまたは他の種類のシチジンデアミナーゼに取替することができ、上記ＵＮＧの代わりにアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼに取替することができる。

【0318】

このとき、上記１つの（ａ）に複数個の上記（ｂ）を結合することができる。

【0319】

このとき、上記複数とは、２，３，４，５，６，７，８，９または１０以上の整数を意味する。

【0320】

本出願で提供される一塩基置換複合体は、一実施例として、図３６中の（ａ）の結合ドメインおよび（ｃ）の結合ドメイン間の特異的結合にて複合体を形成したものであり得る。

【0321】

このとき、上記（ａ）の結合ドメインＧＣＮ４および上記（ｃ）の結合ドメインｓｃＦｖは、１つの例示であり、これに限定されない。上記ＡＰＯＢＥＣの代わりにアデノシンデアミナーゼまたは他の種類のシチジンデアミナーゼに取替することができ、上記ＵＮＧの代わりにアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼに取替することができる。

【0322】

このとき、上記１つの（ａ）に複数個の上記（ｂ）を結合することができる。

【0323】

このとき、上記複数とは、２，３，４，５，６，７，８，９または１０以上の整数を意味する。

【0324】

本出願で提供される一塩基置換複合体は、一実施例として、図３７中の（ａ）の結合ドメインおよび（ｂ）の結合ドメイン間の特異的結合にて複合体を形成したものであり得る。

【0325】

このとき、上記（ａ）の結合ドメインＧＣＮ４および上記（ｂ）の結合ドメインｓｃＦｖは、１つの例示であり、これに限定されない。上記ＡＰＯＢＥＣの代わりにアデノシンデアミナーゼまたは他の種類のシチジンデアミナーゼに取替することができ、上記ＵＮＧの代わりにアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼに取替することができる。

【0326】

このとき、上記１つの（ａ）に複数個の上記（ｂ）を結合することができる。

【0327】

このとき、上記複数とは、２，３，４，５，６，７，８，９または１０以上の整数を意味する。

【0328】

本出願で提供される一塩基置換複合体は、一実施例として、図３８中の（ａ）の結合ドメインおよび（ｃ）の結合ドメイン間の特異的結合にて複合体を形成したものであり得る。

【0329】

このとき、上記（ａ）の結合ドメインＧＣＮ４および上記（ｂ）の結合ドメインｓｃＦｖは、１つの例示であり、これに限定されない。上記ＡＰＯＢＥＣの代わりにアデノシンデアミナーゼまたは他の種類のシチジンデアミナーゼに取替することができ、上記ＵＮＧの代わりにアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼに取替することができる。

【0330】

このとき、上記１つの（ａ）に複数個の上記（ｂ）を結合することができる。

【0331】

このとき、上記複数とは、２，３，４，５，６，７，８，９または１０以上の整数を意味する。

【0332】

一例として、上記一塩基置換複合体は、上記デアミナーゼが２つ以上の結合ドメインと連結され、上記ＣＲＩＳＰＲ酵素および上記ＤＮＡグリコシラーゼが連結された融合蛋白質の形態で存在することを特徴としてもよい。このとき、上記融合蛋白質は１つ以上の結合ドメインを含む。一実施例では、上記デアミナーゼに連結されるある結合ドメインは、上記融合蛋白質の結合ドメインとペアになる。このとき、上記ペアの間の結合によって上記構成要素（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、（ｂ）デアミナーゼ、および（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼが複合体を形成して一塩基置換複合体を提供することができる。

【0333】

一例として、上記一塩基置換複合体は、上記ＤＮＡグリコシラーゼが２つ以上の結合ドメインと連結され、上記デアミナーゼおよび上記ＣＲＩＳＰＲ酵素が連結された融合蛋白質の形態で存在することを特徴としてもよい。このとき、上記融合蛋白質は１つ以上の結合ドメインを含む。一実施例では、上記ＤＮＡグリコシラーゼに連結されるある結合ドメインは上記融合蛋白質の結合ドメインとペアになる。このとき、上記ペアの間の結合によって上記構成要素（ａ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、（ｂ）デアミナーゼ、および（ｃ）ＤＮＡグリコシラーゼが複合体を形成して一塩基置換複合体を提供することができる。

【0334】

一例として、一塩基置換複合体は、（ｉ）上記ＣＲＩＳＰＲ酵素、上記デアミナーゼ、および上記ＤＮＡグリコシラーゼから選択される２つの構成と第１結合ドメインを含む第１融合蛋白質、および（ｉｉ）上記選択されなかった残りの１つの構成と第２結合ドメインを含む第２融合蛋白質を含み、このとき、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインは相互作用するペアであり、上記ペアによって複合体を形成することを特徴とする一塩基置換複合体であり得る。このとき、上記第２融合蛋白質は、第２結合ドメインに加えて複数の結合ドメインをさらに含むこともできる。

【0335】

一実施例では、上記一塩基置換複合体は、（ｉ）上記デアミナーゼ、上記ＤＮＡグリコシラーゼおよび第１結合ドメインを含む第１融合蛋白質、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素および第２結合ドメインを含む第２融合蛋白質を含むことを特徴とする一塩基置換複合体であり得る。このとき、上記第２融合蛋白質は、第２結合ドメインに加えて複数の結合ドメインをさらに含むことができる。このとき、上記第１結合ドメインはｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）であり、上記第２融合蛋白質はＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅであり得る。このとき、上記ｓｃＦｖは、上記ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅとの相互作用を通じて一塩基置換複合体を提供することができる。

【0336】

一実施例では、上記一塩基置換複合体は、（ｉ）上記デアミナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ酵素および第１結合ドメインを含む第１融合蛋白質、および（ｉｉ）ＤＮＡグリコシラーゼおよび第２結合ドメインを含む第２融合蛋白質を含むことを特徴とする一塩基置換複合体であり得る。このとき、上記第２融合蛋白質は、第２結合ドメインに加えて複数の結合ドメインをさらに含むことができる。このとき、上記第１結合ドメインはｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）であり、上記第２融合蛋白質はＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅであり得る。このとき、上記ｓｃＦｖは、上記ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅとの相互作用を通じて一塩基置換複合体を提供することができる。

【0337】

一実施例では、上記一塩基置換複合体は、（ｉ）上記ＣＲＩＳＰＲ酵素、上記ＤＮＡグリコシラーゼおよび第１結合ドメインを含む第１融合蛋白質、および（ｉｉ）上記デアミナーゼおよび第２結合ドメインを含む第２融合蛋白質を含むことを特徴とする一塩基置換複合体であり得る。このとき、上記第２融合蛋白質は、第２結合ドメインに加えて複数の結合ドメインをさらに含むことができる。このとき、上記第１結合ドメインはｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）であり、上記第２融合蛋白質はＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅであり得る。このとき、上記ｓｃＦｖは、上記ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅとの相互作用を通じて一塩基置換複合体を提供することができる。

【0338】

一例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素、上記デアミナーゼ、および上記ＤＮＡグリコシラーゼのうちいずれか１つ（ｏｎｅ）は、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインに連結され、このとき、上記第１結合ドメインは、他の構成（ａｎｏｔｈｅｒ）の結合ドメインと相互作用するペアであり、上記第２結合ドメインは、残りの構成（ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ）の結合ドメインと相互作用するペアであり、上記ペアによって一塩基置換複合体を提供することができる。

【0339】

一実施例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインに連結され、このとき、上記第１結合ドメインは上記デアミナーゼの結合ドメインと相互作用するペアであり、上記第２結合ドメインはＤＮＡグリコシラーゼの結合ドメインと相互作用するペアであり、上記ペアによって一塩基置換複合体を提供することができる。

【0340】

一実施例において、デアミナーゼは、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインに連結され、このとき、上記第１結合ドメインは上記ＣＲＩＳＰＲ酵素の結合ドメインと相互作用するペアであり、上記第２結合ドメインはＤＮＡグリコシラーゼの結合ドメインと相互作用するペアであり、上記ペアによって一塩基置換複合体を提供することができる。

【0341】

一実施例において、ＤＮＡグリコシラーゼは、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインに連結され、このとき、上記第１結合ドメインは上記デアミナーゼの結合ドメインと相互作用するペアであり、上記第２結合ドメインはＣＲＩＳＰＲ酵素の結合ドメインと相互作用するペアであり、上記ペアによって一塩基置換複合体を提供することができる。

【0342】

このとき、結合ドメインは、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）、ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよびｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）のうちの１つ、またはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するドメインであり得る。

【0343】

このとき、上記ペアは、以下のいずれか１セットであり得る。
ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ、
第１インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）および第２インテイン、
ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓ、
ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよびｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）、
ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成する第１ドメインおよび第２ドメイン。

【0344】

本出願は、シトシン置換複合体を提供することができる。

【0345】

一例として、上記デアミナーゼはシチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）であり、上記ＤＮＡグリコシラーゼはウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）またはその変異体であり、このとき、上記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるシトシンを任意の塩基への置換を誘導する一塩基置換複合体であり得る。

【0346】

一例として、上記シチジンデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）またはその変異体であることを特徴とする一塩基置換複合体であり得る。

【0347】

一例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素、シチジンデアミナーゼ、およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼのうちいずれか１つ（ｏｎｅ）は、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインに連結され、このとき、上記第１結合ドメインは他の構成（ａｎｏｔｈｅｒ）の結合ドメインと相互作用するペアであり、上記第２結合ドメインは残りの構成（ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ）の結合ドメインと相互作用するペアであり、上記ペアによって一塩基置換複合体を提供することができる。

【0348】

一実施例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインに連結され、このとき、上記第１結合ドメインは上記デアミナーゼの結合ドメインと相互作用するペアであり、上記第２結合ドメインはＤＮＡグリコシラーゼの結合ドメインと相互作用するペアであり、上記ペアによって一塩基置換複合体を提供することができる。

【0349】

一例として、一塩基置換複合体は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、シチジンデアミナーゼ、およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼから選択される２つの構成と第１結合ドメインを含む第１融合蛋白質、および（ｉｉ）上記選択されなかった残りの１つの構成と第２結合ドメインを含む第２融合蛋白質を含み、このとき、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインは相互作用するペアであり、上記ペアによって複合体を形成することを特徴とする一塩基置換複合体であり得る。このとき、上記第２融合蛋白質は、第２結合ドメインに加えて複数の結合ドメインをさらに含むことができる。

【0350】

このとき、上記ペアは、以下のいずれか１セットであり得る。
ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ、
第１インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）および第２インテイン、
ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓ、
ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよびｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）、
ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成する第１ドメインおよび第２ドメイン。

【0351】

本出願は、アデニン置換複合体を提供することができる。

【0352】

一例として、上記デアミナーゼはアデノシンデアミナーゼであり、上記ＤＮＡグリコシラーゼはアルキラデニン－ＤＮＡグリコシラーゼまたはその変異体であり、このとき、上記一塩基置換融合蛋白質は、標的核酸配列中の１つ以上のヌクレオチドに含まれるアデニンを任意の塩基への置換を誘導する一塩基置換複合体であり得る。

【0353】

一例として、上記アデニンシチジンデアミナーゼは、ＴａｄＡ，Ｔａｄ２ｐ，ＡＤＡ，ＡＤＡ１，ＡＤＡ２，ＡＤＡＲ２，ＡＤＡＴ２，ＡＤＡＴ３またはその変異体であることを特徴とする一塩基置換複合体であり得る。

【0354】

一例として、ＣＲＩＳＰＲ酵素、アデノシンデアミナーゼ、およびアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼのうちいずれか１つ（ｏｎｅ）は、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインに連結され、このとき、上記第１結合ドメインは他の構成（ａｎｏｔｈｅｒ）の結合ドメインと相互作用するペアであり、上記第２結合ドメインは残りの構成（ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ）の結合ドメインと相互作用するペアであり、上記ペアによって一塩基置換複合体を提供することができる。

【0355】

一実施例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインに連結され、このとき、上記第１結合ドメインは上記デアミナーゼの結合ドメインと相互作用するペアであり、上記第２結合ドメインはＤＮＡグリコシラーゼの結合ドメインと相互作用するペアであり、上記ペアによって一塩基置換複合体を提供することができる。

【0356】

一例として、一塩基置換複合体は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、アデノシンデアミナーゼ、およびアルキラデニンＤＮＡグリコシラーゼから選択される２つの構成と第１結合ドメインを含む第１融合蛋白質、および（ｉｉ）上記選択されなかった残りの１つの構成と第２結合ドメインを含む第２融合蛋白質を含み、このとき、第１結合ドメインおよび第２結合ドメインは相互作用するペアであり、上記ペアによって複合体を形成することを特徴とする一塩基置換複合体であり得る。このとき、上記第２融合蛋白質は、第２結合ドメインに加えて複数の結合ドメインをさらに含むことができる。

【0357】

このとき、上記ペアは、以下のいずれか１セットであり得る。
ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ、
第１インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）および第２インテイン、
ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓ、
ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよびｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）、
ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成する第１ドメインおよび第２ドメイン。

【0358】

本明細書によって開示される発明の一態様は、塩基置換用組成物およびそれを使用する方法である。

【0359】

一塩基置換組成物は、遺伝子内に１つ以上のヌクレオチドの塩基を人為的に変形させるために使用することができる。

【0360】

「人為的に変形される（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」という用語は、自然状態で起きる存在そのままの状態でない、人為的に変形を加えた状態を意味する。例えば、人為的に変形を加えた状態は、野生型遺伝子に突然変異を人為的に発生させるような変形であり得る。以下で非自然の人為的に変形された多型依存遺伝子は人為的な多型依存遺伝子という用語と組み合わせて使用することができる。

【0361】

上記塩基変形用組成物は、追加としてガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸をさらに含むことができる。

【0362】

一例として、（ａ）ガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸、および（ｂ）一塩基置換融合蛋白質またはそれをコードする核酸、または一塩基置換複合体を含み、このとき、上記ガイドＲＮＡは標的核酸配列と相補的に結合し、上記ガイドＲＮＡと結合される標的核酸配列は１５～２５ｂｐであり、上記一塩基置換融合蛋白質または上記一塩基置換複合体は、上記標的核酸配列を含む標的領域（ｒｅｇｉｏｎ）内に存在する１つ以上のシトシンまたはアデニンの任意の塩基への置換を誘導する、一塩基置換組成物を提供する。

