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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-01
(54)【発明の名称】超高精度ウイルスベクターアッセイ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/861 20060101AFI20220725BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20220725BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20220725BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALN20220725BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20220725BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20220725BHJP
【ＦＩ】
C12N15/861 Z ZNA
A61K35/761
C12N5/10
C12Q1/6876 Z
C12N15/12
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021569884
(86)(22)【出願日】2020-05-22
(85)【翻訳文提出日】2021-11-24
(86)【国際出願番号】 US2020034146
(87)【国際公開番号】W WO2020242913
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】16/426,124
(32)【優先日】2019-05-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519162156
【氏名又は名称】トライゼル リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ミュッカネン， イェンニ
(72)【発明者】
【氏名】ペルトネン， ハンナ
(72)【発明者】
【氏名】ハッシネン， ミンナ
(72)【発明者】
【氏名】イラ－ヘルットゥアラ， セッポ
(72)【発明者】
【氏名】パーカー， ナイジェル
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR77
4B063QR79
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA66
4C087NA06
4C087NA07
(57)【要約】
複製欠損ウイルス遺伝子治療ベクターの製造中に、ランダム変異または他の事象が、望ましくない複製能力のあるウイルス（「ＲＣＶ」）を生成する場合がある。したがって、ウイルス遺伝子治療ベクターの製造業者は、連続感染をアッセイすることにより、すなわち、標的細胞にウイルスベクターを形質導入し、次いで形質導入した細胞を溶解し、次いで溶解物を生存アッセイ細胞と混合し、次いで顕微鏡で観察して、アッセイ細胞がウイルスに感染しているかどうかを視覚的に判定することによって、混入ＲＣＶの存在に関してアッセイする。様々な代替アプローチを試験したが、驚くべきことに、液滴デジタルＰＣＲは、従来技術のアプローチよりも高速であるだけでなく、１桁以上感度が高く、例えば３×１０１０個のアッセイ細胞中のわずか７個の複製能力のあるアデノウイルス（「ＲＣ」）を検出することができることが見出された。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
正常なヒト細胞で複製することができないウイルス遺伝子治療ベクターを含む試料中の正常なヒト細胞で複製することができるウイルスの同定方法であって、前記方法が：ａ．正常なヒト細胞で複製することができないウイルス遺伝子治療ベクターを含む試料を取得することを含み、前記ウイルスベクターが、導入遺伝子と、正常なヒト細胞内でのウイルスの複製に不可欠な野生型ウイルスゲノムの領域に改変または欠失を有することによって前記野生型ウイルスゲノムから遺伝子改変されたウイルスゲノムを含み、それにより、得られるウイルス遺伝子治療ベクターが、正常なヒト細胞で複製することができないことが意図され、前記方法がまた、次いで、
ｂ）前記試料を、前記ウイルス遺伝子治療ベクターによって形質導入することができる標的生細胞と混合して、形質導入混合物を作製し、次いで、
ｃ）前記ウイルス遺伝子治療ベクターが前記標的細胞を形質導入することを可能にするのに十分な時間及び条件下で、前記形質導入混合物を維持し、次いで、
ｄ）任意の残留試料から前記標的細胞を分離し、次いで、
ｅ）前記標的細胞を溶解して細胞内内容物を放出させ、次いで、
ｆ）前記溶解した標的細胞の前記細胞内内容物を、前記ウイルスに感染し得る生存アッセイ細胞と混合して、感染混合物を作成し、次いで、
ｇ）前記ウイルス（もし存在すれば）が前記アッセイ細胞に感染するのを可能にするのに十分な時間及び条件下で、前記感染混合物を維持し、次いで、
ｈ）前記アッセイ細胞を溶解してその細胞内内容物を放出させ、次いで、
ｉ）前記アッセイ細胞の細胞内内容物から核酸を単離し、次いで、
ｊ）前記単離された核酸を、改変または欠失している、前記ウイルスゲノムのウイルス複製に不可欠な前記領域にハイブリダイズするプローブを使用して、デジタルＰＣＲによって評価し、
それにより、正常なヒト細胞で複製することができるウイルスのおおよその量を前記試料中で測定することを含む、前記同定方法。
【請求項2】
前記ウイルスがアデノウイルスであり、前記プローブが、配列番号１、配列番号２及び配列番号３から選択される配列を含む配列を有するＤＮＡプローブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記方法が、正常なヒト細胞で複製することができない３×１０１０個のウイルス遺伝子治療ベクター粒子あたり、正常なヒト細胞で複製することができるわずか２５個のウイルスを検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記方法が、正常なヒト細胞で複製することができない３×１０１０個のウイルス遺伝子治療ベクター粒子あたり、正常なヒト細胞で複製することができるわずか７個のウイルスを検出する、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記導入遺伝子が、インターフェロン及びｐ５３からなる群から選択されるポリペプチドを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
薬学的に許容される賦形剤と、正常なヒト細胞で複製することができず、導入遺伝子を含むウイルス遺伝子治療ベクターを含む、医薬完成剤形であって、前記剤形が、正常なヒト細胞で複製することができない３×１０１０個のウイルス粒子あたり、正常なヒト細胞で複製することができる約２５個以下のウイルス粒子を含む、前記医薬完成剤形。
【請求項7】
正常なヒト細胞で複製することができない３×１０１０個のウイルス粒子あたり、正常なヒト細胞で複製することができる約７個以下のウイルス粒子を含む、請求項６に記載の医薬完成剤形。
【請求項8】
前記ウイルスがアデノウイルスである、請求項６に記載の医薬完成剤形。
【請求項9】
前記導入遺伝子が、インターフェロン及びｐ５３からなる群から選択されるポリペプチドを発現する、請求項６に記載の医薬完成剤形。
【請求項10】
前記導入遺伝子が、インターフェロンを発現する、請求項９に記載の医薬完成剤形。
【請求項11】
正常なヒト細胞で複製することができない３×１０１０個のウイルス粒子あたり、正常なヒト細胞で複製することができる約７個以下のウイルス粒子を含む、請求項１０に記載の医薬完成剤形。
