(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-07-28
(54)【発明の名称】細菌を改変するための最適化された遺伝子ツール
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20220721BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20220721BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20220721BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220721BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20220721BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220721BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20220721BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20220721BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20220721BHJP
C12R 1/145 20060101ALN20220721BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C12N15/11 Z
C12N1/20 A
C12N1/20 Z
C12N1/21
C12N1/00 U
C12N15/09 110
C12N15/55
C12M1/00 A
C12N15/63 Z
C12R1:145
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021569371
(86)(22)【出願日】2020-05-22
(85)【翻訳文提出日】2022-01-07
(86)【国際出願番号】 FR2020050853
(87)【国際公開番号】W WO2020240122
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】1905485
(32)【優先日】2019-05-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521268923
【氏名又は名称】イエフペ・エネルジ・ヌーヴェル
【氏名又は名称原語表記】ＩＦＰ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ ｎｏｕｖｅｌｌｅｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】ロペス フェレイラ，ニコラ
(72)【発明者】
【氏名】オック，レミ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァゼル，フランソワ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA23
4B029BB02
4B029CC01
4B029GA03
4B029GA08
4B029GB06
4B029GB10
4B065AA23X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA02
4B065CA46
4B065CA60
(57)【要約】
本発明は、ファーミキューテス門に属する細菌の形質転換および遺伝子改変に関するものである。特に、細菌の形質転換を促進するために用いられる核酸配列であって、i）配列番号１２６の全部または一部と、ii）細菌の遺伝子の改変および／または該細菌内で、細菌の野生型内に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の発現を可能にする配列とを含む核酸配列を含む、かかる遺伝子改変を可能にする方法、ツールおよびキットに関する。また、本発明の記載は、得られた遺伝子組換え細菌およびその用途、特に、好ましくは工業的規模での溶媒の生産に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
２０１９年２月２０日に寄託番号ＬＭＧ Ｐ－３１２７７でＢＣＣＭ－ＬＭＧコレクションに登録された細菌クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）またはその遺伝子組換え体。
【請求項2】
i）配列番号１２６の全部または一部と、ii）細菌の遺伝子の改変および／または該細菌において、該細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の発現を可能にする配列とを含む、核酸。
【請求項3】
前記細菌の遺伝子の改変を可能にする配列が、相同組換え機序により、該細菌の遺伝子の一部を目的の配列に置換することを可能にする改変マトリックスであることを特徴とする、請求項２に記載の核酸。
【請求項4】
iii）ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコード化する配列、および／またはiv）１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、各ｇＲＮＡは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼに固定するためのＲＮＡ構造と、細菌の遺伝子の標的化部分の相補的配列とを含むことを特徴とする、請求項２または３に記載の核酸。
【請求項5】
前記核酸が、発現カセットおよびベクターから選択され、好ましくはプラスミドであり、例えば、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２４および配列番号１２５から選択される配列を有するプラスミドであることを特徴とする、請求項２から４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項6】
細菌を形質転換し、遺伝子改変するための遺伝子ツールであって、少なくとも－少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする第１の核酸であって、該ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列がプロモーターの制御下に置かれている、第１の核酸、および
－請求項２から５のいずれか一項に記載の第２の核酸
を含むことを特徴とし、ここで、遺伝子ツールの該核酸の少なくとも１つが、好ましくは、誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列をさらに含むか、または、遺伝子ツールが、誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む、
遺伝子ツール。
【請求項7】
前記第１の核酸が１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらにコードすること、または前記遺伝子ツールが１以上のｇＲＮＡをさらに含むことを特徴とする、請求項６に記載の遺伝子ツール。
【請求項8】
細菌を形質転換し、かつ所望により細菌を遺伝子改変するための、請求項２から６のいずれか一項に記載の核酸の使用、あるいは請求項６または７に記載の遺伝子ツールの使用。
【請求項9】
請求項２から５のいずれか一項に記載の核酸を該細菌に導入することにより、該細菌を形質転換する工程を含むことを特徴とする、遺伝子組換えのためのツールを用いて細菌を形質転換し、好ましくは遺伝子改変する、方法。
【請求項10】
前記細菌が、ファーミキューテス門（Firmicutes）に属し、好ましくはクロストリジウム属（Clostridium）、バチルス属（Bacillus）またはラクトバチルス属（Lactobacillus）に属することを特徴とする、請求項２から５のいずれか一項に記載の核酸、請求項６または７に記載の遺伝子ツール、請求項８に記載の使用、あるいは請求項９に記載の方法。
【請求項11】
細菌がクロストリジウム属の細菌であり、好ましくは、C. acetobutylicum, C. cellulolyticum, C. phytofermentans, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. sporogenes, C. butyricum, C. aurantibutyricum, C. tyrobutyricumから選択される溶媒生成細菌であるか、またはC. aceticum, C. thermoaceticum, C. ljungdahlii, C. autoethanogenum, C. difficile, C. scatologenes およびC. carboxydivoransから選択されるアセテート生成細菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の核酸、遺伝子ツール、使用または方法。
【請求項12】
前記細菌が、プラスミドｐＮＦ２を欠く細菌C.beijerinckiiであり、好ましくは、ＤＳＭ ６４２３、ＬＭＧ ７８１４、ＬＭＧ ７８１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５９３、ＮＣＣＢ ２７００６から選択されるサブクレード、およびＤＳＭ ６４２３株と少なくとも９５％、好ましくは９７％の同一性を有するサブクレードであることを特徴とする、請求項１０または１１に記載の核酸、遺伝子ツール、使用または方法。
【請求項13】
細菌を形質転換し、好ましくは遺伝子組み換えするためのキット、または細菌を用いて少なくとも１つの溶媒を製造するためのキットであって、ここで、請求項２から５のいずれか一項に記載の核酸と、請求項６または７に記載の遺伝子ツールで使用される、選択された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現の誘導性プロモーターに適した少なくとも１つの誘導剤とを含む、キット。
【請求項14】
工業的規模での溶媒または溶媒の混合物、好ましくはアセトン、ブタノール、エタノール、イソプロパノールまたはそれらの混合物、一般的にはイソプロパノール／ブタノール混合物の製造を可能にするための、請求項２から５のいずれか一項に記載の核酸の使用、請求項６または７に記載の遺伝子ツールの使用、請求項９に記載の方法の使用あるいは請求項１３に記載のキットの使用。
【請求項15】
請求項９から１２の一項に記載の方法によって得られる細菌C.beijerinckiiであって、該細菌が配列番号１８のｃａｔＢ遺伝子およびプラスミドｐＮＦ２を欠くことを特徴とする、細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌の形質転換および遺伝子改変に関し、特にファーミキューテス門（phylum Firmicutes）に属する細菌、一般的には、例えばクロストリジウム属（genus Clostridium）の溶媒生成（solventogenic）細菌、好ましくは、野生状態で細菌の染色体および該染色体ＤＮＡとは異なる少なくとも１つのＤＮＡ分子（または天然プラスミド）の両方を有する細菌の形質転換および遺伝子改変に関する。従って、本発明は、このような遺伝子改変を可能にする方法、ツールおよびキットに関し、特に、細菌の形質転換を促進するために用いられる核酸配列であって、該配列が、i）配列番号１２６の全部または一部と、ii）細菌の遺伝子の改変および／または前記細菌の野生型内に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の該細菌内での発現を可能にする配列とを含む、核酸配列を含む、方法、ツールおよびキットに関する。また、本発明は、得られた遺伝子組換え細菌およびその使用、特に、好ましくは工業的規模での溶媒の生産に関する。
【背景技術】
【0002】
技術的背景
クロストリジウム属は、グラム陽性であり、かつ厳密に嫌気性であり、かつ胞子を形成する細菌であり、かつファーミキューテス門に属している。クロストリジウム属細菌は、いくつかの理由で科学界にとって重要な細菌群である。第一に、いくつかの重篤な疾患（例えば、破傷風、ボツリヌス菌感染）の原因が、この科の病原菌メンバーによる感染であるからである（John & Wood, 1986; Gonzales et al., 2014）。第二に、いわゆる酸生成細菌株（acidogenic strain）または溶媒生成細菌株（solventogenic strain）をバイオテクノロジーで用いる可能性があるからである（Moon et al., 2016）。これらの非病原性クロストリジウム綱(Clostridia)は、ＡＢＥ発酵と称されるプロセスにおいて、多種多様な糖を変換して目的の化合物、より具体的にはアセトン、ブタノール、エタノールを生産する能力を自然に有している（John & Wood, 1986）。同様に、特定の種ではＩＢＥ発酵も可能であり、これらの株のゲノムに二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(s-ADH; Ismael et al., 1993, Hiu et al., 1987)が存在するため、アセトンは、イソプロパノール生成に比例して還元される（Chen et al., 1986、George et al., 1983）。
クロストリジウム属は、グラム陽性であり、かつ厳密に嫌気性であり、かつ胞子を形成する細菌であり、かつファーミキューテス門に属している。クロストリジウム属細菌は、いくつかの理由で科学界にとって重要な細菌群である。第一に、いくつかの重篤な疾患（例えば、破傷風、ボツリヌス菌感染）の原因が、この科の病原菌メンバーによる感染であるからである（John & Wood, 1986; Gonzales et al., 2014）。第二に、いわゆる酸生成細菌株（acidogenic strain）または溶媒生成細菌株（solventogenic strain）をバイオテクノロジーで用いる可能性があるからである（Moon et al., 2016）。これらの非病原性クロストリジウム綱(Clostridia)は、ＡＢＥ発酵と称されるプロセスにおいて、多種多様な糖を変換して目的の化合物、より具体的にはアセトン、ブタノール、エタノールを生産する能力を自然に有している（John & Wood, 1986）。同様に、特定の種ではＩＢＥ発酵も可能であり、これらの株のゲノムに二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(s-ADH; Ismael et al., 1993, Hiu et al., 1987)が存在するため、アセトンは、イソプロパノール生成に比例して還元される（Chen et al., 1986、George et al., 1983）。
【0003】
クロストリジウム綱の溶媒生成種には重要な表現型の類似性があり、最新の配列決定技術が登場するまでは分類が困難であった（Rogers et al. 2006）。現在では、これらの細菌の完全なゲノムの配列決定が可能になったことで、この細菌属を４つの主要な種に分類することができる：C. acetobutylicum, C. saccharoperbutylacetonicum, C. saccharobutylicum, C. beijerinckii。最近の論文では、３０株の完全なゲノムを比較解析した結果、これらの溶媒生成クロストリジウム綱を４つの主要な群（clade）に分類することが提案されている（図１）。
【0004】
特に、これらの群は、C. acetobutylicumおよびC. beijerinckiiの２種を、それぞれ対照株C. acetobutylicum ATCC 824 (DSM 792またはLMG 5710とも称される)およびC. beijerinckii NCIMB 8052に分けている。後者は、ＡＢＥ発酵を研究するためのモデル株である。
【0005】
ＩＢＥ発酵をもたらし得る天然のクロストリジウム株は数が少なく、主にクロストリジウム・ベイジェリンキイ種に属する（Zhang et al., 2018, 表１参照）。これらの菌株は、一般的には、C. butylicum LMD 27.6株、C. aurantibutylicum NCIB 10659株、C. beijerinckii LMD 27.6株、C. beijerinckii VPI2968株、C. beijerinckii NRRL B-593株、C. beijerinckii ATCC 6014、C. beijerinckii McClung 3081、C. isopropylicum IAM 19239、C. beijerinckii DSM 6423、C. sp. A1424、C. beijerinckii optinoii、およびC. beijerinckii BGS1から選択される。
【0006】
細菌は１世紀以上にわたって産業界で利用されてきたが、特にクロストリジウム属に属する細菌については、それらを遺伝的に改変することが困難なため、長い間、知識が限られていた。近年、クロストリジウム属の菌株を最適化するためのさまざまな遺伝学的ツールが開発されているが、中でもＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート；Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）技術を用いたものが最新のものである。この方法は、ヌクレアーゼと呼ばれる酵素（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝学的ツールの場合、一般的にはＣａｓタイプのヌクレアーゼ、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のタンパク質Ｃａｓ９）を用いることに基づいており、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ分子に導かれて、ＤＮＡ分子（目的の標的配列）内で二本鎖切断を行い得る。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の配列は、ヌクレアーゼの切断部位を決定し、顕著に高い特異性を与える（図１）。
【0007】
生物にとって必須のＤＮＡ分子内の二本鎖切断は致命的であるため、二本鎖切断後の生存はその修復能力に依存する（例えば、Cui & Bikard, 2016）。クロストリジウム属の細菌では、二本鎖切断の修復は、切断された配列の無傷のコピーを必要とする相同組換え機序に依存する。この修復を可能にするＤＮＡ断片を細菌に供給し、元の配列を改変することで、微生物に望ましい変化をそのゲノムに挿入することができる。行われた改変は、標的配列またはＰＡＭ部位の改変により、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体によるゲノムＤＮＡの標的化をその後は不可能にする（図２）。
【0008】
この遺伝学的ツールをクロストリジウム属の細菌で機能させるための様々なアプローチが既に報告されている。実際に、これらの微生物は、形質転換および相同組換えの頻度が低いため、遺伝的な改変が難しいことが知られている。いくつかのアプローチは、C.beijerinckiiおよびC.ljungdahliiでは構成的に発現されるか（Wang et al., 2015; Huang et al., 2016）、またはC.beijerinckii、C.saccharoperbutylacetonicumおよびC.authoethanogenumでは誘導性プロモーターの制御下で発現される、Ｃａｓ９の使用に基づいている（Wang et al., 2016; Nagaraju et al., 2016; Wang et al., 2017）。他の文献は、ゲノム内で二本鎖切断の代わりに一本鎖切断を行う、ヌクレアーゼの改変バージョンであるＣａｓ９ｎの使用について記載している（Xu et al., 2015; Li et al., 2016Xuら、2015；Liら、2016）。この選択は、試験された実験条件下でクロストリジウム属の細菌に用いられるには、Ｃａｓ９の毒性が高すぎるという観察結果によるものである。上記のツールのほとんどは、単一プラスミドの使用に基づいている。最終的には、例えばC. pasteurianumのように、微生物のゲノム内でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが同定されている場合には、内生のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いることも可能とされている（Pyne et al., 2016）
【0009】
（上記の最終ケースのように）改変されるべき株の内生機序を用いる場合を除き、ＣＲＩＳＰＲ技術に基づくツールは、細菌ゲノムに挿入され得る目的の核酸のサイズ（従って、コーディング配列または遺伝子の数）が大幅に制限されるという大きな欠点がある（Xu et al., 2015によれば、せいぜい約１．８ｋｂ）。
【0010】
本発明者らは、２つの異なる核酸、一般的には２つのプラスミドの使用に基づいて、クロストリジウム属の細菌に適した、細菌改変のためのより強力な遺伝学的ツールを開発し、公開しており（ＷＯ２０１７０６４４３９、Wasels et al., 2017、図３）、これは特にこの問題を解決する。特定の態様において、このツールの第１の核酸は、ｃａｓ９の発現を可能にし、達成されるべき修飾に特異的な第２の核酸は、１以上のｇＲＮＡ発現カセットならびにＣａｓ９によって標的とされる細菌ＤＮＡの一部を目的の配列で置換することを可能にする修復マトリックスを含む。このシステムの毒性は、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡ発現カセットを誘導可能なプロモーターの制御下に置くことで制限される。本発明者らは、最近、このツールを改良し、形質転換効率を顕著に大きく向上させ、その結果、（特に、工業規模での生産のためのロバスト株の選択について）有用な数および量の目的の遺伝子組換え細菌を得ることができた（ＦＲ１８／５４８３５６参照）。この改良型ツールでは、少なくとも１つの核酸が、誘導可能なプロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質（“ａｃｒ”）をコードする配列を含む。この抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体の活性を抑制することを可能にする。このタンパク質の発現は、細菌の形質転換の段階でのみ発現できるように調節されている。
【0011】
本発明者らはまた、ごく最近、野生状態で１以上の抗生物質に耐性を有する遺伝子を含む細菌を、前記抗生物質に感受性を持つように遺伝子組換えすることに成功し、少なくとも２つの核酸を用いた遺伝子ツールを容易に使用できるようになった。その結果、イソプロパノールを天然に生産するC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株を遺伝子組換えすることに成功した。特に、本明細書中“ｐＮＦ２”と記載されている、この菌株に必須ではない天然プラスミドを、この菌株から取り除くことに成功した（FR18/73492参照）。
【0012】
その後、本発明者らは、このプラスミドｐＮＦ２を除去することにより、遺伝子の導入効率（すなわち形質転換効率）が約１０1から５×１０３倍に向上した細菌C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３を得ることができることを発見し、本明細書で初めて開示する。以下に説明するように、本発明者らは、プラスミドｐＮＦ２の一部を用いて、細菌の遺伝子を改変することを可能にする、および／または細菌において、該細菌の野生型に存在する遺伝物質には存在しないＤＮＡ配列の発現を可能にする、配列を有する特定の核酸を設計することにより、少なくとも２つの核酸の使用に基づく遺伝子ツールを、再び非常に大きく改良することにも成功した。これらの核酸および新しいツールは、細菌の形質転換効率、特に、これまで野生状態で含有する天然プラスミドまたはプラスミドが枯渇していた細菌の形質転換効率を有益に改善する。
【0013】
本発明は、このようにして、形質転換効率を顕著に有利にし、したがって、特に工業的規模での細菌の利用を容易にする。
【発明の概要】
【0014】
発明の概要
本発明者らは、本明細書中、初めて、細菌の形質転換を容易にする（導入された遺伝子のすべての前記細菌内での維持を改善する）核酸（本明細書では核酸“ＯＰＴ”とも呼ばれる）を記載している。核酸ＯＰＴは、i）配列番号１２６の全部または一部と、ii）細菌の遺伝子の改変、および／または、前記細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の前記細菌内での発現を可能にする配列とを含む。配列番号１２６の配列は、本明細書中、核酸“ＯＲＥＰ”とも称される。
本発明者らは、本明細書中、初めて、細菌の形質転換を容易にする（導入された遺伝子のすべての前記細菌内での維持を改善する）核酸（本明細書では核酸“ＯＰＴ”とも呼ばれる）を記載している。核酸ＯＰＴは、i）配列番号１２６の全部または一部と、ii）細菌の遺伝子の改変、および／または、前記細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の前記細菌内での発現を可能にする配列とを含む。配列番号１２６の配列は、本明細書中、核酸“ＯＲＥＰ”とも称される。
【0015】
本発明者らは、特にC.beijerinckii ＤＳＭ６４２３菌内の配列ＯＲＥＰを抑制することにより、該菌内の核酸の形質転換の頻度を向上させることに成功し、また、この配列ＯＲＥＰの全部または一部を、菌の遺伝子の改変、および／または前記菌の野生型バージョンに存在する遺伝子から一部または全部が欠落したＤＮＡ配列の前記菌内での発現を可能にする、核酸および／または遺伝子ツールの構築に有利に使用することができる。
【0016】
配列ＯＲＥＰは、目的の核酸ＯＰＴの複製に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２７）を含む。この複製に関与するタンパク質はまた、本明細書中、タンパク質“ＲＥＰ”としても記載されている（配列番号１２８は“MNNNNTESEELKEQSQLLLDKCTKKKKKNPKFSSYIEPLVSKKLSERIKECGDFLQMLSDLNLENSKLHRASFCGNRFCPMCSWRIACKDSLEISILMEHLRKEESKEFIFLTLTTPNVKGADLDNSIKAYNKAFKKLMERKEVKSIVKGYIRKLEVTYNLDKSSKSYNTYHPHFHVVLAVNRSYFKKQNLYINHHRWLSLWQESTGDYSITQVDVRKAKINDYKEVYELAKYSAKDSDYLINREVFTVFYKSLKGKQVLVFSGLFKDAHKMYKNGELDLYKKLDTIEYAYMVSYNWLKKKYDTSNIRELTEEEKQKFNKNLIEDVDIE”）である。タンパク質ＲＥＰは、配列番号１２９の“COG 5655”（Plasmid rolling circle replication initiator protein REP）と呼ばれるファーミキューテス門の保存されたドメインを有する。
【0017】
細菌の遺伝物質を最適化して形質転換し、その後相同組換えにより改変することができる遺伝子ツール、および／またはファーミキューテス門に属する細菌、例えばクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバチルス属の細菌の物質に部分的または完全に存在しないＤＮＡ配列を前記細菌で発現させることができる遺伝子ツールも記載されている（Hidalgo-Cantabrana, C. et al.; Yadav, R. et al.）。
【0018】
特定の態様において、相同組換えによる改変のためのツールは、一般的には、
i）少なくとも、
－少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば酵素Ｃａｓ９をコードする“第１の”核酸であって、該ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列がプロモーターの制御下に置かれているもの、および
－相同組換えのメカニズムによって、エンドヌクレアーゼが標的とする細菌ＤＮＡの一部を目的の配列に置き換えることを可能にする修復マトリックスを含む少なくとも１つの“第２の”核酸
を含むことを特徴とし、ここで、
ii）前記核酸の少なくとも１つが、１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらにコードしているか、または遺伝子ツールが１以上のガイドＲＮＡをさらに含み、各ガイドＲＮＡが、ＤＮＡエンドヌクレアーゼに固定するためのＲＮＡ構造および細菌ＤＮＡの標的化部分の相補的配列を含み、好ましくは、
iii）前記核酸の少なくとも１つが、誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列をさらに含むか、または、遺伝子ツールが誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む、ことを特徴とする。
i）少なくとも、
－少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば酵素Ｃａｓ９をコードする“第１の”核酸であって、該ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列がプロモーターの制御下に置かれているもの、および
－相同組換えのメカニズムによって、エンドヌクレアーゼが標的とする細菌ＤＮＡの一部を目的の配列に置き換えることを可能にする修復マトリックスを含む少なくとも１つの“第２の”核酸
を含むことを特徴とし、ここで、
ii）前記核酸の少なくとも１つが、１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらにコードしているか、または遺伝子ツールが１以上のガイドＲＮＡをさらに含み、各ガイドＲＮＡが、ＤＮＡエンドヌクレアーゼに固定するためのＲＮＡ構造および細菌ＤＮＡの標的化部分の相補的配列を含み、好ましくは、
iii）前記核酸の少なくとも１つが、誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列をさらに含むか、または、遺伝子ツールが誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む、ことを特徴とする。
【0019】
特に、この種の遺伝子ツールは、少なくとも以下に記載されるものを含む：
－少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする“第１の”核酸であって、ここで、該ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列がプロモーターの制御下に置かれている核酸、および
－“核酸ＯＲＥＰ”の配列、すなわち、i）配列番号１２６の全部または一部、およびii）細菌の遺伝子の改変を可能にする、および／または前記細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の前記細菌における発現を可能にする配列を含む、あるいはそれらからなる“別の”核酸。