【0363】

＜塩基置換組成物の第１構成－ガイドＲＮＡ＞
塩基置換組成物は、ガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を含むことができる。

【0364】

ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、標的遺伝子または核酸に対するｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を特異的に標的化することができるＲＮＡを指す。また、上記ｇＲＮＡは、標的遺伝子または核酸特異的ＲＮＡを意味し、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合してＣＲＩＳＰＲ酵素を標的遺伝子または核酸に導くことができる。

【0365】

ガイドＲＮＡは、標的遺伝子または核酸の二本鎖のうちいずれか１つ鎖の一部の配列に相補的に結合することができる。上記一部の配列は標的核酸配列を指すことができる。

【0366】

ガイドＲＮＡは、標的遺伝子または核酸の特定のヌクレオチド配列を有する位置にガイドＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を誘導する機能を果たすことができる。

【0367】

ガイドＲＮＡは、標的遺伝子、標的領域または標的核酸配列に対するｇＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を特異的に標的化することができるＲＮＡを指す。また、上記ｇＲＮＡは、標的遺伝子または核酸特異的ＲＮＡを意味し、ＣＲＩＳＰＲ酵素と結合してＣＲＩＳＰＲ酵素を標的遺伝子、標的領域または標的核酸配列に導くことができる。

【0368】

ガイドＲＮＡは、一本鎖ガイドＲＮＡ（単一ＲＮＡ分子、ｓｉｎｇｌｅ ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）、または二本鎖ガイドＲＮＡ（１つ超える通常の２個の別々のＲＮＡ分子を含む）と呼ぶことができる。

【0369】

ガイドＲＮＡは、上記対象配列と相補的に結合する部位（以下ガイド部位と称する）とＣａｓ蛋白質と複合体を形成するのに関与する部位（以下、複合体形成部位と称する）を含む。

【0370】

一例として、上記ガイドＲＮＡは、ＳｐＣａｓ９蛋白質と相互作用し、配列番号４８～８１から選択されるいずれか１つであり得る。

【0371】

他の例として、上記ガイドＲＮＡは、ＣｊＣａｓ９蛋白質と相互作用し、配列番号８２～９２から選択されるいずれか１つを含むことができる。

【0372】

【表1】

【0373】

このとき、上記複合体形成部位はＣａｓ９蛋白質由来微生物の種類によって決定される。例えば、ＳｐＣａｓ９蛋白質と相互作用するガイドＲＮＡの場合、上記複合体形成部位は、５’－ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＧＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ－３’（配列番号４５）を含むことができ、ＣｊＣａｓ９蛋白質と相互作用するガイドＲＮＡの場合、５’－ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ－３’（配列番号４６）を含むことができる。

【0374】

上記ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒ－ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列として、ｓｐＣａｓ９蛋白質を使用する場合、ＮＧＧ（ＮはＡ，Ｔ，ＣまたはＧである）が考慮され、ｃｊＣａｓ９蛋白質を使用する場合、ＮＮＮＮＲＹＡＣ（配列番号４７）（Ｎはそれぞれ独立的にＡ，Ｔ，ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）が考慮される。

【0375】

上記組成物は、ガイドＲＮＡを１個または複数個含むことができる。

【0376】

＜塩基置換組成物の第２構成－一塩基置換蛋白質＞
塩基置換組成物は、一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を含むことができる。

【0377】

一塩基置換蛋白質は、前述したものと同様である。

【0378】

＜塩基置換組成物の第３構成－ベクター＞
上記塩基変形用組成物は、ベクターの形態であり得る。

【0379】

「ベクター」は、細胞に遺伝子配列を伝達することができる。典型的に、「ベクター構造体」、「発現ベクター」、および「遺伝子伝達ベクター」は、関心する遺伝子の発現を指示することができ、標的細胞に遺伝子配列を伝達できる任意の核酸構造体を意味する。したがって、上記用語は、クローニングおよび発現ビヒクルだけでなく、ベクターを統合することを含む。

【0380】

このとき、上記ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）であり得る。

【0381】

このとき、上記ベクターは、１つ以上の調節／制御構成要素を含むことができる。

【0382】

このとき、上記調節／制御構成要素は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザック共通（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）配列、内部リボソーム流入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ，ＩＲＥＳ）、スプライスアクセプターおよび／または２Ａ配列を含むことができる。

【0383】

上記プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。

【0384】

上記プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。

【0385】

上記プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。

【0386】

上記プロモーターは、対象特異的プロモーターであり得る。

【0387】

上記プロモーターは、ウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。

【0388】

上記プロモーターは、制御領域（すなわち、ガイドＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列）に応じて適切なプロモーターを使用することができる。

【0389】

例えば、ガイドＲＮＡのために有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ－１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素のために有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ－１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫまたはＣＡＧプロモーターであり得る。

【0390】

ベクターは、ウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターであり得る。

【0391】

上記ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。

【0392】

このとき、上記ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。

【0393】

このとき、上記ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。

【0394】

上記ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ－関連ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、または単純ヘルペスウイルスであってもよいが、これらに限定されない。

【0395】

一般に、ウイルスは、宿主（例えば、細胞）に感染し、宿主内にウイルスの遺伝情報をコードする核酸を導入するか、または宿主のゲノムに遺伝情報をコードする核酸を挿入することができる。このような特徴を有するウイルスを使用して、対象内にガイドＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素を導入することができる。ウイルスを使用して導入されたガイドＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、対象（例えば、細胞）において一時的に発現され得る。または、ウイルスを使用して導入されたガイドＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素は、対象（例えば、細胞）において長期間（例えば、１週、２週、３週、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１年、２年、または永続的）において連続的に発現することができる。

【0396】

ウイルスのパッケージング能力は、少なくとも２ｋｂ～５０ｋｂで、ウイルスの種類によって異なり得る。このようなパッケージング能力に応じてガイドＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ酵素を単独で含むウイルスベクターを設計するか、またはガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素の両方を含むウイルスベクターを設計することができる。または、ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素および追加的構成要素を含むウイルスベクターを設計することができる。

【0397】

例えば、レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列に対するパッケージング能力を有し、シス（ｃｉｓ）－作用性の長い末端反復順序（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅｔ：ＬＴＲ）から構成される。レトロウイルスベクターは細胞内に治療遺伝子を挿入して永続的な移植遺伝子の発現を提供する。

【0398】

別の例として、アデノ関連ウイルスベクターは、細胞分裂の有無に関係なく、様々な細胞（筋肉、脳、肝臓、肺、網膜、耳、心臓、血管）への形質導入効率が非常に高く、病原性がなく、ウイルスゲノムの大部分が治療遺伝子によって置換することができて免疫反応を誘導せず、繰り返し投与が可能である。また、ＡＡＶは対象細胞の染色体内に挿入されることによって治療蛋白質が長期間安定的に発現される。例えば、核酸およびペプチドの試験管内に生成して生体内および生体外で細胞の標的核酸に形質導入するために使用するのに役立つ。ただし、ＡＡＶはサイズが小さく、４．５ｋｂ以下のパッケージング能力を有する。

【0399】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むベクター、およびアデニン塩基置換蛋白質を含むことができる。

【0400】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡ、およびアデニン塩基置換蛋白質をコードする核酸を含むベクターを含むことができる。

【0401】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むベクター、およびアデニン塩基置換蛋白質をコードする核酸を含むベクターを含むことができる。

【0402】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡをコードする核酸およびアデニン塩基置換蛋白質をコードする核酸を含むベクターを含むことができる。

【0403】

別の例として、塩基変形用組成物は、
（ａ）第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素またはそれをコードする核酸、および
（ｂ）第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼまたはそれをコードする核酸を含むことができる。

【0404】

このとき、ＣＲＩＰＳＲ酵素は、野生型ＣＲＩＰＳＲ酵素またはＣＲＩＰＳＲ酵素変異体であり得る。

【0405】

このとき、上記ＣＲＩＰＳＲ酵素変異体は、ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）であり得る。

【0406】

上記アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ，Ｔａｄ２ｐ，ＡＤＡ，ＡＤＡ１，ＡＤＡ２，ＡＤＡＲ２，ＡＤＡＴ２，ＡＤＡＴ３またはその変異体であり得る。

【0407】

上記第１結合ドメインは、第２結合ドメインと非共有結合を形成することができる。

【0408】

このとき、上記第１結合ドメインは、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）、ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよびｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）のうちの１つ、またはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するドメインであり得る。

【0409】

このとき、上記第２結合ドメインは、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）、ＥＲＴおよびＶＰＲ ｄｏｍａｉｎｓのうちの１つ、ＧＣＮ４ ｐｅｐｔｉｄｅおよびｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）のうちの１つ、またはヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成するドメインであり得る。

【0410】

上記塩基変形用組成物は、１つ以上のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を追加でさらに含むことができる。

【0411】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡ－第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素－第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼ複合体、すなわち、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｉｅｎ（ＲＮＰ）形態であり得る。

【0412】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むベクターと、第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸を含むベクターと、第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼをコードする核酸を含むベクターと、を含むことができる。

【0413】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むベクターと、第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素－第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼ複合体と、を含むことができる。

【0414】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むベクターと、第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸および第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼをコードする核酸を含むベクターと、を含むことができる。

【0415】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡをコードする核酸および第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸を含むベクターと、第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼをコードする核酸を含むベクターと、を含むことができる。

【0416】

このとき、塩基変形用組成物は、第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸を含むベクターと、ガイドＲＮＡをコードする核酸および第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼをコードする核酸を含むベクターと、を含むことができる。

【0417】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むベクターと、第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素と、第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼをコードする核酸を含むベクターと、を含むことができる。

【0418】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡをコードする核酸を含むベクターと、第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸を含むベクターと、第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼと、を含むことができる。

【0419】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡをコードする核酸および第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸を含むベクターと、第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼと、を含むことができる。

【0420】

このとき、塩基変形用組成物は、第１結合ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ酵素と、ガイドＲＮＡをコードする核酸および第２結合ドメインを含むアデノシンデアミナーゼをコードする核酸を含むベクターと、を含むことができる。

【0421】

＜塩基置換組成物の第４構成－ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体＞
上記塩基変形用組成物は、核酸－蛋白質複合体の形態であり得る。このとき、上記核酸－蛋白質複合体は、ガイドＲＮＡ－アデニン塩基置換蛋白質複合体であり得る。このとき、上記核酸－蛋白質複合体は、ガイドＲＮＡ－シトシン塩基置換蛋白質複合体であり得る。

【0422】

このとき、上記ガイドＲＮＡ－アデニン塩基置換蛋白質複合体は、ガイドＲＮＡとアデニン塩基置換蛋白質間に非共有結合によって形成されたものであってもよい。

【0423】

このとき、上記ガイドＲＮＡ－シトシン塩基置換蛋白質複合体は、ガイドＲＮＡとシトシン塩基置換蛋白質間に非共有結合によって形成されたものであってもよい。

【0424】

上記塩基変形用組成物は、非ベクターの形態であり得る。

【0425】

このとき、上記非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体またはｍＲＮＡであり得る。

【0426】

上記塩基変形用組成物は、ベクターの形態であり得る。

【0427】

上記ベクターの関連説明は、上記の通りである。

【0428】

一例として、塩基変形用組成物は、ＣＲＩＳＰＲ酵素およびアデノシンデアミナーゼを含むアデニン塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を含むことができる。

【0429】

このとき、ＣＲＩＰＳＲ酵素は、野生型ＣＲＩＰＳＲ酵素またはＣＲＩＰＳＲ酵素変異体であり得る。

【0430】

このとき、上記ＣＲＩＰＳＲ酵素変異体は、ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）であり得る。

【0431】

上記アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ，Ｔａｄ２ｐ，ＡＤＡ，ＡＤＡ１，ＡＤＡ２，ＡＤＡＲ２，ＡＤＡＴ２，ＡＤＡＴ３またはその変異体であり得る。

【0432】

上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－[アデノシンデアミナーゼ]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0433】

上記アデニン塩基置換蛋白質は、Ｎ末端－[アデノシンデアミナーゼ]－[ＣＲＩＳＰＲ酵素]－Ｃ末端の順に構成することができる。

【0434】

このとき、上記アデニン塩基置換蛋白質は、追加として連結ドメインをさらに含むことができる。

【0435】

上記塩基変形用組成物は、１つ以上のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を追加でさらに含むことができる。

【0436】

このとき、塩基変形用組成物は、ガイドＲＮＡ－アデニン塩基置換蛋白質複合体、すなわち、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｉｅｎ（ＲＮＰ）の形態であり得る。

【0437】

本明細書によって開示される発明の一態様は、一塩基置換蛋白質またはそれを含む一塩基置換組成物の用途である。

【0438】

本出願で提供する一塩基置換蛋白質を通じて次の用途を提供することができる。

【0439】

塩基変形用組成物は、標的遺伝子内に１つ以上のヌクレオチドの塩基を人為的に変形させるために使用することができる。

【0440】

（ｉ）特定の遺伝子の標的化する領域（ｒｅｇｉｏｎ）の１つ以上のヌクレオチドの塩基を人為的に変形することによって、その変形された核酸配列から発現した物質を識別できないように突然変異した部分、すなわち抗体耐性を有するエピトープに対する情報を得るために使用することができる。

【0441】

（ｉｉ）特定の遺伝子の標的化する領域（ｒｅｇｉｏｎ）の１つ以上のヌクレオチドの塩基を人為的に変形することによって、その変形された核酸配列から発現した物質の特定の薬物に対する感度の低下または喪失の有無に関する情報を得るために使用される。すなわち、特定の薬物に影響を与える標的遺伝子または標的遺伝子がコードする蛋白質（以下、標的蛋白質と記す）の１つの領域を探索または確認するために使用することができる。

【0442】

（ｉｉｉ）特定の遺伝子の標的化する領域（ｒｅｇｉｏｎ）の１つ以上のヌクレオチドの塩基を人為的に変形することによって、その変形された核酸配列から発現した物質が特定の薬物に対する感度が増加するかどうかに関する情報を得るために使用することができる。すなわち、特定の薬物に感度の増加に影響を与える標的遺伝子または標的遺伝子がコードする蛋白質（以下、標的蛋白質と記す）の１つの領域を探索または確認するために使用することができる。