【請求項12】
前記導入遺伝子が、ｐ５３を発現する、請求項９に記載の医薬完成剤形。
【請求項13】
正常なヒト細胞で複製することができない３×１０１０個のウイルス粒子あたり、正常なヒト細胞で複製することができる約７個以下のウイルス粒子を含む、請求項１２に記載の医薬完成剤形。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照：
本出願は、２０１９年５月３０日に出願され、参照により本明細書に援用される米国実用新案特許出願シリアル番号１６／４２６１２４の優先権を主張する。
本出願は、２０１９年５月３０日に出願され、参照により本明細書に援用される米国実用新案特許出願シリアル番号１６／４２６１２４の優先権を主張する。
【0002】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載：
該当なし
該当なし
【0003】
共同研究契約の当事者名：
該当なし
該当なし
【0004】
配列表の参照：
本出願は、本出願中にＰａｔｅｎｔＩｎ（商標）記録ファイルを含み、参照により援用する。
本出願は、本出願中にＰａｔｅｎｔＩｎ（商標）記録ファイルを含み、参照により援用する。
【0005】
発明者または共同発明者による事前の開示に関する声明：
該当なし
該当なし
【背景技術】
【0006】
特定のウイルス遺伝子治療ベクターは、設計上、患者内で複製することができない。例えば、正常なヒト細胞で複製するには、アデノウイルスは、機能するＥ１ａ、Ｅ１ｂ、及びＥ３ゲノム領域を必要とする。これらの領域を欠失または変異させることにより、ウイルス遺伝子治療ベクターは、複製が欠損し得る。
【0007】
それにもかかわらず、ウイルス遺伝子治療ベクターの製造中に、ランダムな変異または他の事象のために、望ましくない複製能力のあるウイルス（「ＲＣＶ」）が形成される可能性がある。例えば、Ｅ１ａ欠失アデノウイルスベクターは、機能的なＥ１ａ領域を含むＨＥＫ２９３細胞で製造され得る。自発的組換えは、理論的には機能的なＥ１ａ領域をアデノウイルスに戻し、複製能力のあるアデノウイルス（「ＲＣＡ」）を作り出す可能性がある。
【0008】
したがって、ウイルス遺伝子治療ベクターの製造業者は、混入ＲＣＶの存在に関して、複製欠損ウイルスベクターをアッセイする。規制当局、すなわち、欧州医薬品庁及びアメリカ合衆国食品医薬品局は、これを、一般的に「ローラーボトル」アッセイと呼ばれるものを使用して、連続感染についてアッセイすることによって行うことを要求している。
【0009】
この方法では、標的細胞（例えば、ＨＥＫ細胞）を培地中で増殖させる。次いで、ウイルスベクターの試料を加えて標的細胞を形質導入し、形質導入が完了するのに十分な時間、細胞を培養する。次いで、標的細胞をペレット化し、すすいで、培地に残留しているウイルスベクターをすべて除去する。次いで、標的細胞を溶解し、溶解物をアッセイ細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞）の培養物に加える。次いで、感染性ウイルス（もしあれば）がアッセイ細胞の目に見える感染を引き起こすことを可能にするのに十分長い時間、アッセイ細胞を培地中で増殖させる。任意選択で、これらのアッセイ細胞を再びペレット化し、すすぎ、溶解し、溶解物をアッセイ細胞の第２の培養物に加えてもよく、これを次に培地で増殖させる。目に見える感染は顕微鏡で測定し、アッセイ細胞を観察して、ウイルスに感染しているかどうかを視覚的に判定する。その目視検査は、目に見える細胞ストレスの評価であり；感染細胞は目に見えて変形し、見栄えが悪くなるが、一方、感染性ウイルスがない場合、アッセイ細胞は正常に見える。アッセイ細胞を通常、ローラーボトル内で培養することから、この試験は多くの場合、「ローラーボトル」試験と呼ばれる。
【0010】
ローラーボトルアッセイは、３×１０１０ウイルス粒子中に１つ未満のＲＣＡを検出するのに十分な感度があると理解されている。ローラーボトル試験は、アッセイ細胞の形態の顕微鏡観察に依存しているため、ある程度主観的である。より客観的なアッセイを見出すために、様々な代替アプローチを試験した。代替アッセイを業界標準のローラーボトルアッセイと比較したところ、驚くべきことに、当技術分野の教示に反して、ローラーボトルアッセイは、３×１０１０ウイルス粒子中に１つ未満のＲＣＡを検出するのに十分な感度がないことがわかった。それどころか、ローラーボトルアッセイでは、３×１０１０ウイルス粒子中に７５個以上のＲＣＡを検出することができるに過ぎないことがわかった。
【0011】
したがって、本発明者らは、デジタルＰＣＲを使用した代替アプローチの開発に時間を費やした。これは、従来技術のアプローチに比べて、より高速であり得、より客観的なデータを提供し、驚くべきことに、１０倍の高感度で、例えば、３×１０１０ウイルス粒子中に７個のＲＣＡを検出することができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0012】
本開示は、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）を用いて、複製能力のあるウイルス（「ＲＣＶ」）、例えば、複製能力のあるアデノウイルス（「ＲＣＡ」）を検出するためのアッセイを記載する。好ましくは、装置が容易に入手可能であることから、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用してもよい。本発明者らのアッセイには、細胞培養物中のＲＣＡの複数の増幅サイクルと、ｄｄＰＣＲ法による増幅されたＲＣＡの検出が含まれる。
【0013】
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要請かつ必要な料金の支払いにより特許庁より提供される。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【0015】
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開のコピーは、要請かつ必要な料金の支払いにより特許庁より提供される。
【発明を実施するための形態】
【0016】
アッセイの概要を図１に示す。図１では、浮遊培養したＨｅＬａ細胞を使用して潜在するＲＣＡを増幅している。細胞を７．５×１０７細胞／フラスコの密度で、５００ｍｌ振盪フラスコに播種する。各フラスコに、３×１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）の被験試料（ＴＳ）を加える。３日間のインキュベーション（＋３７℃、５％ＣＯ２、１２２ｒｐｍ）後、細胞を回収し、３回の凍結融解サイクルで溶解する。溶解物を遠心分離により清澄化する。
【0017】
次いで、溶解物を、１２５ｍｌ振盪フラスコの新鮮なアッセイ細胞（２×１０７細胞／フラスコ）に加える。これらの第１のアッセイ培養フラスコを、標的細胞培養と同じ方法で取り扱う。
【0018】
次いで、第１のアッセイ培養由来の溶解物を、第２のアッセイ培養（２×１０７細胞／フラスコ）に加える。３日間のインキュベーション後、第２のアッセイ培養細胞を回収して溶解する。溶解物を遠心分離により清澄化し、超低温冷凍庫に保存する。複数のＲＣＡ増幅サイクルを実行して、治療用タンパク質（例えば、インターフェロン（インターフェロン感受性アッセイ細胞の増殖を妨げる）をコードするウイルスベクター内の導入遺伝子）の干渉効果を最小限に抑え、ＲＣＡの収率を最大化する。
【0019】
溶解物中のＲＣＡを、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）法によって検出する。本発明者らはｄｄＰＣＲの使用を推奨しており、そのため、以下でこれを説明するが、他のｄＰＣＲ法を使用してもよい。
【0020】