－少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする“第１の”核酸であって、ここで、該ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列がプロモーターの制御下に置かれている核酸、および
－“核酸ＯＲＥＰ”の配列、すなわち、i）配列番号１２６の全部または一部、およびii）細菌の遺伝子の改変を可能にする、および／または前記細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の前記細菌における発現を可能にする配列を含む、あるいはそれらからなる“別の”核酸。
【0020】
特定の態様において、上記の“修復マトリックスを含む第２の核酸”は、この“別の核酸”を含む。
【0021】
本発明者らはまた、ファーミキューテス門に属する細菌、例えばクロストリジウム属の細菌、バチルス属の細菌またはラクトバチルス属の細菌、一般的には溶媒生成細菌を形質転換し、好ましくは相同組換えにより遺伝子改変する方法、ならびに前記方法を用いて得られる（形質転換され、一般的に遺伝子改変される）バクテリアまたは細菌を記載している。この方法は、有利には、本明細書に記載の遺伝子ツール、特に、i）配列番号１２６の全部または一部、およびii）細菌の遺伝子の改変を可能にする、および／または前記細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の発現を可能にする配列を含むか、またはこれらからなる核酸（“核酸ＯＲＥＰ”）の全部または一部を前記細菌に導入することにより、前記細菌を形質転換する工程を含む。
【0022】
特定の態様において、この方法は、有利には、
ａ）好ましくは、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導するための薬剤の存在下で、本明細書に記載の遺伝子ツールを細菌に導入する工程、および
ｂ）工程ａ）の終わりに得られた形質転換された細菌を、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導するための薬剤を含まず、一般的にはＤＮＡエンドヌクレアーゼ／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体、例えばＣａｓ９／ｇＲＮＡの発現を可能にする培地上で、培養する工程
を含む。
ａ）好ましくは、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導するための薬剤の存在下で、本明細書に記載の遺伝子ツールを細菌に導入する工程、および
ｂ）工程ａ）の終わりに得られた形質転換された細菌を、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導するための薬剤を含まず、一般的にはＤＮＡエンドヌクレアーゼ／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体、例えばＣａｓ９／ｇＲＮＡの発現を可能にする培地上で、培養する工程
を含む。
【0023】
本発明者らはまた、ファーミキューテス門に属する細菌、例えばクロストリジウム属の細菌、バチルス属の細菌、ラクトバチルス属の細菌を形質転換し、好ましくは遺伝子改変するためのキット、またはこのような細菌を用いて少なくとも１つの溶媒、例えば溶媒の混合物を製造するためのキットを記載している。本キットは、好ましくは、本明細書に記載の核酸と、本明細書に記載の遺伝子ツールで用いられる選択された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現の誘導性プロモーターに適した誘導剤とを含む。特定の態様において、キットは、本明細書中に記載の遺伝子ツールの要素の全部または一部を含む。
【0024】
また、ファーミキューテス門に属する細菌、例えばクロストリジウム属の細菌、バチルス属の細菌、ラクトバチルス属の細菌、好ましくは野生状態で細菌染色体および染色体ＤＮＡとは異なる少なくとも１つのＤＮＡ分子（一般的には天然プラスミド）の両方を有する細菌を形質転換し、要すれば遺伝子改変するための、本明細書にて初めて開示される核酸または遺伝子ツールの使用も記載されている。
【0025】
また、好ましくは工業的規模で、溶媒または溶媒混合物、好ましくはアセトン、ブタノール、エタノール、イソプロパノールまたはそれらの混合物、一般的にはイソプロパノール／ブタノール、ブタノール／エタノールまたはイソプロパノール／エタノールの混合物の生産を可能にするために、核酸、遺伝子ツール、そのような細菌を形質転換し、好ましくは遺伝子的に改変する方法、この種の方法で得られた細菌、および／またはキットの使用も、本明細書において初めて記載されている。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】図１は、ヌクレアーゼであるＣａｓ９を用いて、ｇＲＮＡに導かれてゲノムＤＮＡに１以上の二本鎖切断を作成する、遺伝子ツールとしてゲノム編集に用いられるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを示す。ｇＲＮＡはガイドＲＮＡ、ＰＡＭはProtospacer Adjacent Motifを意味する。図はJinek et al., 2012より引用した。
【図3】図３は、クロストリジウムにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の利用を示す。ｅｒｍＢは、エリスロマイシン耐性遺伝子であり、ｃａｔＰ（配列番号７０）は、チアンフェニコール／クロラムフェニコール耐性遺伝子であり、ｔｅｔＲは、発現産物がＰｃｍ－ｔｅｔＯ２／１から始まる転写を抑制する遺伝子であり、Ｐｃｍ－２ｔｅｔＯ１およびＰｃｍ－ｔｅｔＯ２/１は、アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーター“ａＴｃ”（Dong et al., 2012）であり、ｍｉｎｉＰｔｈｌは、構成的プロモーター（Dong et al., 2012）である。
【図4】図４は、ｐＣａｓ９ａｃｒプラスミドマップ（配列番号２３）を示す。 ｅｒｍＢ、エリスロマイシン耐性遺伝子；ｒｅｐ、大腸菌の複製起点；ｒｅｐＨ、C. acetobutylicumの複製起点；Ｔｔｈｌ、チオラーゼターミネーター；ｍｉｎｉＰｔｈｌ、構成的プロモーター（Dong et al., 2012）；Ｐｃｍ－ｔｅｔＯ２／１、ｔｅｔＲの産物によって抑制され、かつアンヒドロテトラサイクリンによって誘導されるプロモーター“ａＴｃ”（Dong et al., 2012)；Ｐｂｇａｌ、ｌａｃＲの産物によって抑制され、かつラクトースによって誘導されるプロモーター（Hartman et al., 2011）；ａｃｒＩＩＡ４、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質ＡｃｒＩＩ１４をコードする遺伝子；ｂｇａＲ、その発現産物がＰｂｇａｌから始まる転写を抑制する遺伝子。
【図5】図５は、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（配列番号２２）またはｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３）を含むC. acetobutylicum ＤＳＭ７９２の形質転換の相対的割合を示す。頻度は、ｐＥＣ７５０Ｃ（配列番号１０６）の形質転換の頻度と比較して、形質転換に用いたＤＮＡ１μｇあたりに得られた形質転換体の数で表し、少なくとも２回の独立した実験の平均値を示す。
【0027】
【図8】図８は、Poehlein et al., 2017の記載に従って、Clostridiumの３０の溶媒生成株の分類を示す。なお、サブクレード（subclade）のC. beijerinckii ＮＲＲＬ Ｂ－５９３はまた、文献上ではC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３として定義されている。
【図16】図１６は、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株を細菌で形質転換して得られたクローンにおける遺伝子ｃａｔＢのＰＣＲ増幅を示す。該株が遺伝子ｃａｔＢを保持している場合は約１．５ｋｂが増幅され、該遺伝子が欠失している場合は約９００ｂｐが増幅される。
【図18】図１８は、ｐＣａｓ９ａｃｒおよびｕｐｐを標的とするｇＲＮＡの発現プラスミドを含む菌株C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３の形質転換体において、修復マトリクスの有無にかかわらず、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ａｃｒシステムを誘導することを示す。凡例：Ｅｍ、エリスロマイシン；Ｔｍ、チアンフェニコール；ａＴｃ、アンヒドロテトラサイクリン；ＮＤ、希釈しない。
【図19】図１９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３の遺伝子座ｕｐｐの改変を示す。図１９Ａは、遺伝子、ｇＲＮＡの標的部位および修復マトリクスを、ゲノムＤＮＡ上の対応するホモロジー領域と関連付けて、遺伝子座ｕｐｐの遺伝子構成を示す。ＰＣＲで確認するためのプライマー（ＲＨ０１０およびＲＨ０１１）のハイブリダイゼーション部位も示される。図１９Ｂは、プライマーＲＨ０１０およびＲＨ０１１を用いた遺伝子座ｕｐｐの増幅を示す。野生型遺伝子の場合は、１６８０ｂｐの増幅が予想されるのに対し、改変遺伝子ｕｐｐの場合は１０９０ｂｐである。Ｍ、１００ｂｐ－３ｋｂサイズマーカー（Lonza）；ＷＴ、野生型株。
【0028】
【図24】図２４は、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株におけるプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ ２０μｇの形質転換効率（形質転換したＤＮＡ１μｇ当たりに観察されたコロニー数）を示す。エラーバーは、バイオロジカルトリプリケートの平均値の標準誤差を示す。
【図30】図３０は、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３の３つの菌株におけるプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄの形質転換効率（形質転換したＤＮＡ１μｇ当たりに観察されたコロニー数）を示す。エラーバーは、バイオロジカルデュプリケートの平均値の標準偏差に対応する。
【図31】図３１は、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３由来の２つの菌株におけるプラスミドｐＥＣ７５０Ｃの形質転換効率（形質転換したＤＮＡ１μｇ当たりに観察されたコロニー数）を示す。エラーバーは、バイオロジカルデュプリケートの平均値の標準偏差に対応する。
【発明を実施するための形態】
【0029】
発明の詳細な説明
溶媒生成細菌、特にクロストリジウム属の細菌は、１世紀以上に亘って産業界で利用されてきたが、遺伝子組換えが困難なため、その知識は限られている。例えば、イソプロパノールを天然に生産するクロストリジウム属の細菌は、一般的には、アセトンをイソプロパノールに還元できる一次／二次アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子ａｄｈをゲノム中に有しているが、天然状態でのＡＢＥ発酵が可能な細菌とは遺伝的にも機能的にも異なる。
溶媒生成細菌、特にクロストリジウム属の細菌は、１世紀以上に亘って産業界で利用されてきたが、遺伝子組換えが困難なため、その知識は限られている。例えば、イソプロパノールを天然に生産するクロストリジウム属の細菌は、一般的には、アセトンをイソプロパノールに還元できる一次／二次アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子ａｄｈをゲノム中に有しているが、天然状態でのＡＢＥ発酵が可能な細菌とは遺伝的にも機能的にも異なる。
【0030】
本発明者らは、本発明において有利なことに、イソプロパノールを天然に生産するクロストリジウム属の細菌、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３、および対照株C. acetobutylicum ＤＳＭ７９２を形質転換し遺伝子改変することに成功した。
【0031】
実験の部に記載された作業の一部は、ＩＢＥ発酵が可能な菌株である、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株のゲノムおよびトランスクリプトームの解析が本発明者らによって最近発表された（Mate de Gerando et al., 2018）。
【0032】
この株のゲノム形成（assembly of the genome）中に、本発明者らは、特に、染色体に加えて、移動性遺伝要素（mobile genetic elements）（受託番号 ＰＲＪＥＢ１１６２６ － https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB11626）である２つの天然プラスミド（ｐＮＦ１およびｐＮＦ２）ならびに線状バクテリオファージ（Φ６４２３）の存在を発見した。
【0033】
C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株は、天然ではエリスロマイシンに感受性であるが、チアンフェニコールに耐性である。特許出願番号ＦＲ１８／７３４９２は、チアンフェニコールに感受性にされた特定の菌株、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ（本明細書中では、C. beijerinckii ＩＦＰ９６２ ΔｃａｔＢとしても記載）を記載している。本発明の特定の態様において、本発明者らは、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株から、その天然プラスミドｐＮＦ２を除去することに成功し、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２株（本明細書中、C. beijerinckii ＩＦＰ９６３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２としても記載）を取得することに成功した。この株は、本明細書において初めて特徴づけられたものである。この株は、２０１９年２月２０日にＢＣＣＭ－ＬＭＧコレクションに受託番号ＬＭＧ Ｐ－３１２７７で登録された。この株は、配列番号１８の遺伝子ｃａｔＢおよびプラスミドｐＮＦ２（野生型）を欠く。本明細書はまた、一般的には配列番号１８の遺伝子ｃａｔＢおよびプラスミドｐＮＦ２（野生型）も欠く、後者の何れかの派生細菌、クローン、変異体または遺伝子改変体にも関する。また、より一般的には、野生状態で、細菌染色体および染色体ＤＮＡとは異なる少なくとも１つのＤＮＡ分子（本明細書中、“非染色体（細菌）ＤＮＡ”または“天然（細菌）プラスミド”として定義）の両方を有し、その非染色体ＤＮＡ分子の少なくとも１つ、一般的にはその非染色体ＤＮＡ分子のいくつか（例えば、２個、３個または４個の非染色体ＤＮＡ分子）、好ましくはその非染色体ＤＮＡ分子の全てをもはや含まないように、本明細書に記載の核酸および／または遺伝子ツールを用いて遺伝子改変された、何れかの細菌に関する。
【0034】
従って、本発明者らは、本願において、ファーミキューテス門に属する溶媒生成細菌、例えばクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバチルス属の細菌、より具体的にはクロストリジウム属の細菌であって、天然に、イソプロパノールを生産することができ、特にＩＢＥ発酵を行う能力を有する（即ち、野生型で能力を有する）細菌であって、この細菌は遺伝子的に改変され、この遺伝子改変により、特に少なくとも１つの天然プラスミド（すなわち、前記細菌の野生型に天然に存在するプラスミド）、好ましくはその天然プラスミドの全て、ならびにそれを得ることを可能にしたツール、特に遺伝子ツールを失っているものを開示する。
【0035】
これらのツールは、細菌の形質転換および遺伝子改変を顕著に容易にするという利点を有する。本発明者らによって行われた実験は、細菌、特にファーミキューテス門に属する細菌、例えばクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバチルス属の細菌を遺伝子改変するための、本明細書に記載のツール、より一般的には技術の使用が可能であることを示した。特に、野生状態でイソプロパノールの生産、特にＩＢＥ発酵を行うことができるクロストリジウム属の細菌のうち、特に抗生物質に対する耐性を担う酵素、特にアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、例えばクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼまたはチアンプニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有するものである。
【0036】
特定の態様において、本発明者らは、このようにして、アンフェニコールのクラスに属する抗生物質に感受性のある細菌を作製することに成功し、当該細菌は、これらの抗生物質に対する耐性を担う酵素をコードする遺伝子を天然に有する（野生状態で有する）。
【0037】
他の好ましい細菌は、野生状態で、細菌染色体および染色体ＤＮＡとは異なる少なくとも１つのＤＮＡ分子の両方を含む。
【0038】
また、好ましくは、細菌は、野生状態で、細菌染色体および染色体ＤＮＡとは異なる少なくとも１つのＤＮＡ分子の両方を含み、さらに、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含む。特定の態様において、この遺伝子は、アンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、例えばクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼまたはチアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードしている。
【0039】
本発明者らによって記載された第１の目的は、前記細菌内に導入された遺伝物質の全ての維持を改善することによって細菌の形質転換を促進するために有利に使用可能な核酸（本明細書中、核酸“ＯＰＴ”として特定）に関する。この核酸ＯＰＴは、i）配列番号１２６（配列“ＯＲＥＰ”）または後者の機能的変異体の全部もしくは一部、およびii）細菌の遺伝子の改変および／または前記細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の前記細菌における発現を可能にする配列（本明細書中、“目的の配列”としても特定）を含む。
【0040】
配列ＯＲＥＰ（配列番号１２６）は、配列番号１２７のヌクレオチド配列を含む。配列番号１２７は、好ましくは、核酸ＯＰＴの複製に関与するタンパク質をコードする配列を含む。複製に関与すると考えられるタンパク質は、本明細書中、タンパク質“ＲＥＰ”（配列番号１２８）としても記載されている。タンパク質ＲＥＰは、配列番号１２９の“ＣＯＧ ５６５５”と称されるファーミキューテスに保存されたドメインを有する。
【0041】
特定の態様において、核酸ＯＰＴは、配列ＯＲＥＰ（配列番号１２６）の一部、一般的には配列ＯＲＥＰの１以上のフラグメント、好ましくは少なくとも配列ＲＥＰ（配列番号１２８）をコードするタンパク質または後者の変異体もしくは機能的フラグメント（すなわち、複製に関与するフラグメント）、一般的には配列番号１２７またはタンパク質ＲＥＰ内で、核酸ＯＰＴの複製に関与するフラグメントをコードする後者の変異体もしくはフラグメントである。タンパク質ＲＥＰ内に存在する、核酸ＯＰＴの複製に関与するフラグメントをコードする配列ＯＲＥＰの機能的フラグメントは、配列番号１２９のドメインを含む。タンパク質ＲＥＰの機能的フラグメントをコードする核酸のそのようなフラグメントの例、および後者の変異体は、当業者によって容易に調製され得る。変異体の一般例は、配列番号１２７と、７０％から１００％、好ましくは８５％から９９％、さらに好ましくは９５％から９９％、例えば７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性（sequence homology）を有する。
【0042】
好ましい態様において、配列ＯＲＥＰのフラグメントまたは機能的変異体は、核酸ＯＰＴの複製に関与するタンパク質をコードする。
【0043】
本発明の好ましい態様において、配列ＯＲＥＰのフラグメントまたは機能的変異体は、核酸ＯＰＴ（例えば、プラスミド型の遺伝子構築物）の複製に関与するタンパク質（例えば、タンパク質ＲＥＰ）または後者の変異体もしくは機能的フラグメントをコードする配列に加えて、１～１５０塩基の部分、好ましくは１～１５塩基の部分、例えばＡおよびＴに富む配列（Rajewska et al.)、好ましくは配列番号１１８のプラスミドｐＮＦ２内に存在する部分であって、核酸ＯＰＴの複製を可能にするタンパク質の固定化を可能にする部分を含む。
【0044】
細菌の遺伝子の改変を可能にする目的の配列は、一般的に、例えば相同組換えの機序によって、例えば本明細書に記載の方法の１つに従って、細菌の遺伝子の一部を目的の配列で置き換えることを可能にする修飾マトリックスである。細菌の遺伝子の改変を可能にする目的の配列はまた、目的の細菌のゲノムにおいて、i）標的配列、ii）標的配列の転写を調節する配列、またはiii）標的配列に隣接する配列の少なくとも１本の鎖を認識（少なくとも部分的に結合）し、好ましくは標的化し、すなわち認識および切断を可能にする配列であってもよい。
【0045】
前記細菌内で、該細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の発現を可能にする目的の配列は、一般的には、細菌が、野生状態で発現できないか、または十分な量で発現することのできない、１以上のタンパク質を発現することを可能にする。
【0046】
特定の面によれば、“核酸ＯＰＴ”は、iii）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９をコードする配列、および／またはiv）１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含み、各ｇＲＮＡは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼに固定するためのＲＮＡ構造および細菌の遺伝子の標的部分の相補配列を含む。
【0047】
別の特定の面によれば、“核酸ＯＰＴ”は、タイプＤａｍおよびＤｃｍのメチルトランスフェラーゼによって認識される単位のレベルでメチル化を示さない。
【0048】
好ましくは、“核酸ＯＰＴ”は発現カセットおよびベクターから選択され、好ましくはプラスミド、例えば配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２４および配列番号１２５から選択される配列を有するプラスミドである。
【0049】
本発明者らによって記載された別の目的は、目的の細菌、一般的にはファーミキューテス門に属する本明細書に記載の細菌、例えばクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバチルス属の細菌、好ましくはクロストリジウム属の細菌、天然にイソプロパノールを生産することができ（すなわち、野生状態で可能）、特にＩＢＥ発酵を天然に行うことができる細菌、好ましくは１以上の抗生物質に天然に耐性を有する細菌、例えば細菌C. beijerinckiiなどを形質転換および／または遺伝子改変するために用いられ得る遺伝子ツールに関する。好ましい細菌は、野生状態で、細菌染色体および染色体ＤＮＡとは異なる少なくとも１つのＤＮＡ分子の両方を有する。
【0050】
“ファーミキューテス門に属する細菌”とは、本明細書において、クロストリジア、モルキュテス、バシリーまたはトゴバクテリアのクラスに属する細菌、好ましくはクロストリジアまたはバシリーのクラスに属する細菌を意味する。
【0051】
ファーミキューテス門に属する特定の細菌は、例えば、クロストリジウム属の細菌、バチルス属の細菌またはラクトバチルス属の細菌を含む。
【0052】
“クロストリジウム属の細菌”とは、特に、産業上有用と言われているクロストリジウム種を意味し、一般的には、クロストリジウム属の溶媒生成細菌またはアセテート（acetogenic）生成細菌である。“クロストリジウム属の細菌”という表現には、野生型細菌、ならびに後者に由来し、ＣＲＩＳＰＲシステムに曝されることなく、性能を向上させる目的で遺伝子改変された（例えば、ｃｔｆＡ、ｃｔｆＢおよびａｄｃ遺伝子を過剰発現）された菌株も含まれる。
【0053】
“産業上有用なクロストリジウム種”とは、発酵によって、糖または単糖から、一般的にはキシロース、アラビノースまたはフルクトースなどの炭素数５個を含む糖類、グルコースまたはマンノースなどの炭素数６の糖類、セルロースまたはヘミセルロースなどの多糖類、および／またはクロストリジウム属の細菌が同化して利用できる他の炭素源（例えばＣＯ、ＣＯ２およびメタノールなど）から出発して、溶媒および酪酸または酢酸などの酸を生産することができる種を意味する。目的の溶媒生成細菌の例は、アセトン、ブタノール、エタノールおよび／またはイソプロパノールを生産するクロストリジウム属の細菌、例えば、“ＡＢＥ株”［アセトン、ブタノールおよびエタノールの生産を可能にする発酵をもたらす株］および“ＩＢＥ株”［（アセトンの還元により）イソプロパノール、ブタノールおよびエタノールの生産を可能にする発酵をもたらす株］として文献で定義される菌株のような細菌である。クロストリジウム属の溶媒生成細菌は、例えば、C. acetobutylicum、C. cellulolyticum、C. phytofermentans、C. beijerinckii、C. saccharobutylicum、C. saccharoperbutylacetonicum、C. sporogenes、C. butyricum、C. aurantibutyricumおよびC. tyrobutyricumから、好ましくはC. acetobutylicum、C. beijerinckii、C. butyricum、C. tyrobutyricum および C. cellulolyticumから、さらにより好ましくは C. acetobutylicum および C. beijerinckiiから選択され得る。
【0054】
野生状態でイソプロパノールを生産することができる細菌、特に野生状態でＩＢＥ発酵をもたらし得る細菌は、例えば、細菌C. beijerinckii、細菌C. diolis、細菌C. puniceum、細菌C. butyricum、細菌C. saccharoperbutylacetonicum、細菌C. botulinum、細菌C. drakei、細菌C. scatologenes、細菌C. perfringens、および細菌C. tunisienseから選択される細菌、好ましくは細菌C. beijerinckii、細菌 C. diolis、細菌C. puniceumおよび細菌C. saccharoperbutylacetonicumから選択される細菌である。イソプロパノールを天然に生産することができる特に好ましい細菌、特に野生状態でＩＢＥ発酵をもたらし得る細菌は、細菌C. beijerinckiiである。
【0055】
目的のアセテート生成細菌は、ＣＯ２およびＨ２から出発して酸および／または溶媒を生産する細菌である。クロストリジウム属のアセテート生成細菌は、例えば、C. aceticum、C. thermoaceticum、C. ljungdahlii、C. autoethanogenum、C. difficile、C. scatologenes およびC. carboxydivoransから選択され得る。
【0056】
特定の態様において、クロストリジウム属の細菌は、“ＡＢＥ株”、好ましくは、C. acetobutylicumのＤＳＭ ７９２株（ＡＴＣＣ ８２４株または他のＬＭＧ ５７１０株とも称される）、またはC. beijerinckiiのＮＣＩＭＢ ８０５２株である。
【0057】
別の特定の態様において、クロストリジウム属の細菌は、“ＩＢＥ株”、好ましくは、ＤＳＭ ６４２３、ＬＭＧ ７８１４、ＬＭＧ ７８１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５９３、ＮＣＣＢ ２７００６から選択されるC. beijerinckii のサブクレード、または細菌C. aurantibutyricum DSZM 793（Georges et al, 1983）、およびＤＳＭ６４２３株と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する前記細菌C. beijerinckiiまたはC. aurantibutyricumのサブクレードである。特に好ましい細菌C.bijerinckii、または特に好ましい細菌C.bijerinckiiのサブクレードは、プラスミドｐＮＦ２を欠失している。
【0058】
一方のサブクレードＬＭＧ ７８１４、ＬＭＧ ７８１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５９３およびＮＣＣＢ ２７００６、ならびにＤＳＺＭ ７９３のそれぞれのゲノムは、サブクレードＤＳＭ ６４２３のゲノムと少なくとも９７％のパーセント配列同一性を有している。
【0059】
本発明者らは発酵試験を行い、サブクレードＤＳＭ ６４２３、ＬＭＧ ７８１５およびＮＣＣＢ ２７００６の細菌C. beijerinckiiが野生状態でイソプロパノールを生産できることを確認した（表１参照）。
【0060】
【表1】
【0061】
イソプロパノールを天然に生産する菌株C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３、ＬＭＧ７８１５およびＮＣＣＢ２７００６を用いたグルコースの発酵試験のバランス。本発明の特に好ましい態様において、細菌C. beijerinckiiは、サブクレードＤＳＭ ６４２３の細菌である。
【0062】
本発明のさらに別の好ましい態様において、細菌C. beijerinckiiは、菌株C. beijerinckii ＩＦＰ９６３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２（２０１９年２月２０日に受託番号ＬＭＧ Ｐ－３１２７７でＢＣＣＭ－ＬＭＧコレクションに登録され、本明細書中、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２と記載される）、または後者の遺伝子組換え体である。C. beijerinckii ＩＦＰ９６３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２、または後者の前記遺伝子組換え体は、配列番号１８の遺伝子ｃａｔＢおよびプラスミドｐＮＦ２を欠失している。
【0063】
“バチルス属の細菌”とは、特に B. amyloliquefaciens、B. thurigiensis、B. coagulans、B. cereus、B. anthracis またはその他のB. subtilisを意味する。
