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▶ スペクトラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-02
(54)【発明の名称】Ｇ－ＣＳＦタンパク質複合体を用いた治療方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/19 20060101AFI20220726BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220726BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220726BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20220726BHJP
A61K 47/61 20170101ALI20220726BHJP
A61K 47/58 20170101ALI20220726BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220726BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20220726BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220726BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20220726BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220726BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20220726BHJP
C07K 14/53 20060101ALN20220726BHJP
【ＦＩ】
A61K38/19
A61K45/00
A61K39/395 Y
A61K47/60
A61K47/61
A61K47/58
A61K47/68
A61P7/00
A61P37/04
A61P7/06
A61P31/00
C07K19/00
C07K14/53
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2021571286
(86)(22)【出願日】2020-06-01
(85)【翻訳文提出日】2022-01-27
(86)【国際出願番号】 US2020070101
(87)【国際公開番号】W WO2020243755
(87)【国際公開日】2020-12-03
(31)【優先権主張番号】16/428,351
(32)【優先日】2019-05-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506311677
【氏名又は名称】スペクトラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】バート，ガジャナン
(72)【発明者】
【氏名】チャウラ，シャンタ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076CC07
4C076CC14
4C076CC31
4C076EE02
4C076EE06
4C076EE23
4C076EE37
4C076EE38
4C076EE41
4C076EE48
4C076EE59
4C076FF34
4C076FF63
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA37
4C084BA41
4C084CA53
4C084DA19
4C084NA05
4C084NA10
4C084NA14
4C084ZA511
4C084ZA551
4C084ZB091
4C084ZB262
4C084ZB321
4C084ZB351
4C085AA33
4C085BB33
4C085BB34
4C085BB35
4C085BB36
4C085BB37
4C085BB42
4C085DD62
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA40
4H045BA57
4H045CA40
4H045DA10
4H045EA20
4H045EA24
4H045FA10
(57)【要約】
本開示は、損なわれた白血球生成を特徴とするそれを必要とする患者における病気（すなわち好中球減少症）を予防、軽減または治療する方法を提供する。本方法は、非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合させた修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）を含む治療的有効量のタンパク質複合体を患者に投与することを含む。非ペプチジルポリマーは免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されており、かつ修飾されたｈＧ－ＣＳＦはＣｙｓ１７およびＰｒｏ６５のうちの少なくとも１つに置換を含む。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
損なわれた白血球生成を特徴とするそれを必要とする患者における病気を予防、軽減または治療するための方法であって、非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合させた修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）を含む治療的有効量のタンパク質複合体であって、前記非ペプチジルポリマーは前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されており、かつ前記修飾されたｈＧ－ＣＳＦはＣｙｓ１７およびＰｒｏ６５のうちの少なくとも１つに置換を含むタンパク質複合体を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項2】
前記病気は、造血機能の低下、免疫機能の低下、好中球数の減少、好中球動員の減少、末梢血前駆細胞の動員、敗血症、深刻な慢性好中球減少症、熱性好中球減少症、骨髄移植、感染性疾患、白血球減少症、血小板減少症、貧血、移植時の骨髄生着の促進、放射線治療時の骨髄回復の促進、化学物質もしくは化学療法誘発性骨髄形成不全または骨髄抑制および後天性免疫不全症候群からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記病気は深刻な慢性好中球減少症である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記病気は熱性好中球減少症である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記損なわれた白血球生成は化学療法、放射線療法または特発性血小板減少性紫斑病の結果である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記患者をアジュバントもしくはネオアジュバント化学療法で治療した後に前記タンパク質複合体を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記患者をアジュバントもしくはネオアジュバント化学療法で治療した後の１日～５日目に前記タンパク質複合体を投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記アジュバントもしくはネオアジュバント化学療法はドセタキセルおよびシクロホスファミドの組み合わせである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記タンパク質複合体の２回目の用量は、前記タンパク質複合体の１回目の用量を前記患者に投与した後から１５日～２５日目に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記治療的有効量は２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇおよび２００μｇ／ｋｇから選択される単位剤形である、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記治療的有効量は０．６ｍＬ投与体積中に１３．２ｍｇの前記タンパク質複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
治療的有効量の第２の薬剤を前記患者に投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記第２の薬剤は抗癌剤である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記Ｃｙｓ１７における置換はＣｙｓ１７Ｓｅｒである、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記Ｐｒｏ６５における置換はＰｒｏ６５Ｓｅｒである、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記修飾されたヒトＧ－ＣＳＦは配列番号１のポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は配列番号２のポリペプチド配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記非ペプチジルポリマーの両端はそれぞれ前記修飾されたヒトＧ－ＣＳＦおよび前記免疫グロブリンＦｃ領域に反応基を介して共有結合により結合されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
（ａ）前記免疫グロブリンＦｃ領域はアグリコシル化されている、（ｂ）前記免疫グロブリンＦｃ領域はＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる、
（ｃ）前記免疫グロブリンＦｃ領域はＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインのうちの１つを含む、
（ｄ）前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒンジ領域をさらに含む、あるいは
（ｅ）前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭから誘導された免疫グロブリンＦｃ断片である、
請求項１に記載の方法。
【請求項20】
（ａ）前記免疫グロブリンＦｃ断片の各ドメインはドメインのハイブリッドであり、各ドメインはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンから誘導された異なる由来を有する、（ｂ）前記免疫グロブリンＦｃ断片は同じ由来を有するドメインを含む単鎖免疫グロブリンからなる二量体または多量体である、
（ｃ）前記免疫グロブリンＦｃ断片はＩｇＧ４ Ｆｃ断片である、あるいは
（ｄ）前記免疫グロブリンＦｃ断片はヒトのアグリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ断片である、
請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
（ａ）前記非ペプチジルポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、あるいは（ｂ）前記非ペプチジルポリマーはポリエチレングリコールである、
請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記ポリエチレングリコールは３．４ｋＤａの分子量を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記非ペプチジルポリマーの前記反応基はアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項24】
（ａ）前記アルデヒド基はプロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基である、あるいは（ｂ）前記スクシンイミド誘導体はスクシンイミジルカルボキシメチル、吉草酸スクシンイミジル、メチル酪酸スクシンイミジル、メチルプロピオン酸スクシンイミジル、ブタン酸スクシンイミジル、プロピオン酸スクシンイミジル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドまたは炭酸スクシンイミジルである、
請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
（ａ）前記非ペプチジルポリマーは両端に反応基としてアルデヒド基を有する、（ｂ）前記非ペプチジルポリマーは両端に反応基としてアルデヒド基およびマレイミド基をそれぞれ有する、あるいは
（ｃ）前記非ペプチジルポリマーは両端に反応基としてアルデヒド基およびスクシンイミド基をそれぞれ有する、
請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
前記非ペプチジルポリマーの各端部は前記免疫グロブリンＦｃ領域の前記Ｎ末端および前記修飾されたヒトＧ－ＣＳＦのリジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基のＮ末端、Ｃ末端または遊離反応基にそれぞれ結合されている、請求項１に記載の方法。
【請求項27】
化学療法を受けている患者における好中球減少症を治療または予防するための方法であって、非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に結合された生理活性ポリペプチドを含むタンパク質複合体を前記患者に投与することを含み、ここでは前記非ペプチジルポリマーは前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されている方法。
【請求項28】
前記非ペプチジルポリマーの両端は、反応基を介して前記生理活性ポリペプチドおよび前記免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ共有結合により結合されている、請求項２７に記載の方法、。
【請求項29】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は免疫グロブリンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はアグリコシル化されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項31】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインのうちのいずれか１つを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項32】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項33】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒンジ領域をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項34】
前記免疫グロブリンＦｃ断片の各ドメインはドメインのハイブリッドであり、各ドメインはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンから誘導された異なる由来を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項35】
前記非ペプチジルポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項36】
前記非ペプチジルポリマーはポリエチレングリコールである、請求項２７に記載の方法。
【請求項37】
前記生理活性ポリペプチドはＧ－ＣＳＦである、請求項２７に記載の方法。
【請求項38】
化学療法の完了から約６時間以内に前記タンパク質複合体を前記患者に投与する、請求項２７に記載の方法。
【請求項39】
化学療法の完了から約５時間以内に前記タンパク質複合体を前記患者に投与する、請求項２７に記載の方法。
【請求項40】
化学療法の完了から約２時間以内に前記タンパク質複合体を前記患者に投与する、請求項２７に記載の方法。
【請求項41】
化学療法の完了から約１時間以内に前記タンパク質複合体を前記患者に投与する、請求項２７に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、好中球減少症などの病気を治療または予防するかそれを発症するリスクを減少させるためのタンパク質複合体、医薬組成物およびその使用方法に関する。本タンパク質複合体は、非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ領域に結合されている状態で免疫グロブリンＦｃ領域を非ペプチジルポリマーを介して生理活性ポリペプチドに結合させることにより形成することができる。
【背景技術】
【0002】
好中球減少症は、ほとんどの場合に化学療法治療、薬物有害反応または自己免疫不全に付随する比較的一般的な疾患である。化学療法誘発性好中球減少症は抗癌剤の投与によって引き起こされる共通毒性である。それは生命にかかわる感染症に関連しており、化学療法スケジュールを変更させる場合があり、従って初期および長期臨床結果に影響を与える。熱性好中球減少症は、ドセタキセル、ドキソルビシン、シクロホスファミド（ＴＡＣ）、ドーズ・デンス（ｄｏｓｅ－ｄｅｎｓｅ）ドキソルビシン＋シクロホスファミド（ＡＣ）（その後の週１回もしくは週２回のパクリタキセルを含む場合と含まない場合）ならびにドセタキセル＋シクロホスファミド（ＴＣ）などの骨髄抑制性化学療法レジメンの主要な用量制限毒性である。それは通常、長期入院、広域抗生物質の静脈内投与が必要となり、かなりの罹患率および死亡率を伴う場合が多い。約２５％～４０％の治療未経験患者は、Ｇ－ＣＳＦ支援がない場合には一般的な化学療法レジメンにより熱性好中球減少症を発症する。
【0003】
現在の治療法は、この病気と闘うために顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）および／または抗生物質を用いる。しかしＧ－ＣＳＦまたはその他のポリペプチド誘導体は、腎臓または肝臓により容易に除去されるように血中のタンパク分解酵素によって容易に変性したり容易に分解されたりする。従ってＧ－ＣＳＦ含有薬物の血中濃度および力価を維持するために、このタンパク質薬物を患者に頻繁に投与することが必要であり、これは患者に過剰な苦痛を与える。そのような問題を解決するために、Ｇ－ＣＳＦをポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などの高い溶解性を有するポリマーに化学的に結合させ、それによりその血液安定性を高め、かつ好適な血中濃度をより長期間にわたって維持してきた。
【0004】
しかし、ＰＥＧをＧ－ＣＳＦに結合させることにより血液安定性を高めることができるにも関わらず、最適な生理的効果のために必要とされる力価が劇的に減少する。従って、当該技術分野ではこの欠点に対処することが必要である。
【0005】
従って、新しいＧ－ＣＳＦ含有タンパク質複合体が安定なままであって患者の予後を劇的に改善することができる新しい製剤および使用方法が強く必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、容易に調製して好中球減少症を発症するリスクのある患者に投与し、かつ最適な治療結果を達成する血清中濃度を維持することができる、Ｇ－ＣＳＦを含有するより安定なタンパク質複合体を使用する方法に関する。本発明の別の態様は、非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に部位特異的に結合されている状態で生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ断片とを非ペプチジルポリマーを介して結合させることにより調製されるタンパク質複合体に関する。
【0007】
一態様では、本開示はそれを必要とする患者における病気を予防、軽減または治療する方法を提供する。本方法は、非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合させた修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）を含む治療的有効量のタンパク質複合体であって、非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されており、かつ修飾されたｈＧ－ＣＳＦがＣｙｓ１７およびＰｒｏ６５のうちの少なくとも１つに置換を含むタンパク質複合体を患者に投与することを含む。
【0008】
当該病気は患者において損なわれた白血球生成を特徴とする。例えば当該病気は、造血機能の低下、免疫機能の低下、好中球数の減少、好中球動員の減少、末梢血前駆細胞の動員、敗血症、深刻な慢性好中球減少症、熱性好中球減少症、骨髄移植、感染性疾患、白血球減少症、血小板減少症、貧血、移植時の骨髄生着の促進、放射線治療時の骨髄回復の促進、化学物質もしくは化学療法誘発性骨髄形成不全または骨髄抑制および後天性免疫不全症候群のうちの１つであってもよい。
