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特表2022-533878合成ペプチドｂｒａｐ及びその新型コロナウイルスによる肺炎の抗炎症薬の製造のための使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-27
(54)【発明の名称】合成ペプチドｂｒａｐ及びその新型コロナウイルスによる肺炎の抗炎症薬の製造のための使用
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20220720BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20220720BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220720BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220720BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20220720BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20220720BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20220720BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220720BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06
A61K38/08 ZNA
A61P43/00 111
A61P11/00
A61P31/14
A61P37/08
A61P11/02
A61P29/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021552956
(86)(22)【出願日】2021-03-03
(85)【翻訳文提出日】2021-09-06
(86)【国際出願番号】 CN2020100629
(87)【国際公開番号】W WO2021253523
(87)【国際公開日】2021-12-23
(31)【優先権主張番号】202010546684.0
(32)【優先日】2020-06-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520177806
【氏名又は名称】泰安市啓航生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100148633
【弁理士】
【氏名又は名称】桜田 圭
(74)【代理人】
【識別番号】100147924
【弁理士】
【氏名又は名称】美恵 英樹
(72)【発明者】
【氏名】張 万琴
(72)【発明者】
【氏名】李 蔭田
(72)【発明者】
【氏名】吉 学文
(72)【発明者】
【氏名】趙 麗美
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA17
4C084BA23
4C084MA59
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA59
4C084ZB11
4C084ZB13
4C084ZC41
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA15
4H045EA28
4H045FA33
4H045GA15
4H045GA21
4H045HA03
(57)【要約】
本発明は、合成ペプチドｂｒａｐ及びその新型コロナウイルスによる肺炎の抗炎症薬の製造のための使用を開示し、生物医学の技術分野に属する。合成ペプチドｂｒａｐのアミノ酸配列は配列番号１である。ｂｒａｐは、Ｇタンパク質共役のブラジキニンＢ１およびＢ２受容体に対して、いずれも明らかな標的トッキングと抑制作用を有し、ｂｒａｐの鼻腔内投与は、アレルギー性鼻炎に対する局所作用と肺漏出、肺損傷及びＬＰＳにより誘発されるサイトカインストームに対する全身的な薬効作用を有する。ｂｒａｐの静脈内投与は、ＬＰＳ誘発のマウスの過剰な炎症、酸化ストレス反応及び重症の肺損傷の何れに対しても明らかな抑制作用を有し、ＬＰＳ誘発の炎症性サイトカインストームにおける炎症誘発性サイトカインであるＩＬ－６、ＴＮＦ－αの過剰放出、ＩＬ－６ ｍＲＮＡの過剰発現及び活性酸素ラジカル（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＳＯ）の大量な発生に対して明らかな抑制作用を有する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列が配列番号１であることを特徴とする合成ペプチドｂｒａｐ。
【請求項2】
（１）Ｇタンパク質共役のブラジキニンＢ１およびＢ２受容体を抑制する薬の製造のための使用、（２）抗急性肺損傷薬の製造のための使用、（３）新型コロナウイルスによる肺炎用の抗炎症薬の製造のための使用、（４）抗アレルギー性鼻炎薬の製造のための使用のいずれか１つにおける請求項１に記載の合成ペプチドｂｒａｐの使用。
【請求項3】
前記使用（１）～（４）のいずれか１つに記載の薬の投与方法は静脈内投与又は鼻腔内投与であることを特徴とする請求項２に記載の合成ペプチドｂｒａｐの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は生物医学の技術分野に属し、合成ペプチドｂｒａｐ（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｂｒａｐ）及びその抗急性肺損傷、特に新型コロナウイルスによる肺炎の抗炎症薬の製造のための使用に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、重症の新型コロナウイルスによる肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）が人間の生命を脅かしている。新型コロナウイルスが対応する標的がアンジオテンシン変換酵素ＩＩ（ＡＣＥ２）であることが研究者らにより発見されており、ウイルスのＳタンパク質が細胞上のＡＣＥ２に特異的に結合すると、ウイルスが細胞に入ることとなり、ＡＣＥ２は新型コロナウイルスが細胞に感染する標的（すなわち細胞受容体）であるとともに、感染後、肺損傷を発生させる要因である。ウイルスは感染された細細胞内で複製することで、ＡＣＥ２のレベルを低下させる。ＡＣＥ２は、レニン－アンジオテンシン－アルドステロン系（ＲＡＡＳ）であり、カリクレイン－キニン系（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ－Ｋｉｎｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ，ＫＫＳ）の重要なメンバである。
【0003】
ＡＣＥ２のレベルの低下により、ＲＡＡＳ系におけるＡＣＥ２とＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）のバランスが不均衡になり、ＡＣＥが相対的に増強するため、ＡｎｇＩＩのレベルが上昇し、肺ＡＴ１ａ受容体が過剰に活性化され、肺の毛細血管の透過性が増加し、それに伴って肺水腫が発生して、肺の炎症反応が重症化する。ＫＫＳ系において、Ｄｅｓ－ＡｒｇブラジキニンはＢＫ１受容体の作動薬である。ＡＣＥ２はＤｅｓ－Ａｒｇブラジキニン－ＢＫ１受容体経路中のＤｅｓ－Ａｒｇブラジキニンを分解して不活性化するペプチドを有する。ＡＣＥ２のレベルの低下によりＤｅｓ－Ａｒｇブラジキニン－ＢＫ１受容体経路が活性化される。ＢＫ１受容体の活性化は、炎症促進作用がある。
【0004】
ウイルスに感染した後、感染された細胞は炎症性サイトカインを発生し、抗ウイルスや自然免疫応答制御の作用を有する。しかし、感染された細細胞内でウイルスが大量に複製されて、免疫系が過剰に活性化されると、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ等の炎症誘発性サイトカインが顕著に上昇し、炎症誘発性サイトカインはほかの免疫細胞を活性化又は招集することができ、免疫細胞からより多くのサイトカインを分泌することに至り、全身の免疫炎症反応が速やかに引き起こされ、多臓器不全を引き起こす。現在、新型コロナウイルス肺炎によるサイトカインストームの発病過程はまだ明らかではない。現在、新型コロナウイルスによる肺炎の重症度は、炎症誘発性サイトカインＩＬ－６の上昇レベルに深く関わっており、ＩＬ－６の上昇は予後不良の一つの指標であることが明らかになっている。研究者らは、ＩＬ－６阻害剤の作用は、期待できることであると認定している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明は、アミノ酸配列が配列番号１である合成ペプチドｂｒａｐを提供する。
【0006】
本発明は、さらに、以下の（１）から（４）のいずれか１つにおける合成ペプチドｂｒａｐの使用を提供する。（１）Ｇタンパク質共役のブラジキニンＢ１およびＢ２受容体を抑制する薬の製造のための使用、（２）抗急性肺損傷薬の製造のための使用、（３）新型コロナウイルスによる肺炎用の抗炎症薬の製造のための使用、（４）抗アレルギー性鼻炎薬の製造のための使用。
【0007】
さらに、上記の発明において、（１）～（４）のいずれか１つの使用に係る薬の投与方法は静脈内投与又は鼻腔内投与である。
【0008】
本発明に係る使用は、毒性が低いとの特徴があり、２０００ｍｇ／ｋｇＢＷ用量での静脈内投与の限度実験において毒性が見られない。
【0009】