【0064】
最近の試験中、本発明者らは、天然プラスミドｐＮＦ２の除去が、天然または合成の追加の遺伝子要素（例えば、発現カセット（複数可）またはプラスミド発現ベクター（複数可））の導入および維持に顕著な利点を有することを観察した。ＩＦＰ９６３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２株は、このように、その野生型ホモログまたはＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ株（本明細書中、ＩＦＰ９６２ ΔｃａｔＢとしても記載）よりも１０～５ｘ１０３倍高い効率で形質転換され得る。
【0065】
形質転換されることが意図され、好ましくは遺伝子改変される細菌は、好ましくは、野生状態の前記細菌中に天然に存在する染色体外ＤＮＡの少なくとも１分子（一般的には少なくとも１つのプラスミド）を除去することを可能にした本発明の核酸または遺伝子ツールを用いた形質転換の第１工程および遺伝子改変の第１工程に曝された細菌である。
【0066】
本発明者らによって記載された特定の遺伝子ツールは、
i）それが、
－ 少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば酵素Ｃａｓ９をコードする少なくとも１つの“第１の”核酸であって、ここで、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列がプロモーターの制御下に置かれる、“第１の”核酸、および
－ 相同組換え機序によって、エンドヌクレアーゼによって標的とされた細菌ＤＮＡの一部を目的の配列で置換することを可能にする修復マトリックスを含む、少なくとも１つの“第２の”核酸
を含むことを特徴とし、ここで、
ii）前記核酸の少なくとも１つが、１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらにコードするか、または遺伝子ツールが１以上のガイドＲＮＡをさらに含み、各ガイドＲＮＡが、ＤＮＡエンドヌクレアーゼに固定するためのＲＮＡ構造および細菌ＤＮＡの標的部分の相補配列を含む
ことを特徴とする。
i）それが、
－ 少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば酵素Ｃａｓ９をコードする少なくとも１つの“第１の”核酸であって、ここで、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列がプロモーターの制御下に置かれる、“第１の”核酸、および
－ 相同組換え機序によって、エンドヌクレアーゼによって標的とされた細菌ＤＮＡの一部を目的の配列で置換することを可能にする修復マトリックスを含む、少なくとも１つの“第２の”核酸
を含むことを特徴とし、ここで、
ii）前記核酸の少なくとも１つが、１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらにコードするか、または遺伝子ツールが１以上のガイドＲＮＡをさらに含み、各ガイドＲＮＡが、ＤＮＡエンドヌクレアーゼに固定するためのＲＮＡ構造および細菌ＤＮＡの標的部分の相補配列を含む
ことを特徴とする。
【0067】
本発明者らによって記載された遺伝子ツールの一例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと同様に、２つの異なる必須要素、すなわちi）エンドヌクレアーゼ、本発明ではＣＲＩＳＰＲシステムに関連するヌクレアーゼ（Ｃａｓまたは“ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質”）、Ｃａｓ、およびii）ガイドＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡは、細菌のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（trans-activating CRISPR RNA）を組み合わせたキメラＲＮＡの形態である（Jinek et al, Science 2012）。ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質のガイドとなる“スペーサー配列”に対応するｃｒＲＮＡの標的特異性と、ｔｒａｃｒＲＮＡの立体構造特性を１つの転写産物で兼ね備えている。ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質が細胞内で同時に発現されると、修復マトリックスが供給されるため、標的ゲノム配列は通常、有利なことに、永続的に改変される。
【0068】
本発明の遺伝子ツールは、好ましくは、iii）前記（“第１”および“第２”）の核酸の少なくとも１つが、誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列をさらに含むこと、または遺伝子ツールが、誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含むこと、を特徴とする。
【0069】
特に、少なくとも以下を含む遺伝子ツールが記載されている：
－ 少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする第１の核酸（ここで、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列は、プロモーターの制御下に置かれている）、および
－ 核酸配列“ＯＰＴ”、すなわち、i) 配列番号１２６（“ＯＲＥＰ”）の全部または一部、およびii）細菌の遺伝子の改変および／または前記細菌において、前記細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の発現を可能にする配列、を含む配列、を含むかまたはそれからなる別の核酸（または“ｎ番目の核酸”）であって、この特定の遺伝子ツールの前記核酸の少なくとも１つは好ましくは誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列をさらに含んでいるか、または前記特定の遺伝子ツールは好ましくは誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む。
－ 少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする第１の核酸（ここで、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする配列は、プロモーターの制御下に置かれている）、および
－ 核酸配列“ＯＰＴ”、すなわち、i) 配列番号１２６（“ＯＲＥＰ”）の全部または一部、およびii）細菌の遺伝子の改変および／または前記細菌において、前記細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の発現を可能にする配列、を含む配列、を含むかまたはそれからなる別の核酸（または“ｎ番目の核酸”）であって、この特定の遺伝子ツールの前記核酸の少なくとも１つは好ましくは誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列をさらに含んでいるか、または前記特定の遺伝子ツールは好ましくは誘導性プロモーターの制御下に配置された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする第３の核酸をさらに含む。
【0070】
特定の態様において、上記の“第２の”または“修復マトリックスを含むｎ番目の核酸”は、この“他の核酸”を含むか、またはこの“他の核酸”からなる。
【0071】
別の特定の態様において、“第１の核酸”は、１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらにコードする。
【0072】
本発明で意味するところでは、“核酸”とは、任意の天然、合成、半合成または組換えＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であって、任意には化学的に修飾された（すなわち、非天然塩基、例えば修飾結合を含む修飾ヌクレオチド、修飾塩基および／または修飾糖を含む）、またはコーディング配列から合成される転写物のコドンが、クロストリジウム属の細菌中でのその使用を考慮して最も頻繁に見られるコドンであるよう最適化されている、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。クロストリジウム属の場合、最適化されたコドンは、一般的にはアデニン塩基（“Ａ”）およびチミン塩基（“Ｔ”）に富んだコドンである。
【0073】
本明細書に記載のペプチド配列において、アミノ酸は、以下の命名法に従って、１文字表記で示される。Ｃ：システイン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｅ：グルタミン酸；Ｆ：フェニルアラニン；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｋ：リジン；Ｌ：ロイシン；Ｍ：メチオニン；Ｎ：アスパラギン；Ｐ：プロリン；Ｑ：グルタミン；Ｒ：アルギニン；Ｓ：セリン；Ｔ：スレオニン；Ｖ：バリン；Ｗ：トリプトファン、およびＹ：チロシン。
【0074】
本明細書に記載の遺伝子ツールは、少なくとも１つのＤＮＡエンドヌクレアーゼ（本明細書中、“ヌクレアーゼ”としても記載）、一般的にはＣａｓタイプのヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９またはＭＡＤ７をコードする第１の核酸を含む。
【0075】
“Ｃａｓ９”は、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９、Ｃｓｎ１またはＣｓｘ１２とも称される）または後者の機能的タンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドフラグメント、すなわちガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡと相互作用し、標的ゲノムのＤＮＡの二本鎖切断を行うことができる酵素（ヌクレアーゼ）活性を発揮できるものを意味する。従って、“Ｃａｓ９”は、タンパク質の予め定義された機能に必須でないタンパク質のドメイン、特に１つまたは複数のｇＲＮＡとの相互作用に不要なドメインを除去するために、例えば切断されるなど、改変されたタンパク質を示す場合がある。
【0076】
“Ｃａｓ１２”または“Ｃｐｆ１”としても記載されるヌクレアーゼＭＡＤ７（アミノ酸配列は配列番号７２に対応する）は、当業者にこの種のヌクレアーゼに結合できることが知られている１以上のｇＲＮＡと組み合わせることによって、本発明において有利に用いられ得る（Garcia-Doval et al., 2017およびStella S. et al., 2017を参照のこと）。
【0077】
特定の態様では、ヌクレアーゼＭＡＤ７をコードする配列は、クロストリジウム菌株で容易に発現されるように最適化された配列であり、好ましくは配列番号７１の配列である。
【0078】
別の特定の面によれば、ヌクレアーゼＭＡＤ７をコードする配列は、バチルス菌株で容易に発現されるように最適化された配列であり、好ましくは、配列番号１３２の配列である。
【0079】
本発明の可能な態様例の１つにおいて使用可能であるようなＣａｓ９（タンパク質全体またはそのフラグメント）をコードする配列は、任意の既知のＣａｓ９タンパク質から出発して得られてもよい（Makarova et al., 2011）。本発明で使用可能なＣａｓ９タンパク質の例としては、S. pyogenesのＣａｓ９タンパク質（ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／０６４４３９の配列番号１およびＮＣＢＩ受託番号：WP_010922251.1参照）、Streptococcus thermophilus、Streptococcus mutans、Campylobacter jejuni、Pasteurella multocida、Francisella novicida、Neisseria meningitidis、Neisseria lactamicaおよびLegionella pneumophilaのＣａｓ９タンパク質（Fonfara et al., 2013；Mcarova et al., 2015参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0080】
特定の態様において、本発明の遺伝子ツールの核酸の１つによってコードされるＣａｓ９タンパク質、またはその機能的タンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドフラグメントは、配列番号７５のアミノ酸配列または後者と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％の同一性を有し、配列番号７５のアミノ酸配列の１０位（“Ｄ１０”）および８４０位（“Ｄ８４０”）を占める２つのアスパラギン酸（“Ｄ”）を最小値として含む任意の他のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【0081】
好ましい態様において、Ｃａｓ９は、S. pyogenes Ｍ１ ＧＡＳ株のｃａｓ９遺伝子(ＮＣＢＩ受託番号： NC_002737.2 SPy_1046、配列番号７６) またはクロストリジウム属の細菌によって優先的に使用されるコドン、一般的にはアデニン（“Ａ”）およびチミン（“Ｔ”）塩基に富むコドンを含む転写物の起源で最適化された後者のバージョン（“最適化バージョン”）であって、この細菌属でのＣａｓ９タンパク質の円滑な発現を可能にするもの、によってコードされるＣａｓ９タンパク質（ＮＣＢＩ受託番号：WP_010922251.1、配列番号７５）を含むか、またはそれからなる。これらの最適化されたコドンは、当業者によってよく知られている、各細菌株に特有のコドンを用いる方法で多用される。
【0082】
特定の態様では、Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９タンパク質全体、好ましくはS. pyogenesのＣａｓ９タンパク質またはその最適化バージョンからなる。
【0083】
本明細書に記載の遺伝子ツールの核酸それぞれは、一般的には、当該遺伝子ツールの“第１の”核酸および“第２の”または“ｎ番目の”核酸は、異なる物質からなり、一般的に、例えば、目的の１以上の（コーディング）配列、例えば、発現産物が菌体内の目的の機能の遂行に寄与する目的の複数のコーディング配列を含むオペロン、または転写活性化および／または終結配列をさらに含む核酸に作動可能に（当業者によって理解される意味において）連結された少なくとも１つの転写プロモーターを含む核酸などの発現カセット（または“構築物”）の形態で、あるいは上記で定義された１以上の発現カセットを含む、例えばプラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体または合成染色体などの、円形または線形の、一本鎖または二本鎖ベクターの形態で提供される。好ましくは、ベクターはプラスミドである。
【0084】
目的の核酸、一般的にはカセットまたは発現ベクターは、当業者によく知られている従来技術によって構築することができ、１以上のプロモーター、細菌複製起点（ＯＲＩ配列）、終結配列、選択遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、およびカセットまたはベクターの標的挿入を可能にする配列（“隣接領域”）を含み得る。さらに、これらの発現カセットおよびベクターは、当業者によく知られている技術によって細菌ゲノム内に組み込まれ得る。
【0085】
目的のＯＲＩ配列は、ｐＩＰ４０４、ｐＡＭβ１、ｒｅｐＨ（C. acetobutylicumの複製起点）、ＣｏｌＥ１またはｒｅｐ（大腸菌の複製起点）、またはベクター、通常はプラスミドを細菌細胞、例えばクロストリジウムまたはバチルスの細胞内に維持することを可能にする何れか他の複製起点から選択されてよい。
【0086】
本明細書中、好ましいＯＲＩ配列は、プラスミドｐＮＦ２（配列番号１１８）の配列ＯＲＥＰ（配列番号１２６）内に存在するものである。
【0087】
目的のターミネーター配列は、遺伝子ａｄｃ、ｔｈｌ、オペロンｂｃｓのもの、または当業者によく知られている、細菌細胞、例えばクロストリジウムまたはバチルス細胞内で転写を停止することを可能にする任意の他のターミネーターから選択されてもよい。
【0088】
目的の選択遺伝子（耐性遺伝子）は、ｅｒｍＢ、ｃａｔＰ、ｂｌａ、ｔｅｔＡ、ｔｅｔＭおよび／あるいはアンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、チアンフェニコール、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、または細菌、例えばClostridium属もしくはBacillus属を選択するのに用いられ得る、当業者によく知られている任意の他の抗生物質に対する耐性遺伝子から選択されてよい。
【0089】
要すれば本発明の遺伝子ツールの核酸の１つ内に存在してよい、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９をコードする配列は、プロモーターの制御下に置かれてもよい。このプロモーターは、構成的プロモーターであってもよく、誘導性プロモーターであってもよい。好ましい態様において、ヌクレアーゼの発現を制御するプロモーターは、誘導性プロモーターである。
【0090】
本発明において使用可能な構成的プロモーターの例は、遺伝子ｔｈｌのプロモーター、遺伝子ｐｔｂのプロモーター、遺伝子ａｄｃのプロモーター、オペロンＢＣＳのプロモーター、またはその誘導体、好ましくは機能的誘導体であるがより短い（切断型の）、例えばC. acetobutylicumの遺伝子ｔｈｌのプロモーターの“ｍｉｎｉＰｔｈｌ”誘導体（Dong et al, 2012）、または当業者によく知られている、目的の細菌、例えばクロストリジウム属の細菌内でのタンパク質の発現を可能にする、任意の他のプロモーターから選択され得る。
【0091】
本発明において使用可能な誘導性プロモーターの例は、例えば、その発現が転写抑制因子ＴｅｔＲによって制御されるプロモーター、例えば遺伝子ｔｅｔＡ（大腸菌のトランスポゾンＴｎ１０上にもともと存在するテトラサイクリン耐性遺伝子）のプロモーター；Ｌ－アラビノースによって発現が制御されるプロモーター、例えば、好ましくはシステムＡＲＡｉを構築するようにC. acetobutylicum における発現を制御するａｒａＲカセットと組み合わせて（Zhang et al, 2015）、遺伝子ｐｔｋのプロモーター（Zhang et al, 2015）；ラミナリビオース（グルコースβ－１，３の二量体）によってその発現が制御されるプロモーター、例えば、好ましくはリプレッサー遺伝子ｇｌｙＲ３および目的の遺伝子がすぐに続く遺伝子ｃｅｌＣのプロモーター（Mearls et al., 2015）または遺伝子ｃｅｌＣのプロモーター(Newcomb et al., 2011)；ラクトースによってその発現が制御されるプロモーター、例えば遺伝子ｂｇａＬのプロモーター（Banerjee et al., 2014）；キシロースによってその発現が制御されるプロモーター、例えば遺伝子ｘｙｌＢのプロモーター（Nariya et al., 2011）；ならびに、紫外線（ＵＶ）への曝露によって発現が制御されるプロモーター、例えば遺伝子ｂｃｎのプロモーター（Dupuy et al., 2005）から選ばれてよい。
【0092】
上記のプロモーターの１つから誘導されたプロモーター、好ましくは、より短い（切断型の）機能的誘導体もまた、本発明において用いられ得る。
【0093】
本発明において使用可能な他の誘導性プロモーターは、例えば、Ransom et al. （2015）、Currie et al. （2013）およびHartman et al. （2011）による文献にも記載されている。
【0094】
好ましい誘導性プロモーターは、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ；テトラサイクリンよりも毒性が低く、低濃度で転写抑制因子ＴｅｔＲの阻害を除去できる）で誘導可能なｔｅｔＡ由来のプロモーターであり、Ｐｃｍ－２ｔｅｔＯ１およびＰｃｍ－２ｔｅｔＯ２／１から選択される（Dong et al., 2012）。
【0095】
別の好ましい誘導性プロモーターは、ラクトースによって誘導可能なプロモーターであり、例えば、遺伝子ｂｇａＬのプロモーターである（Banerjee et al., 2014）。
【0096】
特定の目的の核酸、一般的には発現カセットまたはベクターは、１以上の発現カセットを含み、各カセットはｇＲＮＡをコードしている。
【0097】
本明細書中、用語“ガイドＲＮＡ”または“ｇＲＮＡ”は、細菌染色体の標的領域にＤＮＡエンドヌクレアーゼを誘導するためにそれと相互作用することができるＲＮＡ分子を意味する。切断特異性はｇＲＮＡによって決定される。上記で説明したように、各ｇＲＮＡは２つの領域：
－ ｇＲＮＡの５'末端にある、標的染色体領域と相補的であり、かつ内在性ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡを模倣する、第１の領域（通称“ＳＤＳ”領域）、および
－ ｇＲＮＡの３'末端にある、ｔｒａｃｒＲＮＡ（“trans-activating crRNA”）と内在性ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡとの間の塩基対相互作用を模倣し、かつ本質的に一本鎖配列で３'で終わる二本鎖ステムループ構造を有する、第２の領域（通称“ハンドル（handle）”領域）、を含む。この第２の領域は、ｇＲＮＡをＤＮＡエンドヌクレアーゼに結合させるために必須である。
－ ｇＲＮＡの５'末端にある、標的染色体領域と相補的であり、かつ内在性ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡを模倣する、第１の領域（通称“ＳＤＳ”領域）、および
－ ｇＲＮＡの３'末端にある、ｔｒａｃｒＲＮＡ（“trans-activating crRNA”）と内在性ＣＲＩＳＰＲシステムのｃｒＲＮＡとの間の塩基対相互作用を模倣し、かつ本質的に一本鎖配列で３'で終わる二本鎖ステムループ構造を有する、第２の領域（通称“ハンドル（handle）”領域）、を含む。この第２の領域は、ｇＲＮＡをＤＮＡエンドヌクレアーゼに結合させるために必須である。
【0098】
ｇＲＮＡの第一の領域（“ＳＤＳ”領域）は、標的とする染色体配列によって異なる。
【0099】
標的染色体領域と相補的なｇＲＮＡの“ＳＤＳ”領域は、少なくとも１個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個または４０個のヌクレオチド、一般的には１～４０個のヌクレオチドを含む。好ましくは、この領域は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長を有する。
【0100】
ｇＲＮＡの第２の領域（“ハンドル”領域）は、ステムループ構造（またはヘアピン構造）を有している。様々なｇＲＮＡの“ハンドル”領域は、選択された染色体標的によって変わらない。
【0101】
特定の態様により、“ハンドル”領域は、少なくとも１ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１、５０、１００、２００、５００および１０００ヌクレオチド、一般的には１～１０００ヌクレオチドの間の配列を含むか、またはそれらから構成されている。好ましくは、この領域は、４０～１２０ヌクレオチド長を有する。
【0102】
ｇＲＮＡの全長は、一般に５０から１０００ヌクレオチド長、好ましくは８０から２００ヌクレオチド長、より特に好ましくは９０から１２０ヌクレオチド長である。特定の態様により、本発明で用いるｇＲＮＡは、９５から１１０ヌクレオチド長の間の長さ、例えば、約１００ヌクレオチド長または約１１０ヌクレオチド長を有する。
【0103】
当業者は、周知の技術を用いて、標的とする染色体領域に応じて、ｇＲＮＡの配列および構造を容易に定義することができる（例えば、DiCarlo et al., 2013の文献を参照のこと）。
【0104】
細菌ゲノム内の、例えば細菌染色体の、標的とされるＤＮＡ領域／部分／配列は、ＤＮＡの非コーディング部分に相当してもよいか、またはＤＮＡのコーディング部分に相当してもよい。
【0105】
所定の配列を改変することからなる特定の態様において、細菌ＤＮＡの標的部分は、該細菌の生存に必須である。それは、例えば、細菌染色体の任意の領域または非染色体ＤＮＡ上に位置する任意の領域、例えば、想定される増殖条件下で細菌を抗生物質の存在下で培養する必要がある場合に該抗生物質に対する耐性マーカーを含むプラスミドなど、特定の増殖条件下での微生物の生存に不可欠な移動性遺伝子要素上に位置する領域に相当する。
【0106】
微生物の培養に関連する特定の増殖条件において必須でない遺伝子要素を除去する目的で別の特定の態様において、細菌ＤＮＡの標的部分は、前記非染色体細菌ＤＮＡの任意の領域に相当し得る。
【0107】
クロストリジウム属の細菌内で標的とされるＤＮＡ部分の特定の例は、試験部分の実施例１において用いられる配列である。それらは、例えば、遺伝子ｂｄｈＡ（配列番号７７）およびｂｄｈＢ（配列番号７８）をコードする配列である。標的となるＤＮＡ領域／部分／配列には、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとの結合に関与する配列“ＰＡＭ”（“protospacer adjacent motif”）が続く。
【0108】
所定のｇＲＮＡの“ＳＤＳ”領域は、細菌ゲノム、例えば細菌染色体内で標的とされるＤＮＡ領域／部分／配列と同一（１００％まで）または少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、かつ該領域／部分／配列の全部または一部の相補配列に対して、一般的には少なくとも１ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド、一般的には１～４０ヌクレオチドを含む配列に対して、好ましくは１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドを含む配列に対して、ハイブリダイズ可能なものである。
【0109】
本発明において、目的の核酸は、配列（“標的配列”、“標的化配列”または“認識される配列”）を標的とする１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み得る。これらの様々なｇＲＮＡは、染色体領域または要すれば微生物内に存在してよい非染色体細菌ＤＮＡに属する領域（例えば、移動性遺伝子要素に属する領域）を標的としてもよく、同一でも異なってもよい。
【0110】
ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの分子（成熟または前駆体）の形態で、前駆体の形態で、または前記ｇＲＮＡをコードする１以上の核酸の形態で、細菌細胞内に導入されてもよい。ｇＲＮＡは、好ましくは、該ｇＲＮＡをコードする１以上の核酸の形態で細菌細胞に導入される。
【0111】
１つまたは複数のｇＲＮＡがＲＮＡ分子の形態で直接細胞に導入されるとき、これらのｇＲＮＡ（成熟または前駆体）は、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性を高め、これにより細胞内での寿命を長くするのを可能にする修飾ヌクレオチドまたは化学修飾を含み得る。特に、例えば、イノシン、メチル－５－デオキシシチジン、ジメチルアミノ－５－デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ－２，６－プリン、ブロモ－５－デオキシウリジンなどの修飾塩基、またはハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基を含むヌクレオチドなどの、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含んでいてよい。本発明に従って用いられるｇＲＮＡはまた、例えばホスホロチオエート、Ｈ－ホスホネートもしくはアルキルホスホネートなどのヌクレオチド間結合のレベルで、または例えばα－オリゴヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキルリボースもしくはＰＮＡ（ペプチド核酸）（Egholm et al., 1992）などの骨格（主鎖）レベルで修飾されてもよい。
【0112】
ｇＲＮＡは、天然ＲＮＡ、合成ＲＮＡまたは組換え技術によって生成されたＲＮＡであり得る。これらのｇＲＮＡは、例えば、化学合成、インビボ転写または増幅技術など、当業者によって知られているあらゆる方法によって調製することができる。
【0113】
ｇＲＮＡが１以上の核酸の形態で細菌細胞に導入されるとき、１つまたは複数のｇＲＮＡをコードする１つまたは複数の配列は、発現プロモーターの制御下に置かれる。このプロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよい。
【0114】
いくつかのｇＲＮＡが用いられるとき、各ｇＲＮＡの発現は異なるプロモーターによって制御され得る。好ましくは、用いられるプロモーターは、全てのｇＲＮＡについて同じである。特定の態様において、１つの同じプロモーターは、発現が意図されるｇＲＮＡのいくつかの、例えば、いくつかまたはすべての、発現を可能にするために用いられ得る。
【0115】
好ましい態様において、ｇＲＮＡ／（複数の）ｇＲＮＡの発現を制御する（１つまたは複数の）プロモーターは、誘導性プロモーターである。
【0116】
本発明において使用可能な構成的プロモーターの例は、遺伝子ｔｈｌのプロモーター、遺伝子ｐｔｂのプロモーター、またはオペロンＢＣＳのプロモーター、あるいはそれらの誘導体、好ましくはｍｉｎｉＰｔｈｌ、または当業者によく知られている、目的の細菌内で（コーディングまたは非コーディング）ＲＮＡの合成を可能にする任意の他のプロモーターから選択されてもよい。
【0117】
本発明において使用可能な誘導性プロモーターの例は、遺伝子ｔｅｔＡのプロモーター、遺伝子ｘｙｌＡのプロモーター、遺伝子ｌａｃＩのプロモーター、または遺伝子ｂｇａＬのプロモーター、あるいはそれらの誘導体、好ましくは２ｔｅｔＯ１またはｔｅｔＯ２／１、から選択され得る。好ましい誘導性プロモーターは、２ｔｅｔＯ１である。
【0118】
ＤＮＡエンドヌクレアーゼの発現およびｇＲＮＡ／（複数の）ｇＲＮＡの発現を制御するプロモーターは、同一でも異なっていてもよく、かつ構成的であっても誘導的であってもよい。特定の好ましい態様において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたは１つもしくは複数のｇＲＮＡの発現をそれぞれ制御するプロモーターは、異なるプロモーターであるが、同一の誘導剤によって誘導可能である。
【0119】
上記の誘導性プロモーターは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ／ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体、例えばＣａｓ９／ｇＲＮＡの作用を有利に制御することを可能にし、所望の遺伝子改変が施された形質転換体の選択を容易にする。