【0009】
いくつかの実施形態では、当該病気は深刻な慢性好中球減少症であってもよい。いくつかの実施形態では、当該病気は熱性好中球減少症であってもよい。いくつかの実施形態では、損なわれた白血球生成は化学療法、放射線療法または特発性血小板減少性紫斑病の結果であってもよい。
【0010】
いくつかの実施形態では、患者をアジュバントもしくはネオアジュバント化学療法で治療した後に本タンパク質複合体を投与してもよい。いくつかの実施形態では、患者をアジュバントもしくはネオアジュバント化学療法で治療した後の１日～５日の間に本タンパク質複合体を投与してもよい。いくつかの実施形態では、アジュバントもしくはネオアジュバント化学療法はドセタキセルおよびシクロホスファミドの組み合わせであってもよい。
【0011】
いくつかの実施形態では、本タンパク質複合体の２回目の用量は本タンパク質複合体の１回目の用量を患者に投与した後の１５日～２５日の間に投与してもよい。
【0012】
いくつかの実施形態では、治療的有効量は２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇおよび２００μｇ／ｋｇから選択される単位剤形である。いくつかの実施形態では、治療的有効量は０．６ｍＬの投与体積中に１３．２ｍｇの本タンパク質複合体である。
【0013】
いくつかの実施形態では、本方法は治療的有効量の第２の薬剤（例えば抗癌剤）を患者に投与することをさらに含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、Ｃｙｓ１７における置換はＣｙｓ１７Ｓｅｒであってもよく、Ｐｒｏ６５における置換はＰｒｏ６５Ｓｅｒであってもよい。
【0015】
いくつかの実施形態では、修飾されたヒトＧ－ＣＳＦは配列番号１のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は配列番号２のポリペプチド配列を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーの両端はそれぞれ、修飾されたヒトＧ－ＣＳＦおよび免疫グロブリンＦｃ領域に反応基を介して共有結合により結合されている。
【0017】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）免疫グロブリンＦｃ領域はアグリコシル化されている、（ｂ）免疫グロブリンＦｃ領域はＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる、（ｃ）免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインのうちの１つを含む、（ｄ）免疫グロブリンＦｃ領域はヒンジ領域をさらに含む、あるいは（ｅ）免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ由来の免疫グロブリンＦｃ断片であることを特徴としてもよい。
【0018】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、（ａ）免疫グロブリンＦｃ断片の各ドメインはドメインのハイブリッドであり、各ドメインはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンから誘導された異なる由来を有する、（ｂ）免疫グロブリンＦｃ断片は同じ由来を有するドメインを含む単鎖免疫グロブリンからなる二量体または多量体である、（ｃ）免疫グロブリンＦｃ断片はＩｇＧ４ Ｆｃ断片である、あるいは（ｄ）免疫グロブリンＦｃ断片はヒトのアグリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ断片であることをさらに特徴としてもよい。
【0019】
いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーは、（ａ）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、（ｂ）ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールは３．４ｋＤａの分子量を有する。
【0020】
いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーの反応基はアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体からなる群から選択される。例えばアルデヒド基はプロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基であってもよい。スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルカルボキシメチル、吉草酸スクシンイミジル、メチル酪酸スクシンイミジル、メチルプロピオン酸スクシンイミジル、ブタン酸スクシンイミジル、プロピオン酸スクシンイミジル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドまたは炭酸スクシンイミジルであってもよい。
【0021】
いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーは両端に反応基としてアルデヒド基を有する。いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーは両端に反応基としてアルデヒド基およびマレイミド基をそれぞれ有する。いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーは両端に反応基としてアルデヒド基およびスクシンイミド基をそれぞれ有する。
【0022】
いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーの各端部は免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端および修飾されたヒトＧ－ＣＳＦのリジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基のＮ末端、Ｃ末端または遊離反応基にそれぞれ結合されている。
【0023】
別の態様では、本開示は、化学療法を受けている患者における好中球減少症を治療または予防するための方法を提供する。本方法は、非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されている状態で非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に結合された生理活性ポリペプチドを含むタンパク質複合体を前記患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、生理活性ポリペプチドはＧ－ＣＳＦである。
【0024】
いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーの両端はそれぞれ、生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域に反応基を介して共有結合により結合されている。
【0025】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は免疫グロブリンである。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域はアグリコシル化されている。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域はＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる。免疫グロブリンＦｃ領域はヒンジ領域をさらに含んでいてもよい。
【0026】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ断片の各ドメインはドメインのハイブリッドであり、各ドメインはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンから誘導された異なる由来を有する。
【0027】
いくつかの実施形態では、化学療法の完了から約６時間、約５時間、２時間または１時間以内に本タンパク質複合体を患者に投与してもよい。
【0028】
別の態様では、本発明は、生理活性ポリペプチドのインビボでの持続時間および安定性を向上させるための有効成分として本タンパク質複合体を含む医薬組成物における、本タンパク質複合体を調製する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1A】免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端反応によって調製した１７，６５Ｓｅｒ－Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法の結果を示す。
【図1B】免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端反応によって調製した１７，６５Ｓｅｒ－Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体のＦｃ領域Ｎ末端結合を分析するためのペプチドマッピングの結果を示す。
【図2】統計的に有意である、１７，６５Ｓｅｒ－Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ（エフラペグラスチム（ＥＦＬＡＰＥＧＲＡＳＴＩＭ））群における深刻な好中球減少症の発生率の低下を示す。
【図3】深刻な好中球減少症による入院および／または好中球減少症のための抗感染薬の使用を含む好中球減少症の合併症がエフラペグラスチム群において有意により少ないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0030】
大まかに言うと、本開示は、損なわれた白血球生成を特徴とする病気を有する患者を予防、軽減、予防的治療および治療する方法を提供する。本方法は、非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合させた修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）などの生理活性ポリペプチドを含む治療的有効量のタンパク質複合体をそのような治療を必要とする患者に投与することを含む。非ペプチジルポリマーは免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合させることができ、かつ修飾されたｈＧ－ＣＳＦはＣｙｓ１７およびＰｒｏ６５のうちの少なくとも１つに置換を含む。
【0031】
別の態様では、本開示は、骨髄移植に適格な患者において顆粒球の数を増加させるための方法を提供する。本方法は、非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合させた修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）を含む治療的有効量のタンパク質複合体であって、非ペプチジルポリマーは免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されており、かつ修飾されたｈＧ－ＣＳＦはＣｙｓ１７およびＰｒｏ６５のうちの少なくとも１つに置換を含むタンパク質複合体をそのような治療を必要とする患者に投与することを含む。
【0032】
さらに別の態様では、本開示は、患者において幹細胞生成を増加させるための方法を提供する。本方法は、非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合させた修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）を含む治療的有効量のタンパク質複合体であって、非ペプチジルポリマーは免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されており、かつ修飾されたｈＧ－ＣＳＦはＣｙｓ１７およびＰｒｏ６５のうちの少なくとも１つに置換を含むタンパク質複合体をそのような治療を必要とする患者に投与することを含む。
【0033】
さらに別の態様では、本開示は、化学療法を受けているものまたは他の患者への幹細胞のドナーであるものを含むそれを必要とする患者において造血前駆細胞の数を増加させるための方法を提供する。本方法は非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合させた修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）を含む治療的有効量のタンパク質コンジュゲートであって、非ペプチジルポリマーは免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されており、かつ修飾されたｈＧ－ＣＳＦはＣｙｓ１７およびＰｒｏ６５のうちの少なくとも１つに置換を含むタンパク質コンジュゲートを患者に投与することを含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、治療される病気は、造血機能の低下、免疫機能の低下、好中球数の減少、好中球動員の減少、末梢血前駆細胞の動員、敗血症、深刻な慢性好中球減少症、骨髄移植、感染性疾患、白血球減少症、血小板減少症、貧血、移植時の骨髄生着の促進、放射線治療時の骨髄回復の促進、化学物質もしくは化学療法誘発性骨髄形成不全または骨髄抑制および後天性免疫不全症候群を含む。一実施形態では、当該病気は骨髄抑制、好中球減少症または好ましくは熱性好中球減少症である。
【0035】
別の態様では、本開示は、骨髄抑制性抗癌剤を受けている非骨髄性悪性腫瘍を有する患者において好中球減少症（例えば、熱性好中球減少症）によって現されるような感染を予防、軽減、予防的治療および治療するための方法を提供する。本方法は、非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合させた修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）を含む治療的有効量のタンパク質複合体であって、非ペプチジルポリマーは免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されており、かつ修飾されたｈＧ－ＣＳＦはＣｙｓ１７およびＰｒｏ６５のうちの少なくとも１つに置換を含むタンパク質複合体を患者に投与することを含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、損なわれた白血球生成は化学療法、放射線療法、アジュバントもしくはネオアジュバント化学療法または特発性血小板減少性紫斑病の結果である。特定の実施形態では、アジュバントもしくはネオアジュバント化学療法はドセタキセルおよびシクロホスファミドの組み合わせである。他の実施形態では、治療的有効量は１２．５μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇおよび２００μｇ／ｋｇから選択される単位剤形である。特定の実施形態では、本方法論は、治療的有効量の抗癌剤などの第２の薬剤を患者に投与することをさらに含む。特定の実施形態では、修飾されたＧ－ＣＳＦはＣｙｓ１７における置換によるものであり、その置換はＣｙｓ１７Ｓｅｒである。他の実施形態では、Ｐｒｏ６５における置換はＰｒｏ６５Ｓｅｒである。
【0037】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は配列番号１のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたＧ－ＣＳＦは配列番号２のポリペプチド配列を含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、本方法に用いられるタンパク質複合体は、（ａ）免疫グロブリンＦｃ断片の各ドメインはドメインのハイブリッドであり、各ドメインはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンから誘導された異なる由来を有する、（ｂ）免疫グロブリンＦｃ断片は同じ由来を有するドメインを含む単鎖免疫グロブリンからなる二量体または多量体である、（ｃ）免疫グロブリンＦｃ断片はＩｇＧ４ Ｆｃ断片である、あるいは（ｄ）免疫グロブリンＦｃ断片はヒトのアグリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ断片であることを含む。
【0039】
特定の実施形態では、非ペプチジルポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましい実施形態では、非ペプチジルポリマーはポリエチレングリコールである。
【0040】
別の態様では、本開示は、化学療法を受けている患者における好中球減少症を治療または予防するための方法を提供する。本方法は、非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されている状態で非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に結合された修飾されたＧ－ＣＳＦを含むタンパク質複合体を前記患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーの両端はそれぞれ、生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域に反応基を介して共有結合により結合されている。好ましい実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域はアグリコシル化されている。
【0041】
いくつかの実施形態では、化学療法の完了から約５時間、２時間、１時間または３０分以内にＧ－ＣＳＦ複合体組成物を患者に投与する。
【0042】
いくつかの実施形態では、本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域がＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインのうちの１つを含むタンパク質複合体を提供する。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域はＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域はヒンジ領域をさらに含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭから誘導された免疫グロブリンＦｃ断片である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ断片の各ドメインはドメインのハイブリッドであり、かつ各ドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンから誘導された異なる由来を有する。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ断片は同じ由来を有するドメインを含む単鎖免疫グロブリンからなる二量体または多量体である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンＦｃ断片はＩｇＧ４ Ｆｃ断片である。
【0044】
いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびそれらの組み合わせのうちの１つであってもよく、好ましくは非ペプチジルポリマーはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーは３．４ｋＤａのポリエチレングリコールである。
【0045】
いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーの反応基はアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体のうちの１つであってもよい。アルデヒド基はプロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基であってもよい。スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルカルボキシメチル、吉草酸スクシンイミジル、メチル酪酸スクシンイミジル、メチルプロピオン酸スクシンイミジル、ブタン酸スクシンイミジル、プロピオン酸スクシンイミジル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドまたは炭酸スクシンイミジルであってもよい。
【0046】
いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーは両端に反応基としてアルデヒド基を有する。いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーは両端に反応基としてアルデヒド基およびマレイミド基をそれぞれ有する。いくつかの実施形態では、非ペプチジルポリマーは両端に反応基としてアルデヒド基およびスクシンイミド基をそれぞれ有する。
【0047】
いくつかの実施形態では、本発明は、非ペプチジルポリマーの各端部が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端および生理活性ポリペプチドのリジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基のＮ末端、Ｃ末端または遊離反応基にそれぞれ結合されているタンパク質複合体を提供する。
【0048】
別の態様では、本開示は、化学療法を受けている患者における好中球減少症を治療または予防するための方法を提供する。本方法は、非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されている状態で非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に結合された生理活性ポリペプチドを含むタンパク質複合体を前記患者に投与することを含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、生理活性ポリペプチドはホルモン、サイトカイン、酵素、抗体、増殖因子、転写因子、血液凝固因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質および受容体のうちの１つであってもよい。いくつかの実施形態では、生理活性ポリペプチドはＧ－ＣＳＦである。
【0050】
別の態様では、本開示は本タンパク質複合体を調製する方法も提供する。本方法は、
（ａ）両端に反応基を有する少なくとも１つの非ペプチジルポリマー、少なくとも１つの生理活性ポリペプチドおよび少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により結合させてタンパク質複合体を調製する工程、および
（ｂ）非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合されている状態で共有結合させた生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域を本質的に含む（ａ）で調製したタンパク質複合体を単離する工程
を含む。
（ａ）両端に反応基を有する少なくとも１つの非ペプチジルポリマー、少なくとも１つの生理活性ポリペプチドおよび少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により結合させてタンパク質複合体を調製する工程、および
（ｂ）非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合されている状態で共有結合させた生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域を本質的に含む（ａ）で調製したタンパク質複合体を単離する工程
を含む。
【0051】
本発明の具体的な一実施形態は、工程（ａ）が、
（ａ１）非ペプチジルポリマーの一端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により結合させてコンジュゲートを調製する工程、および
（ａ２）工程（ａ１）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちの他方に共有結合により結合させる工程
を含む調製方法を提供する。
（ａ１）非ペプチジルポリマーの一端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により結合させてコンジュゲートを調製する工程、および
（ａ２）工程（ａ１）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちの他方に共有結合により結合させる工程
を含む調製方法を提供する。
【0052】
本発明の別の具体的な実施形態は、工程（ａ１）において生理活性ポリペプチドと非ペプチジルポリマーとの反応モル比が１：１～１：３０の範囲内であり、かつ免疫グロブリンＦｃ断片と非ペプチジルポリマーとの反応モル比が１：１～１：２０の範囲内である調製方法を提供する。
【0053】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、工程（ａ１）を４．０～９．０のｐＨ条件下で行う調製方法を提供する。
【0054】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、工程（ａ１）を４．０℃～２５℃の温度で行う調製方法を提供する。
【0055】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、工程（ａ１）において免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲内である調製方法を提供する。
【0056】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、工程（ａ２）においてコンジュゲートと免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの反応モル比が１：０．１～１：２０の範囲内である調製方法を提供する。
【0057】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、工程（ａ２）を４．０～９．０のｐＨ条件下で行う調製方法を提供する。
【0058】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、工程（ａ２）を４．０℃～２５℃の温度で行う調製方法を提供する。
【0059】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、工程（ａ２）において免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲内である調製方法を提供する。
【0060】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、工程（ａ１）および工程（ａ２）を還元剤の存在下で行う調製方法を提供する。
【0061】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、還元剤がシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、水素化ホウ素ナトリウム、ホウ酸ジメチルアミンおよびホウ酸ピリジンからなる群から選択される調製方法を提供する。
【0062】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、工程（ａ２）において陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィおよびサイズ排除クロマトグラフィからなる群から選択される単一もしくは組み合わせた精製方法によって単離を行う調製方法を提供する。
【0063】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、陰イオン交換クロマトグラフィ樹脂の官能基が第四級アンモニウム（Ｑ）、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンアミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）およびトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）からなる群から選択されるいずれか１つである調製方法を提供する。
【0064】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂の官能基はメチルスルホン酸（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）およびポリアスパラギン酸からなる群から選択されるいずれか１つである調製方法を提供する。
【0065】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、疎水性クロマトグラフィ樹脂の官能基がフェニル、オクチル、（イソ）プロピル、ブチルおよびエチルからなる群から選択されるいずれか１つである調製方法を提供する。
【0066】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、アフィニティクロマトグラフィ樹脂の官能基がタンパク質Ａ、ヘパリン、ブルー、ベンズアミジン、金属イオン（コバルト、ニッケルおよび銅）、および本タンパク質複合体の構成要素の一部または全体に対する抗体からなる群から選択されるいずれか１つであり、非ペプチジルポリマーの両端が免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドにそれぞれ結合されている調製方法を提供する。
【0067】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、サイズ排除クロマトグラフィの樹脂がＳｕｐｅｒｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、ＳｕｐｅｒｐｏｓｅおよびＳｅｐｈａｄｅｘからなる群から選択される調製方法を提供する。
【0068】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィおよびサイズ排除クロマトグラフィからなる群から選択される単一もしくは組み合わせた方法によって工程（ｂ）のタンパク質複合体を単離する工程を行う調製方法を提供する。
【0069】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、陰イオン交換クロマトグラフィ樹脂の官能基が第四級アンモニウム（Ｑ）、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンアミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）およびトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）からなる群から選択されるいずれか１つである調製方法を提供する。
【0070】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、陽イオン交換クロマトグラフィ樹脂の官能基がメチルスルホン酸（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）およびポリアスパラギン酸からなる群から選択されるいずれか１つである調製方法を提供する。
【0071】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、疎水性クロマトグラフィ樹脂の官能基がフェニル、オクチル、（イソ）プロピル、ブチルおよびエチルからなる群から選択されるいずれか１つである調製方法を提供する。
【0072】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、アフィニティクロマトグラフィ樹脂の官能基がタンパク質Ａ、ヘパリン、ブルー、ベンズアミジン、金属イオン（コバルト、ニッケルおよび銅）、本タンパク質複合体の構成要素の一部または全体に対する抗体からなる群から選択されるいずれか１つであり、非ペプチジルポリマーの両端が免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドにそれぞれ結合されている調製方法を提供する。
【0073】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、サイズ排除クロマトグラフィの樹脂がＳｕｐｅｒｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、ＳｕｐｅｒｐｏｓｅおよびＳｅｐｈａｄｅｘからなる群から選択される調製方法を提供する。
【0074】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、工程（ｂ）が、タンパク質複合体を構成している非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端を介して結合されている状態のタンパク質複合体を単離するためのものである調製方法を提供する。
【0075】
本発明のさらに別の態様は、
（ａ’）４．０～９．０のｐＨ条件下で、非ペプチジルポリマーの一端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により結合させてコンジュゲートを調製する工程、
（ｂ’）工程（ａ’）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ４．０～９．０のｐＨ条件下で、単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちの他方に共有結合により結合させる工程、および
（ｃ’）非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合されている状態で共有結合させた生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域を本質的に含む工程（ｂ’）で調製したタンパク質複合体を単離する工程
を含む、位置特異的タンパク質複合体を調製する方法を提供する。
（ａ’）４．０～９．０のｐＨ条件下で、非ペプチジルポリマーの一端を免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドに共有結合により結合させてコンジュゲートを調製する工程、
（ｂ’）工程（ａ’）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ４．０～９．０のｐＨ条件下で、単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちの他方に共有結合により結合させる工程、および
（ｃ’）非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合されている状態で共有結合させた生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域を本質的に含む工程（ｂ’）で調製したタンパク質複合体を単離する工程
を含む、位置特異的タンパク質複合体を調製する方法を提供する。
【0076】
特に、非ペプチジルポリマーと免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端との結合における反応速度にとって重要な条件はｐＨであり、部位特異的結合は中性のｐＨ未満、すなわちｐＨ７．０未満のｐＨ値で良好に生じ得る。
【0077】
非ペプチジルポリマーを免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に結合させる工程は中性のｐＨ未満のｐＨ値で行い、好適にはタンパク質の第三級構造または活性を変性させない弱酸性から酸性のｐＨで行うが、それらに限定されない。非限定的な例として、本発明で使用される免疫グロブリンＦｃ領域は配列番号２のアミノ酸配列を有し、それは約ｐＨ８．２の弱塩基性条件においてＮ末端特異性を有することが確認された（実施例５）。
【0078】
すなわち、一般的な免疫グロブリンＦｃ領域を使用する場合、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端と非ペプチジルポリマーとの特異的結合の反応速度は中性のｐＨ未満のｐＨで増加する。但し、より低いｐＨ感受性を有するように突然変異されている免疫グロブリンＦｃ領域を使用する場合、その結合の反応速度は当該条件に限定されなくてもよい。
【0079】
本発明のさらに別の態様は、
（ａ’）非ペプチジルポリマーの一端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちのいずれか一方に共有結合により結合させてコンジュゲートを調製する工程であって、ここでは生理活性ポリペプチドと非ペプチジルポリマーとの反応モル比が１：１～１：３０の範囲内であり、かつ免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチジルポリマーとの反応モル比が１：１～１：２０の範囲内であり、還元剤が１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれており、かつ当該反応を４．０～９．０のｐＨ条件下、４．０℃～２５℃の温度で行い、かつ免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲内である工程、
（ｂ’）工程（ａ’）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちの他方に共有結合により結合させる工程であって、ここではコンジュゲートと免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの反応モル比が１：０．１～１：２０の範囲内であり、還元剤が１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれており、かつ当該反応を４．０～９．０のｐＨ条件下、４．０℃～２５℃の温度で行い、かつ免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲内である工程、および
（ｃ’）非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合されている状態で共有結合させた生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域を本質的に含む工程（ｂ’）で調製したタンパク質複合体を単離する工程
を含む、本タンパク質複合体を調製する方法を提供する。
（ａ’）非ペプチジルポリマーの一端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちのいずれか一方に共有結合により結合させてコンジュゲートを調製する工程であって、ここでは生理活性ポリペプチドと非ペプチジルポリマーとの反応モル比が１：１～１：３０の範囲内であり、かつ免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチジルポリマーとの反応モル比が１：１～１：２０の範囲内であり、還元剤が１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれており、かつ当該反応を４．０～９．０のｐＨ条件下、４．０℃～２５℃の温度で行い、かつ免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲内である工程、
（ｂ’）工程（ａ’）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちの他方に共有結合により結合させる工程であって、ここではコンジュゲートと免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの反応モル比が１：０．１～１：２０の範囲内であり、還元剤が１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれており、かつ当該反応を４．０～９．０のｐＨ条件下、４．０℃～２５℃の温度で行い、かつ免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲内である工程、および
（ｃ’）非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合されている状態で共有結合させた生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域を本質的に含む工程（ｂ’）で調製したタンパク質複合体を単離する工程
を含む、本タンパク質複合体を調製する方法を提供する。
【0080】
本発明のさらに別の具体的な実施形態は、９０％以上のＮ末端選択性を有する本タンパク質複合体を調製するための方法を提供する。
【0081】
本発明のさらに別の態様は、生理活性ポリペプチドのインビボでの持続時間および安定性を向上させるための有効成分として本タンパク質複合体を含む医薬組成物を提供する。
【0082】
本発明の具体的な一実施形態は、９０％以上の量で本タンパク質複合体を含む組成物を提供する。
【0083】
本発明のさらに別の態様は、本組成物の送達のための調製物を含む医薬品容器である。例示的な医薬品容器としては、注射器、シリンジ、バイアル、点滴ボトル、アンプルまたはカルプル（ｃａｒｐｏｕｌｅ）、例えば針保護システムを備えたシリンジまたは注射ペン内にあるカルプルが挙げられる。一実施形態によれば、本発明は、内面を有する壁および内面を有するシールアセンブリを有する容器を含む注射器であって、当該壁およびシールアセンブリの内面は製剤が充填された閉鎖された無菌リザーバーを画定している注射器を提供する。
