特表 2022-534515 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における、ＩＬ－１ＲＡＰを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-01

(54)【発明の名称】急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における、ＩＬ－１ＲＡＰを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20220725BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20220725BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20220725BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20220725BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20220725BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20220725BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20220725BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20220725BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/13

C12N15/12

C12N5/10

C12N5/0783

C07K19/00

C07K16/30

C07K14/725

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2021570800

(86)(22)【出願日】2020-05-27

(85)【翻訳文提出日】2022-01-27

(86)【国際出願番号】 EP2020064636

(87)【国際公開番号】W WO2020239801

(87)【国際公開日】2020-12-03

(31)【優先権主張番号】19305678.5

(32)【優先日】2019-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】512217400

【氏名又は名称】エタブリスマン フランセ デュ サン

(71)【出願人】

【識別番号】500248467

【氏名又は名称】アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム）

(71)【出願人】

【識別番号】520180817

【氏名又は名称】サントル オスピタリエ ユニヴェルシテール ドゥ ブザンソン

(71)【出願人】

【識別番号】515100581

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ド フランシューコンテ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＦＲＡＮＣＨＥ－ＣＯＭＴＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110000914

【氏名又は名称】特許業務法人 安富国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】デシャン， マリーナ

(72)【発明者】

【氏名】フェラン， クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】ラロザ， ファブリス

(72)【発明者】

【氏名】ワルダ， ワリド

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA42

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）における、ＩＬ－１ＲＡＰを標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞及びその使用の提供。
【解決手段】本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に使用するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含む細胞であって、上記ＣＡＲは、抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域と、膜貫通領域と、少なくとも刺激領域を有する細胞内シグナル伝達領域とをもつ抗体又は抗体断片を有する細胞に関する。
【選択図】図１２Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に使用するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を、その膜で発現する細胞であって、該ＣＡＲは、抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域と、膜貫通領域と、少なくとも刺激領域を有する細胞内シグナル伝達領域とをもつ抗体又は抗体断片を有し、該抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号１４のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ重鎖とを有する、細胞。

【請求項2】

前記抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９５％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９５％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９５％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９５％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９５％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号１４のアミノ酸配列との同一性が少なくとも９５％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ重鎖とを有する、請求項１に記載の細胞。

【請求項3】

前記抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列をもつ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列をもつ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号８のアミノ酸配列をもつ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列をもつ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１３のアミノ酸配列をもつ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号１４のアミノ酸配列をもつ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ重鎖とを有する、請求項１又は２に記載の細胞。

【請求項4】

前記細胞は、Ｔ細胞であり、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１～３のいずれかに記載の細胞。

【請求項5】

前記ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は他の抗体断片からなる群より選択され、好ましくはｓｃＦｖである、請求項１～４のいずれかに記載の細胞。

【請求項6】

前記膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、β、又は、ζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及び、ＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通領域であり、好ましくはＣＤ２８の膜貫通領域である、請求項１～５のいずれかに記載の細胞。

【請求項7】

前記抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、ヒンジ領域によって前記膜貫通領域と接続しており、好ましくは、該ヒンジ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ配列又はその同一性が９５～９９％である配列を有する、請求項１～６のいずれかに記載の細胞。

【請求項8】

前記細胞内シグナル伝達領域は、少なくとも１つの共刺激領域を有し、好ましくは、前記機能的細胞内シグナル伝達領域の該少なくとも１つの共刺激領域は、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＣＤ３ζ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択される１種以上のタンパク質から得られ、好ましくは４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）から得られ、且つ／又は、ＣＤ３ζから得られる、請求項１～７のいずれかに記載の細胞。

【請求項9】

前記ＡＭＬは、（ｉ）難治性／再発性のＡＭＬであるか、又は、（ｉｉ）複雑な細胞遺伝学的異常を有するＡＭＬ及び／又はＴＰ５３変異を有するＡＭＬである、請求項１～８のいずれかに記載の細胞。

【請求項10】

前記ＡＭＬは、難治性／再発性のＩＬ１－ＲＡＰ発現ＡＭＬ等のＩＬ１－ＲＡＰ発現ＡＭＬである、請求項１～９のいずれかに記載の細胞。

【請求項11】

抗チェックポイント阻害剤などの少なくとも１つのモノクローナル抗体と結合している、請求項１～１０のいずれかに記載の細胞。

【請求項12】

前記治療は、自家移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）治療である、請求項１～１１のいずれかに記載の細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に使用するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含む細胞であって、上記ＣＡＲは、抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域と、膜貫通領域と、少なくとも刺激領域を含む細胞内シグナル伝達領域とをもつ抗体又は抗体断片を有する細胞に関する。

【背景技術】

【0002】

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ。“ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ”、“ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ”、“ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ”、“ａｃｕｔｅ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ”、及び、“ａｃｕｔｅ ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ”としても知られる。）は、骨髄、末梢血、時には他の組織での白血病芽球の無秩序な増殖と蓄積を特徴とする壊滅的なクローン性造血幹細胞新生物である。これらの細胞は正常な造血を阻害し、急速に骨髄不全や死を引き起こす。ＡＭＬは成人の急性白血病の中で最も一般的なタイプであり、白血病による年間死亡者数の最大の原因となっている。ＡＭＬは急速に進行し、治療せずに放置すると数週間から数ヶ月以内に命を落とすのが一般的である。米国では２０１５年に約２０，８３０人のＡＭＬの新規症例があり、１０，４６０人の患者がこの病気で亡くなった。診断時の年齢の中央値は約７０歳である。６０歳未満の患者の全体的な５年生存率は約３０～４０％、６０歳以上の患者では１０％未満にとどまる。

【0003】

現在、ＡＭＬの標準的な治療法は、高用量の化学療法又は高線量の放射線療法による寛解導入療法に続いて、同種幹細胞移植と必要に応じた化学療法の追加コースからなる強化療法である。この方法で治療を受けたほとんどの患者は、一過性ではあるが、完全な寛解を得ることができる。再発すると、この病気はさらなる治療に対してますます抵抗性となる。

【0004】

過去３０年間で、若い患者の治療成績は多少改善されたが、高齢の患者の治療成績は基本的に変わっていない。残念ながら、初期の完全寛解を達成した患者を含め、ＡＭＬの患者の大部分は病気の再発を経験する。第二寛解期の同種造血幹細胞移植は、長期生存の唯一の可能性を秘めているが、第二寛解が得られないか、移植に耐えられないため、ほとんどの再発ＡＭＬの患者はこの選択肢を利用できない。

【0005】

再発したＡＭＬに対しては、ＭＥＣ（ミトキサントロン、エトポシド、シタラビン）及びＦＬＡＧ－ＩＤＡ（フルダラビン、シタラビン、イダルビシン、顆粒球コロニー刺激因子）など、複数の多剤併用化学療法によるサルベージレジメンがある。しかし、これらのレジメンはいずれも他のレジメンよりも優れておらず、長期的な生存率が得られないため、受け入れられる標準治療ではない。ＮＣＣＮ（米国立総合癌情報ネットワーク）などのガイドラインでは臨床試験が推奨されており、再発ＡＭＬは緊急性のある未充足の医療ニーズであることが広く認識されている。

【0006】

現在、ＡＭＬ、特に再発ＡＭＬを治療するために、抗体－薬物二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＡＭＧ３３０）やＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲＴ－３３細胞又はＣＡＲＴ－１２３細胞）など、多くの新規アプローチが研究されている。しかし、いくつかの新しいアプローチは、臨床的な毒性及び／又は有効性の欠如のために保留されている。そのため、許容できる毒性プロファイルを持つ効率的な新しい治療法が必要とされている。

【0007】

ＡＭＬにおいて、遺伝子発現のプロファイリング研究、細胞表面染色研究、ウェスタンブロッティング研究により、正常なＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^－造血幹細胞では発現されないが白血病性のものでは発現される細胞表面バイオマーカー（ＩＬ－１ＲＡＰ、ＩＬ－１Ｒ３、Ｃ３ｏｒｆ１３、又は、ＩＬ－１ＲＡｃＰ）が明らかとなった。また、ＩＬ－１ＲＡＰの発現は、腫瘍量やＡＭＬ疾患の臨床相と相関している。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

ＩＬ－１ＲＡＰ（インターロイキン－１受容体アクセサリータンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４０５９）は、ＩＬ－１シグナル伝達に関与するＩＬ－１及びＩＬ３３受容体の共受容体であり、炎症及び増殖に関わるＭＡＰキナーゼ、ｐ３８、ＮＦ－κＢ等の遺伝子等、各種のシグナル伝達経路を活性化する。このタンパク質は腫瘍細胞表面で発現される。従って、ＩＬ－１ＲＡＰは有望な腫瘍関連抗原である。

【0009】

本出願人は、このＣＡＲＴ－ＩＬ－１ＲＡＰ細胞を用いることで、ＡＭＬの患者を治療しうることを見出した。

【0010】

従って、本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に使用するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を、その膜で発現する細胞であって、該ＣＡＲは、抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域と、膜貫通領域と、少なくとも刺激領域を有する細胞内シグナル伝達領域とをもつ抗体又は抗体断片を有し、該抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号１４のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ重鎖と
を有する細胞に関する。

【0011】

本明細書では、ＣＡＲを発現するＴ細胞を「ＣＡＲ Ｔ細胞」又は「ＣＡＲ改変Ｔ細胞」と呼ぶ。本明細書では、ＩＬ１－ＲＡＰを標的とするＣＡＲを発現するＴ細胞を「ＣＡＲＴ－ＩＬ１－ＲＡＰ細胞」又は「ＣＡＲＴ－ＩＬ１－ＲＡＰ改変Ｔ細胞」と呼ぶ。

【0012】

本発明で使用される細胞は、ＡＭＬの治療に使用するための、本明細書に記載されるＣＡＲを発現するように遺伝子改変されている。本明細書中、「遺伝子操作された」又は「遺伝子改変された」という語は、追加の遺伝子材料をＤＮＡ又はＲＮＡとして細胞内の全遺伝子材料に付加することを意味する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】様々な造血性ＡＭＬ細胞株及びＣＤ１４＋細胞で選別した単球のウェスタンブロッティングである。

【図2】ＥＬＩＳＡ法による＃Ｅ３Ｃ３ｍＡｂを用いたＩＬ－１ＲＡＰ組換えタンパク質の識別を表す（ｂ）。ＢＳＡをネガティブコントロールとする（ａ）。

【図3】患者のＡＭＬ初代試料に対するフローサイトメトリー・ゲーティング戦略を示す。ＲＦＩは、芽球と単球の亜集団について示される（左）。通常の（ｒｏｕｔｉｎｅ）ＡＭＬ（全サブタイプ）患者（ｎ＝３０）の群におけるＡＭＬ芽球及び単球内のＩＬ－１ＲＡＰ＋の割合、ＡＭＬ芽球内のＣＤ１２３＋細胞及びＩＬ－１ＲＡＰ＋／ＣＤ１２３＋細胞の割合である（右上）。ＲＦＩも示される（右下）。

【図4】凍結組織アレイを用いた特異的な組織結合を表す。（ａ）ＩＬ－１ＲＡＰ高発現（ＫＵ８１２）又は（ｂ）ネガティブ発現（Ｒａｊｉ）細胞株をそれぞれポジティブコントロール又はネガティブコントロールとして使用した。以下の組織を試験した。ａ：リンパ節、ｂ：結腸、ｃ：小腸、ｄ：胎盤、ｅ：胃、ｆ：肺、ｇ：脾臓、ｈ：前立腺。

【図5】安全カセットｉＣＡＳＰ９、＃Ｅ３Ｃ３ｍＡｂの一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、及び細胞表面発現マーカーΔＣＤ１９を有するＳＩＮレンチウイルスコンストラクトの設計を表す。３つの導入遺伝子は２Ａペプチド切断配列で分離され、ＥＦ１プロモーター＋ＳＰ１６３エンハンサー配列で制御されている。

