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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-28
(54)【発明の名称】高密度微小突起アレイパッチを用いたワクチン接種
(51)【国際特許分類】
A61M 37/00 20060101AFI20220721BHJP
A61K 39/145 20060101ALI20220721BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220721BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20220721BHJP
【ＦＩ】
A61M37/00
A61K39/145
A61P37/04
A61K9/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021557686
(86)(22)【出願日】2020-03-27
(85)【翻訳文提出日】2021-11-29
(86)【国際出願番号】 AU2020050296
(87)【国際公開番号】W WO2020198785
(87)【国際公開日】2020-10-08
(31)【優先権主張番号】62/919,786
(32)【優先日】2019-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519347915
【氏名又は名称】ヴァクザス ピーティーワイ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】フォースター，アンガス
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C267
【Ｆターム（参考）】
4C076AA06
4C076BB16
4C076CC06
4C076FF68
4C085AA03
4C085BA55
4C085EE01
4C085GG04
4C085GG05
4C267AA72
4C267BB06
4C267BB24
4C267CC01
4C267GG01
(57)【要約】
本発明は、ワクチンの送達のための微小突起アレイ、特に、同等または優れた免疫原性を提供しながらも、送達されるワクチン投与量は、筋肉内注射によって注入されるワクチン投与量より少量であり得る、患者へのワクチンの送達のための、ポリマー高密度微小突起アレイの利用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上にコーティングされたワクチン投与量を、ヒトに投与する工程を含む、ヒトにおける免疫応答を刺激する方法。
【請求項2】
前記ＭＡＰは、基部、および合成ポリマーから作製された前記基部から伸びる多数の連続する無孔突起を備え、ここで、少なくとも１つの突起は、ワクチンで乾燥コーティングされた端部セクションへ移行する未コーティングの支持セクションを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記突起は、長さが約２００～３００μｍ、前記基部における幅が約１００～約１２０μｍであり、かつ前記突起の密度は約１０００～約５０００突起／ｃｍ２であり、かつ前記ＭＡＰの重量は０．１～０．６ｇである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＭＡＰは、合成ポリマーから作製される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記合成ポリマーは液晶ポリマーである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ヒトへ前記組成物を投与することで、前記ヒトの抗原源への曝露に因り生じる感染に対する防御免疫を提供する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ヒトは４９～６４歳である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ヒトは少なくとも６５歳である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記投与量は、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、２．５μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、および３０μｇの投与量から成る群から少なくとも１つ選ばれる投与量である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記投与量は、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ、および１５μｇの投与量から成る群から少なくとも１つ選ばれる投与量である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ワクチン投与量は、１つ以上のインフルエンザ抗原を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素インフルエンザ抗原である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＡ抗原である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＢ抗原である、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＣ抗原である、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記ワクチン投与量を、前記ヒトへ少なくとも１回後続して投与する工程をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされかつヒト集団においてヒトの皮膚に挿入されるワクチン投与量を、前記ヒト集団へ投与する工程を含む、前記ヒト集団における免疫応答を刺激する方法であって、ここで、前記ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、前記ヒト集団における血清変換率が少なくとも８５％である、方法。
【請求項18】
微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされかつヒト集団においてヒトの皮膚に挿入されるワクチン投与量を、前記ヒト集団へ投与する工程を含む、前記ヒト集団における免疫応答を刺激する方法であって、ここで、前記ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、前記ヒト集団における血清変換率が少なくとも９５％である、方法。
【請求項19】
前記ワクチン投与量は、１つ以上のインフルエンザ抗原を含む、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素インフルエンザ抗原である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＡ抗原である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＢ抗原である、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＣ抗原である、請求項２０に記載の方法。
【請求項24】
前記投与量は、２．５～１５μgの赤血球凝集素インフルエンザ抗原を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項25】
微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされかつヒト集団においてヒトの皮膚に挿入されるワクチン投与量を、前記ヒト集団へ投与する工程を含む、前記ヒト集団における免疫応答を刺激する方法であって、ここで、前記ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、前記ヒト集団における幾何平均抗体価（ＧＭＴ）が、同投与量のワクチンの筋肉内注射のＧＭＴと比較して少なくとも６倍大きい、方法。
【請求項26】
前記ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、前記ヒト集団におけるＧＭＴが、同投与量のワクチンの筋肉内注射のＧＭＴと比較して、約６～約１０倍大きい、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上にコーティングされたワクチン投与量を含む、ヒトにおける免疫応答を刺激するための装置。
【請求項28】
前記ＭＡＰは、基部、および合成ポリマーから作製される前記基部から伸びる多数の連続する無孔突起を備え、少なくとも１つの突起は、ワクチンで乾燥コーティングされた端部セクションへ移行する未コーティングの支持セクションを備える、請求項２７に記載の装置。
【請求項29】
前記突起は、長さが約２００～３００μｍ、前記基部における幅が約１００～約１２０μｍであり、かつ前記突起の密度は約１０００～約５０００突起／ｃｍ２であり、かつ前記ＭＡＰの重量は０．１～０．６ｇである、請求項２７または請求項２８に記載の装置。
【請求項30】
前記ＭＡＰは、合成ポリマーから作製される、請求項２９に記載の装置。
【請求項31】
前記合成ポリマーは液晶ポリマーである、請求項３０に記載の装置。
【請求項32】
前記ヒトへ前記組成物を投与することで、前記ヒトの抗原源への曝露に因り生じる感染に対する防御免疫を提供する、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項33】
前記ヒトは４９～６４歳である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項34】
前記ヒトは少なくとも６５歳である、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項35】
前記投与量は、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、２．５μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、および３０μｇの投与量から成る群から少なくとも１つ選ばれる投与量である、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項36】
前記投与量は、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ、および１５μｇの投与量から成る群から少なくとも１つ選ばれる投与量である、請求項３５に記載の装置。
【請求項37】
前記ワクチン投与量は、１つ以上のインフルエンザ抗原を含む、請求項２７～３６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項38】
前記インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素インフルエンザ抗原である、請求項３７に記載の装置。
【請求項39】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＡ抗原である、請求項３８に記載の装置。
【請求項40】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＢ抗原である、請求項３８に記載の装置。
【請求項41】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＣ抗原である、請求項３８に記載の装置。
【請求項42】
ヒト集団においてヒトの皮膚に挿入するよう構成される微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされたワクチン投与量を含む、前記ヒト集団における免疫応答を刺激するための装置であって、前記ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、前記ヒト集団における血清変換率が、少なくとも８５％である、装置。
【請求項43】
ヒト集団においてヒトの皮膚に挿入するよう構成される微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされたワクチン投与量を含む、前記ヒト集団における免疫応答を刺激するための装置であって、前記ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、前記ヒト集団における血清変換率が、少なくとも９５％である、装置。
【請求項44】
前記ワクチン投与量は、１つ以上のインフルエンザ抗原を含む、請求項４２または４３に記載の装置。
【請求項45】
前記インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素インフルエンザ抗原である、請求項４４に記載の装置。
【請求項46】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＡ抗原である、請求項４５に記載の装置。
【請求項47】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＢ抗原である、請求項４５に記載の装置。
【請求項48】
前記インフルエンザ抗原は、インフルエンザＣ抗原である、請求項４５に記載の装置。
【請求項49】
前記投与量は、２．５～１５μgの赤血球凝集素インフルエンザ抗原を含む、請求項４５に記載の装置。
【請求項50】
ヒト集団においてヒトの皮膚に挿入するよう構成される微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされたワクチン投与量を含む、前記ヒト集団において免疫応答を刺激するための装置であって、ここで、前記ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、前記ヒト集団におけるＧＭＴが、同投与量のワクチンの筋肉内注射のＧＭＴと比較して、少なくとも６倍大きい、装置。
【請求項51】
前記ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、前記ヒト集団におけるＧＭＴが、同投与量のワクチンの筋肉内注射のＧＭＴと比較して、約６～約１０倍大きい、請求項２５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔背景技術〕
本発明は、ワクチンの送達のための微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）、特に、同等または優れた免疫原性を提供しながらも、送達されるワクチン投与量が筋肉内注射によって送達されるワクチン投与量より少量（投与量節約型）である、患者へのワクチンの送達のためのポリマー高密度微小突起アレイパッチ（ＨＤ－ＭＡＰ）の利用に関する。
本発明は、ワクチンの送達のための微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）、特に、同等または優れた免疫原性を提供しながらも、送達されるワクチン投与量が筋肉内注射によって送達されるワクチン投与量より少量（投与量節約型）である、患者へのワクチンの送達のためのポリマー高密度微小突起アレイパッチ（ＨＤ－ＭＡＰ）の利用に関する。
【0002】
〔先行技術〕
本明細書中の先行公開（またはそれに由来する情報）、または既知の事項への言及は、先行公開（またはそれに由来する情報）または既知の事項が本明細書の関連する試みの分野における一般常識の一部を形成している、ということの承認、是認または何らかの示唆としてみなされない、かつみなされるべきではない。
本明細書中の先行公開（またはそれに由来する情報）、または既知の事項への言及は、先行公開（またはそれに由来する情報）または既知の事項が本明細書の関連する試みの分野における一般常識の一部を形成している、ということの承認、是認または何らかの示唆としてみなされない、かつみなされるべきではない。
【0003】