【0084】
注射器は、貯蔵状態ではシールアセンブリを部分的にのみ貫通して配置され、かつ送達状態ではシールアセンブリの内面を通って無菌リザーバーの中に配置される先端を有する清潔なシースのない硬い瓶針を含む流体送達システムも備えていてもよい。さらに注射器は瓶針を貯蔵状態から送達状態に移動させるように構成されたアクチュエータを備えていてもよい。一実施形態では、当該瓶の壁は硬い壁であっても柔らかい壁であってもよく、シールアセンブリはシールアセンブリの内面を画定する内面を有する柔らかい単一の壁であってもよい。柔らかい単一の壁は、開口部を横切って配置され、かつ当該瓶の壁に固定して取り付けられたセプタムを画定していてもよい。あるいは、当該瓶の壁は穴を画定していてもよく、単一の柔らかい壁はその穴に沿って移動可能な栓を画定していてもよい。そのような場合、当該瓶の壁はその栓に対向する閉鎖端およびその中にその栓が配置されている開放端を画定していてもよい。さらなる代替物として、当該瓶の壁は、穴の第１の端部と流体通信している開口部と共に穴を画定していてもよく、単一の柔らかい壁は開口部を横切って配置され、かつ当該瓶の壁に固定して取り付けられたセプタムを画定しており、当該瓶はその穴の第２の端部内に配置され、かつその穴に沿って移動可能な栓をさらに含む。
【0085】
本発明のさらに別の態様は、それを必要とする患者における神経障害を治療、改善または予防する方法に関する。そのような神経障害は慢性脊髄損傷、パーキンソン病、または脳性麻痺などの神経発達障害に関連していてもよい。本方法は、神経障害およびその管理に関連してそれを必要とする患者に治療的有効用量を投与することを含む。
【0086】
本発明のさらに別の態様は、骨髄移植に関する治療における上に記載されている本組成物の使用を提供する。本方法は、骨髄移植および幹細胞の動員に関連してそれを必要とする患者に治療的有効用量を投与することを含む。
【0087】
定義
本明細書で使用される「タンパク質複合体」または「複合体」という用語は、少なくとも１つの生理活性ポリペプチド、その両端に反応基を有する少なくとも１つの非ペプチジルポリマーおよび少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域が共有結合により互いに結合されている構造を指す。さらに、生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域から選択される２つの分子のみが共有結合により互いに結合されている構造は、それを「複合体」と区別するために「コンジュゲート」と呼ぶ。
本明細書で使用される「タンパク質複合体」または「複合体」という用語は、少なくとも１つの生理活性ポリペプチド、その両端に反応基を有する少なくとも１つの非ペプチジルポリマーおよび少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域が共有結合により互いに結合されている構造を指す。さらに、生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域から選択される２つの分子のみが共有結合により互いに結合されている構造は、それを「複合体」と区別するために「コンジュゲート」と呼ぶ。
【0088】
本発明のタンパク質複合体は、ＰＥＧがその両端において修飾されたＧ－ＣＳＦおよび免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ反応基を介して共有結合により結合されているタンパク質複合体であってもよい。
【0089】
本明細書で使用される「生理活性ポリペプチド」、「生理活性タンパク質」、「活性タンパク質」または「タンパク質薬物」という用語は、インビボにおいて生理的事象に対していくつかの種類の拮抗活性を有するポリペプチドまたはタンパク質を指し、これらの用語は同義で使用することができる。
【0090】
本明細書で使用される「非ペプチジルポリマー」という用語は、ペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに結合されている２つ以上の繰り返し単位を含む生体適合性ポリマーを指すが、それに限定されない。
【0091】
本明細書で使用される「免疫グロブリンＦｃ領域」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域を除く免疫グロブリン分子の領域、すなわち免疫グロブリンの重鎖定常領域１（ＣＨ１）および軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を指す。免疫グロブリンＦｃ領域は重鎖定常領域におけるヒンジ領域をさらに含んでもよい。特に、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域はＦｃ領域の一部または全てを含む断片であってもよく、本発明では免疫グロブリンＦｃ領域は免疫グロブリン断片と同義で使用することができる。
【0092】
天然のＦｃは重鎖定常領域１のＡｓｎ２９７位に糖鎖を有するが、大腸菌由来の組換えＦｃはアグリコシル化形態として発現される。Ｆｃからの糖鎖の除去により、重鎖定常領域１に対するＦｃγ受容体１、２および３ならびに補体（ｃｌｑ）の結合親和性が低下し、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が減少または喪失する。
【0093】
本明細書で使用される「免疫グロブリン定常領域」という用語は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨＩ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を除く重鎖定常領域２（ＣＨ２）および重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含む（または重鎖定常領域４（ＣＨ４）を含む）Ｆｃ断片を指してもよく、重鎖定常領域にあるヒンジ領域をさらに含んでもよい。さらに、本発明の免疫グロブリン定常領域は、天然のタンパク質と実質的に同様またはそれよりも良好な生理的機能を有する限り、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域を除く重鎖定常領域１（ＣＨ１）および／または軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むＦｃ領域の一部または全てを含む拡張された免疫グロブリン定常領域であってもよい。
【0094】
一方、免疫グロブリン定常領域はヒトまたはウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物由来であってもよく、好ましくはヒト由来であってもよい。さらに免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭあるいはそれらの組み合わせまたはそれらのハイブリッド由来、好ましくはヒト血液中でそれらのうち最も豊富であるＩｇＧまたはＩｇＭ由来、最も好ましくはリガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが知られているＩｇＧ由来の定常領域から選択されてもよい。本発明では免疫グロブリンＦｃ領域は、同じ由来のドメインの単鎖免疫グロブリンからなる二量体または多量体であってもよい。
【0095】
本明細書で使用される「組み合わせ」という用語は、二量体または多量体を形成するために同じ由来の単鎖免疫グロブリン定常領域（好ましくはＦｃ領域）をコードするポリペプチドが異なる由来の単鎖ポリペプチドに結合されていることを意味する。すなわち、二量体または多量体はＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ ＦｃおよびＩｇＥ ＦｃのＦｃ断片からなる群から選択される２つ以上の断片から調製されていてもよい。
【0096】
本明細書で使用される「ハイブリッド」という用語は、異なる由来の２つ以上の免疫グロブリン定常領域をコードする配列が免疫グロブリン定常領域（好ましくはＦｃ領域）の単鎖中に存在することを意味する。本発明では様々なハイブリッド形態が可能である。例えばハイブリッドドメインは、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ ＦｃおよびＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４からなる群から選択される１～４つのドメインからなっていてもよく、かつヒンジ領域をさらに含んでいてもよい。
【0097】
ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスに分けてもよく、本発明はそれらの組み合わせまたはハイブリッドを含んでもよい。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４サブクラスが好ましく、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）などのエフェクター機能を滅多に有しないＩｇＧ４のＦｃ領域が最も好ましい。
【0098】
免疫グロブリン定常領域は、天然の形態と同程度であるかそれによりも多いまたは少ない程度にグリコシル化形態を有していてもよく、あるいは脱グリコシル化形態であってもよい。免疫グロブリン定常領域のグリコシル化または脱グリコシル化の増加または減少は典型的な方法、例えば化学的方法、酵素的方法または微生物を用いる遺伝子操作方法により達成してもよい。本明細書では脱グリコシル化する場合、免疫グロブリン定常領域に結合している補体（Ｃｌｑ）は有意に減少した状態になり、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が減少または除去され、それによりインビボにおいて不必要な免疫応答を誘導しない。これに関連して、脱グリコシル化もしくはアグリコシル化免疫グロブリン定常領域は薬物担体という目的により一致している。従って免疫グロブリンＦｃ領域は、より具体的にはヒトＩｇＧ４から誘導されたアグリコシル化Ｆｃ領域、すなわちヒトＩｇＧ４由来のアグリコシル化Ｆｃ領域であってもよい。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒトの体内において抗原として機能し、かつ抗原に対する新しい抗体の産生などの望ましくない免疫応答を引き起こす場合がある非ヒト由来のＦｃ領域よりも好ましい。
【0099】
さらに本発明の免疫グロブリン定常領域は、天然のアミノ酸配列だけではなくその配列誘導体（突然変異体）も含む。アミノ酸配列誘導体は、それが１つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、保存もしくは非保存置換またはそれらの組み合わせにより野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有することを意味する。例えば結合のために重要であることが知られているＩｇＧ Ｆｃ中の２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２または３２７～３３１位にあるアミノ酸残基は、修飾のために好適な部位として使用してもよい。ジスルフィド結合を形成することができる部位を除去するか、天然のＦｃからいくつかのＮ末端アミノ酸を除去するか、あるいはメチオニンを天然のＦｃのＮ末端に付加することにより調製される誘導体などの様々な誘導体を使用してもよい。さらに補体結合部位、例えばＣｌｑ結合部位またはＡＤＣＣ部位を除去してエフェクター機能を取り除いてもよい。免疫グロブリン定常領域の配列誘導体を調製する技術は、国際特許公報の国際公開第９７／３４６３１号および国際公開第９６／３２４７８号に開示されている。
【0100】
当該分子の活性を変化させないタンパク質もしくはペプチド分子におけるアミノ酸置換は当該技術分野でよく知られている（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９７９）。最も一般的な置換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｎａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙ間で両方向に生じる。任意にアミノ酸は、リン酸化、硫酸化、アクリル化（ａｃｒｙｌａｔｉｏｎ）、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化またはアミド化などにより修飾されていてもよい。
【0101】
上記免疫グロブリン定常領域誘導体は、本発明の免疫グロブリン定常領域と同等の生物活性を有するが、熱、ｐＨなどに対する免疫グロブリン定常領域の向上した構造的安定性を有する誘導体であってもよい。さらに免疫グロブリン定常領域は、ヒトまたはウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物から単離された天然の種類から得てもよく、あるいは形質転換された動物細胞または微生物から得られたそれらの組換え型または誘導体であってもよい。本明細書では、それらは全免疫グロブリンをヒトまたは動物生物から単離し、かつそれらをタンパク分解酵素で処理することにより天然の免疫グロブリンから得てもよい。パパインは天然の免疫グロブリンを消化してＦａｂおよびＦｃ領域にし、ペプシン処理によりｐＦ’ｃおよびＦ（ａｂ）２断片が生成される。これらの断片を例えばサイズ排除クロマトグラフィに供してＦｃまたはｐＦ’ｃを単離してもよい。
【0102】
好ましくは、ヒト由来の免疫グロブリン定常領域は微生物から得られる組換え免疫グロブリン定常領域であってもよい。
【0103】
本発明のタンパク質複合体は、［生理活性ポリペプチド／非ペプチジルポリマー／免疫グロブリンＦｃ領域］の単位構造の１つ以上を含んでいてもよく、ここでは全ての構成要素は共有結合により直線状に結合されていてもよい。非ペプチジルポリマーはその両端に反応基を有していてもよく、かつ生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域にそれぞれ反応基を介して共有結合により結合されている。すなわち、生理活性ポリペプチドおよび非ペプチジルポリマーの少なくとも１つのコンジュゲートは１つの免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合により結合されており、それにより免疫グロブリンＦｃ領域によって媒介されている生理活性ポリペプチドの単量体、二量体または多量体を形成している。従って、インビボ活性および安定性の向上はより有効に達成することができる。
【0104】
非ペプチジルポリマーの両端にある反応基は、好ましくは反応性アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体からなる群から選択される。スクシンイミド誘導体は、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル、吉草酸スクシンイミジル、メチルブタン酸スクシンイミジル、メチルプロピオン酸スクシンイミジル、ブタン酸スクシンイミジル、プロピオン酸スクシンイミジル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドまたは炭酸スクシンイミジルであってもよい。特に非ペプチジルポリマーが両端に反応性アルデヒド基を有する場合、それは最小の非特異的反応によりその端部の両方を生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンと結合させるのに有効である。アルデヒド結合による還元的アルキル化によって生成された最終生成物は、アミド結合により結合された場合よりもさらに安定である。
【0105】
本発明の非ペプチジルポリマーの両端にある反応基は互いに同じであっても異なっていてもよい。非ペプチドポリマーは両端にアルデヒド反応基を有していてもよく、あるいは一端にアルデヒド基および他端にマレイミド反応基または一端にアルデヒド基および他端にスクシンイミド反応基を有していてもよいが、それらに限定されない。
【0106】
例えば非ペプチドポリマーは、一端にマレイミド基および他端にアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を有していてもよい。また非ペプチドポリマーは、一端にスクシンイミジル基および他端にプロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を有していてもよい。その両端に反応性ヒドロキシ基を有するポリエチレングリコールを非ペプチジルポリマーとして使用する場合、ヒドロキシ基は公知の化学反応により様々な反応基に対して活性化されてもよく、あるいは修飾された反応基を有する市販されているポリエチレングリコールを本発明のタンパク質複合体を調製するために使用してもよい。
【0107】
生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチジルポリマーを介して結合されている場合、非ペプチジルポリマーの端部の両方のそれぞれが、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端および生理活性ポリペプチドのリジン残基、ヒスチジン残基またはシステイン残基のＮ末端（アミノ末端）、Ｃ末端（カルボキシ末端）または遊離反応基に結合してもよい。
【0108】
本明細書で使用される「Ｎ末端」という用語はペプチドのＮ末端を指し、ここは本発明の目的のために非ペプチジルポリマーを含むリンカーを結合させることができる部位である。Ｎ末端の例としては、Ｎ末端の遠位端にあるアミノ酸残基だけでなくＮ末端の近くにあるアミノ酸残基も挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、遠位端から１番目～２０番目のアミノ酸残基を含めてもよい。
【0109】
本発明の非ペプチジルポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸）およびＰＬＧＡ（ポリ乳酸－グリコール酸）などの生分解性ポリマー、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸およびそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよく、特にポリエチレングリコールであるが、それらに限定されない。当該技術分野でよく知られており、かつ当該技術分野の技量の範囲内で容易に調製されるその誘導体も本発明の非ペプチジルポリマーに含められる。非ペプチジルポリマーは１ｋＤａ～１００ｋＤａ、特に１ｋＤａ～２０ｋＤａの範囲の分子量を有していてもよい。
【0110】
本発明の生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、インターロイキン、インターロイキン結合タンパク質、酵素、抗体、増殖因子、転写因子、血液因子、ワクチン、構造タンパク質、リガンドタンパク質または受容体、細胞表面抗原、受容体拮抗薬およびそれらの誘導体または類似体などの様々な生理活性ポリペプチドによって例示することができる。
【0111】
具体的には、生理活性ポリペプチドとしては、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロンおよびインターフェロン受容体（例えば、インターフェロン－α、－βおよび－γ、可溶性１型インターフェロン受容体）、コロニー刺激因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン－１、－２、－３、－４、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－１３、－１４、－１５、－１６、－１７、－１８、－１９、－２０、－２１、－２２、－２３、－２４、－２５、－２６、－２７、－２８、－２９、－３０など）およびインターロイキン受容体（例えばＩＬ－１受容体、ＩＬ－４受容体など）、酵素（例えば、グルコセレブロシダーゼ、イズロネート－２－スルファターゼ、α－ガラクトシダーゼ－Ａ、アガルシダーゼα，β、α－Ｌ－イズロニダーゼ、ブチリルコリンエステラーゼ、キチナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、イミグルセラーゼ、リパーゼ、ウリカーゼ、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ、中性エンドペプチダーゼ、ミエロペルオキシダーゼなど）、インターロイキンおよびサイトカイン結合タンパク質（例えば、ＩＬ－１８ｂｐ、ＴＮＦ結合タンパク質など）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー阻害物質、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、形質転換増殖因子、α－１抗トリプシン、アルブミン、α－ラクトアルブミン、アポリポタンパク質－Ｅ、エリスロポエチン、グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸおよびＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、表皮増殖因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨増殖因子、骨刺激タンパク質、カルシトニン、インスリン、オキシントモジュリン、グルカゴン、グルカゴン誘導体、グルカゴン様ペプチド、エキセンディン（エキセンディン－４）、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路インヒビター、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、軸索形成因子－１、脳性ナトリウム利尿ペプチド、グリア細胞株由来神経栄養因子、ネトリン、好中球阻害因子、神経栄養因子、ニュールツリンなど）、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様増殖因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オータキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体（例えば、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ－１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性化因子受容体など）、受容体拮抗薬（例えば、ＩＬｌ－Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｄ）ならびにウイルス由来ワクチン抗原が挙げられる。