溶解物をプロテイナーゼＫで前処理して、ウイルス粒子内にカプセル化されているウイルスＤＮＡを放出させる。
【0021】
前処理した溶解物をｄｄＰＣＲ分析における試料として、ウイルスから欠失させた（複製不能とするために）ウイルスゲノム領域の一部に特異的なＰＣＲプライマー及びプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）と共に使用する。例えば、Ｅ１領域を欠失させたアデノウイルスを、この方法を使用してアッセイした。Ｅ１領域は、アデノウイルスの複製に不可欠であるため、様々なアデノウイルス遺伝子治療ベクターのゲノムからは欠失させるが、野生型（感染性）ゲノムには存在する。
【0022】
ｄｄＰＣＲ分析では、スーパーミックス、プライマー及びプローブを含む混合物を調製し、次いで９６ウェルプレートの３つのウェルにピペットで移した。溶解物試料（上記由来の）を各ウェルに加える。次いで、自動液滴ジェネレーターを使用して、数千の小さな液滴を生成した。試料ＤＮＡはランダムに液滴間に分割される。液滴内のＤＮＡをＰＣＲによって増幅させる。液滴を、陽性及び陰性の液滴をカウントするリーダーを使用して読み取る。結果を、ポアソン分布を使用して計算し、コピー数／μｌで取得する。
【0023】
本発明者らは、このプロトコルを複製欠損アデノウイルス遺伝子治療ベクターに使用したが、概念的にはＰＣＲ分析に適したゲノムを有する他の複製欠損ウイルスに使用してもよい。同様に、本発明者らは、血管内皮成長因子Ｄ（「ＶＥＧＦ－Ｄ」）の導入遺伝子を含むウイルスベクターでこの系を試験したが、別の導入遺伝子を有するベクターで使用してもよい。
【0024】
アッセイ用の参照標準（ＲＳ）として、第Ｉ相臨床グレードの物質を１．７７×１０１１ｖｐ／ｍｌの濃度で使用した。ＲＳは被験試料（ＴＳ）と同様に扱う。２つ組のＲＳフラスコを用意した。ＴＳの結果を、参照標準に対して報告する。
【0025】
増幅は、陰性対照（ＮＣ）によって調節する。ＮＣは、細胞を細胞培養培地で「模擬感染」させることによって調製する。期待される結果がわかっているため、ＮＣは単一のフラスコとして調製する。
【0026】
標的細胞を１００ｖｐの野生型（複製能力のある）アデノウイルス参照物質（「ＡＲＭ」）（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ－１５１６）で感染させることによって調製した陽性対照（ＰＣ）を使用した。ＰＣは傾向分析の目的でのみ使用し、ＰＣを２つ組で調製する。
【0027】
ｄｄＰＣＲは、テンプレートなしの対照（ＮＴＣ）によって制御する。ＮＴＣでは、試料を、試料、及び陽性対照の精製ＡＲＭ ＤＮＡ（ＡＲＭ物質から抽出した無細胞ＤＮＡを試料として使用する）の希釈に使用した培地と同じ細胞培養培地に置き換える。ＡＲＭ ＤＮＡは、元の濃度である３２２．１ｎｇ／μｌを使用した。次いで、ＡＲＭ ＤＮＡを１０ｎｇ／μｌに希釈し、１２μｌ／チューブのアリコートに分注した。アリコートを－２０℃で保存した。ＤＮＡの凍結融解による損傷を最小限に抑えるために、各アリコートの解凍は５回以内までとすべきである。解凍したチューブの各解凍を記憶または記録し、５回目の解凍後に廃棄して分注することを推奨する。
【0028】
このアッセイでは、１０％ＦＢＳ／Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｌ－グルタミンを添加したＤＭＥＭで培養したＨｅＬａ ＱＣＷＣＢ２細胞を使用する。細胞を、例えば、シェーカープラットフォームを備えたＣＯ２インキュベーターまたはＮｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓ４１ｉ（商標）インキュベーターシェーカー内で、異なるサイズの懸濁振盪フラスコ中で培養する。
【0029】
このプロセスは、第１の感染、第２の感染及び第３の感染の日に２人のオペレーターが実行した場合に最も効率的であることがわかった。１人のオペレーターがアッセイ用にＨｅＬａ浮遊細胞を播種する（感染用に７～１５フラスコ、さらに培養用に１～５フラスコ）。もう１人のオペレーターは、第１の感染のためにウイルス希釈液を調製するか、または第２及び第３の感染中に感染細胞を溶解する。回収及びｄＰＣＲ分析に必要なオペレーターは１人だけである。
【0030】
細胞培養
細胞培養は無菌操作に従って実施する。ＨｅＬａ ＱＣＷＣＢ２細胞を浮遊培養した。ＲＣＡアッセイに必要な細胞フラスコの数は、分析するＴＳの数によって異なる。１つのフラスコをＮＣ用に、２つのフラスコをＲＳ用に、そして２つのフラスコをＰＣ用に確保する。各ＴＳは２つ組として分析する。１回のアッセイで最大５つのＴＳを分析することができる（合計１５フラスコ）。
細胞培養は無菌操作に従って実施する。ＨｅＬａ ＱＣＷＣＢ２細胞を浮遊培養した。ＲＣＡアッセイに必要な細胞フラスコの数は、分析するＴＳの数によって異なる。１つのフラスコをＮＣ用に、２つのフラスコをＲＳ用に、そして２つのフラスコをＰＣ用に確保する。各ＴＳは２つ組として分析する。１回のアッセイで最大５つのＴＳを分析することができる（合計１５フラスコ）。
【0031】
必要な数のフラスコを確保するには、培養物を適切にスケールアップする必要がある。表Ｉは、様々な数の被験試料（ＴＳ）でアッセイを開始するための、播種するフラスコの推奨最小数を示している。２５０ｍｌ及び５００ｍｌの振盪フラスコは交換可能であるため、１つの５００ｍｌフラスコは２つの２５０ｍｌフラスコに対応する。必要な量の細胞を取得するには、スケールアップを十分に早く開始する必要があることに注意されたい：４～５種のＴＳを用いてアッセイする場合、これはアッセイ開始の約２週間前を意味し、１～３種のＴＳを用いてアッセイする場合は前週を意味する。
様々な数の被験試料（ＴＳ）でアッセイを開始するための、播種するフラスコの推奨最小数を示す。スケールアップは、アッセイの１～２週間前に開始すべきである。平日は例示的なものであり、必要に応じて調整することができる。アッセイに必要なフラスコを示し；また、同時にさらに培養するために、複数のフラスコに播種する必要がある。
【表1】
様々な数の被験試料（ＴＳ）でアッセイを開始するための、播種するフラスコの推奨最小数を示す。スケールアップは、アッセイの１～２週間前に開始すべきである。平日は例示的なものであり、必要に応じて調整することができる。アッセイに必要なフラスコを示し；また、同時にさらに培養するために、複数のフラスコに播種する必要がある。
【0032】
ＲＣＡアッセイのために細胞を播種する前に、培養物の増殖をモニタリングし、細胞をカウントする。細胞には以下のシステム適合基準（ＳＳＣ）を使用することを推奨する：細胞生存率≧８０％、及び細胞カウント数のＲＳＤ％（相対標準偏差）≦２０％。
【0033】
ＲＣＡアッセイで感染させる細胞を播種する場合、表ＩＩに示す播種パラメーターを使用することを推奨する。
【表2】
【0034】
第１の感染を、５００ｍｌフラスコ中で、１×１０８細胞／フラスコで実施することを推奨する。この細胞量を１００ｍｌの培地に播種する。感染後、１００ｍｌの培地を加える。フラスコ中の最終細胞密度は５×１０５細胞／ｍｌである。１フラスコあたりの被験物質の用量は３ｘ１０１０ｖｐである。細胞あたりの用量は３００ｖｐ／細胞である。第２及び第３の感染は、１２５ｍｌのフラスコ中で、４０ｍｌの培地中に２×１０７細胞／フラスコで実施する。細胞密度は５×１０５細胞／ｍｌである。播種した細胞は、同じ日に感染させる。
【0035】
第１の感染／形質導入：
第１の感染（すなわち導入遺伝子を含む組換えウイルスを使用する「形質導入」）では、ウイルスベクター希釈液を冷培地（冷蔵庫から取り出した）中で調製する。プロトコル全体を通して、相互汚染を回避する。ウイルス試料は、以下の該当する順序で処理する：１）ＮＣ、２）ＴＳ、３）ＲＳ、４）ＰＣ。