【0443】

（ｉｖ）特定の遺伝子の標的化する領域（ｒｅｇｉｏｎ）の１つ以上のヌクレオチドの塩基を人為的に変形することによって、その変形された核酸配列から発現した物質がウイルスに耐性を有するかどうかに関する情報を得るために使用することができる。すなわち、ウイルス耐性遺伝子またはウイルス耐性蛋白質スクリーニングに使用することができる。

【0444】

＜第１用途－エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）スクリーニング＞
一実施例として、一塩基置換蛋白質またはそれを含む塩基置換用組成物はエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）スクリーニングに使用することができる。

【0445】

「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」とは、抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞など免疫系が抗原を識別するようにする抗原の特定の部分を意味し、抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）とも呼ばれる。蛋白質のエピトープは、形とエピトープを識別する抗体の特定の部分である抗原結合部位との作用方式によって立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ）と線形エピトープ（ｌｉｎｅａｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ）に大きく分かれる。立体構造エピトープは、抗原、すなわち、蛋白質の不連続的なアミノ酸配列からなる。立体構造エピトープは、抗体の抗原結合部位の３次元構造と反応する。ほとんどのエピトープは立体構造エピトープイである。逆に、線形エピトープは、抗体の抗原結合部位の１次元構造と反応して、抗原の線形エピトープを構成するアミノ酸は連続的なアミノ酸配列からなる。

【0446】

「エピトープスクリーニング」とは、抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞など免疫系が抗原を識別するようにする抗原の特定の部分を探索または確認することであり、また、抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞など免疫系が抗原を識別できないように突然変異された抗原の特定の部分を探索または確認する方法、組成物、キットなどを意味する。このとき、上記抗体、Ｂ細胞、Ｔ細胞など免疫系が抗原を識別できないように突然変異された抗原の特定の部分は抗体耐性を有するエピトープであり得る。

【0447】

一塩基置換蛋白質またはそれを含む塩基置換用組成物は、一塩基多型（ＳＮＰ）を人為的に生成し、生体内変化、すなわち、特定因子の発現の生成、抑制、増加または低下、特定機能の生成または消失、または疾患の有無または外部薬物または化合物などの反応性の違い、例えば、エピトープとして利用可能な配列および薬物の耐性誘発の有無に関与する一塩基多型の位置を提供することができる。

【0448】

上記一塩基置換蛋白質および塩基置換用組成物の関連説明は上記の通りである。

【0449】

上記エピトープスクリーニングのために、一塩基置換蛋白質はゲノム内で人為的に一塩基多型を誘発するために使用することができる。

【0450】

このとき、上記人為的な一塩基多型は点突然変異を誘発することができる。

【0451】

点突然変異は、１つのヌクレオチドが変形されて現れる突然変異をいう。点突然変異にはミスセンス（ｍｉｓｓｅｎｓｅ）突然変異、ナンセンス（ｎｏｎｓｅｎｓｅ）突然変異、沈黙（ｓｉｌｅｎｃｅ）突然変異がある。

【0452】

ミスセンス突然変異は、１つ以上の変形されたヌクレオチドによって変異したコドンが他のアミノ酸をコードすることを意味する。ナンセンス突然変異は、１つ以上の変形されたヌクレオチドによって変異したコドンが終結コドンである場合をいう。沈黙突然変異は、１つ以上の変形されたヌクレオチドによって変異したコドンが、変異が起こらなかったコドンと同じアミノ酸をコードする場合をいう。

【0453】

一例として、塩基配列ＡがＣ，Ｔ，Ｇなどの他の塩基配列に置換することによって、他のアミノ酸をコードするコドンに変更することができる。すなわち、ミスセンス突然変異が誘発される可能性がある。例えば、ＡがＣに置換される場合、ロイシンはグリシンに変わり得る。

【0454】

別の例として、塩基配列ＡがＣ，Ｔ，Ｇなどの他の塩基配列に置換することによって、同じアミノ酸をコードするコドンに変更することができる。すなわち、沈黙突然変異が誘発される可能性がある。例えば、ＡがＣに置換される場合、同じプロリンをコードするコドンを有することができる。

【0455】

また、別の例として、ＡがＣ，Ｔ，Ｇなどの他の塩基配列に置換されてＴＡＧ，ＴＧＣおよびＴＡＡ中のいずれか１つが生成される場合、ＵＡＡ，ＵＡＧおよびＵＧＡ中のいずれかの終結コドンを有することができる。すなわち、ナンセンス突然変異が誘発することができる。

【0456】

上記一塩基置換蛋白質は、遺伝子内に１つ以上のヌクレオチドの塩基に人為的な置換を誘導または発生させることで点突然変異を誘発することができる。

【0457】

上記塩基置換用組成物は、遺伝子内に１つ以上のヌクレオチドの塩基に人為的な置換を誘導または発生させることで点突然変異を誘発することができる。

【0458】

上記一塩基の人為的な置換誘導は上記の通りである。

【0459】

一塩基置換蛋白質またはそれを含む塩基置換用組成物によって生成される点突然変異によってコード化した蛋白質は、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列が変更された蛋白質変異体であり得る。

【0460】

例えば、ＥＧＦＲをコードする遺伝子を一塩基置換蛋白質またはそれを含む塩基置換用組成物で点突然変異を誘発させた場合、生成された点突然変異によってコード化した蛋白質は野生型ＥＧＦＲと少なくとも１つ以上のアミノ酸配列が変更されたＥＧＦＲ変異体であり得る。

【0461】

変更された１つ以上のアミノ酸は似た特性を有するアミノ酸に変更することができる。

【0462】

上記疏水性アミノ酸は、他の疏水性アミノ酸に変更することができる。疏水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのいずれかである。

【0463】

上記塩基性アミノ酸は、他の塩基性アミノ酸に変更することができる。塩基性アミノ酸は、アルギニンまたはヒスチジンのいずれかである。

【0464】

上記酸性アミノ酸は、他の酸性アミノ酸に変更することができる。酸性アミノ酸は、グルタミン酸またはアスパラギン酸のいずれかである。

【0465】

上記極性アミノ酸は、他の極性アミノ酸に変更することができる。極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミンのいずれかである。

【0466】

変更された１つ以上のアミノ酸は、異なる特性を有するアミノ酸に変更することができる。

【0467】

一例として、上記アミノ酸は、疏水性アミノ酸が極性アミノ酸に変更することができる。

【0468】

別の例では、上記アミノ酸は、疏水性アミノ酸が酸性アミノ酸に変更することができる。

【0469】

一例として、上記アミノ酸は、疏水性アミノ酸が塩基性アミノ酸に変更することができる。

【0470】

別の例では、上記極性アミノ酸は、疏水性アミノ酸に変更することができる。

【0471】

一例として、上記酸性アミノ酸は、塩基性アミノ酸に変更することができる。

【0472】

別の例では、上記塩基性アミノ酸は、サムスンアミノ酸に変更することができる。

【0473】

上記少なくとも１つ以上のアミノ酸配列が変更された蛋白質変異体は、３次元蛋白質構造を変形することができる。これは、アミノ酸配列中のいずれか１つ以上のアミノ酸が他の特性のアミノ酸配列に変更される場合、アミノ酸配列間の結合力が変化しつつ、３次元構造が変更することができる。３次元構造が変更された場合、立体構造エピトープが変形することができる。上記の変形は、本出願で提供する一塩基置換蛋白質またはそれを含む組成物を使用して誘導することができる。

【0474】

例えば、ＡＴＭをコードする遺伝子を一塩基置換蛋白質またはそれを含む塩基変形用組成物で点突然変異を誘発させた場合、生成された点突然変異によってコード化したＡＴＭ変異体は、３次元構造が一部変更されることができ、それによって立体構造エピトープが変形されることができる。上記の変形は、本出願で提供される単一塩基置換蛋白質またはそれを含む組成物を使用して誘導することができる。

【0475】

人為的な一塩基多型を含む遺伝子は、合成される蛋白質の量を制御することができる。

【0476】

一例として、上記人為的な一塩基多型を含む遺伝子は、ｍＲＮＡ転写する量の増加または減少することができる。これは、蛋白質合成量を増加または減少することができる。

【0477】

別の例として、上記遺伝子内の調節領域の１つ以上の人為的な一塩基多型を含む遺伝子の場合、上記一塩基多型を含む遺伝子から合成される蛋白質の量を増加または減少することができる。

【0478】

遺伝子内に存在する人為的な一塩基多型は蛋白質の活性を調節することができる。

【0479】

一例として、上記の１つ以上の人為的な一塩基多型は蛋白質の活性を促進および／または低下することができる。

【0480】

例えば、核膜受容体をコードする遺伝子内に人為的な一塩基多型が含まれる場合、リガンドを認知し、リガンドと結合して信号を伝達する過程に関与するすべての因子またはメカニズム（燐酸化、アセチル化など）を活性化させたり低下させたりすることができる。

【0481】

例えば、特定の酵素をコードする遺伝子内に人為的な一塩基多型が含まれる場合、酵素の機能、例えば、アセチラーゼの場合、標的因子のアセチル化させる程度を促進させるか、または低下させることができる。

【0482】

遺伝子内に存在する人為的な一塩基多型は蛋白質の機能を変更することができる。

【0483】

一例として、１つ以上の人為的な一塩基多型によって蛋白質の元の機能を追加および／または抑制することができる。

【0484】

例えば、核膜受容体をコードする遺伝子内に人為的な一塩基多型が含まれる場合、リガンドを認知および／または結合する能力を抑制することができる

【0485】

または、例えば、核膜受容体をコードする遺伝子内に人為的な一塩基多型が含まれる場合、リガンドと結合して下流因子（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｆａｃｔｏｒ）に信号を伝達する機能中の一部を抑制することができる。

【0486】

一実施例として、エピトープスクリーニング方法は、
ａ）標的遺伝子内に存在する標的核酸配列に相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡを発現できる細胞を用意することと、
－このとき、上記細胞は標的核酸配列を含む－、
ｂ）上記細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を導入することと、
ｃ）上記ｂ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｄ）生存した細胞分離することと、
ｅ）分離した細胞で標的遺伝子の核酸配列を分析することと、
を含む方法であり得る。

【0487】

一実施例として、エピトープスクリーニング方法は、
ａ）標的遺伝子内に存在する標的核酸配列に相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡを発現できる細胞を用意することと、
－このとき、上記細胞は標的核酸配列を含む－、
ｂ）上記細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を導入することと、
ｃ）上記ｂ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｄ）生存した細胞分離することと、
ｅ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0488】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0489】

一実施例として、エピトープスクリーニング方法は、
ａ）標的核酸配列を含む細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸、およびガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0490】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0491】

他の実施例として、エピトープスクリーニング方法は、
ａ）塩基置換用組成物を標的核酸配列を含む細胞に導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的遺伝子の核酸配列を分析することと、
を含む方法であり得る。

【0492】

他の実施例として、エピトープスクリーニング方法は、
ａ）塩基置換用組成物を標的核酸配列を含む細胞に導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0493】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0494】

上記ガイドＲＮＡライブラリーは、標的配列の一部の核酸配列と相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡセットであり得る。同じガイドＲＮＡライブラリーをコードする核酸が各細胞に導入されても各細胞はそれぞれ異なるガイドＲＮＡを含むことができる。同じガイドＲＮＡライブラリーをコードする核酸が各細胞に導入された結果、各細胞は互いに同じガイドＲＮＡを含むことができる。

【0495】

上記ガイドＲＮＡの関連説明は上記の通りである。

【0496】

上記一塩基置換蛋白質は、アデニン置換蛋白質またはシトシン置換蛋白質であり得る。

【0497】

上記一塩基置換蛋白質、アデニン置換蛋白質およびシトシン置換蛋白質の関連説明は上記の通りである。

【0498】

上記の導入は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、およびＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合蛋白質方法のうち選択される１つ以上の方法で実行することができる。

【0499】

上記の処理する抗体は、標的遺伝子がコードする蛋白質（以下、標的蛋白質と記す）を識別する抗体であってもよく、上記標的蛋白質のエピトープと反応できる抗体であり得る。

【0500】

上記の生存した細胞は、上記の処理した抗体と反応しない細胞であり得る。

【0501】

上記から分離した細胞は、標的遺伝子に少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形を含む細胞であり得る。

【0502】

このとき、上記の１つ以上のヌクレオチドの変形は、標的遺伝子内に発生した１つ以上の人為的な一塩基多型（ＳＮＰ）であり得る。

【0503】

このとき、上記の１つ以上の人為的な一塩基多型（ＳＮＰ）は、点突然変異を誘発することができる。

【0504】

上記標的遺伝子に存在する少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形、すなわち、１つ以上の人為的な一塩基多型を確認することができる。これにより、標的化する情報を得ることができる。

【0505】

このとき、確認された少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形、すなわち、１つ以上の人為的な一塩基多型を含む核酸配列はエピトープをコードする核酸配列であり得る。

【0506】

＜第２用途－薬物耐性遺伝子または薬物耐性蛋白質スクリーニング＞
他の一実施例として、一塩基置換蛋白質またはそれを含む塩基置換用組成物は、薬物耐性遺伝子または薬物耐性蛋白質スクリーニングに使用することができる。

【0507】

薬物耐性スクリーニングは、特定の薬物に関する感度の減少または喪失に影響を与える標的遺伝子または標的遺伝子がコードする蛋白質（以下、標的蛋白質と記す）の一領域に関する情報を提供することができる。本出願で提供する一塩基置換蛋白質またはそれを含む組成物を使用して上記一領域を探索または確認することができる。