【0112】
具体的には、本発明の生理活性ポリペプチドは顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンまたはそれらの修飾型であってもよい。好ましい実施形態では、当該ポリペプチドはＧ－ＣＳＦである。
【0113】
本発明では、抗体断片は特異的な抗原に結合する能力を有するＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、ＦｄまたはｓｃＦｖであってもよく、好ましくはＦａｂ’である。Ｆａｂ断片は軽鎖の可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）と重鎖の可変領域（ＶＨ）および第１の定常領域（ＣＨ１）とを含む。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端にあるヒンジ領域からの１つ以上のシステイン残基を含むいくつかのアミノ酸残基の付加の点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆｄ断片はＶＨおよびＣＨ１ドメインのみからなる断片であり、Ｆ（ａｂ’）２断片はジスルフィド結合または化学反応のいずれかによりＦａｂ’断片の２つの分子の結合により生成される。ｓｃＦｖ断片は、ＶＬおよびＶＨドメインのみがペプチドリンカーにより互いに結合されている単一のポリペプチド鎖である。
【0114】
さらに本発明のタンパク質複合体は、ウシの成長ホルモンまたはブタの成長ホルモンなどの動物成長ホルモンの長時間作用性タンパク質製剤およびインターフェロンなどの動物疾患の治療または予防のための長時間作用性タンパク質製剤の開発において使用してもよい。
【0115】
本発明の別の態様は本発明のタンパク質複合体を調製する方法を提供する。特に本発明は、（ａ）両端に反応基を有する少なくとも１つの非ペプチジルポリマー、少なくとも１つの生理活性ポリペプチドおよび少なくとも１つの免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により結合させてタンパク質複合体を調製する工程、および（ｂ）非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合されている状態で共有結合させた生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域を本質的に含む（ａ）で調製したタンパク質複合体を単離する工程を含む、位置特異的タンパク質複合体を調製する方法を提供する。
【0116】
本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、二量体の形態またはホモ二量体もしくはヘテロ二量体の形態であってもよい。従って、本発明のタンパク質複合体を構成している免疫グロブリンＦｃ領域は１つまたは２つ以上のＮ末端を含んでいてもよい。従って免疫グロブリンＦｃ領域は、Ｎ末端を介して少なくとも１つの非ペプチジルポリマーに結合されていてもよい。特に本発明の免疫グロブリンＦｃ領域はホモ二量体の形態であってもよく、従って免疫グロブリンＦｃ領域のホモ二量体に含まれている２つのＮ末端を介して１つまたは２つの非ペプチジルポリマーに結合されている。この点に関しては、非ペプチジルポリマーはそれぞれ生理活性ポリペプチドに結合し、それにより本タンパク質複合体を形成してもよい。
【0117】
従って本発明のタンパク質複合体は、１つまたは２つ以上の非ペプチジルポリマー、１つまたは２つ以上の生理活性ポリペプチドおよび１つまたは２つ以上の免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合により結合させることにより調製してもよい。
【0118】
工程（ａ）では、３つの構成要素間の共有結合は連続的または同時に生じてもよい。例えば、生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域がそれぞれ非ペプチジルポリマーの両端に結合されている場合、生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域のいずれか一方を最初に非ペプチジルポリマーの一端に結合させてもよく、次いで他方を非ペプチジルポリマーの他端に結合させてもよい。この方法は、所望のタンパク質複合体以外の副生成物の生成が最小限に抑えられ、かつ本タンパク質複合体が高純度で調製されるという点で有利である。
【0119】
従って工程（ａ）は、
（ｉ）免疫グロブリンＦｃ領域の特異的部位または生理活性ポリペプチドを非ペプチジルポリマーの一端に共有結合により結合させること、
（ｉｉ）反応混合物からのコンジュゲートであって、免疫グロブリンＦｃ領域の特異的部位または生理活性ポリペプチドを非ペプチジルポリマーに結合させることにより調製したコンジュゲートを均一に単離すること、
（ｉｉｉ）生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域の特異的部位を単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端に結合させてタンパク質複合体を生成すること
を含んでもよい。
（ｉ）免疫グロブリンＦｃ領域の特異的部位または生理活性ポリペプチドを非ペプチジルポリマーの一端に共有結合により結合させること、
（ｉｉ）反応混合物からのコンジュゲートであって、免疫グロブリンＦｃ領域の特異的部位または生理活性ポリペプチドを非ペプチジルポリマーに結合させることにより調製したコンジュゲートを均一に単離すること、
（ｉｉｉ）生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域の特異的部位を単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端に結合させてタンパク質複合体を生成すること
を含んでもよい。
【0120】
一方、本発明において工程（ａ）は、（ａ１）非ペプチジルポリマーの一端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちのいずれか一方に共有結合により結合させてコンジュゲートを調製すること、および（ａ２）工程（ａ１）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域のうちの他方に共有結合により結合させること
を含む。
を含む。
【0121】
具体的には、工程（ａ）は、（ａ１’）非ペプチジルポリマーの一端を免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合により結合させてコンジュゲートを調製すること、および（ａ２’）（ａ１’）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を生理活性ポリペプチドに共有結合により結合させることを含んでもよい。
【0122】
あるいは工程（ａ）は、（ａ１’’）非ペプチジルポリマーの一端を生理活性ポリペプチドに共有結合により結合させてコンジュゲートを調製すること、および（ａ２’’）工程（ａ１’’）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合により結合させることを含んでもよい。
【0123】
本発明の工程（ａ１）（ａ１’）または（ａ１’’）では、生理活性ポリペプチドと非ペプチジルポリマーとの反応モル比は１：１～１：３０の範囲であってもよく、かつ免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチジルポリマーとの反応モル比は１：１～１：２０の範囲であってもよい。
【0124】
具体的には工程（ａ１’）では、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチジルポリマーとの反応モル比は、１：１～１：２０の範囲、特に１：１～１：１５、１：１～１：１０または１：１～１：４の範囲であってもよい。工程（ａ１’’）では、生理活性ポリペプチドと非ペプチジルポリマーとの反応モル比は１：１～１：３０の範囲、特に１：１～１：１５または１：１～１：１０の範囲であってもよい。調製収率およびコストは反応モル比に応じて最適化してもよい。
【0125】
本発明では、工程（ａ１）、（ａ１）または（ａ１’’）は４．０～９．０のｐＨ条件下で行ってもよく、工程（ａ１）、（ａ１’）または（ａ１’’）は４．０℃～２５℃の温度で行ってもよく、かつ工程（ａ１）（ａ１’）または（ａ１’’）では、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲であってもよい。
【0126】
本発明の工程（ａ２）、（ａ２’）または（ａ２’’）では、コンジュゲートと免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの反応モル比は、１：０．１～１：２０の範囲、特に１：０．２～１：１０の範囲であってもよい。具体的には工程（ａ２’）では、コンジュゲートと生理活性ポリペプチドとの反応モル比は１：０．１～１：２０の範囲であってもよく、かつ工程（ａ２’’）では、コンジュゲートと免疫グロブリンＦｃ領域との反応モル比は１：０．１～１：２０の範囲であってもよい。調製収率およびコストは反応モル比に応じて最適化してもよい。
【0127】
本発明では、工程（ａ２）、（ａ２’）または（ａ２’’）は４．０～９．０のｐＨ条件下で行ってもよく、工程（ａ２）、（ａ２’）または（ａ２’’）は４．０℃～２５℃の温度で行ってもよく、工程（ａ２）、（ａ２’）または（ａ２’’）では、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲であってもよい。
【0128】
一方、本発明の調製方法は、
（ａ’）非ペプチジルポリマーの一端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちのいずれか一方に共有結合により結合させてコンジュゲートを調製する工程であって、生理活性ポリペプチドと非ペプチジルポリマーとの反応モル比は１：１～１：３０の範囲内であり、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチジルポリマーとの反応モル比は１：１～１：２０の範囲内であり、還元剤は１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれており、当該反応を４．０～９．０のｐＨ条件下、４．０℃～２５℃の温度で行い、かつ免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲内である工程、
（ｂ’）工程（ａ’）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちの他方に共有結合により結合させる工程であって、コンジュゲートと免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの反応モル比は１：０．１～１：２０の範囲内であり、還元剤は１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれており、当該反応を４．０～９．０のｐＨ条件下、０℃～２５℃の温度で行い、かつ免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲内である工程、および
（ｃ’）限定されるものではないが非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合されている状態で共有結合させた生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域を本質的に含む工程（ｂ’）で調製したタンパク質複合体を単離する工程
を含む、位置特異的タンパク質複合体を調製する方法であってもよい。
（ａ’）非ペプチジルポリマーの一端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちのいずれか一方に共有結合により結合させてコンジュゲートを調製する工程であって、生理活性ポリペプチドと非ペプチジルポリマーとの反応モル比は１：１～１：３０の範囲内であり、免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチジルポリマーとの反応モル比は１：１～１：２０の範囲内であり、還元剤は１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれており、当該反応を４．０～９．０のｐＨ条件下、４．０℃～２５℃の温度で行い、かつ免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの反応濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲内である工程、
（ｂ’）工程（ａ’）で調製したコンジュゲートを単離し、かつ単離したコンジュゲートの非ペプチジルポリマーの他端を免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドのうちの他方に共有結合により結合させる工程であって、コンジュゲートと免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドとの反応モル比は１：０．１～１：２０の範囲内であり、還元剤は１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれており、当該反応を４．０～９．０のｐＨ条件下、０℃～２５℃の温度で行い、かつ免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲内である工程、および
（ｃ’）限定されるものではないが非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合されている状態で共有結合させた生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域を本質的に含む工程（ｂ’）で調製したタンパク質複合体を単離する工程
を含む、位置特異的タンパク質複合体を調製する方法であってもよい。
【0129】
本発明の工程（ａ１）、工程（ａ１’）、工程（ａ１’’）、工程（ａ２）、工程（ａ２’）および工程（ａ２’’）における反応は必要であれば、反応に関与する非ペプチジルポリマーの両端にある反応基の種類を考慮して還元剤の存在下で行ってもよい。本発明の還元剤はシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）、水素化ホウ素ナトリウム、ホウ酸ジメチルアミンまたはホウ酸ピリジンであってもよい。この点に関しては、還元剤（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム）の濃度、反応溶液の温度およびｐＨならびに当該反応に関与している生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域の総濃度は、生成収率および純度の点で重要である。高純度の均質な複合体の生成を最大化するために、当該条件の様々な組み合わせが必要とされる。調製される生理活性ポリペプチドの特徴に従って様々な条件が可能であり、限定されるものではないが、還元剤（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム）は１ｍＭ～１００ｍＭの範囲で含まれていてもよく、反応溶液は０℃～２５℃の温度および４．０～９．０のｐＨ条件下にあってもよく、かつ反応タンパク質の濃度（当該反応時に含まれる免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの濃度）は５ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬの範囲であってもよい。
【0130】
一方、工程（ａ２）、工程（ａ２’）および工程（ａ２’’）におけるコンジュゲートの分離は必要であれば、分離したコンジュゲートのために必要とされる純度、疎水性、分子量および電荷などの特性を考慮してタンパク質分離で使用される一般的な方法から選択される方法によって行ってもよい。例えばこの分離は、サイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィなどの様々な公知の方法を適用して行ってもよく、必要であれば複数の異なる方法を組み合わせで使用して、より高い純度でコンジュゲートを精製する。
【0131】
調製される生理活性ポリペプチドの特徴に従って様々な条件が可能である。但し、非ペプチジルポリマーに結合されている免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドコンジュゲートを分離するために、サイズ排除クロマトグラフィが一般に行われる。さらなるスケールアップおよび所望の位置以外の位置での非ペプチジルポリマーの結合によって生成される異性体または調製中に生成される少量の変性した形態の分離のために、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィも使用してもよい。
【0132】
本発明では、工程（ｂ）は必要であれば、最終的に高純度で複合体を精製するために疎水性、分子量および電荷などの特性を考慮して、タンパク質分離で使用される一般的な方法から選択される方法によって行ってもよい。例えばこの分離は、サイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィなどの様々な公知の方法を適用して行ってもよく、かつ必要であれば複数の異なる方法を組み合わせで使用して、より高い純度で複合体を精製する。生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよびＦｃ定常領域からなる所望の複合体の特徴に従って様々な分離条件が可能である。但し、生理活性ポリペプチドおよび免疫グロブリンＦｃ領域がそれぞれ非ペプチジルポリマーの両端に結合されている複合体を分離するために、サイズ排除クロマトグラフィが一般に行われる。さらなるスケールアップならびに所望の位置以外の位置での生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチジルポリマーとの結合によって生成される異性体もしくは副反応生成物または調製中に生成される少量の変性した形態、未反応の生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域の有効な分離のために、疎水性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィまたはアフィニティクロマトグラフィを組み合わせで使用してもよい。特に、疎水性クロマトグラフィおよびイオン交換クロマトグラフィを組み合わせで使用してもよく、複数の疎水性クロマトグラフィまたは複数のイオン交換クロマトグラフィも可能である。調製される複合体に従って、イオン交換クロマトグラフィまたは疎水性クロマトグラフィを単独で使用してもよい。
【0133】
本発明では、イオン交換クロマトグラフィは、帯電したタンパク質を帯電したイオン樹脂固定化クロマトグラフィカラムに特定のｐＨで通してタンパク質の移動速度の差によりタンパク質を分離することによりタンパク質を分離するものであり、それは陰イオン交換クロマトグラフィまたは陽イオン交換クロマトグラフィであってもよい。
【0134】