【図6】ＩＬ－１ＲＡＰ形質導入Ｔ細胞の細胞内画分に対するＣＤ３のウェスタンブロッティングを表す。ａ：全ライセート、ｂ：膜、ｃ：細胞質、ｄ：核。（１）ＣＤ３ζと結合したＣＡＲ（５５ｋＤａ）、（２）内在性ＣＤ３ζ（１６ｋＤａ）、（３）ＣＤ４５（１４７ｋＤａ）、（４）ラミン（６８ｋＤａ）、（５）ＧＡＰＤＨ（３５ｋＤａ）。

【図7】ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ形質導入ＣＥＭ Ｔ細胞株又は初代Ｔ細胞のいずれかのＦＡＣＳ分析検出を表す。ビオチン＋／ＣＤ１９＋ＣＥＭ又はＴ細胞のパーセンテージ（ａ）を、標識ビオチン組換えタンパク質の量（ｂ）に対してプロットした。

【図8】化学誘導二量体形成物質（１０ｎＭ ＣＩＤ）暴露後のｉＣＡＳＰ９／ＡＰ１９０３自殺系カセットの安全スイッチを表す。（ａ）２９３Ｔ細胞、（ｂ）ＩＬ－ＩＲＡＰ ＣＡＲ ２９３Ｔ細胞。

【図9】非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）と比較した、２４時間又は４８時間ＣＩＤ暴露後のＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞の除去を表す（^＊＊＊ ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。

【図10A】フローサイトメトリーＣＦＳＥ色素希釈分析のゲーティング戦略を表す代表的な実験例である。

【図10B】分裂しているＣＦＳＥポジティブ細胞の合計の割合を表す。３つの独立した試験の平均±ＳＤである。＊＊＊ ｐ＜０．００１ （学生試験）。

【図11A】細胞内ＩＦＮγサイトカイン検出のためのゲーティング戦略を表す代表的な実験例である。

【図11B】全細胞内ＩＦＮγ産生細胞の割合を表す。ＣＤ８＋細胞及びＣＤ８－（主にＣＤ４＋）細胞についての３つの独立した試験の平均±ＳＤである。＊＊＊ ｐ＜０．００１。＊＊ ｐ＜０．０１（学生試験）。

【図12A】細胞表面のＩＬ－１ＲＡＰ発現細胞を溶解するＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞の有効性研究のためのゲーティング戦略を表す。

【図12B】標的生細胞全体の割合を表す。３つの独立した試験の平均±ＳＤである。

【図13A】組織マイクロアレイを表す。１器官あたり３名の個々のドナーから得た９０個の組織コア（３０器官）（ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ、米国メリーランド州ロックビル）を含む、米国食品医薬品局標準の凍結組織アレイの代表的な＃Ａ３Ｃ３染色を表す。ＵｌｔｒａＶｉｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ、米国）を用いて免疫染色を検出した。ＮＤＰ．ｖｉｅｗ ２．０ソフトウェアで画像を取得し、分析した。分析した３名のうち少なくとも１名において＃Ａ３Ｃ３ｍＡｂによりある程度の染色を示した組織を表示する（スケールバー：１００μｍ）。ＩＬ－１ＲＡＰ高発現（ＫＵ８１２）又はネガティブ発現（Ｒａｊｉ）細胞株をそれぞれポジティブ又はネガティブコントロールとして用いた。

【図13B】ＨＭＥＣ－１皮膚内皮細胞株のＩＬ－１ＲＡＰ Ｒ＆Ｄ（赤）又は＃Ａ３Ｃ３（青）染色を表す。アイソタイプＩｇＧ１（灰色）を重ねて示す。ＲＦＩを両方の染色について示す。

【図14A】図１４は、健常造血細胞に対するＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞の効果及び自殺遺伝子ｉＣＡＳＰ９安全カセットの効率を表す。図１４Ａは、健常ドナー（ｎ＝５）の末梢血細胞（左）又は骨髄細胞（右）に対するＩＬ－１ＲＡＰ細胞表面発現を表す。ＳＳＣ－Ａ／ＣＤ４５＋により、リンパ球（低ＳＳＣ－Ａ）、単球（ＣＤ３３＋）、顆粒球（高ＳＳＣ－Ａ）、又は、ＨＳＣ（ＣＤ３３－／ＣＤ３４＋）として亜集団を識別できた。ＲＦＩはアイソタイプ染色から算出し、各ウインドウに示した。

【図14B-1】全ヒト臍帯血細胞の代表的な（３つのうち１つ）ＩＬ－１ＲＡＰ染色を表す。全ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－、及び、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋ＨＳＣ臍帯血亜集団についてＩＬ－１ＲＡＰ染色を示す。

【図14B-2】全ヒト臍帯血細胞の代表的な（３つのうち１つ）ＩＬ－１ＲＡＰ染色を表す。全ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８－、及び、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋ＨＳＣ臍帯血亜集団についてＩＬ－１ＲＡＰ染色を示す。

【図14C】健常ドナー（ｎ＝５）の臍帯血（ＣＢ、ｎ＝５）又は骨髄（ＢＭ）におけるＣＤ３４＋細胞中のＩＬ－１ＲＡＰポジティブ細胞を、ＣＭＬ患者のＢＭ（ｎ＝１０）又は末梢血（ＰＢ、ｎ＝１０）から得たＣＤ３４＋細胞と比較して表す。

【図14D】左：各種のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比の自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）非形質導入Ｔ細胞又はＭｏｃｋ若しくはＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞の存在下で培養したＳＳＣ－Ａ／ＣＤ４５＋顆粒球（Ｇ）、単球（Ｍ）、及び、リンパ球（Ｌ）亜集団のドットプロットを表す。右：自家Ｍｏｃｋ Ｔ細胞（破線）又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞（実線）とともに２４時間共培養した非形質導入自家Ｔ細胞（Ｃ０）で標準化した、リンパ球（四角）、単球（円）、及び顆粒球（三角）中の生存細胞の相対パーセンテージを表す。

【図14E】各種のＥ：Ｔ比のＭｏｃｋ（黒、破線）又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞（白、実線）の存在下、単球（四角）、ＫＵ８１２（円）、又は、Ｋ５６２（三角）亜集団中の生存細胞の相対パーセンテージを表す。パーセンテージは、５０００蛍光ビーズサイトメトリー取得に基づきＴｒｕｃｏｕｎｔチューブを用いて測定した絶対細胞数により算出した。

【図14F】左：ＣＩＤ ＡＰ１９０３誘導細胞死の絶対数に対するゲーティング戦略及び分析を表す。非形質導入（Ｃ０）又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞を培地のみ又は培地＋ＣＩＤ（２０ｎＭ、２４時間）に暴露した。５０００個の蛍光ビーズを取得してから定量を行った。致死効率をコントロール細胞（未処理細胞）で標準化した。細胞致死を以下の通り算出した。死細胞％＝［１－（ＡＰ１９０３処理細胞中の生細胞の絶対数／未処理細胞中の生細胞の絶対数）］×１００。（Ｄ）死亡率の絶対パーセンテージ。Ｃ０又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ（ＣＤ３＋／ＣＤ１９＋でゲーティング）Ｔ細胞のＣＩＤ暴露２４時間又は４８時間。右：結果は３つの独立した試験の平均である。^＊＊ｐ＜０．００１。

【図14G】腹腔内ＡＰ１９０３（白棒）治療の２４時間後の腫瘍（ＣＭＬ ＫＵ８１２、静注）異種移植ＮＳＧモデルに注射したＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞の絶対定量を表す（ｎ＝３のマウス／群）。コントロールＴ細胞（Ｃ０）を注入したマウスをコントロールとして使用した（ｎ＝２のマウス／群）。^＊＊ｐ＜０．０１。細胞数は末梢血１ｍｌあたりで示す。

【図15】ヒト－ＣＤ３４＋臍帯血細胞生着／ＮＯＧマウスモデル（ｈｕ－ＮＯＧ）において自家ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞のＨＳＣ及び／又は免疫細胞に対する特異的な毒性を検討するための、免疫安全実験ヒトＣＤ３４＋生着ＮＯＧマウスモデルを表す。簡潔に言うと、１０×１０Ｅ６個の自家ＣＡＲＴ細胞又はコントロールＴ細胞（Ｃ０）（マウスＰＢＭＣ、脾臓、又は骨髄から細胞選別したヒトＣＤ４５＋から得た）を注入した。注入後の各時点（５日目、８日目、及び、１５日目）において、サイトメトリーにより成熟免疫細胞（ｈＣＤ３＋、ｈＣＤ１９＋、ｈＣＤ５６＋、ｈＣＤ１４＋、ｈＣＤ１１ｂ＋）のモニタリングを評価した。ＣＡＲＴ細胞注入前の－７日目に取得した基準免疫表現型から倍率変化を算出し、末梢血採取時（－９日目）と比較した。非形質導入（Ｃ０、白棒）又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞（黒棒）の３日目、８日目、及び、１５日目の各種免疫担当細胞亜集団の倍率変化を、末梢血採取時（－９日目）と比較した。後眼窩試料から採取した末梢血で細胞数をカウントし、－７日目を基準として倍率変化を算出した。ｎ．ｓ：非有意。

【図16】３つの異なる臍帯血から採取し、単独培養（白棒）、又は、それぞれの自家非形質導入（Ｃ０、灰棒）若しくはＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞（黒棒）とともに共培養した、ＣＤ３４＋ＨＳＣのコロニー形成単位（ＣＦＵ－ＧＭ）試験を表す。

【図17】上図：形質導入２９３Ｔ細胞に対するＣＩＤ効果の光学顕微鏡による評価を表す。下図：ＣＩＤ ＡＰ１９３０暴露後のＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞のフローサイトメトリー分析を表す。ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲを発現する又はしないＧＭＴＣ混合物及び非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）に対するＣＩＤ暴露（２０ｎＭ、２４時間、濃灰色）後又は非暴露（薄灰色）でのフローサイトメトリー分析である。ＣＤ３＋／ＣＤ１９＋染色により、ＣＡＲを発現するＧＭＴＣを識別できた。

【図18】欧州白血病ネット（ＥＬＮ）の予後分類に従ったＡＭＬ患者の初代試料におけるＩＬ－１ＲＡＰ ｍＲＮＡの発現及び細胞表面のＩＬ－１ＲＡＰ抗原の絶対部位を表す。

【図19A】図１９は、ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞のＡＭＬ芽球の細胞傷害性を表す。ゲーティング戦略を表す。ＣＤ３４抗体を用いて標的となるＡＭＬ芽球を同定した（図１９Ａ）。ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性を示すＡＭＬ芽球のイベント数も示している（図１９Ａ）。

【図19B】３つの独立した試験の結果を図１９Ｂに示す。図１９Ａ及び図１９Ｂの凡例：ＦＳＣ：前方散乱（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）、細胞の大きさを示す。７－ＡＡＤ：７－アミノアクチニマイシンＤ、細胞生存率のマーカー。Ｅ－Ｆｌｕｏｒ：細胞膜を染色する色素。＃１と＃２の試験は、健常ドナーから作られた同種のＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞を用いて行われた。＃３の試験は、ＡＭＬ患者のＴ細胞から作られた同種のＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞を用いて行われた。生存細胞とは、生存ＡＭＬ芽球を意味する。