【0508】

本出願は、薬物耐性遺伝子または薬物耐性蛋白質のスクリーニング方法を提供する。以下、上記スクリーニング方法の一例として、具体的な各段階について説明する。

【0509】

ｓｇＲＮＡライブラリーの用意
標的遺伝子の一領域と相補的に結合できるガイドＲＮＡを用意する。一実施例では、標的遺伝子内のエクソン（ｅｘｏｎ）の一領域と相補的に結合できるガイドＲＮＡを用意する。このとき、上記用意されるガイドＲＮＡは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、５００個、１０００個、２０００個、または３０００個以上であり得る。このとき、上記用意される複数個のガイドＲＮＡは、標的遺伝子内のエクソンの一領域と相補的に結合することができる。

【0510】

一例として、上記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子内のエクソン領域の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、または３０個以上の領域に対応するヌクレオチド配列と相補的に結合できる部位を含む。

【0511】

ガイドＲＮＡの発現可能な形質転換細胞の用意
標的遺伝子内のエクソンの一領域と相補的に結合できるガイドＲＮＡを製造できる細胞を用意する。上記細胞は上記用意されたｓｇＲＮＡライブラリーをコードするベクターによって形質感染されたことであり得る。このとき、上記細胞は、ｓｇＲＮＡライブラリーにコードした１つ以上のガイドＲＮＡを発現することができる。

【0512】

一塩基置換蛋白質の上記形質転換細胞内の導入
ｓｇＲＮＡライブラリーにコードした１つ以上のガイドＲＮＡを発現できる形質転換細胞内に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を導入する。上記一塩基置換蛋白質は、標的領域内の少なくとも１つ以上の塩基の任意の塩基への置換を誘導することができる。

【0513】

上記一塩基置換蛋白質は、標的遺伝子内の少なくとも１つ以上のＳＮＰの発生を誘導することができる。

【0514】

上記一塩基置換蛋白質は、標的領域内の少なくとも１つ以上のＳＮＰの発生を誘導することができる。

【0515】

一例として、上記導入された一塩基置換蛋白質がシチジン置換蛋白質である場合、標的領域内の少なくとも１つ以上のシトシンは任意の塩基で置換することができる。

【0516】

一例として、上記導入された一塩基置換蛋白質がアデニン置換蛋白質である場合、標的領域内の少なくとも１つ以上のアデニンは任意の塩基で置換することができる。

【0517】

形質転換細胞の用意
上記ガイドＲＮＡの発現可能な形質転換細胞の用意および一塩基置換蛋白質の上記形質転換細胞内の導入段階の代わりに、下記のような段階でも本出願の方法を実行できる。

【0518】

標的遺伝子を含む細胞を用意する。

【0519】

上記細胞に上記一塩基置換蛋白質および上記ガイドＲＮＡを導入する。このとき、上記一塩基置換蛋白質およびガイドＲＮＡは、ＲＮＰ複合体（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）の形態で導入するか、またはこれらをそれぞれコーディングする核酸の形態で導入することができる。

【0520】

上記形質転換細胞に薬物または治療剤の処理
上記形質転換細胞に抗生物質、抗癌剤または抗体など、薬物（ｄｒｕｇ）または治療剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）として使用される物質を処理する。このとき、上記処理される薬物または治療剤は、上記標的遺伝子から発現されるペプチド、ポリペプチド、または蛋白質と特異的に結合したり反応したりすることができる。または、上記処理される薬物または治療剤は、上記標的遺伝子から発現されるペプチド、ポリペプチド、または蛋白質の活性または機能を低下または喪失させることができる。または、上記処理される薬物または治療剤は、上記標的遺伝子から発現されるペプチド、ポリペプチド、または蛋白質の活性または機能を改善または向上することができる。

【0521】

上記形質転換細胞は、上記薬物または治療剤によって死滅することができる。

【0522】

上記形質転換細胞は、上記薬物または治療剤の処理にもかかわらず、生存することができる。

【0523】

細胞の選別
上記薬物または治療剤の処理にもかかわらず、生存した細胞を分離、選別、または取得することができる。

【0524】

上記生存した細胞は、少なくとも１つ以上のガイドＲＮＡおよび一塩基置換蛋白質によって標的遺伝子の標的領域内の少なくとも１つ以上の塩基が任意の塩基に置換したことであり得る。上記一塩基置換蛋白質によって標的遺伝子内の塩基が任意の塩基に置換した細胞は、上記処理された薬物または治療剤に耐性を有することができる。

【0525】

このとき、上記生存した細胞の標的遺伝子から発現されるペプチド、ポリペプチド、または蛋白質は、上記薬物または治療剤に耐性を有することができる。

【0526】

情報の取得（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）
上記生存した細胞のゲノムまたは標的遺伝子の核酸配列を分析して上記処理された薬物または治療剤に耐性を有する部位に関する情報を得ることができる。

【0527】

上記生存した細胞のゲノムまたは標的遺伝子の核酸配列を分析して上記標的遺伝子から発現されるペプチド、ポリペプチド、または蛋白質の構造または機能の変更の有無に関する情報を得ることができる。上記変更される構造または機能は、薬物に耐性を有するかどうかに決定的な役割を果たすことができる。

【0528】

一実施例では、薬物耐性遺伝子または薬物耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）標的遺伝子を含む細胞を用意することと、
ｂ）上記細胞に、標的核酸配列に相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡまたはこれをコーディングする核酸、および一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を導入することと、
ｃ）上記ｂ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｄ）生存した細胞を分離することと、
ｅ）分離した細胞で標的遺伝子の核酸配列を分析することと、
を含む方法であり得る。

【0529】

一実施例では、薬物耐性遺伝子または薬物耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）標的遺伝子内に存在する標的核酸配列に相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡを発現できる細胞を用意することと、
ｂ）上記細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を導入することと、
ｃ）上記ｂ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｄ）生存した細胞を分離することと、
ｅ）分離した細胞で標的遺伝子の核酸配列を分析することと、
を含む方法であり得る。

【0530】

一実施例では、薬物耐性遺伝子または薬物耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）標的遺伝子内に存在する標的核酸配列に相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡを発現できる細胞を用意することと、
ｂ）上記細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を導入することと、
ｃ）上記ｂ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｄ）生存した細胞を分離することと、
ｅ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0531】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0532】

一実施例では、薬物耐性遺伝子または薬物耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸、およびガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0533】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0534】

他の実施例として、薬物耐性遺伝子または薬物耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）塩基置換用組成物を、標的核酸配列を含む細胞に導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的遺伝子の核酸配列を分析することと、
を含む方法であり得る。

【0535】

他の実施例として、薬物耐性遺伝子または薬物耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）塩基置換用組成物を、標的核酸配列を含む細胞に導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0536】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。
上記ガイドＲＮＡライブラリーは、標的配列の一部の核酸配列と相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡセットであり得る。同じガイドＲＮＡライブラリーをコードする核酸が各細胞に導入されても各細胞はそれぞれ異なるガイドＲＮＡを含むことができる。同じガイドＲＮＡライブラリーをコードする核酸が各細胞に導入された結果、各細胞は互いに同じガイドＲＮＡを含むことができる。

【0537】

上記ガイドＲＮＡライブラリーは、標的配列の一部の核酸配列と相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡセットであり得る。同じガイドＲＮＡライブラリーをコードする核酸が各細胞に導入されても各細胞はそれぞれ異なるガイドＲＮＡを含むことができる。同じガイドＲＮＡライブラリーをコードする核酸が各細胞に導入された結果、各細胞は互いに同じガイドＲＮＡを含むことができる。

【0538】

上記ガイドＲＮＡの関連説明は上記の通りである。

【0539】

上記一塩基置換蛋白質は、アデニン置換蛋白質またはシトシン置換蛋白質であり得る。

【0540】

上記一塩基置換蛋白質、アデニン置換蛋白質およびシトシン置換蛋白質の関連説明は上記の通りである。

【0541】

上記の導入は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、およびＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合蛋白質方法のうち選択される１つ以上の方法で実行することができる。

【0542】

上記の処理する薬物は、標的遺伝子がコードする蛋白質（以下、標的蛋白質と記す）の活性、機能を阻害または抑制する物質であり得る。このとき、上記物質は、生物学的物質（ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質、ペプチド、抗体など）または非生物学的物質（化合物など）であり得る。

【0543】

上記の処理する薬物は、標的遺伝子がコードする蛋白質（以下、標的蛋白質と記す）の活性、機能を促進または増加させる物質であり得る。このとき、上記物質は、生物学的物質（ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質、ペプチド、抗体など）または非生物学的物質（化合物など）であり得る。

【0544】

上記の生存した細胞は、上記の処理した薬物によって標的蛋白質の活性、機能が変わらない、すなわち、薬物耐性を有する細胞であり得る。

【0545】

上記の分離した細胞は、標的遺伝子に少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形を含む細胞であり得る。

【0546】

このとき、上記の１つ以上のヌクレオチドの変形は、標的遺伝子内に発生した１つ以上の人為的な一塩基多型（ＳＮＰ）であり得る。

【0547】

このとき、上記の１つ以上の人為的な一塩基多型（ＳＮＰ）は点突然変異を誘発することができる。

【0548】

上記の標的遺伝子に存在する少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形、すなわち、１つ以上の人為的な一塩基多型を確認することができる。これにより、標的化する情報を得ることができる。

【0549】

このとき、確認された少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形、すなわち、１つ以上の人為的な一塩基多型を含む核酸配列は、薬物耐性に影響を与える蛋白質の一領域をコードする核酸配列であり得る。

【0550】

上記の処理する薬物は抗癌剤であり得る。ただし、抗癌剤に制限されず、公知のすべての疾病または疾患を治療するために使用される物質または治療剤も含まれる。

【0551】

一例として、上記薬物は、表皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）を阻害して癌細胞が成長を妨げたり、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）を遮断して癌細胞への血管新生を阻害したり、未分化リンパ腫キナーゼ（Ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｋｉｎａｓｅ）を阻害したりするなどのメカニズムを使用することができる。

【0552】

一実施例では、薬物耐性突然変異スクリーニング方法として、標的遺伝子を含む細胞に上記一塩基置換組成物を導入して上記標的遺伝子上で人為的にＳＮＰを誘導する（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）ことと、上記細胞に特定の薬物を処理する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）ことと、標的とするＳＮＰを含む生存した細胞を選別する（ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ）ことと、上記選別された細胞を分析することによって標的とするＳＮＰに関する情報（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を得る（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）ことと、を含み、このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連したことを含む薬物耐性突然変異スクリーニング方法であり得る。

【0553】

一実施例では、上記標的遺伝子は、ＥＧＦＲ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、または未分化リンパ腫キナーゼ遺伝子であり得る。ただし、これらに限定されない。

【0554】

一実施例では、上記処理する薬物は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、イレッサ（ｉｒｅｓｓａ）、タルセバ（ｔａｒｃｅｖａ）、ジオトリフ（ｇｉｏｔｒｉｆ）、タグリッソ（ｔａｇｒｉｓｓｏ）、ザルコリ（Ｘａｌｋｏｒｉ）、ザイカディア（ｚｙｋａｄｉａ）、アレクチニブ（ａｌｅｃｔｉｎｉｂ）、アルンブリグ（ｂｒｉｇａｔｉｎｉｂ）、アバスチン（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、アバスチン（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、キトルダ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、オプジボ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、チセントリック（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、インピンジ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、またはＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ（オシメルチニブ）であり得る。ただし、これらに限定されない。

【0555】

一実施例として、Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂに耐性を有するＥＧＦＲ突然変異遺伝子をスクリーニングする方法は、以下のように実行することができる。

【0556】

一実施例では、薬物耐性突然変異スクリーニング方法として、ＥＧＦＲ遺伝子を含む細胞に一塩基置換組成物を導入して上記ＥＧＦＲ遺伝子上で人為的にＳＮＰを誘導する（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）ことと、上記細胞に薬物を処理する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）ことと、標的とするＳＮＰを含む生存した細胞を選別する（ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ）ことと、上記選別された細胞を分析することによって標的とするＳＮＰに関する情報（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を得る（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）ことと、を含み、このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記ＥＧＦＲの構造または機能に関連したことを含む薬物耐性突然変異スクリーニング方法であり得る。

【0557】

このとき、上記処理される薬物はＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂであり得る。ただし、これに限定されず、ＥＧＦＲの機能を阻害したり喪失させたりする物質であり得る。

【0558】

一実施例で、薬物耐性突然変異スクリーニング方法として、ＥＧＦＲ遺伝子を含む細胞に一塩基置換組成物を導入して上記ＥＧＦＲ遺伝子上で人為的にＳＮＰを誘導する（ｉｎｄｕｃｉｎｇ）ことであって、上記一塩基置換組成物は、Ｃ７９７Ｓ ｓｇＲＮＡ１および／またはＣ７９７Ｓ ｓｇＲＮＡ２を含むことと、上記細胞に薬物を処理する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）ことと、標的とするＳＮＰを含む生存した細胞を選別する（ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ）ことと、上記選別された細胞を分析することによって標的とするＳＮＰに関する情報（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を得る（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）ことと、を含み、このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記ＥＧＦＲの構造または機能に関連したことを含む薬物耐性突然変異スクリーニング方法であり得る。

【0559】

このとき、上記処理される薬物はＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂであり得る。ただし、これに限定されず、ＥＧＦＲの機能を阻害したり喪失させたりする物質であり得る。

【0560】

上記の実施例により、Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂに耐性を有するＥＧＦＲ部位を確認した。上記Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂに耐性を有するＥＧＦＲ部位は、上記導入された一塩基置換組成物または一塩基置換蛋白質によってＳＮＰが誘導されたことを確認した。

【0561】

すなわち、本出願で提供する一塩基置換蛋白質を使用して細胞内のＥＧＦＲ遺伝子に存在するシトシンを任意の塩基に置換することによって上記Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂに耐性を示すことができる様々な位置などに関する情報を把握することができる。

【0562】

一実施例として、本出願は、ＥＧＦＲ耐性ＳＮＰ情報を取得する方法を提供することができる：
ａ）細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸、およびガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0563】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0564】

＜第３用途－薬物感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）スクリーニング＞
一実施例として、一塩基置換蛋白質またはそれを含む塩基変形用組成物は、薬物感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）スクリーニングに使用することができる。

【0565】

「薬物感作または薬物敏感化」とは、特定の薬物に対して敏感になる状態を指し、特定の薬物に対する感度が増加した状態を意味する。逆に、「脱感作」とは、特定の薬物に対する感度が失われた状態を意味し、脱感作は特定の薬物に耐性がある状態を含む。