本発明に開示した合成ペプチドｂｒａｐはアミノ酸配列が配列番号１である８種のアミノ酸からなる１０ペプチド化合物（図１）である。ｂｒａｐは固相化学合成技術により工業的に合成することができ、合成ペプチドｂｒａｐの純度は９９．５以上である（図２、３）。ｂｒａｐの静脈内投与による２０００ｍｇ／ｋｇＢＷ用量での限度実験において毒性が見られない（表２）。最近、ｂｒａｐが急性肺損傷（Ａｃｕｔｅ Ｌｕｎｇ Ｉｎｊｕｒｙ，ＡＬＩ）、特に新型コロナウイルスによる肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）に関係していることが明らかになっている。急性肺損傷は、様々な要因に起因する肺胞上皮細胞と毛細血管内皮細胞の損傷による、漏出と炎症を特徴とする肺間質びまん性呼吸器疾患である。新型コロナウイルスが人体に入って、肺に対する損傷の過程は、ウイルスの細胞に対する病態生理学的反応（漏出と炎症を特徴とする病態生理学的反応）と生体免疫病理学的反応（ウイルスが感染細胞内で複製すると、炎症性サイトカインが放出され、ウイルスが大量に複製すると、生体免疫系が過剰に活性化されて、サイトカインストームが発生する）による損傷を含む。
【0010】
ウイルスの細胞に対する病態生理学的反応による肺損傷は、新型コロナウイルスの対応する標的であるＡＣＥ２がＫＫＳ系とＲＡＡＳ系に同属しているのが原因となる。ウイルス感染によってＡＣＥ２のレベルが低下すると、ＫＫＳ系とＲＡＡＳ系が同時に活性化される。ＲＡＡＳ系において、ＡＣＥ２のレベルの低下、ＡＣＥ２とＡＣＥの間のバランスの不均衡、ＡＣＥの相対的な増強、ＡｎｇＩＩのレベルの上昇、肺部ＡＴ１ａ受容体の過剰活性化で、肺部の毛細血管の透過性の増加、肺微小血管の漏出が引き起こされる。ＡＣＥ２もＫＫＳ系に属し、Ｄｅｓ－Ａｒｇブラジキニンはブラジキニン（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ，ＢＫ）のＢ１受容体の作動薬である。ＡＣＥ２はＤｅｓ－Ａｒｇブラジキニンを活性作用がないペプチドに分解させる。新型コロナウイルスに感染すると、感染された細胞のＡＣＥ２レベルが低下し、これにより、Ｄｅｓ－Ａｒｇブラジキニン－Ｂ１受容体経路が活性化される。ＢＫは受容体に結合することで生物学的役割を果たす。ＢＫ受容体はＧタンパク質共役受容体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＰＣＲ）であり、主にＢ１およびＢ２の２種類を含む。ＢＫのＢ１受容体は誘導的に発現され、組織の損傷及び炎症反応がＢ１受容体の発現を誘導し得る。Ｂ１受容体が活性化されて、炎症性サイトカインの放出を促進し、好中球の浸透を増加し、好中球を活性化して過剰な炎症性メディエータ、活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）を生成して、損傷部位の炎症反応に関与し、肺の炎症や損傷を拡大する。Ｂ２受容体が活性化されると、微小血管の透過性が顕著に高まり、血漿成分が大量に漏出して肺漏出を起こす。本発明により、合成ペプチドｂｒａｐはＧタンパク質共役のブラジキニンＢ２受容体に対して、明らかな標的ドッキングと抑制作用があることが認められた。Ｂｒａｐはその標的ブラジキニンＢ２受容体にドッキングしてＢ２受容体タンパク質の膜貫通らせんから形成されたオープンポケットに分布し、その１番目の残基がポケットの外側へ向かい、１０番目の残基がポケットの底部に位置する。ｂｒａｐとＢ２受容体の結合部位の分析によれば、１０個の残基は何れもＢ２受容体にドッキングしており、ペプチドの各残基のエネルギー供給量を計算した（図４）。本発明により、機能としてｂｒａｐはＢ２受容体に対して、明らかな抑制作用があることが認められた（図５）。本発明により、両側鼻腔に合成ペプチドｂｒａｐ（各側あたり５０μＬ）を滴下することで、ラットのアレルギー性鼻炎だけではなくＢＫにより誘発されるモルモットの肺微小血管漏出に対しても明らかな抑制作用（Ｐ＜０．０１）があり、用量－反応関係を有することが分かった（図６、７）。また、本発明は、ＭＤｏｃｋＰｅＰを用いてｂｒａｐ構造のＢＫのＢ１Ｒに対するドッキングを行った。２つの異なる方法を使って、２種のＢ１受容体構造をモデリングして、それぞれｂｒａｐとのドッキングを行い、計２回のドッキング結果を得、Ｂ１受容体（Ｂ１Ｒ）と合成ペプチドｂｒａｐ（配位子）との相互作用残基をさらに解析した。本発明により、ｂｒａｐはＵ型で受容体のポケットに結合することが分かった（図８）。細胞内カルシウムイオン蛍光技術でｂｒａｐのブラジキニンＢ１受容体に対する機能活性の影響を検出し、ｂｒａｐはＢ１受容体に対して明らかな抑制作用があり、Ｂ１受容体の過剰活性化を低下させることが証明された（図９）。新型コロナウイルスによる肺炎の潜伏期とは、ウイルスが感染した後、ＡＣＥ２レベルの低下による肺漏出や肺炎症の病態生理学的過程の発生・進行段階である。潜伏期から診断までの期間は、新型コロナウイルスによる肺炎による肺損傷を治療するためのゴールデンタイムである。ｂｒａｐは、Ｇタンパク質共役のブラジキニンＢ１およびＢ２受容体と拮抗することで、ＡＣＥ２の低下による新型コロナウイルスによる肺炎の発生過程においての病態的反応を効果的に阻害し、ひいては点鼻投与の簡易な処理であっても、ブラキニンによるモルモットの肺血管透過性の増加と肺漏出を有意に減少させることができる。
【0011】
しかしながら、生体がウイルスを確実に除去するのは、人体の免疫系によるウイルスの死滅に依存するわけである。感染の初期に、新型コロナウイルスのＳタンパク質と細胞上のＡＣＥとの特異的結合が顕著であり、ウイルスが細胞内での複製を開始すると、人体の免疫系が刺激され、感染された細胞は抗ウイルス作用や免疫調節作用を有する炎症性サイトカインを産生する。感染の後期に、感染された細胞内でウイルスが大量に複製されると、過剰な免疫反応を誘発してサイトカインストームを発生する。即ち、肺の免疫細胞を過剰に活性化させ、サイトカインを大量に生成する。
【0012】
ＬＰＳはグラム陰性菌の細胞壁成分であり、細菌内毒素の主要な成分でもあり、単核食細胞系を活性化させることができ、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）、インターロイキン６（ＩＬ－６）などの炎症性サイトカインを放出させ、好中球を活性化させ、炎症性メディエータと活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）の生成を増加させる。さらに、本発明は、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）を用いてマウスの過剰な炎症反応、酸化ストレス反応および深刻なサイトカインストームの誘発過程を観察したところ、マウスにＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）を腹腔内注射してから６時間後、ＬＰＳモデル群とモデル投与群のマウスはいずれも死亡直前の状態になることが認められ、症状としては、精神不振、頻呼吸、毛の立ち、下痢便、目の周辺に分泌物の出現及び涕涙などの全身多臓器障害症状があった。血清における細菌内毒素、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αの含有量及び肺組織におけるＩＬ－６ ｍＲＮＡの発現が顕著に上昇し、肺部ＲＯＳの含有量も顕著に上昇し（図１０～１５）、且つ肺胞隔壁（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｅｐｔｕｍ）の肥厚、炎症細胞の浸潤、肺胞隔壁の局所的相互融合などの肺損傷の病理学的所見が見られた（図１６）。
【0013】
本発明による、Ｂｒａｐの静脈内投与は、血液における内毒素のレベルを明らかに低下させ（図１０）、肺組織におけるＩＬ－６ ｍＲＮＡの過剰発現を明らかに低下させ（図１１）、血液における炎症性のサイトカインＩＬ－６とＴＮＦ－αのレベルを明らかに低下させ（図１２、１３）、肺組織において過剰に増加したＲＯＳの含有量を明らかに低下させ（図１４～１５）、肺損傷の病理学的所見を明らかに軽減させる（図１６）ことが分った。更に、本発明により、ｂｒａｐの鼻腔内投与は、肺組織におけるＩＬ－６ ｍＲＮＡの過剰発現を明らかに低下させ（図１１）、血液における炎症性サイトカインＩＬ－６とＴＮＦ－αのレベルを低下させ（図１２、１３）、肺組織においての過剰に増加したＲＯＳの含有量を低下させ（図１４、１５）、および肺損傷による肺の間質性炎症、肺胞隔壁の肥厚及び大量の炎症細胞の浸潤などの病理学的変化を軽減させる（図１６）薬効もあることが分った。
【0014】
報告によれば、新型コロナウイルスによる肺炎の重症患者ではサイトカインストーム（即ち炎症ストーム）が発生しやすい。科学者らによって、ＩＬ－６は重要な炎症性サイトカインであり、炎症ストームを誘発する重要な経路であることがすでに発見されている。本発明により、静脈及び鼻腔にてｂｒａｐを投与することで、ＬＰＳにより誘発されたＢａｌｂｃマウスの肺組織における過剰上昇のＩＬ－６ｍＲＮＡの発現を顕著に低下させることが認められた。更に、本発明により、ラットのアレルギー性鼻炎だけではなく、ＢＫにより誘発されるモルモットの肺微小血管の漏出に対しても明らかな抑制作用があり（Ｐ＜０．０１）、用量－反応関係を（図６、７）示し、鼻腔内に投与すると、速やかに血液循環に入り、速やかに肺漏出（図７）、肺損傷（図１５）を軽減させることができ、炎症性サイトカインＩＬ－６ｍＲＮＡの肺組織における発現（図１１）を明らかに抑制することが証明された。本発明は、さらに、ｂｒａｐの鼻腔内投与が急性肺損傷の予防や治療に用いられるとの実験的根拠を提供した。Ｂｒａｐはポリペプチド固相合成技術を採用して合成した小ペプチドであり、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて純化し、質量分析にて同定し、ｂｒａｐの薬物の製造、構造の確認、品質研究などの面で定量的な資料を提供した。ｂｒａｐは、Ｇタンパク質共役のＢＫのＢ１およびＢ２受容体を阻害する作用があるため、新型コロナウイルスによる肺炎の発生段階において、ｂｒａｐは肺漏出に対して明らかな抑制作用があり、炎症の進行段階において、ｂｒａｐは過剰な炎症と酸化ストレス反応に対する明らかな抑制作用と肺組織損傷に対する顕著な保護作用がある。病状が重症の炎症ストーム段階に進行した場合、合成ペプチドｂｒａｐは明らかに過剰活性化の免疫炎症反応を抑制し、生体の免疫系の過剰活性化を低下させることができ、且つ症状の進行に応じて鼻腔や静脈の異なる経路で投与することができる。現在、臨床的に抗炎症の治療に用いられている主の薬物はグルココルチコイドであるが、グルココルチコイドは明らかな副作用がある。従来技術では、類似化合物が新型コロナウイルスによる肺炎の抗炎症薬物として使用されている報告はいまだに見られていない。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】合成ペプチドｂｒａｐのアミノ酸組成の分析を示す図である。Ａ：アミノ酸分析装置にて得た合成ペプチドｂｒａｐのアミノ酸組成の曲線図、Ｂ：合成ペプチドｂｒａｐアミノ酸の検出際に使用する基準品のアミノ酸成分の図。