【図20A】図２０は、ヒトＡＭＬマウス異種移植モデルにおけるＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を表す。免疫不全ＮＳＧ－Ｓマウスに放射線（２．５Ｇｙ）を照射し、後日（３日目）ＨＬ－６０又はＭｏｌｍ－１３又はＭｏｎｏ－Ｍａｃ－６のルシフェラーゼ発現ＡＭＬ細胞のいずれかを１×１０^６個注射した。図２０Ａ：ＡＭＬ細胞注入後の０日目に、マウスを無処置、又は、コントロールＴ細胞、すなわちＭｏｃｋＴ又はＵＮＴ細胞（３００μＬのＰＢＳ中、細胞１０ｘ１０^６個）若しくはＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞（３００μＬのＰＢＳ中、細胞１０ｘ１０^６個）で処理し、白血病発症について生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて記載した日数でモニターした。マウスの生物発光イメージング分析は、０日目から２１日目まで異なるグループについて行われた。凡例：（×）： 死亡マウス。▲：ＵＮＴ又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ Ｔ細胞の注入。

【図20B】生物発光イメージング（ＢＬＩ）を用いて採取したインビボでの生物発光信号の輝度（輝度 ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に使用するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含む細胞であって、上記ＣＡＲは、抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域と、膜貫通領域と、少なくとも刺激領域を有する細胞内シグナル伝達領域とをもつ抗体又は抗体断片を有し、上記抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び配列番号１４のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ重鎖と
を有する、細胞に関する。

【0015】

以下の表に配列識別子をまとめる。

【0016】

【表1-1】

【0017】

【表1-2】

【0018】

【表1-3】

【0019】

「＃Ｅ３Ｃ３」と「＃Ａ３Ｃ３」の用語は、同一のものとして理解される。「＃Ｅ３Ｃ３」を「＃Ａ３Ｃ３」を言うものとして自由に用いることができ、逆もまた同一である。

【0020】

ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＣＤ８α、４－１ＢＢ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及びＩＣａｓｐ９遺伝子のヒンジ領域の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋで入手できる。

【0021】

本発明の実施においては、そうでないということが特に明示されない限り、当該技術分野の範囲内にある化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来の方法が採用され、これらの多くを説明のため以下に記載する。これらの方法は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；及びＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の学術誌の論文を参照されたい。

【0022】

特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験においては、本明細書で記載したのと類似又は同等の方法及び材料を使用できるが、本明細書には組成、方法、及び材料の好ましい実施形態を記載している。

【0023】

当業者に理解されるように、また本明細書のどこかで記載する通り、完全抗体は２つの重鎖と２つの軽鎖とを有する。各重鎖は可変領域と第１、第２、及び第３定常領域とで構成され、各軽鎖は可変領域と定常領域とで構成される。哺乳類の重鎖はα、δ、ε、γ、及びμに分類され、哺乳類の軽鎖はλ又はκに分類される。α、δ、ε、γ、及びμ重鎖を有する免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分類される。完全抗体は「Ｙ字」型を形成する。Ｙ字の幹部は、互いに結合した２つの重鎖の第２及び第３定常領域（ＩｇＥ及びＩｇＭの場合、更に第４定常領域）で構成され、ヒンジ部で（鎖間）ジスルフィド結合が形成される。γ、α、及びδ重鎖は、３つのタンデム型（直列型）Ｉｇ領域で構成された定常領域と、柔軟性を付与するヒンジ領域とをもつ。μ及びε重鎖は、４つの免疫グロブリン領域で構成された定常領域をもつ。第２及び第３定常領域は、それぞれ「ＣＨ２領域」及び「ＣＨ３領域」ともいう。Ｙ字の各腕部は、可変領域と、可変領域に結合した単一重鎖の第１定常領域と、単一軽鎖の定常領域とをもつ。軽鎖及び重鎖の可変領域は抗原結合を担う。

【0024】

軽鎖及び重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」ともいわれる３つの超可変領域で分断された「フレームワーク」領域をもつ。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ（Ｗｕ，ＴＴ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１－５０，（１９７０）；Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０－２４４３（１９８７）；（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１参照）の配列、又はＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ（Ｃｈｏｉｔｈｉａ，Ｃ． ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（４）：９０１－９１７（１９８７），Ｃｈｏｉｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８８３（１９８９））の構造等といった従来の方法によって定義又は同定できる。

【0025】

異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒト等の種内では比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成する軽鎖及び重鎖の組み合わさったフレームワーク領域であり、３次元空間にＣＤＲを配置及び配列させるよう機能する。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のＣＤＲは、典型的には、Ｎ末端から順に番号が付けられてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３といわれ、また典型的には、個々のＣＤＲが位置する鎖によって特定される。従って、抗体の重鎖の可変領域に位置するＣＤＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３といわれ、抗体の軽鎖の可変領域に位置するＣＤＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３といわれる。特異性の異なる（すなわち、異なる抗原に対して異なる結合部位を有する）抗体は、異なるＣＤＲを有する。

【0026】

「ＶＨ」又は「Ｖ_Ｈ」とは、免疫グロブリン重鎖の可変領域を意味しており、本明細書で開示される抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は他の抗体断片のものを含む。

【0027】

「ＶＬ」又は「Ｖ_Ｌ」とは、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を意味しており、本明細書で開示される抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、又は他の抗体断片のものを含む。

【0028】

「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、又は単一抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法、例えば、骨髄腫細胞を免疫脾臓細胞と融合させてハイブリッド抗体形成細胞を作製することで得られる。モノクローナル抗体はキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体を含む。

【0029】

本明細書中、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という冠詞は、当該冠詞の文法的対象が１つであること又は１つより多いこと（すなわち、少なくとも１つであること）を意味する。

【0030】

本明細書中、「約」又は「およそ」という語は、基準となる分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量、又は長さに対して３０％、２５％、２０％、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％分変動する分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量、又は長さを意味する。特定の実施形態において、「約」又は「およそ」という語は、数値の前に使用した場合、その値±１５％、１０％、５％、又は１％の範囲であることを示す。

【0031】

本明細書を通じて、文脈上別段の解釈が必要とされない限り、「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、及び、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載された工程若しくは要素、又は工程若しくは要素の群を包含することを意味しており、他の任意の工程若しくは要素、又は工程若しくは要素の群を除外することは意味していないと解釈される。

【0032】

本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「ある実施形態」、「追加実施形態」、「更なる実施形態」、又はそれらの組み合わせとは、当該実施形態に関して記載された特定の特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。

【0033】

本発明の目的のために、「同一性」又は「相同性」は、比較ウインドウ中の２つのアライメント配列を比較することで算出される。配列をアライメントすることで、比較ウインドウ中の２つの配列に共通する位置（ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を決定できる。次いで、共通する位置の数を比較ウインドウ中の全位置数で割り、１００を掛けることで、相同性のパーセンテージが得られる。配列同一性のパーセンテージの決定は、手動で、又はよく知られたコンピュータープログラムを用いて実施できる。

【0034】

本発明は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に使用するための、細胞傷害性を腫瘍細胞へリダイレクトする遺伝子操作された受容体を発現するよう設計されたベクターで遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を提供する。本明細書中、該遺伝子操作された受容体をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）という。

【0035】

ＣＡＲは、標的抗原（腫瘍抗原等）に対する抗体に基づいた特異性をＴ細胞受容体活性化細胞内領域と組み合わせることで、特異的な抗腫瘍細胞性免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書中、「キメラ」という語は、由来の異なる種々のタンパク質又はＤＮＡの一部分で構成されていることを表す。

【0036】

ＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞特異性をリダイレクトすることで、増殖、サイトカイン産生、貪食、又は主要組織適合性（ＭＨＣ）とは独立して標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を引き起こし、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、又は細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能を活用することができることである。

【0037】

本明細書中、「結合領域」、「細胞外結合領域」、「抗原特異的結合領域」、及び「細胞外抗原特異的結合領域」という語は互換的に使用され、対象である標的抗原と特異的に結合できる能力をＣＡＲに付与する。結合領域は、生物学的分子（細胞表面受容体、腫瘍タンパク質、脂質、多糖等の細胞表面標的分子、又はそれらの成分等）を特異的に認識して結合できる能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、又はペプチドを有していてもよい。結合領域には、対象である生物学的分子に対する任意の天然、合成、半合成、又は組換え生成された結合パートナーが含まれる。本明細書中、「特異的結合親和性」、「特異的に結合する」、「特異的に結合した」、「特異的な結合」、又は「特異的に標的とする」という語は、バックグラウンド結合よりも結合親和性が高い分子間の結合を表す。結合領域（又は結合領域を有するＣＡＲ又は結合領域を含む融合タンパク質）は、親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍ単位の特定の結合相互作用の平衡会合定数）が例えば約１０^５Ｍ^－１以上で標的分子と結合又は会合する場合、標的分子と「特異的に結合する」。本開示に係る結合領域ポリペプチド及びＣＡＲタンパク質の親和性は、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）のような従来の方法で容易に測定できる。

【0038】

上記抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、キメラ抗体、又は、ヒト化抗体である。

【0039】

ある好ましい実施形態において、上記抗体は、腫瘍細胞上の表面タンパク質と特異的に結合するキメラ抗体（キメラモノクローナル抗体等）である。「キメラ」抗体は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えば、マウス、ラット、又は合成）免疫グロブリン由来の１種以上のＣＤＲとを有する免疫グロブリンである。従って、恐らくはＣＤＲを除くキメラ免疫グロブリンの全ての部分が、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。キメラ又は他のモノクローナル抗体は、抗原結合又は他の免疫グロブリン機能に対して実質的に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換を追加で有することができる。キメラ抗体は、遺伝子操作によって構築できる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照）。

【0040】

抗体にはその抗原結合断片が含まれ、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、及び抗原結合を担う全長抗体の一部が挙げられる。また、上記用語は、ヒト化抗体、ヘテロ結合抗体（バイスペシフィック抗体等）、及びそれらの抗原結合断片等の遺伝子操作形態も含む。

【0041】

「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を有し、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中にいずれかの配向（ＶＬ－ＶＨ又はＶＨ－ＶＬ等）で存在している。

【0042】

一本鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングしたものであってもよい。このようなハイブリドーマの作製はルーチン化されている。可変領域重鎖（ＶＨ）及び可変領域軽鎖（ＶＬ）をクローニングするのに採用される方法は、例えばＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３－３８３７に記載されている。

【0043】

一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬ領域間にポリペプチドリンカーを更に有し、これによりｓｃＦｖは抗原結合に対して所望の構造を形成できる。

【0044】

本明細書で検討されるＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のリンカーを有していてもよい。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１～約２５アミノ酸、約５～約２０アミノ酸、約１０～約２０アミノ酸、又は任意の介在アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又はそれ以上のアミノ酸長である。

【0045】

リンカーの具体例としては、グリシン重合体（Ｇ）ｎ、グリシン－セリン重合体（Ｇｉ＿ｓＳｉ＿５）ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、又は５以上の整数）、グリシン－アラニン重合体、アラニン－セリン重合体、及び当該分野で知られている他の可動性リンカーが挙げられる。グリシン及びグリシン－セリン重合体は相対的に不定形であるため、本明細書に記載したＣＡＲ等の融合タンパク質の領域間で中立テザーとして機能できる。グリシンはアラニンと比べても非常に多くのｐｈｉ－ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりも制限がはるかに少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１ １１７３－１４２（１９９２）を参照）。当業者に認識される通り、特定の実施形態におけるＣＡＲの設計には、可動性リンカーや、所望のＣＡＲ構造が得られるようにそれより可動性の低い構造を与える１つ以上の部分が含まれるように、全体又は一部が可動性であるリンカーが含まれていてもよい。

【0046】

特定の実施形態において、上記リンカーはＶＨ領域とＶＬ領域との間にある。

【0047】

特定の実施形態において、上記リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列を有する又はそれで構成される。

【0048】

一実施形態において、上記ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、配列番号４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１、２、又は３個以上３０、２０、又は１０個以下の改変を有するアミノ酸配列をもつ軽鎖可変領域と、配列番号２の重鎖可変領域のアミノ酸配列において１、２、又は３個以上３０、２０、又は１０個以下の改変を有するアミノ酸配列をもつ重鎖可変領域とを有するｓｃＦｖである。