第１の感染（すなわち導入遺伝子を含む組換えウイルスを使用する「形質導入」）では、ウイルスベクター希釈液を冷培地（冷蔵庫から取り出した）中で調製する。プロトコル全体を通して、相互汚染を回避する。ウイルス試料は、以下の該当する順序で処理する：１）ＮＣ、２）ＴＳ、３）ＲＳ、４）ＰＣ。
【0036】
ａ） ウイルス力価（ｖｐ／ｍｌ）を記録する。
ｂ） ウイルスの希釈率を計算する。
ｃ） ウイルス希釈液及び感染させる細胞がほぼ同時に準備できるように、細胞を播種するオペレーターと作業を同期させる。
ｄ） 冷蔵庫内のＲＳ、ＡＲＭ及びＴＳを解凍し、使用直前まで冷却したままとする。
ｅ） 必要量の冷培地を５０ｍｌチューブに入れる。必要量は以下のとおりである：ＰＣの予備希釈の場合はおよそ７．０ｍｌ、ＮＣ、ＲＳ及びＰＣフラスコの最終希釈の場合はおよそ８．５ｍｌ、各ＴＳの場合はおよそ４．５ｍｌである。（結果として、１つのＴＳに対しておよそ２０ｍｌ、５つのＴＳではおよそ４０ｍｌが必要である）。
ｆ） 表ＩＩＩに従って、ＰＣ（ＡＲＭ）の予備希釈液を調製する。適切な量で所望の用量を達成するには、ＡＲＭを希釈系列で大幅に希釈する必要があることがわかった。次の希釈液の調製に使用する前に、各希釈液を完全に混合する必要がある。
ｇ） 最終希釈液を調製する。最初にすべてのチューブに培地をピペッティングして入れ、次いで被験物質、最後にＲＳ及びＰＣのみを入れる。ＲＳ、ＰＣ及び各ＴＳに対して２つ組の希釈液を調製することに留意されたい。調製から９０分以内に希釈液を使用する。
ｈ） ５００ｍｌ振盪フラスコを、１００ｍｌの培地中の１×１０８細胞で、培地で（ＮＣ）、及び最終希釈液で感染させる。感染には全希釈液（２ｍｌ）を使用する。
ｉ） 感染後およそ９０分（±１０分）で、感染細胞の入ったフラスコに１００ｍｌの新鮮な予熱培地を加える。
ｊ） 感染させた細胞を含むフラスコを３日間インキュベートする（＋３７℃、５％ＣＯ２、１２２ｒｐｍ）。
ｂ） ウイルスの希釈率を計算する。
ｃ） ウイルス希釈液及び感染させる細胞がほぼ同時に準備できるように、細胞を播種するオペレーターと作業を同期させる。
ｄ） 冷蔵庫内のＲＳ、ＡＲＭ及びＴＳを解凍し、使用直前まで冷却したままとする。
ｅ） 必要量の冷培地を５０ｍｌチューブに入れる。必要量は以下のとおりである：ＰＣの予備希釈の場合はおよそ７．０ｍｌ、ＮＣ、ＲＳ及びＰＣフラスコの最終希釈の場合はおよそ８．５ｍｌ、各ＴＳの場合はおよそ４．５ｍｌである。（結果として、１つのＴＳに対しておよそ２０ｍｌ、５つのＴＳではおよそ４０ｍｌが必要である）。
ｆ） 表ＩＩＩに従って、ＰＣ（ＡＲＭ）の予備希釈液を調製する。適切な量で所望の用量を達成するには、ＡＲＭを希釈系列で大幅に希釈する必要があることがわかった。次の希釈液の調製に使用する前に、各希釈液を完全に混合する必要がある。
【表3】
ｇ） 最終希釈液を調製する。最初にすべてのチューブに培地をピペッティングして入れ、次いで被験物質、最後にＲＳ及びＰＣのみを入れる。ＲＳ、ＰＣ及び各ＴＳに対して２つ組の希釈液を調製することに留意されたい。調製から９０分以内に希釈液を使用する。
ｈ） ５００ｍｌ振盪フラスコを、１００ｍｌの培地中の１×１０８細胞で、培地で（ＮＣ）、及び最終希釈液で感染させる。感染には全希釈液（２ｍｌ）を使用する。
ｉ） 感染後およそ９０分（±１０分）で、感染細胞の入ったフラスコに１００ｍｌの新鮮な予熱培地を加える。
ｊ） 感染させた細胞を含むフラスコを３日間インキュベートする（＋３７℃、５％ＣＯ２、１２２ｒｐｍ）。
【0037】
第１の感染後、アッセイを一時停止できることに留意されたい。上記の手順ａ）～ｈ）に従う。上清をクリーンな１５ｍｌの滅菌遠心チューブに移す。チューブを液体窒素ですばやく凍結し、超低温冷凍庫で最大２か月間保管する。第２の感染の日に、冷蔵庫内で冷凍されている上清を解凍し、すべての上清を使用して新鮮な細胞に感染させる。
【0038】
第２の感染：
第２の感染では、細胞を再懸濁するために培地（冷蔵庫から取り出した）が必要である。ウイルス試料は、以下の該当する順序で処理する：１）ＮＣ、２）ＴＳ、３）ＲＳ、４）ＰＣ。
第２の感染では、細胞を再懸濁するために培地（冷蔵庫から取り出した）が必要である。ウイルス試料は、以下の該当する順序で処理する：１）ＮＣ、２）ＴＳ、３）ＲＳ、４）ＰＣ。
【0039】
ａ） 感染用の上清及び感染させる細胞がほぼ同時に準備できるように、細胞を播種するオペレーターと作業を同期させる。
ｂ） 液体窒素容器に液体窒素を満たす。
ｃ） 感染させた細胞懸濁液（２００ｍｌ）を、各振盪フラスコから５０ｍｌ滅菌チューブに移す（４チューブ／試料）。
ｄ） 細胞を、＋４℃、１０００×ｇで１０分間遠心分離する。
ｅ） 上清を除去する。
ｆ） １つの試料の細胞ペレットを５ｍｌの新鮮な冷培地で再懸濁する。１つのチューブに培地を加え、ピペッティングによってペレットを再懸濁し、懸濁液を同じ試料の第２のチューブに移し、再度懸濁し、試料の４つのチューブすべてを処理するまで繰り返す。
ｇ） 懸濁液を１５ｍｌの滅菌遠心チューブに移す（１チューブ／試料）。
ｈ） 液体窒素で３サイクル凍結し（およそ５分）、水浴中で＋３７℃にて（およそ１０分間）解凍して細胞を溶解する。チューブを、液体窒素及び温水に一列に浸すことができる金属製のケージに配置する。凍結するたびに、チューブが損傷していないことを確認してから、温水に入れる。解凍するたびに、チューブに亀裂がないことを再度確認し、チューブを低速でボルテックスする。凍結ステップの１ステップで、作業を一時停止することができる。続行する準備ができるまで試料を凍結したままにしておく（液体窒素／－８０℃）。
ｉ） 溶解した細胞を２０００×ｇで＋４℃にて２０分間遠心分離して、細胞の破片を取り除く。上清を保持する。
ｊ） 感染させるＨｅＬａ浮遊細胞の準備ができていない場合は、上清をクリーンなチューブに移し、細胞の準備ができるまで冷温に保持する（冷蔵庫）。
ｋ） ４０ｍｌ中に２×１０７個の細胞を含む１２５ｍｌ振盪フラスコに上清を感染させる。感染にはすべての上清（およそ５ｍｌ）を使用する。
ｌ） 感染させた細胞を含むフラスコを３日間インキュベートする（＋３７℃、５％ＣＯ２、１２２ｒｐｍ）。
ｂ） 液体窒素容器に液体窒素を満たす。
ｃ） 感染させた細胞懸濁液（２００ｍｌ）を、各振盪フラスコから５０ｍｌ滅菌チューブに移す（４チューブ／試料）。
ｄ） 細胞を、＋４℃、１０００×ｇで１０分間遠心分離する。
ｅ） 上清を除去する。
ｆ） １つの試料の細胞ペレットを５ｍｌの新鮮な冷培地で再懸濁する。１つのチューブに培地を加え、ピペッティングによってペレットを再懸濁し、懸濁液を同じ試料の第２のチューブに移し、再度懸濁し、試料の４つのチューブすべてを処理するまで繰り返す。
ｇ） 懸濁液を１５ｍｌの滅菌遠心チューブに移す（１チューブ／試料）。
ｈ） 液体窒素で３サイクル凍結し（およそ５分）、水浴中で＋３７℃にて（およそ１０分間）解凍して細胞を溶解する。チューブを、液体窒素及び温水に一列に浸すことができる金属製のケージに配置する。凍結するたびに、チューブが損傷していないことを確認してから、温水に入れる。解凍するたびに、チューブに亀裂がないことを再度確認し、チューブを低速でボルテックスする。凍結ステップの１ステップで、作業を一時停止することができる。続行する準備ができるまで試料を凍結したままにしておく（液体窒素／－８０℃）。
ｉ） 溶解した細胞を２０００×ｇで＋４℃にて２０分間遠心分離して、細胞の破片を取り除く。上清を保持する。
ｊ） 感染させるＨｅＬａ浮遊細胞の準備ができていない場合は、上清をクリーンなチューブに移し、細胞の準備ができるまで冷温に保持する（冷蔵庫）。
ｋ） ４０ｍｌ中に２×１０７個の細胞を含む１２５ｍｌ振盪フラスコに上清を感染させる。感染にはすべての上清（およそ５ｍｌ）を使用する。
ｌ） 感染させた細胞を含むフラスコを３日間インキュベートする（＋３７℃、５％ＣＯ２、１２２ｒｐｍ）。
【0040】