多くのワクチン接種は、今なお１８５３年に発明された針および注射器を使用して、筋肉内に注射されている。特に、資源の不足した国において、低減された投与量の、安価で、耐熱性があり、自己投与可能で、かつ無痛のワクチン接種を利用可能にするために、より効率的なワクチンの送達方法が必要とされている。例えばワクチンで乾燥コーティングされたシリコン微小突起皮膚パッチ（Ｆｅｒｎａｎｄｏら ２０１８）のような、ワクチンおよび薬を皮膚に送達するために使われるパッチが開発されている。皮膚は、抗原提示細胞が高濃度に存在するため、ワクチンを送達するのに理想的な部位である（Ｆｅｒｎａｎｄｏ ２０１０）。シリコンパッチを用いて行われた研究では、従来の針および注射器を用いた筋肉内ワクチン接種で得られる免疫応答と類似の免疫応答が、１回の投与量１５μｇで生じることが観察された。
【0004】
様々な微小突起・微小針アレイおよびそれらのアレイを介してワクチンを投与するための方法がある。新規のワクチン送達技術を開発する際の考慮事項の一つが、ワクチン接種に必要な数百万の投与量を、世界的に製造する能力である。費用は考慮事項であり、かつアレイ投与は針および注射器による投与の費用より安価、または同等でなければならない。溶解針マイクロアレイが研究されているが（Ｒｏｕｐｈａｅｌ ２０１７、Ｈｉｒｏｂｅ ２０１５）、これら溶解針パッチは、必要な量で、かつ針および注射器と同等な費用で、無菌条件下での大量生産が可能であるかは疑わしい。溶解微小針の別の欠点は、各臨床ワクチン接種が、皮膚内で溶解するまで、針の設計に依存して、最低限２０分間～６時間かかることである。このような長い滞留時間は多量のワクチン接種を大幅に遅らせるであろう。対照的に、連続する不活化合成ポリマーを用いて作製されたパッチは、安価で大量生産することが可能である。ワクチンは、適用後、２分間以内に皮膚内で急速に溶解するワクチンの薄層を用いて、ポリマー上に乾燥コーティングされる。微小突起アレイ上に直接ワクチンをコーティングするための自動コーティング法が開発され、ワクチンコーティングパッチの大量生産が達成されている。
【0005】
高密度微小突起アレイを用いて皮膚に存在するＡＰＣにワクチンを送達する場合、マウスのような、いくつかの前臨床モデルにおいて、従来の針および注射器を用いた筋肉内注射と比較して、免疫原性の増強および投与量の低減が観察されている。ワクチン乾燥コーティング微小突起アレイ皮膚パッチを用いたヒトにおける投与量の低減は、実証されていない。中空微小針アレイを通して、液体のインフルエンザワクチンを皮膚へ送達することで、筋肉内注射と比較して最大５倍の投与量の低減がヒトにおいて達成され得ることが、研究で示されている（Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ Ｖａｃｃｉｎｅ ２００９ ２７ ｐ４５４）。投与量の低減は、高い需要により抗原供給が制限されるパンデミック下のような状況において、より多くのワクチン投与量を入手可能にするであろう。さらに、必要な抗原投与量を低減することができれば、抗子宮頸癌ワクチンのような高価なワクチンを、資源の乏しい国々にとってより手頃な価格とすることが可能である。
【0006】
ワクチンが安定しており、かつ針および注射器と同じ有効性を有する低減された投与量を投与することが可能な、ワクチン接種の装置および方法が必要とされている。さらに、再形成を回避し、かつ免疫原性の発現を増加させるＧＭＰ条件下で、低コストで大量生産できるワクチン接種のための装置が必要とされている。投与量節約および非常に手頃な費用でのＭＡＰの大量生産の容易性に加え、ＭＡＰはさらなる利点を有する。ワクチン乾燥コーティングＭＡＰは、一般的に、針および注射器を用いた注射に必要な液体ワクチンよりも耐熱性が高い。
【0007】
〔発明の概要〕
一広範な形態では、本発明の態様は、微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上にコーティングされたワクチン投与量をヒトに投与する工程を含む、ヒトにおける免疫応答を刺激する方法の提供に努める。
一広範な形態では、本発明の態様は、微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上にコーティングされたワクチン投与量をヒトに投与する工程を含む、ヒトにおける免疫応答を刺激する方法の提供に努める。
【0008】
一実施形態では、ＭＡＰは、基部、および合成ポリマーから作製された基部から伸びる多数の連続する無孔突起を備え、ここで、少なくとも１つの突起は、ワクチンで乾燥コーティングされた端部セクションへ移行する未コーティングの支持セクションを備える。
【0009】
一実施形態では、突起の長さが約２００～３００μｍ、基部における幅が約１００～約１２０μｍであり、かつ突起の密度は約１０００～約５０００突起／ｃｍ２であり、かつＭＡＰの重量は０．１～０．６ｇである。
【0010】
一実施形態では、ＭＡＰは合成ポリマーから作製される。
【0011】
一実施形態では、合成ポリマーは液晶ポリマーである。
【0012】
一実施形態では、ヒトへ組成物を投与することで、ヒトの抗原源への曝露に因り生じる感染に対する防御免疫を提供する。
【0013】
一実施形態では、ヒトは４９～６４歳である。
【0014】
一実施形態では、ヒトは少なくとも６５歳である。
【0015】
一実施形態では、投与量は、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、２．５μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、および３０μｇの投与量から成る群から少なくとも１つ選ばれる投与量である。
【0016】
一実施形態では、投与量は、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ、および１５μｇの投与量から成る群から少なくとも１つ選ばれる投与量である。
【0017】
一実施形態では、ワクチン投与量は、１つ以上のインフルエンザ抗原を含む。
【0018】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素インフルエンザ抗原である。
【0019】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＡ抗原である。
【0020】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＢ抗原である。
【0021】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＣ抗原である。
【0022】
一実施形態では、ワクチン投与量を、ヒトへ少なくとも１回後続して投与する工程をさらに含む。
【0023】
一広範な形態では、本発明の態様は、微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされかつヒト集団においてヒトの皮膚に挿入されるワクチン投与量を、ヒト集団へ投与する工程を含む、ヒト集団における免疫応答を刺激する方法を提供するよう努めるのであって、
ここで、ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団における血清変換率が、少なくとも８５％である。
ここで、ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団における血清変換率が、少なくとも８５％である。
【0024】
一広範な形態では、本発明の態様は、微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされかつヒト集団においてヒトの皮膚に挿入されるワクチン投与量を、ヒト集団へ投与する工程を含む、ヒト集団における免疫応答を刺激する方法を提供するよう努めるのであって、
ここで、ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団における血清変換率が少なくとも９５％である。
ここで、ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団における血清変換率が少なくとも９５％である。
【0025】
一実施形態では、ワクチン投与量は、１つ以上のインフルエンザ抗原を含む。
【0026】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素インフルエンザ抗原である。
【0027】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＡ抗原である。
【0028】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＢ抗原である。
【0029】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＣ抗原である。
【0030】
一実施形態では、投与量は２．５～１５μgの赤血球凝集素インフルエンザ抗原を含む。
【0031】
一広範な形態では、本発明の態様は、微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされかつヒト集団においてヒトの皮膚に挿入されるワクチン投与量を、ヒト集団へ投与する工程を含む、ヒト集団における免疫応答を刺激する方法を提供するよう努めるのであって、
ここで、ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団における幾何平均抗体価（ＧＭＴ）が、同投与量のワクチンの筋肉内注射のＧＭＴと比較して少なくとも６倍大きい。
ここで、ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団における幾何平均抗体価（ＧＭＴ）が、同投与量のワクチンの筋肉内注射のＧＭＴと比較して少なくとも６倍大きい。
【0032】
一実施形態では、ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団におけるＧＭＴが、同投与量のワクチンの筋肉内注射のＧＭＴと比較して、約６～約１０倍大きい。
【0033】
一広範な形態では、本発明の態様は、微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上にコーティングされたワクチン投与量を含む、ヒトにおける免疫応答を刺激するための装置を提供するよう努める。
【0034】
一実施形態では、ＭＡＰは、基部、および合成ポリマーから作製される基部から伸びる多数の連続する無孔突起を備え、少なくとも１つの突起は、ワクチンで乾燥コーティングされた端部セクションへ移行する未コーティングの支持セクションを備える。
【0035】
一実施形態では、突起は、長さが約２００～３００μｍ、基部における幅が約１００～約１２０μｍであり、かつ突起の密度は約１０００～約５０００突起／ｃｍ２であり、かつＭＡＰの重量は０．１～０．６ｇである。
【0036】
一実施形態では、ＭＡＰは、合成ポリマーから作製される。
【0037】
一実施形態では、合成ポリマーは液晶ポリマーである。
【0038】
一実施形態では、ヒトへ組成物を投与することで、ヒトの抗原源への曝露に因り生じる感染に対する防御免疫を提供する。
【0039】
一実施形態では、ヒトは４９～６４歳である。
【0040】
一実施形態では、ヒトは少なくとも６５歳である。
【0041】
一実施形態では、投与量は、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、２．５μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、および３０μｇの投与量から成る群から少なくとも１つ選ばれる投与量である。
【0042】
一実施形態では、投与量は、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ、および１５μｇの投与量から成る群から少なくとも１つ選ばれる投与量である。
【0043】
一実施形態では、ワクチン投与量は、１つ以上のインフルエンザ抗原を含む。
【0044】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素インフルエンザ抗原である。
【0045】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＡ抗原である。
【0046】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＢ抗原である。
【0047】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＣ抗原である。
【0048】
一広範な形態では、本発明の態様は、ヒト集団においてヒトの皮膚に挿入するよう構成される微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされたワクチン投与量を含む、ヒト集団における免疫応答を刺激するための装置を提供するよう努めるのであって、
ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団における血清変換率が、少なくとも８５％である。
ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団における血清変換率が、少なくとも８５％である。
【0049】
一広範な形態では、本発明の態様は、ヒト集団においてヒトの皮膚に挿入するよう構成される微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされたワクチン投与量を含む、ヒト集団における免疫応答を刺激するための装置を提供するよう努めるのであって、
ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団における血清変換率が、少なくとも９５％である。
ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団における血清変換率が、少なくとも９５％である。
【0050】
一実施形態では、ワクチン投与量は、１つ以上のインフルエンザ抗原を含む。
【0051】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素インフルエンザ抗原である。
【0052】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＡ抗原である。
【0053】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＢ抗原である。
【0054】
一実施形態では、インフルエンザ抗原は、インフルエンザＣ抗原である。
【0055】
一実施形態では、投与量は、２．５～１５μgの赤血球凝集素インフルエンザ抗原を含む。
【0056】
一広範な形態では、本発明の態様は、ヒト集団においてヒトの皮膚に挿入するよう構成される微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）上に乾燥コーティングされたワクチン投与量を含む、ヒト集団における免疫応答を刺激するための装置を提供するよう努めるのであって、
ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団におけるＧＭＴが、同投与量のワクチンの筋肉内注射のＧＭＴと比較して、少なくとも６倍大きい、装置。
ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団におけるＧＭＴが、同投与量のワクチンの筋肉内注射のＧＭＴと比較して、少なくとも６倍大きい、装置。
【0057】
一実施形態では、ワクチンの投与から少なくとも８日後に測定される、ヒト集団におけるＧＭＴが、同投与量のワクチンの筋肉内注射のＧＭＴと比較して、約６～約１０倍大きい。
【0058】
本発明の広範な形態および各特徴は、同時および／または独立して使用でき、別個の広範な形態への言及は、制限することを意図していないことが理解されるだろう。さらに、方法の特徴は、システムまたは装置を用いて実行可能であり、かつシステムまたは装置の特徴は、方法を用いて実行可能であることが理解されるだろう。
【0059】
〔図面の簡単な説明〕
本発明の様々な実施例および実施形態について、以下、添付の図面を参照して説明する。
本発明の様々な実施例および実施形態について、以下、添付の図面を参照して説明する。
【0060】
図１Ａは、ポリマー微小突起アレイパッチの写真である。
【0061】
図１Ｂは、インクジェットコーティング法を用いてワクチンでコーティングされたポリマーアレイの微小突起の写真である。
【0062】
図１Ｃは、微小突起アレイアプリケーターの写真である。
【0063】
図１Ｄは、アプリケーターを用いた前腕への微小突起アレイの適用の写真である。