【0120】
本発明の遺伝子ツールは、有利には、少なくとも１つの抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質、すなわちＣａｓの作用を阻害または阻止／中和することができるタンパク質、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、例えばヌクレアーゼがＣａｓ９型のヌクレアーゼであるとき、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の作用を阻害または阻止／中和することができるタンパク質をコードする配列をさらに含んでいてもよい。この配列は、一般的には、ＤＮＡエンドヌクレアーゼおよび／または１つもしくは複数のｇＲＮＡの発現を制御するプロモーターとは異なる誘導性プロモーターの制御下に置かれ、かつ別の誘導因子によって誘導可能である。好ましい態様において、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、さらに一般的には、遺伝子ツール内に存在する少なくとも２つの核酸のうちの１つに局在している。特定の態様において、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、最初の２つとは異なる核酸（一般的には“第３の核酸”）上に局在している。さらに別の特定の態様において、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列および当該抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の転写抑制因子をコードする配列の両方が、細菌染色体中に組み込まれている。
【0121】
好ましい態様において、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、遺伝子ツール内で、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸（本明細書中、“第１の核酸”とも称される）上に配置される。別の態様において、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列は、遺伝子ツール内で、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするものとは異なる核酸上、例えば、本明細書中、“第２の核酸”として特定される核酸上、あるいはその他、要すれば遺伝子ツール内に含まれていてよい“ｎ番目の”（一般的には“第３の”）核酸上に配置される。
【0122】
抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、一般的には、“抗Ｃａｓ９”タンパク質または“抗ＭＡＤ７”タンパク質、すなわち、Ｃａｓ９またはＣＡＳ７の作用を阻害もしくは阻止／中和することができるタンパク質である。
【0123】
抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、有利には、例えばＡｃｒＩＩＡ１、ＡｃｒＩＩＡ２、ＡｃｒＩＩＡ３、ＡｃｒＩＩＡ４、ＡｃｒＩＩＡ５、ＡｃｒＩＩＣ１、ＡｃｒＩＩＣ２およびＡｃｒＩＩＣ３から選択される“抗Ｃａｓ９”タンパク質である（Pawluk et al, 2018）。好ましくは、“抗Ｃａｓ９”タンパク質は、ＡｃｒＩＩＡ２またはＡｃｒＩＩＡ４である。さらにより好ましくは、“抗Ｃａｓ９”タンパク質は、ＡｃｒＩＩＡ４である。前記タンパク質は、一般的には、例えば酵素Ｃａｓ９に結合することによって、Ｃａｓ９の作用を非常に著しく制限すること、理想的には阻止することができる（Dong et al., 2017；Rauch et al., 2017）。
【0124】
有利には、使用可能な別の抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、“抗ＭＡＤ７”タンパク質、例えばタンパク質ＡｃｒＶＡ１である（Marino et al., 2018）。
【0125】
好ましい態様において、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、好ましくは、遺伝子ツールの核酸配列を目的の細菌株に導入する工程の間、ＤＮＡエンドヌクレアーゼの作用を阻害する、好ましくは中和することができる。
【0126】
抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする配列の発現を制御するプロモーターは、好ましくは、誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、構成的に発現される遺伝子と結合し、一般的には、当該誘導性プロモーターを起点とする転写抑制を可能にするタンパク質の発現に関与する。このプロモーターは、例えば、遺伝子ｔｅｔＡのプロモーター、遺伝子ｘｙｌＡのプロモーター、遺伝子ｌａｃＩのプロモーターまたは遺伝子ｂｇａＬのプロモーターもしくはそれらの誘導体から選択され得る。
【0127】
本発明において使用可能な誘導性プロモーターの例は、遺伝子ツール内および同じ核酸上で、構成的に発現される遺伝子ｂｇａＲと並んで存在するプロモーターＰｂｇａｌ（ラクトースで誘導可能）であり、その発現産物はＰｂｇａｌから始まる転写抑制を可能にする。誘導因子であるラクトースの存在下では、プロモーターＰｂｇａｌの転写抑制が解除され、後者の下流に配置された遺伝子の転写が可能になる。好ましくは、下流に配置された遺伝子は、本発明において、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質、例えばａｃｒＩＩＡ４をコードする遺伝子に相当する。
【0128】
抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を制御するプロモーターによって、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば酵素Ｃａｓ９の作用を有利に制御することが可能となり、その結果、細菌、例えばクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバチルス属の細菌の形質転換を促進し、および所望の遺伝子改変が行われた形質転換体の産生を容易にできる。
【0129】
特定の態様において、本発明は、配列番号２３の配列を有するプラスミドベクターを“第１の”核酸として含む遺伝子ツールに関する。
【0130】
さらに別の特定の態様において、本発明は、その配列が“第２の”または“ｎ番目の”核酸として配列番号７９、配列番号８０、配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２４および配列番号１２５のいずれかから選択されるプラスミドベクターを含む遺伝子ツールに関する。
【0131】
さらに別の特定の態様において、本発明は、配列が“核酸ＯＰＴ”として配列番号１１９、配列番号１２３、配列番号１２４および配列番号１２５のいずれかから選択されるプラスミドベクターを含む遺伝子ツールに関する。別の特定の態様において、遺伝子ツールは、配列番号２３、７９、８０、１１９、１２３、１２４および１２５のうちのいくつかの（例えば、少なくとも２つまたは３つの）配列を含み、該配列は互いに異なるものである。
【0132】
本発明者らは、細菌内で、該細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠落したＤＮＡ配列の発現を可能にする、目的の核酸、一般的には目的のＤＮＡ配列の例を記載する。
【0133】
特定の態様において、目的のＤＮＡ配列の発現は、細菌、例えばクロストリジウム属の細菌が、いくつかの異なる糖、例えば少なくとも２つの異なる糖、一般的には５個の炭素原子を含む糖（グルコースまたはマンノースなど）のうち少なくとも２つの異なる糖、および／または６個の炭素原子を含む糖（キシロース、アラビノースまたはフルクトースなど）のうち少なくとも２つの異なる糖、好ましくは、例えばグルコース、キシロースおよびマンノース；グルコース、アラビノースおよびマンノース；ならびにグルコース、キシロースおよびアラビノースから選択される少なくとも３つの異なる糖を発酵（通常は同時に）することを可能にする。
【0134】
別の特定の態様において、目的のＤＮＡ配列は、少なくとも１つの目的の産物、好ましくは、細菌、例えばクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバチルス属の細菌による溶媒の生産を促進する産物、一般的には少なくとも１つの目的のタンパク質、例えば酵素；トランスポーターなどの膜タンパク質；他のタンパク質の成熟のためのタンパク質（シャペロンタンパク質）；転写因子；または、それらの組合せをコードしている。
【0135】
好ましい態様において、目的のＤＮＡ配列は、溶媒の生産を促進し、一般的には、i）酵素、例えばアルデヒドのアルコールへの変換に関与する酵素、例えばアルコールデヒドロゲナーゼをコードする配列（例えば、ａｄｈ、ａｄｈＥ、ａｄｈＥ１、ａｄｈＥ２、ｂｄｈＡ、ｂｄｈＢおよびｂｄｈＣから選択される配列）、トランスフェラーゼをコードする配列（例えば、ｃｔｆＡ、ｃｔｆＢ、ａｔｏＡおよびａｔｏＢから選択される配列）、デカルボキシラーゼをコードする配列（例えば、ａｄｃ）、ヒドロゲナーゼをコードする配列（例えば、ｅｔｆＡ、ｅｔｆＢおよびｈｙｄＡから選択される配列）、およびこれらの組合せから選択される酵素、ii）膜タンパク質、例えば、ホスホトランスフェラーゼをコードする配列（例えば、ｇｌｃＧ、ｂｇｌＣ、ｃｂｅ４５３２、ｃｂｅ４５３３、ｃｂｅ４９８２、ｃｂｅ４９８３、ｃｂｅ０７５１から選択される配列）、iii）転写因子（例えば、ｓｉｇＬ、ｓｉｇＥ、ｓｉｇＦ、ｓｉｇＧ、ｓｉｇＨ、ｓｉｇＫから選択される配列）、ならびにｉｖ）これらの組合せ、をコードする配列から選択される。
【0136】
さらに、本発明者らは、目的の核酸が、目的の細菌のゲノムにおいて、i）標的配列、ii）標的配列の転写を調節する配列、またはiii）標的配列の隣接配列、の少なくとも１つの鎖を認識（少なくとも部分的に結合）し、好ましくは標的化し、すなわち認識して切断を可能にする例を記載する。
【0137】
認識される配列は、本明細書中、“標的配列”または“標的化配列”とも記載される。
【0138】
また、前記目的の核酸を含むか、またはそれからなる遺伝子ツールも記載される。この場合、目的の核酸は、一般的には、本明細書中に記載の遺伝子ツールの“第２の”または“ｎ番目”の核酸内に存在する。
【0139】
目的の核酸は、一般的には、本明細書中、細菌ゲノムの認識された配列を抑制するため、またはその発現を改変するため、例えばその発現を調節／制御するため、特にそれを阻害するため、好ましくは前記細菌が該配列から始まるタンパク質、特に機能タンパク質を発現できなくするようにそれを改変するために用いられる。
【0140】
標的配列が、目的の細菌がその細菌に耐性を付与する抗生物質を含む培養液中で増殖することを可能にする酵素をコードする配列、そのような配列の転写を調節する配列、またはそのような配列に隣接する配列であるとき、抗生物質は、一般的には、アンフェニコール類に属する抗生物質である。本明細書に記載のアンフェニコール類の例は、クロラムフェニコール、チアンフェニコール、アジダムフェニコールおよびフロフェニコール（Schwarz S. et al., 2004）、特にクロラムフェニコールおよびチアンフェニコールである。
【0141】
特定の態様において、目的の核酸は、細菌ゲノム内で標的とされるＤＮＡ領域／部分／配列と少なくとも１００％同一または８０％同一、好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、該領域／部分／配列の相補配列の全部または一部とハイブリダイズすることができ、一般的には少なくとも１ヌクレオチドを含む配列、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１４、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチドを含む配列、一般的には、１、１０または２０ヌクレオチドと１０００ヌクレオチドの間、例えば１、１０または２０ヌクレオチドと９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００または２００ヌクレオチドの間、１、１０または２０ヌクレオチドと１００ヌクレオチドの間、１、１０または２０ヌクレオチドと５０ヌクレオチドの間、あるいは１、１０または２０ヌクレオチドと４０ヌクレオチドの間、例えば１０～４０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、１５～４０ヌクレオチド、１５～３０ヌクレオチドまたは１５～２０ヌクレオチド、好ましくは１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドを含む配列とハイブリダイズすることができる、標的配列の少なくとも１つの相補領域を含む。目的の核酸内に存在する標的配列の相補領域は、本明細書中に記載のとおり、ＣＲＩＳＰＲツールで用いられるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の“ＳＤＳ”領域に相当し得る。
【0142】
記載された別の特定の態様において、目的の核酸は、細菌ゲノム内で標的とされる前記ＤＮＡ領域／部分／配列と１００％同一または少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の、標的配列に相補的な少なくとも２つの領域をそれぞれ含む。これらの領域は、前記領域／部分／配列の相補配列の全部または一部、一般的には少なくとも１ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、一般的には１００～１０００ヌクレオチドを含む上記の配列にハイブリダイズすることが可能である。目的の核酸内に存在する標的配列の相補領域は、例えば、遺伝子ツールClosTron（登録商標）、遺伝子ツールTargetron（登録商標）またはACE（登録商標）タイプの対立遺伝子交換ツールなどの、本明細書に記載の遺伝子改変用ツールにおいて、標的化配列の５’および３’隣接領域を認識し得る、好ましくは標的とし得る。
【0143】
特定の面により、標的配列は、アンフェニコール類に属する１以上の抗生物質、例えば、クロラムフェニコールおよび／またはチアンフェニコールを含む培地中で増殖し得る、目的の細菌の、例えばクロストリジウム属のゲノム内で、アンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、例えばクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼまたはチアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする配列であり、かかる配列の転写を調節するかまたはかかる配列に隣接する配列である。
【0144】
認識される配列は、例えば、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３のクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｃａｔＢ（CIBE_3859）に対応する配列番号１８の配列、または該クロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一のアミノ酸配列、または配列番号１８の全てまたは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を含む配列である。換言すると、認識される配列は、少なくとも１ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド、一般的には１～４０ヌクレオチド、好ましくは配列番号１８の１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドを含む配列であり得る。
【0145】
配列番号１８によりコードされるクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩデータベースにおいて以下の参照番号で定義される配列に対応する：ＷＰ＿０７７８４３９３７．１、配列番号４４（ＷＰ＿０６３８４３２１９．１）、配列番号４５（ＷＰ＿０７８１１６０９２．１）、配列番号４６（ＷＰ＿０７７８４０３８３．１）、配列番号４７（ＷＰ＿０７７３０７７７０．１）、配列番号４８（ＷＰ＿１０３６９９３６８．１）、配列番号４９（ＷＰ＿０８７７０１８１２．１）、配列番号５０（ＷＰ＿０１７２１０１１２．１）、配列番号５１（ＷＰ＿０７７８３１８１８．１）、配列番号５２（ＷＰ＿０１２０５９３９８．１）、配列番号５３（ＷＰ＿０７７３６３８９３．１）、配列番号５４（ＷＰ＿０１５３９３５５３．１）、配列番号５５（ＷＰ＿０２３９７３８１４．１）、配列番号５６（ＷＰ＿０２６８８７８９５．１）、配列番号５７（ＡＷＫ５１５６８．１）、配列番号５８（ＷＰ＿００３３５９８８２．１）、配列番号５９（ＷＰ＿０９１６８７９１８．１）、配列番号６０（ＷＰ＿０５５６６８５４４．１）、配列番号６１（ＫＧＫ９０１５９．１）、配列番号６２（ＷＰ＿０３２０７９０３３．１）、配列番号６３（ＷＰ＿０２９１６３１６７．１）、配列番号６４（ＷＰ＿０１７４１４３５６．１）、配列番号６５（ＷＰ＿０７３２８５２０２．１）、配列番号６６（ＷＰ＿０６３８４３２２０．１）および配列番号６７（ＷＰ＿０２１２８１９９５．１）。
【0146】
配列番号１８によりコードされるクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも７５％同一のアミノ酸配列の例は、配列ＷＰ＿０７７８４３９３７．１、ＷＰ＿０６３８４３２１９．１、ＷＰ＿０７８１１６０９２．１、ＷＰ＿０７７８４０３８３．１、ＷＰ＿０７７３０７７７０．１、ＷＰ＿１０３６９９３６８．１、ＷＰ＿０８７７０１８１２．１、ＷＰ＿０１７２１０１１２．１、ＷＰ＿０７７８３１８１８．１、ＷＰ＿０１２０５９３９８．１、ＷＰ＿０７７３６３８９３．１、ＷＰ＿０１５３９３５５３．１、ＷＰ＿０２３９７３８１４．１、ＷＰ＿０２６８８７８９５．１、ＡＷＫ５１５６８．１、ＷＰ＿００３３５９８８２．１、ＷＰ＿０９１６８７９１８．１、ＷＰ＿０５５６６８５４４．１およびＫＧＫ９０１５９．１に対応する。
【0147】
配列番号１８によりコードされるクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列の例は、配列ＷＰ＿０７７８４３９３７．１、ＷＰ＿０６３８４３２１９．１、ＷＰ＿０７８１１６０９２．１、ＷＰ＿０７７８４０３８３．１、ＷＰ＿０７７３０７７７０．１、ＷＰ＿１０３６９９３６８．１、ＷＰ＿０８７７０１８１２．１、ＷＰ＿０１７２１０１１２．１、ＷＰ＿０７７８３１８１８．１、ＷＰ＿０１２０５９３９８．１、ＷＰ＿０７７３６３８９３．１、ＷＰ＿０１５３９３５５３．１、ＷＰ＿０２３９７３８１４．１、ＷＰ＿０２６８８７８９５．１およびＡＷＫ５１５６８．１である。
【0148】
配列番号１８によりコードされるクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも９５％同一のアミノ酸配列の例は、配列ＷＰ＿０７７８４３９３７．１、ＷＰ＿０６３８４３２１９．１、ＷＰ＿０７８１１６０９２．１、ＷＰ＿０７７８４０３８３．１、ＷＰ＿０７７３０７７７０．１、ＷＰ＿１０３６９９３６８．１、ＷＰ＿０８７７０１８１２．１、ＷＰ＿０１７２１０１１２．１、ＷＰ＿０７７８３１８１８．１、ＷＰ＿０１２０５９３９８．１、ＷＰ＿０７７３６３８９３．１、ＷＰ＿０１５３９３５５３．１、ＷＰ＿０２３９７３８１４．１およびＷＰ＿０２６８８７８９５．１に対応する。
【0149】
配列番号１８によりコードされるクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも９９％同一の好ましいアミノ酸配列は、配列ＷＰ＿０７７８４３９３７．１、配列番号４４（ＷＰ＿０６３８４３２１９．１）および配列番号４５（ＷＰ＿０７８１１６０９２．１）である。
【0150】
配列番号１８と同一の特定の配列は、ＮＣＢＩデータベースにおいて参照番号ＷＰ＿０７７８４３９３７．１の下で定義される配列である。
【0151】
特定の例により、標的配列は、そのアミノ酸配列が配列番号６６（ＷＰ＿０６３８４３２２０．１）に対応するC. perfringensのクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｃａｔＱに対応する配列番号６８であるか、または該クロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一の配列、または配列番号６８の全てもしくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％を含む配列である。
【0152】
換言すると、認識される配列は、少なくとも１ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０ヌクレオチド、一般的には１～４０ヌクレオチドを含む配列、好ましくは配列番号６８の１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドを含む配列で有り得る。
【0153】
さらに別の特定の例では、認識される配列は、細菌内に天然に存在するかまたは前記細菌に人工的に導入される、当業者によって知られている、核酸配列ｃａｔＢ（配列番号１８）、ｃａｔＱ（配列番号６８）、ｃａｔＤ（配列番号６９、Schwarz S. et al., 2004）またはｃａｔＰ（配列番号７０、Schwarz S. et al., 2004）から選択される。
【0154】
上記のように、別の特定の例では、標的配列はまた、上記のコーディング配列（目的の細菌がそれに対する耐性を付与される抗生物質を含む培地中で増殖できるようにする酵素をコードする）の転写を調節する配列、一般的にはプロモーター配列、例えばｃａｔＢ遺伝子のプロモーター配列（配列番号７３）またはｃａｔＱ遺伝子のプロモーター配列（配列番号７４）であり得る。
【0155】
次に、目的の核酸は、上記のコーディング配列の転写を調節する配列を認識し、したがって一般的には結合することができる。
【0156】
別の特定の例では、標的配列は、上記のコーディング配列に隣接する配列、例えば配列番号１８の遺伝子ｃａｔＢに隣接する配列または後者と少なくとも７０％同一な配列であり得る。該隣接配列は、一般的には、１、１０または２０および１０００ヌクレオチドを、例えば、１、１０もしくは２０～９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００もしくは２００ヌクレオチド、１、１０もしくは２０～１００ヌクレオチド、１、１０もしくは２０～５０ヌクレオチド、または１、１０もしくは２０～４０ヌクレオチド、例えば、１０～４０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、１０～２０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、１５～４０ヌクレオチド、１５～３０ヌクレオチドあるいは１５～２０ヌクレオチドを含む。
【0157】
特定の面では、標的配列は、前記コーディング配列に隣接する一対の配列に対応し、各隣接配列は、一般的には少なくとも２０ヌクレオチド、一般的には１００～１０００ヌクレオチド、好ましくは２００～８００ヌクレオチドを含む。
【0158】
本明細書中、目的の細菌を形質転換する、および／または遺伝子改変するために用いられる目的の核酸の特定の例は、細菌、例えば上記のクロストリジウム属の細菌のゲノム内に、目的の酵素、好ましくはアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、例えばクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼまたはチアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼを、i）コーディング配列を認識する、ii）コーディング配列の転写を調節する、またはiii) コーディング配列に隣接する、ＤＮＡフラグメントである。
【0159】
上記の本発明の目的の核酸の一例は、細菌のゲノムの認識された配列（“標的配列”）を抑制すること、またはその発現を改変すること、例えばそれを調節すること、特にそれを阻害すること、好ましくは前記細菌が該配列から始まるタンパク質、例えばアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、特に機能タンパク質を発現できないようにそれを修飾することができる。
【0160】
酵素をコードする認識された配列が、細菌にクロラムフェニコールおよび／またはチアンフェニコールに対する耐性を付与する配列である特定の態様において、用いられる選択遺伝子は、クロラムフェニコールおよび／またはチアンフェニコールに対する耐性の遺伝子ではなく、好ましくは遺伝子ｃａｔＢ、ｃａｔＱ、ｃａｔＤまたはｃａｔＰの何れかでもない。
【0161】
特定の態様において、目的の核酸は、目的の酵素、特にアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする配列を標的とする、該コーディング配列の転写を調節する、または該コーディング配列に隣接する１以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、および／または修飾マトリックス（本明細書中、“編集マトリックス”とも記載）、例えば、好ましくは標的配列の発現を阻害または抑制するための、標的配列のすべてまたは一部を除去または修飾することを可能にするマトリックス、一般的には、上記の標的配列の上流および下流に位置する配列と相同な配列（対応する配列）を含むマトリックスであり、一般的には、それぞれが１０もしくは２０塩基対から１０００、１５００もしくは２０００塩基対の間であり、例えば１００、２００、３００、４００もしくは５００塩基対から１０００、１２００、１３００、１４００もしくは１５００塩基対であり、好ましくは１００から１５００または１００から１０００塩基対、さらに好ましくは５００から１０００または２００から８００塩基対を含む配列（標的配列の上流および下流に位置する該配列と相同な配列）を含むマトリックスを含む。
【0162】
特定の態様において、目的の細菌を形質転換および／または遺伝子改変するために用いられる目的の核酸は、ＤａｍおよびＤｃｍ型のメチルトランスフェラーゼ（ｄａｍ－ｄｃｍ－遺伝子型を有する大腸菌から調製される）によって認識されるモチーフのレベルでメチル化を有さない核酸である。
【0163】
形質転換されたおよび／または遺伝子改変された目的の細菌がC. beijerinckii細菌、特にサブクレードＤＳＭ６４２３、ＬＭＧ７８１４、ＬＭＧ７８１５、ＮＲＲＬ Ｂ－５９３およびＮＣＣＢ２７００６の１つに属している場合、遺伝子ツールとして用いられる目的の核酸、例えばプラスミドは、Ｄａｍ－およびＤｃｍ－型メチルトランスフェラーゼに認識されるモチーフとなるレベルでのメチル化を有さない核酸であり、一般的には、ＧＡＴＣモチーフのアデノシン（“Ａ”）および／またはＣＣＷＧＧモチーフ（Ｗはアデノシン（“Ａ”）またはチミン（“Ｔ”）に対応していてよい）の第２シトシン“Ｃ”は脱メチル化されている核酸である。
【0164】
Ｄａｍ－およびＤｃｍ－型メチルトランスフェラーゼに認識されるモチーフのメチル化を有さない核酸は、一般的にはｄａｍ－ｄｃｍ－遺伝子型を有する大腸菌（例えば、Escherichia coli INV 110, Invitrogen）から調製され得る。これと同じ核酸は、例えば、ｅｃｏＫＩ型メチルトランスフェラーゼによって行われた他のメチル化を含み得て、後者はＡＡＣ（Ｎ６）ＧＴＧＣおよびＧＣＡＣ（Ｎ６）ＧＴＴモチーフのアデニン（“Ａ”）を標的とする（Ｎは任意の塩基に対応し得る）。
【0165】
特定の態様において、標的化配列は、遺伝子ｃａｔＢなどのアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼ、例えばクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、この遺伝子の転写を調節する配列、またはこの遺伝子に隣接する配列に相当する。
【0166】
本発明者らによって記載された特定の目的の核酸は、例えばベクター、好ましくはプラスミド、例えば本明細書の実験セクションに記載された配列番号２１のプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢまたは配列番号３８のプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ－ｇＲＮＡ_ｃａｔＢ（実施例２）、特にＤａｍおよびＤｃｍ型のメチルトランスフェラーゼによって認識されるモチーフのレベルでメチル化を有しない該配列バージョンである。
【0167】
本明細書はまた、本明細書に記載の目的の細菌を形質転換および／または遺伝子改変するための目的の核酸の使用にも関する。
【0168】
本発明者らによって記載された別の面は、本発明の遺伝子ツール、一般的には上記の本発明による目的の核酸を用いて、ファーミキューテス門に属する細菌、例えばクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバシルス属の細菌、一般的には溶媒生成細菌、特にクロストリジウム属の溶媒生成細菌を形質転換し、好ましくはさらに遺伝子改変する方法に関する。この方法は、有利には、該細菌に、本明細書に記載の遺伝子ツールの全部または一部、特に本明細書に記載の目的の核酸、好ましくは、i）配列番号１２６（ＯＲＥＰ）の全部または一部、およびii）細菌の遺伝子の改変および／または該細菌において、該細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的または完全に欠失したＤＮＡ配列の発現を可能にする配列、を含むか、またはそれからなる“核酸ＯＰＴ”を導入することにより、該細菌を形質転換する工程を含む。本方法は、形質転換された細菌、すなわち必要な組換えまたは組換え／改変または改変／最適化または最適化を有する細菌を得る、回収する、選択するまたは単離する工程をさらに含んでもよい。
【0169】
特定の態様において、本明細書に記載の細菌を形質転換する、好ましくは遺伝子改変する方法は、遺伝子改変のためのツール、例えばＣＲＩＳＰＲツール、タイプIIイントロンの使用に基づくツール（例えば、Targetron（登録商標）ツールまたはClosTron（登録商標）ツール）および対立遺伝子交換ツール（例えば、ACE（登録商標）ツール）から選択される遺伝子改変のためのツールに関連し、上記のように、本発明による目的の核酸を前記細菌に導入することによって、前記細菌を形質転換する工程を含む。
【0170】