【図2】合成ペプチドｂｒａｐの高速液体クロマトグラフィー結果を示す図である。
【図3】合成ペプチドｂｒａｐの質量分析結果を示す図である。
【図4】合成ペプチドｂｒａｐのＧタンパク質共役のブラジキニンＢ２受容体標的に対するドッキング実験を示す図である。
【図5A】合成ペプチドｂｒａｐのブラジキニンＢ２受容体に対する抑制作用を示す図である。Ａ：合成ペプチドｂｒａｐの陽性対照のブラジキニンＢ２受容体阻害剤ＨＯＥ１４０の用量－反応曲線。
【図5B】Ｂ：合成ペプチドｂｒａｐのブラジキニンＢ２受容体に対する抑制作用の用量－反応曲線。
【図6A】鼻腔内投与の合成ペプチドｂｒａｐのラットアレルギー性鼻炎に対する薬効作用を示す図である。Ａ：アレルギー性鼻炎のスコア。
【図6B】Ｂ：治療前後スコアの変化。
【図7A】鼻腔内投与の合成ペプチドｂｒａｐの、ブラジキニンにより誘導されたモルモットの肺微小血管漏出に対する明らかな抑制作用を示す図である。Ａ：ＯＤ値－ＥＢ濃度基準曲線。
【図7B】Ｂ：肺組織におけるＥＢの含有量。
【図8】合成ペプチドｂｒａｐのＧタンパク質共役のブラジキニンＢ１受容体標的に対するドッキングを示す図である。
【図9A】合成ペプチドｂｒａｐのブラジキニンＢ１受容体に対する抑制作用を示す図である。Ａ：ブラジキニンＢ１受容体の拮抗薬Ｒ８９２の用量－反応曲線。
【図9B】Ｂ：合成ペプチドｂｒａｐのブラジキニンＢ１受容体に対する抑制作用の用量－反応曲線。
【図10】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発された血液における内毒素レベルの顕著な上昇に対する明らかな低下作用を示す図である。
【図11】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発された肺組織におけるＩＬ－６ｍＲＮＡの過剰発現に対する明らかな低下作用を示す図である。
【図12A】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発される血液におけるＩＬ－６レベルの上昇に対する明らかな低下作用を示す図である。Ａ：リボ多糖ＬＰＳの炎症性サイトカインＩＬ－６の放出に対する促進作用。
【図12B】Ｂ：合成ペプチドｂｒａｐのＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）により６時間誘発された際の炎症性サイトカインＩＬ－６の放出に対する影響。
【図12C】Ｃ：合成ペプチドｂｒａｐのＬＰＳにより１２時間誘発された際の炎症性サイトカインＩＬ－６の放出に対する影響。
【図13A】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発される血液におけるＴＮＦ－αの上昇に対する明らかな低下作用を示す図である。Ａ：リボ多糖ＬＰＳの炎症促進性サイトカインＴＮＦ－αの含有量の顕著な増加に対する促進作用。
【図13B】Ｂ：合成ペプチドｂｒａｐのＬＰＳにより６時間誘発された際の炎症性サイトカインＴＮＦ－αの放出に対する影響。
【図13C】Ｃ：合成ペプチドｂｒａｐのＬＰＳにより１２時間誘発された際の炎症性サイトカインＴＮＦ－αの放出に対する影響。
【図14A】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発される肺組織におけるＲＯＳの含有量の上昇に対するｂｒａｐの明らかな低下作用の定性的分析を示す図である。
【図14B】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発される肺組織におけるＲＯＳの含有量の上昇に対するｂｒａｐの明らかな低下作用の定性的分析を示す図である。
【図14C】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発される肺組織におけるＲＯＳの含有量の上昇に対するｂｒａｐの明らかな低下作用の定性的分析を示す図である。
【図14D】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発される肺組織におけるＲＯＳの含有量の上昇に対するｂｒａｐの明らかな低下作用の定性的分析を示す図である。
【図14E】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発される肺組織におけるＲＯＳの含有量の上昇に対するｂｒａｐの明らかな低下作用の定性的分析を示す図である。
【図14F】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発される肺組織におけるＲＯＳの含有量の上昇に対するｂｒａｐの明らかな低下作用の定性的分析を示す図である。
【図14G】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発される肺組織におけるＲＯＳの含有量の上昇に対するｂｒａｐの明らかな低下作用の定性的分析を示す図である。
【図15】ｂｒａｐのＬＰＳにより誘発される肺組織におけるＲＯＳの含有量の上昇に対する明らかな低下作用の定量的分析を示す図である。
【図16】ｂｒａｐのＬＰＳによる肺損傷に対する明らかな保護作用を示す図である。Ａ：正常対照群、Ｂ：ＬＰＳモデル群、Ｃ：ｓｐ２群、Ｄ：静脈内投与のｂｒａｐ高用量群、Ｅ：静脈内投与のｂｒａｐ中用量群、Ｆ：静脈内投与のｂｒａｐ低用量群、Ｇ：鼻腔内投与のｂｒａｐ群、Ｈ：デキサメタゾン投与のモデル群（陽性対照群）。
【発明を実施するための形態】
【0016】
下記の非制限性の実施例は、当業者が本発明を全面的に理解するように説明するためのものであり、いかなる形態で本発明を制限するものではない。
【0017】
（実施例１）
合成ペプチドｂｒａｐのアミノ酸組成の試験：
１０ｍｇのサンプルを計量して水分解管に入れ、６ｍｏｌ／Ｌの塩酸２０ｍＬを加え、真空処理で脱気し、窒素ガスを注入し、管を封止する。１１０℃で２２－２４時間加水分解し、冷却した後、脱イオン水で５０ｍＬに定容して、よく混ぜる。１ｍＬの加水分解液を精確に取り、真空乾燥し、１ｍＬの脱イオン水を加えて蒸発乾燥し、さらに１ｍＬの脱イオン水を加えて蒸発乾燥し、０．０２ｍｏｌ／Ｌの塩酸１ｍＬを精確に加えて再溶解する。０．２２μｍのフィルターで濾過し、装置（日立Ｌ－８９００アミノ酸分析装置）に注入して測定する。測定結果は表１と図１に示す。
合成ペプチドｂｒａｐのアミノ酸組成の試験：
１０ｍｇのサンプルを計量して水分解管に入れ、６ｍｏｌ／Ｌの塩酸２０ｍＬを加え、真空処理で脱気し、窒素ガスを注入し、管を封止する。１１０℃で２２－２４時間加水分解し、冷却した後、脱イオン水で５０ｍＬに定容して、よく混ぜる。１ｍＬの加水分解液を精確に取り、真空乾燥し、１ｍＬの脱イオン水を加えて蒸発乾燥し、さらに１ｍＬの脱イオン水を加えて蒸発乾燥し、０．０２ｍｏｌ／Ｌの塩酸１ｍＬを精確に加えて再溶解する。０．２２μｍのフィルターで濾過し、装置（日立Ｌ－８９００アミノ酸分析装置）に注入して測定する。測定結果は表１と図１に示す。
【0018】
【表1】
【0019】
表１と図１から分かるように、合成ペプチドｂｒａｐは８種のアミノ酸からなる。
【0020】
（実施例２）
合成ペプチドｂｒａｐの合成手順、ＨＰＬＣ純化及び質量分析同定：
本技術は蘇州強耀生物科技有限会社より提供される。
合成ペプチドｂｒａｐの合成手順、ＨＰＬＣ純化及び質量分析同定：
本技術は蘇州強耀生物科技有限会社より提供される。
【0021】
合成手順：アミノ酸配列のＣ末端からＮ末端の手順で行い、プロセスは以下の通りである。
【0022】
ａ．ｎ当量の樹脂（固相合成担体）を計量して反応容器に入れ、ＤＣＭ（ジクロロメタン）を加えて３０分間膨潤させた後、ＤＣＭを取り除き、アミノ酸配列における一番目のアミノ酸を２ｎ当量加え、２ｎ当量のＤＩＥＡ、適量のＤＭＦ、ＤＣＭ（適量とは樹脂を十分に鼓動することができるようにすることが望ましい）を加え、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＣＭを、窒素ガスを吹き込みながら６０分間反応させる。その後、約５ｎ当量のメチルアルコールを加え、３０分ぐらい反応させた後、反応液を取り除き、ＤＭＦ、ＭＥＯＨで洗浄する。
【0023】
ｂ．反応容器の中にアミノ酸配列における二番目のアミノ酸（２ｎ当量）、２ｎ当量のＨＢＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）ウロニウムヘキサフルオロホスファート）及びＤＩＥＡを加え、Ｎ２を吹き込みながら３０分反応させ、液体を洗浄して除去し、ニンヒドリンで検出した後、ピリジンと無水酢酸で末端ブロッキングを行う。最後に洗浄し、適量の脱キャッピング剤を加え、Ｆｍｏｃ（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）保護基を除去し、洗浄し、ニンヒドリンで検出を行う。
【0024】
ｃ．プロセスｂに従って、順次にアミノ酸配列における異なるアミノ酸を加える。
【0025】
ｄ．樹脂を窒素ガスで吹き付けて乾燥させてから、反応カラムから取り外し、フラスコに入れてから、フラスコの中に適当量（切削液と樹脂は約１０ｍL／ｇの割合）の切削液（９５％のＴＦＡ、２％のエタンジチオール、２％のトリイソプロピルシリル、１％の水からなる）を加え、振蕩し、濾過にて樹脂を除去する。
【0026】
ｅ．ろ液を得、次いでろ液に多量のエーテルを加えて粗生成物を析出し、遠心分離して洗浄し、配列番号１であるアミノ酸配列に示す粗生成物を得る。
【0027】
得られた粗生成物を高速液体クロマトグラフィーにて純化し、ペプチドを凍結乾燥し、ペプチドの検出を行い、次いて質量分析により生成物を同定する。高速液体クロマトグラフィー結果は図２に示し、得られた合成ペプチドｂｒａｐの純度が９９．７２％であった。質量分析結果は図３に示し、合成ペプチドｂｒａｐの理論分子量が１０２３．１７であった。質量分析同定による分子量は正確である。
【0028】
（実施例３）