【0064】
図２は、ワクチンでコーティングされた微小突起アレイの走査型電子顕微鏡写真である。
【0065】
図３Ａおよび３Ｂは、本実施例に記載される研究ＡおよびＢのための設計のフローチャートである。
【0066】
図４Ａは、５μｇ投与量ワクチンについての、時間に対する赤血球凝集素のμｇのプロットである。
【0067】
図４Ｂは、１５μｇ投与量ワクチンについての、時間に対する赤血球凝集素のμｇのプロットである。
【0068】
図５は、いくつかのワクチン製剤に対する赤血球凝集素阻害力価のプロットである。ここで、記号ＮＰは、微小突起アレイ皮内投与であり、かつＩＭは、筋肉内注射である、
図６は、研究Ａにおけるいくつかのワクチン製剤についての、１日目対２２日目の赤血球凝集素阻害力価のプロットである。ここで、記号ＮＰは、微小突起アレイ皮内投与であり、かつＩＭは、筋肉内注射である、
図７は、研究Ａでの時間に対する赤血球凝集素阻害力価のプロットである。
図６は、研究Ａにおけるいくつかのワクチン製剤についての、１日目対２２日目の赤血球凝集素阻害力価のプロットである。ここで、記号ＮＰは、微小突起アレイ皮内投与であり、かつＩＭは、筋肉内注射である、
図７は、研究Ａでの時間に対する赤血球凝集素阻害力価のプロットである。
【0069】
図８は、研究Ａでの２２日目のマイクロ中和力価（microneutralization titer）のプロットである。
【0070】
図９は、研究１日目（ワクチン接種前）、４、８、２２および６１日目におけるパートＢおける被験者の赤血球凝集阻止（ＨＡＩ）力価のプロットである。パートＢおける被験者は、以下を用いてワクチン接種された：手掌側前腕（volar forearm）に適用されたＨＤ－ＭＡＰにより送達される、１５、１０、５、または２．５μｇＨＡ／投与量のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１（ＭＡＰ－ＦＡ－１５、ＭＡＰ－ＦＡ－１０、ＭＡＰ－ＦＡ－５、ＭＡＰ－ＦＡ－２．５）；未コーティングのＨＤ－ＭＡＰ（ＭＡＰ－ＦＡ－０）；上腕（upper arm）に適用されたＨＤ－ＭＡＰにより送達される１５μｇＨＡ／投与量のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１（ＭＡＰ－ＵＡ－１５）；またはＡｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価ワクチンの構成要素としての筋肉内注射（ＩＭ－ＱＩＶ－１５）。記号は幾何平均抗体価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは９５％信頼区間を示す。
【0071】
図１０は、以下を用いたワクチン接種後、１日目（ワクチン接種前）および２２日目におけるパートＢおける被験者のマイクロ中和力価のプロットである：手掌側前腕に適用されたＨＤ－ＭＡＰにより送達される、１５、１０、５、または２．５μｇＨＡ／投与量のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１（ＭＡＰ－ＦＡ－１５、ＭＡＰ－ＦＡ－１０、ＭＡＰ－ＦＡ－５、ＭＡＰ－ＦＡ－２．５）；未コーティングのＨＤ－ＭＡＰ（ＭＡＰ－ＦＡ－０）；上腕に適用されたＨＤ－ＭＡＰにより送達される１５μｇＨＡ／投与量のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１（ＭＡＰ－ＵＡ－１５）；またはＡｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価ワクチンの構成要素としての筋肉内注射（ＩＭ－ＱＩＶ－１５）。棒グラフはＧＭＴを表し、記号は各被験者の力価を表し、エラーバーは９５％信頼区間を示す。
【0072】
図１１Ａは、中点ＥＬＩＳＡ力価のプロットであり、図１１Ｂは、ＨＡ特異的ＦｃＲ結合抗体についての１日目に対する２２日目の中点力価の倍数変化のプロットである。二量体の可溶性組換えＦｃγＲＩＩＩに関与するＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５一価精製収穫物に対して特異的な抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した。記号は１日目前および２２日目後の免疫化の個々の応答を表し、水平線は中間反応（media response）を示す（Ａ）；エラーバーを有する棒グラフは四分位数間領域を伴う中央値を表す（Ｂ）。
【0073】
図１２は、唾液試料中のインフルエンザ特異的ＩｇＡ力価のプロットである。被験者は、以下のいずれかを用いてワクチン接種された：ＨＤ－ＭＡＰにより手掌側前腕（ＭＡＰ‐ＦＡ‐１５）または上腕（ＭＡＰ‐ＵＡ‐１５）へ送達される１５μｇのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１、またはＡｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価ワクチン（ＩＭ－ＱＩＶ－１５）の構成要素としての筋肉内注射または未コーティングのＨＤ－ＭＡＰ（ＭＡＰ－ＦＡ－０）。ワクチン接種前（１日目）、４日目、８日目および２２日目の４つの時点で測定した。各時点についての群ごとの吸光度を平均し、１日目と比較した。そして、ワクチン接種前（１日目）と比較した倍数変化をプロット表示した。記号は群ごとの全被験者の平均を表し、エラーバーは９５％信頼区間を示す。
【0074】
図１３Ａ～１３Ｆは、ワクチン接種前後の記憶細胞（ＭＢＣ）の頻度のプロットである。ＨＡ特異的ＭＢＣの頻度を、フローサイトメトリーによって、低温保存したＰＭＢＣ試料中で評価した。生きたＣＤ１９＋、ＩｇＤ－Ｂ細胞について試料をゲートし、特異性を、単独での、またはＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９もしくは安定化Ｈ１Ｎ１ステムプローブと組み合わせての、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５プローブへの結合に基づいて決定した。図１３Ａおよび１３Ｂは、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５ Ｈ１Ｎ１である；図１３Ｃおよび１３Ｄは、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９である；図１３Ｅおよび１３ＦはＨ１ステムである。結果は、図１３Ａ、１３Ｃおよび１３Ｅ中、１日目および２２日目のプローブ結合細胞の頻度として表され、記号は１日目前および２２日目後の免疫化の個々の応答を表し、水平線は中間反応を示す。一方、基準値と比較した２２日目の倍数変化が図１３Ｂ、１３Ｄおよび１３Ｆに示され、棒グラフは倍数変化の中央値を表し、エラーバーは四分位数間領域を伴う中央値を表す。
【0075】
〔好ましい実施形態の詳細な説明〕
広範な一形態では、本発明の態様はワクチンの送達のための微小突起アレイ、特に、同等または優れた免疫原性を提供しながらも、送達されるワクチン投与量が筋肉内注射によって送達されるワクチン投与量より少ない（投与量節約型）である、患者へのワクチンの送達のためのポリマー高密度微小突起アレイの使用に関する。本発明の装置および方法はまた、ワクチンの耐熱性、使用の容易さ、受容性およびワクチンの再形成の回避を提供する。
広範な一形態では、本発明の態様はワクチンの送達のための微小突起アレイ、特に、同等または優れた免疫原性を提供しながらも、送達されるワクチン投与量が筋肉内注射によって送達されるワクチン投与量より少ない（投与量節約型）である、患者へのワクチンの送達のためのポリマー高密度微小突起アレイの使用に関する。本発明の装置および方法はまた、ワクチンの耐熱性、使用の容易さ、受容性およびワクチンの再形成の回避を提供する。
【0076】
インフルエンザは、６５歳以上の成人において、重大な罹患率および死亡率を引き起こす。該年齢群におけるワクチン接種率、免疫原性および実効性を改善するための戦略が必要とされている。現在、この集団群のＩＩＶは、十分な免疫応答を獲得するために、ＭＦ５９などの化学的アジュバントまたは多くの投与量の抗原（例えば、１投与量あたり、１株あたり６０μｇのＨＡ）を必要とする。ＭＡＰ送達でみられる免疫原性の増強は、ＨＤ－ＭＡＰがワクチン投与量の増加に対する代替アプローチを提供することを示している。
【0077】
さらに、標準的な製剤と比較して例外的な、ＭＡＰ上のワクチンの耐熱性は、コールドチェーンへの依存を排除し、コールドチェーンからの逸脱を原因とするワクチンの浪費を低減させる。また、より安定したワクチンは、ワクチンの貯蔵期間に失われる効力を補うために、パッチを過剰に使用する必要性を排除する。本発明の装置および方法の使用は、投与量あたりに必要とされる抗原の量が低減されるので、ワンシーズンまたはパンデミック下において、基本的なワクチン製造施設から生産され得るワクチン投与量の数を増大させ得る。季節性インフルエンザ製品の世界的な受容能力は、ＴＩＶ製剤からＱＩＶ製剤への切り替えにより、２０１３年から２０１５年の間に低下し、パンデミックワクチン製品は、投与量節約型戦略の実行に依存している。不活化ポリオウイルスワクチンまたは黄熱ワクチンのように、長期供給の制約や費用によって使用が制限される世界的に健康上重要な多くのワクチンにとって、投与量節約および防御免疫の迅速な開始がまた、貴重な特性となるであろう。これらワクチンは、耐熱性、使用の容易さ、受容性、および再形成の回避などの本発明の他の重要な特性もまた有益であろう低資源環境において、多くの場合必要とされる。
【0078】
本発明の装置および方法は、微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）を含む。パッチは、幅Ｗおよび短径Ｂを有し、突起は間隔によって分離される。突起は正方形または長方形の配列に沿った微小突起の規則的な反復によって画定されるアレイ中に提供され得る。しかし、回転噴霧コーティングに適合する、突起の円形配列のような突起の別の配列もまた使用され得る。ターゲティング精度のさらなる改善または向上のために、基板は、コーティングされる特徴が回転の中心点から放射線上に配置されるか、同心円上または連続螺旋上に配置されるように設計され得る。基板は、各円弧において間隔を有する特徴が所与の半径に対してモーターの工程数（整数）に一致するように設計され得る。各突起は、生物被験者の組織を貫通するための先端を備え、突起は、典型的には、基部から先端まで先細りとなる外形を有する（図１Ａ～１Ｄ）。
【0079】
微小突起アレイは、異なるワクチン抗原または賦形剤のような他の物質が各領域でコーティングされ得るような領域に分割され得る。例えば、微小突起アレイは、異なるワクチン抗原または賦形剤のような他の物質が適用され得る場合、半分または４つの均等区間に分割され得る。これらの領域は、均等な数の微小突起または不均等な数の微小突起を有し得る。別の実施形態では、いくつかの微小突起は未コーティングであり得る。
【0080】
微小突起アレイの突起密度は、１，０００～７５００／ｃｍ２、または１５００～７５００／ｃｍ２、１５００～５０００／ｃｍ２、１５００～２５００／ｃｍ２、２０００～７５００／ｃｍ２、２０００～５０００／ｃｍ２、２０００～４０００／ｃｍ２、２０００～３０００／ｃｍ２、２５００～７５００／ｃｍ２、２５００～５０００／ｃｍ２、２５００～４０００／ｃｍ２、２５００～３０００／ｃｍ２もしくは３０００～７５００／ｃｍ２、または３０００～５０００／ｃｍ２、３０００～４０００／ｃｍ２、４０００～７５００／ｃｍ２、４０００～５０００／ｃｍ２もしくは５０００～７５００／ｃｍ２であり得る。本発明のアプリケーターは、高密度微小突起アレイを皮膚に突出させるためにしばしば利用される。このような高密度アレイは、手動で適用され得る力では皮膚の弾性に打ち勝つのに不十分となるに足るサイズおよび密度の微小突起アレイである。突起は、典型的には１０μｍ～２００μｍ、３０μｍ～１５０μｍ、５０μｍ～１２０μｍ、より典型的には７０μｍ～１００μｍで分離され、これによりパッチは、１０～１０００突起／ｍｍ２、より典型的には１０００～３０００突起／ｍｍ２を有する。
【0081】
突起の長さは、１００μｍ～７００μｍ、１００μｍ～６００μｍ、１００μｍ～５００μｍ、１００μｍ～４００μｍ、１００μｍ～３００μｍ、１００μｍ～２５０μｍ、１００μｍ～２００μｍ、１５０μｍ～７００μｍ、１５０μｍ～６００μｍ、１５０μｍ～５００μｍ、１５０μｍ～４００μｍ、１５０μｍ～３００μｍ、１５０μｍ～２５０μｍ、１５０μｍ～２００μｍ、２００μｍ～７００μｍ、２００μｍ～６００μｍ、２００μｍ～５００μｍ、２００μｍ～４００μｍ、２００μｍ～３００μｍ、２００μｍ～２５０μｍ、２２５μｍ～７００μｍ、２２５μｍ～６００μｍ、２２５μｍ～５００μｍ、２２５μｍ～４００μｍ、２２５μｍ～３００μｍ、２２５μｍ～２５０μｍ、２５０μｍ～７００μｍ、２５０μｍ～６００μｍ、２５０μｍ～５００μｍ、２５０μｍ～４００μｍまたは２５０μｍ～３００μｍであり得る。
【0082】
突起は、１つ以上のステップショルダー（step shoulder）（不連続部）を有し得る。不連続部を備える場合、これは、典型的には、少なくとも１つの不連続部が真皮に達し、突起の貫通が停止し、先端が真皮層内に延在するように配置される。不連続部は、典型的には、先端の端部から５０～２００μｍ、５０～１９０μｍ、５０～１８０μｍ、５０～１７０μｍ、５０～１６０μｍ、５０～１５０μｍ、５０～１４０μｍ、５０～１３０μｍ、５０～１２０μｍ、５０～１１０μｍ、５０～１００μｍ、５０～９０μｍ、５０～８０μｍ、６０～２００μｍ、６０～１９０μｍ、６０～１８０μｍ、６０～１７０μｍ、６０～１６０μｍ、６０～１５０μｍ、６０～１４０μｍ、６０～１３０μｍ、６０～１２０μｍ、６０～１１０μｍ、６０～１００μｍ、６０～９０μｍ、６０～８０μｍ、７０～２００μｍ、７０～１９０μｍ、７０～１８０μｍ、７０～１７０μｍ、７０～１６０μｍ、７０～１５０μｍ、７０～１４０μｍ、７０～１３０μｍ、７０～１２０μｍ、７０～１１０μｍ、７０～１００μｍ、７０～９０μｍ、７０～８０μｍ、８０～２００μｍ、８０～１９０μｍ、８０～１８０μｍ、８０～１７０μｍ、８０～１６０μｍ、８０～１５０μｍ、８０～１４０μｍ、８０～１３０μｍ、８０～１２０μｍ、８０～１１０μｍ、８０～１００μｍ、８０～９０μｍ、９０～２００μｍ、９０～１９０μｍ、９０～１８０μｍ、９０～１７０μｍ、９０～１６０μｍ、９０～１５０μｍ、９０～１４０μｍ、９０～１３０μｍ、９０～１２０μｍ、９０～１１０μｍ、９０～１００μｍ、１００～２００μｍ、１００～１９０μｍ、１００～１８０μｍ、１００～１７０μｍ、１００～１６０μｍ、１００～１５０μｍ、１００～１４０μｍ、１００～１３０μｍ、１００～１２０μｍ、１００～１１０μｍに配置される。不連続部は、微小突起上の薬物／ワクチン／賦形剤のより大きなローディングを提供し得る。
【0083】
微小突起アレイは、特に限定されないが金属、シリコン、ポリマー、およびプラスチックを含む任意の適切な材料から作製され得る。ポリマーおよびプラスチックは、好ましい材料である。好ましい材料は、液晶ポリマーを含むがこれに限定されない。微小突起アレイのいくつかの実施形態での全体質量は、約０．３ｇｍである。微小突起アレイは、皮膚との機械的な連結を改善し、高速リップリング適用、すなわち「高速／低質量」システムの効果を緩和するために、全体的に弱い凸状のパッチを有し得る。微小突起アレイの質量は、１ｇ未満、または０．９ｇ未満、０．８ｇ未満もしくは０．７ｇ未満、または０．６ｇ未満、０．５ｇ未満もしくは０．６ｇ未満、または０．５ｇ未満、０．４ｇ未満、０．３ｇ未満、０．２ｇ未満、０．１ｇ未満もしくは０．０５ｇ未満であり得る。微小突起アレイは、約０．０５ｇ～約２ｇ、または約０．０５ｇ～約１．５ｇ、約０．０５ｇ～約１．０ｇもしくは約０．０５ｇ～約０．９ｇ、または約０．０５ｇ～約０．８ｇもしくは約０．０５ｇ～約０．７ｇ、または約０．０５～約０．６ｇ、約０．０５ｇ～約０．５ｇもしくは約０．０５ｇ～約０．４ｇ、または約０．０５～約０．３ｇもしくは約０．０５ｇ～約０．２ｇ、または約０．０５ｇ～約０．１ｇ、約０．１ｇ～約１．０ｇもしくは約０．１ｇ～約０．９ｇ、または約０．１ｇ～約０．８ｇもしくは約０．１ｇ～約０．７ｇ、または約０．１ｇ～約０．６ｇ、約０．１ｇ～約０．５ｇもしくは約０．１ｇ～約０．４ｇ、または約０．１ｇ～約０．３ｇもしくは約０．１ｇ～約０．２ｇであり得る。アプリケーター／微小突起システムの一実施形態では、アレイの質量は約０．３ｇであり、アレイは、アプリケーターによって約２０～２６ｍ／秒の速度で発射される。