本発明は、一般的に、有利には、ファーミキューテス門に属する細菌、例えばクロストリジウム属の細菌を形質転換する、好ましくは遺伝子改変するために選択された遺伝子改変ツールが、野生型において１以上の抗生物質に対する耐性を担う酵素をコードする遺伝子を有する、および／または少なくとも１つの染色体外ＤＮＡ配列を野生型で有する、C. beijerinckiiなどの細菌において使用されることが意図されている場合に用いられ、かつ該遺伝子ツールの適用が、この細菌が野生型では耐性を有する抗生物質に対する耐性マーカーの発現を可能にする核酸を用いて上記細菌を形質転換する工程、および／または該抗生物質（この細菌が野生型で耐性を有する）を用いて形質転換された細菌および／または遺伝子改変された細菌を選択する工程、好ましくは該細菌のうち、該染色体外ＤＮＡ配列を欠失した細菌を選択するための工程を含む。
【0171】
例えばＣＲＩＳＰＲツール、タイプＩＩイントロンの使用に基づくツールおよび対立遺伝子交換ツールから選択される遺伝子改変のためのツールを用いて、本発明により有利に得られる改変は、望ましくない配列、例えば細菌に１以上の抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードする配列を欠失させること、またはこの望ましくない配列を非機能的にすることからなる。本発明により有利に得られる別の改変は、細菌の性能、例えば、目的の溶媒（ソルベント）または溶媒混合物の生産におけるその性能を向上させるために細菌を遺伝子改変することからなり、該細菌は、本発明により、野生型では耐性のある抗生物質に対して感受性となるように、および／または該細菌の野生型に存在する染色体外ＤＮＡ配列を除去するために、予め改変されている。
【0172】
好ましい態様において、本発明の方法は、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技術／遺伝子ツール、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（CRISPR-Associated protein）遺伝子ツールの使用（採用）に基づく。
【0173】
本発明は、Wangら（2015）に記載の、ヌクレアーゼ、ｇＲＮＡおよび修復マトリックスを含む単一プラスミドを用いた従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子ツールを用いて実施することができる。
【0174】
当業者であれば、周知の技術を用いて、標的とする染色体領域または移動性遺伝要素に応じて、ｇＲＮＡの配列および構造を容易に決定することができる（例えば、DiCarlo et al., 2013の文献を参照）。
【0175】
本発明者らは、本発明でも使用可能な、細菌を改変するための、クロストリジウム属の細菌を改変するのに適する、２つのプラスミドの使用に基づく遺伝子ツールを開発し、記載している（ＷＯ２０１７／０６４４３９、Wasels et al., 2017、および本明細書に添付する図１５を参照）。
【0176】
特定の態様において、このツールの“第１の”プラスミドはＣａｓヌクレアーゼの発現を可能にし、および“第２の”プラスミドは、実施されるべき改変に特異的な、１以上のｇＲＮＡ発現カセット（一般的には細菌ＤＮＡの異なる領域を標的とする）、ならびに相同組換え機序によって、Ｃａｓが標的とする細菌ＤＮＡの一部を目的の配列で置換することを可能にする、修復マトリックスを含む。Ｃａｓ遺伝子および／またはｇＲＮＡ発現カセット（複数可）は、当業者によって知られている構成的または誘導性の、好ましくは誘導性の発現プロモーター（例えば、出願ＷＯ２０１７／０６４４３９に記載され、引用により本明細書中に包含させる）、および好ましくは異なっているが、同一の誘導因子で誘導可能な発現プロモーター、の制御下に置かれている。
【0177】
使用可能なｇＲＮＡは、本明細書において上記のｇＲＮＡに対応する。
【0178】
本明細書に記載の細菌を形質転換する、および一般的には相同組換えによって遺伝子改変するために本発明において使用可能なＣＲＩＳＰＲ技術を伴う特定の方法は、以下の工程を含む。
ａ）抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導するための薬剤の存在下で、本発明者らが記載する核酸または遺伝子ツールを細菌に導入する工程、および
ｂ）抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現誘導剤を含まない培地中で（または関連しない条件下で）工程ａ）の最後に得られた形質転換細菌を培養し、一般的にはＤＮＡエンドヌクレアーゼ／ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の発現を可能にし、一般的にはＣａｓ／ｇＲＮＡ（前記抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の生成を停止し、エンドヌクレアーゼの作用を可能にするために）の発現を可能にする工程。
ａ）抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導するための薬剤の存在下で、本発明者らが記載する核酸または遺伝子ツールを細菌に導入する工程、および
ｂ）抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現誘導剤を含まない培地中で（または関連しない条件下で）工程ａ）の最後に得られた形質転換細菌を培養し、一般的にはＤＮＡエンドヌクレアーゼ／ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の発現を可能にし、一般的にはＣａｓ／ｇＲＮＡ（前記抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の生成を停止し、エンドヌクレアーゼの作用を可能にするために）の発現を可能にする工程。
【0179】
抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現誘導剤は、前記発現を誘導するのに十分な量で存在する。プロモーターＰｂｇａｌの場合、誘導剤であるラクトースにより、タンパク質ＢｇａＲの発現に関連する抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現阻害（転写抑制）を除去することが可能となる。
【0180】
抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現誘導剤は、好ましくは約１ｍＭ～約１Ｍ、好ましくは約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、例えば約４０ｍＭの濃度で使用される。
【0181】
好ましい態様において、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、遺伝子ツールの核酸配列を目的の細菌株に導入する工程の間、好ましくはヌクレアーゼの作用を阻害する、好ましくは中和することが可能である。
【0182】
特定の態様において、本方法は、工程ｂ）の間または後に、前記遺伝子ツールが前記細菌に導入されると、該細菌の目的の遺伝子改変を可能にするために、該遺伝子ツールに該プロモーター（複数可）が存在している場合には、ヌクレアーゼの発現および／または１つもしくは複数のガイドＲＮＡの発現を制御している１つまたは複数の誘導性プロモーターの発現を誘導する工程をさらに含む。該誘導は、選択された誘導性プロモーターに関連する発現阻害を除去できる物質を用いて実行される。
【0183】
従って、誘導工程が存在する場合、該誘導工程は、本発明の方法により遺伝子ツールを標的細菌に導入した後、当業者に知られているエンドヌクレアーゼ／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体の発現を可能にする培地上での任意の培養方法によって実施され得る。それは例えば、十分な量で存在する適切な物質と細菌を接触させるか、またはＵＶ光に曝露することによって行われる。この物質により、選択された誘導性プロモーターに関連する発現の阻害を除去することが可能となる。選択されたプロモーターが、Ｐｃｍ－２ｔｅｔＯ１およびＰｃｍ－ｔｅｔＯ２／１から選択されるアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）で誘導可能なプロモーターである場合、ａＴｃは、好ましくは、約１ｎｇ／ｍｌから約５０００ｎｇ／ｍｌの濃度、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌから８００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌから約８００ｎｇ／ｍｌまたは１０００ｎｇ／ｍｌ、あるいは約１００ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌまたは７００ｎｇ／ｍｌ、例えば約５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、５５０ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、６５０ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌまたは８００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。
【0184】
別の特定の態様において、本方法は、修復マトリックスを含む核酸を除去する（その後、細菌細胞は該核酸を“除去（stripped）”されたとみなされる）、および／または、１個または複数個のガイドＲＮＡもしくは工程ａ）において遺伝子ツールと共に導入された１個または複数個のガイドＲＮＡをコードする配列、を除去する、追加の工程ｃ）を含む。
【0185】
さらに別の特定の態様において、本方法は、工程ｂ）または工程ｃ）に続いて、既に導入されたそれ（それら）とは異なる修復マトリックス、および、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導する誘導剤の存在下で、細菌ゲノムの標的化ゾーンに上記の異なる修復マトリックスに含まれる目的の配列を組み込むことが可能な１以上のガイドＲＮＡ発現カセットを含む、第ｎの、例えば第３、第４、第５などの核酸を導入する、１以上の追加工程を含み、各追加工程の後には、このように形質転換された細菌を、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現を誘導する、一般的にはＣａｓ／ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体の発現を可能にする誘導剤を含まない培地中で培養する工程が含まれる。
【0186】
本発明による方法の特定の態様において、上記のような核酸または遺伝子ツールを用いて、目的の標的配列の少なくとも１本の鎖の切断を担う酵素を（例えばコード化して）用いて、細菌を形質転換し、その際、特定の態様において、酵素はヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓタイプのヌクレアーゼ、好ましくはＣａｓ９酵素およびＭＡＤ７酵素から選択されたヌクレアーゼである。一態様例において、目的の標的配列は、例えば、ｃａｔＢ遺伝子などの、細菌に１以上の抗生物質、好ましくはアンフェニコールの分類に属する１以上の抗生物質、一般的にはクロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼなどのアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する酵素をコードする配列であるか、コーディング配列の転写を調節する配列であるか、または上記コーディング配列に隣接する配列である。
【0187】
抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、用いる場合、一般的には、上記の“抗Ｃａｓ”タンパク質である。抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、有利には、“抗Ｃａｓ９”タンパク質または“抗ＭＡＤ７”タンパク質である。
【0188】
標的とされるＤＮＡ部位（“認識される配列”）と同様に、編集／修復マトリックス自体も、天然および／または合成の、コーディング配列および／または非コーディング配列に対応する１以上の核酸配列または核酸配列部位を含み得る。マトリックスはまた、１以上の“外来”配列、すなわちファーミキューテス門、特にクロストリジウム属、バチルス属もしくはラクトバチルス属に属する細菌のゲノム、または前記属の特定の種のゲノム、から天然に欠失している配列を含み得る。マトリックスはまた、配列の組み合わせを含み得る。
【0189】
本発明で用いられる遺伝子ツールにより、修復マトリックスの、細菌ゲノム内への目的の核酸、一般的には少なくとも１塩基対（ｂｐ）、好ましくは少なくとも１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、１０００ｂｐ、１００００ｂｐ、１０００００ｂｐまたは１００００００ｂｐ、一般的には１ｂｐから２０ｋｂ、例えば２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂまたは１３ｋｂ、あるいは１ｂｐから１０ｋｂ、好ましくは１０ｂｐから１０ｋｂまたは１ｋｂから１０ｋｂ、例えば１ｂｐから５ｋｂ、２ｋｂから５ｋｂ、あるいは２．５ｋｂまたは３ｋｂから５ｋｂを含む配列またはＤＮＡ配列部分の組み込みを誘導することが可能である。
【0190】
特定の態様において、目的のＤＮＡ配列の発現は、ファーミキューテス門、特にクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバチルス属に属する細菌が、複数の異なる糖、例えば少なくとも２つの異なる糖、一般的には、５つの炭素原子を含む糖（例えば、グルコースまたはマンノース）の内の、および／または６つの炭素原子を含む糖（例えば、キシロース、アラビノース、またはフルクトース）の内の、少なくとも２つの異なる糖、好ましくは、例えば、グルコース、キシロースおよびマンノース；グルコース、アラビノースおよびマンノース；ならびにグルコース、キシロースおよびアラビノースの内から選択された少なくとも３つの異なる糖、の発酵（一般的には、同時に）を可能にする。
【0191】
別の特定の態様において、目的のＤＮＡ配列は、少なくとも１つの目的の産物、好ましくは、改変された細菌による溶媒の生産を促進する産物、一般的には少なくとも１つの目的のタンパク質、例えば、酵素；トランスポーターなどの膜タンパク質；他のタンパク質の成熟のためのタンパク質（シャペロンタンパク）；転写因子；またはそれらの組み合わせ、をコードしている。
【0192】
遺伝子ツールの要素（核酸またはｇＲＮＡ）は、当業者によって知られている直接的または間接的な任意の方法、例えば形質転換、コンジュゲーション、マイクロインジェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション等によって、好ましくはエレクトロポレーション法（Mermelstein et al., 1993）によって、細菌に導入される。
【0193】
別の態様において、本発明の方法は、タイプＩＩイントロンの使用に基づき、例えば、ClosTron（登録商標）技術／遺伝子ツールまたはTargetron（登録商標）遺伝子ツールを用いる。
【0194】
Targetron（登録商標）技術は、リプログラム可能なグループＩＩのイントロン（Lactococcus lactisのイントロンＬｌ.ｌｔｒＢに基づく）の使用に基づき、細菌ゲノムを所望の遺伝子座に迅速に組み込むことができ（Chen et al., 2005、Wang et al., 2013）、通常、標的遺伝子の不活性化を目的とする。編集部位の認識およびレトロスプライシングによるゲノムへの挿入の機序は、一方ではイントロンと当該領域(ゾーン）の相同性に基づき、他方ではタンパク質（ｌｔｒＡ）の活性に基づいている。
【0195】
ClosTron（登録商標）技術は、同様のアプローチに基づき、イントロン配列内に選択マーカーを追加したものである（Heap et al., 2007）。このマーカーにより、イントロンのゲノムへの組み込みを選択することができ、目的の変異体の作製が容易になる。この遺伝子システムもタイプＩのイントロンを利用している。実際に、選択マーカー（レトロトランスポジション活性化マーカーの略でＲＡＭと称される）は、かかる遺伝子要素によって中断され、プラスミドからの発現が阻止される（このシステムのより正確な説明：Zhong et al.）。この遺伝的要素のスプライシングは、ゲノムに組み込まれる前に行われ、これにより耐性遺伝子の活性型を有する染色体が得られる。このシステムの最適化されたバージョンは、この遺伝子の上流および下流にＦＬＰ／ＦＲＴ部位を含み、これによりリコンビナーゼＦＲＴを用いて耐性遺伝子を除去することができる（Heap et al., 2010）。
【0196】
別の態様において、本発明による方法は、対立遺伝子交換ツールの使用に基づき、例えば、ＡＣＥ（登録商標）技術／遺伝子ツールを用いる。
【0197】
ＡＣＥ（登録商標）技術は、栄養素要求性変異体（C. acetobutylicum ATCC 824におけるｐｙｒＥ遺伝子の欠失によるウラシル要求性であり、５－フルオロオロチン酸（５－ＦＯＡ）への耐性も生じる；Heap et al., 2012）の使用に基づく。このシステムは当業者によく知られた、対立遺伝子交換機序を用いる。疑似自滅（pseudo-suicide）ベクター（非常に低コピー）の形質転換後、第１の対立遺伝子交換イベントによる細菌の染色体への後者の組み込みは、プラスミド上に最初から存在している耐性遺伝子によって確認することができる。この組み込み工程は、ｐｙｒＥ遺伝子座内に組み込まれる場合と、他の遺伝子座内に組み込まれる場合の２通りがある：
ｐｙｒＥ遺伝子座に組み込む場合、ｐｙｒＥ遺伝子もまた、プラスミド上に配置されるが、発現しない（機能的なプロモーターがない）。２回目の組換えによって機能的なｐｙｒＥ遺伝子が復活し、その語、栄養要求性（ウラシルを含まない最小培地）によって選択され得る。非機能性ｐｙｒＥ遺伝子もまた、選択可能な特徴（５－ＦＯＡへの感受性）を有するため、同じモデルにおいて、ｐｙｒＥの状態を機能性と非機能性の間で連続的に切り替えることにより、他の組み込みが可能である。
ｐｙｒＥ遺伝子座に組み込む場合、ｐｙｒＥ遺伝子もまた、プラスミド上に配置されるが、発現しない（機能的なプロモーターがない）。２回目の組換えによって機能的なｐｙｒＥ遺伝子が復活し、その語、栄養要求性（ウラシルを含まない最小培地）によって選択され得る。非機能性ｐｙｒＥ遺伝子もまた、選択可能な特徴（５－ＦＯＡへの感受性）を有するため、同じモデルにおいて、ｐｙｒＥの状態を機能性と非機能性の間で連続的に切り替えることにより、他の組み込みが可能である。
【0198】
他の遺伝子座に組み込む場合、組換え後に対選択マーカー（counter-selection marker）の発現を可能にするゲノム領域を標的とする（一般的には、他の遺伝子、好ましくは高発現遺伝子の後のオペロンを標的とする）。この２回目の組換えは、その後、栄養要求性（ウラシルを含まない最小培地）により選択される。
【0199】
タイプＩＩイントロンの使用に基づき、例えばＣｌｏｓＴｒｏｎ（登録商標）技術／遺伝子ツールまたはＴａｒｇｅｔｒｏｎ（登録商標）遺伝子ツールの使用、または対立遺伝子交換ツールの使用に基づき、例えばＡＣＥ（登録商標）技術／遺伝子ツールを用いて記載した態様において、標的とする配列は、一般的には本明細書に記載した配列のうちの1つである。
【0200】
￥
特に有利には、本発明の核酸および遺伝子ツールは、１つの工程で、すなわち単一の核酸（一般的には、本明細書に記載の“核酸ＯＰＴ”またはツールの“第２”もしくは“ｎ番目の”核酸）を用いて、またはいくつかの工程で、すなわちいくつかの核酸（一般的には、本明細書に記載の“第２”もしくは“ｎ番目の”核酸）を用いて、好ましくは１つの工程で、目的の小さなおよび大きな配列を細菌に導入することが可能である。
特に有利には、本発明の核酸および遺伝子ツールは、１つの工程で、すなわち単一の核酸（一般的には、本明細書に記載の“核酸ＯＰＴ”またはツールの“第２”もしくは“ｎ番目の”核酸）を用いて、またはいくつかの工程で、すなわちいくつかの核酸（一般的には、本明細書に記載の“第２”もしくは“ｎ番目の”核酸）を用いて、好ましくは１つの工程で、目的の小さなおよび大きな配列を細菌に導入することが可能である。
【0201】
本発明の特定の態様において、本発明の核酸および遺伝子ツールは、細菌ＤＮＡの標的化部分を抑制すること、またはそれをより短い配列（例えば、少なくとも１つの塩基対を欠失した配列）および／または非機能的配列で置き換えることを可能にする。本発明の好ましい特定の態様において、本発明の核酸および遺伝子ツールは、有利には、細菌に、例えば細菌ゲノムに、少なくとも１つの塩基対、および２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂまたは１５ｋｂまでを含む目的の核酸を導入することを可能にする。
【0202】
本発明はさらに、形質転換および／または遺伝子組換え細菌、一般的にはファーミキューテス門に属し、例えばクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバチルス属に属する細菌、一般的には溶媒生成細菌、好ましくは、本発明者らが本明細書にて説明したサブクレードの１つに対応する種に属する細菌、または本発明者らが本明細書で説明したような方法を用いて得られた細菌、ならびにそれに由来する細菌、クローン、変異体または遺伝子組換え体、およびそれらの使用に関する。
【0203】
このようにして本発明において形質転換および／または遺伝子改変された細菌の一例は、１以上の抗生物質に対する耐性を付与する酵素をもはや発現しない細菌、特にアンフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをもはや発現しない細菌、例えば野生状態では遺伝子ｃａｔＢを発現し、本発明において形質転換および／または遺伝子改変すると前記遺伝子ｃａｔＢが欠失されるかまたは発現不能となる細菌、である。従って、本発明において形質転換および／または遺伝子改変された細菌は、アンフェニコール、例えば本明細書に記載のアンフェニコール、特にクロラムフェニコールまたはチアンフェニコールに対して感受性とされる。
【0204】
本発明における好ましい遺伝子組換え細菌の特定の例は、２０１８年１２月６日にBelgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (“ＢＣＣＭ”, K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent - Belgium) に寄託番号ＬＭＧ Ｐ－３１１５１で登録された、C. beijerinckii ＩＦＰ９６２ ΔｃａｔＢとしても特定される細菌である。
【0205】
本発明における好ましい遺伝子組換え細菌の別の特定の例では、本明細書においてC. beijerinckiiとして定義される細菌が、２０１９年２月２０日にｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＢＣＣＭ－ＬＭに寄託番号ＬＭＧ Ｐ－３１２７７で登録された株C. beijerinckii ＩＦＰ９６３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２である。
【0206】
本明細書はまた、前記細菌の１つの任意の派生細菌、クローン、変異体または遺伝子改変バージョンに関し、例えば、チアンフェニコールおよび／またはクロラムフェニコールなどのアンフェニコールに感受性を有する、前記任意の派生細菌、クローン、変異体または遺伝子改変バージョンであって、一般的には配列番号１８の遺伝子ｃａｔＢおよびプラスミドｐＮＦ２を欠く細菌に関する。
【0207】
特定の態様では、本発明による形質転換および／または遺伝子組換え細菌であり、例えば細菌C. beijerinckii ＩＦＰ９６２ ΔｃａｔＢまたは細菌C. beijerinckii ＩＦＰ９６３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２は、依然として形質転換ができ、好ましくは遺伝子改変されている。これは、核酸、例えば、本明細書の、例えば実験部分に記載のプラスミドを用いて行うことができる。有利に使用できる核酸の例は、配列番号２３の配列のプラスミドｐＣａｓ９ａｃｒ（本明細書の実験部分に記載）であり、あるいはｐＣａｓ９ｉｎｄ（配列番号２２）、ｐＣａｓ９ｃｏｎｄ（配列番号１３３）およびｐＭＡＤ７（配列番号１３４）から選択されるプラスミドである。
【0208】
本発明の特定の面は、実際には、本明細書に記載の遺伝子組換え細菌、好ましくは、受託番号ＬＭＧ Ｐ－３１１５１で寄託された細菌C. beijerinckii ＩＦＰ９６２ ΔｃａｔＢ（本明細書中、C. beijerinckii ＤＳＭ ６４２３ ΔｃａｔＢとしても記載される）、さらに好ましくは受託番号ＬＭＧ Ｐ－３１２７７で寄託された細菌 C. beijerinckii ＩＦＰ９６３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２、または後者の1つの遺伝子組換え体の使用、例えば本明細書に記載の核酸、遺伝子ツールもしくは方法の１つを用いて、自発的にそのゲノムに導入された１つまたは複数の目的の核酸の発現により、好ましくは工業規模で、１以上の溶媒、少なくともイソプロパノールを生産するための使用に関する。
【0209】
本発明はまた、（ｉ）本明細書に記載の核酸、例えば、“核酸ＯＰＴ”または本明細書に記載のファーミキューテス門に属する細菌中の標的配列を認識するＤＮＡフラグメント、および（ｉｉ）この種の細菌の改良型変異体を生産するために、該細菌を形質転換する、および一般的には遺伝子改変するための、以下の遺伝子改変ツールの要素から選択された少なくとも１つのツール、好ましくはいくつかのツール；ｇＲＮＡである核酸；修復マトリックスである核酸；“核酸ＯＰＴ”；少なくとも１つのプライマーペア、例えば、本明細書に記載のプライマーペア；および、上記ツールによってコードされるタンパク質の、例えば、Ｃａｓ９またはＭＡＤ７型ヌクレアーゼの発現を可能にする誘導剤、を含むキットに関する。
【0210】
本明細書に記載のファーミキューテス門に属する細菌を形質転換し、一般的には遺伝子改変するための遺伝子改変ツールは、例えば、上記に説明したように、“核酸ＯＰＴ”、ＣＲＩＳＰＲツール、タイプＩＩのイントロンの使用に基づくツールおよび対立遺伝子交換ツールから選択することができる。
【0211】
特定の態様において、キットは、本明細書に記載の遺伝子ツールの要素の一部または全部を含む。
【0212】
本明細書に記載のファーミキューテス門に属する細菌を形質転換し、好ましくは遺伝子改変するための、またはこの種の細菌を使用して少なくとも１つの溶媒、例えば溶媒混合物を生産するための特定のキットは、ｉ）配列番号１２６の配列の全部または一部、およびｉｉ）細菌の遺伝子の改変および／または該細菌の野生型に存在する遺伝物質から部分的もしくは完全に欠失されたＤＮＡ配列の、前記細菌における発現を可能にする配列、を含む、またはこれらからなる核酸を含み；並びに、本明細書に記載の遺伝子ツールにおいて用いられる、選択した抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の発現の誘導性プロモーターに適した少なくとも１つの誘導剤を含む。
【0213】
キットは、用いられるヌクレアーゼおよび／または１以上のガイドＲＮＡの発現を調節するために遺伝子ツールにおいて要すれば用いられよい選択された誘導性プロモーター（複数可）に適した１以上の誘導剤をさらに含んでもよい。
【0214】
本発明の特定のキットは、標識（または“タグ”）を含むヌクレアーゼの発現を可能にする。
【0215】
本発明のキットは、培養液、本明細書に記載のファーミキューテス門に属する少なくとも１つのコンピテントな細菌、例えばクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバチルス属の細菌（すなわち、形質転換を考慮して）、少なくとも１つのｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、１以上の選択分子、または説明リーフレットなども含む、１つまたは複数の消耗品（consumable）をさらに含み得る。
【0216】
本明細書はまた、本発明のキット、またはこのキットの１以上の要素の使用に関し、ファーミキューテス門に属する細菌、例えばクロストリジウム属、バチルス属またはラクトバチルス属の細菌（例えば、細菌C. beijerinckii ＩＦＰ９６２ ΔｃａｔＢは、受託番号ＬＭＧ Ｐ－３１１５１で寄託されている）、好ましくは、野生状態で、細菌染色体と染色体DNAとは異なる少なくとも１つのＤＮＡ分子（通常は、天然プラスミド）の両方を保有する細菌、最も好ましくは細菌C. beijerinckii ＩＦＰ９６３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２（受託番号ＬＭＧ Ｐ－３１２７７で寄託）、の形質転換および理想的な遺伝子改変の方法を実行するため、および／または該細菌を用いて、溶媒（複数可）またはバイオ燃料（複数可）、またはそれらの混合物を、好ましくは工業規模で製造するための、本明細書に記載のキットの使用に関する。
【0217】
生産され得る溶媒は、一般的にはアセトン、ブタノール、エタノール、イソプロパノールまたはそれらの混合物、一般的にはエタノール／イソプロパノール、ブタノール／イソプロパノール、またはエタノール／ブタノール混合物、好ましくはイソプロパノール／ブタノール混合物である。
【0218】
本発明における形質転換された細菌の使用は、一般的には、少なくとも１００トンのアセトン、少なくとも１００トンのエタノール、少なくとも１０００トンのイソプロパノール、少なくとも１８００トンのブタノール、または少なくとも４００００トンのそれらの混合物の工業規模での年間生産を可能にする。
【0219】
以下の実施例は、発明の範囲を限定することなく、本発明をより十分に説明するためのものである。
【実施例】
【0220】
実施例１
材料および方法
培養条件
C.acetobutylicum ＤＳＭ７９２を２ＹＴＧ培地（トリプトン１６ｇ．ｌ－１、酵母エキス１０ｇ．ｌ－１、グルコース５ｇ．ｌ－１、ＮａＣｌ４ｇ．ｌ－１）中で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ１０ＢをＬＢ培地（トリプトン１０ｇ．ｌ－１、酵母エキス５ｇ．ｌ－１、ＮａＣｌ５ｇ．ｌ－１）で培養した。固体培地は１５ｇ．ｌ－１のアガロースを液体培地に添加することで調製した。エリスロマイシン（２ＹＴＧまたはＬＢ培地にそれぞれに、４０ｍｇまたは５００ｍｇ．ｌ－１の濃度）、クロラムフェニコール（固体または液体ＬＢ培地それぞれに２５ｍｇまたは１２．５ｍｇ．ｌ－１）、およびチアンフェニコール（２ＹＴＧ培地に１５ｍｇ．ｌ－１）を、必要な場合には用いた。
材料および方法
培養条件
C.acetobutylicum ＤＳＭ７９２を２ＹＴＧ培地（トリプトン１６ｇ．ｌ－１、酵母エキス１０ｇ．ｌ－１、グルコース５ｇ．ｌ－１、ＮａＣｌ４ｇ．ｌ－１）中で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ１０ＢをＬＢ培地（トリプトン１０ｇ．ｌ－１、酵母エキス５ｇ．ｌ－１、ＮａＣｌ５ｇ．ｌ－１）で培養した。固体培地は１５ｇ．ｌ－１のアガロースを液体培地に添加することで調製した。エリスロマイシン（２ＹＴＧまたはＬＢ培地にそれぞれに、４０ｍｇまたは５００ｍｇ．ｌ－１の濃度）、クロラムフェニコール（固体または液体ＬＢ培地それぞれに２５ｍｇまたは１２．５ｍｇ．ｌ－１）、およびチアンフェニコール（２ＹＴＧ培地に１５ｍｇ．ｌ－１）を、必要な場合には用いた。