【0566】

薬物感作スクリーニングは、特定の薬物に対する感度の増加に影響を与える標的遺伝子または標的遺伝子がコードする蛋白質（以下、標的蛋白質と記す）の一領域を探索または確認する方法、組成物、キットなどを意味する。

【0567】

一実施例として、薬物感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）スクリーニング方法は、
ａ）標的遺伝子内に存在する標的核酸配列に相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡを発現できる細胞を用意することと、
ｂ）上記細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を導入することと、
ｃ）上記ｂ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｄ）生存した細胞を分離することと、
ｅ）分離した細胞で標的遺伝子の核酸配列を分析することと、
を含む方法であり得る。

【0568】

一実施例で、薬物感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）スクリーニング方法は、
ａ）標的遺伝子内に存在する標的核酸配列に相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡを発現できる細胞を用意することと、
－このとき、上記細胞は標的核酸配列を含む－、
ｂ）上記細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を導入することと、
ｃ）上記ｂ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｄ）生存した細胞を分離することと、
ｅ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0569】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0570】

一実施例では、薬物感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）スクリーニング方法は、
ａ）標的核酸配列を含む細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸、およびガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0571】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0572】

他の実施例として、薬物感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）スクリーニング方法は、
ａ）塩基置換用組成物を、標的核酸配列を含む細胞に導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的遺伝子の核酸配列を分析することと、
を含む方法であり得る。

【0573】

他の実施例として、薬物感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）スクリーニング方法は、
ａ）塩基置換用組成物を、標的核酸配列を含む細胞に導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0574】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0575】

上記ガイドＲＮＡライブラリーは、標的配列の一部の核酸配列と相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡセットであり得る。同じガイドＲＮＡライブラリーをコードする核酸が各細胞に導入されても各細胞はそれぞれ異なるガイドＲＮＡを含むことができる。同じガイドＲＮＡライブラリーをコードする核酸が各細胞に導入された結果、各細胞は互いに同じガイドＲＮＡを含むことができる。

【0576】

上記ガイドＲＮＡの関連説明は、上記の通りである。

【0577】

上記一塩基置換蛋白質は、アデニン置換蛋白質またはシトシン置換蛋白質であり得る。

【0578】

上記一塩基置換蛋白質、アデニン置換蛋白質およびシトシン置換蛋白質の関連説明は、上記の通りである。

【0579】

上記の導入は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、およびＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合蛋白質方法のうち選択される１つ以上の方法で実行することができる。

【0580】

上記の処理する薬物は、標的遺伝子がコードする蛋白質（以下、標的蛋白質と記す）の活性、機能を阻害または抑制する物質であり得る。このとき、上記物質は、生物学的物質（ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質、ペプチド、抗体など）または非生物学的物質（化合物など）であり得る。

【0581】

上記の処理する薬物は、標的蛋白質の活性、機能を促進または増加させる物質であり得る。このとき、上記物質は、生物学的物質（ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質、ペプチド、抗体など）または非生物学的物質（化合物など）であり得る。

【0582】

上記の分離した細胞は、上記ｃ）で処理した薬物によって標的蛋白質の活性、機能が著しく変化した、すなわち、薬物感受性が増加した細胞であり得る。

【0583】

このとき、上記薬物の感度が増加した細胞は、薬物処理後に生存した細胞であり得る。

【0584】

上記の分離した細胞は、標的遺伝子に少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形を含む細胞であり得る。

【0585】

このとき、上記の１つ以上のヌクレオチドの変形は、標的遺伝子内に発生した１つ以上の人為的な一塩基多型（ＳＮＰ）であり得る。

【0586】

このとき、上記の１つ以上の人為的な一塩基多型（ＳＮＰ）は、点突然変異を誘発することができる。

【0587】

上記の標的遺伝子に存在する少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形、すなわち、１つ以上の人為的な一塩基多型を確認することができる。これにより、標的化する情報を得ることができる。

【0588】

このとき、確認された少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形、すなわち、１つ以上の人為的な一塩基多型を含む核酸配列は、薬物感度の増加に影響を与える蛋白質の一領域をコードする核酸配列であり得る。

【0589】

＜第４用途－ウイルス耐性遺伝子またはウイルス耐性蛋白質のスクリーニング＞
他の一実施例として、一塩基置換蛋白質またはそれを含む塩基変形用組成物は、ウイルス耐性遺伝子またはウイルス耐性蛋白質のスクリーニングに使用することができる。

【0590】

一実施例として、ウイルス耐性遺伝子またはウイルス耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）標的遺伝子内に存在する標的核酸配列に相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡを発現できる細胞を用意することと、
ｂ）上記細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を導入することと、
ｃ）上記ｂ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｄ）生存した細胞を分離することと、
ｅ）分離した細胞で標的遺伝子の核酸配列を分析することと、
を含む方法であり得る。

【0591】

一実施例では、ウイルス耐性遺伝子またはウイルス耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）標的遺伝子内に存在する標的核酸配列に相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡを発現できる細胞を用意することと、
－このとき、上記細胞は標的核酸配列を含む－、
ｂ）上記細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸を導入することと、
ｃ）上記ｂ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｄ）生存した細胞を分離することと、
ｅ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0592】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0593】

一実施例では、ウイルス耐性遺伝子またはウイルス耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）標的核酸配列を含む細胞に一塩基置換蛋白質またはそれをコードする核酸、およびガイドＲＮＡライブラリー中のいずれか１つ以上のガイドＲＮＡまたはそれをコードする核酸を導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0594】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0595】

他の実施例として、ウイルス耐性遺伝子またはウイルス耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）塩基置換用組成物を、標的核酸配列を含む細胞に導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的遺伝子の核酸配列を分析することと、
を含む方法であり得る。

【0596】

他の実施例として、ウイルス耐性遺伝子またはウイルス耐性蛋白質のスクリーニング方法は、
ａ）塩基置換用組成物を、標的核酸配列を含む細胞に導入することと、
ｂ）上記ａ）の細胞に薬物または治療剤を処理することと、
ｃ）生存した細胞を分離することと、
ｄ）分離した細胞で標的とするＳＮＰに関する情報を得ることと、
を含む方法であり得る。

【0597】

このとき、上記標的とするＳＮＰは、上記標的遺伝子から発現される蛋白質の構造または機能に関連するものであってもよい。

【0598】

上記ガイドＲＮＡライブラリーは、標的配列の一部の核酸配列と相補的に結合できる１つ以上のガイドＲＮＡセットであり得る。同じガイドＲＮＡライブラリーをコードする核酸が各細胞に導入されても各細胞はそれぞれ異なるガイドＲＮＡを含むことができる。同じガイドＲＮＡライブラリーをコードする核酸が各細胞に導入された結果、各細胞は互いに同じガイドＲＮＡを含むことができる。

【0599】

上記ガイドＲＮＡの関連説明は、上記の通りである。

【0600】

上記一塩基置換蛋白質は、アデニン置換蛋白質またはシトシン置換蛋白質であり得る。

【0601】

上記一塩基置換蛋白質、アデニン置換蛋白質およびシトシン置換蛋白質の関連説明は、上記の通りである。

【0602】

上記の導入は、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、およびＰＴＤ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合蛋白質方法のうち選択される１つ以上の方法で実行することができる。

【0603】

上記の処理するウイルスは、標的遺伝子がコードする蛋白質（以下、標的蛋白質と記す）と相互作用して細胞内に導入することができる。

【0604】

上記の生存した細胞は、上記ｃ）で処理したウイルスと相互作用しない、すなわち、ウイルス耐性を有する細胞であり得る。

【0605】

上記の分離した細胞は、標的遺伝子に少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形を含む細胞であり得る。

【0606】

上記の分離した細胞は、標的遺伝子に少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形を含む細胞であり得る。

【0607】

このとき、上記の１つ以上のヌクレオチドの変形は、標的遺伝子内に発生した１つ以上の人為的な一塩基多型（ＳＮＰ）であり得る。

【0608】

このとき、上記の１つ以上の人為的な一塩基多型（ＳＮＰ）は、点突然変異を誘発することができる。

【0609】

上記の標的遺伝子に存在する少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形、すなわち、１つ以上の人為的な一塩基多型を確認することができる。これにより、標的化する情報を得ることができる。

【0610】

このとき、確認された少なくとも１つ以上のヌクレオチドの変形、すなわち、１つ以上の人為的な一塩基多型を含む核酸配列は、ウイルスと相互作用に重要な蛋白質の一領域をコードする核酸配列であり得る。

【0611】

本明細書によって開示される発明の一態様は一塩基置換方法である。

【0612】

上記塩基置換用組成物は、遺伝子内に１つ以上のヌクレオチドの塩基に人為的な変形を誘導または発生することができる。

【0613】

上記人為的な変形または置換は、ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体によって誘導または発生することができる。

【0614】

このとき、上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体は、ｉ）標的核酸配列ターゲッティング、ｉｉ）標的核酸配列切断、ｉｉｉ）標的核酸配列内に１つ以上のヌクレオチドの脱アミノ化、ｉｖ）脱アミノ化された塩基除去、およびｖ）塩基が除去された標的核酸配列の改善または修復する段階のうちの１つ以上の段階で作用することができる。このとき、上記段階は順次的または同時に発生する可能性があり、また、上記段階の順序は変更されてもよい。

【0615】

ｉ）標的核酸配列の標的化
「標的核酸配列」は、標的遺伝子または核酸内に存在するヌクレオチド配列であり、具体的には、標的遺伝子または核酸内に標的領域の一部のヌクレオチド配列であり、このとき、「標的領域」は標的遺伝子または核酸内にガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体によって変形され得る部位である。

【0616】

以下において、標的配列とは、二種類のヌクレオチド配列情報の両方を意味する用語で使用される。例えば、標的遺伝子の場合、標的核酸配列は、標的遺伝子ＤＮＡのｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄの配列情報を意味することもあるし、ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄのヌクレオチド配列情報を意味することもある。

【0617】

例えば、標的核酸配列は、標的遺伝子Ａの標的領域のうち一部のヌクレオチド配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄ）の５’－ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ－３’（配列番号１７）を意味することもあるし、これに対し相補的なヌクレオチド配列（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄ）の５’－ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ－３’（配列番号１８）を意味することもある。

【0618】

標的核酸配列は、５～５０個のヌクレオチド配列であり得る。

【0619】

一実施例として、上記標的核酸配列は、１６個のヌクレオチド配列、１７個のヌクレオチド配列、１８個のヌクレオチド配列、１９個のヌクレオチド配列、２０個のヌクレオチド配列、２１個のヌクレオチド配列、２２個のヌクレオチド配列、２３個のヌクレオチド配列、２４個のヌクレオチド配列、または２５個のヌクレオチド配列であり得る。

【0620】

標的核酸配列は、ガイドＲＮＡ結合配列あるいはガイドＲＮＡ非結合配列を含む。

【0621】

「ガイドＲＮＡ結合配列（ｇｕｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、ガイドＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全な相補性を有するヌクレオチド配列であり、ガイドＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列と相補的に結合できる。標的核酸配列およびガイドＲＮＡ結合配列は、標的遺伝子または核酸によって、すなわち、遺伝子の操作または変形しようとする対象によって変化し得るヌクレオチド配列であり、標的遺伝子または核酸によって様々に設計することができる。

【0622】

「ガイドＲＮＡ非結合配列（ｇｕｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ｎｏｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、ガイドＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全な相同性を有するヌクレオチド配列であり、ガイドＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列と相補的に結合できない。また、ガイドＲＮＡ非結合配列は、ガイドＲＮＡ結合配列と相補性を有するヌクレオチド配列であり、ガイドＲＮＡ結合配列と相補的に結合できる。

【0623】

ガイドＲＮＡ結合配列は、標的核酸配列のうち一部のヌクレオチド配列であり、標的核酸配列の２つの異なる配列順序を有するヌクレオチド配列、すなわち、互いに相補的な結合ができる２つのヌクレオチド配列のうち１つのヌクレオチド配列であり得る。このとき、ガイドＲＮＡ非結合配列は、標的核酸配列のうち、ガイドＲＮＡ結合配列を除いた残りのヌクレオチド配列であり得る。

【0624】

例えば、標的遺伝子Ａの標的領域のうち一部のヌクレオチド配列である５’－ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ－３’（配列番号１７）と、それに相補的なヌクレオチド配列である５’－ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ－３’（配列番号１８）を標的核酸配列とする場合、ガイドＲＮＡ結合配列は、２つの標的核酸配列のうちの１つ、すなわち、５’－ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ－３’（配列番号１７）または５’－ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ－３’（配列番号１８）であり得る。このとき、ガイドＲＮＡ非結合配列は、ガイドＲＮＡ結合配列が５’－ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ－３’（配列番号１７）である場合、５’－ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ－３’（配列番号１８）であってもよく、またはガイドＲＮＡ結合配列が５’－ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ－３’（配列番号１８）である場合、ガイドＲＮＡ非結合配列は５’－ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ－３’（配列番号１７）であり得る。

【0625】

ガイドＲＮＡ結合配列は、標的核酸配列、すなわち、ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄと同じヌクレオチド配列およびｎｏｎ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄと同じヌクレオチド配列から選択される１つのヌクレオチド配列であり得る。このとき、ガイドＲＮＡ非結合配列は、標的核酸配列のうちガイドＲＮＡ結合配列、すなわち、ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄと同じヌクレオチド配列およびｎｏｎ－ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｔｒａｎｄと同じヌクレオチド配列から選択される１つのヌクレオチド配列を除いた残りのヌクレオチド配列であり得る。

【0626】

ガイドＲＮＡ結合配列は、標的核酸配列の長さと同じであり得る。

【0627】

ガイドＲＮＡ非結合配列は、標的核酸配列またはガイドＲＮＡ結合配列の長さと同じであり得る。

【0628】

ガイドＲＮＡ結合配列は、５～５０個のヌクレオチド配列であり得る。

【0629】

一実施例として、上記ガイドＲＮＡ結合配列は、１６個のヌクレオチド配列、１７個のヌクレオチド配列、１８個のヌクレオチド配列、１９個のヌクレオチド配列、２０個のヌクレオチド配列、２１個のヌクレオチド配列、２２個のヌクレオチド配列、２３個のヌクレオチド配列、２４個のヌクレオチド配列、または２５個のヌクレオチド配列であり得る。