【0049】

上記ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び配列番号８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ軽鎖可変領域と、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び配列番号１４のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ重鎖可変領域とを有するｓｃＦｖであることが好ましい。

【0050】

一般に、ＣＡＲの結合領域には１つ以上の「ヒンジ領域」が続いており、これが抗原結合領域をエフェクター細胞表面から離して配置することで、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、及び活性化を可能とするという役割を果たす。ＣＡＲは、一般に、結合領域と膜貫通領域との間に１つ以上のヒンジ領域を有する。ヒンジ領域は、天然、合成、半合成、又は組換え源のいずれかに由来するものであってもよい。

【0051】

上記抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、ヒンジ領域によって膜貫通領域と接続していることが好ましい。

【0052】

一実施形態において、上記ヒンジ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ配列又はその同一性が９５～９９％である配列を有する。ＩｇＧヒンジは、単一のエクソンによってコードされる。従って、本明細書で使用される「ＩｇＧ１のヒンジ配列」という用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味、すなわち、ヒンジのためのＩｇＧ１エクソンによってコードされる１５個のアミノ酸残基である（基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第５版、第３章、免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ）：構造及び機能（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）－免疫グロブリンのヒンジ（Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｈｉｎｇｅ））。

【0053】

更なる実施形態において、上記ヒンジ領域は、ＩｇＧ４のヒンジ配列又はその同一性が９５～９９％である配列を有する。更なる実施形態において、上記ヒンジ領域は、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４のＣＨ２－ＣＨ３領域又はその同一性が９５～９９％である配列を有していてもよい。

【0054】

更なる実施形態において、上記ヒンジ領域は、ＣＤ８α又はその同一性が９５～９９％である配列を有する。

【0055】

「膜貫通領域」は、細胞外結合部と細胞内シグナル伝達領域とを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の細胞膜にアンカリングするＣＡＲの一部である。上記膜貫通領域は、天然、合成、半合成、又は組換え源のいずれかに由来するものであってもよい。

【0056】

コード化ＣＡＲは、好ましくは、Ｔ細胞受容体のα、β、又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質、より好ましくはＣＤ２８の膜貫通領域を有する。

【0057】

特定の実施形態において、本明細書で検討されるＣＡＲは細胞内シグナル伝達領域を有する。「細胞内シグナル伝達領域」とは、標的抗原に結合している有効ＣＡＲのメッセージを免疫エフェクター細胞の内部へと伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、及び細胞傷害活性（ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出等、細胞外ＣＡＲ領域との抗原結合とともに引き起こされる細胞応答を含む）を引き起こすのに関与するＣＡＲの一部を意味する。

【0058】

「エフェクター機能」という語は、細胞の特殊化した機能を意味する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、あるいはサイトカインの分泌を含む援助又は活性であってもよい。従って、「細胞内シグナル伝達領域」という語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、且つ細胞に特殊化した機能を実行するよう指示するタンパク質の一部を意味する。通常は細胞内シグナル伝達領域全体を使用できるが、多くの場合、領域全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達領域の切断部を使用する場合、エフェクター機能シグナルを伝達しさえすれば、そのような切断部を領域全体の代わりに使用してもよい。「細胞内シグナル伝達領域」という語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達領域の切断部を有することを意味する。

【0059】

ＴＣＲのみを介して生成されたシグナルは、Ｔ細胞を完全に活性化させるには不十分であり、二次又は共刺激シグナルも必要であることが知られている。従って、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達領域、すなわち、ＴＣＲ（ＴＣＲ／ＣＤ３複合体等）を介して抗原依存的な一次活性化を開始する一次シグナル伝達領域と、抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供する共刺激シグナル伝達領域とによって媒介されるといえる。好ましい実施形態において、本明細書で検討されるＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達領域」を有する細胞内シグナル伝達領域を有する。

【0060】

実施形態において、上記単離核酸分子は、少なくとも１つの共刺激領域を有する細胞内シグナル伝達領域をコードしていてもよい。従って、この実施形態において、上記細胞内シグナル伝達領域は少なくとも１つの共刺激領域を有する。

【0061】

本明細書中、「共刺激シグナル伝達領域」又は「共刺激領域」という語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達領域を意味する。共刺激分子は、抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子であり、抗原との結合時にＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要な二次シグナルを提供する。

【0062】

上記機能的細胞内シグナル伝達領域の少なくとも１つの共刺激領域は、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＣＤ３ζ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択される１種以上のタンパク質から得られることが好ましい。

【0063】

４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）から得られた共刺激領域は、４－１ＢＢの共刺激領域のアミノ酸配列との同一性が９５～９９％である配列を有することがより好ましい。

【0064】

ＣＤ３ζから得られた共刺激領域は、ＣＤ３ζの共刺激領域のアミノ酸配列との同一性が９５～９９％である配列を有することがより好ましい。

【0065】

別の実施形態において、上記細胞内シグナル伝達領域は、４－１ＢＢから得られた共刺激領域及び／又はＣＤ３ζから得られた共刺激領域を有する。

【0066】

特定の好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達領域と１つ以上の共刺激シグナル伝達領域とを有する。上記細胞内一次シグナル伝達領域及び共刺激シグナル伝達領域は、膜貫通領域のカルボキシル末端に任意の順序で直列に連結していてもよい。

【0067】

本発明に従って使用できる細胞は、単離されていてもよい。「単離した細胞」とは、生体内の（ｉｎ ｖｉｖｏ）組織又は器官から得られた、細胞外マトリックスを実質的に含まない細胞をいう。

【0068】

本発明に係るＡＭＬを治療するために用いられる細胞は、ベクターを用いて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を宿主細胞のゲノム内に挿入することによって作製されてもよい。

【0069】

本明細書中、「ベクター」という語は、別の核酸分子を導入又は輸送できる核酸分子を意味する。導入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子と連結（例えば、該分子に挿入）されている。ベクターは、細胞における自律増殖を指示する配列を含んでいてもよく、宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能とするのに十分な配列を含んでいてもよい。

【0070】

本発明に係るＡＭＬを治療するために用いられる細胞は、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子を有するベクターであって、該ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターから選択され、好ましくはレンチウイルスベクターである、ベクターを用いて作製することができる。

【0071】

いくつかの実施形態において、上記ベクターは、プロモーター、好ましくはＥＦ－１αプロモーターを有する。

【0072】

レトロウイルスは遺伝子導入用の一般的なツールである。特定の実施形態において、レトロウイルスは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するのに使用される。本明細書中、「レトロウイルス」という語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖二本鎖ＤＮＡコピーへ逆転写した後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムへ共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを意味する。ウイルスは、宿主ゲノムへ組み込まれてしまえば、「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスはＲＮＡポリメラーゼＩＩのテンプレートとして作用し、新しいウイルス分子を産生するのに必要な構造タンパク質及び酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指示する。

【0073】

従って、上記ベクターで形質導入したＴ細胞は、安定的な長期間持続するＣＡＲ介在性Ｔ細胞応答を引き起こすことができる。

【0074】

特定の実施形態において、上記Ｔ細胞は、上記ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター等）で形質導入される。

【0075】

本明細書中、「レンチウイルス」という語は、複雑レトロウイルスの群（又は属）を意味する。レンチウイルスの例としては、特に限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶタイプ１及びＨＩＶタイプ２等）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎・脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。

【0076】

「レンチウイルスベクター」という語は、構造的及び機能的遺伝要素又はその一部（主にレンチウイルスに由来するＬＴＲ等）を含むウイルスベクター若しくはプラスミドを意味する。

【0077】

「自己不活型（ＳＩＮ）」ベクターとは、Ｕ３領域として知られている右側（３’）ＬＴＲエンハンサー／プロモーター領域が、１回目のウイルス複製以降のウイルス転写を妨げるように（欠失又は置換等により）改変されている複製欠損ベクター（レトロウイルス又はレンチウイルスベクター等）を意味する。

【0078】

一実施形態において、ＳＩＮベクターバックボーンが好ましい。

【0079】

使用するベクターは、ＥＦ－１αプロモーター等のプロモーターを更に有することが好ましい。

【0080】

本明細書中、「プロモーター」という語は、Ｒ Ａポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の認識部位を意味する。Ｒ Ａポリメラーゼは、該プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態において、標的抗原を発現する細胞へＴ細胞をリダイレクトするのに十分なレベルで、Ｔ細胞において安定的な長期間のＣＡＲ発現を可能とするプロモーターからＣＡＲを有するポリヌクレオチドを発現することが望ましい場合がある。

【0081】

本発明に係る使用のための細胞は、ヒトＴ細胞等のＴ細胞であり、より好ましくはヒトＣＤ８＋Ｔ細胞等のＣＤ８＋Ｔ細胞である。好ましい実施形態において、本発明に係る使用のための細胞（Ｔ細胞等）は、その膜で上記ＣＡＲを発現する。本明細書で使用される「その膜で」という用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者によって一般的に理解されるのと同じ意味、すなわち「細胞表面の膜で」という意味を有する。

【0082】

特定の実施形態において、本明細書に記載された免疫エフェクター細胞のインビトロ操作又は遺伝子改変に先立って、対象から細胞源を取得する。特定の実施形態において、本発明に係る使用のための細胞はＴ細胞を含む。Ｔ細胞は、特に限定されないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍等、様々な細胞源から得ることができる。ある実施形態において、Ｔ細胞は、沈降（例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）分離）等の当業者に知られている各種方法を用いて対象から採取した血液単位から得ることができる。個体の循環血の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞等のリンパ球、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む。一実施形態において、アフェレーシスによって採取した細胞は、洗浄により血漿画分を除去し、細胞を適当な緩衝液又は培地に配置して、その後の処理を実施してもよい。

【0083】

Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離等によって単球を枯渇させることで、末梢血単核細胞から単離される。ポジティブ又はネガティブ選択法によって、ＣＤ４又はＣＤ８のようなマーカーを１つ又は複数発現するＴ細胞の特定の亜集団を更に単離できる。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブに選択された細胞に特徴的な表面マーカーに対する抗体を組み合わせることで達成できる。

【0084】

本発明のいくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を内部に有する細胞は、誘導性自殺遺伝子等の自殺遺伝子を利用して、直接毒性（すなわち、同種投与状況における移植片対宿主病）及び／又は遺伝子改変細胞の制御されない増殖のリスクを低減する。特定の態様において、上記自殺遺伝子は、上記ポリヌクレオチド又は細胞を内部に有する宿主に対して免疫原性ではない。使用できる自殺遺伝子の一例としては、誘導性カスパーゼ－９（ｉＣＡＳＰ９）、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）、ＣＤ２０、切断型ＥＧＦＲ、カスパーゼ－８、又はシトシンデアミナーゼが挙げられる。カスパーゼ－９は、特定の化学誘導二量体形成物質（ＣＩＤ）を用いて活性化できる。他の系は、代謝プロドラッグ（ガンシクロビル）によって又は結合抗体（リツキシマブ、シツキシマブ）によって活性化できる。

【0085】

本明細書には、Ｔ細胞がＣＡＲを発現するようにエクスビボで遺伝子改変され、ＣＡＲ Ｔ細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される細胞治療の１種が開示されている。注入された細胞は、レシピエント、好ましくはヒトにおいて腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ Ｔ細胞はインビボで複製できるので、長期間持続し、腫瘍を持続的に制御できる。

【0086】

また、ＣＡＲは、抗体由来受容体が結合する際にエフェクターＴ細胞を任意の細胞表面分子に対してリダイレクト及び活性化させることができ、ＭＨＣの制限からは独立している。

【0087】

本発明に係る使用のための遺伝子改変細胞（Ｔ細胞等）は、患者自身の細胞（自家）から構築されるが、骨髄又は末梢造血幹細胞同種移植の関係（ドナーリンパ球輸注）で同種遺伝子改変Ｔ細胞を得るために他の同種ドナーに由来するものであってもよい。ＣＡＲ分子を発現する上記細胞は、哺乳類、好ましくはヒトのＡＭＬを治療するのに有用であり、該疾患は細胞表面ＩＬ－１ＲＡＰ発現と関連している。