ブラジキニンＢ２受容体（Ｂ２Ｒ）標的とｂｒａｐとのドッキング及び結合パターン：
本技術は南京欧際医薬科技サービス有限会社より提供される。
ブラジキニンＢ２受容体（Ｂ２Ｒ）標的とｂｒａｐとのドッキング及び結合パターン：
本技術は南京欧際医薬科技サービス有限会社より提供される。
【0029】
ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔを採用してブラジキニン（ＢＫ）のＢ２受容体（Ｂ２Ｒ）に対してＰＤＢベースに基づく配列の比較を行い、配列の類似性とカバレッジ比率がよい５ＵＮＦをテンプレートとして選択する。ＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒソフトウェアパッケージにおけるホモロジーモデリングモジュールＰｒｉｍｅを採用してＢ２Ｒの３次元構造のモデリングを行う。異なるモデリングのパラメータ設定によって２種類のＢ２Ｒの構造ファイルを得、後続でドッキングの合理性と再現性を確保するために、それぞれは、知識に基づく受容体構造とエネルギーに基づく受容体構造とする。さらにＭＤｏｃｋＰｅＰを採用して、合成ペプチドｂｒａｐを２種類の受容体構造にドッキングさせ、該ドッキング実験は２回行う。ドッキング実験において、合成ペプチドｂｒａｐの結合位置は受容体タンパク質の膜貫通らせんにより形成された、オープンポケットの中に分布している（図４）。
【0030】
（実施例４）
細胞内カルシウムイオン蛍光法を用いたｂｒａｐのブラジキニンＢ２受容体に対する抑制作用の測定：
本技術は武漢合研生物医薬科技有限会社より提供される。
細胞内カルシウムイオン蛍光法を用いたｂｒａｐのブラジキニンＢ２受容体に対する抑制作用の測定：
本技術は武漢合研生物医薬科技有限会社より提供される。
【0031】
ＨＥＫ２９３／Ｇ１５／Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ２（Ｂ２Ｒ）の実験方法：細胞内カルシウムイオン蛍光方法で合成ペプチドｂｒａｐのブラジキニンＢ２受容体に対する抑制作用を測定する。
【0032】
１．成長集密度が８０％に達するＨＥＫ２９３／Ｇ１５／ブラジキニン２細胞をトリプシンで消化した後でカウントし、ウェルあたり２ｘ１０４個／ｍＬの密度でｍａｔｒｉｇｅｌを予めコーティングして置いた黒縁の透明な３８４ウェル培養プレートの中に巻込む。
２．細胞巻込み済の３８４ウェル培養プレートを５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いて一晩培養する。
３．実験当日に、ＨＢＳＳを用いて化合物である合成ペプチドｂｒａｐを３０ｍＭの貯蔵液になるように溶かす。
４．各ウェルに１０μＬ、４ｘの無洗Ｆｌｕｏ８色素を加えて、室温で１時間インキュベートする。
５．細胞をインキュベートする過程において、０．１％のＢＳＡを含むＨＢＳＳで測定対象化合物である合成ペプチドｂｒａｐを五倍の希釈になるように希釈する。陽性阻害剤ＨＯＥ１４０の初期濃度は３μＭである。
６．ＥＣ１０、ＥＣ２０及びＥＣ８０は、Ｂ２受容体に対する異なる刺激強度を表す。
７．調製済の測定対象の化合物を細胞培養プレートに加え、ＦＬＩＰＲにて、データの記録を行う。
２．細胞巻込み済の３８４ウェル培養プレートを５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いて一晩培養する。
３．実験当日に、ＨＢＳＳを用いて化合物である合成ペプチドｂｒａｐを３０ｍＭの貯蔵液になるように溶かす。
４．各ウェルに１０μＬ、４ｘの無洗Ｆｌｕｏ８色素を加えて、室温で１時間インキュベートする。
５．細胞をインキュベートする過程において、０．１％のＢＳＡを含むＨＢＳＳで測定対象化合物である合成ペプチドｂｒａｐを五倍の希釈になるように希釈する。陽性阻害剤ＨＯＥ１４０の初期濃度は３μＭである。
６．ＥＣ１０、ＥＣ２０及びＥＣ８０は、Ｂ２受容体に対する異なる刺激強度を表す。
７．調製済の測定対象の化合物を細胞培養プレートに加え、ＦＬＩＰＲにて、データの記録を行う。
【0033】
図５の結果から分かるように、測定曲線は平滑で、はっきりしたＳ型曲線となり、ＩＣ５０は１ｍＭ程である。
【0034】
（実施例５）
鼻腔内投与による合成ペプチドｂｒａｐのラットアレルギー性鼻炎に対する薬効実験：
本技術は上海美軒生物科技有限会社より提供される。
鼻腔内投与による合成ペプチドｂｒａｐのラットアレルギー性鼻炎に対する薬効実験：
本技術は上海美軒生物科技有限会社より提供される。
【0035】
一．動物モデルの準備
１．モデリング方法：
ＳＤラットのモデリング：腹腔内注射による感作と点鼻による刺激の２段階を含む。オボアルブミンの腹腔内注射：１ｍｇのオボアルブミン（Ｖレベル Ｓｉｇｍａ，アメリカ）を１ｍＬの生理食塩水に溶かし、３０ｍｇの水酸化アルミニウムを加えて免疫補助剤とする。腹腔内注射によりラット１匹当たりに上記の調製済のオボアルブミン懸濁液を１回あたり１ｍＬ、一日おきに１回注射して、計７回実施した後、１５日目にオボアルブミンの鼻腔刺激を実施する。２０ｍｇのオボアルブミン（Ｖレベル Ｓｉｇｎａ，アメリカ）を１ｍＬの生理食塩水に溶かして２％の溶液に調製し、その２％のオボアルブミン溶液を点鼻して刺激し、各ラットの両側鼻腔それぞれへ５０μＬずつを滴下し、７日間連続して実施する。
１．モデリング方法：
ＳＤラットのモデリング：腹腔内注射による感作と点鼻による刺激の２段階を含む。オボアルブミンの腹腔内注射：１ｍｇのオボアルブミン（Ｖレベル Ｓｉｇｍａ，アメリカ）を１ｍＬの生理食塩水に溶かし、３０ｍｇの水酸化アルミニウムを加えて免疫補助剤とする。腹腔内注射によりラット１匹当たりに上記の調製済のオボアルブミン懸濁液を１回あたり１ｍＬ、一日おきに１回注射して、計７回実施した後、１５日目にオボアルブミンの鼻腔刺激を実施する。２０ｍｇのオボアルブミン（Ｖレベル Ｓｉｇｎａ，アメリカ）を１ｍＬの生理食塩水に溶かして２％の溶液に調製し、その２％のオボアルブミン溶液を点鼻して刺激し、各ラットの両側鼻腔それぞれへ５０μＬずつを滴下し、７日間連続して実施する。
【0036】
空白対照群に対しては、３０ｍｇの水酸化アルミニウムと１ｍＬの生理食塩水をよく混ぜてから腹腔内注射を実施し、その実施方法は上記と同じである。１５日目に生理食塩水で点鼻する。
【0037】
２．症状評価
最後の点鼻処理を行った後、観察し、スコア基準表に基づいて、くしゃみ、鼻の抓め、喘ぎ、鼻の分泌物などの各ラットの症状に対して評価を行う。
最後の点鼻処理を行った後、観察し、スコア基準表に基づいて、くしゃみ、鼻の抓め、喘ぎ、鼻の分泌物などの各ラットの症状に対して評価を行う。
【0038】
二．動物モデルの治療及び評価
１．投与方法：マイクロピペットでラットの両側鼻腔それぞれに薬を投与し、一側あたり５０μＬを投与し、投与してから２０分後に、ラットの両側の鼻腔に２％のオボアルブミン溶液を一側あたり５０μＬで滴下して刺激し、この処理を４週間連続して実施した後、薬効を観察する。
１．投与方法：マイクロピペットでラットの両側鼻腔それぞれに薬を投与し、一側あたり５０μＬを投与し、投与してから２０分後に、ラットの両側の鼻腔に２％のオボアルブミン溶液を一側あたり５０μＬで滴下して刺激し、この処理を４週間連続して実施した後、薬効を観察する。
【0039】
２．薬物の調製
合成ペプチドｂｒａｐの高用量：合成ペプチドｂｒａｐの凍結乾燥粉末（５ｍｇ／ボトル）を取り、１．６３ｍＬの無菌生理食塩水に加えて溶かす。
合成ペプチドｂｒａｐの高用量：合成ペプチドｂｒａｐの凍結乾燥粉末（５ｍｇ／ボトル）を取り、１．６３ｍＬの無菌生理食塩水に加えて溶かす。
【0040】
合成ペプチドｂｒａｐの中用量：合成ペプチドｂｒａｐの凍結乾燥粉末（５ｍｇ／ボトル）を取り、４．８９ｍＬの無菌生理食塩水に加えて溶かす。
【0041】
合成ペプチドｂｒａｐの低用量：合成ペプチドｂｒａｐの凍結乾燥粉末（５ｍｇ／ボトル）を取り、１４．６７ｍＬの無菌生理食塩水に加えて溶かす。
【0042】
同時に、合成ペプチドｓｐ２高用量群と合成ペプチドｓｐ２中用量群を対照群とし、合成ペプチドｓｐ２高用量群の濃度は合成ペプチドｂｒａｐ高用量群と同じであり、合成ペプチドｓｐ２中用量群の濃度は合成ペプチドｂｒａｐ中用量群と同じである。合成ペプチドｓｐ２のアミノ酸配列は配列番号２に示す。
【0043】
３．症状評価
最終回のＯＶＡ刺激後、ラットに対してスコアリングを行う。実験結果は図６に示し、図６Ａは合成ペプチドｂｒａｐのアレルギー性鼻炎のラットに対する薬効スコアを示す図であり、実験結果から分かるように、モデル群と比べて、合成ペプチドｂｒａｐの高用量群、中用量群及び低用量群は、いずれもＯＶＡによるアレルギー性鼻炎の症状を改善することができ、且つスコアには有意差があり、これは合成ペプチドｂｒａｐはアレルギー性鼻炎の治療に良好な効果があることを示す。
最終回のＯＶＡ刺激後、ラットに対してスコアリングを行う。実験結果は図６に示し、図６Ａは合成ペプチドｂｒａｐのアレルギー性鼻炎のラットに対する薬効スコアを示す図であり、実験結果から分かるように、モデル群と比べて、合成ペプチドｂｒａｐの高用量群、中用量群及び低用量群は、いずれもＯＶＡによるアレルギー性鼻炎の症状を改善することができ、且つスコアには有意差があり、これは合成ペプチドｂｒａｐはアレルギー性鼻炎の治療に良好な効果があることを示す。
【0044】
図６Ｂはラットの治療前後のスコアの変化を示す図であり、ＯＶＡ刺激を継続して実施した後、モデル群のスコアが大幅に上昇し、ラットの死亡率も継続して上昇した（モデル時期の死亡率が２／５４＝３．７％、後期の投薬治療時期の死亡率が２／８＝２５％となる）。合成ペプチドｓｐ２の中用量群と高用量群も治療実施後、スコアが上昇しており、これはｓｐ２はＯＶＡ刺激による悪作用を完全に相殺することができないことを示唆する。合成ペプチドのｂｒａｐ高用量群、中用量群及び低用量群は、治療後でスコアが低下し、これは合成ペプチドｂｒａｐが治療期間におけるＯＶＡ刺激による悪作用を完全に相殺させることができ、かつラットの正常への回復に一定の効果があることを示す。
【0045】
（実施例６）
鼻腔内投与による合成ペプチドｂｒａｐのブラジキニンにより誘発されるモルモットの肺微小血管漏出に対する影響：
本技術は上海美軒生物科技有限会社より提供される。