【0084】
いくつかの実施形態では、１つ以上のコーティングが同じ突起に適用され得る。例えば、異なるコーティングが、１つ以上の層に適用され得、同時に、もしくは前記層が順に溶解する場合は異なる時間に、被験者内の組織へ送達するための、同じ、もしくは異なる材料が提供される。
【0085】
本発明の装置および方法において使用される抗原の量は、免疫応答を提供するのに必要な量を含む。投与量は、０．１μｇ、０．５μｇ、１μｇ、２μｇ、２．５μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、および３０μｇ投与量であり得る。投与量は、約１μｇ～約１００μｇ、約１μｇ～約７５μｇ、約１μｇ～約５０μｇ、約１μｇ～約２５μｇ、約１μｇ～約１５μｇ、約１μｇ～約１０μｇ、約１μｇ～約５μｇ、約２．５μｇ～約１００μｇ、約２．５μｇ～約７５μｇ、約２．５μｇ～約５０μｇ、約２．５μｇ～約２５μｇ、約２.μｇ～約１５μｇ、約２．５μｇ～約１０μｇ、約２．５μｇ～約５μｇ、約５μｇ～約１００μｇ、約５μｇ～約７５μｇ、約５μｇ～約５０μｇ、約５μｇ～約２５μｇ、約５μｇ～約１５μｇ、約５μｇ～約１０μｇ、約１０μｇ～約１００μｇ、約１０μｇ～約７５μｇ、約１０μｇ～約５０μｇ、約１０μｇ～約２５μｇ、約１０μｇ～約１５μｇ、約１５μｇ～約１００μｇ、約１５μｇ～約７５μｇ、約１５μｇ～約５０μｇ、約１５μｇ～約２５μｇ、約２０μｇ～約１００μｇ、約２０μｇ～７５μｇ、約２０μｇ～約５０μｇ、約２０μｇ～約２５μｇの範囲で変動し得る。各投与量は複数の抗原または複数の物質を含み得る。
【0086】
好ましい実施形態において、微小突起アレイの微小突起は、微小突起上で急速に乾燥する小さな液滴を迅速に提供する無菌プリントヘッド型装置によってコーティングされる。好ましい実施形態において、ワクチン製剤のようなコーティングは、微小突起の上部で急速に乾燥し、送達可能なワクチンの量（図２）を増加させる。無菌プリントヘッド装置は、連続的に、または代替的方法のいずれかで、複数の液滴を微小突起に送達し得る。
【0087】
本発明の装置および方法は、より少ない投与量のワクチンを使用する場合、従来の針および注射器を使用した筋肉内注射と比較して、皮膚へのＭＡＰワクチン送達を用いて、同等または優れた抗体力価を提供する。したがって、本発明の装置および方法は、従来の針および注射器を使用した筋肉内注射と比較して、皮膚へのＭＡＰワクチン送達を用いて、投与量を複数倍低減する。本発明の装置および方法は、筋肉内注射と比較して、ワクチン量を、１．１倍～１００倍、１．１倍～５０倍、１．１倍～２５倍、１．１倍～２０倍、１．１～１５倍、１．１～１０倍、１．１～５倍、１．５倍～１００倍、１．５倍～５０倍、１．５倍～２５倍、１．５倍～２０倍、１．５～１５倍、１．５～１０倍、１．５～５倍、２倍～１００倍、２倍～５０倍、２倍～２５倍、２倍～２０倍、２～１５倍、２～１０倍、２倍～５倍、３倍～１００倍、３倍～５０倍、３倍～２５倍、３倍～２０倍、３～１５倍、３～１０倍、３～５倍、４倍～１００倍、４倍～５０倍、４倍～２５倍、４倍～２０倍、４～１５倍、４～１０倍、４～５倍、５倍～１００倍、５倍～５０倍、５倍～２５倍、５倍～２０倍、５～１５倍、または５倍～１０倍低減する。
【0088】
針および注射器に対するＭＡＰワクチン送達の他の利点は、ワクチンがＭＡＰ上に乾燥コーティングされているため、ワクチンがさらなる耐熱性を有し、また危険な廃棄物を残さないことである。インフルエンザワクチンは、ＨＤ－ＭＡＰ上に最高４０℃で乾燥コーティングで保存された場合、少なくとも１２ヶ月間安定した。これは、コールドチェーンを維持することが困難な資源の乏しい国において特に有用である。別の利点は、ＭＡＰ微小突起が肉眼では見えず、したがって針を恐れている人および子供にワクチン接種をする場合に、極めて貴重であるということである。ＨＤ‐ＭＡＰにおけるより高密度な微小突起は、ワクチン接種中の皮膚においてより高度な危険シグナルを誘導し、身体的アジュバンテーション（adjuvantation）を導き免疫原性を増強し得る。
【0089】
本発明の装置および方法は、同時点に測定される従来の針および注射器での筋肉内注射と比較して、皮膚へのＭＡＰワクチン送達を使用して、より高値の幾何平均抗体価（ＧＭＴｓ）を提供する。本発明の装置および方法は、筋肉内注射と比較して、ＧＭＴを２倍～５００倍、２倍～１００倍、２倍～５０倍、２倍～２５倍、２倍～２０倍、２～１５倍、２～１０倍、２～５倍、５倍～５００倍、５倍～１００倍、５倍～５０倍、５倍～２５倍、５倍～２０倍、５～１５倍、５～１０倍、１０倍～５００倍、１０倍～１００倍、１０倍～５０倍、１０倍～２５倍、１０倍～２０倍、１０～１５倍、２０倍～５００倍、２０倍～１００倍、２０倍～５０倍、２０倍～２５倍、５０～５００倍、または５０倍～１００倍増加させる。
【0090】
ワクチン接種後の抗体の検出は、従来の針および注射器を使用した筋肉内注射と比較して、皮膚へのＭＡＰワクチン送達を利用する場合により急速に生じる。
【0091】
本発明の装置および方法は、感染性因子（例えばインフルエンザ）に対して比較的低投与量の抗原を用いる集団において、防御免疫応答を提供する。
【0092】
血清反応性とは、ＨＡＩ抗体力価が少なくとも４倍に増加し、ワクチン接種後の最低力価が４０であることを意味する。血清保護とは、ワクチン接種前の抗体価が４０未満の被験者のうち、ワクチン接種後の最低ＨＡＩ力価が４０に達することを意味する。抗ＨＡ抗体反応の血清変換率は、保護ワクチン接種後の力価が１：４０以上である各群中の被験者の割合と定義される。血清保護率は、ＨＡＩ力価が、ワクチン接種前に１：１０未満、かつワクチン接種後に１：４０以上である被験者の百分率である。しかしながら、最初の力価が１：１０以上であれば、ワクチン接種後の抗体量が、少なくとも４倍増加している必要がある。
【0093】
本発明の別の態様において、本発明の組成物の投与により生じる免疫応答は、方法に依存する投与量をもって大多数の高齢レシピエントの機能的（ＨＡＩ）抗体を誘導する、本明細書中に請求される組成物、方法、または使用が提供される。特定の実施形態では、組成物は、７日後、１４日後、または２８日後に、力価が約５０を超える中和抗体反応を誘導する。他の実施形態では、組成物は、７日後、１４日後、または２８日後に、力価が約１００を超える中和抗体反応を誘導する。他の実施形態では、組成物は、７日後、１４日後、または２８日後に、力価が約１５０を超える中和抗体反応を誘導する。別の実施形態では、組成物は、７日後、１４日後、または２８日後に、約２００を超える中和抗体反応を誘導する。
【0094】
従って、本発明の一態様において、集団における組成物の投与により生じる免疫応答が、以下の基準の１つを満たす、または超える、本明細書中に請求される組成物、方法、または使用が提供される。
【0095】
－５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９９％を超える血清変換率。
【0096】
－５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９９％を超える血清保護率。
【0097】
－ワクチン接種後の中和抗体価において、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれ以上の増加平均。
【0098】
ヒトに投与されるワクチン組成物の量に言及する場合の「有効量」とは、被験者へ投与される場合に治療有効性に十分な量である、組成物の量または投与量を指す（例えば、被験者における免疫応答を刺激するのに十分な量、被験者における防御免疫を提供するのに十分な量）。
【0099】
ワクチン組成物は、単独で、またはワクチン組成物に対して有害に反応しない従来の賦形剤（例えば、薬学的または生理学的に許容可能な有機または無機の担体物質）との混合物として投与され得る。ワクチン組成物中で、ワクチン組成物を安定化する物質が使用され得る。従来のワクチンは免疫応答を増強するためのアジュバントを含み得る一方で、本発明の製剤は、好ましくはアジュバントなしで使用される。
【0100】
被験者に投与される投与量および頻度（単回または複数回投与量）は、例えば、抗原への曝露の結果として生じる感染への曝露以前に、例えば、被験者の健康、体重、体格指数および食事、または健康関連問題を含む種々の因子に依存して変化し得る。他の治療計画または薬剤が、本発明の方法および組成物、蛋白質またはポリペプチドと共に使用され得る。
【0101】
組成物は、単回投与量または複数回投与量（例えば、少なくとも２回投与量）でヒトに投与され得る。被験者に複数回投与量が投与される場合、２回目または３回目の投与量は初回投与の数日（例えば、１、２、３、４、５、６、７）、数週（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）、数月（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）または数年（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）後に投与され得る。例えば、組成物の２回目の投与量は、融合タンパク質を含む組成物の１回目の投与量の投与後、約７日、約１４日または約２８日目に投与され得る。
【0102】
本明細書中では、範囲はおよそ１つの特定の値から、および／またはおよそ別の特定の値まで、として表され得る。そのような範囲が表される場合、別の態様は１つの特定の値から、および／または他の特定の値まで、を含む。同様に、先行詞「約」を使用することによって値が概数として示される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されるであろう。さらに、各範囲の終点は、他方の終点と関連して重要でもあり、および他方の終点とは独立して重要でもあることが理解されるであろう。
【0103】
〔実施例〕
［実施例１］
＝被験者および研究デザイン＝
少なくとも３０％が男性であり、少なくとも３０％が女性である、計２１０人の健康な被験者（年齢１８～５０歳、ＢＭＩ１８～３０ｋｇ／ｍ２）が、研究のために採用された。パートＡ：健康な被験者６０人（１５人の群４つ）；パートＢ：健康な被験者１５０人（２０人の群７つに加え、皮膚パンチ生検を実施された５人の群２つ）。研究デザインを図３Ａおよび３Ｂに示す。これらの群に加えて、さらに１０人の被験者を採用し、本研究のパートＢにおいてワクチン接種部位の生検を実施した。
［実施例１］
＝被験者および研究デザイン＝
少なくとも３０％が男性であり、少なくとも３０％が女性である、計２１０人の健康な被験者（年齢１８～５０歳、ＢＭＩ１８～３０ｋｇ／ｍ２）が、研究のために採用された。パートＡ：健康な被験者６０人（１５人の群４つ）；パートＢ：健康な被験者１５０人（２０人の群７つに加え、皮膚パンチ生検を実施された５人の群２つ）。研究デザインを図３Ａおよび３Ｂに示す。これらの群に加えて、さらに１０人の被験者を採用し、本研究のパートＢにおいてワクチン接種部位の生検を実施した。
【0104】
以下に記載する実施例は２部構成で行われた。本研究は、Nucleus Network Pty Ltd（Melbourne、VIC）で実施された、２部構成の、無作為化された、部分的二重盲検式の、プラセボ対照試験であった。主な目的は、ＨＤ―ＭＡＰによって送達されるＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｓｉｎｇ）一価ワクチンの安全性および耐用性を、未コーティングＨＤ－ＭＡＰおよびＡ／Ｓｉｎｇ ＨＡタンパク質とおおよそ同じ投与量を送達する四価季節性インフルエンザワクチン（ＱＩＶ）の筋肉内注射と比較して、測定することであった。探索的転帰は、標準的な１株あたり１５μｇのＨＡ／投与量でＡ／Ｓｉｎｇを筋肉内注射した場合と比較して、４つの投与量レベルのＡ／Ｓｉｎｇを用いた前腕へのＨＤ－ＭＡＰの適用に対する免疫応答を評価することであり、かつ追加試験およびＨＤ－ＭＡＰ適用部位のパンチ生検を介した局所的皮膚反応の検定および評価を通して免疫応答のさらなる尺度を評価することである。
【0105】
いずれの実験においても、被験者は１回ワクチン接種され、分析のために、接種前（１日目）および接種後（４、８、２２、および６１日目））に彼らの血液を採取した。第１のパート（Ａ）は、各々が以下のいずれか１つを用いてワクチン接種された、１５人の被験者の群４つからなる：１）手掌側前腕に適用される抗原無しのＭＡＰ対照（Ａ－ＭＡＰ－ＦＡ－０）；２）前腕に適用されるＭＡＰ Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５［Ｈ１Ｎ１］、１５μｇ血球凝集素［ＨＡ］／投与量（Ａ－ＭＡＰ－ＦＡ－１５）；３）三角筋中に筋肉内（ＩＭ）注射される１５μｇのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ抗原（Ａ－ＩＭ－ＡＳｉｎｇ１５）；４）三角筋中に筋肉内(ＩＭ）注射される、１５μｇのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ抗原に加えてインフルエンザ抗原を３株含むＡｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価２０１７／１８（Seqirus（商標）、USA）（Ａ－ＩＭ－ＱＩＶ－１５）。実験の第１のパートでは、１、２２日目の抗体反応を、ＥＬＩＳＡおよび赤血球凝集阻止アッセイ（ＨＡＩ）によって測定した。
【0106】
パート（Ａ）の研究結果の評価後に、実験の第２のパート（Ｂ）を実施した。研究の第２のパート試験は、２０人ごとの被験者の群７つからなる。５つの群は、前腕に漸減の投与量（１５、１０、５、２．５および０μｇＨＡ）が適用されたＭＡＰを用いて、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（Ｈ１Ｎ１）がワクチン接種された（それぞれ、ＭＡＰ－ＦＡ－１５、ＭＡＰ－ＦＡ－１０、ＭＡＰ－ＦＡ－５、ＭＡＰ－ＦＡ－２．５、およびＭＡＰＦＡ－０）。さらなる一群は、ＭＡＰを使用して三角筋を覆う上腕に、１５μｇのＨＡをワクチン接種された（ＭＡＰ－ＵＡ－１５）。最終群は、三角筋中に筋肉内（ＩＭ）注射される、１５μｇのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１ ＨＡ抗原を含むＡｆｌｕｒｉａ（登録商標） Ｑｕａｄ ２０１８（Ｓｅｑｉｒｕｓ（商標）、オーストラリア）をワクチン接種された（ＩＭ－ＱＩＶ－１５）。１日目（ワクチン接種前）、ワクチン接種後４、８、２２、および６１日目の抗体反応を、赤血球凝集阻止アッセイ（ＨＡＩ）およびウイルスマイクロ中和アッセイ（ＶＭＮ）（１日目および２２日目のみ）を使用して測定した。また、ワクチン接種後１、４、８、２２日目に唾液を採取した。唾液試料はＥＬＩＳＡを使用して分析し、インフルエンザ抗原特異的分泌型ＩｇＡを決定した。
【0107】
略語：Ａ／Ｓｉｎｇ＝分裂不活化Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの赤血球凝集素。ＩＭ １５ｕｇ 四価＝三角筋中に筋肉内（ＩＭ）注射される、１５μｇのＡ／Ｓｉｎｇ ＨＡ抗原を含むＡｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価 ２０１８（Seqirus（商標）、Australia）ワクチン。ＳＤ＝標準偏差；Ｎ＝北、Ｅ＝東、Ｓ＝南、Ｗ＝西。
【0108】
［実施例２］
＝微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）＝
本研究で使用されるＭＡＰは、５，０００／ｃｍ２の密度で、約３１３６個の微小突起を含む１０×１０ｍｍの正方形である。各微小突起は、長さが約２５０μｍ、基部における幅が１２０μｍであり、２５μｍ未満の鋭部まで先細りになっている（図２）。各突起の先端上に個々の液滴を堆積させる「Ｄｉｒｅｃｔ－ｊｅｔ」プロセス１６４（Vaxxas Pty Ltd, Australia）を使用して、ガンマ線を照射した（２５ｋＧｙ以上、Steritech, Australia）ＨＤ－ＭＡＰの１６３個の先端にワクチンを無菌的に適用した。
＝微小突起アレイパッチ（ＭＡＰ）＝
本研究で使用されるＭＡＰは、５，０００／ｃｍ２の密度で、約３１３６個の微小突起を含む１０×１０ｍｍの正方形である。各微小突起は、長さが約２５０μｍ、基部における幅が１２０μｍであり、２５μｍ未満の鋭部まで先細りになっている（図２）。各突起の先端上に個々の液滴を堆積させる「Ｄｉｒｅｃｔ－ｊｅｔ」プロセス１６４（Vaxxas Pty Ltd, Australia）を使用して、ガンマ線を照射した（２５ｋＧｙ以上、Steritech, Australia）ＨＤ－ＭＡＰの１６３個の先端にワクチンを無菌的に適用した。