第２の感染後、アッセイを一時停止することができる。上記の手順ａ）～ｈ）に従う。上清をクリーンな１５ｍｌの滅菌遠心チューブに移す。チューブを液体窒素ですばやく凍結し、超低温冷凍庫で最大２か月間保管する。第３の感染の日に、冷蔵庫内で冷凍されている上清を解凍し、すべての上清を使用して新鮮な細胞に感染させる。
【0041】
第３の感染：
第３の感染では、細胞を再懸濁するために冷培地（冷蔵庫から取り出した）を使用する。ウイルス試料は、以下の該当する順序で処理する：１）ＮＣ、２）ＴＳ、３）ＲＳ、４）ＰＣ。
ａ） 感染用の上清及び感染させる細胞がほぼ同時に準備できるように、細胞を播種するオペレーターと作業を同期させる。
ｂ） 液体窒素容器に液体窒素を満たす。
ｃ） 感染させた細胞懸濁液（４０ｍｌ）を、各振盪フラスコから５０ｍｌ滅菌チューブに移す（１チューブ／試料）。
ｄ） 細胞を、＋４℃、１０００×ｇで１０分間遠心分離する。
ｅ） 上清を除去する。
ｆ） １つの試料の細胞ペレットを２ｍｌの新鮮な冷培地で再懸濁する。ペレットが非常に密度が高く、再懸濁が難しい場合は、再懸濁量を増やすことができる。
ｇ） 懸濁液を１５ｍｌの滅菌遠心チューブに移す（１チューブ／試料）。
ｈ） 液体窒素で３サイクル凍結し（およそ５分）、水浴中で＋３７℃にて（およそ１０分間）解凍して細胞を溶解する。チューブを、液体窒素及び温水に一列に浸すことができる金属製のケージに配置する。凍結するたびに、チューブが損傷していないことを確認してから、温水に入れる。解凍するたびに、チューブに亀裂がないことを再度確認し、チューブを低速でボルテックスする。凍結ステップの１ステップで、作業を一時停止することができる。続行する準備ができるまで試料を凍結したままにしておく（液体窒素／－８０℃）。
ｉ） 溶解した細胞を２０００×ｇで＋４℃にて２０分間遠心分離して、細胞の破片を取り除く。上清を保管する。
ｊ） 感染させるＨｅＬａ浮遊細胞の準備ができていない場合は、上清をクリーンなチューブに移し、細胞の準備ができるまで冷温に保持する（冷蔵庫）。
ｋ） ４０ｍｌ中に２×１０７個の細胞を含む１２５ｍｌ振盪フラスコに上清を感染させる。感染にはすべての上清（およそ２ｍｌ）を使用する。
ｌ） 感染させた細胞を含むフラスコを３日間インキュベートする（＋３７℃、５％ＣＯ２、１２２ｒｐｍ）。
第３の感染では、細胞を再懸濁するために冷培地（冷蔵庫から取り出した）を使用する。ウイルス試料は、以下の該当する順序で処理する：１）ＮＣ、２）ＴＳ、３）ＲＳ、４）ＰＣ。
ａ） 感染用の上清及び感染させる細胞がほぼ同時に準備できるように、細胞を播種するオペレーターと作業を同期させる。
ｂ） 液体窒素容器に液体窒素を満たす。
ｃ） 感染させた細胞懸濁液（４０ｍｌ）を、各振盪フラスコから５０ｍｌ滅菌チューブに移す（１チューブ／試料）。
ｄ） 細胞を、＋４℃、１０００×ｇで１０分間遠心分離する。
ｅ） 上清を除去する。
ｆ） １つの試料の細胞ペレットを２ｍｌの新鮮な冷培地で再懸濁する。ペレットが非常に密度が高く、再懸濁が難しい場合は、再懸濁量を増やすことができる。
ｇ） 懸濁液を１５ｍｌの滅菌遠心チューブに移す（１チューブ／試料）。
ｈ） 液体窒素で３サイクル凍結し（およそ５分）、水浴中で＋３７℃にて（およそ１０分間）解凍して細胞を溶解する。チューブを、液体窒素及び温水に一列に浸すことができる金属製のケージに配置する。凍結するたびに、チューブが損傷していないことを確認してから、温水に入れる。解凍するたびに、チューブに亀裂がないことを再度確認し、チューブを低速でボルテックスする。凍結ステップの１ステップで、作業を一時停止することができる。続行する準備ができるまで試料を凍結したままにしておく（液体窒素／－８０℃）。
ｉ） 溶解した細胞を２０００×ｇで＋４℃にて２０分間遠心分離して、細胞の破片を取り除く。上清を保管する。
ｊ） 感染させるＨｅＬａ浮遊細胞の準備ができていない場合は、上清をクリーンなチューブに移し、細胞の準備ができるまで冷温に保持する（冷蔵庫）。
ｋ） ４０ｍｌ中に２×１０７個の細胞を含む１２５ｍｌ振盪フラスコに上清を感染させる。感染にはすべての上清（およそ２ｍｌ）を使用する。
ｌ） 感染させた細胞を含むフラスコを３日間インキュベートする（＋３７℃、５％ＣＯ２、１２２ｒｐｍ）。
【0042】
回収：
回収するために、試料のラベルを、表ＩＶに従って印刷してもよい。感染させた細胞の各フラスコには４つのラベルが必要であり：１１０μｌのアリコートサイズの２種及び＜１０００μｌの２種である。
回収するために、試料のラベルを、表ＩＶに従って印刷してもよい。感染させた細胞の各フラスコには４つのラベルが必要であり：１１０μｌのアリコートサイズの２種及び＜１０００μｌの２種である。
【表4】
【0043】
細胞を再懸濁するには、冷培地（冷蔵庫から取り出した）が必要である。ウイルス試料は、以下の該当する順序で処理する：１）ＮＣ、２）ＴＳ、３）ＲＳ、４）ＰＣ。
ａ） 液体窒素容器に液体窒素を満たす。
ｂ） 回収アリコート用に１ｍｌクライオチューブにラベルを付ける。
ｃ） 感染させた細胞懸濁液（４０ｍｌ）を、各振盪フラスコから５０ｍｌ滅菌チューブに移す（１チューブ／試料）。
ｄ） 細胞を、＋４℃、１０００×ｇで１０分間遠心分離する。
ｅ） 上清を除去する。
ｆ） １つの試料の細胞ペレットを２ｍｌの新鮮な冷培地で再懸濁する。ペレットが非常に密度が高く、再懸濁が難しい場合は、再懸濁量を増やすことができる。
ｇ） 懸濁液を１５ｍｌの滅菌遠心チューブに移す（１チューブ／試料）。
ｈ） 液体窒素で３サイクル凍結し（およそ５分）、水浴中で＋３７℃にて（およそ１０分間）解凍して細胞を溶解する。チューブを、液体窒素及び温水に一列に浸すことができる金属製のケージに配置する。凍結するたびに、チューブが損傷していないことを確認してから、温水に入れる。解凍するたびに、チューブに亀裂がないことを再度確認し、チューブを低速でボルテックスする。凍結ステップの１ステップで、作業を一時停止してもよい。続行する準備ができるまで試料を凍結したままにしておく（液体窒素／－８０℃）。
ｉ） 溶解した細胞を２０００×ｇで＋４℃にて２０分間遠心分離して、細胞の破片を取り除く。上清を保管する。
ｊ） 上清を新しいクリーンなチューブに移して混合する。
ｋ） 各試料の上清を事前にラベル付けした１ｍｌクライオチューブに分注する：２×１１０μｌ；２×＜１０００μｌ。
ｌ） アリコートを液体窒素ですばやく凍結し、分析するまで冷凍庫に保管する。
ａ） 液体窒素容器に液体窒素を満たす。
ｂ） 回収アリコート用に１ｍｌクライオチューブにラベルを付ける。
ｃ） 感染させた細胞懸濁液（４０ｍｌ）を、各振盪フラスコから５０ｍｌ滅菌チューブに移す（１チューブ／試料）。
ｄ） 細胞を、＋４℃、１０００×ｇで１０分間遠心分離する。
ｅ） 上清を除去する。
ｆ） １つの試料の細胞ペレットを２ｍｌの新鮮な冷培地で再懸濁する。ペレットが非常に密度が高く、再懸濁が難しい場合は、再懸濁量を増やすことができる。
ｇ） 懸濁液を１５ｍｌの滅菌遠心チューブに移す（１チューブ／試料）。
ｈ） 液体窒素で３サイクル凍結し（およそ５分）、水浴中で＋３７℃にて（およそ１０分間）解凍して細胞を溶解する。チューブを、液体窒素及び温水に一列に浸すことができる金属製のケージに配置する。凍結するたびに、チューブが損傷していないことを確認してから、温水に入れる。解凍するたびに、チューブに亀裂がないことを再度確認し、チューブを低速でボルテックスする。凍結ステップの１ステップで、作業を一時停止してもよい。続行する準備ができるまで試料を凍結したままにしておく（液体窒素／－８０℃）。
ｉ） 溶解した細胞を２０００×ｇで＋４℃にて２０分間遠心分離して、細胞の破片を取り除く。上清を保管する。
ｊ） 上清を新しいクリーンなチューブに移して混合する。
ｋ） 各試料の上清を事前にラベル付けした１ｍｌクライオチューブに分注する：２×１１０μｌ；２×＜１０００μｌ。
ｌ） アリコートを液体窒素ですばやく凍結し、分析するまで冷凍庫に保管する。
【0044】
デジタルＰＣＲ分析：