【0088】

好ましくは、上記細胞（Ｔ細胞等）は、抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域を有する抗ＩＬ－１ＲＡＰ ｓｃＦｖである抗原結合領域、ＣＤ２８タンパク質の膜貫通領域、共刺激４－１ＢＢシグナル伝達領域、及びＣＤ３ζシグナル伝達領域を有するＣＡＲ分子を発現し、上記抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号１４のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ重鎖とを有する。

【0089】

ＡＭＬは、欧州白血病ネット（ＥＬＮ）予後分類に従った任意のＡＭＬ、及び／又は、Ｆｒｅｎｃｈ－Ａｍｅｒｉｃａｎ－Ｂｒｉｔｉｓｈ（ＦＡＢ）分類に従った任意のサブタイプのＡＭＬであってもよい。

【0090】

一実施形態では、ＡＭＬは再発性／難治性ＡＭＬである。

【0091】

別の実施形態では、ＡＭＬは、複雑な細胞遺伝学的異常、すなわちＷＨＯ分類に従った細胞遺伝学的異常を有する再発性／難治性ＡＭＬ、及び／又は、ＴＰ５３変異を有するＡＭＬである。

【0092】

ＴＰ５３は、第１７染色体の短腕に位置するＴＰ５３遺伝子によってコードされる腫瘍抑制タンパク質である。ＴＰ５３は、ＤＮＡ損傷に対するゲノムの安定性を維持する上で極めて重要な役割を果たしており、ＤＮＡ修復プログラムを活性化し、細胞周期の停止を引き起こす。ＴＰ５３は、ヒトの癌の半数以上で変異する。ＡＭＬでは、変異したＴＰ５３は、治療関連ＡＭＬや複雑な核型を持つ患者で主に認められる。ＡＭＬのマウスモデルを用いた研究では、ホットスポット領域での機能獲得変異が、より侵攻性の高いＡＭＬを促進することが示されている。これまでの研究では、複雑な核型の有無にかかわらず、ＴＰ５３変異の存在が患者における化学療法への反応性の低下や生存率の低下と相関することが示されている。多変量解析では、異常な細胞遺伝学的異常を伴わないＴＰ５３変異の存在は、全生存率の低下及び治療への反応性の低下を予測した。いくつかの実施形態では、ＡＭＬは、ＩＬ－１ＲＡＰ発現に関連するＡＭＬ（「ＩＬ１－ＲＡＰ発現ＡＭＬ」又は「ＩＬ１－ＲＡＰ＋ＡＭＬ」としても公知である）である。

【0093】

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１ＲＡＰ発現に関連するＡＭＬは、（ｉ）ＩＬ１－ＲＡＰ＋ＡＭＬの再発性／難治性形態、又は、（ｉｉ）複雑な細胞遺伝学的異常を有するＩＬ１－ＲＡＰ＋ＡＭＬ、及び／又は、ＴＰ５３変異を有するＩＬ１－ＲＡＰ＋ＡＭＬである。

【0094】

本発明による使用のための細胞は、あらゆる年齢の患者、特に６０歳未満、例えば２０歳未満の患者（すなわち、小児ＡＭＬ）、及び／又は、６０歳以上の患者の治療に使用することができる。

【0095】

ＩＬ－１ＲＡＰに特異的なＣＡＲ分子を発現する細胞（Ｔ細胞等）は、ヒトのＡＭＬを治療する方法に使用されてもよく、この場合、ヒトは、化学療法、免疫療法、又は標的療法などの少なくとも１つの治療ラインによって既に治療されている。化学療法剤は、ＣＰＸ－３５１であってもよく、免疫療法は、モノクローナル抗体であってもよく、例えば、抗体－薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）（ＡＤＣ）（例えば、毒素に連結された抗ＣＤ３３（ゲムツズマブ オゾガマイシン〔Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ〕））、二重特異性抗体（Ｂｉｔｅｓ、例えば、抗ＣＤ３３／ＣＤ３、抗ＣＤ１２３／ＣＤ３又は他のＡＭＬ抗細胞表面マーカー／ＣＤ３）であってもよい。標的療法剤は、ミドスタウリンやクワザルチニブなどの抗変異ＦＬＴ３であってもよく、ＩＤＨ１阻害剤（イボシデニブ）やＩＤＨ２阻害剤（エナシデニブ）などの変異したＩＤＨ１／ＩＤＨ２を標的とする薬剤であってもよい。

【0096】

従って、好ましくは、ＩＬ－１ＲＡＰに特異的なＣＡＲ分子を発現する細胞（Ｔ細胞等）は、抗チェックポイント阻害剤（すなわち、抗ＰＤ－１、抗ＰＤＬ－１又は抗ＣＴＬ４）などの少なくとも１つのモノクローナル抗体と結合して、哺乳動物においてＡＭＬを治療する方法において有用である。抗ＰＤ－１、抗ＰＤＬ－１又は抗ＣＴＬＡ４は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、イピリムマブ又はトレメリムマブであってもよい。

【0097】

従って、ＩＬ－１ＲＡＰに特異的なＣＡＲ分子を発現する細胞（Ｔ細胞等）は、移植片対白血病、同種幹細胞移植、ドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）、ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞ではない以前のＣＡＲＴ細胞療法、又は、同種もしくは自家の造血移植を既に受けたヒトにおいてＡＭＬを治療する方法において有用である。

【0098】

本明細書中、「治療」とは、疾患の症状若しくは病理、又は病態に対して有益な又は望ましい効果を含むものであり、治療される疾患又は異常、例えばがんの１種以上の測定可能なマーカーのごくわずかな低下であってもよい。治療は、場合によっては疾患又は異常の症状の低減又は寛解のいずれかを含んでいてもよく、疾患又は異常の進行の遅延を含んでいてもよい。「治療」は、必ずしも疾患若しくは異常又はその関連症状が完全に根絶又は治癒することを指していない。

【0099】

従って、本開示は、投与を必要とする対象にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含む細胞を治療有効量投与することを含むＡＭＬの治療のための方法であって、上記ＣＡＲは、抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域と、膜貫通領域と、少なくとも刺激領域を有する細胞内シグナル伝達領域とをもつ抗体又は抗体断片を有し、上記抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号１４のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ重鎖とを有する、方法を提供する。

【0100】

上記細胞（Ｔ細胞等）は、単独で投与してもよく、希釈剤及び／又は他の成分（ＩＬ－２等のサイトカインや細胞集団等）と組み合わせて医薬品組成物として投与してもよい。簡潔に言うと、医薬品組成物は、医薬的又は生理学的に許容される１種以上の担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される標的細胞集団を含んでいてもよい。該組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；ポリペプチド又はグリシン等のアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（水酸化アルミニウム等）；及び保存料を含んでいてもよい。本明細書中、「医薬的に許容される」という表現は、適切な医学的判断の範囲内において、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応等の問題又は合併症を起こすことなく、合理的なリスク・ベネフィット比に見合った形で、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適している化合物、材料、組成物、及び／又は、剤形を意味するのに用いられる。

【0101】

本発明に係る使用のための細胞は、組成物に配合されてもよい。

【0102】

従って、本発明はまた、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に用いるためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を含む細胞を含む医薬品組成物等の組成物であって、上記ＣＡＲは、抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域と、膜貫通領域と、少なくとも刺激領域を有する細胞内シグナル伝達領域とを有する抗体又は抗体断片を有し、上記抗ＩＬ－１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号７のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号８のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、配列番号１３のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及び、配列番号１４のアミノ酸配列との同一性が少なくとも８０％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）をもつ重鎖とを有する、組成物に関する。

【0103】

本発明に係る使用のための組成物は、血管内（静脈内又は動脈内）、腹腔内、又は筋肉内投与等の非経口投与用に処方されることが好ましい。

【0104】

本明細書中、「非経口投与された」とは、経腸及び局所投与以外の（通常は注射による）投与方法を意味しており、特に限定されないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入を含む。

【0105】

一実施形態において、ＣＡＲ改変細胞又は組成物は、腫瘍、リンパ節、体循環、又は感染部位へ直接注射することで対象に投与される。

【0106】

一実施形態において、ＣＡＲ改変細胞（例えば、ＣＡＲ改変Ｔ細胞）は、ＡＭＬを有すると診断された対象から免疫エフェクター細胞を除去し、本明細書で記載されるＣＡＲをコードする核酸を有するベクターで該免疫エフェクター細胞を遺伝子改変することで改変免疫エフェクター細胞の集団を得、該改変免疫エフェクター細胞の集団を同対象に投与することによって、同対象を治療するのに有用である。好ましい実施形態において、上記免疫エフェクター細胞はＴ細胞を含む。

【0107】

投与の分量及び頻度、並びに従来のＡＭＬ治療との考えられる組合せの順序は、患者の状態、ＡＭＬの種類及び重症度等の要因により決定されるが、適当な用量は、動物モデル、最終的には臨床試験で決定してもよい。

【0108】

遺伝子改変した治療細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに幹細胞及び前駆細胞が個体において所望の応答を引き起こす能力等の要因に応じて変動してもよい。また、治療有効量は、ウイルス又は形質導入治療細胞の有毒又は有害作用よりも治療上有益な効果が上回るようなものである。一般的に、本明細書に記載したＴ細胞を含む医薬品組成物は、細胞１０^４～１０^９個／ｋｇ体重、好ましくは１０^５～１０^６個／ｋｇ体重（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の用量で投与してもよいといえる。

【0109】

以下の実施例を参照して、本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は単なる例示に過ぎず、特に明示されない限り、限定的なものではない。

【実施例】

【0110】

＜実施例１：モノクローナル抗体作製＞
標準的なハイブリドーマ法により、マウス抗ｈＩＬ－１ＲＡＰモノクローナル抗体を作製した。

【0111】

簡潔に言うと、ＩＬ－１ＲＡＰの細胞外部分（ＮＭ＿００２１８２．２、ＮＣＢＩ）及びヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、仏国リール）で構成された組換え融合タンパク質を用いて、足蹠（ｎ＝３）又は腹腔内（ｎ＝５）のいずれかでＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を免疫化した。リンパ節又は脾臓細胞及び血液試料を採取し、細胞をマウス骨髄腫細胞株と融合した後、ＩＬ－１ＲＡＰポジティブ細胞株（ＫＵ８１２）及びネガティブ細胞株（Ｒａｊｉ、ＫＧ１）に対してＦＡＣＳ分析（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によりスクリーニングした。

【0112】

ハイブリドーマのスクリーニングにより、ＩＬ－１ＲＡＰポジティブ細胞株（ＫＵ８１２又はＫＧ－１、それぞれＡＭＬ又はＰｈｉ^＋ｐ^２１０ＣＭＬ）とネガティブ細胞株（Ｔｏｍ－１、ＮＡＬＭ－２０、Ｊｕｒｋａｔ、又はＲａｊｉ、それぞれＰｈｉ＋ ^ｐ１９０ Ｂ－ＡＬＬ、Ｐｈｉ^－Ｂ－ＡＬＬ、Ｔ－ＡＬＬ、又はバーキットリンパ腫）とを識別する５つのモノクローナル抗体サブクローンを選択することができた。