【0109】
ＨＤ－ＭＡＰは、Ａ／Ｓｉｎｇ ２．５μｇおよび５．０μｇの２つの異なる投与量（２．５μｇおよび５μｇＨＤ－ＭＡＰｓと称される）、ならびに未コーティング（プラセボ）ＨＤ－ＭＡＰを送達するために製造された。コーティング後、ＨＤ－ＭＡＰをアルミニウム製ＭｅｄｉＣａｎ容器（Amcor, UK）に入れ、ホイルで密閉し、使用するまで乾燥剤と共に２～８℃で保存した。抗原コーティングＨＤ－ＭＡＰは製造後６ヶ月以内に使用した。
【0110】
２０ｍ／秒±２ｍ／秒の速度でパッチを放出する携帯ばね装置アプリケーターを用いて、ＭＡＰを皮膚に適用した。微小突起は、平均１２５μｍ前後の深さまで表皮および真皮を貫通した。
【0111】
合成ポリマーＭＡＰを射出成形によって作製した。ポリマー材料は、微小突起を形成するポリマーの能力、効果的な皮膚貫通を可能にするポリマーの硬度、適切なポリマー延性、ガンマ線照射滅菌との材料適合性、皮膚組織と接触する場合の合成ポリマーの生体適合性に基づいて選択された。
【0112】
［実施例３］
＝ワクチン＝
ｃＧＭＰ不活性分裂インフルエンザＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、（ＩＶＲ－１８０Ａ）ウイルスワクチンは、Seqirus Pty Ltd, Australia（一価のプールされた収穫物（Monovalent Pooled Harvest）(ＭＰＨ））から入手した。赤血球凝集素（ＨＡ）抗原が、ＭＡＰコーティングおよびその後の保管中に効能を確実に保持するために、安定化賦形剤スルホブチルエーテルβシクロデキストリン（ＳＢＥＣＤ、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標），Cydex Pharmaceuticals, Kansas, USA）を、ＭＡＰと共に使用されるワクチン溶液に加えた。４．８ｍｇ／ｍｌのＨＡを少量の４０％ｗ／ｖ ＳＢＥＣＤ溶液（洗浄用水中、Baxter）と混合して、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（コーティング溶液）を含む２％ｗ／ｖ ＳＢＥＣＤ溶液にした。一価Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅの筋肉内注射のために、抗原製剤をｐＨ試験済の無菌食塩水で希釈した。四価ワクチンの筋肉内注射のために、市販のワクチンを使用した。研究の第１のパートでは、Seqirus（商標）, USAからのＡｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価インフルエンザワクチン２０１７－２０１８（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ）を使用した。パートＢのために、Ａｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価ワクチン２０１８（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ球）を使用した。Ａｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ ２０１７／１８ワクチンは、以下の各分裂不活化ウイルス型のＨＡを、名目上１５μｇ含んでいた：Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、ＩＶＲ－１８０Ａ；Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）、ＮＹＭＣ Ｘ－２６３Ｂ；Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３ ＢＶＲ－１Ｂ；およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／４６／２０１５。Ａｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ２０１８ワクチンは、以下の各ウイルス型のＨＡを、名目上１５μｇ含んでいた：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（ＩＶＲ－１８０Ａ））；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（ＩＶＲ－１８６））；Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３様ウイルス（Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（ＢＶＲ－１Ｂ））；およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８様ウイルス（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／４６／２０１５）。
＝ワクチン＝
ｃＧＭＰ不活性分裂インフルエンザＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、（ＩＶＲ－１８０Ａ）ウイルスワクチンは、Seqirus Pty Ltd, Australia（一価のプールされた収穫物（Monovalent Pooled Harvest）(ＭＰＨ））から入手した。赤血球凝集素（ＨＡ）抗原が、ＭＡＰコーティングおよびその後の保管中に効能を確実に保持するために、安定化賦形剤スルホブチルエーテルβシクロデキストリン（ＳＢＥＣＤ、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標），Cydex Pharmaceuticals, Kansas, USA）を、ＭＡＰと共に使用されるワクチン溶液に加えた。４．８ｍｇ／ｍｌのＨＡを少量の４０％ｗ／ｖ ＳＢＥＣＤ溶液（洗浄用水中、Baxter）と混合して、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（コーティング溶液）を含む２％ｗ／ｖ ＳＢＥＣＤ溶液にした。一価Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅの筋肉内注射のために、抗原製剤をｐＨ試験済の無菌食塩水で希釈した。四価ワクチンの筋肉内注射のために、市販のワクチンを使用した。研究の第１のパートでは、Seqirus（商標）, USAからのＡｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価インフルエンザワクチン２０１７－２０１８（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ）を使用した。パートＢのために、Ａｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価ワクチン２０１８（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ球）を使用した。Ａｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ ２０１７／１８ワクチンは、以下の各分裂不活化ウイルス型のＨＡを、名目上１５μｇ含んでいた：Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（Ｈ１Ｎ１）、ＩＶＲ－１８０Ａ；Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）、ＮＹＭＣ Ｘ－２６３Ｂ；Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３ ＢＶＲ－１Ｂ；およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／４６／２０１５。Ａｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ２０１８ワクチンは、以下の各ウイルス型のＨＡを、名目上１５μｇ含んでいた：Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９様ウイルス（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（ＩＶＲ－１８０Ａ））；Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（Ｈ３Ｎ２）様ウイルス（Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＩＮＦＩＭＨ－１６－００１９／２０１６（ＩＶＲ－１８６））；Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３様ウイルス（Ｂ／Ｐｈｕｋｅｔ／３０７３／２０１３（ＢＶＲ－１Ｂ））；およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８様ウイルス（Ｂ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／４６／２０１５）。
【0113】
Ａ／Ｓｉｎｇ ＭＡＰを生産するために、滅菌Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ抗原をフィルター滅菌ＳＢＥＣＤ溶液に添加し、直接ジェットコーティング法によってＭＡＰ微小突起の先端上にコーティングした。Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ抗原は、リン酸緩衝生理食塩水中の粒子の懸濁液として受容される。したがってＭＡＰ上の抗原の最終固形調合物は、ＨＡタンパク質、他のタンパク質（Ａ／シンガポールバルク由来）、ＳＢＥＣＤおよび緩衝塩から成る。その後、コーティングＭＡＰを直ちに製品パック中にホイルで密閉し、無菌室から取り出し、２～８℃で保存した。製品の製造および試験を単純化するために、必要な投与量を送達するために３つのパッチを適用した。１５μｇの群の被験者は３×５μｇのパッチを受け、１０μｇの群の被験者は２×５μｇおよび１×プラセボパッチを受け、５μｇの群の被験者は１×５μｇおよび２×プラセボパッチを受け、２．５μｇの群の被験者は１×２．５μｇおよび２×プラセボパッチを受け、０μｇの群の被験者は３×プラセボパッチを受けた。適用の順番は、無作為化され、盲検式であった。
【0114】
ＭＡＰアプリケーター装置（ＣＡＰＤ）は、ＭＡＰを確実かつ再現性をもって皮膚に適用するように設計された、携帯式ばね動力装置であった。ＭＡＰアプリケーターは、バネによって生じる機械的な力を利用して、微小突起の密なアレイが皮膚を裂くために十分に、短距離（５ｍｍ未満）で２０ｍ／秒の高速度までＭＡＰを加速させる。ＣＡＰＤは、ＭＡＰを取り付け、配置し、保持するために磁石を使用する。ＣＡＰＤは使い捨て装置であり、皮膚コンディショニング環（skin conditioning ring）と共に使用される。皮膚コンディショニング環は、ＭＡＰ投与領域周辺の皮膚に接する。皮膚環を作動させるためには、約３０ニュートンの下向きの力が必要であり、その結果、ＭＡＰ投与のための皮膚のプレコンディショニングが生じる。
【0115】
ＭＡＰ上に乾燥コーティングされたＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ ＨＡ抗原は安定であることが示された（酵素結合免疫検定法によって測定され、ＭＡＰ上にコーティングした後、最高４０℃の温度で１２ヶ月間）（参照）（図Ｙ）。プラセボＭＡＰ（ＭＡＰ－プラセボ／ＦＡ群）はガンマ線滅菌（２５ｋＧｙ以上、Steritech, Australia）した。全てのＭＡＰをアルミニウムＭｅｄｉＣａｎ容器（Amcor, UK）に入れ、ホイルで密閉し、使用までの間２～８℃で保存した（図４）。
【0116】
［実施例４］
＝免疫原性の評価＝
血清試料を１日目（接種前）、４、８、２２、および６１日目に採取し、１日目と２２日目について、赤血球凝集阻止（ＨＡＩ）およびウイルスマイクロ中和（ＶＭＮ）アッセイで試験した。ＨＡＩアッセイは以前に記載されているとおりに実施した（Fernando et al 2018）。簡単に述べると、ＨＡＩのための血清試料を受容体破壊酵素（Denka Seiken Co Ltd, Japan）で処理し、洗浄し充填された七面鳥の赤血球細胞（ＴＲＢＣ）に、室温（ＲＴ）で３０分間吸着させた。試験前に、ＴＲＢＣをＰＢＳ中で１％ｖ／ｖに希釈した。１：１０から開始する２倍の血清希釈液を調製し、４ＨＡユニット／２５μＬのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ウイルス（WHO Collaborating Centre, Australia）を各試験用ウェルに添加し、室温（ＲＴ）で４５分間インキュベートした。ＴＲＢＣを添加し、室温でさらに３０分間培養した。ＨＡＩ力価は、ウイルスによるＴＲＢＣの凝集を完全に阻害した血清の最高希釈率の逆数とした。
＝免疫原性の評価＝
血清試料を１日目（接種前）、４、８、２２、および６１日目に採取し、１日目と２２日目について、赤血球凝集阻止（ＨＡＩ）およびウイルスマイクロ中和（ＶＭＮ）アッセイで試験した。ＨＡＩアッセイは以前に記載されているとおりに実施した（Fernando et al 2018）。簡単に述べると、ＨＡＩのための血清試料を受容体破壊酵素（Denka Seiken Co Ltd, Japan）で処理し、洗浄し充填された七面鳥の赤血球細胞（ＴＲＢＣ）に、室温（ＲＴ）で３０分間吸着させた。試験前に、ＴＲＢＣをＰＢＳ中で１％ｖ／ｖに希釈した。１：１０から開始する２倍の血清希釈液を調製し、４ＨＡユニット／２５μＬのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ウイルス（WHO Collaborating Centre, Australia）を各試験用ウェルに添加し、室温（ＲＴ）で４５分間インキュベートした。ＴＲＢＣを添加し、室温でさらに３０分間培養した。ＨＡＩ力価は、ウイルスによるＴＲＢＣの凝集を完全に阻害した血清の最高希釈率の逆数とした。
【0117】
ＶＭＮアッセイは、以前に記載されているとおりに実施した（Fernando et al 2018）。簡単に述べると、血清試料を、５６℃で３０分間加熱し不活性化した。１：１００から開始する２倍の血清希釈液を調製し、１００ ＴＣＩＤ５０のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ウイルス（WHO Collaborating Centre, Australia）を各試験用ウェルに添加した。Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ウイルスによるＭＤＣＫ細胞の感染予防を、インフルエンザ核タンパクのＥＬＩＳＡ検出を使用して試験した。
【0118】
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介可能な抗体を、可溶性組換えＦｃγＲＩＩＩＡ受容体二量体と架橋する、固定化Ａ／Ｓｉｎｇ ＭＰＨ特異的抗体の能力を検出するＥＬＩＳＡを用いて分析した（２２）。ＭＡＰ－ＦＡ－０群、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群の被験者から１日目および２２日目に採取した血清試料を試験した。簡単に述べると、９６ウェルのＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ プレート（Thermofisher Scientific, USA）を、４℃で１６時間、ＰＢＳ中の５０ｎｇのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ ＨＡでコーティングし、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Thermofisher Scientific）でブロックした後、２連の連続希釈血清試料（１：２０～１：４３，７４０）を添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴを用いて洗浄した。ＦｃγＲＩＩＩＡ Ｖａｌ１５８外部ドメインビオチン二量体（０．１μｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴを用いて洗浄した。抗体－ＦｃγＲＩＩＩＡ錯体を、１：１０，０００希釈のストレプトアビジン－ＨＲＰ（Thermofisher Scientific）を用いて検出し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン基質（Sigma-Aldrich, USA）を用いて展開した。反応を０．１６Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで測定した。最大半減シグナル（ＥＣ５０）を与える血清濃度を、適合曲線（４パラメーター対数回帰）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（GraphPad Software, USA）を使用して決定した。