ＤＮＡ作業は、ヌクレアーゼフリー条件下で実施すべきである。滅菌ヌクレアーゼフリー溶液及びプラスチック製品を使用しなければならない。ＤＮＡ試料を取り扱う際は、常に手袋を着用しなければならない。ＤＮＡ－ＥｘｉｔｕｓＰｌｕｓ（商標）を使用して、作業後に潜在するＤＮＡ残留物を取り除いてもよい。ＤＮＡ試料専用のラミナーフローフード（「ＬＦＨ」）を洗浄した後、ＬＦＨをＵＶ照射により一晩、不活化してもよい。
ＤＮＡ作業は、ヌクレアーゼフリー条件下で実施すべきである。滅菌ヌクレアーゼフリー溶液及びプラスチック製品を使用しなければならない。ＤＮＡ試料を取り扱う際は、常に手袋を着用しなければならない。ＤＮＡ－ＥｘｉｔｕｓＰｌｕｓ（商標）を使用して、作業後に潜在するＤＮＡ残留物を取り除いてもよい。ＤＮＡ試料専用のラミナーフローフード（「ＬＦＨ」）を洗浄した後、ＬＦＨをＵＶ照射により一晩、不活化してもよい。
【0045】
回収試料を前処理するために、回収試料を室温で最大１時間解凍する。試料を９６ウェルプレート上でピペッティングする（１００μｌ／ウェル）：ＮＣをウェルＡ４へ。ＲＳ＿１、ＲＳ＿２、ＰＣ＿１、ＰＣ＿２、ＴＳ１＿１及びＴＳ１＿２をウェルＢ１～Ｇ１の列１へ。残りのＴＳを、ウェルＡ６～Ｈ６の列６へ。使用済みのウェルにプロテイナーゼＫ（１μｌ／ウェル）を添加する。プレートを光学粘着カバーでしっかりと密封する。穏やかにボルテックスし、短時間、回転させる。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲシステムで、最新バージョンのＳＤＳテンプレートドキュメント「Ｐｒｏｔ Ｋ」を使用して、プレートを実行する。実行プログラムは以下のとおりである：＋５０℃で６０分間インキュベートする。＋９５℃で２０分間インキュベートする。試料を＋４℃まで冷却する。試料の希釈を直接続けない場合は、プレートを冷蔵庫に保管する。
【0046】
試料を希釈する場合、ｄｄＰＣＲ分析のダイナミックレンジに収まるように試料を希釈する必要がある。１：１０００及び１：１００００の希釈を分析に使用する。これらの希釈のいずれも許容されない場合は、より高いか、またはより低い希釈を試験することができる。前処理した回収試料を含む、９６ウェルプレートのウェルＢ２～Ｇ５上の細胞培養培地（９０μｌ／ウェル）をピペッティングする。ウェルＡ７～Ｈ１０上の細胞培養培地（９０μｌ／ウェル）をピペッティングする。ウェルＨ４上の細胞培養培地（９０μｌ／ウェル）をピペッティングする。このウェルは、ｄｄＰＣＲ分析用のＮＴＣを調製するために使用する。列１及び６上の前処理した試料をピペッティングにより完全に混合させる。列１～列５、及び列６～列１０の希釈系列を調製する。列１～列２まで１０μｌをピペッティングし、調製した希釈液をピペッティングして完全に混合させる。列２～列３まで１０μｌをピペッティングし、混合する。列５の準備ができて混合させるまで続ける。列６～１０についても同じことを繰り返す。ｄｄＰＣＲ分析を直接続行しない場合は、プレートを冷蔵庫に保管する。
【0047】
ｄｄＰＣＲプレートの調製：
ｄｄＰＣＲプレートを調製するために、新鮮な１ｐｇ／μｌ希釈のＡＲＭ ＤＮＡを、製品のリリースを目的とした各ＲＣＡアッセイの１０ｎｇ／μｌアリコートから調製する。ＡＲＭ ＤＮＡの希釈系列については、表Ｖを参照されたい。
ｄｄＰＣＲプレートを調製するために、新鮮な１ｐｇ／μｌ希釈のＡＲＭ ＤＮＡを、製品のリリースを目的とした各ＲＣＡアッセイの１０ｎｇ／μｌアリコートから調製する。ＡＲＭ ＤＮＡの希釈系列については、表Ｖを参照されたい。
【表5】
【0048】
次の希釈液の調製に使用する前に、各希釈液をピペッティングにより完全に混合する必要がある。希釈液はＤＮＡ ＬＦＨで調製する。ＡＲＭ ＤＮＡ（１ｐｇ／μｌ）という名前の最後の希釈液は、ｄｄＰＣＲの実行に使用する。使用する容量は５μｌ、すなわち、各反応で５ｐｇのＡＲＭ ＤＮＡを使用する。
【0049】
ＲＣＡ用のフォワードプライマー、リバースプライマー及びＴａｑＭａｎプローブの新鮮な希釈液を、製品のリリースを目的とした各ＲＣＡアッセイ用に調製する。本発明者らの実験では、Ｅ１を欠失させたアデノウイルスを使用したため、ＲＣＡ用のフォワードプライマーとして、５’－ＡＡＣ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＣＧ ＴＧＡ ＧＡＧ ＴＴＧ－３’；ＲＣＡのリバースプライマーとして、５’－ＣＴＣ ＧＴＴ ＡＡＧ ＣＡＡ ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＡＴ ＡＣＡ－３’及びＲＣＡのＴａｑＭａｎプローブとして、５’－ＴＧＧ ＧＣＧ ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＧＣ ＴＧＴ Ｇ－３’を使用した。
【0050】
試薬は室温で解凍し、混合し、スピンダウンする（例えば、遠心分離／ボルテックサーにより）。希釈手順については、表ＶＩを参照されたい。
【表6】
【0051】
希釈液は、マスターミックス層流中で調製する。プライマー（６０００ｎＭ）及びプローブ（２５００ｎＭ）の最終濃度を、ｄｄＰＣＲの実行において使用する。各試薬２．５μｌを、総量２５μｌの反応混合物に加える。反応混合物中の濃度は、プライマーで６００ｎＭ、プローブで２５０ｎＭである。分析開発、インプロセス試料及び特性評価を目的として、以前に調製し、－２０℃で保存した希釈液を使用することができる。マスターミックスは、マスターミックスの調製専用のＬＦＨで調製する。試料をＤＮＡ ＬＦＨのプレートに加える。マスターミックス及びＤＮＡ作業のための別個の材料、ピペット及び遠心分離／ボルテックサーを使用する。必要なウェル量及びマスターミックスの必要な総量を計算する。プローブ用のｄｄＰＣＲスーパーミックスを室温で解凍し、解凍したら高速でボルテックスする。ＲＣＡ用の希釈したフォワードプライマー、リバースプライマー及びＴａｑＭａｎプローブを混合し、試薬をスピンダウンする。本発明者らは、遠心分離／ボルテックサーが、混合及び回転に便利に使用することができることを見出した。表ＶＩＩに従ってｄｄＰＣＲのマスターミックスを調製し、高速でボルテックスする。
【表7】
【0052】
９６ウェルプレートのウェル上でマスターミックスをピペッティングする（２０μｌ／ウェル）。任意選択で、マスターミックスを試薬リザーバーに注ぐことができ、マルチチャネルピペットを使用してプレート上で混合物をピペッティングすることができる。ウェルＨ４～Ｈ６及び試料を必要としないウェル上にｄｄＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌキット（ＢＣ、２５μｌ／ウェル）を加える。被験試料の最大数については、各列のすべてのウェルを充填する必要があることに留意されたい。ｄｄＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌキット（「ＢＣ」）は、試料を必要としないウェル上で使用する。例えば、１：１０００及び１：１００００希釈でウェルを使用することを推奨する。
【0053】
前処理した試料及び希釈液を含む９６ウェルプレートをボルテックスにより混合し、試料をスピンダウンすることを推奨する。マスターミックス（２０μｌ／ウェル）を含むｄｄＰＣＲプレートに試料（５μｌ／ウェル）を加える。使用後は試料プレートを冷蔵庫に保管する。試料を使用して、ｄｄＰＣＲ分析を繰り返すことができる。
【0054】
対照のために、ピペッティングによりＡＲＭ ＤＮＡ希釈液を混合し、ｄｄＰＣＲプレート（ウェルＡ４、Ａ５及びＡ６）に加える（５μｌ／ウェル）。
【0055】
プレートシーラーを＋１８０℃で５秒間使用して、プレートをヒートフォイルで密封する。プレートを短時間ボルテックスし、試料混合物をスピンダウンする。液滴の生成及びＰＣＲの実行に進む。
【0056】
液滴生成、ＰＣＲ読み取り及び液滴読み取り：