【0113】

・抗体の分子キャラクタリゼーション
Ｗａｎｇ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０００；２３３，ｐｐ１６７－７７）のプロトコルに従い、ＦＲ１並びに重鎖及び軽鎖の定常領域に特異的な縮重プライマーで得られたクローン化ＰＣＲ増幅産物のサンガーシークエンシングによって、分子キャラクタリゼーションを実施した。Ｂｒｏｃｈｅｔ Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００８，３６，ｐｐ５０３－８）に従い、Ｖ－ＱＵＥＳＴオンラインツールを用いて、ＩＭＧＴ（登録商標）データベースに対して共通ヌクレオチド配列をアライメントすることにより、Ｖ－Ｄ－Ｊ－Ｃ遺伝子再構成及びＣＤＲ３領域を同定できた。分子サンガーシークエンシングにより、５つのモノクローナル抗体は全て同一であり、同じＣＤＲ３ヌクレオチド配列を有することが分かった。サイトメトリーによる相対蛍光強度（ＲＦＩ）が最も高かったことから、モノクローナル抗体サブクローン（＃Ｅ３Ｃ３）を選択した。

【0114】

ウェスタンブロッティング法、組換えＩＬ－１ＲＡＰタンパク質に対するＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、共焦点顕微鏡観察、正常組織（ＦＤＡ正常ヒト器官組織アレイ、コア９９個／３３部位／７５症例）及びＣＭＬ患者の一次試料の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）により、選択した抗体（クローン＃Ｅ３Ｃ３）を特徴付けた。

【0115】

・細胞成分画分のウェスタンブロッティング（図１）
異なるＡＭＬ又はＣＭＬ（ポジティブコントロール）造血細胞株の全細胞ライセートをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリビニリデンジフルオライド膜に電気泳動した。膜は一次ＩＬ－１ＲＡＰ ＃Ａ３Ｃ３（１：２０で希釈）で一晩プローブした。２０マイクログラムのタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルで電気泳動し（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、超音波処理したタンパク質画分をプロテアーゼ阻害剤カクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ ＥＤＴＡ－ｆｒｅｅ； Ｒｏｃｈｅ， Ｂａｌｅ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を添加したＲＩＰＡ緩衝液に懸濁した。ウェスタンブロットレーンのタンパク質負荷は、β－アクチン ｍＡｂ染色（１：１０００， クローンＡＣ１５、＃Ａ５４４１， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で評価した。免疫検出染色は、二次ポリクローナル抗体ヒツジ抗マウスＩｇＧ（＃５１５－０３５－０６２、Ｊａｃｋｓｏｎ社）を用いて行った。強化された化学発光検出試薬により、カメラとＢｉｏ－１Ｄソフトウェア（Ｖｉｌｂｅｒ－Ｌｏｕｒｍａｔ、仏国コレジアン）を用いて検出した。

【0116】

－ＩＬ－１ＲＡＰ ｍＲＮＡの相対的な発現（図１８）
相対的なＩＬ－１ＲＡＰ ｍＲＮＡ発現は、細胞表面タンパク質のｍＲＮＡバリアントコドンを標的としたＨｓ＿００８９５０５０＿ｍ１ Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ遺伝子発現アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＲＴ－ｑＰＣＲにより測定した。解析は、診断時のＡＭＬ患者（ｎ＝２９）の全血又は骨髄試料を対象に、欧州白血病ネット（ＥＬＮ）の予後分類に従って行った。Ｋ５６２、ＭｏｎｏＭａｃ－６、ＨＥＬ－６０のｍＲＮＡをそれぞれ陰性、高陽性、低陽性のコントロールとして使用した。

【0117】

－ＩＬ－１ＲＡＰ抗原部位の絶対数（図３）
ＩＬ－１ＲＡＰ抗原部位の絶対数の決定は、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）法に基づいて行った。細胞１．１０^６個／ｍＬの異なる白血病株を、抗ＩＬ－１ＲＡＰ一次抗体（非標識＃Ａ３Ｃ３，Ｄｉａｃｌｏｎｅ（登録商標））で標識し、ＦＩＴＣ－ＩｇＧ１抗マウス二次抗体（カタログ番号：５５５２６、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標））で明らかにした。実験は、Ｃｅｌｌ Ｑｕａｎｔ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ番号７２０８）を用いて、推奨事項に従って行った。コントロールとして、非連結のＩｇＧ１アイソタイプを使用した（カタログ番号：８５７－０７３－０２０、ダイアクローン社）。解析は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（商標） ＩＩ、ＢＤ ＦＡＣＳ ＤＩＶＡ Ｖ ７．０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。ＫＵ８１２及びＫ５６２をそれぞれポジティブ及びネガティブコントロールとして使用した。

【0118】

・ＥＬＩＳＡによる組換えＩＬ－１ＲＡＰタンパク質のインビトロ検出（図２）
抗ヒトＦｃ抗体をプラスチック製ＥＬＩＳＡプレートの底に被覆した。ヒト抗体にロードしたＩＬ－１ＲＡＰタンパク質をマウス及びヒトＩＬ－１ＲＡＰ（＃Ｅ３Ｃ３）抗体でプローブした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で被覆した抗マウスＦＣ抗体により検出した。

【0119】

ＥＬＩＳＡにより、＃Ｅ３Ｃ３モノクローナル抗体がＩＬ－１ＲＡＰ組換えタンパク質を認識することが確認された。

【0120】

・ＡＭＬ患者の初代細胞に対するフローサイトメトリー分析
異なる造血性ＡＭＬ細胞株のＩＬ－１ＲＡＰ細胞表面の染色を、＃Ａ３Ｃ３ ｍＡｂとＩＬ－１ＲＡＰマウスｍＡｂを染色比較として実施した。

【0121】

ＩＬ－１ＲＡＰ染色とアイソタイプの間の相対蛍光強度（ＲＦＩ）を算出した。ＩＬ－１ＲＡＰ＋細胞株（ＫＵ８１２）又はＩＬ－１ＲＡＰ－細胞株（Ｒａｊｉ）をそれぞれポジティブコントロール又はネガティブコントロールとして使用した。

【0122】

ＡＭＬ患者の骨髄又は末梢血の一次サンプルに対しては、マウスＩＬ－１ＲＡＰ ｍＡｂ（＃ＥЗＣЗ）を、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ１４（単球用）を検出できるパネルに含めた。染色した細胞は、ＣＡＮＴＯ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、仏国ルポンドクレ）を用いて採取し、ＤＩＶＡ ６．１ソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、仏国ルポンドクレ）を用いて分析した。

【0123】

・インサイチュ検出
特異的又は非標的組織結合を検討するために、１器官あたり３名の個々のドナーから得た９０個の組織コア（３０器官）を含むＦＤＡ標準凍結組織アレイ（ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ、米国ロックビル）を上述した通りインキュベートした。ＵｌｔｒａＶｉｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＡＢ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ、米国）を用いて免疫染色を検出した。ＮＤＰ．ｖｉｅｗ２ソフトウェアで画像を取得し、分析した。ＩＬ－１ＲＡＰ高発現（ＫＵ８１２）又はネガティブ発現（Ｒａｊｉ）細胞株をそれぞれポジティブ又はネガティブコントロールとして使用した。染色強度は以下の通り等級を付けた：ネガティブ（０）、弱染色（１＋）、中染色（２＋）、又は強染色（３＋）。ＩＬ－１ＲＡＰ高発現（ＫＵ８１２）又はネガティブ発現（Ｒａｊｉ）細胞株をそれぞれポジティブ又はネガティブコントロールとして使用した。

【0124】

＃Ｅ３Ｃ３モノクローナル抗体を用いてＩＬ－１ＲＡＰ発現を検討した。リンパ節、結腸、小腸、胎盤、胃、及び前立腺という６組織のみの主に上皮又は内皮細胞において、様々な強度の染色が検出された（図４）。

【0125】

・結果
＃Ａ３Ｃ３は、ＩＬ－１ＲＡＰを細胞表面に発現している様々なＡＭＬ細胞株を染色することができる。そこで、＃Ａ３Ｃ３を用いたウェスタンブロッティングにより、異なる細胞株の細胞表面にＩＬ－１ＲＡＰが発現していることを、異なる強度レベルのシグナルで確認した。興味深いことに、ＣＤ１４＋単球の亜集団もＩＬ－１ＲＡＰを発現していた。ＡＭＬ（すべてのサブタイプ、ｎ＝３０）の患者コホートをフローサイトメトリーで分析したところ、先行技術で示されているように、単球の発現レベルは安定しているものの、ＡＭＬの芽球にＩＬ－１ＲＡＰが様々な割合（８４．２７±１７．４％）と細胞表面の発現レベルで存在していることが確認された。この結果は、欧州白血病ネット（ＥＬＮ）の予後分類に基づいて分類されたＡＭＬ患者のＩＬ－１ＲＡＰ抗原部位の絶対数によっても確認された。これらの結果をもとに、細胞表面の発現レベルを低、中、高の３段階に定義した。これらの発現レベルは、さらなる研究のために細胞株でモデル化した。

【0126】

＜実施例２：レンチウイルスコンストラクト＞
ＶＤＪ又はＶＪ再構成の分子シークエンシング及びＣＤＲ３ヌクレオチド配列決定に基づき、実施例１の＃Ｅ３Ｃ３ ＩＬ－１ＲＡＰハイブリドーマ由来の合成的に作製された一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）をＳＩＮ－ｐＳＤＹバックボーンにクローニングして、ＣＡＲレンチウイルスコンストラクト（ｐＳＤＹ－ｉＣ９－ＩＬ－１ＲＡＰＣＡＲ－ｄＣＤ１９）を調製した（Ｒｏｓｓｏｌｉｌｌｏ Ｐ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｆ，Ｓｉｍｏｎ－Ｌｏｒｉｅｒｅ Ｅ，Ｇａｌｌｏｉｓ－Ｍｏｎｔｂｒｕｎ Ｓ，Ｎｅｇｒｏｎｉ Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＩＶ－ｄｒｉｖｅｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．，ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．，２０１２；８（８）：ｅ１００２９０４）。

【0127】

簡潔に言うと、安全カセットｉＣＡＳＰ９と、＃Ｅ３Ｃ３モノクローナル抗体の一本鎖可変領域断片と、モニタリング及び有望な細胞選択のための細胞表面発現マーカーΔＣＤ１９とを有するＳＩＮレンチウイルスコンストラクトを構築した。これら３種の導入遺伝子はいずれも、ＥＦ１プロモーター及びＳＰ１６３エンハンサー配列（マウスＶＥＧＦ遺伝子の５’ＵＴＲの一部、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号＃Ｕ４１３８３）の制御下、２Ａペプチド切断配列で隔てられている。

【0128】

図５に示す通り、上記コンストラクトは、自殺安全カセットｉＣＡＳＰ９（化学誘導性カスパーゼ９）、ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ、及び細胞表面選択マーカーΔＣＤ１９（シグナル伝達しない細胞内部を切断したＣＤ１９）という３つの異なる部分を有し、これらはＳＰ１６３エンハンサーに付加されたＥＦ１ａ（伸長因子１プロモーターα）プロモーターの制御下、２つの異なる２Ａリボソームスキップ配列（Ｐ２Ａ及びＴ２Ａ）で隔てられている。ＥＦ１ａプロモーター及びＳＰ１６３エンハンサーの制御下、ＣＤ２８－４．１ＢＢ－ＣＤ３ｚシグナル伝達鎖を用いて、＃Ｅ３Ｃ３免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）配列の可変領域で構成されたｓｃＦｖをインフレームでクローニングする。ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲは一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を有し、この断片は、リーダー配列（Ｌ）と結合し、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）でタグ付けされ、２つの共刺激領域（改変膜貫通及び細胞内シグナル伝達ＣＤ２８及び４－１ＢＢ）とＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達領域とで構成されたＴ細胞活性化領域にヒンジ領域を介して接続されている。Ｍｏｃｋ Ｔは、ＩＬ－１ＲＡＰ ｓｃＦｖを含まない同様のコンストラクトで構成されている。