鼻腔内投与による合成ペプチドｂｒａｐのブラジキニンにより誘発されるモルモットの肺微小血管漏出に対する影響：
本技術は上海美軒生物科技有限会社より提供される。
【0046】
一．動物の群分け及び処理
体重４００ｇ±５％のオスのモルモットを、各群に６匹ずつなるようにランダムで６つの群に分ける。
１．正常対照群：足の外側に等体積の生理食塩水を３日間連続して静脈内投与する。
２．モデル対照群：足の外側に等体積の生理食塩水を３日間連続して静脈内投与する。
３．陽性対照群：足の外側にデキサメタゾンを１．２５ｍｇ／３ｍＬ／ｋｇ ＢＷで３日間連続して静脈内投与する。
４．合成ペプチドｂｒａｐの高用量群：マイクロピペットでモルモットの両側鼻腔に濃度が３．０ｍＭ／Ｌの合成ペプチドｂｒａｐを一側あたり５０μＬずつ毎日注入し、３日間連続して実施する。
５．合成ペプチドｂｒａｐの中用量群：マイクロピペットでモルモットの両側鼻腔に濃度が１．０ｍＭ／Ｌの合成ペプチドｂｒａｐを一側あたり５０μＬずつ毎日注入し、３日間連続して実施する。
６．合成ペプチドｂｒａｐの低用量群：マイクロピペットでモルモットの両側鼻腔に濃度が０．３３ｍＭ／Ｌの合成ペプチドｂｒａｐ一側あたり５０μＬずつ毎日注入し、３日間連続して実施する。
体重４００ｇ±５％のオスのモルモットを、各群に６匹ずつなるようにランダムで６つの群に分ける。
１．正常対照群：足の外側に等体積の生理食塩水を３日間連続して静脈内投与する。
２．モデル対照群：足の外側に等体積の生理食塩水を３日間連続して静脈内投与する。
３．陽性対照群：足の外側にデキサメタゾンを１．２５ｍｇ／３ｍＬ／ｋｇ ＢＷで３日間連続して静脈内投与する。
４．合成ペプチドｂｒａｐの高用量群：マイクロピペットでモルモットの両側鼻腔に濃度が３．０ｍＭ／Ｌの合成ペプチドｂｒａｐを一側あたり５０μＬずつ毎日注入し、３日間連続して実施する。
５．合成ペプチドｂｒａｐの中用量群：マイクロピペットでモルモットの両側鼻腔に濃度が１．０ｍＭ／Ｌの合成ペプチドｂｒａｐを一側あたり５０μＬずつ毎日注入し、３日間連続して実施する。
６．合成ペプチドｂｒａｐの低用量群：マイクロピペットでモルモットの両側鼻腔に濃度が０．３３ｍＭ／Ｌの合成ペプチドｂｒａｐ一側あたり５０μＬずつ毎日注入し、３日間連続して実施する。
【0047】
二、モルモットの肺漏出測定
１．３日間連続して投与し、最終回の投与から２０分後、足の外側に１％ＥＢ（２０ｍｇ／ｋｇ）とブラジキニン１５ｎｍｏＬ／ｋｇ（生理食塩水で１０ｎｍｏＬ／ｍＬに希釈して、１．５ｍＬ／ｋｇ体重、つまり１５ｎｍｏＬ／ｋｇ）を順次に静脈内投与する。正常群はＥＢとブラジキニンを注射しない。
１．３日間連続して投与し、最終回の投与から２０分後、足の外側に１％ＥＢ（２０ｍｇ／ｋｇ）とブラジキニン１５ｎｍｏＬ／ｋｇ（生理食塩水で１０ｎｍｏＬ／ｍＬに希釈して、１．５ｍＬ／ｋｇ体重、つまり１５ｎｍｏＬ／ｋｇ）を順次に静脈内投与する。正常群はＥＢとブラジキニンを注射しない。
【0048】
２．肺組織のＥＢ測定：ブラジキニンを注射してから３０分後、動物を麻酔した後、頸動脈から血を取って屠殺して、血液一般検査を行い、胸腔を開き、右心室と左心房を切り肺動脈に挿管し、流出液が澄清になるまで３０ｍＬの生理食塩水で肺循環を洗浄することを繰り返し、右肺下葉を取り出し、生理食塩水で表面の血液を洗浄し、フィルター紙で水分を吸い尽くし、１００ｍｇを取って細かく切り、２ｍＬのホルムアミド溶液中に置き、４５℃の水浴槽で２４時間インキュベートする。１５００ｒｐｍ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、上清液を吸い取り、６２０ｎｍの波長で吸光度を測定する。図７Ｂに示すように、ＥＢ基準曲線（ＥＢ基準曲線は図７Ａに示す）に基づいて肺組織のＥＢの含有量を求める。
【0049】
３．ＥＢ基準曲線の作成：０．１％のＥＢ溶液を０．１ｍＬ精密に取り、生理食塩水０．９ｍＬを加えて０．０ｌ％のＥＢ基準液１ｍＬを調製し得、ＥＢ基準液を０．１ｍＬ取り２ｍＬになるまでホルムアミドを加えて、最終濃度が５ｍｇ／Ｌの溶液を得、ホルムアミドでそれぞれ４、２、１、０．５ｍｇ／Ｌになるように希釈する。６２０ｎｍの波長において吸光度のＯＤ値を測定し、ＯＤ値を縦軸としＥＢ濃度を横軸にして、ＯＤ値－ＥＢ濃度の基準曲線を作成し、基準曲線は図７Ａに示すとおりである。
【0050】
三．実験分析
１．エバンスブルー（ＥＢ）はアルブミンと結合することができ、ＥＢの漏出はタンパク質の漏出情況を反映し、肺組織に漏出したＥＢの含有量を測定することで、肺微小血管の透過性と肺微小血管の漏出程度を反映することができる。正常対照群と比べて、モデル群の肺組織ＥＢの含有量は顕著に増加する（＊＊はＰ＜０．０１を表す）が、合成ペプチドｂｒａｐの低、中、高用量群はいずれもモデル群より著しく低く（Ｐ＜０．０１）、用量－反応関係を有する。陽性対照群と比べて、低用量群のほか、有意差がない（＾＾はＰ＞０．０５表す）。
１．エバンスブルー（ＥＢ）はアルブミンと結合することができ、ＥＢの漏出はタンパク質の漏出情況を反映し、肺組織に漏出したＥＢの含有量を測定することで、肺微小血管の透過性と肺微小血管の漏出程度を反映することができる。正常対照群と比べて、モデル群の肺組織ＥＢの含有量は顕著に増加する（＊＊はＰ＜０．０１を表す）が、合成ペプチドｂｒａｐの低、中、高用量群はいずれもモデル群より著しく低く（Ｐ＜０．０１）、用量－反応関係を有する。陽性対照群と比べて、低用量群のほか、有意差がない（＾＾はＰ＞０．０５表す）。
【0051】
２．正常対照群と比べて、モデル群の肺組織のＥＢの含有量が著しく増加し（＊＊はＰ＜０．００１を表す）、合成ペプチドｂｒａｐ低、中、高用量群はいずれもモデル群より著しく低く（Ｐ＜０．０１）、用量－反応関係を有する。陽性対照群と比べて、有意差がない（＾＾はＰ＞０．０５を表す）。
【0052】
（実施例７）
ブラジキニンＢ１受容体標的とｂｒａｐとのドッキング及び結合パターン：
本技術は南京欧際医薬科技サービス有限会社より提供される。
ブラジキニンＢ１受容体標的とｂｒａｐとのドッキング及び結合パターン：
本技術は南京欧際医薬科技サービス有限会社より提供される。
【0053】
１．ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔを採用してＢｒａｄｙｋｉｎｉｎ（ＢＫ）のＢ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｂ１Ｒ）テンプレートを選択し、ＰＤＢベースにおける配列の比較に基づいて配列の類似性とカバレッジ比率がよい５ＵＮＦをテンプレートとして選択する。
【0054】
２．ＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒソフトウェアパッケージにおけるホモロジーモデリングモジュールＰｒｉｍｅを採用して、Ｂ１に対して３次元構造のモデリングを行う。
異なるモデリングのパラメータ設定によって２種類のＢ１の構造ファイルを得、それぞれは、知識に基づく受容体構造とエネルギーに基づく受容体構造とする。
異なるモデリングのパラメータ設定によって２種類のＢ１の構造ファイルを得、それぞれは、知識に基づく受容体構造とエネルギーに基づく受容体構造とする。
【0055】
３．ＭＤｏｃｋＰｅＰを採用して、合成ペプチドｂｒａｐを２種類の受容体構造にドッキングし、ドッキング実験は２回行う。
【0056】
４．ドッキング実験での最適な結合パターンに対してｂｒａｐ－受容体結合相互作用のエネルギー分解を行い、合成ペプチドｂｒａｐにおけるアミノ酸残基のエネルギー寄与及びＢ１受容体との結合パターンが開示された。
【0057】
（１）Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（ＢＫ）Ｂ１受容体構造のホモロジーモデリング
Ｂ１受容体の配列をｕｎｉｐｒｏｔデータベースからダウンロードして、配列番号７に示すような、ホモロジーモデリングで採用されたＢ１受容体の配列を得る。
Ｂ１受容体の配列をｕｎｉｐｒｏｔデータベースからダウンロードして、配列番号７に示すような、ホモロジーモデリングで採用されたＢ１受容体の配列を得る。
【0058】
（２）受容体Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ（ＢＫ）Ｂ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒと合成ペプチドｂｒａｐの分子とのドッキング
ＭＤｏｃｋＰｅＰを採用してＢ１受容体タンパク質とｂｒａｐ構造とのドッキングを行う。
ｂｒａｐは８種のアミノ酸からなる１０ペプチド化合物である。
図中、緑色は受容体タンパク質分子を表し、水色は合成ペプチドｂｒａｐ分子を表す。
ＭＤｏｃｋＰｅＰを採用してＢ１受容体タンパク質とｂｒａｐ構造とのドッキングを行う。
ｂｒａｐは８種のアミノ酸からなる１０ペプチド化合物である。
図中、緑色は受容体タンパク質分子を表し、水色は合成ペプチドｂｒａｐ分子を表す。
【0059】
（３）Ｍｏｄｅｌにおける合成ペプチドｂｒａｐの残基ごとのエネルギー寄与を計算する。
Ｂ１（受容体）とｂｒａｐ（配位子）との相互作用残基をさらに研究して、ｂｒａｐにおいての残基ごとに、距離が４A未満の範囲内での受容体残基を接触残基として定義し、これを基に、ｂｒａｐにおいての残基ごとのエネルギー寄与を計算する。
図中、緑色は受容体タンパク質分子を表し、水色はｂｒａｐ分子を表す。
合成ペプチドｂｒａｐはＵ字型で受容体ポケットに結合する。
Ｂ１（受容体）とｂｒａｐ（配位子）との相互作用残基をさらに研究して、ｂｒａｐにおいての残基ごとに、距離が４A未満の範囲内での受容体残基を接触残基として定義し、これを基に、ｂｒａｐにおいての残基ごとのエネルギー寄与を計算する。
図中、緑色は受容体タンパク質分子を表し、水色はｂｒａｐ分子を表す。
合成ペプチドｂｒａｐはＵ字型で受容体ポケットに結合する。
【0060】
（実施例８）
合成ペプチドｂｒａｐのブラジキニンＢ１受容体に対する抑制作用：
本技術は武漢合研生物医薬科技有限会社より提供される。
合成ペプチドｂｒａｐのブラジキニンＢ１受容体に対する抑制作用：
本技術は武漢合研生物医薬科技有限会社より提供される。
【0061】
１．ＨＥＫ２９３／Ｇ１５／ブラジキニン１実験方法：
細胞の回復：