ＡｕｔｏＤＧ（商標）装置を使用して自動液滴生成を実行することを推奨する。そのために、本発明者らは、プレートシーラーを＋１８０℃で５秒間使用して、液滴を含むプレートをヒートフォイルで密封する。次いで、ＰＣＲの実行を続行する。表ＶＩＩＩに示すＰＣＲ条件でＣ１０００（商標）Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用してプレートを実行することを推奨する。
ＡｕｔｏＤＧ（商標）装置を使用して自動液滴生成を実行することを推奨する。そのために、本発明者らは、プレートシーラーを＋１８０℃で５秒間使用して、液滴を含むプレートをヒートフォイルで密封する。次いで、ＰＣＲの実行を続行する。表ＶＩＩＩに示すＰＣＲ条件でＣ１０００（商標）Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを使用してプレートを実行することを推奨する。
【表8】
【0057】
ＰＣＲの実行後、液滴は安定である。プレートは冷蔵庫で一晩保存することができる。最新バージョンのＱｕａｎｔａＳｏｆｔテンプレート「ＲＣＡ ｄｄＰＣＲ」を備えたＤｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒで液滴を読み取る。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアは、実行用のフォルダーを自動的に作成し、実行結果をＱｕａｎｔａＳｏｆｔプレートドキュメントとして保存する。実行後、以下のようにすべてのウェルの閾値を手動で２０００に設定する：左側のメニューの「Ａｎａｌｙｚｅ」ボタンをクリックし；右上隅のプレートレイアウトからすべてのウェルを選択し；「１Ｄ Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ」表示を選択し；左側のメニューの下部で、黄色のマークが付いたボタン（マルチウェルツール）をアクティブにする。これにより、すべてのウェルの閾値を同時に設定することができる。閾値の設定ボックスに２０００と入力して、閾値を設定する（Ｅｎｔｅｒキーを押す）。閾値設定の視覚化及びソフトウェアユーザーインターフェイスの詳細については、図２を参照されたい。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを閉じ、ソフトウェアが「プレート情報を保存しますか？」を選択するように要求するため、「Ｙｅｓ」をクリックする。作成したフォルダーをサーバーにコピーし、フォルダー名としてアッセイ実行番号が含まれていることを確認する。
【0058】
ｄｄＰＣＲ実行データはＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアによって自動的に分析される。ＳＳＣの履行が評価され、結果がソフトウェアで読み取られる。
【0059】
データ分析：
ｄｄＰＣＲ技術では、試料ＤＮＡを数千の液滴にランダムに分割する。分析の精度は、より多くの液滴が存在するほど良好である。ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステムは、ウェルあたり２００００を超える液滴を生成し、読み取ることができる。所望の精度を確保するために、分析するウェルごとに８０００以上の許容液滴の基準を設定する。ただし、個々のウェルがこの基準を満たしていない場合でも、アッセイは失敗しない。基準を満たさなかったウェルは、以降の分析から除外する。各試料を、ｄｄＰＣＲ分析において３つのウェルで分析する。試料の結果は、３つのウェルのうち少なくとも２つに８０００以上の許容液滴がある場合に読み取ることができる。許容液滴の数を確認するには、以下の手順に従う：サーバーに保存されているプレートドキュメント（閾値２０００）を開く。左側のメニューの「分析」ボタンをクリックする。右上隅のプレートレイアウトからすべてのウェルを選択する。「イベント」表示を選択する。右側の「合計」ボックスにチェックマークを付ける。明確にするために、他のボックス（ｐｏｓ／ｎｅｇ）はチェックすべきでない。ヒストグラムの値から、各ウェルに８０００以上の許容液滴があることを確認する。
ｄｄＰＣＲ技術では、試料ＤＮＡを数千の液滴にランダムに分割する。分析の精度は、より多くの液滴が存在するほど良好である。ＱＸ２００ ｄｄＰＣＲシステムは、ウェルあたり２００００を超える液滴を生成し、読み取ることができる。所望の精度を確保するために、分析するウェルごとに８０００以上の許容液滴の基準を設定する。ただし、個々のウェルがこの基準を満たしていない場合でも、アッセイは失敗しない。基準を満たさなかったウェルは、以降の分析から除外する。各試料を、ｄｄＰＣＲ分析において３つのウェルで分析する。試料の結果は、３つのウェルのうち少なくとも２つに８０００以上の許容液滴がある場合に読み取ることができる。許容液滴の数を確認するには、以下の手順に従う：サーバーに保存されているプレートドキュメント（閾値２０００）を開く。左側のメニューの「分析」ボタンをクリックする。右上隅のプレートレイアウトからすべてのウェルを選択する。「イベント」表示を選択する。右側の「合計」ボックスにチェックマークを付ける。明確にするために、他のボックス（ｐｏｓ／ｎｅｇ）はチェックすべきでない。ヒストグラムの値から、各ウェルに８０００以上の許容液滴があることを確認する。
【0060】
ＮＣ、ＮＴＣ及びＡＲＭ ＤＮＡのシステム適合基準は、３つのウェルのうち少なくとも２つに８０００以上の許容液滴があることである。基準に合格するかどうかを確認する。基準が満たされない場合は、ｄｄＰＣＲ分析を繰り返す必要がある。さらにＳＳＣを検討する場合、許容液滴が８０００以上のウェルのみを考慮する。
【0061】
ｄｄＰＣＲ分析では、陽性液滴を５個以下しか含まない試料は陰性とみなされる。６～３４個の陽性液滴を含む試料は陰性とはみなされないが、汚染されているか、標的ＤＮＡの量が非常に少ない可能性がある。３５個以上の陽性液滴を有する試料は、明確に陽性とみなされる。上記の手順ａ）～ｅ）によって各ウェルの陽性及び陰性の液滴の数をチェックするが、合計ではなく陽性または陰性のボックスにチェックマークを付ける。
【0062】
ＮＣ、ＮＴＣ及びＡＲＭ ＤＮＡのアッセイＳＳＣは以下のとおりである：ＮＣ試料の許容ウェルのいずれかが５個以下の陽性液滴を有するか、またはＮＴＣの許容ウェルのいずれかが５個以下の陽性液滴を有するか、またはＡＲＭ ＤＮＡの３つ組のウェルの少なくとも２つが３５個以上の陽性液滴を示す。
【0063】
これらのＳＳＣが基準を満たさない場合は、ｄｄＰＣＲを繰り返すことを推奨する。それでもＮＣが基準を満たさない場合は、第１の感染から始まるＲＣＡアッセイ全体を繰り返すことを推奨する。基準を満たさない理由がＮＴＣまたはＡＲＭ ＤＮＡである場合、ＲＣＡ増幅は成功している可能性があるが、ｄｄＰＣＲ分析に何らかの問題がある。ＮＴＣまたはＡＲＭ ＤＮＡが繰り返し基準を満たさない場合は、基準を満たさない理由を調査する必要がある。
【0064】
特定の試料の結果を読み取るには、試料に陽性と陰性の両方の液滴が必要である。陰性の液滴の量が少ないと、分析の精度が低下する。ウェルは、１００個超の陰性の液滴を示すべきである。それ以外の場合、ウェルは「飽和」とみなされ、そのウェルの結果を読み取ることができない。
【0065】
ｄｄＰＣＲ分析のダイナミックレンジは狭い。ＲＳ及びＴＳは、２つの希釈：１：１０００及び１：１００００として分析される。希釈の少なくとも１つは範囲内にある必要がある。許容可能なＲＳ希釈の基準は、３つのウェルのうち少なくとも２つが８０００以上の許容液滴を示し、１００個超の陰性の液滴を示し（ウェルが非飽和である）、３５個以上の陽性の液滴を示す（ウェルが陽性の結果を示す）ことである。
【0066】