【0630】

ガイドＲＮＡ非結合配列は、５～５０個のヌクレオチド配列であり得る。

【0631】

一実施例として、上記ガイドＲＮＡ非結合配列は、１６個のヌクレオチド配列、１７個のヌクレオチド配列、１８個のヌクレオチド配列、１９個のヌクレオチド配列、２０個のヌクレオチド配列、２１個のヌクレオチド配列、２２個のヌクレオチド配列、２３個のヌクレオチド配列、２４個のヌクレオチド配列、または２５個のヌクレオチド配列であり得る。

【0632】

ガイドＲＮＡ結合配列は、ガイドＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全に相補的な結合をすることができ、上記ガイドＲＮＡ結合配列の長さはガイド配列の長さと同じであり得る。

【0633】

上記ガイドＲＮＡ結合配列は、ガイドＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的なヌクレオチド配列であってもよい。例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上の相補的または完全に相補的なヌクレオチド配列であり得る。

【0634】

一例として、上記ガイドＲＮＡ結合配列は、ガイドＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的ではない１～８個のヌクレオチド配列を有するかまたは含むことができる。

【0635】

ガイドＲＮＡ非結合配列は、ガイドＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列と部分的または完全な相同性を有し得、上記ガイドＲＮＡ非結合配列の長さはガイド配列の長さと同じであり得る。

【0636】

上記ガイドＲＮＡ非結合配列は、ガイドＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列に相同性を有するヌクレオチド配列であってもよい。例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上の相同性または完全な相同性であるヌクレオチド配列であり得る。

【0637】

一例として、上記ガイドＲＮＡ非結合配列は、ガイドＲＮＡのガイドドメインに含まれるガイド配列に相同的ではない１～８個のヌクレオチド配列を有するかまたは含むことができる。

【0638】

ガイドＲＮＡ非結合配列は、ガイドＲＮＡ結合配列と相補的に結合でき、上記ガイドＲＮＡ非結合配列は、ガイドＲＮＡ結合配列の長さと同じであり得る。

【0639】

上記ガイドＲＮＡ非結合配列は、ガイドＲＮＡ結合配列に相補的なヌクレオチド配列であってもよい。例えば、少なくとも９０％または９５％以上の相補的または完全に相補的なヌクレオチド配列であり得る。

【0640】

一例として、上記ガイドＲＮＡ非結合配列は、ガイドＲＮＡ結合配列に相補的ではない１～２個のヌクレオチド配列を有するかまたは含むことができる。

【0641】

また、上記ガイドＲＮＡ結合配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識できるヌクレオチド配列に近接した位置に位置したヌクレオチド配列であり得る。

【0642】

一例として、上記ガイドＲＮＡ結合配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識できるヌクレオチド配列の５’末端または／および３’末端に隣接して位置する連続する５～５０個のヌクレオチド配列であり得る。

【0643】

また、上記ガイドＲＮＡ非結合配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識できるヌクレオチド配列に近接した位置のヌクレオチド配列であり得る。

【0644】

一例として、上記ガイドＲＮＡ非結合配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素が認識できるヌクレオチド配列の５’末端または／および３’末端に隣接して位置する連続する５～５０個のヌクレオチド配列であり得る。

【0645】

「標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」とは、標的遺伝子または核酸内に存在する標的核酸配列のうちガイドＲＮＡ結合配列と相補的に結合することを意味する。このとき、上記相補的結合は１００％の完全な相補的結合であってもよく、または、７０％以上１００％未満の不完全な相補的結合であり得る。したがって、「標的化するｇＲＮＡ」は、標的遺伝子または核酸内に存在する標的核酸配列のうちガイドＲＮＡ結合配列と相補的に結合するｇＲＮＡを意味する。

【0646】

上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体は、標的核酸配列を標的化することができる。

【0647】

ｉｉ）標的核酸配列切断
上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体は、標的核酸配列を切断することができる。

【0648】

このとき、上記標的核酸配列が二本鎖の核酸である場合、上記切断は二本鎖を全部切断することであってもよい。または、上記切断は二本鎖のうちの１つの鎖だけ切断することもできる。

【0649】

このとき、上記標的核酸配列が一本鎖の核酸の場合、上記切断は一本鎖を切断することであってもよい。

【0650】

または、標的核酸配列切断は、ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体を構成するＣＲＩＳＰＲ酵素の種類によって切断形態が変わり得る。

【0651】

例えば、上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体を構成するＣＲＩＳＰＲ酵素が野生型のＣＲＩＳＰＲ酵素（例えば、ＳｐＣａｓ９）である場合、上記標的核酸配列切断は標的核酸配列の二本鎖を全部切断することであってもよい。

【0652】

別の例として、上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体を構成するＣＲＩＳＰＲ酵素がＣＲＩＳＰＲ酵素変異体であるニッカーゼ（例えば、Ｎｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９）である場合、上記標的核酸配列切断は標的核酸配列の二本鎖のうちの１つの鎖を切断することであってもよい。

【0653】

ｉｉｉ）標的核酸配列内に１つ以上のヌクレオチドの脱アミノ化
上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体は、標的核酸配列内に１つ以上のヌクレオチドが有する塩基のアミノ（－ＮＨ_２）基を脱アミノ化することができる。

【0654】

このとき、上記脱アミノ化は、シトシンまたはアデニン塩基で発生する可能性がある。

【0655】

例えば、標的核酸配列内にアデニンを有するヌクレオチドが５個（このとき、５個のヌクレオチドは連続しても連続しなくてもよい）である場合、上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体はアデニンを有するヌクレオチド５個のアデニンのアミノ（－ＮＨ_２）基を全て脱アミノ化することができる。

【0656】

別の例として、標的核酸配列内にシトシンを有するヌクレオチドが８個（このとき、５個のヌクレオチドは連続しても連続しなくてもよい）である場合、上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体はシトシンを有するヌクレオチド８個のうち３個のヌクレオチドが有するシトシンのアミノ（－ＮＨ_２）基を脱アミノ化することができる。

【0657】

脱アミノ化が発生する塩基は、ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体を構成するデアミナーゼの種類によって異なり得る。

【0658】

例えば、上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体を構成するデアミナーゼがアデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡまたはＴａｄＡ変異体）である場合、上記脱アミノ化はアデニンで発生する可能性がある。このとき、アデニンのアミノ（－ＮＨ_２）基が脱アミノ化されてケト（＝Ｏ）基を形成することができる。上記アデニンの脱アミノ化によってヒポキサンチンを生成する可能性がある。

【0659】

別の例として、上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体を構成するデアミナーゼがシチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１またはＡＰＯＢＥＣ１変異体）である場合、上記脱アミノ化はシトシンで発生する可能性がある。このとき、シトシンのアミノ（－ＮＨ_２）基が脱アミノ化されてケト（＝Ｏ）基を形成することができる。上記シトシンの脱アミノ化によってウラシルを生成する可能性がある。

【0660】

ｉｖ）脱アミノ化された塩基の除去
上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体は、ｉｉｉ）段階によって生成された脱アミノ化された塩基を除去することができる。このとき、脱アミノ化された塩基の除去は、ｉｉｉ）段階によって生成された脱アミノ化された塩基を全部または一部を除去することであり得る。

【0661】

このとき、上記脱アミノ化された塩基は、脱アミノ化されたシトシンまたは脱アミノ化されたアデニンであり得る。

【0662】

このとき、上記脱アミノ化された塩基は、ウラシルまたはヒポキサンチンであり得る。

【0663】

脱アミノ化された塩基の除去は、ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体を構成するＤＮＡグリコシラーゼの種類によって異なり得る。

【0664】

例えば、上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体を構成するＤＮＡグリコシラーゼがＡｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＡＡＧ）またはＡＡＧ変異体である場合、ヌクレオチドを構成するデオキシリボースまたはリボースと塩基（脱アミノ化されたアデニンまたはヒポキサンチン）を連結するＮ－グリコシド結合（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を加水分解することができる。また、ＡＰ付着部位（ＡＰ ｓｉｔｅ，ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｓｉｔｅ）を形成することができる。上記ＡＰ付着部位は自発的またはＤＮＡ（またはＲＮＡ）損傷によりプリンまたはピリミジン塩基のないＤＮＡ（またはＲＮＡ）の位置であり得る。

【0665】

別の例として、上記ガイドＲＮＡ－一塩基置換蛋白質複合体を構成するＤＮＡグリコシラーゼがＵｒａｃｉｌ－ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＤＧ ｏｒ ＵＮＧ）またはＵＤＧ変異体である場合、ヌクレオチドを構成するデオキシリボースまたはリボースと塩基（脱アミノ化されたシトシンまたはウラシル）を連結するＮ－グリコシド結合（Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅ）を加水分解することができる。また、ＡＰ付着部位（ＡＰ ｓｉｔｅ，ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｓｉｔｅ）を形成することができる。

【0666】

ｖ）塩基が除去された標的核酸配列の改善または修復
塩基が除去された標的核酸配列の改善または修復は、標的核酸配列の切断による改善または修復を含む。

【0667】

上記塩基が除去された標的核酸配列は、切断された標的核酸配列であり得る。

【0668】

このとき、上記切断された標的核酸配列は、二本鎖が全て切断された標的核酸配列であり得る。

【0669】

このとき、上記切断された標的核酸配列は、二本鎖のうちの１つの鎖が切断された標的核酸配列であり得る。このとき、切断された１つの鎖は塩基が除去された鎖であり得る。または、切断された１つの鎖は塩基が除去されなかった鎖であり得る。

【0670】

塩基が除去された標的核酸配列の改善または修復は、標的核酸配列内に１つ以上の塩基が除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位に任意の塩基、すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、またはウラシルで改善または修復されることであり得る。

【0671】

例えば、標的核酸配列内に１つ以上の脱アミノ化されたアデニンが除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位がグアニンで修復されてもよい。または、標的核酸配列内に１つ以上の脱アミノ化されたアデニンが除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位がシトシンで修復されてもよい。標的核酸配列内に１つ以上の脱アミノ化されたアデニンが除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位がチミンで修復されてもよい。標的核酸配列内に１つ以上の脱アミノ化されたアデニンが除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位がウラシルで修復されてもよい。標的核酸配列内に１つ以上の脱アミノ化されたアデニンが除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位がアデニンで修復されてもよい。

【0672】

別の例として、標的核酸配列内に１つ以上の脱アミノ化されたシトシンが除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位がアデニンで修復されてもよい。または、標的核酸配列内に１つ以上の脱アミノ化されたシトシンが除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位がグアニンで修復されてもよい。または、標的核酸配列内に１つ以上の脱アミノ化されたシトシンが除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位がチミンで修復されてもよい。または、標的核酸配列内に１つ以上の脱アミノ化されたシトシンが除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位がウラシルで修復されてもよい。または、標的核酸配列内に１つ以上の脱アミノ化されたシトシンが除去されたヌクレオチドのＡＰ付着部位がシトシンで修復されてもよい。

【0673】

上記人為的な変形は、遺伝子のエクソン、イントロン、スプライシング部位（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｉｔｅ）、調節領域（エンハンサー、サプレッサー領域）、５’末端またはその隣接した部位、３’末端またはその隣接した部位などで発生する可能性がある。

【0674】

例えば、上記人為的な変形は、エクソン領域に１つ以上の塩基配列が置換されたことであり得る。例えば、遺伝子内のエクソン領域に１つ以上のＡおよび／またはＣが他の任意の塩基配列（Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ，Ｕ）で置換されたことであり得る。

【0675】

別の例として、上記人為的な変形は、イントロン領域に１つ以上の塩基配列が置換されたことであり得る。例えば、遺伝子内のイントロン領域に１つ以上のＡおよび／またはＣが他の任意の塩基配列（Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ，Ｕ）で置換されたことであり得る。

【0676】

例えば、上記人為的な変形は、スプライシング部位に１つ以上の塩基配列が置換されたことであり得る。例えば、遺伝子内のスプライシング部位に１つ以上のＡおよび／またはＣが他の任意の塩基配列（Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ，Ｕ）で置換されたことであり得る。

【0677】

別の例として、上記人為的な変形は、調節領域（エンハンサー、サプレッサー領域）に１つ以上の塩基配列が置換されたことであり得る。例えば、遺伝子内の調節領域（エンハンサー、サプレッサー領域）に１つ以上のＡおよび／またはＣが他の任意の塩基配列（Ａ，Ｃ，Ｔ，Ｇ，Ｕ）で置換されたことであり得る。

【0678】

上記人為的な変形は、蛋白質をコードする遺伝子のコドン配列の変形であり得る。

【0679】

「コドン」とは、遺伝子からアミノ酸をコード化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）している遺伝コードのうちの１つをいう。ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡに転写されるとき、このようなメッセンジャーＲＮＡの塩基配列は３個ずつコドンを形成する。コドンは一種類のアミノ酸をコードすることができ、またはアミノ酸合成を終結させる終結コドンであり得る。

【0680】

上記人為的な変形は、１つ以上の一塩基配列変形によって蛋白質をコードするコドン配列の変形であってもよく、変形されたコドン配列は同じアミノ酸または異なるアミノ酸をコードすることができる。

【0681】

例えば、１つ以上の核酸配列がＣからＴに変更する場合、プロリンをコードするＣＣＣは、ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）をコードするＣＵＵまたはＣＵＣ、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）をコードするＵＣＣまたはＵＣＵ、またはフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌ－ａｌａｎｉｎｅ）をコードするＵＵＣまたはＵＵＵなどでコドンを変形することができる。

【0682】

例えば、１つ以上の核酸配列がＡからＣに変更する場合、スレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）をコードするＡＣＣまたはＡＣＡは、プロリンをコードするＣＣＣまたはＣＣＡなどでコドンを変形することができる。