【0129】

＜実施例３：ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞の作製＞
製造業者の指示書に従い、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、仏国）を用いて、健常ドナーの末梢血単核細胞から得たＣＤ３＋Ｔリンパ球を活性化した後、磁気カラム（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、仏国パリ）で単離した。２日目に、活性化したＴ細胞を上清（ＳＮ）と接触させて、実施例２のレンチウイルスベクターを使用して、２０００ｇ、１０℃で９０分間スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）して形質導入した。フローサイトメトリー分析によって形質導入効率を測定して、ΔＣＤ１９細胞表面マーカー発現を同定した。形質導入から４日後、ＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、仏国パリ）で標識したＣＤ１９ポジティブ細胞をＭＡＣＳカラムで磁気的に分離した。単離したＣＤ１９発現細胞を、８％ヒト血清を添加した５００ＵＩ／ｍＬのｒｈＩＬ－２（プロロイキン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含むＸ－ｖｉｖｏ完全培地（Ｌｏｎｚａ、スイス国バーゼル）で増殖させ、凍結保存した。実験的には、ＴｒａｎｓＡｃｔ Ｔ Ｃｅｌｌ試薬と、ヒトＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、又はＩＬ－７＋ＩＬ－１５を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、仏国パリ）とを使用した。

【0130】

＜実施例４：ドナーＴ細胞のレンチウイルス形質導入＞
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープ（ｐＭＤＧ）をコードするヘルパープラスミドと、ＧＡＧ／ＰＯＬ（ｐｓＰＡＸ２）パッケージングプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、それぞれ＃１２２５９及び＃１２２６０、Ｔｒｏｎｏ ｅｔ ａｌ、スイス国ローザンヌ）とを用いたＣａＣｌ２法でサブコンフルエントな２９３Ｔ細胞の一過性同時導入を行うことによって、実施例２のレンチウイルスベクター上清ストックを作製した。４８時間及び７２時間後にウイルス上清を回収し、ＰＥＧ及び低速遠心分離（３０００ｇ、一晩）により濃縮してから、使用するまで－８０℃で保管した。ＩＬ－１ＲＡＰ ｓｃＦｖを含まない同レンチウイルスコンストラクト（Ｍｏｃｋ）をコントロールとして使用した。ＳＮの段階希釈液を用いた２９３Ｔ許容細胞の形質導入により、レンチウイルス上清の力価測定を確立した。

【0131】

フローサイトメトリーで形質導入効率を測定した。開始細胞数に応じて上清力価測定から感染多重度（ＭＯＩ）を差し引いた。

【0132】

レンチウイルス上清を用いたインビトロ作製プロセスによって、Ｍｏｃｋ又はＣＡＲ ＩＬ－１ＲＡＰ上清についてそれぞれＭＯＩ＝２で初代Ｔ細胞を形質導入することができる。

【0133】

・ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析
ＩＬ－１ＲＡＰ形質導入Ｔ細胞の膜又は細胞質細胞亜画分（超遠心後に得られたもの）から抽出したタンパク質又は全タンパク質ライセートを、マウス抗ヒトＣＤ３ｚ抗体でプローブした。細胞成分画分へのウェスタンブロッティングにより、ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲがＣＤ３ｚシグナル伝達（予測される内在性ＣＤ３ｚシグナルが１６ＫＤａであるのに対して、５５ＫＤａのシグナル）と関連することが分かった（図６）。

【0134】

・フローサイトメトリーによる分析
Ｔ細胞表面でのＣＡＲ発現について、組換えＩＬ－１ＲＡＰビオチン化タンパク質を用いて分析し、二次抗ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、クローン＃Ｂｉｏ３－１８Ｅ７）を用いたフローサイトメトリーにより検出した。Ｍｏｃｋ又はＣＡＲ ＩＬ－１ＲＡＰのいずれかでＣＥＭ細胞株又は初代Ｔ細胞を形質導入した。次いで、ビオチンで標識した組換えＩＬ－１ＲＡＰの量を増やしながら、各量の存在下で細胞をインキュベートした。抗ビオチン蛍光抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーで分析した。ビオチン＋／ＣＤ１９＋ＣＥＭ又はＴ細胞のパーセンテージを標識ビオチン組換えタンパク質の量に対してプロットした。サイトメトリー分析のドットプロットは、最大値を含む代表的な染色に対して示した。非形質導入細胞（Ｃ０）又はＭｏｃｋ Ｔ細胞をコントロールとして使用した。

【0135】

ビオチン化ＩＬ－１ＲＡＰタンパク質の段階希釈液（２０ｎｇ～２．４ｐｇ／ｍｌ）を用いた追加分析及びＦＡＣＳ分析によって、ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ形質導入ＣＥＭ Ｔ細胞株又は初代Ｔ細胞のいずれかを検出できる。１回の実験から、最大のＣＥＭ（８５．８％）又は初代（６８．５％）ＧＭＴＣを動員するためには、それぞれ１．２５ｎｇ及び０．１５ｎｇという異なる量の組換えタンパク質が必要であることを示すことができる（図７）。

【0136】

ＣＥＭの細胞表面では初代Ｔ細胞よりも多くのＣＡＲが発現される。また、Ｅ：Ｔ共培養系に多量（１０００倍＞血漿濃度）の非標識組換えＩＬ－１ＲＡＰタンパク質を添加すると、エフェクター細胞傷害性が顕著に阻害される。

【0137】

これらの実験は、ＣＡＲは細胞表面にアドレッシングされること、及びＩＬ－１ＲＡＰタンパク質のＣＡＲ特異的な認識及び結合が起こることを確認するものである。

【0138】

＜実施例５：自殺遺伝子ｉＣＡＳＰ９カセットの効率＞
形質導入細胞（ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ２９３Ｔ）又は非形質導入細胞（２９３Ｔ）を、培地のみ（－化学誘導二量体形成物質（ＣＩＤ））又は２０ｎＭのＣＩＤ ＡＰ１９０３を含む培地で２４時間培養した。光学顕微鏡観察によって、培養液中の生細胞又は死細胞の存在及び構造を画像化できる（×４０）。

【0139】

光学顕微鏡観察により、ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲで形質導入した２９３Ｔ細胞培養液はＣＩＤに対して感受性を有することが分かる（図８）。

【0140】

ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲを発現する又はしないＧＭＴＣ細胞混合物及び非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）に対するＣＩＤ暴露（２０ｎＭ、２４時間）後又は非暴露（薄灰色）でのフローサイトメトリー分析。ＣＤ３^＋／ＣＤ１９^＋染色により、ＣＡＲを発現するＧＭＴＣをそれ以外から識別できる。

【0141】

非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞をいずれも培地のみ又は培地＋ＣＩＤに暴露した（２０ｎＭ、２４時間）。

【0142】

正確な細胞死は、まず、製造業者の指示書（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＩＭ３６１４）に従い、アネキシン－Ｖ／７－ＡＡＤゲーティング後にフローサイトメトリーで評価した。蛍光分析は、ＣＤ３^＋／ＣＤ１９^＋ポジティブ細胞に対してゲーティングした。５０００個の蛍光ビーズを取得してから定量化した。致死効率をコントロール細胞（未処理細胞）に対して標準化した。細胞致死を以下の通り算出した。死細胞％＝［１－（ＡＰ１９０３処理細胞中の生細胞の絶対数／未処理細胞中の生細胞の絶対数）］×１００。Ｃ０又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ（ＣＤ３＋／ＣＤ１９＋でゲーティング）細胞のＣＩＤ暴露２４時間又は４８時間。結果を３つの独立した試験の平均±ＳＤで表す。^＊＊＊：ｐ＜０．００１（図９）。

【0143】

サイトメトリー分析から、ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲを発現する（ＣＤ１９^＋）又はしない（ＣＤ１９^－）Ｔ細胞の混合集団を２４時間ＣＩＤ暴露した後、ＣＤ１９^－ＣＤ３＋細胞のみが存続したことが分かる２６。より正確には、アポトーシスの定量的ＡｎｎＶ／７ＡＡＤアッセイにより、非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）（２４時間又は４８時間でそれぞれ１．２８％及び６．１３％）と比較して、それぞれ２４時間又は４８時間ＣＩＤ暴露後に８４．１１％及び８８．９３％のＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞が除去されることが分かった（ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。

【0144】

＜実施例６：ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞の増殖能力＞
材料と方法
非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）、Ｍｏｃｋ Ｔ細胞（ＭｏｃｋＴ）又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ（ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ）を、エフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比が１：３となるように、培地のみ（標的なし）か、ＩＬ－１ＲＡＰネガティブ細胞（Ｋ５６２）と接触させるか、又は、細胞表面発現標的細胞（ＫＵ８１２、 ＣＭＬ、ポジティブコントロール）及び細胞表面発現のＩＬ－１ＲＡＰレベルが異なるＡＭＬ細胞株（低：ＨＬ－６０、中：ＭＯＬＭ－１３、高：ＥＯＬ－１）と接触させるかのいずれかで３日間培養した。エフェクターはあらかじめＩＬ－２を添加せずに０．５Ｍ ＣＦＳＥで標識した。ＩＬ－２を添加せずに７２時間共培養した後、生きているＣＤ３＋／ＣＤ１９－（Ｃ０）とＣＤ３＋／ＣＤ１９＋ゲート細胞（ＭＯＣＫＴ－又はＩＬ－１ ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞）の分裂をフローサイトメトリーで評価し、ＣＦＳＥ色素の希釈率を測定した。

【0145】

結果
非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）又はＭＯＣＫ形質導入Ｔ細胞（ＭｏｃｋＴ）とは逆に、ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞は、標的細胞のＩＬ－１ＲＡＰ細胞表面発現が何であれ、ＡＭＬ細胞株の存在下で特異的に活性化され、分裂することができた（図１０Ａ及び１０Ｂ）。

【0146】

＜実施例７：ＩＦＮγの細胞内での発現＞
材料と方法
非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）、Ｍｏｃｋ導入Ｔ細胞（ＭｏｃｋＴ）又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ（ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ）を、エフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比が１：５となるように、培地のみ（標的なし）、ＩＬ－１ＲＡＰネガティブ細胞（Ｋ５６２）、又は、細胞表面発現標的細胞（ＫＵ８１２、ＣＭＬ、ポジティブコントロール）及び細胞表面発現のＩＬ－１ＲＡＰレベルが異なるＡＭＬ細胞株（低：ＨＬ－６０、中：ＭＯＬＭ－１３、高：ＥＯＬ－１）と接触させて６時間培養した。サイトカイン産生のポジティブコントロールとして、１０ｎｇ／ｍＬのホルボールミリスタートアセタート（ＰＭＡ）及び１μｇ／ｍＬのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した細胞を用いた。ＩＦＮγの標識は、ブレフェルディンＡ処理及び細胞の透過処理後に行った。蛍光ＩＦＮγシグナルは、ＣＤ８＋細胞とＣＤ４＋（旧ＣＤ８－）細胞を区別するために、ＣＤ８染色に加えて、ＣＤ３＋／ＣＤ１９＋（ＣＡＲポジティブ細胞）にゲーティングした後検出した。

【0147】

結果
非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）又はＭＯＣＫ導入Ｔ細胞（ＭｏｃｋＴ）とは逆に、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋のＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞は、ＩＬ－１ＲＡＰ細胞表面が何であれＡＭＬ細胞株の存在下で、細胞内ＩＦＮγを特異的に発現することができる（図１１Ａ及び１１Ｂ）。