陰イオン交換クロマトグラフィは陽イオン樹脂を使用するものであり、対応する陰イオン交換クロマトグラフィを構成している樹脂の官能基は、第四級アンモニウム（Ｑ）、第４級アミノエチル（ＱＡＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレンアミン（ＰＥＩ）、ジメチルアミノメチル（ＤＭＡＥ）およびトリメチルアミノエチル（ＴＭＡＥ）からなる群から選択されるいずれか１つであってもよいが、それらに限定されない。
【0135】
さらに、陽イオン交換クロマトグラフィは陰イオン樹脂を使用ものであり、対応する陽イオン交換クロマトグラフィを構成している樹脂の官能基はメチルスルホン酸（Ｓ）、スルホプロピル（ＳＰ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）およびポリアスパラギン酸からなる群から選択されるいずれか１つであってもよいが、それらに限定されない。
【0136】
本発明では、疎水性クロマトグラフィを構成している樹脂の官能基はフェニル、オクチル、（イソ）プロピル、ブチルおよびエチルからなる群から選択されるいずれか１つであってもよいが、それらに限定されない。
【0137】
本発明では、サイズ排除クロマトグラフィを構成している樹脂の官能基はＳｕｐｅｒｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ、ＳｕｐｅｒｐｏｓｅおよびＳｅｐｈａｄｅｘからなる群から選択されるいずれか１つであってもよいが、それらに限定されない。
【0138】
さらに本発明におけるアフィニティクロマトグラフィは、リガンドが固定化されている樹脂においてタンパク質とそのタンパク質と相互作用することができるリガンドとの相互作用によって生じるタンパク質の移動速度の差によってタンパク質を分離するものである。アフィニティクロマトグラフィを構成している樹脂の官能基は、タンパク質Ａ、ヘパリン、ブルー、ベンズアミジン、金属イオン（コバルト、ニッケルおよび銅）、および非ペプチジルポリマーの両端が免疫グロブリンＦｃ領域および生理活性ポリペプチドにそれぞれ結合されているタンパク質複合体の構成要素の全体および一部に対する抗体からなる群から選択されるいずれか１つであってもよいが、それらに限定されない。
【0139】
本発明では工程（ｂ）は、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端を介して互いに結合されているタンパク質複合体を単離するものである。
【0140】
本発明のさらに別の態様は、９０％以上のＮ末端選択性を有するタンパク質複合体を調製するための方法を提供する。具体的には、本発明の方法によって調製されるタンパク質複合体は、非ペプチジルポリマーの一端を、限定されるものではないが９０％以上、より詳細には９５％以上、さらにより詳細には９８％以上、なおさらにより詳細には９９％以上のＮ末端選択性で免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に結合させることができるものであればよい。
【0141】
本明細書で使用される「９０％以上のＮ末端選択性で結合させる」という用語は、本発明に係る一連の反応によって得られたタンパク質複合体画分の精製により調製されるタンパク質複合体の９０％以上において、非ペプチジルポリマーが位置特異的にＦｃ領域のＮ末端に結合されていることを意味する。本明細書で使用される「９０％以上」という用語はｖ／ｖ、ｗ／ｗおよびピーク／ピークを指してもよいが、特定の単位に限定されない。位置特異的にＦｃ領域のＮ末端に結合された非ペプチジルポリマーを含むタンパク質複合体の収率は、反応条件、非ペプチジルポリマーの反応器などによって異なってもよい。
【0142】
本発明の実施例では、９０％以上のＮ末端選択性を有するタンパク質複合体を、様々な生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよびＦｃ複合体の調製により本発明に係る方法によって調製することができることを確認した。
【0143】
本医薬組成物は、限定されるものではないが９０％以上、より詳細には９５％以上、さらにより詳細には９８％以上、なおさらにより詳細には９９％以上の量で生理活性ポリペプチド－非ペプチジルポリマー－免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端を含むタンパク質複合体を含んでいてもよい。本明細書で使用される「９０％以上」という用語はｖ／ｖ、ｗ／ｗおよびピーク／ピークを指してもよいが、特定の単位に限定されない。
【0144】
本医薬組成物は薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでいてもよい。
【0145】
本発明の医薬組成物は経口、経皮、皮下、静脈内および筋肉内経路などの様々な経路を介して、好ましくは注射製剤の形態で投与してもよい。さらに本発明の医薬組成物は、哺乳類へのその投与後に有効成分の速放、持続放出または遅延放出を提供するために当該技術分野で知られている方法によって製剤化してもよい。当該製剤は錠剤、丸剤、粉末、小袋、エリキシル剤、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ、エアロゾル、軟もしくは硬ゼラチンカプセル、無菌注射溶液または無菌粉末であってもよい。好適な担体、賦形剤および希釈液の例としてはラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられる。本医薬組成物は充填剤、抗凝固剤、滑沢剤、湿潤剤、着香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでいてもよい。
【0146】
本発明のタンパク質複合体の実際の投与用量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の年齢、性別、体重および疾患の重症度ならびに有効成分としての生理活性ポリペプチドの種類などのいくつかの関連因子によって決定してもよい。本発明のタンパク質複合体は優れた血中持続時間およびインビボ効力を有するので、本発明のタンパク質複合体を含むペプチド薬物の投与用量および頻度を著しく減少させることができる。
【0147】
本発明のさらに別の態様は、９０％以上の量で上記方法に従って調製されるタンパク質複合体を含むタンパク質複合体の集団を提供する。本明細書で使用される「複合体の集団」および「集団」という用語は同義で使用することができ、非ペプチジルポリマーがＦｃ領域のＮ末端に結合されているタンパク質複合体および／または非ペプチジルポリマーがＦｃ領域のＮ末端以外の領域に結合されているタンパク質複合体を含むタンパク質複合体群を指す。
【0148】
当該集団は、非ペプチジルポリマーがＦｃ領域のＮ末端に結合されているタンパク質複合体または非ペプチジルポリマーがＦｃ領域のＮ末端以外の領域に結合されているタンパク質複合体のみを含んでいてもよい。具体的には、当該集団に含まれている非ペプチジルポリマーがＦｃ領域のＮ末端以外の領域に結合されているタンパク質複合体の割合は９０％以上、より詳細には９５％以上、さらにより詳細には９８％以上、なおさらにより詳細には９９％以上であってもよいが、それらに限定されない。本明細書で使用される「９０％以上」という用語はｖ／ｖ、ｗ／ｗおよびピーク／ピークを指してもよいが、特定の単位に限定されない。
【0149】
本発明の目的のために当該集団は、不純物、未反応物質などをその調製されるタンパク質複合体から除去することにより、非ペプチジルポリマーがＦｃ領域のＮ末端以外の領域に結合されているタンパク質複合体を増加した割合で含む集団を指してもよい。さらに当該集団は、限定されるものではないが９０％以上のＮ末端選択性を有するタンパク質複合体を調製するための方法によって調製されたものを指してもよい。当該集団は本発明の方法によって効率的に精製してもよい。
【0150】
本発明は特に、非ペプチジルポリマーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合させた修飾されたヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）を含む治療的有効量のタンパク質複合体を患者に投与することによる、患者の白血球生成、すなわちその数の上昇を必要としているか幹細胞生成を増加させることを必要としている、それを必要とする患者の予防、軽減または治療における上記タンパク質複合体の使用であって、非ペプチジルポリマーが免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に部位特異的に結合されており、かつ修飾されたｈＧ－ＣＳＦがＣｙｓ１７およびＰｒｏ６５のうちの少なくとも１つに置換を含む上記タンパク質複合体の使用に関する。そのような方法論は、ドセタキセル、ドキソルビシン、シクロホスファミド（ＴＡＣ）、ドーズ・デンスドキソルビシン＋シクロホスファミド（ＡＣ）（その後の週１回もしくは週２回のパクリタキセルを含む場合と含まない場合）およびドセタキセル＋シクロホスファミド（ＴＣ）を含む化学療法剤またはレジメンとの組み合わせであってもそうでなくもよい。それにも関わらず、本発明に記載されている方法論は、そのようなレジメンを受けている患者に優れた臨床および副作用結果を与える。好ましい実施形態では、エフラペグラスチムを１３．２ｍｇ／０．６ｍＬ（３．６ｍｇのＧ－ＣＳＦを含有）の一定用量で投与する。一実施形態では、ＴＣを各サイクルの１日目に静脈内（ＩＶ）に投与する。従ってドセタキセルを７５ｍｇ／ｍ２でＩＶ注入により投与し、かつ（ｉｉ）シクロホスファミドを６００ｍｇ／ｍ２でＩＶ注入により投与する。各治療サイクルは２１日であり、最大４サイクルの化学療法を行う。あらゆるサイクルの１日目（前のサイクルの２２日目）にフルドーズ化学療法を開始するために、患者はＡＮＣ≧１．５×１０９／Ｌおよび血小板数≧１００×１０９／Ｌを示さなければならない。他の実施形態では、各サイクルの２日目、すなわちＴＣ化学療法から約２４時間（±２時間）後にエフラペグラスチムを投与してもよい。
【0151】
ここに提供されている実施例は単に例示のためのものであり、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【0152】
実施例１：インターフェロンα（ＩＦＮα）－ＰＥＧ－免疫グロブリンＦｃのＮ末端領域の複合体の調製
【0153】
１－１ ＩＦＮα－ＰＥＧコンジュゲートの調製
３．４ｋＤａの分子量およびその両端にアルデヒド反応基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（ＩＤＢ社、韓国）を１００ｍＭのリン酸緩衝液に溶解した５ｍｇ／ｍＬのヒトインターフェロンα－２ｂ（ｈＩＦＮα－２ｂ、分子量：１９ｋＤａ）に１：５～１：１０のｈＩＦＮα：ＰＥＧのモル比で添加した。そこに還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ、Ｓｉｇｍａ社）を２０ｍＭの最終濃度で添加し、ゆっくり撹拌しながら４℃～８℃で約１時間反応させた。ＰＥＧがインターフェロンαのアミノ末端に選択的に結合されており、かつＰＥＧおよびインターフェロンαが１：１の比で互いに結合されているコンジュゲートを得るために、反応混合物をＳＰ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陰イオン交換クロマトグラフィに供して高純度でＩＦＮα－ＰＥＧコンジュゲートを精製した。
３．４ｋＤａの分子量およびその両端にアルデヒド反応基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（ＩＤＢ社、韓国）を１００ｍＭのリン酸緩衝液に溶解した５ｍｇ／ｍＬのヒトインターフェロンα－２ｂ（ｈＩＦＮα－２ｂ、分子量：１９ｋＤａ）に１：５～１：１０のｈＩＦＮα：ＰＥＧのモル比で添加した。そこに還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ、Ｓｉｇｍａ社）を２０ｍＭの最終濃度で添加し、ゆっくり撹拌しながら４℃～８℃で約１時間反応させた。ＰＥＧがインターフェロンαのアミノ末端に選択的に結合されており、かつＰＥＧおよびインターフェロンαが１：１の比で互いに結合されているコンジュゲートを得るために、反応混合物をＳＰ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陰イオン交換クロマトグラフィに供して高純度でＩＦＮα－ＰＥＧコンジュゲートを精製した。
【0154】
１－２ ＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体の調製
実施例１－１で精製したＩＦＮα－ＰＥＧコンジュゲートを免疫グロブリンＦｃのＮ末端プロリン残基に結合させるために、免疫グロブリンＦｃ断片を１：１～１：４のＩＦＮα－ＰＥＧコンジュゲート：免疫グロブリンＦｃのモル比で添加して反応させた。反応溶液を１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）として調製し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ、Ｓｉｇｍａ社）を２０ｍＭ～５０ｍＭの最終濃度で還元剤として添加した。それらをゆっくり撹拌しながら４℃～８℃で約１２時間～１６時間反応させた。
実施例１－１で精製したＩＦＮα－ＰＥＧコンジュゲートを免疫グロブリンＦｃのＮ末端プロリン残基に結合させるために、免疫グロブリンＦｃ断片を１：１～１：４のＩＦＮα－ＰＥＧコンジュゲート：免疫グロブリンＦｃのモル比で添加して反応させた。反応溶液を１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）として調製し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ、Ｓｉｇｍａ社）を２０ｍＭ～５０ｍＭの最終濃度で還元剤として添加した。それらをゆっくり撹拌しながら４℃～８℃で約１２時間～１６時間反応させた。
【0155】
１－３ ＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体の単離および精製
実施例１－２の結合反応の後に未反応物質および副生成物を除去し、かつこのようにして生成したＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を精製するために、反応混合物を１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）に緩衝液交換し、次いでＳｏｕｒｃｅ Ｑ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陰イオン交換クロマトグラフィカラムに通して未反応Ｆｃを除去してＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分を得た。詳細には、反応溶液を１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で平衡化させたＳｏｕｒｃｅ Ｑカラムに注加し、このカラムを５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液を用いるイソクラティック溶媒洗浄に供して不純物を除去した。次いで、ＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する緩衝液の濃度勾配により溶離した。得られたＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分中には少量の未反応Ｆｃおよびインターフェロンα二量体が不純物として存在していた。それらの不純物を除去するために、Ｓｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）疎水性クロマトグラフィをさらに行った。詳細には、Ｓｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）を約１．３Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）緩衝液で平衡化させ、次いでそこに精製したＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分を注加した。最後に、高純度ＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）緩衝液の直線濃度勾配により精製した。調製したＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体のＦｃ領域のＮ末端選択性をペプチドマッピングにより調べ、その選択性が９０％以上であることが分かった。
実施例１－２の結合反応の後に未反応物質および副生成物を除去し、かつこのようにして生成したＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を精製するために、反応混合物を１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）に緩衝液交換し、次いでＳｏｕｒｃｅ Ｑ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陰イオン交換クロマトグラフィカラムに通して未反応Ｆｃを除去してＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分を得た。詳細には、反応溶液を１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で平衡化させたＳｏｕｒｃｅ Ｑカラムに注加し、このカラムを５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液を用いるイソクラティック溶媒洗浄に供して不純物を除去した。次いで、ＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する緩衝液の濃度勾配により溶離した。得られたＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分中には少量の未反応Ｆｃおよびインターフェロンα二量体が不純物として存在していた。それらの不純物を除去するために、Ｓｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）疎水性クロマトグラフィをさらに行った。詳細には、Ｓｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）を約１．３Ｍの硫酸アンモニウムを含有する２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）緩衝液で平衡化させ、次いでそこに精製したＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分を注加した。最後に、高純度ＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）緩衝液の直線濃度勾配により精製した。調製したＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体のＦｃ領域のＮ末端選択性をペプチドマッピングにより調べ、その選択性が９０％以上であることが分かった。
【0156】
実施例２：ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体の調製
【0157】
天然のＧ－ＣＳＦの１７および６５位のアミノ酸をセリンに置き換えて調製した誘導体（１７，６５－Ｇ－ＣＳＦ）を用いて、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を調製し、次いで精製した。
【0158】
２－１ １７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲートの調製
３．４ｋＤａの分子量およびその両端にアルデヒド反応基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（ＩＤＢ社、韓国）を１００ｍＭのリン酸緩衝液に溶解した５ｍｇ／ｍＬの１７，６５Ｓ－Ｇ－ＣＳＦ（分子量：１８ｋＤａ）に１：５～１：１０のＧ－ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比で添加した。そこに還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ、Ｓｉｇｍａ社）を２０ｍＭの最終濃度で添加し、ゆっくり撹拌しながら４℃～８℃で約１時間反応させた。ＰＥＧがヒト顆粒球コロニー刺激因子のアミノ末端に選択的に結合されており、かつＰＥＧおよびＧ－ＣＳＦが１：１の比で互いに結合されているコンジュゲートを得るために、反応混合物をＳＰ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陽イオン交換クロマトグラフィに供して、高純度で１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲートを精製した。