【0683】

例えば、１つ以上の核酸配列がＡからＧに変更する場合、リシンをコードするＡＡＡは、グルタミン酸をコードするＧＡＡまたはＧＡＧ、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）をコードするＧＧＡまたはＧＧＧ、またはアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）をコードするＡＧＡまたはＡＧＧなどでコドンを変形することができる。

【0684】

発明の実施のための形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

【0685】

これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業者にとって自明であろう。

【0686】

（実験方法）
＜第１実施例＞
実施例１－１：プラスミド構築（Ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）
プラスミドは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ，ＮＥＢ）を使用して構築した。図３（ａ）、図７（ａ）および図２１の各断片を、ＰＣＲを使用して増幅させた後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘにＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を追加し、その後、５０℃で６０分間インキューベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。すべてのプラスミドは、ＣＭＶプロモーター、ｐ１５Ａ複製開始点およびアンピシリン（ａｍｂｉｃｉｌｌｉｎ）抗生物質耐性遺伝子を選択するマーカーを含む。一部のプラスミドは、ヒトコドン－最適化ＷＴ－Ｃａｓ９（Ｐ３ｓ－Ｃａｓ９ＨＣ、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃４３９４５）またはその変異体を含む。

【0687】

実施例１－２：細胞培養および形質導入（Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
（１）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞：一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質形質導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、５％ＣＯ_２下、３７℃で１０％ＦＢＳと１％抗生物質を添加したＤｕｌｂｅｃｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ，Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。形質感染の前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６－ｗｅｌｌプレートにｗｅｌｌ当たり２ｘ１０^５の密度で分注した。その後、１ｕｇ ＢＥ３（ＷＴ，ｂｐＮＬＳ，ｘＣａｓ－ＵＮＧ，ＵＮＧ－ｘＣａｓ，ｓｃＦｖ－ＡＰＯ－ＵＮＧまたはｓｃＦｖ－ＵＮＧ－ＡＰＯ）および１ｕｇ ｓｇＲＮＡ－発現プラスミド（ｈＥＭＸ１ ＧＸ１９ ｏｒ ＧＸ２０）を２００ｕｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で４ｕＬリポペクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）^ＴＭ２０００（ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８０１９）を使用して形質感染させた。

【0688】

（２）Ｈｅｌａ細胞：一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質形質導入
Ｈｅｌａ細胞は、５％ＣＯ_２下、３７℃で１０％ＦＢＳと１％抗生物質を添加したＤｕｌｂｅｃｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。形質感染の前にＨｅｌａ細胞を６－ｗｅｌｌプレートにｗｅｌｌ当たり２ｘ１０^５の密度で分注した。その後、１ｕｇ塩基置換プラスミド（ＢＥ３ ＷＴ，ｂｐＮＬＳ ＢＥ３，ｕｎｇ－ｎｃａｓ，ｎｃａｓ－ｕｎｇまたはｎｃａｓ－ｄｅｌｔａ ＵＮＧ）および１ｕｇ ｓｇＲＮＡ－発現プラスミドを２００ｕｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で４ｕＬリポペクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）^ＴＭ２０００（ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８０１９）を使用して形質感染させた。

【0689】

（３）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞：一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質形質導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、５％ＣＯ_２下、３７℃で１０％ＦＢＳと１％抗生物質を添加したＤｕｌｂｅｃｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ，Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。形質感染の前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２－ｗｅｌｌプレートにｗｅｌｌ当たり２ｘ１０^５の密度で分注した。その後、５００ｎｇ塩基置換プラスミド（ｂｐＮＬＳ－ＵＮＧ－ＡＰＯＢＥＣ－Ｎｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９－ｂｐＮＬＳ）、５００ｎｇ ｓｇＲＮＡ－発現プラスミド（ｈＥＭＸ１ ＧＸ１９ ｏｒ ＧＸ２０）を２００ｕｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で２ｕＬリポペクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）^ＴＭ２０００（ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８０１９）を使用して形質感染させた。

【0690】

実施例１－３：ｈＥＭＸ１ ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡ，ｈＥＭＸ１ ＧＸ２０ ｓｇＲＮＡ設計および合成
（１）ｓｇＲＮＡ設計および合成
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３１：４０１４－４０１６，２０１５）を使用して、ｈＥＭＸ遺伝子の「ＮＧＧ ＰＡＭ」または「ＮＧ」ＰＡＭを考慮したｇｕｉｄｅ ＲＮＡをデザインした。デザインしたｇｕｉｄｅ ＲＮＡはＯｎ－ｔａｒｇｅｔ部位を除いて１ｂａｓｅまたは２ｂａｓｅ ｍｉｓｍａｔｃｈがないことを考慮した。

【0691】

ｓｇＲＮＡ発現プラスミドを生成するために使用したオリゴ（表１参照）をアニーリングおよび伸長させた後、ｐＲＧ２プラスミドのＢｓａ１部位にクローニングした。

【0692】

【表2】

【0693】

（２）Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｈｉｐｉ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｌｐｉｓ－ｂｉｏ）を使用して、オンターゲット（ｏｎｔａｒｇｅｔ）およびオフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）の部位を２００～３００ｂｐのサイズにＰＣＲ増幅した。上記の方法で得られたＰＣＲ産物を、Ｍｉ－ｓｅｑ．（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）装置を使用してｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇし、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）のＣａｓ Ａｎａｌｙｚｅｒを介して分析した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の切断部位から５ｂｐ以内での置換を一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質から誘導された変異と見なした。

【0694】

実施例１－４：実験の結果
本実施例において、一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質を使用してシトシン（Ｃ）がアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）またはグアニン（Ｇ）で置換効果を確認した。

【0695】

（１）ｂｐＮＬＳ検証
ＨＥＫ ｃｅｌｌでＢＥ３ ＷＴおよびｂｐＮＬＳ ＢＥ３ ＷＴを使用して、ｂｐＮＬＳ ＢＥ３ ＷＴがＢＥ３ ＷＴよりもＣ ｔｏ Ｔの置換率（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｒａｔｅ）が増加したことを確認した（図７（ｂ）参照）。

【0696】

（２）一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質の塩基置換効率の確認
１）Ｈｅｌａ ｃｅｌｌでＣ ｔｏ Ｎ（Ａ，Ｔ，Ｇ）効率の確認
Ｈｅｌａ ｃｅｌｌで一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質を使用して、ｈＥＭＸ１ ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡ ｔａｒｇｅｔでＣ ｔｏ Ｎへの置換率を確認した。

【0697】

実験の結果、ＵＧＩを除去したｎｃａｓ－ｄｅｌｔａ ＵＧＩは、ＢＥ３ ＷＴとＣ ｔｏ ＧまたはＣ ｔｏ Ａの置換率にほとんど差がないことを確認した。一方、ＵＮＧを融合させたＵＮＧ－ｎｃａｓ、ｎｃａｓ－ＵＮＧはＢＥ３ ＷＴと比較してＣ ｔｏ ＧまたはＣ ｔｏ Ａの置換率が増加したことを確認した（図８参照）。このような結果から、ＢＥ３ ＷＴにＵＧＩをＵＮＧに置換する場合、Ｃ ｔｏ ＧまたはＣ ｔｏ Ａで塩基置換される確率が増加することを確認した。

【0698】

また、ｈＥＭＸ１ ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡシークエンスで１５Ｃ、１６Ｃの塩基置換率を確認した。実験の結果、１５Ｃ、１６ＣでＢＥ３ ＷＴ、ｂｐＮＬＳ ＢＥ３よりもＵＮＧ－ｎｃａｓ、ｎｃａｓ－ＵＮＧでＣ ｔｏ ＧまたはＣ ｔｏ Ａで塩基置換される確率が増加することを確認した（図９参照）。

【0699】

ｈＥＭＸ１ ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡシークエンスにおいて、１６Ｃよりも１５ＣでＣ ｔｏ ＧまたはＣ ｔｏ Ａへの塩基置換がよりよく起こり、ＵＮＧ－ｎｃａｓ構造を有する一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質におけるＣ ｔｏ ＧまたはＣ ｔｏ Ａへの塩基置換確率が最も高いことを確認した（図９参照）。

【0700】

２）ＨＥＫ ｃｅｌｌでＣ ｔｏ Ｎ（Ａ，Ｔ，Ｇ）効率の確認
ＨＥＫ ｃｅｌｌからｈＥＭＸ１ ＧＸ２０ ｓｇＲＮＡ ｔａｒｇｅｔへの一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質のＣ ｔｏ Ｎへの置換率を確認した。

【0701】

実験の結果、ｈＥＭＸ１ ＧＸ１９ ｓｇＲＮＡシークエンスにおいて１３Ｃ、１５Ｃ、１６Ｃ、１７Ｃで塩基置換されることを確認した（図１０参照）。

【0702】

また、ＨＥＫ ｃｅｌｌではｎｃａｓ－ＵＮＧがＵＮＧ－ｎｃａｓよりもＣ ｔｏ Ｎへの塩基置換率が高いことを確認した（図１１参照）。特に、１５Ｃ、１６Ｃ、１７ＣではＵＮＧ－ｎｃａｓがｎｃａｓ－ＵＮＧよりもＣ ｔｏ ＧまたはＣ ｔｏ Ａへの塩基置換がよりよく起こることを確認した（図１１参照）。

【0703】

また、一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質複合体、すなわち、ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ｓｃＦｖ）を含む融合塩基置換ドメイン（ｓｃＦｖ－ＡＰＯ－ＵＮＧまたはｓｃＦｖ－ＵＮＧ－ＡＰＯ）を使用して、ｈＥＭＸ１標的核酸配列中の一塩基置換効率を確認した結果、１１ＣではＣ ｔｏ Ａで、１５Ｃと１６ＣではＣ ｔｏ Ｇで塩基置換がよりよく起こることを確認した（図２２～２４参照）。

【0704】

（３）Ｎｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９検証
一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質を使用して、ランダムエラー（ｒａｎｄｏｍ ｅｒｒｏｒ）を与えることができる標的部位を拡張しようとして、ＮＧ ＰＡＭ配列を有するＮｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９を使用して実験を進めた。

【0705】

ｈＥＭＸ１ ＧＸ１７ ｓｇＲＮＡ、ｈＥＭＸ１ ＧＸ２０ ｓｇＲＮＡを使用して実験を進めた結果、ＨＥＫ ｃｅｌｌでよく作動することを確認した。特に、ＮＧ ＰＡＭにおいてＣ ｔｏ Ｎへ置換することを確認した（図１２参照）。
＜第２実施例＞

【0706】

実施例２－１：プラスミド構築（Ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）
プラスミドは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ，ＮＥＢ）を使用して構築した。図４の各断片を、ＰＣＲを使用して増幅させた後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘにＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を追加し、その後、５０℃で６０分間インキューベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。すべてのプラスミドは、ヒトコドン－最適化されたＷＴ－Ｃａｓ９（Ｐ３ｓ－Ｃａｓ９ＨＣ、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃４３９４５）、ＣＭＶプロモーター、ｐ１５Ａ複製開始点およびアンピシリン（ａｍｂｉｃｉｌｌｉｎ）抗生物質耐性遺伝子を選択するマーカーを含む（図１９および２０参照）。

【0707】

実施例２－２：ｓｇＲＮＡ設計および合成
（１）ｓｇＲＮＡ設計
科学雑誌「ネイチャー」に掲載された「ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ ｔｏ Ｇ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ」論文でＥｘｔｅｎｄｅｄ Ｄａｔａ Ｆｉｇｕｒｅ２に明示されたｓｇＲＮＡのうち３個を選定した（図２５参照）。

【0708】

（２）ｓｇＲＮＡ合成
２個の相補的オルリゴヌクレオチドをアニーリングおよび伸長させてｓｇＲＮＡ合成のための鋳型をＰＣＲ－増幅させた。

【0709】

上記鋳型ＤＮＡ（標的配列において３’末端の「ＮＧＧ」を除く）に対してＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を行い、製造者の使用説明書にしたがってＲＮＡを合成した後、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて鋳型ＤＮＡを除去した。Ｅｘｐｉｎ Ｃｏｍｂｏ ｋｉｔ（ＧｅｎｅＡｌｌ）とイソプロパノール沈殿によって転写したＲＮＡを精製した。

【0710】

本実施例において、上記ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｓｇＲＮＡは、２’ＯＭｅおよびｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅに変形するものを使用した。

【0711】

実施例２－３：細胞培養および形質導入（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
（１）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞：一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質形質導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、５％ＣＯ_２下、３７℃で１０％ＦＢＳと１％抗生物質を添加したＤｕｌｂｅｃｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ，Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。形質感染の前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４－ｗｅｌｌプレートにｗｅｌｌ当たり５ｘ１０^４の密度で分注した。その後、異なる３つの１ｕｇ ｓｇＲＮＡ発現プラスミドにそれぞれ３ｕｇ ＡＢＥ（ＷＴ，Ｎ－ＡＡＧ，Ｃ－ＡＡＧ）を２００ｕｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で１２ｕＬ ＦｕｇｅｎｅR ＨＤ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅｇａｔｅｎ（Ｃａｔ ｎｏ．Ｅ２３１Ａ、ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して形質感染させた。

【0712】

（２）Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｈｉｐｉ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｌｐｉｓ－ｂｉｏ）を使用して、オンターゲット（ｏｎｔａｒｇｅｔ）およびオフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）の部位を２００～３００ｂｐのサイズにＰＣＲ増幅した。上記の方法で得られたＰＣＲ産物を、Ｍｉ－ｓｅｑ．（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）装置を使用してｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇし、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）のＣａｓ Ａｎａｌｙｚｅｒを介して分析した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の切断部位から５ｂｐ以内での置換を一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質から誘導された変異と見なした。

【0713】

実施例２－４：実験の結果
ＡＢＥ（Ａｄｅｎｉｎｅ Ｂａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ）は、アデニン塩基校正遺伝子はさみで、アデニン（Ａ）塩基をグアニン（Ｇ）塩基に置換する技術である。Ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＡＡＧ）は、ＤＮＡでイノシン（Ｉｎｏｓｉｎｅ）塩基を除去する酵素である（図２）。本発明者らは、アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ，Ａ）塩基のランダム的突然変異を誘導するためにＡＢＥ ＷＴプラスミドのＮ－末端とＣ－末端それぞれにＡＡＧ（Ａｌｋｙｌａｄｅｎｉｎｅ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ、ＡＡＧ）遺伝子を挿入して変形させ、アデニン塩基置換蛋白質を開発した。Ｃａｓ９ニッカーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼを様々な順序で構成して融合蛋白質を生成した（図４）。