許容可能な希釈率（複数可）でアッセイＳＳＣを評価する。ＲＳのアッセイＳＳＣは以下のとおりである：ＲＳ＿１とＲＳ＿２の両方が、許容可能なウェル上の許容可能な希釈率（複数可）で、陽性の結果（３５個以上の陽性液滴）を示す。ＳＳＣは、ＲＳ＿１とＲＳ＿２の両方が少なくとも１つの許容可能な希釈率を有する場合に合格する。ＳＳＣの基準を満たさない理由は、不適切な希釈であり得る。使用した希釈率が低すぎる（ウェルが飽和している）か、または高すぎる（陰性の結果）可能性がある。この場合、ｄｄＰＣＲを、調整した希釈率で繰り返すことができる。前処理プレートからの希釈率１：１０及び／または１：１００を適切な希釈率として使用することができ、またはさらなる希釈率１：１００００から調製することができる。続行方法を決定するために、専門家に相談されたい。２つ組のフラスコの１つ（ＲＳ＿１またはＲＳ＿２）が、もう一方がダイナミックレンジ内にある一方で依然として陰性の結果を示す場合、第１の感染から始まるＲＣＡアッセイ全体を繰り返す必要がある。
【0067】
許容可能なＴＳ希釈の基準は、３つ組のウェルのうちの少なくとも２つが８０００以上の許容液滴を示し、１００個超の陰性の液滴を示す（ウェルは非飽和である）ことである。許容可能な希釈率（複数可）で試料ＳＳＣを評価する。ＴＳにはＲＣＡが含まれていない可能性があるため、ＴＳは３５個以上の陽性液滴の基準に合格する必要はないことに留意されたい。
【0068】
試料ＳＳＣは以下のとおりである：ＴＳＸ＿１とＴＳＸ＿２の両方が、少なくとも１つの許容可能な希釈率を有する。試料がＳＳＣの基準を満たさない場合、その結果を報告することはできず、試料を再分析する必要がある。ただし、他の試料の結果を読み取って報告することはできる。ＳＳＣの基準を満たさない理由は、不適切な希釈であり得る。使用した希釈率が低すぎる可能性がある（ウェルが飽和している）。この場合、ｄｄＰＣＲを、調整した希釈率で繰り返すことができる。１：１００００から、さらなる希釈液を調製することができる。
【0069】
ＲＣＡアッセイの結果：
ｄｄＰＣＲ分析の結果は、コピー数／μｌとして得られる。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアは、この値を各ウェルについて、左上隅の結果表に報告する。ウェルに陽性の液滴がない場合、値は０であり、ウェルに陰性の液滴がない場合、値は１００００００（飽和）である。ＲＳ及びＴＳの結果を計算するには、各ウェルについて、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアの結果表に報告されている濃度（コピー数／μｌ）を記録する。許容されたウェル及び希釈液の濃度のみを記録し；それ以外の場合はＮ／Ａを記録する。次いで、報告された濃度に希釈係数を掛けることによって、調整した濃度（コピー数／μｌ）を計算する。次いで、調整した濃度の平均（コピー数／μｌ）を計算する。小数なしの整数としてこれを記録する。特定のＴＳの２つ組のフラスコの１つ（ＴＳＸ＿１またはＴＳＸ＿２）が両方の希釈で陰性の結果を示す場合、陽性のフラスコから平均を計算することに留意されたい。ＲＳの場合、ＲＳ範囲を平均±２０％として計算し；範囲の下限は０．８×平均であり、範囲の上限は１．２×平均である。ＴＳの結果を、このＲＳ範囲と比較する。各ＴＳについて、平均とＲＳ範囲を比較する。平均がＲＳ範囲を下回っている場合、結果は「ＲＳよりもＲＣＡが少ない」である。平均がＲＳ範囲内にある場合、結果は「ＲＳと同等量のＲＣＡ」である。平均がＲＳ範囲を上回っている場合、結果は「ＲＳよりもＲＣＡが多い」である。
ｄｄＰＣＲ分析の結果は、コピー数／μｌとして得られる。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアは、この値を各ウェルについて、左上隅の結果表に報告する。ウェルに陽性の液滴がない場合、値は０であり、ウェルに陰性の液滴がない場合、値は１００００００（飽和）である。ＲＳ及びＴＳの結果を計算するには、各ウェルについて、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアの結果表に報告されている濃度（コピー数／μｌ）を記録する。許容されたウェル及び希釈液の濃度のみを記録し；それ以外の場合はＮ／Ａを記録する。次いで、報告された濃度に希釈係数を掛けることによって、調整した濃度（コピー数／μｌ）を計算する。次いで、調整した濃度の平均（コピー数／μｌ）を計算する。小数なしの整数としてこれを記録する。特定のＴＳの２つ組のフラスコの１つ（ＴＳＸ＿１またはＴＳＸ＿２）が両方の希釈で陰性の結果を示す場合、陽性のフラスコから平均を計算することに留意されたい。ＲＳの場合、ＲＳ範囲を平均±２０％として計算し；範囲の下限は０．８×平均であり、範囲の上限は１．２×平均である。ＴＳの結果を、このＲＳ範囲と比較する。各ＴＳについて、平均とＲＳ範囲を比較する。平均がＲＳ範囲を下回っている場合、結果は「ＲＳよりもＲＣＡが少ない」である。平均がＲＳ範囲内にある場合、結果は「ＲＳと同等量のＲＣＡ」である。平均がＲＳ範囲を上回っている場合、結果は「ＲＳよりもＲＣＡが多い」である。
【0070】
特定のＴＳの２つ組のフラスコのうちの１つ（ＴＳＸ＿１またはＴＳＸ＿２）が、両方の希釈率で陰性の結果を示し、もう一方が明確に陽性の結果を示す場合、平均（コピー数／μｌ）は、陽性フラスコに基づく。ＲＳ範囲との比較で「ＲＳよりもＲＣＡが多い」という結果が得られた場合は、ｄｄＰＣＲ分析を繰り返す必要がある。それでも結果が同じ場合は、第１の感染から始まるＲＣＡアッセイ全体を繰り返す必要がある。
【0071】
アッセイ結果を、Ｅｘｃｅｌ（商標）ファイルで傾向分析してもよい。以下のパラメーターを傾向分析することを推奨する。
・ ＲＣＡアッセイの実行番号
・ アッセイＳＳＣの合否
・ ＳＳＣ否決の考えられる理由
・ ＡＲＭ ＤＮＡの結果（コピー数／μｌ）
・ ＲＳ及びＰＣで許容される希釈率
・ ＲＳ及びＰＣの平均（コピー数／μｌ）（ＰＣの平均は傾向分析用エクセルでのみ計算されることに留意されたい。）
・ ＲＣＡアッセイの実行番号
・ アッセイＳＳＣの合否
・ ＳＳＣ否決の考えられる理由
・ ＡＲＭ ＤＮＡの結果（コピー数／μｌ）
・ ＲＳ及びＰＣで許容される希釈率
・ ＲＳ及びＰＣの平均（コピー数／μｌ）（ＰＣの平均は傾向分析用エクセルでのみ計算されることに留意されたい。）
【0072】
本発明者らの開示に基づいて、当業者はこれを容易に変更し得る。例えば、本発明者らは、血管内皮成長因子Ｄの導入遺伝子を有する組換えアデノウイルスを使用した改良型アッセイを実際に開発したが、このアッセイはまた、他の導入遺伝子（例えば、ｐ５３、インターフェロンなど）を有するベクター内の複製能力のある混入ウイルスを同定することもできる。
【0073】
「感染」とは、標的細胞内で複製して子孫を形成するウイルスを指す。対照的に、「トランスフェクション」とは、外来ＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスベクターを介した標的細胞への送達を指す。トランスフェクションは、標的細胞内でのウイルス複製を必要としない。
【0074】
同様に、本発明者らは実際に、ヒト患者内でまったく複製されないことを目的としたウイルスベクターでアッセイを試験したが、このアッセイは、条件付きで複製されること、例えば、がん化したヒト細胞でのみ複製され、正常なヒト細胞では複製されないことを意図したウイルスベクターにおいて、容易に使用することができる。したがって、これを示すために、添付の特許請求の範囲において、語句「正常なヒト細胞で複製することができない」を使用する。
【0075】
同様に、本発明者らの実験はアデノウイルスで実施しているが、この方法は他のタイプの遺伝子治療ウイルスベクターにも容易に役立つ。
【0076】
したがって、本発明者らの特許の法的適用範囲は、上記の特定の実験室での作業ではなく、添付の特許請求の範囲及びその許容される均等物によって定義されることを意図している。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】