【0119】
［実施例５］
＝唾液中のＩｇＡ＝
１日目、４日目、８日目および２２日目に、ＭＡＰ－ＦＡ－０群、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群の被験者から唾液試料を採取した。被験者は、Ｓａｌｉｖｅｔｔｅ（登録商標）唾液コレクター（Sarstedt, France）の綿棒を約１分間噛んだ。遠心分離後、上清（唾液）を－８０℃で保存した。インフルエンザ特異的ＩｇＡをＥＬＩＳＡにより検出した。具体的には、ＰＢＳ（ＰＢＳＡ）中の４ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ中で連続希釈した唾液試料を、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ ＨＡ ＭＰＨ（２μｇ／ｍｌで６０μｌ／ウェル）で一晩予めコーティングされたＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Thermofisher Scientific, USA）に添加し、ＰＢＳＡでブロックした。Ａ／Ｓｉｎｇ ＨＡ特異的ＩｇＡの存在を、ＨＲＰ－１結合ヤギ抗ヒトポリクローナルＩｇＡ（PA1-74395, Thermofisher Scientific, USA）およびＡＢＴＳ ２３２基板（Sera-Care, USA）を用いて検出した。反応を１％ ＳＤＳで停止させ、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
＝唾液中のＩｇＡ＝
１日目、４日目、８日目および２２日目に、ＭＡＰ－ＦＡ－０群、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群の被験者から唾液試料を採取した。被験者は、Ｓａｌｉｖｅｔｔｅ（登録商標）唾液コレクター（Sarstedt, France）の綿棒を約１分間噛んだ。遠心分離後、上清（唾液）を－８０℃で保存した。インフルエンザ特異的ＩｇＡをＥＬＩＳＡにより検出した。具体的には、ＰＢＳ（ＰＢＳＡ）中の４ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ中で連続希釈した唾液試料を、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ ＨＡ ＭＰＨ（２μｇ／ｍｌで６０μｌ／ウェル）で一晩予めコーティングされたＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Thermofisher Scientific, USA）に添加し、ＰＢＳＡでブロックした。Ａ／Ｓｉｎｇ ＨＡ特異的ＩｇＡの存在を、ＨＲＰ－１結合ヤギ抗ヒトポリクローナルＩｇＡ（PA1-74395, Thermofisher Scientific, USA）およびＡＢＴＳ ２３２基板（Sera-Care, USA）を用いて検出した。反応を１％ ＳＤＳで停止させ、吸光度を４０５ｎｍで測定した。
【0120】
［実施例６］
＝記憶Ｂ細胞＝
１日目および２２日目に、ＭＡＰ－ＦＡ－０群、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群の被験者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取および低温保存し、使用するまで液体２３７窒素中に保存した。Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９および安定化Ｈ１Ｎ１ステムドメインのためのフローサイトメトリープローブとして使用するための組換えＨＡタンパク質を、以前に報告されたとおりに誘導した（２３）。ＨＡ特異的Ｂ細胞を、ＳＡ－ＰＥ、ＳＡ－ＡＰＣ、またはＳＡ－Ａｘ４８８（Thermofisher Scientific）に結合したＨＡプローブとの共染色によって、低温保存されたヒトＰＢＭＣ内で同定した。表面染色用モノクローナル抗体は以下を含む：ＣＤ１９－ＥＣＤ（Ｊ３－１１９）（Beckman Coulter, USA）、ＩｇＭ－ＢＵＶ３９５（Ｇ２０－１２７）、ＣＤ２１－ＢＵＶ７３７（Ｂ－ｌｙ４）、ＩｇＤ－Ｃｙ７ＰＥ（ＩＡ６－２）、ＩｇＧ－ＢＶ７８６（Ｇ１８－１４５）（BD 243 Biosciences, USA）、ＣＤ１４－ＢＶ５１０（Ｍ５Ｅ２）、ＣＤ３－ＢＶ５１０（ＯＫＴ３）、ＣＤ８ａ－ＢＶ５１０（ＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＤ１６－ＢＶ５１０（３Ｇ８）、ＣＤ１０－ＢＶ５１０（ＨＩ１０ａ）、ＣＤ２７－ＢＶ６０５（Biolegend, USA）およびＩｇＡ－Ｖｉｏ４５０（ＲＥＡ１０１４）２４５（Miltenyi, USA）。ＳＡと相互作用するＢ細胞のバックグラウンドは、ＳＡ－ＢＶ５１０（BD 246 Biosciences）で染色することによって除外した。Ａｑｕａ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアミン反応性色素（Thermofisher Scientific）を用いて細胞生存率を評価した。１８個の蛍光色素を検出するように構成されたＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して試料を採取し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン９．５．２（TreeStar, USA）を使用して分析を行った。
＝記憶Ｂ細胞＝
１日目および２２日目に、ＭＡＰ－ＦＡ－０群、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群の被験者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を採取および低温保存し、使用するまで液体２３７窒素中に保存した。Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９および安定化Ｈ１Ｎ１ステムドメインのためのフローサイトメトリープローブとして使用するための組換えＨＡタンパク質を、以前に報告されたとおりに誘導した（２３）。ＨＡ特異的Ｂ細胞を、ＳＡ－ＰＥ、ＳＡ－ＡＰＣ、またはＳＡ－Ａｘ４８８（Thermofisher Scientific）に結合したＨＡプローブとの共染色によって、低温保存されたヒトＰＢＭＣ内で同定した。表面染色用モノクローナル抗体は以下を含む：ＣＤ１９－ＥＣＤ（Ｊ３－１１９）（Beckman Coulter, USA）、ＩｇＭ－ＢＵＶ３９５（Ｇ２０－１２７）、ＣＤ２１－ＢＵＶ７３７（Ｂ－ｌｙ４）、ＩｇＤ－Ｃｙ７ＰＥ（ＩＡ６－２）、ＩｇＧ－ＢＶ７８６（Ｇ１８－１４５）（BD 243 Biosciences, USA）、ＣＤ１４－ＢＶ５１０（Ｍ５Ｅ２）、ＣＤ３－ＢＶ５１０（ＯＫＴ３）、ＣＤ８ａ－ＢＶ５１０（ＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＤ１６－ＢＶ５１０（３Ｇ８）、ＣＤ１０－ＢＶ５１０（ＨＩ１０ａ）、ＣＤ２７－ＢＶ６０５（Biolegend, USA）およびＩｇＡ－Ｖｉｏ４５０（ＲＥＡ１０１４）２４５（Miltenyi, USA）。ＳＡと相互作用するＢ細胞のバックグラウンドは、ＳＡ－ＢＶ５１０（BD 246 Biosciences）で染色することによって除外した。Ａｑｕａ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄアミン反応性色素（Thermofisher Scientific）を用いて細胞生存率を評価した。１８個の蛍光色素を検出するように構成されたＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して試料を採取し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン９．５．２（TreeStar, USA）を使用して分析を行った。
【0121】
［実施例７］
＝Ｔ細胞のフローサイトメトリー＝
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生を、Ｌａｎｄｒｙらによって記載された方法を改変して使用し評価した（２４）。ＰＢＭＣを解凍し、１．５×１０６／ウェルで平板培養し、６時間静置した。洗浄後、ＰＢＭＣを、Ａ／Ｓｉｎｇ ＭＰＨ（２０μｇ／ｍｌ）で２０時間、またはＡ／Ｓｉｎｇ ＨＡ配列（Mimotopes Pty Ltd, Australia）にわたる重複合成ペプチド（１１個のアミノ酸が重複する１７個のアミノ酸長、５μｇ／ｍｌ）のプールで６時間、刺激した。培地のみ、およびＰＭＡ／イオノマイシンを、それぞれネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして使用した。ゴルジブロッカー（モネンシンおよびブレフェルジンＡ）を、インキュベート終了の５時間前に添加した。細胞を、表面染色Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（生存率のために）、抗ＣＤ３ ＢＶ７８５、抗ＣＤ４ ＦＩＴＣ、抗ＣＤ８ ＡＰＣ／Ｃｙ７（すべてBiolegendから）で標識し、次いで固定し、透過性をもたせ、抗ＩＦＮ－γ Ａｘ６４７、抗ＴＮＦ－α ＢＶ４２１、および抗ＩＬ－２ ＰＥ（すべてBiolegendから）で標識した。最後の洗浄工程から２４時間以内にＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０上で、試料を分析した。約５００，０００の事象を得て、生データを、最初にＦｌｏｗＪｏを用いて分析し（各サイトカインについて正のパーセント値を得るために）、その後ＳＰＩＣＥ（http://exon.niaid.nih.gov/spice）ソフトウェアを使用して、バックグラウンド減算値を分析した。
＝Ｔ細胞のフローサイトメトリー＝
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生を、Ｌａｎｄｒｙらによって記載された方法を改変して使用し評価した（２４）。ＰＢＭＣを解凍し、１．５×１０６／ウェルで平板培養し、６時間静置した。洗浄後、ＰＢＭＣを、Ａ／Ｓｉｎｇ ＭＰＨ（２０μｇ／ｍｌ）で２０時間、またはＡ／Ｓｉｎｇ ＨＡ配列（Mimotopes Pty Ltd, Australia）にわたる重複合成ペプチド（１１個のアミノ酸が重複する１７個のアミノ酸長、５μｇ／ｍｌ）のプールで６時間、刺激した。培地のみ、およびＰＭＡ／イオノマイシンを、それぞれネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして使用した。ゴルジブロッカー（モネンシンおよびブレフェルジンＡ）を、インキュベート終了の５時間前に添加した。細胞を、表面染色Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（生存率のために）、抗ＣＤ３ ＢＶ７８５、抗ＣＤ４ ＦＩＴＣ、抗ＣＤ８ ＡＰＣ／Ｃｙ７（すべてBiolegendから）で標識し、次いで固定し、透過性をもたせ、抗ＩＦＮ－γ Ａｘ６４７、抗ＴＮＦ－α ＢＶ４２１、および抗ＩＬ－２ ＰＥ（すべてBiolegendから）で標識した。最後の洗浄工程から２４時間以内にＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０上で、試料を分析した。約５００，０００の事象を得て、生データを、最初にＦｌｏｗＪｏを用いて分析し（各サイトカインについて正のパーセント値を得るために）、その後ＳＰＩＣＥ（http://exon.niaid.nih.gov/spice）ソフトウェアを使用して、バックグラウンド減算値を分析した。
【0122】
［実施例８］
＝耐熱性＝
Ａ／ＳｉｎｇでコーティングされたＨＤ－ＭＡＰを、２～８℃、２５℃±２℃／６０％±５％相対湿度（ＲＨ）および４０℃±２℃／６０％±５％ＲＨで、１２か月間保存した。指定された時点で、２０～２８℃での水浴超音波処理を使用して、１ｍＬの溶出緩衝液（０．０４１％ｗ／ｗヒプロメロース、０．０２９５％ｗ／ｗトレハロース二水和物）中のＨＤ－ＭＡＰからコーティングを溶出し、酵素免疫アッセイによってＨＡの効力を決定した（Bodle et al, 2013）。
＝耐熱性＝
Ａ／ＳｉｎｇでコーティングされたＨＤ－ＭＡＰを、２～８℃、２５℃±２℃／６０％±５％相対湿度（ＲＨ）および４０℃±２℃／６０％±５％ＲＨで、１２か月間保存した。指定された時点で、２０～２８℃での水浴超音波処理を使用して、１ｍＬの溶出緩衝液（０．０４１％ｗ／ｗヒプロメロース、０．０２９５％ｗ／ｗトレハロース二水和物）中のＨＤ－ＭＡＰからコーティングを溶出し、酵素免疫アッセイによってＨＡの効力を決定した（Bodle et al, 2013）。
【0123】
［実施例９］
＝統計分析＝
スチューデントのｔ検定を用いて、ＨＡＩ力価およびＭＮ力価の倍数増加を群間で比較した。連続補正を伴うピアソンのχ２検定（SAS version 9.4, SAS Institute Inc., USA）を用いて、血清保護または血清変換された被験者の割合を群間で比較した。本試験は初期段階の試験であるため、有効性の探索的分析はＡＤＣＣおよび記憶Ｂ細胞応答アッセイに適応しておらず、クラスカル・ワリスのノンパラメトリック検定（多重比較のための補正なし）およびダンの多重比較後検定（Dunn’s multiple comparison post-test）を用いて、全群を比較した。１日目および２２日目の、ＣＤ４＋細胞によるサイトカイン産生の群内比較を、ウィルコクソン順位和検定を用いて行った。
〔結果〕
＝安定性＝
臨床での製造に先立って安定したデータを得るために、ＧＬＰ安定性試験を行い、ＨＤ－ＭＡＰ上にローディングされる５μｇおよび１５μｇのＨＡ Ａ／Ｓｉｎｇを試験した。このローディング範囲は、本研究での使用を意図したＨＡ Ａ／Ｓｉｎｇのローディングの範囲を包含するように選択された。ＨＤ－ＭＡＰあたり５μｇおよび１５μｇでコーティングされたＡ／Ｓｉｎｇ抗原は、２～８℃または４０℃で少なくとも１２ヶ月間保存した場合に安定していた（図４）。
＝統計分析＝
スチューデントのｔ検定を用いて、ＨＡＩ力価およびＭＮ力価の倍数増加を群間で比較した。連続補正を伴うピアソンのχ２検定（SAS version 9.4, SAS Institute Inc., USA）を用いて、血清保護または血清変換された被験者の割合を群間で比較した。本試験は初期段階の試験であるため、有効性の探索的分析はＡＤＣＣおよび記憶Ｂ細胞応答アッセイに適応しておらず、クラスカル・ワリスのノンパラメトリック検定（多重比較のための補正なし）およびダンの多重比較後検定（Dunn’s multiple comparison post-test）を用いて、全群を比較した。１日目および２２日目の、ＣＤ４＋細胞によるサイトカイン産生の群内比較を、ウィルコクソン順位和検定を用いて行った。
〔結果〕
＝安定性＝
臨床での製造に先立って安定したデータを得るために、ＧＬＰ安定性試験を行い、ＨＤ－ＭＡＰ上にローディングされる５μｇおよび１５μｇのＨＡ Ａ／Ｓｉｎｇを試験した。このローディング範囲は、本研究での使用を意図したＨＡ Ａ／Ｓｉｎｇのローディングの範囲を包含するように選択された。ＨＤ－ＭＡＰあたり５μｇおよび１５μｇでコーティングされたＡ／Ｓｉｎｇ抗原は、２～８℃または４０℃で少なくとも１２ヶ月間保存した場合に安定していた（図４）。
【0124】
＝血清学的反応＝