【0221】
核酸の取り扱い
用いた全ての酵素およびキットは、供給業者の推奨に従って用いた。
用いた全ての酵素およびキットは、供給業者の推奨に従って用いた。
【0222】
プラスミドの構築
図４に示すプラスミドｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３)を、Eurofins Genomicsが合成したプロモーターＰｂｇａｌの制御下にｂｇａＲおよびａｃｒＩＩＡ４を含むフラグメント(配列番号８１）をベクターｐＣａｓ９ｉｎｄのＳａｃＩ部位のレベルでクローニングすることにより構築した（Wasels et al., 2017)。
図４に示すプラスミドｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３)を、Eurofins Genomicsが合成したプロモーターＰｂｇａｌの制御下にｂｇａＲおよびａｃｒＩＩＡ４を含むフラグメント(配列番号８１）をベクターｐＣａｓ９ｉｎｄのＳａｃＩ部位のレベルでクローニングすることにより構築した（Wasels et al., 2017)。
【0223】
プラスミドｐＧＲＮＡｉｎｄ（配列番号８２）を、Eurofins Genomicsが合成したプロモーターＰｃｍ－２ｔｅｔＯ１（Dong et al., 2012）の制御下にｇＲＮＡの発現カセット(配列番号８３）をベクターｐＥＣ７５０Ｃ（配列番号１０６）のＳａｃＩ部位にクローニングすることにより構築した（Wasels et al., 2017）。
【0224】
プラスミドｐＧＲＮＡ－ｘｙｌＢ（配列番号１０２）、ｐＧＲＮＡ－ｘｙｌＲ（配列番号１０３）、ｐＧＲＮＡ－ｇｌｃＧ（配列番号１０４）およびｐＧＲＮＡ－ｂｄｈＢ（配列番号１０５）を、それぞれのプライマーペア５’－ＴＣＡＴＧＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴＡＴＴＡＧＣＴＡＧ－’および５’－ＡＡＡＣＣＴＡＧＣＴＡＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＣ－３’、５’－ＴＣＡＴＧＴＴＡＣＡＣＴＴＧＧＡＡＣＡＧＧＣＧＴ－３’および５’－ＡＡＡＣＡＣＧＣＣＴＧＴＴＣＣＡＡＧＴＧＴＡＡＣ－３’、５’－ＴＣＡＴＴＴＣＣＧＧＣＡＧＴＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡ－３’および５’－ＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＣＣＧＧＡＡ－３’、５’－ＴＣＡＴＧＣＴＴＡＴＴＡＣＧＡＣＡＴＡＡＣＡＣＡ－３’および５’－ＡＡＡＣＴＧＴＧＴＴＡＴＧＴＣＧＴＡＡＴＡＡＧＣ－３’で、ＢｓａＩで消化したプラスミドｐＧＲＮＡｉｎｄ（配列番号８２）内にクローニングすることにより構築した。
【0225】
プラスミドｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＢ（配列番号７９）を、一方はプライマー５’－ＡＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＣ－３’および５’－ＧＧＴＴＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＣＴＡＣＣＧ－３’を、他方は５’－ＡＣＡＣＡＧＡＴＴＴＧＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＣＴＴＴＡＡＣＣＣ－３’および５’－ＡＴＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＴＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧＴＡＴＧＧ－３’を用いて得られたＰＣＲ産物のＰＣＲアセンブリのオーバーラップによって得られたＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化したベクターｐＧＲＮＡ－ｂｄｈＢ内にクローニングして構築した。
【0226】
プラスミドｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＡ ΔｂｄｈＢ（配列番号８０）を、一方はプライマー５’－ＡＴＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＡＡＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＴＣ－３’および５’－ＧＣＴＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＣＴＡＣＣＧ－３’を、他方は５’－ＡＣＡＣＡＧＡＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＡＧＣＡＴＡＣＴＴＣＴＴＡＣＣ－３’および５’－ＡＴＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＴＣＴＣＣＴＣＴＡＣＴＡＴＴＴＴＡＧ－３’を用いて得られたＰＣＲ産物のＰＣＲアセンブリのオーバーラップによって得られたＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化したベクターｐＧＲＮＡ－ｂｄｈＢ中にクローニングすることで構築した。
【0227】
形質転換
C.acetobutylicum ＤＳＭ７９２をMermelstein et al., 1993に記載のプロトコルに従って形質転換した。ｇＲＮＡ発現カセットを含むプラスミドで形質転換され、Ｃａｓ９発現プラスミド（ｐＣａｓ９ｉｎｄまたはｐＣａｓ９ａｃｒ）をすでに含む、C.acetobutylicum ＤＳＭ７９２形質転換体の選択を、エリスロマイシン（４０ｍｇ．ｌ－１）、チアンフェニコール（１５ｍｇ．ｌ－１）およびラクトース（４０ｎＭ）を含む固体２ＹＴＧ培地で行った。
C.acetobutylicum ＤＳＭ７９２をMermelstein et al., 1993に記載のプロトコルに従って形質転換した。ｇＲＮＡ発現カセットを含むプラスミドで形質転換され、Ｃａｓ９発現プラスミド（ｐＣａｓ９ｉｎｄまたはｐＣａｓ９ａｃｒ）をすでに含む、C.acetobutylicum ＤＳＭ７９２形質転換体の選択を、エリスロマイシン（４０ｍｇ．ｌ－１）、チアンフェニコール（１５ｍｇ．ｌ－１）およびラクトース（４０ｎＭ）を含む固体２ＹＴＧ培地で行った。
【0228】
ｃａｓ９発現の誘導
得られた形質転換体の増殖過程において、エリスロマイシン（４０ｍｇ．ｌ－１）、チアンフェニコール（１５ｍｇ．ｌ－１）ならびにｃａｓ９およびｇＲＮＡ発現誘導剤、ａＴｃ（１ｍｇ．ｌ－１）を含む固体２ＹＴＧ培地でｃａｓ９の発現の誘導を行った。
得られた形質転換体の増殖過程において、エリスロマイシン（４０ｍｇ．ｌ－１）、チアンフェニコール（１５ｍｇ．ｌ－１）ならびにｃａｓ９およびｇＲＮＡ発現誘導剤、ａＴｃ（１ｍｇ．ｌ－１）を含む固体２ＹＴＧ培地でｃａｓ９の発現の誘導を行った。
【0229】
ｂｄｈ遺伝子座の増幅
ｂｄｈＡ遺伝子およびｂｄｈＢ遺伝子の遺伝子座におけるC.acetobutylicum ＤＳＭ７９２のゲノム編集の制御は、Ｑ５（登録商標）High-Fidelity ＤＮＡポリメラーゼ酵素（ＮＥＢ）とプライマーＶ１（５’－ＡＣＡＣＡＴＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＴＴＴ－３’）およびプライマーＶ２（５’－ＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＴ－３’）を用いたＰＣＲによって実施された。
ｂｄｈＡ遺伝子およびｂｄｈＢ遺伝子の遺伝子座におけるC.acetobutylicum ＤＳＭ７９２のゲノム編集の制御は、Ｑ５（登録商標）High-Fidelity ＤＮＡポリメラーゼ酵素（ＮＥＢ）とプライマーＶ１（５’－ＡＣＡＣＡＴＴＧＡＡＧＧＧＡＧＣＴＴＴＴ－３’）およびプライマーＶ２（５’－ＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＴＴＴ－３’）を用いたＰＣＲによって実施された。
【0230】
結果
形質転換効率
ａｃｒＩＩＡ４ 遺伝子の挿入がＣａｓ９発現プラスミドの形質転換頻度に与える影響を評価するために、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（配列番号２２）またはｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３）を含むＤＳＭ７９２菌株に、種々のｇＲＮＡ発現プラスミドを形質転換し、その形質転換体をラクトース補充培地で選択した。得られた形質転換頻度を図５に示す。
形質転換効率
ａｃｒＩＩＡ４ 遺伝子の挿入がＣａｓ９発現プラスミドの形質転換頻度に与える影響を評価するために、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（配列番号２２）またはｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３）を含むＤＳＭ７９２菌株に、種々のｇＲＮＡ発現プラスミドを形質転換し、その形質転換体をラクトース補充培地で選択した。得られた形質転換頻度を図５に示す。
【0231】
ΔｂｄｈＢおよびΔｂｄｈＡΔｂｄｈＢ変異体の作成
ｂｄｈＢ（ｐＧＲＮＡ－ｂｄｈＢ－配列番号１０５）を標的とするｇＲＮＡ発現カセットを含む標的プラスミド、ならびにｂｄｈＢ遺伝子単独（ｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＢ－配列番号７９）またはｂｄｈＡおよびｂｄｈＢ遺伝子（ｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＡΔｂｄｈＢ－配列番号８０）の欠失を可能にする修復マトリックスを含む２つの派生プラスミドを、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（配列番号２２）またはｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３）を含むＤＳＭ７９２菌株に形質転換した。得られた形質転換頻度を表２に示す。
ｂｄｈＢ（ｐＧＲＮＡ－ｂｄｈＢ－配列番号１０５）を標的とするｇＲＮＡ発現カセットを含む標的プラスミド、ならびにｂｄｈＢ遺伝子単独（ｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＢ－配列番号７９）またはｂｄｈＡおよびｂｄｈＢ遺伝子（ｐＧＲＮＡ－ΔｂｄｈＡΔｂｄｈＢ－配列番号８０）の欠失を可能にする修復マトリックスを含む２つの派生プラスミドを、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（配列番号２２）またはｐＣａｓ９ａｃｒ（配列番号２３）を含むＤＳＭ７９２菌株に形質転換した。得られた形質転換頻度を表２に示す。
【0232】
【表2】
【0233】
ｐＣａｓ９ｉｎｄまたはｐＣａｓ９ａｃｒを含むＤＳＭ７９２菌株における、ｂｄｈＢを標的とするプラスミドの形質転換頻度。頻度は、形質転換に用いたＤＮＡ１μｇあたりの得られた形質転換体の数で示し、少なくとも２つの独立した実験の平均値で示す。
【0234】
得られた形質転換体に、アンヒドロテトラサイクリン、ａＴｃを補充した培地上で培養することによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの発現を誘導する工程を行った（図６）。
【0235】
所望の改変を、２つのａＴｃ耐性コロニーのゲノムＤＮＡのＰＣＲにより確認した（図７）。
【0236】
結論
Wasels et al. (2017)に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子ツールは、以下の２つのプラスミドを用いる：
－第１のプラスミド、ｐＣａｓ９ｉｎｄは、ａＴｃ誘導性プロモーターの制御下にあるＣａｓ９を含む、および
－ｐＥＣ７５０Ｃに由来する第２のプラスミドは、ｇＲＮＡ発現カセット（第２のａＴｃ誘導性プロモーターの制御下にある）およびこのシステムによって誘導された２本鎖切断を修復するための編集マトリックスを含む。
Wasels et al. (2017)に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく遺伝子ツールは、以下の２つのプラスミドを用いる：
－第１のプラスミド、ｐＣａｓ９ｉｎｄは、ａＴｃ誘導性プロモーターの制御下にあるＣａｓ９を含む、および
－ｐＥＣ７５０Ｃに由来する第２のプラスミドは、ｇＲＮＡ発現カセット（第２のａＴｃ誘導性プロモーターの制御下にある）およびこのシステムによって誘導された２本鎖切断を修復するための編集マトリックスを含む。
【0237】
しかしながら、本発明者らはａＴｃ誘導性プロモーターを用いてＣａｓ９の発現制御と同様にｇＲＮＡの発現を制御したにも関わらず、特定のｇＲＮＡが依然として毒性が高いことを確認したため、その結果遺伝子ツールによる細菌の形質転換効率を制限し、よって染色体の改変が制限されることを観察した。
【0238】
この遺伝子ツールを改良するため、抗ＣＲＩＳＰＲ遺伝子、ａｃｒＩＩＡ４を、ラクトース誘導性プロモーターの制御下に配置されるように挿入することによりｃａｓ９発現プラスミドを改変した。これにより、異なるｇＲＮＡ発現プラスミドの形質転換効率を顕著に向上させ、試験した全てのプラスミドについて形質転換体を得ることができた。
【0239】
ｐＣａｓ９ｉｎｄを含むＤＳＭ７９２菌株に導入できなかったプラスミドを用いて、C.acetobutylicum ＤＳＭ７９２ゲノム内のｂｄｈＢ遺伝子座の編集もまた行うことができた。観察された改変頻度は以前の観察（Wasels et al., 2017）と同様であり、試験したコロニーの１００％が改変されていた。
【0240】
結論として、ｃａｓ９発現プラスミドの改変は、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体のより良い制御を可能にし、目的の変異体を得るためにＣａｓ９の作用が誘発され得る形質転換体の生産を有利に促進する。
【0241】
実施例２
材料および方法
培養条件
C.beijerinckii ＤＳＭ６４２３を２ＹＴＧ培地（トリプトン１６ｇ．Ｌ－１、酵母エキス１０ｇ．Ｌ－１、グルコース５ｇ．Ｌ－１、ＮａＣｌ４ｇ．Ｌ－１）で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ１０－βおよびＩＮＶ１１０をＬＢ培地（トリプトン１０ｇ．Ｌ－１、酵母エキス５ｇ．Ｌ－１、ＮａＣｌ５ｇ．Ｌ－１）で培養した。固体培地を１５ｇ．Ｌ－１のアガロースを液体培地に添加することで調製した。エリスロマイシン（２ＹＴＧまたはＬＢ培地中に、それぞれ２０ｍｇまたは５００ｍｇ．Ｌ－１の濃度）、クロラムフェニコール（固体または液体ＬＢ培地中に、それぞれ２５ｍｇまたは１２．５ｍｇ．Ｌ－１）、チアンフェニコール（２ＹＴＧ培地中に１５ｍｇ．Ｌ－１）またはスペクチノマイシン（ＬＢまたは２ＹＴＧ培地中に、それぞれ１００ｍｇまたは６５０ｍｇ．Ｌ－１の濃度）を、必要な場合には用いた。
材料および方法
培養条件
C.beijerinckii ＤＳＭ６４２３を２ＹＴＧ培地（トリプトン１６ｇ．Ｌ－１、酵母エキス１０ｇ．Ｌ－１、グルコース５ｇ．Ｌ－１、ＮａＣｌ４ｇ．Ｌ－１）で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＥＢ１０－βおよびＩＮＶ１１０をＬＢ培地（トリプトン１０ｇ．Ｌ－１、酵母エキス５ｇ．Ｌ－１、ＮａＣｌ５ｇ．Ｌ－１）で培養した。固体培地を１５ｇ．Ｌ－１のアガロースを液体培地に添加することで調製した。エリスロマイシン（２ＹＴＧまたはＬＢ培地中に、それぞれ２０ｍｇまたは５００ｍｇ．Ｌ－１の濃度）、クロラムフェニコール（固体または液体ＬＢ培地中に、それぞれ２５ｍｇまたは１２．５ｍｇ．Ｌ－１）、チアンフェニコール（２ＹＴＧ培地中に１５ｍｇ．Ｌ－１）またはスペクチノマイシン（ＬＢまたは２ＹＴＧ培地中に、それぞれ１００ｍｇまたは６５０ｍｇ．Ｌ－１の濃度）を、必要な場合には用いた。
【0242】
核酸およびプラスミドベクター
全ての酵素およびキットは、提供業者の推奨に従って用いた。
全ての酵素およびキットは、提供業者の推奨に従って用いた。
【0243】
コロニーＰＣＲアッセイを以下のプロトコルで観察した：
C. beijerinckii ＤＳＭ ６４２３の単離したコロニーを、１００μＬのＴｒｉｓ １０ｍＭ ｐＨ７．５ ＥＤＴＡ ５ｍＭに再懸濁させた。この溶液を９８℃で１０分間、撹拌せずに加熱した。次いで、０．５μＬのこの細菌溶解物を、Ｐｈｉｒｅ（Thermo Scientific）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（Thermo Scientific）、Ｑ５（NEB）またはＫＡＰＡ２Ｇ Ｒｏｂｕｓｔ（Sigma-Aldrich）ポリメラーゼを含む１０μＬの反応系において、ＰＣＲマトリックスとして用い得る。
C. beijerinckii ＤＳＭ ６４２３の単離したコロニーを、１００μＬのＴｒｉｓ １０ｍＭ ｐＨ７．５ ＥＤＴＡ ５ｍＭに再懸濁させた。この溶液を９８℃で１０分間、撹拌せずに加熱した。次いで、０．５μＬのこの細菌溶解物を、Ｐｈｉｒｅ（Thermo Scientific）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（Thermo Scientific）、Ｑ５（NEB）またはＫＡＰＡ２Ｇ Ｒｏｂｕｓｔ（Sigma-Aldrich）ポリメラーゼを含む１０μＬの反応系において、ＰＣＲマトリックスとして用い得る。
【0244】
全ての構築物において用いたプライマーのリスト（名称／ＤＮＡ配列）を以下に詳述する：
ΔcatB_fwd : TGTTATGGATTATAAGCGGCTCGAGGACGTCAAACCATGTTAATCATTGC
ΔcatB_rev : AATCTATCACTGATAGGGACTCGAGCAATTTCACCAAAGAATTCGCTAGC
ΔcatB_gRNA_rev : AATCTATCACTGATAGGGACTCGAGGGGCAAAAGTGTAAAGACAAGCTTC
RH076 : CATATAATAAAAGGAAACCTCTTGATCG
RH077 : ATTGCCAGCCTAACACTTGG
RH001 : ATCTCCATGGACGCGTGACGTCGACATAAGGTACCAGGAATTAGAGCAGC
RH002 : TCTATCTCCAGCTCTAGACCATTATTATTCCTCCAAGTTTGCT
RH003 : ATAATGGTCTAGAGCTGGAGATAGATTATTTGGTACTAAG
RH004 : TATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGAAGCGCTTATTATTGCATTAGC
pEX-fwd : CAGATTGTACTGAGAGTGCACC
pEX-rev : GTGAGCGGATAACAATTTCACAC
pEC750C-fwd : CAATATTCCACAATATTATATTATAAGCTAGC
M13-rev : CAGGAAACAGCTATGAC
RH010 : CGGATATTGCATTACCAGTAGC
RH011 : TTATCAATCTCTTACACATGGAGC
RH025 : TAGTATGCCGCCATTATTACGACA
RH134 : GTCGACGTGGAATTGTGAGC
pNF2_fwd : GGGCGCACTTATACACCACC
pNF2_rev : TGCTACGCACCCCCTAAAGG
RH021 : ACTTGGGTCGACCACGATAAAACAAGGTTTTAAGG
RH022 : TACCAGGGATCCGTATTAATGTAACTATGATATCAATTCTTG
aad9-fwd2 : ATGCATGGTCCCAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGG
aad9-rev : ATGCGAGTTAACAACTTCTAAAATCTGATTACCAATTAG
RH031 : ATGCATGGATCCCAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGG
RH032 : ATGCGAGAGCTCAACTTCTAAAATCTGATTACCAATTAG
RH138 : ATGCATGGATCCGTCTGACAGTTACCAGGTCC
RH139 : ATGCGAGAGCTCCAATTGTTCAAAAAAATAATGGCGGAG
RH140 : ATGCATGGATCCCGGCAGTTTTTCTTTTTCGG
RH141 : ATGCGAGAGCTCGGTTAAATACTAGTTTTTAGTTACAGAC
ΔcatB_fwd : TGTTATGGATTATAAGCGGCTCGAGGACGTCAAACCATGTTAATCATTGC
ΔcatB_rev : AATCTATCACTGATAGGGACTCGAGCAATTTCACCAAAGAATTCGCTAGC
ΔcatB_gRNA_rev : AATCTATCACTGATAGGGACTCGAGGGGCAAAAGTGTAAAGACAAGCTTC
RH076 : CATATAATAAAAGGAAACCTCTTGATCG
RH077 : ATTGCCAGCCTAACACTTGG
RH001 : ATCTCCATGGACGCGTGACGTCGACATAAGGTACCAGGAATTAGAGCAGC
RH002 : TCTATCTCCAGCTCTAGACCATTATTATTCCTCCAAGTTTGCT
RH003 : ATAATGGTCTAGAGCTGGAGATAGATTATTTGGTACTAAG
RH004 : TATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGAAGCGCTTATTATTGCATTAGC
pEX-fwd : CAGATTGTACTGAGAGTGCACC
pEX-rev : GTGAGCGGATAACAATTTCACAC
pEC750C-fwd : CAATATTCCACAATATTATATTATAAGCTAGC
M13-rev : CAGGAAACAGCTATGAC
RH010 : CGGATATTGCATTACCAGTAGC
RH011 : TTATCAATCTCTTACACATGGAGC
RH025 : TAGTATGCCGCCATTATTACGACA
RH134 : GTCGACGTGGAATTGTGAGC
pNF2_fwd : GGGCGCACTTATACACCACC
pNF2_rev : TGCTACGCACCCCCTAAAGG
RH021 : ACTTGGGTCGACCACGATAAAACAAGGTTTTAAGG
RH022 : TACCAGGGATCCGTATTAATGTAACTATGATATCAATTCTTG
aad9-fwd2 : ATGCATGGTCCCAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGG
aad9-rev : ATGCGAGTTAACAACTTCTAAAATCTGATTACCAATTAG
RH031 : ATGCATGGATCCCAATGAATAGGTTTACACTTACTTTAGTTTTATGG
RH032 : ATGCGAGAGCTCAACTTCTAAAATCTGATTACCAATTAG
RH138 : ATGCATGGATCCGTCTGACAGTTACCAGGTCC
RH139 : ATGCGAGAGCTCCAATTGTTCAAAAAAATAATGGCGGAG
RH140 : ATGCATGGATCCCGGCAGTTTTTCTTTTTCGG
RH141 : ATGCGAGAGCTCGGTTAAATACTAGTTTTTAGTTACAGAC
【0245】
以下のプラスミドベクターを調製した：
－プラスミド番号１：ｐＥＸ－Ａ２５８－ΔｃａｔＢ（配列番号１７）
これは、プラスミドｐＥＸ－Ａ２５８にクローニングした合成ＤＮＡフラグメントΔｃａｔＢを含む。このΔｃａｔＢフラグメントは、ｉ）アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーター（発現カセット：配列番号１９）の制御下にあるC.beijerinckii ＤＳＭ６４２３のｃａｔＢ遺伝子（クロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードするクロラムフェニコール耐性遺伝子－配列番号１８）を標的とするガイドＲＮＡ発現カセット、およびｉｉ）ｃａｔＢ遺伝子の上流および下流に位置する相同な４００ｂｐを含む編集マトリックス（配列番号２０）、を含む。
－プラスミド番号１：ｐＥＸ－Ａ２５８－ΔｃａｔＢ（配列番号１７）
これは、プラスミドｐＥＸ－Ａ２５８にクローニングした合成ＤＮＡフラグメントΔｃａｔＢを含む。このΔｃａｔＢフラグメントは、ｉ）アンヒドロテトラサイクリン誘導性プロモーター（発現カセット：配列番号１９）の制御下にあるC.beijerinckii ＤＳＭ６４２３のｃａｔＢ遺伝子（クロラムフェニコール－Ｏ－アセチルトランスフェラーゼをコードするクロラムフェニコール耐性遺伝子－配列番号１８）を標的とするガイドＲＮＡ発現カセット、およびｉｉ）ｃａｔＢ遺伝子の上流および下流に位置する相同な４００ｂｐを含む編集マトリックス（配列番号２０）、を含む。
【0246】
－プラスミド番号２：ｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢ（図９および配列番号２１参照）
これは、ＰＣＲで増幅され（プライマーΔｃａｔＢ＿ｆｗｄおよびΔｃａｔＢ＿ｒｅｖ）、かつＸｈｏＩ制限酵素によって種々のＤＮＡを消化した後にｐＣａｓ９ｉｎｄ（特許出願ＷＯ２０１７／０６４４３９に記載－配列番号２２）にクローニングされた、ΔｃａｔＢフラグメントを含む。
これは、ＰＣＲで増幅され（プライマーΔｃａｔＢ＿ｆｗｄおよびΔｃａｔＢ＿ｒｅｖ）、かつＸｈｏＩ制限酵素によって種々のＤＮＡを消化した後にｐＣａｓ９ｉｎｄ（特許出願ＷＯ２０１７／０６４４３９に記載－配列番号２２）にクローニングされた、ΔｃａｔＢフラグメントを含む。
【0247】
－プラスミド番号３：ｐＣａｓ９ａｃｒ（図１０および配列番号２３参照）
【0248】
－プラスミド番号４：ｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲ（図１１および配列番号２４参照）
これは、ｕｐｐ遺伝子の欠失に用いる修復マトリックス（配列番号２５）を含み、かつｕｐｐ遺伝子の上流および下流と相同な２つのＤＮＡフラグメント（それぞれのサイズ：５００ｂｐ（配列番号２６）および３７７ｂｐ（配列番号２７））からなる。このアセンブリを、ギブソンクローニングシステム（New England Biolabs, Gibson assembly Master Mix2X）を用いて得た。この目的のために、上流および下流部分を、それぞれのプライマーＲＨ００１／ＲＨ００２およびＲＨ００３／ＲＨ００４を用いて、ＤＳＭ６４２３菌株（Mate de Gerando et al., 2018および受託番号ＰＲＪＥＢ１１６２６（https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB11626）を参照）のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによって増幅させた。次いで、これら２つのフラグメントは予め制限酵素（ＳａｌＩおよびＳａｃＩ制限酵素）によって線状化されたｐＥＣ７５０Ｓにアセンブリされた。
これは、ｕｐｐ遺伝子の欠失に用いる修復マトリックス（配列番号２５）を含み、かつｕｐｐ遺伝子の上流および下流と相同な２つのＤＮＡフラグメント（それぞれのサイズ：５００ｂｐ（配列番号２６）および３７７ｂｐ（配列番号２７））からなる。このアセンブリを、ギブソンクローニングシステム（New England Biolabs, Gibson assembly Master Mix2X）を用いて得た。この目的のために、上流および下流部分を、それぞれのプライマーＲＨ００１／ＲＨ００２およびＲＨ００３／ＲＨ００４を用いて、ＤＳＭ６４２３菌株（Mate de Gerando et al., 2018および受託番号ＰＲＪＥＢ１１６２６（https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB11626）を参照）のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲによって増幅させた。次いで、これら２つのフラグメントは予め制限酵素（ＳａｌＩおよびＳａｃＩ制限酵素）によって線状化されたｐＥＣ７５０Ｓにアセンブリされた。
【0249】
－プラスミド番号５：ｐＥＸ－Ａ２－ｇＲＮＡ－ｕｐｐ（図１２および配列番号２８参照）
このプラスミドは、ｐＥＸ－Ａ２と称される複製用プラスミドに挿入された、構成的プロモーター（配列番号３０の配列の非コーディングＲＮＡ）の制御下でｕｐｐ遺伝子（ｕｐｐを標的とするプロトスペーサー（配列番号３１））を標的とするｇＲＮＡの発現カセット（配列番号２９）に対応するｇＲＮＡ－ｕｐｐＤＮＡフラグメントを含む。
このプラスミドは、ｐＥＸ－Ａ２と称される複製用プラスミドに挿入された、構成的プロモーター（配列番号３０の配列の非コーディングＲＮＡ）の制御下でｕｐｐ遺伝子（ｕｐｐを標的とするプロトスペーサー（配列番号３１））を標的とするｇＲＮＡの発現カセット（配列番号２９）に対応するｇＲＮＡ－ｕｐｐＤＮＡフラグメントを含む。
【0250】
－プラスミド番号６：ｐＥＣ７５０Ｓ－Δｕｐｐ（図１３および配列番号３２参照)
これは、プラスミドｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲ（配列番号２４）をベースとして、追加で、構成的プロモーターの制御下でｕｐｐ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ発現カセットを含む、ＤＮＡフラグメントを含む。
このフラグメントはｐＥＸ－Ａ２に挿入され、ｐＥＸ－Ａ２－ｇＲＮＡ－ｕｐｐと称された。次いで、挿入物をプライマーｐＥＸ－ｆｗｄおよびｐＥＸ－ｒｅｖを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで切断した。最終的に、このフラグメントを、予め同じ制限酵素で切断していたｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲにライゲーションすることでクローニングし、ｐＥＣ７５０Ｓ－Δｕｐｐを得た。
これは、プラスミドｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲ（配列番号２４）をベースとして、追加で、構成的プロモーターの制御下でｕｐｐ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ発現カセットを含む、ＤＮＡフラグメントを含む。
このフラグメントはｐＥＸ－Ａ２に挿入され、ｐＥＸ－Ａ２－ｇＲＮＡ－ｕｐｐと称された。次いで、挿入物をプライマーｐＥＸ－ｆｗｄおよびｐＥＸ－ｒｅｖを用いてＰＣＲで増幅し、制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｃｏＩで切断した。最終的に、このフラグメントを、予め同じ制限酵素で切断していたｐＥＣ７５０Ｓ－ｕｐｐＨＲにライゲーションすることでクローニングし、ｐＥＣ７５０Ｓ－Δｕｐｐを得た。