３．４ｋＤａの分子量およびその両端にアルデヒド反応基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（ＩＤＢ社、韓国）を１００ｍＭのリン酸緩衝液に溶解した５ｍｇ／ｍＬの１７，６５Ｓ－Ｇ－ＣＳＦ（分子量：１８ｋＤａ）に１：５～１：１０のＧ－ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比で添加した。そこに還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ、Ｓｉｇｍａ社）を２０ｍＭの最終濃度で添加し、ゆっくり撹拌しながら４℃～８℃で約１時間反応させた。ＰＥＧがヒト顆粒球コロニー刺激因子のアミノ末端に選択的に結合されており、かつＰＥＧおよびＧ－ＣＳＦが１：１の比で互いに結合されているコンジュゲートを得るために、反応混合物をＳＰ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陽イオン交換クロマトグラフィに供して、高純度で１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲートを精製した。
【0159】
２－２ １７，６５Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体の調製
実施例３－１で精製した１７，６５Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲートを免疫グロブリンＦｃのＮ末端に結合させるために、免疫グロブリンＦｃ断片を１：１～１：４の１７，６５Ｓｅｒ－Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲート：免疫グロブリンＦｃのモル比で添加して反応させた。反応溶液を１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）として調製し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３、Ｓｉｇｍａ社）を２０ｍＭの最終濃度で還元剤として添加した。これらをゆっくり撹拌しながら４℃～８℃反応させた。
実施例３－１で精製した１７，６５Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲートを免疫グロブリンＦｃのＮ末端に結合させるために、免疫グロブリンＦｃ断片を１：１～１：４の１７，６５Ｓｅｒ－Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲート：免疫グロブリンＦｃのモル比で添加して反応させた。反応溶液を１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）として調製し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３、Ｓｉｇｍａ社）を２０ｍＭの最終濃度で還元剤として添加した。これらをゆっくり撹拌しながら４℃～８℃反応させた。
【0160】
２－３ １７，６５Ｓｅｒ－Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ（または１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ）複合体の単離および精製
実施例３－２の結合反応後に未反応物質および副生成物を除去し、かつこのようにして生成した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を精製するために、反応混合物を２ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に緩衝液交換し、次いでＳｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌカラムに通した。不純物を除去するために、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液の濃度勾配により精製した。得られた１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分中には少量の未反応免疫グロブリンＦｃおよび１７，６５Ｇ－ＣＳＦ二量体が不純物として存在していた。それらの不純物を除去するために、Ｑ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陰イオンクロマトグラフィをさらに行った。Ｑ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液で平衡化させ、次いでそこに精製した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分を注加した。最後に高純度１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を、１Ｍの塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液の直線濃度勾配により精製した。調製した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体のＦｃ領域のＮ末端選択性をペプチドマッピングにより調べ、その選択性が９０％以上であることが分かった。
実施例３－２の結合反応後に未反応物質および副生成物を除去し、かつこのようにして生成した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を精製するために、反応混合物を２ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に緩衝液交換し、次いでＳｏｕｒｃｅ Ｐｈｅｎｙｌカラムに通した。不純物を除去するために、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液の濃度勾配により精製した。得られた１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分中には少量の未反応免疫グロブリンＦｃおよび１７，６５Ｇ－ＣＳＦ二量体が不純物として存在していた。それらの不純物を除去するために、Ｑ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陰イオンクロマトグラフィをさらに行った。Ｑ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液で平衡化させ、次いでそこに精製した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分を注加した。最後に高純度１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を、１Ｍの塩化ナトリウムを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液の直線濃度勾配により精製した。調製した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体のＦｃ領域のＮ末端選択性をペプチドマッピングにより調べ、その選択性が９０％以上であることが分かった。
【0161】
実施例３：異なる反応基を有するＰＥＧを用いたタンパク質複合体の調製
【0162】
３－１ １７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲートの調製
３．４ｋＤａの分子量およびその両端にα－メチルブタン酸スクシンイミジル（ＳＭＢ）反応基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるＳＭＢ－ＰＥＧ－ＳＭＢ（Ｎｅｋｔａｒ社、米国）を、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬの１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ（分子量１８ｋＤａ）に１：３のＧ－ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比で添加し、ゆっくりと撹拌しながら室温で約３０分間反応させた。ＰＥＧが１７，６５ＳＧ－ＣＳＦのアミノ末端に選択的に結合されており、かつＰＥＧおよび１７，６５ＳＧ－ＣＳＦが１：１の比で互いに結合されているコンジュゲートを得るために、反応混合物をＳＰ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陽イオン交換クロマトグラフィに供した。
３．４ｋＤａの分子量およびその両端にα－メチルブタン酸スクシンイミジル（ＳＭＢ）反応基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であるＳＭＢ－ＰＥＧ－ＳＭＢ（Ｎｅｋｔａｒ社、米国）を、２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した１０ｍｇ／ｍＬの１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ（分子量１８ｋＤａ）に１：３のＧ－ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比で添加し、ゆっくりと撹拌しながら室温で約３０分間反応させた。ＰＥＧが１７，６５ＳＧ－ＣＳＦのアミノ末端に選択的に結合されており、かつＰＥＧおよび１７，６５ＳＧ－ＣＳＦが１：１の比で互いに結合されているコンジュゲートを得るために、反応混合物をＳＰ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陽イオン交換クロマトグラフィに供した。
【0163】
３－２ １７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体の調製
実施例７－１において精製した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲートを免疫グロブリンＦｃのＮ末端以外の領域に結合させるために、免疫グロブリンＦｃ断片を１：４～１：８の１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲート：免疫グロブリンＦｃのモル比で添加して反応させた。これらを２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）中でゆっくりと撹拌しながら室温で約２時間反応させた。
実施例７－１において精製した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲートを免疫グロブリンＦｃのＮ末端以外の領域に結合させるために、免疫グロブリンＦｃ断片を１：４～１：８の１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧコンジュゲート：免疫グロブリンＦｃのモル比で添加して反応させた。これらを２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）中でゆっくりと撹拌しながら室温で約２時間反応させた。
【0164】
３－３ １７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体の単離および精製
実施例７－２の結合反応後に未反応物質および副生成物を除去し、かつこのようにして生成した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を精製するために、反応混合物をＱ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陰イオン交換クロマトグラフィカラムに通し、このようにして未結合Ｆｃを除去し、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分を得た。この反応溶液を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液で平衡化させたＱ ＨＰカラムに注加し、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する緩衝液の濃度勾配により精製した。得られた１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分中には少量の未反応の免疫グロブリンＦｃおよび１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ二量体が不純物として存在していた。これらの不純物を除去するために、Ｓｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）疎水性クロマトグラフィをさらに行った。最後にＳｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）を用いて、高純度１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を１．２Ｍの硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液の直線濃度勾配により精製した。調製した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体のＦｃ領域のＮ末端選択性をペプチドマッピングにより調べ、その選択性が９０％以上であることが分かった。
実施例７－２の結合反応後に未反応物質および副生成物を除去し、かつこのようにして生成した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を精製するために、反応混合物をＱ ＨＰ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陰イオン交換クロマトグラフィカラムに通し、このようにして未結合Ｆｃを除去し、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分を得た。この反応溶液を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）緩衝液で平衡化させたＱ ＨＰカラムに注加し、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する緩衝液の濃度勾配により精製した。得られた１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体画分中には少量の未反応の免疫グロブリンＦｃおよび１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ二量体が不純物として存在していた。これらの不純物を除去するために、Ｓｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）疎水性クロマトグラフィをさらに行った。最後にＳｏｕｒｃｅ ｉｓｏ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）を用いて、高純度１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を１．２Ｍの硫酸アンモニウムを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）緩衝液の直線濃度勾配により精製した。調製した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体のＦｃ領域のＮ末端選択性をペプチドマッピングにより調べ、その選択性が９０％以上であることが分かった。
【0165】
実施例４：異なる反応基を有するＰＥＧを用いたタンパク質複合体の調製
【0166】
本発明者らによって以前に提出された韓国特許出願第１０－２０１２－０１１１５３７号のＦａｃＶＩＩ誘導体であるＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣを用いて、ＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体を調製した。
【0167】
４－１ ＰＥＧ－Ｆｃ複合体の単離および精製
最初に、マレイミド－１０ｋＤａのＰＥＧ－アルデヒド（ＮＯＦ社、日本）のアルデヒド反応基を免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合させるために、免疫グロブリンＦｃ領域およびマレイミド－１０ｋＤａのＰＥＧ－アルデヒドを１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）中で１：１のモル比で混合し、そこに還元剤である２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３、Ｓｉｇｍａ社）を１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で添加した。それらを低い温度（４℃～８℃）で約２時間反応させた。モノペグ化免疫グロブリンＦｃ断片（マレイミド－１０ｋＤａのＰＥＧ－Ｆｃ）を得るために、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陰イオンクロマトグラフィを行い、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の塩化ナトリウムの濃度勾配により溶離を行った。
最初に、マレイミド－１０ｋＤａのＰＥＧ－アルデヒド（ＮＯＦ社、日本）のアルデヒド反応基を免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端に結合させるために、免疫グロブリンＦｃ領域およびマレイミド－１０ｋＤａのＰＥＧ－アルデヒドを１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５．５～６．５）中で１：１のモル比で混合し、そこに還元剤である２０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３、Ｓｉｇｍａ社）を１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で添加した。それらを低い温度（４℃～８℃）で約２時間反応させた。モノペグ化免疫グロブリンＦｃ断片（マレイミド－１０ｋＤａのＰＥＧ－Ｆｃ）を得るために、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）陰イオンクロマトグラフィを行い、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の塩化ナトリウムの濃度勾配により溶離を行った。
【0168】
４－２ ＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体の調製
Ｃ末端を還元するために０．５ｍＭ～２ｍＭのトリフェニルホスフィン－３，３’，３’’－トリスルホン酸トリナトリウム塩水和物を還元剤として添加して、ＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣを１０ｍＭのグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ５．５）中、室温で約２時間反応させた。Ｃ末端が還元されたＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣおよびモノペグ化免疫グロブリンＦｃ断片（マレイミド－１０ｋＤａのＰＥＧ－Ｆｃ）を１：４～１：２０のモル比で混合し、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中に１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度でこれらを室温で約２時間反応させた。
Ｃ末端を還元するために０．５ｍＭ～２ｍＭのトリフェニルホスフィン－３，３’，３’’－トリスルホン酸トリナトリウム塩水和物を還元剤として添加して、ＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣを１０ｍＭのグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ５．５）中、室温で約２時間反応させた。Ｃ末端が還元されたＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣおよびモノペグ化免疫グロブリンＦｃ断片（マレイミド－１０ｋＤａのＰＥＧ－Ｆｃ）を１：４～１：２０のモル比で混合し、５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中に１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度でこれらを室温で約２時間反応させた。
【0169】
４－３ ＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体の単離および精製