パートＡおける被験者の１、４、８、２２および６１日目のＨＡＩ抗体の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）を図５に示す。上記のデータは、ＭＡＰによって皮膚に送達された２．５μｇが、針と注射器を使用して単独で、または四価ワクチンの一部としてのいずれかで送達された１５μｇのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ ＨＡによって誘導されるＨＡＩ力価と統計的に相違ないＨＡＩ力価を誘導することを示している。ヒトに筋肉内送達される１５μｇの投与量と比較すると、ＭＡＰを使用した場合、抗原の投与量が６倍低減される。投与量を２．５μｇ未満に低減させてもなお筋肉内注射に匹敵する抗体力価を維持することができ得る。ＭＡＰにおいてマウスモデルでの投与量の低減が示されていたが、それがヒトで示されたのは今回が初めてである。２２日目の時点では、ワクチン接種群間に統計的に有意な相違は見られなかった。図６は、試験Ａにおけるいくつかのワクチン製剤について、１日目対２２日目の赤血球凝集素阻害力価のプロットである。図７は、試験Ａでの時間に対する赤血球凝集素阻害力価のプロットである。図８は、試験Ａでの２２日目のマイクロ中和力価のプロットである。
パートＡおける被験者の１、４、８、２２および６１日目のＨＡＩ抗体の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）を図５に示す。上記のデータは、ＭＡＰによって皮膚に送達された２．５μｇが、針と注射器を使用して単独で、または四価ワクチンの一部としてのいずれかで送達された１５μｇのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ ＨＡによって誘導されるＨＡＩ力価と統計的に相違ないＨＡＩ力価を誘導することを示している。ヒトに筋肉内送達される１５μｇの投与量と比較すると、ＭＡＰを使用した場合、抗原の投与量が６倍低減される。投与量を２．５μｇ未満に低減させてもなお筋肉内注射に匹敵する抗体力価を維持することができ得る。ＭＡＰにおいてマウスモデルでの投与量の低減が示されていたが、それがヒトで示されたのは今回が初めてである。２２日目の時点では、ワクチン接種群間に統計的に有意な相違は見られなかった。図６は、試験Ａにおけるいくつかのワクチン製剤について、１日目対２２日目の赤血球凝集素阻害力価のプロットである。図７は、試験Ａでの時間に対する赤血球凝集素阻害力価のプロットである。図８は、試験Ａでの２２日目のマイクロ中和力価のプロットである。
【0125】
ＨＡＩ ＧＭＴ、血清保護率、血清変換率およびＧＭＴ力価の倍数増加を、表１に示す。表１は、試験Ｂについて、血清保護率、血清変換率およびＧＭＴの倍数増加の観点において、ワクチン接種に対する赤血球凝集阻止反応がワクチン接種前水準を超えることを示している。
【0126】
【表1】
【0127】
パートＢおける被験者の１、４、８、２２および６１日目のＨＡＩ抗体の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）を図９に示す。未コーティングのＨＤ－ＭＡＰを受けた被験者では、ＨＡＩ力価の増加は認められなかった。ＨＤ－ＭＡＰまたはＩＭのいずれかによってワクチン接種を受けた被験者では、４日目の力価は基準値を超えて上昇しなかったが、８日目では、ＧＭＴは、ＭＡＰ－ＦＡ－１０群（ＧＭＴ４３７、２５４～７５１ ９５％ＣＩ）、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群（ＧＭＴ２４３、１３３～４４２ ９５％ＣＩ）およびＭＡＰ－ＦＡ－１５（ＧＭＴ２１９、１１２～４２７ ９５％ＣＩ）群で最も高かった。基準値からのＧＭＴ力価の増加は、ＩＭ－ＱＩＶ－１５群（ＧＭＴ８３、４２～１６１ ９５％ＣＩ）よりも８日目で有意に高かった（ＭＡＰ－ＦＡ－１０ ｐ＝０．０００２、ＭＡＰ－ＵＡ－１５ ｐ＝０．０１６７、ＭＡＰ－ＦＡ－１５ ｐ＝０．０３８４）。力価は、２２日目まで全実薬群において増加を続け、ＭＡＰ－ＦＡ－１０群およびＭＡＰ－ＵＡ－１５群の２２日目（それぞれ、ｐ＝０．００１１およびｐ＝０．０２０１）において、およびＭＡＰ－ＦＡ－１０群およびＭＡＰ－ＵＡ－１５群の６１日目（それぞれ、ｐ＝０．００６２およびｐ＝０．０２７７）において、ＩＭ－ＱＩＶ－１５群より有意に高いままであった。ＭＡＰ－ＦＡ－２．５群（ＨＡの標準投与量の１／６を受けた被験者）のＧＭＩは、いずれの時点でもＩＭ－ＱＩＶ－１５群のＧＭＩと比べて有意差は認められなかった（４日目ｐ＝０．４０３４；８日目ｐ＝０．７４４９；２２日目ｐ＝０．９３１２、６１日目ｐ＝０．７２９７）。さらに、２２日目では、ＨＡＩ ４０５ ＧＭＴは、ＭＡＰ－ＦＡ－１５（ＧＭＴ３２０、１６１～６３８ ９５％ＣＩ）群およびＭＡＰ－ＵＡ－１５（ＧＭＴ３６８、１９８～６８３ ９５％ＣＩ）群で類似しており、これは、ＨＤ－ＭＡＰの適用部位が後続する抗体反応に影響を及ぼさないことを示す。
【0128】
８日目のＧＭＴにおける４２９倍数増加は、ＭＡＰ－ＦＡ－１０群およびＭＡＰ－ＵＡ－１５群４３０（それぞれ、２２．６および１８．４）において、ＩＭ－ＱＩＶ－１５群（１．０）（それぞれ、ｐ＝０．００６９およびｐ＝０．００９５ ４３１）と比較して有意に高く、これは、筋肉内注射と比較してより迅速な抗体応答を示す。基準値からの倍数４３２変化は、２２日目および６１日目のＭＡＰ－ＵＡ－１５群において有意に高いままであった４３３（それぞれ、ｐ＝０．０２４０およびｐ＝０．０２６５）。ＨＤ－ＭＡＰにより送達されたワクチンを受けたパートＡの被験者において観察されたＨＡＩ力価は、どの時点においても試験Ｂにおける対応する群と有意差はなく（すなわち、ＭＡＰ－ＦＡ－１５と比較したＡ－ＭＡＰ－ＦＡ－１５、すべてのｐ値＞０．４１８０）、これは、抗体の送達および誘導の一貫性を示す。パートＡおよびＢにおいてＩＭ－ＱＩＶ－１５によって誘導されたＧＭＴはまた、４、８、および２２日目では有意差はなかったが、６１日目では試験Ａにおいてより高かった（ｐ＝０．０３２０）。
【0129】
１日目（ワクチン接種前）および２２日目における、パートＢの全パートＢおける被験者から得られた血清試料に対してＭＮアッセイを実施した。ＨＡＩ抗体と同様に、ワクチンを受けた全治療群において、１日目から２２日目まで力価が増加した（図１０）。ＭＡＰ－ＦＡ－１０群およびＭＡＰ－ＵＡ－１５群における２２日目のＭＮ力価は、ＩＭ－ＱＩＶ－１５群よりも有意に高かった（それぞれ、ｐ＝０．０００５およびｐ＝０．００９６）。ＨＡＩの結果と同様に、ＭＡＰ－ＦＡ－２．５（１／６投与量）（ＧＭＴ５，３０１、２，５０９～１１，１９６ ９５％ＣＩ）群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５（ＧＭＴ３，８８０ １，９２４～７，８２４ ９５％ＣＩ）群における２２日目のＭＮ ＧＭＴは類似していた（図１０）。
【0130】
ＡＤＣＣを媒介することができるＨＡ特異的ＦｃＲ結合抗体力価を、１日目および２２日目に検定した。中点力価は、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群、ＭＡＰ－ＦＡ－０群、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群においてワクチン送達後に有意に増加したが（それぞれ、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．００１、ｐ＝０．００２）、ＭＡＰ－ＦＡ－０群においては有意に増加しなかった（ｐ＞０．９９）（図Ｘ３Ａ）。これら３つの実薬群における２２日目での中点力価間に有意差は認められず（いずれの比較もｐ＞０．９９）、結果が群内変動の程度に相当する基準値からの倍数変化として表された場合についても有意差は認められなかった（図１１）。
【0131】
ＭＡＰ－ＦＡ－０群、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群の被験者から１、４、８および２２日目に採取された試料について、唾液中のインフルエンザ特異的ＩｇＡをＥＬＩＳＡにより検定した。いずれの群においても、１日目と比較して力価の有意な増加は認められなかった。しかしながら、８日目のＭＡＰ－ＦＡ－１５群およびＭＡＰ－ＵＡ－１５群において基準値を超える１．９２倍および１．５７倍の増加が認められたのに対し、ＭＡＰ－ＦＡ－０群（１．０１倍）については増加が認められず、同時点でのＩＭ－ＱＩＶ－１５群においては１．２２倍の増加が認められた。ＩｇＡ力価は２２日目にはほぼ基準値レベルに戻った（図１２）。
【0132】
蛍光標識組換えＨＡを使用したフローサイトメトリーに基づくアッセイを用いて、免疫化後のＨＡ特異的Ｂ細胞の頻度および特異性を検定した。ＨＡ－Ｍｉｃｈｉｇａｎプローブ結合記憶Ｂ細胞（ＭＢＣ）（抗原的にＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５に一致）の頻度は、ＱＩＶまたは活性ＨＤ－ＭＡＰ（ＭＡＰ－ＦＡ－１５ｐ＜０．０００１、ＭＡＰ－ＵＡ－１５ｐ＜０．０００１およびＩＭ－ＱＩＶ－１５ｐ＜０．０００１）のいずれかによる免疫化後２２日目に上昇したが、プラセボ群（ＭＡＰ－ＦＡ－０ｐ＜０．０００１）では上昇しなかった。しかしながら、２２日目でのＨＡ－ミシガン特異的ＭＢＣの頻度は、３つのワクチン群において有意差が認められなかった（全ての比較についてｐ＞０．９９）。Ｈ１Ｎ１交差反応性を検定するためにＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９プローブへの結合を用いたところ、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／１５結合細胞のごく一部のみがＨＡ認識交差反応性を示した。ＭＡＰ－ＦＡ－１５（ｐ＜０．０００１）群およびＭＡＰ－ＵＡ－１５（ｐ＜０．０００１）群において１日目および２２日目の間に頻度について有意な増加が認められ、ＩＭ－ＱＩＶ－１５群（ｐ＝０．０５２２）において頻度の程度はより低かった。この場合も、２２日目でのワクチン群におけるＭＢＣ頻度に差は認められなかった（すべての比較についてｐ＜０．９９）。同様のパターンが、ＨＡ－スタークドメインプローブに結合する交差反応性Ｂ細胞で認められた。ＭＡＰ－ＦＡ－１５群（ｐ＝０．００６）およびＩＭ＿ＱＩＶ－１５群（ｐ＝０．４６８）において、１日目から２２日目まで有意な拡大が認められた。ＭＡＰ－ＵＡ－１５群の拡大は、おそらく群内変動性（ｐ＝０．１６７）のために、有意性を獲得しなかった。２２日目の実薬ＨＤ‐ＭＡＰ群とＩＭ群との間でスターク反応性ＭＢＣ頻度に差はなかった（全ての比較についてｐ＞０．９９）。図１３Ａ～Ｆ。
【0133】
Ｔ細胞反応を、ＭＡＰ－ＦＡ－０群、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群の被験者から１日目および２２日目に採取したＰＢＭＣ中のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－αを産生するインフルエンザ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔの頻度を分析することによって検定した。ＰＢＭＣを、Ａ／Ｓｉｎｇ ＭＰＨまたはＡ／Ｓｉｎｇ ＨＡ配列にわたる５３６の重複ペプチドのいずれかで刺激した。
【0134】
ＭＡＰ－ＦＡ－１５群、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群において、１日目と比較して２２日目に、インビトロでのペプチドによる刺激後のＩＦＮ－γ、ＩＬ－２またはＴＮＦ－αを産生するＣＤ４＋細胞の全体的な頻度の増加が認められたが、ＭＡＰ－ＦＡ－０群では認められなかった（図８Ａ）。特に、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群（ｐ＝０．０００２）、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群（ｐ＝０．００４５）およびＩＭ－ＱＩＶ－１５（ｐ＝０．０１１０）群について、３種類のサイトカインすべて（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２）を発現する多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在量が１日目と比較して２２日目で有意に増加した。また、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群（ｐ＝０．０００８）、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群（ｐ＝０．０００３）およびＩＭ－ＱＩＶ群（ｐ＝０．００１２）において、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２を産生するＣＤ４＋細胞の有意な増加が認められた。また、ＭＡＰ－ＦＡ－１５群では、ＴＮＦ－αのみ（ｐ＝０．００５３）、またはＩＦＮ－γと共にＴＮＦ－α（ｐ＝０．００１３）を発現するＣＤ４＋細胞が有意に増加した（図８Ａ）。ＭＡＰ－ＦＡ－１５、ＭＡＰ－ＵＡ－１５群およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群を互いの群と比較した場合、２２日目におけるいずれかのサイトカインの組み合わせを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合において統計的有意差は認められなかった（すべての比較についてｐ＞０．０５６５）。
【0135】
ワクチン接種前後のサイトカイン産生ＣＤ４＋細胞の全体的な頻度は、重複ペプチドと比較して、Ａ／Ｓｉｎｇ ＭＰＨによる刺激の後でより大きかった。これは、おそらくＭＰＨ製剤内に存在するエピトープの数がより多いことによる。Ａ／Ｓｉｎｇ ＭＰＨ刺激は、ペプチド刺激と比較して、ＴＮＦ－αのみを産生するＣＤ４＋細胞をより多く誘導すると思われた。しかしながら、ＭＡＰ－ＦＡ－１５、ＭＡＰ－ＵＡ－１５およびＩＭ－ＱＩＶ－１５群を互いに比較した場合、２２日目における各サイトカインの組み合わせを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の割合に統計的有意差は何ら認められなかった（全ての比較についてｐ＞０．０５１５）。
【0136】
ペプチドプールおよびＡ／Ｓｉｎｇ ＭＰＨに対する１日目および２２日目のＣＤ８＋Ｔ細胞の反応も測定したが、ＣＤ４＋の反応と比較して弱かった。ＣＤ８＋Ｔ細胞反応が弱かったことは、再刺激のために使用される抗原（不活化、分割Ａ／Ｓｉｎｇ ＭＰＨおよび１７アミノ酸ペプチド）の性質が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激および検出に有利であったことを考慮すると驚くにはあたらなかった。
【0137】
本研究は、臨床におけるＭＡＰ投与量節約を実証した。ＨＤ－ＭＡＰの安全性および反応原性プロファイルは、同様のＨ１Ｎ１抗原、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（３、１８）を使用するシリコンナノパッチで観察される安全性および反応原性プロファイルと非常に類似しており、ワクチン接種から７日後も紅斑が依然として存在するという事実は、インフルエンザワクチンの皮内（ＩＤ）送達とも一致している。上腕または前腕の掌側表面へのＨＤ‐ＭＡＰ適用後にＨＡＩまたはＭＮＴ反応における差異は認められなかった。
【0138】
血清保護および血清変換された被験者の割合に関して、本研究におけるＨＤ－ＭＡＰ送達によって誘導されたＨＡＩ反応は、不活化インフルエンザワクチン（ＩＩＶ）の針および注射器を使用した筋肉内注射で以前に認められたＨＡＩ反応と類似していた。しかしながら、初期の８日時点でのより高いＨＡＩ力価によって示されるようなＨＤ－ＭＡＰ送達で見られるより迅速な抗体反応は、皮内注射部位をＴＬＲ７アゴニスト（３４）である局所アジュバントイミキモドを用いて前処置しない限り、ＩＩＶの皮内注射では認められていない。ワクチン接種後すぐに季節性インフルエンザまたはトラベルワクチンを送達するためにＨＤ－ＭＡＰを使用することによってより高い力価を獲得することは、ワクチンを受ける者にとって有益であり、パンデミックインフルエンザ株に対するワクチンおよび感染爆発の対応で使用されるワクチンに適用することが示された場合、特に貴重であるだろう。
【0139】