回復が必要なＨＥＫ２９３／Ｇα１５／Ｂ１細胞を液体窒素容器から速やかに取り出し、３７℃のウォーターバスで融かす。細胞懸濁液を予備加熱しておいたＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に速やかに加え、遠心分離機にて１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５分間遠心分離する。遠心分離チューブを取り出し、上清液を除去し、遠心分離チューブに新鮮な予備加熱した培地を加え、細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を培養皿に加え、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件下で培養する。
細胞の回復：
回復が必要なＨＥＫ２９３／Ｇα１５／Ｂ１細胞を液体窒素容器から速やかに取り出し、３７℃のウォーターバスで融かす。細胞懸濁液を予備加熱しておいたＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に速やかに加え、遠心分離機にて１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５分間遠心分離する。遠心分離チューブを取り出し、上清液を除去し、遠心分離チューブに新鮮な予備加熱した培地を加え、細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を培養皿に加え、３７°Ｃ、５％ＣＯ２の条件下で培養する。
【0062】
細胞の継代培養：
Ｂ１受容体を安定的に発現するＨＥＫ２９３／Ｇα１５／Ｂ１細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで培養する。細胞培養条件：ＨＥＫ２９３／Ｇα１５／Ｂ１細胞系の通常培養を行い、１０％のウシ胎児血清とＤＭＥＭを含む培地で継代培養を行う。
Ｂ１受容体を安定的に発現するＨＥＫ２９３／Ｇα１５／Ｂ１細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで培養する。細胞培養条件：ＨＥＫ２９３／Ｇα１５／Ｂ１細胞系の通常培養を行い、１０％のウシ胎児血清とＤＭＥＭを含む培地で継代培養を行う。
【0063】
細胞が培養皿の８０～９０％を占めるまで増殖すると、０．２５％のトリプシンで細胞を消化して、新しい培地を用いて細胞を再懸濁し、細胞は適当な割合で継代培養し、約２～３日に１回継代培養する。
【0064】
実験過程：
１．成長集密度が８０％に達したＨＥＫ２９３／Ｇ１５／ブラジキニン１細胞をトリプシンで消化した後でカウントし、ウェルあたり２ｘ１０４個／ｍＬの密度でｍａｔｒｉｇｅｌによりコーティングされた黒縁の透明な３８４ウェル培養プレートに巻込む。
２．細胞巻込み済の３８４ウェル培養プレートを５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いて一晩培養する。
３．実験当日に、ＨＢＳＳを用いて化合物である合成ペプチドｂｒａｐを３０ｍＭの貯蔵液になるように溶かす。
４．３８４ウェルプレートの各ウェルに１０μＬ、４ｘ無洗Ｆｌｕｏ８色素を加え、室温で１時間インキュベートする。
５．細胞をインキュベートする過程において、０．１％のＢＳＡを含むＨＢＳＳで測定対象の化合物である合成ペプチドｂｒａｐを五倍に希釈する。陽性阻害剤の初期濃度は１０μＭである。
６．ＥＣ１０刺激剤の最終濃度が０．３ｎＭであり、ＥＣ２０刺激剤の最終濃度が０．６ｎＭであり、ＥＣ８０刺激剤の最終濃度が１８ｎＭである。
７．調製済の化合物を細胞培養プレートに加え、ＦＬＩＰＲにて、データの記録を行う。
１．成長集密度が８０％に達したＨＥＫ２９３／Ｇ１５／ブラジキニン１細胞をトリプシンで消化した後でカウントし、ウェルあたり２ｘ１０４個／ｍＬの密度でｍａｔｒｉｇｅｌによりコーティングされた黒縁の透明な３８４ウェル培養プレートに巻込む。
２．細胞巻込み済の３８４ウェル培養プレートを５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いて一晩培養する。
３．実験当日に、ＨＢＳＳを用いて化合物である合成ペプチドｂｒａｐを３０ｍＭの貯蔵液になるように溶かす。
４．３８４ウェルプレートの各ウェルに１０μＬ、４ｘ無洗Ｆｌｕｏ８色素を加え、室温で１時間インキュベートする。
５．細胞をインキュベートする過程において、０．１％のＢＳＡを含むＨＢＳＳで測定対象の化合物である合成ペプチドｂｒａｐを五倍に希釈する。陽性阻害剤の初期濃度は１０μＭである。
６．ＥＣ１０刺激剤の最終濃度が０．３ｎＭであり、ＥＣ２０刺激剤の最終濃度が０．６ｎＭであり、ＥＣ８０刺激剤の最終濃度が１８ｎＭである。
７．調製済の化合物を細胞培養プレートに加え、ＦＬＩＰＲにて、データの記録を行う。
【0065】
実験結果は図９に示す。ｂｒａｐとＶｅｈｉｃｌｅ及びＥＣ１０とＥＣ２０のＢｒａｄｙｋｉｎｉｎ混合溶液を細胞系に加えてから、１５分間継続して培養した後、ＥＣ８０刺激剤を加えて化合物の抑制活性を測定する。
【0066】
実験結果から分かるように、ｂｒａｐとＥＣ８０が共同作用する場合、Ｓ型曲線が明らかであり、これは、Ｂ１受容体の過度活化性に対して明らかな抑制作用があることを示す。一方、ＥＣ１０とＥＣ２０が共同作用する場合の化合物の効果が明らかではなく、これは、前のステップでの反応でカルシウムイオンがかなり多く放出されて、短期間で二次信号を起こすことができないことになっていたのが原因であると推測される。
【0067】
（実施例９）
合成ペプチドｂｒａｐのＬＰＳにより誘発されるマウスの急性肺損傷における保護作用：
本技術は上海美軒生物科技有限会社より提供される。
合成ペプチドｂｒａｐのＬＰＳにより誘発されるマウスの急性肺損傷における保護作用：
本技術は上海美軒生物科技有限会社より提供される。
【0068】
一、動物の群分け及び処理
１．ＳＰＦレベルのＢａｌｂ／Ｃマウス、オス、体重：２０±２ｇ、ｎ＝４８
２．飼育条件：ＳＰＦ無菌環境、２５℃の定温環境、１２時間おきの光交代照明、十分の水及び餌供給下で飼育する。
３．群分け及び処理：各群に６匹ずつなるようにランダムで８つの群（Ａ－Ｈ）に分ける。
１．ＳＰＦレベルのＢａｌｂ／Ｃマウス、オス、体重：２０±２ｇ、ｎ＝４８
２．飼育条件：ＳＰＦ無菌環境、２５℃の定温環境、１２時間おきの光交代照明、十分の水及び餌供給下で飼育する。
３．群分け及び処理：各群に６匹ずつなるようにランダムで８つの群（Ａ－Ｈ）に分ける。
【0069】
３－１．モデリング前、それぞれ３日間連続して異なる処理を行う。
Ａ．正常対照群：尾静脈内投与により生理食塩水を毎日１回投与する。
Ｂ．ＬＰＳモデル群：尾静脈内投与により生理食塩水を毎日１回投与する。
Ｃ．モデル投与のｓｐ２群：尾静脈内投与によりｓｐ２（１６ｍｇ／ｋｇＢＷ）を毎日１回投与する。
Ｄ．モデル投与のｂｒａｐ高用量群：尾静脈内投与によりｂｒａｐ（１６ｍｇ／ｋｇＢＷ）を毎日１回投与する。
Ｅ．モデル投与のｂｒａｐ中用量群：尾静脈内投与によりｂｒａｐ（８ｍｇ／ｋｇＢＷ）を毎日１回投与する。
Ｆ．モデル投与のｂｒａｐ低用量群：静脈内投与によりｂｒａｐ（４ｍｇ／ｋｇＢＷ）を毎日１回投与する。
Ｇ．モデル投与のｂｒａｐ鼻腔内投与群：鼻腔内投与によりｂｒａｐ（３ｍＭ）を両側鼻腔それぞれに１５μＬずつ、毎日１回投与する。
Ｈ．モデル投与のデキサメタゾン群（陽性対照群）：腹腔内注射によりデキサメタゾンｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｍｅ，ＤＥＸ，５ｍｇ／ｋｇを毎日１回投与する。
Ａ．正常対照群：尾静脈内投与により生理食塩水を毎日１回投与する。
Ｂ．ＬＰＳモデル群：尾静脈内投与により生理食塩水を毎日１回投与する。
Ｃ．モデル投与のｓｐ２群：尾静脈内投与によりｓｐ２（１６ｍｇ／ｋｇＢＷ）を毎日１回投与する。
Ｄ．モデル投与のｂｒａｐ高用量群：尾静脈内投与によりｂｒａｐ（１６ｍｇ／ｋｇＢＷ）を毎日１回投与する。
Ｅ．モデル投与のｂｒａｐ中用量群：尾静脈内投与によりｂｒａｐ（８ｍｇ／ｋｇＢＷ）を毎日１回投与する。
Ｆ．モデル投与のｂｒａｐ低用量群：静脈内投与によりｂｒａｐ（４ｍｇ／ｋｇＢＷ）を毎日１回投与する。
Ｇ．モデル投与のｂｒａｐ鼻腔内投与群：鼻腔内投与によりｂｒａｐ（３ｍＭ）を両側鼻腔それぞれに１５μＬずつ、毎日１回投与する。
Ｈ．モデル投与のデキサメタゾン群（陽性対照群）：腹腔内注射によりデキサメタゾンｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｍｅ，ＤＥＸ，５ｍｇ／ｋｇを毎日１回投与する。
【0070】
３－２．実験当日、つまりモデリング当日：
Ａ－Ｈ群の動物に対して上記処理を３０分間継続して実施した後、Ａ群に同体積の生理食塩水を腹腔内注射し、３０分間の後で他の群にＬＰＳ ５ｍｇ／ｋｇＢＷを腹腔内注射する。
Ａ－Ｈ群の動物に対して上記処理を３０分間継続して実施した後、Ａ群に同体積の生理食塩水を腹腔内注射し、３０分間の後で他の群にＬＰＳ ５ｍｇ／ｋｇＢＷを腹腔内注射する。
【0071】
二、肺組織ＨＥ染色による病理学的検出
実験手順：
１．組織切片、プレーティング
２．組織脱ろう水和化
３．ヘマトキシリン染色液で５～２０分間染色し（組織と実験要求に応じて調整する）、水道水で洗浄する。
４．分化液で３０秒間分化する。
５．水道水で１５分間、又は温水（約５０度）で５分間浸漬する。
６．エオシン染色液に２分間置いて（組織と実験要求に応じて調整する）、水道水で洗浄する。
７．水道水で５分間浸漬する。
８．アルコール勾配により脱水：９５％、１００％Ｉ、１００％ＩＩの勾配で、それぞれの濃度で１分間ずつ実施する。
９．キシレンで透明化：キシレンＩ、ＩＩで、それぞれ１０分間ずつ実施する。
１０．中性樹脂でシールする。
１１．６０度の乾燥機に置いて乾燥させ、顕微鏡下で観察する。
実験手順：
１．組織切片、プレーティング
２．組織脱ろう水和化
３．ヘマトキシリン染色液で５～２０分間染色し（組織と実験要求に応じて調整する）、水道水で洗浄する。
４．分化液で３０秒間分化する。
５．水道水で１５分間、又は温水（約５０度）で５分間浸漬する。
６．エオシン染色液に２分間置いて（組織と実験要求に応じて調整する）、水道水で洗浄する。
７．水道水で５分間浸漬する。
８．アルコール勾配により脱水：９５％、１００％Ｉ、１００％ＩＩの勾配で、それぞれの濃度で１分間ずつ実施する。