【0148】

＜実施例８：ＡＭＬ細胞株に対するＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）＞
材料と方法
共培養の前にエフェクター細胞をｅ－Ｆｌｕｏｒで標識した。非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）、Ｍｏｃｋ導入Ｔ細胞（ＭｏｃｋＴ）又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ（ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ）を、様々なエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で、培地のみで（標的なし）、ＩＬ－１ＲＡＰネガティブ細胞（Ｋ５６２）と接触させて、又は、細胞表面発現標的細胞（ＫＵ８１２、ＣＭＬ、ポジティブコントロール）及び細胞表面発現のＩＬ－１ＲＡＰレベルの異なるＡＭＬ細胞株（低：ＨＬ－６０、中：ＭＯＬＭ－１３、高：ＥＯＬ－１）と接触させて２４時間培養した。ＦＳＣ及び７－ＡＡＤ標識に対する細胞のゲーティングにより、標的細胞とエフェクター及び生細胞との識別が可能となった。ＦＳＣ＋／７－ＡＡＤ－のゲートでは、エフェクター細胞が存在してもしなくても、持続する標的細胞の割合が測定された。コントロールとして、非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）又はＭｏｃｋ形質導入Ｔ細胞（ＭｏｃｋＴ）を用いた。

【0149】

結果
ＭＯＣＫ形質導入Ｔ細胞（ＭｏｃｋＴ）とは逆に、エフェクターＣＡＲＴ細胞はＩＬ－１ＲＡＰポジティブ標的（ＡＭＬ）と様々なＥ：Ｔ比で共培養することで、腫瘍抗原の発現レベルに関わらず、ＩＬ－１ＲＡＰを発現する標的ＡＭＬ細胞株を同じ効率で死滅することができる（図１２Ａ及び１２Ｂ）。

【0150】

＜実施例９：ｉＣＡＳＰ９安全スイッチで保護されたＩＬ－１ＲＡＰ－ＣＡＲＴ細胞は健常造血細胞に対して大きな有害作用は示さない＞
オフターゲット毒性を予測するために、＃Ａ３Ｃ３ｍＡｂを使用して、３０個の正常ヒト組織の組織マクロアッセイ（ＴＭＡ）によりＩＬ－１ＲＡＰ発現を検討した。染色は、リンパ節、前立腺、骨格筋、胃、結腸及び小腸、並びに膵臓という６組織のみにおいて、炎症性又は壊死性要素を除いて様々な強度レベルで検出された（図１３Ａ及び表２）。興味深いことに、微小血管ＨＭＥＣ－１内皮細胞株は、我々の＃Ａ３Ｃ３ ＩＬ－１ＲＡＰ ｍＡｂでは認識されず（図１３Ｂ）、Ｒ＆Ｄ ＩＬ－１ＲＡＰ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｆ＃８９４１２）では細胞表面発現が明確に検出されるため、異なるエピトープが認識されたものと思われる。

【0151】

健常造血系の標的化に関して、ｍＡｂ＃Ａ３Ｃ３では健常ドナーの骨髄（図１４Ａ、Ｃ）又は正常臍帯血（図１４Ｂ、Ｃ）においてＨＳＣは検出されないとして（ＲＦＩ＜１．２、ｎ＝５）、健常ドナーの末梢血の２／５及び骨髄の３／５において、単球亜集団の弱い染色（ＲＦＩ＜２）が確認された（図１４Ａ）。次いで、ＰＢＭＣ及び自家ＣＡＲＴ細胞を様々なＥ：Ｔ比で共培養することで、単球のインビトロ感受性を検討した。Ｅ：Ｔ比＝１：１では、単球の一部のみが標的とされ、４１．４５％の単球が生存したままであったが（図１４Ｄ、右、表３）、リンパ球、顆粒球、及びＫ５６２ ＩＬ－１ＲＡＰネガティブ細胞株は、高いＥ：Ｔ比でも、影響を受けなかった（図１３Ｄ）。興味深いことに、上記Ｅ：Ｔ比では、白血病細胞の９４．７７％が死滅した（図１４Ｅ）。

【0152】

【表2-1】

【0153】

【表2-2】

【0154】

【表2-3】

【0155】

【表3】

【0156】

これらの結果はｈＣＤ３４生着（ｅｎｇｒａｆｔｅｄ）マウスモデル（ｈｕ－ＮＯＧ）においてインビボで確認され、単球は１５日目で減少したが（４１±２５％、ｎ＝３、ｐ＝ｎ．ｓ）、ｈＣＤ３４＋細胞由来の他のヒト免疫担当細胞はＣＡＲＴ細胞の影響を受けないことが明らかとなった（図１５）。健常ＣＤ３４＋臍帯血ＨＳＣと自家ＣＡＲＴ細胞とのインビトロ共培養後に造血幹細胞培養アッセイを実施したところ（ｎ＝３）、ＨＳＣは影響を受けないことが確認された（図１６）。これらの結果は、造血系に対するわずかな副作用を伴うＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞免疫療法と一致する。

【0157】

潜在毒性を制限するために、化学誘導二量体形成物質（ＣＩＤ、１０ｎＭ）に暴露してからｉＣＡＳＰ９／ＡＰ１９０３自殺系カセットの安全スイッチの機能性を評価した。まず、光学顕微鏡を用いて、ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲで形質導入した２９３Ｔ細胞培養はＣＩＤに感受性があることを示した（図１７、上）。サイトメトリー分析から、ＣＤ１９＋及びＣＤ１９－ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞の混合集団において、ＣＩＤ暴露２４時間後にＣＤ１９－ＣＤ３＋細胞のみが存続していた（図１７、下）。より正確には、アポトーシスの定量アッセイにおいて、ＣＩＤ暴露２４時間又は４８時間後にそれぞれＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞の８４．１１％及び８８．９３％が除去されたのに対して、非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）では、２４時間又は４８時間でそれぞれ１．２８％及び６．１３％であった（ｐ＜０．００１、ｎ＝３、図１４Ｆ）。最後に、ＮＳＧマウスモデルでの安全スイッチのインビボ評価から、ＡＰ１９０３の腹腔内投与後にＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞の８７±７．３２％（ｐ＜０．０１、ｎ＝３）が除去されるが、ＰＢＳ投与後には影響を受けず、コントロール非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）ではいずれの治療の影響も受けないことが分かった（図１４Ｇ）。

【0158】

＜実施例１０：ＡＭＬ患者由来のＡＭＬ芽球に対するＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞のインビトロでの細胞傷害性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）＞
材料及び方法
非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ細胞）、ＭｏｃｋＴ細胞（すなわち、ＣＡＲＴ細胞に使用するものと同じベクターを形質導入した細胞であるが、ベクターはＣＡＲを有しない）、及びＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞（健常ドナー又はＡＭＬ患者のＴ細胞から生成）を遠心分離し、１ｍｌのＰＢＳ １Ｘに再懸濁した後、１／１０００に希釈したｅ－ｆｌｕｏｒ－Ｖ４５０溶液（Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｄｙｅ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を１ｍｌ加えた。室温で２０分間、細胞を暗所でインキュベートした。次に、８ｍｌのＸ－Ｖｉｖｏ １５完全培地（Ｌｏｎｚａ）、１０％の糞便子牛血清（ＧＩＢＣＯ、米国）、１％のペニシリン－ストレプトマイシンＰＳ（ＧＩＢＣＯ社、米国）を加えた後、＋４℃で５分間インキュベートし、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この細胞を同じ培地で２回洗浄し、インターロイキン２を含むＸ－Ｖｉｖｏ １５完全培地、１０％ヒト血清、１％ＰＢＳに懸濁した。これらの細胞と、ＡＭＬ患者の血液試料から採取した１００ｘ１０^３個の初代細胞（同種又は自家移植）との共培養を、種々のエフェクター：ターゲット比（Ｅ：Ｔ比）で、９６ウェルプレート（丸底）内で行った。最終容量／ウェル＝２００μｌ。共培養２４時間後、３μｌの７－ＡＡＤ－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による生存率標識と、抗ＣＤ３４－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による膜染色により、ＡＭＬ芽球に関するＵＮＴ細胞、ＭｏｃｋＴ細胞及びＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性を評価した。必要に応じて、エフェクター細胞（ＭｏｃｋＴ又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞）からＡＭＬ芽球を染色、検出、識別するために、以下の抗体（Ａｂｓ）を使用した：１μｌの抗ＣＤ３－フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、独国）及び１μｌの抗ＣＤ１９－アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、独国）。エフェクター細胞は、ｅ－ｆｌｕｏｒ標識によって標的細胞から識別された。結果は、フローサイトメトリーで得られ、ＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアで解析した。ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞の異質性殺傷力（Ａｌｌｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｋｉｌｌｉｎｇ）は、コントロールの非形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）の細胞傷害性を差し引いたものとした。

【0159】

ＡＭＬ患者からＩＬ－１ＲＡＰ Ｔ細胞を作製した実験では、Ｔ細胞を分離した後に予めＡＭＬ芽球の標識を行い、Ｔ細胞とＢ細胞の有無を確認した。

【0160】

結果
結果を図１９に示す。細胞傷害性が認められなかったＭＯＣＫＴ細胞やＵＮＴ細胞と比較して、様々なＥ：Ｔ比のＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞との共培養では、ＡＭＬ患者の初代細胞であるＡＭＬ芽球（フローサイトメトリー（図示せず）で事前に同定された低・中ＩＬ－１ＲＡＰ発現者）を、腫瘍抗原の発現レベルに関わらず同じ効率で死滅させることができた。

【0161】

興味深いことに、ＡＭＬ患者のＴ細胞から作製したＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞も、ＡＭＬ芽球を同じ効率で死滅させることができた。これは、ＣＡＲＴ細胞がＡＭＬ患者から生成され、自家移植で使用することができることを確かめるものである。

【0162】

＜実施例１１：ＡＭＬ患者由来のＡＭＬ芽球に対するＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞のインビボでの細胞傷害性（ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ）＞
材料及び方法
ＨＬ－６０、Ｍｏｌｍ－１３、Ｍｏｎｏ－Ｍａｃ－６ ＡＭＬのそれぞれ低、中（ｉｎｔ）、高ＩＬ－１ＲＡＰ発現細胞株を、ルシフェラーゼレンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ Ｖ５－Ｌｕｃ Ｂｌａｓｔ ｖｅｃｔｏｒ，Ａｄｄｇｅｎｅ）で形質導入した。ルシフェラーゼポジティブ細胞はブラスチジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）への耐性により選択した。

【0163】

６～８週齢のＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国カリフォルニア州サクラメント）に４日目に腹腔下照射（２５Ｇｙ）を行った。３日目、各マウスに、３００μＬのＰＢＳに懸濁した１ｘ１０^６個のＨＬ－６０又はＭｏｌｍ－１３又はＭｏｎｏ－Ｍａｃ－６ルシフェラーゼ発現ＡＭＬ細胞を尾静脈から注入した。ＡＭＬ細胞注入後の０日目に、マウスを無処置（ＵＴ）、又は未形質導入Ｔ細胞（ＵＮＴ）（３００μＬのＰＢＳ中、１０×１０^６個）、又はＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲ－Ｔ細胞（３００μＬのＰＢＳ中、１０×１０^６個）を尾静脈から投与し、３日目、５日目、１０日目、１４日目、１７日目、２１日目にＩＶＩＳ（登録商標） ｌｕｍｉｎａ ＩＩＩシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて白血病発症をモニターした。

【0164】

動物プロトコルは、ブザンソン大学の動物管理・使用委員会の管理下で行われた。マウスは、未処置群の動物が衰弱した健康状態になり、白血病の兆候が現れるまで追跡した（すなわち、体重減少１５％超、活動性の低下、及び／又は後肢の麻痺）。マウス実験は、現地の倫理委員会（ＮＳＧ－Ｓモデルについては、ＣＥＬＥＡＧ及びプロトコル１１００７Ｒ（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ ＆ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ））の承認を得た。

【0165】

結果
結果を図２０に示す。ＩＬ－１ＲＡＰ ＣＡＲＴ細胞は、白血病細胞のＩＬ－１ＲＡＰ細胞表面発現とは無関係に、インビボでのＡＭＬ異種移植マウスモデルの白血病負担を有意に減少させることが、未処理又はＵＮＴ処理Ｔ細胞マウス群と比較して示されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B-1】

【図14B-2】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図14G】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【配列表】

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【国際調査報告】