【0251】
－プラスミド番号７：ｐＥＣ７５０Ｃ－Δｕｐｐ（図１４および配列番号３３参照）
このガイドＲＮＡならびに修復マトリックスを含むカセットを、プライマーｐＥＣ７５０Ｃ－ｆｗｄおよびＭ１３－ｒｅｖを用いて増幅させた。増幅産物をＸｈｏＩおよびＳａｃＩ酵素の制限酵素によって切断し、そしてｐＥＣ７５０Ｃに酵素的ライゲーションすることでクローニングし、ｐＥＣ７５０Ｃ－Δｕｐｐを得た。
このガイドＲＮＡならびに修復マトリックスを含むカセットを、プライマーｐＥＣ７５０Ｃ－ｆｗｄおよびＭ１３－ｒｅｖを用いて増幅させた。増幅産物をＸｈｏＩおよびＳａｃＩ酵素の制限酵素によって切断し、そしてｐＥＣ７５０Ｃに酵素的ライゲーションすることでクローニングし、ｐＥＣ７５０Ｃ－Δｕｐｐを得た。
【0252】
－プラスミド番号８：ｐＧＲＮＡ－ｐＮＦ２（図１５および配列番号３４参照）
このプラスミドは、ｐＥＣ７５０Ｃをベースとし、プラスミドｐＮＦ２（配列番号１１８）を標的とするガイドＲＮＡ発現カセットを含む。
このプラスミドは、ｐＥＣ７５０Ｃをベースとし、プラスミドｐＮＦ２（配列番号１１８）を標的とするガイドＲＮＡ発現カセットを含む。
【0253】
－プラスミド番号９：ｐＣａｓ９ｉｎｄ－ｇＲＮＡｃａｔＢ（図２３および配列番号３８参照）
これは、ＰＣＲ（プライマーΔｃａｔＢ＿ｆｗｄおよびΔｃａｔＢ＿ｇＲＮＡ＿ｒｅｖ）によって増幅されたｃａｔＢ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ配列をコードする配列であって、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（特許出願ＷＯ２０１７／０６４４３９に記載）に、ＸｈｏＩ制限酵素による種々のＤＮＡの切断およびライゲーションの後でクローニングされた配列を含む。
これは、ＰＣＲ（プライマーΔｃａｔＢ＿ｆｗｄおよびΔｃａｔＢ＿ｇＲＮＡ＿ｒｅｖ）によって増幅されたｃａｔＢ遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ配列をコードする配列であって、ｐＣａｓ９ｉｎｄ（特許出願ＷＯ２０１７／０６４４３９に記載）に、ＸｈｏＩ制限酵素による種々のＤＮＡの切断およびライゲーションの後でクローニングされた配列を含む。
【0254】
－プラスミド番号１０：ｐＮＦ３（図２５および配列番号１１９参照）
これは、プライマーＲＨ０２１およびＲＨ０２２で増幅させた、特に複製起点およびプラスミド複製タンパク質をコードする遺伝子（CIBE_p20001）を含むｐＮＦ２の一部を含む。次いで、このＰＣＲ産物を、プラスミドｐＵＣ１９（配列番号１１７）の制限部位ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩのレベルでクローニングした。
これは、プライマーＲＨ０２１およびＲＨ０２２で増幅させた、特に複製起点およびプラスミド複製タンパク質をコードする遺伝子（CIBE_p20001）を含むｐＮＦ２の一部を含む。次いで、このＰＣＲ産物を、プラスミドｐＵＣ１９（配列番号１１７）の制限部位ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩのレベルでクローニングした。
【0255】
－プラスミド番号１１：ｐＥＣ７５１Ｓ（図２６および配列番号１２１参照）
クロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔＰ（配列番号７０）を除き、ｐＥＣ７５０Ｃ（配列番号１０６）のすべてのエレメントを含む。前記ｃａｔＰは、スペクチノマイシン耐性を付与するEnterococcus faecalisの遺伝子ａａｄ９（配列番号１３０）に置換された。この要素は、プラスミドｐＭＴＬ００７Ｓ－Ｅ１（配列番号１２０）から出発するプライマーａａｄ９－ｆｗｄ２およびａａｄ９－ｒｅｖで増幅され、ｐＥＣ７５０Ｃの部位ＡｖａＩＩおよびＨｐａＩに、遺伝子ｃａｔＰ（配列番号７０）の代わりにクローニングされた。
クロラムフェニコール耐性遺伝子ｃａｔＰ（配列番号７０）を除き、ｐＥＣ７５０Ｃ（配列番号１０６）のすべてのエレメントを含む。前記ｃａｔＰは、スペクチノマイシン耐性を付与するEnterococcus faecalisの遺伝子ａａｄ９（配列番号１３０）に置換された。この要素は、プラスミドｐＭＴＬ００７Ｓ－Ｅ１（配列番号１２０）から出発するプライマーａａｄ９－ｆｗｄ２およびａａｄ９－ｒｅｖで増幅され、ｐＥＣ７５０Ｃの部位ＡｖａＩＩおよびＨｐａＩに、遺伝子ｃａｔＰ（配列番号７０）の代わりにクローニングされた。
【0256】
－プラスミド番号１２：ｐＮＦ３Ｓ（図２７および配列番号１２３参照）
これは、ｐＮＦ３のすべての要素を含み、部位ＢａｍＨＩとＳａｃＩの間に遺伝子ａａｄ９（ｐＥＣ７５１Ｓから始まるプライマーＲＨ０３１およびＲＨ０３２で増幅）を挿入したものである。
これは、ｐＮＦ３のすべての要素を含み、部位ＢａｍＨＩとＳａｃＩの間に遺伝子ａａｄ９（ｐＥＣ７５１Ｓから始まるプライマーＲＨ０３１およびＲＨ０３２で増幅）を挿入したものである。
【0257】
－プラスミド番号１３：ｐＮＦ３Ｅ（図２８および配列番号１２４参照）
これは、ｐＮＦ３のすべての要素を含み、プロモーターｍｉｎｉＰｔｈｌの制御下にClostridium difficileの遺伝子ｅｒｍＢ（配列番号１３１）の挿入を有する。この要素は、プライマーＲＨ１３８およびＲＨ１３９を用いてｐＦＷ０１から開始して増幅され、ｐＮＦ３Ｅの部位ＢａｍＨＩとＳａｃＩの間にクローニングされた。
これは、ｐＮＦ３のすべての要素を含み、プロモーターｍｉｎｉＰｔｈｌの制御下にClostridium difficileの遺伝子ｅｒｍＢ（配列番号１３１）の挿入を有する。この要素は、プライマーＲＨ１３８およびＲＨ１３９を用いてｐＦＷ０１から開始して増幅され、ｐＮＦ３Ｅの部位ＢａｍＨＩとＳａｃＩの間にクローニングされた。
【0258】
－プラスミド番号１４：ｐＮＦ３Ｃ（図２９および配列番号１２５参照）
これはｐＮＦ３のすべての要素を含み、Clostridium perfringensの遺伝子ｃａｔＰ（配列番号７０）の挿入を有する。この要素は、プライマーＲＨ１４０およびＲＨ１４１を用いてｐＥＣ７５０Ｃから出発して増幅され、ｐＮＦ３Ｅの部位ＢａｍＨＩとＳａｃＩの間にクローニングされた。
これはｐＮＦ３のすべての要素を含み、Clostridium perfringensの遺伝子ｃａｔＰ（配列番号７０）の挿入を有する。この要素は、プライマーＲＨ１４０およびＲＨ１４１を用いてｐＥＣ７５０Ｃから出発して増幅され、ｐＮＦ３Ｅの部位ＢａｍＨＩとＳａｃＩの間にクローニングされた。
【0259】
結果Ｎｏ. １
C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株の形質転換
プラスミドを大腸菌ｄａｍ－ ｄｃｍ－株（INV110, Invitrogen）に導入し、複製した。これにより、Mermelstein et al. (1993)に記載されたプロトコルに従ってＤＳＭ６４２３株に形質転換により導入する前に、プラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢ上のＤａｍ型およびＤｃｍ型のメチル化を除去することが可能になるが、以下の修正を加えた：菌株をより大量のプラスミド（２０μｇ）、ＯＤ６００＝０．８で、１００Ω、２５μＦ、１４００Ｖの電気穿孔パラメータで形質転換する。エリスロマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を含むシャーレ上に増殖させることにより、プラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢを含むC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３の形質転換体を得ることできた。
C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株の形質転換
プラスミドを大腸菌ｄａｍ－ ｄｃｍ－株（INV110, Invitrogen）に導入し、複製した。これにより、Mermelstein et al. (1993)に記載されたプロトコルに従ってＤＳＭ６４２３株に形質転換により導入する前に、プラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢ上のＤａｍ型およびＤｃｍ型のメチル化を除去することが可能になるが、以下の修正を加えた：菌株をより大量のプラスミド（２０μｇ）、ＯＤ６００＝０．８で、１００Ω、２５μＦ、１４００Ｖの電気穿孔パラメータで形質転換する。エリスロマイシン（２０μｇ／ｍＬ）を含むシャーレ上に増殖させることにより、プラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄ－ΔｃａｔＢを含むC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３の形質転換体を得ることできた。
【0260】
ｃａｓ９の発現誘導およびC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ株（C. beijerinckii ＩＦＰ９６２ ΔｃａｔＢ）の産生
次いで、エリスロマイシン耐性コロニー数個を１００μＬの培養液（２ＹＴＧ）に取り込み、培養液で希釈倍率１０４倍まで連続希釈した。各コロニーについて、各希釈液８μＬをエリスロマイシンおよびアンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍＬ）を含むシャーレに添加して、ヌクレアーゼＣａｓ９をコードする遺伝子の発現を誘導できるようにした。
ゲノムＤＮＡを抽出後、プライマーＲＨ０７６およびＲＨ０７７を用いたＰＣＲにより、このディッシュ上で増殖したクローン内の遺伝子ｃａｔＢの欠失を確認した（図１６参照）。
次いで、エリスロマイシン耐性コロニー数個を１００μＬの培養液（２ＹＴＧ）に取り込み、培養液で希釈倍率１０４倍まで連続希釈した。各コロニーについて、各希釈液８μＬをエリスロマイシンおよびアンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍＬ）を含むシャーレに添加して、ヌクレアーゼＣａｓ９をコードする遺伝子の発現を誘導できるようにした。
ゲノムＤＮＡを抽出後、プライマーＲＨ０７６およびＲＨ０７７を用いたＰＣＲにより、このディッシュ上で増殖したクローン内の遺伝子ｃａｔＢの欠失を確認した（図１６参照）。
【0261】
C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ株のチアンフェニコールに対する感受性の検証
遺伝子ｃａｔＢの欠失が実際に新たなチアンフェニコール感受性を付与することを確認するため、寒天培地を用いた比較解析を行った。C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３およびC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢの前培養を２ＹＴＧ培地で行い、この培養液１００μＬを濃度１５ｍｇ／Ｌのチアンフェニコール添加または無添加の２ＹＴＧ寒天培地に播種した。図１７から、初期株であるC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３のみがチアンフェニコール添加培地上で生育可能であることが分かる。
遺伝子ｃａｔＢの欠失が実際に新たなチアンフェニコール感受性を付与することを確認するため、寒天培地を用いた比較解析を行った。C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３およびC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢの前培養を２ＹＴＧ培地で行い、この培養液１００μＬを濃度１５ｍｇ／Ｌのチアンフェニコール添加または無添加の２ＹＴＧ寒天培地に播種した。図１７から、初期株であるC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３のみがチアンフェニコール添加培地上で生育可能であることが分かる。
【0262】
C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ株におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールによる遺伝子ｕｐｐの欠失
C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ株のクローンを、ｄａｍ型およびｄｃｍ型のメチルトランスフェラーゼが認識するモチーフのレベルでメチル化されていないベクターｐＣａｓ９ａｃｒ（ｄａｍ－ ｄｃｍ－遺伝子型を有する大腸菌から調製）で予め形質転換した。C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株で維持されているプラスミドｐＣａｓ９ａｃｒの存在は、プライマーＲＨ０２５およびＲＨ１３４を用いてコロニーでのＰＣＲによって確認した。
C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ株のクローンを、ｄａｍ型およびｄｃｍ型のメチルトランスフェラーゼが認識するモチーフのレベルでメチル化されていないベクターｐＣａｓ９ａｃｒ（ｄａｍ－ ｄｃｍ－遺伝子型を有する大腸菌から調製）で予め形質転換した。C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株で維持されているプラスミドｐＣａｓ９ａｃｒの存在は、プライマーＲＨ０２５およびＲＨ１３４を用いてコロニーでのＰＣＲによって確認した。
【0263】
次いで、エリスロマイシン耐性クローンを、予め脱メチル化したｐＥＣ７５０Ｃ－Δｕｐｐで形質転換した。こうして得られたコロニーを、エリスロマイシン（２０μｇ／ｍＬ）、チアンフェニコール（１５μｇ／ｍＬ）、ラクトース（４０ｍＭ）を含む培地で選択した。
【0264】
次いで、これらのクローン数個を１００μＬの培養液（２ＹＴＧ）に再懸濁し、その後、培養液で（希釈倍率１０４倍まで）連続希釈した。各希釈液５μＬを、エリスロマイシン、チアンフェニコール、アンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍＬ）を含むシャーレに添加した（図１８参照）。
【0265】
各クローンについて、ａＴｃに耐性の２つのコロニーを、遺伝子座ｕｐｐの増幅を意図したプライマーを用いたコロニーＰＣＲによって試験した（図１９参照）。
【0266】
C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ株におけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールによる天然プラスミドｐＮＦ２の欠失
Ｄａｍ型およびＤｃｍ型のメチルトランスフェラーゼが認識するモチーフのレベルでメチル化されていないベクターｐＣａｓ９ｉｎｄ（ｄａｍ－ ｄｃｍ遺伝子型を有する大腸菌から調製）で、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ株のクローンを予め形質転換した。C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株内のプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄの存在を、プライマーｐＣａｓ９ｉｎｄ_ｆｗｄ（配列番号４２）およびｐＣａｓ９ｉｎｄ_ｒｅｖ（配列番号４３）によるＰＣＲで確認した（図２０参照）。
Ｄａｍ型およびＤｃｍ型のメチルトランスフェラーゼが認識するモチーフのレベルでメチル化されていないベクターｐＣａｓ９ｉｎｄ（ｄａｍ－ ｄｃｍ遺伝子型を有する大腸菌から調製）で、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ株のクローンを予め形質転換した。C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株内のプラスミドｐＣａｓ９ｉｎｄの存在を、プライマーｐＣａｓ９ｉｎｄ_ｆｗｄ（配列番号４２）およびｐＣａｓ９ｉｎｄ_ｒｅｖ（配列番号４３）によるＰＣＲで確認した（図２０参照）。
【0267】
次いで、エリスロマイシン耐性クローンを用いて、ｄａｍ－ ｄｃｍ－遺伝子型を有する大腸菌から調製したｐＧＲＮＡ－ｐＮＦ２の形質転換を行った。
【0268】
エリスロマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびチアンフェニコール（１５μｇ／ｍＬ）を含む培地で得られたいくつかのコロニーを培養液に再懸濁し、希釈倍率１０４倍まで連続希釈した。各希釈液の８μＬ（Height μＬ）を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの発現を誘導するために、エリスロマイシン、チアンフェニコール、アンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍＬ）を含むシャーレに添加した。
【0269】
天然プラスミドｐＮＦ２の不在を、プライマーｐＮＦ２_ｆｗｄ（配列番号３９）およびｐＮＦ２_ｒｅｖ（配列番号４０）を用いたＰＣＲによって確認した（図２１参照）。
【0270】
結論
この試験過程で、本発明者らは、Clostridium beijerinckii ＤＳＭ６４２３株内に種々のプラスミドを導入し、維持することに成功した。また、単一プラスミドを用いることを基本としたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールを用いて、遺伝子ｃａｔＢを抑制することに成功した。得られた組換え株のチアンフェニコール感受性は、寒天培地でのアッセイで確認した。
この試験過程で、本発明者らは、Clostridium beijerinckii ＤＳＭ６４２３株内に種々のプラスミドを導入し、維持することに成功した。また、単一プラスミドを用いることを基本としたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールを用いて、遺伝子ｃａｔＢを抑制することに成功した。得られた組換え株のチアンフェニコール感受性は、寒天培地でのアッセイで確認した。
【0271】
この欠失により、特許出願ＦＲ１８５４８３５に記載された２つのプラスミドを必要とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ツールをより効率的に用いることが可能となった。本願発明の有益性を示す２つの例として、遺伝子ｕｐｐの欠失と、Clostridium beijerinckii ＤＳＭ６４２３株にとって必須ではない天然プラスミドの除去を実施した。
【0272】
結果Ｎｏ．２
C. beijerinckii株の形質転換
大腸菌ＮＥＢ １０－β株で調製したプラスミドを、C. beijerinckii ＮＣＩＭＢ８０５２株の形質転換にも用いた。しかしながら、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３については、予めプラスミドを導入し、大腸菌ｄａｍ－ ｄｃｍ－ (INV110, Invitrogen) 株に複製しておく。これにより、ＤＳＭ６４２３株に形質転換により導入する前に、目的のプラスミド上のＤａｍ型およびＤｃｍ型のメチル化を除去することが可能となる。
C. beijerinckii株の形質転換
大腸菌ＮＥＢ １０－β株で調製したプラスミドを、C. beijerinckii ＮＣＩＭＢ８０５２株の形質転換にも用いた。しかしながら、C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３については、予めプラスミドを導入し、大腸菌ｄａｍ－ ｄｃｍ－ (INV110, Invitrogen) 株に複製しておく。これにより、ＤＳＭ６４２３株に形質転換により導入する前に、目的のプラスミド上のＤａｍ型およびＤｃｍ型のメチル化を除去することが可能となる。
【0273】
形質転換は、それ以外は各株について同様に、すなわちMermelstein et al. 1992に記載されたプロトコルにしたがって、以下の修正を加えて行われる：菌株を、より多量のプラスミド（５～２０μｇ）、ＯＤ６００＝０．６～０．８で、電気穿孔パラメータが１００Ω、２５μＦ、１４００Ｖで形質転換される。２ＹＴＧ中で３時間再生した後、所望の抗生物質（エリスロマイシン：２０～４０μｇ／ｍＬ、チアンフェニコール１５μｇ／ｍＬ、スペクチノマイシン６５０μｇ／ｍＬ）を含むペトリ皿（２ＹＴＧ寒天）上に播種する。
【0274】
C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３菌株の形質転換効率の比較
C. beijerinckii菌株：ＤＳＭ ６４２３野生型、ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢおよびＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２で、生物学的デュプリケートで形質転換を行った。（図３０）。これには、特に形質転換効率が悪く、細菌の改変に用いることが困難なベクターｐＣａｓ９ｉｎｄを用いた。このベクターは、３株が感受性である抗生物質エリスロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子もさらに含む。
C. beijerinckii菌株：ＤＳＭ ６４２３野生型、ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢおよびＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２で、生物学的デュプリケートで形質転換を行った。（図３０）。これには、特に形質転換効率が悪く、細菌の改変に用いることが困難なベクターｐＣａｓ９ｉｎｄを用いた。このベクターは、３株が感受性である抗生物質エリスロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子もさらに含む。
【0275】
結果は、天然プラスミドｐＮＦ２が消失したことにより、形質転換効率が約１５～２０倍向上したことを示す。
【0276】
また、チアンフェニコール耐性を付与したプラスミドｐＥＣ７５０Ｃについても、野生型株はこの抗生物質に対して耐性を有するため、ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ（ＩＦＰ９６２ ΔｃａｔＢ）およびＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２（ＩＦＰ９６３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２）のみで形質転換効率の検証を行った（図３１）。このプラスミドでは、形質転換効率の向上はさらに顕著である（約２０００倍の向上）。
【0277】
プラスミドｐＮＦ３の形質転換効率と他のプラスミドのそれの比較
天然プラスミドｐＮＦ２の複製起点を含むプラスミドの形質転換効率を調べるため、プラスミドｐＮＦ３ＥおよびｐＮＦ３ＣをC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２株に導入した。エリスロマイシン耐性遺伝子またはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むベクターを用いることで、耐性遺伝子の性質に応じた該ベクターの形質転換効率の比較が可能となる。また、プラスミドｐＦＷ０１およびｐＥＣ７５０Ｃを形質転換した。これら２つのプラスミドは、異なる抗生物質（それぞれエリスロマイシンおよびチアンフェニコール）に対する耐性遺伝子を含んでおり、C. beijerinckiiおよびC. acetobutylicumの形質転換によく用いられるものである。
天然プラスミドｐＮＦ２の複製起点を含むプラスミドの形質転換効率を調べるため、プラスミドｐＮＦ３ＥおよびｐＮＦ３ＣをC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２株に導入した。エリスロマイシン耐性遺伝子またはクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むベクターを用いることで、耐性遺伝子の性質に応じた該ベクターの形質転換効率の比較が可能となる。また、プラスミドｐＦＷ０１およびｐＥＣ７５０Ｃを形質転換した。これら２つのプラスミドは、異なる抗生物質（それぞれエリスロマイシンおよびチアンフェニコール）に対する耐性遺伝子を含んでおり、C. beijerinckiiおよびC. acetobutylicumの形質転換によく用いられるものである。
【0278】
図３２に示すように、ｐＮＦ３に基づくベクターは、優れた形質転換効率を有し、特にC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３ ΔｃａｔＢ ΔｐＮＦ２において使用可能である。特に、ｐＮＦ３Ｅ（エリスロマイシン耐性遺伝子を含む）は、同じ耐性遺伝子を含むｐＦＷ０１よりもはるかに高い形質転換効率を示している。この同じプラスミドを野生型株C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３に導入することはできず（５μｇのプラスミドを生物学的デュプリケートに形質転換して得られたコロニーは０）、天然プラスミドｐＮＦ２の存在の影響を実証している。
【0279】
他の株／種におけるプラスミドｐＮＦ３の形質転換可能性の検証
本発明者らは、この新規プラスミドを他の溶媒原性クロストリジウム株で使用する可能性を示すために、ＡＢＥ株C. beijerinckii ＮＣＩＭＢ８０５２におけるプラスミドｐＦＷ０１、ｐＮＦ３ＥおよびｐＮＦ３Ｓの形質転換効率の比較分析を行った（図３３）。ＮＣＩＭＢ ８０５２株はもともとチアンフェニコールに耐性であるため、ｐＮＦ３Ｃの代わりにスペクチノマイシン耐性を付与したｐＮＦ３Ｓを用いた。
本発明者らは、この新規プラスミドを他の溶媒原性クロストリジウム株で使用する可能性を示すために、ＡＢＥ株C. beijerinckii ＮＣＩＭＢ８０５２におけるプラスミドｐＦＷ０１、ｐＮＦ３ＥおよびｐＮＦ３Ｓの形質転換効率の比較分析を行った（図３３）。ＮＣＩＭＢ ８０５２株はもともとチアンフェニコールに耐性であるため、ｐＮＦ３Ｃの代わりにスペクチノマイシン耐性を付与したｐＮＦ３Ｓを用いた。
【0280】
この結果は、ＮＣＩＭＢ ８０５２株がｐＮＦ３に基づくプラスミドで形質転換可能であることを示しており、これらのベクターが広義のC. beijerinckii種に適用可能であることを証明するものであった。
【0281】
ｐＮＦ３に基づく一連の合成ベクターの適用性は、C. acetobutylicumの参照株ＤＳＭ７９２でも試験した。形質転換試験の結果、プラスミドｐＮＦ３Ｃによってこの株を形質転換できることが示された（形質転換効率は、プラスミドｐＥＣ７５０Ｃの１２０コロニー／μｇに対して、形質転換したＤＮＡ１μｇあたり３コロニーを観察した）。
【0282】
プラスミドｐＮＦ３と出願番号ＦＲ１８／７３４９２に記載の遺伝子ツールとの適合性の検証
特許出願ＦＲ１８/７３４９２には、ΔｃａｔＢ株、ならびにエリスロマイシン耐性遺伝子およびチアンフェニコール耐性遺伝子の使用を必要とする２つのプラスミドを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用について記載されている。新しいプラスミド群ｐＮＦ３の利点を示すために、ベクターｐＮＦ３Ｃを、プラスミドｐＣａｓ９ａｃｒを既に含むΔｃａｔＢ株に形質転換した。この形質転換はデュプリケートで行われ、０．６２５±０．１２５コロニー／ＤＮＡ（μｇ）（平均±標準誤差）の形質転換効率を示し、このことはｐＮＦ３ＣをベースにしたベクターをｐＣａｓ９ａｃｒと組み合わせてΔｃａｔＢ株に用い得ることを証明している。
特許出願ＦＲ１８/７３４９２には、ΔｃａｔＢ株、ならびにエリスロマイシン耐性遺伝子およびチアンフェニコール耐性遺伝子の使用を必要とする２つのプラスミドを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用について記載されている。新しいプラスミド群ｐＮＦ３の利点を示すために、ベクターｐＮＦ３Ｃを、プラスミドｐＣａｓ９ａｃｒを既に含むΔｃａｔＢ株に形質転換した。この形質転換はデュプリケートで行われ、０．６２５±０．１２５コロニー／ＤＮＡ（μｇ）（平均±標準誤差）の形質転換効率を示し、このことはｐＮＦ３ＣをベースにしたベクターをｐＣａｓ９ａｃｒと組み合わせてΔｃａｔＢ株に用い得ることを証明している。
【0283】
これらの結果と並行して、その複製起点を含むプラスミドｐＮＦ２の一部（配列番号１１８）は、任意に変更可能であり、特に大腸菌株での複製ならびにC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３での再導入を可能にする、新しい一連のシャトルベクター（配列番号１１９、１２３、１２４および１２５）の作製に成功裏に再利用され得ることが示された。これらの新規ベクターは、特に２つの異なる核酸を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ツールを用いて、例えばC. beijerinckii ＤＳＭ６４２３およびその誘導体において遺伝子編集を実施するのに有利な形質転換効率を有する。
【0284】
これらの新規ベクターは、C. beijerinckiiの別の株（ＮＣＩＭＢ ８０５２）およびクロストリジウム種（特に、C. acetobutylicum）でも正常に試験され、ファーミキューテス門の他の生物におけるその適用性を実証することができた。また、Bacillus属についても試験が行われた。
【0285】
結論
これらの結果は、天然プラスミドｐＮＦ２を抑制することで、それを含む細菌の形質転換頻度が大幅に増加することを実証している（ｐＦＷ０１で約１５倍、ｐＥＣ７５０Ｃで約２０００倍）。この結果は、形質転換が困難であることが知られているクロストリジウム属の細菌の場合、特に、天然の形質転換効率が低い（５コロニー／プラスミド（μｇ）以下）C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株にとって興味深いものであった。
これらの結果は、天然プラスミドｐＮＦ２を抑制することで、それを含む細菌の形質転換頻度が大幅に増加することを実証している（ｐＦＷ０１で約１５倍、ｐＥＣ７５０Ｃで約２０００倍）。この結果は、形質転換が困難であることが知られているクロストリジウム属の細菌の場合、特に、天然の形質転換効率が低い（５コロニー／プラスミド（μｇ）以下）C. beijerinckii ＤＳＭ６４２３株にとって興味深いものであった。
【0286】
参考文献
- Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., & Lovley, D. R. (2014). Lactose-inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Applied and environmental microbiology, 80(8), 2410-2416.