９．キシレンで透明化：キシレンＩ、ＩＩで、それぞれ１０分間ずつ実施する。
１０．中性樹脂でシールする。
１１．６０度の乾燥機に置いて乾燥させ、顕微鏡下で観察する。
【0072】
実験結果は図１６に示す。
【0073】
結果分析：
モデル群：肺胞隔壁（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｅｐｔｕｍ）の肥厚、炎症細胞の浸潤、肺胞隔壁の局所的融合が見られる。静脈内投与によるｂｒａｐの高用量群（Ｄ）と鼻腔内投与によるｂｒａｐ群（Ｇ）はいずれにも異常がない。
モデル群：肺胞隔壁（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｅｐｔｕｍ）の肥厚、炎症細胞の浸潤、肺胞隔壁の局所的融合が見られる。静脈内投与によるｂｒａｐの高用量群（Ｄ）と鼻腔内投与によるｂｒａｐ群（Ｇ）はいずれにも異常がない。
【0074】
図１６ＢはＬＰＳモデル群が正常対照群の図１６Ａとの比較であり、肺胞隔壁の肥厚、炎症細胞の浸潤、肺胞隔壁の局所的融合が見られる。図１６ＣはＬＰＳ＋合成ペプチドｓｐ２群であり、炎症細胞の浸潤が明らかに見える。図１６ＤはＬＰＳ＋ｂｒａｐ高用量群であり、肺胞隔壁の肥厚が見られず、明らかな炎症細胞の浸潤が見られない。Ｅ群とＦ群はそれぞれＬＰＳ＋ｂｒａｐの中、低用量群であり、ｂｒａｐ用量の低下に伴い、炎症細胞の浸潤が現れるようになる。Ｇ群は鼻腔内投与の群であり、Ｄ群と類似して、顕著な異常が見られない。Ｈ群はデキサメタゾン陽性対照群であり、炎症細胞の浸潤が顕著であり、肺胞隔壁の局所的融合が見られない。
【0075】
（実施例１０）
血液サンプルにおける内毒素の含有量の検出：
血液サンプルにおける内毒素の含有量の検出
１ 機器
血液サンプルにおける内毒素の含有量の検出：
血液サンプルにおける内毒素の含有量の検出
１ 機器
【表2】
【0076】
２ 試薬
【表3】
【0077】
実験手順：
内毒素検出リムルス試薬キットの説明書に従い操作する。
（１）実施例９でモデリングした各群マウスの抗凝血サンプルを取り、３０００ｒｐｍ／ｍｉｎで２分間遠心分離し、１００μＬの上清液を取り、０．９ｍＬのサンプル処理液を加える。
（２）上記サンプルを乾熱器に置いて７０℃で、１０分間加熱した後、流水で冷却する。
（３）内毒素基準品濃度の勾配はそれぞれ１．０、０．５、０．２５、０．１ＥＵ／ｍＬである。
（４）内毒素の汚染がないテストチューブを取り、１００μＬの細菌内毒素検出用水、内毒素基準品、被験品をそれぞれ加える。
（６）１００μＬのリムルス試薬溶液を加え、よく混ぜ、アルミ箔を覆い、３７℃で１０分間インキュベートする。
（７）１００μＬの発色基質溶液を加え、よく混ぜ、３７℃で６分間インキュベートする。
（８）５００μＬのアゾ試薬１溶液を加え、よく混ぜる。
（９）５００μＬのアゾ試薬２溶液を加え、よく混ぜる。
（１０）５００μＬのアゾ試薬３溶液を加え、よく混ぜ、５分間静置する。
（１１）５４５ｎｍにおいて吸光度値を測定する。
内毒素検出リムルス試薬キットの説明書に従い操作する。
（１）実施例９でモデリングした各群マウスの抗凝血サンプルを取り、３０００ｒｐｍ／ｍｉｎで２分間遠心分離し、１００μＬの上清液を取り、０．９ｍＬのサンプル処理液を加える。
（２）上記サンプルを乾熱器に置いて７０℃で、１０分間加熱した後、流水で冷却する。
（３）内毒素基準品濃度の勾配はそれぞれ１．０、０．５、０．２５、０．１ＥＵ／ｍＬである。
（４）内毒素の汚染がないテストチューブを取り、１００μＬの細菌内毒素検出用水、内毒素基準品、被験品をそれぞれ加える。
（６）１００μＬのリムルス試薬溶液を加え、よく混ぜ、アルミ箔を覆い、３７℃で１０分間インキュベートする。
（７）１００μＬの発色基質溶液を加え、よく混ぜ、３７℃で６分間インキュベートする。
（８）５００μＬのアゾ試薬１溶液を加え、よく混ぜる。
（９）５００μＬのアゾ試薬２溶液を加え、よく混ぜる。
（１０）５００μＬのアゾ試薬３溶液を加え、よく混ぜ、５分間静置する。
（１１）５４５ｎｍにおいて吸光度値を測定する。
【0078】
実験結果は図１０に示す。正常群と比べて、ＬＰＳ ５ｍｇ／ｋｇＢＷを腹腔内注射してから６時間後、マウスの血液における内毒素のレベルが著しく上昇し、有意差がある。モデル群と比べて、合成ペプチドｂｒａｐの低、中、高用量群の血液における内毒素のレベルはいずれもモデル群より低く、用量－反応関係を有する。
【0079】
（実施例１１）
ｑＰＣＲによる肺組織ＩＬ６ ｍＲＮＡ発現の検出：
実験手順
試薬
ｑＰＣＲによる肺組織ＩＬ６ ｍＲＮＡ発現の検出：
実験手順
試薬
【表4】
【0080】
１．サンプルの準備
１．１肺組織サンプル：実施例９でモデリングした各群マウスの新鮮な肺組織サンプルを取り、液体窒素で速やかに冷凍し、－８０℃で保存する。
１．１肺組織サンプル：実施例９でモデリングした各群マウスの新鮮な肺組織サンプルを取り、液体窒素で速やかに冷凍し、－８０℃で保存する。
【0081】
２．総ＲＮＡの抽出（磁気ビーズ法で総ＲＮＡ抽出試薬キット）
２．１組織サンプルを小片に切った後、液体窒素を加えて粉末（５０ｍｇ）状になるまで研磨し、ＲＮＡ酵素を含まない１．５ｍＬのチューブに移す（細胞サンプル及び他の液体のサンプルを研磨せず、直接に次の手順に入る）。
２．２総ＲＮＡの抽出
２．１組織サンプルを小片に切った後、液体窒素を加えて粉末（５０ｍｇ）状になるまで研磨し、ＲＮＡ酵素を含まない１．５ｍＬのチューブに移す（細胞サンプル及び他の液体のサンプルを研磨せず、直接に次の手順に入る）。
２．２総ＲＮＡの抽出
【0082】
３．ｑＰＣＲ反応
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００／７５００／７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍと ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用する操作方法で行う。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００／７５００／７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍと ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用する操作方法で行う。
【0083】
１．ＰＣＲ反応液の調製
試薬 用量
ＳＹＢＲRＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ １０．０μＬ
酵素混合物 ２．５μＬ
ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） １μＬ
ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） １μＬ
ＰＣＲ逆転写 Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） ０．５μＬ
ＲＮＡテンプレート ２．０μＬ
ｄＨ２Ｏ（滅菌蒸溜水） ３．０μＬ
Ｔｏｔａｌ ２０．０μＬ
試薬 用量
ＳＹＢＲRＰｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ １０．０μＬ
酵素混合物 ２．５μＬ
ＰＣＲ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） １μＬ
ＰＣＲ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） １μＬ
ＰＣＲ逆転写 Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ） ０．５μＬ
ＲＮＡテンプレート ２．０μＬ
ｄＨ２Ｏ（滅菌蒸溜水） ３．０μＬ
Ｔｏｔａｌ ２０．０μＬ
【0084】
２．Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ反応を行う。
【0085】
３．実験結果の分析。
反応が完了した後、Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲの増幅曲線と融解曲線を確認し、２－△△ｃｔ値等を計算する。
反応が完了した後、Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲの増幅曲線と融解曲線を確認し、２－△△ｃｔ値等を計算する。
【0086】
４．プライマー配列
【表5】
【0087】
【0088】
（実施例１２）
血清サイトカイン含有量の検出：
試薬
血清サイトカイン含有量の検出：
試薬
【表6】
【0089】
実験手順
１．試薬キット中の試薬を取り出し、常温で３０分間平衡化する。
２．基準品ウェルとサンプルウェルを設定し、基準品の各ウェルにそれぞれ濃度が異なる基準品を５０μＬずつ加える。
３．測定対象サンプルウェルにまず５０μＬの測定対象サンプル（実施例９でモデリングした各群マウスのモデルの血液サンプル）を加える。
４．基準ウェルと測定対象ウェルの各ウェルに１００μＬのＨＲＰ標記検出抗体を加える。
５．封止膜で反応ウェルを封止し、３７℃で６０分間インキュベートする。
６．液体を除去し、吸水紙に置いてたたいて乾燥させ、各ウェルいっぱいに洗浄液を加え、１分間静置する。
７．培養液を除去し、吸水紙に置いてたたいて乾燥させ、手順２～６を５回繰り返し実施する。
８．各ウェルにそれぞれ５０μＬのＡ＼Ｂ基質を加え、３７℃で１５分間インキュベートする。
９．各ウェルに５０μＬの停止液を加え、１５分間内でマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍにおいてＯＤ値を測定する。
１．試薬キット中の試薬を取り出し、常温で３０分間平衡化する。
２．基準品ウェルとサンプルウェルを設定し、基準品の各ウェルにそれぞれ濃度が異なる基準品を５０μＬずつ加える。
３．測定対象サンプルウェルにまず５０μＬの測定対象サンプル（実施例９でモデリングした各群マウスのモデルの血液サンプル）を加える。
４．基準ウェルと測定対象ウェルの各ウェルに１００μＬのＨＲＰ標記検出抗体を加える。
５．封止膜で反応ウェルを封止し、３７℃で６０分間インキュベートする。