【0714】

アデニン（Ａ）塩基のランダム的突然変異を確認するために３つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１，ｓｇＲＮＡ２，ｓｇＲＮＡ３）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に塩基置換蛋白質をコードする核酸を含むプラスミド（すなわち、変形させたＡＢＥプラスミド）とともに形質感染させた。実験の結果、ＡＢＥ ＷＴと比較すると、変形させたＡＢＥプラスミド（Ｎ－ＡＡＧ，Ｃ－ＡＡＧ）を形質感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でｓｇＲＮＡ１の塩基配列のうち１４番目のアデニン（Ａ）塩基が他の塩基（チミン；Ｔ、シトシン；Ｃ、グアニン；Ｇ）にランダム的置換することを確認した。ｓｇＲＮＡ１の塩基配列では１９番目と１３番目のアデニン（Ａ）塩基が他の塩基に置換したことを確認した（図２７）。ｓｇＲＮＡ１では、Ｎ－末端にＡＡＧを挿入したプラスミドだけで１６番目と１２番目のアデニンが置換されたことを確認した（図２８）。したがって、ＡＢＥにＡＡＧを挿入することによってアデニン（Ａ）塩基が他の塩基へのランダム的置換が誘導されることを確認した。さらに、Ｃａｓ９ニッカーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびＤＮＡグリコシラーゼの順序にかかわらず、アデニン塩基置換蛋白質を使用する場合、アデニン（Ａ）塩基が他の塩基へのランダム的置換が誘導されることを確認した（図２６～２８参照）。
＜第３実施例＞

【0715】

ｓｕｎｔａｇシステムを使用した一塩基置換
実施例３－１：プラスミド製作（Ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）
プラスミドは、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｋｉｔ，ＮＥＢ）を使用して構築した。図５の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の各断片を、ＰＣＲを使用して増幅させた後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘにＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を追加し、その後、５０℃で１５－６０分間インキューベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）した。すべてのプラスミドは、ヒトコドン－最適化ＷＴ－Ｃａｓ９（Ｐ３ｓ－Ｃａｓ９ＨＣ、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃４３９４５）、ＣＭＶプロモーター、ｐ１５Ａ複製開始点およびアンピシリン（ａｍｂｉｃｉｌｌｉｎ）抗生物質耐性遺伝子を選択するマーカーを含む。

【0716】

実施例３－２：細胞培養および形質導入（Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ＰＣ９細胞は、５％ＣＯ_２下、３７℃で１０％ＦＢＳと１％抗生物質を添加したＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０（ＲＰＭＩ １６４０，Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。形質感染の前にＰＣ９細胞を２４－ｗｅｌｌプレートにｗｅｌｌ当たり２ｘ１０^５の密度で分注した。その後、１５００ｎｇ塩基置換プラスミド（Ａｐｏｂｅｃ－ｎＣａｓ９－ＵＧＩ，Ａｐｏｂｅｃ－ｎｕｒｅｋｉ ｎＣａｓ９－ＵＮＧ）と５００ｎｇ ｓｇＲＮＡ－発現プラスミド（ｈＥＭＸ１ ＧＸ１９）を、そして１０００ｎｇ ｓｕｎｔａｇプラスミド（ＧＣＮ４－ｎＣａｓ９）と１０００ｎｇ ＳｃＦｖプラスミド（ＳｃＦｖ－Ａｐｏｂｅｃ－ＵＮＧ，ＳｃＦｖ－ＵＮＧ－Ａｐｏｂｅｃ）と５００ｇ ｓｇＲＮＡ－発現プラスミド（ｈＥＭＸ１ ＧＸ１９）を２００ｕｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で４ｕＬリポペクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）^ＴＭ２０００（ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８０１９）を使用して形質感染させた。

【0717】

実施例３－３：Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｈｉｐｉ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｌｐｉｓ－ｂｉｏ）を使用して、オンターゲット（ｏｎｔａｒｇｅｔ）およびオフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）の部位を２００～３００ｂｐのサイズにＰＣＲ増幅した。上記の方法で得られたＰＣＲ産物を、Ｍｉ－ｓｅｑ．（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）装置を使用してｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇした後、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）のＢＥ Ａｎａｌｙｚｅｒを介して分析した。ｓｇＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ部位から１０ｂｐ以内での置換を一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質から誘導された変異と見なした。

【0718】

実施例３－４：実験の結果
ＰＣ９ ｃｅｌｌで一塩基置換蛋白質を使用してＣ ｔｏ Ｎへの置換率を確認した。

【0719】

ＳｕｎＴａｇシステムを使用して１つのｎＣａｓ９でもＵＮＧの効果を最大化することによってランダム的な突然変異誘導を増加させようとした。その結果、ＳｃＦｖ－ＵＮＧ－Ａｐｏｂｅｃの場合、ＷＴと似た一塩基置換効率を有してランダム的な塩基置換（Ｃ ｔｏ Ｔ ｏｒ Ａ ｏｒ Ｇ）を誘導することを確認することができた（図１３参照）。
＜第４実施例＞

【0720】

一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質を使用したＥＧＦＲ Ｃ７９７Ｓ突然変異誘導およびＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ耐性確認
実施例４－１：ＰＣ９細胞：一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質形質導入および薬物培養
ＰＣ９細胞は、５％ＣＯ_２下、３７℃で１０％ＦＢＳと１％抗生物質を添加したＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０（ＲＰＭＩ １６４０，Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。形質感染の前にＰＣ９細胞を１５ｃｍ^２ ｄｉｓｈに３ｘ１０^６の密度で分注した。その後、異なる２つの５ｕｇ ｓｇＲＮＡ発現プラスミドにそれぞれ１５ｕｇ Ｎ－ＵＮＧを３ｍＬ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で４０ｕＬリポペクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）^ＴＭ２０００（ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８０１９）を使用して形質感染させた。形質感染させた日から３日後、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ ４ｕｇ／ｍＬの濃度で抗生物質を処理して７日間培養した。十分な抗生物質培養による安定化細胞株を確保した後、非小細胞性肺癌標的治療剤であるＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ（ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｓ５０７８）１００ｎＭの濃度で２０日間細胞を培養した。Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂに耐性があると知られているＣ７９７Ｓ変異を生成できるｓｇＲＮＡ（Ｃ７９７Ｓ ｓｇＲＮＡ１（配列番号２１）およびＣ７９７Ｓ ｓｇＲＮＡ２（配列番号２２）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ実験を進めた。スクリーニングシステムを使用してＣ７９７Ｓ変異がｅｎｒｉｃｈされることを確認した。

【0721】

実施例４－２：Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｈｉｐｉ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｌｐｉｓ－ｂｉｏ）を使用して、オンターゲット（ｏｎｔａｒｇｅｔ）およびオフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）の部位を２００～３００ｂｐのサイズにＰＣＲ増幅した。上記の方法で得られたＰＣＲ産物を、Ｍｉ－ｓｅｑ．（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）装置を使用してｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇした後、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）のＢＥ Ａｎａｌｙｚｅｒを介して分析した。ｓｇＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ部位から１０ｂｐ以内での置換を一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質から誘導された変異と見なした。

【0722】

実施例４－３：実験の結果
３世代のＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であるＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂは、２世代薬物に耐性があるＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ－陽性の非小細胞肺癌患者の治療剤として使用されている。Ｎ－ＵＮＧによるｔａｒｇｅｔ ｓｇＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ内のｃｙｔｏｓｉｎｅのランダム的塩基置換を誘導することによって特定の薬物に対する耐性突然変異をスクリーニングした。

【0723】

ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ薬物の既知の耐性突然変異であるＣ７９７Ｓをｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして使用し、該当ｔｏｏｌが作動するかを確認した。Ｃ７９７Ｓ ｓｇＲＮＡ１内の１５番目に位置したＣがＧへ、またはＣ７９７Ｓ ｓｇＲＮＡ２内の１３番目のＣがＧへ塩基置換する場合、ＥＧＦＲの７９７番目のアミノ酸であるｃｙｓｔｅｉｎｅがＳｅｒｉｎｅに変わる。実験の結果、ブラスチジン（Ｂｌａｓｔｉｄｉｎｅ）のみ処理した群では、Ｃ７９７Ｓ ｓｇＲＮＡ１と２がＮ－ＵＮＧによって１５Ｃと１３Ｃが１０％だけＧに置換するが、Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂを処理した群では、Ｃ ｔｏ Ｇに変わった部分がそれぞれ５０％と８０％に増えたことを確認した（図３０参照）。
＜第５実施例＞

【0724】

ＥＧＦＲ ｓｇＲＮＡライブラリー導入で形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）細胞製造および薬物耐性突然変異スクリーニング
実施例５－１：ＥＧＦＲ ｓｇＲＮＡライブラリーデザインおよび合成
ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用してＥｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）遺伝子のｅｘｏｎ ２７個で合計１８０３個のｓｇＲＮＡをデザインした。デザインされた１８０３個のｓｇＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｐｏｏｌの順方向オリゴ配列では５’末端にＣＡＣＣＧを追加し、逆方向オリゴ配列ではそれぞれ５’末端にＡＡＡＣを、３’末端にＣを追加してＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅに合成を依頼した。

【0725】

実施例５－２：ＥＧＦＲ ｓｇＲＮＡライブラリープラスミド製造
合成されたＥＧＦＲ ｓｇＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｐｏｏｌは、９５℃で５分間反応し後、２５℃まで段階的に温度を低くして結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）させた。その後、ＥＧＦＲ ｓｇＲＮＡ ｏｌｉｇｏ ｐｏｏｌらとＢｓａ１制限酵素で切断されたピギーバック転移（Ｐｉｇｇｙｂａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）バックボーンベクター（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｖｅｃｔｏｒ）は、Ｔ４ ｌｉｇａｓｅによってｌｉｇａｔｉｏｎした。Ｌｉｇａｔｉｏｎされた反応液は、ＥｎｄｕｒａＴＭ ＤＵＯｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（ｌｕｃｉｇｅｎ，Ｃａｔ ｎｏ．６０２４２－２）にエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用して挿入した。このように、形質転換された大腸菌は、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ抗生物質を添加したＬＢ培地に等しく塗って３７℃で１日間放置して培養した。ＮｕｃｅｌｏＢｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍｉｄｉ ＥＦ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，ｃａｔ Ｎｏ．７４０４２０．５０）を使用して大腸菌群集（ｃｏｌｏｎｙ）からＥＧＦＲ ｓｇＲＮＡライブラリープラスミドを確保した。

【0726】

実施例５－３：細胞培養
ＰＣ９細胞は、５％ＣＯ_２下、３７℃で１０％ＦＢＳと１％抗生物質を添加したＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０（ＲＰＭＩ １６４０，Ｗｅｌｇｅｎｅ）で培養した。

【0727】

実施例５－４：ピギーバック転移（ｐｉｇｇｙｂａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）を利用した形質転換細胞の製造
ＰＣ９細胞に遺伝子伝達システムであるピギーバック転移（ｐｉｇｇｙｂａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）を適用してＥＧＦＲ ｓｇＲＮＡ発現が可能な細胞を製造した。形質転換の前に、ＰＣ９細胞をＴ１７５ ｆｌａｓｋに４ｘ１０^６の密度で分注した。その後、ｐｉｇｇｙｂａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｖｅｃｔｏｒとｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒを１：５の割合で３ｍＬ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で４０ｕＬリポペクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）^ＴＭ２０００（ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８０１９）を使用して形質感染させた。翌日ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ２ｕｇ／ｍＬの濃度で抗生物質を処理し、７日間培養した。十分な抗生物質の継代培養によって安定化細胞株を確保した。

【0728】

実施例５－５：一塩基置換ＣＲＩＳＰＲ蛋白質形質導入および薬物耐性突然変異スクリーニング
リポペクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）^ＴＭ２０００（ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１６６８０１９）を使用して形質感染を下記約１８～２４時間前に形質転換されたＰＣ９細胞をＴ１７５ ｆｌａｓｋに４ｘ１０^６の密度で分注した。その後、２０ｕｇ Ｎ－ＵＮＧを形質感染させた。形質感染させた日から３日後、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ ４ｕｇ／ｍＬの濃度で抗生物質を処理して７日間培養した。十分な抗生物質培養によって安定化細胞が確保されればＴ１７５ ｆｌａｓｋに４ｘ１０^６の密度で分注した。その後、非小細胞性肺癌標的治療剤であるＯｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ （ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｓ５０７８）１００ｎＭの濃度で２０日間細胞を培養して耐性突然変異細胞を確保した。

【0729】

実施例５－６：Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｈｉｐｉ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｅｌｐｉｓ－ｂｉｏ）を使用してオンターゲット（ｏｎｔａｒｇｅｔ）およびオフターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）の部位を２００～３００ｂｐのサイズにＰＣＲ増幅した。上記の方法で得られたＰＣＲ産物を、Ｍｉ－ｓｅｑ．（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）装置を使用してシークエンス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）した後、結果を１８０３個のＥＧＦＲ ｓｇＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅで分析を依頼した。

【0730】

実施例５－７：実験の結果
ＥＧＦＲ ｓｇＲＮＡが発現するＰＣ９細胞にＮ－ＵＮＧでｓｇＲＮＡ内のＣｙｔｏｓｉｎｅをランダムに塩基置換した後、Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂを添加した培地で培養して生き残った細胞を分析した結果を確保した（図２９および図３０参照）。図３１は、ＥＧＦＲ ｓｇＲＮＡを発現できるＰＣ９細胞にＮ－ＵＮＧでｓｇＲＮＡ内のＣｙｔｏｓｉｎｅをランダムに塩基置換した後、Ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂを添加した培地で培養して生き残った細胞を分析した結果である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【配列表】

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【国際調査報告】