- Chen J.-S., Hiu S.F. (1986) Acetone-butanol-isopropanol production by Clostridium beijerinckii (synonym,Clostridium butylicum). Biotechnol. Lett. 8:371－376.
- Cui, L., & Bikard, D. (2016). Consequences of Cas9 cleavage in the chromosome of Escherichia coli. Nucleic acids research, 44(9), 4243-4251.
- Currie, D. H., Herring, C. D., Guss, A. M., Olson, D. G., Hogsett, D. A., & Lynd, L. R. (2013). Functional heterologous expression of an engineered full length CipA from Clostridium thermocellum in Thermoanaerobacterium saccharolyticum. Biotechnology for biofuels, 6(1), 32.
- DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., & Church, G. M. (2013). Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research, 41(7), 4336-4343.
- Dong, H., Tao, W., Zhang, Y., & Li, Y. (2012). Development of an anhydrotetracycline-inducible gene expression system for solvent-producing Clostridium acetobutylicum: A useful tool for strain engineering. Metabolic engineering, 14(1), 59-67.
- Dong, D., Guo, M., Wang, S., Zhu, Y., Wang, S., Xiong, Z., ... & Huang, Z. (2017). Structural basis of CRISPR－SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein. Nature, 546(7658), 436.
- Dupuy, B., Mani, N., Katayama, S., & Sonenshein, A. L. (2005). Transcription activation of a UV‐inducible Clostridium perfringens bacteriocin gene by a novel σ factor. Molecular microbiology, 55(4), 1196-1206.
- Egholm, M., Buchardt, O., Nielsen, P. E., & Berg, R. H. (1992). Peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotide analogs with an achiral peptide backbone. Journal of the American Chemical Society, 114(5), 1895-1897.
- Fonfara, I., Le Rhun, A., Chylinski, K., Makarova, K. S., Lecrivain, A. L., Bzdrenga, J., ... & Charpentier, E. (2013). Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research, 42(4), 2577-2590.
- Garcia-Doval C, Jinek M. Molecular architectures and mechanisms of Class 2 CRISPR-associated nucleases. Curr Opin Struct Biol. 2017 Dec;47:157-166. doi: 10.1016/j.sbi.2017.10.015 Ajouter au projet Citavi par DOI. Epub 2017 Nov 3. Review.
- George H.A., Johnson J.L., Moore W. E. C., Holdeman, L. V., Chen J. S. (1983) Acetone, Isopropanol, and Butanol Production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl. Env. Microbiol. 45:1160－1163.
- Gonzales y Tucker RD, Frazee B. View from the front lines: an emergency medicine perspective on clostridial infections in injection drug users. Anaerobe. 2014 Dec; 30:108-15.
- Hartman, A. H., Liu, H., & Melville, S. B. (2011). Construction and characterization of a lactose-inducible promoter system for controlled gene expression in Clostridium perfringens. Applied and environmental microbiology, 77(2), 471-478.
- Heap, J. T., Ehsaan, M., Cooksley, C. M., Ng, Y. K., Cartman, S. T., Winzer, K., & Minton, N. P. (2012). Integration of DNA into bacterial chromosomes from plasmids without a counter-selection marker. Nucleic acids research, 40(8), e59-e59.
- Heap, J. T., Kuehne, S. A., Ehsaan, M., Cartman, S. T., Cooksley, C. M., Scott, J. C., & Minton, N. P. (2010). The ClosTron: mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal of microbiological methods, 80(1), 49-55.
- Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., Carter, G. P., & Minton, N. P. (2007). The ClosTron: a universal gene knock-out system for the genus Clostridium. Journal of microbiological methods, 70(3), 452-464.
- Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., & Minton, N. P. (2009). A modular system for Clostridium shuttle plasmids. Journal of microbiological methods, 78(1), 79-85.
- Hidalgo-Cantabrana, C., O’Flaherty, S., & Barrangou, R. (2017). CRISPR-based engineering of next-generation lactic acid bacteria. Current opinion in microbiology, 37, 79-87.
- Hiu S.F., Zhu C.-X., Yan R.-T., Chen J.-S. (1987) Butanol-ethanol dehydrogenase and butanol-ethanol-isopropanol dehydrogenase: different alcohol dehydrogenases in two strains of Clostridium beijerinckii (Clostridium butylicum). Appl. Env. Microbiol. 53:697－703.
- Huang, H., Chai, C., Li, N., Rowe, P., Minton, N. P., Yang, S., & Gu, Y. (2016). CRISPR/Cas9-based efficient genome editing in Clostridium ljungdahlii, an autotrophic gas-fermenting bacterium. ACS synthetic biology, 5(12), 1355-1361.
- Huggins, A.S., Bannam, T.L. and Rood, J.I. (1992) Comparative sequence analysis of the catB gene from Clostridium butyricum. Antimicrob. Agents Chemother. 36, 2548-2551.
- Ismaiel A.A., Zhu C.X., Colby G.D., Chen, J. S. (1993). Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii. J. Bacteriol. 175:5097－5105.
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA－guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816-821.
- Jones D.T., Woods D.R. (1986) Acetone-butanol fermentation revisited. Microbiological Reviews 50:484－524.
- Kolek J., Sedlar K., Provaznik I., Patakova P. (2016). Dam and Dcm methylations prevent gene transfer into Clostridium pasteurianum NRRL B-598: development of methods for electrotransformation, conjugation, and sonoporation. Biotechnol Biofuels. 9:14.
- Li, Q., Chen, J., Minton, N. P., Zhang, Y., Wen, Z., Liu, J., ... & Gu, Y. (2016). CRISPR‐based genome editing and expression control systems in Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii. Biotechnology journal, 11(7), 961-972.
- Makarova, K. S., Haft, D. H., Barrangou, R., Brouns, S. J., Charpentier, E., Horvath, P., ... & Van Der Oost, J. (2011). Evolution and classification of the CRISPR－Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 9(6), 467.
- Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Alkhnbashi, O. S., Costa, F., Shah, S. A., Saunders, S. J., ... & Horvath, P. (2015). An updated evolutionary classification of CRISPR－Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 13(11), 722.
- Marino, N. D., Zhang, J. Y., Borges, A. L., Sousa, A. A., Leon, L. M., Rauch, B. J., ... & Bondy-Denomy, J. (2018). Discovery of widespread type I and type V CRISPR-Cas inhibitors. Science, 362(6411), 240-242.
- Mate de Gerando, H., Wasels, F., Bisson, A., Clement, B., Bidard, F., Jourdier E., Lopez-Contreras A., Lopes Ferreira N. (2018). Genome and transcriptome of the natural isopropanol producer Clostridium beijerinckii DSM 6423. BMC genomics. 19:242.
- Mearls, E. B., Olson, D. G., Herring, C. D., & Lynd, L. R. (2015). Development of a regulatable plasmid-based gene expression system for Clostridium thermocellum. Applied microbiology and biotechnology, 99(18), 7589-7599.
- Mermelstein, L. D., & Papoutsakis, E. T. (1993). In vivo methylation in Escherichia coli by the Bacillus subtilis phage phi 3T I methyltransferase to protect plasmids from restriction upon transformation of Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Applied and environmental microbiology, 59(4), 1077-1081.
- Mermelstein L.D., Welker N.E., Bennett G.N., Papoutsakis E.T. (1992). Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 10:190-195.
- Mermelstein L.D., Welker N.E., Bennett G.N., Papoutsakis E.T. (1993). Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 10:190-195.
- Moon HG, Jang YS, Cho C, Lee J, Binkley R, Lee SY. One hundred years of clostridial butanol fermentation. FEMS Microbiol Lett. 2016 Feb;363(3).
- Nagaraju, S., Davies, N. K., Walker, D. J. F., Koepke, M., & Simpson, S. D. (2016). Genome editing of Clostridium autoethanogenum using CRISPR/Cas9. Biotechnology for biofuels, 9(1), 219.
- Nariya, H., Miyata, S., Kuwahara, T., & Okabe, A. (2011). Development and characterization of a xylose-inducible gene expression system for Clostridium perfringens. Applied and environmental microbiology, 77(23), 8439-8441.
- Newcomb, M., Millen, J., Chen, C. Y., & Wu, J. D. (2011). Co-transcription of the celC gene cluster in Clostridium thermocellum. Applied microbiology and biotechnology, 90(2), 625-634.
- Pawluk, A., Davidson, A. R., & Maxwell, K. L. (2018). Anti-CRISPR: Discovery, mechanism and function. Nature Reviews Microbiology, 16(1), 12
- Poehlein A., Solano J.D.M., Flitsch S.K., Krabben P., Winzer K., Reid S.J., Jones D.T., Green E., Minton N.P., Daniel R., Duerre P. (2017). Microbial solvent formation revisited by comparative genome analysis. Biotechnol Biofuels. 10:58.
- Pyne, M. E., Bruder, M. R., Moo-Young, M., Chung, D. A., & Chou, C. P. (2016). Harnessing heterologous and endogenous CRISPR-Cas machineries for efficient markerless genome editing in Clostridium. Scientific reports, 6.
- Rauch, B. J., Silvis, M. R., Hultquist, J. F., Waters, C. S., McGregor, M. J., Krogan, N. J., & Bondy-Denomy, J. (2017). Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell, 168(1-2), 150-158.
- Rajewska M., Wegrzyn K, Konieczny I., FEMS Microbiol Rev. 2012 Mar; 36(2). AT-rich region and repeated sequences - the essential elements of replication origins of bacterial replicons :408-34.
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., & Weiss, D. S. (2015). Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and environmental microbiology, 81(5), 1652-1660.
- Rogers P., Chen J.-S., Zidwick M. (2006) in The prokaryotes. 3rd edition, Vol. 1, edited by Dworkin M (Springer, New York, USA,2006). 3rd edition, Vol. 1, pp. 672－755.
- Schwarz S, Kehrenberg C, Doublet B, Cloeckaert A. Molecular basis of bacterial resistance to chloramphenicol and florfenicol. FEMS Microbiol Rev. 2004 Nov;28(5):519-42.
- Stella S, Alcon P, Montoya G. Class 2 CRISPR-Cas RNA-guided endonucleases: Swiss Army knives of genome editing. Nat Struct Mol Biol. 2017 Nov;24(11):882-892. doi: 10.1038/nsmb.3486.
- Wang, S., Dong, S., Wang, P., Tao, Y., & Wang, Y. (2017). Genome Editing in Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 with the CRISPR-Cas9 System. Applied and Environmental Microbiology, 83(10), e00233-17.
- Wang Y, Li X, Milne CB, et al. Development of a gene knockout system using mobile group II introns (Targetron) and genetic disruption of acid production pathways in Clostridium beijerinckii. Appl Environ Microbiol. 2013; 79(19): 5853-63.
- Wang, Y. et al. Markerless chromosomal gene deletion in Clostridium beijerinckii using CRISPR/Cas9 system. J. Biotechnol.2015. 200: 1-5.
- Wang, Y., Zhang, Z. T., Seo, S. O., Lynn, P., Lu, T., Jin, Y. S., & Blaschek, H. P. (2016). Bacterial genome editing with CRISPR-Cas9: deletion, Integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology, 5(7), 721-732.
- Wasels, F., Jean-Marie, J., Collas, F., Lopez-Contreras, A. M., & Ferreira, N. L. (2017). A two-plasmid inducible CRISPR/Cas9 genome editing tool for Clostridium acetobutylicum. Journal of microbiological methods. 140:5-11.
- Xu, T., Li, Y., Shi, Z., Hemme, C. L., Li, Y., Zhu, Y., ... & Zhou, J. (2015). Efficient genome editing in Clostridium cellulolyticum via CRISPR-Cas9 nickase. Applied and environmental microbiology, 81(13), 4423-4431.
- Yadav, R., Kumar, V., Baweja, M., & Shukla, P. (2018). Gene editing and genetic engineering approaches for advanced probiotics: A Review. Critical reviews in food science and nutrition, 58(10), 1735-1746.
- Yue Chen, Bruce A. McClane, Derek J. Fisher, Julian I. Rood, Phalguni Gupta; Construction of an Alpha Toxin Gene Knockout Mutant of Clostridium perfringens Type A by Use of a Mobile Group II Intron; Appl. Environ. Microbiol. Nov 2005, 71 (11) 7542-7547; DOI: 10.1128/AEM.71.11.7542-7547.2005.
- Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., & Cui, Q. (2015). A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnology for biofuels, 8(1), 36.
- Zhang C., Tinggang L. Jianzhong H. (2018) Characterization and genome analysis of a butanol－isopropanol producing Clostridium beijerinckii strain BGS1. Biotechnol Biofuels (2018) 11:280.
- Zhong, J., Karberg, M., & Lambowitz, A. M. (2003). Targeted and random bacterial gene disruption using a group II intron (targetron) vector containing a retrotransposition‐activated selectable marker. Nucleic acids research, 31(6), 1656-1664.
- Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., & Lovley, D. R. (2014). Lactose-inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Applied and environmental microbiology, 80(8), 2410-2416.
- Chen J.-S., Hiu S.F. (1986) Acetone-butanol-isopropanol production by Clostridium beijerinckii (synonym,Clostridium butylicum). Biotechnol. Lett. 8:371－376.
- Cui, L., & Bikard, D. (2016). Consequences of Cas9 cleavage in the chromosome of Escherichia coli. Nucleic acids research, 44(9), 4243-4251.
- Currie, D. H., Herring, C. D., Guss, A. M., Olson, D. G., Hogsett, D. A., & Lynd, L. R. (2013). Functional heterologous expression of an engineered full length CipA from Clostridium thermocellum in Thermoanaerobacterium saccharolyticum. Biotechnology for biofuels, 6(1), 32.
- DiCarlo, J. E., Norville, J. E., Mali, P., Rios, X., Aach, J., & Church, G. M. (2013). Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research, 41(7), 4336-4343.
- Dong, H., Tao, W., Zhang, Y., & Li, Y. (2012). Development of an anhydrotetracycline-inducible gene expression system for solvent-producing Clostridium acetobutylicum: A useful tool for strain engineering. Metabolic engineering, 14(1), 59-67.
- Dong, D., Guo, M., Wang, S., Zhu, Y., Wang, S., Xiong, Z., ... & Huang, Z. (2017). Structural basis of CRISPR－SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein. Nature, 546(7658), 436.
- Dupuy, B., Mani, N., Katayama, S., & Sonenshein, A. L. (2005). Transcription activation of a UV‐inducible Clostridium perfringens bacteriocin gene by a novel σ factor. Molecular microbiology, 55(4), 1196-1206.
- Egholm, M., Buchardt, O., Nielsen, P. E., & Berg, R. H. (1992). Peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotide analogs with an achiral peptide backbone. Journal of the American Chemical Society, 114(5), 1895-1897.
- Fonfara, I., Le Rhun, A., Chylinski, K., Makarova, K. S., Lecrivain, A. L., Bzdrenga, J., ... & Charpentier, E. (2013). Phylogeny of Cas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 among orthologous type II CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research, 42(4), 2577-2590.
- Garcia-Doval C, Jinek M. Molecular architectures and mechanisms of Class 2 CRISPR-associated nucleases. Curr Opin Struct Biol. 2017 Dec;47:157-166. doi: 10.1016/j.sbi.2017.10.015 Ajouter au projet Citavi par DOI. Epub 2017 Nov 3. Review.
- George H.A., Johnson J.L., Moore W. E. C., Holdeman, L. V., Chen J. S. (1983) Acetone, Isopropanol, and Butanol Production by Clostridium beijerinckii (syn. Clostridium butylicum) and Clostridium aurantibutyricum. Appl. Env. Microbiol. 45:1160－1163.
- Gonzales y Tucker RD, Frazee B. View from the front lines: an emergency medicine perspective on clostridial infections in injection drug users. Anaerobe. 2014 Dec; 30:108-15.
- Hartman, A. H., Liu, H., & Melville, S. B. (2011). Construction and characterization of a lactose-inducible promoter system for controlled gene expression in Clostridium perfringens. Applied and environmental microbiology, 77(2), 471-478.
- Heap, J. T., Ehsaan, M., Cooksley, C. M., Ng, Y. K., Cartman, S. T., Winzer, K., & Minton, N. P. (2012). Integration of DNA into bacterial chromosomes from plasmids without a counter-selection marker. Nucleic acids research, 40(8), e59-e59.
- Heap, J. T., Kuehne, S. A., Ehsaan, M., Cartman, S. T., Cooksley, C. M., Scott, J. C., & Minton, N. P. (2010). The ClosTron: mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal of microbiological methods, 80(1), 49-55.
- Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., Carter, G. P., & Minton, N. P. (2007). The ClosTron: a universal gene knock-out system for the genus Clostridium. Journal of microbiological methods, 70(3), 452-464.
- Heap, J. T., Pennington, O. J., Cartman, S. T., & Minton, N. P. (2009). A modular system for Clostridium shuttle plasmids. Journal of microbiological methods, 78(1), 79-85.
- Hidalgo-Cantabrana, C., O’Flaherty, S., & Barrangou, R. (2017). CRISPR-based engineering of next-generation lactic acid bacteria. Current opinion in microbiology, 37, 79-87.
- Hiu S.F., Zhu C.-X., Yan R.-T., Chen J.-S. (1987) Butanol-ethanol dehydrogenase and butanol-ethanol-isopropanol dehydrogenase: different alcohol dehydrogenases in two strains of Clostridium beijerinckii (Clostridium butylicum). Appl. Env. Microbiol. 53:697－703.
- Huang, H., Chai, C., Li, N., Rowe, P., Minton, N. P., Yang, S., & Gu, Y. (2016). CRISPR/Cas9-based efficient genome editing in Clostridium ljungdahlii, an autotrophic gas-fermenting bacterium. ACS synthetic biology, 5(12), 1355-1361.
- Huggins, A.S., Bannam, T.L. and Rood, J.I. (1992) Comparative sequence analysis of the catB gene from Clostridium butyricum. Antimicrob. Agents Chemother. 36, 2548-2551.
- Ismaiel A.A., Zhu C.X., Colby G.D., Chen, J. S. (1993). Purification and characterization of a primary-secondary alcohol dehydrogenase from two strains of Clostridium beijerinckii. J. Bacteriol. 175:5097－5105.
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA－guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816-821.
- Jones D.T., Woods D.R. (1986) Acetone-butanol fermentation revisited. Microbiological Reviews 50:484－524.
- Kolek J., Sedlar K., Provaznik I., Patakova P. (2016). Dam and Dcm methylations prevent gene transfer into Clostridium pasteurianum NRRL B-598: development of methods for electrotransformation, conjugation, and sonoporation. Biotechnol Biofuels. 9:14.
- Li, Q., Chen, J., Minton, N. P., Zhang, Y., Wen, Z., Liu, J., ... & Gu, Y. (2016). CRISPR‐based genome editing and expression control systems in Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii. Biotechnology journal, 11(7), 961-972.
- Makarova, K. S., Haft, D. H., Barrangou, R., Brouns, S. J., Charpentier, E., Horvath, P., ... & Van Der Oost, J. (2011). Evolution and classification of the CRISPR－Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 9(6), 467.
- Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Alkhnbashi, O. S., Costa, F., Shah, S. A., Saunders, S. J., ... & Horvath, P. (2015). An updated evolutionary classification of CRISPR－Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 13(11), 722.
- Marino, N. D., Zhang, J. Y., Borges, A. L., Sousa, A. A., Leon, L. M., Rauch, B. J., ... & Bondy-Denomy, J. (2018). Discovery of widespread type I and type V CRISPR-Cas inhibitors. Science, 362(6411), 240-242.
- Mate de Gerando, H., Wasels, F., Bisson, A., Clement, B., Bidard, F., Jourdier E., Lopez-Contreras A., Lopes Ferreira N. (2018). Genome and transcriptome of the natural isopropanol producer Clostridium beijerinckii DSM 6423. BMC genomics. 19:242.
- Mearls, E. B., Olson, D. G., Herring, C. D., & Lynd, L. R. (2015). Development of a regulatable plasmid-based gene expression system for Clostridium thermocellum. Applied microbiology and biotechnology, 99(18), 7589-7599.
- Mermelstein, L. D., & Papoutsakis, E. T. (1993). In vivo methylation in Escherichia coli by the Bacillus subtilis phage phi 3T I methyltransferase to protect plasmids from restriction upon transformation of Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Applied and environmental microbiology, 59(4), 1077-1081.
- Mermelstein L.D., Welker N.E., Bennett G.N., Papoutsakis E.T. (1992). Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 10:190-195.
- Mermelstein L.D., Welker N.E., Bennett G.N., Papoutsakis E.T. (1993). Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 10:190-195.
- Moon HG, Jang YS, Cho C, Lee J, Binkley R, Lee SY. One hundred years of clostridial butanol fermentation. FEMS Microbiol Lett. 2016 Feb;363(3).
- Nagaraju, S., Davies, N. K., Walker, D. J. F., Koepke, M., & Simpson, S. D. (2016). Genome editing of Clostridium autoethanogenum using CRISPR/Cas9. Biotechnology for biofuels, 9(1), 219.
- Nariya, H., Miyata, S., Kuwahara, T., & Okabe, A. (2011). Development and characterization of a xylose-inducible gene expression system for Clostridium perfringens. Applied and environmental microbiology, 77(23), 8439-8441.
- Newcomb, M., Millen, J., Chen, C. Y., & Wu, J. D. (2011). Co-transcription of the celC gene cluster in Clostridium thermocellum. Applied microbiology and biotechnology, 90(2), 625-634.
- Pawluk, A., Davidson, A. R., & Maxwell, K. L. (2018). Anti-CRISPR: Discovery, mechanism and function. Nature Reviews Microbiology, 16(1), 12
- Poehlein A., Solano J.D.M., Flitsch S.K., Krabben P., Winzer K., Reid S.J., Jones D.T., Green E., Minton N.P., Daniel R., Duerre P. (2017). Microbial solvent formation revisited by comparative genome analysis. Biotechnol Biofuels. 10:58.
- Pyne, M. E., Bruder, M. R., Moo-Young, M., Chung, D. A., & Chou, C. P. (2016). Harnessing heterologous and endogenous CRISPR-Cas machineries for efficient markerless genome editing in Clostridium. Scientific reports, 6.
- Rauch, B. J., Silvis, M. R., Hultquist, J. F., Waters, C. S., McGregor, M. J., Krogan, N. J., & Bondy-Denomy, J. (2017). Inhibition of CRISPR-Cas9 with bacteriophage proteins. Cell, 168(1-2), 150-158.
- Rajewska M., Wegrzyn K, Konieczny I., FEMS Microbiol Rev. 2012 Mar; 36(2). AT-rich region and repeated sequences - the essential elements of replication origins of bacterial replicons :408-34.
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., & Weiss, D. S. (2015). Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and environmental microbiology, 81(5), 1652-1660.
- Rogers P., Chen J.-S., Zidwick M. (2006) in The prokaryotes. 3rd edition, Vol. 1, edited by Dworkin M (Springer, New York, USA,2006). 3rd edition, Vol. 1, pp. 672－755.
- Schwarz S, Kehrenberg C, Doublet B, Cloeckaert A. Molecular basis of bacterial resistance to chloramphenicol and florfenicol. FEMS Microbiol Rev. 2004 Nov;28(5):519-42.
- Stella S, Alcon P, Montoya G. Class 2 CRISPR-Cas RNA-guided endonucleases: Swiss Army knives of genome editing. Nat Struct Mol Biol. 2017 Nov;24(11):882-892. doi: 10.1038/nsmb.3486.
- Wang, S., Dong, S., Wang, P., Tao, Y., & Wang, Y. (2017). Genome Editing in Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4 with the CRISPR-Cas9 System. Applied and Environmental Microbiology, 83(10), e00233-17.
- Wang Y, Li X, Milne CB, et al. Development of a gene knockout system using mobile group II introns (Targetron) and genetic disruption of acid production pathways in Clostridium beijerinckii. Appl Environ Microbiol. 2013; 79(19): 5853-63.
- Wang, Y. et al. Markerless chromosomal gene deletion in Clostridium beijerinckii using CRISPR/Cas9 system. J. Biotechnol.2015. 200: 1-5.
- Wang, Y., Zhang, Z. T., Seo, S. O., Lynn, P., Lu, T., Jin, Y. S., & Blaschek, H. P. (2016). Bacterial genome editing with CRISPR-Cas9: deletion, Integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology, 5(7), 721-732.
- Wasels, F., Jean-Marie, J., Collas, F., Lopez-Contreras, A. M., & Ferreira, N. L. (2017). A two-plasmid inducible CRISPR/Cas9 genome editing tool for Clostridium acetobutylicum. Journal of microbiological methods. 140:5-11.
- Xu, T., Li, Y., Shi, Z., Hemme, C. L., Li, Y., Zhu, Y., ... & Zhou, J. (2015). Efficient genome editing in Clostridium cellulolyticum via CRISPR-Cas9 nickase. Applied and environmental microbiology, 81(13), 4423-4431.
- Yadav, R., Kumar, V., Baweja, M., & Shukla, P. (2018). Gene editing and genetic engineering approaches for advanced probiotics: A Review. Critical reviews in food science and nutrition, 58(10), 1735-1746.
- Yue Chen, Bruce A. McClane, Derek J. Fisher, Julian I. Rood, Phalguni Gupta; Construction of an Alpha Toxin Gene Knockout Mutant of Clostridium perfringens Type A by Use of a Mobile Group II Intron; Appl. Environ. Microbiol. Nov 2005, 71 (11) 7542-7547; DOI: 10.1128/AEM.71.11.7542-7547.2005.
- Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., & Cui, Q. (2015). A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnology for biofuels, 8(1), 36.
- Zhang C., Tinggang L. Jianzhong H. (2018) Characterization and genome analysis of a butanol－isopropanol producing Clostridium beijerinckii strain BGS1. Biotechnol Biofuels (2018) 11:280.
- Zhong, J., Karberg, M., & Lambowitz, A. M. (2003). Targeted and random bacterial gene disruption using a group II intron (targetron) vector containing a retrotransposition‐activated selectable marker. Nucleic acids research, 31(6), 1656-1664.
【図1】
【図2】
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【図21】
【図22】
【図23】
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【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【配列表】
【国際調査報告】