６．液体を除去し、吸水紙に置いてたたいて乾燥させ、各ウェルいっぱいに洗浄液を加え、１分間静置する。
７．培養液を除去し、吸水紙に置いてたたいて乾燥させ、手順２～６を５回繰り返し実施する。
８．各ウェルにそれぞれ５０μＬのＡ＼Ｂ基質を加え、３７℃で１５分間インキュベートする。
９．各ウェルに５０μＬの停止液を加え、１５分間内でマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍにおいてＯＤ値を測定する。
【0090】
【0091】
１．正常群と比べて、ＬＰＳ（５ｍｇ／ｋｇＢＷの腹腔内注射）は、マウスの血清におけるＴＮＦ－ａとＩＬ－６のレベルの著しく上昇を誘発し、有意差がある（＊＊はｐ値＜０．０１を表す）。
【0092】
２．モデル群と比べて、静脈内投与のｂｒａｐ低、中、高用量群は、血清におけるＴＮＦ－ａとＩＬ－６のレベルが低下し、用量－反応関係があり（＾＾はｐ値＜０．０１を表す）、ｂｒａｐの点鼻群は、ＬＰＳ処理１２ｈでの血液におけるＴＮＦ－ａとＩＬ－６のレベルを低下させることができ、Ｐ＜０．０５である。
【0093】
（実施例１３）
フローサイトメトリーを用いた各群肺組織におけるＲＯＳの蛍光強度の検出：
実験手順
１．実施例９でモデリングした各群マウスモデルの新鮮な左肺組織約１００ｍｇを取り、ＰＢＳで３回洗浄して血液を除去する。
２．組織をナイロンネットに置いて、研磨棒で研磨しながら、ＰＢＳで洗浄する。
３．細胞懸濁液を集めて、２００メッシュのスクリーンでろ過し、組織塊を除去する。
４．細胞懸濁液を集めて、１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５分間遠心分離する。
５．細胞の上清を除去し、ＰＢＳを加えて再懸濁する。
６．無血清培養液で１０μｍｏｌ／ＬのＤＣＦＨ－ＤＡを調製する。
７．細胞を遠心分離してＰＢＳを除去し、上記プローブ希釈剤を加えて、細胞濃度が１０６個／ｍＬになるように調製する。
８．３７℃で３０分間インキュベートし、３分間おきに揺動する。
９．１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、無血清培地で細胞を再懸濁して沈殿させる。
１０．手順９を２回繰り返す。
１１．５００μＬのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーにて平均蛍光強度値を検出する。
フローサイトメトリーを用いた各群肺組織におけるＲＯＳの蛍光強度の検出：
実験手順
１．実施例９でモデリングした各群マウスモデルの新鮮な左肺組織約１００ｍｇを取り、ＰＢＳで３回洗浄して血液を除去する。
２．組織をナイロンネットに置いて、研磨棒で研磨しながら、ＰＢＳで洗浄する。
３．細胞懸濁液を集めて、２００メッシュのスクリーンでろ過し、組織塊を除去する。
４．細胞懸濁液を集めて、１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５分間遠心分離する。
５．細胞の上清を除去し、ＰＢＳを加えて再懸濁する。
６．無血清培養液で１０μｍｏｌ／ＬのＤＣＦＨ－ＤＡを調製する。
７．細胞を遠心分離してＰＢＳを除去し、上記プローブ希釈剤を加えて、細胞濃度が１０６個／ｍＬになるように調製する。
８．３７℃で３０分間インキュベートし、３分間おきに揺動する。
９．１０００ｒｐｍ／ｍｉｎで５分間遠心分離し、無血清培地で細胞を再懸濁して沈殿させる。
１０．手順９を２回繰り返す。
１１．５００μＬのＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーにて平均蛍光強度値を検出する。
【0094】
実験結果は図１４に示す。図１４Ａは正常対照群であり、図１４ＢはＬＰＳモデル群（５ｍｇ／ｋｇＢＷの腹腔内注射）であり、図１４ＣはＬＰＳ＋１６ｍｇ／ｋｇＢＷの合成ペプチドｂｒａｐであり、図１４ＤはＬＰＳ＋８ｍｇ／ｋｇＢＷの合成ペプチドｂｒａｐであり、図１４ＥはＬＰＳ＋４ｍｇ／ｋｇＢＷの合成ペプチドｂｒａｐであり、図１４ＦはＬＰＳ＋合成ペプチドｂｒａｐ（両側鼻腔それぞれに、１５μＬずつ毎日一回注射する）であり、図１４Ｇは陽性対照群（ＬＰＳ＋デキサメタゾン５ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射）である。
【0095】
図１５はフローサイトメトリーにて検出された各群マウス肺組織におけるＲＯＳの平均蛍光強度を示す。
【0096】
（実施例１４）
ｂｒａｐの静脈内投与２０００ｍｇ／ｋｇＢＷ用量での限度実験：
実験条件：Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＧＬＰ
一．被験動物：昆明種マウス、健康、成体、オス、体重≦２０ｇ、ｎ＝５匹
ｂｒａｐの静脈内投与２０００ｍｇ／ｋｇＢＷ用量での限度実験：
実験条件：Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＧＬＰ
一．被験動物：昆明種マウス、健康、成体、オス、体重≦２０ｇ、ｎ＝５匹
【0097】
二．被験サンプル：合成ペプチドｂｒａｐ
１．Ｌｏｔ Ｎｏ．：０４０１００３９５７２、蘇州強耀生物科技有限会社より合成された。
２．含有量：サンプルは精密に分注されているので、再秤量する必要なく、５ｍｇ／ボトル×８本（１匹目のマウス用）、８ｍｇ／ボトル×２０本（他の４匹のマウス用）
３．保存条件：－２０℃で保存
４．サンプル純度：ＨＰＬＣ検出による純度＞９９．４９％
５．調製方法：－２０℃の環境から合成ペプチドｂｒａｐの凍結乾燥粉末を取り出し、室温に１５分間放置した後、１．５ｍＬの生理食塩水を加え、振って、完全に溶解させる。
１．Ｌｏｔ Ｎｏ．：０４０１００３９５７２、蘇州強耀生物科技有限会社より合成された。
２．含有量：サンプルは精密に分注されているので、再秤量する必要なく、５ｍｇ／ボトル×８本（１匹目のマウス用）、８ｍｇ／ボトル×２０本（他の４匹のマウス用）
３．保存条件：－２０℃で保存
４．サンプル純度：ＨＰＬＣ検出による純度＞９９．４９％
５．調製方法：－２０℃の環境から合成ペプチドｂｒａｐの凍結乾燥粉末を取り出し、室温に１５分間放置した後、１．５ｍＬの生理食塩水を加え、振って、完全に溶解させる。
【0098】
三．投与経路及び用量：尾静脈内投与２０００ｍｇ／ｋｇＢＷ
【0099】
四．投与方式：
投与容量：マウスの尾静脈内投与の最大容量は１回あたり０．５ｍＬであり、ゆっくり注射する。
投与用量及び方式：４０ｍｇ／１．５ｍＬの作業液を、９時間以内に３回に分けて投与する。
投与容量：マウスの尾静脈内投与の最大容量は１回あたり０．５ｍＬであり、ゆっくり注射する。
投与用量及び方式：４０ｍｇ／１．５ｍＬの作業液を、９時間以内に３回に分けて投与する。
【0100】
五．実験手順：
１）尾静脈内投与により２０００ｍｇ／ｋｇ用量の被験薬物（合成ペプチドｂｒａｐ）を１匹目の昆明種マウスに投与する。
２）毒性反応が現れるか否か観察して記録する（開始症状、開始時間、すなわち投与後時間、重症度及び持続時間）
３）動物が死亡した場合、死亡直前の反応、死亡時間を記録する。
１）尾静脈内投与により２０００ｍｇ／ｋｇ用量の被験薬物（合成ペプチドｂｒａｐ）を１匹目の昆明種マウスに投与する。
２）毒性反応が現れるか否か観察して記録する（開始症状、開始時間、すなわち投与後時間、重症度及び持続時間）
３）動物が死亡した場合、死亡直前の反応、死亡時間を記録する。
【0101】
【表7】
【0102】
結果判断：生存動物数≧３匹の場合、ＬＤ５０は２０００ｍｇ／ｋｇ以上である。
結論：静脈内投与２０００ｍｇ／ｋｇＢＷ用量の限度実験により毒性が見られない。
結論：静脈内投与２０００ｍｇ／ｋｇＢＷ用量の限度実験により毒性が見られない。
【0103】
（付記）
（付記１）
アミノ酸配列が配列番号１であることを特徴とする合成ペプチドｂｒａｐ。
（付記１）
アミノ酸配列が配列番号１であることを特徴とする合成ペプチドｂｒａｐ。
【0104】
（付記２）
（１）Ｇタンパク質共役のブラジキニンＢ１およびＢ２受容体を抑制する薬の製造のための使用、（２）抗急性肺損傷薬の製造のための使用、（３）新型コロナウイルスによる肺炎用の抗炎症薬の製造のための使用、（４）抗アレルギー性鼻炎薬の製造のための使用のいずれか１つにおける付記１に記載の合成ペプチドｂｒａｐの使用。
（１）Ｇタンパク質共役のブラジキニンＢ１およびＢ２受容体を抑制する薬の製造のための使用、（２）抗急性肺損傷薬の製造のための使用、（３）新型コロナウイルスによる肺炎用の抗炎症薬の製造のための使用、（４）抗アレルギー性鼻炎薬の製造のための使用のいずれか１つにおける付記１に記載の合成ペプチドｂｒａｐの使用。
【0105】
（付記３）
前記使用（１）～（４）のいずれか１つに記載の薬の投与方法は静脈内投与又は鼻腔内投与であることを特徴とする付記２に記載の合成ペプチドｂｒａｐの使用。
前記使用（１）～（４）のいずれか１つに記載の薬の投与方法は静脈内投与又は鼻腔内投与であることを特徴とする付記２に記載の合成ペプチドｂｒａｐの使用。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図14F】
【図14G】
【図15】
【図16】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2021-09-06
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0003】
ＡＣＥ２のレベルの低下により、ＲＡＡＳ系におけるＡＣＥ２とＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）のバランスが不均衡になり、ＡＣＥが相対的に増強するため、ＡｎｇＩＩのレベルが上昇し、肺ＡＴ１ａ受容体が過剰に活性化され、肺の毛細血管の透過性が増加し、それに伴って肺水腫が発生して、肺の炎症反応が重症化する。ＫＫＳ系において、Ｄｅｓ－ＡｒｇブラジキニンはＢ１受容体の作動薬である。ＡＣＥ２はＤｅｓ－Ａｒｇブラジキニン－Ｂ１受容体経路中のＤｅｓ－Ａｒｇブラジキニンを分解して不活性化するペプチドを有する。ＡＣＥ２のレベルの低下によりＤｅｓ－Ａｒｇブラジキニン－Ｂ１受容体経路が活性化される。Ｂ１受容体の活性化は、炎症促進作用がある。
【国際調査報告】