実施例８－２の反応溶液をＳｏｕｒｃｅ Ｑ陰イオンクロマトグラフィに供し、ＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣ－１０ｋＤａのＰＥＧ－Ｆｃ複合体を２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の塩化ナトリウムの濃度勾配により溶離した。ＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体のＦａｃＶＩＩを活性化させるために、この反応は０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８．０）中で約４ｍｇ／ｍＬのＦａｃＶＩＩの条件下、低温（４℃～８℃）で約１８時間行った。最後に、高純度ＦａｃＶＩＩａ－ＡＴＫＡＶＣ－ＰＥＧ－Ｆｃを１０ｍＭのグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ５．５）中にＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いるサイズ排除クロマトグラフィ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）により精製した。調製したＦａｃＶＩＩａ－ＡＴＫＡＶＣ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体のＦｃ領域のＮ末端選択性をペプチドマッピングにより調べ、その選択性が９０％以上であることが分かった。
実施例８－２の反応溶液をＳｏｕｒｃｅ Ｑ陰イオンクロマトグラフィに供し、ＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣ－１０ｋＤａのＰＥＧ－Ｆｃ複合体を２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）中の塩化ナトリウムの濃度勾配により溶離した。ＦａｃＶＩＩ－ＡＴＫＡＶＣ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体のＦａｃＶＩＩを活性化させるために、この反応は０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣ１緩衝液（ｐＨ８．０）中で約４ｍｇ／ｍＬのＦａｃＶＩＩの条件下、低温（４℃～８℃）で約１８時間行った。最後に、高純度ＦａｃＶＩＩａ－ＡＴＫＡＶＣ－ＰＥＧ－Ｆｃを１０ｍＭのグリシルグリシン緩衝液（ｐＨ５．５）中にＳｕｐｅｒｄｅｘ２００を用いるサイズ排除クロマトグラフィ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）により精製した。調製したＦａｃＶＩＩａ－ＡＴＫＡＶＣ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体のＦｃ領域のＮ末端選択性をペプチドマッピングにより調べ、その選択性が９０％以上であることが分かった。
【0170】
実施例５：異なる分子量を有するＰＥＧを用いたタンパク質複合体の調製
【0171】
実施例５－２と同じように、１０ｋＤａの分子量およびその両端にアルデヒド反応基を有するポリエチレングリコールであるＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ（Ｎｅｋｔａｒ社、米国）を使用してインスリン－１０ｋＤａのＰＥＧコンジュゲートを精製した。精製したインスリン－１０ｋＤａのＰＥＧコンジュゲートを約５ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮し、次いでこれを使用して実施例２－３と同じようにインスリン－１０ｋＤａのＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体を調製して精製した。
【0172】
実施例６：タンパク質複合体の純度の評価
【0173】
６－１ タンパク質複合体の識別
上記実施例で調製したタンパク質複合体を、４％～２０％勾配ゲルおよび１２％ゲルを用いる非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。免疫グロブリンＦｃおよび生理活性ポリペプチドに対する抗体を用いた個々のタンパク質複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析およびウェスタンブロット分析を行った。図１に示すように、カップリング反応によりＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ａ）、ｈＧＨ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｂ）、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｃ）、インスリン－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｄ）、ＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｅ）、ＣＡ－エキセンディン－４－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｆ）およびＦａｃＶＩＩ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｇ）の生成に成功した。
上記実施例で調製したタンパク質複合体を、４％～２０％勾配ゲルおよび１２％ゲルを用いる非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。免疫グロブリンＦｃおよび生理活性ポリペプチドに対する抗体を用いた個々のタンパク質複合体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析およびウェスタンブロット分析を行った。図１に示すように、カップリング反応によりＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ａ）、ｈＧＨ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｂ）、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｃ）、インスリン－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｄ）、ＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｅ）、ＣＡ－エキセンディン－４－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｆ）およびＦａｃＶＩＩ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｇ）の生成に成功した。
【0174】
６－２ タンパク質複合体の純度の評価
上記実施例で調製したタンパク質複合体、すなわちＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ａ）、ｈＧＨ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｂ）、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｃ）、インスリン－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｄ）、ＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｅ）およびＣＡ－エキセンディン－４－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｆ）をＨＰＬＣを用いて、サイズ排除クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィにそれぞれ供した。それらは各分析において９５％以上の高純度に対応する単一のピークを示した。
上記実施例で調製したタンパク質複合体、すなわちＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ａ）、ｈＧＨ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｂ）、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｃ）、インスリン－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｄ）、ＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｅ）およびＣＡ－エキセンディン－４－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｆ）をＨＰＬＣを用いて、サイズ排除クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィまたはイオン交換クロマトグラフィにそれぞれ供した。それらは各分析において９５％以上の高純度に対応する単一のピークを示した。
【0175】
６－３ タンパク質複合体の部位選択性の調査
実施例で調製したタンパク質複合体、すなわちＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ａ）、ｈＧＨ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｂ）、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｃ）、インスリン－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｄ）およびＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｅ）をそれぞれプロテアーゼを用いるペプチドマッピング分析（逆相クロマトグラフィ）に供した。９０％以上の高い選択性で免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端を介して結合されたタンパク質複合体が調製されたことを確認した。
実施例で調製したタンパク質複合体、すなわちＩＦＮα－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ａ）、ｈＧＨ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｂ）、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｃ）、インスリン－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｄ）およびＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ（Ｅ）をそれぞれプロテアーゼを用いるペプチドマッピング分析（逆相クロマトグラフィ）に供した。９０％以上の高い選択性で免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端を介して結合されたタンパク質複合体が調製されたことを確認した。
【0176】
実施例７：Ｆｃ結合位置に応じた複合体の有効性の比較
実施例で調製したタンパク質複合体、すなわちＣＡ－エキセンディン－４－ＰＥＧ－Ｆｃ、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－ＦｃおよびＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃをそれぞれインビトロおよびインビボ有効性試験に供した。以下の表に示すように、ＦｃのＮ末端（プロリン）への結合は他の領域（例えばリジン）への結合よりも良好な有効性を示した。
実施例で調製したタンパク質複合体、すなわちＣＡ－エキセンディン－４－ＰＥＧ－Ｆｃ、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－ＦｃおよびＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃをそれぞれインビトロおよびインビボ有効性試験に供した。以下の表に示すように、ＦｃのＮ末端（プロリン）への結合は他の領域（例えばリジン）への結合よりも良好な有効性を示した。
【表1】
【0177】
表１に示すように、ＣＡ－エキセンディン－ＰＥＧ－Ｆｃ位置異性体間のインビトロ活性の比較により、免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端への特異的結合により調製した本発明のＣＡ－エキセンディン－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体が免疫グロブリンＦｃ領域の別の位置への結合により調製したＣＡ－エキセンディン－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体よりも６倍高い効力を有することが分かった。
【表2】
【0178】
表２に示すように、１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－（Ｎ末端）－ＰＥＧ－（Ｎ末端）Ｆｃ－実験群Ｓ－Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ位置異性体間のインビトロ活性の比較により、免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端への特異的結合により調製した本発明の１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－（Ｎ末端）－ＰＥＧ－（Ｎ末端）Ｆｃ－実験群Ｓ－Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体が、免疫グロブリンＦｃ領域の別の位置への結合により調製した１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－（Ｎ末端）－ＰＥＧ－（Ｎ末端）Ｆｃ－実験群Ｓ－Ｇ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体と比較して約６７％上昇した力価を有することが分かった。
【0179】
一方、本発明のタンパク質複合体、特にＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ位置異性体のインビボ活性を調べるために正常赤血球マウスアッセイを行って、正常赤血球マウスへのＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃの皮下注射後に網状赤血球レベルを測定した。
【表3】
【0180】
表３に示すように、ＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ位置異性体間のインビボ活性の比較により、免疫グロブリンＦｃ断片のＮ末端への特異的結合により調製した本発明のＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体が、免疫グロブリンＦｃ領域の別の位置への結合により調製したＥＰＯ－ＰＥＧ－Ｆｃ複合体と比較して約４０％上昇した力価を有することが分かった。
【0181】
これらの結果は、生理活性ポリペプチド、非ペプチジルポリマーおよび免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質複合体を結合部位として免疫グロブリンＦｃ断片の特異的部位を用いて調製した場合に、当該タンパク質複合体が生理活性ポリペプチドの向上したインビボ活性を示すことを示唆している。
【0182】
実施例８：ドセタキセルおよびシクロホスファミド（ＴＣ）を受けている乳癌患者における化学療法誘発性好中球減少症の管理におけるペグフィルグラスチム（ＰＥＧＦＩＬＧＲＡＳＴＩＭ）に対する１７，６５ＳＧ－ＣＳＦ－ＰＥＧ－Ｆｃタンパク質複合体（エフラペグラスチム）の無作為化ヒト臨床試験
【0183】
ドセタキセルおよびシクロホスファミド（ＴＣ）によるアジュバントもしくはネオアジュバント化学療法の候補である乳癌を有する患者における一定用量のエフラペグラスチム（１３．２ｍｇ／０．６ｍＬ、３．６ｍｇのＧＣＳＦ当量）の有効性および安全性を評価するために、４０６人の患者において非盲検の実薬対照ヒト研究を行った。
【0184】
適格な患者を以下の２つの治療群、すなわち（ａ）エフラペグラスチム群：エフラペグラスチム１３．２ｍｇ／０．６ｍＬ（３．６ｍｇのＧ－ＣＳＦを含有）の一定用量、および（ｂ）ペグフィルグラスチム群：ペグフィルグラスチム６ｍｇ／０．６ｍＬ（６．０ｍｇのＧ－ＣＳＦを含有）の一定用量に１：１で無作為化した。従って、ＴＣを各サイクルの１日目に静脈内に（ＩＶ）投与し、すなわち（ｉ）実施医療機関の標準治療に従ってドセタキセルを７５ｍｇ／ｍ２でＩＶ注入し、（ｉｉ）実施医療機関の標準治療に従ってシクロホスファミドを６００ｍｇ／ｍ２でＩＶ注入した。各治療サイクルは２１日間であり、最大で４サイクルの化学療法を行った。任意のサイクルの１日目（前のサイクルの２２日目）にフルドーズ化学療法を開始するために、患者はＡＮＣ≧１．５×１０９／Ｌおよび血小板数≧１００×１０９／Ｌを有していなければならない。
【0185】
エフラペグラスチムまたはペグフィルグラスチムを各サイクルの２日目、すなわちＴＣ化学療法から約２４時間（±２時間）後に投与した。ペグフィルグラスチムを製造業者の処方情報（化学療法サイクルごとに皮下に６ｍｇを１回）に従って投与するものとした。
【0186】
全ての組み入れおよび除外基準を満たしている患者をエフラペグラスチム群またはペグフィルグラスチム群のいずれかに無作為化し、研究治療（ＴＣ）およびその後のエフラペグラスチムまたはペグフィルグラスチムのいずれかによる２４（±２）時間の治療を４サイクルで行った。研究治療薬の最後の投与から３５（±５）日目に、治療終了時（ＥＯＴ）来院を行った。サイクル１の間に、化学療法前の１日目および次いで４日目から１５日目まで、または好中球減少症から回復するまで毎日１回ＣＢＣ試料を採取した。サイクル２～４では、１日目の投与前および次いで４、７、１０および１５日目（各採取で±１日）にＣＢＣ試料を採取した。治療終了時来院の際にもＣＢＣを採取した。サイクル１において２日目、４日目および５日目、次いでサイクル３において２日目、４日目および７日目に、集団ＰＫのためにスパースＰＫ試料を採取した。各サイクルにおいて化学療法投与前、治療終了時ならびに６および１２ヶ月目に免疫原性試料を採取した（長期安全性）。
【0187】
研究薬物の少なくとも１回の投与を受け、かつ当該研究を中断しなかった患者は、研究治療の最後の投与後に長期安全性について追跡調査している。長期安全性は、３ヶ月目および９ヶ月目の電話による有害事象（ＡＥ）評価と６ヶ月目および１２ヶ月目のＡＥ評価および免疫原性採血のための来院とを含んでいた。サイクル１におけるＤＳＮは、深刻な好中球減少症の投与後日数として定める。
【0188】
閾値未満のＡＮＣの最初の発症から深刻な好中球減少症（ＡＮＣ＜０．５×１０９／Ｌ）の投与後日数として定められたサイクル１における深刻な好中球減少症（ＤＳＮ）の持続期間の主要評価項目のために有効性分析を行った。それらの結果から、ペグフィルグラスチム群における０．３５（±０．６８）日の平均ＤＳＮと比較して、エフラペグラスチム群の平均ＤＳＮは０．２０（±０．５０）日であることが分かった。エフラペグラスチム群とペグフィルグラスチム群との平均ＤＳＮの差は－０．１５日であり、対応する９５％ＣＩは統計分析計画において指定されているようなパーセンタイル法を用いて（－０．２６４、－０．０３２）であった。主要評価項目のために事前に指定された基準を用いて、ペグフィルグラスチム群に対するエフラペグラスチム群は、ペグフィルグラスチム（９５％ＣＩの上限＜０．６２日、ｐ＜０．０００１）よりも劣らない（良好または同じ位に有効な）ＤＳＮを提供することが実証された。これらの結果は、サイクル１におけるペグフィルグラスチム（９５％ＣＩの上限＜０、ｐ＝０．０３８）を超えるエフラペグラスチムの統計学的優位性も実証し、これは深刻な好中球減少の発生率がエフラペグラスチム群において有意により低いことを示している（図２および図３）。一方、有害事象の発生率は治療群の間でほぼ同等であり、そのほとんどが化学療法（ＴＣ）投与に関連しているとみなした。
【0189】
本明細書において提供されている実施例は、生理活性ポリペプチドのインビボでの持続時間を引き延ばし、かつ同時にインビボ活性（効力）を増加または維持するためのＰＥＧ部分を介して免疫グロブリンＦｃ領域に結合されたＧ－ＣＳＦタンパク質複合体の優位性を支持している。
【0190】
上記記載に基づいて、本発明はその技術的趣旨または必須の特性を変えることなく異なる特定の形態で実施できることが当業者によって理解されるであろう。従って当然のことながら、上記実施形態は限定的なものではなく、全ての態様において例示的なものである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲に先行する記載ではなく添付の特許請求の範囲によって定められ、従って特許請求の範囲の境界および限界に含まれる全ての変形および修正またはそのような境界および限界の均等物は特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】