特定地域および世界的なインフルエンザの流行の影響を抑えるために、現在の季節性ワクチンよりも幅広く防御効果を発揮し、より長時間持続する免疫を誘導する１インフルエンザワクチンが必要とされている。研究から、ＡＤＣＣ媒介抗体は中和抗体が結合するエピトープよりも保存されているエピトープを認識し、異種株に対する防御に寄与する可能性があることが示唆されている。ＡＤＣＣ誘導能力を有する抗体の誘導は、ＩＭ注射と比較してＨＤ－ＭＡＰを用いてワクチン接種された群で観察される力価がわずかに高いというＨＡＩおよびＭＮデータに対する反応と同様の反応パターンに従っていた。ＨＡ－スタークおよび歴史的なＨ１Ｎ１ ＨＡプローブを認識するＢ細胞の頻度もまた、ＨＤ‐ＭＡＰワクチンの筋肉内注射後に同程度増加した。
【0140】
いくつかのＨＤ－ＭＡＰ群は、筋肉内注射と比較して、ワクチン接種後８、２２および６１日目で統計的により高い反応を示し、１／６投与量で、全投与量筋肉内注射と同等の抗体レベルを引き起こした。
【0141】
合成ポリマーＭＡＰワクチンは、被験者にとって安全かつ許容可能である。ＭＡＰは分裂不活化Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５（Ｈ１Ｎ１）ウイルス抗原（２．５μｇのＨＡ）をヒトの皮膚に送達することができ、従来の１５．０μｇのＨＡ筋肉内ワクチン接種によって生成されるＨＡ特異的抗体反応と同等のＨＡ特異的抗体反応を獲得し得る。この６倍の投与量の低減はワクチンの費用を低減できることを意味し、特にパンデミックの場合のように入手可能な抗原が制限されている場合には、より多くのワクチンを入手可能にすることができる可能性がある。さらに、インフルエンザワクチンに加えて大部分のワクチンについてもこれらの投与量の低減が可能であるならば、抗子宮頸癌ワクチンのような高価なワクチンの費用を削減することが、資源の乏しい国々がこれらの高価なワクチンを容易に入手するのに役立つであろう。
【0142】
２．５μｇのＨＡという低投与量のＭＡＰ送達は、ＩＭ ＱＩＶ（１５μｇのＨＡ／投与量）と同様のＨＡＩおよびＭＮＴ力価を誘導した。８日目の血清変換率および血清保護率は、ＭＡＰ送達でより高い。ＭＡＰの前腕および上腕への適用との間で違いは見られなかった。ＭＡＰは、優れた高温安定性を有する。
【0143】
本明細書および後続する特許請求の範囲全体を通して、文脈上別段の要求がない限り、「備える（comprise）」という語および「備える（comprises）」または「備えている（comprising）」などの変形型は、記載される整数、整数の群または工程を含むことを意味すると理解されるが、他の整数または整数の群を除外するものではない。本明細書で使用される場合、別段の記載がない限り、「約」という語は±２０％を意味する。
【0144】
当業者であれば、多数の変形および改変は見かけ上となることを理解するであろう。当業者にとって見かけ上のこのような全ての変形および改変は、本発明が以前に広く説明した精神および範囲内に入ると考えられるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0145】
【図1】図１Ａは、ポリマー微小突起アレイパッチの写真である。図１Ｂは、インクジェットコーティング法を用いてワクチンでコーティングされたポリマーアレイの微小突起の写真である。図１Ｃは、微小突起アレイアプリケーターの写真である。図１Ｄは、アプリケーターを用いた前腕への微小突起アレイの適用の写真である。
【図6】図６は、研究Ａにおけるいくつかのワクチン製剤についての、１日目対２２日目の赤血球凝集素阻害力価のプロットである。ここで、記号ＮＰは、微小突起アレイ皮内投与であり、かつＩＭは、筋肉内注射である、
【図9】図９は、研究１日目（ワクチン接種前）、４、８、２２および６１日目におけるパートＢおける被験者の赤血球凝集阻止（ＨＡＩ）力価のプロットである。パートＢおける被験者は、以下を用いてワクチン接種された：手掌側前腕（volar forearm）に適用されたＨＤ－ＭＡＰにより送達される、１５、１０、５、または２．５μｇＨＡ／投与量のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１（ＭＡＰ－ＦＡ－１５、ＭＡＰ－ＦＡ－１０、ＭＡＰ－ＦＡ－５、ＭＡＰ－ＦＡ－２．５）；未コーティングのＨＤ－ＭＡＰ（ＭＡＰ－ＦＡ－０）；上腕（upper arm）に適用されたＨＤ－ＭＡＰにより送達される１５μｇＨＡ／投与量のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１（ＭＡＰ－ＵＡ－１５）；またはＡｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価ワクチンの構成要素としての筋肉内注射（ＩＭ－ＱＩＶ－１５）。記号は幾何平均抗体価（ＧＭＴ）を表し、エラーバーは９５％信頼区間を示す。
【図10】図１０は、以下を用いたワクチン接種後、１日目（ワクチン接種前）および２２日目におけるパートＢおける被験者のマイクロ中和力価のプロットである：手掌側前腕に適用されたＨＤ－ＭＡＰにより送達される、１５、１０、５、または２．５μｇＨＡ／投与量のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１（ＭＡＰ－ＦＡ－１５、ＭＡＰ－ＦＡ－１０、ＭＡＰ－ＦＡ－５、ＭＡＰ－ＦＡ－２．５）；未コーティングのＨＤ－ＭＡＰ（ＭＡＰ－ＦＡ－０）；上腕に適用されたＨＤ－ＭＡＰにより送達される１５μｇＨＡ／投与量のＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１（ＭＡＰ－ＵＡ－１５）；またはＡｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価ワクチンの構成要素としての筋肉内注射（ＩＭ－ＱＩＶ－１５）。棒グラフはＧＭＴを表し、記号は各被験者の力価を表し、エラーバーは９５％信頼区間を示す。
【図11A】図１１Ａは、中点ＥＬＩＳＡ力価のプロットであり、図１１Ｂは、ＨＡ特異的ＦｃＲ結合抗体についての１日目に対する２２日目の中点力価の倍数変化のプロットである。二量体の可溶性組換えＦｃγＲＩＩＩに関与するＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５一価精製収穫物に対して特異的な抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した。記号は１日目前および２２日目後の免疫化の個々の応答を表し、水平線は中間反応（media response）を示す（Ａ）；エラーバーを有する棒グラフは四分位数間領域を伴う中央値を表す（Ｂ）。
【図11B】図１１Ａは、中点ＥＬＩＳＡ力価のプロットであり、図１１Ｂは、ＨＡ特異的ＦｃＲ結合抗体についての１日目に対する２２日目の中点力価の倍数変化のプロットである。二量体の可溶性組換えＦｃγＲＩＩＩに関与するＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５一価精製収穫物に対して特異的な抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した。記号は１日目前および２２日目後の免疫化の個々の応答を表し、水平線は中間反応（media response）を示す（Ａ）；エラーバーを有する棒グラフは四分位数間領域を伴う中央値を表す（Ｂ）。
【図12】図１２は、唾液試料中のインフルエンザ特異的ＩｇＡ力価のプロットである。被験者は、以下のいずれかを用いてワクチン接種された：ＨＤ－ＭＡＰにより手掌側前腕（ＭＡＰ‐ＦＡ‐１５）または上腕（ＭＡＰ‐ＵＡ‐１５）へ送達される１５μｇのＡ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／ＧＰ１９０８／２０１５ Ｈ１Ｎ１、またはＡｆｌｕｒｉａ（登録商標）四価ワクチン（ＩＭ－ＱＩＶ－１５）の構成要素としての筋肉内注射または未コーティングのＨＤ－ＭＡＰ（ＭＡＰ－ＦＡ－０）。ワクチン接種前（１日目）、４日目、８日目および２２日目の４つの時点で測定した。各時点についての群ごとの吸光度を平均し、１日目と比較した。そして、ワクチン接種前（１日目）と比較した倍数変化をプロット表示した。記号は群ごとの全被験者の平均を表し、エラーバーは９５％信頼区間を示す。
【図13A】図１３Ａ～１３Ｆは、ワクチン接種前後の記憶細胞（ＭＢＣ）の頻度のプロットである。ＨＡ特異的ＭＢＣの頻度を、フローサイトメトリーによって、低温保存したＰＭＢＣ試料中で評価した。生きたＣＤ１９＋、ＩｇＤ－Ｂ細胞について試料をゲートし、特異性を、単独での、またはＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９もしくは安定化Ｈ１Ｎ１ステムプローブと組み合わせての、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５プローブへの結合に基づいて決定した。図１３Ａおよび１３Ｂは、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５ Ｈ１Ｎ１である；図１３Ｃおよび１３Ｄは、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９である；図１３Ｅおよび１３ＦはＨ１ステムである。結果は、図１３Ａ、１３Ｃおよび１３Ｅ中、１日目および２２日目のプローブ結合細胞の頻度として表され、記号は１日目前および２２日目後の免疫化の個々の応答を表し、水平線は中間反応を示す。一方、基準値と比較した２２日目の倍数変化が図１３Ｂ、１３Ｄおよび１３Ｆに示され、棒グラフは倍数変化の中央値を表し、エラーバーは四分位数間領域を伴う中央値を表す。
【図13B】図１３Ａ～１３Ｆは、ワクチン接種前後の記憶細胞（ＭＢＣ）の頻度のプロットである。ＨＡ特異的ＭＢＣの頻度を、フローサイトメトリーによって、低温保存したＰＭＢＣ試料中で評価した。生きたＣＤ１９＋、ＩｇＤ－Ｂ細胞について試料をゲートし、特異性を、単独での、またはＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９または安定化Ｈ１Ｎ１ステムプローブと組み合わせての、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５プローブへの結合に基づいて決定した。図１３Ａおよび１３Ｂは、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５ Ｈ１Ｎ１である；図１３Ｃおよび１３Ｄは、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９である；図１３Ｅおよび１３ＦはＨ１ステムである。結果は、図１３Ａ、１３Ｃおよび１３Ｅ中、１日目および２２日目のプローブ結合細胞の頻度として表され、記号は１日目前および２２日目後の免疫化の個々の応答を表し、水平線は中間反応を示す。一方、基準値と比較した２２日目の倍数変化が図１３Ｂ、１３Ｄおよび１３Ｆに示され、棒グラフは倍数変化の中央値を表し、エラーバーは四分位数間領域を伴う中央値を表す。
【図13C】図１３Ａ～１３Ｆは、ワクチン接種前後の記憶細胞（ＭＢＣ）の頻度のプロットである。ＨＡ特異的ＭＢＣの頻度を、フローサイトメトリーによって、低温保存したＰＭＢＣ試料中で評価した。生きたＣＤ１９＋、ＩｇＤ－Ｂ細胞について試料をゲートし、特異性を、単独での、またはＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９または安定化Ｈ１Ｎ１ステムプローブと組み合わせての、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５プローブへの結合に基づいて決定した。図１３Ａおよび１３Ｂは、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５ Ｈ１Ｎ１である；図１３Ｃおよび１３Ｄは、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９である；図１３Ｅおよび１３ＦはＨ１ステムである。結果は、図１３Ａ、１３Ｃおよび１３Ｅ中、１日目および２２日目のプローブ結合細胞の頻度として表され、記号は１日目前および２２日目後の免疫化の個々の応答を表し、水平線は中間反応を示す。一方、基準値と比較した２２日目の倍数変化が図１３Ｂ、１３Ｄおよび１３Ｆに示され、棒グラフは倍数変化の中央値を表し、エラーバーは四分位数間領域を伴う中央値を表す。
【図13D】図１３Ａ～１３Ｆは、ワクチン接種前後の記憶細胞（ＭＢＣ）の頻度のプロットである。ＨＡ特異的ＭＢＣの頻度を、フローサイトメトリーによって、低温保存したＰＭＢＣ試料中で評価した。生きたＣＤ１９＋、ＩｇＤ－Ｂ細胞について試料をゲートし、特異性を、単独での、またはＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９または安定化Ｈ１Ｎ１ステムプローブと組み合わせての、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５プローブへの結合に基づいて決定した。図１３Ａおよび１３Ｂは、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５ Ｈ１Ｎ１である；図１３Ｃおよび１３Ｄは、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９である；図１３Ｅおよび１３ＦはＨ１ステムである。結果は、図１３Ａ、１３Ｃおよび１３Ｅ中、１日目および２２日目のプローブ結合細胞の頻度として表され、記号は１日目前および２２日目後の免疫化の個々の応答を表し、水平線は中間反応を示す。一方、基準値と比較した２２日目の倍数変化が図１３Ｂ、１３Ｄおよび１３Ｆに示され、棒グラフは倍数変化の中央値を表し、エラーバーは四分位数間領域を伴う中央値を表す。
【図13E】図１３Ａ～１３Ｆは、ワクチン接種前後の記憶細胞（ＭＢＣ）の頻度のプロットである。ＨＡ特異的ＭＢＣの頻度を、フローサイトメトリーによって、低温保存したＰＭＢＣ試料中で評価した。生きたＣＤ１９＋、ＩｇＤ－Ｂ細胞について試料をゲートし、特異性を、単独での、またはＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９または安定化Ｈ１Ｎ１ステムプローブと組み合わせての、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５プローブへの結合に基づいて決定した。図１３Ａおよび１３Ｂは、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５ Ｈ１Ｎ１である；図１３Ｃおよび１３Ｄは、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９である；図１３Ｅおよび１３ＦはＨ１ステムである。結果は、図１３Ａ、１３Ｃおよび１３Ｅ中、１日目および２２日目のプローブ結合細胞の頻度として表され、記号は１日目前および２２日目後の免疫化の個々の応答を表し、水平線は中間反応を示す。一方、基準値と比較した２２日目の倍数変化が図１３Ｂ、１３Ｄおよび１３Ｆに示され、棒グラフは倍数変化の中央値を表し、エラーバーは四分位数間領域を伴う中央値を表す。
【図13F】図１３Ａ～１３Ｆは、ワクチン接種前後の記憶細胞（ＭＢＣ）の頻度のプロットである。ＨＡ特異的ＭＢＣの頻度を、フローサイトメトリーによって、低温保存したＰＭＢＣ試料中で評価した。生きたＣＤ１９＋、ＩｇＤ－Ｂ細胞について試料をゲートし、特異性を、単独での、またはＡ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９または安定化Ｈ１Ｎ１ステムプローブと組み合わせての、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５プローブへの結合に基づいて決定した。図１３Ａおよび１３Ｂは、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／２０１５ Ｈ１Ｎ１である；図１３Ｃおよび１３Ｄは、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／１９９９である；図１３Ｅおよび１３ＦはＨ１ステムである。結果は、図１３Ａ、１３Ｃおよび１３Ｅ中、１日目および２２日目のプローブ結合細胞の頻度として表され、記号は１日目前および２２日目後の免疫化の個々の応答を表し、水平線は中間反応を示す。一方、基準値と比較した２２日目の倍数変化が図１３Ｂ、１３Ｄおよび１３Ｆに示され、棒グラフは倍数変化の中央値を表し、エラーバーは四分位数間領域を伴う中央値を表す。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図13E】
【図13F】
【国際調査報告】